JP4308760B2 - トランケートtauタンパク質 - Google Patents
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Description
4反復配列を含むtau43の少なくとも最初の236 N末端アミノ酸および少なくとも最後の45 C末端アミノ酸がトランケートされており、
アルツハイマー病の脳組織に検出できるが、正常健康脳組織には検出できず、
in vitro微小管構築アッセイにおいて正常tauタンパク質の微小管構築の促進を防止し、
該微小管構築の促進の防止は微小管構築アッセイにおいて該分子に対する特異的阻害、中和モノクローナル抗体により除去することができる。
4反復配列を含むtau43の少なくとも最初の238 N末端アミノ酸および少なくとも最後の40 C末端アミノ酸または3反復配列を含むtau44の最初の207 N末端アミノ酸および少なくとも最後の50 C末端アミノ酸がトランケートされており、
アルツハイマー病の脳組織に検出できるが、正常健康脳組織には検出できず、
in vitro微小管構築アッセイにおいて野生型tauの微小管構築の促進を防止しない。
4反復配列を含むtau43の少なくとも最初の68 N末端アミノ酸および少なくとも最後の40 C末端アミノ酸または3反復配列を含むtau44の最初の68 N末端アミノ酸および少なくとも最後の20 C末端アミノ酸がトランケートされており、
アルツハイマー病の脳組織に検出できるが、正常健康脳組織には検出できず、
in vitro微小管構築アッセイにおいて野生型tauより高い微小管構築促進活性を有し、
該微小管構築促進活性は微小管構築アッセイにおいて該分子に対する特異的阻害、中和モノクローナル抗体により除去することができ、該分子の病的活性は微小管重合促進活性により定義される微小管ネットワークに対する結合に依存する。
4反復配列を含むtau43の少なくとも最初の68 N末端アミノ酸および少なくとも最後の40 C末端アミノ酸または3反復配列を含むtau44の最初の68 N末端アミノ酸および少なくとも最後の20 C末端アミノ酸がトランケートされており、
アルツハイマー病の脳組織に検出できるが、正常健康脳組織には検出できず、
in vitro微小管構築アッセイにおいて野生型tauと異なる病的微小管構築促進活性を有する。
a)少なくとも最初の236および最後の40アミノ酸または最初の68および最後の20アミノ酸またはその組み合わせにわたる欠失を有する二重トランケートtau分子をコードする配列を保持する組換え原核性発現プラスミドの構築、
b)該NおよびC末端二重トランケートtau分子の発現を許す条件下で該細菌を増殖させ、
c)好ましくは遠心により細菌を回収し、
d)細菌ペレットを再浮遊させ、
e)該細菌を超音波処理し、
f)該超音波処理細菌をゲルろ過により分画し、
g)得られた分画の活性を微小管構築アッセイによりモニターすることにより、タイプIおよびタイプII tau分子の異なる活性を同定する。
a)アルツハイマー罹患脳組織を得、
b)該病的(罹患)脳組織を緩衝液、特にTris緩衝液中でホモゲナイズし、
c)該ホモゲナイズ脳組織を硫酸アンモニウム沈殿し、
d)PIPES緩衝液に再溶解し、
e)該再溶解物質をゲルろ過で分画化し、
f)得られた分画の活性を微小管構築アッセイでモニターすることによりタイプIおよびタイプII tau分子の異なる活性を同定する。
a)タイプIA分子とチューブリンのタンパク質複合体を形成させ、
b)該タンパク質複合体を被検物質とインキュベーションし、野生型tauの微小管構築促進能力を回復させる物質を同定する。
a)適切な制御領域の制御下でタイプIA分子をコードする機能的遺伝子を正常tauタンパク質発現細胞に導入し、
b)タイプIA分子とチューブリンのタンパク質複合体を形成させ、
c)試験する物質を該複合体を保持する細胞に適用し、
d)上記のタイプIA生物活性に対する該物質の効果を試験する。
a)タイプIIA分子およびチューブリン存在下で病的微小管を形成させ、
b)該物質、タイプIIAおよびチューブリンの混合物をスクリーニングする物質とインキュベーションし、
c)タイプIIA分子により生じる病的微小管の形成を減少させる結果を試験する。
a)タイプIIA分子をコードする機能的遺伝子を適切な制御領域の制御下で野生型tau発現細胞中に導入し、
b)タイプIIA tau分子と微小管の複合体を形成させて該複合体を病的微小管の形成に関与させ、
c)試験する物質を該複合体を保持する細胞に適用し、
d)タイプIIA生物活性、特に微小管ネットワークおよびその関連機能の修飾に対する該物質の効果を試験する。
(1)NおよびC末端トランケート病的型のtauタンパク質の分子的および機能的同定および特徴付け(これら分子は微小管関連生物学的機能、例えば微小管構築または細胞内輸送を修飾することによりアルツハイマー病のその病的機能を示す。)、
(2)タンパク質エピトープの特異抗体、
(3)該タンパク質の病的活性を中和する抗体、
(4)NおよびC末端二重トランケートtauタンパク質を阻害、中和、および除去し、またはその形成を予防するのに有効な治療薬候補(抗体を含む)のスクリーニングおよび試験方法、
(5)薬物スクリーニングに用いることができる、各二重トランケートtauタンパク質をコードする遺伝子構築物を保有する動物モデルの開発、
(6)該二重トランケートtauタンパク質の阻害剤およびその起源に含まれるプロテアーゼを含む医薬組成物、
(7)NおよびC末端二重トランケートtau分子を生じる分子のスクリーニング方法、
(8)該分子を認識しそして/またはそれと相互作用する診断用および治療用組成物、
(9)該二重トランケートタンパク質の抗原性に基づくワクチンの開発、
(10)アルツハイマー病およびtauの病的変化に関連する他の障害のin vitroおよびin vivo診断用の該タンパク質およびそのエピトープおよび/または抗体または他の特異的プローブを含む方法。
(a)該二重トランケートtau分子(タイプIおよびII)のコーディング配列を保持する組換え原核性発現プラスミドの構築、
(b)NおよびC末端二重トランケートtau分子(タイプIおよびII)を発現させることができる条件下での細菌の増殖、
(c)遠心分離による細菌の回収、
(d)500ml培養から得た細菌ペレットの緩衝液A:(20mM PIPES pH6.9、50mM NaCl、1mM EGTA、1mM MgSO4、2mM DTT、0.1mM PMSF)への再浮遊、
(e)氷上で1分間(3回)超音波処理し、2℃、45000rpmで15分間遠心分離(ローターTLA-120,2、Beckmann Optima TLX)、
(f)緩衝液「A」中の直線勾配0〜1M NaClを用いPhosphocellulose(ホスホセルロース)、またはMONO S HR 5/5または5ml HiTrap SP Sepharose HPカラムでクロマトグラフィし、得られたタンパク質をSDS-PAGEおよびWestern(ウエスタン)ブロット分析により同定。
配列番号1(239-333、R4)
配列番号4(239-326、R4)
配列番号10(208-302、R3)
A: ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu(配列番号1-9および11-14、19の残基239-267に対応する)。エピトープ欠失突然変異体は配列番号21(268-333、R4; del 239-267)
A1: ile lys his val pro gly gly gly ser(配列番号1-9および11-14、19の残基239-247に対応する)。欠失突然変異体は配列番号22(248-333、R4; del 239-247)
A2: ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu(配列番号1-9および11-14、19の残基239-257に対応する)。欠失突然変異体は配列番号23(258-333、R4; del 239-257)
A3: ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser(配列番号1-9および11-14、19の残基239-262に対応する)。欠失突然変異体は配列番号24(263-333、R4; del 239-262)
A4: ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser(配列番号1-9および11-14、19の残基246-262に対応する)。
エピトープ欠失突然変異体は配列番号25(239-333、R4; del 248-262)
A5: asp leu ser lys val thr ser、配列番号1-9および11-14、19の残基256-262および残基225-231、R3 配列番号10、15-18、20に対応する。エピトープ欠失突然変異体は配列番号26(239-333、R4; del 256-262)
A6: lys cys gly ser leu、配列番号1-9および11-14、19の残基263-267および配列番号10、15-18、20の残基232-236、R3に対応する。エピトープ欠失突然変異体は配列番号27(239-333、R4; del 263-267)
a)該タンパク質はNおよびC末端がトランケートされている(実施例6)、
b)該タンパク質はアルツハイマー病の組織に存在するが、該タンパク質は正常健康脳には存在しない(実施例6)、
c)in vitro微小管構築アッセイにおいて、それらは正常tauタンパク質の微小管構築の促進を妨げる(実施例7)、
d)正常tauを用いる微小管構築アッセイにおいて、それらの阻害活性は特異的阻害的中和モノクローナル抗体により除去することができる(実施例11)、
e)その病的活性は正常健康tauに存在しないアミノ酸配列および構造的コンフォメーションの組み合わせに依存する(実施例6)、
f)該タンパク質は正常tauタンパク質とコンフォメーション的に異なるようである(実施例6)。
a)タイプIBタンパク質はNおよびC末端がトランケートされている(実施例6)、
b)該タンパク質は正常健康ヒト脳に存在するかもしれない、
c)in vitro微小管構築アッセイにおいて、それらは正常tauタンパク質の微小管構築の促進を妨げない(それぞれ実施例2および7)、
d)それらは微小管構築の修飾において病的活性を示さない(それぞれ実施例2および7)、
e)タイプIB分子は正常tauとコンフォメーション的に異なるようである(実施例6)。
a)タイプIA分子またはその誘導ペプチドおよびチューブリンまたはタイプIA分子と相互作用する他の分子のタンパク質複合体を形成させ、
b)該タンパク質複合体と試験すべき薬剤をインキュベーションし、
c)工程(b)のインキュベーションの結果を健康tauアイソフォームの微小管構築促進能力の回復について試験する。
a)タイプIA分子またはその誘導ペプチドと組み合わせて試験すべきある薬剤は正常tauおよびそのvitro機能と干渉しないと予想される、
b)タイプIA分子と正常tauおよびチューブリンの存在下で試験すべき薬剤のインキュベーション、
c)工程a)およびb)のインキュベーションの結果をタイプIA分子の微小管重合に対する阻害活性が存在するかまたはしないかについて試験する(実施例8)。
a)適切な制御領域の制御下でタイプIA分子をコードする機能的遺伝子を正常tauタンパク質を発現する細胞内に導入し、
b)タイプIA tauとチューブリン分子のタンパク質複合体を形成させ、
c)該複合体を保有する細胞を試験すべき薬剤に適用し、
d)タイプIA生物活性に対する該薬剤の効果、例えば微小管の構造的および機能的修飾を試験する。
(1)特異的微小管結合および微小管構築の異常な促進をもたらすtau修飾の分子的説明および特徴付け(実施例3)、およびその担体に対する病的結果(実施例4)、
(2)該タンパク質エピトープに特異的な抗体および
(3)該タイプII分子の病的活性を中和する抗体(実施例12)、および
(4)該タイプIIタンパク質を阻害、中和、および排除するのに有効な治療薬候補をスクリーニングおよび試験する方法、または
(5)tau由来タンパク質、例えばタイプII分子の形成を阻害するのに有効な治療薬候補をスクリーニングおよび試験する方法、
(6)薬剤スクリーニングに用いることができるトランス遺伝子またはトランス遺伝子混合物として各NおよびC末端二重トランケートtauタンパク質をコードする遺伝子構築物を有する動物モデルの開発、
(7)該二重トランケートtauタンパク質およびそのプロテアーゼに対する阻害剤を含む医薬組成物、
(8)該分子を認識/相互作用する診断用および治療用組成物、
(9)該二重トランケートタンパク質に基づくワクチンの開発、
(10)アルツハイマー病およびtauの病的変化に関連する他の障害のin vitroおよびin vivo診断用の該タンパク質およびそのエピトープおよび/または抗体または他の特異的プローブを含む方法。
4反復配列tau(tau 43)の誘導体にR4を付す。
配列番号11(69-333、R4)
配列番号15(93-302、R3)
配列番号19(6-378、R4)
a)該タンパク質はNおよびC末端がトランケートされている(実施例6)、
b)微小管構築の十分な病的促進物質である(実施例3; 図28C)、
c)その病的微小管構築促進活性は例えば阻害的モノクローナル抗体またはその誘導体(実施例12)のような特異的化合物により除去することができる、
d)該タンパク質は正常健康脳にはみられない(実施例6)、
e)細胞内輸送機能が有意に損なわれる(実施例16)、
f)その病的活性は、微小管ネットワークと結合する高い親和性およびその機能的障害に関連する(実施例3)、
g)それらは正常tauとコンフォメーション的に異なるようである(実施例6)。
a)該タンパク質はNおよびC末端がトランケートされている、
b)タイプIIAより微小管構築促進効果が低い、
c)該タンパク質は正常健康脳にはみられない、
d)タイプIIAで観察されるより程度は低いが、それとの結合により微小管機能を損なうようである、
e)それらは正常tauとコンフォメーション的に異なるようである。
(1)適切な条件下、タイプIIA分子およびチューブリン存在下における病的微小管の形成(それぞれ実施例3および4)、
(2)これら病的微小管と試験する候補薬剤とのインキュベーション、
(3)タイプIIA分子の微小管に対する効果の中和に対する試験(各実施例9および12)。
a)タイプII分子をコードする機能的遺伝子を適切な制御領域の制御下で正常tauタンパク質発現細胞に導入し、
b)タイプIIA tauおよび微小管(病的微小管)の複合体を形成させ、
c)得られた複合体を保有する細胞に被検薬剤を適用し、
d)タイプIIA生物活性、例えば微小管ネットワークおよびその関連機能の修飾に対する薬剤の効果を試験する。
本発明を以下の実施例および図面によりさらに説明するが、それらに限定されるものではない。
パネルB. F1世代由来の動物の遺伝子型別。ゲノムDNAを尾の先端から抽出し、二重トランケートtau特異的DNA配列を同定し、レーン1に示す。レーン2および3は陰性コントロールを示す。F1世代におけるtau特異的DNA断片の同定はこれらトランス遺伝子の遺伝性(inheritability)を確認する。
健康tauの生理学的機能は微小管(MT)の安定化である。この機能は微小管構築アッセイ(MAA)により測定することができる。本実施例において、MAA反応は3タイプのtau分子:正常健康ヒトtau、組換え型のtauタイプIA(配列番号1)およびtauタイプIB(配列番号4)を用いて行った。正常ヒトtau、tauタイプIAおよびタイプIBを別個の反応で個々にアッセイした。tau 0.1mg/mlの単一調製物を最終濃度1mg/mlの精製ブタ脳チューブリンおよび1mM GTPと混合した(すべての物質に重合緩衝液(100mM PIPES、pH 6.9、1mM MgSO4、2mM EGTA)使用)。最後にTauを加えMT構築の促進を開始した。静かにそして急速に混合した後、試料をピペットで水晶マイクロキュベットに入れ、サーモスタットで制御した分光光度計(Beckman Coulter DU640)中で37℃に平衡化した。濁度を340nmで10秒間隔で20分間連続的にモニターした。上端の曲線1(図1)は正常健康tauの微小管構築促進能を示す。それに対し、タイプIA(曲線2)およびタイプIB(曲線3)はいずれも正常tauのこの活性を示さず、MAAにおけるいかなるMT構築促進も示さなかった。
実施例2: NおよびC末端二重トランケートtauタイプIAおよびタイプIB分子による微小管構築の阻害。
表
NおよびC末端の二重トランケートtau分子の微小管重合に対する影響
最短R3アイソフォームに従った配列番号15-18;20番号付け。
実施例3:微小管構築におけるNおよびC末端二重トランケートtauタイプIIAおよびIIB分子の活性
実施例4: 病的tauタイプIIタンパク質によるストレス保護メカニズムの阻害をin vitroで種々の酸化ストレスに曝露した該分子を発現する神経芽細胞腫細胞において示された。
実施例5:二重トランケートtauタイプIAのコンフォメーションに対する個々のエピトープの寄与
実施例6:NおよびC末端二重トランケートtauタイプIおよびタイプIIの単離
実施例7:微小管構築アッセイにおける正常健康tauに対するAD-脳由来および組換えtauタイプIAの阻害効果
実施例8:tauタイプIAの病的活性を中和する薬剤候補のスクリーニングアッセイ
1.tauタイプIAを中和する薬剤候補のスクリーニング。個々の薬剤候補(最終濃度50mg/ml)と別個に混合したプロトタイプ組換えタイプIA分子(配列番号1)(最終濃度100mg/ml)を37℃で1時間プレインキュベーションした。インキュベーション後、チューブリン、GTPおよび健康tauを+4℃で混合物に加えた(最終濃度:チューブリン-1mg/ml、GTP-1mM、健康tau-100mg/ml)。急速混合物後、試料を水晶マイクロキュベットに入れ、温度調節分光光度計中で37℃に平衡化した。濁度変化を340nmで測定した。タイプIA活性中和能を有する薬剤候補を正常健康tauの残存する微小管構築促進能を測定することにより選択した(図13;薬剤候補をタイプIA分子とプレインキュベーションし、タイプIA中和の有効性を微小管構築を用いてアッセイした。下端の曲線1および上端の曲線2は病的タイプIA分子に対する被検薬剤候補の陰性(中和なし)および陽性(100%)中和活性を示す。中側の曲線は3つの異なる薬剤候補による種々のタイプIA中和効果を示す。)。陽性薬剤を選択するための閾値は任意であり、タイプIAの完全中和からその部分中和まで変化するかもしれない。
実施例9:tauタイプIIAの病的活性を中和する薬剤候補のスクリーニングアッセイ
実施例10:NおよびC末端二重トランケートタイプIAおよびタイプIIA分子を中和するモノクローナル抗体の製造。
実施例11:モノクローナル抗体を用いるAD脳由来および組換えNおよびC末端トランケートタイプIA分子の病的活性の中和。
実施例12:モノクローナル抗体によるタイプIIA活性の中和
実施例13:組換えNおよびC末端二重トランケートtauタイプIAおよびIIA分子の免疫原性。
実施例14: トランスジェニック動物
遺伝子型別(図25):二重トランケートtau型をコードするトランス遺伝子の特異的増幅をトランスジェニック動物の親世代由来のゲノムDNAを用いて実施し、図25Aに示す。F1世代のゲノムDNAのさらなる分析ではトランス遺伝子は親世代の子孫にも確認されたことから該遺伝子が遺伝性であることが明らかになった。したがって、二重トランケートtauをコードするトランス遺伝子は該動物の染色体DNAに固定される(図25B-F1世代の遺伝子型別)。この実施例に用いる動物は自然発症高血圧および他のアルツハイマー病関連危険因子、例えば異脂肪血症または糖尿病を特徴とする特異的遺伝的背景がある。したがって、この動物系統は最も頻発するアルツハイマー病の危険因子、例えば高血圧および糖尿病を組み合わせることによりユニークな実験アルツハイマーモデルである。
トランス遺伝子を生成するにはSambrookら、Molecular Cloning A Laboratory Manual、CSH Laboratory、New York(2001)に記載の分子生物学の標準技術を用いた。二重トランケートtauをコードするcDNAを遍在性または組織特異的な発現をもたらすプロモータと結合した発現ベクターに導入した。該遺伝子断片を前核注射(非限定)により1日齢の胚に導入した。生じた子孫を尾の先端から得たゲノムDNAを用いて遺伝子型別した。
実施例15:A:タイプIIA分子の過剰発現は分化したニューロン様細胞の細胞死をもたらす。
(2)チューブリンの添加(conc=1mg/ml)、
(3)340nm/5minの測定(注:すべてPIPES緩衝液で希釈。
tau 43で示されたこの実施例の正常tauは電子顕微鏡検査で示される典型的微小管を形成する(図28C参照)。しかしながら、アルツハイマーtauタイプIIは典型的にパターンを有する病的微小管を生じる(図28C参照)。
実施例16:真核細胞におけるNおよびC末端二重トランケートtauタイプIIの過剰発現の機能的結果
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Claims (12)
- 以下の特徴により特徴づけられるNおよびC末端二重トランケートtau分子(「タイプIIA tau分子」):
4反復配列を含むtau43の少なくとも最初の68 N末端アミノ酸および少なくとも最後の40 C末端アミノ酸または3反復配列を含むtau44の最初の68 N末端アミノ酸および少なくとも最後の20 C末端アミノ酸がトランケートされており、
アルツハイマー病の脳組織に検出できるが、正常健康脳組織には検出できず、
in vitro微小管構築アッセイにおいて野生型tauより高い微小管構築促進活性を有し、
該微小管構築促進活性は微小管構築アッセイにおいて該分子に対する特異的阻害、中和モノクローナル抗体により除去することができ、該分子の病的活性は微小管重合促進活性により定義される微小管ネットワークに対する結合に依存する。 - 配列番号11〜18の群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項1記載のタイプIIA tau分子。
- 以下の工程を特徴とする請求項1または2に記載の分子の製造方法:
a)4反復配列を含むtau43の少なくとも最初の68 N末端アミノ酸および少なくとも最後の40 C末端アミノ酸または3反復配列を含むtau44の最初の68 N末端アミノ酸および少なくとも最後の20 C末端アミノ酸がトランケートされている二重トランケートtau分子をコードする配列を保持する組換え原核性発現プラスミドを構築し、
b)該NおよびC末端二重トランケートtau分子の発現を許す条件下で該細菌を増殖させ、
c)好ましくは遠心により細菌を回収し、
d)細菌ペレットを再浮遊させ、
e)該細菌を超音波処理し、
f)該超音波処理細菌をゲルろ過により分画し、
g)得られた分画の活性を微小管構築アッセイによりモニターすることにより、タイプIIA tau分子の 活性を同定する。 - 該トランケーションが請求項1または2に記載のものであることを特徴とする請求項3記載の方法。
- 微小管構築アッセイ活性が請求項1または2に記載のものである請求項3または4記載の方法。
- 以下の工程を特徴とする請求項1または2に記載の分子の製造方法:
a)アルツハイマー罹患脳組織を緩衝液、特にTris緩衝液中でホモゲナイズし、
b)該ホモゲナイズ脳組織を硫酸アンモニウム沈殿し、
c)PIPES緩衝液に再溶解し、
d)該再溶解物質をゲルろ過で分画化し、
e)得られた分画の活性を微小管構築アッセイでモニターすることによりタイプIIA tau分子の 活性を同定する。 - 微小管構築アッセイ活性が請求項1または2に記載されていることを特徴とする請求項6記載の方法。
- 該タイプIIA tau分子と微小管との相互作用により病的微小管を生成させる生理的条件下で請求項1または2記載のタイプIIA tauと野生型tauタンパク質をインキュベーションすることを特徴とする微小管をin vitroで病的状態に変換する方法。
- 以下の工程を含むタイプIIA tau分子を除去および/または中和し、タイプII分子により生じる生理学的微小管パラメーターおよび機能を修復するその特性について請求項1または2記載のタイプIIA tau分子の病的効果を中和することができる物質のスクリーニング方法:
a)請求項8に記載のごとくタイプIIA tau分子およびチューブリン存在下で病的微小管を形成させ、
b)該物質、タイプIIA tauおよびチューブリンの混合物をスクリーニングする物質とインキュベーションし、
c)タイプIIA tau分子により生じる病的微小管の形成を減少させる結果を試験する。 - 以下の工程を含むタイプIIA tau分子発現細胞系における異常微小管形成および機能の促進において請求項1または2記載のタイプIIA tau分子のin vivo活性を阻害するのに有効な物質の試験方法:
a)タイプIIA tau分子をコードする機能的遺伝子を適切な制御領域の制御下で野生型tau発現細胞中に導入し、
b)タイプIIA tau分子と微小管の複合体を形成させて該複合体を病的微小管の形成に関与させ、
c)試験する物質を該複合体を保持する細胞に適用し、
d)タイプIIA tau生物活性、特に微小管ネットワークおよびその関連機能の修飾に対する該物質の効果を試験する。 - 請求項1または2に記載の分子を発現するヒトを除くトランスジェニック動物。
- 特にアルツハイマー病治療用の薬剤をスクリーニングおよび試験するためのアルツハイマー病の動物モデルとしての請求項11記載のトランスジェニック動物の使用。
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