ES2262662T3 - Modelo de animal transgenico que presenta desordenes neurodegenerativos. - Google Patents
Modelo de animal transgenico que presenta desordenes neurodegenerativos.Info
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Abstract
Un ratón transgénico que puede ser producido por medio de: (a) el cruce de un primer ratón transgénico cuyo genoma incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP695) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en la posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde el transgén se expresa, con un segundo ratón transgénico que tiene un genoma que incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 2 humana en donde el residuo de metionina en la posición 239 se sustituye por valina para producir una primera generación de descendientes; y (b) la selección de una primera generación de descendientes de un ratón transgénico que tiene un genoma que incluye al menos un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP695) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y al menos un segundo transgén que incluye una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 2 humana en donde el residuo de metionina en la posición 239 se sustituye por valina y expresa a ambos de dichos primer y segundo transgenes.
Description
Modelo de animal transgénico que presenta
desordenes neurodegenerativos.
La presente invención se relaciona con modelos
transgénicos de animales no humanos que presentan desordenes
degenerativos, incluida la Enfermedad de Alzheimer. Más
específicamente, la presente invención está dirigida a un modelo
murino que facilita la caracterización de los mecanismos patogénicos
de la enfermedad de Alzheimer y el desarrollo de diagnósticos,
terapias y compuestos terapéuticos.
En la descripción que se hace a continuación, se
hace referencia a ciertas citaciones de la literatura que se
enlistan al final de la descripción, todas las cuales se incorporan
aquí por referencia.
La Enfermedad de Alzheimer (AD), la causa más
común de demencia, tiene una etiología compleja que involucra más
probablemente determinantes genéticos y ambientales. Se caracteriza
por depósitos de amiloide en el cerebro formados a partir del
péptido \beta amiloide (A\beta), perdida de neuronas, y
depósitos intracelulares conocidos como marañas neurofibrilares
(NFT), compuestas de formas hiperfosforiladas de la proteína tau
(\tau) asociada con los microtúbulos.
El análisis genético de diversos congéneres
familiares con la Enfermedad de Alzheimer (FAD) indican que la
biosíntesis del péptido \beta amiloide (A\beta) es un
denominador común en la patogénesis de la enfermedad. En el caso de
los congéneres vinculados por el cromosoma 21, las mutaciones
flanquean los sitios de la endoproteasa en donde A\beta es
cortado de la proteína precursora amiloide del Alzheimer (APP),
puesto que se piensa que las mutaciones en las presenilinas 1 y 2
acrecientan la escisión de la APP en el límite
C-terminal de A\beta, el así llamado sitio de la
\gamma-secretasa. Aunque el gen tau sobre el
cromosoma 17 no está mutado en la AD, las sustituciones en sentido
inverso y las mutaciones en el sitio de empalme están presentes en
condiciones con algunas semejanzas patológicas con la AD, tales como
la demencia frontotemporal.
Los datos genéticos indican que la biogénesis
del A\beta se ubica secuencia arriba en una trayectoria patogénica
que culmina en la generación de las NFT. Mientras que los primeros
debates se enfocaron en si el A\beta amiloide o las NFT causan
pérdida neuronal y disfunción, hoy en día parece que ambos tipos de
agregado de proteína son tóxicos y contribuyen al fenotipo clínico
de la AD.
Aunque no existen formas animales de ocurrencia
natural de la AD, los modelos de animales transgénicos de la
enfermedad tienen el potencial de clarificar y ordenar los eventos
patogénicos claves en la enfermedad humana. A pesar de intensos
esfuerzos, sin embargo, existen pocos modelos satisfactorios.
La patente estadounidense No. 5.877.399 se
relaciona con ratones transgénicos que expresan la APP_{695}
humana o de ratón ya sea de tipo salvaje o soportando la mutación
"Sueca", y desarrollan un desorden neurológico progresivo
generalmente dentro del año desde su nacimiento. La patente
estadounidense No. 6.037.521 se relaciona con un modelo animal de
la Enfermedad de Alzheimer que tiene un transgén que codifica a una
porción carboxi-terminal de 99 a 103 aminoácidos de
APP humana. La patente estadounidense No. 5.894.078 se relaciona con
un ratón transgénico cuyo genoma incluye una secuencia de ADN que
codifica a los 100 aminoácidos carboxi-terminales de
la \betaAPP insertada dentro del exón I del gen del
neurofilamento. La patente estadounidense No. 5.850.003 se relaciona
con ratones transgénicos que albergan a un transgén que codifica a
la APP_{751} humana con la mutación Sueca.
La patente estadounidense No. 5.898.094 se
relaciona con un modelo de animal transgénico de AD en donde el
animal soporta y expresa tanto al transgén mutante presenilina 1
como al transgén de la APP_{695} que porta la mutación Sueca.
WO 96/40895 se relaciona con un modelo de animal
transgénico de la enfermedad de Alzheimer y su uso para identificar
terapéuticas para la enfermedad de Alzheimer, teniendo el animal
transgénico un transgén que expresa las tres principales formas de
la APP (APP_{695}, APP_{751}, APP_{770}) y que contienen tanto
las mutaciones Hardy como la
Sueca.
Sueca.
Algunos de estos modelos fallan en producir APP
y/o sus metabolitos por medio de trayectorias fisiológicamente
adecuadas, y en los casos en donde esta advertencia no aplica, los
animales transgénicos pueden mostrar solamente ciertas facetas del
fenotipo de la AD. Con respecto a la neuropatología, pueden existir
depósitos de amiloide que se parecen mucho a aquellos observados en
la AD, perdida neuronal selectiva (en un caso) e hiperfosforilación
de tau, pero no el depósito de las NFT. Adicionalmente, estas
anormalidades neuropatológicas pueden no aparecer hasta los
8-9 meses de edad, o hasta los 6 meses de edad en el
caso de animales bigénicos u homocigotos. Otras complicaciones
encontradas en la creación de estos modelos incluyen letalidad
neonatal atribuida a sobreexpresión de APP, al uso de ambientes
genéticos complejos, y generalmente a la evidencia no clara de
disfunción cognitiva progresiva.
Existe por lo tanto la necesidad de un modelo de
animal transgénico de la AD que muestre rápidamente las facetas
importantes del fenotipo de la AD humana, de tal manera que los
animales no necesiten ser mantenidos por largos pedidos de tiempo y
puedan investigarse y desarrollarse compuestos terapéuticos y de
diagnóstico mucho más rápidamente y en forma rentable.
La presente invención se relaciona con un nuevo
modelo de animal de la AD que incluye un ratón transgénico. Se
revela aquí un ratón transgénico denominado TgCRND8, que exhibe
altos niveles de síntesis de A\beta y depósito de amiloide en el
CNS a los tres meses de edad. Además, los ratones TgCRND8 exhiben
cambios cognitivos dentro del período de tiempo en el cual
comienzan los depósitos de amiloide. También se describen los
métodos para la producción del modelo de animal transgénico TgCRND8
de la Enfermedad de Alzheimer.
Con el desarrollo del modelo de ratón
transgénico TgCRND8 para la Enfermedad de Alzheimer, puede
entenderse mejor la etiología de la enfermedad, y pueden
desarrollarse y analizarse tratamientos potenciales, incluidas las
terapias con drogas efectivas.
El modelo de ratón transgénico TgCRND8 se
caracteriza por una gran semejanza con el fenotipo de la Enfermedad
de Alzheimer de ocurrencia natural, basado en la expresión de la
proteína A\beta amiloide en el CNS, así como sobre los análisis
histológicos, las deficiencias neurológicas y del
comportamiento.
El gen de la APP experimenta empalmes
alternativos para generar tres isoformas comunes. La isoforma más
larga, que contiene 770 aminoácidos (APP_{770}), y la segunda
isoforma más larga que contiene 751 aminoácidos (APP_{751}), se
expresan en la mayoría de los tejidos. La tercera transcripción, que
contiene 695 aminoácidos (APP_{695}), se expresa
predominantemente en el cerebro. Por convención, se utiliza la
numeración del codón de la isoforma más larga, APP_{770}, aún
cuando se refiera a las posiciones de los codones de las isoformas
más cortas.
El ratón transgénico TgCRND8 contiene un
transgén que expresa una forma mutante de la isoforma APP_{695}
específica del cerebro; este transgén porta tanto las mutaciones
"Sueca" como "Indiana" de la APP.
Se generó un ADNc de la APP_{695} conteniendo
(utilizando la numeración del codón de la APP_{695}) las
mutaciones K595N/M596L (la mutación Sueca) y V642F (la mutación
Indiana). Estas y otras mutaciones de la APP serán generalmente
mencionadas aquí, incluidas las reivindicaciones, por medio del
sistema más común de numeración del codón de la APP_{770}, esto
es, para estas dos mutaciones, K670N/M671L (la mutación Sueca) y
V717F (la mutación Indiana).
Se insertó el casete mutante doble de ADNc de la
APP_{695} dentro del vector cósmido de expresión, cosTet, que
contiene al promotor del gen de la proteína prión de hámster Sirio.
Se microinyectó entonces al vector dentro de un oocito de ratón
para crear una línea transgénica denominada TgCRND8. Estos ratones
exhiben múltiples depósitos difusos de amiloide a los tres meses de
edad, en cuyo momento son evidentes las deficiencias de aprendizaje
espacial.
De acuerdo con un aspecto de la invención, los
ratones TgCRND8 han sido cruzados con diferentes ratones
transgénicos que soportan una mutación relacionada con la AD para
producir ratones bitransgénicos que muestran además una
neuropatología mejorada relacionada con la AD.
Por lo tanto, la invención se relaciona con un
ratón transgénico cuyo genoma incluye un transgén que comprende una
secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que
codifica a un polipéptido de la proteína heteróloga precursora de
amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la
posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina
en la posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina
en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde se
expresa el transgén.
De acuerdo con la invención, la AP_{695}
heteróloga es APP_{695} humana.
Así, la invención provee un ratón transgénico
que puede producirse por medio del:
- (a)
- cruce de un primer ratón transgénico cuyo genoma incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en la posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde el transgén se expresa, con un segundo ratón transgénico que tiene un genoma que incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 2 humana en donde el residuo de metionina en la posición 239 se sustituye por valina para producir una primera generación de descendientes; y
- (b)
- la selección de una primera generación de descendientes de un ratón transgénico que tiene un genoma que incluye al menos un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y al menos un segundo transgén que incluye una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 2 humana en donde el residuo de metionina en la posición 239 se sustituye por valina y expresa a ambos de dichos primer y segundo transgenes.
De acuerdo con una primera modalidad, la
invención provee un ratón transgénico producible por medio del:
- (a)
- cruce de un primer ratón transgénico cuyo genoma incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en la posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde el transgén se expresa, con un segundo ratón transgénico que tiene un genoma que incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina para producir una primera generación de descendientes; y
- (b)
- la selección de una primera generación de descendientes de un ratón transgénico que tiene un genoma que incluye al menos un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y al menos un segundo gen que incluye una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina y expresa a ambos de dichos primer y segundo transgenes.
De acuerdo con una primera modalidad, la
invención provee un ratón transgénico producible por medio del:
- (a)
- cruce de un primer ratón transgénico cuyo genoma incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en la posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde el transgén se expresa, con un segundo ratón transgénico que tiene un genoma que incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de metionina en la posición 146 se sustituye por leucina y el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina para producir una primera generación de descendientes; y
- (b)
- la selección de una primera generación de descendientes de un ratón transgénico que tiene un genoma que incluye al menos un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y al menos un segundo transgén que incluye una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de metionina en la posición 146 se sustituye por leucina y el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina y expresa a ambos de dichos primer y segundo transgenes.
De acuerdo con las modalidades anteriormente
mencionadas de la invención, se describe un método para investigar a
un compuesto candidato por su eficacia en la prevención o la demora
en el desarrollo de la AD, comprendiendo el método las etapas
de:
- (a)
- administrar el compuesto candidato a un primer ratón transgénico como se describe aquí antes del surgimiento de un rasgo fenotípico seleccionado relacionado con la AD en dicho ratón; y
- (b)
- comparar la edad a la cual dicho rasgo fenotípico seleccionado relacionado con la AD surge en dicho ratón, con la edad a la cual dicho rasgo aparece en un segundo ratón transgénico del mismo tipo al cual no le había sido administrado el compuesto;
en donde una mayor edad en el
surgimiento del rasgo en el primer ratón comparado con aquel en el
segundo ratón indica la eficacia del
compuesto.
También se describe un método para investigar a
un compuesto candidato por su eficacia en el mejoramiento de los
síntomas de la Enfermedad de Alzheimer, comprendiendo el método las
etapas de:
- (a)
- administrar el compuesto candidato a un primer ratón transgénico como se describe aquí;
- (b)
- determinar el desempeño de dicho ratón en una prueba de memoria o de aprendizaje; y
\newpage
- (c)
- comparar el desempeño de dicho ratón con el desempeño de un segundo ratón transgénico del mismo tipo al cual no le había sido administrado el compuesto;
en donde un mejor desempeño del
primer ratón comparado con aquel en el segundo ratón indica la
eficacia del
compuesto.
De acuerdo con las modalidades anteriormente
mencionadas, se describe un método para la producción de un mamífero
transgénico no humano que muestra un depósito anormal de A\beta
en su sistema nervioso central que comprende:
- (a)
- introducir dentro de un oocito fertilizado de dicho mamífero un transgén que incluye una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido heterólogo de la proteína precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina;
- (b)
- transplantar dicho oocito fertilizado dentro de un mamífero pseudopreñado,
- (c)
- permitir que dicho oocito fertilizado se desarrolle dentro de un descendiente nacido vivo, y
- (d)
- seleccionar un descendiente cuyo genoma incluya a un transgén que comprenda una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido heterólogo de la proteína precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde se expresa el transgén.
Se describen ciertas modalidades de la
invención, haciendo referencia a los dibujos que las acompañan, en
donde:
La Figura 1 muestra el desempeño en el
laberinto con agua de los ratones TgCRND8 analizados a las 11
semanas de edad. Los ratones TgCRND8 (n = 5) tenían latencias de
escape significativamente más prolongadas (Panel A) y de
trayectorias de búsqueda (Panel B) que sus compañeros sin Tg de
camada (n = 8), (F(1,10) = 28.8, p < 0.001 y
F(1,10) = 22.0, p < 0.01, respectivamente), y
consecuentemente vivieron significativamente menos (F(1,10)
= 14.9, p < 0.01) en el cuadrante objetivo (TQ) que contenía una
plataforma oculta (Panel C). Las habilidades locomotoras evaluadas
por medio de la velocidad de nado (Panel D) entre los ratones Tg y
los sin Tg fue comparable (F(1,10) = 0.48, p > 0.05).
Los ratones TgCRND8 mostraron memoria especial
menoscabada para la posición de la plataforma que la medida por
medio de sus patrones de búsqueda durante 60 segundos de nado en el
ensayo de prueba cuando se removió la plataforma escondida de la
piscina. Ellos mostraron una tendencia a buscar menos el TQ (Panel
E) y cruzaron significativamente menos a menudo el anillo exacto de
la posición de la plataforma (t(10) = 2.1, p = 0.06) que los
ratones sin Tg (Panel F).
La Figura 2 muestra el desempeño de los ratones
bitransgénicos TgCRND8 x TgPS2(M239V)1379 en el
laberinto de agua. Cuando se los analizó a los 2 meses de edad, los
ratones bitransgénicos (n = 5) tenían latencias de escape
significativamente mayores (F(1,11) = 8.1, p< 0.05, con el
tamaño del efecto debido al genotipo (h2) = 42%) (Panel A) y la
trayectoria de búsqueda (F(1,11) = 8.46, p < 0.05, h2 =
43%), (Panel B) que los solos compañeros de camada Tg
PS2(M239V)1379 (n = 8). Durante la prueba inversa de
aprendizaje que siguió a continuación, se movió la plataforma oculta
hacia el cuadrante opuesto del TQ original, los ratones
bitransgénicos mostraron una tendencia a latencias de escape más
largas (F(1,11) = 3.28, p = 0.1, h2 = 23%, Panel C) pero sus
trayectorias de búsqueda (Panel D) no difirieron significativamente
de las de los ratones TgPS2(M239V)1379 únicamente
(F(1,11) = 2.46, p > 0.05, h2 = 18%). La velocidad de nado
de los ratones en ambos grupos transgénicos fue comparable durante
los ensayos. Cuando se analizaron nuevamente a los 5 meses de edad,
los ratones bitransgénicos mostraron latencias de escape
significativamente más largas (F(1,10) = 16.6, p < 0.01,
h2 = 62%, (1 ratón bitransgénico murió)) (Panel E) y de trayectorias
de búsqueda significativamente mayores (F(1,10) = 20.3, p
< 0.001, h2 = 66%, Panel F) que las de los compañeros de camada
Tg PS2(M239V)1379 únicamente. Este empeoramiento
significativo fue debido al pobre desempeño inicial de los ratones
bitransgénicos en los ensayos (grupo x interacciones diarias:
F(2,40) = 3.32, p < 0.05 por latencia y F(2,40) =
2.85, p = 0.07 por trayectoria). Este empeoramiento en la
adquisición de aprendizaje persistió en los ensayos inversos cuando
los ratones bitransgénicos aún mostraron latencias
significativamente más largas (F(1,10) = 28.58, p < 0.001,
h2 = 74% Panel G) y de trayectorias de búsqueda por más tiempo
(F(1,10) = 27.43, p < 0.001, h2 = 73% Panel H) que los
compañeros de camada únicamente Tg. Aunque los ratones eventualmente
mejoraron su desempeño al final del entrenamiento inverso de
aprendizaje, las interacciones diarias del grupo para ambas
mediciones no alcanzaron a ser significativas con \alpha =
0.05.
La Figura 3 muestra el desempeño en el laberinto
de agua de los ratones TgCRND8 (Tg(APP)8); n = 12) y
de los compañeros de camada non transgénicos (sin Tg; n = 20)
inmunizados con A\beta_{42} y los ratones TgCRND8
(Tg(APP)8; n = 9) y los compañeros de camada no
transgénicos (sin Tg; n =19) inmunizados con el péptido IAPP. La
inmunización con el péptido A\beta_{42} redujo
significativamente el déficit cognoscitivo en ratones TgCRND8 de
acuerdo a lo medido por su latencia de escape y la trayectoria de
búsqueda comparada con la de los compañeros de camada sin Tg. Aunque
los ratones TgCRND8 inmunizados con A\beta_{42} mostraron
latencias de escape mayores a las de los demás (Panel A) y de
trayectorias de búsqueda (Panel C), (F(1,30) = 9.71, p <
0.01; F(1,30) = 10.9, p < 0.01 para latencia y trayectoria
respectivamente) que la de los ratones sin Tg, la diferencia fue
debida a sus búsquedas iniciales más largas (grupo x interacciones
diarias: F(4,120) = 2.83, p < 0.05 - latencia;
F(3,120) = 4.73, p < 0.01 - trayectoria). Las
comparaciones de su desempeño durante los últimos 3 días de
entrenamiento no revelaron diferencias significativas entre los
grupos (F(1,30) = 0.64, p > 0.05 - latencia;
F(1,30) = 1.24, p > 0.05 - trayectoria). Los ratones Tg
inmunizados con A\beta_{42} mostraron una ligera tendencia a
buscar menos el TQ (F(1,30) = 3.71, p = 0.06, Panel E), pero
su velocidad de nado no difirió significativamente de la de los
ratones sin Tg (F(1,30) = 1.33, p > 0.05) (Panel G). Los
ratones TgCRND8 inmunizados con IAPP mostraron latencias de escape
significativamente mayores (Panel B) y de trayectorias de búsqueda
(Panel D) que la de sus compañeros de camada sin Tg (F(1,26)
= 39.9, p < 0.001 - latencia; F(1,26) = 43.9, p < 0.001
- trayectoria). Aunque ellos no difirieron en su búsqueda inicial de
la de los ratones sin Tg, no mejoraron su desempeño durante el
entrenamiento (grupo x interacciones diarias: F(4,104) =
6.31, p < 0.001 - latencia, F(4,104) = 5.69, p < 0.001
- trayectoria). Ellos gastaron también significativamente menos
tiempo en la búsqueda del cuadrante objetivo (F(1,26) = 7.39,
p < 0.05, Panel F), pero su velocidad de nado no se afectó
significativamente por la inmunización (F(1,26) = 1.73, p
>0.05, Panel H).
La invención provee un ratón transgénico, que
muestra una deposición anormal de A\beta similar a aquella
observada en ciertos desordenes humanos tales como la Enfermedad de
Alzheimer (AD), la variante los Cuerpos de Lewy de la Enfermedad de
Alzheimer, y ciertos tipos de la Enfermedad de
Creutzfeld-Jacob (CJD), que causan demencia, y
angiopatía cerebral hereditaria con el tipo Dutch de amiloidosis
(HCAWA-D) y angiopatía amiloide senil que causa
hemorragia cerebral.
El ratón transgénico de la invención muestra
deficiencias tanto histológicas como de comportamiento como
resultado de la deposición anormal de A\beta. En particular, el
ratón transgénico de la invención muestra una apariencia acelerada
de varias facetas de la patología relacionada con la AD y provee un
modelo mejorado de animal de la AD.
Por lo tanto, la invención se relaciona con un
mamífero no humano que tiene en su genoma un transgén que codifica a
un polipéptido heterólogo APP_{695}, preferiblemente un
polipéptido humano APP_{695}, que porta tanto a la nutación
"Suiza" como a la mutación "Indiana" de la proteína
precursora amiloide de la enfermedad de Alzheimer (APP). Ambas
mutaciones están asociadas, en humanos, con la Enfermedad Familiar
de Alzheimer (FAD).
Lo que se revela aquí es la producción de un
ratón transgénico denominado TgCRND8 que tiene un transgén
APP_{695} que porta tanto a la mutación "Sueca" como a las
mutaciones "Indiana" de la APP.
Las construcciones transgénicas se basaron en un
casete de ADNc que codifica a la isoforma principal de APP en el
cerebro humano, APP_{695}. Este casete se modificó para incluir
dos mutaciones FAD: la mutación "Sueca" (K670N, M671L) y la
mutación "Indiana" (V717F), que se encuentran adyacentes a los
límites N y C-terminales del dominio A\beta de
APP. El casete se introdujo en cosTet, un vector de expresión del
promotor prión que dirige la expresión del transgén en forma
independiente de la posición en neuronas del CNS, y en menor medida
astrocitos. Las microinyecciones se llevaron a cabo en oocitos de un
ambiente genético híbrido, incluidas las cepas CH3 y C57BL6. La
línea de ratón transgénico fue denominada TgCRND8.
Como lo entenderán aquellos ordinariamente
entrenados en la técnica, puede utilizarse cualquier promotor que
dirija la expresión neuronal o al sistema nervioso central del
transgén. Estos incluyen al promotor génico de la enolasa,
específico de la neurona (37); al promotor de la subunidad del
factor de crecimiento B derivado de plaquetas humanas (38), al
promotor Thy-1 (19) y al promotor de neurofilamentos
(41).
El casete de expresión incluye preferiblemente a
las secuencias de la región de control del locus y del promotor a
partir de un gen que se expresa en el cerebro y preferiblemente que
se expresa a un nivel en proporción con el número de copias
transgénicas incorporadas dentro del genoma.
El uso de un casete del transgén
doble-cis mutante de la APP_{695} no ha sido
previamente reportado; otros modelos de la AD han utilizado a los
transgenes (KM670/671NL + V717I)(19) o APP_{770} (KM670/671NL +
V717F)(27) de la APP_{751}.
Los ratones TgCRND8 exhiben profusos depósitos
amiloides en el CNS, en la forma de placas esféricas inmunoreactivas
para el péptido A\beta tan pronto como a los 90 días después del
nacimiento, tales placas son características de la AD humana. Los
depósitos aislados de placa son visibles en ratones TgCRND8 tan
pronto como a los 66 días después del nacimiento. La aparición de
los depósitos amiloides en ratones TgCRND8 ocurre más pronto que en
cualquier modelo de animal reportado previamente de la AD empleando
transgenes únicos (ver Tabla 1).
Se ha publicado una revisión (16) de los modelos
murino de la Enfermedad de Alzheimer y se enlistan algunos
ejemplos en la Tabla 1. Como se observa a partir de las propiedades
enlistadas, los ratones TgCRND8 representan una mejora sustancial e
inesperada sobre otros modelos disponibles de animales de la AD.
Por ejemplo, el modelo transgénico
doble-cis mutante de la APP descrito anteriormente,
el ratón "TgAPP22", que emplea un casete doble mutante de
APP_{751} (KM670/671NL + V717I), que mostró la apariencia de
placas A\beta a los 18 meses de edad (19) y la línea J9, un
casete doble mutante de la APP_{770} (KM670/671NL + V717F), se
reportó que desarrollo placas a lo 8-10 meses
(27).
El ratón bitransgénico reportado anteriormente,
Tg2576 x TgPS1, tenía mínimos depósitos de placa en el corteza
cingulada a partir de los 70 días de edad (39) pero eventualmente
mostró depósitos bien formados a los 6 meses (22).
El ratón TgCRND8 y los ratones transgénicos de
la invención son útiles para el descubrimiento y desarrollo de
compuestos de diagnóstico y terapéuticos para el tratamiento de la
AD, así como para la mejor elucidación de los mecanismos patogénicos
de la enfermedad.
Los ratones TgCRND8 exhiben deficiencias en el
aprendizaje espacial, como se evalúa por medio de la versión de la
plataforma oculta del laberinto de agua de Morris. Estas
deficiencias, medidas contra los compañeros de camada no
transgénicos de control, pueden detectarse tan pronto como a las 11
semanas de edad (Figura 1).
Los inventores han mostrado también que la
inmunización de los ratones TgCRND8 con péptido A\beta_{42}
humano, utilizando el protocolo de Schenk y colaboradores (26),
resulta en una mejora significativa tanto en el comportamiento como
en la neuropatología a las 10-22 semanas de edad,
como se describe en el Ejemplo 5. En contraste, los ratones PDAPP
utilizados por Schemk y colaboradores han mostrado que solamente
exhiben una mejora en la neuropatología pero no en el comportamiento
(26).
El modelo TgCRND8 es por lo tanto el primer
modelo de animal de la AD en el cual la modulación del depósito de
A\beta (un evento de iniciación conocido y ampliamente aceptado en
la Enfermedad de Alzheimer) se ha mostrado que conduce a la mejora
tanto de la patología como del comportamiento, proveyendo así el
modelo más apropiado hasta la fecha para probar nuevas terapias y
para investigar a los candidatos para compuestos terapéuticos.
Tales terapias o compuestos pueden dirigirse a
la inhibición de las funciones de la PS1 en la escisión con
\gamma-secretasa de la \betaAPP o para acelerar
la remoción de los derivados proteolíticos de \betaAPP. Estos
derivados proteolíticos de la APP incluyen a la misma A\beta, que
es conocida por ser neurotóxica en formas agregadas, así como los
derivados C-terminales resultantes de la escisión
con \gamma-secretasa de las cepas \alpha y
\beta (C83/C99-\betaAPP) que se ha sugerido que
son neurotóxicas (25).
Los ratones transgénicos de la invención también
son útiles para el desarrollo de nuevos diagnósticos. Por ejemplo,
los ensayos putativos de la carga cerebral de A\beta o las pruebas
para lesión neuronal en respuesta a la acumulación de A\beta
pueden llevarse a cabo con los ratones transgénicos descritos
aquí.
Los mamíferos transgénicos no humanos descritos
aquí, que tienen un transgén que codifica a la APP_{695} tanto con
la mutación Sueca como con la mutación Indiana, pueden cruzarse con
otras líneas del mamífero que soporta una mutación diferente, ya sea
en un gen transgénico o en uno endógeno, para producir un
"mamífero bitransgénico".
Un "mamífero bitransgénico" como se lo
utiliza aquí significa un mamífero cuyo genoma incluye un transgén
que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un
polipéptido heterólogo de la APP_{695}, preferiblemente un
polipéptido humano de la APP_{695}, que porta a las mutaciones
Sueca e Indiana de la APP y a un segundo gen seleccionado,
preferiblemente un gen que incluye una secuencia de nucleótidos que
codifica a una proteína que tiene al menos una mutación
seleccionada.
El segundo gen puede ser un gen endógeno que
soporta al menos a una mutación seleccionada, o a un transgén
homólogo o heterólogo que soporta al menos a una mutación
seleccionada. La mutación seleccionada puede ser, por ejemplo, una
mutación relacionada con la AD o una mutación en un gen relacionado
con el procesamiento de A\beta.
Alternativamente, el segundo gen seleccionado
puede ser un transgén normal.
Los ratones TgCRND8 descritos aquí son útiles
para la creación de los modelos de ratón de la AD de la invención,
porque la trayectoria para la síntesis acelerada del péptido
A\beta no se satura en estos ratones, permitiéndoles a ellos
cruzarse con otros ratones transgénicos para dar los modelos
bitransgénicos de la invención, con mejoras adicionales del proceso
patológico relacionado con la AD de la síntesis y deposición del
péptido amiloide.
Los ratones TgCRND8 pueden cruzarse, por
ejemplo, con animales transgénicos que soportan un gen mutante de
presenilina, un gen mutante APOE4, un gen mutante de nicastrina o un
mutante diferente de un gen de la APP.
Por lo tanto, de acuerdo con la invención, se
proveen ratones bitransgénicos que pueden ser producidos por medio
del cruzamiento de un ratón TgCRND8 con
- (a)
- un ratón transgénico que incluye a un transgén que codifica a una proteína mutante presenilina 1, preferiblemente una proteína presenilina 1 PS1 (L286V);
\newpage
- (b)
- un ratón transgénico que incluye a un transgén que codifica a una proteína mutante presenilina 2, preferiblemente una proteína presenilina 2 PS2 (M239V), o
- (c)
- un ratón transgénico que incluye a un transgén que codifica a una proteína presenilina 1 que tiene dos mutaciones, preferiblemente una proteína presenilina 1 PS1 (M146L + L286V).
La primera generación de descendientes producida
por cruzamiento se investiga utilizando métodos convencionales, por
la presencia y expresión tanto del primero como del segundo
transgenes, para seleccionar ratones bitransgénicos.
Los ratones TgCRND8 pueden cruzarse también con
animales transgénicos que soportan una mutación en un gen
relacionado con el procesamiento de A\beta, tal como el gen
relacionado con el receptor de lipoproteína de baja densidad, un gen
de \alpha2-macroglobulina o un gen de
\beta-secretasa.
Los ratones TgCRND8 se cruzaron con ratones
transgénicos que sobre expresan transgenes de presenilina humana
mutante (PS1 o PS2) (Tabla 2). Se observó un potente incremento en
la densidad de la placa en ratones TgCRND8 que coexpresan a un
transgén mutante de presenilina humana denominada
TgPS1(L286V)1274 (que porta una mutación de la
enfermedad familiar de Alzheimer (FAD)). Por lo tanto, en los
ratones TgCRND8 x TgPS1(L286V)1274, ya está presente
una carga de amiloide muy parecida a la de la autopsia de un cerebro
con AD, a los 62 días de edad (Figura 1A: comparar con los ratones
TgCRND8 a los 117 días de edad en el Panel C).
En forma similar, el cruce de ratones TgCRND8
con ratones que portan la forma mutante de la FAD de presenilina 2
(una mutación de metionina a valina en el residuo aminoácido 239 de
la región de codificación del gen de la PS2) también resulta en un
potente incremento en la densidad de la placa. Una comparación a la
edad de 91 días de ratones TgCRND8 y TgCRND8 x TgPS2(M239V)
(en donde la línea transgénica se denomina 1379) se muestra en la
Figura 2.
Se obtuvo una mejora aún mayor por medio del
cruzamiento de ratones TgCRND8 con ratones que soportan un transgén
humano mutante de presenilina con dos mutaciones de la FAD en cis
con cada uno de los otros, denominado
Tg(M146L+L286V)6500. En ratones TgCRND8 x
TgPS1(M146L+L286V)6500, los depósitos de amiloide en
el hipocampo se detectaron a los 30 días de edad (Figura 3), que es
5 meses más temprano que lo previamente reportado para cualquier
otro de los ratones Tg con APP/PS1 doble (que típicamente
desarrollan placas a, o después de los 6 meses de edad) (22,
23).
Todos estos ratones bitransgénicos de la
invención mostraron una aparición aún más acelerada de placas
amiloides en el hipocampo, en comparación ya sea con los padres
TgCRND8 o los padres TgPS1 (Tabla 2).
Además de la aparición acelerada de
características relacionadas con la AD en comparación con los
ratones Tg anteriormente descritos, los análisis preliminares
indican que es evidente una perdida sustancial de neuronas
corticales en ratones bitransgénicos TgCRND8 x
TgPS1(M146L+L286V)6500 de 43 días de edad.
También se observa un deterioro progresivo en el
desempeño cognitivo que comienza a las 8-10 semanas
de edad en ratones bitransgénicos generados por el cruzamiento de
ratones TgCRND8 con ratones que expresan un alelo de FAD de
presenilina 2 (TgPS2(M239V), línea 1379 (Figura 5).
Los ratones TgCRND8 descritos aquí, y los cruces
de estos ratones con otras líneas de ratones que soportan una
mutación seleccionada, por ejemplo una mutación relacionada con la
AD, como se describe además aquí, son útiles para una variedad de
propósitos.
Estos ratones pueden ser utilizados para
investigar compuestos farmacéuticos potenciales por su eficiencia
en la prevención o el retraso en el desarrollo de cualquiera de los
indicios patológicos, por ejemplo los rasgos fenotípicos
relacionados con la AD, observados en estos ratones. Existe por lo
tanto un método previsto para investigar a los compuestos
candidatos por su eficacia en la prevención o el retraso en el
desarrollo de la AD. El método para la investigación incluye la
administración de un compuesto candidato a un ratón transgénico de
la invención antes de la aparición de un rasgo fenotípico
seleccionado relacionado con la AD, y la comparación de la edad a
la cual aparece el rasgo fenotípico seleccionado en los ratones
tratados con la edad de aparición de aquel rasgo en ratones
transgénicos no tratados. Los rasgos adecuados relacionados con la
AD para el examen incluirían la apariencia de histología cerebral
anormal o la aparición de deficiencias en el comportamiento. Las
deficiencias en el comportamiento pueden determinarse, por ejemplo,
por medio del examen del desempeño de los ratones en un ensayo de
memoria o de aprendizaje tal como la prueba del laberinto en agua,
como se describió aquí.
Estos ratones pueden también ser utilizados para
investigar a los compuestos farmacéuticos potenciales por su
eficiencia en el mejoramiento de los síntomas de la AD, por medio
de la administración similar y la comparación de los efectos de los
compuestos candidatos en animales transgénicos después de la
aparición de un rasgo relacionado seleccionado de la AD, tal como
histología anormal del cerebro o un déficit de comportamiento.
La etiología específica de la enfermedad puede
ser identificada durante el crecimiento y el desarrollo del animal
transgénico para estudiar el progreso de la enfermedad y los efectos
tanto físicos como fisiológicos. Los ratones transgénicos de la
presente invención que en corto tiempo sobre expresan rápidamente
A\beta en el cerebro, pueden elaborarse y estudiarse ahora, y
utilizarse como modelo para estudiar posibles terapias que incluyen
intervención farmacéutica, técnicas de focalización en los genes,
terapias antisentido, terapias con anticuerpos, etc. Además, pueden
establecerse y estudiarse también líneas celulares transgénicas
in vitro con el propósito de elucidar los sistemas de
señalamiento intracelular involucrados en la enfermedad así como el
ensayo y la identificación de compuestos potencialmente
terapéuticos.
Además, los ratones transgénicos de la presente
invención pueden también ser utilizados para examinar las
situaciones o los ambientes peligrosos que se sospecha que aceleran
o inician la Enfermedad de Alzheimer, tales como por ejemplo,
trauma craneal o agentes ambientales tóxicos. En este caso, puede
exponerse al ratón transgénico a una situación particular y luego
observarlo para determinar la declinación en el comportamiento
neural, la muerte prematura, gliosis, etc., como indicadores de la
capacidad de la situación para provocar más y/o incrementar la
AD.
Los ratones transgénicos de la presente
invención son útiles para la caracterización más detallada de la
Enfermedad de Alzheimer que conduzca a la elucidación de la
patogénesis de la patología neurológica progresiva y la
determinación de la secuencia de eventos moleculares. Los ratones
transgénicos son útiles para el estudio de diferentes mecanismos
propuestos de la patogénesis de la enfermedad con el propósito de
conducir a mejores tratamientos de la enfermedad.
Los ratones transgénicos de la invención son
también útiles pata la identificación de genes no reconocidos
anteriormente que pueden también jugar un papel en la AD, ya sea en
forma beneficiosa o perjudicial. Un ratón transgénico que soporta
un gen candidato se cruza con un ratón transgénico de la invención y
se examina el efecto de la presencia del gen candidato sobre los
rasgos relacionados con la AD del transgénico. Un gen candidato se
marcará como beneficioso si retrasa o diluye a los fenotipos
relacionados con la AD tales como la deposición de amiloide y el
empeoramiento del desempeño cognitivo. A la inversa, un gen
candidato será marcado como favorecedor del desarrollo de la AD si
aumenta la edad de aparición o mejora la penetrancia de los
fenotipos relacionados con la AD tales como la deposición de
amiloide y el empeoramiento del desempeño cognitivo.
Adicionalmente, los ratones transgénicos de la
invención son útiles para ensayar las posibles terapias génicas
para la AD familiar, por ejemplo la terapia génica por medio de la
administración de copias adicionales de un gen normal de
presenilina.
Se entenderá por aquellos entrenados en la
técnica que los ratones transgénicos de la presente invención
proporcionan modelos no humanos de animales de la Enfermedad
humana de Alzheimer. Tales modelos permiten la identificación del
papel de \betaAPP y del péptido A\beta como involucrados en la
Enfermedad de Alzheimer.
Los ratones son a menudo utilizados como modelos
de animales transgénicos debido a que son fáciles de alojar,
relativamente baratos, y fáciles de criar. Sin embargo, también
pueden elaborarse otros mamíferos transgénicos no humanos tales
como, pero sin limitarse a, monos, ovejas, conejos y ratas. Los
animales transgénicos son aquellos que portan un transgén, esto es,
un gen clonado introducido e incorporado en forma estable que se
transmite a generaciones sucesivas. En la presente invención el ADNc
de la proteína APP_{695} humana fue clonado y modificado para
contener dos mutaciones de la FAD, la mutación "Sueca" (K670N,
M671L) y la mutación "Indiana" (V717F). Esta construcción se
incorporó entonces en forma estable dentro del genoma de un
ratón.
Existen varios métodos por medio de los cuales
crear un modelo de animal transgénico que porte una cierta secuencia
génica además de aquella específicamente descrita aquí.
La generación de una alteración/mutación
específica de la secuencia génica de la APP humana es una
estrategia. Las alteraciones pueden logarse por medio de una
variedad de métodos enzimáticos y químicos utilizados in
vitro. Uno de los métodos más comunes es la utilización de un
oligonucleótido específico como un mutágeno para generar supresiones
diseñadas en forma precisa, inserciones y mutaciones puntuales en
una secuencia de ADN. En segundo lugar, un gen silvestre de tipo
humano y/o un gen murino humanizado podrían ser insertados por
medio de recombinación homóloga. También es posible insertar un gen
humano mutante o alterado (sencillo o múltiple) como construcciones
genómicas o de minigén utilizando elementos promotores de tipo
silvestre o mutante o artificial. La desactivación de los genes
endógenos murino puede logarse por inserción de fragmentos
modificados artificialmente del gen endógeno por medio de
recombinación homóloga. En esta técnica, los alelos mutantes se
introducen por medio de recombinación homóloga dentro de células
madre embrionarias. Las células madre embrionarias que contienen una
mutación desactivada en un alelo del gen que está siendo estudiado,
se introducen dentro de embriones tempranos de ratón. Los ratones
resultantes son quimeras que contienen tejidos derivados tanto de
las células ES transplantadas como de las células huésped. Se
emparejó a los ratones quiméricos para evaluar si la mutación se
incorpora dentro de la línea germinal. Se empareja a aquellos
ratones quiméricos cada uno heterocigoto para la mutación
desactivada para producir ratones homocigotos desactivados.
Los genes desactivados que producen el
reconocimiento génico permiten evaluar la función in vivo de
un gen que ha sido alterado y utilizado para reemplazar una copia
normal. Las modificaciones incluyen la inserción de codones mutantes
de detención, la supresión de secuencias de ADN, o la inclusión de
elementos recombinantes (sitios lox p) reconocidos por medio de
enzimas tales como la Cre recombinasa. El sistema
Cre-lox permite la ablación de un gen dado o la
ablación de una cierta porción de la secuencia del gen.
Para inactivar al gen, puede aplicarse
mutagénesis química o por rayos X de gametos de ratón, seguido de
fertilización. La descendencia del heterocigoto puede ser
identificada entonces por medio de transferencias de Southern para
demostrar la perdida de un alelo por medio de dosificación, o
perdida para heredar un alelo parental utilizando marcadores
RFLP.
Para crear un ratón transgénico, puede
insertarse una versión alterada del gen humano de interés dentro de
una línea germinal de ratón utilizando técnicas estándar de
microinyección de oocito o transfección o microinyección dentro de
células madre. Alternativamente, si se desea inactivar o reemplazar
al gen endógeno, puede aplicarse recombinación homóloga utilizando
células madre embrionarias como se describió anteriormente.
Para la inyección del oocito, pueden insertarse
una o más copias de la secuencia génica de la APP humana
alterada/mutada dentro del pronucleo de un oocito de ratón
recientemente fertilizado. Este oocito se reimplanta entonces en
una madre de acogida pseudopreñada. Los integrantes de los ratones
que nacieron vivos pueden ser investigados entonces utilizando
análisis del ADN de la cola por la presencia de las secuencias
alteradas de los genes de la APP. El transgén puede ser o bien una
secuencia genómica completa inyectada como un YAC o un fragmento de
cromosoma, un ADNc ya sea con el promotor natural o un promotor
heterólogo, o un minigén que contiene toda la región de codificación
y otros elementos encontrados como necesarios para la expresión
óptima.
La infección retroviral de embriones tempranos
puede hacerse también para insertar al gen alterado. En este
método, el gen alterado se inserta dentro de un vector retroviral
que se utiliza para infectar directamente a los embriones de ratón
durante las etapas tempranas de desarrollo para generar una quimera,
algunas de las cuales conducirá a transmisión por línea
germinal.
La recombinación homóloga utilizando células
madre permite la investigación de las células por transferencia
génica para identificar los raros eventos de recombinación homóloga.
Una vez identificados, estos pueden ser identificados para generar
quimeras por medio de inyección de blastocistos de ratón, y una
proporción de los ratones resultantes mostrarán transmisión por
línea germinal a partir de la línea recombinante. Esta metodología
de reconocimiento génico es útil especialmente si se desea la
inactivación del gen. Por ejemplo, la inactivación del gen puede
hacerse por medio del diseño de un fragmento de ADN que contiene
secuencias de un exón que flanquea a un marcador seleccionable. La
recombinación homóloga conduce a la inserción de las secuencias del
marcador en la mitad de un exón, inactivando al gen. Los análisis
del ADN de los clones individuales pueden ser utilizados entonces
para reconocer los eventos homólogos de recombinación.
También es posible crear mutaciones en la línea
germinal del ratón por medio de la inyección de nucleótidos que
contienen la mutación de interés y se investiga a las células
resultantes por medio de PCR.
Alguien entrenado en la técnica comprendería
fácilmente que las construcciones de ácido nucleico como las
utilizadas para producir a los mamíferos transgénicos de la
invención pueden contener cualquier secuencia apropiada de ácido
nucleico que codifique a la proteína mutante APP_{695} que conduce
a una mayor producción de A\beta en el cerebro. Tal secuencia de
ácido nucleico es preferiblemente el ADNc de la APP_{695} mutada
completa, pero puede abarcar otros derivados alterados de tal
secuencia mientras que la forma deseada del mutante de la proteína
se expresa y se incrementa marcadamente la producción de
A\beta.
Los ejemplos que se describen son para
propósitos de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la
invención.
Se hace referencia a métodos de síntesis
química, bioquímica de proteínas y de péptidos, biología molecular,
histología e inmunología pero no se describen explícitamente en esta
descripción, y los ejemplos que se reportan en la literatura
científica son bien conocidos por aquellos entrenados en la
técnica.
Ejemplo Preparativo
1
Un casete de ADNc de Proteína Precursora
\beta-Amiloide humana (1)(\betaAPP) incluye 90
pares de bases de una región no traducida 5', una región de
codificación de 695 residuos de aminoácido ("APP695"), y una
región no traducida 3' de 271 pares de bases fueron mutagenizadas
para introducir, en posición cis una con respecto a la otra, dos
mutaciones asociadas con la Enfermedad familiar de Alzheimer (FAD).
La primera mutación fue la mutación "Sueca" (2), un cambio di
nucleótido afectando a dos codones adyacentes
(KM670/671NL:GA\rightarrowTC en los nucleótidos 1785 y 1786,
utilizando la numeración del codón/nucleótido del transcrito de la
APP770 (1)). La segunda mutación fue un cambio sencillo de
nucleótido para producir la sustitución V717F (3) (G\rightarrowT
en el nucleótido 1924, utilizando la numeración del codón/nucleótido
del transcrito de la APP770 (1)). El transcrito de la APP695, que
carece de los exones 7 y 8 codifica al domino inhibidor de la
Proteasa Kunitz, es el principal transcrito expresado en el
cerebro. El casete de ADNc de la \betaAPP doble mutante se inserto
dentro del vector de expresión del cósmido de la proteína prión
cosTet. (10).
\newpage
El clon resultante del cósmido recombinante se
expandió en el cultivo, se lo lisó para producir ADN súper
enrollado, y el inserto de ADN de mamífero incluyendo a los
elementos reguladores del gen PrP y a la región de codificación de
la APP cortada desde las secuencias del vector procariota en este
clon molecular por medio de digestión con la endonucleasa de
restricción Not1. Después de la electroforesis sobre gel de agarosa
para purificar este fragmento de ADN del transgén Not1, se
microinyectó al ADN purificado dentro de los oocitos fertilizados
de ratón (derivados del apareamiento de ratones (C3H x C57BL6)),
utilizando protocolos estándar (29). Después del implante dentro de
las madres de acogida, se investigaron a los nacimientos vivo entre
los descendientes positivos del transgén por medio de análisis de
hibridación del ADN de la cola, utilizando un fragmento de sonda de
ADN derivado de la región no traducida 3' del gen PrP del hámster
Sirio (30).
Se utilizaron anticuerpos específicos para la
APP (Senetek Inc., Boehringer-Mannheim) para
establecer la expresión transgénica en un descendiente positivo del
transgén. Los homogenizados de cerebro al 10% elaborados en
sacarosa 0,32M fueron diluidos con amortiguador Laemlli, sonicados y
corrieron sobre geles de gradiente de tricina al
10-20% (Novex). Después de transferir a
nitrocelulosa, se detectaron a la APP y a la PS1 humanas utilizando
C y N-terminal específico de Mab y desarrollada por
ECL (Amersham). Los resultados se muestran en la Figura 6. Además
de la holoproteína APP completa madura e inmadura de 120 y 100 kDa,
el análisis de las transcripciones de Western revelo especies de
bajo peso molecular en extractos de cerebro de ratones TgCRND8, con
niveles más bajos de expresión de la APP. La detección de estas
especies con antisuero 6E10 (posicionado N-terminal
al sitio de escisión de la \alpha-secretasa) y el
anticuerpo 369 indica que estos se derivan del
C-terminal de la APP. Estos fueron probablemente
intermediarios en el procesamiento de la APP que se acumularon
hasta altos niveles en virtud de la sobre expresión, y corresponden
a fragmentos C-terminales (CTF) que comienzan en el
sitio de la \beta-secretasa (llamadas cepas
\beta). En ratones TgCRND8 envejecidos, pero no compañeros de
camada sin Tg emparejados por edad o ratones Tg2576, se detectaron
también niveles crecientes de especies de 4kDa como animales
envejecidos. Las especies inmunoreactivas de 4kDa corresponden al
péptido A\beta, que se acumula hasta niveles altos durante el
tiempo de vida de estos animales.
La microinyección de transgenes de ADN dentro de
oocitos, como se describió anteriormente, conduce a la inserción de
los transgenes en forma aleatoria dentro del genoma del ratón. El
mapeo de la endonucleasa de restricción de los transgenes
insertados demuestra que ellos se insertan en el orden cabeza con
cola, con el número de transgenes por ordenación (número de copias)
alcanzando más de 100 copias transgénicas por genoma haploide
(24).
Los ratones transgénicos que expresan a la APP
humana deben mostrar sobre expresión de APP, preferiblemente 5 a 6
veces el nivel de expresión endógena, para amiloidogénesis óptima.
La expresión de la APP en el cerebro se determina por medio del
análisis de las transferencias de Western utilizando un anticuerpo
dirigido a la APP tal como 22C11 (Roche Diagnostics) que reconoce
tanto a la APP de ratón como a la humana.
El trabajo previo sobre el vector cos.Tet de la
proteína prión a mostrado una expresión independiente de la
posición de la ordenación del transgén, de tal manera que los
niveles de expresión del transgén aumentan paralelamente con el
número de copia (4, 40). Cuando se utiliza este vector, los ratones
transgénicos con el nivel alto deseado de expresión de APP, pueden
por lo tanto ser identificados primero por medio de la
identificación, por análisis de hibridación (30) de ratones
transgénicos positivos con un alto número de copias del transgén,
preferiblemente al menos 30 copias.
Aunque los ratones que contienen el ambiente
genético FVB/N son propensos a la muerte prematura en la vida
temprana de adulto, atribuida a un efecto pobremente definido de la
sobre expresión de APP, esta tendencia se atenúa en un ambiente
genético derivado de las cepas C57 y C3H. Los ratones TgCRND8
establecen por lo tanto que los niveles del péptido A\beta pueden
ser tolerados sin comprometer la viabilidad.
La inmunocoloración se llevó a cabo utilizando
el anticuerpo específico humano 4G8, que reacciona con el fragmento
proteolítico A\beta de la APP, utilizando secciones fijadas en
formalina, cera parafínica en bebida con material del cerebro. Los
protocolos estándar para este procedimiento inmunohistoquímico han
sido descritos en otra parte (17, 20, 23). Los depósitos aislados
de placase hacen visibles primero en ratones TgCRND8 tan pronto
como a los 60 días después de nacimiento, con una deposición robusta
de placas amiloides difusas de 90 días de edad. Las placas con
núcleo denso fueron aparentemente de 4-5 meses de
edad, con muchos de estos tipos de depósitos coloreados con Rojo
Congo (un reactivo que se intercala dentro de las láminas \beta
ricas en depósitos de amiloide) para producir birrefringencia
verde/dorada bajo luz polarizada. Depósitos birrefringentes
similares están presentes en muestras de cerebro humano con AD. Los
depósitos de amiloide fueron prominentes en el hipocampo y en la
corteza cerebral (especialmente en la corteza frontal) de ratones
TgCRND8, áreas muy afectadas por la Enfermedad de Alzheimer en
humanos. El cerebelo, que usualmente está libre en AD esporádica,
pero que puede ser afectado en forma suave por depósitos difusos de
A\beta en los casos severos tempranos de la AD, también se afecta
suavemente en ratones TgCRND8 de un año de edad y en ratones TgCRND8
que coexpresan PS1 o PS2 mutante a los 6 meses de edad.
Aunque la APP se expresó sistemáticamente en
ratones TgCRND8, (como en el gen PrP del hámster), los depósitos de
amiloide no se manifestaron por inmunocoloración en el riñón, el
músculo esqueletal y el músculo cardiaco de animales envejecidos
con deposición florida sobre el CNS, aún cuando estos son sitios
conocidos de la expresión de ARNm del PrP.
Se evaluó el aprendizaje espacial en ratones
TgCRND8 utilizando un paradigma bien establecido, el laberinto en
agua de Morris (31) como se describió (32). El análisis de
comportamientote los ratones TgCRND8 reveló una deficiencia
cognitiva significativa en su adquisición de información espacial
evaluada en la versión de discriminación de lugar (plataforma
oculta en la misma posición espacial) de un laberinto en agua tan
temprano como a las 11 semanas de edad. Durante el entrenamiento,
los ratones mostraron una velocidad de aprendizaje
significativamente menor reflejada en sus latencias más largas de
escape y en las trayectorias de búsqueda así como la búsqueda de
cambio de nivel del cuadrante que contenía a la plataforma oculta
(Figura 1). Los ratones TgCRND8 también mostraron déficit en la
memoria espacial cuando fueron analizados en el ensayo de prueba.
Durante este ensayo, se removió la plataforma oculta y se les
permitió a los ratones buscar su posición durante 60 segundos.
Mientras que los ratones sin Tg mostraron una clara propensión
espacial selectiva por la posición de la plataforma (Figura 1, E y
F), la búsqueda de los ratones TgCRND8 fue más generalizada e
incluyó a los cuadrantes adyacentes a TQ, y cruzó la corona central
de la posición de la plataforma significativamente menos que los
compañeros de camada sin Tg. Las habilidades de nado tanto de los
ratones sin Tg como de los APP positivos fueron comparables durante
el ensayo, que no segaron por lo tanto las mediciones del
aprendizaje.
Se apareó a los ratones TgCRND8 con ratones
transgénicos que soportan a un gen mutante de presenilina 1
relacionado con la FAD, designada línea TgPS1 (L286V) 1274, su
progenie fue destetada, y se removieron las biopsias de la cola
para la preparación de AD genómico. Los ADN purificados de la cola
fueron inmovilizados en ordenamientos de "manchas puntuales"
sobre una membrana de Nylon e hibridados para utilizar una sonda
específica para el gen de la región de codificación de la APP
humana cortada de un clon de ADNc o de un fragmento de sonda de la
región de clonación de la PS1 humana cortado de un clon de ADNc.
Estos fragmentos d restricción de ADNc fueron marcados por medio de
la preparación aleatoria con
\alpha-32p-dCTP (33). Los
duplicados de las membranas de Nylon se incubaron ya sea con las
sondas de hibridación de la APP o de SP1, y lavadas en una solución
de dodecil sulfato de sodio al 0,1%, 0,1 de citrato de sodio en
suero fisiológico a una temperatura de 65ºC (esto corresponde a un
"riguroso" lavado posterior a la hibridación de tal manera que
las señales que se derivan de los genes endógenos de PS1 y de APP
en el genoma del ratón se minimizan). Los ratones bitransgénicos
fueron identificados en virtud al hecho de que las muestras
hibridas correspondientes al ADN de la cola hibridaron con ambas
sondas específicas para el gen de la APP y de la PS1.
La deposición de amiloide se amplificó en los
ratones bitransgénicos resultantes, mostrando estos ratones una
carga de amiloide que se parece mucho a la autopsia del cerebro
humano con la AD a los 62 días de edad.
En ratones envejecidos, la deposición de
amiloide fue suficientemente florida que se extendió hasta las
estructuras usualmente libres en ratones transgénicos individuales
(por ejemplo, cerebelo).
Los ratones TgCRND8 fueron cruzados también con
la línea transgénica denominada como línea TgPS2(M239V) 1379,
que expresa a un alelo mutante de la presenilina 2 en el contexto
del mismo vector de expresión del cósmido de la proteína prión
cos.Tet. Los ratones bitransgénicos TgCRND8 x TgPS2
(M239V)1379 se genotiparon como se describió anteriormente
para los ratones TgCRND8 x TgPS1 (L286V)1274, con la
excepción de que se utilizó una sonda de hibridación del ADN de la
región de codificación PS2, en lugar de una sonda de hibridación de
la región de codificación PS1.
Estos ratones bitransgénicos exhibieron profusos
depósitos amiloides en el CNS en la forma de placas inmunoreactivas
esféricas para el péptido A\beta a los 91 días después del
nacimiento. Estos depósitos amiloides se ubicaron en el hipocampo y
en la corteza cerebral, en áreas muy afectadas por la Enfermedad de
Alzheimer en humanos. El cerebelo usualmente se afecta solamente
por medio de los depósitos difusos de A\beta solamente en los
casos severos tempranamente libres de la Enfermedad de Alzheimer; se
afecta en ratones con las cargas más pesadas de placa.
Los ratones bitransgénicos TgCRND8 x TgPS2
(M239V)1379 fueron analizados a los 2 meses de edad y
mostraron un defecto cognitivo significativo en la adquisición de
aprendizaje espacial con el tamaño del efecto en el rango del 40%
(Figura 2, paneles A & B). Durante el siguiente ensayo inverso,
sin embargo, aunque inferior al comienzo, los ratones
bitransgénicos mostraron un desempeño comparable hacia el final del
análisis (aproximadamente 20% de variación explicada por el
transgenotipo) (Figura 2, paneles C & D). Durante la nueva
prueba a los 5 meses de edad, los mismos ratones bitransgénicos
mostraron un déficit de aprendizaje significativamente alto durante
la adquisición y el
ensayo inverso (tamaño del efecto debido al transgenotipo de 60% y 70% respectivamente) (Figura 2, Paneles E & F). Los ratones bitransgénicos tampoco difirieron de los ratones TgPS2(M239V)1379 en su velocidad de nado a cualquier edad analizada. La expresión de la APP humana mutada en presencia del gen mutado PS2 confiere un empeoramiento en el aprendizaje espacial y en la memoria como tan temprano como a los dos meses de edad, comparado con el desempeño de los ratones TgPS2(M239V)1379 que se comportaron en una forma similar a los ratones no transgénicos derivados de la misma combinación de cepas consanguíneas. Este empeoramiento en el progreso con la edad y para una edad de 5 meses, los ratones muestran una constante deficiencia en la adquisición de nueva información
espacial.
ensayo inverso (tamaño del efecto debido al transgenotipo de 60% y 70% respectivamente) (Figura 2, Paneles E & F). Los ratones bitransgénicos tampoco difirieron de los ratones TgPS2(M239V)1379 en su velocidad de nado a cualquier edad analizada. La expresión de la APP humana mutada en presencia del gen mutado PS2 confiere un empeoramiento en el aprendizaje espacial y en la memoria como tan temprano como a los dos meses de edad, comparado con el desempeño de los ratones TgPS2(M239V)1379 que se comportaron en una forma similar a los ratones no transgénicos derivados de la misma combinación de cepas consanguíneas. Este empeoramiento en el progreso con la edad y para una edad de 5 meses, los ratones muestran una constante deficiencia en la adquisición de nueva información
espacial.
Los ratones TgCRND8 fueron cruzados con ratones
transgénicos que soportan dos mutaciones de PS1 (M146L + L286V)
(34). Los ratones doble mutantes PS1 fueron creados por medio de
procedimientos estándar, como se describió previamente (35). Los
ratones bitransgénicos fueron identificados por medio del análisis
del genotipo del ADN de la cola por hibridación con dos sondas
independientes de ADN, como de describió anteriormente para los
ratones bitransgénicos TgCRND8 x TgPS1(L286V)1274.
Los ratones bitransgénicos dobles resultantes
mostraron depósitos amiloides A\beta por punción en la corteza al
mes de edad, con múltiples placas difusas de amiloide A\beta
presentes a los 43 días de edad. Algunas de las placas que se
manifestaron a la edad de 43 días eran congofílicas (esto es, pueden
ser coloreadas con el reactivo Rojo Congo).
Ejemplo Comparativo
5
Un grupo de ratones TgCRND8 y un grupo de
compañeros de camada no transgénicos fueron inmunizados con el
péptido sintético A\beta42 como lo describen Schenk y
colaboradores (36). Los grupos de control de los ratones TgCRND8 y
los compañeros no transgénicos de camada fueron inmunizados con un
péptido amiloidogénico de control (polipéptido amiloide de isleta
(IAPP), que se asocia con la patogénesis de diabetes). El desempeño
de estos dos grupos transgénicos en el ensayo del laberinto con
agua, como se describió anteriormente, fue comparado con el
desempeño de los compañeros de camada sin Tg. Los resultados se
muestran en la Figura 3.
Como se observa en la Figura 3, la inmunización
con el péptido A\beta42 atenuó el empeoramiento cognitivo de los
ratones TgCRND8 en etapas tempranas de la inmunización. El desempeño
en el laberinto con agua de los ratones TgCRND8 inmunizados con
A\beta42 o 1APP (inmunización iniciada a las 6 semanas de edad)
fue analizado a las 11 semanas de edad. La inmunización con el
péptido A\beta42 redujo significativamente el déficit cognitivo
en ratones TgCRND8 como se midió por medio de la latencia de escape
(Panel A) y la longitud de la trayectoria de búsqueda (Panel D)
comparado con los compañeros de camada sin Tg. Aunque los ratones
TgCRND8 inmunizados con A\beta42 mostraron latencias totales de
escape más largas (Panel A) y de trayectorias de búsqueda (Panel
D), (F(1,30)=9.71, p<0.01; F(1,30)=10.9, p<0.01
para latencia y trayectoria respectivamente), que los ratones sin
Tg, la diferencia se debió a sus búsquedas iniciales más largas
(grupo x interacciones diarias:
F(4,120)-2.83, p<0.05 - latencia;
F(3,120)=4.73, p<0.01 - trayectoria). La comparación de su
desempeño durante los últimos 3 días de entrenamiento no reveló
diferencias significativas entre los grupos (F(1,30)=0.64,
p>0.05 - latencia; F(1,30)=1.24, p>0.05 - trayectoria).
Los ratones TgCRND8 inmunizados con A\beta42 mostraron una
ligera tendencia a buscar al TQ menor (F(1,30)=3.71, p =
0.06, panel E), pero su velocidad de nado (Panel G) no difirió
significativamente de los ratones sin Tg (F(1,30)=1.33,
p>0.05). Los ratones TgCRND8 inmunizados con IAPP mostraron
latencias de escape significativamente más largas (Panel B) y de
trayectorias de búsqueda (Panel C) que sus compañeros de camada sin
Tg (F(1,26)=39.9, p<0.001- latencia; F(1,26)=43.9,
p<0.001- trayectoria). Aunque los transgénicos no difieren en su
búsqueda inicial de ratone sin Tg, ellos no mejoraron su desempeño
durante el entrenamiento (grupo x interacciones diarias:
F(4,104)=6.31, p<0.001-latencia,
F(4,104)=5.69, p<0.001 - trayectoria). Ellos gastaron
también significativamente menos tiempo buscando el cuadrante
objetivo (F(1,26)=7.39, p<0.05, panel F), pero su
velocidad de nado no se afectó por la inmunización
(F(1,26)=1.73, p>0.05, panel H).
En resumen, la inmunización de los ratones
TgCRND8 con péptido A\beta42 a las 6 semanas seguido por un
refuerzo a las 8 semanas, mejoró significativamente las habilidades
cognitivas de los ratones TgCRND8 en el paradigma del laberinto con
agua administrado a las 11 semanas de edad. Por otro lado, los
ratones inmunizados con IAPP mostraron un empeoramiento
significativo en la adquisición de información espacial comparado
con los compañeros de camada sin Tg (Figura 3), y este
empeoramiento fue de naturaleza similar a aquella observada en los
ratones TgCRND8 no inmunizados (no se muestran los datos).
La inmunización con los péptidos A\beta42 o
IAPP no afectó las habilidades nadadoras de los ratones. Estos
hallazgos indican que la inmunización con A\beta42 (pero no con el
péptido de control IAPP) mejora el desempeño en el laberinto de
agua, y que esta mejora puede ocurrir en un momento coincidente con
la primera deposición de placas amiloides de A\beta en el
hipocampo. Estos hallazgos también establecen que el empeoramiento
cognitivo en TgCRND8 no es debido a un defecto congénito
irreversible.
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| Línea con | Mutación | Isoforma(s) | Edad del comienzo | Edad del comienzo de las | Edad del comienzo de las |
| APP | con APP | con APP | de las placas de | placas de amiloide del | deficiencias en la versión |
| humana | amiloide del A\beta en el | A\beta maduro (coloración | de la plataforma del | ||
| hipocampo por medio | Rojo Congo) | laberinto con agua | |||
| de inmunocoloración | |||||
| PDAPP^{17} | V717F | 695, 751, | 8 meses | ¶No | Sin deficiencias |
| 770^{\text{*}} | reportado | reportadas | |||
| Tg2576^{18} | K670N, | 695 | 9-11 meses | ¶No | Empeoramiento a los |
| M671L | reportado | 9-1 meses en el ambiente | |||
| de la cepa C57xSJL | |||||
| TgAPP23^{19} | K670N, | 751 | Depósitos raros | 6 meses | Sin deficiencias |
| M671L | a los 6 meses | reportadas | |||
| TgAPP22^{19} | K670N, | 751 | 18 meses | Subconjunto de las | Sin deficiencias |
| M671L más | placas presentes a | reportadas | |||
| V717I | los 18 meses | ||||
| APP/Ld/2^{20} | V717I | 695 | 13-18 meses | ¶No | Empeoramiento a los |
| reportado | 3-6 meses en el ambiente | ||||
| de la cepa FVB/N x C57 | |||||
| TgCRND8 | K670N, | 695 | Múltiple depósitos | Un subconjunto de | Empeoramiento a los |
| M671L más | a los 3 meses | placas, aparición | 2.8 meses en el ambiente | ||
| V717F | desde los 4-5 meses | de la cepa C57xC3H | |||
| en adelante | |||||
| * \begin{minipage}[t]{155mm} El casete de ADNc incluye intrones para permitir la producción de los ARNm empalmados de la APP695, 751, y 770.\end{minipage} | |||||
| ¶Se reportó que los depósitos de placa colorearon con Rojo Congo pero no se establecieron las edades. | |||||
| La coloración con tioflavina-S se reportó a los 8 meses en ratones PDAPP y a los 354 días en ratones Tg2576 |
| Origen del | Origen del mutante | Edad del comienzo | Edad del comienzo de las | Edad del comienzo de las |
| mutante con | con presenilina | de las placas de | placas de amiloide del | deficiencias en la versión |
| APP | amiloide del A\beta en el | A\beta maduro (coloración | de la plataforma del | |
| hipocampo por medio | Rojo Congo) | laberinto con agua | ||
| de inmunocoloración | ||||
| Ninguno | Mutante PS1 o PS2 | Ninguna | Ninguna | Ninguna |
| TgCRND8 | Ninguno | 3 meses | 4-5 meses | 2,8 meses\ddagger |
| TgCRND8 | PS1(L286V)1274 | 2 meses | No se hizo | No se hizo |
| TgCRND8 | PS2(M239V)1379 | 2 meses | No se hizo | 2,8 meses\ddagger |
| TgCRND8 | PS1(M146L+L286V)6500 | 1 mes | 1,5 meses | No se hizo |
| Tg2576 | PS1(M146L) | 6 meses, ninguna a | 7 meses | *No se reportó |
| los 3 meses | ||||
| + \begin{minipage}[t]{155mm} Las deficiencias se reportan para estos ratones en otros paradigmas (laberinto Y) y en ratones Tg2576 con "Tg sencillo" de acuerdo con la Tabla 1.\end{minipage} | ||||
| \ddagger \begin{minipage}[t]{155mm}Ratones de prueba en edades tempranas no se realizan en forma rutinaria, ya que los ratones necesitan alcanzar un peso de 25 g y dos semanas de entrenamiento previo antes del ensayo en el paradigma del laberinto con agua.\end{minipage} |
Claims (9)
1. Un ratón transgénico que puede ser
producido por medio de:
- (a)
- el cruce de un primer ratón transgénico cuyo genoma incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en la posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde el transgén se expresa, con un segundo ratón transgénico que tiene un genoma que incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 2 humana en donde el residuo de metionina en la posición 239 se sustituye por valina para producir una primera generación de descendientes; y
- (b)
- la selección de una primera generación de descendientes de un ratón transgénico que tiene un genoma que incluye al menos un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y al menos un segundo transgén que incluye una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 2 humana en donde el residuo de metionina en la posición 239 se sustituye por valina y expresa a ambos de dichos primer y segundo transgenes.
2. Un ratón transgénico que puede ser
producido por medio de:
- (a)
- el cruce de un primer ratón transgénico cuyo genoma incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en la posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde el transgén se expresa, con un segundo ratón transgénico que tiene un genoma que incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina para producir una primera generación de descendientes; y
- (b)
- la selección de una primera generación de descendientes de un ratón transgénico que tiene un genoma que incluye al menos un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y al menos un segundo transgén que incluye una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina y expresa a ambos de dichos primer y segundo transgenes.
3. Un ratón transgénico que puede ser
producido por medio de:
- (a)
- cruce de un primer ratón transgénico cuyo genoma incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en la posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde el transgén se expresa, con un segundo ratón transgénico que tiene un genoma que incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de metionina en la posición 146 se sustituye por leucina y el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina para producir una primera generación de descendientes; y
- (b)
- la selección de una primera generación de descendientes de un ratón transgénico que tiene un genoma que incluye al menos un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y al menos un segundo transgén que incluye una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de metionina en la posición 146 se sustituye por leucina y el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina y expresa a ambos de dichos primer y segundo transgenes.
4. El ratón transgénico de cualquiera de las
reivindicaciones 1-3 en donde el ratón es un ratón
(C3H X C57 BL6) X C57.
5. El ratón transgénico de la reivindicación 4
en donde el ratón muestra una deposición anormal de A\beta en su
sistema nervioso central.
6. El ratón transgénico de la reivindicación 4
en donde el ratón muestra una aparición acelerada de la patología
relacionada con la Enfermedad de Alzheimer.
7. Un ratón transgénico cuyo genoma
incluye:
- un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y un segundo transgén que incluye a un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 2 humana en donde el residuo de metionina en la posición 239 se sustituye por valina y en donde los transgenes se expresan.
8. Un ratón transgénico cuyo genoma
incluye:
- un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y un segundo transgén que incluye a un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina y en donde los transgenes se expresan.
9. Un ratón transgénico cuyo genoma
incluye:
- un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y un segundo transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de metionina en la posición 146 se sustituye por leucina y el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina y en donde los transgenes se expresan.
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