KR100699453B1 - 신경퇴행성 질환용 모델로서의 형질전환 동물 - Google Patents

Abstract

a) 인간 Tau 단백질을 코딩하는 핵산 서열; b) 인간을 제외한 동물의 신경계에서 인간 Tau 단백질의 발현을 지시 (directing)할 수 있는 서열; 및 c) 인간 Tau 단백질에 유리하게 동물로부터 균등한 Tau 단백질 또는 관련되거나 균등한 단백질의 발현을 저해하도록, 동물 게놈내로 벡터의 도입(integration)을 용이하게 하는 표적 서열을 포함하는 핵산 벡터가 제공된다. 추가의 일면은 a) 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 인간 단백질을 코딩하는 핵산 서열; b) 동물의 신경계에서 단백질의 발현을 지시할 수 있는 서열; c) 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 인간 단백질에 유리하게 균등한 서열의 발현을 저해하도록, 임의로, 동물에서 인간 단백질의 균등물을 코딩하는 서열에 상응하는 위치에서 동물 게놈내로 벡터의 도입을 촉진시킬 수 있는 표적 서열을 포함하는 핵산 벡터를 제공한다. a) 상기 기재된 핵산 벡터를 동물의 배아세포내로 도입하고; b) 단계 a)로부터의 배아를 암컷 동물내로 도입하고; c) 배아가 충분히 발생하고 암컷으로부터 출생하는 시간까지 단계 b)의 암컷을 유지시키고; d) 형질전환된 동물을 유지시키는 단계를 포함하는 인간 Tau 단백질를 발현하는 인간을 제외한 형질전환된 동물을 제조하기 위하여 벡터를 사용한다.

Description

신경퇴행성 질환용 모델로서의 형질전환 동물{Transgenic animals as models for neurodegenerative disease}

본 발명은 질환 이상에 대한 세포 및 동물 모델 및 특히 알츠하이머와 같은 신경퇴행성 질환에 대한 모델로서 작용할 수 있는 동물 모델에 관한 것이다.

알츠하이머 질환은 약 5% 내지 20%의 65세가 이에 시달리는, 가장 유행하는 형태의 노인성치매인 신경퇴행성 질환이다. 신경 섬유성 덩어리(neurofibrillary tangles) 및 노인성 반점을 칭하는, 뇌내 두개의 주된 병변을 나타냄을 특징으로 한다.

신경 섬유성 덩어리는 쌍나선형 필라멘트(paired helical filaments(PHF))의 선형 응집괴(aggregates)를 포함하는 세포내 봉입체(inclusion body)이다. PHF의 주성분은 세포골격을 유지하고 신경세포 형태를 결정함에 관여하는 단백질과 관련된 미세소관(microtubule)인 Tau로 나타났다. Tau는 인단백질이고 Tau의 비정상적 과도한 인산화가 PHF로의 그의 응집에 대한 메카니즘을 나타내는 것처럼 보인다. 알츠하이머 질환(AD) 환자의 뇌중에 쌍나선형 필라멘트(PHF)의 인간 단백질 Tau의 인산화 위치의 생화학적 분석 및 구조적 예측에 의해 다수의 위치가 세린 또는 트레오인 잔기 이어서 프롤린 잔기로 구성됨을 밝혀냈고, 프롤린 의존성 키나아제에 관심을 집중시켰다(Wood et al., 1986; Wischik et al., 1988; Brion et al., 1991; Hasegawa et al., 1992; Pollanen et al., 1997).

또한 Tau 양성 선현 병변에 매개된 신경퇴행성 질환은 FTDP-17(파키슨 질환과 관련된 전두측두성 치매(Fronto-temporal dementia), 피질-기저 변성(cortico-basal degeneraion), 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy), 다발성 시스템 위측증(multiple system atrophy), 피크병(Pick's disease), 권투선수치매(dementia pugilistica), 신경 섬유성 덩어리만을 갖는 치매, 신경 섬유성 덩어리 및 석회화(calcification)을 갖는 치매, 다운 증후군, 근긴장성 이영양증(myotonic dystrophy), nieman-pick disease 니만-피크 병(Nieman-Pick 's disease), 괌(Guam)의 파아킨슨성 복합치매, 뇌염후 파아킨슨 증후군(postencephalitic parkinsonism), 신경 섬유성 덩어리를 갖는 프리온(prion), 아급성 경화성 범뇌염(subacute sclerosing panencephalitis )을 포함한다.

현재 이용가능한 데이타에도 불구하고 적절한 동물 모델외에도 생체내 인간 키나아제에 의한 단백질 Tau의 인산화를 증명하고 나타내는 증거를 확인하는 것은 부족하다.

그러므로, 본 발명은 이상의 증상을 치료하거나 호전시키기에 유용한 화합물을 확인함에 사용될 수 있는 모델인, 신경퇴행성 질환, 예를 들면 알츠하이머의 동물 모델을 제공하고자 한다.

본 발명의 제 1면에서, 본 발명은 a) 인간 Tau 단백질을 코딩하는 핵산 서 열; b) 동물의 신경계에서 인간 Tau 단백질의 발현을 지시(directing)할 수 있는 서열; 및 c) 인간 Tau 단백질에 유리하게 동물로부터 균등한 Tau 단백질 또는 관련되거나 균등한 단백질의 발현을 저해하도록, 동물 게놈내로 벡터의 도입 (integration)을 용이하게 하는 표적 서열을 포함하는 핵산 벡터를 제공한다. 따라서 이 작제물 또는 벡터는 인간 Tau를 발현시키고 실질적으로 동물 또는 세포로부터 내성적인 Tau 단백질로 오염되지 않은, 인간을 제외한 동물의 세포를 생산할 수 있게 한다. 따라서, 그러한 세포 또는 인간을 제외한 동물은 특히 인간 Tau 단백질의 작용 및 알츠하이머 질환과 같이 Tau 단백질에 의해 매개된 신경퇴행성 질환의 진행에서 그의 잠재 작용을 조사하기 위한 모델로서 유용할 수 있다.

본 발명의 일면에서, 게놈내로 벡터의 도입을 용이하게 하는 서열은 동물의 Tau 서열 또는 그의 측면(flanking) 부위와 충분한 정도로 상동성을 보이는 뉴클레오타이드 서열을 포함하여, 상동적 재조합 및 벡터상에 존재하는 서열로부터 코딩되는 인간 Tau 단백질에 유리하게, 동물에서 코딩 부위 및 결과적으로 내성적인 Tau 단백질의 발현을 교란시키는 위치에서 동물 게놈내로 벡터를 삽입할 수 있도록 한다. 동물 게놈중 내성적인 Tau 서열의 상류, 하류 또는 서열내 범위의 부위를 상동성 재조합의 부위로서 사용할 수 있다는 것을 본 기술자는 이해할 수 있겠지만, 상동의 부위를 선택하여 내성적인 Tau 서열의 상류 또는 하류의 서열을 코딩하는 다른 유전자로부터 단백질의 발현이 영향을 받지 않도록 하는 것이 바람직하다. 하기 실시예에서 보다 상세히 기술되는 바, 상기 언급된 바와 같이 상기 Tau 서열의 상류 또는 하류 부위에 상동인 적절한 부위를 사용할 수 있지만, 본 발명의 벡터는 마우스 게놈내 Tau 서열의 엑손 1의 유일한(unique) NcoI 위치로 벡터를 삽입하기에 적절한 NcoI 제한단편을 포함하므로써, 예를 들면, 마우스의 상응하는 Tau 서열에 표적될 수 있다.

본 발명에 따른 발현 벡터는 조절 서열, 예를 들면 상기 DNA 단편의 발현에 작용할 수 있는 프로모터 부위에 작동가능하도록 연결된, 본 발명에 따른 핵산을 갖는 벡터를 포함한다. 용어 "작동가능하게 연결"은 기재된 성분들이 의도된 방식으로 작용할 수 있도록 하는 관계에 있는 병치(juxta position)를 언급한다. 그러한 벡터는 적절한 숙주 세포내로 형질전환되어 본 발명에 따른 폴립펩티드의 발현을 제공할 수 있다. 따라서, 추가의 일면에서, 본 발명은 숙주 세포를 배양하고, 조건하에서 상기 기재된 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염시켜 수용체를 코딩하는 코딩 서열의 벡터에 의한 발현을 제공하고, 발현된 벡터를 회수함을 포함하는, 본 발명에 따른 수용체를 제공하는 방법을 제공한다.

내성적인 Tau 단백질이 세포외 DNA 서열에 유리하게 발현되는 것을 저해한다는 사실에 의하여 본 발명에 따른 벡터는 "넉 인-넉 아웃(knock in-knock out)"으로 명명된다. 바람직하게, 그러한 벡터는 추가로 일면에서 하이그로마이신 마커 유전저 Pgk-hyg를 포함할 수 있는 마커 서열을 포함한다.

Tau 단백질을 코딩하는 서열은 바람직하게 cDNA 서열이고, 더욱 바람직하게는 본 분야에 이미 공지되어 있는 40개의 Tau 이성체(isoform)중 하나를 코딩한다(Goedert M, Trens Neuroscience 1993 Nov; 16(11): 460-465). 그러한 인간 Tau 이성체를 코딩하는 공지된 서열을 이용할 수 있지만, 돌변변이화된 Tau 서 열을 사용하여 Tau 단백질에 매개된 동물에서 신경퇴행성 질환의 병변에서 Tau 단백질의 역할을 조사할 수 있다.

본 발명의 제 2면은 a) 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 인간 단백질을 코딩하는 핵산 서열; b) 동물의 신경계에서 단백질의 발현을 지시할 수 있는 서열; c) 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 인간 단백질에 유리하게 균등한 서열의 발현을 저해하도록, 임의로 동물에서 인간 단백질의 균등물을 코딩하는 서열에 상응하는 위치에서 동물 게놈내로 벡터의 도입을 용이하게 할 수 있는 표적 서열을 포함하는 핵산 벡터를 제공한다.

상기 기재된 벡터에 유사한 방법(fashion)으로, 동물 게놈내 균등한 서열에 도입된 벡터는 동물에서 관련되거나 균등한 단백질에 유리하게 Tau 단백질을 조절할 수 있는 단백질을 발현시킬 수 있다.

인간 Tau 단백질의 발현을 지시할 수 있는 서열 또는 그의 조절자는 바람직하게 인간을 제외한 동물의 신경계에 단백질을 발현시킬 수 있는 전사 조절 서열이다. 본 발명에 따른 전사 조절 서열은 적절한 프로모터 및 프로모터의 작용을 조절할 수 있는 다른 조절 부위, 예를 들면, 인핸서 서열을 포함한다.

발현을 위해 필요한 조절 요소는 RNA 폴리머라아제에 결합하는 프로모터 서열 및 리보솜 결합을 위한 전사 개시 서열을 포함한다. 예를 들면, 박테리아 발현 벡터는 락 프로모터와 같은 프로모터 및 전자 개시를 위한 Shine-Dalgarno 서열 및 개시 코돈 AUG를 포함한다. 유사하게, 진핵세포의 발현 벡터는 RNA 폴리머라아제 II를 위한 이질성 또는 상동성 프로모터, 하류의 폴리아데닐화 시그날, 개시 코돈 AUG, 및 리보솜의 분리를 위한 종결 코돈을 포함할 수 있다. 그러한 벡터는 상업적으로 입수할 수 있거나 본 분야에 잘 공지되어 있는 방법에 의해 기술된 서열로부터 조합될 수 있다.

프로모터는 전사 개시 부위의 전사 방향과 관련하여 상류인 DNA 부위를 언급하고 이 프로모터는 본 발명에 따른 관련된 단백질을 발현시킬 수 있는 관계에 존재한다.

뉴런에 발현을 유도하는 DNA 서열이 공지되어 있다. 그들은 뉴런-특이 조절 시스템 및 다소 무차별성이나 뉴런에서 고수준의 발현을 유도하는 조절 시스템 모두를 포함한다. 형질전환(transgenic) 동물의 제조에 사용되는 작제물 및, 특히 조절 요소의 성질에 따라 원하는 단백질을 모든 뉴런 또는 형질전환된 동물의 제한된 서브세트의 뉴런에서만 발현시킬 수 있다. 일반적으로 신경세포 타입에 발현을 유도하는 뉴런-특이 조절 시스템이 공지되어 있다. 뉴런-특이 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유래될 수 있다. 그러한 시스템을 사용하여 뉴런에서 원하는 Tau 단백질 및/또는 그를 조절할 수 있는 단백질을 발현시킬 수 있다.

바람직하게 서열은 뇌의 뉴런 또는 성상세포, 희소돌기아교세포 (oligodendrocytes) 미세아교세포(microglia) 또는 슈반세포(schwannoma)를 포함하는 다른 세포에서 상기 단백질의 발현을 지시하는 프로모터이다. 바람직하게, 프로모터는 마우스의 중추 뉴런에서 발현을 지시하는 마우스 Thy-1 프로모터이다.

유리하게, 본 발명의 일면에 따른 벡터를 상기 기재된 인간 Tau 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 벡터와 조합하여 사용하여 인간을 제외한 동물을 형질감염 시킴으로써 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 단백질 및 상기 Tau 단백질 사이의 상호작용을 조사할 수 있고 Tau의 인산화 작용을 조절할 수 있는 잠재적인 치료제를 확인할 수 있는 모델로서의 형질전환된 동물을 제공할 수 있다.

또한, 인간 Tau 단백질을 코딩하는 핵산 벡터를 포함하는 형질전환된 동물을 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 단백질을 코딩하는 벡터를 포함하는 또다른 형질전환동물과 교배시켜 양 단백질 모두를 발현하는 자손(offspring)을 얻을 수 있다.

형질전환된 동물내로 도입된 인간 서열은 본 분야에 공지된 것을 코딩할 수 있다. 바람직하게, 인간 Tau는 본 분야에 이미 공지되어 있는 Tau 이성체를 포함한다. 또한, 서열을 예를 들면 특정 유전 질환을 유발하는 돌연변이를 자극할 수 있는 점돌연변이와 같이 돌연변이화 시킬 수 있다. 원하는 유전자 부위를 돌연변이화하여 단백질의 작용 또는 발현을 불활성화하거나 변화시키는 기술은 본 분야에 공지되어 있다. 그러한 기술은 상동적 재조합(homologous recombinant)을 포함한다. 상동적 재조합 이벤트를 검출하는 방법은 중합효소 연쇄반응을 포함하거나 잘(successful) 표적화된 재조합 이벤트인 경우에 발현만 하는 마커 또는 리포터 유전자를 사용함을 포함한다. 인간을 제외한 동물내에서 발현되는 경우 돌연변이화된 서열은 유리하게 그들의 동물의 표현형에 대한 작용 및 Tau 단백질에 의해 매개된 알츠하이머와 같은 신경퇴행성 질환의 진행에서 그의 역할을 조사하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 제 2면의 바람직한 일례에서, 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 단백질은 키나아제이고, 바람직하게 인간 Tau 단백질을 인산화시킬 수 있는 것, 예를 들면 인간 GSK-3β키나아제이다. 시험관내 분석에서 Tau의 인산화에 관여하는 하나의 캔디데이트로서 당원 합성효소(glycogen synthase) 키나아제-3β(GSK-3β)를 확인하였다. 무세포 시스템중 소의 GSK-3β(Ishiguro et al., 1992a and 1992b) 및 인간 단백질 Tau(Hanger et al., 1992; Mandelkow et al., 1992)에 의한 인산화는 AD 뇌로부터 PHF로부터 분리된 단백질의 것과 유사한 단백질 Tau의 인산화 패턴을 초래하였다(Ishiguro et al., 1993). 시험관내 GSK-3β에 의한 인간 재조합 단백질의 인산화는 미세소관 핵생성(nucleation)을 유도하는 능력을 저하시키는 반면(Utton et al.,1997), 상기 키나아제는 또한 특정 영역상에 신경미세섬유(neurofilament) 단백질을 인산화하였다(Guan et al., 1991). 강력한 단백질 Tau로서 GSK-3β및 및 신경미세섬유 키나아제에 대한 추가의 증거가 형질감염된 세포에서 수득되었고, 여기에서 양 단백질 Tau(Loveston et al., 1994; Anderton et al., 1995; Loveston et al., 1996; Loveston and Reynolds, 1997) 및 NF-H가 기질로서 확인되었다. CHO 세포내에 Tau와 함께 GSK-3β의 공-형질감염은 중요한 미세소관 다발을 상실시키면서 그의 인산화를 증가시키는 반면(Wagner et al., 1996), COS 세포내 NF-H와의 공-형질감염은 전기영동 이동을 지연시키고 인산-의존 항체 프로필을 출현시켰다.

GSK-3β의 억제자로서 리튬이 전형적으로 AD 뇌중 PHF와 관련된 두개의 중요한 에피토프인, 항체 Tau-1 및 PHF-1에 의해 인식되는 위치에서 Tau 탈인산화를 일으킨다는 사실에 의해 배양된 뉴런 및 생체내 뇌 모두에서 Tau의 과인산화에 GSK-3 β가 관여한다는 것이 간접적으로 입증되었다. GSK-3β의 생리학적 작용이 Tau 및 신경미세섬유-H 및 최종적으로 다른 기질의 인산화를 조절하여 신경세포의 세포골격을 안정화시키는 것이라고 제안되었다(Takagash et al., 1994). 또한, GSK-3β는 제노퍼스의 뇌의 발생에서 하기 경로에서 배측 축 형성의 음성 조절자인 윙글리스(Wingless) 신호전달 경로의 일부로서 역할을 한다. 이 메커니즘에서, 액신(axin) 또는 컨덕틴(contuctin)에 의해 매개되는 β-카테닌의 인산화는 유비퀴틴-프로테아좀(ubiquitin-proteasome) 경로에 의한 β-카테닌의 분해를 조절한다(Aberle et al., 1997; Behrens et al., 1998; Ikeda et al., 1998). 따라서, 모델은 Tau 단백질에 의해 알츠하이머 및 매개된 다른 신경퇴행성 질환에 대한 분자원리를 조사하고 질환의 증상을 완화시킬 수 있는 화합물의 조사에 특히 유용하다.

벡터는 바람직하게 진핵세포인 적절한 숙주 세포내로 형질전환될 수 있고, 그 자체로 사용되어 인간을 제외한 동물을 형질전환시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가의 일면에서, 단백질의 벡터에 의해 발현이 제공되는 조건하에서 본 발명에 따른 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 배양하고 발현된 단백질을 회수하는 것을 포함하는, 인간 Tau 단백질 또는 Tau 단백질을 조절할 수 있는 단백질의 제조 방법이 제공된다. 바람직하게, 숙주 세포는 인간을 제외한 동물 세포, 및 더욱 바람직하게, 인간을 제외한 동물의 배아세포이다.

연속된 형질전환 및 숙주 세포 또는 인간을 제외한 동물 게놈내로의 도입을 위해 핵산 서열을 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press]에 제공되는 방법과 같이 본 발명에 따른 벡터내로 삽입은 본 분야에 기술자에 잘 공지되어 있는 방법에 따라 수행한다. 벡터는 형질감염 또는 전기충격(electrophoration)과 같은 적절한 다른 기술에 의해 도입될 수 있다. 본 발명에서, 세포외 DNA를 동물 게놈내로의 삽입은 배아줄기 세포중 벡터의 전기충격에 의해 달성된다. 이어서, 원하는 표현형를 갖는 형질전환된 동물의 생산을 위해 상동적 재조합에 의해 게놈내로 삽입된 세포외 DNA를 갖는 세포를 포배(blastocyst)내로 주사할 수 있다. 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 잘 형질전환된 세포는 잘 공지되어 있는 기술, 예를 들면 세포를 분해하고 예를 들면 서던 블롯팅에 의하거나 중합효소 연쇄반응을 사용하여 DNA를 조사함으로써 확인될 수 있다.

벡터는 예를 들면, 플라스미드, 바이러스, 코스미드 또는 파지 벡터일 수 있고, 하이그로마이신 마커 유전자 Pgk-hyg와 같은 하나 이상의 선별가능한 마커를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 유리하게 본 발명에 따른 핵산에 인접하는 적어도 약 10개의 뉴클레오타이드 및 바람직하게 10 내지 50개의 뉴클레오타이드의 핵산 서열을 제공하고 더욱더 바람직하게는 핵산 서열은 표 1에 나타낸 서열을 포함한다. 이들 서열은 유리하게 복제를 개시하기 위한 프로브 또는 프라이머 등으로서 사용될 수 있다. 그러한 핵산 서열은 재조합 또는 합성법과 같이 본 분야에 잘 공지되어 있는 기술에 따라 제조될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 핵산의 존재를 검출하기 위한 진단용 키트 등에 사용될 수 있다. 통상 이 시험은 혼성화 조건하에서 프로브를 샘 플과 접촉시키고 프로브 및 샘플중 어느 핵산사이의 이중 또는 삼중 나선 형성의 존재를 검출하는 것을 포함한다.

본 발명의 이 면에 따른 프로브를 고체 지지체에 고착시킬 수 있다. 바람직하게, 다수의 프로브들이 하나의 어레이상에 존재하여 단일의 생물학적 샘플과 동시에 혼성화할 수 있다. 프로브들은 상기 어레이상에 점적되거나 어레이상의 제자리(in situ)에서 합성될 수 있다(참조 Lockgart et al., Nature Biotechnology, vol. 14, December 1996 "Expression monitoring by hybridisatio into igh density oligonucleotide arrays"). 단일 어레이는 분리된 위치에 100, 500개 이상 심지어는 1000개 이상의 상이한 프로브를 포함할 수 있다.

본 발명에 따라, 그러한 재조합 또는 합성 방법, 예를 들면, 일반적으로 바람직하게 클로닝되는 유전자의 부위의 약 10 내지 50개의 뉴클레오타이드 일 수 있는 한 쌍의 프라이머를 제조하고, 상기 프로이머를 인간 세포로부터 유래된 mRNA, cDNA, 또는 게놈 DNA와 접촉시키고, 원하는 부위를 증폭시킬 수 있는 조건하에서 중합효소연쇄반응을 수행하고, 증폭된 부위 또는 단편을 분리시키고 증폭된 DNA를 회수하는 것을 포함하는 PCR 클로닝 메커니즘을 사용하여 핵산 서열이 제조될 수 있다. 일반적으로, 이하 정의된 바와 같은 그러한 기술은 예를 들면, Sambrook 등의 (Molecular Cloning: a Laboratory Mannual, 1989)에 기재된 바와 같이 본 분야에 잘 공지되어 있다.

본 발명에 따른 핵산 또는 올리고뉴크레오타이드는 출현(revealing) 표지를 포함할 수 있다. 적절한 표지는 ³²P 또는 ³⁵S와 같은 방사성동위원소, 효소 표지 또는 바이오틴(biotin)과 같은 다른 단백질 표지 또는 형광 표지(fluorescent markers)를 포함한다. 그러한 표지들은 본 발명의 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드에 첨가될 수 있고 그 자체는(per se) 공지된 기술을 사용하여 검출될 수 있다.

안티센스 기술을 사용하여 폴리뉴클레오타이드가 DNA 또는 RNA에 결합함에 기초하는 방법인 안티센스 DNA 또는 RNA의 삼중-나선 형성을 통하여 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 단백질에 대하여 코딩하는 5' 코딩 부위 또는 성숙(mature) 단백질 서열을 사용하여 10 내지 50 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리코뉴클레오타이드를 설계한다. DNA 올리고뉴클레오타이드는 전사에 관여하는 유전자 부위에 상보적이도록 설계하여(triple-gelix 참조 Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:703(1979); Cooney et al., Scinece, 241;456(1988); and Dervan et al., Science, 251: 1360(1991)), 전사 및 인간 Tau 단백질 또는 본 명세서에 정의된 본 발명에 따른 Tau를 조절할 수 있는 단백질의 생산을 저해한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드는 생체내에서 mRNA와 혼성화하고 mRNA 분자의 해독을 차단한다(antisense-Okano, J. Neurochem., 56L560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL(1988)).

따라서 유리하게는 인간 Tau 단백질 및/또는 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 단백질을 발현하는 본 명세서에 기재된 인간을 제외한 형질전환된 동물을 사용하여 Tau 단백질에 의해 매개된 다른 신경퇴행성 질환 또는 알츠하이머를 위한 강력한 치료제로서 확인될 수 있는 캔디데이트 화합물의 작용을 선택적으로 확인하기 위하여 사용될 수 있는 안티센스 기술을 사용하여 각각의 관련된 단백질의 발현을 억제시킬 수 있다.

최근 정의된 시간에 조직내 유전자의 발현 또는 제거을 표적화할 수 있는 동물 게놈내 유전자변환공학(engineering genetic switches)에 의해 동물에서 유전자의 발현을 조작하는 것이 가능하게 되었다(Inducible gene targetin in mice using the Cre/lox system, a companion to methods in enzymelogy 14, 381-392(1998)). 이 기술을 사용하여 본 발명에 따른 어느 단백질의 발현을 조작할 수 있고, 예를 들면, 형질전환주(transgenic line)가 구축된 경우에만 오직 발현된다. 따라서, 본 발명의 벡터는 정지 신호 또는 인간 Tau 또는 인간 Tau 의 발현을 조절할 수 있는 단백질의 발현을 지시할 수 있는 서열 또는 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 단백질 사이에 존재하는 서열을 포함할 수 있고, 정지 신호는 두개의 loxP 위치 측면에 위치한다. 상기 기재 및 하기 실시에서와 같은 벡터를 사용하여 형질전환주를 구축할 때, Cre 재조합효소 단백질이 존재하지 않는 경우 관련 단백질은 발현되지 않을 것이다. Cre 단백질은 loxP 쌍 위치 사이에 상호 보존적 DNA 재조합을 촉진시켜 loxP 위치 사이에 위치하는 정지 서열을 제거한다. Cre 단백질은 그 스스로 제 1(first)와 교배된 또다른 형질전환된 동물에서 스스로 발현되어, 두개의 loxP 위치 사이에서 상호 조합 이벤트에 따라 정지 서열을 제거함으로써 형질전환된 동물에서 적절한 서열의 발현을 변환시킬 수 있다. 이 기술은 또한 인간 Tau 및/또는 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 단백질을 코딩하는 서열의 측면에 위치하는 loxP 위치를 적절한 핵산 벡터중에 포함시킴으로써 본 발명에 따른 단백질을 코딩하는 DNA 서열이 Cre 단백질에 의해 절단될 수 있도록 한다. 그러한 벡터를 사용하여 본 발명에 따른 형질전환된 동물에서 단백질을 코딩하는 서열의 널 뮤테이션(null mutation) 또는 넉-아웃의 작용을 조사할 수 있다.

본 발명과 관련하여, 정의된 핵산은 균등한 핵산 및 특히, 보존적인 아미노산 치환체중 퇴화 코돈에 의해 예를 들면 유사한 코돈(동일한 아미노산 잔기를 특정화하는 상이한 코돈)을 얻게 되는 경우의 치환체를 포함하는 최소 염기 변이를 포함한다. 용어 "핵산 서열"은 또한 염기 변이와 관련하여 주어진 어느 단일 스트랜드 서열에 상보적인 서열을 포함한다.

본 발명의 추가의 일면은 a) 동물의 신경계에서 인간 Tau 단백질을 발현할 수 있는 트랜스진을 포함하는 제 1 핵산 벡터 및 동물 게놈내로 도입시 동물로부터 내생적인 Tau 단백질의 발현을 저해할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제 2 핵산 벡터를 동물의 배아세포내로 연속적으로 또는 동시에 도입하고; b) 단계 a)로부터의 배아를 암컷 동물내로 도입하고; c) 배아가 충분히 발생하고 암컷으로부터 출생하는 시간까지 단계 b)의 암컷을 유지시키고; d) 형질전환된 동물을 유지시키는 단계를 포함하는 인간 Tau 단백질를 발현하는 인간을 제외한 형질전환된 동물을 제조하는 방법을 포함한다.

인간 Tau 단백질을 발현하는 인간을 제외한 형질전환된 동물을 제조하는 추가의 방법은 a) 인간 Tau 단백질을 코딩하는 트랜스진(transgene)을 포함하는 핵산 벡터; 및 동물 게놈내로 도입시 동물로부터 내성적인 Tau 단백질의 발현을 저해할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 벡터를 동물의 배아세포내로 연속적으로 또는 동시에 도입하고; b) 단계 a)로부터의 배아를 암컷 동물내로 도입하고; c) 배아가 충분히 발생하고 암컷으로부터 출생하는 시간까지 단계 b)의 암컷에서 유지시키고; d) 형질전환된 동물을 유지시키는 단계를 포함한다.

알츠하이머 질환과 같은 질환용 모델인, 인간을 제외한 형질전환된 동물을 제조하는 또다른 방법은 본 발명에 따른 벡터로부터 인간 Tau 단백질을 발현하는 제 1의 인간을 제외한 형질전환된 동물을 본 발명에 따른 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 단백질을 발현하는 제 2의 인간을 제외한 형질전환된 동물과 교배시키고, 자손중 인간 Tau 단백질 및 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 단백질 모두를 발현하는 것을 선택하는 것을 포함한다.

상기 기재된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 각각의 인간을 제외한 형질전환된 동물에서 Cre/lox 기술을 사용하여 적절한 DNA 서열의 측면에 위치하는 loxP 위치의 삽입에 의해 단백질의 발현을 조작할 수 있다. 서열은 인간 Tau 또는 인간 Tau 단백질 자신을 조절할 수 있는 단백질을 코딩하는 것중 어느 하나 또는 모두, 또는 정지 서열을 제거하기 위하여 Cre 재조합효소의 존재하에 재조합 이벤트가 발생하지 않는 경우에는 정지 서열 또는 상기 단백질의 발현을 저해하는 코돈일 수 있다. 인간을 제외한 형질전환된 동물을 제조하기 위한 본 발명의 이 일면에 따라 사용되는 벡터는 효모에서는 복제할 수 없다.

본 발명의 추가의 일면은 동물의 신경계에 단백질 Tau를 코딩하고 발현할 수 있는 도입된 DNA 서열을 포함하고 또한 인간 Tau 단백질을 직접 또는 간접적으로 조절할 수 있는 단백질을 코딩하고 발현할 수 있는 DNA 서열을 포함하는, 알츠하이머 질환 또는 또다른 신경퇴행성 질환을 위한 모델인 인간을 제외한 형질전환된 동물을 포함한다. 본 발명의 이 일면에서, 인간 Tau 및 인간 Tau를 조절할 수 있는 단백질은 바람직하게 상기 기재된 본 발명에 따른 벡터상의 서열에 의해 코딩된 것이다.

본 발명의 추가의 일면은 i) 인간 Tau 단백질을 코딩하는 핵산 서열, ii) 동물의 신경계에서 인간 Tau 단백질의 발현을 지시할 수 있는 서열 및 iii) 동물 게놈내로 벡터의 도입을 용이하게 하는 표적 서열을 갖는 벡터를 포함하는 제 1의 인간을 제외한 형질전환된 동물을 본 발명에 따른 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 제 2의 인간을 제외한 형질전환된 동물과 교배시키고, 자손중 인간 Tau 단백질 및 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 단백질 모두를 발현하는 것을 선택하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 또는 관련된 신경퇴행성 질환을 위한 모델인, 인간을 제외한 형질전환된 동물을 제조하는 방법을 포함한다.

본 발명에 따른 또다른 인간을 제외한 형질전환된 동물은 또한 인간 Tau 단백질을 발현하는 제 1의 인간을 제외한 형질전환된 동물을 인간 Tau 단백질을 조절하는 단백질을 위하여 형질전환된 또다른 인간을 제외한 동물과 교배하여 제공된다. 그러므로, 본 발명의 이 일면에 따라, i) 인간 Tau 단백질을 코딩하는 핵산 서열, ii) 동물의 신경계에서 인간 Tau 단백질의 발현을 지시할 수 있는 서열 및 iii) 동물 게놈내로 벡터의 도입을 용이하게 하는 표적 서열을 갖는 벡터를 포함하 는 제 1의 인간을 제외한 형질전환된 동물을 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 제 2의 인간을 제외한 형질전환된 동물과 교배시키고, 자손중 인간 Tau 단백질 및 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 단백질 모두를 발현하는 것을 선택하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 질환 또는 관련된 신경퇴행성 질환을 위한 모델인 인간을 제외한 형질전환된 동물을 제조하는 방법이 제공된다.

용어 "자손" 또는 "자식"은 본 발명에 따른 벡터를 수반하는 경우 기재된 형질전환된 동물사이의 교배에 의한 산물을 포함하고자 한다. 또한 게놈내로 안정하게 도입된 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 추가의 자손을 낳기 위하여 스스로 사용될 수 있는 형질전환된 동물로부터의 배아세포(germ cell)가 포함된다.

바람직하게, 본 발명의 발명에 따라 사용되는 인간을 제외한 동물은 포유 동물 및 더욱 바람직하게 마우스이다.

기재된 핵산 벡터는 예를 들면 전기충격에 의해 배아줄기 세포내로 도입될 수 있다. 단일 세포기에 있는 경우 세포의 미량주사(microinjection)로 배상에서 수행하여, 핵산 벡터가 동물의 배선(germ line)내로 도입되어 자손으로의 연속된 유전에 대하여 동물의 모든 세포에서 발현되도록 한다. 본 발명의 추가의 일면은 게놈내로 안정하게 도입된 본 발명에 따른 어느 핵산 벡터를 수반하는, 본 발명에 따른 형질전환된 동물의 자손을 포함한다.

형질전환된 동물은 유리하게 알츠하이머 또는 인간에서 질환에 대한 적절한 모델을 만드는 인간 Tau 단백질 인산화에 의해 매개된 다른 관련된 신경퇴행성 질환의 증상을 나타낼 수 있다. 인간 Tau 단백질의 과인산화를 조절하고 조정하는(증 진시키거나 억제하여) 화합물은 상기 화합물을 동물에게 투여하므로써 확인될 수 있다. 인핸서로서 확인되는 화합물을 유리하게 동물에게 적용시켜 질환의 전개를 용히하게 할 수 있다. 화합물을 동물에게 적용 또는 투여한 후 동물에서 Tau 단백질의 효과 또는 인산화 프로필을 조사하여 질환의 억제자를 확인할 수 있다. 화합물은 어느 적절한 경로, 예를 들면 경구 또는 정맥내로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 또한 상기 기재된 스크리닝 방법중 어느 하나의 단계; 및 추가로

i) 상기 방법에서 수득되거나 확인된 화합물 또는 그의 생리학적으로 허용가능한 아날로그 또는 유도체를 충분한 양으로 합성하여 환자에게 치료학적 유효량으로 상기 조절자를 제공하고/거나;

ii) 상기 방법에서 수득되거나 확인된 화합물 또는 그의 아날로그 또는 유도체를 약제학적으로 허용가능한 담체와 결합함을 포함하는, 인간 Tau 단백질의 과인산화에 매개된 인간 키나아제를 조절하는 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 의해 분리되는 화합물은 아날로그 화합물의 개발을 위한 선도 화합물(lead compound)로서도 작용한다. 아날로그는 선도 화합물과 실질적으로 동일한 방식으로 주요 작용 그룹이 Tau 단백질 또는 키나아제에 존재하도록 하는 안정화된 전자 배치 및 분자 배열을 가져야 한다. 특히, 아날로그 화합물은 결합 부위와 상응하는 공간적인 전자 성질을 갖지만, 선도 화합물보다 더 작은 분자, 주로 약 2 kD 미만 바람직하게 약 1 kD 미만의 분자량을 가질 수 있다. 아날로그 화합물의 확인은 자가-일관성 장(self-consistene field(SCF)) 분석, 배치간 상호작용 (configuration interaction; CI) 분석, 및 정상 모드 동태분석(normal mode dynamics analysis)과 같은 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 이들 기술을 수행하기 위한 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다(예: Rein, Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions(Alan Liss, New York, 1989). 화학 유도체 및 아날로그를 제조하는 방법은 본 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있고 예를 들면, [Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edtion New York Inc., 175 Fifth Avenue, New yourk, N.Y. 10010 U.S.A. and Organic Systhesis, Wiley, New York, USA.]. 또한, 상기 유도체 및 아날로그를 본 분야에 공지된 방법에 따라 그의 작용을 시험할 수 있다: 상기 참조. 또한, 적절한 유도체 및 아날로그의 펩티도미메틱(Peptidomimetics) 및/또는 컴퓨터 사용 디자인(computer aided design)을 사용할 수 있다.

달리 트랜스진으로 언급되지 않는 경우, 모든 벡터가 모든 세포 또는 동물 형태에서 최상으로 작용하는 것은 아니라는 것을 이해할 것이다. 따라서, 어느 주어진 세포 또는 동물 형태를 위한 최상의 키나아제 또는 Tau 이성체 또는 프로모터 서열을 확인하거나 구축하기 위하여 일반 시험이 요구된다.

본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 항체는 유리하게 본 분야에 공지된 기술에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 폴리클로날 항체는 마우스와 같은 숙주 동물을 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 그의 에피토프로 접종하고 면역 혈청을 회수하여 제조할 수 있다. 모노클로날 항체는 [Kogler R. and Milstein C., Nature(1975) 256, 495-497)]에 기재된 방법과 같은 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다. 유리하게, 항체는 항체를 샘플과 접촉시키기 위한 수단과 함께 샘플중 인간 Tau 또는 키나아제를 확인하기 위한 키트중에 포함될 수 있다.

본 발명은 하기 도면을 참고로 하여 하기 실시예로부터 더욱 명확하게 이해될 것이다:

도 1은 마우스 Tau 좌위(locus)를 표적하기 위하여 사용되는 재조합 DNA 작제물의 도이다. 삼각형 모형은 loxP 위치를 나타낸다. 블랙 박스는 마우스 Tau 유전자의 엑손 1 부분을 가리킨다. BSSK+는 블루스크립트(bluescript) 클로닝 벡터를 나타낸다. Pgk-hyg는 하이그로마이신 마커 유전자를 나타낸다. 중간의 도는 야생형 마우스 Tau 유전자의 부분적인 구조를 나타낸다. Nco1 은 전체 작제물이 도입되는 엑손 1상의 유일한(unique) 위치이다. 하단의 도는 ES 세포내로 도입되기 위해 준비된 작제물을 나타내고 상동적 재조합이 마우스 게놈중에 발생하는 경우 상이한 효소 분해와 함께 상이한 프로브를 사용하였다. 텍스트내 각 란에서 상세히 설명한다.

도 2는 배아기에서 인간 Tau 40 cDNA를 포함하는 형질전환 마우스를 확인하기 위하여 사용되는 서던 블랏의 도이다. 배아기에 주사된 46마리의 퍼프(pup)중 5마리가 상기 DAN를 포함하였다.

도 3은 3개의 상이한 형질전환 마우스 종내 64 kDa Tau 단백질을 나타내는, 항체 HT-7 및 Tau-5로 프로빙된 웨스턴 블랏 결과의 도이다.

도 4 및 5는 인간 Tau 유전자의 제한지도에서 희유한(rare) 제한 분해 효소를 사용한 상이한 분해도이다.

도 6은 형질전환 마우스의 뇌중 인간 GSK-3β의 발현(A) 및 합성 기질 펩티 드를 사용하는 형질전환된 동물의 뇌중 인간 GSK-3β의 활성(B)의 도이다.

도 7은 5주령된 GSK-3β[S9A]/htau 40 이중 형질전환 마우스의 뇌 추출물을 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타낸 도이다. 야생형(WT), GSK-3β[S9A] 단일 형질전환([S9A]-5), htau 40 단일 형질전환 및 GSK-3β[S9A]/htau 40 이중 형질전환 마우스로부터의 뇌 추출물을 특정화된 모노클로날 항체로 이뮤노블롯팅하였다. Tau-5를 면역검출하기 위하여 AT8 및 AT-180 염색. 인간 단백질 tau의 강한 과인산화는 생성된 3개의 모든 변종의 이중 형질전환된 동물에서 모노클로날 항제 AT-8 및 AT-180과의 반응에 의해 입증되었다.

도 8은 loxP-하이그로마이신 작제물의 제조 방법의 설명도이다. 이 작제물은 효모에서 세포외 단백질을 복제 및/또는 발현할 수 없다.

도 9는 다양한 제한 효소를 사용하는 도 8의 작제물의 제한 분해이다.

도 10은 도 8의 작제물의 제한지도를 설명한다.

도 11은 작제물의 존재를 확인하기 위하여 세포주를 프로빙하여 얻은 결과도이다.

도 12는 7개월된 GSK-3β[S9A] 형질전환 마우스의 뇌 추출물을 웨스턴 블롯팅한 설명도이다. 각 패널은 각 패널과 함께 나타내는 바와 같이 항체 Tau-5, PHF-1, AT-8 및 AT-180으로 이뮤노블롯팅된, 모두 약 7개월된 2마리의 야생형(wt) 마우스 및 2마리의 GSK-3β[S9A] 형질전환 마우스로부터의 뇌 추출물을 비교한다. 전기 영동에 앞서 뇌 균질액을 마우스 IgG로부터 정제하였다.

도 13은 과인산환 단백질 tau에 대한 알칼리성 포스포타아제 전처리의 효과 의 설명도이다. 단일 및 이중 htau-40-5 및 GSK-3β[S9A]/htau 형질전환 마우스의 뇌 균질액을 미처리하거나, 웨스턴 블롯팅에 앞서 알칼리성 포스포타아제없이 또는 포스포타아제와 함께 3시간동안 37℃에서 인큐벤이션 후에 시켰다. 항체 Tau-5 및 Tau-1로 염색하기 위하여, 적용된 추출물의 양은 AT-8 및 AT-180을 위한 것보다 6배 적었다. 명세서에 기재되고 언급된 바와 같이 신호의 감소 및 전기영동에 증가를 인지한다.

도 14중 a) 및 e)는 GSK-3β[S9A]로 나타낸 GSK-3β돌연변이형, 및 htau40의 돌연변이형을 발현하는 형질전환 마우스를 생산하기 위하여 사용되는 재조합 DNA 작제불의 대표 그래프이고; b) 및 c)는 야생형 마우스와 비교되는 형질전환 마우스에서 트랜스진의 발현을 설명하는, 형질전환 및 야생형 마우스로부터의 뇌 및 척수 추출물의 웨스턴 블롯팅으로부터 얻은 결과의 설명도이고; d) 및 g)는 GSK-3β[S9A] 돌연변이 및 인간 tau 트랜스진 모두를 발현하는 척수의 배쪽돌기내 뉴런을 조사하면서 신경 세포체 및 피질 및 해마내 돌기(processes)중 형질전환 단백질의 면역조직학적 위치결정의 설명도이다.

도 15는 항체, AT-8, AT-180,AD-2 및 12E8을 사용하여 이뮤노블롯팅된 5주령된 tau-4R x GSK-3β[S9A]의 이중 형질전환 마우스의 뇌 추출물을 사용한 웨스턴 블롯팅으로부터 얻은 결과의 설명도이다.

도 16은 hyau-4R 한배새끼(littermate)와 비교되는 htau-4R x GSK-3β이중 형질전환 마우스로부터 유래된 마우스의 뇌 및 척수로부터 추출된 재결합된 미세호관에 대한 tau 단백질의 결합 시험으로부터 얻은 결과의 설명도이다.

도 17은 Tau-1, AT-180 및 AD-2를 사용하여, 미세소관에 비결합된 인간 및 쥐 tau 단백질의 웨스턴 블랏으로부터 얻은 결과의 설명도이다. 또한 항체 Tau-5와의 반응에 대한 사진 농도적(densitometric) 스캐닝 및 정상화에 의해 비결합 단백질의 정량분석 결과를 나타낸다.

도 18은 AD-2 및 12E8 에피토프가 미세소관 추출물중 결합 및 유리 단백질 tau상에 차별적으로 존재함을 증명하는 웨스턴 블롯팅으로부터 얻은 결과의 설명도이다.

도 19는 인간 tau 형질전환된 동물내 시냅토시신(synapthophysin)-포함 소포체의 축재를 나타내는 이병(diseased) 축색돌기(axon)의 단면의 설명도이다.

도 20은 htau 40-1 x GSK3β의 사두(quadriceps)에서 근육 소모의 부족 및 팽창된 돌기의 수의 현저한 감소를 나타내는 htau 40R x GSK3β이중 형질전환 마우스의 뇌 및 척수의 단면도이다.

도 21은 htau 40-2, GSK-3β및 야생형 마우스와는 상대적인, htau 40 x GSK-3β형질전환 마우스에서 상이한 시험에서 GSK-3β의 공발현의 운동성 측면에 대한 작용의 평가로부터 수득한 결과를 나타낸 설명도이다. a)는 정립반사(upright reflex)의 결과이고 b)는 로드로부터 떨어진 마우스의 수를 측정한 로드워킹(rodwalking)이고 c)는 마우스가 로드상에 존재하는 시간이고 d)는 포스트 스윔 시험이고 d)는 그리드 행(grid hang) 시험이다.

형질전환 GSK-3β[S9A] 마우스

인간 GSK-3β[S9A] 돌연변이 키나아제를 함유하는 5마리의 독립된 형질전환 파운더(founder)를 FVB 유전정보로 마우스 thy-1 유전자 프로모터의 조절하에 생산하였다. GSK-3β발현이 가장 높고 모든 표현형 면에서는 일치하는 GSK-3β[S9A]-5 및 -1 세포주로부터 이형 마우스로 모든 시험을 비교적으로 수행하였다.

인간 GSK-3β단백질은 웨스턴 블롯팅(도 6A)에 의해 밝혀졌고 GS-1 합성 펩티드에 대하여 효소적으로 활성이었다. 형질전환 마우스의 뇌 균질액중, GSK-3β키나아제의 작용은 야생형 마우스 뇌에서의 작용에 상대적으로 약 2배였다(도 6B). 면역조직학적으로, 인간 단백질은 신경 세포체 및 피질 및 해마중 돌기내 위치하였고 사용된 적응 마우스 thy1 유전자 작제물의 공지된 발현 패턴으로부터 예측되었다(Moechars et al., 1996 and references therein).

형질전환 인간 tau40 마우스

적응 마우스 thy-1 유전자 프로모터에 포매된 인간 tau40 cDNA를 함유하는 5마리의 독립된 형질전환 파운더를 생산하고; 이는 상기 사용된 작제물과 유사하였다. 3마리의 파운더 세포주, 즉, htau40-1, -2 및 -5를 멘델 패턴으로 트랜스진을 이동시키고 분석하였다. 인간 특이 인산화-독립 모노클로날 항체 HT-7로 웨스턴 블롯팅하여 htau40-1 및 htau40-2 세포주에서 인간 단백질 tau가 가장 높게 발현되었음을 증명하였다(도 3A). 인산화-독립 모노클로날 항체 Tau-5로 총 단백질 tau의 웨스턴 블롯팅은 사진 농도적 스캐닝에 의해 정량화하여 3마리의 형질전환 세포주에서 내성적인 마우스 단백질 tau에 대한 형질전환 인간 tau의 비가 각각 약 1.5, 1.6 및 0.5임을 증명하였다. 4 내지 8주령 인간 단백질 tau40 형질전환 마우스의 뇌에서, 항체 HT-7이 원추상 세포체 및 해마 및 피질내 돌기를 염색시켰고(도 7C), 또한 피질층 V내에서 짙은 표지가 입증되었다.

형질전환 GSK-3β[S9A] 및 이중 [GSK-3βx tau-4R] 마우스

가장 긴 인간 tau-4R 이성체를 발현하는 형질전환 마우스가 기재되고 특징화되었다(Spittaels et al., 1999).

본 발명자는 인산화에 의한 불활성화를 저해하도록 cDNA가 9번 위치에 야생형 세린 대신 알라닌 잔기를 함유하기 때문에 인간 GSK-3β[S9A]로 나타낸 인간 GSK3β의 돌연변이형을 발현하는 형질전환 마우스를 생산하였다(Woodgett, 1990). 마우스 thy-1 유전자 프로모터에 기초하여 재조합 DNA 작제물내로 cDNA를 삽입하고 FVB 마우스 종(strain)에 미세주사하여 형질전환 마우스를 생산하였다(Moechars et al., 1996; Spittaels et al., 1999).

인간 GSK-3β단백질을 뇌 및 척수에서 웨스턴 블롯팅하여 증명하였다(도 14b). 트랜스진은 합성 펩티드 기질상에서 효소적으로 활성이었고, 야생형 마우스와 상대적으로, GSK-3β마우스 뇌 균질액에서 총 GSK-3β키나아제의 활성은 2배였다(도 14c). 면역조직학적으로, 적응 마우스 thy1 유전잔 작제물에 대하여 예측된 바와 같이, 인간 형질전환 단백질은 신경세포체 및 피질 및 해마내 돌기에 위치하였다(도 14d)(Moechars et al., 1996; Spittaels et al., 1999). 또한, 척수의 배쪽돌기내 운동신경세포 또한 인간 GSK-3β[S9A] 돌연변이 및 인간 tau 트랜즈진을 발현하였다(도 14d,g)(Spittaels et al., 1999). 따라서, 양 트랜스진이 동일한 뉴런, 뇌 및 척수의 동일한 부위에서 발현된다고 증명되었다.

이중 형질전환 마우스를 단일 형질전환 종을 교배-번식시켜 수득하였다.

단백질 tau의 인산화 분석

GSK-3β에 의해 인산화됨이 공지된 단백질 tau의 상이한 에피토프에 대하여 특이적인 항체를 포함하는, 잘 특징화된 일련의 항체로 마우스 뇌 추출물을 웨스턴 블롯팅하여 집중적으로 분석을 수행하였다(Spittaels et al., 1995). 전기영동 이동에서 4-8주령 GSK-3β[S9A] 형질전환 마우스에서는 동일한 나이의 야생형 마우스에 대하여 상대적으로 단지 최소한의 상이함이 관찰되었고 PHF-1 항체로 웨스턴 블롯팅하여 분석하였다. 단지 더 장시간의 웨스턴 블롯팅에 노출에 의해서만 형질전환된 동물에서 쥐 단백질 tau의 과인산화를 AT-180 면역반응에 의해 입증하였다. 그러나, 2달 미만의 단일 형질전환 마우스에서는 추가의, 항체 AT-80로 원하는 반응은 존재하지 않았다. 모노클로날 항체 Tau-5 및 PHF1로 또한 검출된 단백질 tau의 면역-반응 이성체의 더욱 저속의 전기영동 이동과 함께, 좀더 나이든 즉 16개월 이하의 GSK-3β형질전환 마우스의 뇌(도 12)에서 인산화-의존 항체 AT-8 및 AT-180 모두의 면역반응을 명확하게 관찰되었다.

상이한 나이에 희생된 마우스의 뇌로부터 절개되고 처리되고 수개의 상이한 공정에 따라 고정된 파라핀 및 사이로스탓(cyrostat) 절편상에서 집중적으로 면역조직학적 분석을 수행하였다. 웨스턴 블롯팅에 사용되는 항체 및 추가의 항체로의 염색에 의해서는 GSK-3β형질전환 마우스에서 내성적인 마우스 단백질의 판단가능하고 재생가능한 인산화를 밝혀내지 못했다. 인간 단백질 tau는 마우스 tau 단백질보다 더욱 특징적이고, 사용되는 항체는 일차적으로 인간 단백질 tau에 대하여 지 시된다는 것이 분명하다. 또한, 마우스에서 어느 tau-병증에 대한 증거가 부족하기 때문에 본 발명자는 동일한 뉴런에서 인간 단백질 tau과 GSK-3β[S9A]를 공발현시키는 이중 형질전환 마우스를 제조하여, 생체내에서 인간 단백질 tau의 인산화를 조정할 때 GSK-3β의 역할을 조사하기로 결정하였다.

항체 AT-8, AT-180 및 Tau-5로 웨스턴 블롯팅에 의해 심지어 5주의 어린 나이의 이중 형질전환 마우스의 뇌추출물에서 인간 단백질 tau의 정의된 과인산화를 입증하였다(도 7). GSK-3β 또는 인간 tau40만을 발현하는 단일 형질전환 한배새끼의 뇌는 AT-8 및 AT-180 면역반응을 나타내지 않거나 더욱 약한 반응을 나타냈고 단백질 tau의 더 천천히 이동하는 이성체를 함유하지 않거나 더 소량 함유하였다. 동일한 블롯팅 방법에 의해, 심지어 5주령의 어린, tau4R x GSK-3β[S9A]의 이중 형질전환 마우스의 뇌에서 인간 단백질 tau의 과인산화가 입증되었다. 항체 AT-8, AT-180, AD-2 및 12E8로 웨스턴 블롯팅은 이중 형질전환 마우스의 뇌균질액중 천천히 이동하는 인간 단백질 이성체와 반응하였고, 이는 유리하게 단일 형질전환 한배새끼에는 존재하지 않았다(도 15).

전기영동에 앞서, 알칼리성 포스포타아제로 뇌 추출물을 전처리하여 웨스턴 블롯팅에 대한 모든 마우스의 균등한 단백질 tau 패턴을 수득하고 쥐 및 인간 단백질 tau의 AT-8 및 AT-180 면역반응은 삭제하였다(도 13). 추가로, 전(prior) 탈인산화는 항체 Tau-1과의 면역반응을 증가시켰다(도 13).

GSK-3β는 미세소관에 결합하는 단백질의 양을 감소시킨다

본 발명자는 GSk-3β활성이 뇌 및 척수중의 미세소관에 결합하는 단백질 tau 에 영향을 주는지 조사하였다. 탁솔의 존재에서 분리된 세포질 추출물은 튜불린의 농도가 낮은 불리한 조건, 프로테아제의 존재 및 다른 어려운 조건하에도 불구하고 여전히 수행할 수 있고 미세소관 구조로 결합시켰다. 재결합 표본은 미세소관은 MAP와 결합하였다(Vallee 1982).

htau4R 한배새끼와 비교하여, htau4R x GSK-3β이중 형질전환 마우스에서 유래된 균질액중 마우스 뇌 및 척수로부터 추출된 재결합 미세소관에 대한 단백질의 결합은 현저하게 감소하였다(도 16). 분리 공정동안 LiCl의 추가는 결과에 아무런 영향을 주지 않지만, 포스포타아제 억제자의 존재는 필수적이고, 이는 생체내에서 tau 인산화가 발생하고 htau40-1 x GSK-3β형질전환 마우스의 뇌에서와 같은 조건을 반영함을 나타내었다(도 16).

추출물의 상등액에 존재하는 비결합 인간 및 쥐 단백질 tau의 분석에 의하여 증명되는 바와 같이 미세소관에 대한 감소된 결합은 과인산화와 관련한다고 명확하게 입증되었다. 이 가용성 단백질 tau는 항체 Tau-1, AT-180 및 AD-2와의 반응에서 입증되는 바와 같이 과인산화되었다(도 17). 정량적으로 AD-2에 의해 인식되는 에피토프가 가장 반응을 잘하였고, 이는 단백질 tau상의 동일한 인산화된 에피토프를 인식하는 PHF-1 항체와 반응에 의해 확인되었다.

사진농도 스캐닝에 의한 정량 분석 및 항체 Tau-5와 반응에 대한 표준화는 이들 모노클로날 항체에 의해 정의된 에피토프에서 거의 4배로 인산화가 증가되었음이 증명하였다(도 17). 항체 AT-180 및 Tau-1은 단일 형질전환 마우스 tau4R 마우스와 상대적으로 이중 형질전환 마우스에서 단백질 tau중 그의 각각의 에피토프 의 인산화가 단지 적절히 증가되었다고 밝혔다.

이후, 본 발명자는 AD-2 및 12EB 에피토프는 미세소관 추출물중 결합 및 유리 단백질 tau상에 차별적으로 존재한다고 증명하였다. 웨스턴 블롯팅에 의해 12EB 에피토프는 결합 및 유리 단백질 tau상에서 검출할 수 있지만, 대조적으로 AD-2 포스포-에피토프는 미세소관-관련 단백질 tau에서 검출할 수 없다고 밝혔다(도 18).

AD-2 및 12EB의 에피토프는 각각 Ser³⁹⁶/Ser⁴⁰⁴(Buee-Scherer et al., 1996) 및 Ser²⁶²/Ser³⁵⁶(Seubert et al., 1995)를 포함하고, tau-미세소관 상호 작용에서 인산화에 의해 조절되는 대상으로, 중요하게 검토되었다(ramblett et al., 1993; Sengupta et al., 1998). 본 발명자의 결과는 GSK-3β의 본 발명의 조건에서 AD-2에피토프의 인산화가 이 상호작용에 필수적이라고 제안하였다.

htau40 형질전환 마우스의 CNS에서 GSK-3β의 공발현이 돌기병증(axonpathy)를 감소시켰다

tau4R 형질전환 마우스의 병리학적 특징, 즉 팽창된 돌기(axon)의 존재(Spittaels et al., 1999)가 현재 정상적으로는 운동 단백질 키네신에 의해 시냅스로 신속하게 수송되고, 또한 이병 돌기에 축재되는 시냅토피신(synathopysin)-함유 소포체를 포함한다고 증명되었다(도 19). 따라서, 과량의 단백질 tau이 tau4R 형질전환 마우스에서 미세포관에 대한 결합에 의해 돌기의 수송을 억제하는 것처럼 보였고, 이는 이어서 돌기 팽창 및 돌기병증을 유발하였다(Spittaels et al., 1999).

tau4R x GSK3β이중 형질전환 마우스의 뇌 및 척수에서, 팽창된 돌기의 수는 현저히 감소하였다(도 20, 표 1). 상이한 부모의 tau 형질전환 종으로 수득된 이종 형질전환 마우스에서 동일한 결과를 관찰하고(Spittaels et al., 1999) htau40-2 x GSK-3β라고 명명하였다(표 1). 동시에, htau40 형질전환 마우스에 신경성 위축증에 대한 증상인 위축성 섬유 및 근다발성 위축이 이중 형질전환 마우스에서는 현저하게 감소하였다. htau40-1 x GSK3β마우스의 (대퇴) 사두근(quadriceps)은 htau 40 동물에서 병인 표시인 소모성의 어느 근육도 없었다(도 20)(Spittaels et al., 1999).

GSK-3β의 공발현이 htau40 형질전환 마우스의 운동성 장애를 구하였다

3마리의 상이한 htau4R 형질전환 파운더 종에서 돌기병증 및 심각한 운동장애 모두는 인간 htau4R 형질전환 단백질의 발현 수준과 직접적으로 관련되었다 (Spittaels et al., 1999). GSK-3β의 공발현의 표현형의 운동성 측면에 대한 효과를 htau40-1, GSK-3β 및 야생형 마우스에 비교하여 htau40 X GSK-3β이중 형질전환 마우스에서 5개의 상이한 시험에 의해 평가하였다(도 21).

결과, 하나의 변수를 제외한 로드-워킹 시험(rod-walking test)에서, htau40 X GSK-3β이중 형질전환 마우스는 단일 부모 종보다도 모든 시험에서 현저하게 반응을 나타내었다(도 21). 흥미롭게, 시험은 또한 단일 형질전환 마우스의 중요한 특성을 밝혀냈다.

"정립반사(uprighting reflex)"에서, 단일 tau-4R 형질전환 마우스의 명확한 증거인 뒤집혔을 때 되돌려 지는데 필요한 시간(도 21a)은 htau40x GSK-3β이중 형질전환 마우스에서 거의 완전하게 교정되었다(도 21a)

포스트 스윔 시험(forced swimtest)(도 21d) 및 그리드-행 시험(grid-hangtest)에서, 이중 형질전환 마우스는 야생형 마우스와 같이 그리고 단일 htau40 및 단일 GSK-3β 마우스에서보다 현저하게 이행하였다(eh 21b, e).

가장 분석하기 어려운 것은 두개의 독립된 변수: 로드에서 떨어진 마우스의 수(도 21b) 및 로드상에 남아있는 시간(도 21c)을 측정한 로드-워크 시험이었다(rod-walking test). 첫번째 변수는 단일 tau4R 및 이중 형질전환 마우스를 명확하게 차별화시키지 못했고, 이는 GSK-3β공발현에 의해 영향을 받지 않은 성질인 모든 tau-4R 형질전환 마우스가 로드상에 남아있을 수 없다는 것을 증명하였다. 한편, 단일 tau4R 형질전환 마우스에서 현저히 감소된 시간과는 대조적으로 이중 형질전환에서 마우스가 로드상에 남아 있는 시간은 야생형 마우스의 것으로 회복되었다(도21c). 두개의 변수가 상이한 행동 양식, 운동 능력 및 가능성을 반영하기 때문에, 추가로 다른 수단에 의해 노화의 추가적 효과와 함께 심도있게 이를 분석하는 것이 흥미로울 수 있다.

흥미롭게도, GSK-3β형질전환 마우스는 야생형 마우스와는 상대적으로 3개의 정신운동성 작업에서 저하된 운동 능력을 보이는 반면, 이중 형질전환 마우스는 항상 단일 htau40 마우스보다도 더욱 성공적이었다. 이들 기록은 인간 단백질 tau와의 공발현은 지구력(endurance), 체위안정성(postural stability), 협조운동(motor coordination), 평형유지 및 근력 측정에서 측정된 바와 같이 GSK-3β의 발현이 형질전환 마우스의 운동성에 이미 작용을 하지만, 더욱 확장되거나 심지어는 완전한 tau-4R 형질전환 마우스의 표현형을 지켰다.

척수의 전체 횡단면(두께 6μm ) 및 오른쪽 반구피질의 관상단면(두께 40μm )중 팽창된 돌기의 수를 나타낸다. 단면으로부터 해마를 통해 뇌 신피질중 팽창된 돌기의 수를 카운팅하였다. 도은법(silver impregnation staining )(마우스형마다 9개의 단면 카운팅) 및 SMI-32 면역염색법(마우스형마다 9개의 단면 카운팅)에서 유사한 결과를 수득하였다. 사용된 마우스는 3개월된 것이었다.

Kruskal-Wallis 분석은 htau40 단일 형질전환 마우스 한배새끼와 비교하여 htau40x GSK-3β이중 형질전환 마우스의 척수 및 반구피질중 팽창된 액수의 수가 감소하였음을 밝혀냈다. (*) htau40-1 H-htau40-1H x GSK: p=0.0181, htau40-2 H-GSK:=0.0073.(**) htau40-1H-htau40-1 H x GSK:p=0.0063; htau40-2H-htau-2H xGSK: p=0.017.

WT는 야생형 마우스, n은 분석한 마우스의 수이다.

GSK-3β가 뇌에서 단백질 tau를 과인산화할 수 있는 주요한 키나아제라는 가설은 마우스 thy1 유전자 프로모터를 사용한 형질전환 마우스의 뇌중 본질적으로 활성 인간 키나아제, GSK-3β[S9A]의 과잉발현에 의해 최초로 생체내에서 접근되었 고 시험되었다. 트랜스진은 뇌에서 효소적으로 활성이고 해마 및 뇌의 뉴런에서 주로 발현되어, 총 GSK-3β키나아제 작용에 약 두배였다. 어린 GSK-3β[S9A] 형질전환 마우스의 뇌로부터 추출된 쥐 단백질 tau는 웨스턴 블롯팅에 대하여 일부의 AT-180 면역반응 그러나 약하거나 부재의 AT-8 반응과 함께, 더욱 저속의 전기영동 이동을 갖는 이성체의 존재에 의해 명백해진 바와 같이, 다수 과인산화되었다. 7 및 16 개월된 더욱 나이든 마우스의 시험에서, 명확하게 지연된 전기영동 이동 및 강한 AT-8 면역반응을 갖는 내성적인 단백질 tau 이성체가 뇌에서 입증되었다. 넓은 밴드로서 8% 폴리아크릴마이드 겔상에서 이동한 쥐 단백질 tau의 이성체는 항체 PHF-1 및 Tau-5와 반응하였다. GSK-3β-매개된 과인산화에 의해 유발된 증가된 PHF-1 면역반응은 이 에피토프내 포함된 위치 396 및/또는 404번에 세린 잔기의 과인산화때문일 수 있다(Otvos et al.,1994). 시험관내 연구는 이들 및 다른 에피토프의 과인산화가 tau 이성체가 더욱 저속으로 이동하게 한다고 나타내었다.

형질전환 마우스에서 내성적인 마우스 단백질 tau 및 GSK-3β[S9A]에 대한 기질로서 인간 tau 단백질을 조사하는 이유는 많고 실용적이기 때문이다. 명확하게는, 단백질 tau상의 인산화된 에피토프를 검출하기 위해 사용되는 모든 전형적이고 특이적인 항체가 인간 단백질에 대하여 지시된다. 또한, tau-병증에서 내성적인 쥐의 단백질 tau의 관여에 대한 증거는 부족하다.

따라서, 인간 단백질 tau의 인산화를 조절하는 GSK-3β의 능력을 이중 형질전환 마우스, 즉 인간 tau40 단백질 이성체 및 인간 GSK-3β[S9A] 돌연변이 키나아제를 공발현하는 마우스를 생산하여 조사하였다. 결과, 가장 긴 인간 단백질 tau 이성체, 즉 2 N-말단 인서트(insert) 및 4개의 미세소관 결합 리피트를 포함하는 인간 단백질 tau40를 과잉발현시키는 형질전환 마우스를 제조하였다. 동일한 형태의 유전자 프로모터 작제물을 사용하여 뇌중 동일한 뉴런내에서 균등한 양 트랜스진의 발현을 확인하였다. 단일 및 이중 형질전환 마우스에서, 인간 tau 단백질은 가장 고도의 발현 형질전환 마우스 계열(line)의 중에서 총 단백질 tau의 60%를 차지하였다.

HT-7을 사용한 면역검출로 인간 tau 형질전환 마우스에 대한 선행의 보고와 유사한, 돌기 염색외에도 세포체가지돌기(somatodendritic) 위치 결정(Gotz et al.,1995) 및 중추 뉴런중 내성적인 단백질 tau의 유사한 위치결정을 밝혀냈다(Tashiro et al.,1997).

교차교배로 유전자형에 의해 확인되고 웨스턴 블롯팅에 의해 인간 단백질 tau40 및 GSK-3β[S9A]를 공발현하는 것으로 증명된 예측된 수의 이중 형질전환 마우스 자손를 수득하였다. 이중 형질전환된 마우스의 뇌에서, 단백질 tau의 명확하고 강한 과인산화는 5주령의 어린 것에서도 항체 AT-8 및 AT-180과 강하게 반응하는 더욱 저속 이동 이성체의 존재에 의하여 입증되었다. 세린 199 및/또는 202 잔기를 포함하는 항체 AT-8의 에피토프 및 트레오닌 231을 포함하는 항체 AT-180의 에피토프는 다른 잔기에서는 추가로 인산화되지 않으면서, 풍부하게 인산화되어 더욱 저속으로 이동하는 tau 단백질을 유도하는 것을 입증하였다. 수개의 부위의 인산화에 의해 Tau가 미세소관에 결합하는 것을 제거하였고(Mandelkow et al., 1995, Trinczek et al.,1995, Preuss et al., 1997), 이중 잔기 Thr231이 주로 중요하였 다(Sengupta et al., 1998). 전기영동에 앞선 탈-인산화는 AT-8 및 AT-180을 파괴하였고, 항체 Tau-1과의 반응을 증가시켰고 단백질 Tau의 전기영동 이동성을 증가시켰다.

인간 GSK-3β[S9A]에 대하여 코딩하는 cDNA(Sutherland et al., 1993;Stambolic and Woodget, 1994)를 마우스 thy1 유전자에 결찰시켰다(Moechars et al., 1996). Pvul-Notl 제한 단편을 0.5일령 FVB/N 무세포핵 마우스 배내로 미세주입하였다. 형질전환 파운더를 Stul-제한된 마우스 꼬리-생검적(biopt) DNA의 서던 블롯팅에 의해 확인하고, 전향 프라이머 5'CAAGGTCCCCGTTTCTCC3' 및 후향 프라이머 5'CAGGGGATAGTGGTGTGG3'을 포함하는, PCR에 의해 수득된 701bp의 프로브와 혼성화하였다. FVB/N 유전자 정보에 기초하여 마우스 thy1 유전자에 위치하는 전향 프라이머 5'CCCCACCACAGATCCA3' 및 인간 GSK-3β에 위치하는 역향 프라이머 5'GCTGCCGTCCTTGTCTCT3'으로 꼬리-생검정 DNA상에서 교배된 형질전환 자손의 일반 유전자화를 수행하였다. 인간 Tau40을 마우스 thy1 유전자에 결찰시켰다. Pvul-Notl 제한단편을 미세주사하고 형질전환 파운더를 Stul-제한된 마우스 꼬리-생검정 DNA의 서던 블롯팅에 의해 확인하였다. 마우스 thy1 유전자에 위치하는 전향 프라이머 5'CCCCACCACAGAATCCA3'및 인간 tau40 cDNA에 위치하는 역향 프라이머 5'GCCCCCCTGATCTTTCC3'으로 PCR에 의해 135bp의 프로브를 수득하였다. FVB/N 유전정보로 교배된 정해진 유전자형의 형질전환 자손을 꼬리-생검점 DNA상에서 인간 tau40 유전자에 위치하는 전향 프라이머 5'CTGGGGCGGTCAATAAT3' 및 마우스 thy1 유전자에 위치하는 역향 프라이머 5'CAAGGTCCCCGTTTCTCC3'으로 PCR을 수행하여, 231 bp의 앰플리콘을 수득하였다.

뇌 추출물중 GSK-3β[S9A] 단백질의 수준은 모노클로날 항체 TPK I/GSK-3β(0.1μg/㎖)과의 웨스턴 블롯팅에 의해 추정되었고 인간 htau40 단백질 수준은 모노클로날 항체 HT-7(0.5μg/㎖)과의 웨스턴 블롯팅에 의해 추정되었다. 면역침전(immunoprecipitation) 및 이온교환 수지 FPLC(Mono S)(Pharmacia, Uppsala, Sweden)에 의한 분획 후 키나아제 효소 작용을 뇌균질액상에서 측정하였다(Van Lint et al., 1993).

뇌의 면역조직학법에 대하여, 마우스를 넴뷰탈(nembutal)로 마취시키고 파라포름알데히드(4% v/v) 또는 메타카른(MC)(50% 메탄올, 30% 클로로포름, 10% 아세트산)으로 심장내로 관류시켰다. 뇌를 밤새도록 액침(immersion)-고정시키고, 탈수시키고 파라핀내 포매시켰다(달리 언급되지 않는 경우에 한하여). 마이크로톰 (microtome) 단면(6μm)을 탈납(dewax)하고, 수화시키고 차단액, 즉, 3% BSA, 트리스 완충 염수(TBS)(50mM 트리스, pH 7.4, 0.15M NaCl)중 10% 정상의 염소 혈청과 인큐베이션하였다. 1차 항체와 12시간동안 차단액중 컨쥬게이트된 2차 항혈청과 1시간동안 인큐베이션하고 Strep-ABComplex/HRP 시스템(Daka A/S, Denmark)으로 면역반응을 증가시켰다. MAP2(1/400)에 대한 모노클로날 항체는 수상돌기를 표지하기 위하여 사용하였다.

htau40 형질전환 마우스에서 인간 tau의 면역조직학적 검출을 위해, 파라포름알데히드(PBS중 4%) 고정된 무-부유 비라톰(viratome) 슬라이스(40μm)를 24웰 Costar 세포 배양 플레이트에서 1시간동안 300㎕의 차단액(상기 참조) 및 밤새도 록 차단액중 250-300㎕의 1차 항체(HT-7, 2.5μg/㎕; AT-8, 2.5μg/㎕; AT-8, 2.5μg/㎕; PHF-1, 1/50)와 연속하여 인큐베이션하였다. 이후, 뇌단면을 500㎕ TBS(3x5')으로 세정하고, 1시간동안 2차 항체와 컨쥬게이트된 비오틴(1/10000)과 인큐베이션하고, 세척하고(3x5') 500㎕의 0.05M Tris-HCl로 5분동안 전처리하였다. 이 조직 단면을 30분동안 300㎕ Strep-ABComplex/HRP(15㎖당 양 용액 1방울, 0.05㎖ 0.05M Tris-HCl)중에 침지시킨 후 세척하고(3x5') 500㎕의 0.05M Tris-HCl로 5분동안 전처리하고 DAB로 염색하였다.

웨스턴 블롯팅을 위해, 뇌조직을 억제제를 포함하는 2㎖의 MES 완충액, 즉 0.1M MES(pH 6.4), 0.5mM MgCl₂, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1mM DTT, 5μg/㎖ 레우펩틴(leupeptin), 5μg/㎖ 펩스테인(pepstain), 1μM 오카다산(okadaic acid), 200μM PMSF, 20mM NaF, 200μM 소듐 오르토바나데이트, 5μg/㎖ 소이빈 트리신 억제제, 1% 트리톤-X-100, 1% 소듐 데속시콜레이트 및 0.1% SDS중에서 균질화하였다. 원심분리(4℃에서 30분동안 100,000g) 후, 상등액의 일부를 변성시키고 분리에 앞서 트리스-글리신 완충 폴리아크릴아미드 겔(8% SDS-PAGE)(Novex, San Diego, CA)상에서 희석시키고 니트로셀룰로오스 겔로 이동시켰다. 하기 항체를 사용하였다: 모노클로날 AT-8 및 AT-180(1μg/㎖), PHF1(1/25) 및 Tau-5(1μg/㎖). 신호를 사진농도계로 정량화하고 포스페이트-독립 항체 Tau-5와의 동일한 블롯팅상에서 수득된 신호로 표준화하였다.

마우스 이뮤노글로블린이 웨스턴 블롯팅(~50KDa)에 대한 AT-8 및 AT0-180 면 역반응을 방해하기 때문에, GSK-3β형질전환 마우스의 뇌균질액을 2.5시간동안 4℃에서 부동 단백질-G(Pierce, Illinois, USA)와 인큐베이션하고 원심분리(8000rpm, 5분, 4℃)에 의해 마우스 IgG로부터 정제하였다. 상등액을 변성시키고 전기영동 분리에 앞서 희석시켰다.

tau 단백질을 탈인산화하기 위하여, 뇌균질액을 알칼리성 포스포타아제 (Boegringer Manngeim)를 포함하는 탈인산화 완충액(Boegringer Manngeim)중에서 희석시키고 3시간동안 37℃에서 완만하게 교반하였다. 겔상에 로딩되는 샘플을 상기와 같이 제조하였다.

항체 HT-7(인간 tau로 향함), AT-8(인산화된 Ser199 및/또는 Ser202(Biernat et al., 1992)로 향함) 및 AT-180(인산화된 Thr231(Goedert et al., 1994)로 향함)를 벨기에 켄트에 소재하는 이노게네틱스사(Innogenetics)로부터 구입하였다. 항-TPKI/GSK-3β는 영국, 노키검에 소재하는 어피니티사(Affinity); Tau-5(tau로 인지된, 포스페티트-독립)을 캘리포니아주 샌디에고 벡크톤 디키슨사(Beckton Dickinsom); Tau-1(비인산화된 Ser199 및 Ser202(Biernat et al., 1992)로 향함)을 독일에 소재하는 베링거 만하임사(Boehringer Manngeim) 및 2차 항혈청으로 컨쥬게이트된 비오틴을 캘리포니아주에 소재하는 바이오라드 랩사(Biorad Labs)로부터 구입하였다. PHF1(인산화된 Ser396 및 Ser 404로 향함)(Otvos et al.,1994)은 P.Davis로부터 기증받았다.

마우스 Tau 좌위를 표적하기 위한 작제물의 합성

3'loxP 및 포스포글리세레이트 키나아제(PGK 프로모터)에 의해 유도된 하이드로마이신 B 포스포트랜스퍼라아제 유전자를 코딩하는 1.9kb Not I 단편을 먼저 pBluescript 벡터의 BamHI 부위내로 클로닝하였다. 다음으로, 마우스 Thy1 프로모터에 의해 유도된 성인 Tau의 가장 긴 이성체를 코딩하는 인간 tau cDNA를 함유하는 8kb Mlu IβAat II 단편을 pGEM lox 벡터로부터 5'lox 부위와 함께 절단하고 Bluscript 벡터의 SmaI 부위내로 서브클로닝하였다(Thy-I Tau 40 작제물로서 언급됨). 이 재조합 벡터로부터 10kb, SalIβNot I 단편을 마우스 Tau 유전자의 엑손 I의 유일한(unique) Nco I 부위내로 도입하였다. ES 세포내로의 전기충격 앞서, 이 표적 벡터를 Not I 제한효소 및 및 정제된 겔로 선형화였다. 전기영동법 및 UV 분광광도계를 사용하는(여기에서, O.D.는 260nM에서 측정하였다) 광학밀도법 모두에 의해 표적 벡터의 수율을 분석하였다.

ES 세포 배양, 선별 및 유전자화(genotyping)

ES 세포주 E14(Hooper et al., 1987)를 비필수아미노산, 20%(w/v) 소 태아 혈청, 0.1mM 2-메캅토에탄올 및 1mM 소듐 피루베이트를 포함하는 Glasgow ME 배지중 미토마이신-처리된 STO 섬유아세포상에서 배양하였다. 트립신화된 ES 세포(1.5-2x10⁷)를 500㎕ 배양 배지중에 재현탁시키고 0.4cm 거리의 전기막대의 전기충격 큐벳(cuvettes)중 200V 및 960μF로 세팅에서 전기 펄스기(Biorad Labs.)를 사용하여 10 내지 15μg의 선형화된 표적 DNA로 전기충격시켰다. 전기충격화된 ES 세포를 25cm² 플라스크중에서 미토마이신 처리된 STO 섬유아세포상에 접종하고 40시간 후, 배지를 100μg/㎖의 하이그로마이신 B를 함유하는 배지로 치환하였다. 전기 충격 후 10 내지 14 경과후 하이그로마이신 내성 콜로니를 선별하고 추가로 유전자화를 위해 확장시켰다.

선별된 ES 세포주로부터 세포를 분리하고 10μg을 4 내지 6시간동안 원하는 제한 효소로 분해하였다. 밤새도록 전개된(overnight run) 0.7% 아가로스 겔상에서 14시간동안 2V/cm 메카니즘에서 전기영동에 의해 분해물을 분리하여 밤새도록 전개시켰다. 다음날 겔을 에티디움 브로마이드로 염색시키고 촬영하고 나일론막에 모세관 이동을 위해 프로세싱하였다. 베이킹(baking) 및 예비혼성화시킨 후, 2-5x10⁶ cpm/㎖ 농도로 방사선표지된 프로브와 혼성화한 후 60℃에서 밤새도록 유지시켰다. 혼성화를 6 x SSC, 5 x Dengardt's 용액, 1% SDS, 0.1% 헤파린, 10% 덱스트란 설페이트 및 0.1% 연어 정자 DNA중에서 수행하였다. 막을 0.3 x SSC, 0.5% SDS중에서 1시간동안 60℃에서 세척하고 70℃에서 방사능 노출을 위해 방치하였다.

서던 블롯팅에 의한 유전자화

서던 블롯팅을 위해 10μg의 게놈 DNA를 37℃에서 5시간동안 분해하고 0.7% 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 분리하였다. DNA를 10 x SSC(1.5M 염화나트륨, 150mM 소듐 시트레이트, pH 7.2)와 함께 나일론막에 모세관 이동시켰다. 막을 80℃에서 2시간동안 베이킹하고, 6시간동안 60℃에서 6 x SSC, 4 x Dengardt's 용액, 1% SDS, 100μg 연어 정자 DNA, 10% 덱스트란 설페이트 및 0.05% 헤파린중에서 예비 혼성화시켰다. 2-5 x 10⁶ cpm/㎖ 농도로 표시된 [³²P]-표지된 DNA 프로브로 충진된 동일한 용액중에서 60℃에서 밤새도록 수행하였다. 방사선 노출에 앞서 1-7일동 안 -70℃에서 스크린을 증가시키면서 60℃에서 1시간동안 0.5% SDS로 충진된 0.3 x SSPE중에서 세척하였다.

ES 세포주를 유전자화하기 위하여 상이한 프로브를 설계하였다. 상기 언급된 Thy1-Tau-40 프로브, 하이그로마이신 프로브(Lieve Umans, Lutgarde Serneels and Anton Roeborek 기증) 및 3' 프로브. 후자의 것은 Bluescript 벡터(Hirokawa, 1997 기증)에 클로닝된 마우스 Tau 유전자의 엑손 1 및 2 사이의 인트론 및 엑손 1을 포함하는 13kb EcorV-Hind III 단편의 BamHI-Kpn I 제한에 의해 제조하여 외부 프로브를 수득하였다. 수득된 3' 외부 프로브를 겔로부터 정제하고 선별 배지를 함유하는 하이그로마이신 상에서 배양된 전기충격화된 ES 세포의 첫번째 스크리닝에 사용하였다. 이 프로브는 작제물밖에서 부위를 인식하기 때문에, 상동적 재조합이 발생하였는지 여부를 파악하는데 도움이 된다(도 1). 작제물의 5'부위를 조사하기 위하여 사용되는 ThyI 프로브는 ThyI DNA의 ApaI 분해에 의하여 수득하였다(Prof. Van Der Putten).

PCR에 의한 유전자화

하기 두 셋트의 프라이머를 사용하여 이중 PCR에 의하여 마우스 thyI-Tau40 형질전환 마우스에 대한 유전자화:i) 마우스 thy1 유전자 프로모터내 P16 전향 프라이머: 5'GCCCCCCTGATCTTTCC3'를 인간 Tau-40 cDNA내 NE199 역향 프라이머 5'CCCCACCACAGAATCCA과 조합하여 135bp 앰플리콘을 수득하고 ii) 인간 Tau-40 cDNA내 NE200 전향 프라이머: 5'CTGGGGCGGTCAATAAT3'을 마우스 thy-1 유전자내 위치하는 P62 역향 프라이머, 5'CAAGGTCCCCGTTTCTCC3'과 조합하여 213bp 앰플리콘을 수득 하였다. PCR 프로그램은 1분간 95℃에서 30회 변성, 1분간 60℃에서 어닐링 및 15초동안 72℃에서 신장으로 구성되었다.

웨스턴 블롯팅

뇌조직을 2㎖의 0.1M MES 완충액 pH 6.4, 0.5mM MgCl₂, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1mM DTT, 0.2mM PMSF, 20mM NaF, 0.2mM Na₃VO₄, 1μM 오카다산, 5μg/㎖ 레우펩틴, 5μg/㎖ 펩스테인, 5μg/㎖ 소이빈 트리신 억제제, 1% 트리톤-X-100 및 0.1% SDS중에서 균질화하였다(Genis et al., 1995, 최소한의 변형을 포함). 수득된 뇌추출물을 10분동안 95℃에서 변성시키고 8% SDS-PAGE상에서 분리하였다. 이후 단백질을 니트로셀룰로오스 겔로 이동시키고, 차단시킨 후, 적절하게 희석된 모노클로날 및 폴리클로날 항체와 프로빙시켰다. 사용된 항체 모두는 1:1000로 희석된 HT-7 모노클로날 항체(BR-1, 클론 HT-7, Innogenetics) 및 Tau-5 모노클로날 항체(60101A, Pharmigen)였다.

결과

Thy-1 Tau 40

Thy1 프로모터를 사용하여 형질전환 마우스의 뇌에서 인간 Tau 40 cDNA의 발현시켰다. 10회의 만남(session)으로 46마리의 강아지를 수득하였다(17 F1 위장 임신한 암컷내로 이동된 450개의 주사된 FVB 난모세포로부터). 서던 블롯팅 기술에 의해 유전자화하여 46마리의 강아지중 5를 인간 Tau 40 파운더로서 확인하였다(도 2). 이중 PCR을 사용하여 추가로 유전자화하여 5마리의 마우스를 파운더로서 확인 하였다. 파운더 Thy-1 Tau40/4의 F1 자손은 조기사망하였고 완전 변종은 2개월내 죽었다. 파운더 Thy-1 Tau 40/3은 정상적으로 번식하지 못했고 그 결과 3마리의 파운더 계열이 생존하였고 '유전적으로" 건강하게 나타났다. 웨스턴 결과는 모든 형질전환 계열에서 가장 긴 인간 Tau 이성체를 나타내는 ±70kDa Tau 단백질을 나타냈다(도 3). 모든 파운더 계열의 트랜스진 발현은 가장 높은 발현을 나타내는 라인 1, 근접하게 라인 2 및 라인 5와 관련하에 유사한 수준에 도달하였다. Thy-1 Tau 40/5의 계열은 동형 계열로 교배된다.

PAC2 인간 Tau 유전자 클론

간헐야 전기영동(pulsed-field gel electrophoresis(PFGE))에 의해 분리된 제한 단편의 분석에 의해 정제된 PAC2 클론을 특징화하고 PCR에 의해 제조된 프로브를 사용하여 서던 블롯팅하여 확인하였다(참조 물질 및 방법). 희유-절단 제한 효소를 사용하여 상이하게 분해한 결과를 인간 Tau 유저자 제한효소지도상에 나타낸다(도 4). PFGE에 의해 크기에 따라 분류된 PAC2 클론은 약 200kb였고 전체 인간 Tau 단백질을 포함하였고, 상이한 프로브를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 유전자의 5', 중간 및 3' 부위를 확인함을 확인하였다. 수개의 효소를 사용하여 Tau 유전자외의 작제물을 선형화하고, 본 발명자는 Sal1 및 NotI 효소로의 제한분해로 각각 4 및 5 밴드를 수득하였지만, Pme1는 유전자를 2회 분해하고 Cpo1은 클론을 선형화한다는 것을 발견하였다(도 5). PFGE상에서 분석된 Cpo1과 NotI 및 Sal1의 PAC2 DNA의 이중 분해는 NotI 및 Sal1의 효소의 단일 분해에 의해 생성된 단편중 하나가 분해된다고 증명하였으나 수행된 서던 블롯팅은 Cpo1은 인간 Tau 유전자중 어느 부분 도 분해하지 못했다고 증명하였다. 이들 분석의 도움으로 PAC2 DNA는 인간 Tau 유전자의 분절없이도 Cpo1에 의해 단지 선형될 수 있음을 결론지을 수 있었다.

선형화된 DNA를 최소한의 변형을 포함하고 (다이알리시스 막의 단점중의 하나) 미세주사를 위해 요구되는 1ng/㎕ 농도의 낮은 용출 용적으로 DNA를 수득할 수 있기 때문에 QIAGEN 칼럼이 가장 효율적임을 발견하여, Qiagen 칼럼 및 상이한 크기의 포어(pore)의 다이알리시스 챔버[Millipore Purification Columns, Spectra ProCE Dispodialyzer of Spectrum]을 사용하여 정제하고 수득하였다. PCR에 의해 유전자화하여 9마리중 2마리를 PAC2 인간 Tau 유전자 파운더로서 확인하였다. PCR이 어느 결과도 나타내지 않았지만 웨스턴 블롯팅에 의한 연구에서와 같이 마우스에서는 어느 발현도 관찰되지 않았다.

넉인-넉아웃 표적된 벡터

loxP-PGK-하이그로마이신 작제물을 NotI에 의해 pGEM으로부터 절단하고 Bluescript 벡터의 BamGI 부위내로 결찰시켰다. 4.7kb의 작제물로 DH5α세포를 형질전환하여 스크린된 20개중 2개의 양성 콜로니를 수득하였다. Sal1 및 Scal 효소로 제한분석하여 T7 프라이머와의 서열화에 의해 확인되는 결찰이 오른쪽 배향으로 발생하였음을 나타내는 예정된 밴드를 수득하였다. loxP 위치를 포함하는 8kb Thy-1 인간 Tau 40 작제물(참조 물질 및 방법)을 상기 bluescript 벡터의 SmaI 부위내로 서브클로닝하였다. 형질전환후 스크린된 20개의 콜로닝중 5개가 인서트를 포함하였다. ApaI, EcorV 및 Xmn1 효소를 사용한 제한 분석으로 원하는 배향으로 Thy1 Tau 40 인서트를 포함하는 2개의 콜로니를 확인하였고, 추가로 프라이머 T7 및 NE201(PGK내 위치하는 서열)과 서열화하여 확인되었다. 다음의 작제물 합성 단계는 10kb Sal1-Not1 단편을 마우스 Tau 유전자중 엑손 1의 유일한(unique) Nco1 부위내로 도입하는 것을 포함한다. 11개의 콜로니를 스크리닝하고, 이중 2개가 형질전환후 인서트를 포함한다는 것을 발견하였다. 프라이머 NE201(5'GATGTGGAATGTGTGCGA3'), NE260(5'CGCCAGGAGTTTGACA3')(마우스 엑손 1의 5'부위에 위치하는 서열), 및 NE261(5'CTCATTCCTCCCACTCAT3')(PGK-하이그로마이신 작제물의 5' 말단에 위치하는 서열)을 사용하여 서열화하여 2개의 예정된 배향을 확인하였고, 이중 하나는 오른쪽 배향을 가졌다. 도 8은 작제물을 제조하는 방법을 전체적으로 나타낸다. 하기에나타내는 바 오른쪽 배향으로 완전 작제물의 존재를 나타내는 바와 같이 다양한 효소를 사용하여 제한 분석을 수행하였다(도 9). 1kb 마커의 도움으로 크기를 추정하였다.

효소 오른쪽 배향을 갖는 인서트에 나타낸 밴드 크기

도 10은 최종 작제물의 제한효소지도를 나타낸다. 이 작제물은 효모에서 세포외 단백질을 복제하고/거나 발현시킬 수 없다. 이 최종 작제물을 NotI으로 선형 화하고 팁-100 칼럼(Qiagen)상에서 정제하여 최종 2.25μg/㎕ 농도를 수득하고 이중 8㎕은 ES 세포내로 전기충격시키기 위하여 사용하였다. 전기충격에 대하여 생존한 ES 세포를 하이그로마이신 선별 배지상에서 배양하고 4일 밤 후 잘 배양된 333 콜로니를 배양하기 위하여 선별하였다. 1차 스크리닝을 위한 외부 3' 프로브(물질 및 방법에 언급된 바와 같음)를 사용하는 서던 블롯팅의 도움으로, 본 발명자는 1차 스크린에서 6개의 강력한 양성 세포주를 선별할 수 있었다. 내부 하이그로마이신 및 ThyI Tau 40 프로브로 이들 6개의 콜로니를 2차 스크리닝한 후 그 안에 우(right) 표적된 작제물을 포함하는 하나의 세포주를 수득하였다. 또한, 사용된 ThyI 프로브는 최종적으로 양성 세포주에서 작제물의 5'부위의 존재를 확인하였고(도 11) 이 프로브와 혼성화하는 5'BamHI 단편은 작제물이 상동 재조합된 경우 예정된 BamHI-단편으로서 동일한 수의 염기쌍이 측정되었다. 블랏에서 사용된 마커는 1kb 마커이다.

이 제 1 양성 세포주를 사용하여 포배에 주사하고 추가의 5개의 강력한 세포주를 스크리닝하였다. 자궁이동에 의해 3마리의 암컷 마우스로부터 20마리의 강아지를 얻고 이중 6마리는 키메라성이었다.

참조 문헌

<110> Janssen Pharmaceutica N. V. <120> Transgenic Animals As Models for Neurodegenerative Disease <130> 52246/002 <140> PCT/EP00/06171 <141> 2000-06-30 <150> GB 9915574.9 <151> 1999-07-02 <150> GB 0002674.0 <151> 2000-02-04 <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 1 caaggtcccc gtttctcc 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 2 caggggatag tggtgtgg 18 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 3 ccccaccaca gaatcca 17 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 4 gctgccgtcc ttgtctct 18 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 5 gcccccctga tctttcc 17 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 6 ctggggcggt caataat 17 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 7 gatgtggaat gtgtgcga 18 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 8 cgccaggagt ttgaca 16 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 9 ctcattcctc ccactcat 18

Claims (51)

1. a) 인간 Tau 40 단백질을 코딩하는 핵산 서열;

   b) 인간을 제외한 동물의 신경계에서 인간 Tau 단백질의 발현을 지시 (directing)할 수 있는 서열;

   c) 동물로부터 균등한 Tau 단백질 또는 관련되거나 균등한 단백질의 발현을 저해하도록, 상동적 재조합에 의해 동물 게놈내로의 벡터의 도입을 용이하게 하기 위하여, 동물의 Tau 단백질을 코딩하는 서열 또는 그의 측면(flanking) 서열을 포함하는 표적서열; 및

   d) 상기 인간 Tau 단백질의 발현을 저해할 수 있고, Cre 재조합효소의 존재하에 상호 보존적 DNA 재조합을 수행하여 정지 서열을 제거(excision)할 수 있는 두 개의 loxP 위치에 의해 연결된 정지 서열을 포함하는 핵산 넉인-넉아웃(knockin-knockout) 벡터.
2. 제 1항에 있어서, 추가로 리포터 분자를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터.
3. 제 2항에 있어서, 리포터 분자가 하이그로마이신(Hygromycin) Pgk-hyg 마커 유전자 서열을 포함하는 벡터.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 인간 Tau 단백질의 발현을 지시할 수 있는 서열이 마우스 프로모터인 벡터.
7. 제 6항에 있어서, 마우스 프로모터가 Thy-1 프로모터인 벡터.
8. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 표적 서열이 마우스의 야생형 게놈의 Tau 서열중 엑손 1의 유일한(unique) NcoI 제한위치에 상응하는 NcoI 제한위치를 포함하는 벡터.
9. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 또는 b)의 서열중 어느 것의 전장(upstream) 및 후장(downstream), 또는 단계 a)의 서열의 후장 및 단계 b)의 서열의 전장에 위치하는 두 개의 loxP 위치를 추가로 포함하는 벡터.
10. 삭제
11. a) 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 인간 단백질을 코딩하는 핵산 서열;

    b) 인간의 제외한 동물의 신경계에서 상기 단백질의 발현을 지시할 수 있는 서열;

    c) 균등한 서열의 발현을 저해하도록, 인간 단백질의 균등물을 코딩하는 상기 동물의 서열에 상응하는 위치에서 동물 게놈내로 벡터의 도입을 용이하게 할 수 있고, Tau를 조절할 수 있는 인간 단백질의 균등물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 측면 서열을 포함하는 표적 서열; 및

    d) 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 상기 단백질의 발현을 저해할 수 있고, Cre 재조합효소의 존재하에 상호 보존적 DNA 재조합을 수행하여 정지 서열을 제거(excision)할 수 있는 두 개의 loxP 위치에 의해 연결된 정지 서열을 포함하는 핵산 넉인-넉아웃(knockin-knockout) 벡터.
12. 제 11항에 있어서, 인간 단백질이 인간 Tau 단백질을 인산화시킬 수 있는 벡터.
13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 인간 단백질이 당원 합성효소 키나아제-3β(glycogen synthase kinase-3β; GSK-3β)인 벡터.
14. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 단계 a)의 핵산 서열이 cDNA 서열인 벡터.
15. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 단백질의 발현을 지시할 수 있는 서열이 마우스 프로모터인 벡터.
16. 제 15항에 있어서, 프로모터가 Thy-1 프로모터인 벡터.
17. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 단계 a) 또는 b)의 서열중 어느 것의 전장(upstream) 및 후장(downstream), 또는 단계 a)의 서열의 후장 및 단계 b)의 서열의 전장에 위치하는 두 개의 loxP 위치를 추가로 포함하는 벡터.
18. 삭제
19. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 따른 벡터로 형질전환, 형질감염 또는 감염된 분리된 숙주 세포.
20. 제 19항에 있어서, 세포가 인간을 제외한 동물 세포인 숙주 세포.
21. 제 20항에 있어서, 인간을 제외한 동물 세포가 인간을 제외한 포유 동물의 배아세포인 숙주 세포.
22. 제 21항에 있어서, 세포가 배아줄기 세포인 숙주 세포.
23. a) 제 1항에 따른 하나 이상의 핵산 벡터를 동물의 배아세포내로 도입하고;

    b) 단계 a)로부터의 배아를 암컷 동물내로 도입하고;

    c) 배아가 충분히 발생하고 암컷으로부터 태어날 때까지 단계 b)의 암컷을 유지시키고(sustain);

    d) 형질전환된 동물을 유지시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 형질전환된 동물을 제조하는 방법.
24. 제 23항에 있어서, 벡터를 먼저 배아줄기 세포내로 도입한 후 동물의 포배로 도입하는 방법.
25. 제 24항에 있어서, 각각 제 1항에 따른 인간 Tau를 코딩하는 벡터 및 제 11항에 따른 인간 Tau를 조절할 수 있는 단백질을 코딩하는 벡터 모두를 줄기 세포내로 도입하는 방법.
26. 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 인간을 제외한 동물이 포유 동물인 방법.
27. 제 26항에 있어서, 포유 동물이 마우스인 방법.
28. 제 23항에 있어서, 제 1항에 따른 벡터를 제 1 동물에 도입하고 제 11항에 따른 벡터를 제 2 동물에 도입하고, 제 1 및 제 2 동물을 교배시키고 자손중 인간 Tau 및 인간 Tau 단백질을 조절할 수 있는 단백질을 모두 발현하는 것을 선별하는 단계를 포함하는 방법.
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제
33. 삭제
34. 삭제
35. 삭제
36. 제 23항에 있어서, 제 2 동물내로 Cre 재조합효소를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 벡터를 도입하는 것을 추가로 포함하는 방법.
37. 제 23항의 방법에 따라 수득될 수 있는 인간을 제외한 형질전환된 동물.
38. 삭제
39. 삭제
40. 삭제
41. 삭제
42. 인간 Tau 단백질 및 인간 키나아제 모두를 발현하는 제 37항에 따른 인간을 제외한 동물에 시험 화합물을 투여하고, 화합물을 투여받지 않은 형질전환된 동물중 하나와 비교하여 Tau 단백질의 인산화 프로필을 조사하는 것을 포함하는, 인간 Tau 단백질의 인간 키나아제 매개된 인산화를 조절하는 화합물을 확인하는 방법.
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51. 제 3항에 있어서, 표적 서열이 인간 Tau 40 대립 유전자의 엑손 1의 유일한(unique) NcoI 제한위치에 상응하는 NcoI 제한위치를 포함하는 벡터.

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