DE60223205T2

DE60223205T2 - Transgenes Tiermodell für Alzheimer-Erkrankung

Info

Publication number: DE60223205T2
Application number: DE60223205T
Authority: DE
Inventors: Martin c/o GlaxoSmi Harlow Geppert; Alexander James c/o GlaxoSmi Harlow Harper; Steve Mark c/o GlaxoSmi Harlow Harrison; Hayon c/o GlaxoSmi Harlow Prosser
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd
Priority date: 2001-08-21
Filing date: 2002-08-20
Publication date: 2008-08-07
Anticipated expiration: 2022-08-21
Also published as: US20040154049A1; ES2295283T3; EP1285578A3; ATE376768T1; DE60223205D1; US6958433B2; EP1285578B1; EP1285578A2

Description

Diese Erfindung betrifft transgene Tiere und ihre Verwendung als Modelle für die Alzheimer-Erkrankung.
Hintergrund der Erfindung
Die Hauptproteinkomponente der amyloiden Plaques, die im Gehirn von Patienten mit Alzheimer-Erkrankung (AD) gefunden werden, ist Aß, ein Peptid mit 4 kDa, das aus hauptsächlich vierzig und zweiundvierzig Resten (Aβ_1-40, Aβ_1-42) besteht, die von dem amyloiden Vorläuferprotein abgeleitet sind (APP). APP kann am N-Terminus von Aβ von einem Enzym gespalten werden, das β-Sekretase genannt wird, wobei lösliches APP und das C-terminale Fragment A4CT (C99) gebildet wird. Das 99 Reste lange Membranprotein A4CT (Ref. 1), welches der direkte Vorläufer von Aβ ist, enthält die gesamte Aβ-Domäne, die Membrandomäne und den cytoplasmatischen Schwanz von APP. Von β-Sekretase nimmt man an, daß sie ein Protein ist, das Aspartyl-Protease 2 (Asp 2) genannt wird. Es gibt widersprüchliche Daten, ob das hoch homologe Protein Aspartyl-Protease 1 (Asp 1) auch β-Sekretase-Aktivität hat (Refs. 2,3). Man nimmt an, daß Asp 1 eine Rolle bei der Amyloidogenese eher in peripherem Gewebe als in Hirngewebe spielen könnte.
Die beiden C-terminale Fragmente von APP, A4CT und p3CT, werden innerhalb der Membrandomäne durch eine γ-Spaltaktivität gespalten, wobei Aβ und p3 in das Medium freigesetzt werden (Refs. 4,5). In Zellen, die Wildtyp-APP exprimieren, ist die Stelle der γ-Spaltung hauptsächlich die Peptidbindung Val(40)-Ile(41) von A4CT und in kleinerem Ausmaß die Bindung Ala(42)-Thr(43). In Zellen, die APP mit den mit familiärer AD in Zusammenhang stehenden Mutationen an Val 717 (basierend auf APP₇₇₀, Val 46 von A4CT) exprimieren, tritt nach Val(42) eine erhöhte γ-Spaltung auf, wobei größere Mengen an Aβ_1-42 (Ref. 6) produziert werden.
Mehrere Gruppen haben versucht, transgene Mausmodelle zu entwickeln, die eine überzeugende Pathologie zeigen, die indikativ für die Alzheimer-Erkrankung (AD) ist, wie die PDAPP-Mäuse, Tg2576, TgAPP/Sw,1 usw. (Übersicht in Ref. 7). Es wurden jedoch noch keine transgenen Mausmodelle produziert, die menschliche β-Sekretase (Asp 2) überexprimieren. Dieses Enzym ist eines der beiden Schlüsselenzyme, die das Amyloide Vorläuferprotein spalten, um das β-amyloide Peptid freizusetzen, den Hauptbestandteil der amyloiden Plaques im Gehirn mit Alzheimer-Erkrankung. Es ist wahrscheinlich, daß solche Mäuse eine überzeugende Pathologie entwickeln werden, da die Überexpression dieses Enzyms das Niveau der Spaltung des Amyloiden Vorläuferproteins an der β-Stelle erhöhen wird. Deshalb würde dies ein neues Modell der AD darstellen, da alle existierenden transgenen Tiermodelle auf der Expression von mutanten Formen von menschlichen Genen beruhen, die mit dem frühen Auftreten der Alzheimer-Erkrankung verknüpft sind (Amyloides Vorläuferprotein und Presenilin 1). Ein solches Modell sollte ein zuverlässiges Modellsystem für die Produktion und die Ablagerung von amyloiden Ablagerungen darstellen, die charakteristisch sind für die Alzheimer-Erkrankung.
Die erhaltenen Ergebnisse hängen von der Quelle des Promotors und der verwendeten das Protein codierenden Sequenz ab. Wir fanden, daß die Verwendung eines spezifischen neuronalen Promotors die Möglichkeit der Entwicklung einer Pathologie erhöht, die der klinischen Situation ähnelt.
Eine kurze Beschreibung der Figuren:
1: diese beschreibt in darstellender Form die Clonierungsstrategie, die zur Erzeugung des Vektors IRES β-gal verwendet wurde.
2: die Resultate zeigen die Expression von LacZ und somit das Transgen in Knockout-Mäusen, bei denen LacZ unter der Kontrolle des endogenen Asp2-Promotors (a und b) exprimiert wurde, und in den überexprimierenden transgenen Mäusen der Erfindung (d und e). Die Figur zeigt auch, daß in den Wildtyp-Mäusen (c) keine LacZ-Expression gesehen wurde.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegenden Erfindung stellt demgemäß ein nicht-menschliches transgenes Tier bereit, dessen Genom eine Nucleotidsequenz enthält, die das menschliche ASP2-Protein codiert, wobei die Nucleotidsequenz funktionell mit dem CaM-Kinase-II-Promotor der Maus verknüpft ist. Mit dem Ausdruck "ASP2-Protein" ist ein Protein oder Polypeptid gemeint, das die grundlegende biologische Funktionalität des menschlichen ASP2-Proteins hat. Eine solche grundlegende biologische Funktionalität würde vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet so eingeschätzt werden, daß sie die Fähigkeit zur Spaltung von APP bedeutet, wie hier beschrieben. Der Ausdruck ASP2-Protein umfaßt die Wildtypform des ASP2-Enzyms ebenso wie modifizierte Formen des ASP2-Enzyms. Eine Modifikation kann zum Beispiel mittels herkömmlicher molekularbiologischer Techniken wie der Addition, Substitution oder Deletion von einer oder von mehreren Aminosäuren vorgenommen werden; oder in der Tat Fragmente des ASP2-Enzyms, mit der Maßgabe, daß solche modifizierten Formen oder Fragmente die grundlegende biologische Funktionalität des Wildtyp-ASP2-Proteins haben. Ein Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet wäre leicht in der Lage zu testen, ob solche modifizierten Formen oder Fragmente eine solche grundlegende biologische Funktionalität behalten haben, indem sie auf die Spaltung des amyloiden Vorläuferproteins testen, von dem bekannt ist, daß es das Substrat des Enzyms ist. Vorzugsweise ist das ASP2-Protein jedoch das Wildtypprotein mit der Sequenz, die in SEQ ID 1 und Referenz 42 dargestellt ist. Vorzugsweise ist die Nucleotidsequenz, die das menschliche ASP2-Protein codiert, so, daß sie das Protein mit der Sequenz codiert, wie sie in SEQ ID 1 und Referenz 42 dargestellt ist.
Die Nucleotidsequenz, die das menschliche ASP2-Protein codiert, kann aus der folgenden Gruppe ausgewählt werden:

a) einem Polynucleotid, das eine Polynucleotidsequenz umfaßt, die eine Polypeptidsequenz codiert, die zu mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität mit der Polypeptidsequenz von SEQ ID NO:1 hat;
b) einem Polynucleotid, das eine Polynucleotidsequenz umfaßt, die das Polypeptid von SEQ ID NO:1 codiert;
c) einem Polynucleotid, das eine Polypeptidsequenz codiert, die zu mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität mit der Polypeptidsequenz von SEQ ID NO:1 hat;
d) einem Polynucleotid, das das Polypeptid von SEQ ID NO:1 codiert;
e) einem Polynucleotid, das eine Polynucleotidsequenz hat oder umfaßt, die eine Polypeptidsequenz codiert, die einen Identitätsindex von 0,95, 0,96, 0,97, 0,98 oder 0,99 im Vergleich mit der Polypeptidsequenz von SEQ ID NO:1 hat.

Der CamKII-Promotor ist in den Referenzen 32 und 33 beschrieben. Die transgenen Tiere der Erfindung können amyloide Plaques entwickeln und sind daher nützliche Modelle für die Alzheimer-Erkrankung und andere neurodegenerative Störungen.
Ein "Transgen" umfaßt ein Polynucleotid, aus der Natur isoliert, das in-vitro manipuliert wurde und das anschließend in der nativen oder in modifizierten Formen in das Genom derselben oder einer anderen Art eingebracht wurde, so daß es stabil und vererbbar in diesem Genom enthalten ist. Das Polynucleotid codiert vorzugsweise ein Protein von Interesse und ist im allgemeinen funktionell mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft. Der Ausdruck Transgen wird hier so verwendet, daß er das Polynucleotid und die regulatorischen Sequenzen betrifft, mit denen es funktionell verknüpft ist. Das Transgen kann weiterhin andere Polynucleotide umfassen, die zum Beispiel Reportergene codieren, um die Expression des Transgens zu überwachen. Ein Organismus, in den ein Transgen eingebracht wurde, wird als ein "transgener Organismus" bezeichnet. Ein transgenes Konstrukt ist ein Vektorkonstrukt, das das Transgen enthält.
Der Ausdruck "transgene DNA", wie hier verwendet, betrifft ein Polynucleotid, das innerhalb des Transgens enthalten ist, wobei das Polynucleotid das Protein von Interesse codiert.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Verwendung eines Nucleinsäurekonstrukts zur Erzeugung eines transgenen Tieremodells für die Durchmusterung von Mitteln für eine mögliche Verwendung bei der Behandlung von neurologischen Störungen, insbesondere der Alzheimer-Erkrankung. Das Konstrukt umfaßt eine Nucleotidsequenz, die das menschliche ASP2-Protein codiert, funktionell verknüpft mit dem CaM-K-II-Promotor der Maus. Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Nucleinsäurekonstrukt weiterhin eine interne ribosomale Eintrittstelle (IRES) stromabwärts (3') des Nucleotids, das das menschliche ASP2-Protein codiert, und eine Nucleinsäuresequenz, die ein Reportergen codiert, stromabwärts von der IRES. Dieser Typ von Konstrukt wird als bi-cistronisch bezeichnet und ermöglicht die separate Expression des menschlichen ASP 2- Proteins und des Reporterproteins. Das Reporterprotein kann zum Beispiel Luciferase, grünes fluoreszierendes Protein oder Derivate davon oder β-Galactosidase sein, ist aber vorzugsweise β-Galactosidase. Der Vorteil eines solchen Konstrukts ist, daß es einem ermöglicht, die Expression von menschlichem ASP2 zu beobachten, indem man die Expression des Reportergens verfolgt. Der Zusammenbau des transgenen Konstrukts folgt Standardclonierungstechniken, die im Stand der Technik wohl bekannt sind (vergleiche zum Beispiel Ref. 8) Das ASP2 codierende Polynucleotid kann aus cDNA oder genomischer DNA bestehen. Wenn es cDNA ist, kann die cDNA, die überexprimiert werden soll, von einer mRNA gewonnen werden, die aus relevantem Gewebe extrahiert wurde, vorzugsweise einem Gewebe, von dem bekannt ist, daß das ASP2-Protein exprimiert wird, oder sie kann alternativ durch Sondierung einer menschlichen cDNA-Bibliothek extrahiert werden.
Die DNA, zusammen mit dem CamKII-Promotor und allen anderen gewünschten Komponenten, wie künstlichen Introns, der IHRES, oder einem Reportergen kann dann durch Restriktionsverdau und Ligierung in einen Clonierungsvektor inseriert werden. Geeignete Clonierungsvektoren für den Zusammenbau von Transgenen sind diejenigen, die annehmbare Ausbeuten an DNA bereitstellen. Jeder kommerziell verfügbare Plasmidvektor oder Phage, der eine cDNA aufnehmen kann und der manipuliert werden kann, damit er einen Selektionsmarker enthält, ist geeignet.
Der Cam-K-II-Promotor ist funktionell mit der codierenden Sequenz des ASP2 codierenden Polynucleotids auf eine Weise verknüpft, die die erforderliche zeitliche und räumliche Expression des Polynucleotids erlauben wird. Es können intervenierende Sequenzen zwischen dem verknüpften Polynucleotid und dem Promotor sein oder auch nicht, mit der Maßgabe, daß der Promotor die Expression des so mit ihm verknüpften, ASP2 codierenden Polynucleotids steuert. Verfahren für die Verknüpfung von regulatorischen Sequenzen mit cDNAs, um deren Expression zu erleichtern, sind im Stand der Technik wohl bekannt. Solche Verfahren umfassen zum Beispiel die direkte Ligierung der Nucleinsäure, die den CamK-II-Promotor umfaßt, mit der codierenden Region des ASP2 codierenden Polynucleotids. Zusätzliche Nucleinsäuresequenzen können eingeschlossen werden, die die Expression in der erforderlichen Weise modulieren. Beispiele für zusätzliche Sequenzen umfassen verstärkende Elemente, künstliche Introns und andere.
Zusätzlich kann die Nucleotidsequenz des CamK-II-Promotors oder eine andere regulatorische Sequenz modifiziert werden, um das Niveau der Expression zu erhöhen. Solche Modifikationen können zum Beispiel durch stellengerichtete Mutageneseverfahren erreicht werden, die im Stand der Technik wohl bekannt sind (vgl. Ref. 8 vorstehend).
Zusätzlich zu der Modifikation der Sequenz von regulatorischen Elementen zur Erhöhung oder anderweitigen Veränderung des Expressionsniveaus kann die codierende Sequenz des ASP2 codierenden Polynucleotids modifiziert werden, um die Expressionsniveaus zu erhöhen oder anderweitig zu verändern. Wenn zum Beispiel die transgene DNA von einer anderen Art als der Wirt ist, kann die Codonverwendung der transgenen DNA so verändert werden, daß sie besser zu der des Wirts paßt. Es ist im Stand der Technik wohl bekannt, daß verschiedene Organismen die 64 codierenden und Stop-Codons mit unterschiedlicher Häufigkeit verwenden. Codons, die in einem Organismus nicht häufig verwendet werden, werden als "seltene Codons" bezeichnet. Wenn die transgene DNA ein Codon enthält, das in dem Wirt ein seltenes Codon ist, können die Expressionsniveaus beträchtlich reduziert werden. Eine Lösung ist der Ersatz von einem oder mehreren seltenen Codons in der transgenen DNA durch Codons, die in dem Wirt häufig verwendet werden. Andere Modifikationen der transgenen DNA-Sequenz umfassen die Modifikation der Polynucleotidsequenz, die das Start-Codon umgibt (das Codon, das das Start-Methionin codiert), um diese besser passend zu machen zu der Consensus-"Kozak"-Sequenz (A/G CCATGG, wobei das fettgedruckte ATG das Start-Codon ist; vgl. zum Beispiel Ref. 9. Man glaubt, daß in dem transkribierten mRNA-Molekül die Kozak-Sequenz die optimale Umgebung für die Initiierung der Translation des Polypeptids bereitstellt.
Vorzugsweise werden vor der Einbringung des Transgens in die Wirtszelle die Vektorteile durch Verdau mit Restriktionsenzymen entfernt, zum Beispiel unter Verwendung von Restriktionsstellen im Vektor, die das Transgen flankieren. Somit wird das genetische Material, das tatsächlich in die Wirtszelle eingebracht wird, vorzugsweise die codierenden Sequenz des ASP2 codierenden Polynucleotids umfassen und die regulatorischen Sequenzen, mit denen sie funktionell verknüpft ist, zusammen mir anderen potentiellen Komponenten des Transgens, zum Beispiel einem Reportergen. Ein Beispiel für diese Technik ist in Referenz 10 gegeben.
Es kann auch ein induzierbares System wie das in Ref. 11 beschriebene verwendet werden, das den Vorteil der Regulation der Genexpression (Induktion/Repression) hat. Zum Beispiel verwendet das durch Tetracyclin induzierbare System (Refs. 12, 13) zwei Konstrukte: einen minimalen Promotor (PhCMV*-1), fusioniert mit sieben Tetracyclin-Operator-Sequenzen und der fraglichen cDNA; und ein Transgen, das die codierende Sequenz für das durch Tetracyclin kontrollierte tran-Aktivatorprotein (tTA) unter der Kontrolle eines Promotors enthält, der zum Beispiel von der folgenden Liste genommen wurde: Menschliches APP (Ref. 14); Neuron-spezifische Enolase der Ratte (Neuronen) (Ref. 15); menschliches β-Actin (Ref. 16); menschliches PDGFβ (Ref. 17); Thy 1 der Maus (Ref. 18); der Prionprotein-Promotor der Maus (PrP) (Ref. 19); der Prionprotein-Promotor des Syrischen Hamsters (Refs. 20 und 21); Synapsin 1 der Ratte (Ref. 22); menschliches FMR1 (Gehirn) (Ref. 23); menschliches niedriges Neurofilament (Ref. 24), mittleres (Gehirn) (Ref. 25); NEX-1 (Gehirn) (Ref. 26); APLP2 der Maus (Gehirn) (Ref. 27); alpha-Tubulin der Ratte (Ref. 28); Transferrin der Maus (Ref. 29); HMGCR der Maus (3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A-Reduktase, Oligodendrocyten) (Ref. 30), basisches Myelinprotein der Maus (Ref. 31), CaM-Kinase-II-Promotor der Maus (Refs. 32 und 33), menschlicher thy-1-Promotor (Ref. 34), die frühe Region des viralen JC-Promotors (Ref. 35), oder die transkriptional regulatorischen Sequenzen des menschlichen Neurofilaments NF-L (Ref. 36). Jedes Konstrukt wird verwendet, um eine transgene Maus zu erzeugen. Die Kreuzung der zwei homozygoten Mäuse erzeugt eine doppelt transgene Linie, die das tTA gemäß dem ausgewählten Promotor exprimiert. Dieses tTA induziert die Expression der cDNA durch Aktivierung von PhCMV*-1, aber nur in Abwesenheit von Tetracyclin. In der Gegenwart von Tetracyclin gibt es nur eine Grundexpression.
Die Erzeugung von transgenen nicht-menschlichen Säugern der Erfindung kann in herkömmlicher Weise erfolgen, zum Beispiel wie beschrieben in WO 93/14200 , WO 91/19810 , WO 93/02189 , WO 89/00689 , WO 92/06187 , EP 0451700 , WO 92/13069 und WO89/06689 .
Es gibt eine Reihe von Techniken, die die Einbringung von genetischem Material wie einem Transgen in die Keimbahn erlauben. Das am häufigsten verwendete und bevorzugte Protokoll umfaßt die direkte Injektion des Transgens in den männlichen Pronucleus des befruchteten Eis (Ref. 10), was in der zufälligen Integration einer verschiedenen Anzahl an Kopien in einem Locus resultiert, üblicherweise in einer Kopf zu Schwanz-Anordnung (Ref. 37). Die injizierten Eier werden dann wieder in den Uterus der pseudo-schwangeren Empfängermütter transferiert. Einige der resultierenden Nachkommen können eine oder mehrere Kopien des Transgens in ihr Genom integriert enthalten, üblicherweise an einer Integrationsstelle. Diese "Gründer"-Tiere werden dann gezüchtet, um transgene Linien zu erzeugen und in den genetischen Hintergrund der Wahl rückzukreuzen. Es ist einfach, wenn man die transgene Insertion auf beiden Chromosomen hat (homozygot), da dies die Notwendigkeit der wiederholten Genotypisierung im Verlauf der routinemäßigen Partnersuche bei den Mäusen überflüssig macht.
Alternativ können für die Produktion von transgenen Mäusen Transgene unter Verwendung der Elektroporation, von retroviralen Vektoren oder Lipofektion für den Gentransfer über embryonale Stammzellen (ES) eingebracht werden. Dem folgt die zufällige Inserierung in das Genom der pluripotenten embryonalen Stammzellen (ES), gefolgt von der Produktion von chimären Mäusen und anschließender Übertragung in die Keimbahn. Transgene von bis zu mehreren Hundert Kilobasen von Nager-DNA wurden für die Produktion von transgenen Mäusen auf diese Weise verwendet (zum Beispiel Refs. 38, 39). Der letzte Weg kann so zugeschnitten werden, daß das Transgen an einem vorbestimmten Locus inseriert wird (nicht zufällig, zum Beispiel ROSA26 oder HPRT), was die allgemeine ebenso wie die gewebespezifische Expression des Transgens unterstützt (Ref. 40).
Bei einem Aspekt wird das transgene, nicht-menschliche Säugetier erzeugt durch Einbringen des transgenen Konstrukts in einen Embryo, Einpflanzen des Embryo in eine Ersatzmutter und Zulassen der Entwicklung des Embryo bis zur Entbindung.
Das Konstrukt für die Übertragung auf das Wirtstier wird durch Spaltung des Vektors, der das Konstrukt enthält, und Reinigung der DNA gewonnen (Ref. 8).
Die Übertragung wird herkömmlich durchgeführt, vorzugsweise unter Verwendung der Mikroinjektion, wie im Detail in Referenz 8 beschrieben.
Bei einem alternativen Aspekt wird das elterliche transgene, nicht-menschliche Säugetier durch Einbringung des Konstrukts in embryonale Stammzellen mit herkömmlichen Verfahren wie der Calciumphosphat/DNA-Fällung, der direkten Injektion oder der Elektroporation produziert (Ref. 9), gefolgt von Injektion der transformierten Zellen in Blastocyten und Einpflanzung des resultierenden Embryos in eine Ersatzmutter, wie vorstehend beschrieben.
Transgene Tiere können durch Testen identifiziert werden, um sicherzustellen, das die erforderliche genotypische Veränderung erreicht wurde. Das kann in geeigneter Weise erfolgen, zum Beispiel durch den Nachweis der Anwesenheit des Transgens mittels PCR mit spezifischen Primern, oder mit Southern-Blotting, vorzugsweise mit DNA vom Schwanz, mit einer spezifischen Sonde.
Nachdem der gewünschte Genotyp bestätigt wurde, kann die transgene Tierlinie verschiedenen Tests unterzogen werden, um den Phänotyp zu bestimmen. Die bei dieser phänotypischen Charakterisierung verwendeten Tests hängen davon ab, welche genotypische Veränderung erreicht wurde und können zum Beispiel morphologische, biochemische oder Untersuchungen zum Verhalten umfassen. Die transgenen Tiere der vorliegenden Erfindung können eine erhöhte Spaltung von APP an der β-Stelle aufweisen, was zu erhöhten Spiegeln von Aß an den C-terminalen Fragmenten von APP führt. Dies würde zu erhöhter χ-Spaltung und einer erhöhten amyloiden Belastung führen. Auffällige erwartete phänotypische Effekte können ein Nachlassen bei der Wahrnehmung sein, die in herkömmlichen Verhaltenstests getestet werden können, wie dem Morris Water Maze und dem Y Maze.
Diese Erfindung umfaßt auch alle Zellen, die von dem transgenen, nicht-menschlichen Tier gezüchtet werden. Die Zellen werden in vitro gezüchtet. Das Genom der Zellen kann somit das Konstrukt der Erfindung umfassen. Das menschliche ASP2-Polypeptid wird typischerweise in solchen Zellen in einer Menge von mindestens 2, vorzugsweise 3, 4 oder 5 mal größer exprimiert als die Menge von endogenem ASP2-Polypeptid, die in den Zellen exprimiert wird.
Zellen, die in vitro von einem transgenen Tier gezüchtet werden, können mit jedem geeigneten Verfahren hergestellt werden. Die Zellen sind typischerweise Nager- und vorzugsweise Mauszellen. Kulturen von neuronalen Zellen können daher bereit gestellt werden, zum Beispiel Kulturen von primären Hippocampus-Zellen. Die Zellen können für die Einbringung von anderen Genen von Interesse mittels jedes bekannten Verfahrens (einschließlich der viralen Verabreichung) verwendet werden.
Das transgene, nicht-menschliche Säugetier ist vorzugsweise ein Nager wie eine Ratte oder eine Maus, mehr bevorzugt eine Maus.
Die geeignete transgene DNA-Sequenz kann mittels einer Reihe von Prozeduren in den Vektor inseriert werden. Im allgemeinen wird die transgene DNA-Sequenz mittels Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, in eine geeignete Restriktions-Endonucleasestelle/geeignete Restriktions-Endonucleasestellen inseriert. Solche Verfahren und andere sollten im Anwendungsbereich des Durchschnittsfachmanns auf dem Fachgebiet sein.
Die Verwendung von nicht-menschlichen Tiermodellen, die mehr als ein Gen überexprimieren oder denen mehr als ein Gen fehlt, kann wichtige Einblicke in die Wechselwirkung von verschiedenen genetischen Loci bei speziellen Krankheiten, zum Beispiel der Alzheimer-Erkrankung, bereit stellen. Folglich kann die Kreuzung der bezüglich ASP2 transgenen, nicht-menschlichen Tiere der vorliegenden Erfindung mit nicht-menschlichen Tiermodellen, die ein unterschiedliches Gen überexprimieren oder unterexprimieren, alternative und potentiell überlegene Tiermodelle für Krankheiten wie Alzheimer produzieren. Zum Beispiel können die bezüglich ASP2 transgenen, nicht-menschlichen Tiere der vorliegenden Erfindung mit Mäusen gekreuzt werden, die ein Transgen tragen, das ein Nucleotid umfasst, das das mutante menschliche Amyloide Vorläuferprotein K670N, M671L codiert (die "Schwedische" Mutation) (solche Mäuse sind beschrieben in der Europäischen Patentanmeldung EP1063298 ). Bei einem anderen Aspekt können die bezüglich ASP2 transgenen, nicht-menschlichen Tiere der vorliegenden Erfindung mit Mäusen gekreuzt werden, die ein Transgen tragen, das ein Nucleotid umfasst, das das mutante menschliche Amyloide Vorläuferprotein V717I codiert (die "London" Mutation) (solche Mäuse sind beschrieben in Ref. 41).
Geeignete Promotoren für das zweite Transgen umfassen: Menschliches APP (Ref. 14); Neuron-spezifische Enolase der Ratte (Neuronen) (Ref. 15); menschliches β-Actin (Ref. 16); menschliches PDGFβ (Ref. 17); Thy 1 der Maus (Ref. 18); der Prionprotein-Promotor der Maus (PrP) (Ref. 19); der Prionprotein-Promotor des Syrischen Hamsters (Refs. 20 und 21); Synapsin 1 der Ratte (Ref. 22); menschliches FMR1 (Gehirn) (Ref. 23); menschliches niedriges Neurofilament (Ref. 24), mittleres (Gehirn) (Ref. 25); NEX-1 (Gehirn) (Ref. 26); APLP2 der Maus (Gehirn) (Ref. 27); alpha-Tubulin der Ratte (Ref. 28); Transferrin der Maus (Ref. 29); HMGCR der Maus (3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A-Reduktase, Oligodendrocyten) (Ref. 30), basisches Myelinprotein der Maus (Ref. 31), CaM-Kinase-II-Promotor der Maus (Refs. 32 und 33), menschlicher thy-1-Promotor (Ref. 34), die frühe Region des viralen JC-Promotors (Ref. 35), oder die transkriptional regulatorischen Sequenzen des menschlichen Neurofilaments NF-L (Ref. 36).
Es ist jedoch bevorzugt, wenn beide Vorläufer der transgenen, nicht-menschlichen Tierlinien Transgene umfassen, die funktionell mit einem neuronalspezifischen Promotor verknüpft sind, zum Beispiel dem CamKII-Promotor. Dies stellt sicher, daß in dem durch die Kreuzung produzierten nicht-menschlichen Tier die beiden transgenen DNAs auf neuronal-spezifische Weise exprimiert werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein nicht-menschliches transgenes Tier durch Kreuzung der ASP2-Linien der vorliegenden Erfindung mit einem nicht-menschlichen transgenen Tier erzeugt, dessen Zellen ein Transgen enthalten, das ein Nucleotid umfaßt, das das menschliche Amyloide Vorläuferprotein codiert. Besonders bevorzugt ist es, wenn das besagte, APP-codierende Nucleotid funktionell mit dem CamKII-Promotor oder mit dem Thy 1-Promotor verknüpft ist. Das besagte APP kann Wildtyp-APP sein oder es kann Mutationen wie die Schwedische oder die London-Mutation enthalten, oder jede andere Mutation, wie in Ref. 7 beschrieben.
Solche transgenen, nicht-menschlichen Tiere, die mehr als ein Transgen enthalten, wobei eines der Transgene ein Nucleotid umfaßt, das das menschliche Asp2-Protein codiert, funktionell verknüpft mit dem CamKII-Promotor, sind auch Teil dieser Erfindung und können wie hier beschrieben verwendet werden.
Die transgenen, nicht-menschlichen Säuger oder Zellen der vorliegenden Erfindung können für die Durchmusterung auf therapeutischen Mitteln verwendet werden, die die Aktivität von ASP2 hemmen und folglich die Bildung von APP und amyloiden Plaques, indem man diese therapeutischen Testmittel dem Säuger oder dem Zellkulturmedium verabreicht und die Veränderungen bei der Aktivität von ASP2 beobachtet. Solche Veränderungen können zum Beispiel durch die Beobachtung einer Verminderung bei der Aβ-Produktion gemessen werden, die biochemisch gemessen werden kann, oder durch die Beobachtung einer Verminderung bei der Plaque-Belastung oder einer Verzögerung bei der Ablagerung von Plaques, was mit physikochemischen Techniken gemessen werden kann. Die Wirkung von therapeutischen Mitteln kann auch mittels Verbesserungen bei Verhaltesntests gemessen werden. Geeignete Tests sind in Ref. 41 angegeben. Die Erfindung erstreckt sich auf solche Verfahren der Durchmusterung. Geeignete Techniken für die Durchführung solcher Beobachtungen sind in der WO 93/14200 beschrieben.
Potentiell therapeutische Mittel können die Aktivität des ASP2-Proteins hemmen (antagonistisch wirken). Vorzugsweise wird das besagte therapeutische Mittel auch an einem nicht-menschlichen transgenen Tier getestet, das Aspartylprotease 1 überexprimiert, um zu bestätigen, daß das therapeutische Mittel nicht auch asp 1 hemmt, oder daß, wenn es asp 1 hemmt, durch diese Inhibition keine schädlichen Effekte entstehen. Ein Beispiel für die Produktion eines transgenen nicht-menschlichen Tieres, das asp 1 überexprimiert, wird in den Beispielen dieser Beschreibung gegeben.
Es kann somit ein Verfahren für die Identifizierung eines therapeutischen Mittels für die Behandlung eines Zustands bereitgestellt werden, der durch ein Anwachsen bei der Prozessierung von APP, ein Anwachsen der amyloiden Ablagerungen und einen Verlust der Wahrnehmung charakterisiert ist, umfassend:

– die Verabreichung eines Kandidaten für eine Testsubstanz an ein Tier und
– Bestimmung, ob die Kandidatensubstanz (i) den Verlauf des Zustands verhindert oder verzögert oder (ii) den Zustand behandelt.

Auf die Option (ii) kann durch die Bestimmung getestet werden, ob die Kandidatensubstanz eine Verminderung bei irgendeiner der durch den Zustand verursachten zellulären oder physiologischen Veränderungen verursacht. Solche zellulären oder physiologischen Veränderungen können eine Veränderung bei der Prozessierung von APP, der amyloiden Ablagerung oder der Wahrnehmung umfassen.
Ein Verfahren für die Identifizierung eines therapeutischen Mittels für die Behandlung eines Zustands, der durch ein Anwachsen bei der Prozessierung von APP, ein Anwachsen der amyloiden Ablagerungen und einen Verlust der Wahrnehmung charakterisiert ist, kann auch bereitgestellt werden, umfassend:

– das Inkontaktbringen der Kandidatensubstanz mit einer Zelle der Erfindung, und
– die Bestimmung, ob die Kandidatensubstanz (i) den Verlauf der zellulären oder physiologischen Veränderungen, die mit dem Zustand assoziiert sind, verhindert oder verzögert oder (ii) eine Verminderung bei irgendeinem der zellulären Veränderungen, die von dem Zustand verursacht werden (wie alle der zellulären Veränderungen, die hier erwähnt werden, insbesondere das Niveau der Prozessierung von APP), verursacht.

Bei dem Verfahren, bei dem die Kandidatensubstanz mit einer Zelle der Erfindung in Kontakt gebracht wird, kann das Verfahren das Ziel haben, Proteaseinhibitoren als Antagonisten von ASP2 zu identifizieren, oder es kann das Ziel haben, neuroprotektive Mittel zu identifizieren. Es ist wahrscheinlich, daß Zellen der Erfindung, die ASP2 überexprimieren, sensitiv sind gegenüber neurotoxischen Angriffen wie mit Glutamat, Kainat, Serum und Kaliumentzug. Die Umkehrung oder Verhinderung der Effekte dieser Mittel in einer Zelle der Erfindung durch eine Kandidatensubstanz ist ein Hinweis, daß die Kandidatensubstanz ein neuroprotektives Mittel sein kann.
Geeignete Kandidatensubstanzen, die mit den vorstehenden Verfahren getestet werden können, umfassen Antikörperprodukte (zum Beispiel monoclonale und polyclonale Antikörper, Einzelkettenantikörper, chimäre Antikörper und CDR-verpflanzte Antikörper). Darüber hinaus können auch kombinatorische Bibliotheken, definierte chemische Identitäten, kleine Moleküle, Peptide und Peptidimitatoren, Oligonucleotide und Bibliotheken von natürlichen Produkten wie Displaybibliotheken (z. B. Phagen-Displaybibliotheken) getestet werden. Die Kandidatensubstanzen können chemische Verbindungen sein. Mengen der Kandidatensubstanzen können bei einer vorläufigen Durchmusterung verwendet werden, zum Beispiel zehn Substanzen pro Reaktion, und die Substanzen von Mengen, die Inhibition zeigen, individuell getestet werden.
Mittel, die die phänotypischen Veränderungen wie ein Anwachsen bei der Prozessierung von APP, ein Anwachsen der amyloiden Ablagerungen und Defizite bei der Wahrnehmung, die bei dem transgenen Tier der Erfindung zu sehen sind, umkehren, können in-vivo getestet werden oder in Zellen oder Gewebepräparationen in-vitro. Die Verbindungen können unter Verwendung der Assays und Tests getestet werden, die für die Charakterisierung der Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann die Reaktion des transgenen Tieres nach der Verabreichung eines potentiell therapeutischen Mittels durch zum Beispiel die Beobachtung einer Verbesserung bei der Wahrnehmung oder eine Verminderung der Prozessierung von APP oder der amyloiden Ablagerungen bewertet werden, wie in den Beispielen beschrieben. Verfahren für die Durchmusterung von potentiell therapeutischen Mitteln unter Verwendung von Zelllinien oder Tieren sind etabliert. Es können ELISA-Methoden oder Methoden der Homogenen Zeitaufgelösten Fluoreszenz (HTRF) verwendet werden.
Mittel, die mit den Durchmusterungsverfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert werden, können verwendet werden, um die vorstehend diskutierten Krankheiten zu verhindern oder zu behandeln, insbesondere die Alzheimer-Erkrankung. Der Zustand eines Patienten, der an einer solchen Krankheit leidet, kann daher durch die Verabreichung eines solchen Produkts verbessert werden. Die Formulierung des Produkts für die Verwendung bei der Verhinderung oder Behandlung der Krankheit wird von Faktoren wie der Natur des identifizierten Mittels und der zu verhindernden oder zu behandelnden Krankheit abhängen. Typischerweise wird das Mittel für die Verwendung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel formuliert. Zum Beispiel kann es für die intracraniale, parenterale, intravenöse, intramuskuläre, subkutane, transdermale oder orale Verabreichung formuliert werden. Ein Arzt wird zur Bestimmung des erforderlichen Verabreichungswegs für jeden speziellen Patienten in der Lage sein. Der pharmazeutische Träger oder das Verdünnungsmittel kann zum Beispiel eine isotonische Lösung sein.
Die Dosis des Produkts kann gemäß einer Reihe von Parametern bestimmt werden, insbesondere der verwendeten Substanz; dem Alter, Gewicht und Zustand des zu behandelnden Patienten; dem Verabreichungsweg; und dem erforderlichen Schema. Eine geeignete Dosis kann jedoch von 0,1 bis 100 mg/kg Körpergewicht sein, wie 1 bis 40 mg/kg Körpergewicht. Wiederum wird ein Arzt zur Bestimmung des erforderlichen Verabreichungswegs und Dosis für jeden speziellen Patienten in der Lage sein.
Das Konstrukt, die Zellen oder die therapeutischen Mittel der Erfindung können in einer im Wesentlichen isolierten Form vorhanden sein. Es sollte verstanden werden, daß sie mit Trägern oder Verdünnungsmitteln gemischt werden können, die nicht mit ihrem beabsichtigten Zweck interferieren und dennoch als im Wesentlichen isoliert anzusehen sind. Somit können das Konstrukt, die Zellen oder das therapeutische Mittel der Erfindung auch dann in einer im Wesentlichen isolierten Form sein, in welchem Fall sie im allgemeinen mehr als 90 Gew.-%, d. h. mehr als 95 Gew.-%, 98 Gew.-% oder 99 Gew.-% der jeweiligen Präparation umfassen.
Beispiele
Herstellung von transgenen Mäusen, die ASP2 exprimieren
Die ASP2-cDNA mit der Sequenz von Ref. 42 wurde gemäß herkömmlicher Techniken präpariert. Um die Asp2 mis-Expressionstransgene herzustellen, wurde die ASP2-cDNA in den Vektor pCamKIRESbgal cloniert.
Dieser Vektor enthält den Calcium-Calmodulin-abhängige Kinase IIα (CamKIIα)-Promotor der Maus, von dem kürzlich gezeigt wurde, daß er die Transgenexpression auf den Hippocampus und Neocortex des Vorhirns der Maus richtet (Ref. 32).
Der Promotor wurde auf die Weise isoliert, die in Ref. 32 beschrieben ist (vgl. Referenznote 20). Dann wurde ein SalI-Promotorfragment von 8,5 kb durch Restriktionsverdau isoliert. Dieses wurde in den Arm3-Vektor ligiert (ein Derivat von pBluescript mit den angezeigten Stellen, die den SacI-KpnI-pBluescript-Polylinker flankieren), der mit XhoI und SalI verdaut war. Dies erzeugte Arm3-CamKII (die 5'SalI-Stelle wird zerstört). Die 5Isolat–Form AS210S (ein Derivat von Plasmid AS210 (erhalten von Stem Cell Science, Melbourne) enthält das IRES-bgal-Intron–polyA-Fragment als ein XbaI-XhoI-Restriktionsfragment. Die XbaI-Stelle wurde in eine SalI-Stelle umgewandelt (um AS210S zu erzeugen), und das resultierende SalI/XhoI-Fragment, das die IRES-bgal-Intron-polyA-Kassette enthält, wurde in die SalI-Stelle von Arm3-CamKII ligiert, um CamKII-IRES-bgal zu erzeugen. Dies enthält einzigartige NotI- und SalI-Stellen für die Inserierung von cDNAs. In dem resultierenden Vektor liegt der Promotor stromaufwärts einer Kassette, die die interne Ribosomen-Eintrittstelle (IRES) (Ref. 35) von Picornavirus enthält und das Gen für beta-Galactosidase und die SV40-Transkriptionsterminationssignale. Die Asp2-cDNA wurde dann unter Verwendung der NotI- und SalI-Stellen zwischen dem CamKII-Promotor und der IRES inseriert. Die Transkription, die an der CamKIIα-Promotorcap-Stelle beginnt und an den SV40-Polyadenylierungssignalen endet, resultiert daher in einer dicistronischen Botschaft, die APPV46F- und beta-Galactosidase-Proteine codiert. Das letztere kann leicht nachgewiesen werden, um zu bestätigen, daß die Transgenexpression stattgefunden hat. Der Einschluß eines beta-Galactosidase-Reportergens in dem Konstrukt ermöglicht den einfachen, genauen und sensitiven Nachweis der zellulären Stellen der Transgenexpression. Dieser Clonierungsprozess ist schematisch in 1 gezeigt.
Das vorstehende Konstrukt wurde verwendet um gemäß der folgenden Prozeduren transgene Mäuse zu erzeugen:
Das Kontrukt wurde hergestellt und gereinigt.
Bei weiblichen Mäusen wurde eine Superovulation induziert und Embryos gewonnen. In den Pronucleus der Embryos wurde DNA injiziert.
Die Embryos wurde in pseudoschwangere Mäuse verpflanzt (weibliche Mäuse, die zuvor mit Männchen mit durchtrennten Samenleitern gepaart worden waren).
Man ließ die Embryos sich normal entwickeln und Mäuse werden geboren.
Ursprungsmäuse wurden mit Southern Blot und PCR identifiziert und weitergezüchtet.
Geeignete Mauslinien sind wie folgt;
Spendermäuse (Embryos für die Pronucleus-Injektion): [C57B1/6 × CBA]F2-Hybrid.
Empfängermäuse: [C57B1/6 × CBA]F1-Hybrid.
Mäuse für die Weiterzüchtung: C57B1/6
Bestätigung, daß die transgenen Mäuse Asp 2 in neuronenspezifischer Weise exprimieren
Das für die Expression von Asp2-cDNA verwendete Kontrukt wurde so geplant, daß der Nachweis der Gewebespezifität der Expression durch die Färbung von Schnitten von transgenen Tieren auf β-Galactosidase ermöglicht wurde. Um die Expression des Transgens mit der Expression von endogenem Asp2 zu vergleichen, wurde eine Knockout-Maus mit dem LacZ-Reportergen erzeugt, das in einem Vektor verwendet wurde, der den endogenen Asp2-Promotor umfaßte. Dies stellte einen einfachen Weg für die Überprüfung der Expression von dem endogenem Asp2-Promotor bereit, wiederum durch Färbung auf β-Galactosidase.
Gesamte Gehirne wurden von der Asp2 überexprimierenden Linie und der vergleichbaren Knockoutlinie gewonnen und für die Färbung auf β-Galactosidase verarbeitet.
Es wurden parasaggitale Schnitte geschnitten, um klar die Verteilung der Färbung innerhalb des Gehirns zu zeigen. Die Resultate sind in 2 gezeigt. In den Wildtyp-Gehirnen wurde keine Färbung auf LacZ gesehen (2c). Die Schnitte des Gehirns von Knockout-Maus zeigen klar, daß die LacZ-Expression im Hippocampus und dem Cortex lokalisiert ist und eine reduzierte LacZ-Expression im Caudate Striatum, der Medulla und dem Vorhirn (2a, b). In den Gehirnen der Asp2 überexprimierenden Mäuse (2d, e) ist die LacZ-Expression eindeutig auf den Hippocampus und Caudate Striatum in Linie 17 lokalisiert mit einer stärkeren Färbung, die sich in den Cortex in Linie 4 erstreckt. Das Expressionsmuster des Transgens, gezeigt in den Linien 17 und 4, unter der Kontrolle des camKII-Promotors, spiegelt eindeutig das wieder, wie es in den Knockout-Mäusen zu sehen ist, wo der endogene Promotor die LacZ-Expression steuert. In Patienten mit Alzheimer-Erkrankung werden die Plaques und Verflechtungen am häufigsten im Cortex und Hippocampus gesehen. Somit ist die Überexpression des Asp2-Proteins in geeigneter Weise so lokalisiert, um zuverlässig die endogene neuronale Expression von Asp2 zu reproduzieren.
Herstellung von Mäusen, die Asp1 überexprimieren
Die asp1-DNA mit der Sequenz von Referenz 43 wurde mit herkömmlichen Verfahren gewonnen. Diese wurde dann, wie vorstehend beschrieben, in den Vektor pCamKIRESβgal cloniert.
Das transgene asp1-Konstrukt wurde verwendet um gemäß der folgenden Prozeduren transgene Mäuse zu erzeugen:
Das Kontrukt wurde hergestellt und gereinigt.
Bei weiblichen Mäusen wurde eine Superovulation induziert und Embryos gewonnen.
In den Pronucleus der Embryos wurde DNA injiziert.
Die Embryos wurde in pseudoschwangere Mäuse verpflanzt (weibliche Mäuse, die zuvor mit Männchen mit durchtrennten Samenleitern gepaart worden waren).
Man ließ die Embryos sich normal entwickeln und Mäuse werden geboren.
Ursprungsmäuse wurden mit Southern Blot und PCR identifiziert und weitergezüchtet.
Geeignete Mauslinien sind wie folgt;
Spendermäuse (Embryos für die Pronucleus-Injektion): [C57B1/6 × CBA]F2-Hybrid.
Empfängermäuse: [C57B1/6 × CBA]F1-Hybrid.
Mäuse für die Weiterzüchtung: C57B1/6
Züchtung von Mäusen, um Träger von zwei Transgenen zu erzeugen
Die transgenen Mäuse, die Asp2 und das weitere gewünschte Transgen exprimieren, zum Beispiel das amyloide Vorläuferprotein, das Wildtyp-APP sein kann, oder APP, das eine familiäre Mutation wie die Schwedische oder London-Mutation trägt, werden gekreuzt und die Nachkommen genotypisiert, um diejenigen mit beiden Transgenen zu selektieren. Vorzugsweise sind beide Transgene unter der Kontrolle des CamKII-Promotors. Wenn das Asp2-Transgen 'a' und das zweite Transgen 'b' ist, dann ist von heterozygoten Eltern mit zwei unabhängig segregierenden Genen das folgende Kreuzungsmuster möglich:

Allele b -

a ab a-

- -b --
Einer von vier Nachkommen wäre ein doppelter Überexprimierer, zwei von vier wären ein einfacher Überexprimierer (einer für jedes Transgen) und einer von vier Nachkommen wäre eine Wildtypmaus. Diese Kreuzung kann verwendet werden, um die erforderliche Menge an Eltern zu kalkulieren, um eine experimentelle Kohorte von doppelten Überexprimierern zu produzieren.
Durchmusterung von Arzneistoffen unter Verwendung von transgenen Mäusen
Die vorstehend beschriebenen transgenen Mäuse können verwendet werden, um Testarzneistoffe auf potentielle Aktivität bei der Behandlung der Alzheimer-Erkrankung und anderer neurodegenerativer Störungen zu durchmustern.
Die APP-Expression und -Prozessierung kann unter Verwendung des Nachweises von mRNA mittels Northern Blot und des Nachweises der Polypeptide unter Verwendung von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern, die spezifisch für die Zielpeptide sind, untersucht werden.
Histopathologische Untersuchungen können unter Verwendung der immunhistologischen Techniken durchgeführt werden, um die Identifizierung von amyloiden Plaques und verwandten Ablagerungen wie hyperphosphoryliertem Tau zu erlauben, und der in situ-Hybridisierung unter Verwendung von markierten Sonden für Ziel-mRNA.
Analysen von Mausgehirn
Tiere werden mit einer Überdosis Anästhetikum getötet. Die Gehirne werden entnommen und entlang der Mittelinie halbiert. Die Hälften werden entweder in 10% Standardsalzlösung plaziert oder blitzgefroren.
Extraktion von Aß und APP von Mausgehirn für Immuntests
Blitzgefrorene Gehirnhälften werden gewogen und dann unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators bei Maximalgeschwindigkeit 30 Sekunden homogenisiert. Es werden Homogenisate mit 20% Gew./Vol. in 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8 mit vollständigem TM-Proteaseinhibitor (Boehringer Mannheim) hergestellt, der an dem Tag entsprechend den Vorschriften des Herstellers zugegeben wurde. Die Homogenisate werden dann mit einem gleichen Volumen von 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8 verdünnt, das 1% Nonidet P40 (10%-ige Lösung, Pierce), 1% Desoxycholat, 0,4% Natriumdodecysulphat und vollständigem TM (wie vorstehend) enthält. Die Homogenisate werden dann in einem Wasserbad-Ultraschallbehandlungsgerät 45 Minuten mit Ultraschall behandelt und dann 10 Minuten in einem größeren Becherglas mit Wasser 10 Minuten gekocht. Die Homogenisate werden dann in Eppendorf-Röhrchen von 1,5 ml übertragen und 10 Minuten bei 12000 U./Min. zentrifugiert. Die Überstände werden entnommen und in Teilmengen bei –20°C aufbewahrt.
Immuncytochemische Bewertung von Gehirnen von transgenen Mäusen
Ein halbes durchtrenntes Hausgehirn, das in Standardsalzlösung aufbewahrt war, wird in Paraffinwachs eingebettet und in einem Mikrotom in Schnitte von 10 μm auf mit Gelatine beschichtete Objektträger aufgebracht. Für die Immuncytochemie werden die Schnitte entwachst und mit Standardtechniken rehydriert. Die Schnitte, die hinsichtlich ihres Gehalts an Aβ oder APP untersucht werden, werden nach der Rehydrierung mit 80%-iger Ameisensäure behandelt. Bei den anderen Schnitten erhöht 10 Minuten Kochen in 0,1 M Citratpuffer in einem Mikrowellenherd die Immunreaktivität. Die endogene Peroxidase wird durch Inkubation mit Wasserstoffperoxid (0,3% in phosphatgepufferter Salzlösung für 30 Minuten) blockiert. Primäre Antikörper gegen Aβ (1E8 – monoclonaler gegen Aβ 13-27; G210 – monoclonaler gegen ABeta 33-40; 20G10 und 5G5 – monoclonale gegen Aβ 35-42), APP (22C11 – Weidemann et al, 1989), gliales fibrilläres saures Protein (anti-GFAP, Boehringer Mannheim), neuronale Marker (Synaptophysin, MAP-2, Cholinacetyltransferase – Boehringer Mannheim) und normales oder hyperphosphoryliertes Tau (Innogenetics) werden Obernacht bei 4°C mit den Schnitten inkubiert. Die Schnitte werden unter Verwendung von DAB (Vektor Labs) sichtbar gemacht und nach der Dehydratisierung in dem wäßrigen Fixiermittel DPX fixiert.
Proteintest
Homogenisate von Hausgehirn werden vor der Gelelektrophorese auf Protein getestet, um innerhalb der Proben eine gleiche Beladung mit Protein für den Vergleich der Expressionsniveaus sicher zu stellen. Die Proteine werden unter Verwendung des Bio-Rad (Herts, UK)-Farbreagenskonzentrats mittels des Bradford-Farbbindungsverfahrens gemessen (Ref. 28). Der Test wird auf einer Platte mit 96 Vertiefungen durchgeführt, wobei die Adsorption unter Verwendung eines Spectramax-Plattenlesegeräts mit Software zur Analyse der Resultate bei 595 nm gemessen wird. Da verschiedene Reagentien, insbesondere Detergentien, mit dem Bradford-Test interferieren, wird die Kalibrierung in den geeigneten Probenvehikeln durchgeführt.
SDS-PAGE
Die Proteine werden unter Verwendung eines Novex Minigel-Systems (R & D Systems Europe Ltd, Oxon, UK) fraktioniert. Es wird eine gleiche Menge an Protein für den Vergleich der Expressionsniveaus von APP zwischen den Tieren aufgetragen. Die Proben werden mit 2 × reduzierendem Probenpuffer verdünnt, der 0,1M Tris pH 6,8, 10% Natriumdodecylsulphat (SDS), 0,1% Bromphenolblau in Glycerin und 50% β-Hercaptoethanol enthält. Die Proteine werden dann auf einem 6%-igen Tris-Glycin-Polyacrylamidgel, das SDS enthält (Ref. 29), 90 Minuten bei 125 Volt aufgetrennt.
Proteinstandards mit bekanntem Molekulargewicht (Sigma) werden eingeschlossen, ebenso wie sezernierte APP-Standards (in Pichia exprimiert, vgl. Ref. 32).
Western Blot-Analyse
Nach der SDS-PAGE werden die Gele 5 Minuten in Transferpuffer gewaschen, der 2,5 mM Tris, 19,2 mM Glycin, 20% Methanol bei pH 8,3 enthält. Die Proteine werden dann von dem Gel unter Verwendung eines Bio-rad-halbtrocken-Systems 2 Stunden bei 0,8 mA/cm² auf eine Nitrocellulosemembran von 0,45 μm (Schleicher & Schuell) transferiert. Nach dem Transfer werden die Proteine auf der Membran durch 2 Minuten Färben mit 10%-iger Lösung von Ponceau S (Sigma) sichtbar gemacht. Diese wird durch Spülen mit destilliertem Wasser entfärbt.
Die Membran wird mindesten 1 Stunde bei Raumtemperatur mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), die 10% Trockenmilchpulver enthält, blockiert. WO2, ein monoclonaler Antikörper, der gegen menschliches Aβ 1-16 gebildet worden war, wird mit 1 μg/ml in PBS übernacht bei 4°C inkubiert. Dem folgt dreimal 10 Minuten Waschen in PBS. Dann wird der sekundäre Antikörper zugegeben, dies war Anti-Maus-Meerrettichperoxidase (Amersham NA931) mit einer Verdünnung 1/3000 in PBS, das 4% Rinderserumalbumin und 0,1% Tween 20 enthält, es wird 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das Waschen mit PBS wird wie vorstehend wiederholt und dann wird die Membran für die Zugabe von verstärktem Chemilumineszenzsubstrat (Amersham RPN2106) in ein sauberes Gefäß übertragen. Die immunreaktiven Banden wurden unter Verwendung eines Hyperfilm-ECL (Amersham) nachgewiesen, der unter Verwendung eines automatisierten Prozessors (X-OGraph Compact X4) entwickelt wurde. Die APP-Banden werden unter Verwendung eines Fluor-S Multilmager (Bio-rad) aufgezeichnet, der mit einem Computer mit Software für die Datenverarbeitung verbunden war.
Bestimmung der Konzentration von Aβ 1-40 und 1-42 mit einem Immuntest
Für den Immuntest auf Aβ 1-40 werden Platten (Gibco BRL, Platte mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden, Katalog # 1-67008-A) mit dem Einfangantikörper 2F12, der gegen das Peptid 1-16 von Aβ gebildet worden war, mit 0,8 μg/ml in PBS beschichtet (Obernacht bei 4°C). Nach der Beschichtung wurde die Antikörperlösung abgesaugt und die Platten durch 60 Minuten Inkubation bei 37°C mit 1%-iger Gelatine (Vol./Vol.) (Amersham RPN416) in Testpuffer (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 0,5% Rinder-Gammaglobulin, 0,05% Tween 20, pH 7,4, vor der Verwendung durch ein Filter von 0,2 μm gegeben) blockiert. Nach dem Blockieren werden die Platten 4 × mit 250 μl phosphatgepufferter Salzlösung mit Tween 20 (Sigma Kat. No. P3563) gewaschen. Es werden Proben des Mausgehirnextrakts, die wie vorstehend gewonnen worden waren, zu den Platten zugegeben, zusammen mit dem Nachweisantikörper, mit Biotin markierter G210 (1 μg/ml in Testpuffer), der gegen ein Aß 40-C-terminales Peptid (Ref. 30) gebildet worden war. Die mit 2F12 beschichtete Platte, die den Gehirnextrakt und 150 μl des Nachweisantikörpers enthält, wird übernacht bei 4°C inkubiert. Die Platten werden anschließend mit phosphatgepufferter Salzlösung mit Tween 20 gewaschen (4 × 250 μl).
Die Quantifizierung der Komplexbildung Peptid/Antikörper wird durch die Bindung von Streptavidin-Europium erreicht. Zu jeder Vertiefung werden 200 μl Streptavidin-Europium (Wallac, Katalog # 1244-360) zugegeben, 1:500 verdünnt mit 0,5% BSA, 0,05% Globulin, 0,01% Tween 20, 20 μM DTPA (Sigma D 6518) in Trisgepufferter Salzlösung, pH 7,4. Die Platten werden bei Raumtemperatur 60 Minuten inkubiert, bevor sie mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen werden. Schließlich werden zu jeder Vertiefung 200 μl Verstärkerlösung (Wallac, Katalog # 1244-105) zugegeben und die Platte vor der Messung der Emission mittels zeitaufgelöster Fluoreszenz mit einem Wallac 1234 Delfia Fluorometer 5 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt.
Für die Bestimmung von Aβ 1-42 werden die Platten mit dem monoclonalen Antikörper 5G5 (1 μg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung) beschichtet, der gegen das Aβ-35-42-Peptid gebildet worden war. Der Nachweis erfolgt mit dem Biotin-6E10-Antikörper (Senetek PLC). Alle andern Details sind wie bei der Bestimmung von Aβ-1-40.
Aβ-1-40 und -1-42 (California Peptide Research Inc) werden für die Konstruktion der Standardkurven verwendet. Die Peptide werden in Dimethylsulphoxid gelöst und mit dem geeignetem Gehirnextraktpuffer verdünnt. Die Standards von Aβ-1-40 und -1-42 werden mit jedem Ansatz von Mausgehirnextrakt getestet. Die Konzentration von Aβ-1-40 und -1-42 wird durch Bezugnahme auf das Immuntestsignal berechnet, das von bekannten Konzentrationen an Peptid produziert wird.
Bestimmung der Konzentration von APP voller Länge und von mit alpha-Sekretase gespaltenem APP mit einem Immuntest
Für den Immuntest von APP voller Länge plus mit alpha-Sekretase gespaltenem APP (FL + sAPPα) werden Platten (Gibco BRL, Platte mit 96 Vertiefungen und flachem Boden, Katalog # 1-67008-A) mit dem WO2-Einfangantikörper (Ref. 37), der gegen das Aβ-1-16-Peptid gebildet worden war, mit 2,7 μg/ml in PBS beschichtet (übernacht bei 4°C). Nach der Beschichtung wurde die Antikörperlösung abgesaugt und die Platten durch 60 Minuten Inkubation bei 37°C mit 1%-iger Gelatine (Amersham RPN416) (Vol./Vol.) in Testpuffer (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 0,5% Rinder-Gammaglobulin, 0,05% Tween 20, pH 7,4, vor der Verwendung durch ein Filter von 0,2 μm gegeben) (Vol./Vol.) blockiert. Nach dem Blockieren werden die Platten 4 × mit 250 μl phosphatgepufferter Salzlösung mit Tween 20 (Sigma Kat. No. P3563) gewaschen. Es werden Proben des Mausgehirnextrakts, die wie vorstehend gewonnen worden waren, zu den Platten zugegeben, zusammen mit dem Nachweisantikörper, einem polyclonalen, der gegen APP gebildet worden war (Ref. 31). Die mit 2F12 beschichtete Platte, die den Gehirnextrakt und 150 μl des Nachweisantikörpers enthält, wird übernacht bei 4°C inkubiert. Die Platten werden anschließend mit phosphatgepufferter Salzlösung mit Tween 20 gewaschen (4 × 250 μl).
Die Quantifizierung der Komplexbildung Peptid/Antikörper wird durch die Bindung von Europium-anti-Kaninchen-IgG erreicht, 1:500 verdünnt mit 0,5% BSA, 0,05% Globulin, 0,01% Tween 20, 20 μM DTPA (Sigma D 6518) in Tris-gepufferter Salzlösung, pH 7,4. Die Platten werden bei Raumtemperatur 60 Minuten inkubiert, bevor sie mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen werden. Schließlich werden zu jeder Vertiefung 200 μl Verstärkerlösung (Wallac, Katalog # 1244-105) zugegeben und die Platte vor der Messung der Emission mittels zeitaufgelöster Fluoreszenz mit einem Wallac 1234 Delfia Fluorometer 5 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt.
Mit alpha-Sekretase gespaltenes sezerniertes APP, das aus Pichia pasioris gewonnen wurde (vgl. Ref. 32) wird für die Konstruktion der Standardkurve verwendet. Die Konzentration von FL + sAPPα (dieses Antikörperformat unterscheidet nicht zwischen APP voller Länge und alpha-gespaltenem APP) wird durch Bezugnahme auf das Immuntestsignal berechnet, das von bekannten Konzentrationen an Peptid produziert wird.
Beobachtung von Veränderungen im Verhalten
Beobachtung von Veränderungen im Verhalten können herkömmliche Tests verwenden, die verwendet werden, um Lern- und Gedächtnisdefizite zu bewerten (Ref. 44).
Referenzen

1. Dyrks T., Weidemann A., Multhaup G., Salbaum J. M., Lemaire H.-G., Kang J., Müller-Hill B., Masters C. L., Beyreuther K., EMBO J. 7, 949-957, (1988).
2. Hussain et al Molecular Cellular Neurosciences 16 pp 609-610 (2000)
3. Yan et al J. Biol Chem (papers in press in June 22) manuscript No M105583200
4. Dyrks T., Dyrks E., Mönning U., Urmoneit B., Turner J., Beyreuther K. FEBS Letters 335, 89-93, (1993).
5. Haass C., Hung A. Y., Schlossmacher M. G., Teplow D. B., Selkoe D. J. J. Biol. Chem., 268, 3021-3024, (1993).
6. Suzuki N.; Cheung T. T.; Cai X. D.; Odaka A.; Otvos L. Jr.; Eckman C.; Golde T. E., Younkin S. G. Science 264, 1336-1340, (1994).
7. Janus et al., 2000 Biochenimica et Biophysica Acta 1502 63-75
8. Sambrook et al, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor
9. Kozak, M., Nucleic Acids Res (1984) May 11;12(9): 3873-3893
10. Hogan et al., 'Manipulating the mouse embryo', Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1994).
11. Rossi und Blau, Current Opinion in Biotechnology. 9, 451-456 (1998).
12. Baron et al., Nucl. Acids Res. 23(17) 3605-6 (1995).
13. Furth et al., Proc. Natl. Acad., Sci., USA 91, 9302-9306 (1994).
14. Wirak D. O., et al Science 253, 323-325, (1991).
15. Forss-Petter et al., Neuron 5; 197, (1990).
16. Ray et al., Genes and Development 5; 2265-2273 (1991).
17. Sasahara et al., Cell 64; 217-227 (1991).
18. Ingraham et al., Mol. Cell. Biol. 6(8) 2923-31 (1986).
19. M. Fischer et al., EMBO J. 15(6) 1255-64, (1996).
20. Scott et al., Prot. Sci. 1, 986-997 (1992).
21. Scott et al, Cell 59, 847-857 (1989)
22. Howland et al., Neurobiol. Aging 16(4) 685-99, (1995).
23. Hergersberg et al., Hum. Mol. Genet. 4(3) 359-66 (1995).
24. Thomas et al., J. Virol. 68(11) 7099-107 (1994).
25. Tu et al., J. Cell. Biol. 129(6) 1629-40 (1995).
26. Bartholoma et al., Mech. Dev. 48(3), 217-8 (1994).
27. Kock et al., J. Biol. Chem. 270(43) 25475-80 (1995).
28. Gloster et al., J. Neurosci. 14(12), 7319-30 (1994).
29. Thiesen et al., Mol. Cell. Biol. 13(12) 7666-76 (1993).
30. Duhamel-Clerin et al., Glia 11(1) 35-46 (1994).
31. Readhead et al., Cell 48; 703-712 (1987).
32. Mayford et al. Science 274(5293) 1678-1693 (1996)
33. Tang, Y-P et al., Nature 1999, 401, 63-69
34. Kawabata S. Nature 354 476-478, (1991).
35. Sandhu F.A.J. Biol. Chem., 266 21331-21334, (1991).
36. Nalbantoglu et al., Nature 387: 500-505, (1997).
37. Costantini und Lacy, Nature 294, 92, 1981
38. Choi et al., Nature Genet. 4, 117-123 (1993)
39. Strauss et al., Science 259, 1904-07 (1993)
40. Vivian et al., BioTechniques 27, 154-162 (1999)
41. Moechars et al J. Biological Chemistry 274 pp 6834-6492.
42. Hussein et al Molecular and Cellular Neuroscience (1999) 14 pp 419-427
43. Acquati et al FEBS letters 468 (1) pp 59-64
44. Rogers DC et al, Mamm Genome. (1997) Oct; 8(10): 711-3.

SEQ ID No.1

Claims

Rekombinantes DNA-Konstrukt, umfassend eine codierende Sequenz, die menschliches ASP2 codiert, und eine hirnspezifische Calcium-Calmodulin-Kinase II-Promotorsequenz, welche mit der codierenden Sequenz funktionell verknüpft ist.
Transgenes nicht-menschliches Tier, dessen Genom ein Polynucleotid enthält, das eine codierende Sequenz umfasst, welche das menschliche ASP2-Protein codiert, wobei die codierende Sequenz mit einem Hirn-spezifischen Calcium-Calmodulin-Kinase II-Promotor funktionell verknüpft ist.
Transgenes nicht-menschliches Tier nach Anspruch 2, wobei die Hirnzellen Zellen des Hippocampus, Cerebellum oder Cortex sind.
Transgenes nicht-menschliches Tier nach Anspruch 2 oder 3, welches ein Nager ist.
Transgenes nicht-menschliches Tier nach Anspruch 4, welches eine Maus ist.
Transgene nicht-menschliche tierische Zelle, deren Genom ein Polynucleotid enthält, das eine codierende Sequenz umfasst, welche das menschliche ASP2-Protein codiert, und eine Hirn-spezifische Calcium-Calmodulin-Kinase II-Promotorsequenz, welche mit der codierenden Sequenz funktionell verknüpft ist.
Zelle nach Anspruch 6, welche eine Nagerzelle ist.
Zelle nach Anspruch 7, welche eine Mauszelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines transgenen nicht-menschlichen Tiers, wie in Anspruch 2 definiert, wobei das Verfahren umfasst: (a) Einführen eines Konstrukts, wie in Anspruch 1 definiert, in eine Zelle oder einen Embryo; und (b) Erzeugen eines Tiers aus der Zelle oder dem Embryo.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Konstrukt in den Vorkern einer befruchteten Eizelle eines nicht-menschlichen Tiers injiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die erhaltenen Ausgangstiere gezüchtet werden.
Verfahren zur Beurteilung eines therapeutischen Agens für die Verwendung in der Behandlung der Alzheimer-Krankheit, wobei das Verfahren umfasst: (i) Verabreichen des Agens an ein transgenes nicht-menschliches Tier, wie in einem der Ansprüche 2 bis 5 definiert, oder an eine nicht-menschliche, tierische Zelle, wie in einem der Ansprüche 6 bis 8 definiert; und (ii) Beurteilen der Wirkung des Agens auf das transgene, nicht-menschliche Tier oder auf die nicht-menschliche transgene tierische Zelle.