JPH09511388A

JPH09511388A - 進行性神経疾患を持つヒト以外のトランスジェニック哺乳類

Info

Publication number: JPH09511388A
Application number: JP7520186A
Authority: JP
Inventors: シャオ，カレン; アールボーシェルト，デイヴィッド; エムスィソディア，サングラ
Original assignee: リージェンツオブザユニバーシティーオブミネソタ
Priority date: 1994-01-27
Filing date: 1995-01-27
Publication date: 1997-11-18
Also published as: CA2182311A1; AU1909695A; WO1995020666A3; EP0742831A1; ATE278023T1; US6262335B1; EP0742831B1; DE69533583T2; WO1995020666A2; DE69533583D1

Abstract

(57)【要約】生殖細胞及び体細胞が、胚段階において動物あるいは動物の祖先に導入されたアミロイド前駆体タンパク質配列を含むトランスジェニックなヒト以外の真核動物が提供される。マウスでは、興奮、新奇恐怖症、痙攣、活性低下、大脳グルコース利用の低下、コルチコ辺縁グリオーシス、及び死亡を特徴とする年齢に関連したＣＮＳ疾患(disorder)が進行する。この疾患の促進が、位置依存性、コピー数依存性の発現を与えるハムスターのプリオンタンパク質遺伝子に誘導されたコスミドベクターを用いて製造されたヒト及びマウスのアルツハイマーアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を発現するトランスジェニックマウスにおいて起こる。トランスジェニックマウスにおいて、疾患は、脳のトランスジェニックＡＰＰレベルに直接関係して進行するが、突然変異体ＡＰＰは、野生種ＡＰＰより低いレベルで発現する表現型を与える。この疾患は、細胞外のアミロイド沈着無しでも起こり、ＡＰＰの病原学的活性には、アミロイド形成とは分離して考えるべき部分があることを示している。

Description

【発明の詳細な説明】進行性神経疾患を持つヒト以外のトランスジェニック哺乳類序論技術分野：本発明は、進行性の退化性神経疾患を有するトランスジェニック動物に関する。背景：神経系の疾患に用いられる退化性という用語は、徐々に、通常は絶え間なく神経系構成要素の消失の進行が見られる障害の類を呼称するために用いられ；多くの条件は、異常な遺伝因子によってこのように呼称される。退化性疾患は、臨床的及び病理学的な特徴により識別される多数の症候群として現れる。それでも、これら全てがある種の共通の局面を有する。これらの局面とは、一連の徐々に進行する発病、該疾患により引き起こされる変化の左右対称の分布、及び多くの場合、解剖学的もしくは生理学的に関連するニューロンのほぼ選択的な関わりを含む。病理過程は、神経細胞体もしくはこれらの神経繊維としての遷延の遅いインバリュエーション(invaluation)の一つであるのが典型的である。神経系の退化性疾患の中には、進行性の痴呆が著しい特徴である症候群があり；この類の症候群は老年痴呆及びアルツハイマー病を含む。老年痴呆は、老年期にはかなりしばしば見られる状況である。アルツハイマー病は、より稀ではあるが、老年期のずっと以前に現れる進行性の痴呆と病理学的に同一である。これら二つの状況の識別は、純粋に臨床的なものであって；これらは、アルツハイマー病の場合にはより深刻で広範囲に渡る傾向にあり、老年期よりも早い年齢に始まるということによってのみ相違する。アルツハイマー病（ＡＤ）には、深刻な痴呆につながる記憶の喪失、失見当及び錯乱を伴う、遅い進行性の精神的衰退が見られる。この疾患は、主として脳の辺縁及び皮質領域に関連する。いくつかの組織学的特徴があるが、２つが著しいものである。第一に、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のアミロイドジェニックＡβフラグメントを含む好銀性プラークが、大脳の皮質及び海馬全体にまき散らされる。第二には、主として新皮質、海馬、及びメイナート基底核内に位置する錐体ニューロンに、神経細線維のもつれが見られる。他の変化もまた見られる。海馬の錐体細胞における顆粒空胞（granulovacular）の変性は、プラークもしくは神経細線維のもつれよりも、ＡＤに対してより特異的であるとも考えられる。最後に、皮質及び海馬においてニューロンの喪失及び神経膠症が見られる。ＡＤの病理学的特徴に欠ける（また、定義によれば、異なる疾患を持つ）痴呆の患者もおり、逆に、ＡＤの病理学的特徴の多くを有するが、死の前にも痴呆にならない個体もある。ＡＤの診断には、患者の持つ疾患に特徴的な、臨床的及び病理学的特徴の双方が必要である；臨床的及び病理学的特徴のいずれか一方のみからでは、確かな診断を下すことは不可能である。神経性機能不全及び臨床的異常が、これらの病理学的特徴、特にアミロイドプラーク及び神経線維のもつれ等の発達を進行させるか否かは、知られていない。ＡＤの臨床的発現により、大脳皮質、海馬、小脳扁桃及びパラ海馬の回（para hippocampal gyri）を含む前脳における冒された脳構造の領域が予測される。これらの領域は脳の、コルチコ辺縁領域として知られている。菱脳は、スペアされており、小脳、橋及び骨髄核を含む。大脳新皮質内では、第一の皮質領域は比較的にスペアされており、これはベーシックモータ及び知覚コルチコ機能との相対的な臨床スペアリングに相当する。ＡＤ等の進行性の神経性障害の研究については、容易に手に入る動物モデルの不足が非常な妨げとなっていた。老齢の霊長類の神経病理学の局面には、ヒトＡＤに類似のものがある（プライス（Price）ら、（1992）J.Neurobiol．23:1277 〜1294頁）。老齢の霊長類には、アミロイドプラーク及びフォルムフラステ神経線維のもつれが発生する。研究した動物でも、老齢の霊長類ほどＡＤに似た疾患が発生する動物は他にない。しかしながら、多数の老齢の霊長類を研究することは実際的でなく；こうした使用は、道徳的及び経済的な、双方の問題を醸す。ＡＰＰトランスジェンを持つトランスジェニックマウスについては説明されている；しかしながら、報告されているトランスジェン生成物の発現では、ＡＰＰの内因性レベルをかなりの不足にまで低下させ（別のトランスジェニックマウスにおける総ＡＰＰ水準は、内因性水準の１５０％を越えない）、脳のコルチコ辺縁領域における病理学に伴う進行性の神経行動障害を持つ疾患表現系を発生させることができない。これらの他のトランスジェニックマウスにおいては、申請神経疾患の証拠であると見なすことのできる、進行性神経疾患もしくは脳における神経病理学的変化の徴候は全く見られない。ミッセンス（Missense）は、アミロイド前駆体タンパク質のための遺伝子コードにおける突然変異が同族ＡＤに関連していることを指摘している。しかしながら、ＡＰＰにおける突然変異を伴う疾患の発見にも関わらず、ほとんどのＡＤをもつトランスジェニック動物を作り出すための公開された試みのほとんどは、マウスにおけるワイルドタイプＡＰＰトランスジェンのみについてのものである（カワバタ（Kawabata）ら、(1991)Natu re 354，476-478; クォン（Quon）ら、(1991); Nature 352，239-41; ヴィラク（Wirak）ら、(1991)Science 253，323-325; カムシェイト（Kammesheidt）ら、 (1992)Proc Natl Acad Sci U.S.A．89，10857-61; ラム（Lamb）ら、(1993)Natu re Genetics 5，22-30）。残念なことに、病理学を主張する公開された研究のいくつかは、トランスジーン生成物発現の不適当な文献及び／または病理学の誤解によって、制限されている。２つが撤回されている（カワバタ（Kawabata）ら、1991; ヴィラク（Wirak）ら、1991）。トランスジェニックマウスにおいて、ＡＤのモデルを作ろうとのこれまでの試みは、不成功であった。ほとんどの場合、ＡＰＰの内因性標準に適合するもしくはこれを超えるトランスジェン生成物発現は達成されず、トランスジェンは突然変異したＡＰＰをコード化しなかった。ＰＣＴ／ＵＳ９２／１１２７６には、突原変異した遺伝子の使用方法が記載されている。カルボキシル末端のみで、全ＡＰＰ遺伝子が発現しない場合もあり（カムシェイト（Kammesheidt）ら、(1992)P roc Natl Acad Sci U.S.A．89,10857-61）；このことによりその他のＡＰＰ分子がＡＤにおいて作用し得るというようなあらゆる生物学的効果を見落とすこともある。プレアミロイドＡＰＰプラークが観察されるトランスジェニックマウスもあった。しかしながら、大脳などのヒトの脳領域において通常観察され、病理学的もしくは臨床的な表示の他の徴候に欠けていることから、プレアミロイドＡＰＰプラークは、必ずしも疾患を指示するものではない。トランスジェニックマウスの海馬神経における小胞構造内に位置するＡＰＰの免疫反応性の増加が報告されているが、マウスが進行性の神経行動障害も、真性の神経疾患も示さないことから、この免疫反応性の異議は不明である。一般的に、絶え間のない一連の進行性の神経退化疾患は、現在の治療形式には影響されない。したがって、老年痴呆のような退化性神経疾患のヒト以外のトランスジェニック哺乳類モデルを発生させることは、興味深い。この動物が、誕生からかなり短い期間内に神経疾患を発生し、多数世代系の分析が容易であることが望ましい。別の、強い臨床的及び病理学的表現系を試験し、記録できることから、モデルを病理学の研究及び退化性神経疾患の治療に用いることができる。関連文献：クオン（Quon）ら、(1991)Nature 352:239には、ヒトアミロイド前駆体タンパク質遺伝子を含むトランスジェニックマウスが記載されている。ラム(Lamb)ら、 (1993)Nature Genetics 5:22には、アミロイド前駆体タンパク質の量が、内因性水準を約５０％上回るトランスジェニックマウスが記載されている。ＰＣＴ出願ＵＳ９２／１１２７６には、様々なプロモータの下で、３つの形態のＢ−アミロイド前駆体（ＡＰＰ）、ＡＰＰ６９Ｓ’ＡＰＰ７５１、及びＡＰＰ７７０を発現する、トランスジェニックマウス及びラット構築のための方法が開示されている。イン・ビボでこれらの方法を用いて発現が得られるかどうかについてのデータは、明細書中に与えられていない。アルツハイマーアミロイド前駆体（ＡＰＰ）タンパク質の他のトランスジェニックマウス研究には、下記のものが含まれる。（グリーンバーグ．Ｂ．Ｄ．（Gr eenberg，B.D.）(1993)Abstract421.12，Society for Neuroscience Abstracts 19:1035）ＡＰＰタンパク質遺伝子がＭＡＰＰ及びｍＭｔ−Ｉプロモータを用いて発現される。シュバルツ（Schwartz）ら、((1993)Abstract 421.12，Society for Neuroscience Abstracts，19:1035)には、トランスジェニックマウスにおけるヒトのベータ-アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のニューロン特異的な発現が開示されている。サベージ（Savage）ら、((1993)Abstract 421.14 Society f or Neuroscience Abstract 19:1035)には、アルツハイマー病のモデル：病理学の調査としてのトランスジェニックマウスにおける、５つのヒトアミロイド前駆体タンパク質発現が開示されている。リーバーバーグ．Ｉ（Lieberberg.I）、(( 1993)Abstract 421.15，Society for Neuroscience Abstracts 19:1035)には、ＮＳＥプロモータを用いる、トランスジェニックマウスにおけるヒトタンパク質の発現が開示されている。フクチ．Ｋ（Fukuchi．K）ら、((1993)Abstract 421. 16，Society for Neuroscience Abstracts 19:1035)には、トランスジェニックマウスにおける腸のベータ-アミロイドが開示されている。ＡＰＰタンパク質遺伝子の発現のために、ニワトリベータ-アクチンプロモータ及びＣＭＶエンハンサーが使用されている。ワグナー（Wagner）ら、((1981)Proc．Nat．Acad．Sci．U.S.A．78:5016)には、ヒトグロブリン遺伝子を持つトランスジェニックマウスが記載されている。スコット（scott）ら、((1989)Cell 59:847)には、ハムスタープリオンタンパク質遺伝子を持っトランスジェニックマウスが記載されている。シャオ（Hsiao）ら、((1990)Science 250:1587)には、突然変異ヒトプリオンタンパク質遺伝子を持つトランスジェニックマウスが記載されている。シャオは、ゲルストマン-シュトラウスラー-シェインカー病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)（ＧＳＳ）のモデル、臨床的及び病理学的な表現系を発生させるためには、内因性水準を超える突然変異トランスジーン生成物の水準が必要とされるトランスジェニックマウスにおける、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）遺伝子における突然変異による引き起こされる稀な神経退化疾患を開示している(シャオら、(1990)Scien ce 250:1587-1590); シャオら、(1994)Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91:9126-9 130)。発明の要旨進行性の神経疾患の、ヒト以外のトランスジェニック動物のモデルを、動物モデルの調製のための方法及び組成物と、これを用いる方法と共に与える。このヒト以外の哺乳類は、胎児の段階でヒト以外の哺乳類に発現カセットの多数コピーを導入し、胎児を発達させてプソイド妊娠養雌（pseudo-pregnant foster femal e）においてタームする工程により得られる。発現カセットは、ワイルドタイプアミロイド前駆体タンパク質の内因性水準が、少なくとも２から４フォールドである水準の神経細胞組織におけるコード配列の発現のための規制配列に実施可能な程度に結合したアミロイド前駆体タンパク質コード配列を含む。得られるヒト以外のトランスジェニック哺乳類は、脳のコルチコ辺縁領域において進行性の神経疾患を発生する。トランスジェニック動物の、例えば進行性の神経疾患の治療及び予防を目的とするプロトコルの遮断に使用が見いだされる。図面図１は、ＨｕＡＰＰｃＤＮＡ配列を示す図である。図２は、トランスジェニック動物で発現することのできる他のＡＰＰ配列を示す図である。図３は、ＰｒＰ配列を置換するＳａｌＩ部位に隣接したテトラサイクリン−耐性配列を持つハムスターＰｒＰコスミドベクターを示す図である。図４及び図５は、図６及び７に示したように強い翻訳開始するよう修飾されたＨｕＡＰＰ配列と融合させたハムスターＰｒＰコスミドベクターを示す図である。図６及び図７は、強い翻訳開始をするよう修飾され、ＳａｌＩ制限部位に隣接したＨｕＡＰＰ配列を示す図である。図８は、トランスジーンをの検出に用いられるＰＣＲプライマーを示す図である。図９は、トランスジェニック及び非トランスジェニックＦＶＢマウスにおける齢関連ＣＮＳ脱機能を示す。Ｔｇマウスの２つの系統、Ｔｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＴＲＩｍｙｃ）１１３０Ｈ及びＴｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＴＲＩｍｙｃ）１１１８は、各々、内因性ＭｏＡＰＰレベルの３．６倍及び１．４倍の変種ＨｕＡＰＰを発現するが、疾患の平均開始はＡＰＰレベルに逆相関する。Ｔｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＷＴｍｙｃ）１８７４及び非Ｔｇマウスの亜群は、影響Ｔｇマウスに類似した臨床及び病理学的以上を示すが、与えられた如何なる齢でもかなり低い浸透性しか持たない。図１０は、は、行動異常性を示すトランスジェニック及び非トランスジェニックＦＶＢマウスにおけるコルチコ辺縁肥大性星状細胞グリオーシスを示す。ＧＦＡＰに対する抗体と反応するコルチコ辺縁及び脳幹構造の冠状部分は、行動異常性を示す動物のコルチコ辺縁領域における肥大性グリオーシスを示す。図１０Ａ：１４４日齢で行動異常性（興奮及び低いコーナー・インデックス・スコア）を示すＴｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＴＲＩｍｙｃ）１１１８−３３４、２０６日に犠牲；図１０Ｂ：２０６日齢の行動異常を示さないＴｇ１１１８−３３４の非Ｔｇマウス；図１０Ｃ：３２４日齢で行動異常性（活動低下及び低いコーナー・インデックス・スコア）を示す非Ｔｇ＃４５６５、３３４日に犠牲；図１０Ｄ：３３４日齢の行動異常を示さない＃４５６５の非Ｔｇマウス。図１１は、脳組織におけるトランスジェニックＨｕＡＰＰタンパク質の発現を示す。ＨｕＡＰＰタンパク質の発現は、４系統のＴｇマウス、Ｔｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．Ｗｔｍｙｃ）４６６、Ｔｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＴＲＩｍｙｃ）１０５６、Ｔｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＴＲＩｍｙｃ）１１１８、及びＴＧ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＴＲＩｍｙｃ）１１３０Ｈで半定量的に行った。これらの系統は、各々、４０、７、２１及び７４のトランスジーンコピー数を持つ。内因性脳ＭｏＡＰＰに対するトランスジェニックの相対的レベルを、２つのポリクローナルＡＰＰ抗血清、ＣＴ１５（図１１Ａ）及び抗ＧＩＤ（図１１Ａ）、及びモノクローナル抗体、２２Ｃ１１（図１１Ｂ）によって試験した。ＣＴ１５抗血清は、マウスとヒトのＡＰＰで相同の領域であるＡＰＰのＣ末端の１５アミノ酸を認識する。ＧＩＤ抗血清は、マウスとヒトのＡＰＰで一致する領域であるＡＰＰ６９５のアミノ末端から１７５−１８６残基のエピトープを認識する。非Ｔｇ及びＴｇマウスの界面活性−抽出脳ホモジネートからの等量のタンパク質を、平行してイムノブロットした。主要な抗体は¹²⁵Ｉ−タンパク質Ａで明らかになった。モノクロ− ナル抗体について、ブロットは最初にマウスＩｇＧに対するラビット抗血清でインキュベートした。結合した¹²⁵Ｉ−タンパク質Ａは、ホスホリマガーを用いて定量し、トランスジーンコピー数とトランスジーン生成物発現との直接的関係が示された。ＨｕＡＰＰの発現レベルを特異的に測定するため、脳ホモジネートをヒトＡβの１−１７残基に対して生じた６Ｅ１０抗体でプローブした（Kim，et al.，(1990) Neuroscience Research Communications，7，113-122）。図１１Ｃは、脳におけるＡＰＰの領域的発現を示す。種々の組織の１０％ｗ／ｖホモジネートでのＨｕＡＰＰの相対量は、Ｔｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＴＲＩｍｙｃ）１１３０Ｈマウスにおいて、６Ｅ１０抗体を用いて選択的に検出された。各系列において、等量のタンパク質がイムノブロットされた。１：終脳、２：間脳、３：中脳、４：脳橋、５：小脳、６：髄質、７：脊髄。終脳における最も高いＨｕＡＰＰレベルは、小脳のレベルの薬２倍である。図１２は、トランスジェニック脳ＡＰＰ発現の、種及びコピー数依存性を示す。図１３は、トランスジェニックマウスのニューロンでのＨｕＡＰＰ発現を示す。図１３Ａ：Ｔｇ、犠酸前処理、６Ｅ１０抗体（海馬）；図１３Ｂ：非Ｔｇ、犠酸前処理、６Ｅ１０抗体（海馬）；図１３Ｃ：Ｔｇ、擬酸前処理、６Ｅ１０抗体（大脳皮質）；図１３Ｄ：ＡＤプラーク、擬酸前処理、６Ｅ１０抗体；図１３Ｅ：ＡＤプラーク、擬酸前処理無し、６Ｅ１０抗体；図１３Ｆ：ＡＤプラーク、マイクロ波前処理、８Ｅ５抗体；図１３Ｇ、Ｔｇ、マイクロ波前処理、８Ｅ５抗体（海馬）；図１３Ｈ、非Ｔｇ、マイクロ波前処理、８Ｅ５抗体（海馬）。図１４は、ＣＮＳ疾患のトランスジェニック脳ＡＰＰ発現及びゲノタイプ(gen otype)依存性を示す。好ましい実施態様の説明本発明は、トランスジェニックのヒト以外の真核動物、好ましくはマウス等のげっ歯類、並びにその動物を調製および使用するための方法と組成物に向けられている。動物は、アミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）配列を、誕生から短い期間内、一般的には誕生から１年以内、好ましくは誕生から２〜６ヶ月以内に進行性神経疾患を起こすレベルで、脳組織内で発現する。ＡＰＰタンパク配列は、その動物あるいはその動物の祖先に、胎児期、好ましくは一つの細胞、すなわち受精した卵母細胞の段階、一般的には約８細胞期より以前に導入される。次いで、接合子または胚を、偽妊娠フォスター雌（a pseudo-pregnant foster female）で発達させる。アミロイド前駆体タンパクの超内在性発現(the supra-endogenou s expression)、および、ＡＤ等の進行性神経疾患状態に顕著に影響される脳の領域である、脳のコルチコ辺縁領域における進行性神経疾患の発達を引き起こすために、アミロイド前駆体タンパク遺伝子を動物胚内に導入する。本発明は、ＡＤ等の進行性神経疾患の存在するモデルを超えたいくつかの利点を提供する。トランスジェニック動物は、高レベルの天然ＡＰＰまたは変異ＡＰＰを発現し、未熟死を伴う神経病を発達する。グリオーシスおよび細胞内ＡＰＰ／Ａβ癒着は、海馬および大脳皮質に存在する。罹患したトランスジェニック動物におけるグリオーシスおよび症状は、真の神経疾患の指標である。神経疾患の進行性の態様は、減少した試験的な／移動の挙動、および減少した２−デオキシグルコースの取り込み／利用、並びに脳のコルチコ辺縁領域における肥大性グリオーシスによって特徴付けされる。さらに、観察される変化は、ある成熟した動物に見られる変化と類似している。本発明のトランスジェニック動物は、転写の５’−３’方向に、脳組織内での遺伝子発現に係る転写および翻訳の開始領域、変異もしくは野生型のＡＰＰをコードするＤＮＡ、並びに宿主動物内で機能する転写および翻訳終結領域を含む発現カセットを用いて作製される。一つ以上のイントロンが存在してもよい。発現に関して、他の組織と比べて、脳において、優先的もしくは少なくとも実質的に特異的な発現を提供する開始領域（時には“プロモーター”と称される）に特別な関心が注がれる。“少なくとも実質的”とは、脳組織における発現が、他の組織における発現の約１０倍より優れていることを指す。脳内では、コルチコ辺縁領域における発現が特に注目される。転写開始領域は、宿主動物に内在性のもの、あるいは宿主動物に対して外来性あるいは外因性のものであってもよい。外来性とは、転写開始領域が導入される野生型の動物宿主中に、その転写開始領域が見出されないことを指す。内在性とは、宿主動物に固有（すなわち、生来）のもの、および、例えばウイルス、プリオン等の感染性疾患の結果として宿主動物中に存在するものの両方を指す。プロモーターは、好ましくは、翻訳されない５’配列の転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域、ｍＲＮＡとリボソームの結合および翻訳開始を担う“リボソーム結合部位”を含む。転写開始制御領域は、異なる細胞に種々の量で存在するトランス作用ファクターの結合に反応して転写を活性化または抑制するｃｉｓ− 作用サブドメインから構成されてもよい。開始調節領域の全ての転写および翻訳作用要素が、同一の遺伝子から誘導または得られることが好ましい。ある実施態様では、エンハンサー等の配列の添加、あるいは、必須でない配列および／または望ましくない配列の欠失により、プロモーターを修飾することができる。“得られる”とは、関心のＤＮＡ配列の転写の所望の特異性を提供するのに、天然のプロモーターと十分に類似したＤＮＡ配列を備えたプロモーターを指す。これは、天然および合成配列、並びに合成および天然配列を組み合わせた配列を含む。組織特異的転写は、遺伝子制御タンパクがエンハンサー配列および他の上流プロモーター要素に結合することを示唆する。エンハンサー要素（エンハンサー）とは、通常のＲＮＡ出発部位に合成開始点を備えた、エンハンサーに結合したプロモーターからの転写を活性化することができる制御ＤＮＡ配列を指し、両方向に操作することができ（正常またはフリップ(flipped)）、かつプロモーターの上流または下流に移動しても機能することができる。エンハンサーおよび他の上流プロモーター要素の両方が、それらの効果を仲介する配列特異的ＤＮＡ結合タンパクに結合する。エンハンサーおよび他の上流要素の機能に重要な厳密なヌクレオチド配列を同定するために、関心のある組織中で発現されたタンパクをコードする翻訳されない５’−領域の断片を、核タンパクとの結合力および非相同プロモーターと作用する能力に関して調べた。エンハンサーおよびサイレンサー配列の存在を調べるために、脳組織の核タンパクとの結合実験を用いることができる；遺伝子制御タンパクの対応する連鎖に結合する特異的ヌクレオチド配列を限定するために、タンパク結合研究を用いることができる。各エンハンサーおよび他の上流プロモーター要素の活性は、一般に、複数のタンパクの結合部位を含むことができるＤＮＡのセグメントに存在する。産物を容易に測定することができるレポーター遺伝子に結合された、より小さい変異型のエンハンサー配列を調製することによって、結合部位は、一般に分けることができる。転写における各変異の効果を調べることができる。あるいは、この領域の断片を調製することができる。エンハンサー配列もしくは断片の各変異型は、適切な宿主細胞に導入することができ、レポーター遺伝子の発現効率を測定することができる。この試験でエンハンサー作用を必要としたヌクレオチドは、ゲル移動およびＤＮＡフットプリント試験によって、特異的タンパクの結合部位として同定される。レポーター遺伝子の発現を増幅するプロモーターの上流領域の単離された断片の能力を調べる別の手段は、ＴＡＴＡＣＡＡＴボックスを含む試験プロモーターから発現レベルを増幅することができるが、検出可能な活性をほとんどあるいは全く示さない上流領域のサブドメインを調べることである。５’領域の断片を、発現カセットの試験プロモーターの前に挿入して、レポーター遺伝子の発現における効果を評価する。脳特異的、コピー数依存発現に関して特に注目すべき点は、脳特異的タンパク遺伝子のｍＲＮＡ出発部位から約２０ｋｂまでの領域における核タンパクに結合する領域である。この領域内に、作製物を用いることによって評価される脳特異的増幅要素の特徴を備えた注目されるいくつかのサブドメインがあるかもしれない。宿主動物の表現型を変えるために、宿主動物の脳組織で発現された遺伝子のプロモーターを用いてもよい。転写レベルは、修飾された動物で産生することができるある量のＲＮＡを提供するのに十分であるべきである。本発明の主題の“修飾された動物”とは、同一種の非形質転換動物と検出可能に異なる表現型を備えた動物を、例えば、そのゲノムにＡＰＰコード配列を含む転写カセットを備えていない動物を意味する。表現型の種々の変化は興味深い。これらの変化は、誕生から短い期間内で発現された脳のコルチコ辺縁領域における進行性神経疾患；内在性発現レベル以上に増加したＡＰＰ遺伝子の発現レベルおよび未熟死を伴った神経病の進行；海馬および大脳皮質に存在するグリオーシスおよび細胞内ＡＰＰ／Ａβ癒着；減少した試験的な／移動の挙動、および減少した２−デオキシグルコースの取り込み／利用、並びに脳のコルチコ辺縁領域における肥大性グリオーシスによって特徴付けされた進行性神経疾患を含んでもよい。転写開始領域として特に興味があるのは、宿主動物の脳で機能を有するプリオンタンパク遺伝子からのものである。プリオンタンパクは、Gerstmann-Straussl er症候群およびこれと同等の動物疾患であるスクレーピーの病原および伝達に関係している。脳組織は、所望の配列を調製する核酸の源として提供される。プリオンタンパクが単離されている所望の特徴を備えたプリオンプロモーターを同定するために、部分的に配列決定され、プリオンタンパクに特異的なｍＲＮＡを同定するためにプローブを設計することができる。ｃＤＮＡにハイブリダイズする配列が単離され、操作され、５’翻訳されない領域が単離されたコード領域と連結され、５’翻訳されない領域の転写活性を決定するために発現作製物に用いることもできる。適切に、配列は、当業者に知られたＰＣＲ法を用いて増幅することができる。ある場合には、プローブを、ゲノムライブラリをスクリーニングすること、およびプローブにハイブリダイズする配列を同定することに直接用いてもよい。この配列を、翻訳されない領域を同定するために、上述のように扱われる。プリオンプロモーター配列は、Baslerら(1986)，Cell 46: 417-428およびSc ottら(1992)Protein Science 1: 986-987に記載されている。ＡＰＰコード配列の発現を制御するために、種々の他のプロモーター配列を用いることができる。これらは、亜鉛の修飾およびグルココルチコイドホルモンレべルを介して調節されるプロモーターからの発現であるメタロチオニン(metallo tionine)（ＭＴ）プロモーター（Palmiterら，Nature 300，611-615(1982)）；ラットニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーター（Forss-Petterら．Neur on 5; 197-197(1990)）；ヒトβアクチン遺伝子プロモーター（Rayら，Genes an d Development（1991）5: 2265-2273）；ヒト血小板誘導成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ −Ｂ）鎖遺伝子プロモーター（Sasaharaら，Cell（1991）64: 217-227）；ラットナトリウムチャネル遺伝子プロモーター（Maueら，Neuron（1990）4:223-231 ）；ヒト銅-亜鉛過酸化物ジスムターゼ遺伝子プロモーター（Ceballos-Picotら，Brain Res．(1991)552: 198-214）；哺乳類ＰＯＵドメイン制御遺伝子ファミリーのメンバーのプロモーター（Xiら(1989)Nature 340: 35-42）を含む。ＰＯＵドメインは、４つの哺乳類の転写因子Ｐｉｔ-１、Ｏｃｔ-１、Ｏｃｔ-２およびｕｎｃ-８６の類似領域であり、ＤＮＡ結合ドメインの一部を示す。これらのプロモーターは、特にトランスジェニック動物の神経内における発現を提供する。終結領域は比較的交換可能だから、主に用いられる終結領域は、都合のよいものでよい。終結領域は、転写開始領域と同じ由来のもの、関心のＤＮＡ配列と同じ由来のもの、あるいは別の出所から誘導されたものとすることができる。都合のよい終結領域は、プリオンタンパク遺伝子のものを利用できる。本発明の主題で用いられる発現カセットは、脳で発現され、好ましくはクロモソームに取り込まれた配列の数に関連して、すなわちクロモソームに取り込まれたトランスジーン(transgene)のコピーが多いほどより高い転写が起こる方法で発現される遺伝子からのプロモーターおよびエンハンサー配列を含み、実施できるように、ＡＰＰ遺伝子配列並びに翻訳および転写終結領域と結合されている。脳で発現され、コピー数依存発現を誘導するプロモーターおよびエンハンサー配列の例は、scottらによって記載されたようなプリオンタンパクプロモーターを含む。プロモーターから上流の配列を伴ったProtein Science（1992）1: 986-98 7は、コピー数依存発現を得るために、位置効果によって比較的影響されないように大きい転写を調節する十分に大きい領域のＤＮＡを一般に含む必要がある。例えば、ハムスターのプリオンタンパク遺伝子については、約２０ｋｂのプロモーターの上流配列を用いることができる。本発明で用いられるコスミドベクターの構成の例としては、組み立てられる構成要素は、５’から３’方向に、脳組織でのＡＰＰ遺伝子を発現するためにマウス卵の前核(pronuclei)へのＤＮＡ構成物輸送用コスミドベクターに実施可能に取り付けられた、プリオンタンパク遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー配列、関心のあるＡＰＰ遺伝子配列のコード領域、および転写および翻訳終結配列を含む。このエンハンサー配列は、プリオンタンパクプロモーターの上流の２０ｋｂ領域を含んでもよく、プリオンタンパク遺伝子から非コードのエキソン１およびエキソン１の下流１０ｋｂのイントロンを含んでもよく、あるいは例えば国際特許ＷＯ９２／１１２７６に記載されたように一つ以上のＡＰＰタンパクをコードする配列を含むこともできる。当該技術分野でよく知られた分子遺伝学の技術を用いて、プリオンタンパク遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域は、プリオンタンパクを発現するトランスジェニックマウスを作成するのに用いられたほ乳類ゲノムコスミドクローンから単離することもできる。ＡＰＰ遺伝子のコード配列は、プロモーター／エンハンサー領域と終結配列の間の、コード配列がインフレーム（in-frame）で翻訳されるような独特の制限部位に挿入される。上述のようにコスミドベクターを用いて導入されたトランスジェニック脳組織のＡＰＰタンパクは、内在性レベルの少なくとも２〜４倍であることが確認されてもよい。ＡＤのトランスジェニックモデルの作成に関する主な障害は、トランスジェニック動物の脳においてトランスジェニックＡＰＰタンパクを過剰発現することができないことであった。ある場合には、ｍＲＮＡはよく発現されるが、タンパクはわずかにしか発現されない。これは、用いたプロモーターの強度は適切であるが、タンパク翻訳が適切でないことを示す。わずかしか翻訳できないのは、弱い翻訳開始配列によるものである。従って、開始コドンのマイナス３およびプラス４が、それぞれＡおよびＧである翻訳開始配列を含む必要がある。以下の表１を参照。あらゆるアミロイド前駆体タンパク配列を、本発明のトランスジェニック動物を作成するために用いることができる。ＡＰＰタンパク配列は（ここではこの用語を用いる）、複数のコピーで動物のゲノムに取り込まれ、超内在性(supraendo genous)レベルでトランスジェニック動物で発現される際に、トランスジェニック動物に進行性神経疾患を引き起こすＡＰＰ遺伝子のコード領域の配列を意味する。この神経疾患は、グリオーシスを伴った神経挙動(neurobehavioral)疾患およびコルチコ辺縁脳構造におけるグルコースの取り込みおよび／または利用の減少により特徴付けされる。コード配列は、野生型遺伝子、あるいは一つ以上の変異を含む遺伝子に由来するものとすることができる。このコード配列は、天然配列または合成配列もしくは天然配列と合成配列の組み合わせとすることができる。変異とは、天然のＡＰＰの配列と異なるアミノ酸配列を備え、置換、欠失等を含むあらゆるＡＰＰを指す。野生型ＡＰＰとは、関連する宿主動物で発生する天然ＡＰＰを指す。天然ヒトＡＰＰは、クロモソーム２１の１８のエキソンからなる単一の４００ｋｂ遺伝子にコードされている。選択的なｍＲＮＡスプライシングは、３つのＡＰＰイソ型タンパク質を生じる。二つの形態ＡＰＰ−７５１とＡＰＰ−７７０は、Ｋｕｎｉｔｚ−プロテアーゼインヒビター（ＫＰＩ）領域を含んでおり、第３の形態ＡＰＰ−６９５は、ＫＰＩセグメントを欠いている。好ましい配列は、疾患に関連するものである。疾患に関連する変異の例は、オランダのコンゴ好染血管障害に関連した（ＡＰＰ−７７０の）ＡＰＰコドン６９３における変異（Levy ら，（1990）Science 248: 1124）、同族のＡＤに関連したＡＰＰにおける変異、（ＡＰＰ７７０の）コドン７１７におけるバリン−イソロイシン（Goateら，( 1991)Nature 349: 704-706）、コドン７１７のバリンをフェニルアラニンまたはグリシンで置換する変異（Chartier-Harlinら，(1991)Nature 353: 844-846: Mu rrellら，(1991)Science 254: 97-99）；およびコンゴ好染血管障害とＡＤの両方を備えた一家における、コドン６９２のアラニンをグリシンで置換する変異（ Hendriksら，(1992)Nature Genetics 1: 218-221）を含む。あるスウェーデンの家族では、正常のリシン−メチオニンの二つのペプチドをアスパラギン−ロイシンで置換したコドン６７０と６７１の二つの変異が観察された（Mullanら，(199 2)Nature Genetics 1: 345-347）。Ｍ６７ＯＮ−Ｋ６７ＩＬを備えたＡＰＰは、増加したＡＢ１−４０分泌と関連すると報告されているが（Citronら（1992）Na ture 360: 672-674: Caiら（1993）Science 259: 514-516）、増幅されたＡＢ１ −４２産物は、Ｖ７１７Ｉ変異を伴ったＡＰＰについて報告されている（Caiら( 1993)，上述; Suzukiら（1994）Science 264: 1335-1350）。以下の表２は、既知のアミロイド前駆タンパク配列のリストであって、そのいくつかは家族性のアルツハイマー疾患に関連する。特に関心があるのは、ヒトＡβ配列がマウスＡＰＰのＡβ領域と置換されている通常のキメラＡＰＰ遺伝子である。Ａ１５８．５は、ＡＰＰから誘導された４ｋＤａのペプチドである。５人のヒト（Ｈｕ）、マウス（Ｍｏ）、およびマウス細胞ラインにおけるキメラ（Ｍｏ／Ｈｕ）ＡＰＰプロセッシングを調べることにより、確実な差異が明白であることを示唆した。ＨｕＡＰＰは、Ｍｏ-または組み合わせのＭｏ／ＨｕＡＰＰと比べて、マウス細胞でわずかにしか成熟しないようである。しかしながら、ヒトＡβ配列は、通常生成される可溶性Ａβペプチドの形成を促進する。Ｍｏ／ＨｕＡＰＰキメラタンパクは、ＨｕＡＰＰよりさらに効率的に成熟し、ＭｏＡＰＰより可溶性のＡβを生成する。トランスジェニックなほ乳類は、いくつかの方法で調製される。トランスジェニック生物は、外的または外在性のＤＮＡ断片をそのゲノム中に備えた生物である。外的または外在性ＤＮＡ断片を安定に遺伝させるために、機能的生殖細胞、精子または卵母細胞を生じることができる細胞のタイプで完全化が起こらなければならない。生殖細胞を形成することができ、容易にＤＮＡが導入される二つの動物細胞のタイプは、受精した卵細胞と胚幹細胞(embryonic stem cell)である。胚幹（ＥＳ）細胞を、in vitro培養から、発達中の動物に取り込まれるようになり、生殖細胞を含む全ての組織でトランスジェニック細胞を生じることができる“宿主”胚に戻すことができる。ＥＳ細胞は培養に移入され、胚に細胞を注入することによって変異が生殖系に導入される。変異生殖細胞を有する動物を、トランスジェニックの子孫を生むまで育てる。目的のトランスジェニック動物を作成する好ましい方法は、接合子注入することである。この方法は、例えばＵＳＰＮ４７３６８６６に記載されている。この方法は、受精した卵または接合子にＤＮＡを注入すること、次いでその卵を偽妊娠母体で育てることを含む。接合子は、同じ系統の雄および雌の動物を用いて、あるいは異なる系統の雄および雌の動物から得られる。生まれたトランスジェニック動物を、始祖(founder)とし、同じＤＮＡ挿入物を備えたさらなる動物を生むように育てる。トランスジェニック動物を生ずるこの方法では、非相同的組換えによって、新しいＤＮＡが概して不規則にゲノムにまとめる。ゲノムの一つの部位で１〜数千のＤＮＡのコピーがまとめてもよい。一般的に、ＤＮＡは前核の一つ、普通はより大きな雄の前核に注入される。接合子は同日に移入されるか、２細胞胚を形成するまでオーバーナイトで培養されて偽妊娠雌の卵管に移される。生まれた動物は、所望のまとめられたＤＮＡの存在が調べられる。偽妊娠雌とは、精管切除された雄とつがいにされた発情期の雌を指し、受精卵を含まないが胚を受けるには十分である。偽妊娠雌は、ＤＮＡを注入された胚または胚幹細胞の代理母体として、トランスジェニックマウスを作成するのに重要である。推定された始祖は、いくつかの方法でトランスジーンの存在を調べることができる。脳のＡＰＰタンパクおよびＲＮＡの発現は分析され、トランスジーンコピー数は、当業者に既知の方法で調べられる。脳のＡＰＰタンパクＲＮＡ発現、およびトランスジーンコピー数は、乳離れしたての子供（４−５週）で調べられる。プリオンタンパク遺伝子プロモーターは、乳離れしたての子供以上で本来的に活性であるため、乳離れした年齢を超えたらトランスジェニックＡＰＰＲＮＡ発現動物のレベルに変化はないと予想される。ＡＰＰレベルは、年齢を伴った発現レベルで一貫した変化があるか否かを調べるために観察することができる。トランスジェニック動物も、臨床的な変化を観察される。評価のための神経挙動疾患の例は、つがい反応が乏しいこと、動揺、新しい環境での調査行為の減少、不活発、発作および未熟死である。トランスジーンコピー数については、各構成からの全体の脳ＡＰＰの発現が内在性の生来の遺伝子の少なくとも２倍、好ましくは少なくとも２〜４倍を達成するのに十分なコピーが好ましい。この数は、発現されたＡＰＰの種類およびＡＰＰ遺伝子における特定の疾患関連変異に依存して、５コピーから６０コピー以上の範囲とすることができる。それゆえ、トランスジーンの十分なコピーは、進行性神経疾患を生じるレベルのＡＰＰを発現する数である。トランスジェニックマウスで観察された臨床的な変化は、発現されるＡＰＰ量の増加の結果であるというのが本発明の理論である。それ故、関連する脳構造における測定可能な生物化学的変化を伴った、観察される臨床および／または行動的症状を引き起こす特有のＡＰＰ遺伝子のある発現レベルを達成するのに、十分なＡＰＰ遺伝子のコピーが必要である。あまり望ましくないが、生物化学的な変化のみが得られる。十分なコピーとは、各構成物からの全体的な発現レベルが、内在性の本来の遺伝子の少なくとも２倍、好ましくは少なくとも２〜４倍であること、あるいは全体的なコピー数がこれに関連する増加を達成することを指す。ある場合には、遺伝子の２〜４のコピー、特に変異した疾患結合遺伝子は、ＡＰＰの所望の関連した増加を達成するのに十分かもしれないが、他の場合には、特に天然の遺伝子が用いられる場合には、より大量のコピー数が必要である。特にＡＰＰの変異がＡβ領域、あるいは遺伝子のＡβ領域の上流で発生するようなある場合には、少量のＡＰＰが進行性神経疾患を引き起こすのに効果的であるかもしれない。所望の結果を得るのに十分な特定の遺伝子のコピー数は、経験的に決定することができる。例えば、ＨｕＡＰＰ６９５．ＴＲＩｍｙｃの効果的な範囲のコピー数は、約２０〜７５であり、ＨｕＡＰＰ６９５．ＳＷＥでは約３０〜５０であり、かつＭｏＡＰＰ．ｗｇでは２５より大きい。始祖動物は、ＡＰＰ、変異もしくは天然のＡＰＰを過剰発現するトランスジェニック動物の安定な系統を生むために用いることができる。繁殖容易性については、雄の始祖マウスが好ましい。この動物は、臨床的に観察される。これらの動物における、トランスジーンのコピー数（複数のトランスジーン挿入部位を除外する）、ｍＲＮＡ発現、タンパク発現、神経病理学およびグルコースの取り込みの分析も行われる。これらの研究は、病気の開始年齢、病気の期間、表現型の浸透度、神経病理学的な５つの認識(neuropathologic 5 findings)の範囲、局所的な脳の機能不全、およびタンパク発現レベルの表現型の表現型の依存についての情報を提供する。これらの動物は、種に適切な神経挙動試験(neurobehavioral test)を用いて調べることもできる。例えば、マウスにおける運動／診査の挙動の研究は、神経心理学の評価の標準的な手段である（FileとWardill，(1975)Psychopharmacologia （Berl）44:53-59; Loggiら（1991）Pharmacol．Biochem．Behav．38: 817-822 ）。例えば、マウスでは、“コーナー指数(corner index)”（ＣＩ）が用いられる。これは、脳病理学の証拠に関して動物を調べるための、早くて簡単な神経挙動試験である。変異および野生型ＡＰＰを発現するトランスジェニックマウスにおけるＣＩも測定される。低いＣＩ（≦４）は、高い変異ＡＰＰトランスジーンコピー数、未熟死、および神経病理学的な認識に関連する。ＣＩは、トランスジェニックマウスの神経挙動徴候を評価することにおけるその使用妥当性を支持する、トランスジーンコピー数との投与に依存する関係を示す。動物の神経病理学も評価される。コルチコ辺縁領域におけるもの等のＡＤに影響されることが知られている脳の領域は、ＡＰＰ／Ａβ癒着、グリオーシス、およびグルコースの取り込みおよび利用における変化を含む変化に関して特に良く調べられる。種々の脳領域のイムノヒストロジック(immunohistologic)な研究が、トランスジーン産物を検出するために用いられる。受精した卵細胞または胚肝細胞の供給源として用いられる動物、“宿主動物” は、あらゆる動物とすることができるが、一般的に好ましい宿主動物は、数世代にわたる研究(multigenerational studies)に用いられる動物である。特に関心があるのは、ＦＶＢ系統のマウス、並びに（Ｃ５７Ｂ６）ｘ（ＳＪＬ．Ｆ１）ハイブリッドおよび（ＳｗｉｓｓＷｅｂｓｔｅｒ）ｘ（Ｃ５７Ｂ１６／ＤＢＡ− ｚ．Ｆ１）ハイブリッド等の商業的に利用できる系統を交配させたマウス等の、マウスを含むげっ歯類である。後者の親の系統も、Ｃ５７Ｂ１６／Ｄ２と称される。他の系統および交配系統の動物を、ＡＤ等の進行性神経疾患のモデルとして用いるための適性について、ここに記載された技術を用いて評価することができる。しかしながら、ある場合には、特に治療試験に関して、アカゲザル等の霊長類が宿主動物として望ましい。本発明の動物は、ＡＤの発達を防ぐと考えられている、ビタミンＥまたはラザロイド(lazaroids)等の酸化防止剤のような関心の物質のための試験動物として用いることもできる。動物を関心の物質で処理して、未処理の動物と比較した発生率の低下もしくは神経疾患の開始の遅延を、保護の指標として検出する。この動物は、アルツハイマー症を改善または治療すると考えられる関心物質の試験動物として用いることができる。神経疾患を有する動物を関心物質で処理して、神経疾患を有する未処理の動物と比較した、死の遅延、神経挙動、グリオーシスもしくはグルコースの取り込み／利用の改良を、改善または治療の指標として検出する。本発明の動物は、例えばアルツハイマー症を加速もしくは誘発すると考えられている酸化剤または頭部外傷等の物質または環境に曝して、アルツハイマー症を含む試験物質または環境の容量の指標である神経挙動の衰退、未熟死、グリオーシス、および減少したグルコースの取り込み／利用を調べることによって、その物質または環境を調べるために用いることができる。この方法は、さらに、アルツハイマー症を誘発すると考えられている物質または環境に動物を曝して、治療剤の効果を評価することによる治療剤の試験を含むことができる。トランスジェニック動物の慎重な特徴付けは、ＡＤの病原の解明を導くであろう。疾患を引き起こす変異ＡＰＰ代謝における一連の分子現象を研究することができる。またこれらの動物を、疾患の水平伝達(horizontal transmission of di sease)（Prusinerら（1987）Cell 63，673-86）、酸化およびフリーラジカルの生成（BlassとGibson（1991）Rev．Neurol（Paris）147: 513-525; Amesら（199 3）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90: 7915-7922）、炎症（McGeerら（1993）Can ．J．Neurol．Sci．18: 376-379，Rogersら（1992）Proc．Natl．Acad．Sci．US A 89: 10016-10020）；神経栄養因子の剥奪（Perry（1990）Alzheimer's Diseas e and Associated Disorders 4: 1-13; HeftiとSchneider，(1991)Clinical Neu ropharmacology 1: 62-76）；Koliatsoessら（1991）Ann．Neurol．30: 831-840 ）、アポリポタンパクＥ４代謝（strittmatterら，(1993)Proc．Natl．Acad．Sc i．U.S.A．90: 1977-1981）、並びにカリウムチャネル不全（Etcheberrigarayら（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90: 8209-8213）を含む、種々の提案された病因メカニズムを調べるために用いることもできる。このような知識は、神経疾患のよりよい形態の治療を導くであろう。本発明の他の特徴および利点は、好ましい実施態様の記載および請求の範囲から明白であろう。以下の例は、例証として与えられたものであって、限定ではない。実施例実施例１ＰｒＰ−ＨｕＡｐｐトランスジーン構造体ヒトＡＰＰコード配列を、ヒトｃＤＮＡから誘導し（Kang，et al.，(1987)Na ture，325，733; Goldgaber，et al.，(1987)Science，235，877; Tanzi，et al .，(1987)Science，235，880; Robakis，et al.，(1987)Proc.Nat.Acad.Sci.(US A)，84，4190参照）、図１に例示した。これは、Kitaguchi，et al.，(1988)Nat ure，331，530; Tanzi，et al.，(1988)Nature，331，528; 及びPonte，e t al.，(1988)Nature，331，525に記載されているような染色体２１に位置する遺伝子から誘導される３つのスプライシング形態で生ずる。図２は、本発明のトランスジェニック動物を産生するためにアミロイド前駆体タンパク質配列に組み込むことのできる３つの特徴を例示している。（１）ＯＸ領域を持つあるいは持たないＫｕｎｉｔｚプロテアーゼ阻害剤の存在下または不存在下で得られるスプライシング形態の変形例(variants)；（２）Goate，(1991)Nature，349，704; C hartier-Harlin，et al.，(1991)Nature，353，844; Murrell，et al.，(1991)S cience，254，97; Hendriks，et al.，(1992)Nature Genetics 1，218; 及びMul lan，et al.，(1992)Nature Genetics，1，345に記載されているようなアルツハイマー病を持つ属における疾患に結合した突然変異を含むアミロイド前駆体タンパク質変形例；（３）トランスジーン生成物の免疫検出に用いることができるが無い方が好ましいカルボキシル末端のｍｙｃ−ｔａｇ。 Scott，et al.，(1992)Protein Science，1，986に記載されたように、要求されるハムスターのプリオンタンパク質遺伝子機能は、ＳａｌＩ部位に隣接するテトラサイクリン−耐性(resistance)配列がプリオンタンパク質コード配列に置換されたハムスタープリオンタンパク質のコスミドベクターによって与えられる。ハムスタープリオンタンパク質コスミドベクターを、図３に例示した。プリオンタンパク質遺伝子の３’−非翻訳領域におけるＤＮＡの１．６ＫＢの領域が、このコスミドから生成されるトランスジーンの検出用の有効なプローブであることが示された。ＡＰＰ配列とコスミドは、図４及び５に示した２つの融合遺伝子構造体を構成するために用いられた。このＡＰＰ配列は、略号ＣＳ１及びＣＳ２で示す強い翻訳開始するように修飾されている。この構造体は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び２組のプライマーを用いて作製されたＤＮＡ配列のＡＰＰコード配列の５’末端において、ＳａｌＩからＫｐｎＩのＤな配列を置換することによって作製された。図６に示したＣＳＩＡＰＰ配列では、用いたプライマー組は５’−ＡＡＧＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＧＧＴＴＴＧＧＣＡＣＴ−３’、及び、５’−ＡＡＧＧＴＡＣＣＴＣＣＣＡＧＣＧＣＣＣＧＡＧＣＣ−３’であり、図７に示したＣＳ２ＡＰＰでは、５’−ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＣＣＧＧＴＴＴＧＧＣＡＣＴ−３’及び、５’−ＡＡＧＧＴＡＣＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＣＧＡＧＣＣ−３’である。手法は、Maniatis，et al.，(1982)Molecular Cloning: A Laboratory Manual （Cold Spring Harbor Laboratory）に記載されている従来技術であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Saiki，et al.，(1988)Science，239，487に記載されている。図１から７に示した制限部位は、ＳａｌＩ（Ｓ）、ＫｐｎＩ（Ｋ）、ＢｇｌＩＩ（Ｂ）、ＸｈｏＩ（Ｘ）及びＮｏｔＩ（Ｎ）である。動物中の融合構造体の検出に用いられるＰＣＲオリゴマーの位置を、図８にＡ及びＰで示した。融合体用に合成した各ＰＣＲフラグメントを続けて示した。構造体に用いるために選択されるＰＣＲフラグメントは、故意の突然変異を含まない。上記のＰｒＰ−ＡＰＰコスミドは、図３から５に示したｐｃｏｓ６ＥＭＢＬからのＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子に関連するＮｏｔＩで消化される。ＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子は、寒天ゲルでのサイズ分画及び電気溶離の後に単離した。このＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子を、フェノール／クロロホルム、クロロホルム、及び豚ノールの一連の有機抽出、及び、酢酸アンモニウム及びエタノールでの沈降によってさらに精製した。胚注入に先だって、ＰｒＰＡＰＰ融合遺伝子を、１０っＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）に、最終濃度３−４μｇ／ｍｌとなるように溶解した。実施例２ＰｒＰ−ＡＰＰトランスジーンを有するトランスジェニックマウスの製造（ＡＰＰ配列ＶＭ７１７／７２１／７２２ＩＡＶ各ＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子を受精したマウスの卵に別々に注入した（Hogan ，et al.，(1986)Manipulating the Mouse Embrio: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.，及びUSPN4,736,866参照）。胚ドナー及び受精用スタッド(stud)は、国立ガン機関（National Cancer Institute，ＮＩＨ）からの近交系ＦＶＢマウスである。その結果、ＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子の１から１２８のコピーが、出産予定日(term)まで発育したマウスのゲノムに組み込まれた。注入された卵は、Wagner，et al.，(1981)Proc．Natl．Acad．Sci.，U.S.A.， 7 8．5016に記載されているように疑似妊娠フォスター雌に移した。マウスは、１０時間の暗と１４時間の明のサイクルに保たれた好ましく調製された環境で飼育した。フォスター雌の卵は、出産予定日まで生育させた。実施例３ＶＶＭ７１７／７２１／７２２ＩＡＶトランスジェニックマウスの分析４週齢において、各ポップボーン(pup born)を、尾から取ったＤＮＡを用いたＰＣＲ反応で分析した。各場合において、尾ＤＮＡは、図８に示したプローブを用いたＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。分析用のＤＮＡは、Hanley and Merlie，(1991)Biotechniques，10，56に記載された方法によって尾から抽出した。図８に示したプライマーＡ及びＰを含む２５ＺｌＰＣＲ反応におけるトランスジーン特異的ＤＮＡフラグメントを増幅するために、１ｍｌの尾ＤＮＡ調製物（約１ｍｇのＤＮＡ）を用いた。ＰＣＲ反応は、１５のファウンダー(founder)マウスが注入されたＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子を保持していることを示した。これらの動物におけるＡＰＰ配列はＶＶＭ７１７／７２１／７２２ＩＡＶ突然変異及びｍｙｃ−ｔａｇを含むが、図２に示したようにＫＰＩ／ＯＸ領域を欠いていた。トランスジーンのコピー数を決定するために、指数的に希釈した変性ＤＮＡを、１．６キロベース（ＫＢ）の図３に示したようなハムスターＰｒＰ遺伝子の３’−非翻訳領域からの放射線ラベル下ＤＮＡセグメントでプローブした。最も高いトランスジーンコピー数（約１００以上）を持つファウンダーマウスの中で、２つのファウンダーマウスが成育せず、第３のファウンダーは子孫を生んだが生育しなかった。即ち１５のファウンダーマウスは、１２系統のトランスジェニックな子孫を生じた。ＡＰＰトランスジーンを持つトランスジェニックファウンダーの目録を表１１１に示す。ファウンダー動物は、非注入動物とかけ合わせ、得られた１２系統のトランスジェニック子孫のＤＮＡを分析した。この分析は、全ての場合において注入された遺伝子が生殖系統を通して伝達されたことを示した。６のファウンダー動物が＞２０のＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子のコピーをかくまった。これら６匹全てで、神経疾患が進行し、探求／運動挙動が次第に減退し、５ヶ月齢までに早死にするという特徴を持つ。それに対して、ＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子の＜２０のコピーをかくまう９のファウンダー動物は、初期５ヶ月齢以内に神経疾患が進行した。神経脱機能化は、常染色体優性形態で続く世代に移行した。新たに獲得されたＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子の組織内での発現は、ヒトＡβペプチドの最初の１７残基を生ずるモノクローナル抗体６Ｅ１０を用いたウェスタンブロット分析によって決定した（Kim，et al.，(1990)Neuroscience Research Communicating，7，113-122）。融合遺伝子生成物は、脳、脊髄、骨格筋、心臓、及び最小だが肺で検出された。肝臓、脾臓、腎臓、及び精巣では検出されなかった。ＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子の脳組織における発現は、イムノドットブロット(i mmunodot blot)分析で定量化した。脳組織における相対的ＡＰＰ発現は、指数的に希釈した一連のものに対して、ＡＰＰのカルボキシル末端の１５残基、ＣＴ１５を認識し、マウス及びヒトのＡＰＰを認識する抗体との反応（Sisodia，et al .，(1993)J．Neuroscience，13．3136-3142）を、トランスジェニックマウスと非トランスジェニックマウスとで比較した。神経疾患の進行した系統のマウスにおける全ＡＰＰタンパク質は、内因性レベルの少なくとも３００％であった。発現が３００％未満の場合、神経疾患は進行しなかった。処理したマウスにおける脳機能の指標を得るために、Chmielowska，et al.，( 1986)Exp．Brain Res.，63，607に記載され、マウスのグルコースの取り込み(up take)／代謝を測定するソコロッフ(Sokoloff)の方法の変形法を用いてグルコースの利用(utilizatin)を領域毎に決定した。デンシトメトリーでえ決定した領域ごとの２−デオキシグルコース濃度を、病原学を欠いている小脳について規格化した。トランスジェニックマウスにおける結果は、海馬、扁桃体及び大脳皮質の或る領域では、同じ齢の非トランスジェニックマウスに比較して、グルコース利用が２０−３０％減少していることがわかった。実施例４インビトロでの合成及び加工の分析培養細胞におけるＶＶＭ７１７／７２１／７２２ＩＡＶ突然変異体の合成及び加工を、これらの突然変異体の疾患進行に対する影響を決定することによって試験した。野生種ＨｕＡＰＰ６９５ｍｙｃ及び突然変異体ｃＤＮＡ遺伝子を、発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（大阪生化学工業(Osaka Bioscience Institute)、大阪、日本）にクローンし、マウスの神経芽腫細胞に一時的に移入し、次いで、［³⁵Ｓ］メチオニンで４時間連続的にラベルした。ラベルしたＡＰＰ分子を、モノクローナル抗体２２Ｃ１１（Weidemann，et al.，(1989)Cells，57，115-126）で免疫的沈殿させた。細胞の抽出液中で、適当なサイズのラベルしたＡＰＰ分子を類似のレベルで検出した。これらの培地からの媒質を、ｍＡｂ６Ｅ１０及びｍＡｂ４Ｇ８（Kim，et al.，(1990)上記）を用いて可溶性ＡＰＰフラグメントの存在を試験した。これら両方の抗体ともに、ヒトＡＰＰのＡβ領域を認識する。ｍＡｂ６Ｅ１０はＡβ１−１７間のＡσの配列を認識し、ｍＡｂ４Ｇ８はＡβ１ −２８間の配列を認識する。Ａβ１７−２８の配列はマウスＡβと同一であるので、４Ｇ８はヒトとマウスのＡＰＰを区別することができない。培地の媒質は、日常的に観察されるＡＰＰの大きなエクトドメイン(ectodomain)フラグメントを含む遺伝子のいずれかとともに移入する。ＡＰＰの加工に関連したさらに新しい発見の一つは、培養した細胞の媒質におけるＨｕＡＰＰを発現する可溶性Ａβ１−４０フラグメントの検出である。これらのＡβフラグメントは、ＡＤアミロイドプラーク傷害に見られるペプチドに類似している。よって、ＡＰＰは、通常はアミロイドゲン(amyloidogenic)フラグメントに加工されることがわかる。さらに、ＡＤに結びついた突然変異は、ＡＰＰの加工を可溶性Ａβの生成が好ましいように変えることがわかった。ＶＶＭ７１７／７２１／７２２ＩＡＶ突然変異体が、ＡＰＰ加工に影響を与えるか否かを決定するために、培養媒質を小さなＡβ含有ＡＰＰペプチドに対して試験した。ｍＡｂ６Ｅ１０で免疫的精製されたＡσペプチドフラグメントは、突然変異体を移入された細胞の媒質において優勢である。同様に、ｍＡｂ４Ｇ８は、突然変異体を含む培地の媒質におけるＡβペプチドレベルの増加を検出した。蓄積したＡＰＰフラグメントについての細胞抽出物の試験により、突然変異体を発現する細胞における抗ｍｙｃポリクローナル抗血清で免疫的精製した後に、１０ｋＤａＡＰＰペプチドフラグメントのレベルの増加が検出された（図５Ｃ、３行目）。突然変異ＨｕＡＰＰ６９５ｍｙｃで生成された突然変異体は、結果的なＡＰＰ生成物の加工に影響を与え、可溶性Ａβのレベルを増加させ、ＡＰＰの分子内Ｃ末端フラグメントを、Ａβ領域を含むのに十分な長さにする。よって、突然変異体ＡＰＰで生み出される動物の表現型は、突然変異ヒトＡＰＰ遺伝子を発現し、ＡＤのスウェーデン血族で見出された突然変異体をエンコードするヒトるいについて報告されたものに類似している。今日まで、Ｖ６４２ＩＡＤ結合性突然変異のみをエンコードするＨｕＡＰＰの発現の結果としてＡβの生成が増加することを報告した研究者はいない（Gold，et al.，(1993)Neuroscience，Ab stract，19，431，182.7）。しかし、この突然変異は、可溶性Ａβ誘導体の長さを変え、Ａβ１−４２にまでするように思われる。よって、ＶＶＭ７１７／７２１／７２２ＩＡＶ突然変異は、主に可溶性Ａβ生成のぞうかによって起こることがわかった。Ａβフィブリロゲネーシス(fibrillogenesis)についての研究により、Ａβペプチドが長いほどアミロイドゲン性が高くなることが示唆された。実施例５マウス細胞におけるヒト及びマウスＡＰＰの加工の比較マウスＡＰＰ６９５及びヒトＡβ配列を含むキメラＡＰＰトランスジーンを調製し、それらの加工を比較した。この実験の仮説として、マウスとヒトのＡＰＰはマウスにおいて異なる方法で加工されるとした。ヒト化したＭｏＡＰＰｃＤＮＡを構成するために、ＭｏＡＰＰ遺伝子をクローンしｃｏｓＳＨａＰｒＰ．５３５ベクターに適合するように突然変異させた。マウスｃＤＮＡは、逆トランスクリプターゼ−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴＰＣＲ）、５’及び３’末端にクローニング用のＸｈｏｌ部位を含むＰＣＲプライマーによって単離した。マウスｃＤＮＡの内部Ｘｈｏｌ部位を取り除くために、さらなるプライマーを導入した、このプライマーは、内部Ｘｈｏｌ部位をスパンし、Ｘｈｏｌを除くが正確なアミノ酸配列を保持する単一の塩基置換を含んでいる。さらにＰＣＲ生成物は、ＰＣＲにおいて望まない突然変異が生じないように配列されている。ＨｕＡＰＰのＡβ領域とＭｏＡＰＰとは、３つのアミノ酸残基で異なっており、トランスジーン生成物のアミロイドゲン能力に影響を与えることができる。マウスＡβ領域をヒト化するために、Ａβ領域を含むＨｕＡＰＰ遺伝子のセグメントをプライマーを用いたＰＣＲで増幅した。このプライマーは、ＨｕＡＰＰ６９５のコドン５９０にＢｇＩＩ部位を含むセンス(sense)プライマーと、コドン６２６におけるＮａｒＩ部位（）を生ずるがアミノ酸配列は維持する２点突然変異を含むアンチセンス(antisense)プライマー（図４、プライマー１及び２）を含む。このＰＣＲ生成物は、ＢｇＩＩＩ及びＮａｒＩで消化され、ＭｏＡＰＰｃＤＮＡのＢｇＩＩＩ及びＮａｒＩ部位にクローンされる。キメラ（Ｍｏ／ＨｕＡＰＰ）ｃＤＮＡは、ＢｇＩＩＩ及びＮａｒＩ部位を横切って配列し、この領域がヒトＡβを含み、他の望まない突然変異が生じないようにされている。この組み換えｃＤＮＡが全長さのタンパク質中に発現されることを確実にするために、ＤＮＡは修飾したｐＥＦＢＯＳべくたーにクローンされる。ｐＥＦ−ＢＯＳベクターは、プロモーター要素、第１のエクソン、第１のイントロン、及び、ベクターの複製及びＣＯＳ−１細胞における高い発現をさせる複製のＳＶ４０起源に沿った哺乳類の延長因子２αの第２のエクソンの一部を含んでいる。ＣＯＳ−１細胞はｐＥＦ−ＢＯＳＭｏＨｕＡＰＰ−６９５と移入され、細胞抽出物はイムノブロットで分析された。ＣＴ１５は全長のＭｏ／ＨｕＡＰＰポリペプチドで認識されたが、モノクローナル抗体６Ｅ１０での免疫染色により、ヒト化したマウスｃＤＮＡ生成物は、確かにヒトＡβ配列をエンコードすることが確認された。ＡＤ初期に関わる２つの突然変異をエンコードするキメラＭｏ／ＨｕＡＰＰｃＤＮＡを生成するために、上述したプライマー２及び３（表４）に示したものと類似のＰＣＲに基づく試みを採用した。反応のテンプレートは、Ｍｏ／ＨｕＡＰＰ−６９５のクローンしたコピーである。突然変異したキメラ遺伝子は、ＢｇｌＩＩ及びＮａｒＩ部位を横切って配列し、突然変異の存在を確実にし、他の望まない突然変異が存在しないようにされている。Ｍｏ／ＨｕＡＰＰｃＤＮＡ突然変異体は、ｐＥＦＢＯＳにクローンされＣＯＳ−１細胞に移入されて、ＡＰＰポリペプチドが合成されたか否かを決定した。予想されたサイズのＡＰＰポリペプチドは、ＣＴ１５及び６Ｅ１０の両方の抗体と反応した。マウスＮ２ａ細胞におけるＭｏ−、Ｈｕ−及びＭｏ／ＨｕＡＰＰの合成及び加工の試験は、驚嘆すべきことに識別できるほど異なっていた。ＭｏＡＰＰでは、ＨｕＡＰＰより大きな割合で開裂して可溶性エクトドメインフラグメントを生ずることが明らかになった。細胞結合性対可溶性ＭｏＡＰＰの比は、約１から５であり、ＨｕＡＰＰでは、細胞結合性が可溶性の３倍以上であった。ＭＯ／ＨｕＡＰＰ６９５での開裂して可溶性エクトフラグメントを生ずる割合は、Ｍｏ及びＨｕＡＰＰの間にあり、細胞結合性の可溶性Ｍｏ／ＨｕＡＰＰの比は１から１に近づいた。可溶性ＡＰＰエクトフラグメントの大多数は、細胞表面でのＡＤにおける開裂行為であり、細胞結合性ＡＰＰ対可溶性エクトフラグメントの非の相違は、ポリペプチドの突然変異の相違を示している。特に、ＭｏＡＰＰの大多数は細胞表面に到達し、セクレターゼ(secretase)によって開裂される。逆に、ＨｕＡＰＰは細胞表面には有効に達せず、セクレターゼ開列は不可能である。Ｍｏ／ＨｕＡＰＰポリペプチドは、ＭｏとＨｕＡＰＰとの中間にあることがわかった。また、Ａβドメインを含む配列はセクレターゼ開列の有効性に影響を与えることができる。可溶性ＡＰＰエクトフラグメントに生成の相違に加えて、可溶性あβペプチドのレベルの相違に注意すべきである。３つのタンパク質は全て可溶性Ａβペプチドを生じ、そのサイズ及び特徴はＡβ１−４０と同一である。ＭｏＡＰＰを移入した細胞では、Ａβ１７−４０と同一のサイズ及び特徴を持つフラグメントが検出された。Ａβ１７−４０フラグメントは、Ａβ１６と１７の間を開裂するアセクレターゼ(asecretase)によると推定されるＡＰＰ膜開裂に後に生ずると考えられる。Ｈｕ及びＭｏＨｕＡＰＰ誘導Ａβ１−４０ペプチドのみがｍＡｂ６Ｅ１０によって認識されると予想される。ＭｏＡＰＰは相対的に同量のＡβ１−４０及びＡβ１７−４０を生ずることがわかったが、ＨｕＡＰＰ及びＭｏ／ＨｕＡＰＰは、開裂してＡβ１−４０のみを好ましく生ずる。これらの結果は、ヒトＡβドメインにおける配列の相違がＡＰＰタンパク質分解開列に影響することを示唆している。実施例６通常の加齢マウス及びトランスジェニックマウスの比較トランスジーン構造ＰｒＰ−ＡＰＰトランスジーンは、実施例１に記載したように、ハムスターＰｒＰコスミドベクターにおけるＳａｌＩ隣接テトラサイクリン耐性配列（scott ， et al.，(1992)上記）を、ＳａｌＩ隣接ヒト及びマウスＡＰＰコード配列で置換することにより生成した。Ｔｇマウスは、６の異なるＰｒＰ／ＡＰＰキメラトランスジーン、即ち、突然変異野生種ＡＰＰ６９５（ＭｏＡＰＰ６９５．ＷＴ）、Ｍ６７０Ｎ及びＫ６７１Ｌに２つの突然変異を持つヒトＡＰＰ６９５（ＡＰＰ７７０付数）、（ＨｕＡＰＰ６９５．ＳＷＥ）、Ｍ６７０Ｎ及びＫ６７１Ｌに２つの突然変異を持つヒトＡＰＰ６９５（ＡＰＰ７７０付数）、（ＨｕＡＰＰ６９５．ＳＷＥ）、Ｅ６９３Ｑに突然変異を持つヒトＡＰＰ６９５（ＨｕＡＰＰ６９５．ＤＵＴ）、Ｍ６７０Ｎ及びＫ６７１Ｌを持つヒトＡＰＰ７７０（ＨｕＡＰＰ７７０．ＳＷＥ）、Ｖ７１７Ｉ、Ｖ７２１ＩＡ、及びＭ７２２Ｖに、３’−ｍｙｃｔａｇによる３つの突然変異を持つヒトＡＰＰ６９５（ＨｕＡＰＰ６９５．ＴＲＩｍｙｃ）、及び３’−ｍｙｃｔａｇを持つヒト野生種ＡＰＰ６９５（ＨｕＡＰＰ６９５．ＷＴｍｙｃ）の１つを用いて調製した。ＣＳ１ＨｕＡＰＰ６９５．ＳＷＥ、ＣＳ１ＨｕＡＰＰ７７０．ＳＷＥ．ＣＳ１ＨＵＡＰＰ６９５．ＴＲＩｍｙｃ、及びＣＳ２ＨｕＡＰＰ６９５．ＴＲｌｍｙｃのＡＰＰ配列は、強い翻訳開始のために修飾された。スウェーデン突然変異と同様に、ＡＰＰのトランスメンブランドメインにおけるＶ７１７１Ｉ、Ｖ７２１Ａ及びＭ７２２Ｖの３つの突然変異は、培養細胞において５倍Ａβ分泌を促進する。３’−ｍｙｃｔａｇ、ｃ−ｍｙｃプロト−オンコゲンの１２コドンは、培養細胞中で移入生成物の免疫検出を行うことがわかった（Wong and Cleveland，(1990)The Journal of Cell Biology，111，1987-2003 ）。Ｔｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＷＴｍｙｃ）及びＴｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＴＲＩｍｙｃ）マウスにおいて、ｍｙｃｔａｇはウェスタンブロットで明確に検出されず、ヒト特異的ＡＰＰ抗体と反応したＨｕＡＰＰとしての組織学的サンプルではない。Ｔｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＳＷＥ）、Ｔｇ（ＨｕＡＰＰ７７０．ＳＷＥ）及びＴｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＤＵＴ）マウスは同じ臨床的及び病理学的異常性を示すｍｙｃｔａｇの成長が無いので、ｍｙｃｔａｇは、表現型に明確な影響を及ぼさない。構造体は、ＡＰＰコード配列の５’末端におけるＳａｌＩからＫｐｎＩＤＮＡ配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と２組のプライマーを用いて作製したＤＮＡ配列で置換することによって作製した。ＣＳ１ＡＰＰ配列については、用いたプライマー組は、５’−ＡＡＧＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＧＧＴＴＴＧＧＣＡＣＴ−３’及び５’−ＡＡＧＧＴＡＣＣＴＣＣＣＡＧＣＧＣＣＣＧＡＧＣＣ−３’である。ＣＳ２ＡＰＰ配列については、用いたプライマー組は、５’−ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＣＣＧＧＴＴＴＧＧＣＡＣＴ−３’及び５’−ＡＡＧＧＴＡＣＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＣＧＡＧっＣ−３ ’である。ＨｕＡＰＰ突然変異体は、標準的な部位特定突然転移誘発を用いて作製した。構造体用に合成した各ＰＣＲフラグメントを配列した。構造体で用いるために選択されるＰＣＲフラグメントは、望まない突然変異を含まない。ＰｒＰ −ＡＰＰコスミドは、ＮｏｒＩ（これは、ｐｃｏｓ６ＥＭＢＬベクターからのＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子に関連する）で消化した。ＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子は、寒天ゲルでのサイズ分固及び電気溶離の後に単離した。ＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子は、有機溶媒でさらに精製し、酢酸アンモニウム及びエタノール中で沈殿させた。ＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子は、胚注入に先立って、１０ｍＭのＴｒｉｓ− Ｃｌ（ｐＨ８．０）に最終濃度が３−４μｇ／ｍｌとなるように溶解させた。１５０３：５’−ＣＴＧＡＣＣＡＣＴＣＧＡＣＣＧＧＴＴＣＴＧＧＧＴ−３’及び１５０２：５’−ＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＣＣＴＡＧＡＣＣＡ−３’は、ＡＰＰの３’領域及びＰｒＰの３’−非翻訳領域に各々位置している。１５０３プライマーは、マウスとヒトのＡＰＰとで同一の領域を認識し、従ってＰｒＰ−ＭｏＡＰＰ及びＰｒＰ−ＨｕＡＰＰの両方のＤＮＡの検出に用いられる。プライマー１５０２及び１５０１：５’−ＡＡＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＧＧＡＡＣＡ−３’を用いて、正の対照として、突然変異ＰｒＰのフラグメントを増幅する平行ＰＣＲ反応を行うことができる。トランスジーンのコピー数分析は、ニトロセルロース上にベークした５μｇの精製した変性尾ＤＮＡを用いて行い、放射線ラベルした１．３ｋｂのＳａｌＩ− ＸｈｏＩＤＮＡフラグメントにハイブリダイズしたが、このフラグメントは、実施例１で示したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と２組のプライマーを用いて作製したＤＮＡ配列のＡＰＰコード配列の５’末端のＤＮＡ配列に位置するハムスターＰｒＰ３’−非翻訳領域のセグメントをエンコードする。ＨｕＡＰＰ突然変異体は、標準的な部位特定突然変異誘導を用いて作製した。構造体用に合成した各ＰＣＲフラグメントを配列した。構造体で用いるために選択されるＰＣＲフラグメントは、望まない突然変異を含まない。ＰｒＰ−ＡＰＰコスミドは、ＮｏｒＩで消化し、ＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子は、寒天ゲルでのサイズ分画及び電気溶離の後に単離した。ＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子は、実施例１で示したようにさらに精製した。ＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子は、胚注入に先立って、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）に最終濃度が３−４μｇ／ｍｌとなるように溶解させた。トランスジェニックマウス生成のスクリーニングトランスジェニック系列は、（Hogan，et al.，(1986)上記）に記載されているように、単一細胞マウス胚のマイクロインジェクションで開始した。胚ドナーと受精スタッドは国立ガン機関から得たＦＶＢマウスに近交させた。離乳後の尾生検ＤＮＡを、（Hanley and Merlie，(1991)Biotechniques，10，56）に記載されているように生成した。１マイクロリットルの未精製ＤＮＡを２５μｌのＰＣＲ反応に用いた。ＰｒＰ−ＡＰＰ融合ＤＮＡを検出するために、ＰｒＰ−ＡＰＰ融合ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応と１対のオリゴマープライマーを用いて増幅した。１５０３：５’−ＣＴＧＡＣＣＡＣＴＣＧＡＣＣＧＧＴＴＣＴＧＧＧＴ− ３’及び１５０２：５’−ＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＣＣＴＡＧＡＣＣＡ−３’は、ＡＰＰの３’領域及びＰｒＰの３’−非翻訳領域に各々位置している。１５０３プライマーは、マウスとヒトのＡＰＰとで同一の領域を認識し、従ってＰｒＰ−ＭｏＡＰＰ及びＰｒＰ−ＨｕＡＰＰの両方のＤＮＡの検出に用いられる。プライマー１５０２及び１５０１：５’−ＡＡＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＧＧＡＡＣＡ−３’を用いて、正の対照として、突然変異ＰｒＰのフラグメントを増幅する平行ＰＣＲ反応を行うことができる。トランスジーンのコピー数分析は、ニトロセルロース上にベークした５μｇの精製した変性尾ＤＮＡを用いて行い、放射線ラベルした１．３ｋｂのＳａｌＩ− ＸｈｏＩＤＮＡフラグメントにハイブリダイズしたが、このフラグメントは、ハムスターＰｒＰコスミドベクター（Scott，et al.，(1992)上記）に位置するハムスター３’−非翻訳領域のセグメントをエンコードする。２回の強力な洗浄と感放射線フィルムへの露光の後、トランスジェニックマウスとハムスターのゲノムＤＮＡの相対的信号強度を、ホスホリマガー(phosphorimager)を用いて比較し、二倍体ハムスターゲノムＤＮＡに対するトランスジーンコピー数を得た。トランスジーン発現の分析ＡＰＰトランスジーン生成物の発現を、１から４ヶ月齢で犠牲にしたトランスジェニックファウンダーのプロゲニー(progeny)で試験した。脳ホモジネートからの抽出物の定量的イムノブロットを行い、平行して齢を合わせた非トランスジェニックマウスから調製した抽出物でもおこなった。脳組織の２０％（ｗ／ｖ）ホモジネートを、手持ちポリトロン(Polytron)を用いて、ＴＮＥ（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ及び２％ＰＭＳＦ）バッファー中に調製した。ホモジネートを等量のＴＮＥ１％ん４０、１％デオキシコレート、０．４％ＳＤＳで希釈し、超音波バスで粘性が無くなるまで超音波処理した。次いでホモジネートを１０分間煮沸し、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄みを等量の２Ｘサンプルバッファー（Laemmli，(1979)Nature，227，680- 685）と混合し、２分間煮沸し、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分固した。タンパク質を電気泳動でイムノブリオン膜（Pierce）に移動させ、ポリクローナル（ＣＴ１５及び抗ＧＩＤ）及びモノクローナル（２２Ｃ１１及び６Ｅ１０）ＡＰＰ抗体とインキュベートした。反応性ラビットポリクローナル抗体を可視化し、次いでマウスＩｇＧに対する第２のラビット抗体とインキュベートしてから¹²⁵Ｉ −タンパク質Ａとインキュベートした。放射線強度をホスホリマガー（Molecula rDynamics，Inc.）で定量化した。脳組織でのＡＰＰ発現を、異なるトランスジーンコピー数を持つＴｇマウスで、ＭｏＡＰＰとＨｕＡＰＰの両方を認識する３つの抗体を持つＴｇ系統でのイムノブロットの定量化により測定した、ＣＴ１５（図１１）、抗−ＧＩＤ（図１１）、及び２２Ｃ１１（図１１）。ＣＴ１５（Si sodia，et al.，(1993)J．Neurosciｅnce，13，3136-3142，Borchelt，et al.， (1994)J．Biol．Chem，269，14711-14714）；抗ＧＩＤ（Cole，et al.，(1989)B rain Res．Reviews，13，325-349）；及び２２Ｃ１１（Weidemann，et al.， (1989)Cell，57，115-126）は、マウス及びヒトの両方のＡＰＰを同等に認識するが、２２Ｃ１１はＡＰＰに密接に関連したＡＰＬＰ２にも同じ結合力で結合する（Slunt，et al.，(1994)J．Biol．Chem 269，2637-2644）。異なる抗体について得られるＭｏＡＰＰに比べて小さなＨｕＡＰＰレベルの変化は、抗体結合の結合力の相違、及び野生種と変形ＨｕＡＰＰ間の翻訳後加工の違いを反映している。トランスジェニック脳ＡＰＰタンパク質発現は、コピー数及び発現されたＡＰＰの種にも依存している（図１２）。ＨｕＡＰＰに比較して、同等なレベルのＭｏＡＰＰは、より少ないトランスジーンコピー数で得られる。ＨｕＡＰＰのレベルを特異的に測定するために、脳ホモジネートを、ヒトＡβ の１−１７残基に対して生成した６Ｅ１０抗体でプローブした（Kim，et al.，( 1990)Neuroscience Res．Comm.，7，113-122）。非−Ｔｇマウスでは、反応性− １００−１２５ｋＤのＡＰＰは検出されなかった。Ｔｇ１１３０マウスでは、６Ｅ１０を用いてイムノブロットにおけるＨｕＡＰＰの最も高いレベルが、脳及び脊髄において検出され、骨格筋、心臓、皮膚及び肺ではかなり低いレベル（脳レベルの＜５％）が見られた。ＨｕＡＰＰは、胸腺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、及び小腸ではほとんどまたは全く検出されなかった。６Ｅ１０及び８Ｅ５抗体（Athena Neurosciences）を用いたヒトＡＰＰ／Ａβ の特異的免疫染色では、脳全体にＨｕＡＰＰが見られた。８Ｅ５は、４４４−５９２残基（ＡＰＰ６９５付数）に渡るＡＰＰセグメントを認識する。ＨｕＡＰＰを過剰発現するＴｇ系統からの脳組織におけるＡＰＰ免疫反応性を促進するために２つの方法を用いた。高いコピー数の系統では、６Ｅ１０の１：５０００希釈液を用いた組織の犠酸前処理、または、１：１００の６Ｅ１０抗体あるいは１：１００の８Ｅ５抗体を用いた組織のマイクロ波前処理に従い、ＡＰＰ染色は、海馬、パラヒポカンパル(parahippocampal)領域、扁桃、及び小脳皮質の大ピラミッド細胞のベシクル構造に見られた（図１３Ａ、Ｃ、Ｈ）。脳のコルチコ辺縁領域の小さなニューロン、及び基本神経節、脳幹、及び小脳の大小のニューロンにおいて、かすかな免疫反応性が見られる脳もあった。染色は、非−Ｔｇマウスでは行わず（図１３Ｂ、Ｈ）、影響されたＴｇマウスからの未処理脳組織に行った。得られたＨｕＡＰＰ免疫染色のパターンは、終脳において高いレベルで発現する脳に広範に広がったＨｕＡＰＰの発現を反映している。これは別の６Ｅ１０を用いた領域的イムノブロットでも確認された（図１１）。８Ｅ５抗体は、ＡＤ患者からのマイクロ波処理した組織部分のアミロイドプラーク及びベシクル構造を染色した（図１３Ｆ）。１：５０００希釈液で、６Ｅ１９抗体はＡＤ患者からのアミロイドプラークを、脳組織の犠酸前処理の後にのみ染色した（図１３Ｄ、Ｅ）。しかし、ＴｇＨｕＡＰＰマウスでは、脳組織をマイクロ波または犠酸で前処理しても、いずれかの抗体を用いた細胞外アミロイドまたはプレアミロイド(pre-amyloid)沈着(deposit)に類似したＨｕＡＰＰ染色しないことが明らかになった。従って、これらのＴｇマウスにおける異常な表現型はアミロイドまたはプレアミロイド沈着では起こらない。突然変異及び野生種ＡＰＰトランスジーンの、ＣＮＳ疾患に対する影響を相対的に評価するため、野生種ＨｕＡＰＰ、突然変異ＡＰＰ、または野生種ＭｏＡＰＰの異なるレベルで発現する系統において、１００及び２００日での疾患及び死亡の割合を決定した（表５）。これらのデータは、ＡＰＰ発現と異常な表現型に進行との直接的な関係を示している（図１５）。野生種ＨｕＡＰＰと突然変異ＨｕＡＰＰを発現するＴｇマウスの比較は、ＡＰＰ発現の全ての範囲に渡っては不可能であった。しかし、突然変異ＨｕＡＰＰ（ＴｇＡＰＰ６９５．ＴＲＩｍｙｃ）１１４０及び（ＴｇＨｕＡＰＰ．ＴＲＩｍｙｃ）１１３０が、野生種ＭｏＡＰＰ（ＴｇＭｏＡＰＰ．ＷＴ）の約３倍の発現するＴｇマウスに比較して約２から４倍であることから、突然変異ＨｕＡＰＰが容易に異常な表現型を引き起こすことが示された。この結果は、異常な表現型が非特異的Ｔｇタンパク質の過剰発現によるということに反するものである。なぜならば、突然変異ＨｕＡＰＰが野生種ＭｏＡＰＰより高い浸透性をもつ疾患を持ち、これは発現するＴｇタンパク質種の特異的効果を示しているからである。データは、滴定曲線として示したが（図１５）、ＡＰＰ発現と異常な表現型との直接的関係を表している。しかし、突然変異ＡＰＰを発現するＴｇマウスについての野生種ＡＰＰに比較して左に寄った曲線は、突然変異ＡＰＰの発現が、より容易に異常な表現型を引き起こすことを示している。外来（ヒト）種のタンパク質の過剰発現は、人工的に以上表現型を生じず、ＭｏＡＰＰを過剰発現するＴｇマウスが生成された。内因性ＡＰＰレベルの３．１倍のＭｏＡＰＰレベルを持つマウスにおいて同じ表現型が生じた。このことは、観察された表現型が外来種のタンパク質の過剰発現によるものでないことを示している。行動分析ＦＶＢマウスが自然に齢をとるに従って不均衡（不対）の行動をとるようになる（マウスにおけるヒトでいう老人性痴呆症）か否かを決定するために、ＦＶＢマウスを１年間観察し、これらの加齢マウスをトランスジェニックマウスと比較した。行動分析は、通常は週に３回のコーナー・インデックス(Corner Index)（ＣＩ）試験で行った。この試験は、多くの罹患（影響）されたＴｇマウスにおいて起こる新奇恐怖反応を利用する。新奇恐怖反応は、新奇な容器での試験に特異的な診断活性において疾患を証拠立てるものである。臨床過程の初期では、影響マウスは、自分の籠の中ではしばしば通常の行動をとるが、きれいな籠の中でに入れて３０から６０秒後に一時的に動かなくなる。これは、非影響マウスが新奇な環境を利用しかぎまわるのと対照的である。影響マウスの特徴的反応は、、一時的な不動状態の間、首を低くして尾を硬直させることである。また、影響マウスは角まで走り、うずくまったり、かたまった姿勢をとるふりをする。ＣＩ試験は、マウスをきれいな籠に１匹で入れたときから３０秒の間に、角をかぎまわる回数を測定する。１００以上のＴｇマウスについて２０００回以上、１４０以上の非Ｔｇマウスについて２５００回以上の観察結果を収集し、３回の連続試験で起こる２つの”０”または”０及び１”のスコアをつける行動的疾患の存在に関する基準を確立した。疾患の罹患は、異常なスコアが得られた最初の３回連続試験の日付とした。コーナー・インデックス試験を実施するために、試験マウスの尾を持って、自分の籠以外のきれいな籠の真ん中に位置させた。その籠に入れてから３０秒の間に試験籠の角をかぎまわる回数をＣＩとして記録した。ＣＩ基準に達する前に死にかかった動物、及び目に見える痙攣を発した動物は疾患と診断した。１匹で生育したＴｇ及ぶ非Ｔｇマウスには、影響Ｔｇ動物のかたまった姿勢の特徴を示さずに低いスコアしか得られないものがあったので、１匹で生育したマウスは分析から除いた。これらのマウスを他のマウスとともに飼育すると、ＣＩスコアは上昇した。毎日の活性の変化を調整するため、全ての動物は１４３０から１８３０時間試験した。ＦＶＢマウスにおける加齢に関連したＣＮＳ疾患行動異常性ＦＶＢマウスの寿命は約６００日だが、ＦＶＢマウスにおける加齢に関連したＣＮＳ疾患はほとんど知られていない。ＦＶＢマウスが齢に従って自然に行動的不対（不均衡）を示すことを確認するために、３カ所の機関（ミネソタ大学（ミネアポリス）、McLaughlin Research Institute，Great Falls，MT、及び、Harl an Spague Dawley，Inc．Indianapolis，IN）からの１５０−５００日齢の１１０のＦＶＢマウスを観察した。齢が進むにつれて、たかだか１５４日齢の１８のマウスが、行動的不対を表した。これは、興奮、活動低下、痙攣、及びコーナー・インデックス試験で定義した新奇恐怖症、及び早死を含む（表６）。他の６のマウスは、腫瘍または事故で死亡した。興奮及び活動低下はすべての影響マウスで生じたが、これらは、ほとんどの通常マウスで見られない客観的サインである。疾患の開始（罹患）は、ＣＩ試験とともに、痙攣、興奮または無関心の観察によって決定した。雄と雌のマウスの両方が影響された。３匹の興奮したマウスがＣＩ基準による診断以前に死亡した。１匹は、痙攣の観察の直後に死亡した。残ったマウスは、活動が次第に低下したが、異常な行動サインの開始後９から９１日に病原学的研究のために犠牲にした。このＦＶＢマウスの仲間の行動異常性及び死亡（事故及び腫瘍関連の死亡を除く）の累積的発生率は、５００日齢で２３％であった（図９参照）。グリオーシス：９から１２ヶ月齢の１６匹の老非Ｔｇマウス、７匹の影響Ｔｇマウスの異常行動特徴を示すマウス、及び９匹の齢を合わせた通常行動をとるマウスからの脳をコード形状で試験した。行動異常マウスからの７の脳のうち６は、海馬、パラヒポカンパル領域、扁桃、及び小脳皮質において、深い肥大星状細胞グリオーシスを表した（図１０）。９匹の齢を合わせた通常行動をとるマウスは、この程度のグリオーシスを表さなかったが、同じマウスに海馬に限られた中位のグリオーシスが観察された。これらの発見は、影響老非Ｔｇマウスにおける行動的疾患が、コルチコ辺縁グリオーシスに密接に関連していることを示している（Yates-corrected X²=8.96，p=0.003）。非Ｔｇ行動不対ＦＶＢマウスの脳は、アミロイドプラーク沈着、神経繊維もつれの形成、ニューロン異常性、またはニューロン及びグリア細胞の量的変化が見られなかった。領域的−脳グルコース利用：不対ＦＶＢマウスで観察される異常挙動の独立した機能的評価を得るために、Sokoloff（Sokoloff，et al.，(1977)J．Neurochem ，28，897-916）の方法を変形して領域的脳グルコース利用を決定した。学習、記憶、及び感情に関連する領域である海馬、エントーヒナル(entorhinal)皮質、及び扁桃は、認識的に不対の老齢のヒト及びＡＤ患者においてほとんど不対であるが、これらを試験した。小脳は臨床及び病原学に含まれていないので、¹⁴Ｃ− デオキシグルコース分布のデンシトメトリー値を小脳の値に規格化した。不対ＦＶＢマウスにおける脳組織の領域的脳グルコース利用は、通常行動をとる齢を合わせたＦＶＢマウスのものと比較した。不対ＦＶＢマウスの脳組織において、特に海馬（−４２％）、扁桃（−４３％）、エントーヒナル皮質（−４６％）、壁皮質（−３４％）、前方皮質（−１９％）側頭皮質（−１８％）において、領域的グルコース利用の有意な減少が観察された。逆に、脳梁縁小体、髄質網状形成、歯状核及び虫部を含むいくつかの構造体では有意な減少が見られなかった。ＦＶＢマウスにおける特に大脳のコルチコ辺縁肥大性グリオーシス及び領域的脳グルコース利用の減少を伴う不対行動の進行は、辺縁及びコルチコ構造における肥大性グリオーシス及び領域的グルコース利用の減少といった他の齧歯類で観察される老齢変化の特徴を持つ特徴的な齢関連ＣＮＳ疾患を決定する。不対ＦＶＢマウスで観察される齢関連行動異常は、他の齧歯類では自然に起こらないが、学習、記憶、感情が含まれるコルチコ辺縁領域に見られる領域的グルコース利用の主な減少は、影響ＦＶＢマウスにおける行動異常がこれらの脳領域に非活性化を反映していることを強く示唆している。これらのマウスで見られる行動的、病原学的及び機能的異常性は、他の老齢の不対齧歯類及び老衰したヒトで見られる特徴を占め、発見の組合せはＦＶＢマウスにおけるＣＮＳ老化の形態を示している。突然変異及び野生種ＡＰＰを発現するトランスジェニックマウス行動異常性：老齢の不対ＦＶＢマウスに類似した異常な表現型が、高いレベルでＡＰＰを発現する動物で発達した。コピー数そのものはＣＮＳ疾患の直接的原因では内容に思える。なぜならば、ハムスターＰｒＰ遺伝子コスミドの３０−５０コピーによって誘導されたヒトＰｒＰを発現するＦＶＢマウスで発育したＴｇマウス、Ｔｇ（ＨｕＡＰＰ）ＦＶＢ−１５２は、早期行動異常や死亡を示さなかった（Telling，et al.，(1994)Proc．Natl．Acad．Sci.，U.S.A．91，9936-994 0）。ＴｇＡＰＰマウスにおける表現型を、種、ゲノタイプ(genotype)及びあっＰ発現によって４つの系統に分け、およそのコピー数（２０−３０）で発育させた：Ｔｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＷＹｍｙｃ）４６６、Ｔｇ（ＭｏＡＰＰ６９５．ＷＴｍｙｃ）６２０９。ＰｒＰレベルが、定数外のＰｒＰ遺伝子成分の存在で影響されるか否かを決定するために、脳ＰｒＰレベルを、７４トランスジーンコピーを持つＴｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．．ＴＲＩｍｙｃ）１１３０マウス及び非Ｔｇマウスで測定した。相違は見られず、ＰｒＰ発現の変化も異常表現型の原因ではないことが示された。影響動物では、興奮、驚嘆反応、無関心、及び新奇恐怖症を含む加齢の不対非ＴｇＦＶＢマウスで見られる全ての臨床的サインが進むが（表６）、それらはかなり高い浸透性(penetrance)で起こる（図９、表５）。後に、活動低下及び再現不能が進行するが、尾または足を挟むことに対する禁断及び発生反応から判断される震え、インコーディネーション、弱化、麻痺、または感覚喪失は無かった。痙攣は、影響Ｔｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＴＲＩｍｙｃ）マウスの少ない割合（３％（６／１８１））しか見られなかった。実際に起こった痙攣は多いが、週に３回の３０−６０秒より多く観察されるならば検出することができるであろう。Ｔｇマウスにおける行動異常は、早ければ１ヶ月齢で進行する。雄と雌のマウスでの行動異常の開始に相違はない。ＡＰＰを過剰発現するＴｇマウスには、前もって痙攣や新奇恐怖症を表すことなく１ヶ月齢程度で死亡するものもある（１４％）。これらのマウスのうちの２種の神経病原学的試験により、特徴的な行動サインを示した後に死亡したＴｇマウスから識別可能なコルチコ辺縁グリオーシスが一致したので、これらのマウスが他の影響Ｔｇマウスと同じ疾患によって死亡したものと思われる。内因性レベルの２倍を越えるＡＰＰレベルのトランスジェニック脳を持つ動物で、小さな発達が観察された（表５）。このサイズの相違は、誕生時には見られないが、４から６週齢で顕著になり、老齢動物では小さく又は無くなる。現れるＴｇ動物は、通常に比例する。Ｔｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＴＲＩｍｙｃ）マウスは、通常のサイズでも早死にし行動異常を来すので、１１１８小さなサイズは行動異常を起こすためには必要ない。トランスジェニックマウスの病理学的分析行動異常性を示すトランスジェニックマウスと、死亡した及び齢を合わせたマウスの脳の神経病理学的異常性を試験した。脳は、パラフィン上の１０％のリン酸緩衝ホルマリンまたは４％の緩衝パラホルムアルデヒド中で浸漬固定または灌流し、回転ミクロトームで５−８μｍの切片に切断した。組織片はヘマトキシリン及びエオシン、クレシルバイオレット、チオフラビンＳ、またはコンゴレッド染料で、またはビエルショウスキー・シルバー(Bielchowsky silver)またはＴＵＮＥＬ（Garvreli，et al.，(1992)Journal of Cell Biology，119，493-501）法を用いて染色した。免疫組織学的研究のために、パラフィン切片からパラフィンを除き、キシロール及び精製アルコールを通して再加水した。内因性ペルオキシダーゼを、メタノール中の６％過酸化水素で１０分間処理するか、メタノール（１：５）中の３％過酸化水素で処理してクエンチ(quench)し、脱塩水またはリン酸緩衝水で洗浄した。ＡＰＰ抗原の検出を促進するために、選択した切片を水中で１５分間最大出力でマイクロ波処理し、室温に冷却した。０．５ＭのＴＢＳ（ｐＨ７．６）を含む脱塩水に移し、０．４％ＴＸ／ＴＢＳ、次いでＴＢＳ中の３％通常ヤギ血清で前処理した。主要な抗体６Ｅ１０（１：１００）及び８Ｅ５（１：１００腹水液）は、２％の通常ヤギ血清を含む０．１％ＴＸ／ＴＢＳ中で調製した。２４時間のインキュベーションの後、スライドを洗浄し、０．１％ＴＸ／ＴＢＳ中のヤギ−抗ウサギまたは抗マウスＩｇＧ（１：２０）中でインキュベートし、ＴＢＳで洗浄してから、ウサギまたはマウスペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ（１：１００）中、室温で１時間インキュベートした。洗浄したスライドを０．０１％過酸化水素中の０．０５％ジアミノベンジジン存在下で反応させ、ＴＢＳで３回洗浄し、一連の精製アルコールからキシレンを通して脱水した。特徴部分は、Fontana-Masson法（Masson（1928）Am．J．Path．H，181-211）に従って銀−強化(silver-enhance)し、透過光顕微鏡及び微分干渉顕微鏡で観察した。他の切片は７０％犠酸に１０分間浸漬し、リン酸緩衝食塩水で洗浄し、１０％の通常ウマ血清に１時間浸漬した。主要な抗体６Ｅ１０（１：５０００）をリン酸緩衝食塩水中に調製した。４℃で終夜インキュベートした後、切片をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、抗マウスＩｇＧ、次いでアビジン−ビオチン錯体（Vector Labs ，Inc）でインキュベートした。洗浄したスライドをジアミノベンジジンと反応させ、Harris ヘマトキシンでカウンター染色した。リン酸緩衝食塩水中、１：６０の希釈液において、ＧＦＡＰに対するモノクローナル抗体を用いてＧＦＡＰを検出した。グリオーシス：コードした試料、ＨｕＡＰＰ類、オランダＨｕＡＰＰ類、スウェーデンＨｕＡＰＰ類野生種ＨｕＡＰＰを発現する２１の影響Ｔｇマウスからの脳、及び、１２の齢を合わせた非影響非Ｔｇマウスを用いて試験した。１６の影響Ｔｇマウスからの脳は、主にパラヒポカンパル領域、海馬、扁桃及び大脳皮質に位置する、比較的広がった基本神経節を持つ顕著な肥大性星状細胞グリオーシスが見られた（図１０）。グリア繊維酸タンパク質（ＧＦＡＰ）を免疫染色したときは星状細胞が拡大し延長するが、星状細胞の数の増加は無かった。齢を合わせた非Ｔｇマウスは反応性グリオーシスが無く、グリオーシスと異常行動の強い相関を示している（Yates-corrected X²=14.83，P=0.00012）。ベイルショウスキー銀染色により、神経繊維のもつれ、ジストロフィー神経炎、ニューロンプラークが無かった。ニューロンは、Ｎｉｓｓ１及びヘマトキシリン及びエオシン染色で正常であった。死亡が見られた６匹のＴｇマウスの粗いまたは顕微鏡による試験により、特徴的な脳病理学が明らかになった（以下に示すような海馬、大脳皮質、扁桃及びパラヒポカンパル領域での星状細胞グリオーシス）。しかし、ＣＮＳ以外の顕微鏡又は粗い病理はわからなかった。これらのＴｇマウスのうち４匹で、扁桃は、心臓、肺、肝臓、脾臓、胸腺、肝臓、小腸及び精巣においてチオフラビンＳ染色によって特異的に除かれる。ＣＮＳ以外の病理学的発見が無いことは、死亡が神経起源の原因によることを示している。領域的脳グルコース利用影響Ｔｇマウスの脳において機能的な相違が存在することを決定するために、領域的脳グルコース利用を、影響Ｔｇマウス、不対非ＴｇＦＶＢマウス、及び齢を合わせた非Ｔｇマウス間で比較した。正常、非Ｔｇマウスと比較すると、Ｔｇマウスの、海馬（−３１％）、扁桃（−２８％）、壁皮質（−３４％）、側頭皮質（−３３％）、及びオクシパル(occipital)皮質（−３６％）を含む多くの前脳領域でグルコース利用のかなりの減少（p<0.05;変数分析）が見られた。逆に、感覚-運動皮質、脳梁縁小体、網状形成、虫部、前庭複合体、及び歯状核を含む多くの領域では、減少が見られなかった（p>0.05）。領域的グルコース利用の低減は、影響Ｔｇマウスの海馬、扁桃友びいくつかのコルチコ辺縁領域で顕著であり、老化した不対非ＴｇＦＶＢマウスに極めて類似していた。Ｔｇマウスにおける細胞外Ａβ染色 Seido，et al.，JBC 269(21): 15253-15257，1994に記載された抗体で細胞外染色される動物がある。この抗体はＡβのアミノ末端を選択的に染色する。これはアフィニティ精製したポリクローナル抗体である。我々のＴｇマウスにおける染色は、Ａβフラグメントへの特異的競合によって阻害しうる。我々のＴｇマウスの染色パターンは、同じ抗体で染色したＡＤ脳に類似している。さらなる動物を試験した。他の抗体のさらなる特徴付けを行った。構造を越えた試験も行った。実施例７進行性神経疾患を抑制する薬剤の試験本発明の動物を、進行性神経疾患の進行を抑制する能力を有する物質の試験用に用いた。進行性神経疾患を発現する動物を、試験物質で処理するのと平行して、神経疾患を発現するトランスジェニック動物は処理しなかった。処理した動物では比較的低い発生率が検知され、抑制効果が見られた。処理及び未処理動物について、探求／移動挙動の低減（ＣＩ試験：実施例６参照）、及び脳のコルチコ辺縁構造での２−デオキシグルコースの取り込み／利用の減少及び肥大性グリオーシスを分析した。処理によって疾患の発生が抑制または遅延されるか否かを決定するために、神経疾患が進行することが知られている系統のマウスからのトランスジェニックマウスの半数を任意に選んで処理を施し、残りの半数には、この系統のマウスで疾患が開始される最も早い齢に先だってプラシーボを施した。用いたマウスの数は、処理及び非処理のマウス間に見られる相違の大きさに依存している。マウスは毎日観察し、それらの診断はＣＩ試験（実施例６参照）を用いて行ったが、個々のマウスに対し、いずれの実験グループに属するかを隠して週に３回行った。生存曲線及び疾患開始及び死亡の平均齢を計算し累積臨床データを形成した。臨床的結果は、実験及び対照グループにおけるサンプルに神経病理学的及びグルコース取り込み試験を行うことによって確証した。グリオーシスは、グリア繊維酸タンパク質に対する抗体を用いた免疫組織学的研究によって評価した。グルコース取り込み試験は、Chmielowska，et al.，(1986)Exp．Brain Res．63，607 に記載されたSokoloffの変形法を用いて行った。処理が疾患を改善または治療するか否かを決定するために、罹患したマウスを無作為に選択し、本発明の治療薬または食塩水プラシーボを与えた。神経病理学的及びグルコース取り込み試験及びＣＩ試験による生存及び臨床的改善が、上述の用に確認された。実施例８進行性神経疾患の治療薬の試験本発明の動物を、進行性神経疾患の改善または治療できる物質の試験用に用いた。進行性神経疾患を発現する動物を、試験物質で処理するのと平行して、神経疾患を発現する対照用トランスジェニック動物は処理しなかった。比較的遅延した死亡、または疾患の神経挙動、病理学、または機能指標の改善が抑制効果を示している。処理及び非処理動物を、探求／移動挙動、及び脳のコルチコ辺縁構造での２−デオキシグルコース取り込み／利用の低減及び肥大性グリオーシスについて分析した。上記の結果によって示されているように、突然変異又は無垢のアミロイド前駆体タンパク質の高い内因性レベルを持つ非ヒト哺乳類の臨床的及び病理学的発見は、予期しないが、アルツハイマー病のような進行性神経疾患を持つひとにおけるものとまさしく平行する結果を示した。影響マウス及びヒトの新皮質に含まれる領域は類似していた。さらに、大脳皮質の感覚運動領域でのグルコース取り込みは、トランスジェニックマウスの神経疾患によっては影響されなかった。主に初期(primary)新皮質を表現するのはサンプリングしたマウス新皮質のみであって、初期及び連合新皮質の混合ではない。アルツハイマー病患者の脳において初期新皮質には、連合皮質に比較して神経病理学的発見が少ないということは、良く知られた観察である。ＴｇマウスのＣＮＳ表現型は、同じＦＶＢ株の加齢非Ｔｇマウス亜群のＣＮＳ表現型に極めて類似している。海馬星状細胞グリオーシスは、加齢、記憶障害マウス（Landfield，et al.，(1977)J．Gerontology，32，2-12）、及び加齢、ヌードマウス（Mandybur，et al.，(1989)Acta Neuropathol（Berl.）77，507-513 ）に特徴的に見られる。影響Ｔｇマウス及び加齢、不対非Ｔｇマウスの両方における領域的グルコース代謝低下は、海馬、大脳皮質、及び扁桃において顕著に低減され、ＡＤを持つヒト（de Leon，et al.，(1983)Am．J．Neuradiology，4，5 68-571）及び加齢、不対Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの辺縁系の制限領域（Gage，et al.，(1984)J．Neurosceience，11，2856-2865）で起こるグルコースのジポ代謝(gypometabolism)のパターンに類似している。Ｔｇ動物によって発現される神経疾患と、同じ系統の老化マウスで自然に起こる疾患との顕著な類似は、これらのＴｇマウスを、アルツハイマー病を含む脳の進行性老化疾患のモデルとできることを支持している。神経疾患で死亡する動物は、海馬、扁桃、及び大脳皮質のいくつかの領域で肥大性グリオーシスを発現する。トランスジェニックマウスにおけるＨｕＡＰＰの免疫組織学的マッピングは、脳全体に広がった発現を示した。しかし、行動異常性は、神経節病理の原局領域及び選ばれた前脳領域で見られるグルコース利用の低下に対応していた。これらトランスジェニックマウス及びアルツハイマー病の脳（海馬、扁桃、及び大脳皮質のいくつかの領域）のコルチコ辺縁領域における標的細胞特異性の類似は、これらのトランス下ニックマウスをアルツハイマー病等の進行性神経疾患のモデルに使用できることを支持している。要するに、これらのトランスジェニックマウスは内因性を越えたレベルでＡＰＰを発現する。神経疾患の進行するこの系統では、少なくとも内因性レベルの２００％でＡＰＰトランスジーンが発現され、これは既に報告されている値の２倍以上である。他のトランスジェニックマウスでＡＰＰ発現が達成されるとしても、それらは脳のコルチコ辺縁領域に影響する進行性神経疾患が進行しない。この明細書で述べた全ての出版物及び特許は、個々の出版物及び特許が選択的かつ独立して参考として取り入れるように、その同じ内容で参考としてここに取り入れる。本発明は、十分に説明されたが、添付の請求の範囲の精神及び範囲から離れることなく、多くの変形または修飾が可能であることは当業者には明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ボーシェルト，デイヴィッドアールアメリカ合衆国メリーランド 21286 バルティモアスティーヴンソンレイン 723 (72)発明者スィソディア，サングラエムアメリカ合衆国メリーランド 21212 バルティモアオールドトレイル 416

Claims

【特許請求の範囲】１．脳のコルチコ辺縁領域に進行性の神経疾患を有するトランスジェニックなヒト以外の哺乳類の製造方法において、プリオンタンパク質遺伝子から得られる調節配列に操作可能に結合したアミロイド前駆体タンパク質コード配列を含む発現カセットを、ヒト以外の哺乳類のゲノムに染色体的に組み込むことからなり、前記プリオンタンパク質遺伝子が前記コード配列を神経組織において少なくとも野生種アミロイド前駆体タンパク質の内因性レベルの２から４倍のレベルで発現させる方法。２．前記コード配列が、ヒトのコード配列である請求項１記載の方法。３．前記コード配列が、疾患結合性の突然変異配列である請求項１または２記載の方法。４．前記コード配列が、ＣＳ１ＨｕＡＰＰ６９５．Ｖ７１７Ｉ．Ｖ７２１Ａ．Ｍ７２２Ｖ；ＣＳ２ＨｕＡＰＰ６９５．Ｖ７１７１．Ｖ７２１Ａ．Ｍ７２２Ｖ；及びＣＳ１ＨｕＡＰＰ６９５．Ｋ６７０Ｎ．Ｍ６７１Ｌからなる群より選択される請求項３記載の方法。５．前記コード配列が、キメラコード配列である請求項１から３のいずれかに記載の方法。６．前記キメラコード配列が、ヒト−マウスのキメラコード配列である請求項５記載の方法。７．前記調節配列が、ＡＴＧを開始コドンとするＡＣＣＡＴＧ、ＡＣＣＡＴＧ、ＡＣＣＡＴＧＧ、及びＡＣＣＡＴＧＧからの配列を含む請求項１から６のいずれかに記載の方法。８．前記発現カセットが、プリオン調節配列に隣接するＤＮＡの領域からなり、それによってコピー数依存性トランスジーン発現が得られる請求項１から７のいずれかに記載の方法。９．前記進行性神経疾患が、グリオーシス、及び、グルコース取り込みとグルコース利用の一方または両方を伴う神経挙動疾患である請求項１から８のいずかに記載の方法。１０．少なくとも２０の発現カセットのコピーがゲノムに組み込まれる請求項１から９のいずれかに記載の方法。１１．請求項１から８のいずれかに記載の発現カセットを含むヒト以外の哺乳類の接合子。１２．前記接合子が、同じ種の齧歯類の交雑から導かれる請求項１１記載の接合子。１３．前記齧歯類が、マウスである請求項１２記載の接合子。１４．前記マウスが、ＦＶＢマウスである請求項１３記載の接合子。１５．前記マウスが、異なる系統である請求項１３記載の接合子。１６．前記系統が、ＳｗｉｓｓＷｅｓｔｅｒ及びＣＳ７Ｂ１６／ＤＢＡ−ＺＦ１ハイブリッドである請求項１５記載の接合子。１７．請求項１から１６のいずれかに記載の接合子から発生した胚。１８．請求項１７記載の胚から発育した動物。１９．トランスジェニックなヒト以外の動物であって、その生殖細胞及び体細胞が、前記動物の脳の突然変異体コルチコ辺縁領域において進行性の神経疾患を生ずるアミロイド前駆体タンパク質遺伝子突然変異体の発現のレベルを供給する発現カセットを含み、前記発現カセットが、請求項１から８のいずれかに記載されたものである動物。２０．請求項１から８のいずれかに記載の発現カセットを含むコスミドベクター。