KR102223264B1 - 인간화된 Fc-감마 수용체를 갖는 비-인간 동물 - Google Patents

Abstract

유전적으로 변형된 마우스 및 이를 제조하고 사용하기 위한 방법 및 조성물이 제공되며, 유전적 변형은 FcγRI 단백질의 인간화를 포함한다.

Description

인간화된 Fc-감마 수용체를 갖는 비-인간 동물{NON-HUMAN ANIMALS HAVING HUMANIZED FC-GAMMA RECEPTORS}

관련 출원

본 출원은 2014년 4월 8일자로 출원된 미국 가출원 제61/977,037호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

Fc 수용체(FcR)는 포유류에서 면역 시스템의 다양한 기능을 수행하는 면역 시스템의 세포 표면에서 발견되는 단백질이다. FcR은 다양한 세포에 다양한 유형으로 존재하며, 다양한 면역 기능을 매개하는데, 예를 들어 감염된 세포나 침입 병원체에 부착된 항체에 결합하거나, 식세포 또는 세포독성 세포를 자극해서 항체-매개 식세포작용 또는 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)에 의해서 미생물이나 감염된 세포를 파괴한다.

ADCC는 면역 시스템의 효과기(effector) 세포가 항체에 의해 결합된 표적 세포를 용해하는 과정이다. 이 과정은 외부 항원이나 세포에 대한 사전 노출 결과 항체 반응이 일어나는 데 좌우된다. ADCC는, 예를 들어 자연 사멸(NK) 세포와 같은 효과기 세포를 통해서, 효과기 세포의 표면에서 발현된 FcR을, 그 자체가 외부 항원이나 세포에 결합된 항체의 Fc 부분에 결합함으로써 매개될 수 있다. 고친화성 FcγR1 수용체 신호전달(signaling)은 면역 시스템 조절 및 효과기 세포 기능에서 중요한 역할을 한다.

본 발명은 인간에서 수행될 수 없었던 인간 면역 효과기 반응 실험을 허용하도록 인간 또는 하이브리드 FcγRI 단백질을 발현하기 위해 비-인간 동물, 예컨대 마우스를 조작(engineer)하는 것이 바람직하다는 인식을 포함한다.

본 발명은 또한 내인성(endogenous) 마우스 FcγRI 유전자를 인간화된 (인간 또는 하이브리드) FcγRI 유전자로 대체하는 것이 바람직하다는 인식을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 인간 FcγRI α 사슬의 세포외 부분 및 마우스 FcγRI α 사슬의 세포내 부분을 포함하는 FcγRI 단백질을 발현하는 마우스를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 인간 FcγRI α 사슬의 세포외 부분은 EC1 도메인, EC2 도메인, EC3 도메인, 또는 이들의 조합을 포함한다.

일부 실시 형태에서, EC1 도메인은 서열 번호 3의 엑손 3과 50%, 70%, 85%, 90% 또는 95% 이상 동일한 엑손으로 인코딩된다.

일부 실시 형태에서, EC2 도메인은 서열 번호 3의 엑손 4와 50%, 70%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 엑손으로 인코딩된다.

일부 실시 형태에서, EC3 도메인은 서열 번호 3의 엑손 5와 50%, 70%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 엑손으로 인코딩된다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 인간 FcγRI α 사슬의 세포외 부분 및 마우스 FcγRI α 사슬의 세포내 부분을 포함하는 FcγRI 단백질을 발현하는 마우스를 제공하고, 마우스는 전장(full-length) 마우스 FcγRI α 사슬을 검출가능하게 발현하지 않는다. 일부 실시 형태에서, FcγRI α 사슬의 세포내 부분은 마우스 FcγRI α 사슬의 세포질 도메인을 전체적으로 또는 부분적으로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 마우스는 마우스 FcγRI α 사슬 막관통 도메인을 전체적으로 또는 부분적으로 포함하는 FcγRI α 사슬을 추가로 발현한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 5와 70%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 FcγRI α 사슬 아미노산 서열을 발현하는 마우스를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 인간 또는 하이브리드 FcγRI 단백질은 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 및/또는 이들의 조합에서 검출가능하게 발현된다.

일부 실시 형태에서, 인간 FcγRI 단백질 수준은 뮤린 과립구 집락 자극 인자 (mG-CSF)의 투여에 의해 증가된다. 일부 실시 형태에서, 마우스 FcγRI 단백질 수준은 뮤린 과립구 집락 자극 인자 (mG-CSF)의 투여에 의해 단핵구, 호중구, 또는 수지상 세포에서 증가되지 않는다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 마우스 FcγRI 유전자의 하나 이상의 엑손에 작동가능하게 연결된 인간 FcγRI 유전자의 하나 이상의 엑손을 포함하는 FcγRI 유전자를 발현하는 마우스를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 인간 FcγRI 유전자의 엑손은 인간 FcγRI 단백질의 하나 이상의 세포외 부분을 인코딩한다. 일부 실시 형태에서, 마우스 FcγRI 유전자의 엑손은 마우스 FcγRI 단백질의 하나 이상의 세포내 부분을 인코딩한다. 일부 실시 형태에서, 인간 FcγRI의 엑손은 엑손 3, 4, 5, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 실시 형태에서, 마우스 FcγRI의 세포내 부분은 하나 이상의 마우스 세포내 신호전달 캐스케이드에 작동가능하게 연결된다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 인간 FcγRI을 발현하는 마우스를 제공하고, 마우스의 생식 계열 세포는 기능적 마우스 FcγRI 유전자가 결여되어 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명은 인간 FcγRI을 발현하는 마우스를 제공하고, 마우스의 생식 계열 세포는 임의의 마우스 FcγRI 유전자가 결여되어 있다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 게놈이 인간 FcγRI 단백질의 세포외 부분 및 마우스 FcγRI 단백질의 세포내 부분을 인코딩하는 FcγRI 유전자를 포함하는 배아줄기세포를 제공한다. 일부 실시 형태에서, FcγRI 유전자는 인간 FcγRI 유전자의 엑손 3, 4, 및 5를 포함한다. 일부 실시 형태에서, FcγRI 유전자는 인간 엑손 1에 플랭킹(flanking)된 하나 이상의 인간 5′ 비번역 영역들을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 FcγRI 단백질의 세포외 부분은 EC1, EC2, 및 EC3 중 하나 이상을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 게놈이 서열 번호 5와 70%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 FcγRI α 사슬 아미노산 서열을 포함하는 배아줄기세포를 제공한다.

일부 실시 형태에서, 배아줄기세포는 마우스 FcγRI 유전자의 엑손 6의 아미노산 잔기를 포함하는 FcγRI 유전자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 마우스 FcγRI 단백질의 세포내 부분은 마우스 FcγRI 단백질의 세포질 도메인을 전체적으로 또는 부분적으로 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 인간 FcγRI 유전자를 포함하는 배아줄기세포를 제공하고, 인간 FcγRI 유전자는 자연에서 발견되는 바와 같은 마우스 게놈에서 나타나는 내인성 FcγRI 좌(locus)에 위치한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 배아줄기로부터 생산된 마우스 배아를 제공한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 유전자도입(transgenic) 마우스를 제조하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 마우스 배아줄기세포의 용도를 제공한다.

일부 실시 형태에서, 인간 FcγRI 단백질의 세포외 부분 및 마우스 FcγRI 단백질의 세포내 부분을 포함하는 FcγRI 단백질을 발현하는 마우스를 제조하는 방법이 개시되고, 본 방법은 하기의 단계들을 포함한다: (a) 마우스 배아줄기세포를 얻는 단계; (b) 배아세포에서 내인성 마우스 FcγRI 유전자를 인간 세포외 영역을 갖는 인간 FcγRI 단백질의 일부를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 게놈 단편으로 대체하는 단계; 및 (c) (b)의 배아세포를 사용하여 마우스를 생성하는 단계.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 인간 세포외 영역을 갖는 인간 FcγRI 단백질의 일부를 인코딩하는 핵산 분자 및 마우스 FcγRI 단백질의 세포내 부분을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 게놈 단편을 제공한다.

본 출원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은 동등하게 사용된다. 약/대략과 함께 또는 이들 없이 본 출원에서 사용된 임의의 숫자는 관련 기술분야의 당업자에 의해 이해되는 임의의 통상적인 변동을 포함하는 것으로 여겨진다.

본 발명의 다른 특징, 목적, 및 이점들은 하기의 상세한 설명에서 명백해진다. 그러나, 상세한 설명은, 본 발명의 실시 형태를 나타내지만, 단지 예로서 제공될 뿐이며 제한이 아님이 이해되어야 한다. 본 발명의 범주 내에 있는 다양한 변경 및 변형들이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.

본 명세서에 포함된 도면들은 단지 설명을 목적으로 하며 제한하기 위한 것은 아니다.
도 1은 실험 마우스 및 야생형 대조군에서 FcγRI 마우스 대립유전자의 유전자형 결정(genotyping)을 보여준다.
도 2는 실험 마우스 및 야생형 대조군에서 인간 FcγRI 유전자의 상대 카피수를 보여준다.
도 3은, 인간 FcγRI의 단일 카피를 갖는 Het (+/-) 마우스에 기초하고 평균 △Ct로 보정된 유전자 카피수에 대한 변환 데이터를 보여준다.
도 4는 인간 혈액 공여자로부터의 세포에서 FcγRI 수용체의 발현을 보여준다.
도 5는 인간 FcγRI 유전자, 마우스 FcγRI 유전자, 및 인간화된 FcγRI 유전자의 개략도(축적대로 그려지지 않음)를 보여준다.
도 6은 MAID 6074 카세트를 제조하는 과정의 개략도(축적대로 그려지지 않음)를 보여준다.
도 7은 인간화된 FcγRI 유전자를 갖는 마우스가 비장 및 혈액에서 정상 세포 빈도를 나타냄을 보여준다.
도 8은 인간화된 FcγRI 유전자를 갖는 마우스에서 골수 비장 집단(population)을 보여준다.
도 9는 인간화된 FcγRI 유전자를 갖는 마우스의 비장으로부터의 대식세포에서 뮤린 FcγRI 발현의 손실(loss)을 보여준다.
도 10은 인간화된 FcγRI 유전자를 갖는 마우스의 비장으로부터의 단핵구에서 인간 FcγRI 발현의 획득(gain)을 보여준다.
도 11은 내인성 마우스 FcγRI 유전자를 갖는 마우스 (MAID 6074 WT) 및 인간화된 FcγRI 유전자에 대해 동형접합성인 마우스 (MAID 6074 HO)의 복막강으로부터 정제된 대식세포의 FACS 분석 시의 게이팅 전략을 보여준다.
도 12는 내인성 마우스 FcγRI 유전자를 갖는 마우스 (MAID 6074 WT) 및 인간화된 FcγRI 유전자에 대해 동형접합성인 마우스 (MAID 6074 HO)의 복막강으로부터의 대식세포에서 인간 FcγRI 및 마우스 FcγRI의 발현을 보여준다.
도 13은 내인성 마우스 FcγRI 유전자를 갖는 마우스 (MAID 6074 WT) 및 인간화된 FcγRI 유전자에 대해 동형접합성인 마우스 (MAID 6074 HO)의 골수 유래 대식세포의 FACS 분석 시의 게이팅 전략을 보여준다.
도 14는 내인성 마우스 FcγRI 유전자를 갖는 마우스 (MAID 6074 WT) 및 인간화된 FcγRI 유전자에 대해 동형접합성인 마우스 (MAID 6074 HO)의 골수 유래 대식세포에서 인간 FcγRI 및 마우스 FcγRI의 발현을 보여준다.
도 15는 내인성 마우스 FcγRI 유전자를 갖는 마우스 (대조군 75/25) 및 인간화된 FcγRI 유전자에 대해 이형접합성인 마우스 (MAID 6074 HET)의 골수 유래 대식세포의 FACS 분석 시의 게이팅 전략을 보여준다.
도 16은 내인성 마우스 FcγRI 유전자를 갖는 마우스 (대조군 75/25) 및 인간화된 FcγRI 유전자에 대해 이형접합성인 마우스 (MAID 6074 HET)의 골수 유래 대식세포에서 인간 FcγRI 및 마우스 FcγRI의 발현을 보여준다.
도 17은 PBS 처리 48시간 후 MAID 6074 WT와 비교하여 MAID 6074 HO 마우스에서의 골수 혈액 집단을 보여준다.
도 18은 mG-CSF 처리 48시간 후 MAID 6074 WT 마우스와 비교하여 MAID 6074 HO 마우스에서의 골수 혈액 집단을 보여준다.
도 19는 PBS 처리 48시간 후 MAID 6074 WT 마우스와 MAID 6074 HO 마우스의 혈액에서의 인간 FcγRI 발현의 결여를 보여준다.
도 20은 mG-CSF 처리 48시간 후 MAID 6074 WT 마우스와 비교하여 MAID 6074 HO 마우스의 혈액에서의 인간 FcγRI 발현을 보여준다.
도 21은 PBS 처리 48시간 후 MAID 6074 WT와 MAID 6074 HO 마우스의 혈액에서의 뮤린 FcγRI 발현의 결여를 보여준다.
도 22는 mG-CSF 처리 48시간 후 MAID 6074 HO 마우스와 비교하여 MAID 6074 WT의 혈액에서의 뮤린 FcγRI 발현을 보여준다.
도 23은 PBS 처리 48시간 후 MAID 6074 WT 마우스와 비교하여 MAID 6074 HO에서의 골수 비장 집단을 보여준다.
도 24는 mG-CSF 처리 48시간 후 MAID 6074 WT 마우스와 비교하여 MAID 6074 HO 마우스에서의 골수 비장 집단을 보여준다.
도 25는 PBS 처리 48시간 후 MAID 6074 HO 마우스와 MAID 6074 WT 마우스에서 비장 단핵구에서의 인간 FcγRI 발현의 결여를 보여준다.
도 26은 mG-CSF 처리 48시간 후 MAID 6074 WT 마우스와 비교하여 MAID 6074 HO 마우스의 비장에서의 인간 FcγRI 발현을 보여준다.
도 27은 PBS 처리 48시간 후 MAID 6074 HO 마우스와 비교하여 MAID 6074 WT 마우스의 비장에서의 뮤린 FcγRI 발현을 보여준다.
도 28은 mG-CSF 처리 48시간 후 MAID 6074 HO 마우스와 비교하여 MAID 6074 WT 마우스의 비장에서의 뮤린 FcγRI 발현을 보여준다.
도 29는 PBS 또는 mG-CSF 처리 후 MAID 6074 WT 및 MAID 6074 HO 마우스의 세포 집단에서의 인간 FcγRI 발현의 요약을 보여준다.
도 30은 mHPRT1에 대하여 정규화된, MAID 6074 HO 마우스 혈액 및 비장에서 mG-CSF에 의해 유도된 인간 FcγRI mRNA의 상향조절(upregulation)을 보여준다.
도 31은 MAID 6074 HO 마우스 혈액 및 비장에서 mG-CSF에 의해 유도된 인간 FcγRI mRNA의 상향조절을 보여준다.
도 32는 마우스 FcγRI의 인간화를 위한 개략적이고 예시적인 전략을 묘사한다.
정의
본 발명은 기재된 특정 방법, 및 실험 조건으로 제한되지 않는데, 그러한 방법 및 조건이 다양할 수 있기 때문이다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는, 본 발명의 범주는 청구범위에 의해 한정되기 때문에, 단지 특정 실시 형태를 기재할 목적을 위한 것이지 제한하고자 하는 것이 아님이 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 용어 및 문구는, 그러한 용어 또는 문구가 사용되는 맥락이 반대로 명백히 지시되거나 반대임이 자명하지 않는 한, 그러한 용어 및 문구가 본 기술분야에서 획득한 의미를 포함한다. 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 특정 방법 및 물질이 이제 기재된다.
본 명세서에 적용된 바와 같이, 관심 있는 하나 이상의 값에 대한 용어 "대략"은 언급된 참조값과 유사한 값을 말한다. 소정 실시 형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 맥락으로부터 다르게 언급되거나 다르게 증명되지 않는 한 (그러한 수가 가능한 값의 100%를 초과할 수 있을 경우를 제외함), 언급된 참조값의 어느 한 쪽의 방향으로든 (크거나 작은 쪽으로) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생물학적으로 활성인"은 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서의 생물학적 시스템에서 (예를 들어, 유기체에서) 활성을 갖는 임의의 작용제의 특징을 말한다. 예를 들어, 유기체에 존재할 때 그 유기체 내에서 생물학적 효과를 갖는 작용제는 생물학적으로 활성인 것으로 여겨진다. 특정 실시 형태에서, 단백질 또는 폴리펩티드가 생물학적으로 활성인 경우에, 그 단백질 또는 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 공유하는 단백질 또는 폴리펩티드의 일부는 전형적으로 "생물학적으로 활성인" 부분으로 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비견되는"은 서로 동일하지 않을 수 있지만 그들 사이에 비교를 허용하기에 충분히 유사하여 관찰된 차이 또는 유사성을 기초로 결론이 타당하게 도출될 수 있도록 하는 둘 이상의 작용제, 개체(entity), 상황, 조건 세트 등을 말한다. 당업자는 둘 이상의 그러한 작용제, 개체, 상황, 조건 세트 등에 대해 임의의 주어진 상황에서 비견되는 것으로 간주되기 위해 어느 정도의 동일성이 필요한지를 맥락으로 이해할 것이다.
본 명세서에서 보존적 아미노산 치환을 설명하기 위해 사용되는 용어 "보존적"은 아미노산 잔기를 유사한 화학적 특성 (예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 R 기를 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것을 말한다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 관심 있는 기능적 특성들, 예를 들어 수용체가 리간드에 결합하는 능력을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예는 다음을 포함한다: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신과 같은 지방족 측쇄; 세린 및 트레오닌과 같은 지방족-하이드록실 측쇄; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드-함유 측쇄; 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판과 같은 방향족 측쇄; 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘과 같은 염기성 측쇄; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 측쇄; 및 시스테인 및 메티오닌과 같은 황-함유 측쇄. 보존적 아미노산 치환기는, 예를 들어, 발린/류신/아이소류신, 페닐알라닌/타이로신, 라이신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타메이트/아스파르테이트, 및 아스파라긴/글루타민을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 보존적 아미노산 치환은, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이생성(alanine scanning mutagenesis)에 사용되는 바와 같이, 단백질 내의 임의의 고유 잔기의 알라닌으로의 치환일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 보존적 치환은 문헌[Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45] (본 명세서에 참고로 포함됨)에 개시된 PAM250 로그-우도 매트릭스(log-likelihood matrix)에서 양의 값을 갖도록 행해진다. 일부 실시 형태에서, 치환은 PAM250 로그-우도 매트릭스에서 음이 아닌 값을 갖는 중간 정도로 보존적인 치환이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "파괴"는 DNA 분자 (예를 들어, 유전자 또는 유전자 좌와 같은 내인성 상동 서열)와의 상동 재조합 사건의 결과를 말한다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 DNA 서열(들)의 삽입, 결실, 치환, 대체, 미스센스 돌연변이, 또는 프레임-시프트, 또는 이들의 임의의 조합을 달성하거나 나타낼 수 있다. 삽입은 내인성 서열 이외의 기원의 것일 수 있는 전체 유전자 또는 유전자들의 단편, 예를 들어, 엑손의 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 (예를 들어, 유전자에 의해 인코딩된 단백질의) 발현 및/또는 활성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 인코딩된 유전자 산물 (예를 들어, 인코딩된 단백질)의 서열을 변경시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 인코딩된 유전자 산물 (예를 들어, 인코딩된 단백질)을 절단하거나 단편화할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 인코딩된 유전자 산물을 연장시킬 수 있고; 그러한 일부 실시 형태에서, 파괴는 융합 단백질의 조립을 달성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 수준에 영향을 미칠 수 있지만 활성에는 영향을 미치지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 활성에 영향을 미칠 수 있지만 수준에는 영향을 미치지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 수준에 유의한 영향을 미치지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 활성에 유의한 영향을 미치지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 수준 또는 활성 중 어느 것에도 유의한 영향을 미치지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 문구 "내인성 좌" 또는 "내인성 유전자"는 본 명세서에 기재된 바와 같은 파괴, 결실, 대체, 변경, 또는 변형의 도입 전에 모(parent) 유기체 또는 참조 유기체에서 발견되는 유전적 좌를 말한다. 일부 실시 형태에서, 내인성 좌는 자연에서 발견되는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 내인성 좌는 야생형이다. 일부 실시 형태에서, 참조 유기체는 야생형 유기체이다. 일부 실시 형태에서, 참조 유기체는 조작된 유기체이다. 일부 실시 형태에서, 참조 유기체는 (야생형이든 조작된 것이든) 실험실-교배(laboratory-bred) 유기체이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 문구 "내인성 프로모터"는, 예를 들어, 야생형 유기체에서, 내인성 유전자와 자연적으로 연관된 프로모터를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "FcγRI 단백질"은 3개의 세포외 도메인들, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 갖는 α 사슬을 포함하는 고친화성 면역글로불린 Fc 수용체를 말한다.
예로서, 마우스 및 인간 FcγRI α 유전자의 대표적인 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 표 3에 제공되어 있다. 본 개시 내용을 읽는 숙련자는 게놈 내의 하나 이상의 (또는 모든) 내인성 FcγRI 수용체 유전자들이 하나 이상의 이종(heterologous) FcγRI 유전자들 (예를 들어, 다형 변이체들, 아형들 또는 돌연변이체들, 다른 종으로부터의 유전자들, 등)로 대체될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "FcγRI-발현 세포"는 FcγRI을 발현하는 세포를 말한다. 일부 실시 형태에서, FcγRI-발현 세포는 그의 표면에 FcγRI 수용체를 발현한다. 일부 실시 형태에서, FcγRI 수용체는 세포의 표면에서 발현되는 FcγRI 단백질을 통한 세포-세포 상호작용을 매개하기에 충분한 양으로 세포의 표면에서 발현된다. 예시적인 FcγRI-발현 세포는 림프구, 골수 세포, 대식세포, 호중구, 및 자연 사멸(NK) 세포를 포함한다. FcγRI-발현 세포는 면역 세포들의 상호작용을 조절하여 다양한 외부 항원 또는 병원체에 대한 면역 반응을 조절한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비-인간 동물은 비-인간 동물의 하나 이상의 세포의 표면에서 발현되는 인간화된 FcγRI 수용체를 통한 면역 세포 조절을 보여준다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이종"은 상이한 공급원으로부터의 작용제 또는 개체를 말한다. 예를 들어, 특정 세포 또는 유기체에 존재하는 폴리펩티드, 유전자 또는 유전자 산물과 관련하여 사용될 때, 그 용어는 관련된 폴리펩티드, 유전자 또는 유전자 산물이 1) 인공적으로 조작되었고/되었거나; 2) 인공적으로 (예를 들어, 유전자 조작을 통해) 세포 또는 유기체 (또는 그의 전구체)에 도입되었고/되었거나; 3) 관련된 세포 또는 유기체 (예를 들어, 관련된 세포 유형 또는 유기체 유형)에 의해 자연적으로 생산되거나 거기에 존재하지 않는다는 것을 명확히 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 이종 (예를 들어, 외인성) 핵산 또는 단백질이 도입된 세포를 말한다. 본 개시 내용을 읽은 숙련자는 그러한 용어들이 특정 대상 세포를 말할 뿐 아니라 그러한 세포의 자손을 말하는 데에도 사용된다는 것을 이해할 것이다. 소정 변형은 돌연변이 또는 환경적 영향 중 어느 것으로 인해서든 후세대에서 일어날 수 있기 때문에, 그러한 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 여전히 포함된다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이거나 그것을 포함한다. 일반적으로, 숙주 세포는, 그 세포가 지정되어 있는 생명계(Kingdom of life)와 관계없이, 이종 핵산 또는 단백질을 수용하고/하거나 생산하기에 적합한 임의의 세포이다. 예시적인 세포는 원핵생물 및 진핵생물의 것들 (단세포 또는 다세포), 세균 세포 (예를 들어, 대장균(E. coli), 바실루스 종(Bacillus spp.), 스트렙토미케스 종(Streptomyces spp.), 등의 균주들), 미코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포 (예를 들어, S. 세레비시아이(S. cerevisiae), S. 폼베(S. pombe), P. 파스토리스(P. pastoris), P. 메타놀리카(P. methanolica), 등), 식물 세포, 곤충 세포 (예를 들어, SF-9, SF-21, 배큘로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 등), 비-인간 동물 세포, 인간 세포 또는 세포 융합물, 예컨대, 하이브리도마(hybridoma) 또는 쿼드로마(quadroma)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트, 또는 마우스 세포이다. 일부 실시 형태에서, 세포는 진핵 세포이고 하기 세포들로부터 선택된다: CHO (예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, 베지(Veggie)-CHO), COS (예를 들어, COS-7), 망막 세포, 베로(Vero), CV1, 신장 (예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60 (예를 들어, BHK21), 주르카트(Jurkat), 다우디(Daudi), A431 (표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, 세르톨리(Sertoli) 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포, 및 상기 언급된 세포로부터 유래된 세포주.일부 실시 형태에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어, 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어, PER.C6™ 세포)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 단리된 세포이거나 그를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 조직의 일부이다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 유기체의 일부이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 문구 "인간 FcγRI 유전자"는 문맥에 따라 FcγRI 단백질의 완전한 인간 부분, 실질적인 인간 부분, 또는 인간화된 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 일부 실시 형태에서, "인간 FcγRI" 유전자는 완전한 마우스 FcγRI 유전자와 대조해서 인간화된 FcγRI 유전자를 말한다. 일부 실시 형태에서, 인간 FcγRI 유전자는 하나 이상의 치환, 부가, 결실, 또는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 FcγRI 유전자는 FcγRIA (CD64A), FcγRIB (CD64B), FcγRIC (CD64C), 또는 이들의 조합을 포함한다.
문구 "인간 FcγRI 단백질"은 문맥에 따라 완전한 인간 FcγRI 유전자, 실질적인 인간 FcγRI 유전자, 또는 인간화된 FcγRI 유전자로 인코딩된 단백질을 말한다. 일부 실시 형태에서, "인간 FcγRI" 단백질은 완전한 마우스 FcγRI 단백질과 대조해서 인간화된 FcγRI 단백질을 말한다. 일부 실시 형태에서, 인간 FcγRI 단백질은 하나 이상의 아미노산 치환, 부가, 결실, 또는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시 형태에서, FcγRI 단백질은 FcγRIA (CD64A), FcγRIB (CD64B), FcγRIC (CD64C), 또는 이들의 조합을 포함한다.
문구 "하이브리드 FcγRI 유전자" 또는 "하이브리드 FcγRI 단백질"은 적어도 2개의 상이한 종(species)의 동물들의 FcγRI 서열을 포함하는 FcγRI 유전자 또는 단백질을 말한다. 일부 실시 형태에서, 하이브리드 FcγRI 유전자는 인간 핵산 서열의 일부 및 마우스 핵산 서열의 일부를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하이브리드 FcγRI 단백질은 인간 아미노산 서열의 일부 및 마우스 아미노산 서열의 일부를 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "인간화된"은, 그의 기술분야에서 이해되는 의미에 따라, 구조 (즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열)가 자연에서 비-인간 동물에서 발견되는 특정 유전자 또는 단백질의 구조와 실질적으로 또는 동일하게 상응하는 부분들을 포함하며, 또한 관련된 특정 비-인간 유전자 또는 단백질에서 발견되는 것과 상이하고 그 대신 상응하는 인간 유전자 또는 단백질에서 발견되는 비견되는 구조와 더 근접하게 상응하는 부분을 포함하는 핵산 또는 단백질을 말하기 위해 사용된다. 일부 실시 형태에서, "인간화된" 유전자는 인간 폴리펩티드 (예를 들어, 인간 단백질 또는 그의 일부 - 예를 들어, 그의 특징적인 부분)의 아미노산 서열과 실질적으로 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 것이다. 일례를 제공하자면, 막 수용체의 경우에, "인간화된" 유전자는 인간 세포외 부분의 아미노산 서열과 같은 아미노산 서열을 갖는 세포외 부분 및 비-인간 (예를 들어, 마우스) 폴리펩티드의 아미노산 서열과 같은 나머지 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 인간화된 유전자는 인간 유전자의 DNA 서열의 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간화된 유전자는 인간 유전자의 전체 DNA 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간화된 단백질은 인간 단백질에 나타나는 부분을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간화된 단백질은 인간 단백질의 전체 서열을 포함하고 인간 유전자의 호모로그(homolog) 또는 오르토로그(ortholog)에 상응하는 비-인간 동물의 내인성 좌로부터 발현된다.
본 명세서에서 서열의 비교와 관련하여 사용되는 바와 같이, 용어 "동일성"은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있는, 본 기술분야에 공지되어 있는 많은 상이한 알고리즘에 의해 결정된 바와 같은 동일성을 말한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 동일성은 10.0의 개방 갭 페널티, 0.1의 확장 갭 페널티를 사용하는 클러스탈더블유(ClustalW) v. 1.83 (슬로우(slow)) 정렬을 사용하고, 고넷(Gonnet) 유사성 매트릭스 (맥벡터(MACVECTOR)™ 10.0.2, 맥벡터 인크.(MacVector Inc.), 2008)를 사용하여 결정된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포내 신호 캐스케이드" 또는 "세포내 신호 전달(signal transduction)"은 신호를 세포 표면으로부터 하나 이상의 세포내 표적으로 전달하는 것을 말한다. 일부 실시 형태에서, 세포내 신호 전달은 FcγR1 수용체의 세포외 성분에 대한 표적 분자 (예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역)의 결합으로 인해 유도되는 세포에서의 생리학적 반응을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된"은 (1) (자연적으로든 및/또는 실험실 환경에서든 어느 쪽으로든) 초기에 생산되었을 때 회합된 성분들 중 적어도 일부로부터 분리되었고/되었거나, (2) 인공적으로 설계, 생산, 제조, 및/또는 제작된 물질 및/또는 개체를 말한다. 단리된 물질 및/또는 개체는 초기에 회합되었던 다른 성분들로부터 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99%를 초과하여 분리될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 단리된 작용제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과 순도이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 물질에 다른 성분들이 실질적으로 없다면 그것은 "순수"하다. 일부 실시 형태에서, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 물질은, 예를 들어, 하나 이상의 담체 또는 부형제 (예를 들어, 완충제, 용매, 물, 등)와 같은 특정 다른 성분들과 배합된 후에도 여전히 "단리된" 또는 심지어 "순수한" 것으로 간주될 수 있고; 그러한 실시 형태에서, 그 물질의 %단리 또는 순도는 그러한 담체 또는 부형제들을 포함하지 않고서 계산된다. 일례를 제공하자면, 일부 실시 형태에서, 자연적으로 발생하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 생물학적 중합체는 a) 그것의 유래가 되는 기원 또는 공급원에 의해 자연에서의 그것의 고유 상태에서 그것을 동반하는 성분들 중 일부 또는 모두와 회합되어 있지 않을 때; b) 자연에서 그것을 생산하는 종으로부터 동일한 종의 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 그것에 실질적으로 없을 때; c) 자연에서 그것을 생산하는 종의 것이 아닌 세포 또는 다른 발현 시스템에 의해 발현되거나 또는 그렇지 않으면 그러한 세포 또는 시스템으로부터의 성분들과 회합되어 있을 때 "단리된" 것으로 간주된다. 따라서, 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 화학적으로 합성되거나 자연에서 그것을 생산하는 세포 시스템과 상이한 세포 시스템에서 합성되는 폴리펩티드는 "단리된" 폴리펩티드인 것으로 간주된다. 대안적으로 또는 부가적으로, 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 정제 기법이 수행된 폴리펩티드가, 그것이 a) 자연에서 회합되어 있고/있거나; b) 초기에 생산되었을 때 회합되어 있던 다른 성분들로부터 분리되어 있는 한 "단리된" 폴리펩티드인 것으로 간주될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 문구 "마우스 FcγRI 유전자"는 서열 번호 1에 나타낸 바와 같은 핵산 분자, 또는 서열 번호 1에 나타낸 바와 같은 분자와 실질적인 동일성을 갖는 핵산 분자를 포함하는 유전자를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 문구 "마우스 FcγRI 단백질"은 서열 번호 2에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 2에 나타낸 바와 같은 단백질과 실질적인 동일성을 갖는 단백질을 포함하는 단백질을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 문구 "비-인간 동물"은 인간이 아닌 임의의 척추동물 유기체를 말한다. 일부 실시 형태에서, 비-인간 동물은 원구류, 경골 어류, 연골 어류 (예를 들어, 상어 또는 가오리), 양서류, 파충류, 포유류, 및 조류이다. 일부 실시 형태에서, 비-인간 포유류는 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소 또는 설치류이다. 일부 실시 형태에서, 비-인간 동물은 래트 또는 마우스와 같은 설치류이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 문구 "핵산"은, 그의 가장 넓은 의미로, 올리고뉴클레오티드 사슬이거나 그 안으로 도입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 말한다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 올리고뉴클레오티드 사슬이거나 포스포다이에스테르 결합을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬 내로 도입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 문맥으로부터 명백해지게 될 바와 같이, 일부 실시 형태에서, "핵산"은 개별적인 핵산 잔기 (예를 들어, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)들을 말하고; 일부 실시 형태에서, "핵산"은 개별적인 핵산 잔기들을 포함하는 올리고뉴클레오티드 사슬을 말한다. 일부 실시 형태에서, "핵산"은 RNA이거나 RNA를 포함하고; 일부 실시 형태에서, "핵산"은 DNA이거나 DNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 하나 이상의 자연 핵산 잔기이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 하나 이상의 핵산 유사체이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 핵산 유사체는 포스포다이에스테르 골격을 이용하지 않는다는 점에서 핵산과 상이하다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 핵산은, 본 기술분야에 알려져 있고 골격에 포스포다이에스테르 결합 대신 펩티드 결합을 가지며, 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주되는 하나 이상의 "펩티드 핵산"이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 대안적으로 또는 부가적으로, 일부 실시 형태에서, 핵산은 포스포다이에스테르 결합보다는 오히려 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 5'-N-포스포라미다이트 결합을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 하나 이상의 천연 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘)이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화된 염기, 삽입된 염기, 및 이들의 조합)이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 천연 핵산에서의 것들과 비교하여 하나 이상의 변형된 당 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 RNA 또는 단백질과 같은 기능적 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 천연 공급원으로부터의 단리, (생체내 또는 시험관내에서) 상보성 주형에 기반한 중합에 의한 효소적 합성, 재조합 세포 또는 시스템에서의 재생산, 및 화학적 합성 중 하나 이상에 의해 제조된다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개 또는 그 이상의 잔기 길이이다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 단일 가닥이고; 일부 실시 형태에서, 핵산은 이중 가닥이다. 일부 실시 형태에서, 핵산은, 폴리펩티드를 인코딩하거나, 폴리펩티드를 인코딩하는 서열의 상보체인 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 효소적 활성을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 문구 "작동가능하게 연결된"은 기재된 성분들이 그들의 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병치상태를 말한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 양립가능한 조건 하에서 달성되는 방식으로 연결된다. "작동가능하게 연결된" 서열은 관심 유전자와 인접한 발현 제어 서열 및 관심 유전자를 제어하기 위해 트랜스로 또는 일정 거리를 두고 작용하는 발현 제어 서열 둘 다를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현 제어 서열"은 그것이 연결되는 코딩 서열의 발현 및 프로세싱을 이루는 데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 프로세싱 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증강시키는 서열 (즉, 코작(Kozak) 공통 서열); 단백질 안정성을 증강시키는 서열; 및 원하는 경우, 단백질 분비를 증강시키는 서열을 포함한다. 그러한 제어 서열들의 성질은 숙주 유기체에 따라 상이하다. 예를 들어, 원핵생물에서, 그러한 제어 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함하는 반면, 진핵 세포에서는, 전형적으로 그러한 제어 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "제어 서열"은, 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 성분을 포함하는 것으로 의도되고, 또한 존재가 유리한 추가적인 성분들, 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 임의의 중합 사슬을 말한다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드는 자연적으로 발생하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드는 자연적으로 발생하지 않는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드는 인공적인 작용을 통해 설계되고/되거나 생성된다는 점에서 조작되는 아미노산 서열을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합"은 재조합 수단에 의해 설계되거나, 조작되거나, 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리되는 폴리펩티드 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 신호-조절 단백질), 예컨대 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 폴리펩티드, 재조합의 조합 인간 폴리펩티드 라이브러리로부터 단리된 폴리펩티드 (문헌[Hoogenboom H. R., (1997) TIB Tech. 15:62-70]; 문헌[Azzazy H., and Highsmith W. E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445]; 문헌[Gavilondo J. V., and Larrick J. W. (2002) BioTechniques 29:128-145]; 문헌[Hoogenboom H., and Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378]), 인간 면역글로불린 유전자를 위해 유전자도입된 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체 (예를 들어, 문헌[Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res.20:6287-6295]; 문헌[Kellermann S-A., and Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597]; 문헌[Little M. et al (2000) Immunology Today 21:364-370] 참조), 또는 서로에 대해 선택된 서열 요소들을 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 폴리펩티드를 말하는 것으로 의도된다. 일부 실시 형태에서, 그러한 선택된 서열 요소들 중 하나 이상은 자연에서 발견된다. 일부 실시 형태에서, 그러한 선택된 서열 요소들 중 하나 이상은 가상 실험(in silico)에서 설계된다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 그러한 선택된 서열 요소들은, 예를 들어 천연 또는 합성 공급원으로부터의 공지된 서열 요소의 (예를 들어, 생체내 또는 시험관내에서의) 돌연변이생성으로부터 유발된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 재조합 폴리펩티드는 관심 있는 공급원 유기체 (예를 들어, 인간, 마우스, 등)의 게놈에서 발견되는 서열로 구성된다. 일부 실시 형태에서, 재조합 폴리펩티드는 (예를 들어, 시험관내 또는 생체내에서의, 예를 들면 비-인간 동물에서의) 돌연변이생성으로부터 유발된 아미노산 서열을 가지며, 이에 따라 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열은, 폴리펩티드 서열로부터 기원하고 그와 관련되어 있지만, 생체내에서 비-인간 동물의 게놈 내에는 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본 명세서에서 용어 "대체"는 숙주 좌(host locus)에서 (예를 들어, 게놈에서) 발견되는 "대체된" 핵산 서열 (예를 들어, 유전자)이 그 좌로부터 제거되고 상이한 "대체" 핵산이 그의 자리에 위치되는 과정을 말하기 위해 사용된다. 일부 실시 형태에서, 대체된 핵산 서열 및 대체 핵산 서열은, 예를 들어 그들이 서로에 대해 상동이고/이거나 상응하는 요소들 (예를 들어, 단백질-코딩 요소, 조절 요소, 등)을 포함한다는 점에서 서로 비견된다. 일부 실시 형태에서, 대체된 핵산 서열은 프로모터, 인핸서, 스플라이스 공여체 부위, 스플라이스 수용체 부위, 인트론, 엑손, 비번역 영역 (UTR) 중 하나 이상을 포함하고; 일부 실시 형태에서, 대체 핵산 서열은 하나 이상의 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 대체 핵산 서열은 대체된 핵산 서열의 호모로그이다. 일부 실시 형태에서, 대체 핵산 서열은 대체된 핵산 서열의 오르토로그이다. 일부 실시 형태에서, 대체 핵산 서열은 인간 핵산 서열이거나 이를 포함한다. 대체 핵산 서열이 인간 핵산 서열이거나 이를 포함하는 경우를 포함하여, 일부 실시 형태에서, 대체된 핵산 서열은 설치류 서열 (예를 들어, 마우스 서열)이거나 이를 포함한다. 그렇게 배치된 핵산 서열은, 그렇게 배치된 서열을 얻기 위해 사용된 공급원 핵산 서열의 일부인 하나 이상의 조절 서열 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 5'- 또는 3'-비번역 영역, 등)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시 형태에서, 대체는 이종 서열로의 내인성 서열의 치환이며, 그 결과 (이종 서열을 포함하는) 그렇게 배치된 핵산 서열로부터 유전자 산물의 생산을 가져오지만 내인성 서열의 발현은 일으키지 않고; 대체는 내인성 게놈 서열을 내인성 서열에 의해 인코딩된 단백질과 유사한 기능을 갖는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열로 대체하는 것이다 (예를 들어, 내인성 게놈 서열은 FcγRI 단백질을 인코딩하고, DNA 단편은 하나 이상의 인간 FcγRI 단백질을 인코딩한다). 다양한 실시 형태에서, 내인성 유전자 또는 그의 단편은 상응하는 인간 유전자 또는 그의 단편으로 대체된다. 상응하는 인간 유전자 또는 그의 단편은, 대체된 내인성 유전자 또는 그의 단편의 오르토로그이거나, 구조 및/또는 기능에서 그와 실질적으로 유사하거나 동일한 인간 유전자 또는 단편이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로"는 관심 있는 특징 또는 특성의 전체적인 또는 거의 전체적인 크기 또는 정도를 나타내는 정성적 상태를 말한다. 생물학적 기술분야의 당업자는 생물학적 및 화학적 현상들은 설사 있다 해도 드물게 완료되고/되거나 완전성에 이르도록 진행되거나 절대적인 결과를 달성하거나 피한다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 본 명세서에서 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및 화학적 현상들에 고유한 완전성의 잠재적인 결여를 나타내기 위해 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 문구 "실질적인 상동성"은 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 비교를 말한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 2개의 서열은 그것들이 상응하는 위치에 상동인 잔기를 함유한다면 일반적으로 "실질적으로 상동인" 것으로 간주된다. 상동 잔기들은 동일한 잔기들일 수 있다. 대안적으로, 상동 잔기들은 적절하게 유사한 구조적 및/또는 기능적 특징을 가질 비-동일한 잔기들일 수 있다. 예를 들어, 당업자에 의해 잘 알려진 바와 같이, 소정 아미노산들은 전형적으로 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산으로서, 그리고/또는 "극성" 또는 "비극성" 측쇄를 갖는 것으로 분류된다. 한 아미노산을 동일 유형의 다른 아미노산으로 치환하는 것은 종종 "상동" 치환으로 간주될 수 있다. 전형적인 아미노산 분류가 표 1 및 2에 요약되어 있다.
[표 1]

[표 2]

본 기술분야에서 잘 알려져 있는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은, 뉴클레오티드 서열을 위한 BLASTN 및 아미노산 서열을 위한 BLASTP, 갭이 있는(gapped) BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 시판 컴퓨터 프로그램에서 이용가능한 것들을 포함하여, 다양한 알고리즘 중 임의의 것을 사용하여 비교될 수 있다. 예시적인 그러한 프로그램들은 하기에 기재되어 있다: 문헌[Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990]; 문헌[Altschul, et al., Methods in Enzymology]; 문헌[Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997]; 문헌[Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998]; 및 문헌[Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999].상동 서열을 확인하는 것 외에도, 상기 언급된 프로그램들은 전형적으로 상동성 정도의 표시를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 2개의 서열은 그것들의 상응하는 잔기들의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 잔기들의 관련 구간(relevant stretch)에 걸쳐 상동이라면 실질적으로 상동인 것으로 간주된다. 일부 실시 형태에서, 관련 구간은 완전한 서열이다. 일부 실시 형태에서, 관련 구간은 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 또는 그 이상의 잔기들이다. 일부 실시 형태에서, 관련 구간은 완전한 서열을 따라 인접한 잔기들을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 관련 구간은 완전한 서열을 따라 불연속적인 잔기들을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 관련 구간은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개, 또는 그 이상의 잔기들이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 문구 "실질적인 동일성"은 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 비교를 말한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 2개의 서열은 그것들이 상응하는 위치에 동일한 잔기를 함유한다면 일반적으로 "실질적으로 동일한" 것으로 간주된다. 본 기술분야에서 잘 알려져 있는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은, 뉴클레오티드 서열을 위한 BLASTN 및 아미노산 서열을 위한 BLASTP, 갭이 있는 BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 시판 컴퓨터 프로그램에서 이용가능한 것들을 포함하여, 다양한 알고리즘 중 임의의 것을 사용하여 비교될 수 있다. 예시적인 그러한 프로그램들은 하기에 기재되어 있다: 문헌[Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990]; 문헌[Altschul, et al., Methods in Enzymology]; 문헌[Altschul et al., Nucleic acids Res. 25:3389-3402, 1997]; 문헌[Baxevanis et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998]; 및 문헌[Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999].동일한 서열을 확인하는 것 외에도, 상기 언급된 프로그램들은 전형적으로 동일성 정도의 표시를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 2개의 서열은 그것들의 상응하는 잔기들의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 잔기들의 관련 구간에 걸쳐 동일하다면 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 일부 실시 형태에서, 관련 구간은 완전한 서열이다. 일부 실시 형태에서, 관련 구간은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개, 또는 그 이상의 잔기들이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 문구 "표적화 벡터" 또는 "표적화 작제물"은 표적화 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 말한다. 표적화 영역은 표적 세포, 조직 또는 동물의 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하고, 상동 재조합을 통해 그러한 세포, 조직 또는 동물의 게놈 내의 위치 내로 표적화 작제물을 도입하도록 제공한다. 부위-특이적 재조합효소 인식 부위 (예를 들어, loxP 또는 Frt 부위)를 사용하여 표적화하는 표적화 영역이 또한 포함된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 표적화 작제물은, 특별히 관심이 있는 핵산 서열 또는 유전자, 선택가능 마커, 제어 및/또는 조절 서열, 및 기타 핵산 서열들이 관여하는 재조합을 보조하거나 촉진하는 단백질의 외인성 부가를 통해 매개되는 재조합을 허용하는 그러한 서열들을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 표적화 작제물은 관심 유전자를 전체적으로 또는 부분적으로 추가로 포함하며, 이때 관심 유전자는 내인성 서열에 의해 인코딩된 단백질과 유사한 기능을 갖는 단백질을 전체적으로 또는 부분적으로 인코딩하는 이종 유전자이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 참조 개체와 유의한 구조적 동일성을 보이지만 참조 개체와 비교하여 하나 이상의 화학적 모이어티(moiety)의 존재 또는 수준에 있어서 참조 개체와 구조적으로 상이한 개체를 말한다. 많은 실시 형태에서, 변이체는 또한 그의 참조 개체와 기능적으로 상이하다. 일반적으로, 특정 개체가 참조 개체의 "변이체"인 것으로 적절하게 간주되는지의 여부는 참조 개체와의 그의 구조적 동일성 정도를 기초로 한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 어떠한 생물학적 또는 화학적 참조 개체든지 이들은 소정의 특징적인 구조적 요소들을 갖는다. 정의에 의하면, 변이체는 하나 이상의 그러한 특징적인 구조적 요소들을 공유하는 별개의 화학적 개체이다. 몇몇 예를 제공하자면, 소분자는 특징적인 코어 구조적 요소 (예를 들어, 거대고리(macrocycle) 코어) 및/또는 하나 이상의 특징적인 펜던트 모이어티를 가질 수 있어서 소분자의 변이체는 코어 구조적 요소 및 특징적인 펜던트 모이어티들을 공유하지만 다른 펜던트 모이어티 및/또는 코어 내에 존재하는 결합의 유형 (단일 대 이중, E 대 Z 등)이 상이한 것이 되며, 폴리펩티드는 선형 또는 삼차원 공간에서 서로에 대해 상대적으로 지정된 위치를 갖고/갖거나 특정 생물학적 기능에 기여하는 복수의 아미노산들로 구성된 특징적인 서열 요소를 가질 수 있으며, 핵산은 선형 또는 삼차원 공간에서 서로에 대해 상대적으로 지정된 위치를 갖는 복수의 뉴클레오티드 잔기들로 구성된 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다. 예를 들어, 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열의 하나 이상의 차이 및/또는 폴리펩티드 골격에 공유적으로 부착되어 있는 화학적 모이어티 (예를 들어, 탄수화물, 지질, 등)의 하나 이상의 차이의 결과로서 참조 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와의 전체 서열 동일성이 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 99%임을 보여준다. 대안적으로 또는 부가적으로, 일부 실시 형태에서, 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 적어도 하나의 특징적인 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 참조 폴리펩티드는 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드의 생물학적 활성들 중 하나 이상을 공유한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드의 생물학적 활성들 중 하나 이상이 결여되어 있다. 일부 실시 형태에서, 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 생물학적 활성들의 감소된 수준을 보여준다. 많은 실시 형태에서, 관심 폴리펩티드는, 그러한 관심 폴리펩티드가 모 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖지만 특정 위치에서 적은 수의 서열 변경을 갖는다면 모 또는 참조 폴리펩티드의 "변이체"인 것으로 간주된다. 전형적으로, 모 폴리펩티드와 비교하여 변이체 내의 잔기들은 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만으로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 모 폴리펩티드와 비교하여 변이체는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 치환된 잔기를 갖는다. 종종, 변이체는 매우 작은 수 (예를 들어, 5, 4, 3, 2 또는 1개보다 작은)의 치환된 기능성 잔기 (즉, 특정한 생물학적 활성에 참여하는 잔기)를 갖는다. 나아가, 전형적으로 변이체는 모 폴리펩티드와 비교하여 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 부가 또는 결실을 가지며, 종종 부가 또는 결실을 갖지 않는다. 더욱이, 임의의 부가 또는 결실은 전형적으로 약 25, 약 20, 약 19, 약 18, 약 17, 약 16, 약 15, 약 14, 약 13, 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6개 미만의 잔기이고, 통상적으로는 약 5, 약 4, 약 3, 또는 약 2개 미만의 잔기이다. 일부 실시 형태에서, 모 또는 참조 폴리펩티드는 자연에서 발견되는 것이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 관심 있는 특정 폴리펩티드의 복수의 변이체들은, 특히 관심 폴리펩티드가 감염성 인자(infectious agent) 폴리펩티드일 때, 자연에서 통상적으로 발견될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 핵산 분자로서, 그것이 회합되는 다른 핵산을 수송할 수 있는 그러한 핵산 분자를 말한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는, 그것이 진핵 세포 및/또는 원핵 세포와 같은 숙주 세포에서 연결되는 핵산의 염색체외(extra-chromosomal) 복제 및/또는 발현이 가능하다. 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있는 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "야생형"은 그의 기술분야에서 이해되는 의미를 가지며, (돌연변이, 병에 걸린, 변경된, 등과 대조적으로) 자연에서 "정상" 상태 또는 상황에서 발견되는 것과 같은 구조 및/또는 활성을 갖는 개체를 말한다. 당업자는 야생형 유전자 및 폴리펩티드는 종종 다수의 상이한 형태 (예를 들어, 대립유전자)로 존재한다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 다양한 태양이 다음의 섹션들에서 상세하게 설명된다. 섹션들의 사용은 본 발명을 제한하는 것을 의미하지 않는다. 각각의 섹션은 본 발명의 어떠한 태양에도 적용될 수 있다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 다르게 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다.

본 발명은, 특히, 인간 또는 인간-유사 면역 효과기 반응 실험을 위한, FcγRI 수용체를 인코딩하는 인간화된 유전 물질을 갖는 개선되고/되거나 조작된 비-인간 동물을 제공한다.

Fc 수용체

면역글로불린의 Fc (즉, 불변) 영역에 대한 수용체(FcR)는 면역 반응의 조절에서 중요한 역할을 한다. FcR은 숙주 면역 시스템의 보조 세포에 존재하여 항체에 의해 결합된 외부 항원의 처리를 용이하게 한다. FcR은 또한 면역 시스템의 보조 세포의 활성화 반응 및 억제 반응 둘 모두의 균형에서 중요한 역할을 한다. FcR은 대식세포에 의한 식세포작용, 비만 세포의 탈과립화, 항체-항원 복합체의 흡수 및 면역 반응의 조절(modulation), 및 기타 면역 시스템 과정들에 관여한다.

마우스와 인간에서, 별개의 FcR들은 발현된 항체 레퍼토리에 존재하는 면역글로불린 아이소타입들에 대해 각각이 특이적인 상이한 보조 세포들의 표면에 차등적으로 발현된다. 예를 들어, 면역글로불린 G (IgG) 항체는 IgG 수용체 (FcγR)를 통해서 효과기 기능을 매개한다. FcγR은 네 그룹으로 분류되어 왔다: 고친화성 활성화 FcγRI (CD64), 저친화성 억제성 FcγRIIb (CD32b), 저친화성 활성화 FcgRIIa/c (CD32a/c) 및 저친화성 활성화 FcγRIII (CD16). 마우스와 인간 둘 다 각각의 그룹이 존재하지만, 이들이 존재하는 면역 세포의 동형(isoform) 및 아형의 수는 상이하다. 예를 들어, Fcγ RIIA 및 FcγRIIIB는 인간에서 보조 세포에서 발현되지만 알려진 바에 의하면 마우스에는 없다. 또한, 각각의 FcγR에 대한 상이한 IgG 아이소타입들 (예를 들어, IgG 1)의 친화도는 마우스와 인간이 상이하다.

고친화성 인간 FcγRI

인간 고친화성 FcγRI (CD64)은 고친화도로 (전형적으로 대략 10^-8 내지 10^-9 M의 Ka로) 단량체성 IgG-형 항체에 결합하는 내재성(integral) 막 당단백질이다. IgG에 결합한 후, CD64는 세포 활성화를 촉발시키는 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 보유하는 공통 γ 사슬(common γ chain) (γ 사슬)로 알려진 보조 사슬과 상호작용한다. 인간에서, CD64는 본질적으로 대식세포 및 단핵구에서 발현되고, 이와 함께 IFNγ 및 G-CSF와 같은 사이토카인에 의해 다형핵 백혈구에서 유도성 발현을 갖는 것으로 보고되어 왔다.

FcγRI 서열

인간, 마우스, 및 하이브리드화된 FcγRI에 대한 예시적인 서열들이 표 3에 제시되어 있다. cDNA 서열의 경우에, 연속된 엑손들은 교대로 밑줄이 그어진 텍스트로 구분되어 있다. 단백질 서열의 경우, 세포외 서열은 밑줄이 그어져 있다. 언급된 서열은 예시적이고; 당업자는 추가적인 마우스 및 인간 서열들을 식별하기 위해 서열 요소들 또는 동일성 정도를 결정하고 비교할 수 있다.

[표 3]

인간화된 FcγRI 비-인간 동물

FcγRI 단백질을 인코딩하는 비-인간 동물의 내인성 좌의 유전적 변형으로 인해 유발된 인간화된 FcγRI 수용체 단백질을 비-인간 동물의 면역 세포 (예를 들어, 골수 세포)의 표면에 발현하는 비-인간 동물이 제공된다. 본 명세서에 기재된 적합한 예로는 설치류, 특히, 마우스가 포함된다.

일부 실시 형태에서, 인간화된 내인성 FcγRI 유전자는 이종(heterologous species) (예를 들어, 인간)으로부터의 유전 물질을 포함하고, 인간화된 내인성 FcγRI 유전자는 이종으로부터의 유전 물질의 인코딩된 일부를 포함하는 FcγRI 단백질을 인코딩한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 인간화된 내인성 FcγRI 유전자는 세포의 원형질 막에서 발현되는 FcγRI 단백질의 세포외 부분에 상응하는 이종의 게놈 DNA를 포함한다. 상기 인간화된 내인성 FcγRI 유전자를 함유하는 비-인간 동물, 배아, 세포 및 그러한 비-인간 동물, 비-인간 배아, 및 세포를 제조하기 위한 표적화 작제물이 또한 제공된다.

일부 실시 형태에서, 내인성 FcγRI 좌는 결실된다. 일부 실시 형태에서, 내인성 FcγRI 좌는 변경되는데, 여기서는 내인성 FcγRI 좌의 일부가 이종 서열로 (예를 들어, 인간 FcγRI 서열로 전체적으로 또는 부분적으로) 대체된다. 일부 실시 형태에서는, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 FcγRI 좌가 이종 좌 (예를 들어, 인간 FcγRI 좌)로 대체된다. 일부 실시 형태에서는, 이종 FcγRI 좌의 일부가 내인성 비-인간 FcγRI 좌 내로 삽입된다. 일부 실시 형태에서, 이종 좌는 인간 좌이다.

본 발명의 비-인간 동물은 내인성 비-인간 FcγRI 좌에서 인간 FcγRI 유전자를 전체적으로 또는 부분적으로 함유한다. 따라서, 그러한 비-인간 동물은 이종 FcγRI 유전자를 갖는 것으로 설명될 수 있다. 대체되거나, 삽입되거나, 변형된 내인성 FcγRI 좌는, 예를 들어 PCR, 웨스턴 블롯(Western blot), 서던 블롯(Southern blot), 제한 단편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism)(RFLP), 또는 대립유전자 검정의 획득 또는 손실을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 검출될 수 있다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화된 FcγRI 유전자는, 각각이 서열 번호 3의 인간 FcγRI 유전자에 나타나는 제3, 제4, 및 제5 엑손과 50% 이상 (예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 갖는 제3, 제4 및 제5 엑손을 갖는 FcγRI 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화된 FcγRI 유전자는 서열 번호 5에 나타나는 뉴클레오티드와 50% 이상 (예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 뉴클레오티드 코딩 서열 (예를 들어, cDNA 서열)을 갖는 FcγRI 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비-인간 동물에 의해 생산되는 인간화된 FcγRI 단백질은 표 3에 나타나는 인간 FcγRI 단백질의 세포외 부분과 50% 이상 (예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 갖는 세포외 부분을 갖는다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비-인간 동물에 의해 생산되는 인간화된 FcγRI 단백질은 서열 번호 4의 인간 FcγRI 단백질에 나타나는 아미노산 잔기 18 내지 288과 50% 이상 (예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 갖는 세포외 부분을 갖는다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비-인간 동물에 의해 생산되는 인간화된 FcγRI 단백질은 서열 번호 5에 예시된 바와 같은 인간화된 FcγRI 단백질의 아미노산 서열과 50% 이상 (예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

특이적 다형 형태 또는 대립유전자 변이체 (예를 들어, 단일 아미노산 차이)를 포함하여, 인간화된 FcγRI 단백질을 발현하는 비-인간 동물을 제조하기 위한 조성물 및 방법이 제공되며, 이는 인간 프로모터 및 인간 조절 서열로부터 그러한 단백질을 발현하는 비-인간 동물을 제조하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 내인성 프로모터 및 내인성 조절 서열로부터 그러한 단백질을 발현하는 비-인간 동물을 제조하기 위한 조성물 및 방법이 또한 제공된다. 본 방법은 비-인간 동물의 게놈 내의 정확한 위치에 전체적으로 또는 부분적으로 인간 FcγRI 단백질을 인코딩하는, 내인성 FcγRI 유전자에 상응하는 유전 물질을 삽입하여, 전체적으로 또는 부분적으로 인간인 FcγRI 단백질을 발현하는 인간화된 FcγRI 유전자를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 엑손 3 내지 5에 상응하는 게놈 DNA를 삽입하여, 삽입된 엑손에 의해 인코딩된 아미노산을 함유하는 인간 부분을 함유하는 FcγRI 단백질을 인코딩하는 인간화된 유전자를 생성하는 단계를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, FcγRI 서열의 게놈 서열은 단일 단편에서 변형되어 필수 조절 서열을 포함함으로써 정상 기능성을 보유하기 때문에, 인간화된 내인성 FcγRI 유전자 접근은 내인성 유전자의 비교적 최소한의 변형을 이용하고 비-인간 동물에서 자연적인 FcγRI 매개 효과기 반응을 유발한다. 따라서, 그러한 실시 형태에서, FcγRI 유전자 변형은 다른 주변 유전자 또는 다른 내인성 FcγRI 유전자에 영향을 주지 않는다. 또한, 다양한 실시 형태에서, 변형은 원형질에서 기능적 수용체의 조립에 영향을 주지 않고, 변형에 의해 최소한으로 영향을 받거나 전혀 영향을 받지 않은 수용체의 세포질 부분을 통한 결합 및 이어지는 신호 전달을 통해 정상 효과기 기능을 유지한다.

내인성 뮤린 FcγRI 유전자 및 인간화된 내인성 FcγRI 유전자의 개략도(축적대로 그려지지 않음)가 도 5에 제공되어 있다. 예시된 바와 같이, 인간 FcγRI 유전자의 엑손 3 내지 5를 함유하는 게놈 DNA는 표적화 작제물에 의해 내인성 뮤린 FcγRI 유전자 좌 내로 삽입된다. 이러한 게놈 DNA는 Fc 결합에 참여하는 인간 FcγRI 단백질의 하나 이상의 세포외 도메인 영역 (예를 들어, 아미노산 잔기 28 내지 362)을 인코딩하는 유전자의 일부를 포함한다.

인간화된 내인성 FcγRI 유전자를 갖는 비-인간 동물 (예를 들어, 마우스)은 본 기술분야에 알려진 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 인간 FcγRI 유전자를 전체적으로 또는 부분적으로 선택가능 마커 유전자와 함께 도입한 표적화 벡터가 제조될 수 있다. 도 5는 인간 FcγRI의 엑손 1 내지 5의 삽입을 포함하는 마우스 게놈을 예시한다. 예시된 바와 같이, 표적화 작제물은 내인성 뮤린 FcγRI 유전자의 엑손 1의 상류측에 있는 서열을 함유하는 5' 상동성 아암(arm), 그 뒤를 따라 인간 FcγRI 유전자의 엑손 1 내지 5를 함유하는 게놈 DNA 단편, 약물 선택 카세트 (예를 들어, loxP 서열들이 양측에 플랭킹된 네오마이신 내성 유전자), 및 내인성 뮤린 FcγRI 유전자의 엑손 6의 하류측에 있는 서열을 함유하는 3' 상동성 아암을 함유한다. 상동 재조합 시에, 내인성 뮤린 FcγRI 유전자의 엑손 1 내지 5 및 엑손 6의 일부는 표적화 벡터에 함유된 서열로 대체된다. 인간화된 내인성 FcγRI 유전자가 생성되며, 결과적으로 인간 FcγRI 유전자의 엑손 1 내지 5에 의해 인코딩된 아미노산을 함유하는 인간화된 FcγRI 단백질을 발현하는 세포 또는 비-인간 동물이 얻어진다. 약물 선택 카세트는 선택적으로, 후속되는 재조합효소 부가에 의해 (예를 들어, Cre 처리에 의해) 제거될 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 인간화된 FcγRI 유전자를 갖는 마우스 외에도, 인간화된 FcγRI 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 다른 비-인간 동물이 또한 본 명세서에 제공된다. 일부 실시 형태에서, 그러한 비-인간 동물은 내인성 FcγRI 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간화된 FcγRI 유전자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 그러한 비-인간 동물은 내인성 좌로부터 인간화된 FcγRI 단백질을 발현하며, 인간화된 FcγRI 단백질은 인간 FcγRI 단백질의 아미노산 잔기 16 내지 290을 포함한다.

그러한 비-인간 동물은 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 솟과 동물 (예를 들어, 소, 황소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 페럿, 영장류 (예를 들어, 마모셋, 붉은털 원숭이)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 적합한 유전적으로 변형가능한 ES 세포가 용이하게 이용가능하지 않는 비-인간 동물의 경우, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적 변형을 포함하는 비-인간 동물을 제조하기 위해 다른 방법들이 사용된다. 그러한 방법들은, 예를 들어, 비-ES 세포 게놈 (예를 들어, 섬유아세포 또는 유도된 만능 세포)을 변형시키는 단계 및 핵 전달을 사용하여 적합한 세포, 예를 들어, 난모세포에 변형된 게놈을 전달하는 단계, 및 배아를 형성하기에 적합한 조건 하에서 비-인간 동물 내에 변형된 세포 (예를 들어, 변형된 난모세포)를 잉태시키는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 비-인간 동물은 포유류이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비-인간 동물은 작은 포유류, 예를 들어, 뛰는쥐상과(Dipodoidea) 또는 쥐상과(Muroidea) 상과(superfamily)의 작은 포유류이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 동물은 설치류이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 설치류는 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 설치류는 쥐상과 상과로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 동물은 칼로미스쿠스 과(Calomyscidae) (예를 들어, 마우스-유사 햄스터(mouse-like hamster)), 비단털쥐과(Cricetidae) (예를 들어, 햄스터, 뉴월드(New World) 래트 및 마우스, 들쥐), 쥐과(Muridae) (트루 마우스 및 래트, 게르빌루스쥐, 아프리카가시쥐, 돌기 래트), 붉은숲쥐과(Nesomyidae) (클라이밍 마우스, 락 마우스, 꼬리 래트, 마다가스카르 래트 및 마우스), 가시겨울잠쥐과(Platacanthomyidae) (예를 들어, 가시겨울잠쥐) 및 소경쥐과(Spalacidae) (예를 들어, 뒤쥐, 대나무쥐 및 조코)로부터 선택된 과(family)로부터 유래된다. 일부 소정 실시 형태에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 설치류는 트루 마우스 또는 래트 (쥐과), 게르빌루스쥐, 아프리카가시쥐, 및 돌기 래트로부터 선택된다. 일부 소정 실시 형태에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 마우스는 쥐과의 구성원으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비-인간 동물은 설치류이다. 일부 소정 실시 형태에서, 본 발명의 설치류는 마우스 및 래트로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비-인간 동물은 마우스이다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 비-인간 동물은 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/ KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C57BL 계통의 마우스인 설치류이다. 일부 소정 실시 형태에서, 본 발명의 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예를 들어, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 계통으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 129 계통이다 (예를 들어, 문헌[Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836]; 문헌[Auerbach et al., 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032] 참조). 일부 소정 실시 형태에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 마우스는 상기 언급된 129 계통과 상기 언급된 C57BL/6 계통의 혼합이다. 일부 소정 실시 형태에서, 본 발명의 마우스는 상기 언급된 129 계통들의 혼합, 또는 상기 언급된 BL/6 계통들의 혼합이다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 혼합의 129 계통은 129S6 (129/SvEvTac) 계통이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 마우스는 BALB 계통, 예를 들어, BALB/c 계통이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 마우스는 BALB 계통과 상기 언급된 다른 계통의 혼합이다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 비-인간 동물은 래트이다. 일부 소정 실시 형태에서, 본 발명의 래트는 위스타(Wistar) 래트, LEA 계통, 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 계통, 피셔(Fischer) 계통, F344, F6, 및 다크 아구티(Dark Agouti)로부터 선택된다. 일부 소정 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 래트 계통은 위스타, LEA, 스프라그 돌리, 피셔, F344, F6, 및 다크 아구티로 이루어진 그룹으로부터 선택된 둘 이상의 계통의 혼합이다.

인간화된 FcγRI 유전자를 갖는 비-인간 동물

FcγR 돌연변이 및 유전자도입 비-인간 동물 (예를 들어, 마우스)이, 예를 들어, 반 데 빙켈(van de Winkel) 등에 의해 미국 특허 제6,111,166호에 보고되어 있다.

그러한 동물들은 FcγRI 발현, 기능 및 조절의 분자적 측면을 평가하기 위한 검정에 사용되어 왔다. 그러나, 이들은 제한 및 단점이 없는 것이 아니다. 예를 들어, '166 특허에 개시된 마우스는 그의 게놈 내로 무작위로 삽입된 인간 FcγRI을 함유하는데, 이는 (1) 검출되든 그렇지 않든 간에 의도적이지 않게 다른 유전자의 발현 및/또는 기능을 파괴할 수 있고, (2) 단일 유형의 FcγR의 특정 연구를 복잡하게 하거나 혼란스럽게 하는 완전한 인간 FcγRI 및 완전한 마우스 FcγRI 둘 다의 발현을 초래한다. 더욱이, 신호 전달에 참여하는 FcγRI α 사슬의 세포내 영역은 마우스라기보다는 인간이기 때문에, FcγRI α 사슬의 세포내 신호전달 영역은 '116 특허에 개시된 마우스에서 교란되거나, 파괴되거나, 그렇지 않으면 정상 FcγRI에 따르지 않을 수 있다.

본 발명은 이러한 단점 및 다른 단점을 극복하기 위한 수단을 제공한다. 특히, 본 발명은 마우스 FcγRI을 인간 또는 하이브리드 FcγRI 유전자로 대체하기 위해 내인성 마우스 좌에 삽입되는 인간화된 FcγRI 도입유전자를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 하이브리드 FcγRI 유전자는 내인성 마우스 좌에 삽입되고, 세포외 도메인은 인간 서열을 포함하고 세포내 도메인은 마우스 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 마우스 FcγRI 유전자의 내인성 좌에의 하이브리드 FcγRI 유전자의 삽입은, 내인성 마우스 FcγRI 단백질을 추가적으로 발현하는 마우스의 면역 세포에서의 인간 FcγRI 단백질 발현의 분포와 비교하여, 인간 면역 세포에서의 인간 FcγRI 단백질의 분포와 더 근접하게 유사한 면역 세포에서의 FcγRI 단백질의 발현을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 마우스 FcγRI 유전자의 내인성 좌에의 하이브리드 FcγRI 유전자의 삽입은 적절한 신호 및 자극에 의해 유도되고 조절되는 면역 세포에서의 FcγRI 단백질의 발현을 제공한다.

일부 실시 형태에서, MHC 클래스 II 항원의 FcγRI α 사슬 매개 제시가 인간화된 세포외 영역 및 마우스 FcγRI α 사슬 세포내 영역을 갖는 하이브리드 FcγRI 단백질을 갖는 마우스에서 기능적으로 유지된다. 일부 실시 형태에서, 내재화된 FcγRI의 세포내 프로세싱은, 완전한 인간 FcγRI 단백질 또는 비-뮤린 세포내 영역을 갖는 FcγRI 단백질을 갖는 마우스에서의 그것과 비교하여, 마우스 세포내 영역을 갖는 하이브리드 FcγRI 단백질을 갖는 마우스에서 보존된다.

본 발명의 비-인간 동물은 다양한 검정에 유용한 인간 FcγRI을 발현하는 생물학적 물질 (예를 들어, 세포)의 개선된 생체내 시스템 및 공급원을 제공한다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비-인간 동물은, FcγRI을 표적으로 하고/하거나 FcγRI 신호전달 및 면역 효과기 반응을 조절하는 치료제를 개발하기 위해 사용된다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 마우스는 FcγRI이 결합하는 후보 치료제 (예를 들어, 항체)를 스크리닝하고 개발하기 위해 사용된다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비-인간 동물은 특정 치료 항체와 관련된 면역 효과기 반응을 결정하기 위해 사용된다.

내인성 고친화성 마우스 FcγR 유전자를 발현하지 않는 유전적으로 변형된 비-인간 동물은, 예를 들어, 면역 반응에서 개개의 고친화성 FcγR 유전자의 다양한 기능들을 설명하고, 세포-매개 면역 (예를 들어, ADCC)을 통한 인간 치료 항체의 효능을 측정하고, 면역 질환 또는 장애에서 FcγR의 역할을 결정하고, 면역 질환 또는 장애의 모델 역할을 하고, 하나 이상의 FcγR 단백질에 대한 항체를 생성하고, 관심이 있는 다른 유전적으로 변형된 마우스를 생성하기 위한 교배짝으로서의 역할을 하는 데 유용하다.

일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 마우스는 고친화성 FcγR 유전자를 발현하지 않는 마우스에 작용제를 투여함으로써 (야생형 마우스와 비교하여) 그러한 마우스에 의한 세포독성 효과 손실을 결정하는 데 사용될 수 있고, 작용제는 야생형 마우스에서 FcγR 의존성 세포독성 효과를 촉발한다고 알려진 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 마우스에 종양 세포가 이식되고, 이어지는 일정 기간 후에, 종양 세포의 표면에서 발현되는 항원에 특이적인 항체가 주입된다. 항체의 아이소타입은 주입 전에 알려져 있으며, 동물은 야생형 동물에서 관찰되는 ADCC 대비 FcγR-의존성 ADCC의 손상에 대해 분석된다.

일 태양에서, 내인성 고친화성 수용체가 결핍된 마우스가 자가면역 질환의 생체내 모델을 개발하기 위해 다른 면역 결핍 마우스와 (예를 들어, 교배에 의해) 조합될 수 있다. 예를 들어, 중증 복합 면역결핍 (SCID) 마우스가 본 기술분야에서 내부 시스템을 연구하기 위한 모델 유기체로 일상적으로 사용된다. Scm 마우스는 T 또는 B 림프구를 만들거나 보체 시스템의 일부 성분을 활성화하는 능력이 손상되어, 감염에 효율적으로 대항할 수 없고, 종양을 거부할 수 없으며, 이식물을 거부할 수 없다. 본 발명의 고친화성 FcγR a-서브유닛 유전자-결핍 마우스를 SCID 마우스와 교배하여 항체 치료제 (예를 들어, 항-종양 항체)의 투여에 따라 숙주 동물에서의 세포 고갈을 확인할 수 있으며, 이는 생체내 종양 세포 고갈에서 ADCC 및 보체-의존성 세포독성(CDC)의 역할을 결정할 것이다.

일부 실시 형태에서, 내인성 고친화성 FcγR 유전자의 고친화성 인간 FcγR 유전자로의 대체를 포함하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물이 제공된다. 그러한 동물은 완전한 인간 항체의 약물동태학 및 FcγR-매개 ADCC를 연구하는 데 유용하다. 게다가, 인간 FcγR 유전자는 질환과 관련된 다형성 또는 대립유전자 변이체를 나타내는 것으로 알려져 왔다. 따라서, 내인성 고친화성 FcγR 유전자의 인간 FcγR 유전자의 특정 대립유전자 형태 또는 다형 형태로의 대체를 포함하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물은 동물에서 인간 자가면역 질환, 및 다형성과 관련된 특성을 연구하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 인간 FcγR 유전자의 대립유전자 형태는 인간 IgG에 대한 향상된 효능과 관련이 있다.

일부 실시 형태에서, 인간 항체 치료제의 효능에 대한 인간 고친화성 FcγR 다형성의 효과가 결정된다. 일부 실시 형태에서, 항-종양 항체가 인간 FcγR의 제1 다형성을 포함하는 제1 인간화된 마우스에 투여되고 또한 인간 FcγR의 제2 다형성을 포함하는 제2 인간화된 마우스에도 투여되며, 제1 및 제2 마우스 각각은 인간 종양 세포를 포함하고; 항-종양 항체의 항-종양 활성이 제1 마우스 및 제2 마우스에서 평가된다.

일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 마우스에서의 항-종양 항체의 효능 평가에 기초하여, 제1 또는 제2 다형성을 갖고 인간 종양 세포에 상응하는 종양을 갖는 인간을 치료하는 것과 관련하여 치료 옵션이 의사에 의해 선택된다.

내인성 FcγRI α-사슬 대체 접근은 동물에서 자연적 FcγR-매개 신호 전달의 비교적 최소한의 파괴를 사용한다. 다양한 실시 형태에서, FcγR α-사슬의 게놈 서열은 단일 단편에서 대체되므로 필수 조절 서열을 포함함으로써 정상 기능성을 보유한다. 따라서, 그러한 실시 형태에서, FcγR α-사슬 변형은 기능적 FcRγ-사슬 분자에 의존적인 다른 내인성 FcR을 손상시키지 않는다. 또한, 다양한 실시 형태에서, 변형은 FcγR α-사슬 및 내인성 FcR γ-사슬을 포함하는 기능적 수용체 복합체의 조립에는 영향을 미치지 않는데, 이러한 조립은 세포 표면에서 일부 FcγR α-사슬의 적절한 발현 및 활성화된 수용체로부터 생긴 소정의 하류 신호전달에 중요할 수 있다. FcR γ-사슬은 결실되지 않기 때문에, 다양한 실시 형태에서 내인성 FcγR α-사슬 유전자의 인간 FcγR α-사슬 유전자로의 대체를 포함하는 동물은 보조 세포의 표면에 존재하는 인간 FcγR-사슬에 대한 IgG 면역글로불린의 Fc 부분의 결합을 통해서 항체로부터 정상 효과기 기능을 처리할 수 있다.

본 발명의 비-인간 동물은 인간화된 FcγRI 단백질을 발현하고, 이에 따라 세포, 세포주, 및 세포 배양물을 생성하여, 결합 및 기능적 검정, 예를 들어, 잠재적 치료 항체에 대한 FcγRI의 결합 또는 기능에 대한 검정에 사용하기 위한 인간화된 FcγRI의 공급원 역할을 할 수 있다. 다양한 실시 형태에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 비-인간 동물에 의해 발현되는 인간화된 FcγRI 단백질은 변이체 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 리간드 결합 잔기와 관련된 변이를 갖는 변이체 인간 FcγRI 단백질이 보고되어 있다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비-인간 동물은 인간화된 FcγRI 단백질 변이체를 발현한다. 다양한 실시 형태에서, 변이체는 리간드 결합과 관련된 아미노산 위치에서 다형이다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비-인간 동물은 인간 FcγRI의 다형 변이체와의 상호작용을 통해 치료 항체의 면역 효과기 반응을 결정하는 데 사용된다.

본 발명의 비-인간 동물로부터의 세포는 단리될 수 있고 필요에 따라 수시로 사용될 수 있거나, 여러 세대 동안 배양 상태로 유지될 수 있다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비-인간 동물로부터의 세포는 불멸화되고 (예를 들어, 연속 배양으로) 무기한 배양 상태로 유지된다.

본 발명의 비-인간 동물은 항체 의존성 세포 매개 세포독성의 메커니즘을 설명하는 개선된 생체내 시스템을 제공한다.

실시예

하기의 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 당업자에게 설명하도록 하기 위해 제공되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 달리 나타내지 않는 한, 온도는 섭씨로 나타내고 압력은 대기압 또는 그 부근이다.

실시예 1. 내인성 FcγRI 유전자의 인간화.

본 실시예는 설치류와 같은 비-인간 포유류 (예를 들어, 마우스)에서 고친화성 FcγRI을 인코딩하는 내인성 유전자를 인간화하는 예시적인 방법을 설명한다.

인간화 FcγRI 표적화 벡터 (MAID6074)의 작제

인간 Fc 감마 수용체 1 유전자 (프로모터 영역, 시그널 플러스 엑토(signal plus ecto) 도메인 영역)를 사용하여 뮤린 염색체 3 상의 마우스 대응 서열을 대체함으로써 대형 표적화 벡터 (LTVEC)를 작제하였다.

BAC-기반 표적화 벡터 (MAID6073)의 생성

FcγRI의 유전자를 함유하는 마우스 BAC RP23-477p23 및 인간 BAC CTD-2339o22를 NCBI 및 앙상블(Ensemble)의 데이터베이스에 기초한 BLAST 및 BAC 말단 서열을 사용하여 확인하였다.

인간 FcγRI 유전자의 (5' 원단부) FcγRI 유전자 프로모터 (25 kb)로부터 유전자 코돈 W290 (그의 막관통 도메인 (TM) 앞)에서의 3' 근단부까지의 인간 서열을 함유하는 (그 뒤를 따라, 마우스 막관통 도메인 및 나머지 유전자가 이어지는), 표적화 벡터인 LTVEC을 생성하기 위한 접근은 하기 단계들을 포함한다.

첫번째, 세균에서의 상동 재조합을 통해, 인간 BAC(CTD-2339o22)로부터 인간 서열의 5' 말단을 제거하고 FcγRI 유전자의 I-Ceu1 부위 및 25 kb 프로모터 영역을 남기고, FcγRI 유전자의 인트론 5 (TM 도메인의 404bp 상류)에 위치하고 AsiS1 부위가 뒤따르는 loxped pgk-Neo 카세트로 3' 말단 인간 서열을 제거함.

두번째, 세균에서의 상동 재조합을 통해, 마우스 BAC RP23-477p23에서, I-Ceu1 및 AsiS1 부위가 플랭킹된 Spec 카세트 (마우스 TM 앞에 부가된 (코돈 W290에 이르기까지의) 인간 FcγRI 서열의 EC3 도메인의 8 AA)로 마우스 FcγRI 유전자 (이의 프로모터(20 kb)부터 막관통 도메인까지)를 제거함.

세번째, I-Ceu1 및 AsiS1 부위에 의한 분해(digestion) 및 연결(ligation)에 의해, 인간 FcγRI의 (5' 원단부) FcγRI 유전자 프로모터 (25 kb)로부터 코돈 W290 (막관통 도메인 앞)에서의 3' 근단부까지의 인간 서열을 함유하고, 그 뒤를 따라 마우스 막관통 도메인 및 나머지 유전자가 이어지는 LTVEC (MAID6073)을 생성함.

도 32는 마우스 FcγRI의 인간화를 위한 개략적이고 예시적인 전략을 묘사한다. MAID6074는 MAID6073의 카세트 제거 버전이다. 접합 서열들은 도 6에 나타나 있다.

표적화된 마우스 ES 세포의 선택

MAID 6074 LTVEC을 전기천공으로 마우스 ES 세포주 F1H4 내로 도입하였다.

실시예 2. 고친화성 FcγRI 인간화 마우스의 생성

본 실시예는 마우스의 형질전환 및 교배를 설명한다. hFcgR1 엑토 도메인 (MAID 6073) LTVEC을 전기천공으로 모 F1H4 마우스 배아줄기(ES)세포 내로 도입하였다. G418 약물 선택으로부터 살아남은 콜로니들을 골라서 FcγRI 마우스 좌로의 인간 FcγRI 서열의 상동 재조합을 위해 스크리닝하였다. 8개의 클론이, 적절한 변형을 갖고 인간 FcγRI 엑토 도메인에 대해 이형접합성인 것으로 확인되었으며, 그 중 하나가 클론 6073F-D2였다. 이들 클론 모두는 neo 카세트를 함유하였다.

클론 6073F-D2를 2 ㎍의 Cre 플라스미드와 함께 전기천공하여 neo 카세트를 제거하였다. 콜로니들을 고른 후 neo 카세트의 부재에 대해 스크리닝하였다. neo 카세트가 제거된 것으로 판단된 클론들 중, ES클론 6074B-A1 및 6074B-A10을 벨로시마우스(VelociMouse) 방법을 사용하여 미세-주입하였다.

클론 6074B-A1 및 6074B-A10으로부터 수컷 및 암컷 (XY 암컷) F0 벨로시마우스를 생성하였다. 이러한 F0 마우스들을 클론 및 비-클론 페어링으로 서로 교배시켰다. F1 마우스를 생산하였으며, 이들 마우스는 인간 FcγRI에 대해 이형접합성 및 동형접합성 (및 야생형)인 것으로 확인되었다. F1 마우스는 정상인 것으로 나타났으며, Hom:Het:WT 마우스의 비는 1:2:1의 예측된 멘델비를 따랐다. 인간 FcγRI에 대해 야생형 및 동형접합성인 수컷 및 암컷의 코호트를 연구를 위해 전달하였다.

실시예 3. 고친화성 FcγRI 인간화된 마우스의 특성화

본 실시예는 내인성 FcγRI 좌에 실시예 1에 기재된 바와 같은 인간화된 FcγRI 유전자 작제물을 함유하도록 조작된 비-인간 동물로부터의 세포 표면에서의 고친화성 FcγRI 단백질의 특징적 발현을 예시한다.

고친화성 FcγRI 인간화된 마우스의 유전자형 특성화가 도 1 내지 도 3에 나타나 있다. 마우스 FcγRI에 대한 전사가 인간화된 FcγRI에 대해 동형접합성인 마우스에서 검출되지 않는다.

표현형 특성화의 결과는 도 4, 및 도 7 내지 도 16에 나타나 있다.

실시예 4. 뮤린 과립구 집락 자극 인자 (mG-CSF)로 처리된 고친화성 FcγRI 인간화된 마우스의 표현형 특성화

인산염 완충 식염수 (PBS) 대조군 대비 뮤린 G-CSF (mG-CSF)로 처리된 MAID 6074 (hFcγRI) HO 마우스들에 대해 표현형 분석을 수행하였다. 피하 주사 48시간 후 마우스를 조사하였다. PBS (n=2) 또는 mG-CSF (n=3)로 처리된 MAID 6074 HO 마우스와 비교하여, PBS (n=2) 또는 mG-CSF (n=2)로 처리된 6 내지 7 주령 MAID 6074 WT 마우스에 대하여 데이터가 나타나 있다. 결과는 PBS (n=1) 또는 mG-CSF (n=1)로 처리된 MAID 6074 HO 마우스와 비교하여, PBS (n=1) 또는 mG-CSF (n=1)로 처리된 16 내지 17 주령 MAID 6074 WT 마우스에 대해서 유사하였다. MAID 6074 WT 및 MAID 6074 HO 마우스의 혈액 및 비장 내의 단핵구, 대식세포, 호중구 및 수지상 세포에서의 마우스 또는 하이브리드화된 FcγRI의 베이스라인 (PBS) 및 mG-CSF 유도 발현이 도 17 내지 도 31에 나타나 있다.

비처리 MAID 6074 HO 마우스는 혈액에서 FcγRI (CD64) mRNA를 발현하지만, 단백질은 FACS에 의해 검출되지 않았다. G-CSF (48시간)는 혈액 및 비장에서 FcγRI (CD64) mRNA의 증가를 유도하였으며, FACS에 의해 검출된 바와 같이 단백질의 증가를 유도하였다.

실시예 5. 인간화된 고친화성 및 저친화성 Fcγ 수용체를 발현하는 마우스의 표현형 특성화

인간화된 고친화성 및 저친화성 Fcγ 수용체를 발현하는 마우스를 표준 교배 기법을 사용하여 생성하였다. 구체적으로는, 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성된 인간화된 고친화성 FcγRI을 발현하는 마우스를, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2014/0154701호의 실시예 1 내지 실시예 6 및 도 1 내지 도 6에 기재된 바와 같이 생성된 인간화된 저친화성 FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb를 발현하는 마우스와 교배하였다. 생성된 마우스들을 동형접합성을 위해 교배시켰다.

뮤린 G-CSF (mG-CSF) 또는 인산염 완충 식염수(PBS) 대조군으로 처리한 후에, 인간화된 고친화성 및 저친화성 FcγR 마우스에서 표현형 분석을 수행하였다. PBS 또는 mG-CSF (62 ㎍ s.c., 단회 용량)의 피하 주사를 마우스에 투여하였다. 48시간 후, 처리된 마우스로부터 혈액 및 비장을 수거하고 실시예 4에 기재된 바와 같이 FACS로 표현형을 특성화하였다. 인간화된 고친화성 및 저친화성 FcγR 마우스의 세포 표면 표현형은 고친화성 FcγR 인간화된 마우스에 대해 관찰된 표현형과 유사하였다. 고친화성 Fcγ 수용체 인간화된 마우스와 또한 유사하게, 고친화성 및 저친화성 Fcγ 수용체 둘 다 인간화된 마우스는 혈액 및 비장의 단핵구, 대식세포 및 호중구에서 인간 FcγRI의 증가된 발현을 보여주었다. 요컨대, FcγRI 인간화된 마우스에서 저친화성 Fcγ 수용체의 인간화는 유의한 표현형 변화를 일으키지 않았다.

동등물

본 발명의 적어도 하나의 실시 형태의 지금까지 기술된 여러 태양을 고려하여, 당업자는 다양한 변경, 변형 및 개선이 당업자에게 용이하게 일어날 것임이 이해되어야 한다. 그러한 변경, 변형 및 개선은 본 발명의 일부인 것으로 의도되고, 본 발명의 사상 및 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 따라서, 전술한 설명 및 도면은 단지 예시이고 본 발명은 이어지는 청구범위에서 상세하게 기재된다.

청구범위에서 청구 요소를 변형시키기 위한 "제1", "제2", "제3" 등과 같은 서수의 사용은 그 자체로 어떠한 우선권, 우월성, 또는 한 청구 요소의 다른 것을 우선하는 순서 또는 방법의 시행이 수행되는 시간적인 순서를 함축하지 않고, 청구 요소들을 구별하기 위하여 소정 명칭을 갖는 하나의 청구 요소를 동일 명칭을 갖는 (그러나 서수의 사용을 위한) 다른 요소와 구별하기 위한 표시로서 단지 사용된다.

본 발명에서 본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 하나를 가리키는 항목들은, 명백하게 반대를 가리키지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 그룹의 하나 이상의 구성원들 사이에 "또는"을 포함하는 청구항 또는 설명은, 만약 그 그룹의 구성원들 중 하나, 하나 초과, 또는 모두가 주어진 생성물 또는 과정에 존재하거나, 사용되거나, 또는 달리 관련되는 것이라면, 맥락으로부터 반대로 지시되거나 달리 명백하지 않는 한 만족되는 것으로 간주된다. 본 발명은 그룹의 정확히 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 과정에 존재하거나, 사용되거나, 또는 달리 관련된 실시 형태들을 포함한다. 본 발명은 또한 하나 초과의 구성원 또는 전체 그룹 구성원이 주어진 생성물 또는 과정에 존재하거나, 사용되거나, 또는 달리 관련된 실시 형태들을 포함한다. 나아가, 다르게 지시되지 않는 한, 또는 당업자에게 모순 또는 불일치가 발생할 것임이 명백하지 않는 한, 본 발명은 열거된 청구항들 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 구절, 설명적 용어, 등이 동일한 내용의 청구항 (또는, 적절하게, 어떠한 다른 청구항)에 종속하는 다른 청구항에 도입되는 모든 변형, 조합, 및 순열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 요소들이 목록으로 (예를 들어, 마쿠쉬(Markush) 그룹 또는 유사한 포맷으로) 제시되는 경우에, 그 요소들의 각각의 하위그룹이 또한 개시되고, 임의의 요소(들)가 그 그룹으로부터 제거될 수 있음이 이해되어야 한다. 일반적으로, 본 발명, 또는 본 발명의 태양들이 특정 요소, 특징, 등을 포함하는 것으로서 언급되는 경우에, 본 발명의 소정 실시 형태 또는 본 발명의 태양들은 그러한 요소, 특징, 등으로 이루어지거나, 본질적으로 이루어진다는 것이 이해되어야 한다. 단순화를 목적으로, 그러한 실시 형태들이 모든 경우에 본 명세서에서 그렇게 많은 단어들로 구체적으로 제시되어 있는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 임의의 실시 형태 또는 태양은 구체적인 배제가 본 명세서에서 열거되어 있는지의 여부와 관계없이 청구범위로부터 명백하게 배제될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

당업자는 전형적인 표준 편차 또는 오차가 본 명세서에 기술된 검정 또는 다른 과정에서 얻어진 값들에 기인한다는 것을 이해할 것이다.

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> NON-HUMAN ANIMALS HAVING HUMANIZED FC-GAMMA RECEPTORS <130> RPB-008.01 <150> 61/977,037 <151> 2014-04-08 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2589 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 acattacatg attcttacca gctttggaga tgacatgtgg cttctaacaa ctctgctact 60 ttgggttcca gtcggtgggg aagtggttaa tgccaccaag gctgtgatca ccttgcagcc 120 tccatgggtc agtattttcc agaaggaaaa tgtcacttta tggtgtgagg ggcctcacct 180 gcctggagac agttccacac aatggtttat caacggaaca gccgttcaga tctccacgcc 240 tagttatagc atcccagagg ccagttttca ggacagtggc gaatacaggt gtcagatagg 300 ttcctcaatg ccaagtgacc ctgtgcagtt gcaaatccac aatgattggc tgctactcca 360 ggcctcccgc agagtcctca cagaaggaga acccctggcc ttgaggtgtc acggatggaa 420 gaataaactg gtgtacaatg tggttttcta tagaaatgga aaatcctttc agttttcttc 480 agattcggag gtcgccattc tgaaaaccaa cctgagtcac agcggcatct accactgctc 540 aggcacggga agacaccgct acacatctgc aggagtgtcc atcacggtga aagagctgtt 600 taccacgcca gtgctgagag catccgtgtc atctcccttc ccggagggga gtctggtcac 660 cctgaactgt gagacgaatt tgctcctgca gagacccggc ttacagcttc acttctcctt 720 ctacgtgggc agcaagatcc tggagtacag gaacacatcc tcagagtacc atatagcaag 780 ggcggaaaga gaagatgctg gattctactg gtgtgaggta gccacggagg acagcagtgt 840 ccttaagcgc agccctgagt tggagctcca agtgcttggt ccccagtcat cagctcctgt 900 ctggtttcac atcctgtttt atctgtcagt gggaataatg ttttcgttga acacggttct 960 ctatgtgaaa atacacaggc tgcagagaga gaagaaatac aacttagaag tccctttggt 1020 ttctgagcag ggaaagaaag caaattcctt tcagcaagtt agaagcgatg gcgtgtatga 1080 agaagtaaca gccactgcga gccagaccac accaaaagaa gcgcccgatg gacctcgaag 1140 ctcagtgggt gactgtggac ccgagcagcc tgaacccctt cctcccagtg acagtactgg 1200 ggcacaaact tcccaaagtt gaccctgaaa ctgtgggacc atggcatgca actcttaaat 1260 aaagcaaata tacagactgg atccggctga gacaagctgg gtaatcagac atttgaaagg 1320 agacctatac caaagggatc ttgcaacaca tggagtcagg tcacagcggg ggttgtcgaa 1380 tgtttgacct tatggagcag ggaaacagga agtgaatccc acaggactcc ccccccccgc 1440 ccatccccct ccaggccgcc ccggacagga cccagctctg gaagactcca gtctgagact 1500 tgcggaacca gagcaggggt gagattcctg cccagaaggg acagctgtgc catcccctca 1560 cagggtggat gggttcaggg aaaggcctcc ccagggacgg cctgcgtgtc aggggagcag 1620 acgctgatac agacagctcc atagcctggg ctaaagctgg ctaagacccg gtggtcatcc 1680 tgagagcatc ggaatttgtg ctctccttcc taccgtctct cttcatgcac cctccccaga 1740 tttgctgccc acgaccctca aaggacatag tggcggcagc taaagagtga agtgtcagca 1800 gtaatccatc catctaacct ccctcaggtc cagatacccc cacccccaaa ctcccacact 1860 ctaggggcct tttcaggcag cctgcatgtg gtgtcttagc agagctatgg tacaaaggct 1920 tttagctcta tcattatctg acaagcagac agcaccctca ggtgctctca ttgggtggtg 1980 agagctttct ccagcctgta ccacctgtaa gctggagtgt ggggcgggaa cactggccca 2040 aagcgtccct attggaaggc acggcttaca tgggtgtcac aaatgccctt agaccacgca 2100 ggaagaccga attctagaaa caaggagtag atcatgtctc cacttactgt cactcctaag 2160 gatcccctga aggtcttgga gcttcacatc cctggaactc tagggtctgc cgtgctagag 2220 gtcccagtct gcagagtggg tgtggcatag cctgagcctc cctggatgtg aacattagca 2280 aggtatattg ggacctttat aaccagggac caataggcat gagagggacc gggataatgg 2340 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Gln Val Arg 340 345 350 Ser Asp Gly Val Tyr Glu Glu Val Thr Ala Thr Ala Ser Gln Thr Thr 355 360 365 Pro Lys Glu Ala Pro Asp Gly Pro Arg Ser Ser Val Gly Asp Cys Gly 370 375 380 Pro Glu Gln Pro Glu Pro Leu Pro Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ala Gln 385 390 395 400 Thr Ser Gln Ser <210> 3 <211> 2268 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aatatcttgc atgttacaga tttcactgct cccaccagct tggagacaac atgtggttct 60 tgacaactct gctcctttgg gttccagttg atgggcaagt ggacaccaca aaggcagtga 120 tcactttgca gcctccatgg gtcagcgtgt tccaagagga aaccgtaacc ttgcactgtg 180 aggtgctcca tctgcctggg agcagctcta cacagtggtt tctcaatggc acagccactc 240 agacctcgac ccccagctac agaatcacct ctgccagtgt caatgacagt ggtgaataca 300 ggtgccagag aggtctctca gggcgaagtg accccataca gctggaaatc cacagaggct 360 ggctactact gcaggtctcc agcagagtct tcacggaagg agaacctctg gccttgaggt 420 gtcatgcgtg gaaggataag ctggtgtaca atgtgcttta ctatcgaaat ggcaaagcct 480 ttaagttttt ccactggaat tctaacctca ccattctgaa aaccaacata agtcacaatg 540 gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac 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<210> 4 <211> 374 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser 20 25 30 Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu 35 40 45 Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln 50 55 60 Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser 65 70 75 80 Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile 85 90 95 Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg 100 105 110 Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys 115 120 125 Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe 130 135 140 Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile 145 150 155 160 Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr 165 170 175 Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro 180 185 190 Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu 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oligonucleotide <400> 6 taactataac ggtcctaagg tagcgaagtg agttccctgt cagc 44 <210> 7 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 ccgggctcga gataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatcctag ggcgatcgcc 60 c 61 <210> 8 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 8 accaactcct gtctggtttc acatcctgtt ttatctgtca gtgggaat 48

Claims (38)

1. FcγRI 프로모터 및 조절 서열을 포함하는 FcγRI 유전자로부터 FcγRI 단백질을 발현하는 마우스로서, 상기 FcγRI 단백질은
   인간 EC1 도메인, 인간 EC2 도메인, 인간 EC3 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하는 인간 FcγRI α 사슬의 세포외 부분 및
   마우스 FcγRI α 사슬의 세포질 도메인을 포함하는, 마우스.
2. 제1항에 있어서, 상기 인간 FcγRI α 사슬의 세포외 부분은 인간 EC1 도메인, 인간 EC2 도메인, 및 인간 EC3 도메인을 포함하는, 마우스.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   (a) 상기 EC1 도메인은 서열 번호 3의 엑손 3과 90% 이상 동일한 엑손에 의해 인코딩되거나,
   (b) 상기 EC2 도메인은 서열 번호 3의 엑손 4와 90% 이상 동일한 엑손에 의해 인코딩되거나,
   (c) 상기 EC3 도메인은 서열 번호 3의 엑손 5와 90% 이상 동일한 엑손에 의해 인코딩되는, 마우스.
4. 제1항에 있어서,
   (a) 상기 마우스는 전장(full-length) 마우스 FcγRI α 사슬을 검출가능하게 발현하지 않거나,
   (b) 상기 FcγRI 단백질은 마우스 FcγRI α 사슬 막관통 도메인을 전체적으로 또는 부분적으로 추가로 포함하거나,
   (c) 상기 FcγRI 단백질은 서열 번호 5와 90% 이상 동일한 FcγRI α 사슬 아미노산 서열을 포함하거나,
   (d) 상기 FcγRI 단백질은 단핵구, 대식세포, 호중구 또는 수지상 세포에서 발현되고, 바람직하게는, 상기 FcγRI 단백질의 발현은 뮤린 과립구 집락 자극 인자 (mG-CSF)를 상기 마우스에 투여 시에 증가되는, 마우스.
5. FcγRI 유전자를 포함하는 마우스로서,
   상기 FcγRI 유전자는 FcγRI 프로모터 및 조절 서열, 및 마우스 FcγRI 단백질의 세포내 부분을 인코딩하는 마우스 FcγRI 유전자의 적어도 하나의 엑손에 작동가능하게 연결된 인간 FcγRI 단백질의 세포외 부분을 인코딩하는 인간 FcγRI 유전자의 적어도 하나의 엑손을 포함하는, 마우스.
6. 제5항에 있어서, (a) 상기 인간 FcγRI 유전자의 엑손은 엑손 3, 4 및 5로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나,
   (b) 상기 마우스는 기능적 마우스 FcγRI 유전자를 발현하지 않는, 마우스.
7. 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서,
   (a) 상기 FcγRI 프로모터 및 조절 서열은 인간 FcγRI 프로모터 및 조절 서열이거나,
   (b) 상기 FcγRI 프로모터 및 조절 서열은 마우스 FcγRI 프로모터 및 조절 서열인, 마우스.
8. 마우스 배아줄기세포로서, 이의 게놈은 FcγRI 유전자를 포함하고, 상기 FcγRI 유전자는 FcγRI 프로모터 및 조절 서열을 포함하고, FcγRI 단백질을 인코딩하며,
   이때 상기 FcγRI 단백질은 인간 EC1 도메인, 인간 EC2 도메인, 인간 EC3 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하는 인간 FcγRI α 사슬의 세포외 부분 및
   마우스 FcγRI α 사슬의 세포질 도메인을 포함하는, 마우스 배아줄기세포.
9. 제8항에 있어서,
   (a) 상기 FcγRI 유전자는 인간 FcγRI 유전자의 엑손 3, 4, 및 5를 포함하고/하거나,
   (b) 상기 FcγRI 유전자는 인간 엑손 1에 플랭킹(flanking)된 하나 이상의 인간 5′ 비번역 영역들을 추가로 포함하고/하거나,
   (c) 상기 세포가 서열 번호 5와 90% 이상 동일한 FcγRI α 사슬 아미노산 서열을 포함하고/하거나,
   (d) 상기 FcγRI 유전자는 마우스 FcγRI 유전자의 엑손 6을 포함하고/하거나,
   (e) 상기 FcγRI 유전자는 내인성(endogenous) FcγRI 좌(locus)에 위치하는, 마우스 배아줄기세포.
10. 제8항의 마우스 배아줄기세포로부터 생성된, 마우스 배아.
11. FcγRI 프로모터 및 조절 서열을 포함하는 FcγRI 유전자로부터 FcγRI 단백질을 발현하는 마우스를 생성하는 방법으로서,
    상기 FcγRI 단백질은 인간 EC1 도메인, 인간 EC2 도메인, 인간 EC3 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하는 인간 FcγRI α 사슬의 세포외 부분 및 마우스 FcγRI α 사슬의 세포질 도메인을 포함하고,
    상기 방법은 (a) 제8항의 마우스 배아줄기세포를 얻는 단계; 및
    (b) (a)의 배아세포를 사용하여 마우스를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
12. FcγRI 프로모터 및 조절 서열을 포함하는 FcγRI 유전자로부터 FcγRI 단백질을 발현하도록 마우스를 유전적으로 조작하는 단계를 포함하여, 마우스를 생성하는 방법으로서, 상기 FcγRI 단백질은
    인간 EC1 도메인, 인간 EC2 도메인, 인간 EC3 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하는 인간 FcγRI α 사슬의 세포외 부분 및
    마우스 FcγRI α 사슬의 세포질 도메인을 포함하는, 방법.
13. 제12항에 있어서,
    (a) 상기 마우스는 전장 마우스 FcγRI α 사슬을 검출가능하게 발현하지 않도록 유전적으로 조작되거나,
    (b) 상기 마우스는 상기 FcγRI 단백질이 마우스 FcγRI α 사슬 막관통 도메인을 전체적으로 또는 부분적으로 추가로 포함하도록 유전적으로 조작되거나,
    (c) 상기 마우스는 상기 FcγRI 단백질이 서열 번호 5와 90% 이상 동일한 FcγRI α 사슬 아미노산 서열을 포함하도록 유전적으로 조작되거나,
    (d) 상기 마우스는 상기 FcγRI 단백질이 단핵구, 대식세포, 호중구 또는 수지상 세포에서 발현되도록 조작되고, 바람직하게는, 상기 마우스가 상기 FcγRI 단백질의 발현이 뮤린 과립구 집락 자극 인자 (mG-CSF)를 상기 마우스에 투여 시에 증가 되도록 유전적으로 조작되는, 방법.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 마우스가
    (a) 상기 EC1 도메인이 서열 번호 3의 엑손 3과 90% 이상 동일한 엑손에 의해 인코딩되거나,
    (b) 상기 EC2 도메인이 서열 번호 3의 엑손 4와 90% 이상 동일한 엑손에 의해 인코딩되거나,
    (c) EC3 도메인이 서열 번호 3의 엑손 5와 90% 이상 동일한 엑손에 의해 인코딩되도록 유전적으로 조작되는, 방법.
15. FcγRI 유전자를 게놈 내에 포함하도록 마우스를 유전적으로 조작하는 단계를 포함하여, 마우스를 생성하는 방법으로서,
    상기 FcγRI 유전자는 FcγRI 프로모터 및 조절 서열 및
    마우스 FcγRI 단백질의 세포내 부분을 인코딩하는 마우스 FcγRI 유전자의 적어도 하나의 엑손에 작동가능하게 연결된 인간 FcγRI 단백질의 세포외 부분을 인코딩하는 인간 FcγRI 유전자의 적어도 하나의 엑손을 포함하는, 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 마우스가
    (a) 상기 인간 FcγRI 유전자의 엑손이 엑손 3, 4 및 5로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나,
    (b) 상기 마우스가 기능적 마우스 FcγRI 유전자를 발현하지 않도록 유전적으로 조작되는, 방법.
17. 제12항, 제13항, 제15항 및 제16항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 FcγRI 프로모터 및 조절 서열은 인간 FcγRI 프로모터 및 조절 서열이거나,
    (b) 상기 FcγRI 프로모터 및 조절 서열은 마우스 FcγRI 프로모터 및 조절 서열인, 방법.
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