JP5070236B2 - 神経変性性障害のトランスジェニック動物モデル - Google Patents
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Description
本発明は、アルツハイマー病を含む、神経変性性障害のトランスジェニック非ヒト動物モデルに関する。より詳細には、本発明は、アルツハイマー病の病理モ機構の特徴づけ、ならびに診断、治療および治療用化合物の開発を容易にするマウスモデルに関する。
以下の説明において、参考は、本明細書の巻末に列挙する特定の文献引用に対してなされており、その全てが本明細書において参考として援用されている。
本発明は、トランスジェニック哺乳動物を含むADの新しい動物モデルに関する。この動物モデルは、好ましい実施形態において、TgCRND8と名付けられたトランスジェニックマウスを含むが、このトランスジェニックマウスは、3ヶ月齢までにCNSにおいて、高レベルのAβ合成およびアミロイド沈着を示す。さらに、TgCRND8マウスは、アミロイド沈着が開始する時点までに認知の変化を示す。本発明はまた、アルツハイマー病のTgCRND8トランスジェニック動物モデルの生成のための方法を提供する。
アルツハイマー病のTgCRND8トランスジェニックマウスモデルの開発によって、この疾患の病因は、さらに良好に理解され得、そして有効な薬物治療を含む、可能性のある処置が開発され、そして試験され得る。
(a)ゲノムが導入遺伝子を含む第一のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を、第二の遺伝子を含むゲノムを有する第二の非ヒト哺乳動物と交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、この導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質695(APP695)ポリペプチドをコードしており、ここで、このポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの導入遺伝子が発現され、そしてこの第二の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも1つの選択された変異を有する選択されたタンパク質をコードする、工程;ならびに
(b)この第一世代の子孫から、少なくとも1つの第一導入遺伝子および少なくとも1つの第二遺伝子を含むゲノムを有し、そしてこの少なくとも1つの第一導入遺伝子およびこの少なくとも1つの第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を選択する工程であって、この第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種APP695ポリペプチドをコードし、ここでこのポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの第二遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも1つの選択された変異体を有する上記選択されたタンパク質をコードする、工程、
によって産生される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。
(a)そのゲノムが導入遺伝子を含む第一のトランスジェニックマウスを、第二の遺伝子を含むゲノムを有する第二のマウスと交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、この導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつヒトAPP695ポリペプチドをコードしており、ここで、このポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの導入遺伝子が発現され、そしてこの第二の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも1つの選択された変異を有する選択されたタンパク質をコードする、工程;ならびに
(b)この第一世代の子孫から、少なくとも1つの第一導入遺伝子および少なくとも1つの第二遺伝子を含むゲノムを有し、そしてこの少なくとも1つの第一導入遺伝子およびこの少なくとも1つの第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であって、この第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種APP695ポリペプチドをコードし、ここでこのポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの第二遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも1つの選択された変異を有するこの選択されたタンパク質をコードする、工程、
によって産生される、トランスジェニックマウスを提供する。
(a)本明細書に記載されたような第一のトランスジェニックマウスにおける、選択されたAD関連表現型特徴の出現の前に、このマウスに対してこの候補化合物を投与する工程;および
(b)このマウスにおいてこの選択されたAD関連表現型特徴が出現する年齢を、この化合物を投与しなかった、同じタイプの第二のトランスジェニックマウスにおいてこの特徴が出現する年齢と比較する工程;
を包含し、
ここでこの第二のマウスにおいてこの特徴が出現した年齢と比べた、この第一のマウスにおいてこの特徴が出現した年齢の上昇は、この化合物の有効性を示す、方法が提供される。
(a)本明細書に記載のような第一のトランスジェニックマウスに対してこの候補化合物を投与する工程;
(b)記憶試験または学習試験においてこのマウスの能力を決定する工程;および
(c)このマウスのこの能力を、この化合物を投与しなかった、同じタイプの第二のトランスジェニックマウスの能力と比較する工程;
を包含し、
ここでこの第二のマウスの能力と比べた、この第一のマウスの改善された能力は、この化合物の有効性を示す、方法が提供される。
(a)導入遺伝子をこの哺乳動物の受精した卵母細胞に導入する工程であって、この導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質695(APP695)ポリペプチドをコードしており、ここで、このポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されている、工程;
(b)偽妊娠哺乳動物中にこの受精卵母細胞を移植する工程;
(c)この受精卵母細胞を生きて誕生した子孫中で発育させる工程;および
(d)ゲノムが導入遺伝子を含む子孫を選択する工程であって、この導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質695(APP695)ポリペプチドをコードしており、ここで、このポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの導入遺伝子が発現される、工程;
を包含する、方法が提供される。
本発明はさらに、以下の項目を提供する。
(項目1)ゲノムが導入遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質695(APP 695 )ポリペプチドをコードしており、ここで、該ポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該導入遺伝子が発現される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
(項目2)前記哺乳動物がマウスである、項目1に記載のトランスジェニック哺乳動物。
(項目3)前記マウスが、(C3H×C57BL6)×C57マウスである、項目2に記載のトランスジェニックマウス。
(項目4)前記異種APP 695 がヒトAPP 695 である、項目3に記載のトランスジェニックマウス。
(項目5)前記マウスがその中枢神経系において異常なAβ沈着を示す、項目4に記載のトランスジェニックマウス。
(項目6)前記動物が、アルツハイマー病関連の病状の加速された出現を示す、項目4に記載のトランスジェニックマウス。
(項目7)祖先として項目4に記載のトランスジェニックマウスを有する、トランスジェニックマウス。
(項目8)トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、以下:
(a)項目1に記載の第一のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を、第二の遺伝子を含むゲノムを有する第二の非ヒト哺乳動物と交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、該第二の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも1つの選択された変異を有する選択されたタンパク質をコードする、工程;ならびに
(b)該第一世代の子孫から、少なくとも1つの第一導入遺伝子および少なくとも1つの第二遺伝子を含むゲノムを有し、そして該少なくとも1つの第一導入遺伝子および該少なくとも1つの第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を選択する工程であって、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種APP 695 ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも1つの選択された変異を有する前記選択されたタンパク質をコードする、工程、
によって産生される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
(項目9)前記選択されたタンパク質が、プレセニリンであり、そして前記選択された変異がAD関連変異である、項目8に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
(項目10)前記選択されたタンパク質が、低密度リポタンパク質レセプター関連遺伝子、α2−マクログロブリン遺伝子およびβ−セクレターゼ遺伝子からなる群より選択され、そして前記選択された変異がAβプロセシング関連変異である、項目8に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
(項目11)前記動物がマウスである、項目10に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物
(項目12)トランスジェニックマウスであって、以下:
(a)項目4に記載の第一のトランスジェニックマウスを、第二の遺伝子を含むゲノムを有する第二のマウスと交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、該第二の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも1つの選択された変異を有する選択されたタンパク質をコードする、工程;ならびに
(b)該第一世代の子孫から、少なくとも1つの第一導入遺伝子および少なくとも1つの第二遺伝子を含むゲノムを有し、そして該少なくとも1つの第一導入遺伝子および該少なくとも1つの第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であって、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種APP 695 ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも1つの選択された変異を有する該選択されたタンパク質をコードする、工程、
によって産生される、トランスジェニックマウス。
(項目13)前記第二の遺伝子が、内因性変異遺伝子である、項目12に記載のトランスジェニックマウス。
(項目14)前記第二の遺伝子が、導入遺伝子である、項目12に記載のトランスジェニックマウス。
(項目15)前記第二の遺伝子が、AD関連アミノ酸置換を有する選択されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、項目12に記載のトランスジェニックマウス。
(項目16)前記選択されたタンパク質が、プレセニリンである、項目15に記載のトランスジェニックマウス。
(項目17)項目12に記載のトランスジェニックマウスであって、以下:
(a)項目4に記載の第一のトランスジェニックマウスを、導入遺伝子を含むゲノムを有する第二のトランスジェニックマウスと交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン2ポリペプチドをコードしており、ここで該ポリペプチドの239位のメチオニン残基がバリンで置換されている、工程;ならびに
(b)該第一世代の子孫から、少なくとも1つの第一導入遺伝子および少なくとも1つの第二導入遺伝子を含むゲノムを有し、そして該第一導入遺伝子および該第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であって、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質(APP)ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン2ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの239位のメチオニン残基はバリンで置換されている、工程、
によって産生される、トランスジェニックマウス。
(項目18)項目12に記載のトランスジェニックマウスであって、以下:
(a)項目4に記載の第一のトランスジェニックマウスを、導入遺伝子を含むゲノムを有する第二のトランスジェニックマウスと交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン1ポリペプチドをコードしており、ここで該ポリペプチドの286位のロイシン残基がバリンで置換されている、工程;ならびに
(b)該第一世代の子孫から、少なくとも1つの第一導入遺伝子および少なくとも1つの第二導入遺伝子を含むゲノムを有し、そして該第一導入遺伝子および該第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であって、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質(APP)ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン1ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの286位のロイシン残基はバリンで置換されている、工程、
によって産生される、トランスジェニックマウス。
(項目19)項目12に記載のトランスジェニックマウスであって、以下:
(a)項目4に記載の第一のトランスジェニックマウスを、導入遺伝子を含むゲノムを有する第二のトランスジェニックマウスと交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン1ポリペプチドをコードしており、ここで該ポリペプチドの146位のメチオニン残基がロイシンで置換されており、そして286位のロイシン残基がバリンで置換されている、工程;ならびに
(b)該第一世代の子孫から、少なくとも1つの第一導入遺伝子および少なくとも1つの第二導入遺伝子を含むゲノムを有し、そして該第一導入遺伝子および該第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であって、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質(APP)ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン1ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの146位置のメチオニン残基はロイシンで置換されており、そして286位のロイシン残基はバリンで置換されている、工程、
によって産生される、トランスジェニックマウス。
(項目20)ADの発生を防止または遅延するのにおける有効性について候補化合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)項目1〜19のいずれか1項に記載の第一のトランスジェニックマウスにおける、選択されたAD関連表現型特徴の出現の前に、該マウスに対して該候補化合物を投与する工程;および
(b)該マウスにおいて該選択されたAD関連表現型特徴が出現する年齢を、該化合物を投与しなかった、同じタイプの第二のトランスジェニックマウスにおいて該特徴が出現する年齢と比較する工程;
を包含し、
ここで該第二のマウスにおいて該特徴が出現した年齢と比べた、該第一のマウスにおいて該特徴が出現した年齢の上昇は、該化合物の有効性を示す、方法。
(項目21)前記特徴が行動障害である、項目20に記載の方法。
(項目22)前記特徴が異常なCNSアミロイド沈着である、項目20に記載の方法。
(項目23)アルツハイマー病の症状を寛解するのにおける有効性について候補化合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)項目1〜19のいずれか1項に記載の第一のトランスジェニックマウスに対して該候補化合物を投与する工程;
(b)記憶試験または学習試験において該マウスの能力を決定する工程;および
(c)該マウスの該能力を、該化合物を投与しなかった、同じタイプの第二のトランスジェニックマウスの能力と比較する工程;
を包含し、
ここで該第二のマウスの能力と比べた、該第一のマウスの改善された能力は、該化合物の有効性を示す、方法。
(項目24)中枢神経系において異常なAβ沈着を示すトランスジェニック非ヒト哺乳動物を産生する方法であって、該方法は以下:
(a)導入遺伝子を該哺乳動物の受精した卵母細胞に導入する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質695(APP 695 )ポリペプチドをコードしており、ここで、該ポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されている、工程;
(b)偽妊娠哺乳動物中に該受精卵母細胞を移植する工程;
(c)該受精した卵母細胞を生きて誕生した子孫中で発育させる工程;および
(d)ゲノムが導入遺伝子を含む子孫を選択する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質695(APP 695 )ポリペプチドをコードしており、ここで、該ポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該導入遺伝子が発現される、工程;
を包含する、方法。
(項目25)前記哺乳動物がマウスである、項目24に記載の方法。
(項目26)前記プロモーターが、プリオンタンパク質cos.Tetプロモーターである、項目24に記載の方法。
(項目27)異種アミロイド前駆体タンパク質695(APP 695 )ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該ポリペプチドの670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されている、ヌクレオチド配列。
(項目28)プロモーターに作動可能に連結された項目27に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
(項目29)中枢神経系における異常なアミロイド沈着を罹患する哺乳動物において、認識不全を減弱する方法であって、該方法は、認識不全を減弱するのに有効な量のAβペプチドを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
(項目30)前記異常なアミロイド沈着がAβ沈着である、項目29に記載の方法。
(項目31)前記投与されたペプチドがAβ42である、項目29または30に記載の方法。
(項目32)前記哺乳動物が、アルツハイマー病に罹患しているヒトである、項目29〜31のいずれか1項に記載の方法。
(項目33)中枢神経系において異常なアミロイド沈着を罹患している哺乳動物において認識不全を減弱するための医薬の製造のためのAβペプチドの使用。
(項目34)前記AβペプチドがAβ42である、項目33に記載の使用。
(項目35)前記医薬がアルツハイマー病の予防または処置のための医薬である、項目33または34に記載の使用。
本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物、好ましくはげっ歯類、およびより好ましくはマウスを提供し、これは、アルツハイマー病(AD)、アルツハイマー病のレーヴィ体変種、および特定の型のクロイツフェルト−ヤーコプ病(CJD)(これは、痴呆を引き起こす)、アミロイドーシスオランダ型(HCAWA−D)を有する遺伝性小脳性血管障害、および脳出血を引き起こす老年性アミロイド血管症のような多数のヒト障害において見られるものと同様の異常なAβ沈着を示す。
本発明の非ヒトトランスジェニック哺乳動物は、異常なAβ沈着の結果として、組織学的および行動性欠損を示す。特に、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、種々の面のヒトAD関連病態の促進された出現を示し、そしてADの改善された動物モデルを提供する。
(a)変異プレセニリン1タンパク質、好ましくはPS1(L286V)プレセニリン1タンパク質をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス;
(b)変異プレセニリン2タンパク質、好ましくはPS2(M239V)プレセニリン2タンパク質をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス;
(c)2つの変異を有するプレセニリン1タンパク質、好ましくはPS1(M146L+L286L)プレセニリン1タンパク質をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス、
とTgCRND8マウスとを交配することによって生成される二重トランスジェニックマウスを提供する。
実施例は例示のために記載され、発明の範囲を制限することを意図していない。
90塩基対の5’非翻訳領域、695アミノ酸残基コード領域(「APP695」)および271bpの3’非翻訳領域を含むヒトβ−アミロイド前駆体タンパク質(1)(βAPP)cDNAカセットを変異誘発して、互いにシスの、家族性アルツハイマー病(FAD)に関連する2つの変異を導入した。第一の変異は、隣接する2つのコドンに影響するジヌクレオチドの変化(APP770転写物のコドン/ヌクレオチド番号付け(1)を用いると、ヌクレオチド1785および1786でKM670/671NL:GA→TC)である、「Swedish」変異(2)であった。第二の変異は、V717F置換を産生する単一ヌクレオチドの変化(3)であった(APP770転写物(1)のコドン/ヌクレオチド番号付けを用いると、ヌクレオチド1924でG→T)。Kunitz Protease Inhibitorドメインをコードするエキソン7および8を欠くAPP695転写物は、脳で発現される主要な転写物である。βAPP二重変異体cDNAカセットを、プリオンタンパク質コスミド発現ベクターcosTet(10)に挿入した。
免疫染色を、APPのAβタンパク質分解フラグメントと反応するヒト特異的抗体4G8を用い、ホルマリン固定し、パラフィンワックス包埋した脳材料からの切片を用いて行った。この免疫組織化学的手順のための標準プロトコールは、別に記載されている(17,20,23)。単離したプラーク沈着物は、生後60日という早期にTgCRND8マウスにおいて可視化になり、びまん性アミロイド斑の頑強な沈着物は90日齢から可能になる。高密度の中心を有する斑は、4〜5ヶ月齢で明らかであり、これらの型の沈着物の多くは、コンゴ−レッド(β−シートリッチアミロイド沈着物中にインターカレートされる試薬)で染まり、偏光下で緑/金複屈折をもたらす。同様の複屈折沈着物は、ヒトADの脳サンプルに存在する。アミロイド沈着物は、TgCRND8マウスにおいて、ヒトアルツハイマー病によって重大な影響を受ける領域である海馬および大脳皮質(特に前頭皮質)に顕著であった。散発性ADでは通常免れるが、ADの重症な早発型症例でのびまん性Aβ沈着物によって穏やかに影響を受け得る小脳もまた、1年齢のTgCRND8マウスおよび6ヶ月齢で変異体PS1または変異体PS2を同時発現するTgCRND8マウスにおいて、穏やかに影響を受ける。
TgCRND8マウスの空間学習を、(32)に記載の十分に確立されたパラダイムのMorris水迷路(31)を用いて評価した。TgCRND8マウスの行動分析は、11週齢という早期の水迷路の場所識別(同じ空間的位置の隠したプラットフォーム)バージョンにて評価された、それらの空間情報獲得の重大な認知欠損を明らかにした。トレーニングの間、マウスは有意に遅い学習速度を示し、この学習速度は、より長いエスケープ潜時および探索通路ならびに隠したプラットフォームを含む四分区画の偶然のレベル探索に反映される(図1)。TgCRND8マウスはまた、探索足跡(probe trail)で試験する場合、空間記憶の欠損を示した。この試行の間、隠したプラットフォームを取り外し、そしてマウスに60秒間その位置を探索させた。非Tgマウスは、プラットフォーム位置に対する明らかで選択的な空間の偏りを示し(図1,EおよびF)、TgCRND8マウスの探索は、非Tg同腹仔よりも全体にわたりかつTQ四分区画に隣接して含まれ、そしてプラットフォーム位置の周りの環状部を有意に少なく横断した。APP陽性マウスおよび非Tgマウスの両方の泳ぐ能力は、試験の間は同等であり、従って、学習の尺度は偏らなかった。
TgCRND8マウスを、TgPS1(L286V)系統1274と称されるFAD関連変異体プレセニリン1遺伝子を有するトランスジェニックマウスと交配させた。これらの子孫を離乳させ、そしてゲノムDNAの調製のために尾部の生検を取り出した。精製された尾部のDNAを、ナイロン膜上にニ連の「ドット−ブロット」アレイで固定化し、そしてcDNAクローンから切り出したヒトAPPコード領域の遺伝子特異的プローブまたはcDNAクローンから切り出したヒトPS1クローニング領域プローブフラグメントを用いてハイブリダイズさせた。これらのDNA制限フラグメントを、α−32p−dCTP(33)で無作為にプライミングすることによって標識した。二連のナイロン膜を、APPまたはPS1のいずれかのハイブリダイゼーションプローブとともにインキュベートし、そして65℃の温度で0.1% ドデシル硫酸ナトリウム(sodium dodecyl suphate)、0.1×クエン酸ナトリウム生理食塩水の溶液(これは、マウスのゲノム内で内在性PS1遺伝子およびAPP遺伝子に由来するシグナルを最少化するような「ストリンジェント」なハイブリダイゼーション後の洗浄に対応する)中で洗浄した。二重トランスジェニックマウスを、対応する尾部のDNAサンプルがAPP遺伝子特異的プローブおよびPS1遺伝子特異的プローブの両方にハイブリダイズするという事実によって同定した。
アミロイド沈着は、生じた二重トランスジェニックマウスにおいて増強された。これらのマウスは、62日齢まで、死後のヒトADの脳に非常に似ているアミロイド負荷量を示した。
TgCRND8マウスをまた、同様のプリオンタンパク質コスミド発現ベクターcosTet中に変異プレセニリン2対立遺伝子を発現する、TgPS2(M239V)系統1379と名づけたトランスジェニック系統と交配した。二重トランスジェニックマウスTgCRND8xTgPS2(M239V)1379マウスは、PS2コード領域DNAハイブリダイゼーションプローブを、PS1コード領域ハイブリダイゼーションプローブの代わりに使用したことを除いて、上に記載のTgCRND8xTgPS1(L286V)1274マウスとして遺伝子型を特定した。
TgCRND8xTgPS2(M239V)1379二重トランスジェニックマウスを2ヶ月齢で試験し、そして空間学習の獲得において40%範囲内にエフェクトサイズを有する有意な認知欠陥を示した(図2、パネルAおよびB)。しかしながら、以下の逆試験の間、最初は下位であったけれども、この二重トランスジェニックマウスは、試験の最後まで比較し得る能力を示した(導入遺伝子型によって説明される分散の約20%)(図2、パネルCおよびC)。5ヶ月齢での再試験の間、同様の二重トランスジェニックマウスは、獲得試験および逆試験の間に有意に高い学習欠陥を示した(それぞれ60%および70%の導入遺伝子型に起因するエフェクトサイズ)(図2、パネルEおよびF)。また、この二重トランスジェニックマウスは、任意の年齢で試験したこれらの泳ぐ速度において、TgPS2(m239V)1379マウスと相違しなかった。変異したPS2遺伝子の存在中の変異したヒトAPPの発現は、同系統の同様の組み合わせから由来した非トランスジェニックマウスと同様の様式で行動するTgPS2(M239V)1379マウスの能力と比較して、2ヶ月齢程度の早さで空間学習および記憶の障害を起こす。この障害は加齢に伴いかつ5ヶ月齢までに進行する。このマウスは、常に新しい空間情報の獲得の欠陥を示す。
TgCRND8マウスを、PS1(M146L+L286V)の2つの変異を有するトランスジェニックマウスと交配した(34)。このPS1二重変異体マウスを、先に記載のように(35)、標準プロトコールによって作製した。二重トランスジェニックマウスを、上に記載のTgCRND8xTgPS1(L286V)1274二重トランスジェニックマウスのための、2つの独立したDNAプローブを用いたハイブリダイゼーションによる尾部のDNAの遺伝子型分析によって同定した。
TgCRND8マウスの群および非トランスジェニック同腹仔の群を、Schenkら(36)による記載のように、合成Aβ42ペプチドで免疫した。TgCRND8マウスおよび非トランスジェニック同腹仔のコントロール群を、コントロールアミロイド生成性ペプチド(糖尿病の病因と関連する島状のアミロイドポリペプチド(IAPP))で免疫した。水迷路試験でのこれらの2つのトランスジェニック群の能力を、上に記載のように、非Tg同腹仔の能力と比較した。この結果を図3に示す。
Claims (9)
- 中枢神経系における異常なアミロイド沈着を罹患する哺乳動物において、認知不全を減弱するための組成物であって、該哺乳動物は、変異体アミロイド前駆体タンパク質を含み、該変異体アミロイド前駆体タンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質695(APP695)ポリペプチドであり、該ポリペプチドのAPP770コドン番号付けによる670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、APP770コドン番号付けによる671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そしてAPP770コドン番号付けによる717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、該組成物は、認知不全を減弱するのに有効な量のAβ42ペプチドを含有する、組成物。
- 前記異常なアミロイド沈着がAβ沈着である、請求項1に記載の組成物。
- 前記哺乳動物が、アルツハイマー病に罹患しているヒトである、請求項1または2に記載の組成物。
- 中枢神経系において異常なアミロイド沈着を罹患している哺乳動物において認知不全を減弱するための医薬の製造のためのAβ42ペプチドの使用であって、該哺乳動物は、変異体アミロイド前駆体タンパク質を含み、該変異体アミロイド前駆体タンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質695(APP695)ポリペプチドであり、該ポリペプチドのAPP770コドン番号付けによる670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、APP770コドン番号付けによる671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そしてAPP770コドン番号付けによる717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されている、使用。
- 前記哺乳動物がヒトであり、前記医薬がアルツハイマー病の予防または処置のための医薬である、請求項4に記載の使用。
- 前記哺乳動物がマウスである、請求項4に記載の使用。
- 神経系において異常アミロイド沈着に罹患する哺乳動物における認知不全の処置の方法または予防の方法において使用するための組成物であって、該組成物は、Aβ42ペプチドを含有し、該哺乳動物は、変異体アミロイド前駆体タンパク質を含み、該変異体アミロイド前駆体タンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質695(APP695)ポリペプチドであり、該ポリペプチドのAPP770コドン番号付けによる670位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、APP770コドン番号付けによる671位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そしてAPP770コドン番号付けによる717位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されている、組成物。
- 前記哺乳動物がヒトであり、前記使用は、アルツハイマー病の処置または予防のための使用である、請求項7に記載の組成物。
- 前記哺乳動物がマウスである、請求項7に記載の組成物。
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