CN102058619A - 一种阿尔茨海默病复合动物模型的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种阿尔茨海默病复合动物模型的制备方法，是取健康雄性APP/PS1双转基因小鼠，将1mol/LAlCl₃·6H₂O溶液腹腔注射染毒，染毒30次，每次0.05mL。采用本发明方法得到的阿尔茨海默病复合动物模型经神经行为学及形态学检测，较对照组动物学习记忆能力显著下降，具备老年斑、神经原纤维缠结、淀粉样蛋白沉积和颗粒空泡变性等典型的形态学特征，可以较好地模拟阿尔茨海默病的神经行为表现和具备阿尔茨海默病的全部典型形态学改变。本发明所提供的阿尔茨海默病复合动物模型可以用于药物筛选和阿尔茨海默病的机制研究。

Description

一种阿尔茨海默病复合动物模型的制备方法

技术领域

本发明属于动物模型构建技术领域，涉及一种阿尔茨海默病动物模型的制备方法，具体涉及一种铝诱导APP/PS1双转基因小鼠阿尔茨海默病复合动物模型的制备方法。

背景技术

随着人类寿命的增加，很多国家已经或即将进入老龄社会，老年性疾病已成为社会关注和相关学科研究的热点。老年性痴呆(Alzheimer′s disease，AD)是中枢神经系统的一种慢性、进行性变性疾病，在老龄人口中与恶性肿瘤、心脑血管疾病并列为导致老年人死亡的三大疾病，其发病率随着人均寿命的延长而逐年上升。流行病学调查发现，我国65岁以上老年人中AD的发病率高达3.5％。

自1906年德国神经病理学家AloisAlzheimer发现AD以来，科学工作者进行了近一个世纪的潜心探究，从形态学、神经生物学和临床研究等方面着手，在AD的病理改变、发病机制及治疗等方面都做了大量研究工作。目前，关于AD的病因主要有下述几种学说：

1.遗传学说。AD和遗传易感性有关，目前已知4个与AD相关的基因是位于21号染色体的APP基因、14号染色体的早老素1(PS1)基因、1号染色体的早老素2(PS2)基因和位于19号染色体的ApoEε4(apolipoprotein Eε4)等位基因。APP基因、早老素1、早老素2基因突变被认为是早发型家族性AD的遗传因子；ApoEε4等位基因被认为是散发型AD的发病危险因素。

2.铝中毒学说。大量研究支持铝是AD的病因，概括为以下五方面：1)铝是人体的非必需金属元素，在很低浓度下就可以有神经毒性作用，可以引起类似AD的三个典型病理改变：铝在脑内的蓄积可以诱导β-淀粉样蛋白沉积，是老年斑(senile plaque，SP)的组成成分；AD患者脑部存在大量的神经原纤维缠结(neuronfibrillary tangles，NFTs)，动物脑室内注射铝也可以引起脑组织广泛的神经纤维细丝聚集；细胞凋亡是AD细胞死亡的主要形式之一，铝诱导的神经细胞凋亡与AD的神经细胞凋亡相似，都是导致抑凋亡基因bcl-2和促凋亡基因bax比值改变，诱发凋亡而致细胞死亡。2)AD患者脑中的铝含量与铝染毒动物的脑铝含量均有升高，并主要发生在皮质和海马等与学习记忆有关的区域；在正常人脑组织海马区铝的摩尔百分比是1.6％，轻度AD患者为8.1％，重度AD患者为48.4％。人体的脑铝含量有随着年龄而增高的趋势，并伴有脑铝清除力的下降。动物实验证明，年老动物对铝的吸收率较高，对铝的神经毒性作用也更易感。3)虽然存在多种AD动物模型，但铝致AD模型较好地模拟了AD的某些行为和病理特征；无论经何种方式给以铝化物，均可见到动物认知功能损伤，行为学及病理学上出现类似于AD的改变。4)在铝暴露高的地区，AD的发病率也较高。5)氧化损伤是AD发病的关键机制，铝在老年动物促进氧化损伤，体内、体外试验都证实铝是氧化应激的肯定促发因素。

3.神经递质学说。AD患者神经递质活动改变主要在海马、基底前脑核及大脑新皮质区。多数学者认为主要与乙酰胆碱能系统改变有关，其次为5-羟色氨能系统等。

4.免疫反应学说。可能是独立因素，也可能是与感染、遗传和环境中毒相关的继发因素，并提出与白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)等有关。

5.慢病毒学说。

6.雌激素水平下降。

临床上AD患者主要表现为大脑认知功能障碍，如健忘、记忆力和空间辨别能力减退以及反应迟钝等。关于AD的病理特征，目前较为明确的是：1)基底前脑核群内乙酰胆碱(Ach)能神经元的变性和丢失；2)患者脑内形成神经原纤维缠结；3)新皮质和海马结构内出现大量的淀粉样沉积，其数量多寡与AD严重程度呈正相关。近年已从淀粉样沉积核心中分离和鉴别出一种肽类物质，称为β-淀粉样肽(β-AP或β/A4蛋白)。β-AP是β-淀粉样前体蛋白(β-APP)的病理性裂解产物，正常情况下不表达，在正常老年人有极少量的表达。4)脑内形成淀粉样斑块。这一病理改变是Trojanowski等人的最新发现，其与神经原纤维缠结、淀粉样沉积一起为AD病人的三大特征性病理改变。

由于AD疾病严重危害老年人的健康，同时也给家庭和社会带来巨大的财政负担，因而关于AD疾病的研究日益受到国内外学者的高度重视。近年来，各国学者均在探讨制作能较完全模拟人类AD临床表现和病理生理特征的动物模型，并通过这些模型研究有效的干预方法。

目前复制AD模型有多种方法，但每种建立AD模型的方法各有其优缺点。

1.老年动物模型。可出现学习记忆减退，脑组织出现淀粉样斑块和NFT的病理改变，这与AD病人是一致的。但存在以下缺点：1)老年动物神经系统的发病与AD的发病过程和机制不完全一致，因此神经化学方面的改变也是不同的；2)体质差，易死亡，故不宜用于周期长的实验；3)对药物的吸收代谢不佳；4)价格昂贵。

2.用物理方法——断开穹窿海马伞通路法建立的AD毁损模型。可以诱导实验动物行为及神经化学方面的缺损，造成动物空间定向和记忆障碍及胆碱能神经元的丢失，而且制备周期短(约两周)，但手术定位难以控制，很难避免手术区邻近组织的受损。

3.用神经毒氨基酸损毁基底大细胞核(nucleus basalis magnocellularis，NBM)法制备乙酰胆碱(Ach)损毁AD模型。可导致NBM的胆碱能神经元变性和减少，继而引进相应大脑新皮质区的胆碱能纤维减少，细胞变性与死亡，胆碱能的标志酶ChAT和AChE含量下降，学习记忆行为减退。但有以下几个缺陷：1)无神经炎斑及神经纤维缠结的组织病理学改变；2)神经毒氨基酸对非胆碱能神经元也有影响；3)ChAT的活性在海马末受影响；4)据报道神经毒氨基酸对乙酰胆碱系统的损伤可逆转；5)业已证明AD病的基底核胆碱能神经元的丧失是逆行性引起的，即继发于大脑皮层的病理变化。

4.用AF64A(Ethylcholine mustard aziridiniumion)制做的乙酰胆碱损毁AD模型。表现为胆碱能系统和记忆功能损害，但不影响非胆碱能神经元，这点优于兴奋性神经毒氨基酸。然而用此方法也不出现老年斑和神经原纤维缠结形成的组织病理学改变。

5.用192IgG-Saporin行大鼠侧脑室有前脑基底区注射制备免疫损毁AD模型。可选择性损害与基底前脑核有关的乙酰胆碱系统，如内侧隔区、斜角带，同时出现记忆减退的表现，但仍然不能出现AD所特有的其它组织病理学改变。

6.喹啉酸在海马CAI区直接注射制备乙酰胆碱损毁AD模型。可引起大鼠空间辨别能力和学习记忆障碍。但是它能否导致其它组织病理学改变未见文献报道。

7.东莨菪碱注入小鼠、大鼠、猴等哺乳动物的侧脑室建立的乙酰胆碱损毁AD模型。主要是出现与AD一致的记忆、认知功能障碍，有关AD特有的组织病理学改变是否发生未见文献报道。

8.Aβ注射模型。将Aβ不同的片段Aβ1-42或Aβ1-40注入脑室或海马等部位，大鼠、小鼠出现学习和记忆功能减退、胶质细胞炎性反应、SP等病理学特征。该模型基本模拟了AD学习记忆能力损害，海马神经元坏死或缺失，凋亡相关基因表达增加。缺点是注射Aβ本身对脑组织产生局灶损伤，而且存在Aβ局部聚集的问题。

9.铝中毒模型。对大鼠、小鼠用口服、脑室注射、灌胃、腹腔注射等方法均可以建立铝中毒AD模型。铝对中枢神经系统有毒性损害，使神经元变性或死亡，产生NFT病理性改变，继而表现为大脑皮质萎缩，脑重减轻；出现记忆、认知功能障碍。铝还能促进淀粉样蛋白的形成和积累，在AD发病过程中发挥重要作用。用铝诱导建立的AD模型能较好模拟出与AD有关的记忆损害和形态变化，但缺点是此种AD模型出现的NFT与AD病人略有差异，再就是用铝造模周期比较长(口服约三个月)。

10.转墓因动物模型。目前发现，与AD相关的基因有4个，即APP、ApoEε4、早老素1(PS1)和早老素2(PS2)，它们在AD的病因病理中起着重要作用。AD转基因动物模型目前主要有APP转基因模型、PS1转基因模型、ApoEε4转基因模型、Tau蛋白转基因模型、双重和三重转基因模型等。每种AD转基因动物模型都有自己独特的病理特征，同时通过对动物模型的研究也可以给AD发病机制及神经病理特征及治疗的展望提供重要的理论依据。

1)APP转基因模型

Dewachterder等PDAPP转基因小鼠模型的建立：以血小板源性生长因子(PDGF)为引物，与人类APP小基因片段(含717位上的突变位点缬氨酸-苯丙氨酸)结合成PDAPP基因，将此段基因以显微注射法导入小鼠受精卵中，植入假孕小鼠体内，产生的小鼠携带突变基因，较好地模拟了老年斑的病理学改变。Aβ沉积部位以海马和皮层为主，其中以大片段Aβ1～42(43)为多，星形胶质细胞反应性增生，营养不良性神经元增多，突触缺失，且老年斑的密度随鼠龄的增加而增多。Games等用Val 717Phe突变构建了一个包含人类APP基因全cDNA的杂交转基因，该基因的APP表达水平比标准cDNA高的多。Deng等以血小板源性生长因子为引物，与人类带有Val 717Phe突变的APP基因片断结合成PDAPP基因，以显微注射法导入小鼠受精卵中，移植到假孕雌鼠输卵管内，产生携带此突变基因的幼鼠即为转基因鼠，能够高水平表达APP。运用弥散张量成像DTT技术观测到PDAPP鼠大脑灰质和白质均有损害，且Aβ沉积量随年龄增长而逐渐增多。Moran等报道，APP 751转基因小鼠(表达APP751)尤其在海马可显示早期AD样Aβ沉积和神经炎斑，且学习记忆能力明显减退。Hsiao等构建的APP 695sw和APP 670/671转基因小鼠APP表达水平升高3～5倍，并表现为与年龄相关的脑内Aβ沉积(主要分布在杏仁核、海马和皮层)，同时学习记忆减退。这些转基因小鼠的培育成功，对研究调节Aβ产生和沉积的因素有非常重要的作用。Jeong等建APPV717I-CT100转基因鼠模型并给与慢性免疫抑制处理，发现Aβ沉积增强，且加速了学习和记忆功能的损伤。

APPsw转基因小鼠模型的建立：应用朊病毒启动子，含有2个突变基因的人类APP基因(670位上赖氨酸-天冬氨酸；671位上蛋氨酸-亮氨酸)，将此片段基因以显微注射法导入小鼠受精卵中，植入假孕小鼠体内，产生的小鼠即携带突变基因，在此种小鼠模型中Aβ的生成量提高了8～10倍，小胶质细胞在Aβ沉积部位活性明显增加。Frackowiak等在thy-1增强子调控下，将大量表达Swedish序列突变的β-APP基因(APPsw)按上述方法转录到小鼠体内产生Tg 2576小鼠。此种小鼠脑血管平滑肌细胞所表达的β-APP大约是生理水平的4倍，并包含了大量的Aβ1～40和Aβ1～42，形成细胞内Aβ免疫反应阳性颗粒。这种大量表达APP基因的转基因鼠模型(PDAPP鼠)表现为神经细胞外硫黄素S阳性的Aβ沉积，突触减少，胶质细胞增生，胆碱能神经末梢变异和大脑皮质神经元退行性改变。

2)PS转基因模型

Masliah等将PDGF和人类PS1突变基因采用上述方法导入小鼠受精卵中，在新生小鼠体内可见Aβ生成增多(主要是Aβ1～42)，但并无Aβ沉积。此种模型仅适用于抑制Aβ产生方面的研究。Cataldo等利用血小板源性生长因子β2启动子促进神经元的表达，构建了几种过度表达PS1的转基因鼠，发现表达突变型PS1可选择性地增加Aβ42。制作出伴有M146L或M146V的PS1基因突变转基因模型(制作方法同前)。这种模型通过选择性增加Aβ42/43的神经毒性和破坏细胞内Ca²⁺稳定性，促进神经元变性，从而导致AD发病。并发现PS1、PS2复合突变基因模型较其他转基因模型加速了神经元溶酶体系统的病变。Flood等将人类PS1突变基因导入小鼠受精卵中，制作了FAD(familial early-onset AD)转基因动物模型，发现表达突变型PS1可选择性地增加Aβ42表达和Aβ沉积，不伴有APP增加。

3)ApoEε4转基因模型

已知ApoEε4能够与神经细胞外可溶性Aβ高亲和力结合，促进淀粉样斑块形成，调节Tau蛋白磷酸化过程，促进细胞骨架瓦解和NFT形成。一些研究者采用人类基因组ApoEε4的不同等位基因，通过动物自身启动子和3′增强子，将突变的ApoEε4基因通过上述方法转录到小鼠体内构建完成ApoEε4转基因鼠模型。子代小鼠中存在大量老年斑，胆碱乙酰转移酶活性明显降低。

4)Tau蛋白转基因小鼠模型

用人类Thy-1作为启动子，将带有表达人类Tau蛋白的基因注射到受精卵中，植入假孕的母鼠体内，生产的小鼠带有此基因段。转基因小鼠Tau蛋白mRNA表达水平是内源性的5倍，且发现与AD相似部位存在有过度磷酸化Tau蛋白。尽管未发现NFT，但此种模型仍适合AD治疗药物的筛选，并为有NFT形成的转基因模型奠定基础。Schindowski等用人类Thy-1.2作为启动子，在其G272V、P301S两个位置制成Tau蛋白突变基因，制成了新的THY-Tau22转基因小鼠。THY-Tau22转基因小鼠不仅显示了AD相关Tau蛋白抗原决定族(AT8、AT100、AT180、AT270、12E8、tau-pSer396、AP422)的Tau蛋白过度磷酸化、神经纤维缠结，还伴有明显星形胶质细胞的增多。THY-Tau22转基因小鼠也表现海马区的突触转运功能的缺失和行为、记忆的改变。该模型成功的展示了Tau蛋白引起的病理特征和神经纤维缠结变性过程中的病理生理紊乱。

5)双重、多重转基因模型

与前述转基因模型相比，双重、多重转基因鼠能更全面的表达出AD的病理特征和临床特征。为了探讨APP与PS间的相互作用，Samura等用APP和PS1两种突变基因制作淀粉样蛋白沉积的转基因模型，发现突变型PS1对突变型APP转基因鼠的淀粉样蛋白β斑块引起的和Tau蛋白的聚集形成有增强作用，并且加速了Tau蛋白引起的神经纤维缠结。Gordon等构建了携带突变型APP、PS1转基因的双重转基因鼠，发现突变型PS1对突变型APP转基因鼠的淀粉样蛋白β斑块形成有增强作用。Sadowski等也构建了携带突变型APP、PS1转基因的双重转基因鼠，发现该模型能够很好的模拟AD的早期记忆功能损伤临床特征和海马糖代谢的减低、神经元数目的减少病理生理机制的一致性。Dickey等用APP和PS1两种突变基因制作淀粉样蛋白沉积的转基因模型，可模拟AD早期记忆功能障碍，且在Aβ沉积区记忆形成相关基因的mRNA表达减少，但缺乏NFT的形成。Wirths等用APP和PS1两种突变基因转基因鼠模型发现胞内不断升高的Aβ可以触发轴突病理改变——轴突肿胀和髓鞘球样变结构形成，这种病理改变可以与Tau蛋白引起的病理改变无相关性。这一发现也对典型的AD病理学，Aβ作为AD的首发触发剂，提出了质疑。Costa等通过使用APP和PS1两种突变基因转基因鼠模型发现ApoEε4促进淀粉样蛋白β沉积的作用是促使了细丝折叠样Aβ的形成，不是无形的Aβ形成，所以阻止ApoEε4对Aβ沉积作用也可能是对AD的一项有效的治疗手段。Ribe等通过构建了携带突变型APP/Tau转基因的双重转基因鼠，该模型发现边缘区有选择性的Aβ蛋白沉积、神经纤维缠结和大量神经元的丢失。Lewis等通过构建了携带突变型APP/Tau转基因的双重转基因鼠，该模型发现边缘系统和嗅皮质区明显出现NFT的病理改变。推测Aβ蛋白和Tau蛋白在转基因鼠病理过程中具有相互促进的作用。

总之，转基因AD鼠的脑病理变化与人类相似，可模拟AD的年龄依赖性老年斑的形成、胶质细胞增生和突触减少等部分神经病理特征，并表现出与AD临床相似的行为学障碍。转基因模型可以为淀粉样蛋白变性疾病和认知功能障碍的AD病提供动物模型，用于研究AD的病因病理及抗AD药筛选有不可替代的作用。携带h-APP基因不同片段的转基因鼠病变表现有很大差异，通过对比分析可阐明h-APP基因不同片段的生物学效应和h-APP过度表达与β/A4沉积的关系，为AD的早期预防寻找有效途径。

培育转基因鼠是一项艰苦而细致的工程，对资金、实验室条件、研究者理论水平、实践经验有较高的要求，实验前慎重考虑，周密设计，而且制作复杂，费用昂贵，一般实验室不具备制作该模型的条件。AD是一种多基因疾病，尽管转基因模型是AD动物模型中的较理想者，但转基因模型大部分只模拟了AD的某一方面病理特征，而不能全面模拟AD发病。因此，转基因动物模型尚有待进一步全面深入研究和发展。

11.复合式动物模型。AD模型虽多，但只是模拟了该病的某些方面和特征。每种建立AD模型的方法各有优缺点，迄今为止，尚无一客观、准确全面地再现、模拟、复制出AD主要病理、生化及行为等方面全部特征的理想AD模型。制约了治疗AD的有效药物的开发和应用，也影响了AD基础研究的深化，这种矛盾已显得十分尖锐，现今已成为AD进一步研究的障碍。因此，有必要开展多学科、多层次综合研究，继续深入探索，寻找一种公认的合理的AD综合复制模型或AD全面复制模型，复合式动物模型较单一式动物模型更能反映AD的特征，有利于促进AD病因学、病理学和治疗学研究的快速发展。

腹腔注射D-半乳糖是我国学者最先报道的，用D-半乳糖120mg/kg和亚硝酸钠90mg/kg腹腔联合注射，1次/d，连续60d，模型组小鼠的逃避潜伏期明显增加，出现触须脱落及大脑皮层Aβ病理改变。有学者依据正交试验原理、联用IBA、Aβ及D-半乳糖，发现其可致大鼠记忆障碍，海马皮层锥体细胞数量明显减少，Alzheimer细胞增多及出现卫星现象。有报道给鼠长期高胆固醇饮食，其大脑皮层Aβ注射点胆碱能纤维比对照组减少49.62％。但最新报道表明，血浆胆固醇水平与表达APP/PS1基因的小鼠Aβ42水平并不成正相关。在其他动物模型的基础上再予胆固醇饮食，也有可能成为一种比较理想的动物模型。采用脑立体定位注射技术向海马注射缓激肽(BK)，海马区特定位点磷酸化的Tau蛋白显色增强。还有学者以一种衰老模型为背景，添加各种干扰因素建立复合式动物模型。另外，用高龄大鼠加左侧侧脑室一次性注射聚集态的Aβ25-35建立AD大鼠模型，通过行为学试验和脑组织病理检查等方法来研究这种复合式AD动物模型与人类AD也有一定的相似度。

综上所述，尽管目前已建立的AD动物模型多种多样，但均不能全面准确地反映AD的特征。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中还没有最适宜的具有AD行为学和典型病理学全部特征的AD动物模型的问题，提供一种AD复合动物模型的制备方法

AD是一种多因素损伤引起的疾病，其致病因素无外乎遗传因素和环境因素两大类。APP基因、早老素1(PS1)、早老素2(PS2)是占AD 85％家族性痴呆的易感基因；铝是AD病最重要的环境因素。基于此，本发明在仔细分析经典的单因素铝中毒模型和转基因动物模型的基础上，综合两种模型的优点，并加以改进，将AD发病相关的已知环境因素铝与遗传因素APP/PS1基因的作用相结合，期望制作出一种更贴近人类AD复杂病因，同时具有人类AD特征的新的、理想的多因素AD动物模型。

基于上述构思，本发明的AD复合动物模型制备方法是采用如下技术方案实现的：

取健康雄性APP/PS1双转基因小鼠，新鲜配制1mol/L AlCl₃·6H₂O溶液，高压灭菌后通过腹腔注射染毒，染毒30次，每次0.05mL。

进一步地，本发明对APP/PS1双转基因小鼠的染毒期为60天，隔天注射AlCl₃·6H₂O溶液，并在间歇天肌内注射青链霉素以抗感染。

优选地，本发明选用四月龄健康雄性APP/PS1双转基因小鼠。

本发明采用铝中毒方法，对转入了AD致病基因APP和PS1的小鼠腹腔注射AlCl₃·6H₂O，经神经行为学检测及形态学检测，可以较好地模拟AD的神经行为表现和具备AD的全部典型形态学改变。复合模型动物较对照组动物学习记忆能力显著下降，具备老年斑、神经原纤维缠结、淀粉样蛋白沉积和颗粒空泡变性等典型的形态学特征，从而在神经行为学和病理组织学上较好地模拟了AD的特征性改变。

本发明所提供的AD复合模型动物不但可以用于药物筛选，也可以用于机制研究。

附图说明

图1为C57BL/6J野生小鼠对照组HE染色(×400)的光镜照片；

图2为C57BL/6J野生小鼠染铝组HE染色(×400)的光镜照片；

图3为APP/PS1双转基因小鼠对照组HE染色(×400)的光镜照片；

图4为APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组HE染色(×400)的光镜照片；

图5为C57BL/6J野生小鼠对照组NFT染色(×400)的光镜照片；

图6为C57BL/6J野生小鼠染铝组NFT染色(×400)的光镜照片；

图7为APP/PS1双转基因小鼠对照组NFT染色(×400)的光镜照片；

图8为APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组NFT染色(×400)的光镜照片；

图9为C57BL/6J野生小鼠对照组β-APP蛋白免疫组化染色(×400)的光镜照片；

图10为C57BL/6J野生小鼠染铝组β-APP蛋白免疫组化染色(×400)的光镜照片；

图11为APP/PS1双转基因小鼠对照组β-APP蛋白免疫组化染色(×400)的光镜照片；

图12为APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组β-APP蛋白免疫组化染色(×400)的光镜照片；

图13为C57BL/6J野生小鼠对照组Aβ蛋白免疫组化染色(×400)的光镜照片；

图14为C57BL/6J野生小鼠染铝组Aβ蛋白免疫组化染色(×400)的光镜照片；

图15为APP/PS1双转基因小鼠对照组Aβ蛋白免疫组化染色(×400)的光镜照片；

图16为APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组Aβ蛋白免疫组化染色(×400)的光镜照片；

图17为C57BL/6J野生小鼠对照组刚果红染色(×400)的光镜照片；

图18为C57BL/6J野生小鼠染铝组刚果红染色(×400)的光镜照片；

图19为APP/PS1双转基因小鼠对照组刚果红染色(×400)的光镜照片；

图20为APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组刚果红染色(×400)的光镜照片；

图21为APP/PS1双转基因小鼠对照组DAPI染色(×400)的荧光照片；

图22为APP/PS1双转基因小鼠染铝组TUNEL染色(×400)的荧光照片；

图23为APP/PS1双转基因小鼠对照组两种染色Merge(×400)的荧光照片；

图24为APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组DAPI染色(×400)的荧光照片；

图25为APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组TUNEL染色(×400)的荧光照片；

图26为APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组两种染色Merge(×400)的荧光照片。

具体实施方式

实施例1

铝中毒APP/PS1双转基因小鼠动物复合模型的建立

取健康雄性C57BL/6J小鼠和健康雄性APP/PS1双转基因小鼠(中科院动物所)各16只，体重20～22g，活动能力相近。随机分为4组：野生小鼠对照组、野生小鼠染铝组、APP/PS1双转基因小鼠对照组、APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组，每组8只。

新鲜配制1mol/L AlCl₃·6H₂O溶液，高压灭菌后通过腹腔注射染毒，染毒期60天，0.05mL/d，隔天注射，60天内共计注射30次。在间歇天肌内注射青链霉素以抗感染。对照组腹腔注射同等体积灭菌后的生理盐水，注射时间、次数及抗感染处理相同。

整个染毒期间，动物室以自然节律采光，温度18～23℃，湿度40～60％，清洁、安静。所有动物饲以普通饲料，自由饮水和进食。笼具、饮水瓶等所有用具均不使用含铝制品。实验操作在每天上午8:30～11:00完成。

实施例2

Morris水迷宫试验

染毒结束后进行Morris水迷宫实验(Morris water maze，MWM)。Morris水迷宫由一白色圆柱形水池和一可移动位置和调节高度的透明有机玻璃站台组成。圆形水池直径100cm，高75cm，平台高度50cm，直径10cm，池壁由白色金属板组成。池内水深30cm，平台低于水面lcm，水温22±2℃。迷宫上方安置带有显示系统的摄像机，计算机自动跟踪计时并记录游泳轨迹。实验期间迷宫外参照物保持不变。

定位航行实验(place navigation)：小鼠连续接受4天训练，每天4次，每次间隔20min，记录小鼠分别从四个不同象限入水点入水找到平台所需的时间，即逃避到平台上的潜伏期(escaping latency)。4次潜伏期成绩的平均值作为当日最终成绩进入最后统计。如果小鼠在60s内未找到平台，其潜伏期按60s计算。

空间搜索实验(spatial probe test)：实验第5天撤除平台，从任一入水点将小鼠面向池壁放入水中，记录60s内小鼠的游泳轨迹，观察分析小鼠停留目标象限的时间。

结果表明，APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组找到平台的潜伏期较对照组显著增加（P＜0.01)，见表1。

表1铝染毒APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型神经行为学结果

*：与对照组相比，P＜0.01。

实施例3

组织切片的制备和常规HE染色

染铝期结束后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，灌注固定，断头取脑，迅速将取出的大脑皮质及海马组织固定于10％中性福尔马林缓冲液中，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，RM-2245型石蜡切片机切片，厚度5μm，60℃烤片12h后取片，常温保存，以进行常规、特殊组织学染色备用。

1)组织切片经二甲苯脱蜡2×10min；2)无水乙醇去二甲苯2×1～2min；3)95％、80％、70％乙醇各2min，自来水洗1min；4)苏木素染色3min，自来水洗1min；5)1％盐酸酒精分化20s，自来水洗1min；6)1％氨水返蓝30s，自来水洗1min；7)伊红染色15min，自来水洗1min；8)70％、80％乙醇各20s；9)95％乙醇2×1min；10)无水乙醇2×2min；11)中性树胶封片；12)AX70 OLYMPUS光学显微镜观察、摄片。

病理切片HE(Hematoxylin-Eosin，苏木精-伊红)染色，光学显微镜下观察

C57BL/6J野生小鼠大脑皮质神经元数量较多，神经元体积较大；核圆，核仁明显，细胞轮廓清晰(图1)；C57BL/6J野生小鼠染铝、APP/PS1双转基因小鼠大脑皮质内神经元体积变小，出现零散的严重损伤细胞，主要表现为细胞核呈固缩状，核周及胞浆空泡变性细胞结构破坏以及细胞轮廓模糊(图2、图3)；染铝的APP/PS1双转基因小鼠神经细胞结构破坏以及细胞轮廓模糊等病理改变更加明显(图4)。皮质神经元细胞颗粒空泡样变计数结果显示两种模型内实验组与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05)(见表2)，C57BL/6J野生小鼠与APP/PS1双转基因小鼠组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)(见表3)。

表2脑组织皮质神经细胞颗粒空泡样变计数(

n＝8)

*P＜0.05。

表3脑组织皮质神经细胞颗粒空泡样变计数(

n＝8)

*P＜0.05。

实施例4

Bielschowsky银染色改良法

1)组织切片脱腊至水；2)放入预先加热至37℃的20％硝酸银溶液内30min；3)蒸馏水速洗；4)入10％中性甲醛液还原2次，10s/次；5)入重氨银溶液中作用30s；6)取出切片，去除多余的银溶液，入10％中性甲醛液还原1min；7)蒸馏水冲洗；8)入5％硫代硫酸钠水溶液中作用约5min；9)常规脱水、透明，中性树胶封片；10)AX70OLYMPUS光学显微镜观察、摄片；11)结果判定：银染色处呈黑色，背景呈黄色。

Bielschowsky银染色改良法光学镜下观测，结果显示C57BL/6J野生小鼠大脑皮质及海马均未见NFT，铝染毒C57BL/6J野生小鼠大脑皮质可见个别NFT；铝染毒APP/PS1双转基因小鼠动物复合模型小鼠大脑皮质见到较多比较密集的NFT。形态特点是缠结变性的神经元纤维变粗或粗细不等，排列紊乱呈密集的团块状或纺织状遍布于胞质内，在轴突形成染色较深的拖尾形状(图5～图8)。APP/PS1双转基因鼠染铝组与对照组比较，神经元NFT样改变数量增加显著（P＜0.05)，见表4；两种模型神经元NFT样改变各组之间差异有统计学意义(P＜0.05)，见表5。

表4大脑皮质神经元NFT样计数(

n＝8)

*P＜0.05。

表5大脑皮质神经元NFT样计数(

n＝8)

*P＜0.05。

实施例5

免疫组织化学法

1)组织切片二甲苯脱蜡、水化；2)枸橼酸盐修复液96℃加热10min(GFAP免修复)；3)每张组织切片加1滴0.3％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，37℃恒温箱60min，PBS洗3次，每次5min；4)滴加5％脱脂奶粉封闭液，37℃恒温箱60min；5)弃去封闭液，分别滴加一抗(鼠抗APP、Aβ抗体)，4℃恒温箱过夜，PBS洗3次，每次5min；6)滴加二抗(生物素化的马抗小鼠IgG)，37℃恒温箱60min，PBST洗3次，每次5min；7)滴加辣根酶标记链酶卵白素，37℃恒温箱60min，PBST洗3次，每次5min；8)DAB显色，于显微镜下控制反应时间，充分水洗；9)苏木精复染核，脱水、透明，中性树胶封片；10)AX70 OLYMPUS光学显微镜下观察、摄片；11)结果判定：细胞内棕黄色物质为阳性标记。

免疫组织化学染色结果：镜下可见各组小鼠皮质均有β-淀粉样前体蛋白(β-APP)蛋白免疫反应阳性神经元，阳性反应定位于细胞胞浆内，染色呈棕黄色(图9～图12)。用Image-Proplus 6.0图像分析和SPSS13.0软件分析，各组中染铝组与对照组比较，皮质阳性细胞平均积分光密度值(IOD)差异有统计学意义（P＜0.05)，见表6。组间比较差异有统计学意义（P＜0.05)，见表7。

表6皮质β-APP蛋白表达IOD的变化(

n＝8)

*P＜0.05。

表7皮质β-APP蛋白表达IOD的变化(

n＝8)

*P＜0.05。

皮质Aβ蛋白表达

免疫组织化学染色结果：镜下可见各组小鼠皮质细胞层均有β-淀粉样肽(Aβ)。Aβ蛋白免疫反应阳性神经元，阳性反应定位于细胞胞浆内，染色呈棕黄色(图13～图16)。用Image-Proplus 6.0图像分析和SPSS13.0软件分析，两组中实验组与对照组比较，阳性细胞平均积分光密度值(IOD)差异有统计学意义(P＜0.05)，见表8。两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见下页表9。

表8皮质Aβ蛋白表达IOD的变化(

n＝8)

*P＜0.05。

实施例6

改良甲醇刚果红染色

1)组织切片常规脱蜡至水；2)Harris苏术精染色5～10min，自来水冲洗数分钟；3)1％盐酸乙醇分化数秒钟，温水显蓝，自来水冲洗数分钟；4)甲醇刚果红染色15min，自来水冲洗数分钟；5)0.2％碱性乙醇分化数秒钟，自来水冲洗；6)常规脱水、透明、封片。

甲醇刚果红染色光学镜下观测，结果显示铝染毒C57BL/6J野生小鼠大脑皮质均未见老年斑，铝染毒APP/PS1双转基因小鼠动物复合模型小鼠皮层和海马可见散在分布的橘红色沉积物，形似圆形，背景清晰，周围绕以蓝色细胞带，细胞体积较小，形成未成熟型SP(图17～图20)。

表9皮质Aβ蛋白表达IOD的变化(

n＝8)

*P＜0.05。实施例7

流式细胞仪检测

处死动物取海马，用0.25％胰酶消化细胞，于4℃1000r/min离心5min，PBS洗2次，加入100μl Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20μg/ml)10μl，室温避光30min，再加入PI(50μg/ml)5μl，避光反应5min后，加入400μl Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超1h)，同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

流式细胞检测结果显示，生理盐水组大多数活细胞Annexin V和PI均低染，绝大多数细胞位于左下象限；位于右下象限早期凋亡细胞凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；右上象限的晚期凋亡细胞Annexin V/PI均高染；位于左上象限的坏死细胞则表现为Annexin V低染、PI高染。由表10可见，染铝组凋亡细胞的数目高于生理盐水组（P＜0.01)。

表10流式细胞检测结果(％，

)

*：与对照组相比P＜0.01。

实施例8

TUNEL法检测细胞凋亡

应用脱氧核糖核普酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terlninal-deoxynu-trans ferasemediated nickend labeling，TUNEL)法检测动物组织切片细胞的凋亡情况，用荧光素(FITC)-dUTP来标记。常规石蜡组织切片的的预处理：石蜡包埋的组织切片按常规方法进行脱蜡及水合，PBS漂洗两次，加入蛋白酶K工作液(蛋白酶K工作液：2μl 50×Proteinase K+98μl PBS)，室温孵育15～30min，PBS漂洗两次。标记：用吸水纸吸干样品周围的水，每个样品滴加50μl的TdT酶反应液，加盖玻片37℃避光湿润反应60min(TdT酶反应液：45μl Equilibration Buffer+1μl FITC-12-dUTP+4μl TdT Enzyme，需新鲜配制)(阴性对照片不加TdT酶)，PBS漂洗三次。阴性对照：在制备TdT酶反应液时，不添加TdT酶，其余步骤均相同。阳性对照：组织样本在蛋白酶K处理、PBS浸洗后，再加入100μl DNase I反应液(10U～3000U DNase I，40mM Tris-HCl pH 7.9，10mM NaCl，6mM MgCl₂，10mM CaCl₂)。加DAPI 0.5ml，室温孵育20分钟复染细胞核，PBS漂洗三次。于515～565nm处用绿光激发在激光共聚焦显微镜下观察细胞，计数阳性细胞比例。

由图10中可见，APP/PS1双基因转染小鼠对照组神经细胞只有少量的荧光绿染颗粒，但是AD复合模型组可见较多的绿染颗粒。模型组细胞的凋亡率明显高于对照组(P＜0.01)，见表11、图21～图26。

表11TUNEL法检测细胞凋亡结果(％，

)

*：与对照组相比P＜0.01。

Claims (3)

1.一种阿尔茨海默病复合动物模型的制备方法，其特征是取健康雄性APP/PS1双转基因小鼠，新鲜配制1mol/L AlCl₃·6H₂O溶液，高压灭菌后通过腹腔注射染毒，染毒30次，每次0.05mL。

2.根据权利要求1所述的阿尔茨海默病复合动物模型的制备方法，其特征是对APP/PS1双转基因小鼠的染毒期为60天，隔天注射AlCl₃·6H₂O溶液，并在间歇天肌内注射青链霉素以抗感染。

3.根据权利要求1或2所述的阿尔茨海默病复合动物模型的制备方法，其特征是选用四月龄健康雄性APP/PS1双转基因小鼠。

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