ES2445446T3

ES2445446T3 - Animales no humanos cuatro veces transgénicos

Info

Publication number: ES2445446T3
Application number: ES08843771.0T
Authority: ES
Inventors: Bernd Bohrmann; Antonio Iglesias; Hansruedi Loetscher
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2007-11-01
Filing date: 2008-10-23
Publication date: 2014-03-03
Anticipated expiration: 2028-10-23
Also published as: US20100306868A1; WO2009056257A1; CA2703727A1; JP2011501955A; CN101918564A; JP5213962B2; EP2207885B1; EP2207885A1

Abstract

Un ratón transgénico cuyo genoma comprende: a) una primera secuencia de DNA transgénico que codifica una proteína humana APP Swedish o una proteínahumana APP London, en el que dicha primera secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a unprimer promotor; b) una segunda secuencia de DNA transgénico que codifica una proteína presenilina 2 humana, quecomprende una sustitución N141I, en el que dicha segunda secuencia de DNA transgénico está unidaoperativamente a un segundo promotor; c) una tercera secuencia de DNA transgénico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo dirigido contra elpéptido amiloide, en el que dicha tercera secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a un tercerpromotor y; d) una cuarta secuencia de DNA transgénico que codifica una cadena pesada de dicho anticuerpo, en el quedicha cuarta secuencia de DNA transgénico está unida operativamente al tercer promotor o a un cuartopromotor.

Description

Animales no humanos cuatro veces transgénicos

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa que se caracteriza por la pérdida de memoria y deterioro de las funciones cognitivas. La prevalencia de la EA se duplica aproximadamente cada cinco años por encima de los 65 años de edad. En general, aproximadamente entre el 5 y el 10% de los mayores de 65 años se ven afectados. El diagnóstico clínico de la EA sigue siendo el diagnóstico por exclusión. Sólo el examen microscópico post mortem del cerebro ofrece un diagnóstico definitivo basado en la presencia de placas extracelulares de fibrillas que contienen péptidos beta amiloides (A beta) y ovillos intracelulares que contienen proteína tau fosforilada polimerizada. En la mayoría de los casos, la EA aparece tarde en sus síntomas y de forma esporádica. La EA familiar de aparición temprana representa una minoría de los casos, pero ha sido extremadamente importante para la progresión en la comprensión de los mecanismos de la enfermedad. Mutaciones conocidas son la mutación sueca (SFAD) que afecta los codones 670/671 (K670+N y M671+L) y la mutación London que afecta el codón 717 de APP. Todas estas mutaciones afectan al procesamiento proteolítico de APP proporcionando más péptidos amiloidogénicos.

La APP puede ser procesada por al menos tres secretasas: secretasas alfa, beta, y gamma. La beta-secretasa inicia la generación del péptido A-beta mediante la escisión de APP después de la metionina 671 (numeración APP770) que proporciona un fragmento carboxilo terminal de 12 kD retenido en membrana. El fragmento de 12 kD puede a continuación, someterse a una escisión con la secretasa gamma en el dominio de transmembrana hidrófobo para liberar los residuos 40, 42, o 43 del péptido A-beta (Seubert P, Vigo-Pelfrey C, Esch F, Lee M, Dovey H, Davis D, Sinha S, Schlossmacher M, J Whaley, Swindlehurst C. Isolation and quantification of soluble Alzheimer’s betapeptide from biological fluids. Nature. 1992. 359: 325-7).

Los tratamientos actuales para la EA proporcionan sólo un alivio sintomático modesto. Existe una alta necesidad médica no satisfecha de agentes modificadores de la enfermedad que frenen el curso de la enfermedad y prevengan

o retrasen la prevención de la enfermedad en individuos susceptibles. El desarrollo de dichos agentes requiere, entre otros, el progreso en la comprensión de la base molecular de la enfermedad y en el desarrollo de modelos animales.

Un número de líneas transgénicas que sobreexpresan proteínas relacionadas con la EA son conocidos, por ejemplo ratones doble transgénicos que sobreexpresan APP London, y secretasa beta.

La presente invención proporciona un ratón transgénico cuyo genoma incluye

a) una primera secuencia de DNA transgénico que codifica una proteína humana APP Swedish o una proteína humana APP London, en el que dicha primera secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a un primer promotor;

b) una segunda secuencia de DNA transgénico que codifica una proteína presenilina 2 humana, que comprende una sustitución N141I, en el que dicha segunda secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a un segundo promotor;

c) una tercera secuencia de DNA transgénico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo dirigido contra el péptido amiloide, en el que dicha tercera secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a un tercer promotor y;

d) una cuarta secuencia de DNA transgénico que codifica una cadena pesada de dicho anticuerpo, en el que dicha cuarta secuencia de DNA transgénico está unida operativamente al tercer promotor o a un cuarto promotor.

El término "patología de enfermedad de Alzheimer (EA)" Se refiere a los cambios patológicos en los pacientes con EA: como por ejemplo la pérdida de densidad sináptica neuronal y el número de sinapsis, disminución de la capacidad cognitiva, y pérdida de memoria. También incluyen placas difusas y neuríticas en el cerebro, que se componen principalmente de péptido beta-amiloide, inclusiones neuronales y / o gliales o depósitos insolubles que se tiñen positivamente con los anticuerpos anti-Abeta.

En particular, la presente invención proporciona un ratón transgénico cuyo genoma comprende

APP

APP significa proteína precursora amiloide. Varias formas de cDNA de APP han sido identificadas, codifican entre otras las tres isoformas más abundantes APP695, APP751, y APP770. Estas formas surgen a partir de un único precursor de RNA por corte y empalme alternativo. El gen se extiende por más de 175 kb con 18 exones (Yoshikai S, Sasaki H, Doh-ura K, Furuya H, Sakaki Y. Genomic organization of the human amyloid beta-protein precursor gene. Gene. 1990. 87(2):257-63). APP contiene un dominio extracelular, una región transmembrana y un dominio citoplásmico. A-beta se compone de hasta 28 aminoácidos justo fuera del dominio transmembrana hidrofóbico y hasta 15 residuos de este dominio transmembrana. Así, A-beta es un producto de escisión derivado de APP que se encuentra normalmente en el cerebro y otros tejidos como el corazón, el riñón y el bazo. Sin embargo, los depósitos de A-beta se encuentran generalmente en abundancia sólo en el cerebro. Las formas alternativas de mayor tamaño de APP (APP751, APP770) consisten en APP695 más uno o dos dominios adicionales. APP751 consta de los 695 aminoácidos de APP695 más 56 aminoácidos adicionales en los cuales tiene homología con la familia Kunitz de los inhibidores de las serina proteasas (KPI) (Tanzi RE, McClatchey AI, Lamperti ED, Villa-Komaroff L, Gusella JF, Neve RL. Protease inhibitors domain encoged by an amyloid protein precursor mRNA associated with Alzheimer’s disease. Nature. 1988. 331:528-30; Weidemann A, Konig G, Burke D, Fischer P, Salbaum JM, Masters CL, Beyreuther K. Identification, biogenesis, and localization of precursors of Alzheimer’s disease A4 amyloid protein. Cell. 1989 Apr 7; 57(1):115-26. Kitaguchi N, Takahashi Y, Tokushima Y, Shiojiri S, Ito H. Novel precursor of Alzheimer’s disease amyloid protein shows protease inhibitory activity. Nature. 1988. Feb 11;331(6156):530-2.; Tanzi RE, St George-Hyslop PH, Haines JL, Polinsky RJ, Nee L, Foncin JF, Neve RL, McClatchey AI, Conneally PM, Gusella JF. The genetic defect in familial Alzheimer’s disease is not tightly linked to the amyloid beta-protein gene. Nature. 1987. 329 (6135):156-7). APP770 contiene los 751 aminoácidos de la APP751 y un dominio adicional de 19 aminoácidos homólogo para el antígeno de superficie celular de la neurona OX-2 (Weidemann et al 1989. Kitaguchi et al 1988.). A menos que se indique lo contrario, las posiciones de los aminoácidos referidas en este documento son las posiciones que aparecen en APP770. El número de aminoácidos de las posiciones equivalentes en APP695 y APP751 difieren en algunos casos debido a la ausencia de los dominios OX-2 y KPI. Por convención, las posiciones de aminoácidos de todas las formas de APP están referidas por las posiciones equivalentes en la forma APP770. A menos que se indique lo contrario, esta convención se utiliza en este documento. A menos que se indique lo contrario, todas las formas de APP y fragmentos de APP, incluyen todas las formas de A-beta, referidas en este documento en base a la secuencia de aminoácidos de la APP humana. APP se modifica después de la traducción por la eliminación de la secuencia líder y por la adición de grupos sulfato y de azúcar. El término "APP" incluye también APP mutante, como por ejemplo APP Swedish y APP London.

Una proteína APP humana que comprende una mutación asociada con la enfermedad de Alzheimer (EA) o patología de tipo EA es preferiblemente APPswedish y APPlondon.

El término "APP Swedish" como se usa aquí se refiere a una isoforma de APP como se define anteriormente, que comprende una sustitución K670N/M671L. Preferiblemente, la APP Swedish humana está codificada por el Id. de Sec. Nº: 1

El término "APP London" tal como se utiliza en se refiere a una isoforma de APP como se define anteriormente, que contiene una o más de las mutaciones naturales o artificiales que afectan a la producción de péptidos amiloides hacia un aumento de la producción específica del péptido 42 de A-beta. Se prefieren las mutaciones de APP naturales alrededor del sitio de corte de la secretasa gamma con relevancia patológica incluyendo

-T714I (Kumar-Singh S et al. Hum Mol Genet. 1 Nov 2000; 9(18): 2589-98.) -V715M (Ancolio K, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 30 Mar 1999; 96(7): 4119-24.) -I716V (Eckman CB, et al., Hum Mol Genet. Nov 1997; 6(12):2087-9.) -V717F (Murrell J, et al, Science. 4 Oct 1991; 254(5028):97-9.) -V717G (Chartier-Harlin MC, et al., Nature. 31 Oct 1991; 353(6347): 844-6.) -V717I (Goate A, et al., Nature. 21 Feb 1991; 349(6311): 704-6) -V717L (Murrell JR, et al., Arch Neurol. Jun 2000; 57(6): 885-7.) -L723P (Kwok JB, et al., Ann Neurol. Feb 2000; 47(2): 249-53.)

También son preferidas las mutaciones artificiales (sustitución de todos los residuos en la región transmembrana fuera del dominio A-beta) ejemplos de las mismas y sus consecuencias en la escisión de secretasa gamma se ha descrito por Lichtenthaler y colaboradores (Lichtenthaler SF, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 16 de marzo 1999; 96

5 (6):3053-8).

Más preferiblemente, el APP London es APP London humano que contiene la mutación V717F natural. Más preferiblemente, el APP humano London está codificada por el Id. de Sec. Nº: 3

10 Preferiblemente, la primera secuencia de DNA transgénico codifica APPswedish humana.

Presenilina 2 (PS2)

La presenilina 2 (PS) es un complejo de proteínas de la secretasa gamma. La secretasa gamma está implicada en el 15 procesamiento de la APP (ver Figura 1).

El término "secuencia de DNA que codifica la presenilina 2" o "gen de PS2", tal como se utiliza aquí se refiere al gen de mamífero descrito por primera vez en la solicitud de patente EE.UU. Nº 08/496.841, presentada el 28 de junio de 1995, y más tarde descrita en Rogaev et al. (Nature. 1995, 376 (6543):775-8) y Levy Lahad et al. (Ann Neurol. 1995;

20 38(4): 678-80), incluyendo cualquier variante alélica y los homólogos de mamífero heteroespecíficos. Una secuencia de cDNA humano de presenilina-2 (HPS2) se describe en este documento como Id. de Sec. Nº: 9.

El término "gen de la presenilina-2" o "gen de PS2" se refiere principalmente a una secuencia de codificación, pero pueden incluir algunas o todas las regiones reguladoras flanqueantes y / o intrones. El término gen PS2 incluye

25 específicamente genes artificiales o recombinantes creados a partir de cDNA o DNA genómico, incluyendo genes recombinantes basados en variantes de corte y empalme. Los genes de la presenilina-2 también se han denominado como gen E5-1.

Una proteína presenilina 2 humana que comprende una mutación asociada con la enfermedad de Alzheimer (EA) o

30 patología de tipo EA es preferiblemente una PS2 humana con la sustitución N141I, T122P, M239V o M239I (Shen et al., PNAS, 2007, 104 (2): 403-409). Más preferible, la proteína presenilina 2 humana que comprende una mutación asociada con la enfermedad de Alzheimer (EA) o patología de tipo EA es una PS2 humana con la sustitución N141I.

Por eso, la segunda secuencia de DNA transgénico codifica preferiblemente una PS2 humana con una sustitución 35 N141I. La más preferible es la secuencia de DNA codificada por el Id. de Sec. Nº: 19.

Anticuerpos

Un anticuerpo es una molécula en forma de "Y" y consiste en dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Hay

40 diferentes tipos y subtipos de ambas cadenas pesadas y cadenas ligeras. Cada cadena pesada y cada cadena ligera tienen una región constante y una región variable, mientras que el tamaño de las regiones constantes es más grande para la cadena pesada.

El término "región constante" o "región C" se refiere a una región de una molécula de anticuerpo que es casi idéntica

45 a la de las regiones correspondientes de anticuerpos de diferentes especificidades producidas por organismos de la misma especie. La parte constante es invariable dentro de la misma clase de anticuerpo (isotipo) y es responsable de las funciones efectoras de una subclase particular de inmunoglobulina. Un fragmento Fc es un fragmento de un anticuerpo generada por la escisión de un anticuerpo con la enzima papaína y que comprende la mayor parte de las regiones constantes.

50 El término "región variable" como se utiliza aquí, se refiere a una región de una molécula de anticuerpo que se une a antígenos específicos. Se compone de la combinación de los sitios de unión a antígeno de la cadena pesada y ligera. Se diferencia entre las inmunoglobulinas de diferentes células B, pero es la misma para todas las inmunoglobulinas producidas por la misma célula B. La región variable se genera somáticamente a través de un

55 proceso de recombinación de genes que tiene lugar durante la maduración de las células B. Es este proceso de reorganización lo que crea la enorme diversidad necesaria para unir cualquier antígeno determinado, y esto permite al sistema inmunológico reconocer y neutralizar las innumerables cargas antigénicas generadas por estructuras foráneas y patógenas. Como consecuencia, el conjunto de anticuerpos se compone de inmunoglobulinas que llevan un gran repertorio de diferentes regiones V, mientras que comparten las mismas porciones Fc.

60 El término "fragmento de unión a antígeno" o "fragmento Fab" es un fragmento de anticuerpo hizo incluye la variable, región de unión al antígeno, y que es generada por la escisión de un anticuerpo con la enzima papaína.

El término "región idiotípica" tal como se utiliza aquí, se refiere a la parte de la región variable de un anticuerpo que 65 es única para cada tipo de anticuerpo.

La tercera secuencia de nucleótidos transgénica codifica la cadena ligera del anticuerpo dirigido contra el péptido beta-amiloide. Preferiblemente, dicho anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. Más preferiblemente, dicho anticuerpo es una inmunoglobulina gamma (IgG). Más preferiblemente, dicho anticuerpo es el

5 anticuerpo terapéutico MAb11 (documento WO 03/070760).

La cuarta secuencia de nucleótidos transgénica codifica la cadena pesada de un anticuerpo dirigido contra el péptido beta-amiloide. Preferiblemente, dicho anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. Más preferiblemente, dicho anticuerpo es una inmunoglobulina gamma (IgG). Más preferiblemente, dicho anticuerpo es el

10 anticuerpo terapéutico MAb11 (documento WO 03/070760).

El término "péptido beta-amiloide" o "A-beta" se refiere a un péptido producido por la escisión de APP por la secretasa beta y secretasa gamma. El péptido posee 39-43 aminoácidos. Es el principal constituyente de las placas amiloides en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer. Preferiblemente, el péptido beta-amiloide es

15 un péptido beta-amiloide humano.

Preferiblemente, la cuarta secuencia de nucleótidos transgénicos codifica para la cadena pesada de un anticuerpo secretado. Dicha secuencia de DNA preferida carecen de las secuencias que codifican un dominio transmembrana.

20 La tercera y cuarta secuencia de DNA transgénico pueden estar unidas operativamente con un promotor (es decir, con el tercer promotor) o pueden estar operativamente unidas cada una con un promotor separado (es decir, la tercera secuencia de DNA transgénico está unida operativamente con el tercer promotor y la cuarta secuencia de DNA está unida operativamente con el cuarto promotor).

25 Promotores

El término "operativamente unido", tal como se utiliza aquí indica que una secuencia de DNA y una secuencia reguladora están conectadas de una manera que permite la expresión génica cuando las proteínas activadoras de la transcripción apropiadas se unen a la secuencia reguladora.

30 El término "secuencia reguladora" tal como se utiliza aquí se refiere a una secuencia de nucleótidos que es un sitio de unión para proteínas que controlan la expresión de la proteína. Una secuencia reguladora puede ser por ejemplo, un promotor o un potenciador.

35 El término "promotor" tal como se utiliza aquí hace referencia a la región del gen que se une a la polimerasa de RNA y factores de transcripción para iniciar la transcripción.

El término "potenciador" tal como se utiliza aquí hace referencia a una secuencia de nucleótidos que aumenta la tasa de transcripción genética aumentando la actividad del promotor más cercano en la misma molécula de DNA.

40 El primer promotor puede ser cualquier promotor que expresa el DNA operativamente unido en las neuronas. El primer promotor puede ser un promotor ubicuo. Preferiblemente, el primer promotor es un promotor neuronal. Más preferiblemente, el primer promotor es un promotor específico del cerebro.

45 El término "promotor específico de tejido" se refiere a un promotor, que controla y dirige la expresión de un gen en un tejido específico, por ejemplo, en el tejido cerebral, en el tejido muscular, tejido hepático, en el tejido renal, etc. Un promotor específico de cerebro es un promotor que controla y dirige la expresión de un gen en el tejido cerebral. Más preferiblemente, el primer promotor es un promotor de un gen de prión.

50 El primer promotor puede tener también un promotor controlable. Un promotor controlable puede ser cualquier promotor, que controla la expresión de un transgén de una forma regulable y / o inducible, por ejemplo, mediante la adición de sustancias inductoras o represoras específicas. Varios promotores bacterianos inducibles son conocidos en la materia (Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H; Nat Biotechnol 1996, 14 (4): 499-503; van der Neut R, Targeted gene disruption: applications in neurobiology;J Neurosci Methods 1997, 71 (1): 19-27, Liu HS, Lee

55 CH, Lee CF, Su U, Chang TY; Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian cell lines. Biotechniques 1998, 24 (4): 624-8, 630-2).

El segundo promotor puede ser cualquier promotor que expresa el DNA operativamente unido en las neuronas. El segundo promotor puede ser un promotor ubicuo. Preferiblemente, el segundo promotor es un promotor neuronal.

60 Más preferiblemente, el segundo promotor es un promotor específico del cerebro.

El término "promotor específico de tejido" se refiere a un promotor, que controla y dirige la expresión de un gen en un tejido específico, por ejemplo, en el tejido cerebral, en el tejido muscular, tejido hepático, en el tejido renal, etc. Un promotor específico de cerebro es un promotor que controla y dirige la expresión de un gen en el tejido cerebral.

65 Más preferiblemente, el segundo promotor es un promotor de glicoproteína Thy 1.2.

El segundo promotor puede tener también un promotor controlable. Un promotor controlable puede ser cualquier promotor, que controla la expresión de un transgén de una forma regulable y / o inducible, por ejemplo, mediante la adición de sustancias inductoras o represoras específicas. Varios promotores bacterianos inducibles son conocidos en la materia (Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H; Nat Biotechnol 1996, 14 (4): 499-503; van der Neut R, Targeted gene disruption: applications in neurobiology;J Neurosci Methods 1997, 71 (1): 19-27, Liu HS, Lee CH, Lee CF, Su U, Chang TY; Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian cell lines. Biotechniques 1998, 24 (4): 624-8, 630-2).

El tercer promotor puede ser un promotor ubicuo o un promotor específico de tejido linfoide.

Preferiblemente, el tercer promotor es un promotor del gen MHC de clase I. Así, preferiblemente, la tercera secuencia de DNA transgénico está unido operativamente con un potenciador. Más preferiblemente, el potenciador es un potenciador de la IgH.

El tercer promotor puede también ser un promotor controlable. Un promotor controlable puede ser cualquier promotor, que controla la expresión de un transgén de una forma regulable y / o inducible, por ejemplo, mediante la adición de sustancias inductoras o represoras específicas. Varios promotores bacterianos inducibles son conocidos en la materia (Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H; Nat Biotechnol 1996, 14 (4): 499-503; van der Neut R, Targeted gene disruption: applications in neurobiology;J Neurosci Methods 1997, 71 (1): 19-27, Liu HS, Lee CH, Lee CF, Su U, Chang TY; Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian cell lines. Biotechniques 1998, 24 (4): 624-8, 630-2).

El cuarto promotor puede ser un promotor ubicuo o un promotor específico de tejido linfoide. Preferiblemente, el cuarto promotor es un promotor del gen MHC de clase I. Así, preferiblemente, la cuarta secuencia de DNA transgénico está unido operativamente con un potenciador. Más preferiblemente, el potenciador es un potenciador de la IgH.

El cuarto promotor puede también ser un promotor controlable. Un promotor controlable puede ser cualquier promotor, que controla la expresión de un transgén de una forma regulable y / o inducible, por ejemplo, mediante la adición de sustancias inductoras o represoras específicas. Varios promotores bacterianos inducibles son conocidos en la materia (Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H; Nat Biotechnol 1996, 14 (4): 499-503; van der Neut R, Targeted gene disruption: applications in neurobiology;J Neurosci Methods 1997, 71 (1): 19-27, Liu HS, Lee CH, Lee CF, Su U, Chang TY; Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian cell lines. Biotechniques 1998, 24 (4): 624-8, 630-2).

Como el ratón transgénico produce también sus propios anticuerpos, las cadenas pesadas y ligeras humanas se pueden mezclar con las cadenas pesadas y ligeras endógenas para formar una mezcla de anticuerpos transgénicos / endógenos. En el caso de un ratón, se pueden formar una mezcla de anticuerpos de ratón / humanos. Si las cadenas pesadas y ligeras humanas se produces fuera del tejido linfoide, no estarán presentes las cadenas pesadas y ligeras endógenas y por lo tanto se formarán anticuerpos transgénicos puros. Por lo tanto, el(los) promotor(es) unido(s) operativamente a la tercera y cuarta secuencia de DNA transgénico es preferiblemente un promotor expresado en ambos tejidos, linfoide y no linfoide.

Animales transgénicos / integración de los transgenes

Las secuencias de DNA transgénicos están integradas en la totalidad o una parte de las células animales, especialmente en las células germinales. La integración en el genoma puede ser transitorio o estable. Preferiblemente, la integración es estable.

El ratón transgénico puede ser homocigoto o heterocigoto para la primera, segunda, tercera y cuarta secuencia transgénica de DNA. El ratón transgénico puede ser heterocigoto para algunas de las secuencias de DNA transgénico, por ejemplo para la primera y segunda secuencia de DNA transgénico, y homocigoto para el otro, por ejemplo, para la tercera y cuarta secuencia de DNA. Preferiblemente, el ratón transgénico es homocigótico para al menos una de las secuencias de DNA transgénico.

Producción de animales transgénicos

Los métodos para producir un animal transgénico no humano son bien conocidos en la materia. Los métodos adecuados se describen por ejemplo en Hogan B., Beddington R., Costantini F., y Lacy E. Manipulating the mouse embryo. A laboratory manual. Segunda edición (1994). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Las proteínas transgénicas pueden expresarse de forma ubicua. Preferiblemente, las proteínas codificadas por la primera y segunda secuencia de DNA transgénico se expresan en las neuronas. Más preferiblemente, las proteínas codificadas por la primera y segunda secuencia de DNA transgénico se expresan en tejido cerebral. Preferiblemente,

las proteínas codificadas por la tercero y cuarta secuencia de DNA transgénico se expresa en el tejido linfoide. Más preferiblemente, las proteínas codificadas por la tercera y cuarta secuencia de DNA transgénico se expresan en ambos tejidos, linfoide y no linfoide.

Los ratones transgénicos no humanos descritos anteriormente se puede analizar genéticamente, molecularmente y por su comportamiento.

Utilización

El ratón cuatro veces transgénico como se ha descrito anteriormente se puede utilizar como un modelo para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o como modelo para la prevención de la EA. Permite para investigar el efecto de un anticuerpo anti-Aβ humano en el inicio y el proceso de la amiloidosis Aβ en un modelo murino de EA. Puesto que el animal transgénico es inmunotolerante para el anticuerpo Mab11 humano transgénico, se puede determinar el efecto del tratamiento crónico con un anticuerpo terapéutico como por ejemplo Mab 11. Por lo tanto, puede hacerse un seguimiento del efecto sobre los niveles solubles de Aβ y el proceso y la cinética de la amiloidosis vascular.

Adicionalmente, el ratón cuatro veces transgénico tal como se ha descrito anteriormente es una herramienta interesante para determinar la eficacia y efectividad de un tratamiento preventivo de la enfermedad de Alzheimer con un anticuerpo humano.

Después de haber descrito en general esta invención, se entenderá mejor la misma por referencia a los ejemplos específicos, que se incluyen en este documento sólo a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes a menos que se especifique lo contrario, en relación con las siguientes figuras.

Figuras

La figura 1 muestra una representación esquemática del procesamiento de APP. A) Proteína precursora amiloide. El punto de escisión de las tres secretasas están indicados (α: secretasa α, β: secretasa β, γ: secretasa γ).

La figura 2 muestra una representación esquemática del procesamiento de la proteína precursora amiloide (APP). APP puede someterse a un procesamiento proteolítico a través de dos vías. La escisión mediante secretasa α que ocurre dentro del dominio A-beta y genera el fragmento grande APP α N-terminal soluble y un fragmento C-terminal no amiloidogénico. Una proteólisis adicional de este fragmento mediante la secretasa γ genera el péptido p3 no amiloidogénico. Alternativamente, la escisión de APP mediante la secretasa β se produce al comienzo del dominio Aβ y genera un fragmento corto APPβ N-terminal soluble, así como un fragmento C-terminal amiloidogénico (C99). Una escisión adicional de este fragmento C-terminal mediante la secretasa γ genera Aβ. La escisión mediante la secretasa γ o múltiples secretasas γ puede dar lugar a heterogeneidad en el C-terminal de Aβ para generar un Aβ40 yAβ42

La figura 3 muestra una representación esquemática de las construcciones genéticas.

A) construcción que comprende el DNA que codifica betaAPP751 humano con la sustitución K60N, M671L (βAPP751-SFAD humana) incrustada en el gen de la glicoproteína Thy 1.2 de ratón (MThy1.2). KPI: dominio inhibidor de la proteasa Kunitz, Aβ: péptido beta amiloide, EI: exón I; EII: exón II; EIV: exón IV; ATG: codón de inicio, TAG: codón de parada. B) construcción que comprende el DNA que codifica una presenilina 2 mutante humana con la sustitución N141 (hPS2-N141I) incrustada en el prión de ratón (pPrPHG). E1: exón 1, E2: exón 2, UTR: región untraduccional, ATG: codón de inicio, TAG: codón de parada. C) construcción que comprende DNA que codifica la cadena pesada del anticuerpo la IgG1.1 humano (MAb11) dirigido contra el péptido beta-amiloide. MHC-I: región promotora H-2k, VH: regiones variables de la cadena pesada del anticuerpo, CH1-CH2-CH3: regiones constantes de la cadena pesada del anticuerpo, potenciador IgH: elemento potenciador transcripcional del gen IgH murino. D) construcción que comprende DNA que codifica la cadena ligera del anticuerpo humano IgG1.1 (MAb11) dirigido contra el péptido beta-amiloide. MHC-I: región promotora H-2k, VL: regiones variables de la cadena ligera del anticuerpo, CL: regiones constantes de la cadena ligera del anticuerpo, potenciador IgH: elemento potenciador transcripcional del gen IgH murino.

La Figura 4 muestra la secuencia codificadora completa (Id. de Sec. Nº: 10) del gen Ig γ1 humano específico para Aβ humana como se clonó en el vector de expresión pHSE3' para la expresión transgénica. La posición y el nombre de los cebadores utilizados en la amplificación por PCR se muestran por encima o por debajo de la secuencia correspondiente. El codón de parada se muestra en negrita. La secuencia líder se muestra en negrita y subrayada.

La Figura 5 muestra la secuencia codificadora completa (Id. de Sec. Nº: 11) del gen de Ig κ humano específico para Aβ humana como se clonó en el vector de expresión pHSE3' para la expresión transgénica. La posición y el nombre de los cebadores utilizados en la amplificación por PCR se muestran por encima o por debajo de la secuencia de correspondiente. Los codones de inicio y parada se muestran en negrita.

La figura 6 muestra una imagen de la electroforesis en gel de la PCR para detectar la progenie transgénica cuádruple de B6.Mab11xB6.PS2APP en ratones. Carril 1: marcador, carril 2 a 7: descendencia de los ratones B6.Mab11xB6.PS2APP. IgH: fragmento de PCR específico de IgH; IgL: fragmento de PCR específico de IgL. PSEN2: fragmento de PCR específico de PS(N41I).

La figura 7 muestra una transferencia Western blot de homogeneizado de cerebro de ratones B6.MAB11, B6.152 y B6.MAB11.152 sondeadas por APP. B6.MAB11: ratón transgénico para la cadena pesada y ligera del MAB 11. B6.152: ratón transgénico para PS2 (N141I) / APPswedish. B6.MAB 11.152: ratón transgénico para la cadena pesada y ligera del MAB 11 y para PS2 (N141I) / APPswedish. APP: proteína precursora amiloide, CTF: fragmento C-terminal, Abeta: péptido beta amiloide.

La figura 8 muestra imágenes de microscopía de fluorescencia de sección de tejido de la corteza frontal de ratones de tipo salvaje, ratón transgénico MAb11 (B6.MAB11), ratones doble transgénicos PS2 (N141I) / APPsw (B6.152) y ratón cuatro veces transgénico para la cadena pesada y ligera del MAB 11 y para PS2 (N141I) / APPswedish (B6.MAB11.152). Los ratones tenían 8 meses de edad y las secciones se tiñeron con un anticuerpo monoclonal anti -Ab murino (BAP2/Alexa 555 conjugado). La expresión transgénica de MAB 11 en el ratón cuatro veces transgénico previno completamente la formación de placas.

La Figura 9 muestra imágenes de microscopía de fluorescencia de sección de tejido de la corteza frontal de ratones de tipo salvaje, ratón transgénico MAb11 (B6.MAB11), ratones doble transgénicos PS2 (N141I) / APPsw (B6.152) y ratón cuatro veces transgénico para la cadena pesada y ligera del MAB 11 y para PS2 (N141I) / APPswedish (B6.MAB11.152). Los ratones tenían 8 meses de edad y las secciones se tiñeron con tioflavina-S. La expresión de MAb11 en el ratón cuatro veces transgénico previno completamente la formación de placas.

La figura 10 muestra una representación gráfica de los niveles medidos de IgG humana, es decir, MAB11 en plasma retirados del ratón transgénico MAb11 (A) y de ratón cuatro veces transgénico (B6.MAB11.152) (B). Se compararon diferentes métodos independientes con (i) IgG humana capturada mediante el antígeno Aβ y detectado mediante un

anticuerpo de detección específica de Fc -●-, (ii) IgG humana capturada mediante IgG anti-humano (H + L) y detectado mediante un (H + L) anticuerpo de detección específica -▲-(iii) IgG humana capturada mediante IgG antihumano (H + L) y detectado mediante un anticuerpo de detección específica de Fc -■ -.

La Figura 11 muestra una transferencia Western blot de homogeneizado de cerebro de ratón cuatro veces transgénico B6.MAB11.152, ratón transgénico de MAb11 B6.MAB11 en un fondo no transgénico (C57B1 / 6) sondeados con IgG humana para MAb11. Para determinar la cantidad mínima medible de MAb11, el anticuerpo se añadió a diferentes concentraciones (10, 3, 1, 0,3, 0,1 y 0,03 µg/ml) para el homogeneizado de cerebro del ratón B6 no transgénico (C57B1/6). Retirados del plasma del ratón no transgénico es el control para MAb11 en la periferia.

La Figura 12 muestra una transferencia Western blot de homogeneizados de cerebro de ratones de 16 meses sondadas para Aβ. Los cerebros se tomaron de ratones no transgénicos de tipo salvaje C57B1/6, de ratones cuatro veces transgénicos B6.MAB11.152 y ratones B6.152 doble transgénicos PS2(N141I)/APPsw. En el primer carril, que añadió MAB 11 al tampón de muestra sin homogeneizado de cerebro como control negativo.

La figura 13 muestra una representación gráfica de Abeta insoluble medido (Abeta40 y 42) después de una disociación de Aβ en el homogeneizado de cerebro a partir de ratones B6.152 y B6.MAB 11.152 (en ng / mg de cerebro).

1-4: ratones (B6.152) doble transgénicos PS2 (N141I)/APPsw: 1 = 4 meses de edad, 2 = 8 meses de edad, 3 = 12 meses de edad, 4 = 16 meses de edad; 5-8: ratón cuatro veces transgénico (B6.MAB11.152): 5 = 4 meses de edad, 6 = 8 meses de edad, 7 = 12 meses de edad, 8 = 16 meses de edad.

A) Abeta 42 medido en ratones hembras B) Abeta 42 medido en ratones machos C) Abeta 40 medido en ratones hembras, D) Abeta 40 medido en ratones machos.

La Figura 14 muestra imágenes de microscopía confocal de barrido visualizado como una proyección de intensidad máxima de las secciones de la corteza tomadas de B6.MAB 11.152 de doble inmunotinción para los depósitos amiloide vasculares y células endoteliales. Las Figuras 14A y D muestran la tinción BAP2 de la deposición amiloide, tiñendo a baja y alta ampliación, respectivamente. Para la comparación, las Figuras 14B y E muestran la distribución

de capilares mediante la tinción de CD31 (marcador de células endoteliales) a baja y alta ampliación, respectivamente. Las Figuras 14C y F muestran los canales fusionados de ambas tinciones.

La Figura 15 muestra imágenes de microscopía confocal de barrido visualizado como una proyección de intensidad máxima tomadas de ratones B6.152 doble transgénicos del (A a C) y las imágenes planas confocales individuales de un capilar cortical de un cuádruple transgénico B6.MAB 11.152 (D a F) a gran resolución. Las figuras 15A y D muestran la tinción BAP2 de los depósitos amiloides. Las figuras 14B y E muestran tinción de CD31 (marcador de células endoteliales). Las Figuras 14C y F muestran los canales fusionados de ambas tinciones.

Ejemplos:

Los reactivos disponibles comercialmente mencionados en los ejemplos se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante salvo que se indique lo contrario.

Ejemplo 1: construcciones transgénicas (figura 1) Construcción APPswe: El cDNA que codifica βAPP751 humana fue donado por el Prof. D.Goldgaber. La doble mutación familiar Swedish de EA (sustitución SFAD, K670N, M671L) se introdujo mediante mutagénesis dirigida. El transgén Thy1.2-huβAPP751SFAD se generó por la inserción de aproximadamente 2,4kbp del fragmento de cDNA de SFAD huβAPP751 (Id. de Sec. Nº: 1: nucleótidos 32-2369 de AC: X06989) en el sitio XhoI de un vector de expresión que contiene el gen y el promotor de la glucoproteína de ratón Thy-1.2 (Id. de Sec. Nº: 2, AC: M 12379). Este vector de expresión tiene un fragmento NotI de 6,8kbp que comprende el gen Thy 1.2 de ratón (Andra K, et al, (1996) Expression of APP in transgenic mice: a comparison of neuron-specific promoters, Neurobiol Aging 17:183190; Vidal M, et al., (1990) Tissue-specific control elements of the Thy-1 gene. EMBO J. 9:833-840) en el que el fragmento de 1,5 kpb BamI-XhoI situado en los exones 2 y 4 se reemplazó por el sitio de clonación XhoI. La secuencia parcial de la construcción se proporciona en el Id. de Sec. Nº: 4 (nucleótidos 1-2602, MMTHYGP, AC: M12379 (del 27/04/1993), el gen de la glicoproteína Thy-1.2 de ratón (XbaI-BanI), nucleótidos 2603 a 4982, huβAPP751 SFAD (SmaI / HindIII-romos, 2400 pb), AC: X06989 (del 09/01/2003), (nt :32 -2400) con K670N, M671L, nucleótidos 4983 a 6112, MMTHYGP, AC: M12379 (del 27/04/1993), sitio XhoI-polyA (exón IV).

Construcción PSEN2mut: La mutación FAD N141I se introdujo en un cDNA humano PSEN2 (Id. de Sec. Nº: 9 de AC: L43964). Para expresión en ratones transgénicos, se utiliza un vector basado en el gen prión de ratón (pPrPHG) (Fischer et al, 1996;. Borchelt et al, 1996). Un fragmento KpnI-NarI, que abarca la región codificante del gen del prión, se suprimió y se sustituyó por un único sitio SceI. La secuencia de codificación de la presenilina 2 se insertó por ligación de extremos romos y se verificó mediante secuenciación de los sitios de inserción.

Construcción MAb11: Se utilizó un cDNA que codifica una cadena pesada (H) de inmunoglobulina (Ig) del isotipo γ1 (Id. de Sec. Nº: 10) y un cDNA que codifica una cadena ligera (L) del isotipo κ (Id. de Sec. Nº: 11) con especificidad por el péptido Ab humano [Bardroff, M. et al., Anti-Amyloid beta antibodies and their use. W003070760]. Los cDNA se amplificaron en una reacción de PCR utilizando los cebadores de la Tabla 1. Los cebadores 5' contienen un sitio SalI (o XhoI compatible) y los cebadores 5 ' contienen un sitio BamHI (o BglII compatible) para la inserción dirigida en el vector pHSE3' [Pircher, H., et al., T cell tolerante to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.1 chain transgenic mice. Embo J, 1989. 8(3): p. 719-27.]. Los cDNA amplificados por PCR se cortaron primero enzimáticamente con ambas enzimas de restricción SalI y BamHI, y después se insertaron individualmente en los sitios correspondientes del vector pHSE3'. La expresión de los cDNA de Ig en pHSE3' está dirigido por el promotor murino del gen H-2k de MHC de clase I y potenciado por el gen potenciador de Ig H murino situado en 3' de los genes clonados [Pircher, H., et al. T cell tolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.1 chain transgenic mice. Embo J, 1989.8(3): p. 719-27]. Este vector de expresión garantiza un alto nivel de producción de los correspondientes productos génicos insertados en linfocitos T y B de los ratones transgénicos ([ Pircher, H., et alT cell tolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.1 chain transgenic mice. EMBO J., 1989, 8(3): p. 719-27]). El casete de expresión completo, incluyendo (de 5'a 3'): el promotor H-2k, el cDNA insertado, los sitios de corte y empalme poli-A y el elemento potenciador del gen Ig H, se escindió entonces del vector por medio de corte con enzimas restricción XhoI y purificación en gel de agarosa, y se preparó en una concentración adecuada para la microinyección en oocitos fertilizados de ratón (2 µg / ml en Tris -HCl 10 mM / EDTA 0,1 mM, pH 7). El potencial de codificación del cDNA se confirmó mediante la secuenciación de los cDNA completos que codifican los genes Ig H y L de anti-Aβ.

Tabla 1 Secuencias de cebadores de clonación.

Nombre de cebador: Secuencia Sitio de restricción (en negrita) Id. de Sec. Nº:

G1.11Salfor (5'IgH): 5'-ACGTGTCGACGCCGCCACCATGAAACACCTG3' SalI (GTCGAC) 12

G1.11 Bamrev (3'IgH): 5'-ACGTGGATCCTCATTTACCCGGAGACAG-3' BamHI (GGATCC) 13

K.11Xhofor (5' IgL): 5'-ACGTCTCGAGGCCGCCACCATGGTGTTGCAG3' XhoI (CTCGAG) 14

K.11Bglrev (3'IgL): 5'-ACGTAGATCTCTAACACTCTCCCCTGTTG -3' BglII (AGATCT) 15

Ejemplo 2 Generación de ratones transgénicos Generación de ratones transgénicos B6.PS2APP (línea B6.152): Los animales transgénicos se generaron esencialmente como se ha descrito anteriormente (Hogan CF, and Lyacy E. 1995. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. Ed 2. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory). Se mezclaron fragmentos lineales libres de vectores, portadores de las construcciones Thy-1 huAPP751SFAD o PrphuPsen2 (N141I) en una proporción 1:1 y se microinyectaron en los pronúcleos masculinos de los cigotos C57B1/6. Después de la microinyección, los cigotos viables se implantaron en los oviductos de madres adoptivas B6CBAF1pseudopreñadas. La integración de los transgenes en las líneas germinales se analizó en la progenie F1 mediante la detección de los transgenes mediante PCR. Se asume en general que los transgenes coinyectados se integran en el mismo sitio cromosómico (Overbeek PA, Aguilar-Córdova E, Hanten G, Schaffner DL, Patel P, Lebowitz RM, y Lieberman MW 1991. Coinjection strategy for visual identification of transgenic mice. Transgenic Res. 1, 31-37).

Generación de B6Mab11 (ratones transgénicos anti-AβIgG1): Los animales transgénicos se generaron tal como se ha descrito anteriormente en el documento EP-A-1748294. Los ovocitos fertilizados obtenidos de hembras donantes C57BL/6 se microinyectaron con una mezcla 1:1 de los fragmentos XhoI purificados que codifican los genes IgH y L descritos en la sección anterior (construcción MAb11) para obtener los animales B6.Mab11. Después de la microinyección, los cigotos viables se implantaron en los oviductos de madres adoptivas B6CBAF1 pseudopreñadas. La integración de los transgenes en la línea germinal se analizó en la progenie F1 mediante la detección de los transgenes por PCR. Se asume en general que los transgenes coinyectados se integran en el mismo sitio cromosómico (Overbeek PA, Aguilar-Córdova E, Hanten G, Schaffner DL, Patel P, Lebowitz RM, y Lieberman MW 1991. Coinjection strategy for visual identification of transgenic mice. Transgenic Res. 1, 31-37). En total, se generaron y criaron 5 ratones doble transgénicos portadores de los genes IgH y L transgénicos y 1 ratón transgénico que lleva sólo el gen IgH.

Generación de ratones transgénicos B6.Mab11.PS2APP (Línea 86.Mab11.152): Los ratones transgénicos con ambos transgenes para MAb11 y los transgenes PSEN2mut y APPsw humanos se generaron mediante el cruce de machos heterocigóticos para los transgenes MAb11 con hembras homocigotas para los transgenes huPSEN2mut y huAPPSw. La progenie resultante es heterocigótica para todos los transgenes de heterocigotos para sólo huAPPSw y huPSEN2.

Ejemplo 3: análisis de PCR La presencia de los transgenes se detecta mediante análisis de PCR utilizando DNA genómico aislado a partir de biopsias de tejido tomadas de los ratones de 10 días de edad. Los fragmentos amplificados son específicos para los transgenes y no reaccionan de forma cruzada con secuencias de DNA endógenas.

Ratones B6.PS2APP (ratones doble transgénicos APPswedish-PS2mut): Los cebadores 5'-AAG TAT GTC CGC GCA GAA AAG CAG G-3' (Id. de Sec. Nº: 5) y 5'-CTG AGA TAT TTG AAG GAC TTG GGG AG-3 ' (Id. de Sec. Nº: 6) se utilizan para amplificar un fragmento 932pb que se solapa con las secuencias de huAPP y muThy1. Del mismo modo, el cebador 5'-TCA TTG GCT TGT TGA GTC CCC T-3 ' (Id. de Sec. Nº: 7) y 5'-GCT TTC AAC AGT GTC ACA AGG A-3' (Id. de Sec. N º: 8) se utilizan para amplificar un fragmento de 327pb que se solapa con las secuencias de huPSEN2mut y secuencias priónicas. Los transgenes de huPSEN2 y huAPPSw siempre se cosegregan. La reacción de PCR se realizó utilizando 1 µl (aproximadamente 100 ng) de DNA total obtenido de tejido del dedo del pie, en la reacción de PCR con las siguientes condiciones: 3 min. a 95 °, 35x [30 seg. a 95º, 1 min. a 60°, 1 min. a 72°], 5 min. a 72°. Los fragmentos de DNA amplificados por PCR de 932 pb para el transgén huAPP y de 327 pb para el transgéno huPS2 se visuaqlizaron en geles de agarosa al 1,8 %.

Ratones B6.Mab11 (ratones dobles transgénicos MAb11): Los cachorros nacidos a partir de estos embriones microinyectados se analizaron para la presencia de los transgenes mediante la amplificación de DNA genómico preparado a partir de biopsias de la cola con cebadores específicos. Los cebadores utilizados se indican en la Tabla

2. La reacción de PCR se realizó utilizando 1 µl (aproximadamente 100 ng) de DNA total obtenido de la biopsia de la cola, en la reacción de PCR con las siguientes condiciones: 1 min. a 90°, 30x [10 seg. a 94º, 30 segund os a 64°, 90 seg. a 72°], 7 min. a 72°. Los fragmentos de DNA amp lificados por PCR de aproximadamente 1270 pb y 660 pb, respectivamente, se visualizaron finalmente en geles de agarosa al 1,5 % por separado para los genes IgH y L transgénicos.

Tabla 2. Secuencias de cebadores para la detección de transgenes.

Ensayo de PCR: Cebadores Fragmento de PCR Id. de Sec.

Gen Ig H: 5H2KP 5'-ATGAATTCACAGTTTCACTTCTGCACC-3' G1.0501 5'-TGTACTCCTTGCCATTCAGC-3' 1270 pb 16 17

Gen Ig L: 5H2KP 5'-ATGAATTCACAGTTTCACTTCTGCACC-3' K.44 5'-GCTCATCAGATGGCGGGAAG-3' 660 pb 16 18

Ratones MAB11.PS2APP (Figura 2): Los cebadores 5'-ATG AAT TCA CAG TTT CAC TTC TGC CAC-3 ' (Id. de Sec. N º: 16) específicos para las regiones promotoras del MHC y los cebadores 5'-TGT ACT CCT TGC CAT TCA GC-3'

(Id. de Sec. Nº: 17) y 5'-GCT CAG CAT ATG GGA GCG AG-3 ' (Id. de Sec. Nº: 18) específicos para la cadena gamma y cadena kappa, respectivamente, se añaden a los cebadores huPSEN2 (Id. de Sec. Nº : 7 y 8) en una reacción de PCR múltiple. En la presencia de todos los transgenes, 3 productos de PCR de diferentes tamaños se amplifican: 327 pb, 600 pb y 1200 pb para el huPSEN2, los transgenes de la cadena pesada de Ig hu y de la cadena ligera de Ig hu, respectivamente.

La reacción de PCR se realizó utilizando 1,5 µl (aproximadamente 150 ng) de DNA total obtenido de tejido de dedo del pie, en la reacción de PCR con las siguientes condiciones: 1 min. a 95°, 30x [30 seg. a 95º, 40 seg undos a 62°, 80 segundos a 72°], 7 min. a 72°. Los fragmentos de DNA amplificados mediante PCR de 327 pb, de aproximadamente 660 pb y 1200 pb se visualizaron en geles de agarosa al 1,5 % para los transgenes huPS2, IgH y L, respectivamente.

Ejemplo 4: Inmunohistoquímica Los ratones de 8 meses se anestesiaron con FluothaneR (ratón de tipo salvaje (C57B1/6), ratón transgénico MAb11, ratón doble transgénico PS2(N141I)/APPsw y ratón cuádruple transgénico PS2(N141I)/APPsw/Mab11) fueron decapitados y los cerebros se congelaron en hielo seco. Se cortaron secciones de criostato parasagitales entre lateral ~ 1,92 y 1,2 de acuerdo con Paxinos y Franklin con un espesor nominal de 20 micrómetros a -18 °C utilizando un criostato Leica CM3050 S y se montaron en portaobjetos Superfrost Plus™ y se almacenaron a -20 °C. La tinción de las placas amiloides se realizó mediante protocolos de tinción de inmunofluorescencia según el estado de la técnica o tinción con tioflavina S, un colorante específico para placas amiloides. Brevemente, las secciones se hidrataron en PBS y se trataron con acetona al 100 % previamente enfriada a -20 °C durante 2 min. El lavad o con PBS se realizó dos veces durante dos minutos, seguido por el bloqueo de los sitios de unión no específica mediante incubación en albúmina de suero bovino al 2 % y ovoalbúmina en PBS al 2 % durante 15 min. seguido por el lavado con PBS y la incubación con un anticuerpo monoclonal murino de alta afinidad (BAP-2), que fue conjugado con el fluoróforo Alexa488 (Molecular Probes) y se incubaron a 0,5 mg / ml durante 1 hora a temperatura ambiente. La tinción con tioflavina-S se realizó a 0,0125 % en etanol / PBS (40/ 60% en volumen). Después de aclarar los portaobjetos en agua bidestilada se montaron cubreobjetos de vidrio utilizando medio de montaje de fluorescencia (S3023, DAKO). Los resultados de ratones B6.MAB 11152 y B6.152 de 8 meses de edad con los controles de la misma camada se muestran en la Figura 8 (BAP-2) y la Figura 9 (tioflavina-S) y demuestran una ausencia completa de los depósitos de amiloide en ratones B6.MAB11.152.

Los portaobjetos de tejidos de la corteza y el hipocampo cercano de ratones B6.MAB 11.152 (20 meses de edad) y ratones B6.152 (20 meses de edad) se prepararon como se ha descrito anteriormente para los animales de 8 meses de edad. Los portaobjetos de tejidos se tiñeron como sigue:

1.: rata / L anti-CD31 de ratón, 10,0 µg/ml (Serotec, ID: 1102) en PBS, pH 7,4 + bloque de potencia (1x) + 10 % de suero de cabra (pH 7,4), 1 h de incubación a temperatura ambiente, enjuague 3 veces con tampón de lavado DakoCytomation (solución de cloruro sódico tampón Tris + Tween 20)

2.: cabra / anti-IgG de rata (H + L) Alexa 488,1:100 (Molecular Probes, ID: 1254) en PBS, pH 7,4 +10 % de suero de cabra (pH 7,4), 1 h de incubación a temperatura ambiente, enjuague 3 veces con tampón de lavado DakoCytomation (solución de cloruro sódico tampón Tris + Tween 20)

3.: ratón/BAP-2a ALEXA 555, 5,0 µg/ml (EM Labor, ID: 1296) en PBS, pH 7,4 + bloque de potencia (1x) + 10 % de suero de cabra (pH 7,4), 1 h de incubación a temperatura ambiente, enjuague 3 veces con tampón de lavado DakoCytomation (solución de cloruro sódico tampón Tris + Tween 20)

Los cubreobjetos se tiñeron durante 5 minutos con DAPI, luego se enjuagaron 2x con tampón de lavado DakoCytomation, a continuación se incubaron durante 30 minutos con CuS04.5H2O 4 mM en CH3COONH4 50 mM a pH 5,0. Después de aclarar los portaobjetos en agua bidestilada se montaron cubreobjetos de vidrio utilizando medio de montaje de fluorescencia (S3023, DAKO).

Los resultados se muestran en las Figuras 14 a 15. En la corteza de ratones B6.MAB 11.152 aparecen ocasionalmente deposiciones amiloides vasculares en los capilares finos. No obstante, en ratones B6.152 a la misma edad no mostraron amiloide vascular alrededor de los capilares corticales. En los vasos más grandes, como los vasos meníngeos y ventriculares no aparece ninguna diferencia obvia en el grado de amiloidosis vascular observado entre ratones B6.MAB11.152 y B6.152.

Ejemplo 5: análisis de transferencia Western y mediciones Abeta Análisis de transferencia Western

Se fraccionaron 15 µg de extracto de proteínas totales mediante SDS -PAGE y posteriormente lo Transferido ontológica de una membrana de nitrocelulosa (Amersham, Hybond). Para una detección , las membranas se calentaron durante 5 min a 95 ° C en PBS (8,1 mM de d isodio hidrógeno fosfato, 1,5 mM de dihidrógeno fosfato de potasio, cloruro de sodio 137 mM, 2,7 mM de cloruro de potasio) para aumentar agrandar desnaturalización epítopo

y la presentación de epítopos, bloquearon con 5 % (w / v) de leche seca sin grasa en PBST (PBS y 0,05 % (v / v) de Tween 20) y se incubaron durante la noche a 4 ° C c on el anticuerpo primario. Para la detección de la APP, el anticuerpo primario W0-2 (Ida et al., J Biol. Chem. 1996, 271(37):22908-1) se utilizó a una concentración de 1 µg/ ml. Para la detección de la presenilina-2 se utilizó el anticuerpo monoclonal PST-20 para la detección del fragmento amino terminal (Loetscher et al, J. Biol. Chem. 1997 Aug 15; 272 (33) :20655-9), para el anticuerpo tau, Tau-5 (Invitrogen) para la totalidad de APP el anticuerpo anti-APP-CT20 (Calbiochem) y para APP humano, el anticuerpo WO-2 que es específico para APP humana (Ida et al, J. Biol. Chem. 1996, 271 (37):22908-1). Todos los pasos de lavado se realizaron con PBST a 4 °C. La unión del an ticuerpo primario se reveló con anticuerpo anti-IgG conjugado con peroxidasa de rábano picante (Amersham) seguido por el sistema de detección ECL de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham).

Mediciones Abeta

Un hemisferio cerebral se homogeneizó en 10 volúmenes (p/v) de urea 9M, Tris-HCl 50 mM pH 7,4, que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa (Complete™, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 4 °C d urante 5 min. a 1500 g. La concentración de proteína en el sobrenadante se midió utilizando el ensayo de proteína BCA (Pierce, EE.UU.).

Los niveles de Aβ40 y Aβ42 en homogeneizados de cerebro se determinaron utilizando electroquimioluminiscencia en fase líquida (LPECL) como se describe en Czech et al. (J Neurochem, 2007, 101 (4): 929-36). Brevemente, perlas paramagnéticas M-280 (Bioveris) se diluyeron con tampón de ensayo (Tris 50 mM, NaCl 60 mM, BSA 0,5 %, 1 % de Tween 20, pH 7,4). 50 µl de extracto de cerebro se incubaron a temperatura ambiente con con 50 µl de perlas y 25 µl de anticuerpos marcados (6E10-bio y BAP24-TAG para la detección de Aβ1-40 6E10-bio y BAP24-TAG para la detección de Aβ1-42) en un volumen final de 250 µl durante 3 h con agitación suave. ECL se cuantificó utilizando un analizador M8 de serie M (Bioveris). Diferentes diluciones de homogeneizados de cerebro con tampón de ensayo se midieron para asegurar la respuesta lineal de la señal y se comparó con péptidos sintéticos estándar Aβ1-40 y Aβ1-42 (Bachem). Los péptidos Aβ se solubilizaron en DMSO a una concentración de 1 mg/ml, se alicuotaron y se almacenaron congeladas a -80 °C. L os resultados se expresaron como ng/mg de homogeneizado de cerebro en referencia a las curvas estándar de Aβ1-40 y Aβ1-42, respectivamente. Las mediciones se realizaron por duplicado para cada dilución de la muestra y se repitieron al menos dos veces.

Ejemplo 6: qRT -PCR de mab11 en ratones B6.mab11.152 Los esplenocitos se aislaron a partir de bazos enteros picados pasados a través de un filtro de células de 70 µm y se diluyeron en serie para la extracción de RNS. Se tomaron muestras de cerebro con microdisecciones láser de la corteza, el cerebelo y el subiculum y se recogieron en RNAlater®. El RNA se extrajo utilizando el equipo RNAeasy de Qiagen. La PCR se realizó con el equipo QuantiTectProbe RT-PCR (Qiagen). El ensayo TaqMan ® (Applied Biosystems Inc) se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las sondas fueron muIGH6_ Mm01718956_ml (IgM = marcador de células B), muAPP Mm00431827_m1 (gen de referencia para el cerebro), huHC_custom (a medida por ABI basado en la construcción MAb11 IgG1), y huLC_custom (a medida por ABI basado en la construcción MAb11 IgKappa).

La PCR se realizó con el LC480 (Roche Diagnostics). La cuantificación relativa de los RNA diana se realizaron mediante el método ΔCt. Las microdisecciones cerebrales de los ratones no transgénicos no dieron ninguna señal positiva para los RNA de MAb11 IgH y IGK. Los resultados para ratones B6.mab11.152 se dan en las tablas 3 y 5.

Tabla 3: Expresión de huIgH y hulgK en el cerebro de los ratones B6.mab11.152

Media ΔCp DE ΔΔ % de APP dlgHCX 4,17 1:32 0,055 5,5 dlgKCx 2,41 0,58 0,188 18,8 dlgHCb 4,23 0,75 0,053 5,3 dlgKCb 2,93 0,69 0,131 13,1 dlgHSub 4,32 1,12 0,050 5,0 dlgKSub 2,71 1,32 0,153 15,3

La expresión de genes endógenos de referencia IgM y CD20 en ratones de tipo salvaje y transgénicos fue dependiente del número de células. Sólo se encontró en los ratones transgénicos una señal robusta y dependiente de células para huIg. En los ratones de tipo salvaje no se detectó señal frente la señal de fondo del ensayo (véase el cuadro 4 y 5).

Tabla 4: Ct para ratones B6.mab11.152. IGH6_55, IGH6_56 = referencia de IgM endógena, CD20 = referencia de CD20 endógeno, huIgHG I huIgKC = sondas específicas de transgenes.

Nº de células: IGH6_55 IGH6_56 CD20 huIgHG1 hulgKC

10.000: 22,2 25,0 24,9 29,0 24,4

12

1000 25,5 28,0 28,0 32,2 27,3 100 28,6 31,5 30,8 35,1 30,8 10 31,2 34,7 32,8 37,9 34,6 1 32,7 38,1 33,1 38,0

Tabla 5: Ct para ratones de tipo salvaje C57B1/6. IGH6_55, IGH6_56 = referencia de IgM endógena, CD20 = referencia de CD20 endógeno, huIgHG I huIgKC = sondas específicas de transgenes.

Nº de células IGH6_55 IGH6_56 CD20 huIgHG1 hulgKC

10 10.000 20,8 23,3 23,2 44,5 38,4 1000 24,0 26,4 26,4 100 27,2 29,7 29,6 38,5 36,3 10 30,1 33,5 32,2 38,1 1 31,9 36,5 33,5

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> F. Hoffmann-La Roche AG

<120 > animal no humano cuatro veces transgénico 5 <130> 24576

<150> EP07119837.8

<151> 2007-11-01

<160> 19

<170> PatentIn versión 3.4 10 <210> 1

<211> 2369

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<300> 15 <308> sw/X06989

<309> 2003-01-09

<313> (32)..(2369)

<400> 1

<210> 2

<211> 5572

<212> DNA 5 <213> Mus musculus

<300>

<308> SW/X06989

<309> 2003-01-09

<313> (1)..(5572) 10 <400> 2

<210> 3

<211> 4742

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 6112

<212> DNA 5 <213> Artificial

<220>

<223> descripción de la secuencia artificial: la secuencia comprende nucleótidos del gen de la glicoproteína de ratón Thy-1.2 (XbaI-BanI) y de BetaAPP751 humano que comprende la mutación swedish.

<220> 10 <221> fuente

<222> (1)..(2602)

<223> mus musculus

<220>

<221> fuente

<222> (2603)..(4982)

<223> homo sapiens 5 <220>

<221> característica miscelánea

<222> (2616)..(2616)

<223>n is a,c,g, ort

<220> 10 <221> fuente

<222> (4983)..(6112)

<223> mus musculus

<400> 4

<210> 5

<211> 25

5: <212> DNA

<213> Artificial

<220>

10: <223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR <400> 5 aagtatgtcc gcgcagaaca gaagg 25 <210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

15: <223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR <400> 6 ctgagatatt tgaaggactt ggggag 26 <210> 7

<211> 22

<212> DNA

20: <213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial description: cebador de PCR <400> 7 tcattggctt gtgtctgacc ct 22 <210> 8

25: <211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

30: <223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR <400> 8 gctttcaacg tcagtaggac aa 22 <210> 9

<211> 2236

<212> DNA

35: <213> Homo sapiens <300>

<308> X06989

<309> 2003-01-09

<313> (1)..(2236) <400> 9

40

<210> 10

<211> 1562

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 715

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 31 10 <212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR

<400> 12 acgtgtcgac gccgccacca tgaaacacct g 31 15 <210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220> 20 <223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR

<400> 13 acgtggatcc tcatttaccc ggagacag 28

<210> 14

<211> 31

<212> DNA 25 <213> Artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR

<400> 14 acgtctcgag gccgccacca tggtgttgca g 31

<210> 15 30 <211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR 35 <400> 15 acgtagatct ctaacactct cccctgttg 29

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220> 5 <223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR

<400> 16 atgaattcac agtttcactt ctgcacc 27

<210> 17

<211> 20

<212> DNA 10 <213> Artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR

<400> 17 tgtactcctt gccattcagc 20

<210> 18 15 <211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR 20 <400> 18 gctcatcaga tggcgggaag 20

<210> 19

<211> 448

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25 <400> 19

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ratón transgénico cuyo genoma comprende:

5 a) una primera secuencia de DNA transgénico que codifica una proteína humana APP Swedish o una proteína humana APP London, en el que dicha primera secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a un primer promotor;

b) una segunda secuencia de DNA transgénico que codifica una proteína presenilina 2 humana, que

10 comprende una sustitución N141I, en el que dicha segunda secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a un segundo promotor;

c) una tercera secuencia de DNA transgénico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo dirigido contra el péptido amiloide, en el que dicha tercera secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a un tercer

15 promotor y;

d) una cuarta secuencia de DNA transgénico que codifica una cadena pesada de dicho anticuerpo, en el que dicha cuarta secuencia de DNA transgénico está unida operativamente al tercer promotor o a un cuarto promotor.
2. El ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la tercera y cuarta secuencia de DNA transgénico codifican la cadena ligera y pesada del anticuerpo Mab11 anti-Abeta.
3. El ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el primer y segundo promotor son 25 promotores neuronales.
4. El ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el primer y segundo promotor son promotores específicos de cerebro.

30 5. El ratón transgénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el tercer y/o cuarto promotor es un promotor del gen MHC de clase I.
6. El ratón transgénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el tercer y/o cuarto promotor está combinado con un potenciador de IgH.
7. El ratón transgénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el ratón es homozigoto para al menos una de las secuencias de DNA transgénico.
8. La utilización de ratones cuatro veces transgénicos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 como 40 modelo de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
9. La utilización de ratones cuatro veces transgénicos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 como modelo de prevención de la enfermedad de Alzheimer.

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Figura 7

Figura 8

Figura 9