ES2295283T3 - Modelos animales transgenicos para la enfermedad de alzheimer. - Google Patents

Abstract

Una construcción de DNA recombinante que comprende una secuencia codificadora que codifica ASP2 humana, y una secuencia del promotor de la calcio-calmodulina-cinasa II específica del cerebro, que está ligada operativamente a la secuencia codificadora.

Description

Modelos animales transgénicos para la enfermedad de Alzheimer.

Esta invención se refiere a animales transgénicos y a su uso como modelos de la enfermedad de Alzheimer.

Antecedentes de la invención

El principal componente proteínico de las placas amiloides encontradas en el cerebro de los pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD) es A\beta, un péptido de 4 kDa que consiste principalmente en cuarenta y cuarenta y dos residuos (A\beta_{1-40}, A\beta_{1-42}) y que se deriva de la proteína precursora del amiloide (APP). La APP puede ser escindida en el N-terminal de A\beta por una enzima llamada \beta-secretasa que genera una APP soluble y el fragmento A4CT (C99) de C-terminal. Esta proteína A4CT membranal de 99 residuos de largo (ref. 1) que es el precursor directo de A\beta contiene el dominio completo de A\beta, el dominio membranal y la cola citoplásmica de APP. Se cree que la \beta-secretasa es una proteína llamada aspartil-proteasa 2 (Asp 2). Existen pruebas contradictorias puesto que aunque es una proteína altamente homóloga, la aspartil-proteasa 1 (Asp 1) también tiene actividad de \beta-secretasa (Refs. 2, 3). Se cree que la Asp 1 puede desempeñar un papel en la amiloidogénesis de los tejidos periféricos más que de los tejidos cerebrales.

Ambos fragmentos de C-terminal de APP, A4CT y p3CT, se escinden dentro del dominio membranal por una actividad de \gamma-escisión, liberando de este modo A\beta y p3 al medio (refs. 4, 5). En las células que expresan la APP de tipo natural el sitio de \gamma-escisión es principalmente el enlace peptídico Val(40)-Ile(41) de A4CT y en una menor medida el enlace Ala(42)-Thr(43). En las células que expresan APP con las mutaciones ligadas con la enfermedad de Alzheimer familiar en Val 717 (basadas en APP770, Val 46 de A4CT) tiene lugar un aumento de la \gamma-escisión detrás de Val(42), produciendo así mayores cantidades de A\beta_{1-42} (ref. 6).

Se han intentado varios grupos para desarrollar modelos de ratón transgénico que demuestran patologías convincentes indicativas de la enfermedad de Alzheimer (AD) tales como los ratones PDAPP, Tg2576, TgAPP/Sw,1 etc. (Revisado en la ref. 7). Sin embargo, no se han producido todavía modelos de ratones transgénicos que sobreexpresen la \beta-secretasa humana (Asp 2). Esta enzima es una de las dos enzimas claves que escinden la proteína precursora del amiloide para liberar el péptido \beta-amiloide, el principal constituyente de las placas amiloides del cerebro en la enfermedad de Alzheimer. Es probable que dichos ratones desarrollen una patología convincente como la sobre-expresión de esta enzima que aumentará el nivel de escisión de la proteína precursora del amiloide en el sitio \beta. Por tanto esto representaría un nuevo modelo de enfermedad de Alzheimer ya que todos los modelos existentes de animales transgénicos se basan en la expresión de formas mutantes de genes humanos que están ligados con la aparición temprana de la enfermedad de Alzheimer (proteína precursora del amiloide y presenilina-1). Dicho modelo representaría un sistema de modelo fiel para la producción y deposición de los depósitos amiloides característicos de la enfermedad de Alzheimer.

Los resultados obtenidos dependen de la fuente del promotor y de la secuencia que codifica la proteína usada. Se ha encontrado en esta invención que el uso de un promotor neuronal específico aumentará la posibilidad del desarrollo de la patología que se asemeja a la situación clínica.

Una breve descripción de las figuras

Figura 1 - describe en forma gráfica la estrategia de clonación usada para formar el vector IRES \beta-gal

Figura 2 - los resultados muestran la expresión de LacZ y por tanto el transgén en ratones knockout en los que LacZ fue expresado bajo el control del promotor endógeno Asp2 (a y b) y en los ratones transgénicos sobre-expresores de la invención (d y e). La figura demuestra también que no se observa la expresión de LacZ en los ratones nativos (c).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona por consiguiente un animal transgénico no humano cuyo genoma incorpora una secuencia nucleotídica que codifica la proteína humana ASP2, cuya secuencia nucleotídica está ligada operativamente al promotor de la CaM-cinasa-II de ratón. Por el término "proteína ASP2" se indica una proteína o polipéptido que tiene la funcionalidad biológica básica de la proteína humana ASP2. Debería ser apreciado por una persona experta en la técnica que dicha funcionalidad biológica básica significa la capacidad de escindir la APP como se describe en esta memoria. El término proteína ASP2 incluye la forma de tipo natural de la enzima ASP2, así como las formas modificadas de la enzima ASP2. La modificación se puede realizar, por ejemplo por técnicas convencionales de biología molecular tales como la adición, sustitución o deleción de uno o más aminoácidos; o verdaderos fragmentos de la enzima ASP2, con la condición de que tales formas modificadas o fragmentos tengan la funcionalidad biológica básica de la proteína ASP2 de tipo natural. Un experto en la técnica debe ser capaz de analizar fácilmente si tales formas modificadas o fragmentos retienen dicha funcionalidad biológica básica ensayando la escisión de la proteína precursora del amiloide que es conocida como el sustrato de la enzima. Preferiblemente, sin embargo, la proteína ASP2 es la proteína de tipo natural, con la secuencia dada en la SEQ ID 1, y en la referencia 42. Preferiblemente, la secuencia nucleotídica que codifica la proteína humana ASP2 es de tal modo que codifica la proteína con la secuencia dada en la SEQ ID 1 y en la referencia 42.

La secuencia nucleotídica que codifica la proteína humana ASP2 se puede seleccionar del siguiente grupo:

a) un polinucleótido que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia polipeptídica que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 1;

b) un polinucleótido que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido de la SEQ ID
NO: 1;

c) un polinucleótido que codifica una secuencia polipeptídica que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 1;

d) un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 1;

e) un polinucleótido que tiene o que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia polipeptídica que tiene un índice de identidad de 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, o 0,99 en comparación con la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 1;

El promotor de la CamKII se describe en las referencias 32 y 33.

Los animales transgénicos de la invención pueden desarrollar placas amiloides y por tanto son útiles como un modelo de la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos.

Un "transgén" comprende un polinucleótido, aislado de la naturaleza, que ha sido manipulado in vitro y que puede ser introducido posteriormente en el genoma de la misma especie o de una especie diferente en cualquiera de las formas nativa o modificada, de tal modo que se mantiene de forma estable y hereditaria en dicho genoma. El polinucleótido codifica preferiblemente una proteína de interés, y generalmente está ligado operativamente a una secuencia reguladora. El término transgén se usa aquí para referirse al polinucleótido y a las secuencias reguladoras a las que está ligado operativamente. El transgén puede comprender además otros polinucleótidos que codifican, por ejemplo, genes indicadores con el fin de monitorizar la expresión del transgén. Un organismo en el que ha sido introducido un transgén se denomina un "organismo transgénico". Una construcción transgénica es una construcción vector que comprende el transgén.

El término "DNA transgénico" como se usa aquí se refiere al polinucleótido comprendido dentro del transgén, cuyo polinucleótido codifica la proteína de interés.

La presente invención se basa en el uso de una construcción de ácido nucleico para generar un modelo de animal transgénico para el cribado de agentes para uso potencial en el tratamiento de trastornos neurológicos, en particular la enfermedad de Alzheimer. La construcción comprende una secuencia nucleotídica que codifica la proteína humana ASP2, ligada operativamente a un promotor de la CaM-K-II de ratón. En una realización preferida, la construcción de ácido nucleico comprende un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) hacia abajo (3') del nucleótido que codifica la proteína humana ASP2, y una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen indicador hacia abajo del IRES. Este tipo de construcción se denomina bi-cistrónico, y hace posible la expresión separada de ambas, la proteína humana ASP 2, y la proteína indicadora. La proteína indicadora puede ser, por ejemplo, luciferasa, proteína verde fluorescente o sus derivados, o \beta-galactosidasa, pero preferiblemente es \beta-galactosidasa. La ventaja de una construcción de este tipo es que hace posible monitorizar la expresión de ASP2 humana al monitorizar la expresión del gen indicador. El ensamblaje de la construcción transgénica sigue métodos de clonación estándar, que son bien conocidos en la técnica (por ejemplo véase la ref. 8). El polinucleótido que codifica la ASP2 puede consistir en cDNA o DNA genómico. Si es cDNA, el cDNA a ser sobreexpresado se puede preparar a partir de un mRNA extraído de un tejido relevante, preferiblemente un tejido en el que se sabe que es expresada la proteína ASP2, o alternativamente se puede extraer escudriñando una genoteca de cDNA humano.

El DNA, junto con el promotor de la CaMKII y cualquier otro componente deseado tal como los intrones artificiales, el IRES, o un gen indicador, se pueden insertar entonces en un vector de clonación mediante digestión de restricción y ligamiento. Los vectores de clonación adecuados para el ensamblaje de transgenes son aquellos que proporcionan rendimientos aceptables de DNA. Es adecuado cualquier vector plásmido o fago disponible comercialmente que pueda llevar un cDNA y que pueda ser manipulado para contener un marcador de selección.

El promotor de la CaM-K-II está ligado operativamente a la secuencia codificadora del polinucleótido que codifica ASP2 de tal manera que permitirá la expresión temporal y espacial requerida del polinucleótido. Puede haber o no secuencias intermedias entre el polinucleótido ligado y el promotor, con la condición de que el promotor dirige la expresión del polinucleótido que codifica ASP2 ligado de esta forma a él. Los métodos para ligar de este modo las secuencias reguladoras a los cDNAs para facilitar su expresión son ampliamente conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, por ejemplo, el ligamiento directo del ácido nucleico que comprende el promotor de la CaMK-II a la región codificadora del polinucleótido que codifica ASP2. Se pueden incluir secuencias adicionales de ácido nucleico que modulan la expresión de la manera requerida. Los ejemplos de secuencias adicionales incluyen elementos potenciadores, intrón artificial y otros.

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En adición la secuencia nucleotídica del promotor de la CaMK-II, u otra secuencia reguladora, se puede modificar para aumentar los niveles de expresión. Tales modificaciones se pueden conseguir usando, por ejemplo, métodos de mutagénesis dirigida a un sitio bien conocidos en la técnica (véase ref. 8, supra).

En adición a la modificación de la secuencia de elementos reguladores para potenciar, o cambiar de otro modo, los niveles de expresión, la secuencia codificadora del polinucleótido que codifica ASP2 se puede modificar para potenciar o afectar de otro modo los niveles de expresión. Por ejemplo si el DNA transgénico procede de una especie diferente del hospedante, el uso del codón del DNA transgénico puede ser alterado para ajustarse más estrechamente al del hospedante. Es bien conocido en la técnica que diferentes organismos usan los 64 codones de codificación y terminación a diferentes frecuencias. Los codones que se usan infrecuentemente en un organismo se denominan "codones raros". Si el DNA transgénico incluye un codón que es un codón raro en el hospedante, los niveles de expresión pueden ser severamente reducidos. Una solución es reemplazar uno o más codones raros en el DNA transgénico con codones que se usan frecuentemente en el hospedante. Otras modificaciones de la secuencia de DNA transgénico incluyen modificar la secuencia polinucleotídica que rodea al codón de inicio (el codón iniciador que codifica metionina) para hacer que éste se ajuste más estrechamente a la secuencia de consenso "Kozak" (A/G CCATGG, en la que ATG en negrita es el codón de inicio; véase por ejemplo la ref. 9). En la molécula de mRNA transcrito se cree que la secuencia Kozak proporciona el entorno óptimo para la iniciación de la traducción del polipéptido.

Preferiblemente, antes de la introducción del transgén en la célula hospedante, se separan las porciones de vector mediante digestión con la enzima de restricción, por ejemplo usando los sitios de restricción del vector que flanquean al transgén. De este modo el material genético que se introduce realmente en la célula hospedante comprenderá preferiblemente la secuencia codificadora del polinucleótido que codifica ASP2 y las secuencias reguladoras a las que éste se ha ligado operativamente junto con otros componentes potenciales del transgén, por ejemplo un gen indicador. Un ejemplo de esta técnica se da en la referencia 10.

También se puede usar un sistema inducible tal como se describe en la Ref. 11, que tiene la ventaja de regular la expresión génica (inducción/represión). Por ejemplo, el sistema inducible por tetraciclina (Refs. 12, 13) utiliza dos construcciones genéticas: un promotor mínimo (PhCMV*-1) fundido con siete secuencias de un operador tetracíclico y el cDNA en cuestión; y un transgén que contiene la secuencia codificadora de la proteína trans-activadora (tTA) controlada por tetraciclina bajo el control de un promotor, por ejemplo tomado de la siguiente lista: APP humana (ref. 14); enolasa específica de neurona de rata (neuronas) (ref. 15); actina \beta humana (ref. 16); PDGF\beta humana (ref. 17); Thy 1 de ratón (ref. 18); promotor de la proteína Prion de ratón (PrP) (ref. 19); promotor de la proteína Prion de hámster sirio (ref. 20 y 21); sinapsina 1 de rata (cerebro) (ref. 22); FMR1 humano (cerebro) (ref. 23); neurofilamento humano inferior (ref. 24), medio (cerebro) (ref. 25); NEX-1 (cerebro) (ref. 26); APLP2 de ratón (cerebro) (ref. 27); alfa-tubulina de rata (ref. 28); transferrina de ratón (ref. 29); HMGCR (3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A-reductasa, oligodendrocitos) de ratón (ref. 30), proteína básica de la mielina de ratón (ref. 31), promotor de la CaM-cinasa-II de ratón (ref. 32 y 33), promotor thy-1 humano (ref. 34), promotor de la región viral temprana JC (ref. 35), o las secuencias reguladoras transcripcionales NF-L del neurofilamento humano (ref. 36). Se utiliza cada construcción para generar un ratón transgénico. El cruce de dos ratones homozigóticos genera una doble línea transgénica que expresa la tTA según el promotor elegido. Esta tTA induce la expresión del cDNA mediante la activación de PhCMV*-1, pero solamente en ausencia de tetraciclina. En presencia de tetraciclina solamente hay expresión basal.

La generación de los mamíferos transgénicos no humanos de la invención se puede llevar a cabo convencionalmente, por ejemplo como se describe en los documentos WO93/14200, WO91/19810, WO93/02189, WO89/00689, WO92/06187, EP0451700, WO92/13069 y WO89/06689.

Existen una serie de técnicas que permiten la introducción de material genético, tal como un transgén, en la línea germinal. El protocolo más comúnmente usado, y preferido comprende la inyección directa del transgén en el pronúcleo macho del huevo fertilizado (ref. 10), dando como resultado la integración aleatoria en un locus de un número variable de copias, usualmente en un ordenamiento de cabeza a cola (ref. 37). Los huevos inyectados se re-transfieren entonces a los úteros de madres receptoras pseudo-preñadas. Algunas de las crías resultantes pueden tener una o varias copias del transgén integrado en sus genomas, usualmente en un sitio de integración. Estos animales "fundadores" se reproducen entonces para establecer líneas transgénicas y para volver a cruzarse en el fondo genético de elección. Es conveniente tener la inserción del transgén en ambos cromosomas (homozigosidad) ya que esto evita la necesidad de determinar los genotipos repetidos a lo largo de la crianza rutinaria de los ratones.

Alternativamente, para la producción de ratones transgénicos, se pueden introducir los transgenes por medio de las células madres embrionarias (ES), utilizando electroporación, vectores retrovirales o lipofección para transferir el gen. Esto va seguido por la inserción aleatoria en el genoma de las células madres embrionarias pluripotentes (ES), seguido por la producción de ratones quiméricos y la subsiguiente transmisión de líneas germinales. Se han utilizado transgenes de hasta varios cientos de kilobases de DNA de roedor para producir ratones transgénicos de esta manera (por ejemplo refs. 38, 39). El último método puede ser adaptado de tal modo que el transgén se inserta en un locus predeterminado (no aleatoriamente, por ejemplo ROSA26 o HPRT) que soporta la expresión ubícua así como la expresión específica del tejido, del transgén (ref. 40).

En un aspecto, el mamífero transgénico no humano se genera por introducción de la construcción transgénica en un embrión, inserción del embrión en una madre de alquiler y dejar que el embrión se desarrolle a término.

La construcción transgénica se prepara para transferencia al animal hospedante mediante la escisión del vector que contiene la construcción y purificación del DNA (ref. 8).

La transferencia se lleva a cabo convencionalmente preferiblemente utilizando la microinyección como se describe en detalle en la referencia 8.

En un aspecto alternativo el mamífero transgénico no humano parental es producido por introducción de la construcción transgénica en las células madres embrionarias por métodos convencionales tales como precipitación de DNA por fosfato de calcio, inyección directa o electroporación (ref. 9) seguido por inyección de las células transformadas en blastocitos e inserción del embrión resultante en una madre de alquiler como se ha descrito antes.

Los animales transgénicos se pueden identificar mediante ensayos que aseguran que el cambio genotípico requerido ha sido efectuado. Esto se puede hacer de una forma adecuada, por ejemplo detectando la presencia del transgén mediante PCR con cebadores específicos, o por transferencia Southern, preferiblemente del DNA de la cola, con una sonda específica.

Una vez que se ha confirmado el genotipo deseado, se puede someter la línea de animales transgénicos a diferentes ensayos para determinar el fenotipo. Los ensayos implicados en esta caracterización fenotípica dependen de que el cambio genotípico haya sido efectuado, y pueden incluir, por ejemplo, estudios morfológicos, bioquímicos y de comportamiento. Los animales transgénicos de la presente invención pueden demostrar un aumento de la escisión de APP en el sitio \beta, llevando a mayores niveles de fragmentos de A\beta en C terminal de APP. Esto podría llevar a un aumento de la escisión \chi y a un aumento de la carga de amiloides. Los efectos fenotípicos esperados grosso modo pueden ser una reducción en la cognición que puede ser ensayada con ensayos de comportamiento convencionales tales como los de Morris Water Maze y el Y Maze.

Esta invención incluye también todas las células cultivadas procedentes del animal transgénico. Las células se cultivan in vitro. El genoma de las células puede comprender por tanto la construcción de la invención. El polipéptido humano ASP2 es expresado típicamente en dichas células en una cantidad al menos 2, preferiblemente al menos 3, 4 o 5 veces mayor que la cantidad de polipéptido ASP2 endógeno que se expresa en las células.

Las células cultivadas in vitro procedentes de un animal transgénico se pueden preparar por cualquier método adecuado. Las células son típicamente de roedor y preferiblemente células de ratón. Se pueden proporcionar por tanto cultivos de células neuronales, por ejemplo cultivos de células primarias de hipocampo. Las células se pueden utilizar para introducir otros genes de interés por cualquier método conocido (incluyendo la administración viral).

El mamífero transgénico no humano es preferiblemente un roedor tal como una rata o un ratón, más preferiblemente un ratón.

La secuencia apropiada de DNA transgénico se puede insertar en el vector por una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de DNA transgénico se inserta en un sitio o sitios apropiados de las endonucleasas de restricción por procedimientos conocidos en la técnica. Dichos procedimientos y otros se consideran dentro de las posibilidades de los expertos en la técnica.

El uso de modelos animales que sobreexpresan o carecen de más de un gen puede proporcionar importantes ideas sobre la interacción de diferentes loci genéticos en enfermedades particulares, por ejemplo la enfermedad de Alzheimer. Consecuentemente el cruce de los animales ASP2 transgénicos de la presente invención con modelos animales que sobreexpresan o infraexpresan un gen diferente puede producir modelos animales alternativos y potencialmente superiores de enfermedades tales como la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, los animales transgénicos ASP2 de la presente invención se pueden cruzar con ratones que llevan un transgén que comprende un nucleótido que codifica la proteína mutante humana precursora del amiloide K670N, M671L (la mutación "Swedish") (dichos ratones están descritos en la Solicitud de Patente Europea EP1063298). En otro aspecto, los animales transgénicos ASP2 de la presente invención se pueden cruzar con ratones que llevan un transgén que comprende un nucleótido que codifica la proteína
mutante humana precursora del amiloide. V717I (la mutación "London") (dichos ratones están descritos en la ref. 41).

Los promotores adecuados para el segundo transgén incluyen: APP humana (ref. 14); enolasa específica de neurona de rata (neuronas) (ref. 15); actina \beta humana (ref. 16); PDGF\beta humana (ref. 17); Thy 1 de ratón (ref. 18); promotor de la proteína Prion de ratón (PrP) (ref. 19); promotor de la proteína Prion de hámster sirio (ref. 20 y 21); sinapsina 1 de rata (cerebro) (ref. 22); FMR1 humano (cerebro) (ref. 23); neurofilamento humano inferior (ref. 24), medio (cerebro) (ref. 25); NEX-1 (cerebro) (ref. 26); APLP2 de ratón (cerebro) (ref. 27); alfa-tubulina de rata (ref. 28); transferrina de ratón (ref. 29); HMGCR (3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A-reductasa, oligodendrocitos) de ratón (ref. 30), proteína básica de la mielina de ratón (ref. 31), promotor de la CaM-cinasa-II de ratón (ref. 32 y 33), promotor thy-1 humano (ref. 34), promotor de la región viral temprana JC (ref. 35), o las secuencias reguladoras transcripcionales NF-L del neurofilamento humano (ref. 36).

Sin embargo, es preferible que ambas líneas precursoras de animales transgénicos comprendan transgenes que están ligados operativamente a un promotor específico neuronal, por ejemplo el promotor de la CamKII. Esto asegura que en el animal producido por el cruce, ambos DNAs transgénicos están expresados de una manera neuronal específica.

En una realización preferida, se genera un animal transgénico cruzando las líneas ASP2 de la presente invención con un animal transgénico cuyas células contienen un transgén que comprende un nucleótido que codifica la proteína humana precursora del amiloide. Particularmente preferida es cuando dicho nucleótido que codifica APP está ligado operativamente al promotor de la CamKII, o al promotor Thy 1. Dicha APP humana puede ser APP de tipo natural, o puede contener mutaciones tales como la mutación Swedish o London, o cualquier otra de las mutaciones conocidas como se describe en la ref. 7.

Dichos animales transgénicos que contienen más de un transgén en los que uno de los transgenes comprende un nucleótido que codifica la proteína humana Asp2 ligada operativamente al promotor de la CamKII son también parte de la invención, y se pueden usar como se describe en esta memoria.

El mamífero transgénico no humano o las células de la invención se pueden usar para el cribado de los agentes terapéuticos que inhiben la actividad de ASP2, y consecuentemente la producción de APP y de los depósitos de amiloides, administrando un agente terapéutico de ensayo al mamífero o al medio de cultivo celular y observando los cambios en la actividad de la ASP2. Se pueden medir tales cambios, por ejemplo, buscando una reducción en la producción de A\beta que se puede medir bioquímicamente, o buscando una reducción en la producción de placas o un retraso en la deposición de placas, que se puede medir por técnicas fisicoquímicas. La acción de los agentes terapéuticos se puede medir también por las mejoras en los ensayos de comportamiento. En la ref. 41 se dan ensayos adecuados. La invención se extiende a dicho método de cribado. Técnicas adecuadas para el tratamiento de tales observaciones están descritas en el documento WO93/14200.

Los agentes terapéuticos potenciales pueden inhibir (antagonizar) la actividad de la proteína ASP2. Preferiblemente, dicho agente terapéutico es cribado también frente a un animal transgénico que sobreexpresa la aspartil-proteasa 1, con el fin de confirmar o que el agente terapéutico no inhibe también la asp1, o que si inhibe la asp1 no hay efectos adversos debidos a esta inhibición. Un ejemplo de la producción de un animal transgénico que sobreexpresa la asp1 se da en los ejemplos de esta memoria descriptiva.

Se puede proporcionar por tanto un método para identificar un agente terapéutico para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por un aumento en la producción de APP, un aumento en los depósitos de amiloides y una disminución en la cognición, que comprende:

-

administrar a un animal de la invención una sustancia de ensayo candidato y

-

determinar si la sustancia candidato (i) previene o retrasa la aparición de la enfermedad o (ii) trata la enfermedad.

La opción (ii) puede ser ensayada determinando si la sustancia candidato produce una disminución en cualquiera de los cambios celulares o fisiológicos causados por la enfermedad. Tales cambios celulares o fisiológicos pueden incluir cambios en la producción de APP, en la deposición de amiloides, o en la cognición.

Se puede proporcionar también un método para identificar un agente terapéutico para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por un aumento en la producción de APP, un aumento en los depósitos de amiloides y una disminución en la cognición, que comprende:

-

poner en contacto una sustancia candidato con una célula de la invención, y

-

determinar si la sustancia candidato (i) previene o retrasa la aparición de los cambios celulares asociados con la enfermedad, o si (ii) produce una disminución en cualquiera de los cambios celulares causados por la enfermedad (tales como cualquiera de los cambios celulares mencionados aquí, en particular el nivel de producción de APP).

En el método en el que la sustancia candidato se pone en contacto con una célula de la invención, se puede intentar que el método identifique los inhibidores de la proteasa como los antagonistas de ASP2, o se puede intentar que identifique los agentes neuroprotectores. Es probable que las células de la invención que sobreexpresan ASP2 puedan ser sensibles a agresiones neurotóxicas tales como la privación de glutamato, cainato, suero y potasio. La inversión o prevención de los efectos de estos agentes en una célula de la invención por una sustancia candidato es una indicación de que dicha sustancia candidato puede ser un agente neuroprotector.

Las sustancias candidatos adecuadas que se pueden ensayar con los métodos anteriores incluyen productos anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos y anticuerpos injertados con CDR). Además, se pueden ensayar también genotecas combinatorias, identidades químicas definidas, moléculas pequeñas, péptidos y péptidos miméticos, oligonucleótidos y bancos de productos naturales, tales como los bancos de exposición (por ejemplo, bancos de exposición de fagos). Las sustancias candidatos pueden ser compuestos químicos. Los lotes de las sustancias candidatos se pueden utilizar en un cribado inicial, por ejemplo, de diez sustancias por reacción, y las sustancias de lotes que presentan inhibición pueden ser ensayadas individualmente.

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Los agentes que pueden invertir los cambios fenotípicos tales como un aumento en la producción de APP, un aumento de los depósitos de amiloides, y déficit en la cognición vistos en los animales transgénicos de la invención, se pueden ensayar in vivo o en preparaciones de células o de tejidos in vitro. Se pueden ensayar los compuestos utilizando los ensayos y tests usados para caracterizar la invención. Por ejemplo, después de la administración de cualquier agente terapéutico potencial, la respuesta del animal transgénico puede ser evaluada, por ejemplo, buscando una mejora en la cognición, o una disminución en la producción de APP o en los depósitos de amiloides como se describe en los ejemplos. Están establecidos métodos para el cribado de los agentes terapéuticos potenciales usando líneas celulares o animales. Se pueden utilizar metodologías ELISA o fluorescencia homogénea de resolución temporal
(HTRF).

Los agentes identificados en los métodos de cribado de la invención se pueden usar para prevenir o para tratar las enfermedades detalladas antes, en particular la enfermedad de Alzheimer. La condición de un paciente que sufre tal enfermedad puede por tanto ser mejorada por la administración de un producto de este tipo. La formulación del producto para uso en la prevención o tratamiento de la enfermedad dependerá de factores tales como la naturaleza del agente identificado y la enfermedad a ser prevenida o tratada. Típicamente se formula el agente para su uso con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo se puede formular para administración intracraneal, parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica u oral. Un médico será capaz de determinar la vía de administración requerida para cada paciente particular. El vehículo o diluyente farmacéutico puede ser, por ejemplo, una solución isotónica.

La dosis de producto se puede determinar según diferentes parámetros, especialmente según la sustancia usada; la edad, peso y condición del paciente a ser tratado; la vía de administración; y el régimen requerido. Una dosis adecuada puede variar sin embargo desde 0,1 a 100 mg/kg de peso corporal, tal como 1 a 40 mg/kg de peso corporal. Una vez más, un médico será capaz de determinar la vía de administración requerida y la dosificación para cualquier paciente particular.

La construcción transgénica, las células o los agentes terapéuticos de la invención pueden estar presentes en una forma sustancialmente aislada. Se debe entender que se pueden mezclar con vehículos o diluyentes que no interfieran con el propósito que pretenden y también se pueden considerar como sustancialmente aisladas. Por tanto la construcción transgénica, la célula o el agente terapéutico de la invención pueden estar también en una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso dicha forma comprenderá en general más del 90%, por ejemplo, más del 95%, 98% o 99%, en peso de la preparación pertinente.

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Ejemplos Generación de ratones transgénicos que expresan ASP2

El cDNA de ASP2, con la secuencia indicada en la ref. 42, se preparó de acuerdo con técnicas convencionales. Para generar los transgenes de expresión incorrecta de Asp2, se clona el cDNA de Asp2 en el vector pCamKIRESbgal.

Este vector contiene el promotor de la cinasa II\alpha dependiente de calcio-calmodulina (CamKII \alpha) de ratón, que como ha sido demostrado previamente dirige la expresión del transgén en ambos, el hipocampo y la neocorteza del prosencéfalo del ratón (Ref. 32)).

Se aisló el promotor de la manera descrita en la ref. 32 (véase la nota 20 de la referencia). Después, se aisló un fragmento del promotor SalI de 8,5 kb mediante digestión por restricción. Este fue ligado al vector Arm3 (un derivado de pBluescript con los sitios indicados que flanquean al policonector SacI-KpnI pBluescript) digerido con XhoI y SalI. Esto generó Arm3-CamKII (el sitio 5' SalI se destruye). La forma aislada 5 AS210S (un derivado del plásmido AS210 (obtenido de Stem Cell Sciences, Melbourne) contiene el fragmento IRES-bgal-intrón-poliA como un fragmento de restricción XbaI-XhoI. El sitio XbaI se convirtió en un sitio SalI (para crear AS210S), y el fragmento resultante SalI/Xhol que contiene el cassette IRES-bgal-intrón-poliA se ligó al sitio SalI de Arm3-CamKII para generar CamKII-IRES-bgal. Éste contiene los sitios únicos NotI y SalI para la inserción de los cDNAs. En el vector resultante, el promotor está hacia arriba de un cassette que contiene el sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) picornaviral (Ref. 35) y el gen de la beta-galactosidasa y señales de terminación de transcripción de SV40. El cDNA de Asp2 se insertó entonces entre el promotor de la CamKII y el IRES usando los sitios NotI y SalI. La transcripción que se inicia en el CAPsite del promotor de la CamKII\alpha y termina en las señales de poliadenilación de SV40 da como resultado por tanto un mensaje dicistrónico que codifica las proteínas APPV46F y beta-galactosidasa. La última se puede detectar fácilmente para confirmar que ha tenido lugar la expresión del transgén. La inclusión de un gen indicador de beta-galactosidasa en la construcción hace posible la detección sencilla, exacta y sensible de sitios celulares de expresión del transgén. Este proceso de clonación se muestra esquemáticamente en la figura 1.

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La construcción descrita antes se utilizó para generar ratones transgénicos por los siguientes procedimientos:

\quad

La construcción se preparó y se purificó.

\quad

Se indujeron los ratones hembras a superovular y se recogieron los embriones.

\quad

Se microinyectó el DNA en el pronúcleo de los embriones.

\quad

Se transfirieron los embriones a ratones pseudopreñados (ratones hembras previamente apareados con machos vasectomizados).

\quad

Se dejó que los embriones se desarrollaran normalmente y nacieron ratones.

\quad

Los ratones fundadores fueron identificados por transferencia Southern y PCR y se reprodujeron.

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Las líneas adecuadas de ratones son como sigue:

\quad

Ratones donantes (embriones para inyección en el pronúcleo): híbridos [C57B1/6 x CBA]F2

\quad

Ratones aceptores: híbridos [C57B1/6 x CBA]F1

\quad

Ratones para reproducción posterior: C57B1/6

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Confirmación de que los ratones transgénicos expresan Asp 2 de una manera neuronal específica

La construcción utilizada para expresar el cDNA de Asp2 se diseñó para hacer posible la monitorización de la especificidad de expresión del tejido tiñendo las secciones de los animales transgénicos para determinar la actividad de \beta-galactosidasa. Con el fin de comparar la expresión del transgén con la expresión de Asp2 endógena, se generó un ratón knockout con el gen indicador LacZ utilizado en un vector que comprende el promotor Asp2 endógeno. Esto proporcionó una forma sencilla de comprobar la expresión del promotor Asp2 endógeno, tiñendo una vez más para determinar la actividad de \beta-galactosidasa.

Se recogieron los cerebros completos de la línea sobreexpresora de Asp2 y de la línea comparativa knockout y se sometieron a la tinción de la \beta-galactosidasa.

Se cortaron secciones parasagitales con el fin de mostrar claramente la distribución de la tinción dentro del cerebro. Los resultados se muestran en la figura 2. No se observó tinción de LacZ en los cerebros de tipo natural (fig. 2c). Las secciones de cerebro del ratón knockout muestran claramente la expresión de LacZ localizada en el hipocampo y corteza y la reducción de la expresión de LacZ en el cuerpo estriado caudado, médula y prosencéfalo (Figs. 2a,b). En los cerebros de los ratones sobreexpresores de Asp2 (Fig. 2d, e), la expresión de LacZ está claramente localizada en el hipocampo y en el cuerpo estriado caudado en la línea 17 con una tinción más fuerte que se extiende a la corteza en la línea 4. El modelo de expresión del transgén mostrado en las líneas 17 y 4 bajo el control del promotor de la camKII reproduce claramente lo visto en el ratón knockout en el que el promotor endógeno dirige la expresión de LacZ. En los pacientes de la enfermedad de Alzheimer, las placas y marañas se ven más a menudo en la corteza y en el hipocampo. Por tanto la sobreexpresión de la proteína Asp2 está localizada de modo apropiado para reproducir fielmente la expresión neuronal endógena de Asp2.

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Generación de ratones transgénicos que sobreexpresan Asp1

El DNA de asp1, con la secuencia indicada en la referencia 43 se preparó por métodos convencionales. Éste fue clonado después en el vector pCamKIRES\betaGal como se ha descrito anteriormente.

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La construcción transgénica de asp1 se utilizó para generar ratones transgénicos por los siguientes procedimientos:

\quad

La construcción se preparó y se purificó.

\quad

Se indujeron los ratones hembras a superovular y se recogieron los embriones.

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Se microinyectó el DNA en el pronúcleo de los embriones.

\quad

Se transfirieron los embriones a ratones pseudopreñados (ratones hembras previamente apareados con machos vasectomizados).

\quad

Se dejó que los embriones se desarrollaran normalmente y nacieron ratones.

\quad

Los ratones fundadores fueron identificados por transferencia Southern y PCR y se reprodujeron.

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Las líneas adecuadas de ratones son como sigue:

\quad

Ratones donantes (embriones para inyección en el pronúcleo): híbridos [C57B1/6 x CBA]F2

\quad

Ratones aceptores: híbridos [C57B1/6 x CBA]F1

\quad

Ratones para reproducción posterior: C57B1/6

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Cruce de ratones transgénicos para generar vehículos de dos transgenes

Los ratones transgénicos que expresan Asp2 y el posterior transgén deseado, por ejemplo la proteína precursora del amiloide que puede ser APP de tipo natural, o APP que lleva una mutación familiar tal como la mutación Swedish o London, se cruzan y se determinan los genotipos de las crías para seleccionar aquellas que tienen ambos transgenes. Preferiblemente, ambos transgenes están bajo el control del promotor de la CamKII. Si el transgén de Asp2 es "a" y el segundo transgén es "b", entonces es posible el siguiente modelo de apareamiento de los padres heterozigóticos con dos genes de segregación independiente:

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1

Una de cuatro crías debería ser doble-sobreexpresora, dos de cuatro deberían ser simple-sobreexpresoras (una para cada transgén) y una de cuatro crías debería ser un ratón de tipo natural. Este cruce se puede usar para calcular el número de padres requerido para producir una cohorte experimental de doble-sobreexpresores.

Cribado de fármacos usando ratones transgénicos

Los ratones transgénicos descritos antes se pueden usar para cribar los fármacos de ensayo según su actividad potencial en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos.

La expresión y producción de APP se pueden examinar usando la detección de mRNA por transferencia Northern y la detección de polipéptidos usando anticuerpos policlonales y monoclonales que son específicos para las regiones terminales de los péptidos objetivos.

Se pueden realizar observaciones histopatológicas utilizando técnicas inmunohistológicas que permiten la identificación de las placas amiloides y los depósitos relacionados tales como la proteína tau hiperfosforilada y la hibridación in situ utilizando sondas marcadas para dirigirse al mRNA.

Análisis del cerebro de ratón

Se sacrifican los animales por sobredosis de anestésico. Se separan los cerebros y se hemiseccionan por la línea media. Las mitades se colocan o bien en solución formal-salina al 10% o se congelan en seco (snap frozen).

Extracción de A\beta y APP del cerebro de ratón para inmunoensayo

Los hemicerebros congelados en seco se pesan y después se homogenizan utilizando un homogenizador politrón a la máxima velocidad durante 30 segundos. Se preparan homogenatos al 20% peso/volumen, en Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8 con inhibidor completo de proteasa TM (Boehringer Mannheim) añadido el día que indican las instrucciones del fabricante. Se diluyen entonces los homogenatos con un volumen igual de Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM pH 8 que contiene Nonidet P40 al 1% (solución al 10%, Pierce), desoxicolato al 1%, dodecilsulfato de sodio al 0,4% y TM completo (como antes). Se someten entonces los homogenatos a sonicación en un baño de agua con sonicador durante 45 minutos y después se hierven durante 10 minutos con agua en un vaso de precipitados grande. Se transfieren entonces los homogenatos a tubos Eppendorf de 1,5 ml y se centrifugan a 12000 rpm durante 10 minutos. Se separan los sobrenadantes y se almacenan en alícuotas a -20ºC.

Evaluación inmunocitoquímica de los cerebros de ratones transgénicos

El cerebro de ratón hemiseccionado, conservado en solución formal-salina, se incluye en cera parafina y se corta en secciones de 10 \mum con un microtomo antes de montarlo sobre portaobjetos recubiertos con gelatina. Para inmunocitoquímica, se separan las secciones de la cera y se rehidratan con técnicas estándar. Las secciones que se evalúan en cuanto a contenido de A\beta o APP se tratan con ácido fórmico al 80% después de la rehidratación. Para las otras secciones, la ebullición durante 10 minutos en tampón de citrato 0,1 M en un horno microondas aumenta la inmunorreactividad. La peroxidasa endógena se bloquea incubando con peróxido de hidrógeno (al 0,3% en solución salina tamponada con fosfato durante 30 minutos). Los anticuerpos primarios para A\beta (1E8 - monoclonal para A\beta 13-27; G210 - monoclonal para ABeta 33-40; 20G10 y 5G5 - monoclonales para A\beta 35-42, APP (22C11 - Weidemann et al., 1989), la proteína ácida fibrilar neuroglial (anti-GFAP, Boehringer Mannheim), los marcadores neuronales (sinaptofisina, MAP-2, acetilcolina-transferasa - Boehringer Mannheim) y la proteína tau normal e hiperfosforilada (Innogenetics) se incuban con las secciones durante la noche a 4ºC. Las secciones se visualizan usando DAB (Vector Labs) y después de deshidratación se montan en montante acuoso DPX.

Ensayo de proteínas

Los homogenatos de cerebro de ratón se ensayan en cuanto a proteínas antes de la electroforesis en gel para asegurar una carga igual de proteína entre las muestras para comparación de los niveles de expresión. Las proteínas se miden por el procedimiento de unión al colorante de Bradford (Ref. 28) usando concentrado de reactivo colorante Bio-Rad (Herts, UK). El ensayo se lleva a cabo en una placa de 96 pocillos con la lectura de absorbancia a 595 nm usando un lector de placas Spectramax con software para analizar los resultados. Ya que diferentes reactivos, particularmente detergentes, interfieren con el ensayo de Bradford las calibraciones se realizan en el vehículo de la muestra apropiado.

SDS-PAGE

Las proteínas se fraccionan utilizando un sistema mini-gel Novex (R & D Systems Europe Ltd, Oxon, UK). Se carga una cantidad igual de proteína para comparación de los niveles de expresión de APP entre animales. Se diluyen las muestras en 2x de tampón reductor de la muestra que contiene Tris 0,1 M pH 6,8, dodecilsulfato de sodio al 10% (SDS), azul de bromofenol al 0,1% en glicerol y \beta-mercaptoetanol al 50%. Se separan las proteínas en un gel de Tris-glicina-poliacrilamida al 6% que contiene SDS (Ref. 29) durante 90 minutos a 125 voltios. Se incluyen estándares de proteína de conocido peso molecular (Sigma) así como un estándar de APP segregada (expresada en Pichia, véase Ref. 32).

Análisis por transferencia Western

Después de la SDS-PAGE se lavan los geles durante 5 minutos en tampón de transferencia que contiene Tris 2,5 mM, glicina 19,2 mM, metanol al 20% a pH 8,3. Las proteínas se transfieren del gel a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 um (Schleicher & Schuell) usando un sistema semi-seco Bio-rad durante 2 horas a 0,8 mA/cm^{2}. Después de la transferencia se visualizan las proteínas sobre la membrana tiñendo con una solución al 10% de Ponceau S (Sigma) durante 2 minutos. Se quita la tinción lavando con agua destilada.

La membrana se bloquea en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 10% de leche desecada en polvo durante al menos 1 hora a temperatura ambiente. Se incuba WO2, anticuerpo monoclonal producido frente a A\beta 1-16 humano, a 1 ug/ml en PBS durante la noche a 4ºC. Esto va seguido por tres lavados de 10 minutos en PBS. Se añade entonces un anticuerpo secundario, que fue peroxidasa de rábano anti-ratón (Amersham NA931) a una dilución 1/3000 en PBS que contiene seroalbúmina bovina al 4% y Tween 20 al 0,1% incubado durante 1 hora a temperatura ambiente. Se repiten los lavados con PBS como anteriormente y después se transfiere la membrana a una placa limpia para la adición de un sustrato de quimioluminiscencia aumentada (Amersham RPN2106). Las bandas inmunorreactivas se detectan usando Hyperfilm-ECL (Amersham) que se desarrolló usando un procesador automático (X-OGraph Compact X4). Las bandas de APP se escanean usando un Fluor-S MultiImager (Bio-rad) unido a un ordenador con software para el procesado de los datos.

Determinación de la concentración de A\beta 1-40 y 1-42 por inmunoensayo

Para el inmunoensayo de A\beta 1-40, las placas (Gibco BRL, placas de 96 pocillos de fondo plano, catálogo # 1-67008-A) se recubren (durante la noche a 4ºC) con anticuerpo de captura 2F12, producido frente al péptido A\beta 1-16, a 0.8 \mug/ml en PBS. Después del recubrimiento, la solución de anticuerpos se aspira y las placas se bloquean incubando durante 60 minutos a 37ºC con gelatina al 1% v/v (Amersham RPN416) en tampón de ensayo (Tris HCl 50 mM, NaCl 150 mM, gamma-globulinas bovinas al 0,5%, Tween 20 al 0,05%, pH 7,4, pasado a través de un filtro de 0,2 um antes del uso). Después del bloqueo, se lavan las placas 4 x 250 ul con solución salina tamponada con fosfato con Tween 20 (Sigma Cat No P3563). Las muestras de extracto de cerebro de ratón preparadas como se ha descrito antes se añaden a las placas junto con el anticuerpo de detección, G210 biotininilado (1 \mug/ml en tampón de ensayo) producido frente a un péptido A\beta 40 de C-terminal (Ref. 30). La placa recubierta con 2F12 que contiene el extracto de cerebro y 150 ul de anticuerpo de detección se incuba durante la noche a 4ºC. Seguidamente se lavan las placas (4 x 250 ul) con solución salina tamponada con fosfato con Tween 20.

La cuantificación del complejo péptido-anticuerpo se realiza por la unión de estreptavidina-europio. Se añaden a cada pocillo 200 ul de estreptavidina-europio (Wallac, Catálogo # 1244-360) diluido 1:500 en BSA al 0,5%, globulina al 0,05%, Tween 20 al 0,01%, DTPA 20 uM (Sigma D 6518) en solución salina tamponada con Tris pH 7,4. Se incuban las placas a temperatura ambiente durante 60 minutos antes de lavar con solución salina tamponada con fosfato. Finalmente, se añaden 200 ul de solución potenciadora (Wallac, Catálogo # 1244-105) a cada pocillo y se agita la placa durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de la medida de la emisión de fluorescencia resuelta en el tiempo en un fluorímetro Wallac 1234 Delfia Fluorometer.

Para la determinación de A\beta 1-42, se recubren las placas con el anticuerpo monoclonal SG5 (1 \mug/ml en solución salina tamponada con fosfato) producido frente al péptido A\beta 35-42. La detección se realiza con anticuerpo biotina-6E10 (Senetek PLC). Los demás detalles son exactamente iguales que para la determinación de A\beta 1-40.

Para la construcción de curvas estándar se usan A\beta 1-40 y 1-42 (California Peptide Research Inc). Se disuelven los péptidos en dimetil-sulfóxido y se diluyen en el apropiado tampón para extracto de cerebro. Se ensayan estándares de A\beta 1-40 y 1-42 con cada lote de extracto de cerebro de ratón. La concentración de A\beta 1-40 y 1-42 se calcula por referencia a la señal de inmunoensayo producida por concentraciones conocidas de péptido.

Determinación de la concentración de APP de longitud completa y de APP escindida por alfa-secretasa mediante inmunoensayo

Para el inmunoensayo de APP de longitud completa más APP escindida por alfa-secretasa (FL+sAPP\alpha), las placas (Gibco BRL, placas de 96 pocillos de fondo plano, catálogo # 1-67008-A) se recubren (durante la noche a 4ºC) con anticuerpo de captura WO2 (Ref. 37), producido frente al péptido A\beta 1-16, a 2,7 \mug/ml en PBS. Después del recubrimiento, la solución de anticuerpo se aspira y las placas se bloquean incubando durante 60 minutos a 37ºC con gelatina al 1% v/v (Amersham RPN416) en tampón de ensayo (Tris HCl 50 mM, NaCl 150 mM, gamma-globulinas bovinas al 0,5%, Tween 20 al 0,05%, pH 7,4, pasado a través de un filtro de 0,2 um antes del uso). Después del bloqueo, se lavan las placas 4 x 250 ul con solución salina tamponada con fosfato con Tween 20 (Sigma Cat No P3563). Las muestras de extracto de cerebro de ratón preparadas como se ha descrito antes se añaden a las placas junto con el anticuerpo de detección, un anticuerpo policlonal producido frente a APP (Ref. 31). La placa recubierta con 2F12 que contiene el extracto de cerebro y 150 ul de anticuerpo de detección se incuba durante la noche a 4ºC. Seguidamente se lavan las placas (4 x 250 ul) con solución salina tamponada con fosfato con Tween 20.

La cuantificación del complejo péptido-anticuerpo se realiza por la unión de europio-IgG anticonejo (Wallac) diluida 1:500 en BSA al 0,5%, globulina al 0,05%, Tween 20 al 0,01%, DTPA 20 uM (Sigma D 6518) en solución salina tamponada con Tris pH 7,4. Se incuban las placas a temperatura ambiente durante 60 minutos antes de lavar con solución salina tamponada con fosfato. Finalmente, se añaden 200 ul de solución potenciadora (Wallac, Catálogo # 1244-105) a cada pocillo y se agita la placa durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de la medida de la emisión de fluorescencia resuelta en el tiempo en un fluorímetro Wallac 1234 Delfia Fluorometer.

La APP segregada escindida por la alfa-secretasa preparada a partir de Pichia pasioris (véase Ref. 32) se usa para la construcción de una curva estándar. La concentración de FL+sAPP\alpha, (este formato de anticuerpo no distingue entre la APP de longitud completa y la alfa-escindida) se calcula por referencia a la señal del inmunoensayo producida por concentraciones conocidas de péptido.

Observación de cambios de comportamiento

La observación de cambios de comportamiento puede emplear ensayos convencionales usados para evaluar el aprendizaje y los déficit de memoria (Ref. 44).

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2

<110> SmithKline Beecham plc

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<120> Compuestos

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<130> PG4564EP

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<140> EP 02078428.6

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2002-08-20

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<150> GB 0120342.1

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<151> 2001-08-21

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<150> GB 0126732.6

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<151> 2001-11-07

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<160> 1

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 501

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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3

4

5

Claims (12)

1. Una construcción de DNA recombinante que comprende una secuencia codificadora que codifica ASP2 humana, y una secuencia del promotor de la calcio-calmodulina-cinasa II específica del cerebro, que está ligada operativamente a la secuencia codificadora.

2. Un animal transgénico cuyo genoma incorpora un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora que codifica la proteína humana ASP2, en el que dicha secuencia codificadora está ligada operativamente a un promotor de la calcio-calmodulina-cinasa II específica del cerebro.

3. Un animal transgénico según la reivindicación 2, en el que dichas células del cerebro son células del hipocampo, cerebelo o corteza.

4. Un animal transgénico según la reivindicación 2 o 3, que es un roedor.

5. Un animal transgénico según la reivindicación 4, que es un ratón.

6. Una célula de un animal transgénico cuyo genoma incorpora un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora que codifica la proteína humana ASP2, y una secuencia de un promotor de la calcio-calmodulina-cinasa II específica del cerebro que está ligada operativamente a la secuencia codificadora.

7. Una célula según la reivindicación 6, que es una célula de roedor.

8. Una célula según la reivindicación 7, que es una célula de ratón.

9. Un método para producir un animal transgénico como se ha definido en la reivindicación 2, cuyo método comprende:

(a)

introducir una construcción como se define en la reivindicación 1, en una célula o embrión; y

(b)

generar dicho animal a partir de dicha célula o embrión.

10. Un método según la reivindicación 9, en el que la construcción se inyecta en el pronúcleo de un oocito fertilizado de un animal.

11. Un método según la reivindicación 9 o 10, en el que los animales fundadores que se obtienen se reproducen.

12. Un método para evaluar un agente terapéutico para uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, cuyo método comprende:

i)

administrar dicho agente a un animal transgénico como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, o una célula de un animal transgénico como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8; y

ii)

evaluar el efecto de dicho agente sobre el animal transgénico o sobre dicha célula del animal transgénico.