KR102211267B1 - 사람화된 주요 조직적합성 복합체를 발현하는 마우스 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 키메라 사람/비-사람 MHC I 및 MHC II 폴리펩타이드 및/또는 사람 또는 사람화된 2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하는 유전자 변형된 비-사람 동물, 및 상기 동일한 구성을 포함하는 배아, 세포 및 조직을 제공한다. 또한, 상기 유전자 변형된 동물을 제조하기 위한 작제물 및 이를 제조하는 방법이 제공된다. 사람 면역계의 다양한 양상을 연구하기 위해 유전자 변형된 동물을 사용하는 방법이 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2013년 2월 22일자로 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제61/767,811호의 우선권을 주장하고, 이 출원은 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
서열목록
본 명세서는, 2014년 2월 20일자로 "2010794-0424_ST25" 명칭의 ascii.txt 파일로서 전자 형태로 제출된 서열목록을 참조로 한다. 상기 .txt 파일은 2014년 2월 20일자로 작성되었고, 크기는 8kb이다.
본 발명의 분야
본 발명은, 사람 또는 사람화된 주요 조직적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex: MHC) 클래스 I(class I), 및 사람 또는 사람화된 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 유전자 변형된 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류(예를 들면, 마우스 또는 래트)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 사람 또는 사람화된 MHC I 단백질(예를 들면, MHC I α 쇄), 및 사람 또는 사람화된 MHC II 단백질(예를 들면, MHC II α 및 MHC II β 쇄)을 발현하고, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린을 추가로 발현하는, 유전자 변형된 비-사람 동물, 예를 들면, 마우스 또는 래트; 및 이를 발현하는 배아, 조직, 및 세포에 관한 것이다. 본 발명은, 사람 또는 사람화된 MHC 클래스 I 단백질 및 클래스 II 단백질 둘 다, 및/또는 β2 마이크로글로불린을 발현하는 유전자 변형된 비-사람 동물을 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 또한, 본 발명은, 사람화된 세포성 면역계와 관련하여 펩타이드를 시험관내에서 또는 유전자 변형된 비-사람 동물에서 확인하고 평가하는 방법, 및 사람 또는 사람화된 MHC I 및 사람 또는 사람화된 MHC II 단백질을 발현하도록 비-사람 동물, 예를 들면, 마우스 또는 래트의 MHC 유전자좌를 변형시키는 방법을 제공한다.
적응 면역 반응(adaptive immune response)에서, 외래 항원들은, B 림프구들 상의 수용체 분자(예를 들면, 면역글로불린들) 및 T 림프구들 상의 수용체 분자(예를 들면, T 세포 수용체 또는 TCR)들에 의해 인식된다. 이들 외래 항원들은, 일반적으로, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자들로서 언급되는, 특수화된 단백질들에 의해 펩타이드 단편들로서 세포의 표면 상에 제시된다. MHC 분자들은, 약 4Mb에 걸친 유전자들의 연결된 클러스터(cluster)로서 발견되는 다수의 유전자좌(locus)들에 의해 암호화된다. 마우스에서, MHC 유전자들은 17번 염색체 상에서 발견되며, 조직학적 이유로 조직적합성 2(H-2) 유전자들로서 언급된다. 사람에서, 상기 유전자들은 6번 염색체 상에서 발견되며, 사람 백혈구 항원(HLA) 유전자라고 칭한다. 마우스 및 사람에서의 유전자좌는 다유전자성이고; 이들은, 사람 및 뮤린 게놈(genome)에서 유사한 조직화를 나타내는, 3개의 고도로 다형성인 클래스들(클래스 I, 클래스 II 및 클래스 III)의 MHC 유전자들을 포함한다(각각 도 2 및 도 3을 참조한다).
MHC 유전자좌들은 게놈 내에서 최고의 다형성(polymorphism)을 나타내며; 일부 유전자들은 300 초과의 대립형질유전자들(예를 들면, 사람 HLA-DRβ 및 사람 HLA-B)로 나타낸다. 모든 클래스 I 및 클래스 II MHC 유전자들은 펩타이드 단편들을 제시할 수 있지만, 각각의 유전자는, 다형성 및 대립형질유전자 변이체를 반영하는 상이한 결합 특성들을 갖는 단백질들을 발현한다. 임의의 소정의 개체는, 면역 반응 과정에서 B 및 T 세포들에 대해 세포 표면 상에 제시될 수 있는 고유한 범위의 펩타이드 단편들을 갖는다.
사람과 마우스 둘 다는 클래스 I MHC 유전자(도 2 및 도 3 참조)를 갖는다. 사람에서, 전형적 클래스 I 유전자는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C로 칭하고, 한편, 마우스에서 이들은 H-2K, H-2D 및 H-2L이다. 클래스 I 분자는 2개의 쇄: 다형성 α-쇄(때때로 중쇄로서 언급됨) 및 일반적으로 다형성이 아닌, β2-마이크로글로불린이라고 칭하는 보다 작은 쇄(또한 경쇄로서도 알려짐)로 이루어진다(도 1, 좌측). 이들 2개의 쇄는 세포 표면에서 비-공유결합적 이종이량체(heterodimer)를 형성한다. α-쇄는 3개의 도메인(α1, α2 및 α3)을 포함한다. α-쇄 유전자의 엑손 1은 리더 서열을 암호화하고, 엑손 2 및 3은 α1 및 α2 도메인을 암호화하고, 엑손 4는 α3 도메인을 암호화하고, 엑손 5는 막관통(transmembrane) 도메인을 암호화하고, 엑손 6 및 7은 세포질 테일을 암호화한다. α-쇄는 (Ig-유사 도메인을 닮은) α1 및 α2 도메인에 이어 β2-마이크로글로불린과 유사한 α3 도메인을 수반하는 펩타이드-결합 틈(cleft)을 형성한다.
β2 마이크로글로불린은 비-당화된 12kDa 단백질이며; 이의 기능 중 하나는 MHC 클래스 I α-쇄를 안정화시키는 것이다. α-쇄와는 달리, β2 마이크로글로불린은 막에 걸쳐있지 않다. 사람 β2 마이크로글로불린 유전자좌는 15번 염색체 상에 있으며, 한편, 마우스 유전자좌는 2번 염색체 상에 있다. β2 마이크로글로불린 유전자는 4개의 엑손 및 3개의 인트론으로 이루어져 있다. 순환 형태의 β2 마이크로글로불린은 혈청, 뇨 및 기타 체액에 존재하며; 비-공유결합적 MHC I-관련 β2 마이크로글로불린은, 생리학적 조건 하에서 순환하는 β2 마이크로글로불린과 교환될 수 있다.
클래스 I MHC 분자는, 종양 세포를 포함하는 모든 유핵 세포 상에서 발현된다. 이들은 특히 다른 세포들 중에서도 T 및 B 림프구, 대식세포, 수지상 세포 및 호중구 상에서 발현되며, CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL)에 대해 표면 상에 펩타이드 단편(통상 8 내지 10개 아미노산 길이)을 디스플레이하도록 기능한다. CTL은 자신의 막-결합 TCR에 의해 인식되는 MHC I-결합된 펩타이드를 갖는 임의의 세포를 사멸시키도록 특수화된다. 세포가 (예를 들면, 바이러스, 종양, 또는 기타 비-자기 기원의) 정상적으로는 존재하지 않는 세포성 단백질로부터 유도되는 펩타이드를 디스플레이하는 경우, 이러한 펩타이드는, CTL에 의해 인식되고, 이는, 활성화되어 이러한 펩타이드를 디스플레이하는 세포를 사멸시킨다.
사람 및 마우스는 둘 다 클래스 II MHC 유전자들(참조: 도 2 및 도 3)을 갖는다. 사람에서, 전형적 MHC II 유전자들은 HLA-DP, HLA-DQ, 및 HLA-DR로 칭하고, 반면, 마우스에서 이들은 H-2A 및 H2E(흔히 I-A 및 I-E로 각각 약칭됨)이다. MHC II 유전자좌 내의 유전자들에 의해 암호화된 추가의 단백질들인 사람에서의 HLA-DM 및 HLA-DO, 및 마우스에서의 H-2M 및 H-2O은 세포 표면 상에서는 발견되지 않지만, 세포내이입 격실(endocytic compartment) 내에 체류하여 펩타이드들로의 MHC II 분자들의 적절한 로딩(loading)을 확보한다. 클래스 II 분자들은 2개의 폴리펩타이드 쇄들: α 쇄 및 β 쇄로 이루어져 있다. α 쇄의 세포외 부분은 2개의 세포외 도메인들, α1 및 α2를 함유하며; β 쇄의 세포외 부분은 또한 2개의 세포외 도메인들, β1 및 β2도 함유한다(참조: 도 1, 우측). 상기 α 쇄 및 β 쇄들은 서로 비-공유결합적으로 회합되어 있다.
MHC 클래스 II 분자들은 염증 등의 과정 동안에 항원-제시 세포(antigen-presenting cell: APC), 예를 들면, B 세포, 대식세포, 수지상 세포, 내피 세포 상에서 발현된다. APC의 표면 상에 발현된 MHC II 분자들은, 전형적으로 세포내 소포 내에서 CD4+ T 세포들에 대해 생성된 항원들을 제시한다. CD4+ T 세포 관여(engagement)에 참여하기 위하여, 목적하는 항원과의 MHC 클래스 II 복합체는 충분히 안정하여 CD4+ T 세포를 관여시키기에 충분히 오래 생존하여야 한다. CD4+ T 헬퍼 세포(helper cell)가 APC의 표면 상에서 외래 펩타이드/MHC II 복합체에 의해 관여되는 경우, T 세포는 활성화되어 침입자(invader)에 대한 면역 반응을 보조하는 사이토카인을 방출한다.
모든 항원이 내성 메커니즘들로 인하여 T 세포 활성화를 유발하지는 않을 것이다. 그러나, 일부 질환(예를 들면, 암, 자가면역 질환)에서 자기-단백질(self-protein)로부터 유도된 펩타이드들은 면역계의 세포 구성성분의 표적이 되고, 이는, 이러한 펩타이드들을 제시하는 세포들의 파괴를 초래한다. 임상학적으로 유의한 항원들(예를 들면, 다양한 유형들의 암과 관련된 항원들)을 인식하는데 있어서 유의한 진보가 존재하여 왔다. 그러나, 특히, 임상적으로 유의한 항원들의 펩타이드들에 대해, 사람 T 세포에서 적합한 반응을 유발할 것인 펩타이드들의 확인 및 선택을 개선시키기 위하여, 사람 면역계의 양상들을 모사하는 생체내 및 시험관내 시스템들에 대한 필요성이 남아 있다. 따라서, 사람 면역계의 구성성분들을 나타낼 수 있는 생물학적 시스템들(예를 들면, 유전자 변형된 비-사람 동물들 및 세포들)에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명의 요약
사람 MHC 클래스 I 단백질 및 이의 키메라와 관련되고 CD8+ T 세포들에 결합하는 펩타이드들, 및 사람 MHC 클래스 II 단백질 및 이의 키메라와 관련되고, CD4+ T 세포들에 결합하는 펩타이드들을 생성하거나 확인하기 위한 생물학적 시스템이 제공된다. 세포성 면역 반응에서 기능하는 사람화된 분자를 발현하는 비-사람 세포를 포함하는 비-사람 동물이 제공된다. 또한, 사람화된 MHC I 및 MHC II 단백질을 암호화하는 사람화된 설치류 유전자좌가 제공된다. 또한, 사람화된 MHC 분자를 발현하는 사람화된 설치류 세포가 제공된다. 하나 이상의 사람화된 면역계 분자를 발현하는 사람화된 설치류 세포를 포함하는 생체내 및 시험관내 시스템이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 본원에서는 내인성 MHC 유전자좌에, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열(여기서, 상기 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함한다); 키메라 사람/비-사람 MHC II α 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열(여기서, 상기 키메라 사람/비-사람 MHC II α 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC II α 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함한다); 및 키메라 사람/비-사람 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열(여기서, 상기 키메라 사람/비-사람 MHC II β 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC II β 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함한다)을 포함하는 비-사람 동물로서, 상기 비-사람 동물이 이의 내인성 비-사람 MHC 유전자좌로부터 기능성 키메라 사람/비-사람 MHC I 및 MHC II 단백질을 발현하는, 비-사람 동물이 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 동물은, 내인성 비-사람 MHC 유전자좌 유래의 기능성 내인성 MHC I, II α 및/또는 II β 폴리펩타이드를 발현하지 않는다.
한 양상에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌에 위치하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 MHC II α 유전자좌에 위치하고, 제3 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 MHC II β 유전자좌에 위치한다. 한 양상에서, 제1, 제2 및/또는 제3 뉴클레오타이드 서열(들)은 내인성 비-사람 조절 요소들에 작동적으로 연결되어 있다. 한 양상에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 MHC I 프로모터 및 조절 요소들에 작동적으로 연결되어 있고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 MHC II α 프로모터 및 조절 요소들에 작동적으로 연결되어 있고, 제3 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 MHC II β 프로모터 및 조절 요소들에 작동적으로 연결되어 있다.
한 실시형태에서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 포함한다. 한 양상에서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 내인성 비-사람 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 사람 MHC I 폴리펩타이드는, HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 한 실시형태에서, 사람 MHC I 폴리펩타이드는 HLA-A2이다. 다른 양상에서, 사람 MHC I 폴리펩타이드는 HLA-A3, HLA-B7, HLA-B27, HLA-Cw6, 또는 사람 집단에서 발현되는 임의의 다른 MHC I 분자이다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 비-사람 동물은, 이의 내인성 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자좌에, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고, 여기서, 상기 동물은 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현한다.
한 실시형태에서, 사람 MHC II α 세포외 도메인은 사람 MHC II α1 및 α2 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 사람 MHC II β 세포외 도메인은 사람 MHC II β1 및 β2 도메인을 포함한다. 한 양상에서, 키메라 사람/비-사람 MHC II α 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 내인성 비-사람 MHC II α 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 한 양상에서, 키메라 사람/비-사람 MHC II β 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 내인성 비-사람 MHC II β 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 키메라 사람/마우스 MHC II α 및 β 폴리펩타이드의 사람 부분은, HLA-DR, HLA-DQ, 및 HLA-DP로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사람 HLA 클래스 II 단백질로부터 유도된다. 한 특정 실시형태에서, 키메라 사람/비-사람 MHC II α 및 β 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 HLA-DR4 단백질로부터 유도된다. 대안으로, 키메라 사람/비-사람 MHC II α 및 β 폴리펩타이드의 사람 부분은, HLA-DR2, HLA-DQ2.5, HLA-DQ8, 또는 사람 집단에서 발현되는 임의의 다른 MHC II 분자로부터 선택되는 사람 MHC II 단백질로부터 유도될 수 있다.
일부 양상에서, 제공된 동물은, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 2개 카피의 MHC 유전자좌를 포함하고, 한편, 다른 양상에서, 제공된 동물은, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 1개 카피의 MHC 유전자좌를 포함한다. 따라서, 상기 동물은, 키메라 사람/비-사람 MHC I, MHC II α 및 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 MHC 유전자좌에 대해 동종접합성이거나 이종접합성일 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 키메라 사람/비-사람 MHC I, MHC II α 및 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 유전자 변형된 MHC 유전자좌는 비-사람 동물의 생식계열 내이다.
또한, 본원에서는 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열(여기서, 상기 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함한다); 키메라 사람/비-사람 MHC II α 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열(여기서, 상기 키메라 사람/비-사람 MHC II α 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC II α 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함한다); 및 키메라 사람/비-사람 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열(여기서, 상기 키메라 사람/비-사람 MHC II β 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC II β 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함한다)을 포함하는, MHC 유전자좌가 제공된다. 일부 양상에서, 키메라 MHC I, II α 및 II β 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 각각 비-사람 MHC I, II α 및 II β의 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, 유전자 조작된 비-사람 동물은 설치류이다. 한 실시형태에서, 설치류는 래트 또는 마우스이다. 한 실시형태에서, 설치류는 마우스이다. 따라서, 한 양상에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하고, 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 마우스 부분은 H-2K, H-2D, 또는 H-2L로부터 유도된다. 하나의 특정 실시형태에서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 마우스 부분은 H-2K로부터 유도된다. 한 양상에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 키메라 사람/마우스 MHC II α 폴리펩타이드를 암호화하고, 제3 뉴클레오타이드 서열은 키메라 사람/마우스 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하고, 키메라 MHC II α 및 β 폴리펩타이드의 마우스 부분은 H-2E 또는 H-2A로부터 유도된다. 특정 실시형태에서, 키메라 MHC II 폴리펩타이드의 마우스 부분은 H-2E로부터 유도된다.
따라서, 또한, 본원에서는 내인성 MHC 유전자좌에, 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열(여기서, 상기 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함한다); 키메라 사람/마우스 MHC II α 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열(여기서, 상기 키메라 사람/비-사람 MHC II α 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC II α 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함한다); 및 키메라 사람/마우스 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열(여기서, 상기 키메라 사람/비-사람 MHC II β 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC II β 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함한다)을 포함하는 유전자 조작된 마우스로서, 상기 마우스가 이의 내인성 마우스 MHC 유전자좌로부터 기능성 키메라 사람/마우스 MHC I 및 MHC II 단백질을 발현하는, 유전자 조작된 마우스가 제공된다. 하나의 특정 실시형태에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 키메라 HLA-A2/H-2K 폴리펩타이드를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 키메라 HLA-DR4/H-2E 폴리펩타이드의 α 쇄를 암호화하고, 제3 뉴클레오타이드 서열은 키메라 HLA-DR4/H-2E 폴리펩타이드의 β 쇄를 암호화하고, 상기 마우스는 기능성 HLA-A2/H-2K 및 HLA-DR4/H-2E 단백질을 발현한다. 추가의 실시형태에서, 마우스는, 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 사람 또는 사람화된 β2 마이클로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스는 이의 내인성 MHC 유전자좌로부터 기능성 내인성 MHC 폴리펩타이드를 발현하지 않는다.
또한, 본원에서는 본원에 기재된 유전자 변형된 비-사람 동물(예를 들면, 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트)를 생성시키는 방법이 제공된다. 따라서, 한 양상에서, 본 발명은, 내인성 비-사람 MHC II 유전자좌에서 비-사람 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 사람/비-사람 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하여 제1 비-사람 동물을 생성시키고; 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌에서 비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하여 제2 비-사람 동물을 생성시킴을 포함하는, 유전자 변형된 비-사람 동물을 생성시키는 방법을 제공한다. 한 양상에서, 뉴클레오타이드 서열을 대체하는 단계는 비-사람 ES 세포에서의 상동성 재조합을 포함하고, 상기 제2 비-사람 동물은, 키메라 사람/비-사람 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 ES 세포에서의 상동성 재조합에 의해 생성된다. 키메라 MHC II 복합체는 키메라 사람/비-사람 MHC II α 및 β 폴리펩타이드를 포함한다.
대안의 실시형태에서, 본 발명은, 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌에서 비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하여 제1 비-사람 동물을 생성시키고; 내인성 비-사람 MHC II 유전자좌에서 비-사람 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 사람/비-사람 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하여 제2 비-사람 동물을 생성시킴을 포함하는, 유전자 변형된 비-사람 동물을 생성시키는 방법을 제공한다. 한 양상에서, 뉴클레오타이드 서열을 대체하는 단계는 비-사람 ES 세포에서 상동성 재조합을 포함하고, 제2 비-사람 동물은, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 ES 세포에서 상동성 재조합에 의해 생성된다.
또한, 본원에서는 세포들, 예를 들면, 본원에 기술된 비-사람 동물들(예를 들면, 설치류들, 예를 들면, 마우스들 또는 래트들)로부터 유도된, 단리된 항원-제시 세포들도 제공된다. 본원에 기술된 비-사람 동물들로부터 유도된 조직 및 배아도 제공된다.
본원에 기술된 실시형태들 및 양상들 중 어느 것도 내용에 달리 나타내거나 이로부터 명백하지 않는 한, 서로 함께 사용될 수 있다. 다른 실시형태들은 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용의 고찰로부터 당해 분야의 숙련가에게 명백해질 것이다. 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본 발명의 청구범위로 한정하지 않는, 본 발명의 각종 실시형태들의 예시적인 표시들을 포함한다. 첨부된 도면들은 당해 명세서의 일부를 구성하며, 설명과 함께, 실시형태들을 단지 설명하기 위해 제공되며 본 발명을 제한하지 않는다.
도 1은, 세포의 표면 상에서 발현되는 MHC I(좌측 패널) 및 MHC II(우측 패널)의 도식도이다. 회색 원은, 펩타이드-결합 틈에 결합된 펩타이드를 나타낸다.
도 2는, 클래스 I, 클래스 II 및 클래스 III 유전자를 나타내는, 사람 HLA의 상대적 게놈 구조에 대한 도식적 설명(축척에 의한 것이 아님)이다.
도 3은, 클래스 I, 클래스 II 및 클래스 III 유전자를 나타내는, 마우스 MHC의 상대적 게놈 구조에 대한 도식적 설명(축척에 의한 것이 아님)이다.
도 4는, 사람화된 MHC I 및 MHC II 유전자를 포함하는 사람화된 MHC 유전자좌를 생성시키기 위한 전략을 도시한다. 도시된 특정 실시형태에서, 생성된 마우스의 MHC 유전자좌는 사람 HLA-A2 및 HLA-DR4 서열(H2-K+/1666 MHC-II+/1681)을 포함한다. 사람화의 각각의 단계에서 ES 세포로 도입되는 대형 표적화 벡터는 화살표 우측으로 도시된다.
도 5(a-d)는, 사람화된 I-Eβ 및 I-Eα(즉, 각각 H-2Eβ/HLA-DRβ1*04 및 H-2Eα/HLA-DRα*01 키메라)를 포함하는 표적화 벡터(targeting vector)를 생성하기 위한 전략의 개략도(축척은 나타내지 않음)이다. 도 5c에서, 도 5b로부터의 최종 사람화된 MHC II 서열은, 도 5a로부터의 최종 작제물의 PI-SceI 및 I-CeuI 제한 부위들 사이에서 연결되어 사람화된 MHC II 및 BALB/c로부터의 I-Eα의 엑손 1을 포함하는 작제물을 생성한다. Pg=슈도유전자(pseudogene); BHR=세균 상동성 재조합; CM=클로람페니콜; spec=스펙티노마이신; hyg=하이그로마이신; neo=네오마이신; EP=전기천공(electroporation). 삼각형들은 엑손들을 나타내고, 채워진 삼각형들은 C57BL/6 마우스로부터의 마우스 엑손[BALB/c 마우스로부터의 I-Eα의 엑손 1을 나타내는, 빗금친(hashed) 삼각형들은 제외됨]을 나타내고, 개방된 삼각형들은 사람 엑손들을 나타낸다.
도 6은, MHC 클래스 II I-E 및 I-A 유전자들의 개략도(축척은 나타내지 않음)를 나타내고, 하이그로마이신 카세트(hygromycin cassette)를 사용한 마우스 유전자좌의 녹아웃(knockout)에 이어서, 사람화된 I-Eβ 및 I-Eα(즉, 각각 H-2Eβ/HLA-DRβ1*04 및 H-2Eα/HLA-DRα*01 키메라)를 포함하는 벡터의 도입을 나타낸다. 개방된 삼각형들은 사람 엑손들을 나타내고; 채워진 삼각형들은 마우스 엑손들을 나타낸다. 유전형 분석(genotyping)에 사용된 프로브(probe)들은 원 안에 있다.
도 7은, 도 6의 네오마이신 카세트의 Cre-매개된 제거의 개략도(축척은 나타내지 않음)를 나타낸다. 개방된 삼각형들은 사람 엑손들을 나타내고; 채워진 삼각형들은 마우스 엑손들을 나타낸다. 상부의 2개의 가닥(strand)들은, 네오마이신 선택 카세트를 갖는 사람화된 MHC II 이종접합성 마우스 내의 MHC II 유전자좌들을 나타내고, 하부 2개의 가닥들은, 제거된 네오마이신 카세트를 갖는 사람화된 MHC II 이형접합성 마우스 내의 MHC II 유전자좌들을 나타낸다.
도 8은, 사람 HLA-A2 단백질의 세포외 영역을 발현하는 키메라 H-2K 유전자좌를 생성하는데 이용되는 표적화 전략에 대한 도식적 다이아그램(축척에 의한 것이 아님)이다. 마우스 서열은 흑색으로 표시되고, 사람 서열은 백색으로 표시된다. L=리더, UTR=비해독 영역, TM=막관통 도메인, CYT=세포질 도메인, HYG=하이그로마이신.
도 9는, 키메라 HLA-A2/H-2K 및 HLA-DR4/H-2E 유전자좌를 갖는 이종접합성 마우스에서 HLA-A2 및 HLA-DR4의 생체내 발현에 대한 도트 플롯이다. 정상 상태(steady state)의 HLA-DR4 발현은 낮지만 존재하였고; 상기 낮은 발현은 예상되었으며, 상기 발현은 활성화시 상향조절된다.
도 2는, 클래스 I, 클래스 II 및 클래스 III 유전자를 나타내는, 사람 HLA의 상대적 게놈 구조에 대한 도식적 설명(축척에 의한 것이 아님)이다.
도 3은, 클래스 I, 클래스 II 및 클래스 III 유전자를 나타내는, 마우스 MHC의 상대적 게놈 구조에 대한 도식적 설명(축척에 의한 것이 아님)이다.
도 4는, 사람화된 MHC I 및 MHC II 유전자를 포함하는 사람화된 MHC 유전자좌를 생성시키기 위한 전략을 도시한다. 도시된 특정 실시형태에서, 생성된 마우스의 MHC 유전자좌는 사람 HLA-A2 및 HLA-DR4 서열(H2-K+/1666 MHC-II+/1681)을 포함한다. 사람화의 각각의 단계에서 ES 세포로 도입되는 대형 표적화 벡터는 화살표 우측으로 도시된다.
도 5(a-d)는, 사람화된 I-Eβ 및 I-Eα(즉, 각각 H-2Eβ/HLA-DRβ1*04 및 H-2Eα/HLA-DRα*01 키메라)를 포함하는 표적화 벡터(targeting vector)를 생성하기 위한 전략의 개략도(축척은 나타내지 않음)이다. 도 5c에서, 도 5b로부터의 최종 사람화된 MHC II 서열은, 도 5a로부터의 최종 작제물의 PI-SceI 및 I-CeuI 제한 부위들 사이에서 연결되어 사람화된 MHC II 및 BALB/c로부터의 I-Eα의 엑손 1을 포함하는 작제물을 생성한다. Pg=슈도유전자(pseudogene); BHR=세균 상동성 재조합; CM=클로람페니콜; spec=스펙티노마이신; hyg=하이그로마이신; neo=네오마이신; EP=전기천공(electroporation). 삼각형들은 엑손들을 나타내고, 채워진 삼각형들은 C57BL/6 마우스로부터의 마우스 엑손[BALB/c 마우스로부터의 I-Eα의 엑손 1을 나타내는, 빗금친(hashed) 삼각형들은 제외됨]을 나타내고, 개방된 삼각형들은 사람 엑손들을 나타낸다.
도 6은, MHC 클래스 II I-E 및 I-A 유전자들의 개략도(축척은 나타내지 않음)를 나타내고, 하이그로마이신 카세트(hygromycin cassette)를 사용한 마우스 유전자좌의 녹아웃(knockout)에 이어서, 사람화된 I-Eβ 및 I-Eα(즉, 각각 H-2Eβ/HLA-DRβ1*04 및 H-2Eα/HLA-DRα*01 키메라)를 포함하는 벡터의 도입을 나타낸다. 개방된 삼각형들은 사람 엑손들을 나타내고; 채워진 삼각형들은 마우스 엑손들을 나타낸다. 유전형 분석(genotyping)에 사용된 프로브(probe)들은 원 안에 있다.
도 7은, 도 6의 네오마이신 카세트의 Cre-매개된 제거의 개략도(축척은 나타내지 않음)를 나타낸다. 개방된 삼각형들은 사람 엑손들을 나타내고; 채워진 삼각형들은 마우스 엑손들을 나타낸다. 상부의 2개의 가닥(strand)들은, 네오마이신 선택 카세트를 갖는 사람화된 MHC II 이종접합성 마우스 내의 MHC II 유전자좌들을 나타내고, 하부 2개의 가닥들은, 제거된 네오마이신 카세트를 갖는 사람화된 MHC II 이형접합성 마우스 내의 MHC II 유전자좌들을 나타낸다.
도 8은, 사람 HLA-A2 단백질의 세포외 영역을 발현하는 키메라 H-2K 유전자좌를 생성하는데 이용되는 표적화 전략에 대한 도식적 다이아그램(축척에 의한 것이 아님)이다. 마우스 서열은 흑색으로 표시되고, 사람 서열은 백색으로 표시된다. L=리더, UTR=비해독 영역, TM=막관통 도메인, CYT=세포질 도메인, HYG=하이그로마이신.
도 9는, 키메라 HLA-A2/H-2K 및 HLA-DR4/H-2E 유전자좌를 갖는 이종접합성 마우스에서 HLA-A2 및 HLA-DR4의 생체내 발현에 대한 도트 플롯이다. 정상 상태(steady state)의 HLA-DR4 발현은 낮지만 존재하였고; 상기 낮은 발현은 예상되었으며, 상기 발현은 활성화시 상향조절된다.
정의
본 발명은, 사람 또는 사람화된 MHC I 및 MHC II 단백질 둘 다를 발현하는 유전자 변형된 비-사람 동물들(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼 등); 이를 포함하는 배아, 세포, 및 조직; 이들을 제조하는 방법들; 및 이들을 사용하는 방법들을 제공한다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어들 및 어구들은, 당해 용어 및 어구가 사용된 내용으로부터 명확하게 묘사되거나 명확하게 드러나지 않는 한, 이들 용어들 및 어구들이 당해 분야에서 통용되어 왔던 의미들을 포함한다.
보존적 아미노산 치환을 기술하는데 사용되는 경우, 용어 "보존적"은, 유사한 화학적 특성들(예를 들면, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 R 그룹을 갖는 다른 아미노산 잔기에 의한 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 보존적 아미노산 치환들은, 뉴클레오타이드 서열을 변형하여 보존적 치환을 암호화할 것인 뉴클레오타이드 변화를 도입함으로써 달성할 수 있다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 목적한 기능적 특성들, 예를 들면, 목적한 펩타이드를 제시하는 MHC I 또는 MHC II의 능력을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 특성들을 갖는 측쇄들을 갖는 아미노산들 그룹들의 예로는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신과 같은 지방족 측쇄들; 세린 및 트레오닌과 같은 지방족-하이드록실 측쇄들; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드-함유 측쇄들; 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판과 같은 방향족 측쇄들; 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘과 같은 염기성 측쇄들; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 측쇄들; 및 시스테인 및 메티오닌과 같은 황-함유 측쇄들이 포함된다. 보존적 아미노산 치환 그룹들로는, 예를 들면, 발린/류신/이소류신, 페닐알라닌/타이로신, 라이신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타메이트/아스파르테이트, 및 아스파라긴/글루타민이 포함된다. 일부 실시형태들에서, 보존적 아미노산 치환은, 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발(alanine scanning mutagenesis)에서 사용된 바와 같은, 단백질 내의 임의의 천연의 잔기의 알라닌으로의 치환일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 본원에 인용에 의해 포함된 문헌[참조: Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45]에 기재된 PAM250 로그-우도 매트릭스(log-likelihood matrix)에서 양성 값을 갖는 보존적 치환이 이루어진다. 일부 실시형태들에서, 당해 치환은 중간의 보존적 치환이며, 여기서, 당해 치환은 PAM250 로그-우도 매트릭스에서 비음성(nonnegative) 값을 갖는다.
따라서, 이의 게놈이 사람 또는 사람화된 MHC I 및 MHC II 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물도 본 발명에 포함되며, 여기서, 상기 MHC I 또는 MHC II 폴리펩타이드는, 본원에 기술된 아미노산 서열 내의 보존적 아미노산 치환들을 포함한다.
당해 분야의 숙련가는, 본원에 기술된 사람 또는 사람화된 MHC I 또는 MHC II 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 잔기들 외에, 유전자 암호의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여, 다른 핵산들은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 이의 게놈 내에 보존적 아미노산 치환들을 갖는 MHC I 및 MHC II 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물 외에, 이의 게놈이 유전자 암호의 축퇴성으로 인하여 본원에 기술된 것과 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물이 또한 제공된다.
서열과 함께 사용되는 경우 용어 "동일성(identity)"은, 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 당해 분야에 공지되어 있는 다수의 상이한 알고리즘들에 의해 측정된 바와 같은 동일성을 포함한다. 본원에 기술된 일부 실시형태들에서, 동일성은, 10.0의 개방 갭 페널티(open gap penalty), 0.1의 연장 갭 페널티(extend gap penalty)를 이용하는 ClustalW v. 1.83(slow) 정렬을 사용하고, 곤넷 유사성 매트릭스(Gonnet similarity matrix)(MacVectorTM 10.0.2, MacVector Inc., 2008)를 사용하여 측정한다. 서열들의 동일성과 관련하여 비교되는 서열들의 길이는 특정 서열들에 의존할 것이다. 각종 실시형태들에서, 동일성은, 이의 N-말단으로부터 이의 C-말단까지 성숙한 단백질의 서열을 비교함으로써 측정한다. 각종 실시형태들에서, 키메라 사람/비-사람 서열을 사람 서열에 대해 비교하는 경우, 키메라 사람/비-사람 서열의 사람 부분(비-사람 부분 제외)은 사람 서열과 키메라 사람/비-사람 서열의 사람 부분 사이의 동일성의 수준을 확인할 목적을 위한 비교에 사용된다(예를 들면, 키메라 사람/마우스 단백질의 사람 엑토도메인(ectodomain)을 사람 단백질의 사람 엑토도메인과 비교함).
서열들, 예를 들면, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열들과 관련하여 용어들 "상동성" 또는 "상동성의(homologous)"는, 최적의 정렬 및 비교시, 적어도 약 75%의 뉴클레오타이드들 또는 아미노산들, 예를 들면, 적어도 약 80%의 뉴클레오타이드들 또는 아미노산들, 예를 들면, 적어도 약 90 내지 95%의 뉴클레오타이드들 또는 아미노산들, 예를 들면, 97% 초과의 뉴클레오타이드들 또는 아미노산들에서 동일한 2개의 서열을 의미한다. 당해 분야에서 숙련가는, 최적의 유전자 표적화를 위해, 표적화 작제물이 내인성 DNA 서열들에 대해 상동성인 아암(arm)(즉, "상동성 아암")을 함유함으로써; 상동성 재조합이 표적화 작제물과 표적화된 내인성 서열 사이에서 발생할 수 있음을 이해할 수 있다.
용어 "작동적으로 연결된"은, 이렇게 기술된 구성성분들이 이들을 이들의 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 병렬(juxtaposition)을 언급한다. 이와 같이, 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 조절 서열들[예를 들면, 프로모터, 인핸서, 사일런서(silencer) 서열 등]에 작동적으로 연결됨으로써 적절한 전사 조절을 보유할 수 있다. 또한, 본 발명의 키메라 또는 사람화된 단백질의 다양한 부분들은 작동적으로 연결되어 세포 내의 단백질의 적절한 폴딩(folding), 프로세싱, 표적화, 발현, 및 다른 기능성 특성들을 보유할 수 있다. 달리 언급하지 않는 한, 본 발명의 키메라 또는 사람화된 단백질의 각종 도메인들은 서로에 대해 작동적으로 연결되어 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "MHC I 복합체" 등은, MHC I α 쇄 폴리펩타이드와 β2-마이크로글로불린 폴리펩타이드 사이의 복합체를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "MHC I 폴리펩타이드" 등은, MHC I α 쇄 폴리펩타이드 단독을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어들 "MHC II 복합체", 또는 "MHC II 단백질" 등은 MHC II α 폴리펩타이드와 MHC II β 폴리펩타이드 사이의 복합체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "MHC II α 폴리펩타이드" 또는 "MHC II β 폴리펩타이드"(등)는, MHC II α 폴리펩타이드 단독 또는 MHC II β 폴리펩타이드 단독 각각을 포함한다. 유사하게, 용어들 "HLA-DR4 복합체", "HLA-DR4 단백질", "H-2E 복합체", 또는 "H-2E 단백질" 등은 α 및 β 폴리펩타이드들 사이의 복합체를 말한다. 전형적으로, 용어들 "사람 MHC" 및 "HLA"는 상호교환적으로 사용된다.
유전자 대체(gene replacement)와 관련하여 용어 "대체(replacement)"는 외인성 유전자 물질이 내인성 유전자좌에 위치함으로써, 내인성 유전자 중 전부 또는 일부가 이종상동성(orthologous) 또는 상동성 핵산 서열로 대체됨을 말한다. 하기 실시예들에서 입증된 바와 같이, 내인성 MHC 유전자좌의 핵산 서열은, 사람 MHC I 폴리펩타이드의 부분, 구체적으로 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 부분, 및 사람 MHC II α 및 β 폴리펩타이드의 부분, 구체적으로 MHC II α 및 β 폴리펩타이드의 세포외 부분을 암호화하는 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하였다.
예를 들면, 기능성 폴리펩타이드와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 "기능성"은, 천연의 단백질과 일반적으로 관련된 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩타이드를 말한다. 예를 들면, 본 발명의 일부 실시형태들에서, 내인성 유전자좌에서의 대체(예를 들면, 내인성 비-사람 MHC 유전자좌에서의 대체)는 기능성 내인성 폴리펩타이드, 예를 들면, MHC I 또는 MHC II 폴리펩타이드를 발현하지 못하는 유전자좌를 생성한다. 또한, 단백질의 기능성 세포외 도메인과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "기능성"은, 이의 기능, 예를 들면, MHC I 또는 MHC II의 경우에 항원에 결합하는 능력, T 세포 공동-수용체(co-receptor)에 결합하는 능력 등을 보유하는 세포외 도메인을 말한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 내인성 MHC 유전자좌에서의 대체는, 내인성 MHC의 세포외 도메인(예를 들면, 기능성 세포외 도메인)을 발현하지 못하지만 사람 MHC의 세포외 도메인(예를 들면, 기능성 세포외 도메인)을 발현하는 유전자좌를 야기한다.
유전자 변형된 MHC 동물
다양한 실시형태에서, 본 발명은, 일반적으로, 게놈에 사람 또는 사람화된 MHC I 및 MHC II 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물을 제공하고, 따라서 상기 동물은 사람 또는 사람화된 MHC I 및 MHC II 폴리펩타이드를 발현한다.
MHC 유전자는 3개의 클래스들(클래스 I, 클래스 II 및 클래스 III: 이들 모두는 사람 6번 염색체 또는 마우스 17번 염색체 상에 암호화됨)로 분류된다. 사람 및 마우스 MHC 클래스의 상대적 구성에 대한 도식이 각각 도 2 및 3에 제시된다. MHC 유전자는 마우스 및 사람 게놈의 가장 다형성인 유전자에 속한다. MHC 다형성은, 진화적 이점을 제공하는데 중요한 것으로 추측되고; 서열 변화는 병원체를 세포독성 T 세포에 더욱 잘 제시하도록 펩타이드 결합에 차이를 줄 수 있다.
MHC 클래스 I 단백질은 세포외 도메인(α1, α2 및 α3의 3개의 도메인을 포함), 막관통 도메인 및 세포질 테일을 포함한다. α1 및 α2 도메인은 펩타이드-결합 틈을 형성하고, 한편, α3은 β2-마이크로글로불린과 상호작용한다.
α3 도메인은, β2-마이크로글로불린과의 상호작용 이외에, TCR 공동-수용체 CD8과 상호작용하여 항원-특이적 활성화를 촉진시킨다. MHC 클래스 I의 CD8에의 결합이 TCR의 MHC 클래스 I에의 결합보다 약 100배 약하지만, CD8 결합은 TCR 결합의 친화도를 증진시킨다. [Wooldridge et al. (2010) MHC Class I Molecules with Superenhanced CD8 Binding Properties Bypass the Requirement for Cognate TCR Recognition and Nonspecifically Activate CTLs, J. Immunol. 184:3357-3366]. 흥미롭게도, CD8에 대한 MHC 클래스 I 결합 증가는 CTL 활성화시 항원 특이성을 폐기시켰다. Id.
MHC 클래스 I 분자에 대한 CD8 결합은 종-특이적이며; CD8의 마우스 상동체인 Lyt-2는 α3 도메인에서 H-2Dd 분자에 결합하는 것으로 밝혀졌으나, HLA-A 분자에는 결합하지 않았다. [Connolly et al. (1988) The Lyt-2 Molecule Recognizes Residues in the Class I α3 Domain in Allogeneic Cytotoxic T Cell Responses, J. Exp. Med. 168:325-341]. 차별적 결합은 아마도 사람과 마우스 사이에 보존되지 않았던 CD8 상의 CDR-유사 결정인자(CDR1- 및 CDR2-유사)에 기인한 듯 했다. [Sanders et al. (1991) Mutations in CD8 that Affect Interactions with HLA Class I and Monoclonal Anti-CD8 Antibodies, J. Exp. Med. 174:371-379; Vitiello et al. (1991) Analysis of the HLA-restricted Influenza-specific Cytotoxic T Lymphocyte Response in Transgenic Mice Carrying a Chimeric Human-Mouse Class I Major Histocompatibility Complex, J. Exp. Med. 173:1007-1015; 및 Gao et al. (1997) Crystal structure of the complex between human CD8αα and HLA-A2, Nature 387:630-634]. CD8은 (위치 223 내지 229에서) α3 도메인의 보존된 영역 내의 HLA-A2에 결합하는 것으로 보고되었다. HLA-A에서의 단일 치환(V245A)은, T 세포-매개된 분해가 크게 감소하는 것과 함께, HLA-A에 대한 CD8의 결합을 감소시켰다. [Salter et al. (1989), Polymorphism in the α3 domain of HLA-A molecules affects binding to CD8, Nature 338:345-348]. 일반적으로, HLA-A 분자의 α3 도메인에서의 다형성은 CD8에 대한 결합에도 영향을 미쳤다. Id. 마우스에서, H-2Dd의 잔기 227에서의 아미노산 치환은 H-2Dd에 대한 마우스 Lyt-2의 결합에 영향을 미쳤으며, 돌연변이체 H-2Dd로 형질감염된 세포는 CD8+ T 세포에 의해 분해되지 않았다. [Potter et al. (1989) Substitution at residue 227 of H-2 class I molecules abrogates recognition by CD8-dependent, but not CD8-independent, cytotoxic T lymphocytes, Nature 337:73-75].
따라서, MHC 클래스 I α3 도메인과 CD8 사이의 상호작용의 종 특이성 때문에, H-2K α3 도메인의 사람 HLA-A2 α3 도메인으로의 대체를 포함하는 MHC I 복합체는 사람 CD8의 부재 하에서 마우스에서(즉, 생체내에서) 비기능성이었다. HLA-A2에 대해 유전자전이된 동물에서, 마우스 α3 도메인을 사람 α3 도메인으로 치환함으로써 T 세포 반응이 회복되었다. [Irwin et al. (1989) Species-restricted interactions between CD8 and the α3 domain of class I influence the magnitude of the xenogeneic response, J. Exp. Med. 170:1091-1101; Vitiello et al. (1991) 상기 참조].
또한, 마우스 MHC 클래스 I 단백질의 막관통 도메인 및 세포질 테일도 중요한 기능을 갖는다. MHC I 막관통 도메인의 한가지 기능은, 아마도 표면 MHC 분자의 가교-결합(또는 연결반응)의 결과로서, (부착을 증진시키거나 억제하도록) 동형(homotypic) 세포 부착의 HLA-A2에 의한 조절을 촉진시키는 것이다. [Wagner et al. (1994) Ligation of MHC Class I and Class II Molecules Can Lead to Heterologous Desensitization of Signal Transduction Pathways That Regulate Homotypic Adhesion in Human Lymphocytes, J. Immunol. 152:5275-5287]. 세포 부착은 HLA-A2 분자의 다양한 에피토프에 결합하는 mAb에 의해 영향을 받을 수 있으며, 이는, 동형 세포 부착을 조절하는데 연루되는 HLA-A2 상에 다수의 부위가 있음을 제시하며; 결합되는 에피토프에 따라 그 영향은 HLA-A2-의존적 부착을 증진시키거나 억제시킬 수 있다. Id.
MHC I 유전자의 엑손 6 및 7에 의해 암호화되는 세포질 테일은, 세포 표면 상의 적절한 발현 및 NK 세포 세포독성의 LIR1-매개된 억제에 필요한 것으로 알려져 있다. [Gruda et al. (2007) Intracellular Cysteine Residues in the Tail of MHC Class I Proteins Are Crucial for Extracellular Recognition by Leukocyte Ig-Like Receptor 1, J. Immunol. 179:3655-3661]. 세포질 테일은 시스테인 잔기 상의 디설파이드 결합의 형성을 통해 적어도 일부의 MHC I 분자를 다량체화하는데 필요하므로, 클러스터링(clustering) 및 NK 세포에 의한 인식에서 역할을 할 수 있다. [Lynch et al. (2009) Novel MHC Class I Structures on Exosomes, J. Immunol. 183:1884-1891].
비록 저캇(Jurkat) 세포에서 세포질 도메인이 결여된 돌연변이체 HLA-A2 분자가 발현, 세포골격 결합, 응집, 및 세포내이입 내재화에 대해 정상적인 것으로 보이지만, HLA-A2의 세포질 도메인은 구성적으로 포스포릴화된 세린 잔기 및 포스포릴화가능한 티로신을 포함한다. [Gur et al. (1997) Structural Analysis of Class I MHC Molecules: The Cytoplasmic Domain Is Not Required for Cytoskeletal Association, Aggregation, and Internalization, Mol. Immunol. 34(2):125-132]. 세포질 도메인이 결여된 절단된 HLA-A2 분자는 명백히 외견상 정상적으로 발현되고 β2 마이크로글로불린과 회합한다. Id.
그러나, 수개의 연구는, 세포질 테일이 세포내 트래피킹(trafficking), 수지상 세포(DC)-매개된 항원 제시, 및 CTL 프라이밍에 중요하다는 것을 입증하였다. 엑손 6에 의해 암호화되는 티로신 잔기가 엔도솜 구획을 통한 MHC I 트래피킹, 외인성 항원의 제시 및 CTL 프라이밍에 필요한 것으로 밝혀졌으며, 한편, 엑손 7의 결실은 항-바이러스 CTL 반응을 증진시켰다. [Lizee et al. (2003) Control of Dendritic Cross-Presentation by the Major Histocompatibility Complex Class I Cytoplasmic Domain, Nature Immunol. 4:1065-73; Basha et al. (2008) MHC Class I Endosomal and Lysosomal Trafficking Coincides with Exogenous Antigen Loading in Dendritic Cells, PLoS ONE 3: e3247; 및 Rodriguez-Cruz et al. (2011) Natural Splice Variant of MHC Class I Cytoplasmic Tail Enhances Dendritic Cell-Induced CD8+ T-Cell Responses and Boosts Anti-Tumor Immunity, PLoS ONE 6:e22939].
MHC 클래스 II 복합체는 2개의 비-공유결합적으로 회합된 도메인들: α 쇄 및 β 쇄를 포함하며, 이들은 또한 본원에서 α 폴리펩타이드 및 β 폴리펩타이드(도 1, 우측)로 언급된다. 단백질은 혈장막에 걸쳐 있으므로; 이는 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포질 도메인을 함유한다. α 쇄의 세포외 부분은 α1 및 α2 도메인들을 포함하며, β 쇄의 세포외 부분은 β1 및 β2 도메인들을 포함한다. α1 및 β1 도메인들은 세포 표면 상에 펩타이드-결합 틈을 형성한다. MHC II 복합체의 펩타이드-결합 틈의 3-차원 구조 입체배좌로 인하여, 결합된 항원의 길이에 있어서 이론적으로 상한은 없으나, 전형적으로 MHC II에 의해 제시된 펩타이드들은, 길이 13 내지 17개의 아미노산들이다.
항원성 펩타이드들과 이의 상호작용 이외에, MHC II 분자의 펩타이드-결합 틈은 MHC II 복합체 형성 및 펩타이드 획득의 공정들 동안에 불변의 쇄(Ii)와 상호작용한다. α/β MHC II 이량체들은 소포체 내에서 조립하여 Ii 쇄와 회합하며, 당해 쇄는 펩타이드 결합의 제어 및 MHC II의 식균작용 경로(endocytic pathway)의 표적화에 관여한다. 엔도솜에서, Ii는 단백질분해를 겪으며, Ii의 작은 단편, 클래스 II-관련된 불변 쇄 펩타이드(CLIP)는 펩타이드-결합 틈에서 잔존한다. 엔도솜에서, HLA-DM(사람들내에서)의 제어 하에, CLIP는 항원성 펩타이드에 대해 교환된다.
MHC II는 α2와 β2 도메인들 사이의 접합부에서 소수성 틈새(crevice)에서 T 세포 공동-수용체 CD4와 상호작용한다. [Wang and Reinherz (2002) Structural Basis of T Cell Recognition of Peptides Bound to MHC Molecules, Molecular Immunology, 38:1039-49]. CD4 및 T 세포 수용체가 펩타이드와 복합체화된 동일한 MHC II 분자에 결합하는 경우, 항원에 대한 T 세포의 민감성은 증가하며, 이는 활성화를 위해 100배 미만의 항원을 필요로 한다. 본원에 인용에 의해 포함된 문헌[Janeway's Immunobiology, 7th Ed., Murphy et al. eds., Garland Science, 2008]을 참조한다.
다수의 기능들이 MHC II의 막관통 및 세포질 도메인들을 위해 제안되어 왔다. 세포질 도메인의 경우에, 이는 세포내 신호전달, 혈장막에 대한 트래피킹(trafficking), 및 궁극적으로, 항원 제시를 위해 중요한 것으로 밝혀져 왔다. 예를 들면, T 세포 하이브리도마들은 세포질 도메인에서 절단된(truncated) MHC II β 쇄들로 형질감염된 항원-제시 세포들(APCs)에 대해 불량하게 반응하며, B 세포 분화의 유도가 방해받음이 밝혀졌다. 예를 들면, 문헌[Smiley et al. (1996) Truncation of the class II β-chain cytoplasmic domain influences the level of class II/invariant chain-derived peptide complexes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:241-44]. 클래스 II 분자들의 절단은 cAMP 생산을 손상시키는 것으로 여겨진다. MHC II의 세포질 테일의 결실은 세포내 트래피킹에 영향을 미침으로써 식균작용 경로에서 우연히 발견된 관련 항원들로부터 복합체를 방지하는 것으로 추정되어 왔다. 스밀리 등(Smiley et al.)(상기 참조)은, 세포질 도메인에서 클래스 II 분자들의 절단이 CLIP/클래스 II 복합체들의 수들 감소시킴을 입증하였으며, 이것이 항원 제시를 효과적으로 조절하는 CLIP의 능력에 영향을 미치는 것으로 추정하였다.
MHC II 클러스터링(clustering)은 T 세포 수용체(TCR) 개시(triggering)를 위해 중요하므로, 세포질 도메인에서 절단된 MHC II 분자들이 세포골격을 결합하여 응집하는 것으로부터 방지된 경우, T 세포들에 대한 항원 제시가 영향을 받을 수 있다. [Ostrand-Rosenberg et al. (1991) Abrogation of Tumorigenicity by MHC Class II Antigen Expression Requires the Cytoplasmic Domain of the Class II Molecule, J. Immunol. 147:2419-22]. 실제로, 세포질 도메인에서 절단된 HLA-DR은 올리고머화 후 세포골격과 회합하지 못하였음이 최근에 밝혀졌다. [El Fakhy et al. (2004) Delineation of the HLA-DR Region and the Residues Involved in the Association with the Cytoskeleton, J. Biol. Chem. 279:18472-80]. 중요하게도, 액틴 세포골격은 국재화된 신호 형질도입 활성의 부위이며, 이는 항원 제시를 수행할 수 있다. 세포골격과의 회합 외에도, 최근의 연구들은 또한, 모든 HLA-DR 분자들 중 20% 이하가 콜레스테롤 및 글리코스핑고지질들에서 풍부한 마이크로도메인들인, APC의 지질 뗏목(lipid raft)들에서 구성적으로 존재하며, 이러한 국재화는 항원 제시, 면역 시냅스 형성(immune synapse formation), 및 MHC II-매개된 신호전달에 중요함이 또한 밝혀졌다. 예를 들면, 문헌[Dolan et al. (2004) Invariant Chain and the MHC II Cytoplasmic Domains Regulate Localization of MHC Class II Molecules to Lipid Rafts in Tumor Cell-Based Vaccines, J. Immunol. 172:907-14]을 참조한다. 돌란(Dolan) 등은, MHC II의 세포질 도메인의 절단이 MHC II의 지질 땟목들에 대한 구성적 국재화를 감소시킴을 시사하였다.
또한, MHC II, 특히, β 쇄의 세포질 도메인은 식균작용 트래피킹, 내재화, 및 MHC II의 분해를 제어하는, 막-관련된 RING-CH I (MARCH I)인, 유비퀴틴 리가제에 의한 유비퀴틴화(ubiquitination)가 행해지는 류신 잔기를 함유하며; MARCH-매개된 유비퀴틴화는 수지상 세포 성숙(dendritic cell maturation)시 중단되어 혈장 막에서 증가된 수준들의 MHC II를 생성함이 밝혀졌다. [Shin et al. (2006) Surface expression of MHC class II in dendritic cells is controlled by regulated ubiquitination, Nature 444:115-18; De Gassart et al. (2008) MHC class II stabilization at the surface of human dendritic cells is the result of maturation-dependent MARCH I down-regulation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:3491-96].
MHC II의 α 및 β 쇄들의 막관통 도메인들은 서로 상호작용하며 이러한 상호작용은 클래스 II MHC 복합체의 적절한 조립에 중요하다. [Cosson and Bonifacino (1992) Role of Transmembrane Domain Interactions in the Assembly of Class II MHC Molecules, Nature 258:659-62]. 실제로, α 및 β 쇄들의 막관통 도메인들이 IL-2 수용체의 α 쇄들에 의해 대체된 MHC II 분자들은 ER 내에 보유되어 세포 표면에서 드물게 검출가능하였다. Id. 돌연변이유발 연구들을 통해, α 및 β 막관통 도메인들에서 보존된 Gly 잔기들은 세포 표면에서 MHC II 조립에 관여하는 것으로 밝혀졌다. Id. 따라서, 막관통 및 세포질 도메인들 둘 다는 MHC II 복합체의 적절한 기능에 결정적이다.
다양한 실시형태에서, 본원에서는 이의 게놈에 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 사람 또는 사람화된 MHC II 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류(예를 들면, 마우스 또는 래트)이 제공된다. MHC I 뉴클레오타이드 서열은, 부분적으로 사람 및 부분적으로 비-사람인 MHC I 폴리펩타이드, 예를 들면, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화할 수 있고, MHC II 뉴클레오타이드 서열은, 부분적으로 사람 및 부분적으로 비-사람인 MHC II 단백질, 예를 들면, 키메라 사람/비-사람 MHC II 단백질(예를 들면, 키메라 사람/비-사람 MHC II α 및 β 폴리펩타이드를 포함하는)을 암호화할 수 있다. 일부 양상에서, 동물은 내인성 MHC I 및 II 폴리펩타이드, 예를 들면, 기능성 내인성 MHC I 및 II 폴리펩타이드를 발현하지 않는다.
이의 게놈, 예를 들면, 내인성 유전자좌에서 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물은 미국 특허출원 제13/661,159호 및 제13/793,812호에 기재되어 있고, 이들 출원은 본원에서 전문이 참조로 인용된다. 이의 게놈, 예를 들면, 내인성 유전자좌에서 사람화된, 예를 들면, 키메라 사람/비-사람 MHC II 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물은 미국 특허출원 제13/661,116호 및 제13/793,935호에 기재되어 있고, 이들 출원은 본원에서 전문이 참조로 인용된다. 본원에서는 이의 내인성 MHC 유전자좌에서 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드 및 키메라 사람/비-사람 MHC II 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물이 제공된다. 마우스 염색체 17번 및 사람 염색체 6번 상의 MHC I와 MHC II 유전자의 인접한 연결로 인해 사람화된 MHC I 및 MHC II 동물의 단순 육종에 의해 상기 동물을 생성시키는 것은 어렵다. 따라서, 본 출원은, 또한, 사람 또는 사람화된 MHC I 및 MHC II 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물, 예를 들면, 내인성 MHC I 및 II 폴리펩타이드를 암호화하는 서열이 키메라 사람/비-사람 MHC I 및 II 폴리펩타이드를 암호화하는 것들로 대체된 동물을 생성시키기 위한 신규 방법을 제공한다.
따라서, 다양한 실시형태에서, 본원에서는 이의 게놈, 예를 들면, 내인성 MHC 유전자좌에서 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열(여기서, 상기 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함한다); 키메라 사람/비-사람 MHC II α 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열(여기서, 상기 키메라 MHC II α 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC II α 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함한다); 및 키메라 사람/비-사람 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열(여기서, 상기 키메라 MHC II β 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC II β 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함하고, 비-사람 동물은 이의 내인성 비-사람 MHC 유전자좌로부터 기능성 키메라 사람/비-사람 MHC I 및 MHC II 단백질을 발현한다)를 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물이 제공된다. 한 실시형태에서, 제1, 제2 및/또는 제3 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 MHC 유전자좌에 위치한다. 한 실시형태에서, 비-사람 동물이 마우스인 경우, 제1, 제2 및/또는 제3 뉴클레오타이드 서열은 마우스 염색체 17번 상에 내인성 마우스 MHC 유전자좌에 위치한다. 한 실시형태에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌에 위치한다. 한 실시형태에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 MHC II α 유전자좌에 위치한다. 한 실시형태에서, 제3 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 MHC II β 유전자좌에 위치한다.
한 실시형태에서, 비-사람 동물은 단지 키메라 사람/비-사람 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC β II 폴리펩타이드를 발현하고 내인성 비-사람 MHC 유전자좌로부터 내인성 비-사람 MHC 폴리펩타이드(예를 들면, 기능성 내인성 MHC I, II α 및/또는 II β 폴리펩타이드)를 발현하지 못한다. 한 실시형태에서, 본원에 기재된 동물은 이의 세포, 예를 들면, 항원 제시 세포 등 상에 기능성 키메라 MHC I 및 기능성 키메라 MHC II를 발현한다.
한 실시형태에서, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드는 이의 사람 부분에 사람 MHC I 폴리펩타이드의 펩타이드 결합 도메인을 포함한다. 한 양상에서, 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I의 세포외 도메인을 포함한다. 상기 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I의 α 쇄의 세포외 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I의 α1 및 α2 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I의 α1, α2 및 α3 도메인을 포함한다.
한 양상에서, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드의 사람 부분 및/또는 키메라 MHC II β 폴리펩타이드의 사람 부분은 각각 사람 MHC II α 폴리펩타이드 및/또는 사람 MHC II β 폴리펩타이드의 펩타이드-결합 도메인을 포함한다. 한 양상에서, 키메라 MHC II α 및/또는 β 폴리펩타이드의 사람 부분은 각각 사람 MHC II α 및/또는 β 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC II α 폴리펩타이드의 α1 도메인을 포함하고; 다른 실시형태에서, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC II α 폴리펩타이드의 α1 및 α2 도메인을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 키메라 MHC II β 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC II β 폴리펩타이드의 β1 도메인을 포함하고; 다른 실시형태에서, 키메라 MHC II β 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC II β 폴리펩타이드의 β1 및 β2 도메인을 포함한다.
사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드는, 임의의 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, 또는 HLA-G 유전자좌에 의해 암호화된 기능성 사람 HLA 분자로부터 유도될 수 있다. 사람 또는 사람화된 MHC II 폴리펩타이드는 임의의 HLA-DP, -DQ, 및 -DR 유전자좌에 의해 암호화된 기능성 사람 HLA 분자로부터 유도될 수 있다. 통상적으로 사용되는 HLA 항원 및 대립형질유전자의 목록은 문헌[참조: Shankarkumar et al. ((2004) The Human Leukocyte Antigen (HLA) System, Int. J. Hum. Genet. 4(2):91-103)]에 기재되어 있고, 이는 본원에 참조로서 인용된다. 샨카르쿠마르 등(Shankarkumar et al.)은 또한 당업계에 사용되는 HLA 명명법의 간략한 설명을 제공한다. HLA 명명법 및 다양한 HLA 대립형질유전자에 관한 추가의 정보는 문헌[Holdsworth et al. (2009) The HLA dictionary 2008: a summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, and DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens, Tissue Antigens 73:95-170, 및 a recent update by Marsh et al. (2010) Nomenclature for factors of the HLA system, 2010, Tissue Antigens 75:291-455]에서 찾을 수 있고, 상기 둘 다는 본원에 참조로서 인용된다. 따라서, 사람 또는 사람화된 MHC I 및/또는 II 폴리펩타이드는, 본원에 기재된 임의의 기능성 사람 HLA 분자로부터 유도될 수 있다.
특히 관심 대상은 다수의 사람 질환, 예를 들면, 사람 자가면역 질환과 연관되어 있는 것으로 공지된 사람 HLA 분자, 특이적 다형태 HLA 대립형질유전자이다. 사실, HLA 유전자좌에서 특이적 다형성은 류마티스 관절염, I형 당뇨병, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 그레이브스 질환, 전신성 홍반 낭창, 셀리악병, 크론 질환, 궤양성 대장염 및 다른 자가면역 장애의 발병과 서로 관련된 것으로 확인되었다. 예를 들면, 문헌[Wong and Wen (2004) What can the HLA transgenic mouse tell us about autoimmune diabetes?, Diabetologia 47:1476-87; Taneja and David (1998) HLA Transgenic Mice as Humanized Mouse Models of Disease and Immunity, J. Clin. Invest. 101:921-26; Bakker et al. (2006), A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC, Nature Genetics 38:1166-72 및 Supplementary Information; and International MHC and Autoimmunity Genetics Network (2009) Mapping of multiple susceptibility variants within the MHC region for 7 immune-mediated diseases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:18680-85]을 참조한다. 따라서, 사람 또는 사람화된 MHC I 및/또는 II 폴리펩타이드는 특정 질환, 예를 들면, 자가면역 질환과 연관된 것으로 공지된 사람 HLA 분자로부터 유도될 수 있다.
하나의 구체적 양상에서, 상기 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드는 사람 HLA-A로부터 유도된다. 구체적인 실시형태에서, HLA-A 폴리펩타이드는 HLA-A2 폴리펩타이드(예를 들면, 및 HLA-A2.1 폴리펩타이드)이다. 한 실시형태에서, HLA-A 폴리펩타이드는 HLA-A*0201 대립형질유전자, 예를 들면, HLA-A*02:01 :01 :01 대립형질유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드이다. HLA-A*0201 대립형질유전자는 통상적으로 북아메리카 집단에서 사용된다. 본 실시예가 특정 HLA 서열을 기재하지만 임의의 적합한 HLA-A 서열은 본원에 포함되고, 예를 들면, 사람 집단에서 나타나는 HLA-A2의 다형성 변이체, 하나 이상의 보존성 또는 비-보존성 아미노산 변형을 갖는 서열, 유전자 암호 등의 축퇴성으로 인해 본원에 기재된 서열과 상이한 핵산 서열이 있다.
다른 구체적인 양상에서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 사람 부분은, HLA-B 및 HLA-C로부터 선택된 사람 MHC I로부터 유도된다. 한 양상에서, 이것은 HLA-B, 예를 들면, HLA-B27로부터 유도된다. 다른 양상에서, 이것은 HLA-A3, -B7, -Cw6 등으로부터 유도된다.
하나의 구체적인 양상에서, 본원에 기재된 사람화된 MHC II α 및 β 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 HLA-DR, 예를 들면, HLA-DR4로부터 유도된다. 전형적으로, HLA-DR α쇄는 단일 형태이고, 예를 들면, HLA-DR 복합체의 α쇄는 HLA-DRA 유전자(예를 들면, HLA-DRα*01 유전자)에 의해 암호화된다. 한편, HLA-DR β 쇄는 다형성이다. 따라서, HLA-DR4는, HLA-DRA 유전자에 의해 암호화된 α쇄 및 HLA-DRB1 유전자(예를 들면, HLA-DRβ1*04 유전자)에 의해 암호화된 β쇄를 포함한다. 하기 본원에 기재된 바와 같이, HLA-DR4는 다수의 자가면역 질환, 예를 들면, 류마티스 관절염, I형 당뇨병, 다발성 경화증 등의 발병과 연관되어 있는 것으로 공지되어 있다. 본 발명의 한 실시형태에서, HLA-DRA 대립형질유전자는 HLA-DRα*01 대립형질유전자, 예를 들면, HLA-DRα*01:01:01:01이다. 다른 실시형태에서, HLA-DRB 대립형질유전자는 HLA-DRβ1*04, 예를 들면, HLA-DRβ1*04:01:01이다. 본 실시예가 이들 특정 HLA 서열을 기재하고 있지만, 임의의 적합한 HLA-DR 서열이 본원에 포괄되고, 예를 들면, 사람 집단에서 나타나는 다형성 변이체, 하나 이상의 보존성 또는 비-보존성 아미노산 변형을 갖는 서열, 유전자 암호의 축퇴성 등으로 인해 본원에 기재된 서열과 상이한 핵산 서열이 있다.
키메라 MHC II α 및/또는 β 폴리펩타이드의 사람 부분은 통상의 사람 질환과 연관된 것으로 공지된 HLA 대립형질유전자의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 상기 HLA 대립형질유전자는 HLA-DRB1*0401, -DRB1*0301, -DQA1*0501, -DQB1*0201, -DRB1*1501, -DRB1*1502, -DQB1*0602, -DQA1*0102, -DQA1*0201, -DQB1 *0202, -DQA1*0501, 및 이들의 조합을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. HLA 대립형질유전자/질환 연관의 개요에 대해서 본원에 참조로서 인용되는 상기 문헌[Bakker et al. (2006), supra]을 참조한다.
한 양상에서, 키메라 사람/비-사람 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β폴리펩타이드(들)의 비-사람 부분은 각각 내인성 비-사람(예를 들면, 설치류, 예를 들면, 마우스, 래트 등) MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩타이드(들)의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함한다. 따라서, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 내인성 비-사람 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 키메라 MHC II α 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 내인성 비-사람 MHC II α 폴리펩타이드의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 키메라 사람/비-사람 MHC II β 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 내인성 비-사람 MHC II β 폴리펩타이드의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 한 양상에서, 비-사람 동물은 마우스이고 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 마우스 H-2K 단백질로부터 유도된다. 한 양상에서, 상기 동물은 마우스이고, 키메라 MHC II α 및 β 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 마우스 H-2E 단백질로부터 유도된다. 따라서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 마우스 H-2K로부터 유도된 막관통 및 세포질 도메인을 포함할 수 있고, 키메라 MHC II α 및 β 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 마우스 H-2E 단백질로부터 유도된 막관통 및 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 특이적 H-2K 및 H-2E 서열이 실시예에서 고려되지만 임의의 적합한 서열, 예를 들면, 다형성 변이체, 보존성/비-보존성 아미노산 치환 등이 본원에 포함된다.
키메라 사람/비-사람 폴리펩타이드는 사람 또는 비-사람 리더(신호) 서열을 포함하도록 할 수 있다. 한 실시형태에서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드는 내인성 MHC I 폴리펩타이드의 비-사람 리더 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드는 내인성 MHC II α 폴리펩타이드의 비-사람 리더 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 키메라 MHC II β 폴리펩타이드는 내인성 MHC II β 폴리펩타이드의 비-사람 리더 서열을 포함한다. 대안의 실시형태에서, 키메라 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩타이드(들)은 각각 다른 비-사람 동물, 예를 들면, 다른 설치류 또는 다른 마우스 스트레인 유래의 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩타이드(들)의 비-사람 리더 서열을 포함한다. 따라서, 키메라 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 각각 비-사람 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 리더 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩타이드(들)은 각각 사람 MHC I, 사람 MHC II α 및/또는 사람 MHC II β 폴리펩타이드의 사람 리더 서열(예를 들면, 각각 사람 HLA-A2, 사람 HLA-DRA 및/또는 사람 HLA-DRβ1*04의 리더 서열)을 포함한다.
키메라 사람/비-사람 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩타이드는 각각 이의 사람 부분에서 사람 MHC I, 사람 MHC II α 및/또는 사람 MHC II β 폴리펩타이드의 완전하거나 실질적으로 완전한 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 사람 부분은 사람 MHC I, 사람 MHC II α 및/또는 사람 MHC II β 폴리펩타이드(예를 들면, 사람 HLA-A2, 사람 HLA-DRA 및/또는 사람 HLA-DRβ1*04)의 세포외 도메인을 암호화하는 아미노산의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들면, 적어도 95%를 포함할 수 있다. 하나의 예에서, 사람 MHC I, MHC II α 및/또는 사람 MHC II β 폴리펩타이드의 실질적으로 완전한 세포외 도메인에는 사람 리더 서열이 결여되어 있다. 다른 예에서, 키메라 사람/비-사람 MHC I, 키메라 사람/비-사람 MHC II α 및/또는 키메라 사람/비-사람 MHC II β 폴리펩타이드는 사람 리더 서열을 포함한다.
또한, 키메라 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩타이드는 각각 내인성 비-사람 프로모터 및 조절 요소들, 예를 들면, 마우스 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 조절 요소들(예를 들면, 이의 조절 제어 하에 발현될 수 있음)에 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 배열은 비-사람 동물에서, 예를 들면, 비-사람 동물에서 면역 반응 동안 키메라 MHC I 및/또는 MHC II 폴리펩타이드의 적절한 발현을 촉진시킬 것이다.
유전자 변형된 비-사람 동물은, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 소과(예를 들면, 암소, 황소, 물소), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 페럿, 영장류(예를 들면, 마모셋, 붉은털 원숭이)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 적합한 유전자 변형가능한 ES 세포를 쉽게 이용할 수 없는 비-사람 동물의 경우, 유전자 변형을 포함하는 비-사람 동물을 만들기 위해 다른 방법들을 사용한다. 이러한 방법은, 예를 들면, 비-ES 세포 게놈(예를 들면, 섬유아세포 또는 유도된 다능성 세포)을 변형시키고, 핵 전이를 사용하여 변형된 게놈을 적합한 세포, 예를 들면, 난모세포로 전이시키고, 변형된 세포(예를 들면, 변형된 난모세포)를 적합한 조건 하에서 비-사람 동물에 임신시켜 배아를 형성함을 포함한다.
한 양상에서, 비-사람 동물은 포유동물이다. 한 양상에서, 비-사람 동물은, 예를 들면, 뛰는쥐상과(Dipodoidea) 또는 쥐상과(Muroidea) 상과(superfamily)의 작은 포유동물이다. 한 실시형태에서, 유전자 변형된 동물은 설치류이다. 한 실시형태에서, 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 설치류는 쥐상과(Muroidea)로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 유전자 변형된 동물은, 칼로마이시다에(Calomyscidae)(예를 들면, 마우스-유사 햄스터), 비단털쥐과(Cricetidae)(예를 들면, 햄스터, 뉴 월드 래트 및 마우스, 들쥐), 쥐과(Muridae)(트루 마우스 및 래트, 게르빌루스쥐, 아프리카가시쥐, 갈기쥐), 네소마이다에(Nesomyidae)(등산쥐, 바위쥐, 위드-테일드(with-tailed) 래트, 말라가시(Malagasy) 래트 및 마우스), 가시겨울잠쥐과(Platacanthomyidae)(예를 들면, 가시겨울잠쥐), 및 소경쥐과(Spalacidae)(예를 들면, 두더지쥐, 대나무쥐, 및 조코)로부터 선택된 과 유래이다. 특정 실시형태에서, 유전자 변형된 설치류는 트루 마우스 또는 래트(Muridae 과), 게르빌루스쥐, 아프리카가시쥐 및 갈기쥐로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 유전자 변형된 마우스는 쥐과(family Muridae)의 구성원 유래이다. 한 실시형태에서, 동물은 설치류이다. 특정 실시형태에서, 설치류는 마우스 및 래트로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 비-사람 동물은 마우스이다.
특정 실시형태에서, 비-사람 동물은, C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola로부터 선택되는 C57BL 스트레인의 마우스인 설치류이다. 다른 실시형태에서, 마우스는, 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예: 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 스트레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 129 스트레인이다[예를 들면, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836을 참조하고, 또한, Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines을 참조한다]. 특정 실시형태에서, 유전자 변형된 마우스는, 상기 언급된 129 스트레인과 상기 언급된 C57BL/6 스트레인의 믹스이다. 다른 특정 실시형태에서, 마우스는 상기 언급된 129 스트레인의 믹스 또는 상기 언급된 BL/6 스트레인의 믹스이다. 특정 실시형태에서, 믹스의 129 스트레인은 129S6(129/SvEvTac) 스트레인이다. 다른 실시형태에서, 마우스는 BALB 스트레인, 예를 들면, BALB/c 스트레인이다. 또 다른 실시형태에서, 마우스는 BALB 스트레인과 다른 상기 언급된 스트레인의 믹스이다.
한 실시형태에서, 비-사람 동물은 래트이다. 한 실시형태에서, 래트는 위스타(Wistar) 래트, LEA 스트레인, 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 스트레인, 피셔(Fischer) 스트레인, F344, F6 및 다크 아고우티(Dark Agouti)로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 래트 스트레인은, 위스타, LEA, 스프라그 돌리, 피셔, F344, F6 및 다크 아고우티로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 둘 이상의 스트레인의 믹스이다.
따라서, 한 실시형태에서, 본 발명은, 이의 게놈에서 키메라 사람/마우스 MHC I를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 키메라 사람/마우스 MHC II α를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열, 및 키메라 사람/마우스 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 변형된 마우스에 관한 것이다. 키메라 MHC I, MHC II α, 및 MHC II β의 사람 부분은 각각 사람 MHC I, MHC II α, 및 MHC II β의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 상기 마우스는 이의 내인성 마우스 MHC 유전자좌로부터 기능성 키메라 사람/마우스 MHC I, MHC II α, 및 MHC II β 폴리펩타이드를 발현한다. 한 실시형태에서, 상기 마우스는 이의 내인성 마우스 MHC 유전자좌로부터 기능성 마우스 MHC 폴리펩타이드, 예를 들면, 기능성 마우스 MHC I, MHC II α, 및 MHC II β 폴리펩타이드를 발현하지 않는다.
한 실시형태에서, 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I의 펩타이드 결합 도메인 또는 세포외 도메인(예를 들면, 사람 HLA-A, 예를 들면, 사람 HLA-A2, 예를 들면, 사람 HLA-A2.1)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 마우스는 이의 내인성 마우스 MHC I 유전자좌로부터 내인성 마우스 MHC I 폴리펩타이드의 펩타이드 결합 또는 세포외 도메인을 발현하지 않는다. 사람 MHC I의 펩타이드 결합 도메인은 α1 및 α2 도메인을 포함할 수 있다. 대안으로, 사람 MHC I의 펩타이드 결합 도메인은 α1, α2 및 α3 도메인을 포함할 수 있다. 한 양상에서, 사람 MHC I의 세포외 도메인은 사람 MHC I α 쇄의 세포외 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 내인성 마우스 MHC I 유전자좌는 H-2K(예를 들면, H-2Kb) 유전자좌이고, 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 H-2K(예를 들면, H-2Kb) 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명의 마우스는 이의 내인성 마우스 MHC I 유전자좌에서, 키메라 사람/마우스 MHC I를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서, 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 HLA-A2(예를 들면, HLA-A2.1) 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함하고 마우스 부분은 마우스 H-2K(예를 들면, H-2Kb) 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고, 마우스는 키메라 사람/마우스 HLA-A2/H-2K 단백질을 발현한다. 다른 실시형태에서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 마우스 부분은 다른 마우스 MHC I, 예를 들면, H-2D, H-2L 등으로부터 유도될 수 있고; 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 사람 부분은 다른 사람 MHC I, 예를 들면, HLA-B, HLA-C 등으로부터 유도될 수 있다. 한 양상에서, 상기 마우스는 이의 내인성 마우스 H-2K 유전자좌로부터 기능성 내인성 H-2K 폴리펩타이드를 발현하지 않는다.
한 실시형태에서, 키메라 사람/마우스 MHC II α 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC II α 펩타이드 결합 또는 세포외 도메인을 포함하고, 키메라 사람/마우스 MHC II β 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC II β 펩타이드 결합 또는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 마우스는 내인성 마우스 유전자좌(예를 들면, H-2A 및/또는 H-2E 유전자좌)로부터 내인성 마우스 α 및/또는 β 폴리펩타이드의 펩타이드 결합 또는 세포외 도메인을 발현하지 않는다. 일부 실시형태에서, 마우스는 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, H-2Ea, 및 이들의 조합을 포함하는 기능성 MHC 클래스 II 분자를 암호화하는 유전자가 없는 게놈을 포함한다. 사람 MHC II α 폴리펩타이드의 펩타이드 결합 도메인은 α1 도메인을 포함할 수 있고 사람 MHC II β 폴리펩타이드의 펩타이드 결합 도메인은 β1 도메인을 포함할 수 있고; 따라서, 키메라 MHC II 복합체의 펩타이드 결합 도메인은 사람 α1 및 β1 도메인을 포함할 수 있다. 사람 MHC II α 폴리펩타이드의 세포외 도메인은 α1 및 α2 도메인을 포함할 수 있고 사람 MHC II β 폴리펩타이드의 세포외 도메인은 β1 및 β2 도메인을 포함할 수 있고; 따라서, 키메라 MHC II 복합체의 세포외 도메인은 사람 α1, α2, β1 및 β2 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 키메라 MHC II 복합체의 마우스 부분은 마우스 MHC II, 예를 들면, 마우스 H-2E의 막관통 및 세포질 도메인(예를 들면, 마우스 H-2E α 및 β 쇄의 막관통 및 세포질 도메인)을 포함한다. 따라서, 한 실시형태에서, 본 발명의 마우스는 이의 내인성 마우스 MHC II 유전자좌에서 키메라 사람/마우스 MHC II α를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC II의 쇄(예를 들면, HLA-DR4의 쇄)로부터 유래하는 세포외 도메인을 포함하고, 마우스 부분은 마우스 MHC II의 쇄(예를 들면, H-2E)로부터 기원하는 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고; 마우스는 이의 내인성 마우스 MHC II 유전자좌에서 키메라 사람/마우스 MHC II β를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서, 키메라 MHC II β 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC II의 β 쇄(예를 들면, HLA-DR4의 β쇄)로부터 기원하는 세포외 도메인을 포함하고, 마우스 부분은 마우스 MHC II(예를 들면, H-2E)의 β쇄로부터 기원하는 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고; 여기서, 마우스는 키메라 사람/마우스 HLA-DR4/H-2E 단백질을 발현한다. 다른 실시형태에서, 키메라 MHC II 단백질의 마우스 부분은 다른 마우스 MHC II, 예를 들면, H-2A 등으로부터 유래할 수 있고, 키메라 MHC II 단백질의 사람 부분은 다른 사람 MHC II, 예를 들면, HLA-DQ 등으로부터 기원할 수 있다. 한 양상에서, 상기 마우스는 이들의 내인성 마우스 유전자좌로부터 기능성 내인성 H-2A 및 H-2E 폴리펩타이드를 발현하지 않는다(예를 들면, 마우스는 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, 및 H-2Ea 폴리펩타이드를 발현하지 않는다).
추가의 실시형태에서, 본 발명의 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류, 예를 들면, 마우스는 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. β2 마이크로글로불린 또는 MHC 클래스 I 복합체의 경쇄(또한 "β2M"으로 약칭)는 주로 MHC I α 쇄를 안정화시키는 기능을 하는 소형(12 kDa) 비-당화 단백질이다. 사람 또는 사람화된 마이크로글로불린 동물의 생성은 미국 특허출원 제13/661,159호에 상세하게 기재되어 있고 본원에 참조로서 인용된다. 본원에 기재된 바와 같이 사람화된 MHC 유전자좌 및 미국 특허출원 제13/661,159호에 기재된 바와 같은 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 포함하는 마우스는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 육종에 의해 생성될 수 있다.
유전자 변형된 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류, 예를 들면, 래트 또는 마우스의 다양한 다른 실시형태는 본원에서 및 본원에 참조로서 인용된 미국 특허출원 제13/661,159호 및 제13/661,116호의 기재로부터 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명의 다양한 양상에서, 키메라 사람/비-사람 MHC I 및 MHC II 폴리펩타이드를 암호화하는 서열(들)은 내인성 비-사람 MHC 유전자좌(예를 들면, 마우스 H-2K 및/또는 H-2E 유전자좌)에 위치한다. 한 실시형태에서, 이것은 내인성 MHC 유전자(들) 또는 이의 부분을 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)로 대체시킨다. MHC I, MHC II α 및 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 하나의 동물에서 MHC I 및 MHC II 둘다의 사람화에서 최대의 성공을 성취하기 위해 염색체 상에 서로 인접하게 위치하기 때문에, MHC I 및 MHC II 유전자좌는 연속적으로 표적화되어야만 한다. 따라서, 또한, 본원에서는 본원에 기재된 바와 같은 키메라 사람/비-사람 MHC I, MHC II α및 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물을 생성시키는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 방법은 실시예에 기재된 바와 같이 VELOCIMOUSE® 기술을 사용하여 작제물을 ES 세포로 도입하고 표적화된 ES 세포 클론을 마우스 배아로 도입하는, VELOCIGENE® 기술을 사용하여 제조된 표적화 작제물을 사용한다.
본원에 기재된 비-사람 동물을 생성하기 위해 사용되는 뉴클레오타이드 작제물이 또한 제공된다. 한 양상에서, 뉴클레오타이드 작제물은 5' 및 3' 비-사람 상동성 아암, 사람 MHC 유전자 서열(예를 들면, 사람 HLA-A2 또는 사람 HLA-DR4 유전자 서열)을 포함하는 사람 DNA 단편 및 재조합 부위에 의해 플랭킹된 선택 카세트를 포함한다. 한 실시형태에서, 사람 DNA 단편은 사람 MHC 유전자(예를 들면, 사람 HLA-A2 또는 HLA-DR4 유전자)의 인트론 및 엑손 둘다를 포함하는 게놈 단편이다. 한 실시형태에서, 비-사람 상동성 아암은 비-사람 MHC 유전자좌(예를 들면, MHC I 또는 MHC II 유전자좌)와 상동성이다. 특이적 작제물은 하기 실시예(예를 들면, MHC II 작제물, MAID 1680에 대해 도 6; MHC I 작제물, MAID 1665에 대해 도 8) 및 본원에 참조로서 인용되는 미국 출원 번호 제13/661,159호 및 제13/661,116호에 기재되어 있다.
선택 카세트는 목적하는 작제물이 통합된 세포(예를 들면, ES 세포)의 선택을 촉진시키기 위해 표적화 작제물로 삽입된 뉴클레오타이드 서열이다. 다수의 적합한 선택 카세트는 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 선택 카세트는 특정 항생제(예를 들면, Neo, Hyg, Pur, CM, Spec 등)의 존재하에 양성 선택을 가능하게 한다. 추가로, 선택 카세트는 재조합 부위에 의해 플랭킹될 수 있고 이는 리컴비나제 효소로 처리시 선택 카세트가 결실되게 한다. 통상적으로 사용되는 재조합 부위는 loxP 및 Frt이고, 이는 Cre 및 Flp 효소 각각에 의해 인지되고 다른 것들은 당업계에 공지되어 있다. 한 실시형태에서, 선택 카세트는 사람 DNA 단편의 5' 말단에 위치한다. 또 다른 실시형태에서, 선택 카세트는 사람 DNA 단편의 3' 말단에 위치한다. 또 다른 실시형태에서, 선택 카세트는 사람 DNA 단편 내에 위치한다. 또 다른 실시형태에서, 선택 카세트는 사람 DNA 단편의 인트론 내에 위치한다.
한 실시형태에서, 5' 및 3' 비-사람 상동성 아암은 각각 내인성 비-사람 (예를 들면, 뮤린) MHC 클래스 I 또는 클래스 II 유전자좌의 5' 및 3' 위치(예를 들면, 제1 리더 서열의 5' 및 마우스 MHC I 유전자의 α3 엑손의 3', 또는 H-2Ab1 유전자의 업스트림 및 마우스 H-2Ea 유전자의 다운스트림)에 게놈 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 내인성 MHC 클래스 I 유전자좌는 마우스 H-2K, H-2D 및 H-2L로부터 선택된다. 특이적 실시형태에서, 상기 내인성 MHC 클래스 I의 유전자좌는 마우스 H-2K이다. 한 실시형태에서, 내인성 MHC II 유전자좌는 마우스 H-2E 및 H-2A로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 유전자 가공된 MHC II 작제물은 마우스 H-2E 및 H-2A 유전자 둘다의 대체를 허용한다.
따라서, 한 실시형태에서, 본원에서는 내인성 비-사람 MHC II 유전자좌에서 비-사람 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 사람/비-사람 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하여 제1 비-사람 동물을 생성시키고; 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌에서 비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하여 제2 비-사람 동물을 생성시킴을 포함하는 사람화된 MHC I 및 II 단백질을 발현할 수 있는 유전자 가공된 비-사람 동물(예를 들면, 설치류, 예를 들면, 래트 또는 마우스)을 생성시키는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열을 대체하는 단계는 ES 세포에서 상동성 재조합을 포함한다. 한 실시형태에서, 제2 비-사람 동물은 키메라 사람/비-사람 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 ES 세포에서 상동성 재조합에 의해 생성된다. 대안으로, 또한, 본원에서는 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌에서 비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하여 제1 비-사람 동물을 생성하고; 내인성 비-사람 MHC II 유전자좌에서 비-사람 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 사람/비-사람 MHC II 복합체를 암호하하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하여 제2 비-사람 동물을 생성시킴을 포함하는 사람화된 MHC I 및 MHC II 단백질을 발현할 수 있는 유전자 가공된 비-사람 동물(예를 들면, 설치류, 예를 들면, 래트 또는 마우스)을 생성시키는 방법이 제공된다. 상기 실시형태에서, 제2 비-사람 동물은 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 ES 세포에서 상동성 재조합에 의해 생성된다.
유전자 표적화 완료시, ES 세포 또는 유전자 변형된 비-사람 동물은 목적하는 외인성 뉴클레오타이드 서열의 성공적인 혼입 또는 외인성 폴리펩타이드의 발현을 확인하기 위해 스크리닝한다. 수많은 기술이 당업자에게 공지되어 있고 서던 블롯팅, 긴 PCR, 정량적 PCT(예를 들면, TAQMAN®을 사용하는 실시간 PCR), 동일계 하이브리드화에서의 형광성, 노던 블롯팅, 유동 세포측정, 웨스턴 분석, 면역세포화학, 면역조직화학 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 실시형태에서,목적하는 유전자 변형을 함유하는 비-사람 동물(예를 들면, 마우스)은 문헌[참조: Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21 (6):652-659]에 기재된 대립형질유전자 분석의 변형을 사용한 마우스 대립형질유전자의 상실 및/또는 사람 대립형질유전자의 획득에 대해 스크리닝함에 의해 확인될 수 있다. 유전자 변형된 동물에서 특이적 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 확인하는 다른 분석은 당업자에게 공지되어 있다.
한 양상에서, 키메라 사람/비-사람 MHC I 및 MHC II 단백질(예를 들면, HLA-A2/H-2K 및 HLA-DR4/H-2E 단백질)을 발현하는 세포가 제공된다. 한 실시형태에서, 세포는 본원에 기재된 바와 같은 키메라 MHC 클래스 I의 서열 및 키메라 MHC 클래스 II의 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 한 실시형태에서, 세포는 CHO, COS, 293, HeLa, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포(예를 들면, PERC.6™ 세포)로부터 선택된다.
본원에 기재된 HLA-DR4의 세포외 도메인을 포함하는 키메라 MHC II 복합체는 항-HLA-DR 항체에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 키메라 사람/비-사람 MHC II 폴리펩타이드를 디스플레이하는 세포는 항-HLA-DR 항체를 사용하여 검출되고/되거나 선택될 수 있다. 본원에 기재된 HLA-A2의 세포외 도메인을 포함하는 키메라 MHC I 복합체는 항-HLA-A, 예를 들면, 항-HLA-A2 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 따라서, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 디스플레이하는 세포는 항-HLA-A 항체를 사용하여 검출되고/되거나 선택될 수 있다. 다른 HLA 대립형질유전자를 인지하는 항체는 시판될 수 있거나 생성될 수 있고 검출/선별을 위해 사용될 수 있다.
하기의 실시예는 이의 게놈이 마우스 H-2K, 및 H-2A 및 H-2E 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 각각 키메라 사람/마우스 HLA-A2/H-2K 및 HLA-DR4/H-2E 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체된 것을 포함하는 유전자 가공된 동물을 기재하고 있지만, 당업자는 유사한 전략을 사용하여 다른 사람 MHC I 및 II 유전자들 (다른 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C; 및 다른 HLA-DR, H LA-DP 및 HLA-DQ 유전자)를 포함하는 키메라를 도입할 수 있음을 이해할 것이다. 내인성 MHC 유전자좌에서 다수의 키메라 사람/비-사람(예를 들면. 사람/설치류, 예를 들면, 사람/마우스)를 포함하는 상기 동물이 또한 제공된다.
각종 실시형태들에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물들은 사람 또는 사람화된 MHC I 및 II를 갖는 APC를 세포 표면 상에서 제조하며, 그 결과, 복합체의 성분들 중 실질적으로 모두가 사람이거나 사람화되어 있기 때문에, 사람과 유사한 방식으로 T 세포들에 대한 에피토프(epitope)들로서 펩타이드들을 나타낸다. 본 발명의 유전자 변형된 비-사람 동물들은 사람화된 동물에서 사람 면역계의 기능을 연구하기 위해; 면역 반응을 유발하는 항원들 및 항원 에피토프들(예를 들면, T 세포 에피토프들, 예를 들면, 유일한 사람 암 에피토프들)의 확인을 위해, 예를 들면, 백신 개발시 사용하기 위해; 백신 후보물들 및 다른 백신 전략들의 평가를 위해; 사람 자가면역성을 연구하기 위해; 사람 감염성 질병들을 연구하기 위해; 및 달리는 사람 MHC 발현을 기준으로 하여 보다 우수한 치료학적 전략들을 고안하기 위해 사용될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 비제한적 실시예들에 의해 추가로 설명할 것이다. 이들 실시예들은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시되지만 어떠한 방식으로도 이의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 이들 실시예들은, 당해 분야의 통상의 숙련가들에게 잘 공지될 수 있는 통상의 방법들의 상세한 설명(분자 클로닝 기술들 등)을 포함하지 않는다. 달리 나타내지 않는 한, 부(part)는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨로 나타내고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
실시예 1: 키메라 사람/마우스 MHC II 유전자좌의 조작 및 키메라 MHC II 마우스의 생성
실시예
1.1: 내인성
MHC
클래스 II H-2A 및 H-2E
유전자좌의
결실
VELOCIGENE® 유전자 조작 기술(참조: 예를 들면, 미국 특허 제6,586,251호 및 Valenzuela et al., 상기 참조)을 사용하여 내인성 MHC 클래스 II H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, 및 H-2Ea 유전자들의 결실을 도입하기 위한 표적화 벡터를 제조하였다. 세균 인공 염색체(BAC) RP23-458i22[제조원: 인비트로겐(Invitrogen)] DNA를 변형시켜 내인성 MHC 클래스 II 유전자들 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, 및 H-2Ea를 결실시켰다.
요약하면, 업스트림 및 다운스트림 상동성 아암들은 마우스 BAC DNA의 PCR에 의해 H-2Ab1 유전자의 5' 및 H-2Ea 유전자의 3' 위치로부터 각각 유도되었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 이들의 상동성 아암들을 사용하여 MHC 클래스 II 유전자좌의 유전자들 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, 및 H-2Ea를 포함하는 약 79kb의 RP23-458i22가 결실된 카세트를 세균 상동성 재조합(BHR)에 의해 제조하였다. 당해 영역을 lox66 및 lox71 부위에 의해 플랭킹된 하이그로마이신 카세트로 대체하였다. 최종의 표적화 벡터는, 5'로부터 3'까지, 내인성 MHC 클래스 II 유전자좌의 H-2Ab1 유전자에 대해 마우스 게놈 서열 5'을 포함하는 34kb의 상동성 아암, 5' lox66 부위, 하이그로마이신 카세트, 3' lox71 부위, 및 내인성 MHC 클래스 II 유전자좌의 H-2Ea 유전자에 대해 마우스 게놈 서열 3'을 포함하는 63kb의 상동성 아암을 포함하였다(MAID 5111, 도 6 참조).
BAC DNA 표적화 벡터(상기에 기술함)를 사용하여 마우스 ES 세포들을 전기천공(electroporate)시켜 내인성 MHC 클래스 II 유전자좌의 결실을 포함하는 변형된 ES 세포들을 생성하였다. 결실된 내인성 MHC 클래스 II 유전자좌를 함유하는 양성 ES 세포들을 정량적 PCR 검정에 의해 TAQMANTM 프로브들을 사용하여 확인하였다[참조: Lie and Petropoulos (1998) Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48]. 결실된 유전자좌의 업스트림 영역은, PCR에 의해 프라이머들 5111U F(CAGAACGCCAGGCTGTAAC; 서열번호 1) 및 5111U R(GGAGAGCAGGGTCAGTCAAC; 서열번호 2) 및 프로브 5111U P(CACCGCCACTCACAGCTCCTTACA; 서열번호 3)를 사용하여 확인하였고, 반면, 결실된 유전자좌의 다운스트림 영역은, 프라이머들 5111D F(GTGGGCACCATCTTCATCATTC; 서열번호 4) 및 5111D R(CTTCCTTTCCAGGGTGTGACTC; 서열번호 5) 및 프로브 5111D P(AGGCCTGCGATCAGGTGGCACCT; 서열번호 6)을 사용하여 확인하였다. 표적화 벡터 유래의 하이그로마이신 카세트의 존재는 프라이머들 HYGF(TGCGGCCGATCTTAGCC; 서열번호 7) 및 HYGR(TTGACCGATTCCTTGCGG; 서열번호 8) 및 프로브 HYGP(ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; 서열번호 9)를 사용하여 확인하였다. 업스트림 결실점에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 10)은, 결실점에 존재하는 카세트 서열에 인접하게 연결된 결실점 업스트림의 내인성 마우스 서열(하기 괄호안에 함유됨)을 나타내는, 다음 서열을 포함하였다: (TTTGTAAACA AAGTCTACCC AGAGACAGAT GACAGACTTC AGCTCCAATG CTGATTGGTT CCTCACTTGG GACCAACCCT) CTCGAGTACC GTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT ATGCATCCGG GTAGGGGAGG. 다운스트림 결실점에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 11)은, 결실점 다운스트림의 내인성 마우스 서열과 인접한 카세트 서열(하기 괄호 안에 함유됨)을 나타내는, 하기 서열을 포함하였다: CCTCGACCTG CAGCCCTAGG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAC GGTAGAGCTC (CACAGGCATT TGGGTGGGCA GGGATGGACG GTGACTGGGA CAATCGGGAT GGAAGAGCAT AGAATGGGAG TTAGGGAAGA). 이어서, 양성 ES 세포 클론들을 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법(하기 기술됨)을 사용하여 암컷 마우스들을 이식시켜 내인성 MHC 클래스 II 유전자좌의 결실을 함유하는 새끼들(litter of pups)를 생성하였다.
상기에 기술된 표적화된 ES 세포들을 공여자 ES 세포들로서 사용하여 8개-세포 단계의 마우스 배아 내에 VELOCIMOUSE® 방법(참조: 예를 들면, 미국 특허 제7,294,754호 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99]에 의해 도입시켰다. 내인성 MHC 클래스 II 유전자좌 내에 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, 및 H-2Ea 유전자들의 결실을 갖는 마우스들을, 하이그로마이신 카세트의 존재를 검출하여 내인성 MHC 클래스 II 서열들의 부재를 확인한 대립형질 검정(참조: Valenzuela et al., 상기 참조)의 변형을 사용한 유전형 분석(genotyping)에 의해 확인하였다.
내인성 MHC 클래스 II 유전자좌 내에 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, 및 H-2Ea 유전자들의 결실을 갖는 마우스들을 Cre 결실자(deletor) 마우스 스트레인(참조: 예를 들면, 국제 특허 출원 공보 제WO 2009/114400호)에 대해 육종시켜, 예를 들면, ES 세포 단계에서 또는 배아에서 제거되지 않은 표적화 벡터에 의해 도입된 임의의 플록스드(floxed) 하이그로마이신 카세트도 제거할 수 있다. 임의로, 하이그로마이신 카세트는 마우스 내에 유지된다.
실시예 1.2:
사람화된
H-2
Eb1
및 H-2
Ea
유전자들을 포함하는 거대 표적화 벡터(LTVEC)의 생성
사람화된 MHC II 서열들을 도입하기 위한 표적화 벡터를, 도 5에 나타낸 바와 같이 설계하였다. VELOCIGENE® 유전자 조작 기술을 이용하여, 세균 인공 염색체(BAC) RP23-458i22 DNA를 다양한 단계들에서 변형시켜: (1) BALB/c H-2Ea 유전자로부터 기능성 I-E α 엑손 1을 포함하는 벡터를 생성하고(도 5a); (2) 마우스 I-E β 유전자의 엑손 2 및 엑손 3의 사람 DRβ1*04의 엑손들로의 대체 및 마우스 I-Eα의 엑손 2 및 엑손 3의 사람 DRα1*01의 엑손들로의 대체를 포함하는 벡터를 생성하며(도 5b); (3) 나머지 마우스 I-Eβ 엑손들 중에서 사람 DRβ1*04의 엑손 2 및 엑손 3, 및 BALB/c 마우스로부터의 기능성 I-Eα 엑손 1을 포함하는 나머지 마우스 I-Eα 엑손들 중에서 사람 DRα1*01의 엑손 2 및 엑손 3을 수반하는 벡터를 생성하고[단계 (1)(도 5c)]; (4) (3)에서 생성된 벡터 내에서 잠재 스플라이스 부위(cryptic splice site)를 제거(도 5d)한다.
구체적으로, C57Bl/6 마우스들 내에서, I-Eα 유전자는 비-기능성 엑손 1의 존재로 인하여 슈도유전자(pseudogene)이므로, 우선, BALB/c H-2Ea 유전자로부터 기능성 I-Eα 엑손 1을 포함하는 벡터를 생성하였다(도 5a). RP23-458i22 BAC를 세균 상동성 재조합에 의해 변형시켜(1.BHR) 클로람페니콜 내성 유전자를 스펙티노마이신의 내성 유전자로 대체하였다. 수득된 벡터를 BHR로 추가로 변형시켜 전체 I-A 및 I-E 암호화 영역을 재조합 부위들에 의해 플랭킹된 네오마이신 카세트로 대체하였다(2.BHR). BALB/c I-Eα 리더를 암호화하는 엑손(엑손 1) 및 PI-SceI 및 I-CeuI 제한 부위들에 의해 플랭킹된 클로람페니콜 유전자를 포함하는 작제물을 사용한 다른 라운드의 BHR(3. BHR)로 기능성 BALB/c H-2Ea 엑손 1을 포함하는 벡터를 생성시켰다.
독립적으로, 마우스 I-Eβ 유전자의 엑손 2 및 엑손 3의 사람 DRβ1*04의 엑손들로의 대체 및 마우스 I-Eα의 엑손 2 및 엑손 3의 사람 DRα1*01의 엑손들로의 대체를 포함하는 벡터를 생성시키기 위하여, RP23-458i22 BAC를 몇몇의 상동성 재조합 단계들, 4. BHR 내지 8. BHR을 통해 변형시켰다(도 5b). 수득되는 핵산 서열을 PI-SceI/I-CeuI 제한 부위에 의해 플랭킹하여 상기에 언급한 BALB/c I-Eα 엑손 1을 수반하는 작제물 내로 연결되도록 하였다(도 5c).
도 5c에 나타낸 최종 작제물의 서열은 BALB/c 인트론의 3' 말단에 잠재적 스플라이스 부위를 함유하였다. 몇몇의 BHR 단계들(11. BHR 내지 12. BHR)에 이은 결실 단계를 수행하여 최종의 표적화 벡터(MAID 1680)를 수득하고 이를 사용하여 ES 세포들 내로 전기천공하였다(도 5d).
상세하게는, 최종 표적화 벡터(MAID 1680)는, 5'로부터 3'까지, 내인성 MHC 클래스 II 유전자좌의 H-2Ab1 유전자의 바로 업스트림에서 종결하는 약 26kb의 마우스 게놈 서열; 사람화된 MHC II β 쇄 유전자(사람화된 H-2Eb1 유전자) 및 사람화된 MHC IIα 쇄 유전자(사람화된 H-2Ea 유전자)를 함유하는 약 59kb의 삽입물 및 플록스드(floxed) 네오마이신 카세트로 이루어진 5' 마우스 상동성 아암; 및 내인성 MHC 클래스 II 유전자좌의 H-2Ea 유전자의 바로 다운스트림에서 시작하는 약 57kb의 마우스 게놈 서열로 이루어진 3' 마우스 상동성 아암으로 구성되었다. 5' 아암과 삽입물 사이의 접합부에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 12)은 하기를 포함하였으며: (TGCTGATTGG TTCCTCACTT GGGACCAACC C) TAAGCTTTA TCTATGTCGG GTGCGGAGAA AGAGGTAATG AAATGGCACA AGGAGATCAC ACACCCAAAC CAAACTCGCC, 여기서, 이탤릭체의 서열은 고유한 PI-SceI 부위이고, 5' 상동성 아암 내의 마우스 게놈 서열은 괄호 안에 나타낸다. 삽입물과 3' 아암 사이의 접합부에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 13)은 하기를 포함하였으며: CACATCAGTG AGGCTAGAAT AAATTAAAAT CGCTAATATG AAAATGGGG (ATTTGTACCT CTGAGTGTGA AGGCTGGGAA GACTGCTTTC AAGGGAC), 여기서, 3' 상동성 아암 내의 마우스 게놈 서열은 괄호 안에 나타낸다.
약 59kb의 삽입물 내에서, H-2Eb1 유전자를 다음과 같이 변형시켰다: 인트론 1, 엑손 2, 인트론 2, 엑손 3의 마지막 153bp, 및 인트론 3의 첫번째 122bp를 포함하는, H-2Eb1의 5136bp 영역을, 인트론 1, 엑손 2, 인트론 2, 엑손 3의 마지막 148bp, 및 인트론 3의 첫번째 132bp를 포함하는 사람 HLA-DRB1*04의 3111bp 상동성 영역으로 대체하였다. 인트론 3의 사람과 마우스 서열들 사이의 접합부에서, 5' lox2372 부위, UbC 프로모터, 네오마이신 내성 유전자, 및 3' lox2372 부위로 이루어진 카세트를 삽입하였다. 수득되는 유전자는 마우스 H-2Eb1 리더, DRβ1*04로부터의 사람 β1 및 β2 도메인들, 및 마우스 막관통 도메인 및 세포질 테일로 구성된 키메라 HLA-DRB1*04/H-2Eb1 단백질을 암호화하였다. 인트론 1 내의 마우스/사람 접합부에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 14)은 하기를 포함하였으며: (TCCATCACTT CACTGGGTAG CACAGCTGTA ACTGTCCAGC CTG) GGTACCGAGC TCGGATCCAC TAGTAACGGC CGCCAGTGTG CTGGAATTC GCCCTTGATC GAGCTCCCTG GGCTGCAGGT GGTGGGCGTT GCGGGTGGGG CCGGTTAA, 여기서, 이탤릭체 서열은, 클로닝 단계들 동안 도입된 다수의 클로닝 부위이고, 마우스 인트론 1 서열들은 괄호 안에 나타낸다. 사람 인트론 3과 네오마이신 카세트 사이의 접합부에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 15)은 하기를 포함하였으며: (ATCTCCATCA GAAGGGCACC GGT) ATAACTT CGTATAAGGT ATCCTATACG AAGTTATATG CATGGCCTCC GCGCCGGGTT, 여기서, 5' lox2372 부위는 이탤릭체이고, 사람 인트론 3 서열은 괄호 안에 나타낸다. 네오마이신 카세트와 마우스 인트론 3 사이의 접합부에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 16)은 하기를 포함하였으며: ATAACTTCGT ATAAGGTATC CTATACGAAG TTATCTCGAG (TGGCTTACAG GTAGGTGCGT GAAGCTTCTA CAAGCACAGT TGCCCCCTGG), 여기서, 3' lox2372 부위는 이탤릭체이고, 마우스 인트론 3 서열은 괄호 안에 나타낸다.
또한, 약 59kb의 삽입물 내에서, H-2Ea 유전자가 다음과 같이 변형되었다: 인트론 1, 엑손 2, 인트론 2, 엑손 3의 마지막 101bp, 및 인트론 3의 첫번째 66bp를 포함하는, H-2Ea의 1185bp 영역을, 인트론 1, 엑손 2, 인트론 2, 엑손 3의 마지막 104bp, 및 인트론 3의 첫번째 66bp를 포함하는 사람 HLA-DRA1*01의 1189bp의 상동성 영역으로 대체하였다. 상기에 기술한 바와 같이, H-2Ea의 C57BL/6 대립형질유전자의 엑손 1은, 유전자를 비기능성이 되도록 하는 결실을 함유하기 때문에, H-2Ea 엑손 1 및 인트론 1의 나머지는, 기능성인 H-2Ea의 BALB/c 대립형질유전자로부터의 등가의 2616bp 영역으로 대체하였다. 수득된 유전자는 BALB/c로부터의 마우스 H-2Ea 리더, DRA1*01로부터의 사람 α1 및 α2 도메인들, 및 마우스 막관통 도메인 및 세포질 테일로 구성된 키메라 H-2Ea/HLA-DRA1*01 단백질을 암호화하였다. 인트론 1 내의 마우스/사람 접합부에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 17)은 하기를 포함하였고: (CTGTTTCTTC CCTAACTCCC ATTCTATGCT CTTCCATCCC GA) CCGCGGCCCA ATCTCTCTCC ACTACTTCCT GCCTACATGT ATGTAGGT, 여기서, 이탤릭체 서열은 클로닝 단계들 동안에 도입된 제한 효소 부위이고, BALB/c 인트론 1 서열들은 괄호 안에 나타낸다. 인트론 3 내의 사람/마우스 접합부에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 18)은 하기를 포함하였고: CAAGGTTTCC TCCTATGATG CTTGTGTGAA ACTCGGGGCC GGCC (AGCATTTAAC AGTACAGGGA TGGGAGCACA GCTCAC), 여기서, 이탤릭체 서열은 클로닝 단계들 동안에 도입된 제한 효소 부위이고, 마우스 인트론 3 서열들은 괄호 안에 나타낸다. 엑손 1의 C57BL/6-BALB/c 접합부 5'에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 19)은 하기를 포함하였고: (GAAAGCAGTC TTCCCAGCCT TCACACTCAG AGGTACAAAT) CCCCATTTTC ATATTAGCGA TTTTAATTTA TTCTAGCCTC, 여기서, C57BL/6-특이적 서열들은 괄호 안에 나타낸다. 엑손 1의 BALB/c-C57BL/6 접합부 3'에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 20)은 하기를 포함하였고: TCTTCCCTAA CTCCCATTCT ATGCTCTTCC ATCCCGA CCG CGG (CCCAATC TCTCTCCACT ACTTCCTGCC TACATGTATG), 여기서, SacII 제한 부위는 이탤릭체이고, C57BL/6 서열들은 괄호 안에 나타낸다.
실시예
1.3.
사람화된
MHC
II 마우스들의 생성
실시예 1.2의 벡터를 사용하여 사람화된 MHC II 마우스들을 생성하기 위한 전략의 단순화된 도해들을 도 6에 나타낸다.
구체적으로, MAID 1680 BAC DNA(상기에 기술한 바와 같음)를 사용하여 MAID 5111 ES 세포들을 전기천공시켜 내인성 마우스 I-A 및 I-E 유전자좌들의 키메라 사람 DR4/마우스 I-E 유전자좌를 포함하는 게놈 단편으로의 대체를 포함하는 변형된 ES 세포들을 생성하였다. 키메라 사람 DR4/마우스 I-E 유전자좌를 포함하는 게놈 단편으로 대체된 결실된 내인성 I-A 및 I-E 유전자좌들을 함유하는 양성 ES 세포들을 정량적 PCR 검정에 의해 TAQMANTM 프로브들(참조: Lie and Petropoulos, 상기 참조)을 사용하여 확인하였다. 사람 DRα 서열들의 삽입은 PCR에 의해 프라이머들 hDRA1F(CTGGCGGCTTGAAGAATTTGG; 서열번호 21), hDRA1R (CATGATTTCCAGGTTGGCTTTGTC; 서열번호 22), 및 프로브 hDRA1P (CGATTTGCCAGCTTTGAGGCTCAAGG; 서열번호 23)를 사용하여 확인하였다. 사람 DRβ 서열들의 삽입은 PCR에 의해 프라이머들 hDRB1F(AGGCTTGGGTGCTCCACTTG; 서열번호 24), hDRB1R(GACCCTGGTGATGCTGGAAAC; 서열번호 25), 및 프로브 hDRB1P(CAGGTGTAAACCTCTCCACTCCGAGGA; 서열번호 26)를 사용하여 확인하였다. 표적화 벡터로부터의 하이그로마이신 카세트의 손실은 프라이머들 HYGF(TGCGGCCGATCTTAGCC; 서열번호 7) 및 HYGR(TTGACCGATTCCTTGCGG; 서열번호 8) 및 프로브 HYGP (ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; 서열번호 9)로 확인하였다.
이어서, 양성 ES 세포 클론들을 사용하여 암컷 마우스들을 VELOCIMOUSE® 방법(상기 참조)을 사용하여 이식함으로써 내인성 I-A 및 I-E 유전자좌들이 키메라 사람 DR4/마우스 I-E 유전자좌로 대체됨을 포함하는 새끼들을 생성하였다. 상기에 기술된 표적화된 ES 세포들을 공여자 ES 세포들로서 사용하여 8개-세포 단계 마우스 배아 내로 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 도입시켰다. 키메라 사람 DR4/마우스 I-E 유전자좌를 갖는 마우스들을, 키메라 사람 DR4/마우스 I-E 유전자좌의 존재를 검출한 대립형질 검정(참조: Valenzuela et al., 상기 참조)의 변형을 사용하는 유전형 분석에 의해 확인하였다.
키메라 사람 DR4/마우스 I-E 유전자좌를 포함하는 마우스들을 Cre 결실자 마우스 스트레인(참조: 예를 들면, 국제 특허 출원 공보 제WO 2009/114400호)에 대해 육종시켜, 예를 들면, ES 세포 단계 또는 배아 내에서 제거되지 않은 표적화 벡터에 의해 도입된 임의의 플록스드 네오마이신 카세트도 제거할 수 있다(참조: 도 7).
실시예
2:
키메라
사람/마우스
MHC
I
유전자좌의
조작 및
키메라
MHC
I 마우스의 생성
마우스 H-2K 유전자를, VELOCIGENE® 기술을 이용하여 사람 및 마우스 세균성 인공 염색체(BAC) DNA로부터 특유의 표적화 벡터를 작제함으로써 단일 단계로 사람화하였다[참조: 예를 들면, US Pat. No. 6,586,251 및 Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659]. 마우스 BAC 클론 RP23-173k21(Invitrogen)로부터의 DNA를 상동성 재조합으로 변형시켜 마우스 H-2K 유전자의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 게놈 DNA를 사람 HLA-A 유전자의 α1, α2 및 α3 서브유니트를 암호화하는 사람 게놈 DNA로 대체하였다(도 8).
간단히, H-2K 유전자의 마우스 α1, α2 및 α3 서브유니트를 암호화하는 게놈 서열을, 5' 비해독 영역을 포함하는 마우스 H-2K 유전자좌의 5'의 서열을 포함하는 5' 마우스 상동성 아암(UTR; 5' 상동성 아암은 서열번호 27에 제시됨) 및 마우스 H-2K α3 암호화 서열의 3'의 게놈 서열을 포함하는 3' 마우스 상동성 아암(3' 상동성 아암은 서열번호 28에 제시됨)과 함께 loxP 부위에 의해 플랭킹된 하이그로마이신 카세트를 포함하는 표적화 벡터를 사용하는 단일 표적화 이벤트로, 사람 HLA-A*0201 유전자의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 사람 게놈 DNA로 대체한다.
내인성 H-2K 유전자 유전자좌를 표적화하기 위한 최종 작제물은 5'로부터 3'로 (1) 5'UTR을 포함하는 내인성 H-2K 유전자의 5'의 약 200 bp의 마우스 게놈 서열을 포함하는 5' 상동성 아암, (2) HLA-A*0201 리더 서열, HLA-A*0201 리더/α1 인트론, HLA-A*0201 α1 엑손, HLA-A*0201 α1-α2 인트론, HLA-A*0201 α2 엑손, α2-α3 인트론의 약 316bp의 5' 말단을 포함하는 약 1339bp의 사람 게놈 서열, (3) 5' loxP 부위, (4) 하이그로마이신 카세트, (5) 3' loxP 부위, (6) α2-α3 인트론의 약 304bp의 3' 말단, HLA-A*0201 α3 엑손을 포함하는 약 580bp의 사람 게놈 서열, 및 (7) 마우스 H-2K α3와 막관통 암호화 서열 사이의 인트론을 포함하는 약 200bp의 마우스 게놈 서열을 포함하는 3' 상동성 아암을 포함하였다(H-2K 표적화 벡터의 도시적 도해는 도 8을 참조한다). 표적화 벡터의 5'에 있는 마우스/사람 서열의 접합부의 149개 뉴클레오타이드의 서열은 서열번호 29에 제시되고, 표적화 벡터의 3'에 있는 사람/마우스 서열의 접합부의 159개 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 30에 제시된다. 이러한 표적화 벡터를 사용한 상동성 재조합으로 내인성 마우스 H-2K 막관통 및 세포질 도메인 암호화 서열에 작동적으로 연결된 HLA-A*0201 유전자의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 사람 게놈 DNA를 포함하는 변형된 마우스 H-2K 유전자좌(해독시, 키메라 사람/마우스 MHC 클래스 I 단백질을 형성한다)를 생성하였다.
표적화된 BAC DNA를 사용하여 마우스 F1H4 ES 세포를 전기천공함으로써 유핵 세포(예: T 및 B 림프구, 대식세포, 호중구)의 표면에 키메라 MHC 클래스 I 단백질을 발현하는 마우스를 제조하기 위한 변형된 ES 세포를 생성하였다. 사람 HLA 서열의 삽입을 포함하는 ES 세포는 정량적 TAQMANTM 검정에 의해 확인되었다. 사람 HLA 서열 및 관련된 선택 카세트의 삽입(대립형질유전자의 수득, GOA) 및 내인성 마우스 서열의 손실(대립형질유전자의 손실, LOA)를 검출하기 위한 특정 프라이머 세트 및 프로브를 고안하였다. 표 2는 정량적 PCR 검정에 사용되는 각각의 프로브에 대해 검출되는 이름 및 위치를 나타낸다.
선택 카세트는 당업자에게 공지된 방법으로 제거될 수 있다. 예를 들면, 키메라 사람/마우스 MHC 클래스 I 유전자좌를 포함하는 ES 세포는, 사람 HLA-A*0201 유전자 서열을 포함하는 표적화 작제물(도 8 참조)의 삽입에 의해 도입된 "플록스드" 하이그로마이신 카세트를 제거하기 위해 Cre를 발현하는 작제물로 형질감염될 수 있다. 하이그로마이신 카세트는, 임의로 Cre 리컴비나제를 발현하는 마우스로 육종함으로써 제거될 수 있다. 임의로, 하이그로마이신 카세트는 마우스에 보유된다.
상기 기술된 표적화된 ES 세포를 공여자 ES 세포로서 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아에 도입하였다[참조: 예를 들면, US Pat. No. 7,294,754 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99]. 독립적으로 키메라 MHC 클래스 I 유전자를 포함하는 VELOCIMICE®(공여자 ES 세포로부터 완전히 유도되는 F0 마우스)는, 특유의 사람 HLA-A*0201 유전자 서열의 존재를 검출하는 변형된 대립형질유전자 검정법[참조: Valenzuela et al., 상기 참조]을 이용하는 유전형 분석에 의해 확인되었다.
실시예
3:
키메라
MHC
I 및
MHC
II 유전자를 포함하는 마우스의 생성 및 특성확인
실시예
3.1:
키메라
MHC
I 및 II 유전자를 포함하는 마우스의 생성
키메라 MHC I 및 MHC II 유전자를 포함하는 마우스의 생성을 위한 전략은 도 4에 도시되어 있다. 구체적으로, MAID 1665 BAC DNA (실시예 2에서 상기 기술된 HLA-A2/H-2K BAC)를 사용하여, 키메라 사람/마우스 MHC I 및 MHC II 유전자를 포함하는 변형된 ES 세포를 생성하기 위해 MAID 1680 ES 세포(실시예 1에 기재된 사람화된 MHC II 유전자를 함유하는 ES 세포)를 전기천공하였다. 키메라 MHC I 및 II 유전자 둘 다를 함유하는 양성 ES 세포는, 상기 실시예 1 및 2에 기재된 프라이머 및 프로브를 사용하고 TAQMAN™ 프로브(문헌참조: Lie and Petropoulos, 상기 참조)를 사용하는 정량적 PCR 검정에 의해 확인하였다.
HYG 및 NEO 선택 카세트는, 당업자에 의해 공지된 방법에 의해 제거될 수 있다. 예를 들면, 키메라 사람/마우스 MHC 클래스 I 및 클래스 II 유전자좌를 포함하는 ES 세포는, 표적화 작제물의 삽입에 의해 도입된 "플록스드" 하이그로마이신 및 네오마이신 카세트를 제거하기 위해 Cre를 발현하는 작제물로 형질감염시킬 수 있다(도 4, 도 7 및 도 8 참조). 상기 선택 카세트는 임의로 Cre 리컴비나제를 발현하는 마우스로 육종시킴에 의해 제거될 수 있다. 임의로, 상기 선택 카세트는 마우스에 보유한다.
상기 기술된 사람화된 MHC I 및 II 둘 다를 포함하는 표적화된 ES 세포는 공여자 ES 세포로서 사용하고 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아에 도입하였다[문헌참조: 예를 들면, 미국 특허 제7,294,754호 및 Poueymirou et al. (2007). F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99)]. 키메라 MHC 클래스 I 및 클래스 II 유전자들을 포함하는 VELOCIMICE® (공여자 ES 세포로부터 완전히 유도된 F0 마우스)는, 대립형질유전자 검정의 변형을 사용한 유전형 분석에 의해 확인하였다(문헌참조: Valenzuela et al., 상기 참조).
실시예
3.2:
키메라
MHC
I 및 II 유전자들을 포함하는 마우스의 특성확인
WT 또는 이중 이종접합성 사람화된 HLA-A2/HLA-DR4 마우스로부터의 비장("1666HET/1681 HET" 또는 "H-2K+/1666 MHC-II+/1681")에 콜라게나제 D(Roche Bioscience)를 관류시키고 적혈구는 ACK 용해 완충액으로 용해시켰다. 사람 HLA-A2 및 HLA-DR4의 세포 표면 발현은, 형광단-접합된 항-CD3(17A2), 항-CD19(1D3), 항-HLA-A2(BB7.2) 및 항-HLA-DR(L243)를 사용하여 FACS에 의해 분석하였다. 유동 세포측정은, BD-Fortessa를 사용하여 수행하였다. 사람 HLA-A2 및 HLA-DR4 둘 다의 발현은 CD19+ B 세포의 표면 상에서 명백하게 검출가능하였다(도 9).
등가 범위
당해 분야의 숙련가들은, 본원에 기술된 본 발명의 구체적인 실시형태들의 많은 등가 범위를 인식하거나, 단지 통상의 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가 범위는 하기 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원 전체에서 인용된 모든 비-특허 문헌들, 특허 출원들 및 특허들의 전체 내용들은, 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함되어 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
<120> MICE EXPRESSING HUMANIZED MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX
<130> 2010794-0424
<150> US 61/767,811
<151> 2013-02-22
<160> 33
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2
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<220>
<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 4
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<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 5
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic
<400> 6
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<220>
<223> Synthetic
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cctcacttgg gaccaaccct ctcgagtacc gttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120
atgcatccgg gtaggggagg 140
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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cctcgacctg cagccctagg ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaac ggtagagctc 60
cacaggcatt tgggtgggca gggatggacg gtgactggga caatcgggat ggaagagcat 120
agaatgggag ttagggaaga 140
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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cacatcagtg aggctagaat aaattaaaat cgctaatatg aaaatgggga tttgtacctc 60
tgagtgtgaa ggctgggaag actgctttca agggac 96
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic
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<220>
<223> Synthetic
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catggcctcc gcgccgggtt 80
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<220>
<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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ttttaattta ttctagcctc 80
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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ctggcggctt gaagaatttg g 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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gacactgttg acgcgcagtc agctcttacc cccattgggt ggcgcgatca cccaagaacc 120
aatcagtgtc gccgcggacg ctggatataa agtccacgca gcccgcagaa ctcagaagtc 180
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<400> 33
atcctgtacc agagagtg 18
Claims (39)
- 내인성 MHC 유전자좌에,
키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열로서, 상기 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 MHC I 폴리펩타이드의 α1, α2, 및 α3 도메인을 포함하고, 상기 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 비-사람 부분이 내인성 비-사람 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는, 제1 뉴클레오타이드 서열,
키메라 사람/비-사람 MHC II α 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열로서, 상기 키메라 사람/비-사람 MHC II α 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 MHC II α 폴리펩타이드의 MHC II α1 및 α2 도메인을 포함하고, 상기 키메라 MHC II α 폴리펩타이드의 비-사람 부분이 내인성 비-사람 MHC II α 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는, 제2 뉴클레오타이드 서열, 및
키메라 사람/비-사람 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열로서, 상기 키메라 사람/비-사람 MHC II β 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 MHC II β 폴리펩타이드의 MHC II β1 및 β2 도메인을 포함하고, 상기 키메라 MHC II β 폴리펩타이드의 비-사람 부분이 내인성 비-사람 MHC II β 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는, 제3 뉴클레오타이드 서열
을 포함하는 비-사람 동물 항원 제시 세포 (APC)를 포함하는 비-사람 동물로서,
여기서, 상기 APC가 상기 내인성 MHC 유전자좌로부터 키메라 사람/비-사람 MHC I 및 MHC II 단백질을 발현하는, 비-사람 동물 항원 제시 세포 (APC)를 포함하는 비-사람 동물. - 제1항에 있어서, 상기 APC가 이의 세포 표면 상에 상기 내인성 MHC 유전자좌로부터 기능성 내인성 MHC I, II α, 및 II β 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 비-사람 동물.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열이 상기 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌에 위치하고, 상기 제2 뉴클레오타이드 서열이 상기 내인성 비-사람 MHC II α 유전자좌에 위치하고, 상기 제3 뉴클레오타이드 서열이 상기 내인성 비-사람 MHC II β 유전자좌에 위치하는, 비-사람 동물.
- 제3항에 있어서, 상기 제1, 제2 및/또는 제3 뉴클레오타이드 서열(들)이 내인성-비-사람 조절 요소들에 작동적으로 연결된, 비-사람 동물.
- 제4항에 있어서, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열이 내인성 비-사람 MHC I 프로모터 및 조절 요소들에 작동적으로 연결되어 있고, 상기 제2 뉴클레오타이드 서열이 내인성 비-사람 MHC II α 프로모터 및 조절 요소들에 작동적으로 연결되어 있고, 상기 제3 뉴클레오타이드 서열이 내인성 비-사람 MHC II β 프로모터 및 조절 요소들에 작동적으로 연결되어 있는, 비-사람 동물.
- 제1항에 있어서, 상기 사람 MHC I 폴리펩타이드가 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 비-사람 동물.
- 제1항에 있어서, 상기 APC가 내인성 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고, 상기 APC가 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하는, 비-사람 동물.
- 제1항에 있어서, 상기 동물이 래트이고 상기 APC가 래트 APC이거나, 상기 동물이 마우스이고 상기 APC가 마우스 APC인, 비-사람 동물.
- 제1항에 있어서, 상기 동물이 마우스이고 상기 APC가 마우스 APC이며;
상기 제1 뉴클레오타이드 서열이 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하고 상기 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드의 사람 부분이 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사람 HLA 클래스 I의 유전자에 의해 암호화되고,
상기 제2 뉴클레오타이드 서열이 키메라 사람/마우스 MHC II α 폴리펩타이드를 암호화하고 상기 키메라 사람/마우스 MHC II α 폴리펩타이드의 사람 부분이 HLA-DR, HLA-DQ, 및 HLA-DP의 임의의 α 쇄 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사람 HLA 클래스 II 유전자에 의해 암호화되고;
상기 제3 뉴클레오타이드 서열이 키메라 사람/마우스 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하고 상기 키메라 사람/마우스 MHC II β 폴리펩타이드의 사람 부분이 HLA-DR, HLA-DQ, 및 HLA-DP의 임의의 β 쇄 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사람 HLA 클래스 II 유전자에 의해 암호화된, 비-사람 동물. - 제1항에 있어서, 상기 동물이 마우스이고 상기 APC가 마우스 APC이며,
상기 제1 뉴클레오타이드 서열이 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 마우스 부분이 H-2K, H-2D, 또는 H-2L로부터 유래하고,
상기 제2 뉴클레오타이드 서열이 키메라 사람/마우스 MHC II α 폴리펩타이드를 암호화하고 상기 키메라 MHC II α 폴리펩타이드의 마우스 부분이 H-2E 및 H-2A의 임의의 α 쇄 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 마우스 클래스 II 유전자에 의해 암호화되고,
상기 제3 뉴클레오타이드 서열이 키메라 사람/마우스 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하고 상기 키메라 MHC II β 폴리펩타이드의 마우스 부분이 H-2E 및 H-2A의 임의의 β 쇄 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 마우스 클래스 II 유전자에 의해 암호화된, 비-사람 동물. - 제1항에 있어서, 상기 동물이 마우스이고 상기 APC가 마우스 APC이며,
상기 제1 뉴클레오타이드 서열이 키메라 사람/마우스 HLA-A/H-2K 폴리펩타이드를 암호화하고,
상기 제2 뉴클레오타이드 서열이 키메라 사람/마우스 HLA-DR/H-2E 폴리펩타이드의 α 쇄를 암호화하고,
상기 제3 뉴클레오타이드 서열이 키메라 사람/마우스 HLA-DR/H-2E 폴리펩타이드의 β 쇄를 암호화하고,
상기 마우스 APC가 HLA-A/H-2K 및 HLA-DR/H-2E 단백질을 발현하는, 비-사람 동물. - 제11항에 있어서, 상기 마우스 APC가 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 비-사람 동물.
- 제11항에 있어서, 상기 마우스 APC가 이의 세포 표면 상에 내인성 MHC 유전자좌로부터 기능성 내인성 MHC 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 비-사람 동물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 유전자 변형된 비-사람 동물을 생성시키는 방법으로서, 상기 방법이
(a)
(i) 비-사람 동물 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인에 작동적으로 연결된 사람 MHC I 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 포함하는 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열,
(ii) 비-사람 동물 MHC II α 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인에 작동적으로 연결된 사람 MHC II α 폴리펩타이드의 α1 및 α2 도메인을 포함하는 상기 키메라 사람/비-사람 MHC II α 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열, 및
(iii) 비-사람 동물 MHC II β 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인에 작동적으로 연결된 사람 MHC II β 폴리펩타이드의 β1 및 β2 도메인을 포함하는 상기 키메라 사람/비-사람 동물 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열
을 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물 배아 줄기 (ES) 세포를 생성시키는 단계, 및
(b) 상기 유전자 변형된 비-사람 동물 배아 줄기 세포로부터 유전자 변형된 비-사람 동물을 생성시키는 단계로서, 상기 유전자 변형된 비-사람 동물이 상기 내인성 MHC 유전자좌로부터 상기 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드, 및 상기 키메라 사람/비-사람 동물 MHC II α 및 β 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 사람/비-사람 동물 MHC II 복합체를 발현하는 APC를 포함하는, 단계
를 포함하는, 방법. - 제14항에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-사람 동물 ES 세포를 생성시키는 단계가
(a) 상기 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 ES 세포를 수득하는 단계, 및
(b) 상기 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 수득된 비-사람 ES 세포의 게놈을, 상기 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하도록 변형시키는 단계를 포함하고,
상기 게놈을 변형시키는 단계가 비-사람 동물 MHC II α 폴리펩타이드를 암호화하는 비-사람 MHC II α 유전자의 엑손 2 및 3을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 사람 MHC II α 폴리펩타이드를 암호화하는 사람 MHC II α 유전자의 엑손 2 및 3을 포함하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하는 단계 및 비-사람 동물 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하는 비-사람 동물 MHC II β 유전자의 엑손 2 및 3을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 사람 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하는 사람 MHC II β 유전자의 엑손 2 및 3을 포함하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하는 단계를 포함하는, 방법. - 제15항에 있어서, 상기 게놈을 변형시키는 단계가 상기 수득된 비-사람 ES 세포에서의 상동성 재조합을 포함하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-사람 동물 ES 세포를 생성시키는 단계가
(a) 상기 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물 ES 세포를 수득하는 단계, 및
(b) 상기 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 수득된 비-사람 동물 ES 세포의 게놈을, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하도록 변형시키는 단계를 포함하고,
상기 게놈을 변형시키는 단계가 비-사람 동물 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 비-사람 동물 MHC I 유전자의 엑손 2 내지 4를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 사람 MHC I 유전자의 엑손 2 내지 4를 포함하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하는 단계를 포함하는, 방법. - 제17항에 있어서, 상기 게놈을 변형시키는 단계가 상기 수득된 비-사람 ES 세포에서의 상동성 재조합을 포함하는, 방법.
- 유전자 변형된 비-사람 동물 항원 제시 세포 (APC) 또는 이를 포함하는 조직으로서,
상기 비-사람 동물 APC가 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 비-사람 동물로부터 단리되고,
상기 비-사람 APC가
(i) 이의 내인성 MHC 유전자좌에서 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고,
(ii) 상기 내인성 MHC 유전자좌로부터 키메라 사람/비-사람 MHC I 및 MHC II 단백질을 발현하는 비-사람 APC인, 유전자 변형된 비-사람 동물 항원 제시 세포(APC) 또는 이를 포함하는 조직. - 유전자 변형된 비-사람 동물 배아 줄기(ES) 세포로서, 이의 게놈에
(i) 내인성 MHC I 유전자좌에서, 전형적 사람 MHC I 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 사람 MHC I 유전자의 적어도 일부 및 전형적 비-사람 동물 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 비-사람 동물 MHC I 유전자의 적어도 일부를 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열로서, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열이 상기 전형적 비-사람 동물 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인에 작동적으로 연결된 전형적 사람 MHC I 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 포함하는 키메라 사람/비-사람 동물 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는, 제1 뉴클레오타이드 서열,
(ii) 내인성 MHC II α 유전자좌에서, 전형적 사람 MHC II α 폴리펩타이드의 α2 도메인을 암호화하는 사람 MHC II α 유전자의 적어도 일부 및 전형적 비-사람 동물 MHC II α 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 비-사람 동물 MHC II α 유전자의 적어도 일부를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열로서, 상기 제2 뉴클레오타이드 서열이 상기 전형적 비-사람 동물 MHC II α 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인에 작동적으로 연결된 전형적 사람 MHC II α 폴리펩타이드의 MHC II α1 도메인 및 α2 도메인을 포함하는 키메라 사람/비-사람 동물 MHC II α 폴리펩타이드를 암호화하는, 제2 뉴클레오타이드 서열, 및
(iii) 내인성 MHC II β 유전자좌에서, 전형적 사람 MHC II β 폴리펩타이드의 β2 도메인을 암호화하는 사람 MHC II β 유전자의 적어도 일부 및 전형적 비-사람 동물 MHC II β 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 비-사람 동물 MHC II β 유전자의 적어도 일부를 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열로서, 상기 제3 뉴클레오타이드 서열이 상기 전형적 비-사람 동물 MHC II β 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인에 작동적으로 연결된 전형적 사람 MHC II β 폴리펩타이드의 MHC II β1 도메인 및 β2 도메인을 포함하는 키메라 사람/비-사람 동물 MHC II β 폴리펩타이드를 암호화하는, 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 유전자 변형된 비-사람 동물 배아 줄기 (ES) 세포. - 제20항에 있어서, 상기 제1, 제2 및/또는 제3 뉴클레오타이드 서열(들)이 내인성 비-사람 동물 조절 요소들에 작동적으로 연결된, 비-사람 동물 ES 세포.
- 제21항에 있어서, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열이 상기 내인성 MHC I 유전자좌에서 내인성 비-사람 동물 MHC I 프로모터 및 조절 요소들에 작동적으로 연결되어 있고, 상기 제2 뉴클레오타이드 서열이 상기 내인성 MHC II α 유전자좌에서 내인성 비-사람 동물 MHC II α 프로모터 및 조절요소들에 작동적으로 연결되어 있고, 제3 뉴클레오타이드 서열이 상기 내인성 MHC II β 유전자좌에서 내인성 비-사람 동물 MHC II β 프로모터 및 조절 요소들에 작동적으로 연결되어 있는, 비-사람 동물 ES 세포.
- 제20항에 있어서, 상기 전형적 사람 MHC I 폴리펩타이드가 HLA-A인, 비-사람 동물 ES 세포.
- 제20항에 있어서, 상기 전형적 사람 MHC I 폴리펩타이드가 HLA-B인, 비-사람 동물 ES 세포.
- 제20항에 있어서, 상기 전형적 사람 MHC I 폴리펩타이드가 HLA-C인, 비-사람 동물 ES 세포.
- 제20항에 있어서, 상기 전형적 사람 MHC 클래스 II α 및 β 폴리펩타이드가 각각 사람 HLA-DR α 및 β 폴리펩타이드 또는 사람 HLA-DQ α 및 β 폴리펩타이드인, 비-사람 동물 ES 세포.
- 제20항에 있어서, 상기 MHC II α1 도메인이 상기 전형적 사람 MHC II α 폴리펩타이드의 α1 도메인이고 상기 MHC II β1 도메인이 상기 전형적 사람 MHC II β 폴리펩타이드의 β1 도메인인, 비-사람 동물 ES 세포.
- 제20항에 있어서, 내인성 비-사람 동물 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 비-사람 동물 ES 세포.
- 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-사람 동물 ES 세포가 래트 ES 세포인, 비-사람 동물 ES 세포.
- 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-사람 동물 세포가 마우스 ES 세포인, 비-사람 동물 ES 세포.
- 제30항에 있어서, 상기 전형적 비-사람 동물 MHC I 폴리펩타이드가 H-2K 또는 H-2D인, 비-사람 동물 ES 세포.
- 제30항에 있어서, 상기 전형적 비-사람 동물 MHC II α 및 β 폴리펩타이드가 각각 H-2A α 및 β 폴리펩타이드인, 비-사람 동물 ES 세포.
- 제30항에 있어서, 상기 전형적 비-사람 동물 MHC II α 및 β 폴리펩타이드가 각각 H-2E α 및 β 폴리펩타이드인, 비-사람 동물 ES 세포.
- 제30항에 있어서, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열이 키메라 HLA-A/H-2K 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 제2 뉴클레오타이드 서열이 키메라 HLA-DR/H-2E 폴리펩타이드의 α 쇄를 암호화하고, 상기 제3 뉴클레오타이드 서열이 키메라 HLA-DR/H-2E 폴리펩타이드의 β 쇄를 암호화하는, 비-사람 동물 ES 세포.
- 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항의 비-사람 동물 배아 줄기 세포로부터 유래된 배아로서, 상기 배아가 상기 내인성 MHC 유전자좌로부터 상기 키메라 사람/비-사람 동물 MHC I 폴리펩타이드, 및 상기 키메라 사람/비-사람 동물 MHC II α 및 β 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 사람/비-사람 동물 MHC II 복합체를 발현하는 비-사람 동물로 발생하는, 배아.
- 제35항에 있어서, 상기 비-사람 동물 세포가 마우스 ES 세포이고 상기 전형적 비-사람 동물 MHC I 폴리펩타이드가 H-2K 또는 H-2D인, 배아.
- 제35항에 있어서, 상기 비-사람 동물 세포가 마우스 ES 세포이고 상기 전형적 비-사람 동물 MHC II α 및 β 폴리펩타이드가 각각 H-2A α 및 β 폴리펩타이드인, 배아.
- 제35항에 있어서, 상기 비-사람 동물 세포가 마우스 ES 세포이고 상기 전형적 비-사람 동물 MHC II α 및 β 폴리펩타이드가 각각 H-2E α 및 β 폴리펩타이드인, 배아.
- 제35항에 있어서, 상기 비-사람 동물 세포가 마우스 ES 세포이고 상기 제1 뉴클레오타이드 서열이 키메라 HLA-A/H-2K 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 제2 뉴클레오타이드 서열이 키메라 HLA-DR/H-2E 폴리펩타이드의 α 쇄를 암호화하고, 상기 제3 뉴클레오타이드 서열이 키메라 HLA-DR/H-2E 폴리펩타이드의 β 쇄를 암호화하는, 배아.
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| Nature Biotechnology, Vol. 28, No. 11, pp 1203-1207, 2010. |
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