DE60320258T2 - Transgenes tier welches das trunkierte alzheimer tau protein exprimiert - Google Patents

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Description

  • Neurodegenerative Erkrankungen stellen eine heterogene Gruppe genetischer und erworbener neurologischer Störungen dar, die zu einer schweren und fortschreitenden kognitiven und motorischen Beeinträchtigung führen, welche im mittleren bis späten Lebensalter einsetzt (1). Die häufigste Ursache der Demenz ist die Alzheimer-Krankheit (Alzheimer's disease, AD). Bei weniger als 5% der Fälle der Alzheimer-Krankheit sind genetische Faktoren beteiligt, der Rest der Fälle tritt sporadisch auf.
  • Tau-Protein ist das im Zentralnervensystem exprimierte Protein und spielt im Neuronen-Gerüst eine wesentliche Rolle, indem es das intrazelluläre Mikrotubulus-Netzwerk stabilisiert. Eine Beeinträchtigung der physiologischen Rolle des Tau-Proteins entweder durch Trunkierung, Hyperphosphorylierung oder durch Störung des Gleichgewichts zwischen den sechs natürlich vorkommenden Tau-Isoformen führt zur Bildung der neurofibrillären Bündel („neurofibrillary tangles", NFT), dystrophischen Neuriten und Neuropilfäden. Diese Gebilde stellen ultrastrukturelle Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit dar. Die wichtigste Protein-Untereinheit dieser Gebilde ist das Mikrotubulus-assoziierte Protein Tau (2, 3). Die Menge des bei Autopsien von AD-Patienten festgestellten NFT korreliert mit klinischen Symptomen, einschließlich des intellektuellen Verfalls. Daher spielt das Tau-Protein eine wesentliche Rolle bei der Pathologie der AD. Die jüngste Entdeckung der Kosegregation spezifischer Mutationen im Tau-Gen mit der Krankheit frontotemporale Demenz bei Parkinsonismus in Verbindung mit dem Chromosom 17 (FTDP-17) bestätigte, dass bestimmte Abnormitäten im Tau-Protein eine primäre Ursache der Neurodegeneration und der Demenz bei betroffenen Individuen sein kann (4, 5). Es gibt jedoch kein Versuchsmodell, das sich direkt mit den Details hinsichtlich der Rolle des Tau-Proteins bei der Pathogenese der AD befassen würde.
  • Jüngste transgene Modelle der AD basieren auf der Expression von Proteinen, die mit FAD verbunden sind (APP, PS1, ApoE usw.), die mutiert sind oder auch nicht. Zu diesen zählen Tiere, die hinsichtlich eines einzigen oder mehrerer Gene humanisiert sind. Keines der Modelle fasst beide Merkmale der AD zusammen, gewöhnlich weisen sie keine neurofibrilläre Pathologie auf, und keines davon inkludiert die Möglichkeit der Untersuchung der Funktion von Umwelt-Risikofaktoren, die bei der Entwicklung der AD eine wesentliche Rolle spielen.
  • Derzeit verfügbare Tiermodelle, die gewisse neurofibrilläre Veränderungen aufweisen, basieren einzig auf der transgenen Expression von mutiertem Tau, das aus mit dem Chromosom 17 verbundener frontotemporaler Demenz stammt (FTDP17). Ein typisches Beispiel für diese Gruppe ist die JNPL3-transgene Maus (6). Weitere Beweise für die Rolle von mutiertem Tau wurden kürzlich von Goedert und Spillantini veröffentlicht (7).
  • Bei einem anderen transgenen Tiermodell wurde eine Überexpression des 4-Repeat-Tau-Proteins untersucht. Eine markante Axonopathie in Gehirn und Rückenmark wurde berichtet, und es wurde gezeigt, dass eine Überexpression der 4-Repeat-Tau-Protein-Isoform genügt, um die Physiologie von Neuronen zu verändern. Im Modell wurden Axonen-Dilatationen mit einer Ansammlung von Neurofilamenten in den Neuronen des Zentralnervensystems dokumentiert, jedoch ohne Bildung von intraneuronalen neurofibrillären Bündeln (8).
  • Die transgene Maus wurde auch hergestellt, um die normale Zellfunktion von Tau und seine Rolle bei der Pathogenese zu untersuchen. Die transgene Maus überexprimiert ein genomisches Tau-Transgen und auch Tau-cDNA-Transgen. Der Vergleich der beiden Modelle zeigt, dass die Verteilung von Tau bei beiden transgenen Linien ähnlich ist. Tau-immunreaktive axonale Schwellungen wurden im Rückenmark der cDNA-Mäuse gefunden, was mit einer Abnormität der hinteren Gliedmaßen korrelierte, wogegen bei den genomischen Mäusen keine Neuropathologie festgestellt wurde (9).
  • Trotz des Vorteils der Ratte im Vergleich zur Maus als Versuchsmodell in der Neurobiologie überrascht es, dass kein Tautransgenes Modell für eine neurofibrilläre Pathologie erzeugt wurde. Bisher wurde allgemein eine beträchtlich geringere Menge an transgenen Rattenmodellen der Neurodegeneration erzeugt. Jedoch keine davon fasst die Tau-Pathologie zusammen, die für AD typisch ist.
  • Czech C. et al (12) beschreiben ein transgenes Rattenmodell, welches Mutationen in dem für Presenilin 1 (SP1) codierten Gen aufweist. PS1 wird als Ursache für die Mehrheit der Fälle der früh einsetzenden familiären Alzheimer-Krankheit angesehen, jedoch zeigte das veröffentlichte Modell nicht genügend Anzeichen für eine mit AD verbundene Pathologie. Echeverria V. und Cuello AC. (13) kommentieren die Rolle der intrazellulären Ansammlung von Beta-Amyloid und der möglichen neuropathologischen Rolle ei ner intrazellulären Amyloid-beta-Ansammlung bei der Alzheimer-Krankheit. Sie präsentieren jüngste Beobachtungen aus einem transgenen Rattenmodell mit einem Phänotyp einer intrazellulären Ansammlung von A-beta-Fragmenten in Neuronen des Hippocampus und der Cortex, jedoch ohne Plaque- und NFT-Bildung. Daher gilt für Ratten, die das am zweithäufigsten verwendete Tier bei transgenen Untersuchungen sind, dasselbe wie für Mäuse: in der wissenschaftlichen Literatur ist keine transgene Ratte beschrieben, die trunkiertes Tau-Protein exprimieren würde und eine NFT-Bildung zeigte.
  • Bisher gibt es kein Versuchsmodell zur Untersuchung der Ätiologie der AD in Verbindung mit Hypertonie oder anderen Risikofaktoren, wie Diabetes und Dislipidämie, die mit der AD verbunden sind. Der genetische Hintergrund der transgenen Versuchstiere spielt eine Rolle bei der Entwicklung eines entsprechenden transgenen Modells.
  • Es ist wohlbekannt, dass AD mit bestimmten Umwelt-Risikofaktoren verbunden ist. Bei epidemiologischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass Risikofaktoren für Gefäßerkrankungen und Schlaganfall mit einer kognitiven Schädigung und Alzheimer-Krankheit in Verbindung stehen; außerdem verstärkt das Vorliegen einer zerebrovaskulären Erkrankung das Vorhandensein und die Schwere der klinischen Symptome der Alzheimer-Krankheit (14). Eine weitere Verbindung zwischen Hypertonie und Demenz vom AD-Typ ist in einer Rotterdamer Studie aufgezeigt (15).
  • Die WO 01/53340 A betrifft transgene Mäuse, die humanes Tau-Protein exprimieren. Das humane Tau-Protein können entweder die 6-Isoformen oder verschiedene Mutanten davon sein.
  • Die WO 01/65252 A betrifft ebenfalls ein transgenes Mausmodell, welches mindestens eine Isoform des humanen Tau-Proteins exprimiert.
  • Die WO 01/02552 A betrifft ein transgenes Tiermodell, welches Tau-Protein exprimiert, wobei die Hyperphosphorylierung von Tau verbessert oder inhibiert wird.
  • Lewis et al. (Science 293(2001): 1487–1491) offenbaren die Kreuzung von zwei verschiedenen transgenen Mäusen, einer, die ein mutiertes Tau-Protein (P30lL Mutante) aufweist, und einer mutierten APP-Maus, was zu einer doppeltmutierten Nachkommenschaft führt.
  • Die WO 96/307366 A betrifft einen Screening-Test für Mittel, die die Tau-Tau-Assoziierung modulieren oder inhibieren, u. a. durch Bestimmung der Bindung von Tau an Tubulin.
  • Novak et al. (EMBO J. 12(1)(1993): 365–370) offenbaren verschiedene Tau-Isoformen.
  • Die WO 01/18546 A offenbart mehrere trunkierte Formen von Tau-Peptiden.
  • Daher ist es wichtig, ein Versuchsmodell für AD zu entwickeln, welches die pathologischen Hauptmerkmale der Krankheit nachahmen würde und zugleich eine Expression von Umweltfaktoren ermöglicht, verbunden mit der AD-Ätiologie.
  • Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Versuchsmodell, welches die Kennzeichen der AD so genau wie möglich wiedergibt, und auch das Testsystem für Substanzen zur Behandlung, Prävention und Diagnose von AD vorzusehen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein transgenes, nicht-menschliches Tier, das ein von cDNA codiertes Alzheimer-Tau-Protein im Gehirn der transgenen Tiere exprimiert. Diese Tiere weisen eine pathologische NF-Aktivität im Gehirn auf. Die Erfindung betrifft weiters ein transgenes Tier, welches als Screening-Test-System beim Verfahren zur Identifizierung von Substanzen verwendet werden kann, welche das Lernen und Gedächtnis verbessern, die Neurodegeneration inhibieren und die Rate der Bildung von neurofibrillären Bündeln (NFT) verringern und ihre Eliminierung aus dem Gehirn. Die Tiere können für die Identifizierung von Substanzen zur Prävention, Behandlung und Diagnose neurodegenerativer Krankheiten, vorzugsweise Tauopathien und AD, verwendet werden. Die transgenen Tiere können auch zur Untersuchung des Einflusses von mit AD verbundenen Risikofaktoren auf die Entstehung von AD verwendet werden. Eine andere Verwendung der Tiere liegt im Verfahren zur Identifizierung von Arzneistoff-Zielen.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt das Herstellen transgener Tiere, wobei AD-Veränderungen erzeugt werden, die durch ein spezifisches Transgen induziert werden, was einer Alzheimer-Krankheit in diesen Tieren ähnlich ist. Dies liefert ein Untersuchungswerkzeug für die Entdeckung und Entwicklung von Arzneistoffen und die Diagnose und für die weitere Untersuchung der Rolle normaler und erkrankter Tau-Proteine in vivo.
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf einer Induktion einer NF-pathologischen Aktivität im Gehirn von Tieren einzig durch Expression von Alzheimer-Tau-Protein in den Gehirnen transgener Tiere. Merkmale der AD werden in Tieren induziert, die zur Induktion von mit der Ätiologie von AD verbundenen Risikofaktoren neigen, was ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist.
  • Alle bei der Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke haben – sofern nicht anders angegeben – dieselbe Bedeutung wie sie allgemein auf dem Fachgebiet, zu welchem diese Erfindung gehört, verstanden werden. Die bevorzugten Methoden, die Laborverfahren bei der Zellkultur, Molekulargenetik, Biochemie und Nukleinsäurechemie und Materialien sind in der Erfindung beschrieben, aber jegliche Methoden und Materialien, die ähnlich oder äquivalent sind, können beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Für Verfahren wie die rekombinante Nukleinsäure-Herstellung, biochemische Analyse, Zellkultur und transgene Einarbeitung, wie die Elektroporation, Lipofektion und Mikroinjektion, werden Standardtechniken verwendet.
  • Der Ausdruck „Alzheimer-Tau" bezieht sich auf die Gruppe spezifisch trunkierter Isoformen von Tau-Protein, die genetisch hergestellt wurden, welche jenen entspricht, die ausschließlich im an AD erkrankten Gehirn vorhanden sind. Das Alzheimer-Tau kann eine NF-Aktivität selbst oder in Kombination mit anderen Molekülen im Gehirn induzieren. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck Alzheimer-Tau-Protein auf die Gruppe trunkierter Tau-Formen, die im humanen Hirngewebe mit Alzheimer-Krankheit vorhanden ist.
  • Der Ausdruck „transgen" wird hierin verwendet, um genetisches Material zu beschreiben, das künstlich in das Genom einer Zelle, insbesondere einer Säuger-Zelle, insertiert wurde zwecks Implantation in ein lebendes Tier. Für bestimmte Länder kann es notwendig sein, einen bestimmten Gegenstand aus diesem Aspekt spezifisch auszuschließen, wie humane totipotente Stammzellen als solche oder Verfahren, die zu solchen Zellen führen, die unter Art. 6 (1) und (2) der EU-Richtlinie 98/44/EC fallen.
  • Mit „Alzheimer-Krankheit" (hierin als „AD" abgekürzt) ist ein Zustand gemeint, der mit der Bildung von neurofibrillären Bündeln und Beta-Amyloid-Plaques sowie mit der Beeinträchtigung sowohl des Lernens als auch des Gedächtnisses verbunden ist. Wie hierin verwendet, soll „AD" sowohl AD als auch AD-artige Pathologien umfassen, d. h. Erkrankungen des Zentralnervensystems mit Symptomen, die der AD ähnlich sind.
  • Mit „neurofibrillärer Aktivität" (hierin als „NF"-Aktivität abgekürzt) ist ein Zustand gemeint, der mit der Bildung von neurofibrillären Bündeln im Zentralnervensystem mit Symptomen, die der AD ähnlich sind, verbunden ist.
  • Mit „der AD ähnlichen Symptonen" und „mit AD verbundenem Phänomen" ist eine strukturelle, molekulare oder funktionelle, mit der AD verbundene Begebenheit gemeint, insbesondere eine solche Begebenheit, die in einem Tiermodell leicht beurteilbar ist. Zu solchen Begebenheiten gehören – ohne Einschränkung darauf – neurofibrilläre Pathologie, Lern- und Gedächtnisdefizite und andere mit der AD verbundene Merkmale.
  • Mit „transgenem Tier" ist ein nicht-menschliches Tier, gewöhnlich ein Säugetier (z. B. eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen, ein Hamster usw.) gemeint, das eine nicht-endogene (d. h. heterologe) Nukleinsäuresequenz hat, die als extrachromosomales Element in einem Teil seiner Zelle vorliegt oder stabil integriert ist in seine Keimbahn-DNA (d. h. in der Genom-Sequenz der meisten oder aller seiner Zellen). Heterologe Nukleinsäure wird in die Keimbahn solcher transgener Tiere mittels Genmanipulation von beispielsweise Embryonen des Wirtstieres eingeführt.
  • Mit „Konstrukt" ist eine rekombinante Nukleinsäuresequenz, im Allgemeinen rekombinante DNA-Sequenzen gemeint, die mit einem gewebespezifischen oder allgemeinen Promotor funktionell verknüpft sind, welcher erzeugt wird zum Zweck der Expression von (einer) spezifischen Nukleotidsequenz(en) in Säugerzellen, oder welcher bei der Konstruktion anderer rekombinanter Nukleotidsequenzen verwendet werden soll.
  • Die vorliegende Erfindung sieht die Struktur, Sequenz und das Verfahren zur Erzeugung von DNA-Konstrukten zur Verwendung für die Herstellung von transgenen Tieren vor, gekennzeichnet durch die folgenden Merkmale:
    Ein transgenes, nicht-menschliches Tier, dessen Keim- und/oder Soma-Zellen ein DNA-Konstrukt aufweisen, das eine Codierregion enthält, welche zur Expression eines N- und C-terminal trunkierten Tau-Moleküls führt, wobei
    • – die Codierregion zumindest 30 Nukleotide stromabwärts vom Start-Codon trunkiert und zumindest 30 Nukleotide stromaufwärts vom Stop-Codon der Gesamtlängen-Tau-cDNA-Sequenz, die für 4-repeat bzw. 3-repeat-Tau-Protein codiert, trunkiert ist,
    • – der minimal trunkierte Tau-Kern ein Proteinfragment umfasst, das durch SEQ ID Nr. 9 codiert ist,
    • – das DNA-Konstrukt für ein Protein codiert, welches eine eine neurofibrilläre (NF) Krankheit erzeugende Aktivität aufweist, wenn es in Hirnzellen des Tiers exprimiert wird.
  • Diese NF-Pathologie-erzeugende Aktivität kann durch Zählungen der neurofibrillären Bündel pro ausgewählter Hirnregion, d. h. unter Verwendung eines Stereologie-Ansatzes, quantifiziert werden. Alternativ können neurobehaviorale Tests für die verlässliche Evaluierung kognitiver Werte bei lernenden Gedächtnisaufgaben verwendet werden.
  • Besonders bevorzugte Tau-DNA-Konstrukte gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe der SEQ ID Nr. 1 bis 14. Die Sequenzen sind in 1 dargestellt.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellen diese DNA-Konstrukte eine Gruppe von N- und C-terminal doppelttrunkierten cDNAs dar, die die folgenden Nukleotid-Sequenzen umfassen (Derivate von 4-Repeat-Tau (Tau 43) sind mit R4 bezeichnet, und Derivate von 3-Repeat-Tau (Tau 44) sind mit R3 bezeichnet). Die hier verwendete Nummerierung stammt von der in Goedert et al. (24) beschriebenen Gesamtlängen-Tau-cDNA:
    Figure 00070001
    Figure 00080001
    Figure 00090001
    Figure 00100001
    Figure 00110001
  • Die trunkierten Tau-Sequenzen können wegen der spezifischen Wirtszelle, in welche das Konstrukt transferiert wird, adaptiert werden (Codon-Verwendung, Codon-Präferenzen, Homolog-Adaptationen (Austauschen eines oder mehrerer der humanen Codons mit dem Wirtszellen-Codon, wenn Unterschiede vorliegen)).
  • Bevorzugte Merkmale der Konstrukte:
  • Die obigen cDNA-Sequenzen sind mit regulatorischen Sequenzen verbunden, um eine Expression von trunkiertem Tau-Protein im Gehirn anzutreiben. Die Modifikation des Thy-1-Gens (25) erfolgte so, dass die regulatorische Sequenz, die eine Expression in T-Zellen lenkt, deletiert und eine trunkierte cDNA-Sequenz zwischen die Spe-I und die Xho-Restriktionsstellen eingeführt wurde. Das modifizierte Konstrukt wurde von prokaryontischen Sequenzen befreit und über eine Mikroinjektion in einen männlichen Pronukleus eingeführt. Jegliche funktionellen Promotoren oder Promotor-Verstärker-Komplexe können für die Expression der oben beschriebenen trunkierten Tau-cDNAs verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart auch ein Verfahren zur Herstellung und zum Testen von Molekülen gemäß der vorliegenden Erfindung, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
    • (a) Konstruieren eines rekombinanten Prokaryonten-Klonierplasmids, das Codiersequenzen für ein doppelttrunkiertes Tau-Molekül mit Deletionen trägt, die sich zumindest auf die ersten 30 und die letzten 30 Nukleotide von 3- oder 4-Repeat-Tau-cDNA-Molekülen erstrecken,
    • (b) Konstruieren eines eukaryontischen Expressionsplasmids, das geeignete Promotoren für eine Gehirn-Expression oder für eine ubiquitäre Expression und entsprechende cDNA-Sequenzen von trunkierten Tau-Molekülen und die Kombinationen davon tragen,
    • (c) Züchten von Bakterien, die diese Plasmide enthalten, und Amplifizieren der Plasmide und ihre Extraktion in großen Mengen,
    • (d) Transfizieren der Gen-Konstrukte in COS-7-Zellen und ihre Analyse unter Verwendung der Western-Blot-Technik,
    • (e) Isolieren und Reinigen des Gen-Konstrukts, so dass alle prokaryontischen Sequenzen ausgeschlossen werden, und Verdünnen von Transgenen in einem Puffer in einer für Mikroinjektion geeigneten Konzentration (vgl. Beispiel 1),
    • (f) Verifizieren der für eine Mikroinjektion bestimmten Gen-Konstrukte.
  • Dies erfolgt mittels Restriktionsanalyse, Gensequenzierung und Protein-Analyse nach transienten Transfektionen in Säugetier-Zellen, wonach die korrekte Größe der Proteine und ihre Reaktivität mit spezifischen monoklonalen Antikörpern evaluiert wird (vgl. Beispiel 1, 2.b).
  • Die vorliegende Erfindung sieht daher ein transgenes, nicht-menschliches Tier vor, dessen Keim- und/oder Soma-Zellen das DNA-Konstrukt aufweisen, welches für Alzheimer-Tau-Protein codiert, und welches als geeignetes Tiermodell der Alzheimer-Krankheit verwendet werden kann.
  • Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein transgenes, nicht-menschliches Tier vorzusehen, dessen gesamte Keim- und/oder Soma-Zellen die humanen trunkierten Tau-cDNA-Moleküle aufweisen. Die klonierte humane Alzheimer-Tau-cDNA-Sequenz ist mit einer Promotor-Sequenz verbunden, welche die Expression des Alzheimer-Tau in gewebespezifischer Weise oder ubiquitär lenkt.
  • Transgene Tiere der Erfindung werden hergestellt, indem man die wohlbekannten regulären Verfahren einer Mikroinjektion in den männlichen Pronukleus von einen Tag alten fruchtbaren Embryonen von Ratten verwendet. Die Transgene können auch mittels anderer, auf dem Gebiet bekannter Methoden, einschließlich Transfektion, Lipofektion, Elektroporation und mit Hilfe von Retroviren oder mit anderen Mitteln in Embryo-Zellen eingeführt werden. Embryonen, die das Transgen tragen, können dann in scheinschwangere Tiere implantiert werden.
  • Es ist daher ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Genotypisierung von neugeborenen Tieren vorzusehen. Die PCR-Analyse unter Verwendung von spezifischen Oligonukleotiden, die eine Amplifikation von Ziel-Sequenzen des Transgens ermöglichen, wird daher für diesen Zweck eingesetzt. Für die Genotypisierung verwendete Oligonukleotide wurden auf eine Weise entworfen, dass die Transkriptions-Initiierungsstelle des Transgens einschließlich des ATG-Codons und der Kozak-Sequenz schließlich mittels DNA-Sequenzierung des PCR-Produkts verifiziert werden konnten (Primer-Paar A). Außerdem lagert sich ein Primer an den heterogenen Promotor an, und ein anderer Primer lagert sich an die für Alzheimer-Tau-Protein codierende Nukleotid-Sequenz an. Ähnliche Gestaltungskriterien wurden für das Stop-Codon angewendet (Primer-Paar B). Die Integrität des Transgens kann daher auf diese Weise überwacht werden. Sequenzen der diagnostischen Oligonu kleotide sind daher wie folgt:
    Figure 00140001
  • Die erwartete Größe des PCR-Produkts ist 438 Nukleotide.
  • Das Vorhandensein des PCR-Fragments ist daher für Tiere spezifisch, die das Transgen ins Genom integriert haben (vgl. Beispiel 2).
  • Die Gründer-Tiere („founder animals") können zum Züchten mit Wildtyp-Tieren verwendet werden, um die F1-Generation der Tiere zu erzeugen, die für das Transgen heterozygot sind. Bei weiteren Ausführungsformen können diese heterozygoten Tiere untereinander gekreuzt werden, um lebensfähige transgene Embryonen zu erhalten, deren Soma- und Keim-Zellen für die für das Alzheimer-Tau-Protein codierenden Gene homozygot sind.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, nicht-menschliche Tiere vorzusehen, deren Keim- und Soma-Zellen das für das Alzheimer-Tau-Protein codierende DNA-Konstrukt transient oder stabil exprimieren und die eine NF-Pathologie im Gehirn aufweisen. Das bevorzugte Tier dieser Erfindung ist eine Ratte, wobei das von den DNA-Molekülen codierte Protein im Gehirn exprimiert wird.
  • Die am meisten bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein transgenes, nicht-menschliches Tier, bei welchem das durch die DNA-Moleküle codierte Alzheimer-Tau-Protein im Gehirn des Tiers exprimiert wird. Die Expression des Alzheimer-Tau wurde mittels mehrerer monoklonaler Antikörper nachgewiesen, wie in Beispiel 3 beschrieben und in 3 dokumentiert. Die Expression des Proteins in verschiedenen Hirnregionen der transgenen Abstammungslinie ist in 4 dokumentiert.
  • Die vorliegende Erfindung sieht daher ein transgenes, nicht-menschliches Tier vor, bei welchem für das Alzheimer-Tau-Protein codierende DNA-Moleküle in das Genom des Tiers stabil integriert sind oder auf andere Weise im Zellkern anwesend sind, damit sie transkribiert werden. Diese Tiere sind durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet:
    • – Transgene werden auf nachfolgende Generationen von Tieren gemäß den Mendelschen Gesetzen übertragen, wobei sie eine transgene Abstammungslinie bilden (vgl. 4)
    • – das ererbte Transgen exprimiert trunkierte Proteine in den Gehirnen der Gründer-Tiere und der Nachkommenschaft, wie in Beispiel 3, 4 gezeigt.
  • Die vorliegende Erfindung sieht daher die transgenen, nicht-menschlichen Tiere vor, welche eine neurofibrilläre Pathologie im Zentralnervensystem (ZNS) aufweisen. Diese Tiere sind durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet:
    • – Expression trunkierter Tau-Proteine fördert die Bildung der neurofibrillären Pathologie (Beispiel 5).
    • – PHF-1-immunreaktive NFTs zeigten, dass endogenes normales Ratten-Tau an der Bildung von NFTs beteiligt ist (Beispiel 5).
    • – Neurofibrilläre Bündel sind als intrazelluläre Einschlüsse und Filamente in den Neuronen des ZNS vorhanden und sind homolog zu NFT in humanen, an AD erkrankten Gehirnen.
    • – Immunfluoreszenz zeigte das Vorhandensein kleiner, stabartiger Strukturen ähnlich jenen, die bei präklinischer Alzheimer-Krankheit im humanen Hirngewebe beobachtet werden (vgl. Beispiel 5).
  • Bei der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen transgene Tiere Neuropathologien wie neurofibrilläre Bündel, Geisterfibrillen („ghost tangles") und Neuropil-Fäden, die ameisensäureempfindlich sind, auf. Neurofibrilläre Bündel sind aus einer abnormen Ansammlung intraneuronaler Filamente zusammengesetzt. Die Bündelbestandteile bestehen aus Alzheimer-Tau sowie aus normalen Tau-Molekülen. Solche transgene Tiere dienen als geeignetes Modellsystem zur Untersuchung der Alzheimer-Krankheit und Entwicklung therapeutischer, präventiver und diagnostischer Substanzen.
  • Die Erfindung sieht ein transgenes Tier vor, das eine NF-Pathologie entwickelt und einen genetischen Hintergrund hat, der die Induktion von mit AD verbundenen Risikofaktoren ermöglicht, wodurch es ein Krankheitsmodell für Menschen darstellt.
  • Die vorliegende Erfindung sieht daher ein transgenes, nicht-menschliches Tier vor, bei welchem der genetische Hintergrund, in welchem die DNA-Moleküle im Genom spontan hypertoner Tiere stabil integriert oder in anderer Weise im Zellkern vorhanden sind, damit sie innerhalb des spezifischen genetischen Hintergrunds transkribiert werden.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist das Vorsehen eines Tiermodells, umfassend die Kombination genetischer Faktoren und anderer, mit AD verbundener Risikofaktoren wie folgt:
    • – Hypertonie, die der häufigste Risikofaktor der AD ist,
    • – Diabetes, die durch die Ernährung induziert sein kann (Diabetes ist ein wichtiger Risikofaktor der AD),
    • – Hypercholesterinämie, die durch die Ernährung induziert sein kann (ein weiterer wichtiger Risikofaktor der AD).
  • Diese pathologischen Situationen können im vorgesehenen Tiermodell leicht induziert werden. Geeignete Beispiele wurden früher in der Literatur berichtet (z. B. in 26, 27, 28).
  • Außerdem ist das vorgesehene Tiermodell das erste Tiermodell, welches neurofibrilläre Pathologie auf dem genetischen Hintergrund von SHR exprimiert.
  • Gemäß einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Tier vor, welches ein Versuchsmodell für sporadische Alzheimer-Krankheit darstellt, wobei das Modell eine Beurteilung der Rolle von mit der AD-Entwicklung verbundenen Risikofaktoren gestattet. Risikofaktoren spielen bei der großen Mehrheit der AD-Fälle eine wesentliche Rolle, das Modell kann daher als ein Modell for sporadische AD angesehen werden, welche 90% aller Fälle der AD-Neurodegenerationen ausmacht.
  • Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screenen und zur Validierung von Substanzen für die Behandlung, Prävention und Diagnose von Alzheimer-Krankheit, zur Behandlung und Prävention von Tauopathien, vorzugsweise AD, zur Entwicklung diagnostischer Marker und Sonden für die Detektion von Tauopathien, vorzugsweise AD, und für Substanzen zur Behandlung der Hypertonie, Diabetes, Dislipidämie und Hypercholesterinämie in Verbindung mit Tauopathien, vorzugsweise AD, vor, welches umfasst:
    • – Evaluieren der Substanzen durch:
    • – Nachweisen von Veränderungen einer neurofibrillären Krankheit bei den Tieren,
    • – Messen der neurobehavioralen Veränderungen bei transgenen Tieren,
    • – Messen des kognitiven Werts bei transgenen Tieren,
    • – chemisches Messen von AD-spezifischen Markern in Tiergeweben und Körperflüssigkeiten.
  • Die vorliegende Erfindung sieht daher einen In-vivo-Test zur Bewertung der Wirksamkeit von Substanzen oder von Therapien, insbesondere von NFT-reduzierenden oder verhindernden Therapien, vor. Die Tiere können zum Screenen von Substanzen oder Therapien für neurodegenerative Erkrankungen, insbesondere Tauopathien, vorzugsweise AD und andere neurodegenerative Erkrankungen, die mit der Bildung von neurofibrillären Bündeln einhergehen, verwendet werden.
  • Daher sieht die vorliegende Erfindung ein Modellsystem vor, das aus transgenen Tieren, Zellen und Tests besteht, die bei der Untersuchung der Ätiologie und Behandlung der Alzheimer-Krankheit nützlich sind. Die Tests sind auch zum Screenen auf Substanzen, die die Bildung einer neurofibrillären Pathologie inhibieren, und anderer therapeutischer Wirkungen der Substanzen nützlich.
  • Gemäß einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung eine nicht-menschliche totipotente Zelllinie vor, die ein Konstrukt umfasst, das, wie oben erwähnt, für trunkiertes Tau codiert.
  • Die transgenen Tiere der vorliegenden Erfindung und davon abstammende Tierzellen werden zum Screenen von Verbindungen hinsichtlich einer möglichen Wirkung bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheit unter Verwendung von Standard-Methodiken verwendet. Die Verbindung wird über einen Zeitraum und in verschiedenen Dosierungen den Tieren verabreicht oder in die Kulturmedien eingebracht, danach werden die Tiere oder die Tierzellen auf Veränderungen in der Histopathologie bzw. in der Expression von Alzheimer-Tau untersucht. Weiters ermöglicht die Durchführbarkeit neurobehavioraler Tests an den transgenen Tieren eine Überwachung der kognitiven Funktion nach der Behandlung mit potentiellen therapeutischen Mitteln. Das Screenen von Verbindungen führt zur Selektion bestimmter Mittel für die Verhinderung oder Behandlung oder Diagnose der Alzheimer-Krankheit. Dem Fachmann sind viele Variationen von Screening-Methoden bekannt und können im Rahmen der vorliegenden Erfindung angewendet werden.
  • Das transgene Tiermodell der vorliegenden Erfindung kann auch zum Entschlüsseln der molekularen Kaskade von Ereignissen, die zu einer Neurodegeneration und zur Alzheimer-Krankheit führen, verwendet werden, so dass therapeutische Ziele identifizert werden können.
  • Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist das Vorsehen eines In-vitro-Tests auf der Basis von Zelllinien, die von einem transgenen Tier stammen, oder einer Zelllinie, die von einem transgenen Ratten-Embryo der vorliegenden Erfindung stammt, wobei der Test auch als ein Screening- und Validierungswerkzeug für die Entdeckung und Entwicklung der Alzheimer-Diagnose und von Alzheimer-Markern verwendet wird. Dieser In-vitro-Test basiert auf den Zelllinien und kann auch als Screening- und Validierungswerkzeug zur Entdeckung therapeutischer und präventiver Anti-Alzheimer-Arzneimittel verwendet werden.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Illustration angeführt, und weil verschiedene andere Ausführungsformen für den Fachmann offensichtlich sind, ist das Folgende nicht als Einschränkung des Umfangs der Erfindung auszulegen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1: Schema von für die Erzeugung von Gen-Expressions-Konstrukten verwendeten Alzheimer-Tau-Protein-cDNAs, die bei der Produktion transgener Tiere der vorliegenden Erfindung verwendet wurden.
  • 2: Herstellung und Verifizierung von für die Produktion transgener Tiere verwendeten Gen-Konstrukten. Die Konstruktion transgener Tiere wurde über die pronukleare Mikroinjektion klonierter Gen-Konstrukte, die die Codiersequenz für Alzheimer-Tau enthielten, durchgeführt. Die Gen-Konstrukte wurden durch Restriktionsanalyse und PCR unter Verwendung Transgen-spezifischer Primer (Tafel A, Agarose-Gel von PCR-amplifiziertem DNA-Fragment) sowie mittels DNA-Sequenzierung für eine Kontrolle auf potentielle Mutationen verifiziert. Auf die Verifizierung folgte eine Reinigung der Gen-Konstrukte (Tafel B, Agarose-Gel des reinen Transgen-Fragments) und transiente Transfektionen in Sängerzellen (Tafel C, Western-Blot-Verifizierung der Protein-Expression). Nachdem die Tests fertiggestellt waren, wurden die Konstrukte von prokaryontischen Sequenzen befreit und in einen Tag alte Ratten-Embryonen injiziert. Das untere Flussdiagramm zeigt eine vereinfachte Vorgangsweise der Produktion transgener Tiere.
  • 3: Genotypisierung der transgenen Gründer-Tiere und der F1-Generation der transgenen Tiere. Tafel „A" zeigt Kontrollen für das Genotypisier-Experiment (+C: positive Kontrolle; NAC: keine Amplifikationskontrolle; NTC: keine Matrizen-Kontrolle). Tafel „B" ziegt Ergebnisse der PCR-Genotypisierung. Probe Nr. 12 stellt ein Transgen-positives Tier dar. Tafel „C" umreißt die Zuchtversuche, die durchgeführt wurden, um die Gründer-Tiere zu bestätigen. Weiters zeigt die Tafel die transgene Linie der vorliegenden Erfindung, die das Transgen auf die nachfolgenden Generationen gemäß der Mendelschen Gesetze übertragen hat..
  • 4: Expression des Alzheimer-Tau-Proteins im Gehirn der transgenen Ratte. Die linke Tafel zeigt eine Western-Blot-Analyse, und die rechte Tafel zeigt die Gesamtmenge der pro Bahn geladenen Proteine. Das Alzheimer-Tau-Protein wandert mit der Größe von 35 kD (Bahn 1, Pfeil), durch den monoklonalen pan-Tau-Antikörper DC25 nachgewiesen. Für den Western-Blot wurde eine ECL-Technik verwendet, und ein spezifisches Signal wurde nach 1-minütiger Einwirkung beobachtet. Die 7,5 μg des Gesamt-Protein-Extrakts aus den Gehirn-Lysaten des transgenen Tiers wurden geladen (Bahn 1), wogegen 25 μg Proteine von Wildtyp-Kontroll-Tieren geladen wurden. M: Molekülgrößen-Marker.
  • 5: Expression von Alzheimer-Tau-Protein in verschiedenen Hirnregionen der transgenen Ratte. Western-Blot-Analyse der Gesamt-Protein-Lysate aus Hirnregionen der transgenen Ratte. Bahn 1, vollständiges Gehirn-Lysat des Gründer-Tiers (Generation F0) – 10 μg Proteine; Bahn 2: Gesamt-Gehirn-Lysat eines transgenen Tiers der F2-Generation; Bahnen 3–6: Protein-Lysate eines transgenen Tiers der F2-Generation. 3 – Hippocampus, 4 – subkortikale Fläche, 5 – Großhirnrinde, 6 – Rückenmark und Medulla; Bahnen 7–8 repräsentieren Gehirn-Lysate aus nicht-transgenen Kontroll-Nachkommen desselben Wurfs der F2-Generation: 7 – Cortex, 8 – Cerebellum (die gesamte Protein-Beladung pro Bahnen 2–8 betrug 20 μg).
  • 6: Silberfärbung der Gehirn-Schnitte vom transgenen Tier und nicht-transgenen Wildtyp-Kontrolltier. Intrazelluläre Einschlüsse und neurofibrilläre Filamente wurden in den Neuronen des ZNS der transgenen Ratte nachgewiesen (Bahn B und C: transgenes Tier). Wildtyp-Ratten zeigen diese Strukturen im homologen Hirnbereich nicht (A: Wildtyp-Kontrolle). Vergrößerung: 200 × (A und B), 400 × (C).
  • 7: Detektion neurofibrillärer Bündel unter Verwendung des monoklonalen pan-Tau-Antikörpers DC 25 im Zentralnervensystem des transgenen Tiers mAk DC25 erkennt NFTs in den Neuronen von AD-Patienten. Die äquivalenten Strukturen werden im Gehirn der transgenen Ratte erkannt (Tafeln B und D). Wildtyp-Ratten wiesen keine ähnlichen Strukturen im homologen Hirnbereich auf (A, C). Vergrößerung: 100 × (A, B), 200 × (C, D).
  • 8: Detektion neurofribrillärer Bündel mittels monoklonalem Antikörper PHF-1 im Zentralnervensystem des transgenen Tiers. PHF-1 ist der spezifische Marker für Tau-Phosporylierung. Eine Immunreaktivität mit diesem Antikörper zeigt, dass bei der Expression von Alzheimer-Tau endogenes Tau im Prozess der Bildung von NFTs beteiligt ist. Weiters zeigt die Immunfluoreszenz-Färbung kleine stabartige Strukturen, ähnlich jenen, die im Hirngewebe bei präklinischer Alzheimer-Krankheit beobachtet wird. Vergrößerung: 100 × (A), 200 × (B), 1000 × (C, D).
  • 9: Neuronale Zellkultur als Screening-Testsystem zur Charakterisierung von Therapie-Ansätzen („therapeutic leads") und Arzneimittel-Anwärtern. Primärkulturen transgener und nicht-transgener Ratten-Neuronen können zu diesem Zweck nach Züchtung in vitro verwendet werden, und die Wirkung der Arzneimittel-Anwärter auf den mitochondrialen Transport kann unter Verwendung der Videomikroskopie ausgewertet werden. Neuronen der Cortex (C ×) und des Hippocampus (Hipp), die mit Vitalfarbstoff (z. B. Mito-trek) beladen wurden, sind nach 3 Tagen In-vitro-Züchtung (3DIV) gezeigt. Die Mitochondrien (MT) sind sichtbar gemacht.
  • 10: Histopathologische Merkmale der Alzheimer-Krankheit, zusammengefasst im transgenen Tier der vorliegenden Erfindung. Die dargestellte neurofibrilläre Pathologie ist eines der wesentlichen Merkmale der Alzheimer-Krankheit. 10 zeigt einen Vergleich der durch Gallyas-Silbertechnik (A, C) und auch durch Immunhistochemie (E) im menschlichen Gehirn mit AD nachgewiesenen neurofibrillären Bündel mit im transgenen Tier der vorliegenden Erfindung beobachteten äquivalenten pathologischen Strukturen. Die immunochemische Färbung erfolgte mit dem monoklonalen Antikörper 7.51, der das generische Tau-Epitop in der Tandem-Repeat-Region erkennt (29).
  • BEISPIELE:
  • BEISPIEL 1: Design von Gen-Konstrukten, die eine DNA-Sequenz enthalten, die für Alzheimer-Tau-Protein codiert – humanes trunkiertes Tau-Gen; Herstellung und Verifizierung der Gen-Konstrukte für ubiquitäre und Gewebe-spezifische Expression in transgenen Tieren.
  • Die Konstruktion der Alzheimer-Tau-Expressionsvektoren besteht aus Maßnahmen, welche inkludieren:
    • – das Entwerfen einer Codiersequenz, insbesondere Deletionen und Trunkierungen sind in 1 gezeigt;
    • – diese Teile des Tau-Gens wurden PCR-amplifiziert mit Hilfe der „proofreading"-DNA-Polymerase und von Oligonukleotiden, die mit geeigneten Restriktionssequenzen ausgestattet waren, so dass sie sie unter allgemeinen oder gewebespezifischen Promotoren in einen eukaryontischen Expressionsvektor kloniert werden können; die Klonierung erfolgte unter Verwendung von Standard-Methoden in gewöhnlichen Bakterienstämmen;
    • – Verifizierung der klonierten Gene wurde durchgeführt, um die Ausrichtung des insertierten Gens zu überprüfen, welche durch Restriktionsverdaue und/oder PCR-Analyse bestätigt wurde ( 2A). Außerdem wurden die Konstrukte teilweise sequenziert, um die möglichen mutierten Formen auszuschließen;
    • – Reinigung des für die Mikroinjektion bestimmten Fragments (2B);
    • – Verifizierung der Protein-Expression unter Verwendung von Transfektionen des Transgens in Säuger-Zellen, hauptsächlich COS-7 und C6- Ratten-Gliom-Zellen, und Analyse der Expression der Proteine in eukaryontischen Zellen mit der Western-Blot-Methode (2C).
  • Alle Methoden sind in einem Handbuch beschrieben: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory Press, 1989 (14).
  • BEISPIEL 2: Erzeugung der transgenen Ratte
  • Das klonierte Gen-Konstrukt, das die für Alzheimer-Tau codierende Sequenz enthielt, wurde in den männlichen Pronukleus von einen Tag alten Embryonen injiziert. Befruchtete Eier wurden aus den weiblichen SHR-Donor-Tieren in separaten Versuchen unter Verwendung von Routine-Techniken extrahiert (15). Nach der Mikroinjektion der DNA wurden die Zygoten in vitro im CO2-Inkubator etwa 12 Stunden lang gezüchtet und in die Eileiter von scheinschwangeren Ziehmüttern implantiert. Die Gründer wurden mittels PCR der transgen-spezifischen Zielsequenz von Genom-DNA identifiziert. Um die Tau-Genotypen zu bestimmen, wurde Genom-DNA von etwa 0,5 cm des Schwanzes, die von jeder Ratte entnommen wurden, gereinigt. Die PCR-Analyse wurde zur Identifizierung der Nachkommenschaft, die das Transgen enthielt, verwendet. Oligonukleotide für diagnostisches PCR-Screening wurden so entworfen, dass die Integrität des Transgens leicht bestimmt werden konnte. Zur Bestimmung der Anzahl der in das Ratten-Genom integrierten Transgen-Kopien wurde eine Echtzeit-PCR-Analyse verwendet.
  • Beispielsweise enthielt die Tg-Linie #318 4 Kopien des Transgens, was mittels Echtzeit-PCR unter Verwendung der Sybre-Green-Methode und des BioRad-PCR-Geräts bestimmt wurde.
  • BEISPIEL 3: Genotypisierung von Tieren, die nach Embryo-Implantation in Ziehmütter geboren wurden, Identifizierung transgener Tiere und Beurteilung der Übertragung des Transgens an nachfolgende Generationen
  • Aus Schwanzspitzen extrahierte DNA: Genom-DNA wurde mit dem DNeasy tissue kit, Quiagen, extrahiert.
  • Genotypisierung: Eine spezifische Amplifizierung von Transgenen, die für doppelttrunkierte Tau-Formen codieren, wurde an Genom-DNA durchgeführt, die von der Eltern-Generation transgener Tiere stammte und ist in den 3A und 3B gezeigt. Eine weitere Analyse der Genom-DNA der F1-Generation zeigte, dass Transgene erblich sind, da sie auch in der Nachkommenschaft der Eltern-Generation identifiziert wurden. Transgene, die für Alzheimer-Tau codieren, sind daher in der chromosomalen DNA der Tiere fixiert. Die Genotypisierung erfolgte mit zwei positiven (Plasmid und TG-positive Genom-DNA) und zwei negativen Kontrollen (keine Amplifizierungskontrolle heterologer Genom-DNA; keine Matrizen-Kontrolle für die Kontrolle von Chemikalien), wie in 3A gezeigt.
  • Analyse der Transgen-Expression: Die Expression von mRNA, die von den Transgenen stammte, wurde mittels RT-PCR-Analyse beurteilt, wobei allgemein bekannte Methoden, einschließlich RT-PCR und Agarose-Gelelektrophorese angewendet wurden. RNA wurde aus schockgefrorenem Gewebe transgener Tiere extrahiert und einer reversen Transkription, gefolgt von einer spezifischen Amplifikation der cDNA, unterzogen.
  • Rattenzüchtung und Erzeugung heterozygoter und homozygoter Ratten: Transgen-positive Ratten wurden mit Wildtyp-SHR gezüchtet. Die Keimbahn-Übertragung wurde in mehreren Linien erreicht. In diesem Beispiel ist die Tg-Linie #318 gezeigt. Männliche und weibliche transgene Ratte, von welchen jede vier Kopien des trunkierten humanen Tau-Protein-Gens enthielt, wurden miteinander und mit Wildtyp-SHR-Ratte gepaart, um die transgene Kolonie zu vergrößern. In der Nachkommenschaft wurden Mendelsche Aufteilungsverhältnisse des Transgens beobachtet (3C).
  • Die transgenen Tiere der vorliegenden Erfindung können zum Kreuzen mit transgenen Tieren verwendet werden, welche die humanes APP enthaltende familiäre Alzheimer-Krankheit (FAD)-Mutation oder PS1 überexprimieren (13). Die resultierende Ratte exprimiert sowohl APP als auch PS1 mit oder ohne FAD-Mutation auf einem hypertonen genetischen Hintergrund. Die Wirkung von PS1 und APP auf die NFT-Bildung kann sowohl in vivo als auch in vitro untersucht werden. Insbesondere können der Beginn und die Schwere der AD-verbundenen Pathologien mittels Immunohistochemie untersucht werden.
  • BEISPIEL 4: Expression des Alzheimer-Tau-Proteins im Gehirn transgener Ratten
  • Die Protein-Expression wurde mit Hilfe der Western-Blot-Analyse unter Verwendung von für Tau-Protein spezifischen monoklonalen Antikörpern vorgenommen. Es wurden Hirngewebe von Ratten analysiert, die für das Transgen positiv waren und das Transgen auf nachfolgende Generationen übertragen konnten. Versuche wurden durch gleichzeitige Analyse von Hirnextrakten aus Transgennegativen, im Alter dazu passenden Ratten und Transgen-negativen Nachkommen desselben Wurfs kontrolliert.
  • Gewebeproben-Herstellung: etwa 2 mg frisch isoliertes Hirngewebe wurde mechanisch in 30 μl modifiziertem Hunt-Lysepuffer (20 mM Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Igepal CA630, 0,5% Triton X-100) homogenisiert, welcher die Protease-Inhibitor-Mischung Complete-EDTA free (Roche) enthielt. 170 μl Lysepuffer wurden zugegeben, das Homogenat wurde mit Spritze und Nadel (22 G) trituriert und in flüssigem Stickstoff gefroren. Nach langsamem Auftauen auf Eis wurde das Lysat mit Schall behandelt und 15 Minuten lang zentrifugiert, 10000 g bei +4°C. Der Proteingehalt in den Proben wurde mit dem Bradford-Test unter Verwendung eines Beckman-Spektrophotometers bestimmt.
  • PAGE und Western Blot. Die Proteine wurden auf einem 12% denaturierenden Polyacrylamid-Gel mit 0,1% (Gew./Vol.) SDS getrennt. Die Elektrophorese wurde in Tris-Glycin-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS) durchgeführt. Der Proteintrennung folgte ein Halbtrocken-Blotten. Ein Tris-Glycin-Isopropanol-Puffersystem (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Isopropanol) wurde verwendet. Die Tau-Proteine wurden mit monoklonalen Anti-Tau-Antikörpern DC25 gefärbt, welche Tau-Proteine gleichermaßen wie ein mAk 7.51 erkennen (29), und auch mit mAk Tau-1 (21). Das positive Signal wurde unter Verwendung des Anti-Maus-HRP-Antikörpers und der ECL-Methode bestimmt. Die Effizienz des Blot-Verfahrens wurde mittels Ponceau-Färbung kontrolliert. Die Proteinanalyse offenbarte die spezifische Expression von Alzheimer-Tau-Protein im gesamten Protein-Extrakt des Gehirns der transgenen Ratte (4) und auch eine Expression von Alzheimer-Tau-Protein in verschiedenen Hirnregionen der transgenen Ratte (5).
  • BEISPIEL 5: Immunohistochemische Analyse des Gehirns der transgenen Ratte
  • Um eine immunohistochemsiche Analyse der transgenen Ratte durchzuführen wurden mehrere für Tau-Protein und Alzheimer spezifische monoklonale Antikörper verwendet. Eine kurze Beschreibung der in diesen Untersuchungen verwendeten monoklonalen antikörper umfasst PHF 1, das das phosphorylierte Epitop Ser 396–Ser 404 erkennt; mAk DC 25 erkennt Phosphat-unabhängiges Epitop Lys 347–Ile 353; mAk AT 8 erkennt phosphoryliertes Epitop Ser 198–Ser 202; mAk Tau 1 erkennt nicht-phosphoryliertes Epitop, mAk Tau 5 erkennt Phosphat-unabhängiges Epitop (15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22).
  • Lichtmikroskopie und Immunfluoreszenz:
  • Gewebe wurden hergestellt und wie folgt geschnitten. Transgene und Kontroll-Tiere wurden mit Ether anästhesiert und sofort intrakardial mit gepuffertem 4% Paraformaldehyd perfundiert, die Gehirne wurden entfernt, mit 20% Saccharose kryogeschützt, rasch gefroren und mittels Kryostat zu 50 μm Dicke geschnitten. Einige der Schnitte wurden mit 70% Ameisensäure vor dem Färbevorgang kurz vorbehandelt. Die Rattenhirn-Gewebeschnitte wurden mit 1% H2O2 in PBS inkubiert, und die unspezifischen Bindungsstellen wurden durch Inkubation mit Blockier-Medium (PBS, 0,1% Triton, 5% normales Pferdeserum) blockiert. Die Immunfärbung erfolgte unter Verwendung von oben angeführten Antikörpern, danach wurde mit biotinyliertem Pferd-anti-Maus-Antikörper inkubiert, gefolgt von Avidin-Biotin-Komplex, und es wurde mit VIP und DAB-Lösung sichtbar gemacht. Die Gewebeschnitte wurden auf mit Gelatine beschichteten Objektträgern montiert, getrocknet, mit abgestuften Alkoholen, Xylol behandelt und mit Entellan oben bedeckt.
  • Silberfärbung:
  • Die Gallyas-Silberfärbungsmethode, die früher beschrieben wurde (23), wurde für frei schwebende 50 μm-Schnitte mit Goldtönung („gold toning") adaptiert.
  • Immunfluoreszenzfärbung:
  • Zur indirekten Immunfluoreszenz-Markierung wurden Schnitte mit 1% NaHBO4 30 min lang vorbehandelt, um die Autofluoreszenz des Hirngewebes zu verringern; dann mit primären Antikörpern bei 4°C über Nacht gefärbt, mit biotinyliertem Pferd-anti-Maus-Antikörper inkubiert, gefolgt von Streptavidin-Alexa 488-Konjugat.
  • Der Vergleich der NF-Pathologie, wie man sie in den Gehirnen von Patienten mit AD sieht, mit jener, die man im Gehirn des transgenen Tiers der vorliegenden Erfindung beobachtet, ist in 10 gezeigt.
  • BEISPIEL 6: Ein Screening-Testsystem für Arzneimittel-Ansätze und Arzneimittel-Anwärter für die Behandlung und Prävention der Alzheimer-Krankheit.
  • Die transgenen Tiere der vorliegenden Erfindung können als Zell-Quelle für die Zellkultur verwendet werden. Sowohl Tiere als auch Zellen können bei Tests dieser Erfindung verwendet werden. Beispielsweise können Zellen vor Hirngewebe, die trunkiertes Tau-Gen exprimieren, unter Verwendung von Standard-Züchtungstechniken verwendet werden. Die Tiere und die gezüchteten Zellen können als In-vivo- und In-vitro-Systeme für die Untersuchung der Rolle der Arzneimittel-Anwärter auf das Zeltgerüst, die Zellteilung und die Apoptose sowie auf eine Morphologie der primären gezüchteten Neuronen, das Sprossen von Neuriten, Axon-Verzweigung und Axon-Verlängerung in den Primärkulturen und auch für die Untersuchung der Organellen-Bewegung verwendet werden (9). Sie können auch als Testsystem für neurotrophe Wirkungen von getesteten Substanzen verwendet werden.
  • Eine Studie kann entworfen werden, um auf quantitative oder qualitative Veränderungen bei einer Wechselwirkung von Tau und Tubulin und auch bei einer Wechselwirkung mit Organellen-Austausch („trafficking"), der durch die getesteten Substanzen moduliert werden kann, zu screenen.
  • Es kann auch eine Studie entworfen werden, um auf Verbindungen zu screenen, die die Expression oder Aktivität der Zellskelett-Proteine im Prozess des Aufbaus von synaptischen Verbindungen modulieren.
  • Eine Studie kann auch entworfen werden, um auf jene Verbindungen zu screenen, die die NFT-Bildung oder die Protein-Protein-Interaktion beeinflussen können, was schließlich zur Verlangsamung, Inhibierung oder Eliminierung der NFT-Bildung führen könnte, und dies könnte ein nützlicher Test zum Screenen auf Substanzen sein, die potentielle Therapeutika für Tauopathien und andere neurodegenrative Erkrankungen, vorzugsweise AD, sein könnten. Die Wirkung der Verbindungen kann in Zellkulturen und auch in vivo an den Tieren mittels neuropathologischer, neurophysiologischer und behavioraler Analyse evaluiert werden. Viele Variationen der Screening-Methoden sind dem Fachmann bekannt und können im Rahmen der vorliegenden Erfindung angewendet werden.
  • Diese Beispiele beschreiben besondere Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung zu illustrativen Zwecken und schränken den Umfang der Erfindung, wie er durch die nachfolgenden Patentansprüche angegeben ist, nicht ein.
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Claims (16)

  1. Transgenes, nicht-menschliches Tier, dessen Keim- und/oder Soma-Zellen ein DNA-Konstrukt aufweisen, das eine Codierregion enthält, welche zur Expression eines N- und C-terminal trunkierten Tau-Moleküls führt, wobei – die Codierregion zumindest 30 Nukleotide stromabwärts vom Start-Codon trunkiert und zumindest 30 Nukleotide stromaufwärts vom Stop-Codon der Gesamtlängen-Tau-cDNA-Sequenz, die für 4-repeat bzw. 3-repeat-Tau-Protein codiert, trunkiert ist, – der minimal trunkierte Tau-Kern ein Proteinfragment umfasst, das durch SEQ ID No. 9 codiert ist, – das DNA-Konstrukt für ein Protein codiert, welches eine eine neurofibrilläre (NF) Krankheit erzeugende Aktivität aufweist, wenn es in Gehirnzellen des Tiers exprimiert wird.
  2. Transgenes, nicht-menschliches Tier nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass seine Keim- und Soma-Zellen das DNA-Konstrukt transient oder stabil exprimieren, wodurch sie eine NF-Krankheit im Gehirn aufzeigen.
  3. Transgenes, nicht-menschliches Tier nach Anspruch 1 oder 2, wobei das durch das DNA-Molekül codierte Protein im Gehirn exprimiert wird.
  4. Transgenes, nicht-menschliches Tier nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Tier eine Ratte ist.
  5. Verfahren zum Genotypisieren transgener Tiere nach einem der Ansprüche 1 bis 4 unter Verwendung von Oligonukleotiden, die für transgenes, trunkiertes Tau, wie in Anspruch 1 definiert, spezifisch sind.
  6. Transgenes Tier nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches eine NF-Krankheit entwickelt und einen genetischen Hintergrund hat, der die Induktion von Risikofaktoren, die mit AD verbunden sind, ermöglicht, wodurch es ein Krankheitsmodell für Menschen darstellt.
  7. Transgenes, nicht-menschliches Tier nach Anspruch 6, welches ein Tiermodell der AD darstellt und die Induktion der Hypertonie als Risikofaktor der AD ermöglicht.
  8. Transgenes, nicht-menschliches Tier nach Anspruch 6, welches ein Tiermodell der AD darstellt und die Induktion von Diabetes als Risikofaktor der AD ermöglicht.
  9. Transgenes, nicht-menschliches Tier nach Anspruch 6, welches ein Tiermodell der AD darstellt und die Induktion von Hypercholesterinämie als Risikofaktor der AD ermöglicht.
  10. Verfahren zum Screenen und zur Validierung von Substanzen für die Behandlung, Prävention und Diagnose von Alzheimer-Krankheit, zur Behandlung und Prävention von Tauopathien, vorzugsweise AD, zur Entwicklung diagnostischer Marker und Sonden für die Detektion von Tauopathien, vorzugsweise AD, und für Substanzen zur Behandlung der Hypertonie, Diabetes, Dislipidämie und Hypercholesterinämie in Verbindung mit Tauopathien, vorzugsweise AD, welches umfasst: – Evaluieren der Substanzen durch: – Nachweisen von Veränderungen einer neurofibrillären Krankheit bei einem Tier nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 6 bis 9, – Messen der neurobehavioralen Veränderungen bei diesem Tier, – Messen des kognitiven Werts des Tiers.
  11. Verfahren nach Anspruch 10 zum Identifizieren neuer Arzneimittel-Ziele bei Tauopathien und verwandten neurodegenerativen Prozessen, vorzugsweise AD.
  12. Verwendung des Tiers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 6 bis 9 als in vivo-Test zum Testen der Wirksamkeit von Substanzen oder Therapien, insbesondere von eine neurofibrilläre Krankheit verringernden Therapien.
  13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Substanzen oder Therapien für neurodegenerative Krankheiten, insbesondere Tauopathien, vorzugsweise AD und andere, von einer neurofibrillären Krankheit begleitete neurodegenerative Krankheiten bestimmt sind.
  14. Zelllinie, umfassend ein Konstrukt nach Anspruch 1, welche Zelllinie keine humane totipotente Zelllinie ist.
  15. Zelllinie nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelllinie eine Ratten-Zelllinie ist, die von einem transgenen Ratten-Embryo stammt.
  16. In vitro-Test, umfassend eine Zelllinie nach Anspruch 14 oder 15, wobei der Test als Screening- und Validierungswerkzeug für die Entdeckung therapeutischer präventiver und diagnostischer Verbindungen und Marker für Alzheimer-Krankheit verwendet wird.
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