KR20150126410A - 키메라 주요 조직적합성 복합체 （ｍｈｃ） 제ｉｉ부류 분자를 발현하는 유전자전이 마우스 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간화된 MHC II 단백질 (인간화된 MHC II 및 폴리펩타이드)을 발현하는 유전적으로 변형된 비인간 동물 뿐만 아니라, 이러한 단백질을 포함하는 배아, 세포 및 조직을 제공한다. 또한, 상기 유전적으로 변형된 동물을 제조하기 위한 작제물 및 이를 제조하는 방법도 제공된다. 유전적으로 변형된 동물들을 이용하여 인간 면역계의 다양한 측면들을 연구하는 방법이 제공된다.
Description
관련 출원의 인용
본 출원은, 2013년 3월 11일자로 출원된 미국 특허 출원 제13/793,935호에 대한 우선권의 이익을 청구하고, 이로써 그 내용은 그 전체가 본원에 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 유전자 조작으로 인간화된 주요 조직적합성 복합체(MHC) 제II 부류 단백질을 발현하는 비인간 동물, 예를 들어, 설치류(예컨대, 마우스 또는 래트), 및 또한 이를 발현하는 배아, 조직, 및 세포에 관한 것이다. 본 발명은, 추가로, 인간화된 MHC II 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 림프구들을 활성화시키고 T 세포들을 개입하도록 하는 펩타이드들을 동정하고, 인간 백신 및 다른 치료제들을 개발하기 위해 인간화된 MHC 제II 부류 단백질을 발현하는 비인간 동물, 세포 및 조직을 사용하는 방법들도 제공된다.
후천성 면역 반응(adaptive immune response)에 있어서, 외부 항원은 B 림프구(예를 들어, 면역글로불린) 및 T 림프구(예를 들어, T 세포 수용체 즉 TCR) 상의 수용체 분자들에 의해 인지된다. 이러한 외부 항원은 일반적으로 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자로 지칭되는 특수화된 단백질에 의해 펩타이드 단편들로서 세포의 표면 상에 제시된다. MHC 분자는 약 4Mb 범위에 걸쳐있는 유전자들이 연결된 클러스터로 발견되는 다수의 유전자 자리(locus)에 의해 암호화된다. 마우스에서, MHC 유전자들은 17번 염색체 상에서 발견되며, 조직학적 이유로 조직적합성 2(H-2) 유전자로서 지칭된다. 인간에 있어서, 당해 유전자들은 6번 염색체 상에서 발견되며, 인간 백혈구 항원(HLA) 유전자라고 불린다. 마우스 및 인간에서 유전자 자리는 다유전자성(polygenic)이고; 이들은, 인간 및 쥐과의 유전체에서 유사한 기질화를 나타내는 3개의 고도로 다형성인 부류들(제I, 제II 및 제III 부류)의 MHC 유전자들을 포함한다(각각 도 2 및 도 3 참조).
MHC 유전자 자리는 유전체 내에서 가장 많은 다형성을 나타내며; 일부 유전자들은 300 초과의 대립형질들(예를 들어, 인간 HLA-DRβ 및 인간 HLA-B)로 나타난다. 모든 제I 및 제II 부류 MHC 유전자들은 펩타이드 단편들을 제시할 수 있지만, 각각의 유전자는 서로 다른 결합 특성들을 갖는 단백질을 발현하는데, 이는 다형성과 대립형질 변이체로 나타난다. 어떠한 개체라도 면역 반응 과정 중에서는 B 세포 및 T 세포에 대해 그 세포 표면 상에 제시될 수 있는 고유한 특성을 갖는 펩타이드 단편들을 가진다.
인간과 마우스는 모두 제II 부류 MHC 유전자를 가진다(도 2 및 도 3 참조). 인간에게 있어서, 전통적인 MHC II 유전자들은 HLA-DP, HLA-DQ 및 HLA-DR로 명명되는 반면, 마우스에 있어서는 이들은 H-2A 및 H-2E(I-A 및 I-E로 각각 약칭되는 경우가 많음)이다. MHC II 유전자 자리 내의 유전자들에 의해 암호화된 추가의 단백질들인 HLA-DM과 HLA-DO (인간), 그리고 H-2M과 H-2O (마우스)는 세포 표면 상에서는 발견되지 않으나, 식균 구획(endocytic compartment) 내에 체류하여 펩타이드들을 지닌 MHC II 분자들을 적절히 로딩할 수 있게 해준다. 제II 부류 분자들은 2개의 폴리펩타이드 사슬인 α사슬 및 β사슬로 이루어져 있다. α사슬의 세포외 부분은 2개의 세포외 도메인인 α1 및 α2를 함유하며; β사슬의 세포외 부분 역시 2개의 세포외 도메인인 β1 및 β2를 함유한다(도 1 참조). α사슬 및 β사슬들은 서로 비공유적으로 결합되어 있다.
MHC 제II 부류 분자들은 염증 등의 과정 동안에 항원-제시 세포(APC), 예컨대, B 세포, 대식세포, 수지상 세포, 내피 세포 상에서 발현된다. APC의 표면 상에서 발현된 MHC 제II 분자는 통상 CD4+ T 세포에 대해 세포내 소포에서 생성된 항원들을 제시한다. CD4+ T 세포 개입에 참여하기 위해, 관심 대상 항원을 지닌 MHC 제II 부류 복합체는 CD4+ T 세포를 개입시킬 정도로 충분히 오래 생존하기 위해 충분히 안정되어야 한다. CD4+ T 헬퍼 세포가 APC의 표면 상에서 외부 펩타이드/MHC II 복합체에 의해 개입되는 경우, T 세포가 활성화되어 침입자에 대한 면역 반응을 보조하는 사이토카인을 방출하게 된다.
내성 기작으로 인해, 모든 항원이 T 세포 활성화를 유발하지는 않을 것이다. 그러나, 일부 질환(예를 들어, 암, 자가면역 질환)에서는 자기-단백질(self-protein)로부터 유래된 펩타이드들은 면역계의 세포 구성 성분의 표적이 되어, 이로써 이러한 펩타이드들을 제시하는 세포들의 파괴를 초래하게 된다. 임상적으로 유의미한 항원(예를 들어, 다양한 유형들의 암과 관련된 항원들)을 인지하는데 있어서는 현저한 발전이 있었다. 그러나, 인간 T 세포에서 적절한 반응을 유발할 펩타이드, 특히 임상적으로 유의한 항원의 펩타이드들에 있어서 이들을 동정하고 선택하는 과정을 개선하기 위해서는, 인간 면역계의 양상들을 모방하는 생체 내 및 시험관 내 시스템이 필요한 실정이다. 따라서, 인간 면역계의 구성성분들을 제시할 수 있는 생물학적 시스템(예를 들어, 유전적으로 변형된 비인간 동물 및 세포)이 필요하다.
발명의 개요
인간 MHC 제II 부류 단백질 및 이의 키메라와 관련되어 있고, CD4+ T 세포에 결합하는 펩타이드를 생성하거나 동정하기 위한 생물학적 시스템이 제공된다. 세포의 면역 반응에서 작용하는 인간화된 분자를 발현하는 비인간 세포를 포함하는 비인간 동물이 제공된다. 또한, 인간화된 MHC II 단백질을 암호화하는 인간화된 설치류 유전자 자리도 제공된다. 인간화된 MHC 분자를 발현하는 인간화된 설치류 세포도 제공된다. 인간화된 설치류 세포를 포함하는 생체 내 및 시험관 내 시스템들이 제공되는데, 이때 상기 설치류 세포는 하나 이상의 인간화된 면역계 분자를 발현한다.
본원에는 인간화된 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 유전체 내에 포함하고 있는 비인간 동물, 예를 들어, 설치류(예컨대, 마우스 또는 래트)가 제공되는데, 이때 상기 인간화된 MHC II 복합체의 인간 부분은 인간 MHC II 복합체의 세포외 도메인, 예컨대, 인간화된 MHC IIα 세포외 도메인 및 인간화된 MHC IIβ 세포외 도메인을 포함한다.
한 양상에서, 내인성 MHC IIα 유전자 자리에 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비인간 동물이 제공된다. 한 실시형태에서, 이러한 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC IIα 세포외 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 비인간 동물은 동물의 세포의 표면 상에서 기능성 MHC II 복합체를 발현한다. 한 실시형태에서, 동물 내의 인간 MHC IIα 세포외 도메인은 인간 MHC IIα1 및 α2 도메인을 포함하고; 한 실시형태에서, 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 비인간 부분은 내인성 비인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간 MHC IIα 프로모터 및 조절 요소들에 작동가능하게 연결된다 (예를 들어, 내인성 비인간 MHC IIα 프로모터 및 조절 요소들의 조절성 제어 하에서 발현됨). 한 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인간 HLA 제II 부류 단백질로부터 유래하는데, 예컨대 당해 인간 부분은 HLA-DR4, HLA-DR2, HLA-DQ2 및 HLA-DQ8 단백질로부터 선택된 HLA 제II 부류 단백질로부터 유래된다. 비인간 동물은 설치류, 예컨대 마우스일 수 있다. 한 양상에서, 내인성 MHC IIα 유전자 자리에 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비인간 동물은, 내인성 MHC IIβ 유전자 자리에 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 또한, 내인성 MHC IIα 유전자 자리에 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하는 방법도 제공된다. 이러한 방법은 내인성 MHC IIα 유전자 자리에 내인성 비인간 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체함을 포함할 수 있다.
또한, 내인성 MHC IIβ 유전자 자리에 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비인간 동물도 제공된다. 한 실시형태에서, 이러한 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC IIβ 세포외 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 비인간 동물은 동물의 세포 표면 상에서 기능성 MHC II 복합체를 발현한다. 한 실시형태에서, 동물 내의 인간 MHC IIβ 세포외 도메인은 인간 MHC IIβ1 및 β2 도메인을 포함하고; 한 실시형태에서, 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 비인간 부분은 내인성 비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간 MHC IIβ 프로모터 및 조절 요소들에 작동가능하게 연결된다 (예를 들어, 내인성 비인간 MHC IIβ 프로모터 및 조절 요소들의 조절성 제어 하에서 발현됨). 한 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인간 HLA 제II 부류 단백질로부터 유래하는데, 예컨대 당해 인간 부분은 HLA-DR4, HLA-DR2, HLA-DQ2 및 HLA-DQ8 단백질로부터 선택된 HLA 제II 부류 단백질로부터 유래된다. 비인간 동물은 설치류, 예컨대 마우스일 수 있다. 한 양상에서, 내인성 MHC IIβ 유전자 자리에 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비인간 동물은 내인성 MHC IIα 유전자 자리에 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 또한, 내인성 MHC IIβ 유전자 자리에 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하는 방법도 제공된다. 이러한 방법은 내인성 MHC IIβ 유전자 자리에서 내인성 비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체함을 포함할 수 있다.
한 양상에서, 내인성 MHC II 유전자 자리에 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비인간 동물이 제공되는데, 이때 상기 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC IIα 세포외 도메인을 포함하고, 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC IIβ 세포외 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 키메라 인간/비인간 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드는 세포의 표면 상에 기능성 키메라 MHC II 복합체(예를 들어, 인간/비인간 MHC II 복합체)를 형성한다. 한 실시형태에서, 인간 MHC IIα 세포외 도메인은 인간 MHC II의 인간 α1 및 α2 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 인간 MHC IIβ 세포외 도메인은 인간 MHC II의 인간 β1 및 β2 도메인을 포함한다. 다양한 양상들에 있어서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간 MHC IIα 프로모터 및 조절요소들의 조절성 제어 하에(예컨대, 이들과 작동가능하게 연결되어) 발현된다. 다양한 양상들에 있어서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간 MHC IIβ 프로모터 및 조절요소들의 조절성 제어 하에(예컨대, 이들과 작동가능하게 연결되어) 발현된다. 일부 실시형태에서, 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 비인간 부분은 내인성 비인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 비인간 부분은 내인성 비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다.
다양한 실시형태들에 있어서, 비인간 동물은 설치류이고, 키메라 인간/설치류 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드의 인간 부분은 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HLA 제II 부류 단백질로부터 유래된 인간 서열을 포함한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 키메라 인간/설치류 MHC IIα 및 β 서열의 인간 부분은 인간 HLA-DR4 서열로부터 유래하므로; MHC IIα 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 HLA-DRα*01 유전자의 서열로부터 유래되고, MHC IIβ 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 HLA-DRβ1*04 유전자의 서열로부터 유래된다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 키메라 인간/설치류 MHC IIα 및 β 서열의 인간 부분은 인간 HLA-DR2 서열로부터 유래되므로; MHC IIα 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 HLA-DRα*01 유전자의 서열로부터 유래되고, MHC IIβ 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 HLA-DRβ1*02 유전자 (예컨대, HLA-DRβ1*02(1501) 유전자)의 서열로부터 유래된다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 키메라 인간/설치류 MHC IIα 및 β 서열의 인간 부분은 인간 HLA-DQ2 서열로부터 유래되므로; MHC IIα 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 HLA-DQα1*05 유전자 (예컨대, HLA-DQA1*1501 유전자)의 서열로부터 유래하고, MHC IIβ 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 HLA-DQβ1*02 유전자의 서열로부터 유래된다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 키메라 인간/설치류 MHC IIα 및 β 서열의 인간 부분은 인간 HLA-DQ8 서열로부터 유래되므로; MHC IIα 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 HLA-DQα1*0301 유전자의 서열로부터 유래되고, MHC IIβ 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 HLA-DQβ1*0302 유전자의 서열로부터 유래된다.
본 발명의 다양한 실시형태들에 있어서, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 동일한 염색체 상에 위치한다. 일부 양상들에서, 동물은 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 MHC II 유전자 자리의 2개의 복제본을 포함하는 반면, 다른 양상에 있어서는, 동물은 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 MHC II 유전자 자리의 1개의 복제본을 포함한다. 따라서, 당해 동물은 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 MHC II 유전자 자리에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 한 실시형태에서, 본원에 기술된 키메라 MHC II는 비인간 동물의 생식 세포 계열에 존재한다.
일부 양상들에 있어서, 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드 및/또는 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드는 비인간 리더 서열(leader sequence)에 작동가능하게 연결되어 있다.
한 양상에서, 유전자 조작된 비인간 동물은 설치류이다. 한 실시형태에서, 설치류는 마우스 및 래트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 키메라 MHC IIα 및 β 유전자의 비인간 서열은 마우스 MHC II 단백질, 예를 들어, 마우스 H-2A 또는 H-2E 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된다. 한 실시형태에서, 본 발명의 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)는 설치류의 내인성 유전자 자리에서부터 기능성인 내인성 MHC II 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 한 실시형태에서, 설치류가 마우스이고, 당해 마우스는 마우스의 내인성 유전자 자리에서부터 기능성인 내인성 H-2E 및 H-2A 폴리펩타이드들을 발현하지 않는다.
따라서, 일부 실시형태에서, 내인성 마우스 MHC II 유전자 자리에서 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스가 제공되는데, 이때 상기 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 인간 부분은 HLA-DR4, HLA-DR2, HLA-DQ2 및 HLA-DQ8로부터 선택된 인간 HLA 제II 부류의 α 폴리펩타이드로부터 유래된 세포외 도메인을 포함하고, 상기 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 부분은 HLA-DR4, HLA-DR2, HLA-DQ2 및 HLA-DQ8로부터 선택된 인간 HLA 제II 부류의 β 폴리펩타이드로부터 유래된 세포외 도메인을 포함하며, 이때 상기 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 H-2A 또는 H-2E α 사슬의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고, 상기 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 H-2A 또는 H-2E β 사슬의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며, 이때 마우스는 기능성인 키메라 HLA 제II 부류의 복합체를 발현한다. 한 실시형태에서, 기능성인 키메라 HLA 제II 부류의 복합체는 HLA-DR4/H-2E이다. 또 다른 실시형태에서, 기능성인 키메라 HLA 제II 부류의 복합체는 HLA-DR2/H-2E이다. 또 다른 실시형태에서, 기능성인 키메라 HLA 제II 부류의 복합체는 HLA-DR2/H-2E이다. 또 다른 실시형태에서, 기능성인 키메라 HLA 제II 부류의 복합체는 HLA-DQ2/H-2A이다. 또 다른 실시형태에서, 기능성인 키메라 HLA 제II 부류의 복합체는 HLA-DQ8/H-2A이다. 일부 양상들에 있어서, 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 세포외 도메인은 인간 α1 및 α2 도메인을 포함하고; 일부 양상들에 있어서는, 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인은 인간 β1 및 β2 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 마우스 MHC IIα 프로모터 및 조절 요소들의 조절성 제어 하에 (예컨대, 이들과 작동가능하게 연결됨) 발현되고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 마우스 MHC IIβ 프로모터 및 조절 요소들의 조절성 제어 하에 (예컨대, 이들과 작동가능하게 연결됨) 발현된다. 다양한 실시형태들에 있어서, 마우스는 마우스의 내인성 유전자 자리에서부터 기능성인 내인성 MHC II 폴리펩타이드, 예를 들어, H-2E 및 H-2A 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 일부 양상에서, 마우스는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 MHC II 유전자 자리의 2개의 복제본을 포함하는 반면, 다른 양상에 있어서, 마우스는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 MHC II 유전자 자리의 1개의 복제본을 포함한다.
추가로, 본원에서는 마우스의 유전체 내에, 예컨대 마우스의 내인성 MHC II 유전자 자리에 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체(들)을 암호화하는 하나 이상, 예컨대 1개, 2개, 3개, 4개의 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 마우스가 제공된다. 한 실시형태에서, 각 복합체는 MHC IIα 및 MHC IIβ 폴리펩타이드를 포함하며, 당해 키메라 MHC IIα 및 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 부분은 각각 인간 MHC IIα 및 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함하는 반면, 마우스 부분은 각각 마우스 MHC IIα 및 MHC IIβ 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 따라서, 마우스는 하나 이상, 예컨대 1개, 2개, 3개, 4개의 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체(들)을 발현할 수 있다.
또한, 본원에 기술된 바와 같은 유전자 조작된 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트)을 제조하는 방법도 제공된다. 다양한 실시형태들에 있어서, 본 발명의 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예컨대, 마우스 또는 래트)은, 내인성 MHC II 서열을 키메라 인간/비인간(예를 들어, 인간/마우스) MHC IIα 및 β 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하여 제조한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 내인성 설치류 MHC II 유전자 자리에서 설치류 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 인간/설치류 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체함을 포함하는, 키메라 인간/설치류 MHC II 복합체를 발현시키기 위해 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)의 MHC II 유전자 자리를 변형시키는 방법을 제공한다. 당해 방법의 한 양상에서, 키메라 인간/설치류 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 MHC IIα 사슬의 세포외 도메인 및 설치류 MHC IIα 사슬의 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 및 인간 MHC IIβ 사슬의 세포외 도메인 및 설치류 MHC IIβ 사슬의 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 키메라 MHC II 복합체의 설치류 부분은 마우스 H-2E 단백질로부터 유래되고, 인간 부분은 인간 HLA-DR4 단백질로부터 유래된다. 일부 양상에서, 키메라 MHC II 복합체의 설치류 부분은 마우스 H-2E 단백질로부터 유래되고, 인간 부분은 인간 HLA-DR2 단백질로부터 유래된다. 일부 양상에서, 키메라 MHC II 복합체의 설치류 부분은 마우스 H-2A 단백질로부터 유래되고, 인간 부분은 인간 HLA-DQ2 단백질로부터 유래된다. 또 다른 양상에서, 키메라 MHC II 복합체의 설치류 부분은 마우스 H-2A 단백질로부터 유래되고, 인간 부분은 인간 HLA-DQ8 단백질로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 내인성 MHC II 유전자 자리들의 대체는 단일 ES 세포 내에서 이루어지며, 당해 단일 ES 세포를 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트) 배아 내로 도입하여 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)를 제조한다.
또한, 본원에서는 인간 MHC IIα 사슬의 세포외 도메인 및 비인간 MHC IIα 사슬의 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 및 인간 MHC IIβ 사슬의 세포외 도메인 및 비인간 MHC IIβ 사슬의 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 키메라 인간/비인간 MHC II 복합체를 암호화하는 비인간 키메라 MHC II 유전자 자리도 제공된다. 한 양상에서, 당해 키메라 MHC II 유전자 자리는 비인간 동물의 유전체 내의 내인성 MHC II 위치에 존재한다. 한 양상에서, 당해 키메라 MHC II 유전자 자리는 키메라 인간/비인간 (예를 들어, 인간/설치류, 예컨대 인간/마우스 또는 인간/래트) MHC II 복합체를 발현한다. 한 실시형태에서, 인간 MHC II는 HLA-DQ, HLA-DR 및 HLA-DP (예를 들어, HLA-DR4, HLA-DR2, HLA-DQ2 및 HLA-DQ8)로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 비인간 MHC II는 H-2A 및 H-2E로부터 선택된 마우스 MHC II이다. 한 양상에서, 키메라 MHC II 유전자 자리는 유전적으로 변형된 비인간 동물 (예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트)을 제조하기 위해 본원에 기술된 임의의 방법들에 의해 수득가능하다.
또한, 본원에서 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트)로부터 유래된, 분리된 항원-제시 세포도 제공된다. 본원에 기술된 비인간 동물로부터 유래된 조직 및 배아도 제공된다.
본원에 기술된 어떠한 실시형태 및 양상들이라도 달리 지시가 있거나 문맥으로부터 명백한 경우가 아닌 한 서로 함께 사용될 수 있다. 그 밖의 다른 실시형태들도 하기 상세한 설명을 고찰해 보면 해당 업계의 숙련자에게는 명백할 것이다. 하기 상세한 설명은 본 발명의 다양한 실시형태들의 대표적인 예시를 포함하지만, 이는 청구하고 있는 바와 같이 본 발명을 제한하지는 않는다. 첨부되는 도면들은 당해 명세서의 일부를 구성하며, 발명의 상세한 설명과 함께 실시형태들을 단지 예시하기 위해 제공되는 것이지, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
도 1은 4개의 도메인 α1, α2, β1 및 β2를 함유하는 항원 제시 세포(APC)의 표면 상에 발현된 MHC 제II 부류 분자의 개략도이다. 회색 원은 펩타이드-결합 간극(cleft)에 결합된 펩타이드를 나타낸다.
도 2는 인간 HLA의 상대적인 유전체 구조의 개략도(축척은 나타내지 않음)로서, 제I, 제II 및 제III 부류 유전자를 보여주고 있다.
도 3은 마우스 MHC의 상대적인 유전체 구조의 개략도(축척은 나타내지 않음)로서, 제I, 제II 및 제III 부류 유전자를 보여주고 있다.
도 4(A-D)는 인간화된 I-Eβ 및 I-Eα(즉, 각각 H-2Eβ/HLA-DRβ1*04 및 H-2Eα/HLA-DRα*01 키메라)를 포함하는 표적화 벡터를 제조하기 위한 전략을 나타내는 개략도(축척은 나타내지 않음)이다. 도 4C에서, 도 4B에서 최종적으로 인간화된 MHC II 서열은 도 4A의 최종 작제물의 PI-SceI 및 I-CeuI 제한 부위 사이에서 결찰되어, 인간화된 MHC II 및 BALB/c I-Eα의 엑손 1을 포함하는 작제물을 생성한다. Pg = 유사유전자(pseudogene); BHR = 세균 상동성 재조합; CM = 클로람페니콜; spec = 스펙티노마이신; hyg = 하이그로마이신; neo = 네오마이신; EP = 전기천공법. 삼각형은 엑손을 나타내는데, 채워진 삼각형들은 C57BL/6 마우스의 마우스 엑손[예외적으로, 우물정자(#)로 그물처럼 표시된(hashed) 삼각형은 BALB/c 마우스 I-Eα의 엑손 1을 나타냄]을 나타내고, 개방된 삼각형들은 인간 엑손을 나타낸다.
도 5는 MHC 제II 부류 I-E 및 I-A 유전자의 개략도(축척은 나타내지 않음)를 나타내는데, 하이그로마이신 카세트(hygromycin cassette)를 사용한 마우스 유전자 자리의 녹아웃(knockout) 후, 인간화된 I-Eβ 및 I-Eα(즉, 각각 H-2Eβ/HLA-DRβ1*04 및 H-2Eα/HLA-DRα*01 키메라)를 포함하는 벡터를 도입했음을 보여주고 있다. 개방된 삼각형들은 인간 엑손을 나타내고; 채워진 삼각형들은 마우스 엑손을 나타낸다. 유전자형 분석(genotyping)에 사용된 프로브들은 원에 둘러싸여 있다.
도 6은 도 5의 네오마이신 카세트의 Cre-매개된 제거의 개략도(축척은 나타내지 않음)를 나타낸다. 개방된 삼각형들은 인간 엑손을 나타내고; 채워진 삼각형들은 마우스 엑손을 나타낸다. 위쪽의 두 가닥은 네오마이신 선별 카세트를 지닌 인간화된 MHC II 이형접합성 마우스 내의 MHC II 유전자 자리를 나타내고, 아래쪽의 두 가닥은 네오마이신 카세트가 제거된 인간화된 MHC II 이형접합성 마우스 내의 MHC II 유전자 자리를 나타낸다.
도 7은 마우스 및 인간 제II 부류 유전자 자리의 개략적인 비교도(축척은 나타내지 않음)를 나타낸다. 제II 부류 유전자들은 박스 모양으로 표시된다. 다양한 핵산 단편들의 상대적인 크기(kb)가 포함되어 있다.
도 8의 왼쪽 패널은 MHC IIα 사슬에 대한 인간화 전략의 개략도(축척은 나타내지 않음)인데; 특히, 당해 도면은 마우스의 막관통 및 세포질 꼬리 서열을 보유하면서 MHC IIα 유전자의 엑손 2 및 3에 의해 암호화된 α1 및 α2 도메인을 대체한 것을 보여주고 있다. 인간화된 유전자 자리에서, MHC IIα 리더 서열은 마우스 BALB/c 균주로부터 유래된다. 오른쪽 패널은 MHC IIβ 사슬의 인간화를 도시하고 있는데; 특히, 당해 도면은 마우스의 리더, 마우스의 막관통 및 세포질 꼬리 서열을 보유하면서 MHC IIβ 유전자의 엑손 2 및 3에 의해 암호화된 β1 및 β2 도메인을 대체한 것을 보여주고 있다. 맨 윗줄은 모두 인간 서열이고; 가운데 줄은 모두 마우스 서열이며; 맨 아랫줄은 모두 인간 HLA-DR 유전자로부터 유래된 엑손 2 및 3을 지닌 인간화된 서열이다.
도 9는 폴리(I:C)의 존재 [1681HET + 폴리(I:C)] 또는 부재(1681HET) 하에 (네오 카세트가 제거된) 키메라 HLA-DR4에 대해 이형접합성인 마우스 및 야생형 마우스(WT 마우스)에 있어서 B 세포의 항-HLA-DR 항체를 사용한 FACS 분석을 나타내고 있다.
도 10은 인간화된 MHC II 유전자를 제조하는데 사용된 표적화 벡터, 구체적으로 HLA-DQ2.5/H-2A 마우스를 제조하기 위한 표적화 벡터(도 10A), HLA-DQ8.1/H-2A 마우스를 제조하기 위한 표적화 벡터(도 10B) 및 HLA-DR2/H-2E 마우스를 제조하기 위한 표적화 벡터(도 10C)를 개략적으로 도시한 것이다(축척은 나타내지 않음). 그림에서, 달리 지시하지 않는 한 (예컨대, loxP 부위 등), 빈 박스 또는 삼각형들은 인간 엑손의 서열이고, 이중선은 인간 인트론의 서열이며, 채워진 박스 또는 삼각형들은 마우스 엑손의 서열이고, 단일선은 마우스 인트론의 서열이며, 우물정자(#)로 그물처럼 표시된(hashed) 삼각형은 BALB/c 마우스 I-Eα의 엑손 1이다. 접합되는 서열의 위치는 각 표적화 벡터 그림 아래에 표시하였으며, 이는 표 1과 서열목록에도 나타나 있다.
도 11은 WT 또는 이형접합성 HLA-DQ2.5/H-2A ("6040Het") 마우스로부터 수득된 CD19+ B 세포에 대한 마우스 H-2A/H-2E (IA/IE) 및 인간 HLA-DQ2.5의 발현을 보여주고 있다.
도 2는 인간 HLA의 상대적인 유전체 구조의 개략도(축척은 나타내지 않음)로서, 제I, 제II 및 제III 부류 유전자를 보여주고 있다.
도 3은 마우스 MHC의 상대적인 유전체 구조의 개략도(축척은 나타내지 않음)로서, 제I, 제II 및 제III 부류 유전자를 보여주고 있다.
도 4(A-D)는 인간화된 I-Eβ 및 I-Eα(즉, 각각 H-2Eβ/HLA-DRβ1*04 및 H-2Eα/HLA-DRα*01 키메라)를 포함하는 표적화 벡터를 제조하기 위한 전략을 나타내는 개략도(축척은 나타내지 않음)이다. 도 4C에서, 도 4B에서 최종적으로 인간화된 MHC II 서열은 도 4A의 최종 작제물의 PI-SceI 및 I-CeuI 제한 부위 사이에서 결찰되어, 인간화된 MHC II 및 BALB/c I-Eα의 엑손 1을 포함하는 작제물을 생성한다. Pg = 유사유전자(pseudogene); BHR = 세균 상동성 재조합; CM = 클로람페니콜; spec = 스펙티노마이신; hyg = 하이그로마이신; neo = 네오마이신; EP = 전기천공법. 삼각형은 엑손을 나타내는데, 채워진 삼각형들은 C57BL/6 마우스의 마우스 엑손[예외적으로, 우물정자(#)로 그물처럼 표시된(hashed) 삼각형은 BALB/c 마우스 I-Eα의 엑손 1을 나타냄]을 나타내고, 개방된 삼각형들은 인간 엑손을 나타낸다.
도 5는 MHC 제II 부류 I-E 및 I-A 유전자의 개략도(축척은 나타내지 않음)를 나타내는데, 하이그로마이신 카세트(hygromycin cassette)를 사용한 마우스 유전자 자리의 녹아웃(knockout) 후, 인간화된 I-Eβ 및 I-Eα(즉, 각각 H-2Eβ/HLA-DRβ1*04 및 H-2Eα/HLA-DRα*01 키메라)를 포함하는 벡터를 도입했음을 보여주고 있다. 개방된 삼각형들은 인간 엑손을 나타내고; 채워진 삼각형들은 마우스 엑손을 나타낸다. 유전자형 분석(genotyping)에 사용된 프로브들은 원에 둘러싸여 있다.
도 6은 도 5의 네오마이신 카세트의 Cre-매개된 제거의 개략도(축척은 나타내지 않음)를 나타낸다. 개방된 삼각형들은 인간 엑손을 나타내고; 채워진 삼각형들은 마우스 엑손을 나타낸다. 위쪽의 두 가닥은 네오마이신 선별 카세트를 지닌 인간화된 MHC II 이형접합성 마우스 내의 MHC II 유전자 자리를 나타내고, 아래쪽의 두 가닥은 네오마이신 카세트가 제거된 인간화된 MHC II 이형접합성 마우스 내의 MHC II 유전자 자리를 나타낸다.
도 7은 마우스 및 인간 제II 부류 유전자 자리의 개략적인 비교도(축척은 나타내지 않음)를 나타낸다. 제II 부류 유전자들은 박스 모양으로 표시된다. 다양한 핵산 단편들의 상대적인 크기(kb)가 포함되어 있다.
도 8의 왼쪽 패널은 MHC IIα 사슬에 대한 인간화 전략의 개략도(축척은 나타내지 않음)인데; 특히, 당해 도면은 마우스의 막관통 및 세포질 꼬리 서열을 보유하면서 MHC IIα 유전자의 엑손 2 및 3에 의해 암호화된 α1 및 α2 도메인을 대체한 것을 보여주고 있다. 인간화된 유전자 자리에서, MHC IIα 리더 서열은 마우스 BALB/c 균주로부터 유래된다. 오른쪽 패널은 MHC IIβ 사슬의 인간화를 도시하고 있는데; 특히, 당해 도면은 마우스의 리더, 마우스의 막관통 및 세포질 꼬리 서열을 보유하면서 MHC IIβ 유전자의 엑손 2 및 3에 의해 암호화된 β1 및 β2 도메인을 대체한 것을 보여주고 있다. 맨 윗줄은 모두 인간 서열이고; 가운데 줄은 모두 마우스 서열이며; 맨 아랫줄은 모두 인간 HLA-DR 유전자로부터 유래된 엑손 2 및 3을 지닌 인간화된 서열이다.
도 9는 폴리(I:C)의 존재 [1681HET + 폴리(I:C)] 또는 부재(1681HET) 하에 (네오 카세트가 제거된) 키메라 HLA-DR4에 대해 이형접합성인 마우스 및 야생형 마우스(WT 마우스)에 있어서 B 세포의 항-HLA-DR 항체를 사용한 FACS 분석을 나타내고 있다.
도 10은 인간화된 MHC II 유전자를 제조하는데 사용된 표적화 벡터, 구체적으로 HLA-DQ2.5/H-2A 마우스를 제조하기 위한 표적화 벡터(도 10A), HLA-DQ8.1/H-2A 마우스를 제조하기 위한 표적화 벡터(도 10B) 및 HLA-DR2/H-2E 마우스를 제조하기 위한 표적화 벡터(도 10C)를 개략적으로 도시한 것이다(축척은 나타내지 않음). 그림에서, 달리 지시하지 않는 한 (예컨대, loxP 부위 등), 빈 박스 또는 삼각형들은 인간 엑손의 서열이고, 이중선은 인간 인트론의 서열이며, 채워진 박스 또는 삼각형들은 마우스 엑손의 서열이고, 단일선은 마우스 인트론의 서열이며, 우물정자(#)로 그물처럼 표시된(hashed) 삼각형은 BALB/c 마우스 I-Eα의 엑손 1이다. 접합되는 서열의 위치는 각 표적화 벡터 그림 아래에 표시하였으며, 이는 표 1과 서열목록에도 나타나 있다.
도 11은 WT 또는 이형접합성 HLA-DQ2.5/H-2A ("6040Het") 마우스로부터 수득된 CD19+ B 세포에 대한 마우스 H-2A/H-2E (IA/IE) 및 인간 HLA-DQ2.5의 발현을 보여주고 있다.
정의
본 발명은 인간 또는 인간화된 MHC II 폴리펩타이드를 발현하는 유전적으로 변형된 비인간 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등); 이를 포함하는 배아, 세포 및 조직; 이들을 제조하는 방법; 및 이들을 사용하는 방법을 제공한다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어 및 어구는 당해 용어 및 어구가 사용된 문맥과는 다른 의미가 명백하게 지시되어 있거나 혹은 그로부터 명확히 알 수 있는 경우가 아닌 한, 이들은 해당 업계에서 통용되어 왔던 의미를 포함한다.
보존적 아미노산 치환을 기술하는데 사용되는 경우에 있어서, 용어 "보존적"이라는 말은 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측사슬 R 그룹을 보유하는 또 다른 아미노산 잔기에 의한 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 보존적 치환을 암호화할 뉴클레오타이드 변화를 도입하기 위해 뉴클레오타이드 서열을 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 관심 대상 단백질의 기능적 특성, 예컨대 관심 펩타이드를 제시하는 MHC II의 역량을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 특성을 갖는 측사슬을 보유하는 아미노산 그룹의 예로서는 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신과 같은 지방족 측사슬; 세린 및 트레오닌과 같은 지방족-하이드록실 측사슬; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드-함유 측사슬; 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판과 같은 방향족 측사슬; 라이신, 아르기닌 및 히스티딘과 같은 염기성 측사슬; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 측사슬; 및 시스테인 및 메티오닌과 같은 황-함유 측사슬이 포함된다. 보존적 아미노산 치환 그룹들로서는, 예를 들어, 발린/류신/이소류신, 페닐알라닌/타이로신, 라이신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타메이트/아스파르테이트 및 아스파라긴/글루타민이 포함된다. 일부 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환은, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발(alanine scanning mutagenesis)에서 사용된 바와 같이, 단백질 내에서 임의의 천연 잔기를 알라닌을 사용하여 수행한 치환일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 참조로 포함된 문헌[Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45]에 개시된 PAM250 로그-우도 매트릭스(log-likelihood matrix)에서 양성 값을 갖는 보존적 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, 당해 치환은 PAM250 로그-우도 매트릭스에서 음성이 아닌 값을 가지는 중간 정도의 보존적 치환이다.
따라서, 유전체가 인간 또는 인간화된 MHC II 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물도 본 발명에 포함되며, 이때 당해 폴리펩타이드는 본원에 기술된 아미노산 서열 내에 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
해당 업계의 숙련자라면 누구나 유전자 코드의 축중성(degeneracy, 縮重性)이라는 것 때문에, 본원에 기술된 인간 또는 인간화된 MHC II 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 잔기들 이외의 다른 핵산들도 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 보존적 아미노산 치환을 가지는 MHC II 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 유전체 내에 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물 이외에도, 유전체가 유전자 코드의 축중성으로 인해 본원에 기술된 것과 다른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비인간 동물도 제공된다.
서열과 함께 사용되는 경우에 있어서, 용어 "동일성(identity)"이라는 말은 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열의 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 해당 업계에 공지되어 있는 다수의 서로 다른 알고리즘에 의해 측정된 동일성을 포함한다. 본원에 기술된 일부 실시형태에서, 동일성은 10.0의 개방 갭 패널티(open gap penalty), 0.1의 연장 갭 패널티(extend gap penalty)를 이용하는 ClustalW v. 1.83(slow) 정렬을 사용하고, 거넷 유사성 매트릭스(Gonnet similarity matrix)(MacVectorTM 10.0.2, MacVector Inc., 2008)를 사용하여 측정한다. 서열의 동일성과 관련하여 비교된 서열의 길이는 특정 서열에 따라 달라질 것이다. 다양한 실시형태에서, 동일성은 성숙한 단백질의 N-말단에서 C-말단까지의 서열을 비교함으로써 측정한다. 다양한 실시형태에서, 키메라 인간/비인간 서열을 인간 서열에 대해 비교하는 경우, 키메라 인간/비인간 서열의 (비인간 부분이 아닌) 인간 부분이 인간 서열과 키메라 인간/비인간 서열의 인간 부분 사이의 동일성의 수준을 확인할 목적을 위한 비교에 사용된다 (예를 들어, 키메라 인간/마우스 단백질의 인간 엑토도메인(ectodomain)을 인간 단백질의 인간 엑토도메인과 비교함).
서열, 예컨대 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 관련하여 용어 "상동성" 또는 "상동의(상동성인)"이라는 말은, 최적으로 정렬하여 비교할 때 약 75% 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산, 예를 들어 약 80% 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산, 예를 들어 약 90 내지 95% 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산, 예를 들어, 97% 초과의 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 동일한 두 서열을 의미한다. 해당 업계에서 숙련자라면 누구나 최적의 유전자 표적화를 위해서는 표적화 작제물이 내인성 DNA 서열에 대해 상동성인 아암(arm)(즉, "상동성 아암")을 함유해야만; 이로써 상동성 재조합이 표적화 작제물과 표적화된 내인성 서열 간에 일어날 수 있다는 사실을 이해할 수 있을 것이다.
용어 "작동가능하게 연결된"이라는 말은, 이러한 표현으로 기술된 구성성분들이 의도한 방식으로 작용하도록 허용하는 관계에 있는 상기 구성성분들의 병치된 상태(juxtaposition)를 지칭한다. 이와 같이, 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 조절 서열[예를 들어, 프로모터, 인핸서, 사일런서(silencer) 서열 등]에 작동가능하게 연결됨으로써 적절한 전사 조절 특성을 보유할 수 있다. 또한, 본 발명의 키메라 또는 인간화된 단백질의 다양한 부분들도 작동가능하게 연결되어 세포 내의 단백질의 적절한 접힘(folding), 프로세싱, 표적화, 발현 및 다른 기능적인 특성들을 보유할 수 있다. 달리 언급하지 않는 한, 본 발명의 키메라 또는 인간화된 단백질의 다양한 도메인들은 서로에 대해 작동가능하게 연결되어 있다.
본원에 사용된 용어 "MHC II 복합체", "MHC II 단백질" 또는 기타 이와 유사한 용어는 MHC IIα 폴리펩타이드와 MHC IIβ 폴리펩타이드 간의 복합체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "MHC IIα 폴리펩타이드" 또는 "MHC IIβ 폴리펩타이드" (또는 기타 이와 유사한 용어)는 MHC IIα 폴리펩타이드 단독 또는 MHC IIβ 폴리펩타이드 단독 각각을 포함한다. 유사하게, 용어 "HLA-DR4 복합체", "HLA-DR4 단백질", "H-2E 복합체", "H-2E 단백질" 또는 기타 이와 유사한 용어는 α 및 β 폴리펩타이드들 간의 복합체를 지칭한다. 보통, 용어 "인간 MHC" 및 "HLA"는 상호 교환하여 사용된다.
유전자 대체(gene replacement)와 관련하여 용어 "대체"라는 말은 내인성 유전자 자리에 외인성 유전 물질을 위치시켜, 내인성 유전자 전부 또는 일부를 이종상동성(orthologous) 또는 상동성 핵산 서열로 대체함을 지칭한다. 하기 실시예에서 시연하고 있는 바와 같이, 내인성 MHC II 유전자 자리의 핵산 서열은, 인간 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드의 부위, 구체적으로 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드의 세포외 부분을 암호화하는 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 대체되었다.
본원에 사용된 "기능성(기능적인)"이라는 말은, 예를 들어 기능성 폴리펩타이드와 관련하여 볼 때, 천연 단백질과 통상적으로 관련된 하나 이상의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 일부 실시형태에서, 내인성 유전자 자리에서의 대체(예를 들어, 내인성 비인간 MHC II 유전자 자리에서의 대체)는 기능성인 내인성 폴리펩타이드를 발현하지 못하는 유전자 자리를 생성하는 결과를 가져온다. 마찬가지로, 단백질의 기능성 세포외 도메인과 관련하여 본원에서 사용된 "기능성(기능적인)"이라는 말은, 예를 들어 MHC II의 경우 항원에 결합하는 능력, T 세포 보조수용체에 결합하는 능력 등의 기능성을 보유하는 세포외 도메인을 지칭한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 내인성 MHC 유전자 자리에서의 대체는 인간 MHC의 세포외 도메인(예를 들어, 기능성 세포외 도메인)을 발현하지만 내인성 MHC의 세포외 도메인(예를 들어, 기능성 세포외 도메인)을 발현하지 못하는 유전자 자리를 생성하는 결과를 가져온다.
유전적으로 변형된
MHC
II
동물들
다양한 양상에서, 본 발명은 일반적으로 유전체 내에 인간 또는 인간화된 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물들을 제공하므로; 당해 동물들은 인간 또는 인간화된 MHC II 복합체(예를 들어, MHC IIα 및 β 폴리펩타이드)를 발현한다.
MHC 유전자는 3개의 부류인 제I 부류, 제II 부류 및 제III 부류로 분류되는데, 이들 모두는 인간 염색체 6번 또는 마우스 염색체 17번 상에 암호화되어 있다. 인간 및 마우스 MHC 부류의 상대적인 조직화의 개략도는 도 2 및 도 3에 각각 나타나 있다. 대부분의 MHC 유전자는 다형성이며, 실제로 이들은 마우스 및 인간 유전체 중에서 가장 다형성인 유전자들이다. MHC 다형성은 진화상의 이점을 제공하는데 있어서 중요한 것으로 추정되며; 서열의 변화는 더 나은 항원 제시를 허용하는 펩타이드 결합 상에서의 차이를 가져올 수 있다. 한가지 예외는 단형성(monomorphic)인, 인간 HLA-DRα 사슬 및 이의 마우스 동족체 Eα(즉, H-2Ea)이다.
MHC 제II 부류 복합체는 2개의 비공유결합으로 연관된 도메인인 α 사슬 및 β 사슬[본원에서 α 폴리펩타이드 및 β 폴리펩타이드(도 1)로도 지칭됨]을 포함한다. 단백질은 원형질막에 걸쳐 있으므로; 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 함유한다. α 사슬의 세포외 부분은 α1 및 α2 도메인을 포함하며, β 사슬의 세포외 부분은 β1 및 β2 도메인을 포함한다. α1 및 β1 도메인은 세포 표면 상에 펩타이드-결합 간극을 형성한다. MHC II 복합체의 펩타이드-결합 간극의 3차원 구조가 확인됨으로 인해, 결합된 항원의 길이에 있어 이론적으로는 상한선이 없지만, 통상 MHC II에 의해 제시된 펩타이드의 길이는 13개 내지 17개의 아미노산이다.
MHC II 분자의 펩타이드-결합 간극은, 항원성 펩타이드와 상호작용하는 것 이외에, MHC II 복합체 형성 및 펩타이드 취득 공정 동안에 불변 사슬(Ii)과 상호작용한다. α/ β MHC II 이량체는 소포체 내에서 조립되어 Ii 사슬과 결합하는데, 이는 펩타이드 결합의 조절 및 MHC II의 식균작용 경로에 있어서 표적화를 담당하고 있다. 엔도솜에서, Ii는 단백질 분해 과정을 거쳐, Ii의 작은 단편인 제II 부류-관련된 불변 사슬 펩타이드(CLIP)는 펩타이드-결합 간극에 잔존하게 된다. 엔도솜에서, (인간에 있어서) HLA-DM의 제어 하에, CLIP는 항원성 펩타이드로 교환된다.
MHC II는 α2와 β2 도메인 사이의 연결부에 존재하는 소수성 틈새(crevice)에서 T 세포 보조수용체 CD4와 상호작용한다. 문헌 [Wang and Reinherz (2002) Structural Basis of T Cell Recognition of Peptides Bound to MHC Molecules, Molecular Immunology, 38:1039-49]을 참조한다. CD4 및 T 세포 수용체가, 펩타이드와 복합체화된 동일한 MHC II 분자에 결합하는 경우, 항원에 대한 T 세포의 민감도가 증가하여, 활성화를 위한 항원은 100배 덜 필요로 한다. 본원에 참조로 포함되는 문헌[Janeway's Immunobiology, 7th Ed., Murphy et al. eds., Garland Science, 2008]을 참조한다.
MHC II의 막관통 및 세포질 도메인에 대하여 여러 가지 기능들이 제시된 바 있다. 세포질 도메인의 경우, 세포내 신호전달, 원형질막으로의 트래피킹(trafficking) 및 궁극적으로 항원 제시를 위해 중요한 것으로 밝혀져 왔다. 예를 들어, T 세포 하이브리도마는 세포질 도메인에서 절두된(truncated) MHC IIβ 사슬로 형질감염된 항원-제시 세포(APC)에 대한 반응이 형편없어서, B 세포 분화 유도가 저해되고 있음이 밝혀졌다[예를 들어, 문헌 {Smiley et al. (1996) Truncation of the class IIβ-chain cytoplasmic domain influences the level of Class II/invariant chain-derived peptide complexes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:241-44}를 참조한다]. 제II 부류 분자들의 절단(절두)은 cAMP 생산에 위해를 끼치는 것으로 보인다. MHC II의 세포질 꼬리가 결실되면 세포내 트래피킹에 영향을 주게 되므로, 상기 복합체가 식균작용 경로에서 관련 항원들과 맞닥뜨리는 것을 방해하는 것으로 추정되어 왔다. 스밀리(Smiley) 등(상기 참조)은 세포질 도메인에서 제II 부류 분자들의 절단이 CLIP/제II 부류 복합체의 수를 감소시켰음을 입증하여, 이것이 항원 제시를 효과적으로 조절하는 CLIP의 능력에 영향을 미치고 있는 것으로 추정하였다.
MHC II 클러스터화(clustering)는 T 세포 수용체 (TCR) 발동(triggering)을 위해 중요하기 때문에, 만일 세포질 도메인에서 절두된 MHC II 분자들이 세포골격에 결합하여 응집하는 것이 방해받는다면, T 세포에 대한 항원 제시는 영향을 받게될 것이다[문헌 {Ostrand-Rosenberg et al. (1991) Abrogation of Tumorigenicity by MHC Class II Antigen Expression Requires the Cytoplasmic Domain of the Class II Molecule, J. Immunol. 147:2419-22} 참조]. 실제로, 세포질 도메인에서 절두된 HLA-DR은 올리고머화 후 세포골격과 결합하지 못했다는 사실이 최근에 밝혀졌다[문헌 {El Fakhy et al. (2004) Delineation of the HLA-DR Region and the Residues Involved in the Association with the Cytoskeleton, J. Biol. Chem. 279:18472-80} 참조]. 중요한 점은, 액틴 세포골격은 국소 집중화된(localized) 신호 전달 활동 부위로서, 항원을 제시할 수 있다는 것이다. 세포골격과의 결합 이외에, 최근 연구에서는 모든 HLA-DR 분자들 중 20% 이하가 콜레스테롤 및 글리코스핑고리피드에 풍부한 마이크로도메인인 APC의 지질 뗏목(lipid raft)에 구성성분을 이루어 존재하고 있다는 사실과, 이러한 국소 집중화는 항원 제시, 면역 시냅스 형성 및 MHC II-매개된 신호 전달에 중요하다는 사실도 밝혀졌다[예를 들어, 문헌{Dolan et al. (2004) Invariant Chain and the MHC II Cytoplasmic Domains Regulate Localization of MHC Class II Molecules to Lipid Rafts in Tumor Cell-Based Vaccines, J. Immunol. 172:907-14}을 참조한다]. 돌란(Dolan) 등은 MHC II의 세포질 도메인의 절단이 지질 뗏목에 대한 MHC II의 구성적 국소 집중화를 감소시키고 있음을 시사하였다.
또한, MHC II, 특히 β 사슬의 세포질 도메인은 MHC II의 식균작용 트래피킹, 내재화 및 분해를 조절하는 유비퀴틴 리가아제인 막-관련 RING-CH I (MARCH I)에 의한 유비퀴틴화의 대상인 류신 잔기를 함유하며; MARCH-매개된 유비퀴틴화는 수지상 세포 성숙시에 중단되어 원형질막에서의 MHC II의 수준을 증가시킨다는 사실이 밝혀졌다[문헌 {Shin et al. (2006) Surface expression of MHC class II in dendritic cells is controlled by regulated ubiquitination, Nature 444:115-18}; {De Gassart et al. (2008) MHC class II stabilization at the surface of human dendritic cells is the result of maturation-dependent MARCH I down-regulation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:3491-96} 참조].
MHC II α 및 β 사슬의 막관통 도메인은 서로 상호작용하는데, 이러한 상호작용은 제II 부류 MHC 복합체의 적절한 조립에 있어서 중요하다[문헌 {Cosson and Bonifacino (1992) Role of Transmembrane Domain Interactions in the Assembly of Class II MHC Molecules, Nature 258:659-62} 참조]. 실제로, α 및 β 사슬의 막관통 도메인이 IL-2 수용체의 α 사슬에 의해 대체된 MHC II 분자는 ER 내에 보유되어서 세포 표면에서는 거의 검출되지 않았다(상기와 동일한 문헌 참조). 돌연변이유발 연구을 통해, α 및 β 막관통 도메인에서 보존된 Gly 잔기들은 세포 표면에서 MHC II 조립을 담당하는 것으로 밝혀졌다(상기와 동일한 문헌 참조). 따라서, 막관통 및 세포질 도메인은 모두 MHC II 복합체의 적절한 기능에 매우 중요하다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 유전체 내에 인간 또는 인간화된 MHC II 복합체, 예를 들어 인간 또는 인간화된 MHC IIα 및/또는 β 폴리펩타이드(들)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등)을 제공한다. 비인간 동물은 유전체 내에 부분적으로 인간이고 부분적으로는 비인간, 예컨대, 키메라 인간/비인간 MHC II 복합체를 발현하는 비인간 동물(예를 들어, 키메라 인간/비인간 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드를 발현하는 비인간 동물)인 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 한 양상에서, 상기 비인간 동물은 인간 또는 인간화된 MHC II 복합체, 예를 들어 키메라 인간/비인간 MHC II 복합체만을 발현하며, 내인성 MHC II 유전자 자리에서부터 내인성 비인간 MHC II 복합체를 발현하지 않는다. 일부 실시형태에서, 동물은 내인성 MHC II 유전자 자리에서부터 어떠한 내인성 비인간 MHC II 복합체도 발현할 수 없지만, 다만 인간 또는 인간화된 MHC II 복합체만은 발현한다. 다른 실시형태에서, 동물은 기능성인 내인성 마우스 MHC II 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 보유한다. 다양한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 등)은 생식세포 내에 인간 또는 인간화된 MHC II 복합체, 예컨대 인간 또는 인간화된 MHC IIα 및/또는 β 폴리펩타이드(들)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 유전체 내에 예컨대 내인성 비인간 MHC II 유전자 자리에 인간 MHC II 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비인간 동물, 예를 들어 설치류, 예컨대 래트 또는 마우스가 본원에 제공된다. 다른 실시형태에서, 유전체 내에 예컨대 내인성 MHC II 유전자 자리에 키메라 인간/비인간 MHC II 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비인간 동물, 예를 들어 설치류, 예컨대 래트 또는 마우스가 본원에 제공된다. 따라서, 유전체 내에 예컨대 내인성 비인간 MHC II 유전자 자리에 인간 또는 키메라 인간/비인간 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 비인간 동물도 본원에 제공된다.
한 양상에서, 키메라 인간/비인간 MHC II 복합체가 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 키메라 인간/비인간 MHC II 복합체는 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드 및 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드를 포함한다. 한 양상에서, 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 인간 부분 및/또는 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 부분은 각각 인간 MHC IIα 폴리펩타이드 및/또는 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 펩타이드-결합 도메인을 포함한다. 한 양상에서, 키메라 MHC IIα 및/또는 β 폴리펩타이드의 인간 부분은 각각 인간 MHC IIα 및/또는 β 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 α1 도메인을 포함하고; 다른 실시형태에서, 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 α1 및 α2 도메인을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 β1 도메인을 포함하고; 다른 실시형태에서, 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 β1 및 β2 도메인을 포함한다.
본원에 기술된 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드의 인간 부분은 HLA-DP, -DQ 및 -DR 유전자 자리들 중 어떤 것에 의해서도 암호화될 수 있다. 통상적으로 사용된 HLA 항원 및 대립형질의 목록은, 본원에 참고로 포함된 문헌[Shankarkumar et al. (2004) The Human Leukocyte Antigen(HLA) System, Int. J. Hum. Genet. 4(2):91-103]에 기술되어 있다. 샨카르쿠마(Shankarkumar) 등은 또한 해당 업계에서 사용된 HLA 명명법에 대하여 간략한 설명을 제공한다. HLA 명명법 및 다양한 HLA 대립형질들에 관한 추가의 정보는 문헌[Holdsworth et al. (2009) The HLA dictionary 2008: a summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, and DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens, Tissue Antigens 73:95-170] 및 마쉬(Marsh) 등에 의해 최근 (2010) 업데이트된 내용의 문헌[Nomenclature for factors of the HLA system, 2010, Tissue Antigens 75:291-455] (상기 두 문헌은 모두 본원에 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있다. 따라서, 인간 또는 인간화된 MHC II 폴리펩타이드는 본원에 기술된 어떠한 기능성 인간 HLA 분자들로부터 유래할 수 있다.
하나의 구체적인 양상에서, 본원에 기술된 인간화된 MHC II 복합체의 인간 부분은 인간 HLA-DR, 예를 들어 HLA-DR4 또는 HLA-DR2로부터 유래한다. 보통, HLA-DRα 사슬은 단형성인데, 예를 들어 HLA-DR 복합체의 α 사슬은 HLA-DRA 유전자(예를 들어, HLA-DRα*01 유전자)에 의해 암호화된다. 한편, HLA-DRβ 사슬은 다형성이다. 따라서, HLA-DR4는 HLA-DRA 유전자에 의해 암호화된 α 사슬 및 HLA-DRB1 유전자(예를 들어, HLA-DRβ1*04 유전자)에 의해 암호화된 β 사슬을 포함한다. 하기 본원에 기술된 바와 같이, HLA-DR4는 다수의 자가면역질환, 예컨대 류마티스 관절염, 제I형 당뇨병, 다발성 경화증 등의 발병과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. HLA-DR2는 HLA-DRA 유전자에 의해 암호화된 α 사슬 및 HLA-DRB1 유전자(예를 들어, HLA-DRβ1*02 유전자)에 의해 암호화된 β 사슬을 포함한다. HLA-DR2는 다수의 질환, 예컨대 굿파스튜어 증후군(Goodpasture syndrome), 다발성 경화증 등의 발병과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 한 실시형태에서, HLA-DRA 대립형질은 HLA-DRα*01 대립형질, 예컨대 HLA-DRα*01:01:01:01이다. 다른 실시형태에서, HLA-DRB 대립형질은 HLA-DRβ1*04, 예컨대, HLA-DRβ1*04:01:01이다. 다른 실시형태에서, HLA-DRB 대립형질은 HLA-DRβ1*02, 예컨대, HLA-DRβ1*1501이다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, 본원에 기술된 인간화 MHC II 복합체의 인간 부분은 인간 HLA-DQ, 예를 들어 HLA-DQ2 및 HLA-DQ8로부터 유래된다. HLA-DQ2는 HLA-DQA 유전자 (예컨대, HLA-DQα1*05 유전자)에 의해 암호화된 α 사슬을 포함한다. 한 실시형태에서, HLA-DQα1*05 유전자는 HLA-DQα1*0501이다. HLA-DQ2는 HLA-DQB 유전자 (예컨대, HLA-DQβ1*02 유전자)에 의해 암호화된 β 사슬도 포함한다. HLA-DQ8은 HLA-DQA 유전자 (예컨대, HLA-DQα1*0301 유전자)에 의해 암호화된 α 사슬을 포함한다. HLA-DQ8은 HLA-DQB 유전자 (예컨대, HLA-DQβ1*0302 유전자)에 의해 암호화된 β 사슬도 포함한다. HLA-DQ2.5 및 HLA-DQ8 대립형질은 소아 지방변증(Celiac disease) 및 제I형 당뇨병과 같은 질환과 연관이 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 실시예들이 이러한 특정 HLA 서열들을 기술하고는 있지만; 임의의 적절한 HLA-DR 서열 또는 HLA-DQ 서열, 예컨대 인간 개체군에서 나타난 다형성 변이체, 하나 이상의 보존적 또는 비-보존적 아미노산 변형을 지닌 서열, 유전자 코드의 축중성(또는 축퇴성)으로 인하여 본원에 기술된 서열들과는 다른 핵산 서열 등이 본원에 포함된다.
인간화된 MHC II 복합체의 인간 부분은 일반적인 인간 질병들과 관련이 있는 것으로 알려진 HLA 대립형질의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 이러한 HLA 대립형질은, 이에 제한되지는 않지만, HLA-DRB1*0401, -DRB1*0301, -DQA1*0501, -DQB1*0201, -DRB1*1501, -DRB1*1502, -DQB1*0602, -DQA1*0102, -DQA1*0201, -DQB1*0202, -DQA1*0501 및 이들의 조합을 포함한다. HLA 대립형질/질병 관련성의 개요에 대해서는, 참조로 본원에 포함되는 문헌[Bakker et al. (2006) A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC, Nature Genetics 38:1166-72 and Supplementary Information]을 참조한다.
한 양상에서, 키메라 인간/비인간 MHC II 복합체의 비인간 부분은 내인성 비인간(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스, 래트 등) MHC II 복합체의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함한다. 따라서, 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 비인간 부분은 내인성 비인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 비인간 부분은 내인성 비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 한 양상에서, 동물은 마우스이고, 키메라 α 및 β 폴리펩타이드의 비인간 부분은 마우스 H-2E 단백질로부터 유래된다. 따라서, 키메라 α 및 β 폴리펩타이드의 비인간 부분은 마우스 H-2E 단백질로부터 유래된 막관통 및 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 다른 양상에서, 동물은 마우스이고, 키메라 α 및 β 폴리펩타이드의 비인간 부분은 마우스 H-2A 단백질로부터 유래한다. 따라서, 키메라 α 및 β 폴리펩타이드의 비인간 부분은 마우스 H-2A 단백질로부터 유래한 막관통 및 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 비록 특정 서열인 H-2E 및 H-2A 서열만을 실시예에서 고려하고 있지만, 임의의 적합한 서열, 예를 들어 다형성 변이체, 보존적/비-보존적 아미노산 치환 등도 본원에 포함된다.
본 발명의 다양한 양상에서, 키메라 인간/비인간 MHC II 복합체를 암호화하는 서열(들)은 내인성 비인간 MHC II 유전자 자리(예를 들어, 마우스 H-2A 및/또는 H-2E 유전자 자리)에 위치한다. 한 실시형태에서, 이는 결과적으로 내인성 MHC II 유전자(들) 또는 이들 부위의, 인간 또는 인간화된 MHC II 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들), 예를 들어 본원에 기술된 키메라 인간/비인간 MHC II 단백질을 암호화하는 키메라 유전자로의 대체를 야기한다. MHC IIα 및 β 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 염색체 상에서 서로 근접하게 위치하므로, 대체는 두 유전자를 독립적으로 표적화하거나 혹은 아울러 표적화하도록 설계될 수 있으며; 이러한 가능한 경우들이 모두 본원에 포함된다. 한 실시형태에서, 상기 대체는 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드를 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열의, 키메라 인간/비인간 MHC α 폴리펩타이드 및 키메라 인간/비인간 MHC β 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로의 대체를 포함한다. 한 양상에서, 상기 대체는 하나 이상(예를 들어, 2개)의 내인성 MHC II 유전자를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 대체함을 포함한다. 따라서, 비인간 동물은 내인성 MHC II 유전자 자리에 키메라 인간/비인간 뉴클레오타이드 서열을 함유하여, 내인성 비인간 유전자 자리에서부터 키메라 인간/비인간 MHC II 단백질을 발현한다.
따라서, 내인성 MHC II 유전자 자리에 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비인간 동물이 본원에 제공되는데, 이때 상기 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC IIα 세포외 도메인을 포함하고, 상기 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC IIβ 세포외 도메인을 포함하며, 이때 상기 키메라 인간/비인간 MHC IIα 및 MHC IIβ 폴리펩타이드는 세포의 표면 상에 기능성 MHC II 복합체를 형성한다.
키메라 인간/비인간 폴리펩타이드는 인간 또는 비인간 리더(신호) 서열을 포함하도록 할 수 있다. 한 실시형태에서, 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드는 내인성 MHC IIα 폴리펩타이드의 비인간 리더 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드는 내인성 MHC IIβ 폴리펩타이드의 비인간 리더 서열을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 키메라 MHC IIα 및/또는 MHC IIβ 폴리펩타이드는 다른 비인간 동물, 예를 들어, 다른 설치류 또는 다른 마우스 균주로부터 MHC IIα 및/또는 MHC IIβ 폴리펩타이드의 비인간 리더 서열을 각각 포함한다. 따라서, 키메라 MHC IIα 및/또는 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 비인간 MHC IIα 및/또는 MHC IIβ 리더 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 각각 작동가능하게 연결될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 MHC IIα 및/또는 MHC IIβ 폴리펩타이드는 인간 MHC IIα 및/또는 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 리더 서열을 각각 포함한다. 한 실시형태에서, 인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 인간 리더 서열은 인간 HLA-DRA의 리더 서열이고, 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 리더 서열은 인간 HLA-DRβ1*04의 리더 서열이다. 다른 실시형태에서, 인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 인간 리더 서열은 인간 HLA-DRA의 리더 서열이고, 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 리더 서열은 인간 HLA-DRβ1*02의 리더 서열이다. 또 다른 실시형태에서, 인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 인간 리더 서열은 인간 HLA-DQα1*05의 리더 서열이고, 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 리더 서열은 인간 HLA-DQβ1*02의 리더 서열이다. 또 다른 실시형태에서, 인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 인간 리더 서열은 인간 HLA-DQα1*0301의 리더 서열이고, 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 리더 서열은 인간 HLA-DQβ1*0302의 리더 서열이다.
키메라 인간/비인간 MHC IIα 및/또는 MHC IIβ 폴리펩타이드는 이의 인간 부분 내에 인간 MHC IIα 및/또는 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 완전하거나 또는 실질적으로 완전한 세포외 도메인을 각각 포함할 수 있다. 따라서, 인간 부분은 인간 MHC IIα 및/또는 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 아미노산을 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 예컨대 95% 이상으로 포함할 수 있다. 한 실시예에서, 인간 MHC IIα 및/또는 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 실질적으로 완전한 세포외 도메인은 인간 리더 서열이 결여되어 있다. 다른 실시예에서, 키메라 인간/비인간 MHC IIα 및/또는 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드는 인간 리더 서열을 포함한다.
더욱이, 키메라 MHC IIα 및/또는 MHC IIβ 폴리펩타이드는 내인성 비인간 프로모터 및 조절요소들, 예컨대 마우스 MHC IIα 및/또는 MHC IIβ 조절요소들에 각각 작동가능하게 연결될 수 있다(예를 들어, 이들 각각의 제어 하에서 발현될 수 있다). 이러한 배열은 비인간 동물의 키메라 MHC II 폴리펩타이드의 (예를 들어, 비인간 동물에서 면역 반응 동안에) 적절한 발현을 촉진할 것이다.
유전적으로 변형된 비인간 동물은 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 소(예를 들어, 암소, 황소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 흰담비, 영장류[예를 들어, 마모셋(marmoset), 레서스 원숭이(rhesus monkey)]로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 유전적으로 변형할 수 있는 적절한 ES 세포를 바로 이용할 수 없는 비인간 동물의 경우에는, 다른 방법들을 사용하여 유전적 변형을 포함하는 비인간 동물을 제조한다. 이러한 방법들은 예를 들어, 비-ES 세포 유전체(예를 들어, 섬유아세포 또는 유도 만능 세포)을 변형시켜 핵이입(nuclear transfer) 기술을 사용하여 변형된 유전체를 적합한 세포, 예컨대 난모세포로 이입시키는 단계, 및 상기 변형된 세포(예를 들어, 변형된 난모세포)를 적절한 조건 하에 비인간 동물 내에서 잉태시켜 배아를 형성시키는 단계를 포함한다.
한 양상에서, 비인간 동물은 포유동물이다. 한 양상에서, 비인간 동물은 예를 들어 뛰는쥐상과(Dipodoidea) 또는 쥐상과(Muroidea)의 작은 포유동물이다. 한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 동물은 설치류이다. 한 실시형태에서, 상기 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터 중에서 선택된다. 한 실시형태에서, 상기 설치류는 쥐상과로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 동물은 칼로미스쿠스과(Calomyscidae)(예컨대, 마우스-유사 햄스터), 비단털쥐과(Cricetidae)(예를 들어, 햄스터, 뉴월드 래트 및 마우스, 들쥐), 쥐과(Muridae)[진정한 마우스 및 래트, 게르빌루스쥐, 고슴도치, 갈기쥐(crested rats)], 붉은숲쥐과(Nesomyidae)[클라이밍(climbing) 마우스, 록(rock) 마우스, 꼬리가 있는(with-tailed) 래트, 마다가스카르 래트 및 마우스], 가시겨울잠쥐과(Platacanthomyidae)[예를 들어, 가시겨울잠쥐(spiny dormice)] 및 소경쥐과(Spalacidae)[예를 들어, 뒤쥐, 대나무쥐 및 조커(zokor)] 중에서 선택된 부류로부터 유래한다. 구체적인 실시형태에서, 유전적으로 변형된 설치류는 진정한 마우스 또는 래트(쥐과), 게르빌루스쥐, 가시겨울잠쥐 및 갈기쥐로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 마우스는 쥐과 부류의 구성원으로부터 유래한다. 한 실시형태에서, 동물은 설치류이다. 구체적인 실시형태에서, 설치류는 마우스 및 래트로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 비인간 동물은 마우스이다.
구체적인 실시형태에서, 비인간 동물은 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C57BL 균주의 마우스인 설치류이다. 다른 실시형태에서, 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예를 들어, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 균주로 이루어진 그룹으로부터 선택된 129 균주이다[예를 들어, 문헌{Festing et al . (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836}을 참조하고, 문헌{Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines}도 참조한다]. 구체적인 실시형태에서, 유전적으로 변형된 마우스는 전술한 129 균주와 전술한 C57BL/6 균주의 혼합 균주이다. 구체적인 실시형태에서, 마우스는 전술된 129 균주들의 혼합 균주, 또는 전술된 BL/6 균주들의 혼합 균주이다. 구체적인 실시형태에서, 상기 혼합 균주의 129 균주는 129S6(129/SvEvTac) 균주이다. 다른 실시형태에서, 마우스는 BALB 균주, 예를 들어 BALB/c 균주이다. 또 다른 실시형태에서, 마우스는 BALB 균주와 다른 전술된 균주의 혼합 균주이다.
한 실시형태에서, 비인간 동물은 래트이다. 한 실시형태에서, 래트는 위스타 래트(Wistar rat) 균주, LEA 균주, 스프라그 다울리(Sprague Dawley) 균주, 피셔(Fischer) 균주, F344, F6 및 다크 아구티(Dark Agouti) 균주 중에서 선택된다. 한 실시형태에서, 래트 균주는 위스타, LEA, 스프라그 다울리, 피셔, F344, F6 및 다크 아구티로 이루어진 그룹 중에서 선택된 2개 이상의 균주들의 혼합 균주이다.
따라서, 한 실시형태에서, 본 발명은 유전체 내에 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체, 예를 들어 키메라 인간/마우스 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC IIα 펩타이드 결합 또는 세포외 도메인을 포함하고, 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC IIβ 펩타이드 결합 또는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 마우스는 내인성 마우스 유전자 자리(예를 들어, H-2A 및/또는 H-2E 유전자 자리)에서부터 내인성 마우스 α 및/또는 β 폴리펩타이드의 펩타이드 결합 또는 세포외 도메인을 발현하지 않는다. 일부 실시형태에서, 마우스는 내인성 마우스 MHC II 유전자 자리에서부터 내인성 마우스 MHC II 폴리펩타이드의 기능성 펩타이드 결합 또는 세포외 도메인을 발현하지 않는다. 일부 실시형태에서, 마우스는 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, H-2Ea 및 이의 조합을 포함하는 기능성 MHC 제II 부류 분자를 암호화하는 유전자를 결여하고 있는 유전체를 포함한다. 인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 펩타이드-결합 도메인은 α1 도메인을 포함할 수 있고, 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 펩타이드-결합 도메인은 β1 도메인을 포함할 수 있으므로; 키메라 MHC II 복합체의 펩타이드-결합 도메인은 인간 α1 및 β1 도메인을 포함할 수 있다. 인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 세포외 도메인은 α1 및 α2 도메인을 포함할 수 있고, 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인은 β1 및 β2 도메인을 포함할 수 있으므로; 키메라 MHC II 복합체의 세포외 도메인은 인간 α1, α2, β1 및 β2 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 키메라 MHC II 복합체의 마우스 부분은 마우스 MHC II, 예를 들어 마우스 H-2E 또는 H-2A의 막관통 및 세포질 도메인(예를 들어, 마우스 H-2Eα 및 β 사슬 또는 마우스 H-2Aα 및 β 사슬의 막관통 및 세포질 도메인)을 포함한다.
따라서, 한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되는데, 이때 당해 마우스는 내인성 마우스 MHC II 유전자 자리에 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 HLA-DR4 단백질의 α 폴리펩타이드로부터 유래한 세포외 도메인을 포함하고, 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 HLA-DR4 단백질의 β 폴리펩타이드로부터 유래한 세포외 도메인을 포함하며, 여기서 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 H-2Eα 사슬의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고, 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 H-2Eβ 사슬의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며, 이때 상기 마우스는 기능성인 키메라 HLA-DR4/H-2E MHC II 복합체를 발현한다. 한 실시형태에서 키메라 HLA-DR4/H-2E MHC II 복합체는 HLA-DR4 단백질 (HLA-DRAα1 및 α2 도메인)로부터 유래한 세포외 도메인 (예를 들어, α1 및 α2 도메인) 및 마우스 H-2Eα 사슬 유래의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 MHC IIα 사슬뿐만 아니라, HLA-DR4 (HLA-DRβ1*04β1 및 β2 도메인)로부터 유래한 세포외 도메인 (예를 들어, β1 및 β2 도메인) 및 마우스 H-2Eβ 사슬로부터 유래한 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 MHC IIβ 사슬도 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되는데, 이때 당해 마우스는 내인성 마우스 MHC II 유전자 자리에 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 HLA-DR2 단백질의 α 폴리펩타이드로부터 유래한 세포외 도메인을 포함하고, 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 HLA-DR2 단백질의 β 폴리펩타이드로부터 유래한 세포외 도메인을 포함하며, 여기서 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 H-2Eα 사슬의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고, 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 H-2Eβ 사슬의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며, 이때 상기 마우스는 기능성인 키메라 HLA-DR2/H-2E MHC II 복합체를 발현한다. 한 실시형태에서 키메라 HLA-DR2/H-2E MHC II 복합체는 HLA-DR2 단백질 (HLA-DRAα1 및 α2 도메인)로부터 유래한 세포외 도메인 (예를 들어, α1 및 α2 도메인) 및 마우스 H-2Eα 사슬 유래의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 MHC IIα 사슬뿐만 아니라, HLA-DR2 (HLA-DRβ1*02β1 및 β2 도메인)로부터 유래한 세포외 도메인 (예를 들어, β1 및 β2 도메인) 및 마우스 H-2Eβ 사슬로부터 유래한 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 MHC IIβ 사슬도 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되는데, 이때 당해 마우스는 내인성 마우스 MHC II 유전자 자리에 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 HLA-DQ2 단백질의 α 폴리펩타이드로부터 유래한 세포외 도메인을 포함하고, 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 HLA-DQ2 단백질의 β 폴리펩타이드로부터 유래한 세포외 도메인을 포함하며, 여기서 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 H-2Aα 사슬의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고, 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 H-2Aβ 사슬의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며, 이때 상기 마우스는 기능성인 키메라 HLA-DQ2/H-2A MHC II 복합체를 발현한다. 한 실시형태에서 키메라 HLA-DQ2/H-2A MHC II 복합체는 HLA-DQ2 단백질 (HLA-DQα1*05α1 및 α2 도메인)로부터 유래한 세포외 도메인 (예를 들어, α1 및 α2 도메인) 및 마우스 H-2Aα 사슬 유래의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 MHC IIα 사슬뿐만 아니라, HLA-DQ2 (HLA-DQβ1*02β1 및 β2 도메인)로부터 유래한 세포외 도메인 (예를 들어, β1 및 β2 도메인) 및 마우스 H-2Aβ 사슬로부터 유래한 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 MHC IIβ 사슬도 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되는데, 이때 당해 마우스는 내인성 마우스 MHC II 유전자 자리에 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 HLA-DQ8 단백질의 α 폴리펩타이드로부터 유래한 세포외 도메인을 포함하고, 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 HLA-DQ8 단백질의 β 폴리펩타이드로부터 유래한 세포외 도메인을 포함하며, 여기서 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 H-2Aα 사슬의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고, 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 H-2Aβ 사슬의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며, 이때 상기 마우스는 기능성인 키메라 HLA-DQ8/H-2A MHC II 복합체를 발현한다. 한 실시형태에서 키메라 HLA-DQ8/H-2A MHC II 복합체는 HLA-DQ8 단백질 (HLA-DQα1*0301α1 및 α2 도메인)로부터 유래한 세포외 도메인 (예를 들어, α1 및 α2 도메인) 및 마우스 H-2Aα 사슬 유래의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 MHC IIα 사슬뿐만 아니라, HLA-DQ8 (HLA-DQβ1*0302β1 및 β2 도메인)로부터 유래한 세포외 도메인 (예를 들어, β1 및 β2 도메인) 및 마우스 H-2Aβ 사슬로부터 유래한 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 MHC IIβ 사슬도 포함한다.
한 양상에서, 마우스는 이들의 내인성 마우스 유전자 자리에서부터 기능성인 내인성 H-2A 및 H-2E 폴리펩타이드를 발현하지 않는다(예를 들어, 마우스는 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 및 H-2Ea 폴리펩타이드를 발현하지 않는다). 다양한 실시형태에서, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 각각의 내인성 마우스 프로모터와 조절요소들의 제어 하에 존재한다 (예를 들어, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 프로모터 및 조절요소들에 작동가능하게 연결된다). 본 발명의 다양한 실시형태들에 있어서, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 동일한 염색체 상에 위치한다. 일부 양상들에서, 마우스는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 키메라 MHC II 유전자 자리의 2개의 복제본을 포함하는 반면, 다른 양상에 있어서는, 마우스는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 MHC II 유전자 자리의 1개의 복제본을 포함한다. 따라서, 당해 마우스는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 키메라 MHC II 유전자 자리에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 마우스의 생식 세포 계열에 포함되어 있다.
본원에 기술된 일부 실시형태에서, 내인성 마우스 MHC II 유전자 자리에, 예컨대 내인성 마우스 H-2A 및 H-2E 유전자의 대체를 통해, 키메라 MHC II 유전자 자리를 포함하는 마우스가 제공된다. 일부 양상들에서, 키메라 유전자 자리는 인간 HLA-DRA의 세포외 도메인과 마우스 H-2Eα 사슬의 막관통 및 세포질 도메인뿐만 아니라, 인간 HLA-DRβ1*04 또는 HLA-DRβ1*02의 세포외 도메인과 마우스 H-2Eβ 사슬의 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 양상들에서, 키메라 유전자 자리는 인간 HLA-DQα1*05 또는 HLA-DQα1*0301의 세포외 도메인과 마우스 H-2Aα 사슬의 막관통 및 세포질 도메인뿐만 아니라, 인간 HLA-DQβ1*02 또는 HLA-DQβ1*0302의 세포외 도메인과 마우스 H-2Aβ 사슬의 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 키메라 유전자 자리의 여러 도메인들은, 당해 유전자 자리가 기능성인 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 발현하는 방식으로 연결된다.
다양한 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 키메라 MHC II 유전자 자리에서부터 기능성인 키메라 MHC II 단백질을 발현하는 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트)은 세포 표면 상에 키메라 단백질을 제시한다. 한 실시형태에서, 비인간 동물은 인간에서 관찰된 바와 동일한 세포 분포로 세포 표면 상에 키메라 MHC II 단백질을 발현한다. 한 양상에서, 세포는 키메라 MHC II 단백질의 세포외 부분(예를 들어, 인간 HLA-DR4, -DR2, -DQ2 또는 -DQ8 세포외 부분)에 결합된 펩타이드 단편(항원 단편)을 제시한다.
다양한 실시형태에서, 키메라 MHC II 단백질(예를 들어, HLA-DR4/H-2E, HLA-DR2/H-2E, HLA-DQ2/H-2A 또는 HLA-DQ8/H-2A 단백질)을 제시하는 세포는 항원-제시 세포(APC), 예컨대 대식세포, 수지상 세포 또는 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질에 의해 제시된 펩타이드 단편은 종양으로부터 유래한다. 다른 실시형태에서, 키메라 MHC II 단백질에 의해 제시된 펩타이드 단편은 병원체, 예를 들어 세균, 바이러스 또는 기생충으로부터 유래한다.
본원에 기술된 키메라 MHC II 단백질은 동일한 세포 또는 제2의 세포의 표면 상에서 다른 단백질들과 상호작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 MHC II 단백질은 상기 세포의 표면 상에서 내인성 비인간 단백질들과 상호작용한다. 키메라 MHC II 단백질도 동일한 세포 또는 제2의 세포의 표면 상에서 인간 또는 인간화된 단백질들과 상호작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2의 세포는 T 세포이며, 키메라 MHC II 단백질은 T 세포 수용체(TCR) 및 이의 보조수용체인 CD4와 상호작용한다. 일부 실시형태에서, T 세포는 내인성 마우스 T 세포이다. 다른 실시형태에서, T 세포는 인간 T 세포이다. 일부 실시형태에서, TCR은 인간 또는 인간화된 TCR이다. 추가의 실시형태에서, CD4는 인간 또는 인간화된 CD4이다. 다른 실시형태에서, TCR 및 CD4 중 하나 또는 양자 모두는 비인간, 예를 들어 마우스 또는 래트이다.
한 실시형태에서, 키메라 MHC II 유전자가 결여되어 있는 야생형 동물보다 더 빠른 속도로 종양을 진행시키지 않는, 본원에 기술된 바와 같은 유전적으로 변형된 비인간 동물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 동물은 혈액성 악성종양(혈액암), 예컨대 각종 T 및 B 세포 림프종, 백혈병, 복합 림프종(예를 들어, 호지킨 림프종)을 야생형 동물보다 더 빠른 속도로 진행시키기 않는다.
유전자 조작된 비인간 동물 이외에도, 비인간 배아(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트 배아)도 제공되는데, 이때 배아는 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트)로부터 유래한 ES 공여 세포를 포함한다. 한 양상에서, 배아는 키메라 MHC II 유전자 및 숙주 배아 세포을 포함하는 ES 공여 세포를 포함한다.
또한, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트)로부터 유래하며, 키메라 MHC II 단백질(예를 들어, HLA-DR4/H-2E, HLA-DR2/H-2E, HLA-DQ2/H-2A 또는 HLA-DQ8/H-2A 단백질)을 발현하는 조직도 제공된다.
게다가, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물로부터 분리된 비인간 세포도 제공된다. 한 실시형태에서, 세포는 ES 세포이다. 한 실시형태에서, 세포는 항원-제시 세포, 예컨대 수지상 세포, 대식세포, B 세포이다. 한 실시형태에서, 세포는 면역 세포이다. 한 실시형태에서, 면역 세포는 림프구이다.
또한, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 염색체 또는 이의 단편을 포함하는 비인간 세포도 제공된다. 한 실시형태에서, 비인간 세포는 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 핵을 포함한다. 한 실시형태에서, 비인간 세포는 핵이입의 결과로서 염색체 또는 이의 단편을 포함한다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 키메라 MHC II 단백질(예를 들어, HLA-DR4/H-2E, HLA-DR2/H-2E, HLA-DQ2/H-2A 또는 HLA-DQ8/H-2A 단백질)을 암호화하는 유전자를 포함하는 비인간 유도 만능 세포가 제공된다. 한 실시형태에서, 유도 만능 세포는 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물로부터 유래한다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 세포로부터 유래한 하이브리도마 또는 쿼드로마(quadroma)가 제공된다. 한 실시형태에서, 비인간 동물은 마우스 또는 래트이다.
한 양상에서, 결합된 펩타이드를 포함하여 키메라 인간/설치류 MHC II/펩타이드 복합체를 형성하는 키메라 인간/설치류 MHC II 표면 단백질을 함유하는 제1 세포, 및 상기 키메라 인간/설치류 MHC II/펩타이드 복합체에 결합하는 제2 세포를 포함하는 시험관 내 제제가 제공된다. 한 실시형태에서, 제2 세포는 인간 또는 인간화된 T-세포 수용체를 포함하고, 한 실시형태에서는 인간 또는 인간화된 CD4를 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 제2 세포는 인간 또는 인간화된 T-세포 수용체 및 인간 또는 인간화된 CD4 단백질을 포함하는 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트) 세포이다. 한 실시형태에서, 제2 세포는 인간 세포이다.
또한, 본원에 기술된 유전자 조작된 비인간 동물(예를 들어, 유전자 조작된 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트)을 제조하는 방법이 제공된다. 유전자 조작된 비인간 동물을 제조하는 방법은, 유전체가 키메라 MHC II 단백질(예를 들어, 키메라 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 동물을 생성한다. 한 실시형태에서, 당해 방법은 유전자 조작된 마우스를 생성하는데, 이의 유전체는 내인성 MHC II 유전자 자리에 키메라 인간/마우스 MHC II 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이때 상기 키메라 MHC II 단백질의 인간 부분은 인간 HLA-DR4 또는 HLA-DR2의 세포외 도메인을 포함하고, 마우스 부분은 마우스 H-2E의 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 당해 방법은 유전자 조작된 마우스를 생성하는데, 이의 유전체는 내인성 MHC II 유전자 자리에 키메라 인간/마우스 MHC II 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이때 상기 키메라 MHC II 단백질의 인간 부분은 인간 HLA-DQ2 또는 HLA-DQ8의 세포외 도메인을 포함하고, 마우스 부분은 마우스 H-2A의 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 VELOCIGENE® 기법을 사용하여 제조한 표적화 작제물을 이용하고, 당해 작제물을 ES 세포 내로 도입시키고, 표적화된 ES 세포 클론을 실시예에서 기술된 바와 같은 VELOCIMOUSE® 기법을 사용하여 마우스 배아 내로 도입시킨다. 한 실시형태에서, ES 세포는 129 및 C57BL/6 마우스 균주들의 혼합 균주이고; 한 실시형태에서, ES 세포들은 BALB/c 및 129 마우스 균주들의 혼합 균주이다.
또한, 본원에 기술된 유전자 조작된 비인간 동물을 생성하는데 사용된 뉴클레오타이드 작제물도 제공된다. 한 양상에서, 뉴클레오타이드 작제물은 5' 및 3' 비인간 상동성 아암, 인간 HLA-DRα 및 β 사슬 서열을 포함하는 DNA 단편 및 재조합 부위들에 의해 측접(flanking)된 선별 카세트를 포함한다. 한 실시형태에서, 인간 HLA-DRα 및 β 사슬 서열은 인간 HLA-DRα 및 β 사슬 유전자의 인트론 및 엑손을 포함하는 유전체 서열이다. 한 실시형태에서, 비인간 상동성 아암은 비인간 MHC II 유전체 서열에 대해 상동성이다.
한 실시형태에서, 인간 HLA-DRα 사슬 서열은 α1 및 α2 도메인 암호화 서열을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 이는 5'에서부터 3'까지 α1 엑손(엑손 2), α1/α2 인트론(인트론 2) 및 α2 엑손(엑손 3)을 포함한다. 한 실시형태에서, 인간 HLA-DR β 사슬 서열은 β1 및 β2 도메인 암호화 서열을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 이는 5'에서부터 3'까지 β1 엑손(엑손 2), β1/β2 인트론(인트론 2) 및 β2 엑손(엑손 3)을 포함한다.
유사하게, 본원에서는 인간 HLA-DQ α 및 β 사슬 서열 (예를 들어, 인간 HLA-DQ α1 및 α2 도메인 암호화 서열 및 인간 HLA-DQ β1 및 β2 도메인 암호화 서열)을 포함하는 유전자 조작된 비인간 동물을 제조하기 위한 뉴클레오타이드 작제물도 제공된다. 이러한 작제물의 구체적인 실시형태는 도 10에 나타나 있다.
선별 카세트는, 관심 대상 작제물이 통합된 세포(예를 들어, ES 세포)의 선별을 용이하게 하기 위해 표적화 작제물 내로 삽입된 뉴클레오타이드 서열이다. 다수의 적합한 선별 카세트들이 해당 업계에 공지되어 있다. 보통, 선별 카세트는 특정 항생제(예를 들어, Neo, Hyg, Pur, CM, SPEC 등)의 존재 하에서 양성 선택이 가능하게 해준다. 또한, 선별 카세트는 재조합 부위들에 의해 측접될 수 있는데, 이로써 선별 카세트는 재조합 효소를 사용하여 처리시 결실될 수 있다. 흔히 사용되는 재조합 부위는 각각 Cre 및 Flp 효소에 의해 인지되는 loxP 및 Frt이지만, 기타의 것들도 해당 업계에 공지되어 있다. 선별 카세트는 암호화 영역 외부의 작제물 내 어느 곳에도 위치할 수 있다. 한 실시형태에서, 선별 카세트는 β 사슬 인트론, 예컨대 β2/막관통 도메인 인트론(인트론 3) 내에 위치한다.
한 실시형태에서, 5' 및 3' 상동성 아암은 내인성 비인간 MHC II 유전자 자리의 5' 및 3' 위치에서 유전체 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 5' 상동성 아암은 H-2Ab1 유전자 상부의 유전자 서열을 포함하고, 3' 상동성 아암은 마우스 H-2Ea 유전자 하부의 유전체 서열을 포함한다. 당해 실시형태에서, 작제물은 마우스 H-2E 및 H-2A 유전자 양자 모두의 대체를 허용한다.
따라서, 한 양상에서, 5'에서부터 3'까지 마우스 H-2Ab1 유전자 상부의 마우스 유전체 서열을 함유하는 5' 상동성 아암, 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 사슬을 암호화하는 서열을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 키메라 인간/마우스 MHC IIα 사슬을 암호화하는 서열을 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 마우스 H-2Ea 유전자 상부의 마우스 유전체 서열을 함유하는 3' 상동성 아암을 포함하는 뉴클레오타이드 작제물이 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 사슬을 암호화하는 서열을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열은 인간 β1 엑손, β1/β2 인트론, β2 엑손, 인간 β2 엑손 서열과 마우스 막관통 도메인 엑손의 서열 사이의 인트론 영역 내에 삽입된 재조합 부위들에 의해 측접된 선별 카세트를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 키메라 인간/마우스 MHC IIα 사슬을 암호화하는 서열을 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열은 인간 α1 엑손, α1/α2 인트론 및 인간 α2 엑손을 포함한다. 본 발명의 예시적인 작제물은 도 5 및 10에 나타나 있다.
유전자 표적화를 완료하면, ES 세포 또는 유전적으로 변형된 비인간 동물을 스크리닝하여 관심 대상의 외인성 뉴클레오타이드 서열의 성공적인 혼입 또는 외인성 폴리펩타이드의 발현을 확인한다. 다수의 기법들이 해당 업계의 숙련자들에게 공지되어 있는데, 이에 제한되지는 않지만, 서던 블롯팅, 장사슬(long) PCR, 정량적 PCT(예를 들어, TAQMAN®을 사용한 실시간 PCR), 형광 동소 보합법(fluorescence in situ Hybridization), 노던 블롯팅, 유동 세포분석, 웨스턴 분석, 면역세포화학, 면역조직화학 등을 포함한다. 한 실시예에서, 관심 대상의 유전적 변형을 보유한 비인간 동물(예를 들어, 마우스)은 문헌[Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659]에 기술된 대립형질 검정을 변형시켜 사용해 마우스 대립형질의 손실 및/또는 인간 대립형질의 획득에 대하여 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 유전적으로 변형된 동물들에서 특정 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 확인하는 다른 검정들은 해당 업계의 숙련자들에게 공지되어 있다.
또한, 본 개시는 비인간 동물의 MHC II 유전자 자리를 변형시켜 본원에 기술된 키메라 인간/비인간 MHC II 복합체를 발현시키는 방법도 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 내인성 마우스 MHC II 유전자 자리에 마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시킴을 포함하는, 마우스의 MHC II 유전자 자리를 변형시켜 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 발현시키는 방법을 제공한다. 구체적인 양상에서, 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 MHC IIα 사슬(예를 들어, HLA-DR 또는 -DQα 사슬)의 세포외 도메인 및 마우스 MHC IIα 사슬(예를 들어, H-2E 또는 H-2Aα 사슬)의 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열과, 인간 MHC IIβ 사슬(예를 들어, HLA-DR 또는 -DQβ 사슬)의 세포외 도메인 및 마우스 MHC IIβ 사슬(예를 들어, H-2E 또는 H-2Aβ 사슬, 예컨대 H-2Eb1 또는 H-2Ab1 사슬 각각)의 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 마우스 MHC II 유전자 자리는 키메라 HLA-DR4/H-2E 단백질을 발현한다. 다른 실시형태에서, 변형된 마우스 MHC II 유전자 자리는 키메라 HLA-DR2/H-2E 단백질, 키메라 HLA-DQ2/H-2A 단백질 또는 키메라 HLA-DQ8/H-2A 단백질을 발현한다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 뉴클레오타이드 작제물에서부터 키메라 인간/비인간 MHC II 단백질 (예를 들어, HLA-DR4/H-2E, HLA-DR2/H-2E, HLA-DQ2/H-2A 또는 HLA-DQ8/H-2A 단백질)을 단일 세포 내에서 발현시킴을 포함하는, 키메라 인간 HLA 제II 부류/비인간 MHC 제II 부류 분자를 제조하는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 뉴클레오타이드 작제물은 바이러스 벡터이고; 구체적인 실시형태에서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 한 실시형태에서, 세포는 CHO, COS, 293, HeLa 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포(예를 들어, PERC.6TM 세포) 중에서 선택된다.
한 양상에서, 키메라 HLA-DR4/H-2E, HLA-DR2/H-2E, HLA-DQ2/H-2A 또는 HLA-DQ8/H-2A 단백질을 발현하는 세포가 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 세포는 본원에 기술된 바와 같은 키메라 MHC 제II 부류 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 세포는 CHO, COS, 293, HeLa 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포(예를 들어, PERC.6TM 세포) 중에서 선택된다.
본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물에 의해 제조된 키메라 MHC 제II 부류 분자도 제공되는데, 이때 키메라 MHC 제II 부류 분자는 인간 MHC II 단백질, 예를 들어 HLA-DR4, HLA-DR2, HLA-DQ2 또는 HLA-DQ8 단백질의 α1, α2, β1 및 β2 도메인 및 비인간 MHC II 단백질, 예를 들어 마우스 H-2E 또는 H-2A 단백질의 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 본원에 기술된 HLA-DR4 또는 HLA-DR2의 세포외 도메인을 포함하는 키메라 MHC II 복합체는 항-HLA-DR 항체에 의해 검출될 수 있다. 본원에 기술된 HLA-DQ2 또는 HLA-DQ8의 세포외 도메인을 포함하는 키메라 MHC II 복합체는 항-HLA-DQ 항체에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 키메라 인간/비인간 MHC II 폴리펩타이드를 제시하는 세포는 항-HLA-DR 또는 항-HLA-DQ 항체를 사용하여 검출하고/하거나 선별할 수 있다.
비록 후속되는 실시예가, 유전체가 마우스 H-2A 및 H-2E 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 인간/마우스 HLA-DR4/H-2E, HLA-DR2/H-2E, HLA-DQ2/H-2A 또는 HLA-DQ8/H-2A 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체함을 포함하는 유전자 조작된 동물을 기술하고는 있지만, 해당 업계의 숙련자라면 누구나 유사한 전략을 사용하여 다른 인간 MHC II 유전자들(다른 HLA-DP, HLA-DQ 및 HLA-DP 유전자)을 포함하는 키메라들을 도입시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 또한, 다수의 인간화된 MHC II 분자(예를 들어, 키메라 HLA-DR/H-2E 및 HLA-DQ/H-2A)의 도입도 제공된다.
다수의 MHC II 유전자 자리에서의 대체가 제공된다. 따라서, 본원에서는 내인성 MHC II 유전자 자리에 키메라 인간/비인간 (예를 들어, 인간/설치류, 예컨대 인간/마우스) MHC II 복합체(들)을 암호화하는 뉴클레오타이드(들)을 1개 이상, 예컨대 1개, 2개, 3개 또는 4개 포함하는 비인간 동물, 예를 들어 설치류, 예컨대 마우스도 제공된다. 한 예에서, 두 마우스의 17번 자매 염색체는 각각 H-2A 및 H-2E 유전자를 포함하는 MHC II 유전자 자리를 함유하므로; 한 양상에서, 각각의 자매 염색체는 그들의 내인성 유전체 위치에서 2개 이하의 키메라 인간/마우스 복합체를 암호화할 수 있다. 따라서, 한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물, 예를 들어 마우스는 그들의 내인성 MHC 유전자 자리에서 4개 이하의 키메라 인간/비인간, 예컨대 인간/마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 4개 이하의 서로 다른 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, 내인성 MHC II 유전자 자리에 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체(들)을 암호화하는 뉴클레오타이드(들)을 1개 이상, 예컨대, 1개, 2개, 3개 또는 4개 포함하는 마우스가 제공되는데, 이때 상기 MHC II 복합체의 인간 부분은 인간 MHC II 복합체의 세포외 도메인 (즉, 인간 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드)을 포함하고, 여기서 키메라 MHC II 복합체의 마우스 부분은 마우스 MHC II 복합체의 막관통 및 세포질 도메인 (즉, 마우스 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인, 예컨대 H-2A 및 H-2E 막관통 및 세포외 도메인)을 포함하며, 이때 상기 마우스는 1개 이상, 예컨대, 1개, 2개, 3개 또는 4개의 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체(들)을 발현한다. 한 실시형태에서, 마우스 MHC II는 H-2E 및 H-2A로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 인간 MHC II는 HLA-DR, -DQ 및 -DP (예컨대, -DR2, -DR4, -DQ2 및 -DQ8)로부터 선택된다.
또한, 다수의 내인성 MHC 유전자 자리에 대체물을 포함하는 비인간 동물, 예컨대 마우스, 예를 들어 키메라 인간/비인간, 예를 들어 인간/마우스 MHC II 복합체(들)을 암호화하는 뉴클레오타이드(들)을 1개 이상, 예컨대 1개, 2개, 3개 또는 4개 포함하는 비인간, 예컨대 마우스를 제조하는 방법도 제공된다. 마우스 17번 염색체 상에 여러 MHC II 유전자 자리가 근접하여 연관이 이루어지기 때문에, 일부 실시형태에서, 당해 방법은 유전자 자리에서의 연속적인 대체를 포함한다. 한 실시형태에서, 당해 방법은 ES 세포 내에서 제1 마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제1 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하는 단계, 상기 제1 키메라 MHC II 복합체를 발현하는 마우스를 제조하는 단계, 상기 마우스로부터 ES 세포를 제조하는 단계, 상기 ES 세포 내에서 제2 마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제2 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하는 단계, 및 두 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 발현하는 마우스를 제조하는 단계를 포함한다. 대안으로, 당해 방법은 ES 세포 내에서 제1 마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제1 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체한 후, 동일한 ES 세포 내에서 제2 마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제2 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하는 단계, 및 두 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 발현하는 마우스를 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 제3 또는 제4 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스도 예컨대 육종법을 통해 제조할 수 있다. 해당 업계 종사자라면 누구나 2개 이상의 키메라 MHC II 복합체를 포함하는 마우스가 연속적인 대체보다는 오히려 육종법을 통해서도 제조될 수 있고; 이러한 동물은 모든 키메라 MHC II 서열들에 대해 이형접합성일 수 있다는 사실 (예를 들어, 각 자매 염색체 상에 서로 다른 키메라 유전자를 포함하는 마우스는 두 MHC II 유전자에 대해 이형접합성이 될 것이라는 사실 등)을 이해할 수 있을 것이다. 유전자 자리에서 연속적인 대체에 대한 대안으로, 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 1개 이상, 예컨대 2개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스는, 1개 이상, 예컨대 2개의 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 1개 이상, 예컨대 2개의 키메라 인간 /마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 외인성 뉴클레오타이드 서열로 대체함으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, 마우스 H-2A와 H-2E 유전자를 모두 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 키메라 HLA-DR/H-2E 및 HLA-DQ/H-2A 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 대체될 수 있다).
유전적으로 변형된 동물의 용도
다양한 실시형태에서, 본원에 기술된 유전적으로 변형된 비인간 동물들은 세포 표면 상에서 인간 또는 인간화된 MHC II를 지닌 APC를 생성하며, 그 결과, 실질적으로 모든 복합체의 성분들이 인간 또는 인간화되어 있기 때문에, 인간과 유사한 방식으로 T 세포에 대한 에피토프로서 세포질 단백질로부터 유래한 펩타이드를 제시하게 되는 것이다. 본 발명의 유전적으로 변형된 비인간 동물은, 인간화된 동물에서 인간 면역계의 기능을 연구하기 위하여; 면역 반응을 유발하는 항원 및 항원 에피토프(예를 들어, T 세포 에피토프, 예컨대 고유한 인간 암 에피토프)의 동정을 위해, 예컨대 백신 개발에서의 사용을 위해; 백신 후보 물질 및 다른 백신 전략들의 평가를 위해; 인간 자가면역성을 연구하기 위해; 인간 감염성 질병들을 연구하기 위해; 그 외로는 인간 MHC 발현을 기반으로 한 더 우수한 치료적 전략을 고안하기 위해 사용될 수 있다.
MHC II 복합체는 세포외 단백질, 예를 들어, 세포외 세균, 주변 세포, 또는 B 세포 수용체들에 의해 결합되어 B 세포 내로 내재화된 폴리펩타이드로부터 유래한 펩타이드에 결합한다. 일단 세포외 단백질이 식균작용 경로로 유입되면, 이들은 펩타이드로 분해되며, 펩타이드들은 MHC II에 의해 결합되어 제시된다. MHC II에 의해 제시된 펩타이드가 CD4+ T 세포에 의해 인지되면, T 세포들이 활성화되고, 증식되며, 각종 T 헬퍼 아형들(예를 들어, TH1, TH2)로 분화되어, 대식세포-매개된 병원체 사멸, B 세포 증식 및 항체 생산의 활성화를 비롯한 다수의 현상들을 유발된다. 면역 반응에 있어서 MHC II 역할 때문에, MHC II 펩타이드 제시에 대한 이해는 인간 병리학에 있어서 치료법 개발시 중요하다. 그러나, 마우스 MHC II와 관련하여 항원들의 제시는, 인간 및 마우스 MHC 복합체들이 항원을 다르게 인식하므로, 예컨대 마우스 MHC II가 인간 MHC II와 동일한 항원을 인지하지 않을 수 있거나 인간 MHC II와는 다른 에피토프를 제시할 수 있기 때문에, 인간 질병과는 어느 정도만 관련되어 있다. 따라서, 인간 병리학에 대해 가장 관련이 있는 데이터는 인간 MHC II에 의한 항원 에피토프의 제시에 대해 연구함으로써 수득된다.
따라서, 다양한 실시형태에서, 본 발명의 유전자 조작된 동물은, 인간에 있어서 면역 반응을 개시하는 항원의 능력을 평가하고, 다양한 항원들을 제조하여 인간 백신 개발에 사용될 수 있는 특정 항원을 동정하기 위해서 그 어떤 것들보다 유용하다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 유전적으로 변형된 비인간 동물을 펩타이드 서열을 포함하는 분자에 노출시키는 단계, 상기 비인간 동물로 하여금 면역 반응을 개시하도록 하는 단계, 및 상기 비인간 동물 내에서 본원에 기술된 인간화된 MHC II 복합체에 의해 제시된 펩타이드의 서열에 결합하는 세포를 검출하는 단계를 포함하는, 인간 내에서 펩타이드 서열의 항원성을 측정하는 방법이 제공된다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 유전적으로 변형된 비인간 동물을 펩타이드에 노출시키는 단계, 상기 비인간 동물로 하여금 면역 반응을 개시하도록 하는 단계, 및 상기 비인간 동물 내에서 본원에 기술된 바와 같은 키메라 인간/비인간 MHC 제II 부류 분자에 의해 펩타이드의 서열에 결합하는 세포를 검출하는 단계를 포함하는, 펩타이드가 인간에 있어서 면역 반응을 유발하는지에 대한 여부를 측정하는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 노출 후 비인간 동물은 펩타이드에 결합하는 MHC 제II 부류에 한정적인 CD4+ T 세포를 포함한다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물을 추정상의 T 세포 에피토프를 포함하는 항원에 노출시키는 단계, 상기 비인간 동물로 하여금 면역 반응을 개시하도록 하는 단계, 및 MHC 제II 부류에 한정적인 CD4+ T 세포에 의해 결합된 에피토프를 동정하는 단계를 포함하는, 인간 CD4+ T 세포 에피토프를 확인하는 방법이 제공된다.
한 양상에서, 추정된 항원을 본원에 기술된 바와 같은 마우스에 노출시키는 단계, 마우스가 면역 반응을 개시하도록 하는 단계, 인간 MHC II 분자(예를 들어, HLA-DR 또는 HLA-DQ 분자)와 관련하여 항원에 대해 특이적인 CD4+ T 세포 반응을 검지하는 단계, 및 인간 MHC II에 한정된 분자(예를 들어, 인간 HLA-DR 또는 HLA-DQ에 한정된 분자)에 의해 결합된 항원을 확인하는 단계를 포함하는, 인간에서 CD4+ T 세포 반응을 야기하는 항원을 확인하는 방법이 제공된다.
한 실시형태에서, 상기 항원은 세균 단백질을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 항원은 인간 종양 세포 항원을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 항원은 인간에서 사용하기 위한 추정상의 백신, 또는 다른 생물약제를 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 항원은 인간에서 항체들을 생성하는 인간 에피토프를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항원은 효모 또는 진균 세포 항원을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항원은 인간 기생충으로부터 유래한다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 마우스를 추정된 항원에 노출시키는 단계 및 마우스 내에서 항원-특이적인 HLA-DR에 한정적인 (예를 들어, HLA-DR2 또는 HLA-DR4에 한정적인) 면역 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 추정된 항원이 인간 면역계에 대한 노출시 HLA-DR에 한정적인 면역 반응(예를 들어, HLA-DR2 또는 HLA-DR4에 한정적인 반응)을 일으킬 에피토프를 함유하는지의 여부를 측정하는 방법이 제공된다. 다른 양상에서, 추정된 항원이 인간 면역계에 대한 노출시 HLA-DQ에 한정적인 (예를 들어, HLA-DR2 또는 HLA-DR4에 한정적인) 면역 반응을 일으킬 에피토프를 함유하는지의 여부를 측정하는 방법이 제공된다.
또한, 본원에 기술된 마우스를 항원에 노출시키는 단계, 마우스가 면역 반응을 개시하도록 하는 단계(여기서, 면역 반응은 항원 생산을 포함한다), 및 인간 MHC II 복합체와 관련하여 제시된 항원을 인식하는 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 인간 MHC II 복합체와 관련하여 제시된 항원, 예컨대 세균, 기생충 등으로부터 유래한 항원에 대한 항체를 생성시키는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 펩타이드-MHC II에 대한 항체를 생성하기 위하여, MHC II 인간화된 마우스는 펩타이드-MHC II 면역원으로 면역화시킨다.
한 양상에서, 본원에 기술된 인간화된 MHC II 복합체를 포함하는 마우스를 항원에 노출시키는 단계, 상기 마우스가 면역 반응을 개시하도록 하는 단계, 및 상기 마우스로부터 MHC II에 한정적인 항원에 결합하는 T 세포 수용체의 가변 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 분리하는 단계를 포함하는, MHC II와 관련하여 제시된 항원(예를 들어, 인간 종양 항원, 백신 등)을 인식하는 T 세포 수용체 가변 도메인을 확인하는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 항원은 인간화된 MHC II(예를 들어, 인간 HLA II 엑토도메인/마우스 MHC II 막관통 및/또는 세포질 도메인)과 관련하여 제시된다.
T 세포와, MHC II(예를 들어, 인간 HLA II 엑토도메인/마우스 MHC II 막관통 및/또는 세포질 도메인)와 관련하여 펩타이드를 제시하는 APC 간의 상호작용의 결과는 해당 업계에 공지된 다수의 기법들, 예컨대 T 세포 증식 검정, 사이토카인 방출 검정 등으로 측정될 수 있다.
병원체 또는 신생물(암)로부터의 항원 및 이들의 T 세포 에피토프를 확인할 수 있는 점 외에도, 본 발명의 유전적으로 변형된 동물은 인간 자가면역질환과 관련된 자가항원을 확인하고, 이 밖에도 인간 자가면역질환의 진행에 대해서도 연구할 수도 있다. HLA 유전자 자리 내의 다형성이 인간 자가면역질환에 걸리기 쉬운 소인 역할을 한다는 점은 알려져 있다. 실제로, 류마티스 관절염, 제I형 당뇨병들, 하쉬모토 갑상선염, 다발성 경화증, 중증 근육무력증, 그레이브스병, 전신 홍반 루푸스, 소아지방변증, 크론병, 궤양성 대장염 및 다른 자가면역질환들의 발달과 관련이 있는 HLA-DR 및 HLA-DQ 유전자 자리에서 특이적인 다형성들이 확인되었다. 예를 들어, 문헌[Wong and Wen (2004) What can the HLA transgenic mouse tell us about autoimmune diabetes?, Diabetologia 47:1476-87]; [Taneja and David (1998) HLA Transgenic Mice as Humanized Mouse Models of Disease and Immunity, J. Clin. Invest. 101:921-26]; [Bakker et al. (2006), 상기 참조]; 및 [International MHC and Autoimmunity Genetics Network (2009) Mapping of multiple susceptibility variants within the MHC region for 7 immune-mediated diseases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:18680-85]을 참조한다.
따라서, 본원에 기술된 인간화된 MHC II 복합체 동물을 제조하는 방법은 인간의 특정 자가면역질환과 관련된 것으로 생각되는 MHC II 분자들을 도입시키는 데 사용할 수 있어, 인간의 자가면역질환의 진행을 연구할 수 있다. 또한, 본원에 기술된 비인간 동물은 인간 자가면역질환의 동물 모델을 개발하는데 사용할 수 있다. 본원에 기술된 인간화된 MHC II 단백질을 수반하는 본 발명에 따른 마우스는 잠재적인 자가항원을 확인하고, 질병 진행에 관련된 에피토프를 맵핑하며, 자가면역질환 조절을 위한 전략들을 설계하는데 사용될 수 있다.
또한, 본원에 기술된 유전적으로 변형된 동물은 인간 알레르기 반응의 연구에 사용할 수 있다. 알레르기 반응은 MHC II 대립형질들과 관련된 것으로 보이므로, 본원에 기술된 유전적으로 변형된 동물은 알레르기 유발 항원에 특이적인 T 세포 반응의 HLA 한정에 대해 측정하고, 알레르기 반응을 방지하기 위한 전략들을 개발하는데 사용될 수 있다.
게다가, 본 발명의 유전적으로 변형된 동물 및 이에 의해 발현된 인간 또는 인간화된 HLA 분자는, 인간 질병의 진행과 관련이 있는 인간 HLA 분자에 의한 항원 제시를 차단하는 항체를 시험하기 위해서도 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 인간 또는 인간화된 HLA를 발현하는 세포를 시험 항체에 노출시키는 단계 및 상기 시험 항체가 인간 또는 인간화된 HLA에 의한 면역 세포(예컨대, T 세포)로의 항원을 제시를 차단할 수 있는지의 여부를 측정하는 단계(예를 들어 인간 또는 인간화된 HLA 한정 면역 반응을 차단하는 그 능력을 측정함)를 포함하는, 항체가 인간 질병, 예컨대 상기 기술된 인간 질병과 관련된 HLA 분자에 의한 항원의 제시를 차단할 수 있는지의 여부를 측정하는 방법이 본원에 제공된다. 한 실시형태에서, 당해 방법은 인간 또는 인간화된 HLA를 발현하는 동물, 예컨대 질병에 대한 질병 모델로서 기능하는 질병 관련 인간 또는 인간화된 HLA를 발현하는 동물 내에서 수행된다.
실시예
본 발명을 하기의 비제한적인 실시예들로 추가로 설명할 것이다. 이러한 실시예들은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시되는 것이지, 어떠한 방식으로도 발명의 범위를 제한하려고 하는 의도가 아니며, 발명의 범위를 제한하려는 것으로도 해석되어서는 안된다. 본 실시예에는 해당 업계의 통상의 숙련자들에게 잘 알려진 통상의 방법들에 대해 상세한 설명(분자 클로닝 기법 등)을 포함하지 않는다. 달리 지시하지 않는 한, 부(part)는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨로 나타내고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
실시예
1. 내인성
MHC
제
II
부류 H-2A 및 H-2E 유전자 자리
의
결실
VELOCIGENE® 유전 공학 기법(예를 들어, 미국 특허 제6,586,251호 및 문헌[Valenzuela et al., 상기 참조]을 참조한다)을 사용하여 내인성 MHC 제II 부류 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 및 H-2Ea 유전자의 결실을 도입시키기 위한 표적화 벡터를 제조하였다. 세균 인공 염색체(BAC) RP23-458i22[제조원: 인비트로겐(Invitrogen)] DNA를 변형시켜 내인성 MHC 제II 부류 유전자 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 및 H-2Ea를 결실시켰다.
요약하면, 상부 및 하부 상동성 아암을 마우스 BAC DNA의 PCR에 의해 H-2Ab1 유전자의 5' 및 H-2Ea 유전자의 3' 위치로부터 각각 유도하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 이러한 상동성 아암을 사용하여 MHC 제II 부류 유전자 자리의 유전자 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 및 H-2Ea를 포함하는 약 79kb의 RP23-458i22가 결실된 카세트를 세균 상동성 재조합(BHR)에 의해 제조하였다. 당해 영역을 lox66 및 lox71 부위에 측접된 하이그로마이신 카세트로 대체하였다. 최종 표적화 벡터는, 5'에서부터 3'까지, 내인성 MHC 제II 부류 유전자 자리의 H-2Ab1 유전자에 대해 5' 마우스 유전체 서열을 포함하는 34kb의 상동성 아암, 5' lox66 부위, 하이그로마이신 카세트, 3' lox71 부위 및 내인성 MHC 제II 부류 유전자 자리의 H-2Ea 유전자에 대해 3' 마우스 유전체 서열을 포함하는 63kb의 상동성 아암을 포함하였다(MAID 5111, 도 5 참조).
BAC DNA 표적화 벡터(상기에 기술함)를 사용해 마우스 ES 세포를 전기천공시켜 내인성 MHC 제II 부류 유전자 자리의 결실을 포함하는 변형된 ES 세포들을 생성하였다. 결실된 내인성 MHC 제II 부류 유전자 자리를 함유하는 양성 ES 세포들을 TAQMANTM 프로브를 사용하는 정량적 PCR 검정에 의해 확인하였다(문헌 [Lie and Petropoulos (1998) Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48] 참조). 결실된 유전자 자리의 상부 영역을 프라이머 5111U F(CAGAACGCCAGGCTGTAAC; 서열번호 1)와 5111U R(GGAGAGCAGGGTCAGTCAAC; 서열번호 2) 및 프로브 5111U P(CACCGCCACTCACAGCTCCTTACA; 서열번호 3)을 사용한 PCR에 의해 확인하였던 반면, 결실된 유전자 자리의 하부 영역은 프라이머 5111D F(GTGGGCACCATCTTCATCATTC; 서열번호 4)와 5111D R(CTTCCTTTCCAGGGTGTGACTC; 서열번호 5) 및 프로브 5111D P(AGGCCTGCGATCAGGTGGCACCT; 서열번호 6)을 사용하여 확인하였다. 표적화 벡터에서의 하이그로마이신 카세트의 존재는 프라이머 HYGF(TGCGGCCGATCTTAGCC; 서열번호 7)와 HYGR(TTGACCGATTCCTTGCGG; 서열번호 8) 및 프로브 HYGP(ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; 서열번호 9)를 사용하여 확인하였다. 상부 결실점에 걸쳐 있는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 10)은 하기의 서열을 포함하는데, 이는 결실점에 존재하는 카세트 서열에 인접하게 연결된 결실점 상부의 내인성 마우스 서열(하기 괄호 안에 포함되어 있음)을 나타낸다: (TTTGTAAACA AAGTCTACCC AGAGACAGAT GACAGACTTC AGCTCCAATG CTGATTGGTT CCTCACTTGG GACCAACCCT) CTCGAGTACC GTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT ATGCATCCGG GTAGGGGAGG. 하부 결실점에 걸쳐 있는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 11)은 하기의 서열을 포함하는데, 이는 결실점 하부의 내인성 마우스 서열과 인접한 카세트 서열(하기 괄호 안에 포함되어 있음)을 나타낸다: CCTCGACCTG CAGCCCTAGG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAC GGTAGAGCTC (CACAGGCATT TGGGTGGGCA GGGATGGACG GTGACTGGGA CAATCGGGAT GGAAGAGCAT AGAATGGGAG TTAGGGAAGA). 다음으로, 양성 ES 세포 클론을 사용해 VELOCIMOUSE® 방법(하기 기술됨)으로 암컷 마우스를 이식시켜 내인성 MHC 제II 부류 유전자 자리의 결실을 함유하는 동복의 새끼들을 생성하였다.
ES 공여 세포로서 상기에 기술된 표적화된 ES 세포를 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8개-세포 단계의 마우스 배아 내에 도입시켰다(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 문헌[Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99] 참조). 내인성 MHC 제II 부류 유전자 자리 내에 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 및 H-2Ea 유전자의 결실을 함유하는 마우스를, 하이그로마이신 카세트의 존재를 검출하여 내인성 MHC 제II 부류 서열의 부재를 확인한 대립형질 검정(문헌 [Valenzuela et al ., 상기 참조]을 참조)의 변형을 사용한 유전자형 분석법으로 확인하였다.
내인성 MHC 제II 부류 유전자 자리 내에 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 및 H-2Ea 유전자의 결실을 함유하고 있는 마우스는, 예를 들어 ES 세포 단계에서 또는 배아에서 제거되지 않은 표적화 벡터에 의해 도입된 임의의 록스(lox)화된 하이그로마이신 카세트를 제거하기 위해 Cre 결실자 마우스 균주(예를 들어, 국제 특허 출원 공보 제WO 2009/114400호 참조)에 대해 교배할 수 있다. 선택적으로, 하이그로마이신 카세트는 마우스 내에 유지된다.
실시예
2.
키메라
HLA
-
DR4
/H-2E 유전자를 포함하는 거대
표적화
벡터(
LTVEC
)의 생성
인간화된 MHC II 서열을 도입시키기 위한 표적화 벡터를 도 4에 나타낸 바와 같이 설계하였다. VELOCIGENE® 유전 공학 기법을 이용하여, 세균 인공 염색체(BAC) RP23-458i22 DNA를 다양한 단계들에서 변형시켜: (1) BALB/c H-2Ea 유전자로부터 기능성 I-E α 엑손 1을 포함하는 벡터를 생성하고(도 4A); (2) 마우스 I-E β 유전자의 엑손 2 및 3의 인간 DRβ1*04의 엑손으로의 대체 및 마우스 I-Eα의 엑손 2 및 3의 인간 DRα1*01의 엑손으로의 대체를 포함하는 벡터를 생성하며(도 4B); (3) 나머지 마우스 I-Eβ 엑손들 중에서 인간 DRβ1*04의 엑손 2 및 3, 및 BALB/c 마우스의 기능성 I-Eα 엑손 1을 포함하는 나머지 마우스 I-Eα 엑손들 중에서 인간 DRα1*01의 엑손 2 및 3을 수반하는 벡터를 생성하고[단계 (1) (도 4C)]; (4) (3)에서 생성된 벡터 내에서 잠재 스플라이스 부위(cryptic splice site)를 제거한다(도 4D).
구체적으로는, C57Bl/6 마우스들 내에서 I-Eα 유전자는 비-기능성 엑손 1의 존재로 인한 유사유전자이므로, 먼저 BALB/c H-2Ea 유전자의 기능성 I-Eα 엑손 1을 포함하는 벡터를 생성하였다(도 4A). RP23-458i22 BAC를 세균 상동성 재조합에 의해 변형시켜(1.BHR) 클로람페니콜 내성 유전자를 스펙트로마이신의 내성 유전자로 대체하였다. 수득된 벡터를 BHR로 추가로 변형시켜 전체 I-A 및 I-E 암호화 영역을 재조합 부위들에 의해 측접된 네오마이신 카세트로 대체하였다(2.BHR). BALB/c I-Eα 리더를 암호화하는 엑손(엑손 1) 및 PI-SceI 및 I-CeuI 제한 부위들에 의해 측접된 클로람페니콜 유전자를 포함하는 작제물을 사용하여 BHR을 한번 더 수행하여(3.BHR) 기능성 BALB/c H-2Ea 엑손 1을 포함하는 벡터를 제조하였다.
독립적으로, 마우스 I-Eβ 유전자의 엑손 2 및 3의 인간 DRβ1*04의 엑손으로의 대체 및 마우스 I-Eα의 엑손 2 및 3의 인간 DRα1*01의 엑손으로의 대체를 포함하는 벡터를 생성시키기 위하여, RP23-458i22 BAC를 수차례의 동종 재조합 단계들, 4.BHR 내지 8.BHR을 통해 변형시켰다(도 4B). 수득된 핵산 서열을 PI-SceI/I-CeuI 제한 부위에 의해 측접시켜 상기 언급한 BALB/c I-Eα 엑손 1을 수반하는 작제물 내로 결찰되도록 하였다(도 4C).
도 4C에 나타낸 최종 작제물의 서열은 BALB/c 인트론의 3' 말단에서 잠재적 스플라이스 부위를 함유하였다. 수차례의 BHR 단계들(11.BHR 내지 12.BHR)에 이어 결실 단계를 수행하여 최종 표적화 벡터(MAID 1680)를 수득하고, 이를 사용하여 ES 세포들 내로 전기천공하였다(도 4D).
상세히 살펴보면, 최종 표적화 벡터(MAID 1680)는, 5'에서부터 3'까지, 내인성 MHC 제II 부류 유전자 자리의 H-2Ab1 유전자의 바로 상부에서 종결하는 약 26kb의 마우스 유전체 서열로 이루어진 5' 마우스 상동성 아암; 인간화된 MHC IIβ 사슬 유전자(인간화된 H-2Eb1 유전자)와 인간화된 MHC IIα 사슬 유전자(인간화된 H-2Ea 유전자) 및 플록스트된(floxed) 네오마이신 카세트를 함유하는 약 59kb의 삽입물; 및 내인성 MHC 제II 부류 유전자 자리의 H-2Ea 유전자의 바로 하부에서 시작하는 약 57kb의 마우스 유전체 서열로 이루어진 3' 마우스 상동성 아암으로 구성되어 있다. 5' 아암과 상기 삽입물 간의 연결부에 걸쳐 있는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 12)은 하기의 서열을 포함하였으며: (TGCTGATTGG TTCCTCACTT GGGACCAACC C) TAAGCTTTA TCTATGTCGG GTGCGGAGAA AGAGGTAATG AAATGGCACA AGGAGATCAC ACACCCAAAC CAAACTCGCC, 여기서, 이탤릭체로 표시된 서열은 고유한 PI-SceI 부위이고, 5' 상동성 아암 내의 마우스 유전체 서열은 괄호 안에 나타내었다. 상기 삽입물과 3' 아암 간의 연결부에 걸쳐 있는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 13)은 하기의 서열을 포함하였으며: CACATCAGTG AGGCTAGAAT AAATTAAAAT CGCTAATATG AAAATGGGG (ATTTGTACCT CTGAGTGTGA AGGCTGGGAA GACTGCTTTC AAGGGAC), 여기서, 3' 상동성 아암 내의 마우스 유전체 서열은 괄호 안에 나타내었다.
약 59kb의 삽입물 내에서, H-2Eb1 유전자를 다음과 같이 변형시켰다: 인트론 1의 마지막 153bp, 엑손 2, 인트론 2, 엑손 3 및 인트론 3의 처음 122bp를 포함하는 H-2Eb1의 5136bp 영역을, 인트론 1의 마지막 148bp, 엑손 2, 인트론 2, 엑손 3 및 인트론 3의 처음 132bp를 포함하는 인간 HLA-DRB1*04의 3111bp 상동성 영역으로 대체하였다. 인트론 3의 인간과 마우스 서열 간의 연결부에, 5' lox2372 부위, UbC 프로모터, 네오마이신 내성 유전자 및 3' lox2372 부위로 이루어진 카세트를 삽입하였다. 수득된 유전자는 마우스 H-2Eb1 리더, DRβ1*04의 인간 β1 및 β2 도메인 및 마우스 막관통 도메인과 세포질 꼬리로 구성된 키메라 HLA-DRB1*04/H-2Eb1 단백질을 암호화하였다. 인트론 1 내의 마우스/인간 연결부에 걸쳐 있는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 14)은 하기의 서열을 포함하였으며: (TCCATCACTT CACTGGGTAG CACAGCTGTA ACTGTCCAGC CTG) GGTACCGAGC TCGGATCCAC TAGTAACGGC CGCCAGTGTG CTGGAATTC GCCCTTGATC GAGCTCCCTG GGCTGCAGGT GGTGGGCGTT GCGGGTGGGG CCGGTTAA, 여기서, 이탤릭체로 표시된 서열은 클로닝 단계 동안 도입된 다수의 클로닝 부위이고, 마우스 인트론 1 서열은 괄호 안에 나타내었다. 인간 인트론 3과 네오마이신 카세트 간의 연결부에 걸쳐 있는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 15)은 하기의 서열을 포함하였으며: (ATCTCCATCA GAAGGGCACC GGT) ATAACTT CGTATAAGGT ATCCTATACG AAGTTATATG CATGGCCTCC GCGCCGGGTT, 여기서, 5' lox2372 부위는 이탤릭체로 표시하였고, 인간 인트론 3 서열은 괄호 안에 나타내었다. 네오마이신 카세트와 마우스 인트론 3 간의 연결부에 걸쳐 있는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 16)은 하기의 서열을 포함하였으며: ATAACTTCGT ATAAGGTATC CTATACGAAG TTATCTCGAG (TGGCTTACAG GTAGGTGCGT GAAGCTTCTA CAAGCACAGT TGCCCCCTGG), 여기서, 3' lox2372 부위는 이탤릭체로 표시하였으며, 마우스 인트론 3 서열은 괄호 안에 나타내었다.
또한, 약 59kb의 삽입물 내에서, H-2Ea 유전자를 다음과 같이 변형시켰다: 인트론 1의 마지막 101bp, 엑손 2, 인트론 2, 엑손 3 및 인트론 3의 처음 66bp를 포함하는 H-2Ea의 1185bp 영역을 인트론 1의 마지막 104bp, 엑손 2, 인트론 2, 엑손 3 및 인트론 3의 처음 66bp를 포함하는 인간 HLA-DRA1*01의 1189bp의 상동성 영역으로 대체하였다. 상기 기술한 바와 같이, H-2Ea의 C57BL/6 대립형질의 엑손 1은 유전자를 비기능성이 되도록 하는 결실을 함유하고 있기 때문에, H-2Ea 엑손 1 및 인트론 1의 나머지를, 기능성인 H-2Ea BALB/c 대립형질에 있어 등가의 2616bp 영역으로 대체하였다. 수득된 유전자는 BALB/c의 마우스 H-2Ea 리더, DRA1*01의 인간 α1 및 α2 도메인들 및 마우스 막관통 도메인과 세포질 꼬리로 구성된 키메라 H-2Ea/HLA-DRA1*01 단백질을 암호화하였다. 인트론 1 내의 마우스/인간 연결부에 걸쳐 있는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 17)은 하기의 서열을 포함하였고: (CTGTTTCTTC CCTAACTCCC ATTCTATGCT CTTCCATCCC GA) CCGCGGCCCA ATCTCTCTCC ACTACTTCCT GCCTACATGT ATGTAGGT, 여기서, 이탤릭체로 표시된 서열은 클로닝 단계 동안에 도입된 제한 효소 부위이고, BALB/c 인트론 1 서열은 괄호 안에 나타내었다. 인트론 3 내의 인간/마우스 연결부에 걸쳐 있는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 18)은 하기의 서열을 포함하였고: CAAGGTTTCC TCCTATGATG CTTGTGTGAA ACTCGGGGCC GGCC (AGCATTTAAC AGTACAGGGA TGGGAGCACA GCTCAC), 여기서, 이탤릭체로 표시된 서열은 클로닝 단계 동안에 도입된 제한 효소 부위이고, 마우스 인트론 3 서열은 괄호 안에 나타내었다. 엑손 1의 C57BL/6-BALB/c 연결부 5'에 걸쳐 있는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 19)은 하기의 서열을 포함하였고: (GAAAGCAGTC TTCCCAGCCT TCACACTCAG AGGTACAAAT) CCCCATTTTC ATATTAGCGA TTTTAATTTA TTCTAGCCTC, 여기서, C57BL/6-특이적인 서열들은 괄호 안에 나타내었다. 엑손 1의 BALB/c-C57BL/6 연결부 3'에 걸쳐 있는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 20)은 하기의 서열을 포함하였고: TCTTCCCTAA CTCCCATTCT ATGCTCTTCC ATCCCGA CCG CGG (CCCAATC TCTCTCCACT ACTTCCTGCC TACATGTATG), 여기서, SacII 제한 부위는 이탤릭체로 표시하였고, C57BL/6 서열들은 괄호 안에 나타내었다.
실시예
3. 유전적으로 변형된
HLA
-
DR4
마우스의 생성
실시예 2의 벡터를 사용하여 인간화된 MHC II 마우스를 제조하기 위한 전략의 단순화시킨 도해들을 도 5 및 도 8에 나타내었다.
구체적으로, MAID1680 BAC DNA(상기에 기술됨)를 사용해 MAID5111 ES 세포를 전기천공시켜, 내인성 마우스 I-A 및 I-E 유전자 자리의 키메라 인간 DR4/마우스 I-E 유전자 자리를 포함하는 유전체 단편으로의 대체를 포함하는 변형된 ES 세포를 제조하였다. 키메라 인간 DR4/마우스 I-E 유전자 자리를 포함하는 유전체 단편으로 대체시킨 결실된 내인성 I-A 및 I-E 유전자 자리를 함유하는 양성 ES 세포를 TAQMANTM 프로브들(문헌 [Lie and Petropoulos, 상기 참조]을 참조)을 사용한 정량적 PCR 검정에 의해 확인하였다. 인간 DRα 서열의 삽입은 프라이머 hDRA1F(CTGGCGGCTTGAAGAATTTGG; 서열번호 21), hDRA1R (CATGATTTCCAGGTTGGCTTTGTC; 서열번호 22) 및 프로브 hDRA1P (CGATTTGCCAGCTTTGAGGCTCAAGG; 서열번호 23)를 사용한 PCR에 의해 확인하였다. 인간 DRβ 서열의 삽입은 프라이머 hDRB1F(AGGCTTGGGTGCTCCACTTG; 서열번호 24), hDRB1R(GACCCTGGTGATGCTGGAAAC; 서열번호 25) 및 프로브 hDRB1P(CAGGTGTAAACCTCTCCACTCCGAGGA; 서열번호 26)를 사용한 PCR에 의해 확인하였다. 표적화 벡터에서의 하이그로마이신 카세트의 손실은 프라이머 HYGF(TGCGGCCGATCTTAGCC; 서열번호 7) 및 HYGR(TTGACCGATTCCTTGCGG; 서열번호 8) 및 프로브 HYGP (ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; 서열번호 9)로 확인하였다.
다음으로, 양성 ES 세포 클론을 사용하여 암컷 마우스들을 VELOCIMOUSE® 방법(상기 참조)으로 이식함으로써 내인성 I-A 및 I-E 유전자 자리가 키메라 인간 DR4/마우스 I-E 유전자 자리로 대체됨을 포함하는 동복의 새끼들을 생성하였다. 상기 기술된 표적화된 ES 세포들을 ES 공여 세포들로 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8개-세포 단계 마우스 배아 내로 도입시켰다. 키메라 인간 DR4/마우스 I-E 유전자 자리를 함유하는 마우스를 키메라 인간 DR4/마우스 I-E 유전자 자리의 존재를 검출한 대립형질 검정(문헌[Valenzuela et al., 상기 참조]을 참조)을 변형하여 사용한 유전자형 분석법으로 확인하였다.
키메라 인간 DR4/마우스 I-E 유전자 자리를 함유하고 있는 마우스는, 예를 들어, ES 세포 단계 또는 배아 내에서 제거되지 않은 표적화 벡터에 의해 도입된 임의의 록스(lox)화된 네오마이신 카세트를 제거하기 위해 Cre 결실자 마우스 균주(예를 들어, 국제 특허 출원 공보 제WO 2009/114400호 참조)에 대해 교배할 수 있다(도 6 참조).
실시예
4. 유전적으로 변형된 마우스에서의
키메라
HLA
-
DR4
/H-2E의 발현
WT 또는 이형접합성 인간화된 HLA-DR4 마우스("1681 HET")의 비장에 콜라게나제 D[제조원: 로슈 바이오사이언스(Roche Bioscience)]를 관류시키고 적혈구들을 ACK 용해 완충액으로 용해시켰다. 비장세포들을 2일 동안 25㎍/mL의 폴리(I:C)를 사용해 배양하여 MHC-II 유전자들의 발현을 자극하였다. 인간 HLA-DR4의 세포 표면 발현을 플루오로크롬 결합된 항-CD3(17A2), 항-CD19(1D3), 항-CD11c(N418), 항-F480(BM8), 항-I-A/I-E(M15) 및 항-HLADR(L243)을 사용한 FACS에 의해 분석하였다. BD-LSRII를 사용하여 유동 세포분석을 수행하였다. 인간 HLA-DR4의 발현은 CD19+ B 세포들의 표면 상에서 명확하게 검출가능하였으며, 톨-유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist)인 폴리(I:C)에 의한 자극시 유의적으로 상향조절되었다(도 9 참조).
실시예
5. 유전적으로 변형된
HLA
-
DQ2
.5,
HLA
-
DQ8
및
HLA
-
DR2
마우스
VELOCIGENE® 유전 공학 기법(예를 들어, 미국 특허 제6,586,251호 및 문헌[Valenzuela et al., 상기 참조]을 참조한다)을 사용하여 키메라 인간 HLA-DQ2.5/H-2A, HLA-DQ8/H-2A 및 HLA-DR2/H-2E를 함유하는 마우스를 제조하였다. 세균 상동성 재조합 및 분해/결찰 기법에 의한 BAC의 유전자 합성 및 변형으로 LTVEC를 함유하는 인간화된 유전자를 제조하였다.
인간 HLA-DQ2.5, -DQ8.1 및 DR2α 및 β 사슬 서열은, 공개적으로 이용가능한 유전자 서열에 기반하여 블루 헤론 진 신테시스 컴퍼니(미국 워싱턴 소재)에 의해 합성되었다. 구체적으로, 합성된 인간 HLA-DQ2.5 α (DQA1*05) 및 β (DQB1*02) 사슬 및 마우스 BAC RP23-444J20를, 도 10A에 나타난 바와 같이 변형시켜 사용해 LTVEC를 함유하는 키메라 HLA-DQ2.5/H-2A를 제조하였다. 유사하게, 합성된 인간 HLA-DQ8.1 α (DQA1*0301) 및 β (DQB1*0302) 사슬 및 마우스 BAC RP23-444J20를, 도 10B에 나타난 바와 같이 변형시켜 사용해 LTVEC를 함유하는 키메라 HLA-DQ8.1/H-2A를 제조하였다. HLA-DR2/H-2E에 있어서는, 합성된 인간 HLA-DR2 β 사슬(DRB1*1501)을 사용하여 DRβ1*02(1501) 엑손 및 인트론을 포함하는 벡터를 만들고, 이를 세균 상동성 재조합을 이용하여 키메라 HLA-DR4/H-2E 유전자를 포함하는 LTVEC 내로 바꿔 넣었다 (상기 실시예 2의 MAID 1680). 수득된 HLA-DR2/H-2E LTVEC은 도 10C에 나타나 있다. 생성된 LTVEC의 다양한 뉴클레오타이드 서열 연결부(예를 들어, 마우스/인간 서열 연결부, 인간/마우스 서열 연결부 또는 선별 카세트를 갖는 마우스 또는 인간 서열의 연결부)를 하기 표 1에 개괄하였고, 서열목록에 나열하였으며; 이들의 위치는 도 10의 개략도에 표시하였다. 하기 표 1에서, 마우스 서열은 일반적인 글꼴로 나타내었고; 인간 서열은 괄호 안에 나타내었으며; Lox 서열은 이탤릭체로 표시하였고; 클로닝 단계 동안 도입된 제한 부위 및 다른 벡터 기반의 서열들(예컨대, 복수 클로닝 부위)은 굵은 글꼴로 나타내었다. HLA-DR2/H-2E 내의 인간화된 H-2Ea에 대한 뉴클레오타이드 서열 연결부는 상기 실시예 2에서 HLA-DR4/H-2E에 대해 앞서 기술된 바와 동일하다 (서열번호 17-20).
[표 1]
HLA-DR2/H-2E, HLA-DQ2.5/H-2A 및 HLA-DQ8/H-2A 마우스에 대한 LTVEC의 연결부
거대 표적화 벡터를 사용해 MAID5111 ES 세포를 전기천공시켜, 내인성 마우스 I-A 및 I-E 유전자 자리의 키메라 HLA-DQ2.5/H-2A, HLA-DQ8/H-2A 또는 HLA-DR2/H-2E를 포함하는 유전체 단편으로의 대체를 포함하는 변형된 ES 세포를 제조하였다. 키메라 유전자 자리를 포함하는 유전체 단편으로 대체시킨 결실된 내인성 I-A 및 I-E 유전자 자리를 함유하는 양성 ES 세포를 TAQMANTM 프로브(문헌 [Lie and Petropoulos, 상기 참조]을 참조)를 사용한 정량적 PCR 검정에 의해 확인하였다.
양성 ES 세포 클론을 사용해 VELOCIMOUSE® 방법(상기 참조)으로 암컷 마우스를 이식시켜 내인성 I-A 및 I-E 유전자 자리의 키메라 인간/마우스 유전자 자리로의 대체를 함유하는 동복의 새끼들을 생성하였다. ES 공여 세포로서 표적화된 ES 세포를 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8개-세포 단계의 마우스 배아 내에 도입시켰다. 키메라 인간/마우스 유전자 자리를 함유하는 마우스를, 키메라 인간/마우스 유전자 자리의 존재를 검출한 대립형질 검정(문헌 [Valenzuela et al ., 상기 참조]을 참조)의 변형을 사용한 유전자형 분석법으로 확인하였다.
키메라 인간/마우스 유전자 자리를 함유하고 있는 마우스는, 예를 들어, ES 세포 단계 또는 배아 내에서 제거되지 않은 표적화 벡터에 의해 도입된 임의의 록스(lox)화된 네오마이신 또는 하이그로마이신 카세트를 제거하기 위해 Cre 결실자 마우스 균주(예를 들어, 국제 특허 출원 공보 제WO 2009/114400호 참조)에 대해 교배할 수 있다.
키메라 인간/마우스 단백질의 발현을 시험하였다. 구체적으로, HLA-DQ2.5/H-2A 유전적으로 변형된 동물에 대해서는, blood from WT 또는 이형접합성 인간화된 HLA-DQ2.5 마우스("6040 HET"; 카세트 결실됨)의 혈액을 뽑아내어 헤라핀이 코팅된 모세관에 넣고, 적혈구들을 ACK 용해 완충액으로 용해시켰다. 인간 HLA-DQ2.5의 세포 표면 발현을 플루오로크롬 결합된 항-CD3(17A2), 항-CD19(1D3), 항-I-A/I-E(M15) 및 항-HLA-DQ(Tu169) 항체를 사용한 FACS에 의해 분석하였다. BD-포르테사(Fortessa)를 사용하여 유동 세포분석을 수행하였다. 마우스 MHC-II (I-A/I-E) 및 인간 HLA-DQ2.5의 발현은 모두 CD19+ 마우스 B 세포들의 표면 상에서 명확하게 검출가능하였다(도 11 참조).
균등 범위
해당 업계의 숙련자라면, 통상적인 실험 절차만을 사용하더라도 본원에 기술된 본 발명의 구체적인 실시형태들에 대한 많은 균등 범위를 인식하거나, 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등 범위는 하기 특허청구범위에 포함되는 것이다.
본 출원 전체에 걸쳐 인용된 모든 비-특허 문헌, 특허 출원 및 특허의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
<120> TRANSGENIC MICE EXPRESSING CHIMERIC MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLES (MHC) CLASS II MOLECULES
<130> 1210B
<150> US13/793,935
<151> 2013-03-11
<160> 40
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 1
cagaacgcca ggctgtaac 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 3
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 4
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<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 6
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 7
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<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 8
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<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<211> 140
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 10
tttgtaaaca aagtctaccc agagacagat gacagacttc agctccaatg ctgattggtt 60
cctcacttgg gaccaaccct ctcgagtacc gttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120
atgcatccgg gtaggggagg 140
<210> 11
<211> 140
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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cacaggcatt tgggtgggca gggatggacg gtgactggga caatcgggat ggaagagcat 120
agaatgggag ttagggaaga 140
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 12
tgctgattgg ttcctcactt gggaccaacc ctaagcttta tctatgtcgg gtgcggagaa 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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tgagtgtgaa ggctgggaag actgctttca agggac 96
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<212> DNA
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<220>
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<220>
<223> Synthetic
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<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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ctggcggctt gaagaatttg g 21
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic
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gggctgttcc acagctccgg gccgggtcag ggtggcggct 100
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
<400> 28
agagctcctt ctgacccatc ccttcccatc tcttatccct gatgtcactg accggtataa 60
cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat atgcatggcc 100
<210> 29
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 29
cgccataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatgt cgacctcgag ctatatgatc 60
tgcttccact actgagctga gacctacagg aaatcatatc 100
<210> 30
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 30
gtgggttggg cttatggaat gacatgaaat ctagctttag gagcttttta gaagtgtgga 60
aaacaagttt tgggatatag gagtaaaagg caggaagttc 100
<210> 31
<211> 159
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 31
ccttaataca caaaatgatg aaagaaactg actttcaaat attacgggct ctcgagcggc 60
cgccagtgtg atggatggta cctaactata acggtcctaa ggtagcgacc attttttggg 120
gtttgtttct accactcatt cctccctccc acttggtat 159
<210> 32
<211> 280
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 32
cccaattccc aatttcttcc ttccctcact gggcccacta gtagaatcat ggtttggtgg 60
attgtgagct gacggccggc ccaaccagag cctcctgaag aatggatcac acagttgtta 120
gacctcttca tattgagaat ttgtatctcc ctcttctgtg ggtttcccat tgcccggctc 180
caggcatccc tcagctgcac aactcaccca caatgtcttc acctccacag aggctgagca 240
tggtggtcag ggcgaggacc cccagaatca gagctctgct 280
<210> 33
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 33
cggctgctgt ggtggtgctg atggtgctga gcagcccagg gactgagggc agagactctc 60
ccggtaagtg cagggccact gctctccaga gccgccactc 100
<210> 34
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 34
gagctccttc tgacccattc cttcccatct cttatccctg atgtcactac ctcgagataa 60
cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat atgcatggcc 100
<210> 35
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 35
tacgaagtta tacgcgtaac tataacggtc ctaaggtagc gagcggccgc ctatatgatc 60
tgcttccact actgagctga gacctacagg aaatcatatc 100
<210> 36
<211> 136
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 36
agggtgaggg ggcaagttaa tctacatagc ctttgtgggt tgggcttatg ggcgcgccat 60
tcgctacctt aggaccgtta tagttatgaa gtgtggaaaa caagttttgg gatatagagt 120
aaaaggcagg aagttc 136
<210> 37
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 37
ttcagctcca gagaacattc ctcactcatg cactcaccca caatgtcttc acctccacag 60
aggctgagca tggtggtcag ggcgaggacc cccagaatca 100
<210> 38
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 38
gagttcctcc atcacttcac tgggtagcac agctgtaact gtccagcctg tcctgggctg 60
caggtggtgg gcgttgcggg tggggccggt taaggttcca 100
<210> 39
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 39
tcccacatcc tattttaatt tgctccatgt tctcatctcc atcagcacag ctcgagataa 60
cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat atgcatggcc 100
<210> 40
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 40
atacgaagtt atgctagtaa ctataacggt cctaaggtag cgagtggctt acaggtaggt 60
gcgtgaagct tctacaagca cagttgcccc ctgggaagca 100
Claims (66)
- 내인성 MHC II 유전자 자리에, 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비인간 동물로서,
상기 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드는 인간 HLA-DR2α 세포외 도메인을 포함하고, 상기 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드는 인간 HLA-DR2β 세포외 도메인을 포함하며,
상기 키메라 인간/비인간 MHC IIα 및 MHC IIβ 폴리펩타이드는 상기 동물의 세포 표면 상에서 기능성 MHC II 복합체를 형성하는, 비인간 동물. - 제1항에 있어서, 상기 인간 HLA-DR2α 세포외 도메인이 인간 α1 및 α2 도메인을 포함하는, 비인간 동물.
- 제1항에 있어서, 상기 인간 HLA-DR2β 세포외 도메인이 인간 α1 및 α2 도메인을 포함하는, 비인간 동물.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간 MHC IIα 프로모터 및 조절요소들과 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간 MHC IIβ 프로모터 및 조절요소들과 작동가능하게 연결되어 있는, 비인간 동물.
- 제1항에 있어서, 상기 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드는 내인성 비인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는, 비인간 동물.
- 제1항에 있어서, 상기 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드는 내인성 비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는, 비인간 동물.
- 제1항에 있어서, 상기 동물이 설치류인, 비인간 동물.
- 제7항에 있어서, 상기 설치류가 래트 또는 마우스인, 비인간 동물.
- 제8항에 있어서, 상기 설치류가 마우스이고, 상기 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드가 마우스 H-2Eα 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하며, 상기 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드가 마우스 H-2Eβ 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는, 비인간 동물.
- 제1항에 있어서, 내인성 MHC II 유전자 자리에서부터 기능성인 내인성 MHC II 폴리펩타이드를 발현하지 않는 비인간 동물.
- 내인성 MHC II 유전자 자리에, 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비인간 동물로서,
상기 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드는 인간 HLA-DQ8.1α 세포외 도메인을 포함하고, 상기 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드는 인간 HLA-DQ8.1β 세포외 도메인을 포함하며,
상기 키메라 인간/비인간 MHC IIα 및 MHC IIβ 폴리펩타이드는 상기 동물의 세포 표면 상에서 기능성 MHC II 복합체를 형성하는, 비인간 동물. - 제11항에 있어서, 상기 인간 HLA-DQ8.1α 세포외 도메인이 인간 α1 및 α2 도메인을 포함하는, 비인간 동물.
- 제11항에 있어서, 상기 인간 HLA-DQ8.1β 세포외 도메인이 인간 β1 및 β2 도메인을 포함하는, 비인간 동물.
- 제11항에 있어서, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간 MHC IIα 프로모터 및 조절요소들과 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간 MHC IIβ 프로모터 및 조절요소들과 작동가능하게 연결되어 있는, 비인간 동물.
- 제11항에 있어서, 상기 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드는 내인성 비인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는, 비인간 동물.
- 제11항에 있어서, 상기 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드는 내인성 비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는, 비인간 동물.
- 제11항에 있어서, 상기 동물이 설치류인, 비인간 동물.
- 제17항에 있어서, 상기 설치류가 래트 또는 마우스인, 비인간 동물.
- 제18항에 있어서, 상기 설치류가 마우스이고, 상기 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드가 마우스 H-2Aα 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하며, 상기 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드가 마우스 H-2Aβ 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는, 비인간 동물.
- 제11항에 있어서, 내인성 MHC II 유전자 자리에서부터 기능성인 내인성 MHC II 폴리펩타이드를 발현하지 않는 비인간 동물.
- 내인성 H-2E 유전자 자리에 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스로서,
상기 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드가 인간 HLA-DR2α 폴리펩타이드의 세포외 도메인, 마우스 H-2Eα 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 마우스 H-2Eα 폴리펩타이드의 세포질 도메인을 포함하고,
상기 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드가 인간 HLA-DR2β 폴리펩타이드의 세포외 도메인, 마우스 H-2Eβ 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 마우스 H-2Eβ 폴리펩타이드의 세포질 도메인을 포함하며,
상기 마우스 세포 표면 상에서 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 발현하는, 마우스. - 제21항에 있어서, 내인성 H-2E 유전자 자리에서부터 기능성인 마우스 H-2Eα 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 발현하지 않는 마우스.
- 제21항에 있어서, 내인성 H-2E 유전자 자리에서부터 기능성인 마우스 H-2Eβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 발현하지 않는 마우스.
- 제22항에 있어서, 내인성 H-2E 유전자 자리에서부터 기능성인 마우스 H-2Eβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 발현하지 않는 마우스.
- 제21항에 있어서, 상기 내인성 H-2E 유전자 자리에 마우스 H-2Eα 폴리펩타이드의 α1 및 α2 도메인을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열이 결핍된 마우스.
- 제21항에 있어서, 상기 내인성 H-2E 유전자 자리에 마우스 H-2Eβ 폴리펩타이드의 β1 및 β2 도메인을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열이 결핍된 마우스.
- 제25항에 있어서, 상기 내인성 H-2E 유전자 자리에 마우스 H-2Eβ 폴리펩타이드의 β1 및 β2 도메인을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열이 결핍된 마우스.
- 제21항에 있어서, 기능성인 내인성 H-2Aα 또는 β 폴리펩타이드를 발현하지 않는 마우스.
- 제21항에 있어서, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열이 내인성 마우스 MHC IIα 프로모터 및 조절요소들에 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 제2 뉴클레오타이드 서열이 내인성 마우스 MHC IIβ 프로모터 및 조절요소들에 작동가능하게 연결되어 있는, 마우스.
- 제21항에 있어서, 상기 인간 HLA-DR2α 세포외 도메인이 인간 α1 및 α2 도메인들을 포함하는, 마우스.
- 제21항에 있어서, 상기 인간 HLA-DR2β 세포외 도메인이 인간 β1 및 β2 도메인들을 포함하는, 마우스.
- 내인성 H-2A 유전자 자리에, 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스로서,
상기 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드가 인간 HLA-DQ8.1α 폴리펩타이드의 세포외 도메인, 마우스 H-2Aα 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 마우스 H-2Aα 폴리펩타이드의 세포질 도메인을 포함하고,
상기 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드가 인간 HLA-DQ8.1β 폴리펩타이드의 세포외 도메인, 마우스 H-2Aβ 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 마우스 H-2Aβ 폴리펩타이드의 세포질 도메인을 포함하며,
상기 마우스 세포 표면 상에서 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 발현하는, 마우스. - 제32항에 있어서, 내인성 H-2A 유전자 자리에서부터 기능성인 마우스 H-2Aα 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 발현하지 않는 마우스.
- 제32항에 있어서, 내인성 H-2A 유전자 자리에서부터 기능성인 마우스 H-2Aβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 발현하지 않는 마우스.
- 제33항에 있어서, 내인성 H-2A 유전자 자리에서부터 기능성인 마우스 H-2Aβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 발현하지 않는 마우스.
- 제32항에 있어서, 상기 내인성 H-2A 유전자 자리에 마우스 H-2Aα 폴리펩타이드의 α1 및 α2 도메인을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열이 결핍된 마우스.
- 제32항에 있어서, 상기 내인성 H-2A 유전자 자리에 마우스 H-2Aβ 폴리펩타이드의 β1 및 β2 도메인을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열이 결핍된 마우스.
- 제36항에 있어서, 상기 내인성 H-2A 유전자 자리에 마우스 H-2Aβ 폴리펩타이드의 β1 및 β2 도메인을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열이 결핍된 마우스.
- 제32항에 있어서, 기능성인 내인성 H-2Eα 또는 β 폴리펩타이드를 발현하지 않는 마우스.
- 제32항에 있어서, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열이 내인성 마우스 MHC IIα 프로모터 및 조절요소들에 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 제2 뉴클레오타이드 서열이 내인성 마우스 MHC IIβ 프로모터 및 조절요소들에 작동가능하게 연결되어 있는, 마우스.
- 제32항에 있어서, 상기 인간 HLA-DQ8.1α 세포외 도메인이 인간 α1 및 α2 도메인들을 포함하는, 마우스.
- 제32항에 있어서, 상기 인간 HLA-DQ8.1β 세포외 도메인이 인간 β1 및 β2 도메인들을 포함하는, 마우스.
- 제1 내인성 MHC II 유전자 자리에,
인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 세포외 도메인, 마우스 MHC IIα 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 마우스 MHC IIα 폴리펩타이드의 세포질 도메인을 포함하는 제1 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 및
인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인, 마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포질 도메인을 포함하는 제1 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
제2 내인성 MHC II 유전자 자리에,
인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 세포외 도메인, 마우스 MHC IIα 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 마우스 MHC IIα 폴리펩타이드의 세포질 도메인을 포함하는 제2 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열, 및
인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인, 마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포질 도메인을 포함하는 제2 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스로서,
당해 마우스가 마우스의 세포 표면 상에서 두 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 발현하며,
상기 인간 MHC IIα 폴리펩타이드가 HLA-DR2 또는 HLA-DQ8.1의 α사슬로부터 선택되고, 상기 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드가 HLA-DR2 또는 HLA-DQ8.1의 β사슬로부터 선택되는, 마우스. - 제43항에 있어서, 상기 마우스 MHC IIα 폴리펩타이드가 마우스 H-2A 또는 H-2E의 α사슬로부터 선택되고, 상기 마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드가 마우스 H-2A 또는 H-2E의 β사슬로부터 선택되는, 마우스.
- 제43항 또는 제44항에 있어서, 내인성 MHC II 유전자 자리에서부터 마우스 MHC IIα 폴리펩타이드의 기능성 세포외 도메인 또는 마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드의 기능성 세포외 도메인을 발현하지 않은 마우스.
- 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 내인성 MHC II 유전자 자리가 H-2E 유전자 자리이고,
상기 제1 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드가 HLA-DR2α 폴리펩타이드의 세포외 도메인, H-2Eα 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 H-2Eα 폴리펩타이드의 세포질 도메인을 포함하며,
상기 제1 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드가 HLA-DR2β 폴리펩타이드의 세포외 도메인, H-2Eβ 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 H-2Eβ 폴리펩타이드의 세포질 도메인을 포함하는, 마우스. - 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 내인성 MHC II 유전자 자리가 H-2A 유전자 자리이고,
상기 제2 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드가 HLA-DQ8.1α 폴리펩타이드의 세포외 도메인, H-2Aα 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 H-2Aα 폴리펩타이드의 세포질 도메인을 포함하며,
상기 제2 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드가 HLA-DQ8.1β 폴리펩타이드의 세포외 도메인, H-2Aβ 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 H-2Aβ 폴리펩타이드의 세포질 도메인을 포함하는, 마우스. - 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 키메라 인간/비인간 MHC II 복합체를 암호화하는 비인간 키메라 MHC II 유전자 자리로서,
상기 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드는 인간 MHC IIα 세포외 도메인을 포함하고, 상기 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드는 인간 MHC IIβ 세포외 도메인을 포함하며,
당해 유전자 자리가 키메라 인간/비인간 MHC II 복합체를 발현하는, 유전자 자리. - 제48항에 있어서, 상기 인간 MHC IIα 폴리펩타이드 세포외 도메인이 비인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인과 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드 세포외 도메인이 비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인과 작동가능하게 연결되어 있는, 유전자 자리.
- 제48항에 있어서, 비인간 동물의 유전체 내의 내인성 MHC II 위치에 자리잡고 있는 유전자 자리.
- 제48항에 있어서, 상기 인간 MHC II 폴리펩타이드가 HLA-DR2, HLA-DR4, HLA-DQ2 또는 HLA-DQ8 폴리펩타이드인, 유전자 자리.
- 제48항에 있어서, 상기 비인간 MHC II 폴리펩타이드가 마우스 H-2A 또는 H-2E 폴리펩타이드인, 유전자 자리.
- 마우스의 ES 세포 내의 내인성 MHC II 유전자 자리를 변형시켜 두 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 발현시키는 방법으로서, 상기 방법이
ES 세포 내의 제1 내인성 MHC II 유전자 자리에서,
마우스 MHC IIα 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시키고,
마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시켜, 제1 변형된 MHC II 유전자 자리를 생성하는 단계; 및
ES 세포 내의 제2 내인성 MHC II 유전자 자리에서,
마우스 MHC IIα 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 MHC IIα 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시키고,
마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시켜, 제2 변형된 MHC II 유전자 자리를 생성하는 단계
를 포함하며, 상기 제1 유전자 자리 및 제2 유전자 자리는 동일한 ES 세포 내에서 연속적으로 변형되는, 방법. - 제53항에 있어서, 상기 인간 MHC IIα 폴리펩타이드는 HLA-DR2, HLA-DR4, HLA-DQ2, HLA-DQ2.5, HLA-DQ8 및 HLA-DQ8.1의 α사슬로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드는 HLA-DR2, HLA-DR4, HLA-DQ2, HLA-DQ2.5, HLA-DQ8 및 HLA-DQ8.1의 β사슬로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 마우스 MHC IIα 폴리펩타이드가 H-2A 또는 H-2E의 α사슬로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드가 H-2A 또는 H-2E의 β사슬로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 내인성 MHC II 유전자 자리가 H-2A 유전자 자리인, 방법.
- 제56항에 있어서, 상기 제2 내인성 MHC II 유전자 자리가 H-2E 유전자 자리인, 방법.
- 마우스의 제1 내인성 MHC II 유전자 자리에서, 마우스 MHC IIα 폴리펩타이드 및 마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 MHC IIα 폴리펩타이드 및 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시켜, 제1 변형된 MHC II 유전자 자리를 생성함을 포함하는, 마우스의 제1 내인성 MHC II 유전자 자리를 변형시켜 제1 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드 및 제1 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드를 발현시키는 단계; 및
마우스의 제2 내인성 MHC II 유전자 자리에서, 마우스 MHC IIα 폴리펩타이드 및 마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 MHC IIα 폴리펩타이드 및 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시켜, 제2 변형된 MHC II 유전자 자리를 생성함을 포함하는, 마우스의 제2 내인성 MHC II 유전자 자리를 변형시켜 제2 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드 및 제2 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드를 발현시키는 단계
를 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스를 제조하는 방법으로서,
상기 제1 내인성 유전자 자리 및 제2 내인성 유전자 자리는 마우스 내에서 연속적으로 변형되며,
상기 마우스가 제1 및 제2 변형된 MHC II 유전자 자리에서부터 두 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 발현하는, 방법. - 내인성 마우스 MHC II 유전자 자리를 변형시켜 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 발현시키는 방법으로서,
상기 방법이 상기 내인성 MHC II 유전자 자리에서
마우스 MHC IIα 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 HLA-DR2α 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시키고,
마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 HLA-DR2β 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시키는 단계를 포함하고,
상기 유전자 자리가 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 발현하는, 방법. - 제59항에 있어서, 상기 내인성 마우스 유전자 자리가 H-2E 유전자 자리인, 방법.
- 내인성 마우스 MHC II 유전자 자리를 변형시켜 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 발현시키는 방법으로서,
상기 방법이 상기 내인성 MHC II 유전자 자리에서
마우스 MHC IIα 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 HLA-DQ8.1α 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시키고,
마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 HLA-DQ8.1β 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시키는 단계를 포함하고,
상기 유전자 자리가 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 발현하는, 방법. - 제61항에 있어서, 상기 내인성 마우스 유전자 자리가 H-2A 유전자 자리인, 방법.
- 마우스의 내인성 H-2E 유전자 자리에서, 마우스 H-2Eα 폴리펩타이드 및 마우스 H-2Eβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 HLA-DR2α 폴리펩타이드 및 인간 HLA-DR2β 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시켜, 변형된 MHC II 유전자 자리를 생성함을 포함하는, 마우스의 내인성 H-2E 유전자 자리를 변형시켜 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드 및 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스를 제조하는 방법으로서,
당해 마우스가 마우스 세포의 표면 상에서 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 발현하는, 방법. - 마우스의 내인성 H-2A 유전자 자리에서, 마우스 H-2Aα 폴리펩타이드 및 마우스 H-2Aβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 HLA-DQ8.1α 폴리펩타이드 및 인간 HLA-DQ8.1β 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시켜, 변형된 MHC II 유전자 자리를 생성함을 포함하는, 마우스의 내인성 H-2A 유전자 자리를 변형시켜 키메라 인간/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드 및 키메라 인간/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스를 제조하는 방법으로서,
당해 마우스가 마우스 세포의 표면 상에서 키메라 인간/마우스 MHC II 복합체를 발현하는, 방법. - 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 마우스가 기능성인 내인성 H-2Aα 또는 β 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 방법.
- 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마우스가 기능성인 내인성 H-2Eα 또는 β 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 방법.
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