DE69533583T2

DE69533583T2 - Nicht humane, transgenische säugetiere mit sich entwickelnder neurologischer krankheit

Info

Publication number: DE69533583T2
Application number: DE69533583T
Authority: DE
Inventors: Karen North Oaks Minneapolis HSIAO; David R. Borchelt; Sangra M. Sisodia
Original assignee: Johns Hopkins University; University of Minnesota
Current assignee: Johns Hopkins University; University of Minnesota
Priority date: 1994-01-27
Filing date: 1995-01-27
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2015-01-28
Also published as: EP0742831A1; EP0742831B1; DE69533583D1; AU1909695A; WO1995020666A3; US6262335B1; ATE278023T1; WO1995020666A2; CA2182311A1; JPH09511388A

Description

Einführung
Fachgebiet
Die Erfindung betrifft transgene nicht-humane Lebewesen mit einer progressiven, degenerativen, neurologischen Erkrankung.
Hintergrund
Der Ausdruck degenerativ wird in Bezug auf Erkrankungen des Nervensystems verangewendet, um eine Gruppe von Erkrankungen zu bezeichnen, bei der ein allmählicher, im allgemeinen anhaltend fortschreitender Verfall von Strukturelementen des Nervensystems vorliegt; wobei viele der so bezeichneten Zustände von abnormalen Erbfaktoren abhängen. Die degenerativen Krankheiten manifestieren sich selbst durch eine Vielzahl von Syndromen, die sich durch ihre klinischen und pathologischen Merkmale unterscheiden. Trotzdem gibt es bestimmt Aspekte, die allen gemeinsam sind. Diese Aspekte umfassen einen allmählichen progressiven Verlauf des Ausbruchs, eine bilateral symmetrische Verteilung der Veränderungen, die durch die Krankheit verursacht werden, und in vielen Fällen die beinahe selektive Beteiligung von anatomisch oder physiologisch verwandten Systemen von Neuronen. Typischerweise ist der pathologische Prozeß einer mit langsamem Verfall der Nervenzellkörper oder ihrer Verlängerungen als Nervenfasern.
Unter den degenerativen Krankheiten des Nervensystems befinden sich Syndrome, bei denen das hervorstechende Merkmal die progressive Demenz ist; wobei die Syndrome in dieser Gruppe senile Demenz und Alzheimer-Krankheit umfassen. Die senile Demenz ist ein ziemlich häufiger Zustand im Alter. Die Alzheimer-Krankheit ist eine pathologisch identische, aber viel seltenere progressive Demenz, die vor der senilen Zeit auftritt. Der Unterschied zwischen den beiden Zuständen ist rein klinisch; pathologisch unterscheiden sie sich nur dahingehend, daß die charakteristischen Abnormalitäten in Fällen der Alzheimer-Krankheit gewöhnlich stärker und weiter verbreitet sind, und in einem früheren Alter als der senilen Zeit beginnen.
Die Alzheimer-Krankheit (AD) zeigt einen langsam progressiven geistigen Abbau mit dem Versagen des Gedächtnisses, Orientierungsstörungen und Verworrenheit, was zu einer starken Demenz führt. Diese Krankheit umfaßt überwiegend limbische und kortikale Bereiche des Gehirns. Es gibt mehrere histologische Merkmale, aber zwei sind auffallend. Erstens werden argyrophile Plaques, bestehend aus dem Amyloidogen-Aβ-Fragment des Amyloid-Vorläuferproteins (APP), durch die Hirnrinde und den Hippocampus verstreut. Zweitens werden neurofibrilläre Plaques in Pyramidenzellen gefunden, die überwiegend im Neokortex, Hippocampus und Nucleus Basalis Meynert lokalisiert sind. Es gibt ebenso andere Veränderungen. Die granulovakuoläre Degeneration in den Pyramidenzellen des Hippocampus betrachteten einige als spezifischer für AD als für Plaques oder neurofibrilläre Plaques. Schließlich entsteht ein neuronaler Verlust und Gliose in der Rinde und im Hippocampus.
Es gibt Patienten mit Demenz, denen es an den pathologischen Merkmalen von AD fehlt (und per definitionem eine unterschiedliche Krankheit aufweisen), und umgekehrt gibt es Personen mit vielen der pathologischen Merkmale von AD, die vor dem Tod nicht schwachsinnig waren. Die Diagnose von AD erfordert, daß sowohl die klinischen als auch die pathologischen Merkmale, die für die Krankheit charakteristisch sind, bei dem Patienten vorhanden sind. Die Diagnose kann nicht mit Sicherheit aus entweder den klinischen oder den pathologischen Merkmalen alleine gestellt werden. Ob neurale Funktionsstörung und klinische Abnormalitäten der Entwicklung dieser pathologischen Merkmale vorausgehen, insbesondere den Amyloidplaques und neurofibrillären Plaques, ist unbekannt.
Die klinischen Manifestationen von AD sagen die Bereiche der betroffenen Gehirnstrukturen im Vorderhirn, einschließlich der Hirnrinde, Hippocampus, Amygdala und Gyrus parahippocampalis, voraus. Diese Bereiche sind als die cortico-limbischen Felder des Gehirns bekannt. Das Hinterhirn wird verschont, einschließlich dem Kleinhirn, dem Brücken- und Medullakern. Innerhalb des zerebralen Neokortex bleibt das primäre kortikale Feld relativ verschont, was der relativen klinischen Verschonung der grundlegenden motorischen und sensorischen kortikalen Funktionen entspricht.
Die Forschung über progressive neurologische Erkrankungen wie AD ist durch den Mangel an leicht verfügbaren Tiermodellen ernsthaft erschwert worden. Einige Aspekte der Neuropathologie von alten Menschenaffen sind der menschlichen AD ähnlich (Price, et al., (1992) J. Neurobiol. 23: 1277–1294). Alte Menschenaffen entwickeln Amyloidplaques und nicht voll ausgeprägte neurofibrilläre Plaques. Keine anderen untersuchten Tiere entwickeln eine Krankheit, die AD ähnelt, so genau wie alte Menschenaffen. Jedoch ist die Untersuchung von alten Menschenaffen in großer Anzahl praktisch schwer machbar; ihre Verwendung erhebt sowohl moralische als auch wirtschaftliche Fragen.
Transgene Mäuse, die APP-Transgene beherbergen, wurden beschrieben; jedoch fehlt es der angegebenen Transgenprodukt-Expression beträchtlich an endogenen Niveaus von APP (die Gesamt-APP-Niveaus in anderen transgenen Mäusen haben 150% der endogenen Niveaus nicht überschritten), und es wurde kein Krankheitsphänotyp mit einer progressiven neurobehavioralen Störung, die durch die Pathologie in den cortico-limbischen Regionen des Gehirns begleitet ist, erzeugt. Bei diesen anderen transgenen Mäusen gab es keine Anzeichen für eine progressive neurologische Erkrankung oder neuropathologische Veränderungen im Gehirn, die als Beweis für eine echte neurologische Krankheit betrachtet werden könnten. Missense-Punktmutationen beim Gencodieren für Amyloid-Vorläuferproteine sind mit der familiären AD verbunden. Jedoch umfassen, trotz der Entdeckung von Krankheits-assoziierten Mutationen in APP, die meisten veröffentlichten Versuche, um transgene Lebewesen mit AD zu erzeugen, nur APP-Transgene vom Wildtyp in Mäusen (Kawabata et al., (1991) Nature 354, 476–478; Quon et al., (1991); Nature 352, 239–41; Wirak et al., (1991) Science 253, 323–325; Kammesheidt et al., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89, 10857–61; Lamb et al., (1993) Nature Genetics 5, 22–30.). Leider wurden mehrere der veröffentlichten Studien, die Pathologie beinhalten, durch ungenaue Dokumentation der Transgenprodukt-Expression und/oder Fehlinterpretation der Pathologie verwechselt. Zwei sind zurückgezogen worden (Kawabata, et al.., 1991; Wirak, et al., 1991).
Frühere Bemühungen, ein Modell von AD in transgenen Mäusen zu erzeugen, sind entmutigend. In den meisten Fällen wurde die Transgenprodukt-Expression, vergleichbar zu den endogenen Niveaus von APP oder diese überschreitend, nicht erreicht, und die Transgene codierten keine mutierten APPs. PCT/US92/11276 berichtet Verfahren zur Verwendung von mutanten Genen. In einigen Fällen wurde nicht das vollständige APP-Gen exprimiert, sondern nur das Carboxylende (Kammesheidt, et al., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89, 10857–61). Dies kann jegliche biologischen Wirkungen, die der Rest des APP-Moleküls in AD ausüben kann, überragen.
Voramyloid-APP-Plaques sind in einigen transgenen Mäusen beobachtet worden. Jedoch lassen die Voramyloid-APP-Plaques nicht zwangsläufig auf eine Krankheit schließen, da sie routinemäßig in humanen Gehirnregionen wie dem Kleinhirn beobachtet werden, die frei von anderen Anzeichen von Pathologie oder klinischen Manifestationen sind. Es ist von erhöhter APP-Immunreaktivität, die in vesikulären Strukturen in Hippocampusneuronen von transgenen Mäusen lokalisiert ist, berichtet worden, aber die Signifikanz dieser Immunreaktivität ist unklar, da die Mäuse weder eine progressive neurobehaviorale Störung noch den Beweis für echte Neuropathologie zeigten.
Im allgemeinen ist der endlose progressive Verlauf der neurodegenerativen Krankheit von den gegenwärtigen Behandlungsmethoden unbeeinflußt. Es ist daher von Interesse, ein transgenes nicht-humanes Säugermodell für degenerative neurologische Krankheiten wie senile Demenz und AD zu entwickeln, wobei das Tier eine progressive, degenerative, neurologische Krankheit des cortico-limbischen Gehirns entwickelt, die der Krankheit sowohl klinisch als auch pathologisch ähnelt (beispielsweise die Gliose und die speziellen betroffenen Gehirnregionen). Es ist ebenso wünschenswert, daß das Tier eine neurologische Krankheit in einem ziemlich kurzen Zeitraum von der Geburt an entwickelt, was die Analyse von Stammbäumen über mehrere Generationen erleichtert. Das Modell kann verwendet werden, um die Pathogenese und die Behandlung der degenerativen neurologischen Krankheiten zu untersuchen, da es einen bestimmten und robusten klinischen und pathologischen Phänotyp gibt, der zu untersuchen und zu bewerten ist.
Relevante Literatur
Quon et al. (1991) Nature 352: 239 beschreibt transgene Mäuse, die humane Amyloid-Vorläuferproteingene enthalten. Lamb et al. (1993) Nature Genetics 5: 22 beschreibt transgene Mäuse, bei denen die Menge an exprimiertem Amyloid-Vorläuferprotein ungefähr 50% über den endogenen Niveaus liegt. Die PCT-Anmeldung US 92/11276 offenbart Verfahren zum Konstruieren von transgenen Mäusen und Ratten, die unter verschiedenen Promotoren drei Formen des B-Amyloid-Vorläuferproteins (APP), APP 69S' APP 751 und APP 770, exprimieren würden. Es werden in der Beschreibung keine Daten bereitgestellt, ob die Expression in vivo unter Verwendung dieser Verfahren erhalten wurde.
Andere Untersuchungen von Alzheimer-Amyloid-Vorläuferprotein (APP) von transgenen Mäusen umfassen folgendes. (Greenberg, B. D. (1993) Abstract 421.12, Society for Neuroscience Abstracts 19: 1035.) Das APP-Proteingen wurde unter Verwendung von MAPP- und mMt-I-Promotoren exprimiert. Schwartz, et al. ((1993) Abstract 421.13, Society for Neuroscience Abstracts, 19: 1035) offenbart die Neuron-spezifische Expression von humanem Beta-Amyloid-Vorläuferprotein (APP) bei transgenen Mäusen. Savage, et al. ((1993) Abstract 421.14 Society for Neuroscience Abstracts 19: 1035) offenbart 5 humane Amyloid-Vorläuferprotein-Expressionen bei transgenen Mäusen als ein Modell der Alzheimer-Krankheit: Search for Pathology. Lieberburg, I. ((1993) Abstract 421.15, Society for Neuroscience Abstracts 19: 1035) offenbart die Expression des humanen Proteins bei transgenen Mäusen unter Verwendung des NSE-Promotors. Fukuchi, K. et al. ((1993) Abstract 421.16, Society for Neuroscience Abstracts 19: 1035) offenbart Darm-beta-Amyloidose bei transgenen Mäusen. Ein Hühner-beta-Actin-Promotor und ein CMV-Enhancer wurden zum Exprimieren des APP-Proteingens verwendet.
Wagner et al. ((1981) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 5016) beschreiben transgene Mäuse, die humane Globingene enthalten. Scott et al. ((1989) Cell 59: 847) beschreiben transgene Mäuse, die Hamster-Prionproteingene enthalten. Hsiao et al. ((1990) Science 250: 1587) beschreiben transgene Mäuse, die humane Mutanten-Prionproteingene enthalten. Hsiao offenbart ein Modell für die Gerstmann-Straussler-Scheinker-Krankheit (GSS), eine seltene neurodegenerative Krankheit, die durch Mutationen in dem Prionprotein-(PrP-)-gen verursacht wird, bei transgenen Mäusen, bei denen die Niveaus des mutanten Transgenproduktes, die die endogenen Niveaus überschreiten, nicht benötigt wurden, um einen klinischen und pathologischen Phänotyp zu erzeugen (Hsiao et al., (1990) Science 250: 1587–1590); Hsiao, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 9126–9130).
Zusammenfassung der Erfindung
Ein transgenes nicht-humanes Tiermodell für die progressive neurologische Krankheit wird zusammen mit Verfahren und Zusammensetzungen zum Präparieren des Tiermodells und Verfahren zu deren Verwendung bereitgestellt. Die nicht-humanen Säuger werden durch die Schritte des Einbringens von mehreren Kopien einer Expressionskassette in den nicht-humanen Säuger im Embryonalstadium, und des Entwickelns des Embryos, um es in einer pseudoschwangeren Pflegemutter auszutragen, erhalten. Die Expressionskassette umfaßt eine Amyloid-Vorläuferprotein-Codierungssequenz, die operabel mit Regulationssequenzen zur Expression der Codierungssequenz in neurologischen Geweben bei einem Niveau von mindestens dem zwei- bis vierfachen der endogenen Niveaus des Amyloid-Vorläuferproteins vom Wildtyp verbunden sind. Die resultierenden transgenen nicht-humanen Säuger entwickeln eine progressive neurologische Krankheit in den cortico-limbischen Regionen des Gehirns. Die transgenen nicht-humanen Lebewesen finden beispielsweise Verwendung in Screening-Protokollen zur Behandlung und Vorbeugung von progressiven neurologischen Krankheiten.
Zeichnungen
1 zeigt eine graphische Darstellung einer HuAPP-cDNA-Sequenz.
2 zeigt eine graphische Darstellung von unterschiedlichen APP-Sequenzen, die in transgenen Tieren exprimiert werden können (nicht erschöpfend).
3 zeigt eine graphische Darstellung eines Hamster-PrP-Cosmid-Vektors mit einer Tetracyclin-resistenten Sequenz, flankiert durch SalI-Stellen, die die PrP-Codierungssequenz ersetzt.
4 und 5 zeigen graphische Darstellungen eines Hamster-PrP-Cosmid-Vektors, fusioniert mit HuAPP-Sequenzen, modifiziert zur starken Translationsinitiation, wie in den 6 und 7 dargestellt.
6 und 7 zeigen graphische Darstellungen von HuAPP-Sequenzen, modifiziert zur starken Translationsinitiation, und flankierenden SalI-Restriktionsstellen.
8 zeigt eine graphische Darstellung von PCR-Primern, die verwendet werden können, um Transgene nachzuweisen.
9 zeigt altersabhängige ZNS-Funktionsstörungen bei transgenen und nicht-transgenen FVB-Mäusen. Bei zwei Linien von Tg-Mäusen, Tg(HuAPP695.TRImyc)1130H und Tg(HuAPP695.TRImyc)1118, die abweichendes HuAPP bei 3,6- bzw. 1,4-fachen endogenen MoAPP-Niveaus exprimieren, war der durchschnittliche Ausbruch der Krankheit in Bezug auf die APP-Niveaus umgekehrt. Eine Teilmenge von Tg(HuAPP695.WTmyc)1874-Mäusen und Nicht-Tg-Mäusen entwickelte klinische und pathologische Abnormalitäten ähnlich denen bei betroffenen Tg-Mäusen, aber mit signifikant geringerer Häufigkeit bei jedem gegebenen Alter.
10 zeigt cortico-limbische, hypertrophe, astrozytische Gliose bei transgenen und nicht-transgenen FVB-Mäusen, die Verhaltensabnormalitäten aufweisen. Koronaabschnitte von cortico-limbischen und Hirnstammstrukturen, die mit Antikörper zu GFAP umgesetzt wurden, zeigen hypertrophe Gliose in cortico-limbischen Feldern von Tieren, die Verhaltensabnormalitäten zeigen. 10A, Tg(HuAPP695.TRImyc)1118-334 zeigt Verhaltensabnormalitäten (Bewegung und niedrige Eckindexpunkte) bei einem Alter von 144 Tagen, getötet nach 206 Tagen; 10B, Nicht-Tg-Wurfpartner von Tg1118-334 ohne Verhaltensabnormalitäten, Alter 206 Tage; 10C, Nicht-Tg #4565 zeigt Verhaltensabnormalitäten (Inaktivität und niedrige Eckindexpunkte) bei einem Alter von 324 Tagen, getötet nach 334 Tagen; 10D, Nicht-Tg-Wurfpartner von #4565 ohne Verhaltensabnormalitäten, Alter 334 Tage.
11 zeigt die transgene HuAPP-Proteinexpression im Gehirngewebe. Die HuAPP-Proteinexpression wurde in einer semiquantitativen Weise in vier Linien von Tg- Mäusen, Tg(HuAPP695.Wtmyc)466, Tg(HuAPP695.TRImyc)1056, Tg(HuAPP695.TRImyc)1118, Tg(HuAPP695.TRImyc)1130H, die 40, 7, 21 bzw. 74 transgene Kopienzahlen beherbergen, gemessen. Relative Niveaus von transgenen im Vergleich zu endogenen Gehirn-MoAPP wurden durch Immunoblotting-Analyse mit zwei polyklonalen APP-Antiseren, CT15 (11A) und Anti-GID (11A), und einem monoklonalen Antikörper, 22C11 (11B), überprüft. Ct15-Antiserum erkannte die C-terminalen 15 Aminosäuren von APP, eine Region, bei der Mäuse- und humanes APP homolog sind. GID-Antiserum erkennt ein Epitop, 175–186 Reste aus dem Aminoterminus von APP695, eine Region, bei der Mäuse- und humanes APP identisch sind. Äquivalente Mengen an Protein aus Detergens-extrahierten Gehirnhomogenaten von Nicht-Tg- und Tg-Wurfpartnern wurden parallel durch Immunoblotting analysiert. Der primäre Antikörper wurde durch ¹²⁵I-Protein-A erkannt. Für monoklonale Antikörper wurden Blots zunächst mit Kaninchen-Antiserum zu Mäuse-IgG inkubiert. Die Menge an gebundenem ¹²⁵I-Protein-A wurde unter Verwendung eines Phosphorabbilders quantifiziert, der die direkte Beziehung zwischen transgener Kopienzahl und transgener Produktexpression darstellt. Um speziell das Niveau von HuAPP zu messen, wurden Gehirnhomogenate mit 6E10-Antikörper geprüft, gezüchtet gegen Reste 1–17 von humanen Aβ (Kim, et al. (1990) Neuroscience Research Communications 7, 113–122). 11c zeigt die regionale Expression von HuAPP im Gehirn. Die relative Menge von HuAPP in 10% G/V Homogenaten von verschiedenen Geweben wurde speziell in Tg(HuAPP695.TRImyc)1130H-Mäusen unter Verwendung des 6E10-Antikörpers nachgewiesen. Äquivalente Mengen an Protein wurden in jeder Spur durch Immunoblotting analysiert. Spuren 1, Endhirn; 2, Zwischenhirn; 3, Mittelhirn; 4, Gehirnbrücke; 5, Kleinhirn; 6, Medulla; 7, Rückenmark. Das höchste HuAPP-Niveau im Endhirn betrug ungefähr das Zweifache von dem des Kleinhirns.
12 zeigt die Abhängigkeit der transgenen Gehirn-APP-Expression von der Spezies und der Kopienzahl.
13 zeigt HuAPP-Expression in Neuronen von transgenen Mäusen. 13A, Tg, Ameisensäurevorbehandlung, 6E10-Antikörper (Hippocampus); 13B, Nicht-Tg, Ameisensäurevorbehandlung, 6E10-Antikörper (Hippocampus); 13C, Tg, Ameisensäurevorbehandlung, 6E10-Antikörper (Hirnrinde); 13D, AD-Plaque, Ameisensäurevorbehandlung, 6E10-Antikörper; 13E, AD-Plaque, keine Ameisensäurevorbehandlung, 6E10-Antikörper; 13F, AD-Plaque, Mikrowellenvorbehandlung, 8E5-Antikörper; 13G, Tg, Mikrowellenvorbehandlung, 8E5-Antikörper (Hippocampus); 13H, Nicht-Tg, Mikrowellenvorbehandlung, 8E5-Antikörper (Hippocampus).
14 zeigt die Abhängigkeit der ZNS-Störung von dem Niveau der transgenen Gehirn-APP-Expression und APP-Genotyp.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die Erfindung betrifft ein transgenes nicht-humanes eukariotisches Lebewesen, vorzugsweise ein Nagetier wie eine Maus, zusammen mit Verfahren und Zusammensetzungen zum Präparieren und Verwenden des Tiers. Das Tier exprimiert eine Amyloid-Vorläuferprotein-(APP-)-Sequenz bei einem Niveau im Gehirngewebe, so daß das Tier eine progressive neurologische Erkrankung in einem kurzen Zeitraum von der Geburt an, im allgemeinen innerhalb eines Jahres von der Geburt an, vorzugsweise innerhalb von 2 bis 6 Monaten von der Geburt an, entwickelt. Die APP-Proteinsequenz wird in das Tier oder einen Vorfahren des Tieres in einem Embryonalstadium, vorzugsweise das Einzellenstadium oder die befruchtete Eizelle, und im allgemeinen nicht später als etwa das 8-Zellstadium eingebracht. Die Zygote oder der Embryo entwickelt sich dann und wird in einer pseudoschwangeren Pflegemutter ausgetragen. Die Amyloid-Vorläuferproteingene werden in ein Tierembryo eingebracht, damit sie chromosomal in ein Stadium eingebracht werden, das zur supraendogenen Expression des Amyloid-Vorläuferproteins und der Entwicklung einer progressiven neurologischen Krankheit in den cortico-limbischen Feldern des Gehirns führt, also den Regionen des Gehirns, die überwiegend bei progressiven neurologischen Krankheitsstadien wie AD betroffen sind.
Die vorliegende Erfindung bietet mehrere Vorteile gegenüber existierenden Modellen für progressive neurologische Erkrankungen wie AD. Die transgenen Tiere exprimieren hohe Niveaus von entweder natürlichem APP oder mutantem APP und entwic keln eine neurologische Krankheit, die von vorzeitigem Tod begleitet ist. Gliose und intrazelluläre APP/Aβ-Ablagerungen liegen im Hippocampus und der Hirnrinde vor. Die Gliose und klinischen Manifestationen bei betroffenen transgenen Tieren sind ein Anzeichen für eine echte neurologische Krankheit. Die progressiven Aspekte der neurologischen Krankheit sind durch das verminderte exploratorische/lokomotorische Verhalten und die/den verminderte(n) 2-Deoxyglukose-Aufnahme/Umsatz und die hypertrophe Gliose in den cortico-limbischen Regionen des Gehirns gekennzeichnet. Außerdem sind die gesehenen Veränderungen denen ähnlich, die in einigen alternden Tieren gesehen werden.
Zu transgenen nicht-humanen Tieren der Erfindung gelangt man über die Konstruktion einer Expressionskassette, die in der 5'-3'-Richtung der Transkription eine Transkriptions- und Translationsinitiationsregion, die mit der Genexpression im Gehirngewebe assoziiert ist, DNA, die Mutanten- oder Wildtyp-APP codiert, und eine in dem Wirtstier funktionale Transkriptions- und Translationsterminationsregion umfaßt. Ein oder mehrere Introns können ebenso vorliegen.
Zur Expression sind die Initiationsregionen von besonderem Interesse (manchmal auch als „Promotor" bezeichnet), die eine bevorzugte oder zumindest im wesentlichen spezifische Expression im Gehirn im Vergleich zu anderem Gewebe bereitstellen. Unter „zumindest im wesentlichen" ist zu verstehen, daß die Expression im Gehirngewebe größer als etwa das 10fache als in anderem Gewebe ist. Im Gehirn ist die Expression im cortico-limbischen Feld von besonderem Interesse. Die Transkriptionsinitiationsregion kann endogen zu dem Wirtstier oder fremd oder exogen zu dem Wirtstier sein. Unter fremd ist zu verstehen, daß die Transkriptionsinitiationsregion in dem Tierwirt vom Wildtyp nicht gefunden wird, in den die Transkriptionsinitiationsregion eingebracht wird. Unter endogen sind sowohl die Sequenzen zu verstehen, die dem Wirtstier angeboren sind (d. h. natürlich), als auch die, die in dem Wirtstier aufgrund einer Infektionskrankheit, beispielsweise viral, Prion und dergleichen, vorliegen.
Der Promotor umfaßt vorzugsweise eine Transkriptionsinitiations-Regulationsregion und Translationsinitiations-Regulationsregion von nicht-translatierten 5'-Sequenzen, „Ribosombindungsstellen", die für das Binden von mRNA an Ribosome und die Translationsinitiation verantwortlich sind. Die Transkriptionsinitiations-Regulationsregion kann aus cis-aktiven Subdomänen bestehen, die die Transkription als Antwort auf das Binden der transaktiven Faktoren, die in variierenden Mengen in unterschiedlichen Zellen vorliegen, aktivieren oder unterdrücken. Es ist bevorzugt, daß alle Transkriptions- und Translations-funktionellen Elemente der Initiationskontrollregion aus demselben Gen abgeleitet sind oder daraus erhältlich sind. In einigen Ausführungsformen wird der Promotor durch die Addition von Sequenzen, wie Enhancer, oder Deletionen von unwesentlichen und/oder unerwünschten Sequenzen modifiziert. Unter „erhältlich" ist ein Promotor mit einer DNA-Sequenz zu verstehen, die der eines natürlichen Promotors ausreichend ähnlich ist, um die gewünschte Spezifizität der Transkription einer DNA-Sequenz von Interesse bereitzustellen. Er umfaßt natürliche und synthetische Sequenzen sowie Sequenzen, die eine Kombination aus synthetischen und natürlichen Sequenzen sein kann.
Die Gewebe-spezifische Transkription läßt darauf schließen, daß Genregulationsroteine an Enhancersequenzen und andere Upstream-Promotor-Elemente gebunden werden können. Unter Enhancer-Element („Enhancer") ist eine Regulations-DNA-Sequenz zu verstehen, die fähig ist, die Transkription von einem daran geknüpften Promotor zu aktivieren, wobei die Synthese an der normalen RNA-Startstelle beginnt; die fähig ist, in beiden Richtungen zu verlaufen (normal oder umgekehrt); und funktioniert, selbst wenn sie entweder stromaufwärts oder -abwärts vom Promotor bewegt wird. Sowohl Enhancer als auch andere Upstream-Promotor-Elemente binden Sequenz-spezifische DNA-bindende Proteine, die ihre Wirkungen vermitteln. Um die genauen Nukleotidsequenzen, die für die Funktion des Enhancers und andere Upstream-Elemente wichtig sind, nachzuweisen, werden Fragmente der nicht-translatierten 5'-Region, die ein Protein codiert, welches in einem Gewebe von Interesse exprimiert wird, hinsichtlich ihrer Fähigkeit, nukleare Proteine zu binden, und hinsichtlich ihrer Fähigkeit, mit einem heterologen Promotor zu funktionieren, gescreent. Bindungsexperimente mit nuklearen Proteinen aus Gehirngewebe können angewendet werden, um die Gegenwart von Enhancer- und Silencer-Sequenzen zu bestimmen; die Proteinbindungsstudien können angewendet werden, um die spezifischen Nukleotidsequenzen, die an eine entsprechende Reihe von Genregulationsproteinen binden, genau zu bestimmen.
Die Aktivität von jedem Enhancer und anderen Upstream-Promotor-Elementen liegt im allgemeinen auf einem DNA-Segment vor, das Bindungsstellen für mehrere Proteine enthalten kann. Die Bindungsstellen können im allgemeinen durch Herstellen kleinerer mutierter Versionen der Enhancersequenz, die mit einem Reportergen verbunden ist, dessen Produkt leicht gemessen wird, durchtrennt werden. Die Wirkung jeder Mutation auf die Transkription kann dann getestet werden. Alternativ können Fragmente dieser Region hergestellt werden. Jede der mutierten Versionen der Enhancersequenz oder der Fragmente kann in eine geeignete Wirtszelle eingebracht und die Wirksamkeit der Expression eines Reportergens gemessen werden. Diese Nukleotide, die für die Enhancerfunktion in diesem Test erforderlich sind, werden dann als Bindungsstellen für spezifische Proteine mittels Gelmobilitätsverschiebung und DNA-Footprint-Studien nachgewiesen.
Ein alternatives Mittel zur Prüfung der Fähigkeit von isolierten Fragmenten der Upstreamregion des Promotors, die Expression des Reportergens zu verbessern, ist, nach Subdomänen der Upstreamregion zu suchen, die fähig sind, die Expressionsniveaus eines Testpromotors, der die TATA CAAT-Box umfaßt, aber wenig oder keine nachweisbare Aktivität zeigt, zu verbessern. Ein Fragment der 5'-Region wird vor dem Testpromotor in einer Expressionskassette eingefügt und die Wirkung auf die Expression des Reportergens bewertet.
Von besonderem Interesse für Gehirn-spezifische, Kopienzahl-abhängige Expression sind Regionen, die zum Binden an nukleare Proteine in der Region bis zu etwa 20 kb von der mRNA-Startstelle eines Gehirn-spezifischen Proteingens fähig sind. In dieser Region kann es mehrere Subdomänen von Interesse mit den Merkmalen von Gehirn-spezifischen Enhancerelementen geben, die unter Verwendung von Konstrukten bewertet werden können.
Ein Promotor aus einem Gen, das im Gehirngewebe des Wirtstieres exprimiert wurde, kann zum Verändern des Phänotyps des Wirtstiers eingesetzt werden. Das Transkriptionsniveau sollte ausreichend sein, um eine Menge an RNA bereitzustellen, die zur Produktion in einem modifizierten Tier fähig ist. Unter „modifiziertem Tier" ist in der vorliegenden Erfindung ein Tier zu verstehen, das einen nachweisbaren unterschiedlichen Phänotyp zu einem nicht-transformierten Tier derselben Gattung auf weist, beispielsweise eines ohne die Transkriptionskassette einschließlich der APP-Codierungssequenzen in seinem Genom. Verschiedene Veränderungen im Phänotyp sind von Interesse. Diese Veränderungen können eine progressive neurologische Krankheit in den cortico-limbischen Feldern des Gehirns, die in einem kurzen Zeitraum von Geburt an exprimiert wurden, erhöhte Niveaus an Expression eines APP-Gens über den endogenen Expressionsniveaus und die Entwicklung einer neurologischen Krankheit, die von vorzeitigem Tot begleitet ist, Gliose und intrazelluläre APP/Aβ-Ablagerungen, die im Hippocampus und der Hirnrinde vorliegen, eine progressive neurologische Krankheit, die durch das verminderte exploratorische/lokomotorische Verhalten und die/den verminderte(n) 2-Deoxyglukose-Aufnahme/Umsatz und die hypertrophe Gliose in den cortico-limbischen Regionen des Gehirns gekennzeichnet ist, umfassen.
Von besonderem Interesse als eine Transkriptionsinitiationsregion ist ein Prionproteingen, das in dem Gehirn des Wirtstieres funktionell ist. Das Prionprotein ist an der Pathogenese und Transmission des Gerstmann-Straussler-Syndroms und an Scrapie, eine äquivalente Tierkrankheit, beteiligt. Gehirngewebe dient als eine Quelle für Nukleinsäure zur Herstellung der gewünschten Sequenzen. Um einen Prionpromotor mit den gewünschten Merkmalen nachzuweisen, wo ein Prionprotein isoliert worden ist oder isoliert wird, kann es teilweise sequenziert werden, so daß eine Probe zur Identifizierung von mRNA, die für das Prionprotein spezifisch ist, bestimmt wird. Sequenzen, die zu der cDNA hybridisieren, können dann isoliert, manipuliert und die 5'-nicht-translatierte Region, die mit der Codierungsregion assoziiert ist, isoliert und in den Expressionskonstrukten verwendet werden, um die Transkriptionsaktivität der 5'-nicht-translatierten Region zu identifizieren. Wenn geeignet, können die Sequenzen unter Verwendung von PCR-Verfahrensweisen, die dem Fachmann bekannt sind, verstärkt werden. In einigen Fällen kann eine Probe direkt zum Screenen einer Genbibliothek und Identifizieren von Sequenzen, die zu der Probe hybridisieren, eingesetzt werden. Die Sequenzen werden manipuliert, wie oben beschrieben, um die nicht-translatierte Region zu identifizieren. Prionpromotorsequenzen sind bei Basler, et al. (1986), Cell 46: 417–428 und Scott, et al. (1992) Protein Science 1: 986–987 beschrieben.
Eine Vielzahl von anderen Promotorsequenzen kann verwendet werden, um die Expression von APP-Codierungssequenzen zu kontrollieren. Diese umfassen die Metallothionin-(MT-)-Promotorexpression, die durch die Modulation von Zink- und Glucocorticoidhormonniveaus reguliert werden kann (Palmiter et al., Nature 300, 611–615 (1982)); den Rattenneuronen-spezifischen Enolasegenpromotor (Forss-Petter et al., Neuron 5; 197–197 (1990)); den humanen β-Actin-Genpromotor (Ray et al., Genes and Development (1991) 5: 2265–2273); den humanen Blutplättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor B-(PDGF-B)-Kettengenpromotor (Sasahara et al, Cell (1991) 64: 217–227); den Rattennatriumkanal-Genpromotor (Maue et al., Neuron (1990) 4: 223–231); den humanen Kupfer-Zink-Superoxid-Dismutase-GenPromotor (Ceballos-Picot et al., Brain Res. (1991) 552: 198–214); und Promotor für Mitglieder der Säuger-POU-Domäne-Regulationsgenfamilie (Xi et al., (1989) Nature 340: 35–42). Die POU-Domäne ist die Region mit Ähnlichkeit zwischen den vier Säugertranskriptionsfaktoren Pit-1, Oct-1, Oct-2 und unc-86, und stellt einen Teil der DNA-bindenden Domäne dar. Diese Promotoren stellen die spezifische Expression innerhalb der Neuronen von transgenen Tieren bereit.
Die Terminationsregion, die in erster Linie eingesetzt wird, ist von Vorteil, da die Terminationsregionen scheinbar relativ austauschbar sind. Die Terminationsregion kann eine natürliche Transkriptionsinitiationsregion sein, kann eine natürliche DNA-Sequenz von Interesse sein, oder kann von einer anderen Quelle abgeleitet sein. Geeignete Terminationsregionen sind aus dem Prionproteingen erhältlich.
Die Expressionskassette, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfaßt Promotor- und Enhancersequenzen aus einem Gen, das im Gehirn exprimiert wird, und das vorzugsweise in einer Weise exprimiert wird, die zu einer Anzahl dieser in das Chromosom eingebrachten Sequenzen verwandt ist, daß nämlich höhere Transkription mit einer größeren Anzahl an in das Chromosom eingebrachten transgenen Kopien auftritt, die operabel mit einer APP-Gensequenz und Translations- und Transkriptionsterminationsregionen verbunden sind. Beispiele von Promotor- und Enhancersequenzen, die im Gehirn exprimiert werden, und die die Kopienzahl-abhängige Expression antreiben, umfassen den Prionproteinpromotor, wie der von Scott et al. Protein Science (1992) 1: 986–987 beschrieben, zusammen mit Sequenzen stromaufwärts des Promotors, da es, um die Kopienzahl-abhängige Expression zu erhal ten, im allgemeinen notwendig ist, eine ausreichend große Region der DNA-Kontrolltranskription einzubeziehen, um von den Positionswirkungen relativ unbeeinflußt zu sein. Als ein Beispiel können für das Prionproteingen vom Hamster ungefähr 20 kb Sequenz stromaufwärts des Promotors verwendet werden.
Als ein Beispiel der Konstruktion eines Cosmid-Vektors zur Verwendung in der Erfindung umfassen Komponenten, die in der 5'- bis 3'-Richtung vereinigt sind, Promotor- und Enhancersequenzen des Prionproteingens, die Codierungsregion einer APP-Gensequenz von Interesse und Transkriptions- und Translationsterminationssequenzen, operabel angelagert an einen Cosmid-Vektor zur Zufuhr der DNA-Konstrukte in den Vorkern von Mauseiern zur Expression eines APP-Gens im Gehirngewebe. Die Enhancersequenzen können eine 20 kb Upstreamregion des Prionprotein-Promotors umfassen und können ebenso das nicht-codierende Exon 1 und das 10 kb Intron stromabwärts des Exon 1 von dem Prionproteingen umfassen oder können die Codierungssequenz für mehr als ein APP-Protein umfassen, wie beispielsweise in WO92/11276 beschrieben. Unter Verwendung von in der Technik bekannten Molekulargentechniken kann die Promotor/Enhancer-Region des Prionproteingens aus einem Säuger-Genom-Cosmidklon, der verwendet wird, um transgene Mäuse zu erzeugen, die das Prionprotein exprimieren, isoliert werden. Die Codierungssequenz eines APP-Gens wird zwischen die Promotor/Enhancer-Region und die Terminationssequenzen bei einer einmaligen Restriktionsstelle oder -stellen eingefügt, so daß die Codierungssequenz im Rahmen translatiert wird. Es kann bestätigt werden, daß ein APP-Protein in transgenem Gehirngewebe, das unter Verwendung eines Cosmid-Vektors, wie oben beschrieben, eingefügt wurde, zumindest das Zwei- bis Vierfache der endogenen Niveaus ist.
Ein Haupthindernis für die Erzeugung eines transgenen Modells von AD ist die Unfähigkeit gewesen, das transgene APP-Protein im Gehirn des transgenen Tieres überzuexprimieren. In einigen Fällen wird die mRNA gut exprimiert, aber das Protein wird schlecht exprimiert. Dies zeigt, daß die Stärke der verwendeten Promotoren ausreichend sein kann, aber daß die Proteintranslation nicht optimal sein kann. Schlechte Translation kann aus einer schwachen Translationsinitiationssequenz resultieren. Folglich kann es notwendig sein, eine Translationsinitiationssequenz einzubeziehen, worin die Stellen bei minus drei und plus vier in Bezug auf das Initiationscodon A bzw. G sind. Siehe nachstehend Tabelle 1.
Table 1 Transgene Translationsinitiations-Sequenzoptimierung
Eine beliebige Amyloid-Vorläuferproteinsequenz kann verwendet werden, um die transgenen Tiere der Erfindung zu erhalten. Eine APP-Proteinsequenz, wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bedeutet eine Sequenz der Codierungsregion des APP-Gens, die, wenn sie in das Genom des Tieres in mehreren Kopien eingebracht und in dem transgenen Tier bei supraendogenen Niveaus exprimiert wird, eine progressive neurologische Krankheit bei dem transgenen Tier beschleunigt. Die neurologische Krankheit ist durch eine neurobehaviorale Störung mit Gliose und verminderter Glukoseaufnahme und/oder -umsatz in cortico-limbischen Gehirnstrukturen gekennzeichnet. Die Codierungssequenz kann ein Gen vom Wildtyp oder ein Gen, das ein oder mehrere Mutationen enthält, sein. Die Codierungssequenz kann eine natürliche Sequenz oder eine synthetische Sequenz oder eine Kombination aus natürlichen und synthetischen Sequenzen sein. Unter Mutant ist irgendein APP zu verstehen, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von der des natürlichen APP unterscheidet und Substitutionen, Deletionen und dergleichen umfaßt. Unter APP vom Wildtyp ist natürliches APP zu verstehen, so wie es in dem relevanten Wirtstier auftritt.
Natürliches humanes APP wird durch ein einzelnes 400-kb-Gen codiert, das aus 18 Exonen auf Chromosom 21 besteht. Alternativ ergibt das RNA-Spleißen drei APP-Isoformen. Zwei Formen, APP-751 und APP-770, enthalten eine Kunitz-Protease-Inhibitor-(KPI-)-Region; der dritten, APP-695, fehlt es an dem KPI-Segment. Bevorzugte Sequenzen sind die, die krankheitsabhängig sind. Beispiele von krankheitsabhängigen Mutationen umfassen eine Mutation bei APP-Codon 693 (von APP-770), verbunden mit Dutch-congophiler Angiopathie (Levy et al., (1990) Science 248: 1124), eine Mutation in APP, verbunden mit familiärer AD, Valin-Isoleucin bei Codon 717 (von APP-770) (Goate et al., (1991) Nature 349: 704–706), eine Mutation, wobei das Valin bei Codon 717 durch Phenylalanin oder Glycin ersetzt wird (Chartier-Harlin et al., (1991) Nature 353: 844–846; Murrell et al., (1991) Science 254: 97–99); und in einer Familie mit sowohl congophiler Angiopathie als auch AD eine Mutation, wobei Alanin durch Glycin bei Codon 692 ersetzt wird (Hendriks et al., (1992) Nature Genetics 1: 218–221). Bei einem schwedischen Verwandten wurde eine Doppelmutation bei den Codonen 670 und 671 festgestellt, was zu einer Substitution des normalen Lysin-Methionindipeptids durch Asparagin-Leucin führt (Mullan et al., (1992) Nature Genetics 1: 345–347). Es wird berichtet, daß APP mit M67ON-K67IL mit erhöhter AB 1–40-Sekretion verbunden ist (Citron et al. (1992) Nature 360: 672–674; Cai et al. (1993) Science 259: 514–516), während die verbesserte AB 1–42-Produktion für APP mit der V717I-Mutation berichtet wird (Cai et al. (1993), supra; Suzuki et al. (1994) Science 264: 1335–1340).
Die nachstehende Tabelle 2 listet einige der bekannten Amyloid-Vorläuferproteinsequenzen auf, wobei einige von diesen genetisch an die familiäre Alzheimer-Krankheit gebunden sind.
Tabelle 2 Beispiele von APP-Transgenen
Von besonderem Interesse sind neue chimäre APP-Gene, bei denen humane Aβ-Sequenzen die Aβ-Region von Mäuse-APP ersetzen. A158,5 ist ein 4-kDa-Peptid, das von APP abgeleitet ist. Die Untersuchung von 5 humanen (Hu-), Mäuse-(Mo-) und chimären (Mo/Hu-)-APP, das in Mauszellinien reift, zeigt, daß spürbare Unterschiede offensichtlich sind. Es scheint, daß HuAPP schlecht in Mauszellen in bezug auf Mo- oder Kombination Mo/HuAPP reift. Jedoch beschleunigen die humanen Aβ-Sequenzen die Bildung von löslichen Aβ-Peptiden, die normalerweise hergestellt werden. Mo/HuAPP-chimäres Protein reift effizienter als HuAPP und erzeugt löslicheres Aβ als MoAPP.
Transgene nicht-humane Säuger werden in vielfältiger Weise hergestellt. Ein transgener Organismus ist einer, der ein Extra- oder exogenes DNA-Fragment in seinem Genom aufweist. Um stabile Erbanlagen des Extra- oder exogenen DNA-Fragments zu erreichen, muß der Integrationsvorgang in einem Zelltyp stattfinden, der funktionelle Keimzellen, entweder Spermien oder Eizellen, hervorruft. Zwei Tierzelltypen, die Keimzellen bilden können, und in die DNA ohne weiteres eingeführt werden können, sind befruchtete Eizellen und embryonale Stammzellen.
Embryonale Stamm-(ES-)-zellen können aus der in vitro-Kultur zu einem „Wirtsembryo" rückgeführt werden, wo sie in das sich entwickelnde Tier eingebracht werden und transgene Zellen in allen Geweben einschließlich Keimzellen entstehen lassen. Die ES-Zellen werden in Kultur transfiziert, woraufhin die Mutation in den Keim durch Injizieren der Zellen in den Embryo übertragen wird. Die Tiere, die mutierte Keimzellen tragen, werden dann gezüchtet, um transgene Nachkommen zu erzeugen.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Präparieren von transgenen nicht-humanen Tieren ist die Zygoteninjektion. Dieses Verfahren wird beispielsweise in USPN 4,736,866 beschrieben. Das Verfahren umfaßt das Injizieren von DNA in ein befruchtetes Ei oder Zygote und dann die Entwicklung des Eis in einer pseudoschwangeren Mutter. Die Zygote kann unter Verwendung von männlichen und weiblichen Tieren desselben Stammes oder von männlichen und weiblichen Tieren von unterschiedlichen Stämmen erhalten werden. Das transgene Tier, das geboren wird, wird als Gründer bezeichnet, und es wird gebrütet, um mehr Tiere mit derselben DNA-Insertion zu erzeugen. In diesem Verfahren zum Präparieren von transgenen Tieren integriert sich die neue DNA typischerweise zufällig in das Genom durch einen nicht-homologen Rekombinationsvorgang. Eine bis mehrere tausend Kopien der DNA können sich an einer Stelle in das Genom integrieren.
Im allgemeinen wird die DNA in einen der Vorkerne, normalerweise den größeren männlichen Vorkern, injiziert. Die Zygoten werden dann entweder am selben Tag übertragen oder über Nacht kultiviert, um 2-Zell-Embryos zu bilden, und dann in die Eileiter der pseudoschwangeren Weibchen übertragen. Die geborenen Tiere werden auf das Vorhandensein der gewünschten integrierten DNA gescreent. Unter pseudo-schwangeres Weibchen ist ein Weibchen in der Brunst zu verstehen, das mit einem vasektomierten Männchen gepaart wird; sie kann Embryos empfangen, aber enthält keine befruchteten Eier. Pseudoschwangere Weibchen sind wichtig zum Präparieren von transgenen Mäusen, da sie als Leihmütter für Embryos dienen, die mit DNA oder embryonalen Stammzellen injiziert wurden.
Vermeintliche Gründer werden hinsichtlich der Gegenwart des Transgens auf mehrere Weisen gescreent. Gehirn-APP-Protein und RNA-Expression werden analysiert und die transgene Kopienzahl unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren bestimmt. Gehirn-APP-Protein, RNA-Expression und transgene Kopienzahlen werden in kürzlich entwöhnten Tieren (4 bis 5 Wochen) bestimmt. Da der Prionprotein-Genpromotor bei Tieren vom entwöhnten Alter oder älter wesentlich aktiv ist, wird nicht erwartet, daß es Veränderungen in den Niveaus von transgenen APP-RNA-Expressionstieren über dem entwöhnten Alter geben wird. APP-Niveaus können überwacht werden, um zu bestimmen, ob es eine konsistente Veränderung in den Expressionsniveaus mit dem Alter gibt. Die transgenen Tiere werden ebenso hinsichtlich der klinischen Veränderungen beobachtet. Beispiele von neurobehavioralen Störungen zur Bewertung sind schlechte Paarung, Bewegung, vermindertes exploratorisches Verhalten bei neuen Einstellungen, Inaktivität, Krämpfe und vorzeitiger Tod. Hinsichtlich der transgenen Kopienzahl sind ausreichende Kopien, um die gesamte Gehirn-APP-Expression aus jedem Konstrukt von mindestens dem Zweifachen, vorzugsweise mindestens dem Zwei- bis Vierfachen, von einem endogenen natürlichen Gen zu erreichen, bevorzugt. Diese Anzahl kann zwischen fünf Kopien bis mehr als 60 Kopien in Abhängigkeit von der Spezies des exprimierten APP und den speziell Krankheits-assoziierten Mutationen in dem APP-Gen liegen. Ausreichende Kopien eines Transgens bedeutet daher die Zahl, bei der die Expression von APP bei einer Menge erzeugt wird, die zu einer progressiven neurologischen Störung führt.
Es ist eine Theorie der Erfindung, daß die klinischen Veränderungen, die in transgenen Mäusen beobachtet wurden, das Ergebnis einer Erhöhung der Menge an APP, das exprimiert wird, sind, weshalb ausreichende Kopien eines APP-Gens notwendig sind, um ein Expressionsniveau von speziellem APP-Gen zu erreichen, das zu beobachtbaren klinischen und/oder Verhaltenssymptomen, zusammen mit einer meßbaren biochemischen Veränderung der relevanten Gehirnstrukturen, führt. Weniger wünschenswert würden nur biochemische Veränderungen erhalten werden. Unter ausreichenden Kopien ist zu verstehen, daß das gesamte Expressionsniveau aus jedem Konstrukt mindestens das Zweifache, vorzugsweise mindestens das Zwei- bis Vierfache von einem endogenen natürlichen Gen beträgt, oder daß die gesamte Kopienzahl so ist, um diese relative Erhöhung zu erreichen. In einigen Fällen können zwei bis vier Kopien des Gens, insbesondere ein mutiertes krankheitsabhängiges Gen, ausreichend sein, um eine gewünschte relative Erhöhung in APP zu erreichen, während bei anderen, insbesondere wo ein natürliches Gen verwendet wird, eine größere Kopienzahl erforderlich sein kann. In einigen Fällen kann eine geringere Menge an APP beim Herstellen einer progressiven neurologischen Störung wirksam sein, insbesondere wo die Mutation in dem APP in der Aβ-Region oder noch stromaufwärts der Aβ-Region des Gens auftritt. Die Anzahl an Kopien eines speziellen Gens, die ausreichend ist, um ein gewünschtes Ergebnis zu erhalten, kann empirisch bestimmt werden. Als ein Beispiel beträgt der wirksame Bereich der Kopienzahl für HuAPP695.TRImyc ungefähr 20 bis 75; für HuAPP695.SWE ungefähr 30 bis 50; und MoAPP.wg ist größer als 25.
Die Gründertiere können verwendet werden, um stabile Linien von transgenen nicht-humanen Tieren zu erzeugen, die APP, entweder mutantes oder natürliches APP, superexprimieren. Für die Leichtigkeit der Fortpflanzung werden männliche Gründermäuse bevorzugt. Die Tiere werden klinisch beobachtet. Analysen der transgenen Kopienzahl (um mehrere transgene Einführungsstellen auszuschließen), mRNA-Expression, Proteinexpression, Neuropathologie und Glukoseaufnahme werden bei diesen Tieren ebenso durchgeführt. Diese Untersuchungen stellen Informationen über das Alter des Krankheitsbeginns, die Dauer der Krankheit, die Penetranz des Phänotyps, den Bereich der neuropathologischen 5 Befunde, die regionale Gehirnfunktionsstörung und die Abhängigkeit des Phänotyps von den Proteinexpressionsniveaus bereit.
Die Tiere werden auch unter Verwendung eines Spezies-geeigneten Verhaltenstests gescreent. Beispielsweise sind die Untersuchungen des lokomotorischen/exploratorischen Verhaltens bei Mäusen ein Standardmittel zur Bewertung der Neuropsychologie (File and Wardill, (1975) Psychopharmacologia (Berl) 44: 53–59; Loggi et al., (1991) Pharmacol. Biochem. Behav. 38: 817–822). Beispielsweise wird für Mäuse der „Eckindex" (CI) verwendet. Dies ist ein schneller und einfacher Neuroverhaltenstest, um die Tiere hinsichtlich des Nachweises der Gehirnpathologie zu screenen. Der CI bei transgenen Mäusen, die mutantes und APP vom Wildtyp exprimieren, wird ebenso gemessen. Ein geringer CI (≤ 4) korreliert mit hohen mutanten APP-Transgen-Kopienzahlen, vorzeitigem Tod und neuropathologischen Befunden. Der CI zeigt eine dosierungsabhängige Beziehung zu der transgenen Kopienzahl, was die Gültigkeit ihrer Verwendung beim Bewerten von neurobehavioralen Anzeichen bei transgenen Mäusen unterstützt.
Die Neuropathologie wird bei Tieren ebenso bewertet. Gehirnregionen, die dafür bekannt sind, von AD betroffen zu sein, wie die in der cortico-limbischen Region, werden hinsichtlich Veränderungen einschließlich APP/Aβ-Exkretionen, Gliose und Veränderungen bei der Glukoseaufnahme und -umsatz besonders überprüft. Immunohistologische Untersuchungen von verschiedenen Gehirnregionen werden verwendet, um das transgene Produkt nachzuweisen.
Die Tiere, die als einer Quelle für befruchtete Eizellen oder embryonale Stammzellen als „Wirtstier" verwendet werden, können irgendein nicht-humanes Lebewesen sein, obwohl das bevorzugte Wirtstier im allgemeinen eines ist, das sich für Multigenerationsuntersuchungen eignet. Von besonderem Interesse sind Nagetiere, einschließlich Mäuse, wie Mäuse des FVB-Stammes und gekreuzt von kommerziell verfügbaren Stämmen, wie der (C57B6) × (SJL.F1) Hybrid und der (Swiss Webster) × (C57B16/DBA-z.F1) Hybrid. Die letztere parentale Linie wird ebenso als C57B16/D2 bezeichnet. Andere Stämme und Kreuzstämme von Tieren können unter Verwendung der hierin beschriebenen Techniken hinsichtlich der Eignung zur Verwendung als ein Modell für progressive neurologische Krankheiten wie AD bewertet werden. In einigen Fällen kann jedoch ein Menschenaffe, beispielsweise ein Rhesusaffe, als das Wirtstier insbesondere für therapeutische Tests wünschenswert sein.
Die nicht-humanen Lebewesen der Erfindung können als Versuchstiere für Materialien von Interesse, beispielsweise Antioxidationsmittel, wie Vitamin E oder Lazaroide, verwendet werden, die dafür gedacht sind, Schutz gegen die Entwicklung von AD zu verleihen. Ein Tier wird mit dem Material von Interesse behandelt, und eine verminderte Häufigkeit oder verzögerter Ausbruch der neurologischen Krankheit wird im Vergleich zu nicht-behandelten Tieren als ein Anzeichen von Schutz nachgewiesen. Die Tiere können außerdem als Versuchstiere für Materialien von Interesse verwendet werden, die zur Verbesserung oder Heilung der Alzheimer-Krankheit gedacht sind. Ein Tier mit neurologischer Krankheit wird mit dem Material von Interesse behandelt, und ein verzögerter Tod oder die Verbesserung im neurologischen Verhalten, Gliose oder Glukoseaufnahme/umsatz wird im Vergleich zu nicht-behandelten Tieren mit neurologischer Krankheit als ein Anzeichen von Milderung oder Heilung nachgewiesen.
Die nicht-humanen Lebewesen der Erfindung können verwendet werden, um ein Material oder eine Situation zu testen, beispielsweise Oxidationsmittel oder Schädeltrauma, die für die Förderung oder Provozierung von Alzheimer-Krankheit verdächtig sind, indem das Tier dem Material oder der Situation ausgesetzt wird und der neurobehaviorale Verfall, vorzeitige Tod, Gliose und verminderte Glukoseaufnahme/umsatz als Anzeichen der Kapazität des Testmaterials, die Alzheimer-Krankheit zu induzieren, bestimmt wird. Das Verfahren kann außerdem das Testen von therapeutischen Mitteln umfassen, indem die Tiere einem Material oder einer Situation ausgesetzt werden, die für die Provozierung der Alzheimer-Krankheit verdächtig sind, und die Wirkung des therapeutischen Mittels bewertet wird.
Die sorgfältige Charakterisierung der transgenen Tiere sollte zur Erklärung der Pathogenese von AD führen. Die Sequenz von molekularen Vorgängen im mutanten APP-Stoffwechsel, die zur Krankheit führt, kann untersucht werden. Die Tiere sind ebenso zur Untersuchung verschiedener vorgeschlagener Mechanismen der Pathogenese, einschließlich horizontale Ausbreitung der Krankheit (Prusiner, et al. (1987) Cell 63, 673–86), Oxidation und Radikalherstellung (Blass and Gibson, (1991) Rev. Neurol (Paris) 147: 513–525; Ames et al., (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 7915–7922), Entzündung (McGeer et al., (1993) Can. J. Neurol. Sci. 18: 376–379, Rogers et al., (1992) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89: 10016–10020); Neurotrophiefaktorverarmung (Perry, (1990) Alzheimer's Disease and Associated Disorders 4: 1–13; Hefti and Schneider, (1991) Clinical Neuropharmacology 1: 62–76); Koliatsoess et al., (1991) Ann. Neurol. 30: 831–840), Apolipoprotein-E4-Stoffwechsel (Strittmatter et al., (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 1977–1981), und Kaliumkanal-Funktionsstörung (Etcheberrigaray, et al., (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 8209–8213) nützlich. Dieses Wissen würde zu besseren Behandlungsformen für neurologische Erkrankungen führen.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen offensichtlich. Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung.
Beispiele
Beispiel 1
PrP-HuAPP-Transgenkonstruktion
Die humane APP-Codierungssequenz wurde aus einer humanen cDNA abgeleitet (siehe Kang et al. (1987) Nature 325: 733; Goldgabar et al. (1987); Science 235: 877; Tanzi et al. (1987); Science 235: 880; und Robakis et al. (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 84: 4190) und wird in 1 dargestellt. Sie tritt in drei Spleißformen auf, die von einem Gen abgeleitet sind, das auf Chromosom 21 lokalisiert ist, wie von Kitaguchi et al. (1988) Nature 331: 530; Tanzi et al. (1988) Nature 331: 528; und Ponte et al. (1988) Nature 331: 525, beschrieben. 2 stellt drei Merkmale dar, die in die Amyloid-Verläuferprotein-Sequenzen eingebracht werden können, um die transgenen Tiere der Erfindung zu erzeugen: (1) Spleißformvarianten, die aus dem Vorhandensein oder der Abwesenheit des Kunitz-Proteaseinhibitors mit oder ohne OX-Region resultieren; (2) Amyloid-Vorläuferprotein-Varianten, die Mutationen enthalten, welche mit Krankheiten in Familien mit Alzheimer-Krankheit, wie von Goate (1991) Nature 349: 704; Chartier-Harlin et al. (1991) Nature 353: 844; Murrell et al. (1991) Science 254: 97; Hendriks et al. (1992) Nature Genetics 1: 218; und Mullan et al. (1992) Nature Genetics 1: 345 beschreiben, und Familien mit congophiler Angiopathie verbunden gewesen sind, wie von Levy et al. (1990) Science 248: 1124 beschrieben, und (3) eine myc-Markierung am Carboxylende, die verwendet werden kann, um die Immunodetektion von transgenen Produkten zu erleichtern, die aber vorzugsweise abwesend ist.
Die erforderlichen Hamster-Prionprotein-Genfunktionen wurden durch einen Hamster-Prionprotein-Cosmid-Vektor bereitgestellt, bei dem eine Tetracyclin-resistente Sequenz, flankiert von den SalI-Stellen, die Prionprotein-Codierungsssequenz ersetzt, wie von Scott et al. (1992) Protein Science 1: 986 beschrieben. Der Hamster-Prionprotein-Cosmid-Vektor wird in 3 dargestellt. Eine 1,6-KB-Region der DNA in der 3'-nicht-translatierten Region des Prionproteingens wird als eine nützliche Probe zum Nachweis von Transgenen aus diesem Cosmid angegeben.
Die APP-Sequenzen und Cosmid wurden verwendet, um die zwei Fusionsgenkonstruktionen, die in den 4 und 5 dargestellt werden, zu konstruieren. Die APP-Sequenzen wurden hinsichtlich der starken Translationsinitiation, die durch die Abkürzungen CS1 und CS2 dargestellt werden, modifiziert. Die Konstruktionen wurden durch Substituieren der SalI- zu KpnI-DNA-Sequenz am 5'-Ende der APP-Codierungssequenz für DNA-Sequenzen, die unter Verwendung von Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und zwei Einheiten von Primern hergestellt wurden, hergestellt. Für die CS1-APP-Sequenz, die in 6 dargestellt wird, war die verwendete Primer-Einheit 5'-AAGTCGACACCATGCTGCCCGGTTTGGCACT-3' und 5'-AAGGTACCTCCCAGCGCCCGAGCC-3'. Für die CS2-APP-Sequenz, die in 7 dargestellt wird, war die verwendete Primer-Einheit S'-AAAAAAGTCGACACCATGGTGCCCGGTTTGGCACT-3' und 5'-AAGGTACCTCCAGCGCCCGAGCC-3'.
Verfahrensweisen waren die konventionellen Techniken, beschrieben in Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory), und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), beschrieben in Saiki et al. (1988) Science 239: 487. Die Restriktionsstellen, die in den 1 bis 7 gezeigt werden, sind SalI (S), KpnI (K), BglII (B), XhoI (X) und NotI (N). Die Lokation der PCR-Oligomere, die zum Nachweis von Fusionskonstruktionen bei Tieren verwendet werden, wird durch A und P in 8 angegeben. Jedes PCR-Fragment, das für die Konstruktionen synthetisiert wurde, wurde sequenziert. Die PCR-Fragmente, die zur Verwendung in den Konstruktionen ausgewählt wurden, waren frei von unbeabsichtigten Mutationen.
Die obigen PrP-APP-Cosmide wurden mit NotI verdaut, das das PrP-APP-Fusionsgen aus dem pcos6EMBL-Vektor freisetzt, dargestellt in den 3 bis 5. Das PrP-APP-Fusionsgen wurde nach der Größenfraktionierung auf einem Agarosegel isoliert und elektroeluiert. Das PrP-APP-Fusionsgen wurde außerdem in einer Reihe von organischen Extraktionen, einschließlich Phenolchloroform, Chloroform und Butanol, gereinigt und in Ammoniumacetat und Ethanol ausgefällt. Vor der Embryoinjektion wurde das PrP-APP-Fusionsgen in 10 mM Tris-Cl (pH 8,0) auf eine Endkonzentration von 3 bis 4 μg/ml gelöst.
Beispiel 2
Präparieren von transgenen Mäusen, enthaltend PrP-HuAPP-Transgen
APP-Sequenz VM717/721/722IAV
Jedes PrP-APP-Fusionsgen wurde separat in befruchtete Einzellmauseier injiziert (Hogan et al. (1986) Manipulating the Mouse Embyro: A Laboratory Manual, Cold. Spring Harbor Press, N.Y.; siehe auch USPN 4,736,866). Embryospender und fruchtbare Zuchttiere waren Inzucht-FVB-Mäuse, die von dem National Cancer Institute (NIH) erhalten wurden; dies führte zur Integration von 1 bis 128 Kopien der PrP-APP-Fusionsgene in die Genome der Mäuse, die sich entwickelten und ausgetragen wurden. Die injizierten Eier wurden in pseudoschwangere Weibchen übertragen, wie in Wagner et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 5016 beschrieben. Mäuse wurden in einer ökologisch kontrollierten Anlage untergebracht, die in einem Zyklus von 10 Stunden Dunkelheit und 14 Stunden Licht betrieben wurde. Die Eier in den Leihmüttern konnten sich entwickeln und wurden ausgetragen.
Beispiel 3
Analyse von VVM717/721/722IAV-transgenen Mäusen
Bei einem Alter von vier Wochen wurde jedes geborene Junge in einer PCR-Reaktion unter Verwendung von DNA, die aus dem Schwanz entnommen wurde, analysiert. In jedem Fall wurde Schwanz-DNA als eine Schablone für eine PCR-Reaktion unter Verwendung der in 8 angegebenen Proben verwendet. Die DNA zur Analyse wurde aus dem Schwanz durch das Verfahren, das in Hanley und Merlie (1991) Biotechniques 10: 56 beschrieben wird, extrahiert. 1 ml des Schwanz-DNA-Präparats (ungefähr 1 mg DNA) wurden verwendet, um ein transgenes spezifisches DNA-Fragment bei einer 25Z1-PCR-Reaktion, enthaltend die Primer A und P, wie in 8 dargestellt, zu amplifizieren.
Die PCR-Reaktionen zeigten, daß 15 Gründermäuse ein injiziertes PrP-APP-Fusionsgen behielten. Die APP-Sequenz bei diesen Tieren enthielt die VVM717/721/722IAV-Mutation und die myc-Markierung, aber es fehlte an den KPI/OX-Regionen, die in 2 dargestellt werden. Um die transgene Kopienzahl zu bestimmen, wurde denaturierte DNA in einer exponentiell verdünnten Reihe mit einem 1,6-Kilobase (KB) radioaktiv markierten Segment der DNA aus der 3'-nicht-translatierten Region des Hamster-PrP-Gens geprüft, wie in 3 dargestellt. Unter den Gründermäusen mit den höchsten transgenen Kopienzahlen (ungefähr 100 oder mehr) vermehrten sich zwei Gründermäuse nicht, und ein dritter Gründer zeugte Nachkommen, die sich wiederum nicht vermehrten. Daher ergaben die 15 Gründermäuse 12 Linien transgene Nachkommen. Ein Katalog von transgenen Gründern mit APP-Transgenen ist in Tabelle III gezeigt.
Die Gründertiere wurden mit nichtinjizierten Tieren gepaart und die DNA der resultierenden 12 Linien transgener Nachkommen analysiert: Diese Analyse zeigte, daß in jedem Fall die injizierten Gene durch den Keim übertragen wurden.
Tabelle III Katalog der transgenen Gründer mit APP-Transgenen
Sechs Gründertiere beherbergten > 20 Kopien der PrP-APP-Fusionsgene. Alle sechs entwickelten eine neurologische Krankheit, die durch progressiv verminderndes exploratorisches/lokomotorisches Verhalten und den vorzeitigen Tod bei einem Alter von fünf Monaten gekennzeichnet ist. Im Gegensatz dazu entwickelte keines von neun Gründertieren, die < 20 Kopien der PrP-APP-Fusionsgene beherbergen, die neurologische Krankheit innerhalb der ersten fünf Monate. Die neurologische Funktionsstörung wurde auf die folgenden Generationen in einer autosomal-dominanten Weise übertragen.
Die Expression von neu erlangten PrP-APP-Fusionsgenen in Geweben wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers 6E10 bestimmt, gezüchtet auf die ersten 17 Reste des humanen Aβ-Peptids (Kim, et al. (1990) Neuroscience Research Communicating 7: 113–122). Das Fusionsgenprodukt wurde im Gehirn, Rückenmark, Skelettmuskel, Herz und minimal in der Lunge nachgewiesen. Es wurde nicht in der Leber, Milz, Niere oder Hoden nachgewiesen.
Die Expression des PrP-APP-Fusionsgens im Gehirngewebe wurde durch Immunodot-Blot-Analyse quantitativ bestimmt. Die relative APP-Expression im Gehirngewebe wurde in transgenen und nicht-transgenen Mäusen in einer exponentiell verdünnten Reihe verglichen und mit Antikörper umgesetzt, der die 15 Reste am Carboxylende von APP, CT15, erkennt, die sowohl Mäuse- als auch humanes APP erkennen (Sisodia, et al. (1993) J. Neurosciences 13: 3136–3142). Das gesamte APP-Protein in den Mäuselinien, die die neurologische Krankheit entwickelten, betrug mindestens 300% der endogenen Niveaus. Wo die Expression weniger als 300% war, entwickelten die Tiere keine neurologische Krankheit.
Um einen Index der Gehirnfunktion in betroffenen transgenen Mäusen zu erhalten, wurde der Glukoseumsatz unter Verwendung einer Modifikation des Sokoloff-Verfahrens, beschrieben von Chmielowska et al. (1986) Exp. Brain Res. 63: 607, regional bestimmt, was die/den Glukoseaufnahme/stoffwechsel in der Maus, die gemessen werden soll, ermöglicht. Regional wurden 2-Deoxyglukosekonzentrationen, die densitometrisch bestimmt wurden, auf das Kleinhirn, eine Region ohne Pathologie, normalisiert. Ergebnisse bei transgenen Mäusen offenbarten signifikante Verrin gerungen im Glukoseumsatz von 20 bis 30% im Hippocampus, Amygdala und einigen Regionen der Hirnrinde im Vergleich zu alterspassenden nicht-transgenen Wurfpartnern.
Beispiel 4
Analyse der Synthese und Verarbeitung in vitro
Die Synthese und Verarbeitung des VVM717/721/722IAV-Mutanten in kultivierten Zellen wurde überprüft, um die Wirkungen dieser Mutationen auf die Krankheitsentwicklung zu bestimmen. Die Wildtyp-HuAPP695myc- und mutanten cDNA-Gene wurden zu dem Expressionsvektor pEF-BOS geklont (Osaka Bioscience Institute. Osaka, Japan), dann vorübergehend in Mausneuroblastomzellen transfiziert, die dann kontinuierlich mit [³⁵S]-Methionin für 4 Stunden markiert wurden. Markierte APP-Moleküle wurden mit dem monoklonalen Antikörper 22C11 immunpräzipitiert (Weidemann, et al. (1989) Cells 57: 115–126). In Extrakten von Zellen wurden markierte APP-Moleküle von entsprechender Größe in ähnlichen Niveaus nachgewiesen. Medien aus diesen Kulturen wurden hinsichtlich der Gegenwart von löslichen APP-Fragmenten unter Verwendung von mAb 6E10 und mAb 4G8 überprüft (Kim, et al. (1990) supra.). Beide dieser Antikörper erkennen die Aβ-Region des humanen APP. Das mAb 6E10 erkennt Sequenzen in Aσ zwischen Aβ 1–17, während mAb 4G8 Sequenzen zwischen Aβ 1–28 erkennt. Die Sequenz von Aβ 17–28 ist identisch mit Maus Aβ, und daher kann 4G8 humanes und Mäuse-APP nicht unterscheiden. Die Kulturmedien, transfiziert mit beiden Genen, enthielten ein großes Ektodomänefragment von APP, das routinemäßig beobachtet wird.
Eine der neuesten Entdeckungen, die für das Verarbeiten von APP relevant ist, ist der Nachweis von löslichen Aβ 1–40-Fragmenten in dem Medium von kultivierten Zellen, die HuAPP exprimieren. Diese Aβ-Fragmente ähneln Peptiden, die in den AD-Amyloidplaqueläsionen gefunden wurden. Daher scheint es, daß APP normalerweise zu amyloidogenen Fragmenten verarbeitet wird. Außerdem ist gezeigt worden, daß Mutationen, die mit AD verbunden sind, das Verarbeiten von APP verändern, um die Herstellung von löslichem Aβ zu unterstützen. Um zu bestimmen, ob sich die VVM717/721/722IAV-Mutationen auf das Verarbeiten von APP auswirkten, wurde das Kulturmedium hinsichtlich kleiner Aβ-enthaltender APP-Peptide überprüft. Ein Aσ-Peptidfragment, das durch mAb 6E10 immunogereinigt wurde, war in dem Zellmedium, das mit der mutanten Sequenz transfiziert wurde, vorherrschend. Ebenso detektierte das mAb 4G8 erhöhte Niveaus an Aβ-Peptid in dem Kulturmedium, das den Mutanten enthält.
Eine Prüfung von Zellextrakten für angesammelte APP-Fragmente wies erhöhte Niveaus eines 10-kDa-APP-Peptidfragments nach der Immunopräzipitation mit Anti-myc-polyklonalem Antiserum in Zellen, die den Mutanten exprimieren (5C, Linie 3), nach. Mutationen, die in mutantem HuAPP695myc erzeugt werden, beeinflussen das Verarbeiten des resultierenden APP-Produktes, um erhöhte Niveaus an löslichem Aβ zu erzeugen, und ein intrazelluläres C-terminates Fragment von APP, das von ausreichender Länge ist, um die Aβ-Region zu umfassen. Daher ist der Phänotyp von Tieren, der mit dem mutanten APP erzeugt wurde, viel ähnlicher dem, der für Menschen berichtet wurde, der ein mutantes humanes APP-Gen exprimiert, das Mutationen codiert, die bei einem schwedischen Verwandten von AD gefunden wurden. Bis heute berichteten keine Forscher über die erhöhte Herstellung von Aβ infolge der Expression von HuAPP, das nur die V642I-AD-verbundene Mutation codiert (Golde et al., (1993), Neuroscience Abstract 19: 431,182,7). Jedoch verursacht diese Mutation scheinbar eine Veränderung in der Länge des löslichen Aβ-Derivats, was es auf Aβ1–42 erhöht. Daher scheint es, daß die VVM717/721/722IAV-Mutationen die Hauptursache der erhöhten Herstellung von löslichem Aβ ist. Untersuchungen über Aβ-Fibrillogenese lassen darauf schließen, daß längere Aβ-Peptide amyloidogener sind.
Beispiel 5
Vergleich der Verarbeitung von humanen und Mäuse-APP in Mäusezellen
Chimäre APP-Transgene, bestehend aus Mäuse-APP695- und humanen Aβ-Sequenzen, wurden hergestellt und ihre Verarbeitung bewertet. Es ist eine Hypothese der Erfindung, daß es Unterschiede in der Weise gibt, wie Mäuse- und humanes APP in Mäusen verarbeitet wird. Um humanisierte MoAPP-cDNA zu konstruieren, wurde ein MoAPP-Gen geklont und mutiert, um es mit dem cosSHaPrP.535-Vektor kompatibel zu machen. Mäuse-cDNA wurde durch Umkehrtranskriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RTPCR) isoliert, und PCR-Primer umfaßten XhoI-Stellen an den 5'- und 3'-Enden für Klonierzwecke. Um eine interne XhoI-Stelle in der Mäuse-cDNA zu entfernen, wurde ein zusätzlicher Primer einbezogen, der die interne XhoI-Stelle (Codon 397) überspannte und eine Einzelbasensubstitution enthielt, die die XhoI-Stelle entfernte, aber die korrekte Aminosäuresequenz konservierte. Das PCR-Produkt wurde anschließend sequenziert, um nachzuweisen, daß ungewollte Mutationen nicht in der PCR erzeugt werden.
Die Aβ-Region in HuAPP und MoAPP unterscheidet sich durch drei Aminosäurereste, die das amyloidogene Potential des transgenen Produktes beeinflussen könnten. Um die Mäuse-Aβ-Region zu humanisieren, wurde ein Segment des HuAPP-Gens, das die Aβ-Region umfaßt, durch PCR unter Verwendung von Primern, die einen Sense-Primer umfassen, der die BglII-Stelle am Codon 590 von HuAPP 695 umfaßt, und einem Antisense-Primer, der zwei Punktmutationen enthielt, die eine NarI-Stelle am Codon 626 erzeugten (eine verwandte NarI-Stelle wird in der MoAPP-cDNA gefunden), amplifiziert, während die Aminosäuresequenz aufrechterhalten wird (Tabelle 4, Primer 1 und 2). Dieses PCR-Produkt wurde mit BglII- und NarI-Stellen digeriert und dann zu den BglII- und NarI-Stellen der MoAPP-cDNA geklont.
Die chimäre (Mo/HuAPP)-cDNA wurde über den BglII- und NarI-Stellen sequenziert, um nachzuweisen, daß diese Region nun humane Aβ-Sequenzen enthielt, und um nachzuweisen, daß keine anderen ungewollten Mutationen erzeugt wurden. Um nachzuweisen, daß diese rekombinante cDNA zu einem Protein in voller Länge exprimiert werden könnte, wurde die DNA zu einem modifizierten pEFBOS-Vektor geklont. Der pEF-BOS-Vektor enthält das Promotorelement, ein erstes Exon, ein erstes Intron und einen Teil des zweiten Exons des Säugerverlängerungsfaktors 2α zusammen mit einem SV40-Ursprung der Replikation, was die Replikation von Vektoren und die hohe Expression von Genen in COS-1-Zellen ermöglicht. COS-1-Zellen wurden mit pEF-BOSMo/HuAPP-695 transfiziert und Zellextrakte wurden durch Immunoblotting analysiert. CT15 erkannte ein Mo/HuAPP-Polypeptid in voller Länge, während die Immunofärbung mit monoklonalem Antikörper 6E10 nachwies, daß das humanisierte Mäuse-cDNA-Produkt tatsächlich humane Aβ-Sequenzen codiert.
Um chimäre Mo/HuAPP-cDNA zu erzeugen, die eine Doppelmutation, verbunden mit frühzeitig auftretender AD, codiert, wurde ein PCR-basierender Ansatz, ähnlich dem, der oben erläutert wird, unter Verwendung der Primer und 3 (Tabelle 4) eingesetzt. Die Schablone für Reaktionen war eine geklonte Kopie von Mo/HuAPP-695. Das mutierte chimäre Gen wurde über den BglII- und NarI-Stellen sequenziert, um die Gegenwart von Mutationen nachzuweisen, und um sicher zu sein, daß keine ungewollten Mutationen in dem Transgen existieren. Die mutante Mo/HuAPP-cDNA wurde zu pEFBOS geklont und in COS-1-Zellen transfiziert, um zu bestimmen, ob APP-Polypeptide synthetisiert wurden. Ein APP-Polypeptid der vorhergesagten Größe reagierte sowohl mit CT15- als auch 6E10-Antikörpern.
Eine Prüfung der Synthese und Verarbeitung von Mo-, Hu- und Mo/HuAPP in Mäuse-N2a-Zellen offenbarte überraschenderweise erkennbare Unterschiede. Was offensichtlich ist, ist, daß ein größerer Prozentsatz an MoAPP gespalten wird, um ein lösliches Ektodomänefragment zu erzeugen, als es HuAPP ist. Das Verhältnis von zellassoziiertem gegen lösliches MoAPP beträgt ungefähr 1 zu 5, während HuAPP dreimal mehr zellassoziiert als löslich ist. Der Prozentsatz von Mo/HuAPP695, das gespalten wird, um lösliche Ektofragmente zu erzeugen, scheint zwischen das von Mo- und HuAPP zu fallen, da das Verhältnis von zellassoziierten zu löslichen Mo/HuAPP 1 zu 1 näher kommt. Die Mehrheit der löslichen APP-Ektofragmente entsteht scheinbar aus einem Spaltungsvorgang in Ad an der Zelloberfläche; die Unterschiede in dem Verhältnis von zellassoziierten APP gegen lösliche Ektofragmente zeigen Unterschiede bei der Reifung der Polypeptide. Speziell erreicht die Mehrheit von MoAPP die Zelloberfläche und wird durch eine Sekretase gespalten. Im Gegensatz dazu kann HuAPP die Zelloberfläche nicht so effizient erreichen, wodurch die Sekretasespaltung ausgeschlossen ist. Das Mo/HuAPP-Polypeptid scheint zwischen Mo- und HuAPP intermediär zu sein. Alternativ ist es möglich, daß Sequenzen in der Aβ-Domäne die Effizienz der Sekretasespaltung beeinflussen.
Zusätzlich zu den Unterschieden bei der Herstellung von löslichen APP-Ektofragmenten wurden Unterschiede bei dem Niveau der löslichen Aβ-Peptide bemerkt. Alle drei Proteine verursachen lösliche Aβ-Peptide, die von einer Größe und einem Charakter waren, die mit der Identifikation als Aβ1–40 übereinstimmen. In Zellen, die mit MoAPP transfiziert wurden, wurde ein Fragment nachgewiesen, das von einer Größe und einem Charakter ist, die mit der Identifizierung als Aβ17–40 übereinstimmen. Das Aβ17–40-Fragment entsteht nach der Membranspaltung von APP durch die vermeintliche Asekretase, die sich zwischen Aβ16 und -17 spaltet. Nur die Hu- und MoHuAPP-abgeleiteten Aβ1–40-Peptide wurden durch mAb6E10 wie erwartet erkannt. Während MoAPP scheinbar die relativ gleichen Mengen von Aβ1–40 und Aβ17–40 verursacht, wurden HuAPP und Mo/HuAPP vorzugsweise gespalten, um nur Aβ1–40 zu erzeugen. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß die Sequenzunterschiede in der humanen Aβ-Domäne die APP-proteolytische Spaltung beeinflussen.
Beispiel 6
Vergleich von normal gealterten Mäusen und transgenen Mäusen
Transgene Konstruktion
Die PrP-APP-Transgene wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, durch Ersetzen einer SalI-flankierten Tetracyclin-resistenten Sequenz in einem Hamster-PrP-Cosmid-Vektor (Scott et al, (1992), supra) mit SalI-flankierten humanen und Mäuse-APP-Codierungssequenzen erzeugt. Tg-Mäuse wurden unter Verwendung von einem von sechs unterschiedlichen PrP/APP-chimären Transgenen hergestellt: murines APP695 vom Wildtyp (MoAPP695.WT); humanes APP695, enthaltend zwei Mutationen bei M670N und K671L (APP770-Nummerierung) (HuAPP695.SWE); humanes APP695, enthaltend zwei Mutationen bei M670N und K671L (APP770-Nummerierung) (HuAPP695.SWE); humanes APP695, enthaltend eine Mutation bei E693Q (HuAPP695.DUT); humanes APP770 mit M670N und K671L (HuAPP770.SWE); humanes APP695 mit einer dreifachen Mutation bei V717I, V721IA und M722V mit einer 3'-myc-Markierung (HuApp695.TRImyc); und humanes APP695 vom Wildtyp mit einer 3'-myc-Markierung (HuApp695.WTmyc). Die CS1 HuAPP695.SWE-, CS1HuAPP770.SWE-, CS1 HuAPP695.TRImyc- und CS2HuApp695.TRImyc-APP-Sequenzen wurden hinsichtlich der starken Translationsinitiation modifiziert.
Wie die schwedische Mutation verbessern die drei V7171I-, V721A- und M722V-Mutationen in der Transmembrandomäne von APP die Sekretation von Aβ um das fünffache in kultivierten Zellen. Es wurde gezeigt, daß die 3'-myc-Markierung, ein 12-Codonsegment des c-myc-Proto-onkogens, in den kultivierten Zellen die Immunodetektion von Transfektionsprodukten erleichtert (Wong and Cleveland, (1990) The Journal of Cell Biology 111, 1987–2003). Bei Tg(HuAPP695.WTmyc)- und Tg(HuAPP695.TRImyc)-Mäusen war die myc-Markierung in den Western-Blots nicht so deutlich nachweisbar und histologische Proben wie HuAPP reagierten mit human-spezifischen APP-Antikörpern. Die myc-Markierung übte keine offensichtliche Wirkung auf den Phänotypen aus, da Tg(HuAPP695.SWE)-, Tg(HuAPP770.SWE)- und Tg(HuAPP695.DUT)-Mäuse, denen es an der myc-Markierung fehlt, dieselben klinischen und pathologischen Abnormalitäten entwickelten. Die Konstruktionen wurden durch Substituieren der SalI- zu der KpnI-DNA-Sequenz an dem 5'-Ende der APP-Codierungssequenz für DNA-Sequenzen, die unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und zwei Einheiten von Primern hergestellt wurden, hergestellt. Für die CS1-APP-Sequenz war die verwendete Primer-Einheit 5'-AAGTCGACACCATGCTGCCCGGTTTGGCACT-3' und 5'-AAGGTACCTCCCAGCGCCCGAGCC-3'. Für die CS2-APP-Sequenz war die verwendete Primer-Einheit 5'-AAAAAAGTCGACACCATGGTGCCCGGTTTGGCACT-3' und 5'-AAGGTACCTCCAGCGCCCGAGCC-3'. Die HuAPP-Mutationen wurden unter Verwendung von Standardverfahren von ortsgerichteter Mutagenese hergestellt. Jedes PCR-Fragment, das für die Konstruktionen synthetisiert wurde, wurde sequenziert. Die PCR-Fragmente, die zur Verwendung in Konstruktionen ausgewählt wurden, waren frei von unbeabsichtigten Mutationen. Die PrP-APP-Cosmide wurden mit NotI digeriert (das das PrP-APP-Fusionsgen aus dem pcos6EMBL-Vektor freisetzt). Die PrP-APP-Fusionsgene wurden nach der Größenfraktionierung auf einem Agarosegel isoliert und elektroeluiert. Das PrP-APP-Fusionsgen wurde außerdem mit organischen Lösungsmitteln gereinigt und in Ammoniumacetat und Ethanol ausgefällt. Die PrP-APP-Fusionsgene wurden in 10 mM Tris-Cl (pH 8,0) auf eine Endkonzentration von 3 bis 4 μg/ml vor der Embryoinjektion gelöst.
1503: 5'-CTGACCACTCGACCAGGTTCTGGGT-3' und 1502: 5'-GTGGATAACCCCTCCCCCAGCCTAGACCA-3', lokalisiert in der 3'-Region von APP bzw. der 3'-nicht-translatierten Region von PrP. Der 1503-Primer erkennt eine Region, die in Mäuse- und humanem APP homolog ist, und kann daher verwendet werden, um sowohl PrP-MoAPP- als auch PrP-HuAPP-DNA nachzuweisen. Unter Verwendung von Primern 1502 und 1501: 5'-AAGCGGCCAAAGCCTGGAGGGTGGAACA-3', wurde eine parallele PCR-Reaktion, die ein Fragment von murinem PrP amplifiziert, als eine positive Kontrolle durchgeführt.
Die transgene Kopienzahlanalyse wurde unter Verwendung von 5 μg denaturierter gereinigter Schwanz-DNA durchgeführt, die auf Nitrocellulose wärmebehandelt und zu einem radioaktiv markierten 1,3 kb SalI-XhoI-DNA-Fragment hybridisiert wird, welches ein Segment der Hamster-PrP-3'-nicht-translatierten Region codiert, die in der DNA-Sequenz am 5'-Ende der APP-Codierungssequenz für DNA-Sequenzen, die unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und der zwei Einheiten von Primern, die in Beispiel 1 beschrieben wurden, hergestellt wurden, lokalisiert ist. Die HuAPP-Mutation wurde unter Verwendung von Standardverfahren von ortsgerichteter Mutagenese erzeugt. Jedes PCR-Fragment, das für die Konstruktionen synthetisiert wurde, wurde sequenziert. Die PCR-Fragmente, die zur Verwendung in der Konstruktion ausgewählt wurden, waren frei von unbeabsichtigten Mutationen. Die PrP-APP-Cosmide wurden mit NotI digeriert, und die PrP-APP-Fusionsgene wurden nach der Größenfraktionierung auf einem Agarosegel isoliert und elektroeluiert und außerdem gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die PrP-APP-Fusionsgene wurden in 10 mM Tris-Cl (pH 8,0) auf eine Endkonzentration von 3 bis 4 μg/ml vor der Embryoinjektion gelöst.
Erzeugung und Screening einer transgenen Maus
Transgene Linien wurden durch Mikroinjektion von Einzellmausembryos, wie beschrieben, initiiert (Hogan et al., (1986) supra). Embryospender und fruchtbare Zuchttiere waren Inzucht-FVB-Mäuse, die vom National Cancer Institute (NIH) erhalten wurden. Nachentwöhnungs-Schwanzbiopsie-DNA wurde erzeugt, wie beschrieben (Hanley and Merlie, (1991) Biotechniques 10, 56). Ein Mikroliter der ungereinigten DNA wurde in einer 25-μl-PCR-Reaktion verwendet. Um die PrP-APP-Fusions- DNA nachzuweisen, wurde die PrP-APP-Fusions-DNA unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion mit einem Paar an Oligomerprimern, 1503: 5'-CTGACCACTCGACCAGGTTCTGGGT-3' und 1502: 5'-GTGGATAACCCCTCCCCCAGCCTAGACCA-3', lokalisiert in der 3'-Region von APP bzw. der 3'-nicht-translatierten Region von PrP, amplifiziert. Der 1503-Primer erkennt eine Region, die in Mäuse- und humanem APP homolog ist, und könnte daher verwendet werden, um sowohl PrP-MoAPP- als auch PrP-HuAPP-DNA nachzuweisen. Unter Verwendung von Primern 1502 und 1501: 5'-AAGCGGCCAAAGCCTGGAGGGTGGAACA-3', wurde eine parallele PCR-Reaktion, die ein Fragment von murinem PrP amplifiziert, als eine positive Kontrolle durchgeführt.
Die transgene Kopienzahl-Analyse wurde unter Verwendung von 5 μg denaturierter gereinigter Schwanz-DNA durchgeführt, die auf Nitrocellulose wärmebehandelt und zu einem radioaktiv markierten 1,3 kb SalI-XhoI-DNA-Fragment hybridisiert wird, welches ein Segment der Hamster-PrP-3'-nicht-translatierten Region codiert, die in dem Hamster-PrP-Cosmid-Vektor lokalisiert ist (Scott, et al., (1992) supra). Nach zwei hoch stringenten Waschungen und Aussetzen einem strahlungsempfindlichen Film wurden die relativen Intensitäten von Signalen aus Genom-DNAs von transgenen Mäusen und Hamstern unter Verwendung eines Phosphorabbilders verglichen, um transgene Kopienzahlen in Bezug auf diploide Hamstergenom-DNA zu erhalten.
Analyse der Transgenexpression
Die APP-transgene Produktexpression wurde bei den Nachkommen von transgenen Gründern, die bei einem Alter von ein bis vier Monaten getötet wurden, überprüft. Quantitatives Immunoblotting von Extrakten aus Gehirnhomogenaten wurde parallel zu dem Extrakt, das aus alterspassenden nicht-transgenen Wurfpartnern hergestellt wurde, durchgeführt. 20% (Gewicht/Volumen) Homomgenate von Gehirngewebe wurden in TNE-(50 mM Tris-Cl pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA mit 2% PMSF)-Puffer unter Verwendung eines Handpolytrons hergestellt. Homogenate wurden mit einem gleichen Volumen an TNE 1% N40, 1% Deoxycholat, 0,4% SDS verdünnt und in einem Ultraschallbad dem Ultraschall ausgesetzt, bis die gesamte Viskosität verloren ging. Homogenate wurden dann 10 Minuten gekocht und bei 10.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert.
Die Überstände wurden mit einem gleichen Volumen von 2 × Probepuffer gemischt (Laemmli, (1970) Nature 227,680–685), 2 min gekocht und unter Verwendung einer 6% SDS-PAGE fraktioniert. Proteine wurden elektrophoretisch zu Immobilon-Membranen (Pierce) übertragen und mit polyklonalen (CT15 und antiGID) und monoklonalen (22C11 und 6E10) APP-Antikörpern inkubiert. Reaktive polyklonale Kaninchenantikörper wurden nach der Inkubation mit sekundären Kaninchenantikörpern zu Mäuse-IgG vor der Inkubation mit ¹²⁵I-Protein A sichtbar gemacht. Radiointensitäten wurden auf einem Phosphorabbilder quantifiziert (Molecular Dynamics, Inc.). APP-Expression in Gehirngewebe wurde bei Tg-Mäusen, die unterschiedliche transgene Kopienzahlen beherbergen, durch Quantifizierung von Immunoblots in Tg-Linien mit drei Antikörpern, die sowohl MoAPP als auch HuAPP, CT15 (11), Anti-GID (11) und 22C11 (11) erkennen, gemessen. CT15 (Sisodia et al., (1993) J. Neurosciences 13: 3136–3142; Borchelt et al., (1994) J. Biol. Chem 269: 14711–14714); anti-GID (Cole et al., (1989) Brain Res. Reviews 13: 325–349); und 22C11 (Weidemann et al., (1989) Cell 57: 115–126) erkennen sowohl Mäuse- als auch humanes APP in gleicher Weise, aber 22C11 bindet ebenso APLP2, ein enger Verwandter von APP, mit derselben Affinität (Slunt et al., (1994) J. Biol. Chem 269: 2637–2644). Geringe Veränderungen in HuAPP-Niveaus in Bezug auf die MoAPP-Expression, die mit unterschiedlichen Antikörpern erhalten wurden, können Unterschiede in der Affinität des Antikörperbindens oder Unterschiede beim Nachtranslationsverarbeiten zwischen Wildtyp und abweichenden HuAPP wiederspiegeln. Transgene Gehirn-APP-Proteinexpression war von der Kopienzahl sowie der Spezies des exprimierten APP abhängig (12). In Bezug auf HuAPP wurden äquivalente Niveaus von MoAPP mit geringen Zahlen von transgenen Kopien erreicht.
Um das Niveau von HuAPP speziell zu messen wurden Gehirnhomogenate mit 6E10-Antikörper geprüft, gezüchtet gegen Reste 1–17 von humanen Aβ (Kim, et al. (1990) Neuroscience Res. Comm. 7, 113–122). Es wurde keine Reaktivität zu ~100 bis 125 kD APP-Molekülen bei Nicht-Tg-Mäusen nachgewiesen (11). Bei Tg1130H-Mäusen waren die höchsten Niveaus von HuAPP, nachgewiesen auf Immunoblots unter Verwendung von 6E10-Antikörper, im Gehirn und Rückenmark, und viel kleinere Mengen (< 5% der Gehirnniveaus) wurden in dem gestreiften Muskel, im Herz, in der Haut und der Lunge gefunden. HuAPP wurde schlecht nachgewiesen oder war in der Thymusdrüse, Leber, Milz, Niere, Hoden und Dünndarm abwesend.
Spezielle Immunofärbung für humanes APP/Aβ unter Verwendung des 6E10- oder 8E5-Antikörpers (Athena Neurosciences) offenbarte HuAPP im gesamten Gehirn. 8E5 erkennt ein Segment von APP-Spannresten 444 bis 592 (APP695-Nummerierung). Zwei unterschiedliche Verfahren wurden verwendet, um die APP-Immunoreaktivität im Gehirngewebe aus Tg-Linien-überexprimierenden HuAPP zu verstärken. Bei Linien von hohen Kopienzahlen lag entweder nach der Ameisensäurevorbehandlung des Gewebes unter Verwendung einer 1 : 5000-Verdünnung des 6E10-Antikörpers oder der Mikrowellenvorbehandlung des Gewebes unter Verwendung von entweder 1 : 100-6E10-Antikörper oder 1 : 100 8E5-Antikörper die APP-Färbung immer in den Bläschenstrukturen in großen Pyramidenzellen des Hippocampus, den parahippocampalen Flächen, Amygdala und der Hirnrinde vor (13A, C, H). Bei einigen Gehirnen war eine schwache Immunoreaktivität ebenso in kleineren Neuronen in den cortico-limbischen Regionen des Gehirns und in großen und kleinen Neuronen in den Basalganglien, Hirnstamm und Kleinhirn sichtbar. Die Färbung war in Nicht-Tg-Mäusen (13B, H) und in unbehandelten Gehirngewebe von betroffenen Tg-Mäusen abwesend. Die Muster der erhaltenen HuAPP-Immunofärbung spiegelten die weit verbreitete Expression von HuAPP im Gehirn mit den höchsten Niveaus an Expression in dem Endhirn wieder, wie in regionalen Gehirnimmunoblots unter Verwendung des 6E10-Antikörpers unabhängig bestätigt (11).
Der 8E5-Antikörper färbte Amyloidplaques und intraneuronale Bläschenstrukturen in Mikrowellen-behandelten Gewebesektionen von Patienten mit AD (13F). Bei einer 1 : 5000-Verdünnung färbte der 6E10-Antikörper Amyloidplaques von Patienten mit AD nur nach der Ameisensäurevorbehandlung von Gehirngewebe (13D, E). Jedoch offenbarte bei TgHuAPP-Mäusen weder die Mikrowellen- noch die Ameisensäurevorbehandlung von Gehirngewebe die HuAPP-Färbung, die den extrazellulären Amyloid- oder Voramyloidablagerungen unter Verwendung irgendeines Antikörpers gleicht. Der abnormale Phänotyp bei diesen Tg-Mäusen wurde deshalb durch die Amyloid- oder Voramyloidablagerung verursacht.
Um die relativen Wirkungen von mutanter und Wildtyp-APP-transgener Expression auf die Entwicklung einer ZNS-Störung zu bewerten, wurde der Prozentsatz von kranken oder toten Tieren bei 100 und 200 Tagen in den Linien, die unterschiedliche Niveaus von Wildtyp-HuAPP, mutantem HuAPP oder Wildtyp-MoAPP exprimieren (Tabelle 5), bestimmt. Diese Daten zeigen eine direkte Beziehung zwischen der APP-Expression und der Entwicklung eines abnormalen Phänotyps (15). Ein Vergleich von Tg-Mäusen, die Wildtyp-HuAPP und mutantes HuAPP exprimieren, war über den vollständigen Bereich der APP-Expression nicht möglich. Jedoch zeigt ein Vergleich der Tg-Mäuse-Expression von ungefähr dem zwei- bis vierfachen an mutantem HuAPP, (TgHuAPP695.TRImyc)1140 und (TgHuAPP695.TRImyc)1130 mit Tg-Mäusen, die ungefähr das dreifache an Wildtyp-MoAPP, (TgMoAPP695.WT)1874, exprimieren, daß mutantes HuAPP ohne weiteres den abnormalen Phänotypen provozieren wird. Diese Beobachtung argumentiert gegen den abnormalen Phänotyp, der aufgrund einer nicht-spezifischen Wirkung des Tg-Proteins gegenüber der Expression vorliegt, da mutantes HuAPP der Erkrankung höhere Penetranz als Wildtyp-MoAPP verleiht, was eine spezifische Wirkung der exprimierten Tg-Proteinspezies zeigt. Diese Daten werden als Titrationskurven dargestellt, die eine direkte Beziehung zwischen der APP-Expression und der Entwicklung eines abnormalen Phänotyps zeigt (siehe 15). Jedoch zeigt die linksverschobene Kurve für Tg-Mäuse, die mutantes APP in Bezug auf Wildtyp-APP exprimieren, daß die Expression des mutanten APP ohne weiteres den abnormalen Phänotyp stärker provoziert.
Um zu gewährleisten, daß die Überexpression einer fremden (humanen) Spezies an Protein den abnormalen Phänotyp den Artefakt betreffend nicht herstellt, wurden Tg-Mäuse, die Wildtyp-MoAPP überexprimieren, erzeugt. Bei Tg-Mäusen mit MoAPP-Niveaus, die zu 3,1fachen endogenen APP-Niveaus äquivalent sind, trat derselbe Phänotyp auf, was zeigt, daß der beobachtete Phänotyp nicht aufgrund einer Überexpression einer fremden Spezies an Protein vorlag.
Verhaltensanalysen
Um zu bestimmen, ob FVB-Mäuse auf natürliche Weise mit vorrückendem Alter verhaltensbeeinträchtigt werden (das Mäuseäquivalent seniler Demenz zum Menschen), wurden FVB-Mäuse bis zu einem Jahr beobachtet, und das Verhalten dieser gealterten Mäuse mit dem von transgenen Mäusen verglichen. Verhaltensanalysen wurden dreimal pro Woche unter Verwendung des Eckindex-(CI-)-Tests durchgeführt. Der Test nutzt eine auffallende neophobe Reaktion, die bei vielen betroffenen Tg-Mäusen auftritt. Die neophobe Reaktion wird durch eine Verringerung in der exploratorischen Aktivität manifestiert, die für das Testen in einer neuen Kammer spezifisch ist. Am Anfang des klinischen Verlaufs erscheinen die betroffenen Mäuse oftmals normal in ihren Heimkäfigen, aber weisen vorübergehende Unbeweglichkeit für 30 bis 60 Sekunden auf, nachdem sie allein in einen sauberen Käfig gesetzt worden, im Gegensatz zu nicht betroffenen Mäusen, die typischerweise die neue Umgebung untersuchen und rumschnüffeln. Eine charakteristische Reaktion einer betroffenen Maus ist, den Nacken unten zu halten, während ihr Schwanz während der vorübergehenden Unbeweglichkeit steif ist. Alternativ rennt eine betroffene Maus in eine Ecke und nimmt dann dort eine geduckte oder erfrorene Haltung ein. Der (CI)-Test mißt die Häufigkeit mit der eine Maus die Ecken eines sauberen Käfigs während der ersten 30 Sekunden, nachdem sie allein in diesen Käfig gesetzt worden ist, beschnüffelt. Basierend auf den gemeinsamen Beobachtungen von > 2000 Tests von > 100 Tg-Mäusen und > 2500 Tests von > 140 Nicht-Tg-Mäusen stellten wir Kriterien für die Gegenwart einer Verhaltensstörung auf, wobei diese als Werte von zwei „0's" oder „0 und 1" bestimmt wurden, die innerhalb der drei aufeinanderfolgenden Tests auftreten. Der Ausbruch der Krankheit ist auf die ersten von drei aufeinanderfolgenden Testdaten, bei denen abnormale Werte erhalten werden, zurückzuführen.
Um den Eckindextest durchzuführen, wird eine Testmaus, die am Schwanz gehalten wird, in die Mitte eines sauberen Käfigs plaziert, der sonst mit seinem Heimkäfig identisch ist. Die Häufigkeit mit der die Maus die Ecken des Testkäfigs während der ersten 30 Sekunden, nachdem sie in diesen Käfig gesetzt wurde, beschnüffelt, werden als CI aufgezeichnet. Tiere, die vorm Erreichen der CI-Kriterien sichtlich moribund sind, und Tiere, die bewiesene Anfälle entwickeln, werden ebenso als krank diagnostiziert. Tiere, die alleine untergebracht sind, werden von der Analyse ausgeschlossen, weil mehrere Nicht-Tg- und Tg-Mäuse geringe Werte erhalten, während die Alleinlebenden keine charakteristischen Erfrierungshaltungen der betroffenen Tg-Tiere zeigen. Wenn diese Mäuse mit anderen Mäusen untergebracht sind, erhöhen sich ihre CI-Werte. Um die Veränderungen in der täglichen Aktivität zu kontrollieren, werden alle Tiere zwischen 1430 h und 1830 h getestet.
Eine altersabhängige ZNS-Störung bei FVB-Mäusen
Verhaltensabnormalitäten
Die Lebenserwartung von FVB-Mäusen beträgt ungefähr 600 Tage, aber es ist wenig über altersabhängige ZNS-Störungen bei FVB-Mäusen bekannt. Um zu bestimmen, ob FVB-Mäuse auf natürliche Weise mit vorrückendem Alter verhaltensbeeinträchtigt werden, wurden 110 FVB-Mäuse im Alter von 150 bis 500 Tagen aus drei unterschiedlichen Institutionen (University of Minnesota, Minneapolis, MN, McLaughlin Research Institute, Great Falls, MT, und Harlan Sprague Dawley, Inc. Indianapolis, IN) beobachtet. Mit vorrückendem Alter entwickelten 18 Mäuse frühzeitig im Alter von 154 Tagen Verhaltenabnormalitäten, einschließlich Bewegung, Inaktivität, Kämpfe und Neophobie, wie durch den Eckindextest definiert, und vorzeitigen Tod (Tabelle 6). Weitere sechs Mäuse starben an Tumoren oder versehentlich. Obwohl die Bewegung und Inaktivität bei allen betroffenen Tg-Mäusen auftrat, waren dies subjektive Zeichen, die selten bei den meisten normalen Mäusen erscheinen. Der Ausbruch der Krankheit wurde durch Eckindextestergebnisse zusammen mit der Beobachtung der Krämpfe, Bewegung oder Apathie definiert. Es waren sowohl männliche als auch weibliche Mäuse betroffen. Drei unruhige Mäuse starben vor der Diagnose durch die Eckindexkriterien. Der Tod trat unmittelbar nach einem beobachteten Krampfanfall ein. Die übrigen Mäuse wuchsen zunehmend weniger aktiv, und wurden für pathologische Studien zwischen neun und 91 Tagen nach dem Ausbruch der abnormalen Verhaltenszeichen getötet. Die kumulative Häufigkeit von Verhaltensabnormalitäten und Tod (ausschließlich versehentlicher und tumorvermittelter Tod) in dieser Kohorte von FVB-Mäusen betrug 23% im Alter von 500 Tagen (siehe 9). Gliose. Gehirne aus sechzehn älteren Nicht-Tg-FVB-Mäusen im Alter von neun bis zwölf Monaten, sieben, die die abnormalen Verhaltensmerkmale von betroffenen Tg-APP-Mäusen zeigen, und neun alterspassende verhaltensnormale Mäuse wurden in einer codierten Weise untersucht. Sechs der sieben Gehirne von den verhaltensabnormalen Mäusen zeigten starke hypertrophe astrozytische Gliose im Hippocampus, der parahippocampalen Fläche, Amygdala und Hirnrinde (10). Keines der Gehirne von den neun altersanpassenden, verhaltensnormalen Mäusen zeigte diesen Grad an Gliose, obwohl mäßige Gliose, die auf den Hippocampus beschränkt ist, bei einigen Mäusen beobachtet wurde. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Verhaltensstörung bei betroffenen älteren Nicht-Tg-Mäusen fest mit der cortico-limbischen Gliose assoziiert ist (Yates-korrigiert X² = 8,96, p = 0,003). Die Gehirne der Nicht-Tg-verhaltensbeeinträchtigten FVB-Mäuse zeigten keine Amyloidplaqueablagerung, neurofibrilläre Plaquebildung, neuronale Abnormalitäten oder qualitative Veränderungen in Neuronen- oder Gliazahlen.
Regionale Hirnglukoseutilisation. Um eine unabhängige funktionelle Bewertung des abnormalen Verhaltens, das bei beeinträchtigten FVB-Mäusen beobachtet wurde, zu erhalten, wurde die regionale Hirnglukoseutilisation unter Verwendung einer Modifikation des Sokoloff-Verfahrens bestimmt (Sokoloff et al., (1977) J. Neurochem 28, 897–916). Regionen, die mit Lernen, Gedächtnis und Emotionen assoziiert sind, wie die Hirnrinde, der Hippocampus, endorhine Rinde und Amygdala, die am meisten bei kognitiv beeinträchtigen gealterten Menschen und Patienten mit AD am stärksten beeinträchtigt werden, wurden untersucht. Densitometrische Werte der ¹⁴C-Deoxyglukose-Verteilung wurden auf Kleinhirnwerte normalisiert, da das Kleinhirn klinisch und pathologisch nicht involviert schien. Die regionale Gehirnglukoseutilisation in Gehirngewebe bei beeinträchtigten FVB-Mäusen wurde mit der in Gehirngewebe bei verhaltensnormalen, alterspassenden FVB-Mäusen verglichen. Signifikante Verringerungen (p < 0,05, Varianzanalysis) in der regionalen Glukoseutilisation, insbesondere im Hippocampus (–42%), Amygdala (–43%), endorhinale Rinde (–46%), parietale Rinde (–34%), frontale Rinde (–19%) und temporale Rinde (–18%), wurden in dem Gehirngewebe bei beeinträchtigten FVB-Mäusen beobachtet. Im Gegensatz dazu wurden keine signifikanten Verringerungen bei mehreren Strukturen, einschließlich Corpus callosum, medulläre Formatio reticularis, Nucleus dentatus cerebelli und Vermis, beobachtet.
Die Entwicklung des beeinträchtigten Verhaltens, das von cortico-limbischer hypertropher Gliose und verminderter regionaler Gehirnglukoseutilisation, insbesondere im Gehirn begleitet ist, definiert bei FVB-Mäusen eine charakteristische altersabhängige ZNS-Störung mit den Merkmalen der alternden Veränderungen, die bei anderen Nagetierspezies beobachtet wurden, wie hypertrophe Gliose und verminderte regionale Glukoseutilisation in limbischen und corticalen Strukturen. Obwohl nicht beschrieben worden ist, daß die altersabhängigen Verhaltensabnormalitäten, die bei beeinträchtigten FVB-Mäusen beobachtet wurden, natürlich bei anderen Nagetierspezies auftreten, läßt die Hauptverringerung in der regionalen Gehirnglukoseutilisation, die in den cortico-limbischen Flächen des Gehirns, die beim Lernen, Gedächtnis und Emotionen involviert sind, gefunden wurden, stark darauf schließen, daß einige, wenn nicht die meisten, der Verhaltensabnormalitäten bei betroffenen FVB-Mäusen Funktionsstörungen in diesen Gehirnregionen wiederspiegeln. Da die Verhaltens-, pathologischen und funktionellen Abnormalitäten, die bei diesen Mäusen beobachtet wurden, Merkmal teilen, die bei anderen gealterten, beeinträchtigten Nagetieren und bei dementen Menschen gefunden wurden, stellt die Konstellation der Ergebnisse eine Form der ZNS-Altersschwäche bei FVB-Mäusen dar.
Transgene Mäuse, die mutantes und Wildtyp-APP exprimieren
Verhaltensabnormalitäten. Ein abnormaler Phänotyp, der dem bei gealterten, beeinträchtigten FVB-Mäusen ähnelt, entwickelte sich bei Tieren, die hohe Niveaus an APP exprimieren. Kopienzahlen waren an sich unwahrscheinlich die direkte Ursache der ZNS-Störung, da eine zuvor veröffentlichte Tg-Linie, die bei FVB-Mäusen entwickelt wurde, Tg(HuPrP)FVB-152, die humanes PrP exprimieren, angetrieben durch 30 bis 50 Kopien des Hamster-PrP-Gencosmids, keine vorzeitigen Verhaltensabnormalitäten oder Tod zeigten (Telling et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9936–9940). Der Phänotyp bei TgAPP-Mäusen segregiert gemäß der Spezies, des Erbbildes und dem Niveau an APP-Expression in vier Linien, die ungefähr äquivalente Kopienzahlen (20–30): Tg(HuAPP695.WYmyc)466, Tg(MoAPP695.WTmyc)6209, beherbergen. Um zu bestimmen, ob PrP-Niveaus durch die Gegenwart von überzähligen PrP-Genkomponenten betroffen waren, wurden die Gehirn-PrP-Niveaus bei Tg(HuAPP695.TRImyc)1130-Mäusen mit 74 transgenen Kopien und Nicht-Tg-Mäusen gemessen. Es wurden keine Unterschiede festgestellt, was zeigt, daß Änderungen bei der PrP-Expression ebenso nicht die Ursache des abnormalen Phänotyps waren.
Betroffene Tg-Tiere entwickelten alle klinischen Anzeichen, die bei gealterten, beeinträchtigen Nicht-Tg-FVB-Mäusen beobachtet wurden, einschließlich Bewegung, erhöhte Schreckreaktionsapathie und Neophobie (Tabelle 6), aber sie traten mit signifikant hoher Penetranz im frühen Alter auf (9, Tabelle 5). Später im Verlauf entwickelten sich Inaktivität und Fehler beim Reproduzieren, aber es gab keine Zitterbewegungen, Koordinationsstörungen, Schwäche, Lähmung oder scheinbaren Wahrnehmungsverlust, wie aus ihrem Abbruch oder Stimmreaktionen von Schwanz- oder Fußquetschen beurteilt. Krämpfe wurden in einem kleinen Prozentsatz (3 (6/181)) von betroffenen Tg(HuAPP695.TRImyc)-Mäusen beobachtet. Es ist möglich, daß die aktuelle Häufigkeit von Krämpfen höher ist, und nachgewiesen werden würde, wenn die Mäuse für mehr als 30 bis 60 Sekunden dreimal pro Woche beobachtet wurden.
Verhaltensabnormalitäten bei Tg-Mäusen entwickelten sich frühzeitig im Alter von einem Monat. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen dem Ausbruch der Verhaltensabnormalitäten bei männlichen und weiblichen Mäusen. Einige Tg-Mäuse (= 14%), die APP überexprimieren, starben frühzeitig im Alter von einem Monat, ohne vorher Krämpfe oder Neophobie zu zeigen. Eine neuropathologische Untersuchung von zwei dieser Mäuse wies cortico-limbische Gliose, die nicht von Tg-Mäusen zu unterscheiden war, nach, die, nachdem sie die charakteristischen Anzeichen zeigten, starben. Daher ist es wahrscheinlich, daß diese Mäuse infolge derselben Erkrankung wie die anderen betroffenen Tg-Mäuse starben.
Geringer Wuchs wurde bei Tieren mit transgenen Gehirn-APP-Niveaus, die die endogenen Niveaus zweifach überschritten, beobachtet (Tabelle 5). Dieser Unterschied in der Größe war bei der Geburt nicht sichtbar, bei einem Alter von vier bis sechs Wochen unübersehbar und bei älteren Tieren gering oder nicht vorhanden. Die Tg-Tiere schienen normal proportioniert. Kleine Größe war nicht erforderlich für das Auftreten von Verhaltensabnormalitäten, da Tg(HuAPP695.TRImyc)1118-Mäuse vorzei tig starben und Verhaltensabnormalitäten entwickelten, trotz daß sie hinsichtlich der Größe normal waren.
Tabelle 6 Klinische und pathologische Zeichen bei gealterten, beeinträchtigten FVB-Mäusen und bei betroffenen FVB-Mäusen, die APP-Transgene exprimieren
Pathologische Analysen von transgenen Mäusen
Gehirne von transgenen Mäusen, die Verhaltensabnormalitäten zeigen oder tot aufgefunden wurden, und alterspassenden nicht-transgenen Wurfpartnern wurden hinsichtlich neuropathologischer Abnormalitäten untersucht. Gehirne wurden mit 10%igem phosphatgepuffertem Formalin oder 4%igem gepuffertem Paraformaldehyd immersionsfixiert oder perfundiert, in Paraffin eingebettet und in Abschnitte von 5 bis 8 μm auf einem Rotationsmicrotom geschnitten. Gewebeabschnitte wurden mit Hematoxylin und Eosin, Cresylviolett, Thioflavin S oder Kongorot-Farben oder unter Verwendung der Bielschowsky-Silber- oder TUNEL-(Gavrieli et al., (1992) Journal of Cell Biology 119, 493–501)-Verfahren eingefärbt.
Für immunohistologische Studien wurden Paraffinabschnitte entparaffiniert und erneut durch Xylol und reine Alkohole rehydratisiert. Endogene Peroxidase wurde durch die Behandlung mit 6%igem Wasserstoffperoxid in Methanol für 10 Minuten oder mit 3,0%igem Wasserstoffperoxid in Methanol (1 : 5) gequencht und in vollentsalztem Wasser oder phosphatgepufferter Salzlösung gespült. Um die APP- Antigendetektion zu verbessern, wurden ausgewählte Abschnitte in Wasser bei voller Energie für 15 Minuten mikrowellenbestrahlt, auf Raumtemperatur abgekühlt, in vollentsalztes Wasser in 0,5 M TBS (pH 7,6) übertragen und mit 0,4%igem TX/TBS vorbehandelt, gefolgt von 3%igem normalen Ziegenserum in TBS. Primäre Antikörper 6E10 (1 : 100) und 8E5 (1 : 100 Aszitesfluid) wurden in 0,1%igem TX/TBS mit 2%igem normalen Ziegenserum hergestellt.
Nach der Inkubation für 24 Stunden wurden Objektträger abgespült, in Ziege-Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-IgG (1 : 20) in 0,1%igem TX/TBS inkubiert und in TBS gespült, gefolgt von der Inkubation von einer Stunde in Kaninchen- oder Mausperoxidase-Antiperoxidase (1 : 100) bei Raumtemperatur. Abgespülte Objektträger wurden in der Gegenwart von 0,05% Diaminobenzidin in 0,01%igem Wasserstoffperoxid umgesetzt, dreimal in TBS gespült, durch eine reine Reihe von Alkoholen bis Xylol dehydratisiert. Die jeweiligen Abschnitte wurden gemäß dem Fontana-Masson-Verfahren silbergefärbt (Masson (1928) Am. J. Pats. H: 181–211) und unter Durchlichtmikroskop und unterschiedlichen Interferenzkontrastoptiken betrachtet. Andere Abschnitte wurden in 70%ige Ameisensäure für 10 Minuten eingetaucht, in phosphatgepufferter Salzlösung gespült und in 10%iges normales Pferdeserum für 1 Stunde eingetaucht. Primäre Antikörper 6E10 (1 : 5000) wurden in phosphatgepufferter Salzlösung hergestellt. Nach der Inkubation über Nacht bei 4°C wurden die Abschnitte in phosphatgepufferter Salzlösung gespült, mit Antimaus-IgG inkubiert, gefolgt von Avidin-Biotin-Komplex (Vector Labs, Inc). Abgespülte Objektträger wurden mit Diaminobenzidin umgesetzt und mit Harris-Hematoxylin gegengefärbt. GFAP wurde unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers von GFAP bei einer Verdünnung von 1 : 60 in phosphatgepufferter Salzlösung nachgewiesen.
Gliose. Unter Verwendung von codierten Proben wurden Gehirne von 21 betroffenen Tg-Mäusen, die die dreifache HuAPP-Variante, die niederländische HuAPP-Variante, die schwedische HuAPP-Variante, Wildtyp-HuAPP exprimieren, sowie Gehirne von 12 alterspassenden, nicht betroffenen Nicht-Tg-Mäusen untersucht. Gehirne von 16 betroffenen Tg-Mäusen zeigen auffallend hypertrophe astrozytische Gliose, überwiegend lokalisiert in der parahippocampalen Fläche, Hippocampus, Amygdala und Hirnrinde (10), mit geringer Häufigkeit bei den Basalganglien. Die Astrozyten wiesen erweiterte, verlängerte Verfahren auf, wenn sie hinsichtlich Gliafibrillensäure protein (GFAP) immunogefärbt werden, aber es gab keine Erhöhung der Anzahl von Astrozyten. Gehirne von alterspassenden Nicht-Tg-Mäusen waren ohne die reaktive Gliose, was eine starke Assoziation zwischen Gliose und abnormalem Verhalten zeigt (Yates-korrigiert X² = 14,83, p = 0,00012). Bielschowsky-Silber-Färbung offenbarte keine neurofibrilläre Plaques, dystrophe Nervenentzündung oder neuritische Plaques. Neuronen scheinen mit NissI- und Hematoxylin- und Esoin-Färbung normal zu sein.
Makroskopische und mikroskopische Untersuchungen von sechs tot aufgefundenen Tg-Mäusen offenbarten charakteristische Gehirnpathologie (astrozytische Gliose im Hippocampus, Hirnrinde, Amygdala und parahippocampalen Fläche, wie nachstehend beschrieben), aber keinen Nachweis über mikroskopische oder makroskopische Pathologie außerhalb des ZNS. Amyloid wurde speziell durch Thioflavin S-Färbung in dem Herzen, der Lunge, der Leber, der Milz, der Thymusdrüse, der Niere, dem Dünndarm und den Hoden bei vier von diesen Tg-Mäusen ausgeschlossen. Die Abwesenheit der pathologischen Ergebnisse außerhalb des ZNS zeigt, daß die Todesfälle am wahrscheinlichsten aufgrund von Ursachen waren, die von neurologischem Ursprung waren.
Regionale Gehirnglukoseutilisation
Um zu bestimmen, ob es funktionelle Unterschiede in den Gehirnen von betroffenen Tg-Mäusen gab, wurde die regionale Gehirnglukoseutilisation unter betroffenen Tg-Mäusen mit gealterten, beeinträchtigten Nicht-Tg-FVB-Mäusen und alterspassenden Nicht-Tg-Mäusen verglichen. Im Vergleich zu normalen, Nicht-Tg-Wurfpartnern wurden signifikante Verringerungen (p < 0,05; Varianzanalyse) der Glukoseutilisation in verschiedenen Vorderhirnregionen bei Tg-Mäusen beobachtet, einschließlich Hippocampus (–31%), Amygdala (–28%), parietale Rinde (–34%), temporale Rinde (–33%) und okzipitale Rinde (–36%). Viele Regionen zeigten im Gegensatz dazu keine signifikante Verringerung (p > 0,05), einschließlich sensorisch-motorisches Rindenfeld, Corpus callosum, Formatio reticularis, Vermis, Vorhofkomplex und Nucleus dentatus cerebelli. Die Verringerung der regionalen Glukoseutilisation war insbesondere im Hippocampus, Amygdala und einigen Rindenregionen bei betroffenen Tg-Mäusen ausgeprägt, die der sehr ähnelt, die bei älteren, beeinträchtigten Nicht-Tg-FVB-Mäusen auftritt.
Extrazellulare Aβ-Färbung bei einer Tg-Maus
Ein Tier zeigt extrazelluläres Färben mit einem Antikörper, der in Saido et al., JBC 269 (21): 15253–15257, 1994 beschrieben wird. Dieser Antikörper färbt speziell das Aminoende von Aβ. Es ist ein Affinitäts-gereinigter polyklonaler Antikörper. Das Färben in unserer Tg-Maus kann durch spezifische Kompetition mit dem Aβ-Fragment blockiert werden. Das Färbemuster in unserer Tg-Maus ähnelt dem, das in dem AD-Gehirn gesehen wird, welches mit demselben Antikörper gefärbt wird. Es werden mehr Tiere untersucht. Die weitere Charakterisierung mit anderen Antikörpern wird durchgeführt. Ultrastrukturelle Studien werden ebenso durchgeführt.
Beispiel 7
Testen von Medikamenten, die progressiven neurologischen Erkrankungen vorbeugen
Die Tiere der Erfindung werden verwendet, um Materialien hinsichtlich der Fähigkeit, Schutz gegen die Entwicklung der progressiven neurologischen Erkrankung zu verleihen, zu testen. Ein Tier, das die progressive neurologische Erkrankung zeigt, wird mit einem Testmaterial parallel zu einem unbehandelten transgenen Kontrolltier, das die neurologische Erkrankung aufweist, behandelt. Eine verhältnismäßig geringere Häufigkeit der progressiven neurologischen Erkrankung bei dem behandelten Tier wird als Zeichen des Schutzes nachgewiesen. Behandelte und nicht-behandelte Tiere werden hinsichtlich des verringerten exploratorischen/lokomotorischen Verhaltens (CI-Test; siehe Beispiel 6) sowie der verringerten 2-Deoxyglukoseaufnahme/utilisation und hypertrophen Gliose in den cortico-limbischen Strukturen des Gehirns analysiert. Um zu bestimmen, wenn eine Behandlung den Ausbruch der Krankheit vorbeugen oder verzögern kann, kann die Hälfte der transgenen Mäuse in einem Wurf aus einer Linie von Mäusen, die dafür bekannt sind, die neurologische Krankheit zu entwickeln, zufällig zugeordnet werden, um die Behandlung zu erhalten, und die andere Hälfte erhielt ein Scheinmedikament, beginnend bei einem Alter vor dem frühsten bekannten Ausbruch der Krankheit für die angegebene Linie von Mäusen. Die Zahl an Würfen, die verwendet werden soll, wird von dem Ausmaß der Unterschiede, die zwischen behandelten und nicht-behandelten Mäusen beobachtet wurden, abhängen.
Die Mäuse werden täglich beobachtet; ihre Diagnose wird durch die Verwendung des CI-Tests (siehe Beispiel 6) erleichtert, der dreimal pro Woche durch Personen, die an die Versuchsgruppe gebunden sind, verabreicht wird. Überlebenskurven und Durchschnittsalter des Krankheitsausbruchs und Todes werden aus den gesammelten klinischen Daten berechnet.
Die klinischen Ergebnisse werden durch das Durchführen von neuropathologischen und Glukoseaufnahmestudien in Proben der Versuchs- und Kontrollgruppen bestätigt. Gliose wird in immunohistologischen Studien unter Verwendung von Antikörpern für Gliafibrillensäureprotein bewertet. Die Glukoseaufnahmestudien wurden unter Verwendung einer Modifikation des Sokoloff-Verfahrens, das von Chmielowska et al. (1986) Exp. Brain Res. 63: 607, beschrieben wird, durchgeführt.
Um zu bestimmen, wenn eine Behandlung die Krankheit lindern oder heilen kann, werden kranke Wurfpartner zufällig zugeordnet, um die Behandlung von Interesse oder ein salziges Scheinmedikament zu erhalten. Das Überleben und die klinische Verbesserung auf den CI-Test, der mit den neuropathologischen und Glukoseaufnahmestudien verbunden ist, werden ermittelt, wie oben beschrieben.
Beispiel 8
Testen von Medikamenten, die die progressive neurologische Erkrankung heilen
Die Tiere der Erfindung werden verwendet, um Materialien hinsichtlich der Fähigkeit, die progressive neurologische Erkrankung zu verbessern oder zu heilen, zu testen. Ein Tier, das die progressive neurologische Erkrankung zeigt, wird mit einem Testmaterial parallel zu einem nicht-behandleten transgenen Kontrolltier, das die neurologische Erkrankung zeigt, behandelt. Ein verhältnismäßig verzögerter Tod oder eine Verbesserung im Neuroverhalten, pathologische und funktionelle Anzeichen der Krankheit, wird als ein Anzeichen des Schutzes nachgewiesen. Behandelte und nicht-behandelte Tiere werden hinsichtlich des verringerten exploratorischen/lokomotorischen Verhaltens sowie der verringerten 2-Deoxyglukoseaufnahme/umsatz und hypertrophen Gliose in den cortico-limbischen Strukturen des Gehirns analysiert.
Wie durch die obigen Ergebnisse dargestellt, zeigen die klinischen und pathologischen Ergebnisse bei nicht-humanen Säugern mit superendogenen Niveaus von entweder mutantem oder nativem Amyloid-Vorläuferprotein eine unerwartete, aber auffallende Parallele zu denen bei Menschen mit progressiven neurologischen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit. Die einbezogenen Regionen des Neokortex bei betroffenen transgenen Mäusen und Menschen sind ähnlich. Außerdem war die Glukoseaufnahme in der sensorimotorischen Fläche der Hirnrinde durch die neurologische Krankheit bei transgenen Mäusen nicht betroffen. Dies war die einzige Region des geprüften Mausneokortex, die hauptsächlich eher primären Neokortex als ein Gemisch aus primären und Assoziationsneokortex darstellt. Es ist eine allgemein bekannte Beobachtung, daß in Gehirnen von Patienten mit Alzheimer-Krankheit der primäre Neokortex relativ frei on neuropathologischen Befunden im Vergleich zu dem Assoziationskortex ist.
Der ZNS-Phänotyp der Tg-Mäuse ähnelt sehr dem ZNS-Phänotyp einer Untereinheit der gealterten Nicht-Tg-Mäuse desselben FVB-Stamms. Die Gliose im Hippocampus ist astrozytische Gliose, die charakteristisch in den Hippocampalformationen von gealterten, gedächtnisschwachen Ratten (Landfield et al. (1977) J. Gerontology 32, 2–12) und gealterten Nacktmäusen (Mandybur et al., (1989) Acta Neuropathol (Berl.) 77, 507–513) gefunden wird. Der regionale Glukosehypometabolismus bei sowohl den betroffenen Tg-Mäusen als auch den gealterten, beeinträchtigten Nicht-Tg-Mäusen wurde in dem Hippocampus, der Hirnrinde und Amygdala deutlich verringert, was den Mustern des Glukosegypometabolismus, der bei Menschen mit AD auftritt (de Leon et al. (1983) Am J. Neuroradiology 4, 568–571), und in eingeschränkten Flächen des limbischen Systems bei gealterten, beeinträchtigten Sprague-Dawley-Ratten ähnelt (Gage et al. (1984) J. Neuroscience 11, 2856–2865). Die auffallenden Ähnlichkeiten in der neurologischen Krankheit, die die Tg-Tiere zeigen, und die natürlich vorkommende Störung bei älteren Mäusen desselben Stammes unterstützen die Verwendung dieser Tg-Mäuse als ein Modell für progressive alternde Störungen des Gehirns, einschließlich Alzheimer-Krankheit.
Tiere sterben an der neurologischen Krankheit, die hypertrophe Gliose in dem Hippocampus, Amygdala und einigen Flächen der Hirnrinde zeigt. Die immunohistologische Genlokalisation von HuAPP bei transgenen Mäusen zeigte eine weit verbreitete Expression im ganzen Gehirn. Jedoch entsprechen die Verhaltenabnormalitäten den umschriebenen Regionen der gliotischen Pathologie und Glukosehypoutilitsation, die in ausgewählten Vorderhirnregionen gefunden wurden. Die auffallenden Ähnlichkeiten in Zielzell-Spezifizitäten in den cortico-limbischen Bereichen des Gehirns (Hippocampus, Amygdala und einigen Bereichen der Hirnrinde) bei diesen transgenen Mäusen und die Alzheimer-Krankheit unterstützen die Verwendung von diesen transgenen Mäusen als ein Modell für progressive neurologische Störungen wie Alzheimer-Krankheit.
Zusammenfassend exprimieren diese transgenen Mäuse supraendogene Niveaus von APP. Bei diesen Linien, die die neurologische Krankheit entwickeln, ist die APP-Transgenprodukt-Expression mit mindestens 200% endogenen Niveaus erreicht worden, oder mehr als das Doppelte, das in irgendwelchen vorhergehenden Veröffentlichungen berichtet wurde. Bedeutsamerweise weisen diese Mäuse eine definitive progressive neurologische Störung auf. Selbst dort, wo die APP-Expression bei anderen transgenen Mäusen erreicht worden ist, entwickelten sie keine progressive Krankheit, die die cortico-limbischen Bereiche des Gehirns befallen.
Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung erwähnt werden, sind hierin als Verweis im gleichen Maße aufgenommen, als ob jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung speziell und einzeln zur Aufnahme als Verweis angezeigt wäre.
Die Erfindung wurde nun umfassend beschrieben. Es wird für einen Fachmann des Gebiets offensichtlich sein, daß viele Veränderungen und Modifikationen gemacht werden können, ohne vom Geist oder Umfang der anhängenden Ansprüche abzuweichen.

Claims

Methode zum Präparieren eines transgenen nicht-humanen Säugers mit einer progressiven neurologischen Erkrankung in den cortico-limbischen Regionen des Gehirns, welche Methode den chromosomalen Einbau einer Expressionskassette umfasst, die eine Codierungssequenz eines Amyloid-Vorläuferproteins enthält, welche funktionsfähig geknüpft ist an regulatorische Sequenzen, gewinnbar von einem Prion-Protein-Gen, die für die Expression der Codierungssequenz in neurologischen Geweben in einer Menge vom mindestens Zwei- bis Vierfachen der endogenen Mengen an Wildtyp-Amyloid-Vorläuferprotein in das Genom eines nicht-humanen Säugers sorgen.
Methode nach Anspruch 1, wobei die Codierungssequenz eine humane Codierungssequenz ist.
Methode nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Codierungssequenz eine mit einer Krankheit verbundene mutierte Codierungssequenz ist.
Methode nach Anspruch 3, wobei die Codierungssequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus CS1HuAPP695.V717I. V721A.M722V.; CS2HuAPP695.V717I. V721A.M722V.; und CS1HuAPP695.K670N.M671L, wobei die Translationsinitiationssequenz CS1 ist GTCGACACCATGC und die Translationsinitiationssequenz CS2 ist GTCGACACCATGG.
Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Codierungssequenz eine chimäre Codierungssequenz ist.
Methode nach Anspruch 5, wobei die chimäre Codierungssequenz eine Mensch-Maus-chimäre Codierungssequenz ist.
Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die regulatorische Sequenz eine Sequenz enthält, ausgewählt aus ACCATG, ACCATG, ACCATGG und ACCATGG, worin ATG das Initiationscodon ist.
Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Expressionskassette eine DNA-Region umfasst, die die regulatorischen Sequenzen des Prions flankiert, wodurch eine Kopienzahl-abhängige Transgen-Expression erreicht wird.
Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die progressive neurologische Erkrankung eine „neurobehavioral" Störung mit Gliosis und einem oder beidem von verminderter Glucoseaufnahme und Glucoseumsatz ist.
Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei mindestens zwanzig Kopien der Expressionskassette in das Genom eingebaut werden.
Zygote eines nicht-humanen Säugers, umfassend: eine Expressionskassette, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert.
Zygote nach Anspruch 11, wobei die Zygote vom Kreuzen von Nagern derselben Spezies hergeleitet ist.
Zygote nach Anspruch 12, wobei die Nager Mäuse sind.
Zygote nach Anspruch 13, wobei die Mäuse FBV-Mäuse sind.
Zygote nach Anspruch 13, wobei die Mäuse von unterschiedlichen Stämmen sind.
Zygote nach Anspruch 15, wobei die Stämme ein Swiss-Webster- und ein CS7B16/DBA-ZF1-Hybrid sind.
Embryo, entwickelt aus der Zygote nach einem der Ansprüche 11 bis 16.
Tier, entwickelt aus dem Embryo nach Anspruch 17.
Cosmid-Vektor, umfassend eine Expressionskassette, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert.
Transgener nicht-humaner Säuger, dessen Keimzellen und Körperzellen eine Expressionskassette umfassen, die einen Expressionspegel eines mutanten Amyloid-Vorläuferproteins erbringt, welches die progressive neurologische Erkrankung in cortico-limbischen Regionen des Gehirns des Säugers erzeugt, wobei die Expressionskassette wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert ist.
Transgener nicht-humaner Säuger nach Anspruch 20, welcher Säuger eine Menge an Expression eines mutanten Amyloid-Vorläuferproteins in neurologischen Geweben des Säugers zeigt, die ausreichend ist, um eine beeinträchtigte Leistung des Säugers bei Gedächtnis- und Lerntests zu erzeugen und eine abnormale Neuropathologie in einer cortico-limbischen Region des Gehirn des Säugers zu induzieren, wobei die beeinträchtige Leistung und die abnormale Neuropathologie im Vergleich zu Kontroll-Säugern vorliegt.
Nachkommen des transgenen nicht-humanen Säugers nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, wobei die Keimzellen und Körperzellen der Nachkommen die Expressionskassette enthalten.
Methode zum Screening auf ein Agens, welches Symptome von Alzheimer-Krankheit mildert, welche Methode umfasst: Vergleichen der Leistung bei Gedächtnis- und Lerntests eines ersten transgenen nicht-humanen Säugers nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, der mit dem Agens kontaktiert wurde, und eines zweiten transgenen nicht-humanen Säugers nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, der nicht mit dem Agens kontaktiert wurde, wobei ein Agens, welches die Symptome mildert, durch eine überlegene Leistung des ersten transgenen nicht-humanen Säugers im Vergleich zum zweiten trangenen nicht-humanen Säuger bei den Gedächtnis- und Lerntests identifiziert wird.
Methode zum Screening auf ein Agens, welches zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit nützlich ist, welche Methode umfasst: Vergleichen der Leistung bei Gedächtnis- und Lerntests eines ersten transgenen nicht-humanen Säugers nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, der mit dem Agens kontaktiert wurde, und eines zweiten transgenen nicht-humanen Säugers nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, der nicht mit dem Agens kontaktiert wurde; und Vergleichen der Neuropathologie in einer cortico-limbischen Region des Gehirns der ersten und der zweiten transgenen nicht-humanen Säuger, wenn der erste transgene nicht-humane Säuger eine überlegene Leistung bei den Gedächtnis- und Lerntests im Vergleich zu dem zweiten transgenen nicht-humanen Säuger erbringt, wobei ein Agens, das zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit nützlich ist, durch eine Verminderung der neuropathologischen Befunde im ersten transgenen nicht-humanen Säuger im Vergleich zum zweiten transgenen nicht-humanen Säuger identifiziert wird.
Methode zum Screening auf ein Agens, welches zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit nützlich ist, welche Methode umfasst: Vergleichen der Leistung bei Gedächtnis- und Lerntests eines ersten transgenen nicht-humanen Säugers nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, der mit dem Agens kontaktiert wurde, und eines zweiten transgenen nicht-humanen Säugers nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, der nicht mit dem Agens kontaktiert wurde; und Vergleichen des Todesalters der ersten und der zweiten transgenen nicht-humanen Säuger, wenn der erste transgene nicht-humane Säuger eine überlegene Leistung bei den Gedächtnis- und Lerntests im Vergleich zu dem zweiten transgenen nicht-humanen Säuger erbringt, wobei ein Agens, das zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit nützlich ist, durch ein höheres Todesalter des ersten transgenen nicht-humanen Säugers im Vergleich zum zweiten transgenen nicht-humanen Säuger identifiziert wird.
Methode zum Screening auf ein Agens, welches Symptome von Alzheimer-Krankheit mildert, welche Methode umfasst: Vergleichen des explorativen Verhaltens oder lokomotorischen Verhaltens eines ersten transgenen nicht-humanen Säugers nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, der mit dem Agens kontaktiert wurde, und eines zweiten transgenen nicht-humanen Säugers nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, der nicht mit dem Agens kontaktiert wurde, wobei ein Agens, welches die Symptome mildert, durch ein weniger beeinträchtigtes exploratives oder lokomotorisches Verhalten des ersten transgenen nicht-humanen Säugers im Vergleich zum zweiten trangenen nicht-humanen Säuger identifiziert wird.