ES2948808T3 - Ratones transgénicos que expresan moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase II quiméricas - Google Patents
Ratones transgénicos que expresan moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase II quiméricas Download PDFInfo
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Abstract
La invención proporciona animales no humanos genéticamente modificados que expresan una proteína MHC II humanizada (MHC II humanizado y polipéptidos), así como embriones, células y tejidos que comprenden los mismos. También se proporcionan construcciones para fabricar dichos animales genéticamente modificados y métodos para fabricarlos. Se proporcionan métodos para utilizar animales genéticamente modificados para estudiar diversos aspectos del sistema inmunológico humano. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Ratones transgénicos que expresan moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase II quiméricas
Referencia cruzada a solicitud relacionada
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos n.° 13/793.935, presentada el 11 de marzo de 2013.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un roedor (p. ej., un ratón o una rata) que está modificado genéticamente para expresar una proteína del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) de clase II humanizada, así como embriones, tejidos y células que expresan la misma. La invención se refiere además a métodos para producir un roedor modificado genéticamente que exprese una proteína del CMH II humanizada. También se divulgan métodos para usar roedores, células y tejidos que expresan una proteína CMH de clase II humanizada para identificar péptidos que activan linfocitos y que implican linfocitos T, y para desarrollar vacunas humanas y otras terapias.
Antecedentes de la invención
En la respuesta inmunoadaptativa, se reconocen antígenos extraños por las moléculas receptoras en los linfocitos B (por ejemplo, inmunoglobulinas) y linfocitos T (por ejemplo, receptor de linfocitos T o TCR). Estos antígenos extraños se presentan sobre la superficie de células como fragmentos peptídicos mediante proteínas especializadas, referidas genéricamente como moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Las moléculas CMH se codifican por múltiples loci que se encuentran como una agrupación enlazada de genes que abarcan aproximadamente 4 Mb. En ratones, los genes del CMH se encuentran en el cromosoma 17 y por razones históricas se denominan como los genes de histocompatibilidad 2 (H-2). En seres humanos, los genes se encuentran en el cromosoma 6 y se denominan genes de antígeno leucocitario humano (HLA). Los loci en ratones y seres humanos son poligénicos; incluyen tres clases altamente polimórficas de genes del CMH (clase I, II y III) que muestran una organización similar en genomas humanos y murinos (véase Fig. 2 y Fig. 3, respectivamente).
Los loci de CMH muestran el polimorfismo más alto en el genoma; algunos genes se representan por >300 alelos (por ejemplo, HLA-DRp humano y HLA-B humano). Todos los genes del CMH de clase I y II pueden presentar fragmentos peptídicos, pero cada gen expresa una proteína con distintas características de unión, reflejando polimorfismos y variantes alélicas. Cualquier individuo dado tiene una única gama de fragmentos peptídicos que puede presentarse sobre la superficie celular a linfocitos B y T en el transcurso de una respuesta inmunitaria.
Tanto los seres humanos como los ratones tienen genes del CMH de clase II (véase Fig. 2 y 3). En seres humanos, los genes de CMH II clásicos se denominan HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR, mientras que en ratones son H-2A y H-2E (a menudo abreviados como I-A e I-E, respectivamente). Proteínas adicionales codificadas por genes en el locus CMH II, HLA-DM y HLA-DO en seres humanos y H-2M y H-2O en ratones, no se encuentran sobre la superficie celular, sino que residen en el compartimento endocítico y aseguran una carga adecuada de las moléculas CMH II con péptidos. Las moléculas de clase II consisten en dos cadenas polipeptídicas: cadena a y cadena p. La porción extracelular de la cadena a contiene dos dominios extracelulares, a1 y a2; y la porción extracelular de la cadena p también contiene dos dominios extracelulares, p1 y p2 (véase Fig. 1). Las cadenas a y p están asociadas no covalentemente entre sí.
Las moléculas CMH de clase II se expresan sobre células presentadoras de antígeno (APC), p. ej., linfocitos B, macrófagos, células dendríticas, células endoteliales durante el transcurso de inflamación, etc. Las moléculas CMH II expresadas sobre la superficie de APC normalmente presentan antígenos generados en vesículas intracelulares a linfocitos T CD4+. Para participar en implicación de linfocitos T CD4+, el complejo CMH de clase II con el antígeno de interés debe ser lo suficientemente estable para sobrevivir lo suficiente para implicar un linfocito T CD4+. Cuando un linfocito T auxiliar CD4+ se involucra mediante un péptido extraño/complejo CMH II sobre la superficie de las APC, el linfocito T se activa para liberar citocinas que ayudan en la respuesta inmunitaria con respecto al invasor.
No todos los antígenos provocarán la activación de linfocitos T debido a los mecanismos de tolerancia. Sin embargo, en algunas enfermedades (por ejemplo, cáncer, enfermedades autoinmunitarias) los péptidos derivados de algunas proteínas propias se convierten en la diana del componente celular del sistema inmunitario, lo que da como resultado la destrucción de las células que presentan tales péptidos. Ha habido un gran avance en el reconocimiento de antígenos que son clínicamente significantes (por ejemplo, antígenos asociados con diversos tipos de cáncer). Sin embargo, para mejorar la identificación y selección de péptidos que provocarán una respuesta adecuada en un linfocito T humano, en particular, para péptidos de antígenos clínicamente significantes, sigue existiendo la necesidad de sistemas in vivo e in vitro que imiten aspectos del sistema inmunitario humano. Así, existe la necesidad de sistemas biológicos (por ejemplo, células y animales no humanos modificados genéticamente) que pueden mostrar componentes de un sistema inmunitario humano.
Sumario de la invención
Se proporciona un sistema biológico para generar o identificar péptidos que se asocian con proteínas CMH de clase II humanas y quimeras de las mismas y se unen a linfocitos T CD4+. Se proporcionan células de roedores que expresan moléculas humanizadas que actúan en la respuesta inmunitaria celular. También se divulgan loci de roedores humanizados que codifican proteínas CMH II humanizadas. También se divulgan células de roedores humanizadas que expresan moléculas CMH humanizadas. Se divulgan sistemas in vivo e in vitro que comprenden células de roedor humanizadas, en donde las células de roedores expresan una o más moléculas del sistema inmunitario humanizadas.
En el presente documento se divulga un roedor (por ejemplo, un ratón o una rata) que comprende en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica un complejo CMH II humanizado, en donde una porción humana del complejo CMH II humanizado comprende un dominio extracelular de un complejo CMH II humano, p. ej., un dominio a extracelular del CMH II humanizado y un dominio p extracelular del CMH II humanizado.
En el presente documento se divulga un roedor que comprende en un locus del gen a del CMH II endógeno una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor. En un ejemplo, una porción humana de tal polipéptido a del c Mh II quimérico de humano/roedor comprende un dominio a extracelular del CMH II humano. En la presente invención, el roedor expresa un complejo CMH II funcional en una superficie de una célula del animal. En la presente invención, el dominio a extracelular del CMH II humano en el animal comprende los dominios a l y a2 del CMH II humano y una porción de roedor del polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor comprende dominios transmembrana y citoplasmáticos de un polipéptido a del CMH II endógeno de roedor. En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor está unida operativamente a (por ejemplo, se expresa bajo el control regulador de) el promotor de a del CMH II y elementos reguladores endógenos de roedor. En la presente invención, la porción humana del polipéptido quimérico se deriva de una proteína HLA clase II humana seleccionada del grupo que consiste en HLA-DR y HLA-DQ, p. ej., la porción humana se deriva de una proteína HLA clase II seleccionada de una proteína HLA-DR4, HLA-DR2, HLA-DQ2 y HLA-DQ8. El animal es un roedor, p. ej., un ratón. El roedor comprende en un locus del gen a del CMH II endógeno una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor y comprende además en un locus del gen p del CMH II endógeno una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor. También se divulga en el presente documento un método para producir un roedor modificado genéticamente que comprende en un locus del gen a del CMH II endógeno una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor. Tal método puede comprender reemplazar en un locus del gen a del CMH II endógeno una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido a del CMH II endógeno de roedor con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor.
También se divulga en el presente documento un roedor que comprende en un locus del gen p del CMH II endógeno una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido p del c Mh II quimérico de humano/roedor. En un ejemplo, una porción humana de tal polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor comprende un dominio p extracelular del CMH II humano. En la presente invención, el roedor expresa un complejo CMH II funcional en una superficie de una célula del animal. El dominio p extracelular del CMH II humano en el animal comprende los dominios p1 y p2 del CMH II humano y la porción de roedor del polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor comprende los dominios transmembrana y citoplasmáticos de un polipéptido p del CMH II endógeno de roedor. En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor está unida operativamente a (por ejemplo, se expresa bajo el control regulador de) el promotor de p del CMH II y elementos reguladores endógenos de roedor. En la presente invención, la porción humana del polipéptido quimérico se deriva de una proteína HLA clase II humana seleccionada del grupo que consiste en HLA-DR y HLA-DQ, p. ej., la porción humana se deriva de una proteína HLA clase II seleccionada de una proteína HLA-DR4, HLA-DR2, HLA-DQ2 y HLA-DQ8. El animal es un roedor, p. ej., un ratón. El roedor comprende en un locus del gen p del CMH II endógeno una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido p del c Mh II quimérico de humano/roedor y comprende además en un locus del gen a del CMH endógeno una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor. También se divulga en el presente documento un método para producir un roedor modificado genéticamente que comprende en un locus del gen p del CMH II endógeno una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor. Dicho método puede comprender reemplazar en un locus del gen p del CMH II endógeno una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido p del CMH II endógeno de roedor con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor.
En el presente documento se divulga un roedor que comprende en un locus del gen del CMH II endógeno una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor, en donde una porción humana del polipéptido a del CMH II quimérico de humano/ratón comprende un dominio a extracelular del CMH II humano y una porción humana del polipéptido p del CMH II quimérico de humano/ratón comprende un dominio p extracelular del CMH II humano. En la presente invención, los polipéptidos a y p del CMH II quimérico de humano/roedor forman un complejo CMH Ii quimérico funcional (p. ej., complejo CMH II de humano/roedor) en la
superficie de una célula. En la presente invención, el dominio a extracelular del CMH II humano comprende los dominios a1 y a2 humanos del CMH II humano. En la presente invención, el dominio p extracelular del CMH II humano comprende los dominios p1 y p2 humanos del CMH II humano. En diferentes aspectos, la primera secuencia de nucleótidos se expresa bajo el control regulador de (p. ej., está unida operativamente a) el promotor de a del CMH II y elementos reguladores endógenos de roedor. En diferentes aspectos, la segunda secuencia de nucleótidos se expresa bajo el control regulador de (p. ej., está unida operativamente a) el promotor de p del CMH II y elementos reguladores endógenos de roedor. Una porción de roedor del polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor comprende dominios transmembrana y citoplasmáticos de un polipéptido a del CMH II endógeno de roedor. Una porción del polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor comprende dominios transmembrana y citoplásmicos de un polipéptido p del CMH II endógeno de roedor.
En la presente invención, el animal es un roedor, y las porciones humanas de los polipéptidos a y p del CMH II quimérico de humano/roedor comprenden secuencias humanas derivadas de la proteína HLA clase II seleccionada del grupo que consiste en HLA-DR y HLA-DQ. En algunas realizaciones de la invención, las porciones humanas de las secuencias a y p del CMH II quiméricas de humano/roedor se derivan de una secuencia HLA-DR4 humana; así, la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio a extracelular del CMH II se deriva de una secuencia de un gen HLA-DRa*01, y la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio p extracelular del CMH II se deriva de una secuencia de un gen HLA-DRp 1*04. En algunas realizaciones de la invención, las porciones humanas de las secuencias a y p del CMH II quiméricas de humano/roedor se derivan de una secuencia HLA-DR2 humana; así, la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio a extracelular del CMH II se deriva de una secuencia de un gen HLA-DRa1*01, y la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio p extracelular del CMH II se deriva de una secuencia de un gen HLA-DRp1*02 (p. ej., el gen HLA-DRp1 *02(1501)). En algunas realizaciones de la invención, las porciones humanas de las secuencias a y p del CMH II quiméricas de humano/roedor se derivan de una secuencia HLA-DQ2 humana; así, la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio a extracelular del CMH II se deriva de una secuencia de un gen HLA-DQa1*05 (p. ej., el gen HLA-DQA1*1501), y la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio p extracelular del CMH II se deriva de una secuencia de un gen HLA-DQp1*02. En algunas realizaciones de la invención, las porciones humanas de las secuencias a y p del CMH II quiméricas de humano/roedor se derivan de una secuencia HLA-DQ8 humana; así, la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio a extracelular del CMH II se deriva de una secuencia de un gen HLA-DQa1*0301, y la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio p extracelular del CMH II se deriva de una secuencia de un gen HLA-DQp1*0302.
En varias realizaciones de la invención, la primera y la segunda secuencia de ejemplos de nucleótidos están ubicadas en el mismo cromosoma. En algunos ejemplos, el animal comprende dos copias del locus CMH II que contiene la primera y la segunda secuencia de nucleótidos, mientras que en otros ejemplos el animal comprende una copia del locus CMh II que contiene la primera y la segunda secuencia de nucleótidos. Así, el animal puede ser homocigótico o heterocigótico para el locus CMH II que contiene la primera y la segunda secuencia de nucleótidos. En un ejemplo, el CMH II quimérico descrito en el presente documento está en la línea germinal de un roedor.
En algunas realizaciones, el polipéptido a del CMH II quimérico y/o el polipéptido p del CMH II quimérico están unidos operativamente a una secuencia líder de roedor.
En la presente invención, el animal modificado genéticamente es un roedor. En una realización, el roedor se selecciona del grupo que consiste en un ratón y una rata. Así, en algunas realizaciones, las secuencias de roedores de los genes a y p del CMH II quimérico se derivan de secuencias de nucleótidos que codifican la proteína del CMH II de ratón, p. ej., la proteína H-2A o H-2E de ratón. En una realización, el roedor (p. ej., el ratón o la rata) de la invención no expresa polipéptidos del CMH II endógenos funcionales a partir de sus loci endógenos. En una realización, en donde el roedor es un ratón, el ratón no expresa polipéptidos H-2E y H-2A endógenos funcionales de sus loci endógenos.
Así, en algunas realizaciones, se proporciona un ratón que comprende en un locus CMH II endógeno de ratón una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido a del CMH II quimérico de humano/ratón y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido p del CMH II quimérico de humano/ratón, en donde una porción humana del polipéptido a del CMH II quimérico comprende un dominio extracelular derivado de un polipéptido a de una proteína h La de clase II humana seleccionada de HLA-DR4, HLA-DR2, HLA-DQ2 y HLA-DQ8 y una porción humana del polipéptido p del CMH II quimérico de humano/ratón comprende un dominio extracelular derivado de un polipéptido p de una proteína HLA de clase II humana seleccionada de HLA-DR4, HLA-DR2, HLA-DQ2 y HLA-DQ8, en donde una porción de ratón del polipéptido a del CMH II quimérico comprende dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena a H-2A o H-2E de ratón y una porción de ratón del polipéptido p del CMH II quimérico comprende dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena p de H-2A o H-2e de ratón y en donde el ratón expresa un complejo HLA clase II quimérico funcional. En una realización, el complejo HLA clase II quimérico funcional es HLA-DR4/H-2E. En otra realización, el complejo HLA clase II quimérico funcional es HLA-DR2/H-2E. En otra realización, el complejo HLA clase II quimérico funcional es HLA-DQ2/H-2A. En otra realización más, el complejo HLA clase II quimérico funcional es HLA-DQ8/H-2A. El dominio extracelular del polipéptido a del CMH quimérico comprende los dominios a l y a2 humanos y el dominio extracelular del polipéptido p del CMH II quimérico comprende los dominios p1 y p2 humanos. En algunas realizaciones, la primera secuencia de nucleótidos se expresa bajo el control regulador de (p. ej., está unida operativamente a) promotor de a del CMH II y elementos reguladores endógenos de roedor, y la segunda secuencia de nucleótidos se expresa bajo el control regulador de (p. ej., está unida operativamente a) el
promotor de p del CMH II y elementos reguladores endógenos de roedor. En diversas realizaciones, el ratón no expresa polipéptidos del CMH II endógenos funcionales, p. ej., los polipéptidos H-2E y H-2A, de sus loci endógenos. En algunos aspectos, el ratón comprende dos copias del locus CMH II que contienen la primera y la segunda secuencia de nucleótidos, mientras que en otros aspectos, el ratón comprende una copia del locus CMH II que contiene la primera y la segunda secuencia de nucleótidos.
En el presente documento se proporciona un ratón que comprende en su genoma, p. ej., en su locus CMH II endógeno, dos o más, p. ej., dos, tres, cuatro, secuencia(s) de nucleótidos que codifica(n) un complejo(s) CMH II quimérico(s) de humano/ratón. Cada complejo comprende los polipéptido a del CMH II y p del CMH II, y una porción humana de los polipéptidos a del CMH II y p del c Mh quimérico comprende un dominio extracelular de los polipéptidos a del CMH II y p del CMH humanos, respectivamente, mientras que una porción de ratón comprende dominios transmembrana y citoplasmáticos de los polipéptidos a del CMH II y p del CMH de ratón, respectivamente. Así, el ratón puede expresar dos o más, p. ej., dos, tres, cuatro, complejo(s) del CMH II quimérico(s) de humano/ratón.
También se proporcionan métodos para producir roedores modificados genéticamente (por ejemplo, ratones o ratas) como se describe en el presente documento. En diversas realizaciones, los roedores (p. ej., ratones o ratas) de la invención se producen reemplazando secuencias endógenas del CMH II con secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos a y p del CMH II quimérico de humano/roedor (p. ej., humano/ratón). En un ejemplo, la invención proporciona un método para modificar un locus CMH II de un roedor (por ejemplo, un ratón o una rata) para expresar un complejo CMH II quimérico de humano/roedor que comprende reemplazar en el locus CMH II endógeno de roedor una secuencia de nucleótidos que codifica un complejo CMH II de roedor con una secuencia de nucleótidos que codifica un complejo CMH II quimérico de humano/roedor. En un ejemplo del método, la secuencia de nucleótidos que codifica el complejo CMH II quimérico de humano/roedor comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular de una cadena a del CMH II humano y los dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena a del CMH II de roedor y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular de una cadena p del CMH II humano y dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena p del CMH II de roedor. En algunos ejemplos, una porción de roedor del complejo CMH II quimérico se deriva de una proteína H-2E de ratón, y una porción humana se deriva de una proteína HLA-DR4 humana. En algunos ejemplos, una porción de roedor del complejo CMH II quimérico se deriva de una proteína H-2E de ratón, y una porción humana se deriva de una proteína HLA-DR2 humana. En algunos ejemplos, una porción de roedor del complejo CMH II quimérico se deriva de una proteína H-2A de ratón, y una porción humana se deriva de una proteína HLA-DQ2 humana. En otros aspectos más, una porción de roedor del complejo CMH II quimérico se deriva de una proteína H-2A de ratón, y una porción humana se deriva de una proteína HLA-DQ8 humana. En algunas realizaciones, la sustitución de los loci CMH II endógenos descritos en el presente documento se realiza en una sola célula ES, y la única célula ES se introduce en un embrión de roedor (p. ej., ratón o rata) para producir un roedor modificado genéticamente (p. ej., ratón o rata).
También se divulga en el presente documento un locus CMH II quimérico de roedor que codifica un complejo CMH II quimérico de humano/roedor, que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular de una cadena a del CMH II humano y dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena a del CMH II de roedor y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular de una cadena p del CMH II humano y dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena p del CMH II de roedor. En un ejemplo, el locus CMH II quimérico está en una posición del CMH II endógeno en un genoma de un ratón. En un ejemplo, el locus CMH II quimérico expresa un complejo CMH II quimérico de humano/roedor (por ejemplo, humano/ratón o humano/rata). En un ejemplo, el CMH II humano se selecciona de HLA-DQ, HLA-DR y HLA-DP (p. ej., HLA-DR4, HLA-DR2, HLA-DQ2 y HLA-DQ8). En un ejemplo, el CMH II de roedor es un CMH II de ratón seleccionado de H-2A y H-2E. En un ejemplo, el locus CMH II quimérico se puede obtener mediante cualquiera de los métodos descritos en el presente documento para generar roedores modificados genéticamente (por ejemplo, ratones o ratas).
También se divulgan, en el presente documento, células, p. ej., células presentadoras de antígeno aisladas, derivadas de los roedores (por ejemplo, ratones o ratas) descritos en el presente documento. También se describen tejidos y embriones derivados de los roedores descritos en el presente documento.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un dibujo esquemático de la molécula de clase CMH II expresada en la superficie de una célula presentadora de antígeno (APC), que contiene cuatro dominios: a1, a2, p1 y p2. El círculo gris representa un péptido unido en las hendiduras de unión a péptidos.
La Fig. 2 es una representación esquemática (no a escala) de la estructura genómica relativa del HLA humano, que muestra genes de clase I, II y III.
La Fig. 3 es una representación esquemática (no a escala) de la estructura genómica relativa del CMH de ratón, que muestra genes de clase I, II y III.
LaFIG. 4 (A-D) es una ilustración esquemática (no a escala) de la estrategia para generar un vector de direccionamiento que comprende l-E p e l-E a humanizado (es decir, quimera de H-2Ep/HLA-DRp1*04 y H2Ea/HLA-DRa*01, respectivamente). En la Fig. 4C, la secuencia del CMH II humanizado final de la Fig. 4B se liga entre los sitios de restricción Pl-Scel e I-C6ul de la construcción final de la Fig. 4A, para generar una construcción que comprende el CMH II humanizado y el exón 1 de l-Ea a de BALB/c. Pg=pseudogén; BHR= recombinación homóloga bacteriana; CM=cloranfenicol; spec=espectinomicina; hyg=higromicina; neo=neomicina; EP=electroporación. Los triángulos representan exones, los triángulos rellenados representan exones de ratón de ratones C57BL/6 (con la excepción de los triángulos rayados, que representan el exón 1 de l-Ea de ratón BALC/c) y los triángulos transparentes representan exones humanos.
La Fig. 5 muestra una ilustración esquemática, no a escala, de genes I-E e I-A del CMH de clase II, que muestran la desactivación del locus de ratón usando un casete de higromicina, seguido por la introducción de un vector que comprende l-E p e l-E a humanizado (es decir, quimera H-2Ep/HLA-DRp1*04 y H-2Ea/HLA-DRa*01, respectivamente). Los triángulos transparentes representan exones humanos; los triángulos rellenados representan exones de ratón. Las sondas usadas para el genotipado están rodeadas con un círculo.
La Fig. 6 muestra una ilustración esquemática, no a escala, de la eliminación mediada por Cre del casete de neomicina de la Fig. 5. Los triángulos transparentes representan exones humanos; los triángulos rellenados representan exones de ratón. Las dos tiras superiores representan loci de CMH II en ratón heterocigótico con CMH II humanizado que alberga un casete de selección de neomicina y las dos tiras inferiores representan loci de CMH II en ratón heterocigótico con CMH II humanizado con eliminación del casete de neomicina.
La Fig.7 muestra una ilustración comparativa esquemática, no a escala, de loci de clase II de ratón y humano. Los genes de clase II están representados por recuadros. Se incluyen los tamaños relativos (kb) de varios fragmentos de ácido nucleico.
La Fig. 8, en el panel izquierdo, es una ilustración esquemática (no a escala) de la estrategia de humanización para la cadena a del CMH II; en particular, la figura muestra una sustitución de los dominios a l y a2, codificados por los exones 2 y 3 del gen a del CMH II, reteniéndose las secuencias transmembrana y de la cola citoplásmica de ratón. En el locus humanizado, la secuencia líder a del CMH II se deriva de la cepa BALB/c de ratón. El panel derecho ilustra la humanización de la cadena p del CMH II; en particular, la figura muestra una sustitución de los dominios p1 y p2, codificados por los exones 2 y 3 del gen p del MCH II, reteniéndose las secuencias líder de ratón y transmembrana y de la cola citoplásmica de ratón. La fila superior son todas secuencias humanas; la fila central son todas secuencias de ratón; la fila inferior son todas secuencias humanizadas, con los exones 2 y 3 derivados de genes HLA-DR humanos.
La Fig. 9 muestra el análisis FACS con anticuerpo anti-HLA-DR de linfocitos B de un ratón heterocigoto para una HLA-DR4 quimérica (sin casete neo) en presencia (1681HET poli(I:C) o ausencia (1681HET) de poli(I:C), y un ratón de tipo silvestre (ratón WT).
La Fig. 10 es una ilustración esquemática (no a escala) de los vectores dirigidos utilizados para generar genes del CMH II humanizados, específicamente, un vector de direccionamiento para generar un ratón HLA-DQ2.5/H2-A (Fig. 10A), un vector de direccionamiento para generar un ratón HLA-DQ8.1/H-2A (Fig. 10B), y un vector de direccionamiento para generar un ratón HLA-DR2/H-2E (Fig. 10C). En los diagramas, a menos que se indique lo contrario (por ejemplo, loxsitio p, etc.), los recuadros o triángulos vacíos son secuencias de los exones humanos, las líneas dobles son secuencias de los intrones humanos, los cuadros o triángulos rellenados son secuencias de los exones de ratón, las líneas individuales son secuencias de intrones de ratón, y el triángulo rayado es el exón 1 de I-Ea del ratón BALB/c. La ubicación de las secuencias de unión se indica debajo de cada diagrama de vector de direccionamiento y se presenta en la Tabla 1 y en la Lista de secuencias.
La Fig. 11 muestra la expresión de H-2A/H-2E (IA/IE) de ratón y HLA-DQ2.5 humano en linfocitos B CD19+ obtenidos de ratones WT o heterocigotos HLA-DQ2.5/H-2A ("6040Het").
Descripción detallada de la invención
Definiciones
La presente invención proporciona roedores modificados genéticamente (por ejemplo, ratones, ratas, etc.) que expresan el polipéptido Cm H II humanizado; y además divulga embriones, células y tejidos que comprenden el mismo; métodos para producir los mismos; así como métodos para utilizar los mismos. A menos que se definan de otro modo, todos los términos y expresiones utilizados en el presente documento incluyen los significados que los términos y las expresiones tienen en la técnica, a menos que se indique claramente lo contrario o sea claramente evidente a partir del contexto en el que se utiliza un término o expresión.
El término "conservativa", cuando se usa para describir una sustitución conservativa de aminoácidos, incluye la sustitución de un resto de aminoácido por otro resto de aminoácido que tiene un grupo R de la cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). Se pueden conseguir sustituciones conservativas de aminoácidos modificando una secuencia de nucleótidos con el fin de introducir un cambio de
nucleótidos que codificará la sustitución conservativa. En general, una sustitución conservativa de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad del CMH II de presentar un péptido de interés. Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen cadenas laterales alifáticas tales como glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; cadenas laterales de hidroxilo alifáticas tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen amida tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromáticas tales como fenilalanina, tirosina y triptófano; cadenas laterales básicas tales como lisina, arginina e histidina; cadenas laterales ácidas tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y, cadenas laterales que contienen azufre tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/arginina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato, y asparagina/glutamina. En algunas realizaciones, una sustitución de aminoácidos conservativa puede ser una sustitución de cualquier residuo natural en una proteína con alanina, como se usa en, por ejemplo, mutagénesis por barrido de alanina. En algunas realizaciones, se realiza una sustitución conservativa que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica de PAM250 divulgada en Gonnet et al. ((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45).
En algunas realizaciones, la sustitución es una sustitución moderadamente conservativa en donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica de PAM250.
Así, también abarcado por la invención es un roedor modificado genéticamente cuyo genoma comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido CMH II humanizado, en donde el polipéptido comprende sustituciones de aminoácidos conservativas en las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento.
Un experto en la materia entendería que además de los restos de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido del CMH II humanizado descrito en el presente documento, debido a la degeneración del código genético, otros ácidos nucleicos pueden codificar el polipéptido de la invención. Por tanto, además de un roedor modificado genéticamente que comprende en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica polipéptidos del CMH II con sustituciones de aminoácidos conservativas, también se proporciona un roedor cuyo genoma comprende una secuencia de nucleótidos que difiere de la descrita en el presente documento debido a la degeneración del código genético.
El término "identidad", cuando se usa junto con secuencia incluye identidad, como se determina mediante numerosos algoritmos diferentes conocidos en la técnica que se pueden usar para medir la identidad de la secuencia de nucleótidos y aminoácidos. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se determinan las identidades usando una alineación ClustalW v. 1.83 (lenta) que emplea una penalización por apertura de hueco de 10,0, una penalización por extensión de hueco de 0,1, y usando una matriz de similitud de Gonnet (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). La longitud de las secuencias comparadas con respecto a la identidad de las secuencias dependerá de las secuencias concretas. En diversas realizaciones, la identidad se determina comparando la secuencia de una proteína madura desde su extremo N a su extremo C. En varios ejemplos cuando se compara una secuencia quimérica humana/no humana con una secuencia humana, la porción humana de la secuencia quimérica humana/no humana (pero no la porción no humana) se usa en la preparación de una comparación con el fin de discernir un nivel de identidad entre una secuencia humana y una porción humana de una secuencia quimérica humana/no humana (por ejemplo, comparando un ectodominio humano de una proteína quimérica humana/de ratón con un ectodominio humano de una proteína humana).
Los términos "homología" u "homólogo" en referencia a las secuencias, p. ej., nucleótidos o secuencias de aminoácidos, significan dos secuencias que, tras la alineación y la comparación óptimos, son idénticos en al menos aproximadamente el 75 % de nucleótidos o aminoácidos, p. ej., al menos aproximadamente el 80 % de nucleótidos o aminoácidos, p. ej., al menos aproximadamente el 90-95% de nucleótidos o aminoácidos, p. ej., más del 97 % de nucleótidos o aminoácidos. Un experto en la materia entenderá que, para el direccionamiento de genes óptimo, la construcción de direccionamiento debe contener brazos homólogos a secuencias de ADN endógenas (es decir, "brazos de homología"); así, se puede producir la recombinación homóloga entre la construcción de direccionamiento y la secuencia endógena dirigida.
La expresión "operativamente unido" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos de esta manera están en una relación que les permite funcionar en su manera prevista. Como tal, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína puede estar unida operativamente a secuencias reguladoras (por ejemplo, un promotor, potenciador, secuencia silenciadora, etc.) con el fin de conservar la regulación de la transcripción adecuada. Además, varias partes de la proteína quimérica o humanizada de la invención pueden unirse operativamente para retener el adecuado plegado, procesamiento, direccionamiento, expresión y otras propiedades funcionales de la proteína en la célula. A menos que se especifique de otro modo, varios dominios de la proteína quimérica o humanizada de la invención se unen operativamente entre sí.
Las expresiones "complejo CMH II", "proteína del CMH II", o similares, como se utilizan en el presente documento, incluyen el complejo entre un polipéptido a del CMH II y un polipéptido p del CMH II. La expresión "polipéptido a del CMH II" o "polipéptido p del CMH II" (o similares), como se utilizan en el presente documento, incluye el polipéptido a del CMH II solo o el polipéptido p del CMH II solo, respectivamente. De forma similar, los términos "complejo HLA-DR4", "proteína HLA-DR4", "complejo H-2E", "proteína H-2E", o similares (p. ej., términos similares que se refieren a
otros alelos del CMH II), se refieren a un complejo entre polipéptidos a y p. Normalmente, la expresión "CMH humano" y el término "HLA" se usan de manera intercambiable.
El término "sustitución", en referencia a la sustitución de genes se refiere a colocar material genético exógeno en un locus genético endógeno, reemplazando así la totalidad o una porción del gen endógeno con una secuencia del ácido nucleico ortóloga u homóloga. Como se demuestra en los Ejemplos siguientes, la secuencia de ácido nucleico de un locus CMH endógeno se sustituyó por una secuencia de nucleótidos que comprende secuencias que codifican porciones de los polipéptidos a y p del CMH II humano; específicamente, que codifican las porciones extracelulares de los polipéptidos a y p del CMH II.
"Funcional" como se usa en el presente documento, p. ej., en referencia a un polipéptido funcional, se refiere a un polipéptido que conserva al menos una actividad biológica normalmente asociada con la proteína natural. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la invención, una sustitución en un locus endógeno (por ejemplo, la sustitución un locus CMH no humano endógeno) da como resultado un locus que no logra expresar un polipéptido endógeno funcional. Análogamente, el término "funcional" como se usa en el presente documento en referencia al dominio extracelular de una proteína, se refiere a un dominio extracelular que conserva su funcionalidad, p. ej., en el caso del CMH II, la capacidad de unir un antígeno, la capacidad de unir un correceptor de linfocitos T, etc. En algunas realizaciones de la invención, la sustitución en el locus de CMH endógeno da como resultado un locus que no logra expresar un dominio extracelular (por ejemplo, un dominio extracelular funcional) de un CMH endógeno mientras que expresa un dominio extracelular (por ejemplo, un dominio extracelular funcional) de un CMH humano.
Animales con el CMH II modificado genéticamente
En diferentes aspectos, la invención, por lo general, proporciona roedores modificados genéticamente que comprenden en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido del CMH II humanizado; así, los animales expresan un complejo CMH II humanizado (p. ej., polipéptidos a y p del CMH II).
Los genes del CMH se clasifican en tres clases: clase I, clase II y clase III, todos los cuales están codificados o bien en el cromosoma 6 humano o en el cromosoma 17 de ratón. Un esquema de la organización relativa de las clases del CMH humano y de ratón se presenta en las Fig. 2 y 3, respectivamente. La mayoría de los genes del CMH son polimórficos, de hecho, son los genes más polimórficos del genoma humano y del ratón. Se supone que los polimorfismos del CMH son importantes para proporcionar una ventaja evolutiva; los cambios en la secuencia pueden dar como resultado diferencias en la unión de péptidos que permiten una mejor presentación del antígeno. Una excepción es la cadena HLA-DRa humana y su homólogo de ratón, Ea (es decir, H-2Ea), que son monomórficos.
El complejo CMH de clase II comprende dos dominios no covalentemente asociados: una cadena a y una cadena p, también referidas en el presente documento como un polipéptido a y un polipéptido p (Fig. 1). La proteína atraviesa la membrana plasmática; de este modo, contiene un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico. La porción extracelular de la cadena a incluye dominios a l y a2 y la porción extracelular de la cadena p incluye dominios p1 y p2. Los dominios a l y p1 forman una hendidura de unión a péptidos sobre la superficie celular. Debido a la conformación tridimensional de la hendidura de unión a péptidos del complejo CMH II, no hay teóricamente un límite superior sobre la longitud del antígeno enlazado, pero normalmente los péptidos presentados por el CMH II tienen una longitud de entre 13 y 17 aminoácidos.
Además a su interacción con los péptidos antigénicos, la hendidura de unión a péptidos de la moléculas de CMH II interactúa con la cadena invariante (li) durante el proceso de formación del complejo CMH II y la adquisición de péptidos. Los dímeros a/p del CMH II se ensamblan en el retículo endoplásmico y se asocian con la cadena li, que es la responsable del control de la unión de péptidos y direccionamiento del CMH II en la trayectoria endocítica. En el endosoma, li sufre proteólisis y un pequeño fragmento de li, el péptido de cadena invariante asociado a la Clase II (CLIP), permanece en la hendidura de unión a péptidos. En el endosoma, con el control de HLA-DM (en humanos), el CLIP se intercambia por péptidos antigénicos.
El CMH II interactúa con el co-receptor de linfocitos T CD4 en la grieta hidrófoba en el punto de unión entre los dominios a2 y p2. Wang and Reinherz (2002) Structural Basis of T Cell Recognition of Peptides Bound to CMH Molecules, Molecular Immunology, 38:1039-49. Cuando CD4 y el receptor de linfocitos T unen la misma molécula del CMH II que forma un complejo con un péptido, la sensibilidad de un linfocito T a un antígeno se aumenta y requiere 100 veces menos de antígeno para su activación. Véase, Janeway's Immunobiology, 7a Ed, Murphy et al. eds., Garland Science, 2008.
Se han propuesto numerosas funciones para los dominios transmembrana y citoplásmico del CMH II. En el caso del dominio citoplásmico, se ha demostrado su importancia en la señalización intracelular, la transmigración a la membrana plasmática y, finalmente, la presentación de antígenos. Por ejemplo, se mostró que los hibridomas de linfocitos T responden pobremente a células presentadoras de antígeno (APC) transfectadas con cadenas p del CMH II truncadas en el dominio citoplásmico y la inducción de la diferenciación de linfocitos B se ve imposibilitada. Véase, p. ej., Smiley et al. (1996) Truncation of the class II p-chain cytoplasmic domain influences the level of class II/invariant chain-derived peptide complexes, Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa , 93:241-44. El truncamiento de moléculas de clase II
parece alterar la producción de AMPc. Se ha postulado que la deleción de la cola citoplásmica del CMH II afecta la transmigración intracelular, previniendo, de este modo, que el complejo atraviese antígenos relevantes en la trayectoria endocítica. Smiley et al. (anteriormente citado) demostraron que el truncamiento de moléculas de clase II en el dominio citoplásmico reduce el número de complejos CLIP/clase II, postulando que esto afecta a la capacidad de CLIP de regular eficazmente la presentación del antígeno.
Se ha hipotetizado que, como la agrupación del CMH II es importante para la estimulación del receptor de los linfocitos T (TCR), si se evitara que las moléculas del CMH II truncadas en el dominio citoplásmico se unieran al citoesqueleto y, por lo tanto, su agregación, la presentación del antígeno a los linfocitos T se vería afectada. Ostrand-Rosenberg et al. (1991) Abrogation of Tumorigenicity by CMH Class II Antigen Expression Requires the Cytoplasmic Domain of the Class II Molecule, J. Immunol. 147:2419-22. De hecho, se mostró recientemente que la HLA-Dr truncada en el dominio citoplásmico no pudo asociarse con el citoesqueleto tras la oligomerización. El Fakhy et al. (2004) Delineation of the HLA-DR Region and the Residues Involved in the Association with the Cytoskeleton, J. Biol. Chem. 279:18472-80. Es importante destacar que, la actina del citoesqueleto es un sitio de actividad localizada de transducción de la señal, que puede afectar la presentación del antígeno. Además de la asociación con el citoesqueleto, recientes estudios han demostrado también que hasta un 20 % de todas las moléculas de HLA-DR se encuentran presentes en las balsas lipídicas de las APC, que son microdominios ricos en colesterol y glicoesfingolípidos, y que tal localización es importante para la presentación del antígeno, la formación de la sinapsis inmunitaria, y la señalización mediada por el CMH II. Véase, p. ej., Dolan et al. (2004) Invariant Chain and the CMH II Cytoplasmic Domains Regulate Localization of CMH Class II Molecules to Lipid Rafts in Tumor Cell-Based Vaccines, J. Immunol. 172:907-14. Dolan et al. lo que sugiere es que el truncamiento del dominio citoplásmico del CMH II reduce la localización constitutiva del CMH II en las balsas lipídicas.
Además, el dominio citoplásmico del CMH II, en particular la cadena p, contiene un resto de leucina que se somete a ubiquitinación por la ubiquitina ligasa, RING-CH I asociada a membrana (MARCH I), que controla el tráfico endocítico, la internalización, y la degradación del CMH II; y se ha mostrado que la ubiquitinación mediada por MARCH cesa tras la maduración de células dendríticas que da como resultado niveles mayores del CMH II en la membrana plasmática. Shin et al. (2006) Surface expression of CMH class II in dendritic cells is controlled by regulated ubiquitination, Nature 444:115-18; De Gassart et al. (2008) CMH class II stabilization at the surface of human dendritic cells is the result of maturation-dependent MARCH I down-regulation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:3491-96.
Los dominios transmembrana de las cadenas a y p del CMH II interactúan entre sí y esta interacción es importante para el ensamblaje adecuado del complejo CMH de clase II. Cosson y Bonifacino (1992) Role of Transmembrane Domain Interactions in the Assembly of Class II CMH Molecules, Nature 258:659-62. De hecho, las moléculas del CMH II en las que los dominios transmembrana de las cadenas a y p se sustituyeron por la cadena a del receptor de IL-2 quedaron retenidas en el ER y apenas fueron detectables en la superficie celular. Id. A través de los estudios de mutagénesis, se ha descubierto que los restos Gly conservados en los dominios transmembrana a y p eran responsables del ensamblaje del CMH II en la superficie celular. Id. Así, ambos dominios, transmembrana y citoplásmico, son cruciales para el funcionamiento correcto del complejo CMH II.
En este documento se divulga un roedor modificado genéticamente (p. ej., ratón, rata, etc.) que comprende en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica un complejo CMH II humanizado, p. ej., uno varios polipéptidos a y p del CMH II humanizado. El roedor comprende en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica un complejo CMH II que es parcialmente humano y parcialmente no humano, p. ej., un roedor que expresa un complejo CMH II quimérico de humano/roedor (por ejemplo, un roedor que expresa polipéptidos a y p del CMH II quimérico de humano/roedor). En una realización, el roedor solo expresa el complejo c Mh II humanizado, p. ej., un complejo CMH II quimérico de humano/roedor, y no expresa un complejo CMH II endógeno de roedor a partir de un locus CMH II endógeno. En algunas realizaciones, el animal es incapaz de expresar ningún complejo c Mh II endógeno de roedor a partir de un locus CMH II endógeno, y solo expresa el complejo CMH II humanizado. En otras realizaciones, el animal conserva una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido del CMH II de ratón endógeno funcional. En diversas realizaciones, el roedor modificado genéticamente, (por ejemplo, ratón, rata, etc.) comprende en su línea germinal una secuencia de nucleótidos que codifica un complejo CMH II humanizado, p. ej., uno o varios polipéptidos a y/o p del CMH II humanizado.
En este documento se divulga un roedor, p. ej., una rata o un ratón, que comprende en su genoma, p. ej., en un locus CMH II endógeno de roedor, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido del CMH II humano. En este documento se divulga un roedor, p. ej., una rata o un ratón, que comprende en su genoma, p. ej., en un locus CMH II endógeno, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido del CMH II quimérico de humano/roedor. Así, en el presente documento también se divulga un roedor que comprende en su genoma, p. ej., en un locus CMH II endógeno de roedor, una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican un complejo CMH II humano o quimérico de humano/roedor.
En el presente documento se divulga un complejo CMH II quimérico de humano/roedor. En un ejemplo, el complejo CMH II quimérico de humano/roedor comprende un polipéptido a del MCH II quimérico de humano/roedor y un polipéptido p del MCH II quimérico de humano/roedor. En un ejemplo, una porción humana del polipéptido a del CMH II quimérico y/o una porción humana del polipéptido p del CMH II quimérico comprende un dominio de unión al péptido
de un polipéptido a del CMH II humano y/o un polipéptido p del CMH II humano, respectivamente. En un ejemplo, una porción humana del polipéptido a y/o p del CMH II quimérico comprende un dominio extracelular de un polipéptido a y/o p del CMH II humano, respectivamente. En un ejemplo, una porción humana del polipéptido a del CMH II quimérico comprende un dominio a l de un polipéptido a del CMH II humano; en otra realización, una porción humana del polipéptido a del CMH II quimérico comprende los dominios a l y a2 de un polipéptido a del CMH II humano. En un ejemplo adicional, una porción humana del polipéptido p del CMH II quimérico comprende el dominio p1 de un polipéptido p del CMH II humano; en otra realización, una porción humana del polipéptido p del CMH II quimérico comprende los dominios p1 y p2 de un polipéptido p del CMH II humano.
La porción humana de los polipéptidos a y p del CMH II descritos en el presente documento puede estar codificada por cualquiera de los loci HLA-DP, -DQ y DR. Una lista de antígenos y alelos de HLA habitualmente utilizados se describe en Shankarkumar et al. ((2004) The Human Leukocyte Antigen (HLA) System, Int. J. Pharm. Genet. 4(2):91-103). Shankarkumar et al. también presentan una breve explicación de la nomenclatura de HLA utilizada en la técnica. Se puede encontrar información adicional con respecto a la nomenclatura de HLA y diversos alelos de HLA en Holdsworth et al. (2009) The HLA dictionary 2008: a summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, and DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens, Tissue Antigens 73:95-170, y una reciente actualización de Marsh et al. (2010) Nomenclature for factors of the HLA system, 2010, Tissue Antigens 75:291-455. Así, el polipéptido del CMH II humano o humanizado puede derivarse de cualquiera de las moléculas HLA humanas funcionales descritas en dichas referencias.
En un aspecto específico, las porciones humanas del complejo CMH II humanizado descrito en el presente documento derivan de HLA-DR humana, p. ej., HLA-DR4 o HLA-DR2. Normalmente, las cadenas a de HLA-DR son monomórficas, p. ej., la cadena a del complejo HLA-DR está codificada por el gen HLA-DRA (por ejemplo, el gen HLA-DRa1*01). Por otro lado, la cadena p de HlA-DR es polimórfica. Así, HLA-DR4 comprende una cadena a codificada por el gen HLA-DRA y una cadena p codificada por el gen HLA-DRB1 (por ejemplo, el gen HLA-DRp1*04). Como se describe en el presente documento a continuación, HLA-DR4 es conocido por estar asociado con la incidencia de un número de enfermedades autoinmunitarias, p. ej., artritis reumatoide, diabetes de tipo I, esclerosis múltiple, etc. HLA-DR2 comprende una cadena a codificada por el gen HLA-DRA y una cadena p codificada por el gen HLA-DRB1 (por ejemplo, el gen HLA-DRp1*02). HLA-DR2 es conocido por estar asociado con varias enfermedades, p. ej., síndrome de Goodpasture, esclerosis múltiple, etc. En una realización de la invención, el alelo HLA-DRA es el alelo HLA-DRa*01, p. ej., HLA-DRa*01:01:01:01. En otra realización, el alelo HLA-DRB es HLA-DRp1*04, p. ej., HLA-DRp1 *04:01:01. En otra realización, el alelo HLA-DRB es HLA- DRp1*02, p. ej., HLA- DRp1*1501.
En otra realización específica, las porciones humanas del complejo CMH II humanizado descrito en el presente documento derivan de HLA-DQ humana, p. ej., HLA-DQ2 y HLA-DQ8. HLA-DQ2 comprende una cadena a codificada por el gen HLA-DQA (p. ej., el gen HLA-DQa1*05). En una realización, el gen HLA-DQa1*05 es HLA-DQa1*0501. HLA-DQ2 también comprende una cadena p codificada por el gen HLA-DQB (p. ej., el gen HLA-DQp1*02). HLA-DQ8 comprende una cadena a codificada por el gen HLA-DQA (p. ej., el gen HLA-DQa1*0301). HLA-DQ8 también comprende una cadena p codificada por el gen HLA-DQB (p. ej., el gen HLA-DQp1*0302). Se sabe que los alelos HLA-DQ2.5 y HLA-DQ8 están asociados con enfermedades como la enfermedad celíaca y la diabetes tipo I.
Aunque los presentes Ejemplos describen estas secuencias de HLA particulares; cualquier secuencia de HLA-DR o HLA-DQ adecuada queda abarcada en el presente documento, p. ej., variantes polimórficas existentes en la población humana, secuencias con una o más modificaciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, secuencias de ácidos nucleicos que difieren de las secuencias descritas en el presente documento debido a la degeneración del código genético, etc.
Las porciones humanas del complejo CMH II humanizado pueden codificarse mediante secuencias de nucleótidos de alelos del HLA conocidos por estar asociados con enfermedades humanas comunes. Tales alelos HLA incluyen, pero no se limitan a, HLA-DRB1*0401, -DRB1*0301, - DQA1*0501, -DQB1*0201, -DRB1*1501, -DRB1*1502, -DQB1*0602, -DQA1*0102, - DQA1*0201, -DQB1*0202, -DQA1*0501, y combinaciones de los mismos. Para obtener un resumen de las asociaciones entre alelos de HLA y enfermedades, véase Bakker et al. (2006) A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human CMH, Nature Genetics 38:1166-72 and Supplementary Information.
En la presente invención, una porción de roedor del complejo CMH II quimérico de humano/roedor comprende dominios transmembrana y/o citoplasmáticos de un complejo CMH II endógeno de roedor (por ejemplo, ratón, rata, etc.). Así, una porción de roedor del polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor comprende dominios transmembrana y citoplasmáticos de un polipéptido a del CMH II endógeno de roedor. Una porción de roedor del polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor comprende dominios transmembrana y/o citoplasmáticos de un polipéptido p del CMH II endógeno de roedor. En un aspecto, el animal es un ratón y las porciones de roedor de los polipéptidos a y p quiméricos se derivan de una proteína H-2E de ratón. Así, las porciones de roedor de los polipéptidos a y p quimérico pueden comprender dominios transmembrana y citoplasmáticos derivados de una proteína H-2e de ratón. En otro aspecto, el animal es un ratón y las porciones de roedor de los polipéptidos a y p quiméricos se derivan de una proteína H-2A de ratón. Así, las porciones de roedor de los polipéptidos a y p quimérico pueden comprender dominios transmembrana y citoplasmáticos derivados de una proteína H-2A de ratón. Aunque se contemplan
secuencias de H-2E y H-2A específicas en los Ejemplos, cualquier secuencia adecuada, p. ej., variantes polimórficas, sustituciones de aminoácidos conservativas/no conservativas, etc., están abarcadas en el presente documento.
En la presente invención, la secuencia o secuencias que codifican un complejo CMH II quimérico de humano/roedor están situadas en un locus CMH II endógeno de roedor (p. ej., locus H-2A y/o H-2E de ratón). En una realización, esto da como resultado una sustitución de uno o varios genes del CMH II endógenos o una porción de los mismos con una o varias secuencias de nucleótidos que codifican una proteína del CMH II humanizada, p. ej., un gen quimérico que codifica una proteína del CMH II quimérica de human/roedor descrita en el presente documento. Dado que las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos a y p del CMH II se encuentran próximas entre sí en el cromosoma, se puede diseñar una sustitución para dirigirse a los dos genes de forma independiente o conjunta; ambas posibilidades están abarcadas en el presente documento. En una realización, la sustitución comprende una sustitución de una secuencia de nucleótidos endógena que codifica los polipéptidos a y p del CMH II con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido a del CMH quimérico de humano/roedor y un polipéptido p del CMH quimérico de humano/roedor. En un aspecto, la sustitución comprende reemplazar secuencias de nucleótidos que representan uno o más (por ejemplo, dos) genes del CMH II endógenos. Así, el roedor contiene una secuencia de nucleótidos de roedor/humano quimérico en un locus CMH II endógeno, y expresa una proteína del CMH II de humano/roedor quimérica del locus endógeno de roedor.
Así, en el presente documento se divulga un roedor que comprende en un locus del gen del CMH II endógeno una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor, en donde una porción humana del polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor comprende un dominio a extracelular del CMH II humano y una porción humana del polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor comprende un dominio extracelular p del CMH II humano y en donde los polipéptidos a del CMH II y p del CMH quiméricos humano/de roedor forman un complejo CMH II funcional en la superficie de una célula.
Un polipéptido quimérico de humano/roedor puede ser tal que comprende una secuencia líder (señal) humana o de roedor. En una realización, el polipéptido a del CMH II quimérico comprende una secuencia líder de roedor de un polipéptido a del CMH II endógeno. En una realización, el polipéptido p del CMH II quimérico comprende una secuencia líder de roedor de un polipéptido p del CMH II endógeno. En una realización alternativa, el polipéptido a del CMH II y/o p del CMH II quimérico comprende una secuencia líder del polipéptido a del CMH II y/o p del CMH II de roedor, respectivamente, de otro roedor, p. ej., de otra cepa de ratón. Así, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido a del CMH II y/o p del CMH II quimérico puede unirse operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia líder del polipéptido a del CMH II y/o p del CMH II de roedor, respectivamente. En otra realización más, el polipéptido a del CMH II y/o p del CMH II quimérico comprende una secuencia líder del polipéptido a del CMH II humano y/o p del CMH II humano, respectivamente. En una realización, la secuencia líder humana del polipéptido a del CMH II humano es una secuencia líder del HLA-DRA humano y la secuencia líder humana del polipéptido p del CMH II humano es una secuencia líder del HLA-DRp 1*04 humano. En otra realización, la secuencia líder humana del polipéptido a del CMH II humano es una secuencia líder del HLA-DRA humano y la secuencia líder humana del polipéptido p del CMH II humano es una secuencia líder del HLA-DRp 1*02 humano. En otra realización, la secuencia líder humana del polipéptido a del CMH II humano es una secuencia líder del HLA-DQa1*05 humano y la secuencia líder humana del polipéptido p del CMH II humano es una secuencia líder del HLA-DQp1*02 humano. En otra realización más, la secuencia líder humana del polipéptido a del CMH II humano es una secuencia líder del HLA-DQa1*0301 humano y la secuencia líder humana del polipéptido p del CMH II humano es una secuencia líder del HLA-DQp1*0302 humano.
Un polipéptido a del CMH II y/o p del CMH II quimérico de humano/de roedor puede comprender en su porción humana un dominio extracelular completo o sustancialmente completo de un polipéptido a del CMH II humano y/o p del CMH II humano, respectivamente. Así, una porción humana puede comprender al menos un 80%, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 %, p. ej., un 95 % o más de los aminoácidos que codifican un dominio extracelular de un polipéptido a del CMH II humano y/o p del CMH II humano. En un ejemplo, el dominio extracelular sustancialmente completo del polipéptido a del CMH II humano y/o p del CMH II humano carece de una secuencia líder humana. En otro ejemplo, el polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor y/o p del CMH II quimérico de humano/roedor comprende una secuencia líder humana.
Por otra parte, el polipéptido a del CMH II y/o p del CMH II quimérico puede estar operativamente unido a (por ejemplo, expresarse con el control regulador de) un promotor y elementos reguladores endógenos de roedor, p. ej., elementos reguladores de a del CMH II y/o y p del CMH II de ratón, respectivamente. Tal disposición facilitará la expresión adecuada de los polipéptidos del CMH II quiméricos en el animal no humano, p. ej., durante la respuesta inmunitaria en el roedor.
El roedor modificado genéticamente se puede seleccionar de un grupo que consiste en un ratón o rata. Para los roedores de los que no se dispone fácilmente de células ES modificables genéticamente adecuadas, se emplean otros métodos para producir un roedor no humano que comprenda la modificación genética. Dichos métodos incluyen, p. ej., modificar un genoma de una célula no ES (por ejemplo, un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y emplear la transferencia nuclear para transferir el genoma modificado a una célula adecuada, p. ej., un oocito, y gestar la célula
modificada (por ejemplo, el oocito modificado) en un roedor en las condiciones adecuadas para formar un embrión.
En un aspecto, el roedor es de la superfamilia Dipodoidea o Muroidea. El animal modificado genéticamente es un roedor. En una realización, el roedor se selecciona de un ratón, una rata, y un hámster. En una realización, el roedor se selecciona de la superfamilia Muroidea. En una realización, el animal modificado genéticamente es de una familia seleccionada de Calomyscidae (por ejemplo, hámsteres similares a ratones), Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones del nuevo mundo, campañoles), Muridae (ratones y ratas auténticos, jerbos, ratones espinosos, ratas con cresta), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de abazón de las rocas, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirón espinoso), y Spalacidae (por ejemplo, ratas topo, ratas del bambú, y zokores). En una realización específica, el roedor modificado genéticamente se selecciona de un ratón o rata auténtico (familia Muridae), un jerbo, un ratón espinoso y una rata con cresta. En una realización, el ratón modificado genéticamente es un miembro de la familia Muridae. En la presente invención, el animal es un roedor. En una realización específica, el roedor se selecciona de un ratón y una rata. En una realización, el roedor es un ratón.
En una realización específica, el roedor es un ratón de una cepa C57BL seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr y C57BL/Ola. En otra realización, el ratón es una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (véase, p. ej., Festing et al. (1999) "Revised nomenclature for strain 129 mice", Mammalian Genome 10:836, véase también, Auerbach et al (2000) "Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines)". En una realización específica, el ratón modificado genéticamente es una mezcla de una cepa 129 anteriormente mencionada y una cepa C57BL/6 anteriormente mencionada. En otra realización específica, el ratón es una mezcla de las cepas 129 anteriormente mencionadas, o una mezcla de las cepas BL/6 anteriormente mencionadas. En una realización específica, la cepa 129 de la mezcla es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En otra realización, el ratón es una cepa BALB, p. ej., cepa BALB/c. En otra realización más, el ratón es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa anteriormente mencionada.
En una realización, el roedor es una rata. En una realización, la rata se selecciona de una rata Wistar, una cepa LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, F344, F6 y Dark Agouti. En una realización, la cepa de la rata es una mezcla de dos o más cepas seleccionadas del grupo que consiste en Wistar, ESO, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 y Dark Agouti.
Así, en una realización, la invención se refiere a un ratón modificado genéticamente que comprende en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica un complejo CMH II quimérico de humano/ratón, p. ej., polipéptidos a y p del CMH II quimérico de humano/ratón. Una porción humana del polipéptido a del CMH II quimérico de humano/ratón comprende una unión al péptido a del CMH II humano o dominio extracelular o una porción del polipéptido p del CMH II quimérico de humano/ratón comprende una unión al péptido p del CMH II humano o dominio extracelular. En algunas realizaciones, el ratón no expresa una unión al péptido o un dominio extracelular de polipéptido a y/o p de ratón endógeno procedente de un locus de ratón endógeno (por ejemplo, locus de H-2A y/o H-2E). En algunas realizaciones, el ratón no expresa una unión al péptido o dominios extracelulares funcionales de polipéptidos del CMH II endógenos de ratón a partir de su locus CMH II de ratón endógeno. En algunas realizaciones, el ratón comprende un genoma que carece de un gen que codifica una molécula del CMH de clase II funcional que comprende un H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, H-2Ea y una combinación de los mismos. El dominio de unión al péptido del polipéptido CMH II a humano puede comprender un dominio a1 y el dominio de unión al péptido del polipéptido CMH II p humano puede comprender un dominio p1; así, el dominio de unión al péptido del complejo CMH II quimérico puede comprender los dominios a1 y p1 humanos. El dominio extracelular del polipéptido a del CMH humano comprende los dominios a1 y a2 y el dominio extracelular del polipéptido p del CMH II humano puede comprender los dominios p1 y p2; así, el dominio extracelular del complejo CMH II quimérico puede comprender los dominios a1, a2, p1 y p2. En una realización, la porción humana del complejo CMH II quimérico comprende dominios transmembrana y citosólicos del CMH II de ratón, p. ej., H-2E o H-2A de ratón (por ejemplo, dominios transmembrana y citosólicos de las cadenas a y p de H-2E de ratón o cadenas a y p de H-2A de ratón).
Por tanto, en una realización, se proporciona un ratón modificado genéticamente, en donde el ratón comprende en un locus CMH II endógeno de ratón una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido a del CMH II quimérico de humano/ratón y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido p del CMH II quimérico de humano/ratón, en donde una porción humana del polipéptido a del CMH II quimérico comprende un dominio extracelular derivado de un polipéptido a de una proteína HLA-DR4 humana y una porción humana del polipéptido p del CMH II quimérico comprende un dominio extracelular derivado de un polipéptido p de una proteína HLA-DR4 humana, en donde una porción de ratón del polipéptido a del CMH II quimérico comprende dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena a de H-2E de ratón y una porción de ratón del polipéptido p del CMH II quimérico comprende dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena p de H-2E de ratón, y en donde el ratón expresa un complejo HLA-DR4/H-2E CMH II quimérico funcional. En una realización, el complejo HLA-DR4/H-2E CMH II quimérico comprende una cadena a del CMH II que incluye los dominios extracelulares a1 y dominios a2) derivados de la proteína HLA-DR4 (dominios a1 y a2 de h LA-DRA ) y dominios transmembrana y dominios citoplasmáticos de una cadena a de H-2E de ratón, así como una cadena p del CMH II que incluye los dominios extracelulares p1 y p2) derivados de HLA-DR4 (dominios p1 y p2 de HLA-DRp1 *04) y dominios transmembrana y citoplasmáticos de la cadena
p de H-2E de ratón.
En otra realización, se proporciona un ratón modificado genéticamente, en donde el ratón comprende en un locus CMH II endógeno de ratón una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido a del CMH II quimérico de humano/ratón y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido p del CMH II quimérico de humano/ratón, en donde una porción humana del polipéptido a del CMH II quimérico comprende un dominio extracelular derivado de un polipéptido a de una proteína HLA-DR2 humana y una porción humana del polipéptido p del CMH II quimérico comprende un dominio extracelular derivado de un polipéptido p de una proteína HLA-DR2 humana, en donde una porción de ratón del polipéptido a del CMH II quimérico comprende dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena a de H-2E de ratón y una porción de ratón del polipéptido p del CMH II quimérico comprende dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena p de H-2E de ratón, y en donde el ratón expresa un complejo HLA-DR2/H-2E CMH II quimérico funcional. En una realización, el complejo HLA-DR2/H-2E CMH II quimérico comprende una cadena a del CMH II que incluye dominios extracelulares (por ejemplo, dominios a l y a2) derivados de la proteína HLA-DR2 (dominios a l y a2 de HLA-DRA) y dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena a de H-2E de ratón, así como una cadena p del CMH II que incluye dominios extracelulares (p. ej., dominios p1 y p2) derivados de HLA-DR2 (p1 y p2 de HLA-DRp1*02) y dominios transmembrana y citoplasmáticos de la cadena p H-2e de ratón.
En otra realización, se proporciona un ratón modificado genéticamente, en donde el ratón comprende en un locus CMH II endógeno de ratón una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido a del CMH II quimérico de humano/ratón y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido p del CMH II quimérico de humano/ratón, en donde una porción humana del polipéptido a del CMH II quimérico comprende un dominio extracelular derivado de un polipéptido a de una proteína HLA-DQ2 humana y una porción humana del polipéptido p del CMH II quimérico comprende un dominio extracelular derivado de un polipéptido p de una proteína HLA-DQ2 humana, en donde una porción de ratón del polipéptido a del CMH II quimérico comprende dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena a de H-2A de ratón y una porción de ratón del polipéptido p del CMH II quimérico comprende dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena p de H-2A de ratón, y en donde el ratón expresa un complejo HLA-DQ2/H-2A CMH II quimérico funcional. En una realización, el complejo HLA-DQ2/H-2A CMH II quimérico comprende una cadena a del CMH II que incluye dominios extracelulares (por ejemplo, dominios a l y a2) derivados de la proteína HLA-DQ2 (dominios a l y a2 de HLA-DQa1*05) y dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena a de H-2A de ratón, así como una cadena p del CMH II que incluye dominios extracelulares (p. ej., dominios p1 y p2) derivados de HLA-DQ2 (p1 y p2 de HLA-DQp1*02) y dominios transmembrana y citoplasmáticos de la cadena p H-2A de ratón.
En otra realización más, se proporciona un ratón modificado genéticamente, en donde el ratón comprende en un locus CMH II endógeno de ratón una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido a del CMH II quimérico de humano/ratón y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido p del CMH II quimérico de humano/ratón, en donde una porción humana del polipéptido a del CMH II quimérico comprende un dominio extracelular derivado de un polipéptido a de una proteína HLA-DQ8 humana y una porción humana del polipéptido p del CMH II quimérico comprende un dominio extracelular derivado de un polipéptido p de una proteína HLA-DQ8 humana, en donde una porción de ratón del polipéptido a del CMH II quimérico comprende dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena a de H-2A de ratón y una porción de ratón del polipéptido p del CMH II quimérico comprende dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena p de H-2A de ratón, y en donde el ratón expresa un complejo HLA-DQ8/H-2A CMH II quimérico funcional. En una realización, el complejo HLA-DQ8/H-2A CMH II quimérico comprende una cadena a del CMH II que incluye dominios extracelulares (por ejemplo, dominios a l y a2) derivados de la proteína HLA-DQ8 (dominios a l y a2 de HLA-DQa1*0301) y dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena a de H-2A de ratón, así como una cadena p del CMH II que incluye dominios extracelulares (p. ej., dominios p1 y p2) derivados de HLA-DQ8 (p1 y p2 de HLA-DQp1*0302) y dominios transmembrana y citoplasmáticos de la cadena p H-2A de ratón.
En un aspecto, el ratón no expresa los polipéptidos H-2A y H-2E endógenos funcionales a partir de sus loci de ratón endógenos (por ejemplo, el ratón no expresa los polipéptidos H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, y H-2Ea). En diversas realizaciones, la expresión de la primera y la segunda secuencia de nucleótidos está bajo el control de los respectivos promotores y elementos reguladores endógenos de ratón (p. ej., la primera y la segunda secuencia de nucleótidos están unidas operativamente a los promotores y elementos reguladores endógenos). En varias realizaciones de la invención, la primera y la segunda secuencia de nucleótidos están situadas en el mismo cromosoma. En algunos aspectos, el ratón comprende dos copias del locus CMH II quimérico que contiene la primera y la segunda secuencia de nucleótidos, mientras que en otros aspectos, el ratón comprende una copia del locus CMH II que contiene la primera y la segunda secuencia de nucleótidos. Así, el ratón puede ser homocigótico o heterocigótico para el locus CMH II quimérico que contiene la primera y la segunda secuencia de nucleótidos. En diversas realizaciones, la primera y la segunda secuencia de nucleótidos están comprendidas en la línea germinal del ratón.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se proporciona un ratón que comprende un locus CMH II quimérico en un locus CMH II endógeno de ratón, p. ej., mediante la sustitución de genes H-2a y H-2E endógenos de ratón. En algunos aspectos, el locus quimérico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular de un HLA-DRA humano y dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena a de H-2E de ratón,
así como un dominio extracelular de un HLA-DRp1*04 o HLA-DRp1*02 humano y dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena p de H-2E de ratón. En otros aspectos, el locus quimérico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular de un HLA-DQa1*05 o HLA-DQa1*0301 humano y dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena a de H-2A de ratón, así como un dominio extracelular de un HLA-DQp1 *02 o HLA-DQp1 *0302 humano y dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena p de H-2A de ratón. Los diversos dominios del locus quimérico están unidos de tal manera que el locus expresa un complejo CMH II quimérico de humano/ratón funcional.
En la presente invención, un roedor (p. ej., un ratón o una rata) que expresa una proteína del CMH II quimérica funcional a partir de un locus CMH II quimérico como se describe en el presente documento muestra la proteína quimérica en una superficie celular. En una realización, el roedor expresa la proteína del CMH II quimérica en una superficie celular en una distribución celular que es la misma que la observada en un ser humano. En un ejemplo, la célula presenta un fragmento de péptido (fragmento de antígeno) unido a una porción extracelular (p. ej., porción extracelular de HLA-DR4, -DR2, -DQ2, o -DQ8 humano) de la proteína del CMH II quimérica.
En diversas realizaciones, una célula que presenta la proteína del CMH II quimérica (p. ej., proteína HLA-DR4/H-2E, HLA-DR2/H-2E, HLA-DQ2/H-2A o HlA-d Q8/H-2A) es una célula presentadora de antígeno (APC), por ejemplo, un macrófago, una célula dendrítica o un linfocito B. En algunas realizaciones, el fragmento peptídico presentado por la proteína quimérica se deriva de un tumor. En otras realizaciones, el fragmento peptídico presentado por la proteína del CMH II quimérica se deriva de un patógeno, p. ej., una bacteria, un virus o un parásito.
La proteína del CMH II quimérica descrita en el presente documento puede interactuar con otras proteínas en la superficie de la misma célula o de una segunda célula. En algunas realizaciones, la proteína del CMH II quimérica interactúa con proteínas endógenas de roedor sobre la superficie de dicha célula. La proteína del CMH II quimérica también puede interactuar con proteínas humanas o humanizadas en la superficie de la misma célula o de una segunda célula. En algunas realizaciones, la segunda célula es un linfocito T, y la proteína del CMH II quimérica interactúa con el receptor de linfocito T (TCR) y su co-receptor CD4. En algunas realizaciones, el linfocito T es un linfocito T endógeno de ratón. En otras realizaciones, el linfocito T es un linfocito T humano. En algunas realizaciones, el TCR es un TCR humano o humanizado. En realizaciones adicionales, el CD4 es un CD4 humano o humanizado. En otra realización, uno o ambos de TCR y CD4 no son humanos, p. ej., ratón o rata.
Se describe un roedor modificado genéticamente como se divulga en el presente documento que no desarrolla tumores a una tasa mayor que un animal de tipo silvestre que carece de un gen CMH II quimérico. En algunos ejemplos el animal no desarrolla neoplasias hematológicas, p. ej., diversos linfomas de linfocitos T y B, leucemias, linfomas compuestos (p. ej., linfoma de Hodgkin), a un ritmo más alto que el animal de tipo silvestre.
Además de un roedor modificado genéticamente, también se divulga un embrión de roedor, por ejemplo, un embrión de ratón o rata) en donde el embrión comprende una célula ES donante que se deriva de un roedor (por ejemplo, un ratón o una rata) como se describe en el presente documento. En un ejemplo, el embrión comprende una célula ES donante que comprende el gen CMH II quimérico y las células embrionarias del hospedador.
En el presente documento también se divulga un tejido, en donde el tejido se deriva de un roedor (p. ej., un ratón o una rata) como se describe en el presente documento, y expresa la proteína del CMH II quimérica (p. ej., proteína HLA-DR4/H-2E, HLA-DR2/H-2E, HLA-DQ2/H-2A o HLA-DQ8/H-2A).
Además, se divulga una célula de roedor aislada de un roedor como se describe en el presente documento. En una realización, la célula es una célula ES. En una realización, la célula es una célula presentadora de antígenos, p. ej., célula dendrítica, macrófago, linfocito B. En una realización, la célula es una célula inmunitaria. En una realización, la célula inmunitaria es un linfocito.
También se divulga una célula de roedor que comprende un cromosoma o fragmento del mismo de un roedor como se describe en el presente documento. En una realización, la célula de roedor comprende un núcleo de un roedor como se describe en el presente documento. En una realización, la célula de roedor comprende el cromosoma o fragmento del mismo como resultado de una transferencia nuclear.
En el presente documento se divulga una célula pluripotente inducida de roedor que comprende un gen que codifica una proteína del CMH II quimérica (por ejemplo, proteína HLA-DR4/H-2E, HLA-DR2/H-2e , HLA-DQ2/H-2A o HLA-DQ8/H-2A) como se describe en el presente documento. En una realización, la célula pluripotente inducida se deriva de un roedor como se describe en el presente documento.
En el presente documento se divulgan un hibridoma o cuadroma, derivados de una célula de un roedor como se describe en el presente documento. En una realización, el roedor es un ratón o una rata.
En el presente documento se divulga una preparación in vitro que comprende una primera célula que porta una proteína de superficie del CMH II quimérica de humano/roedor que comprende un péptido unido para formar un complejo CMH II/péptido quimérico de humano/roedor, y una segunda célula que se une al complejo CMH II/péptido
quimérico de humano/roedor. En una realización, la segunda célula comprende un receptor de linfocitos T humano o humanizado, y en una realización comprende además un CD4 humano o humanizado. En una realización, la segunda célula es una célula de roedor (p. ej., ratón o rata) que comprende un receptor de linfocitos T humano o humanizado y una proteína CD4 humana o humanizada. En una realización, la segunda célula es una célula humana.
También se proporciona un método para producir un roedor modificado genéticamente (por ejemplo, un ratón o una rata modificados genéticamente) descrito en el presente documento. El método para producir un roedor modificado genéticamente da como resultado el animal cuyo genoma comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína del CMH II quimérica (por ejemplo, los polipéptidos a y p del CMH II quiméricos). En una realización, el método da como resultado un ratón modificado genéticamente, cuyo genoma comprende en un locus CMH II endógeno una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína del CMH II quimérica de humano/ratón, en donde una porción humana de la proteína del CMH II quimérica comprende un dominio extracelular de una HLA-DR4 o HLA-DR2 humano y una porción de ratón comprende dominios transmembrana y citoplasmáticos de una H-2E de ratón. En otra realización, el método da como resultado un ratón modificado genéticamente, cuyo genoma comprende en un locus CMH II endógeno una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína del CMH II quimérica de humano/ratón, en donde una porción humana de la proteína del CMH II quimérica comprende un dominio extracelular de una HLA-DQ2 o HLA-DQ8 humano y una porción de ratón comprende dominios transmembrana y citoplasmáticos de una H-2A de ratón. En algunas realizaciones, el método utiliza una construcción de direccionamiento preparada utilizando la tecnología VELOCIGENE®, introduciendo la construcción en células ES, e introduciendo los clones de células ES diana en un embrión de ratón utilizando la tecnología VELOCIMOUSE®, como se describe en los ejemplos. En una realización, las células ES son una mezcla de cepas 129 y C57BL/6 de ratón; en una realización, las células ES son una mezcla de cepas BALB/c y 129 de ratón.
También se divulga una construcción de nucleótidos utilizada para generar roedores modificados genéticamente descritos en el presente documento. En un ejemplo, la construcción de nucleótidos comprende: brazos de homología 5' y 3' no humanos, un fragmento de ADN que comprende secuencias de cadena a y p de HLA-DR humano, y un casete de selección flanqueado por sitios de recombinación. En un ejemplo, las secuencias de cadena a y p de HLA-DR humano son secuencias genómicas que comprenden intrones y exones de genes de cadena a y p de HLA-DR humano. En una realización, los brazos de homología de roedor son homólogos a la secuencia genómica del CMH II de roedor.
En un ejemplo, la secuencia de cadena a de HLA-DR humano comprende una secuencia codificante de dominio a l y a2. En una realización específica, esta comprende, de 5' a 3': exón a l (exón 2), intrón a1/a2 (intrón 2) y exón a2 (exón 3). En una realización, la secuencia de cadena p de HLA-DR humano comprende una secuencia codificante de dominio p1 y p2. En una realización específica, esta comprende, de 5' a 3': exón p1 (exón 2), intrón p1/p2 (intrón 2) y exón p2 (exón 3).
De forma similar, también se divulgan en el presente documento construcciones de nucleótidos para generar roedores modificados genéticamente que comprenden secuencias de cadena a y p de HLA-DQ humano (por ejemplo, secuencias codificantes de dominio a l y a2 de HLA-DQ humano y secuencias codificantes de dominio p1 y p2 de HLA-DQ humano). Las realizaciones específicas de tales construcciones se presentan en la Fig. 10.
Un casete de selección es una secuencia de nucleótidos insertada en una construcción de direccionamiento para facilitar la selección de células (por ejemplo, células ES) que han integrado la construcción de interés. Un número de casetes de selección adecuados son conocidos en la técnica. Habitualmente, un casete de selección permite la selección positiva en presencia de un antibiótico concreto (por ejemplo, Neo, Hyg, Pur, CM, SPEC, etc.). Además, un casete de selección puede estar flanqueado por sitios de recombinación, que permiten la deleción del casete de selección tras el tratamiento con enzimas recombinasas. Los sitios de recombinación normalmente utilizados son loxP and Frt, reconocidos por las enzimas Cre y Flp, respectivamente, pero se conocen otros en la técnica. Un casete de selección puede localizarse en cualquier lugar de la construcción fuera de la región codificante. En un ejemplo, el casete de selección se encuentra en el intrón de la cadena p, p. ej., p2/intrón de dominio transmembrana (intrón 3).
En una realización, los brazos de homología 5' y 3' comprenden la secuencia genómica en las localizaciones 5' y 3' del locus CMH II no humano endógeno. En una realización, el brazo de homología 5' comprende la secuencia genómica en dirección 5' del gen H-2Ab2 de ratón y el brazo de homología 3' comprende la secuencia genómica en dirección 3' del gen H-2Ea de ratón. En la presente realización, la construcción permite la sustitución de ambos genes H-2E y H-2A de ratón.
Así, en un ejemplo, se divulga una construcción de nucleótidos que comprende, de 5' a 3': un brazo de homología 5' que contiene una secuencia genómica de ratón en dirección 5' del gen H-2Ab2 de ratón, una primera secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que codifica una cadena p del CMH II quimérica de humano/ratón, una segunda secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que codifica una cadena a del CMH II quimérica de humano/ratón, y un brazo de homología 3' que contiene la secuencia genómica de ratón en dirección 3' del gen H-2Ea de ratón. En un ejemplo específico, la primera secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que codifica una cadena p del CMH II quimérica de humano/ratón comprende el exón p1 humano, el intrón p1/p2, el exón p2, un casete de selección flanqueado por sitios de recombinación insertados en la región intrónica entre la secuencia del
exón p2 humano y la secuencia del exón del dominio transmembrana de ratón. En un ejemplo específico, la segunda secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que codifica una cadena a del CMH II quimérica de humano/ratón comprende el exón a l humano, el intrón a1/a2 y el exón a2 humano. Las construcciones ilustrativas de la invención se representan en las Figs. 5 y 10.
Tras completar el direccionamiento del gen, las células ES o los ratones modificados genéticamente se cribaron para confirmar la incorporación correcta de la secuencia de nucleótidos exógena de interés o la expresión del polipéptido exógeno. Los expertos en la materia conocen numerosas técnicas que incluyen (aunque no de forma limitativa) transferencia Southern, PCR larga, PCT cuantitativa (por ejemplo, PCR en tiempo real usando TAQMAN®), hibridación in situ con fluorescencia, transferencia Northern, citometría de flujo, análisis por transferencia Western, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica, etc. En un ejemplo, los roedores (por ejemplo, ratones) que llevan la modificación genética de interés pueden identificarse mediante cribado para la pérdida de alelos del ratón y/o la ganancia de alelos humanos utilizando una modificación del ensayo de alelos descrito en Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech.
21(6):652-659. Los expertos en la materia conocen otros ensayos que identifican una secuencia de nucleótidos o aminoácidos específica en los animales modificados genéticamente.
La divulgación también proporciona un método para modificar un locus CMH II de un roedor para expresar un complejo CMH II quimérico de humano/roedor descrito en el presente documento. En una realización, la invención proporciona un método para modificar un locus CMH II de un ratón para expresar un complejo CMH II quimérico de humano/ratón que comprende sustituir, en el locus CMH II endógeno de ratón, una secuencia de nucleótidos que codifica un complejo CMH II de ratón por una secuencia de nucleótidos que codifica un complejo CMH II quimérico de humano/ratón. En un aspecto específico, la secuencia de nucleótidos que codifica el complejo CMH II quimérico de humano/ratón comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular de una cadena a del CMH II humano (p. ej., cadena a de HLA-DR o -DQ) y dominios transmembrana y citoplasmáticos de una cadena a del CMH II de ratón (p. ej., cadena a de H-2E o H-2A) y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular de una cadena p del CMH II humano (p. ej., cadena p de HLA-DR o -DQ) y dominios transmembrana y citoplásmicos de un cadena p del CMH II de ratón (p. ej., cadena p de H-2E o H-2A, p. ej., cadena H-2Eb1 o H-2Ab1, respectivamente). En algunos ejemplos, el locus CMH II de ratón modificado expresa una proteína HLA-DR4/H-2E quimérica. En otros ejemplos, el locus CMH II de ratón modificado expresa una proteína HLA-DR2/H-2E quimérica, una proteína HLA-DQ2/H-2A quimérica o una proteína HLA-DQ8/H-2A quimérica.
Se divulga un método para fabricar una molécula quimérica de HLA de clase II humana/CMH de clase II de roedor, que comprende expresar en una sola célula una proteína del CMH II quimérica de humano/roedor (por ejemplo, una proteína quimérica HLA-DR4/H-2E, HLA-DR2/H-2E, HLA-DQ2/H-2A o HLA-DQ8/H-2A) de una construcción de nucleótidos como se describe en el presente documento. En una realización, la construcción de nucleótidos es un vector vírico; en una realización específica, el vector vírico es un vector lentivírico. En una realización, la célula se selecciona de CHO, COS, 293, HeLa, y una célula retinal que expresa una secuencia de ácido nucleico vírico (por ejemplo, una célula PERC.6™).
En el presente documento se divulga una célula que expresa una proteína quimérica HLA-DR4/H-2E, HLA-DR2/H-2E, HLA-DQ2/H-2A o HLA-DQ8/H-2A. En un ejemplo, la célula comprende un vector de expresión que comprende una secuencia del CMH de clase II quimérica como se describe en el presente documento. En un ejemplo, la célula se selecciona de CHO, COS, 293, HeLa, y una célula retinal que expresa una secuencia de ácido nucleico vírico (p. ej., una célula PERC.6™).
También se describe una molécula quimérica de CMH de clase II fabricada por un roedor como se divulga en el presente documento, en donde la molécula quimérica CMH de clase II comprende a1, a2, dominios p1 y p2 de una proteína del CMH II humana, p. ej., HLA-DR4, HLA-DR2, HLA-DQ2, o HLA-DQ8, y dominios transmembrana y citoplasmáticos de una proteína del CMH II no humana, p. ej., la proteína H-2E o H-2A de ratón. Un complejo CMH II quimérico que comprende un dominio extracelular de HLA-DR4 o HLA-DR2 descrito en el presente documento puede detectarse mediante anticuerpos anti-HLA-DR. Un complejo CMH II quimérico que comprende un dominio extracelular de HLA-DQ2 o HLA-DQ8 descrito en el presente documento puede detectarse mediante anticuerpos anti-HLA-DQ. Así, una célula que presenta un polipéptido del CMH II quimérico humano/no humano puede detectarse y/o seleccionarse usando anticuerpos anti-HLA-DR o anti-HLA-DQ.
Aunque los Ejemplos siguientes describen un animal modificado genéticamente cuyo genoma comprende una sustitución de una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas H2-A y H-2E de ratón con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HLA-DR4/H-2E, HLA-DR2/H-2E, HLA-DQ2/H-2A o HLA-DQ8/H-2A quimérica de humano/ratón, el experto en la materia entendería que se puede usar una estrategia similar para introducir quimeras que comprenden otros genes del CMH II humanos (otros genes HLA-DR, HLA-DQ o HLA-DP). Además, también se proporciona la introducción de múltiples moléculas del CMH II humanizadas (p. ej., HLA-DR/H-2E y HLA-DQ/H-2A quiméricas).
También se proporciona la sustitución en múltiples loci CMH II. Así, en el presente documento se proporciona un roedor, p. ej., un ratón, que comprende en un locus CMH II endógeno dos o más, p. ej., dos, tres o cuatro, secuencias
de nucleótidos que codifican un complejo o complejos CMH II quiméricos de humano/roedor (por ejemplo, humano/ratón). En un caso, cada uno de los dos cromosomas hermanos 17 de ratón contiene un locus CMH II que comprende los genes H-2A y H-2E; así, en un aspecto, cada cromosoma hermano puede codificar hasta dos complejos quiméricos de humano/ratón en sus posiciones genómicas endógenas. Por tanto, en una realización, un roedor modificado genéticamente, p. ej., un ratón, puede comprender hasta cuatro secuencias de nucleótidos diferentes que codifican hasta cuatro complejos CMH II quiméricos de humano/roedor, p. ej., humano/ratón, en sus loci CMH endógenos.
En una realización, en el presente documento se proporciona un ratón que comprende en un locus CMH II endógeno dos o más, p. ej., dos, tres o cuatro, secuencias de nucleótidos que codifican un complejo o complejos CMH II quiméricos de humano/ratón en donde una porción humana del complejo CMH II comprende un dominio extracelular de un complejo CMH II humano (es decir, dominios extracelulares de los polipéptidos a y p del CMH II humano) y en donde una porción de ratón del complejo CMH II quimérico comprende un dominio transmembrana y citoplasmático de un complejo CMH II de ratón (es decir, dominios transmembrana y citoplasmáticos de los polipéptidos a y p del CMH II de ratón, p. ej., H-2A y H-2E transmembrana y dominios extracelulares), y en donde el ratón expresa uno o más, p. ej., uno, dos, tres o cuatro, complejo(s) del CMH II quimérico(s) de humano/ratón. En una realización, el ratón CMH II se selecciona de H-2E y H-2A. En una realización, el CMH II humano se selecciona de HLA-DR y -DQ, (por ejemplo, -DR2, -DR4, -DQ2 y -Dq 8).
Asimismo, en el presente documento se divulga un método para generar un roedor, p. ej., un ratón, que comprende sustituciones en múltiples loci CMH endógenos, p. ej., un roedor, p. ej., un ratón, que comprende una o más, p. ej., una, dos, tres o cuatro, secuencia(s) de nucleótidos que codifican un complejo(s) CMH II quimérico(s) de humano/roedor, p. ej., de humano/ratón. Debido a la estrecha vinculación de los diversos loci CMH II en el cromosoma 17 de ratón, en algunos ejemplos, los métodos comprenden sustituciones sucesivas en el locus. En un ejemplo, el método comprende sustituir una secuencia de nucleótidos que codifica un primer complejo CMH II de ratón con una secuencia de nucleótidos que codifica un primer complejo CMH II quimérico de humano/ratón en una célula ES, generar un ratón que expresa el primer complejo CMH II quimérico, generar una célula ES a partir de dicho ratón, sustituir en dicha célula ES una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo complejo CMH II de ratón con una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo complejo CMH II quimérico humano/de ratón y generar un ratón que expresa dos complejos CMH II quiméricos de humano/ratón. Como alternativa, el método puede comprender sustituir una secuencia de nucleótidos que codifica un primer complejo CMH II de ratón con una secuencia de nucleótidos que codifica un primer complejo CMH II quimérico de humano/ratón en una célula ES, seguido por la sustitución en la misma célula ES de una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo complejo CMH II de ratón con una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo complejo CMH II quimérico de humano/ratón y generar un ratón que expresa dos complejos CMH II quiméricos de humano/ratón. Un ratón que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un tercer o cuarto complejo CMH II quimérico de humano/ratón puede generarse mediante, p. ej., reproducción. Un experto en la materia entendería que un ratón que comprende dos o más complejos CMH II quiméricos también puede generarse mediante reproducción en lugar de sustitución sucesiva; este animal puede ser heterocigótico para todas las secuencias del CMH II quiméricas (por ejemplo, un ratón que comprende un gen quimérico diferente en cada uno de sus cromosomas hermanos será heterocigótico para los dos genes del CMH, etc.). Como alternativa a las sustituciones sucesivas en el locus, un ratón que comprende más de uno, p. ej., dos, secuencias de nucleótidos que codifican complejos CMH II quiméricos de humano/ratón pueden generarse reemplazando una secuencia de nucleótidos que codifica más de uno, p. ej., dos, complejos CMH II con una secuencia de nucleótidos exógena que codifica más de uno, p. ej., dos, complejos CMH II quiméricos de humano/ratón (p. ej., la secuencia de nucleótidos que codifica los genes H-2A y H-2E de ratón puede sustituirse por una secuencia de nucleótidos que codifica los complejos HLA-DR/H-2E y HLA-DQ/H-2A quiméricos).
Uso de animales modificados genéticamente
En diversas realizaciones, los roedores modificados genéticamente descritos en el presente documento producen APC con CMH II humanizado en la superficie celular y, como resultado, presentan péptidos derivados de proteínas citosólicas como epítopos para linfocitos T de una manera análoga a la humana, ya que, sustancialmente, todos los componentes del complejo son humanos o humanizados. Los roedores modificados genéticamente de la invención se pueden usar para estudiar la función del sistema inmunitario humano en el animal humanizado; para la identificación de antígenos y epítopos de antígenos que desencadenan la respuesta inmunitaria (por ejemplo, epítopos de linfocitos T, p. ej., epítopos únicos de cáncer humano), p. ej., para su uso en el desarrollo de vacunas; para evaluar candidatos de vacunas y otras estrategias de vacunas; para estudiar la autoinmunidad humana; para estudiar las enfermedades infecciosas humanas; y de otra forma, para idear mejores estrategias terapéuticas basadas en la expresión del CMH humano.
El complejo CMH II se une a péptidos derivados de proteínas extracelulares, p. ej., bacterias extracelulares, células vecinas, o polipéptidos unidos por receptores de linfocitos B e internalizados en un linfocito B. Una vez que las proteínas extracelulares entran en la vía endocítica, se degradan en péptidos, y los péptidos se unen y presentan por el CMH II. Una vez que los linfocitos T CD4+ reconocen un péptido presentado por el c Mh II, los linfocitos T se activan, proliferan, se diferencian en varios subtipos de linfocitos T colaboradores (p. ej., Th1, Th2), y conducen a una serie de acontecimientos que incluyen la activación de la eliminación de patógenos mediada por macrófagos, la proliferación
de linfocitos B y la producción de anticuerpos. Debido al papel del CMH II en la respuesta inmunitaria, la comprensión de la presentación del péptido CMH II es importante en el desarrollo de tratamientos para patologías humanas. Sin embargo, la presentación de antígenos en el contexto del CMH II de ratón es solo algo relevante para enfermedades humanas, ya que los complejos CMH humanos y de ratón reconocen los antígenos de manera diferente, p. ej., un CMH II de ratón puede no reconocer los mismos antígenos o puede presentar epítopos diferentes que un CMH II humano. Así, los datos más relevantes para las patologías humanas se obtienen a través del estudio de la presentación de epítopos de antígenos por el CMH II humano.
Así, en diversas realizaciones, los animales modificados genéticamente de la presente invención son útiles, entre otras cosas, para evaluar la capacidad de un antígeno para iniciar una respuesta inmunitaria en un ser humano, y para generar una diversidad de antígenos e identificar un antígeno específico que puede usarse en el desarrollo de vacunas humanas.
En el presente documento se divulga un método para determinar la antigenicidad en un ser humano de una secuencia peptídica, que comprende exponer un roedor modificado genéticamente como se describe en el presente documento a una molécula que comprende la secuencia peptídica, permitir que el roedor genere una respuesta inmunitaria y detectar en el roedor una célula que se une a una secuencia del péptido presentado por un complejo CMH II humanizado descrito en el presente documento.
En el presente documento se divulga un método para determinar si un péptido provocará una respuesta inmunitaria en un ser humano, que comprende exponer un roedor modificado genéticamente como se describe en el presente documento al péptido, permitir que el roedor genere una respuesta inmunitaria, y detectar en el roedor una célula que se une a una secuencia del péptido mediante una molécula del CMH de clase II quimérica de humano/roedor como se describe en el presente documento. En un ejemplo, el roedor después de la exposición comprende un linfocito T CD4+ restringido al CMH de clase II que se une al péptido.
En el presente documento se divulga un método para identificar un epítopo de linfocitos T CD4+ humanos, que comprende exponer un roedor como se describe en el presente documento a un antígeno que comprende un supuesto epítopo de linfocitos T, permitir que el roedor genere una respuesta inmunitaria e identificar el epítopo unido por el linfocito T CD4+ restringido al CMH de clase II.
En el presente documento se divulga un método para identificar un antígeno que genera una respuesta de linfocitos T CD4+ en un ser humano, que comprende exponer un supuesto antígeno a un ratón como se describe en el presente documento, permitir que el ratón genere una respuesta inmunitaria, detectar una respuesta de linfocitos T CD4+ que es específica para el antígeno en el contexto de una molécula del CMH II humana (por ejemplo, una molécula HLA-DR o HLA-DQ) e identificar el antígeno unido por la molécula restringida al CMH II humana (por ejemplo, molécula restringida a HLA-DR o HLA-DQ humana).
En un ejemplo, el antígeno comprende una proteína bacteriana. En una realización, el antígeno comprende un antígeno de célula tumoral humana. En un ejemplo, el antígeno comprende una supuesta vacuna para su uso en un ser humano, u otro producto biofarmacéutico. En un ejemplo, el antígeno comprende un epítopo humano que genera anticuerpos en un ser humano. En otro ejemplo más, un antígeno comprende un antígeno de célula fúngica o de levadura. En otro ejemplo más, un antígeno se deriva de un parásito humano.
En el presente documento se divulga un método para determinar si un supuesto antígeno contiene un epítopo que, tras la exposición a un sistema inmunitario humano, generará una respuesta inmunitaria restringida a HLA-DR (p. ej., respuesta restringida a HLA-DR2 o HLA-DR4), que comprende exponer un ratón como se describe en el presente documento al supuesto antígeno y medir una respuesta inmunitaria restringida a HLA-DR específica de antígeno (por ejemplo, restringida a HLA-DR2 o HLA-DR4) en el ratón.
También se divulga en el presente documento un método para determinar en qué lugar un supuesto antígeno contiene un epítopo que tras la exposición a un sistema inmunitario humano generará una respuesta inmunitaria restringida a HLA-DQ (por ejemplo, restringida a HLA-DQ2 o HLA-DQ8).
También se divulga un método para generar anticuerpos contra un antígeno, p. ej., un antígeno derivado de una bacteria, parásito, etc., presentado en el contexto de un complejo CMH II humano, que comprende exponer un ratón descrito en el presente documento a un antígeno, permitir que un ratón genere una respuesta inmunitaria, en donde la respuesta inmunitaria comprende la producción de anticuerpos y el aislamiento de un anticuerpo que reconoce el antígeno presentado en el contexto del complejo CMH II humano. En un ejemplo, para generar anticuerpos contra el péptido-CMH II, el ratón con CMH II humanizado se inmuniza con un inmunógeno de péptido-CMH II.
En el presente documento se divulga un método para identificar un dominio variable del receptor de linfocitos T que reconoce un antígeno presentado en el contexto del CMH II (por ejemplo, antígeno tumoral humano, una vacuna, etc.), que comprende exponer un ratón que comprende un complejo c Mh II humanizado descrito en el presente documento al antígeno, permitir que el ratón genere una respuesta inmunitaria y aislar del ratón una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio variable de un receptor de linfocitos T que se une al antígeno restringido al CMH II. En un
ejemplo, el antígeno se presenta en el contexto de un CMH II humanizado (p. ej., ectodominio HLA II humano/dominio transmembrana y/o citoplasmático de CMH II de ratón).
La consecuencia de la interacción entre un linfocito T y una APC que presenta un péptido en el contexto del CMH II (por ejemplo, ectodominio HLA II humano/dominio transmembrana y/o citoplasmático de CMH II de ratón) puede medirse mediante una serie de técnicas conocidas en la técnica, p. ej., ensayos de proliferación de linfocitos T, ensayos de liberación de citocinas, etc.
Además de la capacidad de identificar antígenos y sus epítopos de linfocitos T de patógenos o neoplasmas, los animales modificados genéticamente de la invención pueden usarse para identificar autoantígenos de relevancia para una enfermedad autoinmunitaria humanas y estudiar de otra forma la progresión de la enfermedad autoinmunitaria humana. Se sabe que los polimorfismos dentro de los loci HLA juegan un papel en la predisposición a la enfermedad autoinmunitaria humana. De hecho, se han identificado polimorfismos específicos en loci HLA-DR y HLA-Dq que se correlacionan con el desarrollo de artritis reumatoide, diabetes de tipo I, tiroiditis de Hashimoto, esclerosis múltiple, miastenia grave, enfermedad de Graves, lupus eritematoso sistémico, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, y otros trastornos autoinmunitarios. Véase, p. ej., Wong y Wen (2004) What can the HLA transgenic mouse tell us about autoimmune diabetes?, Diabetologia 47:1476-87; Taneja y David (1998) HLA Transgenic Mice as Humanized Mouse Models of Disease and Immunity, J. Clin. Invest. 101:921-26; Bakker et al. (2006), citado anteriormente) y el International CMH and Autoimmunity Genetics Network (2009) Mapping of multiple susceptibility variants within the CMH region for 7 immune-mediated diseases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:18680-85.
Así, los métodos para preparar un complejo CMH II humanizado en roedores descritos en el presente documento pueden usarse para introducir moléculas del CMH II que se piensa que están asociadas con enfermedades autoinmunitarias humanas específicas, y puede estudiarse la progresión de la enfermedad autoinmunitaria humana. Además, los roedores descritos en el presente documento pueden usarse para desarrollar modelos animales de enfermedad autoinmunitaria humana. Los ratones de acuerdo con la invención que portan proteínas CMH II humanizadas descritas en el presente documento pueden usarse para identificar autoantígenos potenciales, cartografiar epítopos implicados en la progresión de la enfermedad y diseñar estrategias para la modulación de enfermedades autoinmunitarias.
Además, los roedores modificados genéticamente descritos en el presente documento pueden usarse en el estudio de la respuesta alérgica humana. Como las respuestas alérgicas parecen estar asociadas con los alelos CMH II, los animales modificados genéticamente descritos en el presente documento pueden usarse para determinar la restricción a HLA de la respuesta de linfocitos T específicos de alérgenos y para desarrollar estrategias para combatir la respuesta alérgica.
Además, los animales modificados genéticamente de la invención y las moléculas HLA humanizadas expresadas por los mismos pueden usarse para probar anticuerpos que bloquean la presentación de antígenos por las moléculas HLA humanas asociadas con la progresión de la enfermedad humana. Así, en el presente documento se divulga un método para determinar si un anticuerpo es capaz de bloquear la presentación de un antígeno por una molécula HLA asociada a una enfermedad humana, p. ej., una enfermedad humana descrita anteriormente, que comprende exponer una célula que expresa un HLA humanizado descrito en el presente documento a un anticuerpo de prueba y determinar si el anticuerpo de prueba es capaz de bloquear la presentación del antígeno por un HLA humanizado a las células inmunitarias (p. ej., a los linfocitos T), p. ej., midiendo su capacidad para bloquear la respuesta inmunitaria restringida al HLA humanizado. En un ejemplo, el método se lleva a cabo en un animal que expresa el HLA humanizado, p. ej., un animal que expresa HLA humanizado asociado a la enfermedad que sirve como modelo de enfermedad para la enfermedad.
Ejemplos
La invención se ilustrará adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos. Estos Ejemplos se exponen para ayudar en la comprensión de la invención, pero no pretenden, y no deben interpretarse como que limitan su alcance de ninguna manera. Los Ejemplos no incluyen descripciones detalladas de métodos convencionales que serían bien conocidos por los expertos en la materia (técnicas de clonación molecular, etc.). A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura se indica en grados Celsius y la presión es la atmosférica o casi atmosférica.
Ejemplo 1. Deleción de los loci H-2A y H-2E del CMH de clase II endógenos
Se preparó el vector de direccionamiento para introducir una deleción de los genes H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, y H-2Ea del CMH de clase II endógenos utilizando la tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (véase,por ejemplo, la patente de los EE.UU. n.° 6.586.251 y Valenzuela et al., anteriormente citado). Se modificó el ADN del cromosoma artificial bacteriano (BAC) RP23-458i22 (Invitrogen) para eliminar los genes del CMH de clase II endógenos H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, y H2Ea.
Brevemente, los brazos de homología en la dirección 5' y en la dirección 3' se derivaron mediante la PCR del ADN del
BAC de ratón a partir de las localizaciones 5' del gen H-2Ab2 y 3' del gen H-2Ea, respectivamente. Como se representa en la Fig. 5, estos brazos de homología se utilizaron para preparar un casete que eliminaba ~79 kb de RP23-458Í22 que comprendía los genes H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 y H-2Ea del locus CMH de clase II mediante recombinación homóloga bacteriana (BHR). Esta región se sustituyó por un casete de higromicina flanqueado por los sitios lox66 y lox71. El vector de direccionamiento final desde 5' hasta 3' incluyó un brazo de homología de 34 kb que comprende la secuencia 5' genómica de ratón en el gen H-2Ab2 del locus CMH de clase II endógeno, un sitio 5' lox66, un casete de higromicina, un sitio 3' lox71 y un brazo de homología de 63 kb que comprende la secuencia 3' genómica de ratón en el gen H-2Ea del locus CMH de clase II endógeno (MAID 5111, véase la Fig. 5).
Se usó el vector de direccionamiento del ADN del BAC (descrito anteriormente) para electroporar las células ES de ratón para crear células ES modificadas que comprenden una deleción del locus CMH de clase II endógeno. Las células ES positivas que contenían un locus CMH de clase II endógeno eliminado se identificaron mediante el ensayo de la PCR cuantitativa usando sondas TAQMAN™ (Lie y Petropoulos (1998) Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48). La región en la dirección 5' del locus eliminado se confirmó mediante la PCR utilizando los cebadores 5111U F (CAGAACGCCAGGCTGTAAC; SEQ ID NO:1) y 5111U R (GGAGAGCAGGGTCAGTCAAC; SEQ ID NO:2) y la sonda 5111U P (CACCGCCACTCACAGCTCCTTa CA; SEQ ID NO:3), mientras que la región en la dirección 3' del locus detectado se confirmó utilizando los cebadores 5111D F (GTg Gg CACCAt Ct TCATCATTC; SEQ ID NO:4) y 5111D R (CTTCCTTTCCAGGGTGTGACTC; SEQ ID NO:5) y la sonda 5111D P (AGGCCTGCGATCAGGTGGCACCT; SEQ ID NO:6). Se confirmó la presencia del casete de higromicina procedente del vector de direccionamiento utilizando los cebadores HYGF (TGCGGCCGATCTTAGCC; SEQ ID NO:7) y HYGR (TTGACCGATTCCTTGCGG; SEQ ID NO:8) y la sonda HYGP (ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; SEQ ID NO:9). La secuencia de nucleótidos a través del punto de deleción en 5' (SEQ ID NO: 10) incluyó lo siguiente, que indica la secuencia endógena de ratón en la dirección 5' del punto de deleción (contenida en los paréntesis siguientes) unida de forma contigua a la secuencia del casete presente en el punto de deleción: (TTTGTAAACA AAGTCTACCC AGAGACAGAT GACAGACTTC AGCTCCAATG CTGATTGGTT CCTCACTTGG GACCAACCCT) CTCGAGTACC GTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT ATGCATCCGG GTAGGGGAGG. La secuencia de nucleótidos a través del punto de deleción en la dirección 3' (SEQ ID NO:11) incluyó lo siguiente, que indica la secuencia del casete contigua de la secuencia endógena de ratón en la dirección 3' del punto de deleción (contenida en los paréntesis siguientes): CCTCGACCTG CAGCCCTAGG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAC GGTAGAGCTC (CACAGGCATT TGGGTGGGCA GGGATGGACG GTGACTGGGA CAATCGGGAT GGAAGAGCAT AGAATGGGAG TTAGGGAAGA). Los clones de células ES positivos se utilizaron a continuación para implantar ratones hembras utilizando el método VELOCIMOUSE® (descrito a continuación) para generar una camada de crías que contenían una deleción del locus CMH de clase II endógeno.
Las células ES diana anteriormente descritas se utilizaron como células ES donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en la fase de 8 células mediante el método VELOCIMOUSE® (véase,por ejemplo, la patente de los EE.UU. n.° 7.294.754 y Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor genetargeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99). Se identificaron ratones que contenían una deleción en los genes H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, y H-2Ea en el locus CMH de clase II endógeno mediante genotipado usando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela et al., citado anteriormente) que detectó la presencia del casete de higromicina y confirmó la ausencia de las secuencias del CMH de clase II endógeno.
Los ratones que contenían una deleción en los genes H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, y H-2Ea en el locus CMH de clase II endógeno se pueden reproducir para criar una cepa de ratón eliminadora de Cre (véase, p. ej., la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2009/114400) a fin de eliminar cualquier casete de higromicina de tipo lox introducido mediante el vector de direccionamiento que no se elimina, p. ej., en la fase de célula ES o en el embrión. Opcionalmente, el casete de higromicina se conserva en los ratones.
Ejemplo 2. Generación de un vector de direccionamiento grande (LTVEC) que comprende el gen HLA-DR4/H-2E quimérico
Se diseñó un vector de direccionamiento para introducir secuencias del CMH II humanizadas como se representa gráficamente en la Fig. 4. Usando la tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE®, se modificó el ADN del cromosoma artificial bacteriano (BAC) RP23-458i22 en diversas etapas para: (1) crear un vector que comprende un exón 1 de I-E a funcional a partir del gen H-2Ea de BALB/c (Fig. 4A); (2) crear un vector que comprende la sustitución de los exones 2 y 3 del gen I-E p de ratón con los de DRp1*04 humano y sustituir los exones 2 y 3 de I-E a de ratón con los de DRa1*01 humano (Fig. 4B); (3) crear un vector que lleva los exones 2 y 3 de DRa1*04 humano entre los restantes exones I-E p de ratón, y los exones 2 y 3 de DRp1*01 humano entre los restantes exones I-E a de ratón incluyendo un exón 1 de I-E a funcional de ratón BALB/c (etapa (1) (Fig. 4C); y (4) eliminar un sitio de corte y empalme críptico en el vector generado en (3) (Fig. 4D).
Específicamente, puesto que en los ratones C57Bl/6, el gen I-E a es un pseudogén debido a la presencia de un exón 1 no funcional, en primer lugar, se creó un vector que comprendía un exón 1 de I-E a funcional a partir del gen H2Ea de BALB/c (Fig. 4A). Se modificó el BAC RP23-458i22 mediante recombinación homóloga bacteriana (1.BHR) para sustituir el gen de resistencia al cloranfenicol por el de la espectromicina. El vector resultante se modificó adicionalmente mediante BHR para sustituir la región de codificación de I-A e I-E completa por un casete de neomicina
flanqueado por sitios de recombinación (2.BHR). Otro ciclo de BHR (3. BHR) con la construcción que comprende un exón que codifica la secuencia líder de I-Ea (exón 1) de BALB/c y el gen del cloranfenicol flanqueado por los sitios de restricción PI-SceI e I-Ceul dio como resultado un vector que comprendía el exón 1 de H-2Ea de BALB/c funcional.
Independientemente, para generar un vector que comprendiese la sustitución de los exones 2 y 3 del gen I-E p de ratón por los del DRp1*04 humano y la sustitución de los exones 2 y 3 de I-E a de ratón por los de DRa1*01 humano, se modificó el BAC de RP23-458i22 mediante diversas etapas de recombinación homóloga, 4. BHR - 8. BHR (Fig. 4B). La secuencia de ácido nucleico resultante estaba flanqueada por los sitios de restricción PI-SceI/I-C6uI para permitir la ligación en la construcción que lleva el exón 1 de I-Ea de BALB/c, mencionado anteriormente (Fig. 4C).
La secuencia de la construcción final representada gráficamente en la Fig. 4C contenía un sitio de corte y empalme críptico en el extremo 3' del intrón de BALB/c. Se llevaron a cabo diversas etapas de BHR (11. BHR - 12. BHR) seguidas por una etapa de deleción para obtener el vector de direccionamiento final (MAID 1680) que se utilizó para su electroporación en células ES (Fig. 4D).
En detalle, el vector de direccionamiento final (MAID 1680), de 5' a 3', estaba comprendido por un brazo de homología 5' consistente en una secuencia genómica de ratón de ~26 kb que finaliza exactamente en la dirección 5' del gen H2Ab1 del locus CMH de clase II endógeno; una inserción de ~59 kb que contenía el gen de la cadena p de CMH II humanizado (gen H-2Eb1 humanizado) y el gen de la cadena a de CMH II humanizado (gen H-2Ea humanizado) y un casete de neomicina de tipo flox; y un brazo de homología 3' de ratón consistente en una secuencia genómica de ratón de ~57 kb que comienza exactamente en la dirección 3' del gen H-2Ea del locus CMH de clase II endógeno. La secuencia de nucleótidos a través de la unión entre el brazo 5' y la inserción (SEQ ID NO:12) incluía lo siguiente: (TGCTGATTGG TTCCTCACTT GGGACCAACC C) TAAGCTTTA TCTATGTCGG GTGCGGAGAA AGAGGTAATG AAATGGCACA AGGAGATCAC ACACCCAAAC CAAACTCGCC, donde la secuencia en cursiva es un único sitio PI-SceI, y la secuencia genómica de ratón en el brazo de homología 5' está entre paréntesis. La secuencia de nucleótidos a través de la unión entre la inserción y el brazo 3' (SEQ ID NO: 13) incluía lo siguiente: CACATCAGTG AGGCTAGAAT AAATTAAAAT CGCTAATATG AAAATGGGG (ATTTGTACCT CTGAGTGTGA AGGCTGGGAA GACTGCTTTC AAGGGAC), donde la secuencia genómica de ratón en el brazo de homología 3' está entre paréntesis.
En la inserción de ~59 kb, el gen H-2Eb1 estaba modificado como sigue: una región de 5136 pb de H-2Eb1, incluyendo los últimos 153 pb del intrón1, el exón 2, el intrón 2, el exón 3, y los primeros 122 pb del intrón 3, se sustituyeron con los 3111 pb de la región homóloga del HLA-DRB1*04 humano, incluyendo los últimos 148 pb del intrón 1, el exón 2, el intrón 2, el exón 3, y los primeros 132 pb del intrón 3. En la unión entre las secuencias de ser humano y ratón del intrón 3, se insertó un casete que consistía en un sitio 5' lox2372, el promotor UbC, gen de resistencia a neomicina y un sitio 3' lox2372. El gen resultante codificó una proteína HLA-DRB1*04/H-2Eb1 quimérica que comprende la secuencia líder de H-2Eb1 de ratón, los dominios p1 y p2 humanos de DRB1*04, y el dominio transmembrana y la cola citoplásmica de ratón. La secuencia de nucleótidos a través de la unión de ratón/humano en el intrón 1 (SEQ ID NO:14) incluía lo siguiente: (TCCATCACTT CACTGGGTAG CACAGCTGTA ACTGTCCAGC CTG) GGTACCGAGC TCGGATCCAC TAGTAACGGC CGCCAGTGTG CTGGAATTC GCCCTTGATC GAGCTCCCTG GGCTGCAGGT GGTGGGCGTT GCGGGTGGGG CCGGTTAA, donde la secuencia en cursiva es un sitio de clonación múltiple introducido durante las etapas de clonación, y las secuencias del intrón 1 de ratón están entre paréntesis. La secuencia de nucleótidos a través de la unión entre el intrón 3 y el casete de neomicina (SEQ ID NO:15) incluía lo siguiente: (ATCTCCATCA GAAGGGCACC GGT) ATAACTT CGTATAAGGTATCCTATACG AAGTTATATG CATGGCCTCC GCGCCGGGTT, donde el sitio 5' lox2372 está en cursiva, y la secuencia del intrón 3 humano está entre paréntesis. La secuencia de nucleótidos a través de la unión entre el casete de neomicina y el intrón 3 de ratón (SEQ ID NO:16) incluía lo siguiente: ATAACTTCGTATAAGGTATC CTATACGAAG TTA TCTCGAG (TGGCTTACAG GTAGGTGCGT GAAGCTTCTA CAAGCACAGT TGCCCCCTGG), donde el sitio 3' lox2372 está en cursiva, y la secuencia del intrón 3 de ratón está entre paréntesis.
También comprendido en la inserción de ~59 kb, el gen H-2Ea estaba modificado como sigue: una región de 1185 pb de H-2Ea, incluyendo los últimos 101 pb del intrón1, el exón 2, el intrón 2, el exón 3, y los primeros 66 pb del intrón 3, se sustituyeron con los 1189 pb de la región homóloga del HLA-DRA1*01 humano, incluyendo los últimos 104 pb del intrón 1, el exón 2, el intrón 2, el exón 3, y los primeros 66 pb del intrón 3. Como se ha descrito anteriormente, como el exón 1 del alelo C57BL/6 de H-2Ea contiene una deleción que vuelve el gen no funcional, el exón 1 de H-2Ea y el resto del intrón 1 se sustituyeron por la región equivalente de 2616 pb del alelo BALB/c de H-2Ea, que es funcional. El gen resultante codificó una proteína H-2Ea/HLA-DRA1*01 quimérica que comprende la secuencia líder de H-2Ea de ratón de BALB/c, los dominios a1 y a2 humanos de DRA1*01, y el dominio transmembrana y la cola citoplásmica de ratón. La secuencia de nucleótidos a través de la unión de ratón/humano en el intrón 1 (SEQ ID NO:17) incluía lo siguiente: (CTGTTTCTTC CCTAACTCCC ATTCTATGCT CTTCCATCCC GA) CCGCGGCCCA ATCTCTCTCC ACTACTTCCT GCCTACATGT ATGTAGGT, donde la secuencia en cursiva es un sitio de la enzima de restricción introducido durante las etapas de clonación, y las secuencias del intrón 1 de BALB/c están entre paréntesis. La secuencia de nucleótidos a través de la unión de humano/ratón en el intrón 3 (SEQ ID NO:18) incluía lo siguiente: CAAGGTTTCC TCCTATGATG CTTGTGTGAA ACTCGGGGCC GGCC (AGCATTTAAC AGTACAGGGA TGGGAGCACA GCTCAC), donde la secuencia en cursiva es un sitio de la enzima de restricción introducido durante las etapas de clonación, y las secuencias del intrón 3 de ratón están entre paréntesis. La secuencia de nucleótidos a través de la unión de C57BL/6-BALB/c en 5' del exón 1 (SEQ ID NO:19) incluía lo siguiente: (GAAAGCAGTC
TTCCCAGCCT TCACACTCAG AGGTACAAAT) CCCCATTTTC ATATTAGCGA TTTTAATTTA TTCTAGCCTC, donde las secuencias específicas de C57BL/6 están entre paréntesis. La secuencia de nucleótidos a través de la unión BALB/c-C57BL/6 en 3' del exón 1 (SEQ ID NO:20) incluía lo siguiente: TCTTCCCTAA CTCCCATTCT ATGCTCTTCC ATCCCGA CCG CGG (CCCAATC TCTCTCCACT ACTTCCTGCC TACATGTATG), donde el sitio de restricción SacII está en cursiva, y las secuencias C57BL/6 están entre paréntesis.
Ejemplo 3. Generación de ratones HLA-DR4 modificados genéticamente
Se presentan en la Fig. 5 y 8 diagramas simplificados de la estrategia para generar ratones CMH II humanizados utilizando el vector del Ejemplo 2.
Específicamente, se utilizó el ADN del BAC MAID1680 (descrito anteriormente) para electroporar células ES MAID5111 para crear células ES modificadas que comprenden una sustitución de los loci I-A e I-E endógenos con un fragmento genómico que comprende un locus quimérico de DR4 humano/I-E de ratón. Las células ES positivas que contienen los loci I-A e I-E endógenos eliminados sustituidos por un fragmento genómico que comprende un locus quimérico de DR4 humano/IE de ratón se identificaron mediante un ensayo de PCR cuantitativa usando las sondas TAQMAN™ (Lie y Petropoulos, anteriormente citado). Se confirmó la inserción de secuencias DRa humanas mediante la PCR usando los cebadores hDRAlF (CTGGCGGCTTGAAGAATTTGG; SEQ ID NO:21), hDRAIR (CATGATTTCCAGGTTGGCTTTGTC; SEQ ID NO:22) y la sonda hDRAIP (CGATTTGCCAGCTTTGAGGCTCAAGG; SEQ ID NO:23). Se confirmó la inserción de secuencias DRp humanas mediante la PCR usando los cebadores hDRBIF (AGGCTTGGGTGCTCCACTTG; SEQ ID NO:24), hDRBIR (GACCCTGGTGATGCTGGAAAC; SEQ ID NO:25), y la sonda hDRBIP (CAGGTGTAAACCTCTCCACTCCGAGGA; SEQ ID NO:26). Se confirmó la pérdida del casete de higromicina del vector de direccionamiento con los cebadores HYGF (TGCGGCCGATCTTAGCC; SEQ ID NO:7) y HYGR (TTGACCGATTCCTTGCGG; SEQ ID NO:8) y la sonda HYGP (ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; SEQ ID NO:9).
A continuación se utilizaron los clones de célula ES positivos para implantar ratones hembras utilizando el método VELOCIMOUSE® (anteriormente citado) para generar una camada de crías que contenía una sustitución de los loci I-A e I-E endógenos con un locus quimérico de DR4 humano/I-E de ratón. Las células ES diana anteriormente descritas se utilizaron como células ES donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en la fase de 8 células mediante el método VELOCIMOUSE®. Se identificaron los ratones que contenían un locus quimérico de DR4 humano/I-E de ratón mediante genotipado utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela et al., citado anteriormente) que detectó la presencia de un locus quimérico de DR4 humano/I-E de ratón.
Los ratones que contienen un locus quimérico de DR4 humano/I-E de ratón se pueden reproducir para crear una cepa de ratón eliminadora de Cre (véase, p. ej., la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2009/114400) a fin de eliminar cualquier casete de neomicina de tipo lox introducido mediante el vector de direccionamiento que no se elimina, p. ej., en la fase de célula ES o en el embrión (véase, Fig. 6).
Ejemplo 4. Expresión de HLA-DR4/H-2E quimérico en ratones modificados genéticamente
Los bazos de ratones WT o HLA-DR4 heterocigóticos humanizados ("1681 HET") se perfundieron con colagenasa D (Roche Bioscience) y los eritrocitos se lisaron con tampón de lisis ACK. Los esplenocitos se cultivaron durante dos días con 25 microgramos/ml de poli(I:C) para estimular la expresión de los genes del CMH-II. La expresión de la superficie celular de HLA-DR4 humano se analizó mediante FACS usando anti-CD3 (17A2), anti-CD19 (1D3), antic D11c (N418), anti-F480 (BM8), anti-I-A/I-E conjugados con fluorocromo (M15) y anti-HLADR (L243). Se llevó a cabo la citometría de flujo usando BD-LSRII. La expresión de HLA-DR4 humano fue claramente detectable en la superficie de los linfocitos B CD19+ y aumentó significativamente tras la estimulación por el agonista del receptor de tipo toll poli(I:C) (véase la Fig. 9).
Ejemplo 5. Ratones HLA-DQ2.5, HLA-DQ8 y HLA-DR2 modificados genéticamente
Se produjeron ratones que albergan HLA-DQ2.5/H-2A, HLA-DQ8/H-2A y HLA-DR2/H-2E humanos quiméricos con la tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (véase,por ejemplo, la patente de los EE.UU. n.° 6.586.251 y Valenzuela et al., anteriormente citado). Los LTVEC que albergan genes humanizados se generaron mediante síntesis de genes y modificación de BAC mediante técnicas de recombinación homóloga bacteriana y digestión/ligación.
Las secuencias de las cadenas a y p de HLA-DQ2.5, -DQ8.1 y DR2 fueron sintetizadas por Blue Heron Gene Synthesis Company (WA, EE. UU.) basándose en secuencias de genes disponibles públicamente. Específicamente, las cadenas a (DQA1*05) y p (DQB1*02) de HLA-DQ2.5 humano sintetizadas y el bAc RP23-444J20 de ratón se modificaron y utilizaron para generar un LTVEC que albergaba HLA-DQ2.5/H-2A quimérico, como se representa en la Fig. 10A. De forma similar, las cadenas a (DQA1*0301) y p (DQB1*0302) de HLA-DQ8.1 humano sintetizadas y el BAC RP23-444J20 de ratón se modificaron y utilizaron para generar un LTVEC que albergaba HLA-DQ8.1/H-2A quimérico, como se representa en la Fig. 10B. Para HLA-DR2/H-2E, la cadena p (DRB1*1501) de HLA-DR2 humano sintetizada se utilizó para generar un vector que comprende los exones y el intrón de DRp1 *02(1501) y se intercambiaron usando recombinación homóloga bacteriana en el LTVEC que comprende el gen HLA-DR4/H-2E quimérico (MAID 1680 del
Ejemplo 2 anterior). El LTVEC HLA-DR2/H-2E resultante se representa en la Fig. 10C. Las diversas uniones de secuencias de nucleótidos de los LTVEC resultantes (p. ej., uniones de secuencia de ratón/humano, uniones de secuencia de humano/ratón, o uniones de secuencia de ratón o humano con casetes de selección) se resumen a continuación en la Tabla 1 y se enumeran en el Listado de secuencias; sus ubicaciones se indican en el diagrama esquemático de la Fig. 10. En la siguiente Tabla 1, las secuencias del ratón están en fuente normal; las secuencias humanas están entre paréntesis; las secuencias Lox están en cursiva; y los sitios de restricción introducidos durante las etapas de clonación y otras secuencias basadas en vectores (por ejemplo, sitios de clonación múltiples, etc.) están en negrita. Las uniones de secuencias de nucleótidos para el H-2Ea humanizado en HLA-DR2/H-2E son las mismas que se describieron previamente para HLA-DR4/H-2E en el Ejemplo 2 anterior (SEQ ID NO:17-20).
Los vectores de direccionamiento se utilizan para electroporar células ES MAID5111 para crear células ES modificadas que comprenden una sustitución de los loci I-A e I-E endógenos de ratón con fragmentos genómicos que comprenden un HLA-DQ2.5/H-2A, HLA-DQ8/H-2A o HLA-DR2/H-2E quiméricos. Las células ES positivas que contienen loci I-A e I-E endógenos eliminados sustituidos por fragmentos genómicos que comprenden loci quiméricos se identifican mediante un ensayo de PCR cuantitativo usando sondas TAQMAN™ (Lie y Petropoulos, anteriormente citado).
A continuación se utilizaron los clones de célula ES positivos para implantar ratones hembras utilizando el método VELOCIMOUSE® (anteriormente citado) para generar una camada de crías que contenía una sustitución de los loci I-A e I-E endógenos con un locus quimérico de humano/ratón. Las células ES diana se utilizan como células ES donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en la fase de 8 células mediante el método VELOCIMOUSE®. Se identificaron los ratones que contenían un locus quimérico de humano/ratón mediante genotipado utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela et al., citado anteriormente) que detecta la presencia de un locus quimérico de humano/ratón.
Los ratones que contienen un locus quimérico de humano/ratón se pueden reproducir para crear una cepa de ratón eliminadora de Cre (véase, p. ej., la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2009/114400) a fin de eliminar cualquier casete de neomicina o higromicina de tipo lox introducido mediante el vector de direccionamiento que no se elimina, p. ej., en la fase de célula ES o en el embrión.
Se ensaya la expresión de la proteína quimérica de humano/ratón. Específicamente, para los animales modificados genéticamente HLA-DQ2.5/H-2A, se extrajo sangre de ratones WT o HLA-DQ2.5 heterocigóticos humanizados ("6040 HET"; casete eliminado) que se introdujo en tubos capilares recubiertos con heparina y los eritrocitos se lisaron con tampón de lisis ACK. La expresión en la superficie celular de HLA-DQ2.5 humano se analizó mediante FACS usando anticuerpos anti-CD3 (17A2), anti-CD19 (1D3), anti-I-A/I-E (M15) y anti-HLA-DQ (Tu169) conjugados con fluorocromo. Se llevó a cabo la citometría de flujo usando BD-Fortessa. La expresión tanto del CMH-II de ratón (I-A/I-E) como de HLA-DQ2.5 humano era claramente detectable en la superficie de linfocitos B de ratón CD19+ presentadores de antígeno (Fig. 11).
Equivalentes
Los expertos en la materia reconocerán, o serán capaces de determinar, utilizando únicamente experimentación habitual, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descritas en el presente documento. Se pretende que dichos equivalentes estén abarcados por las siguientes reivindicaciones.
Claims (14)
1. Un roedor que comprende
(A) en un primer locus CMH II endógeno, una secuencia de nucleótidos que codifica un primer polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor y una secuencia de nucleótidos que codifica un primer polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor,
en donde el primer polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor comprende los dominios a l y a2 de un polipéptido a de HLA-DR humano unido operativamente a dominios transmembrana y citoplásmicos de un polipéptido a del CMH II endógeno de roedor,
en donde el primer polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor comprende los dominios p1 y p2 de un polipéptido p de HLA-DR humano unido operativamente a dominios transmembrana y citoplasmáticos de un polipéptido p del CMH II endógeno de roedor, y
en donde el primer polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor y el primer polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor forman un primer complejo CMH II sobre una superficie de una célula del roedor; y
(B) en un segundo locus CMH II endógeno, una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor y una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor,
en donde el segundo polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor comprende los dominios a l y a2 de un polipéptido a de HLA-DQ humano unido operativamente a dominios transmembrana y citoplásmicos de un polipéptido a del CMH II endógeno de roedor,
en donde el segundo polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor comprende los dominios p1 y p2 de un polipéptido p de h LA-DQ humano unido operativamente a dominios transmembrana y citoplasmáticos de un polipéptido p del CMH II endógeno de roedor, y
en donde el segundo polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor y el polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor forman un segundo complejo CMH II sobre una superficie de una célula del roedor.
2. El roedor de la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el primer polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor y la secuencia de nucleótidos que codifica el segundo polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor están unidas operativamente al promotor de a del CMH II y elementos reguladores endógenos de roedor, y la secuencia de nucleótidos que codifica el primer polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor y la secuencia de nucleótidos que codifica el segundo polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor están unidas operativamente al promotor de p del CMH II y elementos reguladores endógenos de roedor.
3. El roedor de la reivindicación 1, en donde el roedor no expresa un polipéptido del CMH II endógeno funcional del primer locus CMH II endógeno o del segundo locus CMH II endógeno.
4. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el roedor es una rata.
5. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el roedor es un ratón.
6. El roedor de la reivindicación 5, en donde el primer locus CMH II endógeno es un locus H-2E endógeno y en donde el primer polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor comprende los dominios a1 y a2 de un polipéptido de HLA-DR2 o HlA-DR4 humano unido operativamente a un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático de un polipéptido a de H-2E de ratón y el primer polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor comprende los dominios p1 y p2 del polipéptido p de HLA-DR2 o HLA-DR4 humano unido operativamente a un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático de un polipéptido p de H-2E de ratón.
7. El roedor de la reivindicación 5, en donde el segundo locus CMH II endógeno es un locus H-2A endógeno y en donde el segundo polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor comprende los dominios a1 y a2 de un polipéptido a de HLA-DQ2 o HLA-DQ8 humano unido operativamente a un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico de un polipéptido a de H-2A de ratón y el segundo polipéptido p del CMH II quimérico humano/de roedor comprende los dominios p1 y p2 de un polipéptido p de HLA-DQ2 o HLA-DQ8 humano unido operativamente a un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático de un polipéptido p de H-2A de ratón.
8. El roedor de la reivindicación 6, en donde el locus H-2E endógeno carece de una secuencia de nucleótidos endógena que codifica los dominios a1 y a2 de un polipéptido a de H-2E de ratón, y el locus H-2E endógeno carece de una secuencia de nucleótidos endógena que codifica los dominios p1 y p2 de un polipéptido p de H-2E de ratón.
9. El roedor de la reivindicación 7, en donde el locus H-2A endógeno carece de una secuencia de nucleótidos endógena que codifica los dominios a1 y a2 de un polipéptido a de H-2A de ratón, y el locus H-2A endógeno carece
de una secuencia de nucleótidos endógena que codifica los dominios p1 y p2 de un polipéptido p de H-2A de ratón.
10. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o las reivindicaciones 5-7, en donde el roedor es un ratón, y en donde:
(a) el primer locus CMH II endógeno es un locus CMH II H-2E endógeno, el primer polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor es un polipéptido a de HLA-DR2/H-2E CMH II quimérico de humano/roedor y el primer polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor es un polipéptido p de HLA-DR2/H-2E CMH II quimérico de humano/roedor; y
(b) el segundo locus CMH II endógeno es un locus CMH II H-2A endógeno, el segundo polipéptido a del CMH II quimérico de humano/roedor es un polipéptido a de HLA-DQ8.1/H-2A CMH II quimérico de humano/roedor y el segundo polipéptido p del CMH II quimérico de humano/roedor es un polipéptido p de HLA-DQ8.1/H-2A CMH II quimérico de humano/roedor,
en donde el ratón expresa un complejo HLA-DR2/H-2E CMH II quimérico de humano/ratón y un complejo HLA-DQ8.1/H-2A CMH II quimérico de humano/ratón sobre una superficie de una célula del ratón.
11. Un método para modificar los loci CMH II endógenos en una célula ES de ratón, en donde el método comprende:
sustituir en un primer locus CMH II endógeno en la célula ES:
al menos una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios a1 y a2 de un primer polipéptido a del CMH II de ratón con al menos una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios a1 y a2 de un primer polipéptido a del CMH II humano y
al menos una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios p1 y p2 de un primer polipéptido p del CMH II de ratón con al menos una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios p1 y p2 de un primer polipéptido p del CMH II humano
generar un primer locus CMH II modificado; y
sustituir en un segundo locus CMH II endógeno en la célula ES:
al menos una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios a1 y a2 de un segundo polipéptido a del CMH II de ratón con al menos una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios a1 y a2 de un segundo polipéptido a del CMH II humano y
al menos una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios p1 y p2 de un segundo polipéptido p del CMH II de ratón con al menos una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios p1 y p2 de un segundo polipéptido p del CMH II humano
para generar un segundo locus CMH II modificado.
12. El método de la reivindicación 11, en donde el primer locus CMH II endógeno y el segundo locus CMH II endógeno se modifican sucesivamente en la misma célula ES.
13. El método de las reivindicaciones 11 o 12, en donde el primer polipéptido a del CMH II humano y el segundo polipéptido a del CMH II humano se seleccionan cada uno del grupo que consiste en una cadena a de HLA-DR2, HLA-DR4, HLA-DQ2, HLA-DQ2.5, HLA-DQ8 y HLA-DQ8.1, y el primer polipéptido p del CMH II humano y el segundo polipéptido p del CMH II humano se seleccionan cada uno del grupo que consiste en una cadena p de HLA-DR2, HLA-DR4, HLA-DQ2, HLA-DQ2.5, HLA-DQ8 y HLA-DQ8.1.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en donde el primer polipéptido a del CMH II de ratón y el segundo polipéptido a del CMH II de ratón se seleccionan cada uno del grupo que consiste en una cadena a de H-2A y H-2E y el primer polipéptido p del CMH II de ratón y el segundo polipéptido p del CMH II de ratón se seleccionan cada uno del grupo que consiste en una cadena p de H-2A y H-2E.
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