KR102316842B1

KR102316842B1 - 인간화 분화 클러스터 274 유전자를 갖는 비인간 동물

Info

Publication number: KR102316842B1
Application number: KR1020177016266A
Authority: KR
Inventors: 엘레나 부로바; 야준 탕; 카-만 비너스 라이; 앤드류 제이. 머피
Original assignee: 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date: 2014-12-09
Filing date: 2015-12-09
Publication date: 2021-10-25
Also published as: IL252695A0; BR112017011982A2; JP2018500896A; KR20170101910A; KR102457921B1; EP3808775A1; IL282649A; JP7145920B2; EP3230320B1; US9913461B2; IL275864B; RS61218B1; AU2015360667A1; AU2021286369A1; IL252695B; US10881086B2; PT3230320T; MX2017007636A; HUE052606T2; RU2017123754A3

Abstract

분화 클러스터 274(CD274) 유전자의 인간화를 포함하는 비인간 동물, 이를 제조 및 사용하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 이러한 비인간 동물은, 일부 실시 형태에서, 이것이 인간 부분과 내인성 부분(예를 들어, 비인간 부분)을 포함하는 프로그램된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)을 발현하도록, 내인성 CD274 유전자에 대한 유전자 변형을 갖는 것으로 기술될 수 있다.

Description

인간화 분화 클러스터 274 유전자를 갖는 비인간 동물{NON-HUMAN ANIMALS HAVING A HUMANIZED CLUSTER OF DIFFERENTIATION 274 GENE}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2014년 12월 9일자로 출원된 미국 가출원 제62/089,549호 및 2015년 1월 22일자로 출원된 미국 가출원 제62/106,525호의 이익을 주장하며, 이들의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.

참조에 의한 서열 목록의 포함

2015년 11월 24일에 생성되어 EFS-Web을 통해 미국 특허상표청(United States Patent and Trademark Office)에 제출된, 파일명이 31971_10133WO01_PCTSequenceListing.txt인 79 KB의 ASCII 텍스트 파일의 서열 목록은 본 명세서에 참고로 포함된다.

자가면역, 암 및 감염성 질병의 치료에서의 상당한 진보에도 불구하고, 세계 헬스케어 산업의 주요 도전 과제가 남아 있다. 이러한 주요 도전 과제는, 부분적으로, 세포 표면 폴리펩티드를 통해 면역 반응을 조정하는 세포의 능력에 기인한다. 일부 세포 표면 폴리펩티드를 통해, 세포 및 미생물은 신호전달 경로를 빼앗아서 숙주 면역계의 모니터링 메커니즘을 약화시키고 이들에 대한 면역 반응을 억제하였는데, 이는 질병 표현형의 발달을 유발한다. 여전히, 자가면역, 암 및 감염성 질병에 대한 새로운 표적 요법의 치료 잠재력을 최적으로 결정하며, 이러한 질병 병증에 대한 면역 반응을 조정하고 이러한 세포가 어떻게 면역 반응을 조작하는지에 관한 분자적 측면을 결정하도록 설계된, 생체내 시스템의 개발이 부족하다. 이러한 생체내 시스템은 장래에 자가면역, 암 및 감염성 질병의 치료를 위한 후보 작용제(candidate agent)의 치료 효능 및 개발을 평가하는 검정에 대한 소스를 제공한다.

본 발명은 자가면역, 염증성 질병 및 암의 치료에 사용될 수 있는 신규 치료제를 그리고 일부 실시 형태에서는 치료 계획(therapeutic regimen)을 식별 및 개발하기 위해 개선된 생체내 시스템이 될 수 있도록 비인간(non-human) 동물을 유전자조작(engineering)하는 것이 바람직하다는 인식을 포함한다. 또한, 본 발명은 감염성 질병의 치료에 사용될 수 있는 신규 치료제를 그리고 일부 실시 형태에서는 치료 계획을 식별 및 개발하기 위해 개선된 생체내 시스템이 될 수 있도록 비인간 동물을 유전자조작하는 것이 바람직하다는 인식을 포함한다. 추가로, 또한 본 발명은 인간화 CD274 유전자를 갖고/갖거나 그렇지 않은 경우 인간 또는 인간화 PD-L1 폴리펩티드를 발현, 함유 또는 생성하는 비인간 동물이, 예를 들어 항종양 및/또는 항미생물 면역을 상향 조절하는 치료제를 식별 및 개발하는 데 사용하기에 바람직하다는 인식을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 PD-L1을 표적화하거나 PD-L1 결합 파트너(예를 들어, PD-1, B7-1)를 간접적으로 표적화하는 것을 포함하는 병용 요법의 식별 및 개발을 위한 개선된 생체내 시스템을 제공한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 2개의 상이한 종(예를 들어, 인간 및 비인간)으로부터의 유전 물질을 포함하는 CD274 유전자를 포함하는 게놈을 갖는 비인간 동물을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 CD274 유전자는 인간 부분과 비인간 부분을 함유하는 PD-L1 폴리펩티드를 인코딩(encoding)하며, 인간 부분과 비인간 부분은 함께 연결되어 기능적 PD-L1 폴리펩티드를 형성한다. 일부 실시 형태에서, 비인간 부분은 내인성 부분을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 CD274 유전자는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 세포외 도메인의 전부 또는 일부를 함유하는 PD-L1 폴리펩티드를 인코딩한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 인간 부분과 내인성 부분을 포함하는 PD-L1 폴리펩티드를 발현하는 비인간 동물을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 PD-L1 폴리펩티드는 비인간 동물의 세포에서 비인간 신호 펩티드로 번역되고; 일부 특정 실시 형태에서는 설치류 신호 펩티드로 번역된다.

일부 실시 형태에서, 내인성 부분은 내인성 PD-L1 폴리펩티드의 세포내 부분을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 내인성 부분은 내인성 PD-L1 폴리펩티드의 막관통 부분을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 내인성 부분은 도 6에 나타나는 마우스 PD-L1 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 내인성 부분은 도 6에 나타나는 마우스 PD-L1 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 내인성 부분은 도 6에 나타나는 마우스 PD-L1 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

일부 실시 형태에서, 인간 부분은 인간 PD-L1 폴리펩티드의 아미노산 19-238을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 부분은 인간 PD-L1 폴리펩티드의 아미노산 19-277을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 부분은 인간 PD-L1 폴리펩티드의 아미노산 19-131을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 부분은 도 6에 나타나는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 부분은 도 6에 나타나는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 부분은 도 6에 나타나는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 PD-L1 폴리펩티드는 내인성 비인간 CD274 서열과 인간 CD274 서열을 포함하는 CD274 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 특정 실시 형태에서, CD274 유전자는 내인성 CD274 엑손 1, 엑손 2, 엑손 6 및 엑손 7을 포함한다. 일부 특정 실시 형태에서, CD274 유전자는 내인성 CD274 엑손 5의 전부 또는 일부를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 내인성 비인간 CD274 서열과 인간 CD274 서열을 포함하는 CD274 유전자는 내인성 CD274 유전자좌에 위치한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 CD274 유전자는 서열 번호 12, 서열 번호 13 또는 서열 번호 16과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 CD274 유전자는 서열 번호 12, 서열 번호 13 또는 서열 번호 16과 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 CD274 유전자는 서열 번호 12, 서열 번호 13 또는 서열 번호 16과 동일한 서열을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 CD274 유전자는 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15 및 서열 번호 16을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 CD274 유전자는 서열 번호 13 및 서열 번호 16을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 CD274 유전자는 서열 번호 12 및 서열 번호 13을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 CD274 유전자는 서열 번호 12, 서열 번호 13 및 서열 번호 17을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 CD274 유전자는 서열 번호 13, 서열 번호 16 및 서열 번호 17을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 인간화 CD274 유전자좌를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 인간화 CD274 유전자좌는 인간 CD274 서열을 포함하도록 유전자 변형된 내인성 비인간 CD274 유전자좌이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명은 인간 CD274 유전자의 하나 이상의 엑손의 전부 또는 일부에 작동가능하게 연결된 비인간 CD274 유전자의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간화 CD274 유전자좌를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 인간화 CD274 유전자좌는 인간 CD274 유전자의 하나 이상의 엑손을 플랭킹(flanking)하는 5' 및 3' 비인간 CD274 비번역 영역(UTR)을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간화 CD274 유전자좌는 설치류 프로모터의 제어 하에 있고; 일부 특정 실시 형태에서는 내인성 설치류 프로모터의 제어 하에 있다.

일부 실시 형태에서, 인간화 CD274 유전자좌는 인간 CD274 엑손 3 및 엑손 4에 작동가능하게 연결된 비인간 CD274 엑손 1, 엑손 2, 엑손 6 및 엑손 7을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간화 CD274 유전자좌는 비인간 CD274 엑손 1, 엑손 2, 엑손 6 및 엑손 7, 인간 CD274 엑손 3 및 엑손 4를 포함하며, 서로 작동가능하게 연결된 인간 부분과 비인간 부분을 포함하는 CD274 엑손 5를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD274 엑손 5의 인간 부분은 인간 PD-L1 폴리펩티드의 세포외 도메인의 일부인 아미노산 잔기를 인코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD274 엑손 5의 인간 부분은 인간 PD-L1 폴리펩티드의 아미노산 잔기 229-238을 인코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD274 엑손 5의 인간 부분은 약 32 bp의 인간 CD274 엑손 5를 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD274 엑손 5의 비인간 부분은 막관통 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD274 엑손 5의 비인간 부분은 약 69 bp의 설치류 CD274 엑손 5를 포함한다. 일부 특정 실시 형태에서, 인간화 CD274 유전자좌는 서열 번호 12에 제시된 서열을 갖는 CD274 엑손 5를 포함한다. 일부 특정 실시 형태에서, 인간화 CD274 유전자좌는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 L229-R238에 상응하는 아미노산 및 설치류 PD-L1 폴리펩티드의 T238-Q263에 상응하는 아미노산을 인코딩하는 CD274 엑손 5를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 내인성 부분과 인간 부분을 포함하는 CD274 유전자를 포함하는 비인간 동물을 제공하며, 내인성 부분과 인간 부분은 비인간 CD274 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, 비인간 CD274 프로모터는 설치류 CD274 프로모터이다. 일부 특정 실시 형태에서, 설치류 CD274 프로모터는 내인성 설치류 CD274 프로모터이다.

일부 실시 형태에서, 내인성 부분은 내인성 CD274 엑손 1, 엑손 2, 엑손 6 및 엑손 7을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 내인성 부분은 내인성 CD274 엑손 5의 전부 또는 일부를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 내인성 CD274 유전자의 내인성 CD274 엑손 1, 엑손 2, 엑손 5의 전부 또는 일부, 엑손 6 및 엑손 7은 도 6에 나타나는 마우스 Cd274 유전자의 상응하는 엑손 1, 엑손 2, 엑손 5의 전부 또는 일부, 엑손 6 및 엑손 7과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일하다. 일부 실시 형태에서, 내인성 CD274 유전자의 내인성 CD274 엑손 1, 엑손 2, 엑손 5의 전부 또는 일부, 엑손 6 및 엑손 7은 도 6에 나타나는 마우스 Cd274 유전자의 상응하는 엑손 1, 엑손 2, 엑손 5의 전부 또는 일부, 엑손 6 및 엑손 7과 실질적으로 동일하다. 일부 실시 형태에서, 내인성 CD274 유전자의 내인성 CD274 엑손 1, 엑손 2, 엑손 5의 전부 또는 일부, 엑손 6 및 엑손 7은 도 6에 나타나는 마우스 Cd274 유전자의 상응하는 엑손 1, 엑손 2, 엑손 5의 전부 또는 일부, 엑손 6 및 엑손 7과 동일하다.

일부 실시 형태에서, 인간 부분은 인간 PD-L1 폴리펩티드의 아미노산 19-131, 19-227 또는 19-238을 인코딩한다.

일부 실시 형태에서, 인간 부분은 인간 CD274 유전자의 엑손 3 및 엑손 4를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 부분은 인간 CD274 엑손 5의 전부 또는 일부를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 CD274 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 전부 또는 일부는 도 6에 나타나는 인간 CD274 유전자의 상응하는 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 전부 또는 일부와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일하다. 일부 실시 형태에서, 인간 CD274 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 전부 또는 일부는 도 6에 나타나는 인간 CD274 유전자의 상응하는 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 전부 또는 일부와 실질적으로 동일하다. 일부 실시 형태에서, 인간 CD274 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 전부 또는 일부는 도 6에 나타나는 인간 CD274 유전자의 상응하는 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 전부 또는 일부와 동일하다. 일부 실시 형태에서, 인간 부분은 비인간 동물에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 서열을 포함하고; 일부 실시 형태에서는 설치류에서의 발현을 위해 그러하고; 일부 특정 실시 형태에서는 마우스 또는 래트에서의 발현을 위해 그러하다.

일부 실시 형태에서, 인간 부분은 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 부분은 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 부분은 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12와 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 부분은 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 부분은 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 11과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 부분은 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 11을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 16, 서열 번호 17 또는 이들의 조합을 포함하는 CD274 유전자를 포함하는 게놈을 갖는다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물로부터 생성, 발현, 또는 발생된 PD-L1 폴리펩티드를 제공한다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물로부터 생성, 발현, 또는 발생된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6에 나타나는 인간화 PD-L1 폴리펩티드와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물로부터 생성, 발현, 또는 발생된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6에 나타나는 인간화 PD-L1 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물로부터 생성, 발현, 또는 발생된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6에 나타나는 인간화 PD-L1 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물로부터 단리된 세포 또는 조직을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 단리된 세포 또는 조직은 본 명세서에 기술된 바와 같은 CD274 유전자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 림프 계열(lymphoid lineage)로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 세포는 골수 계열(myeloid lineage)로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 세포는 B 세포, 수지상 세포, 대식세포, 단핵구, 및 T 세포로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 조직은 지방, 방광, 뇌, 유방, 골수(bone marrow), 눈, 심장, 장, 신장, 간, 폐, 림프절, 근육, 췌장, 혈장, 혈청, 피부, 비장, 위, 흉선, 고환, 난자, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 CD274 유전자를 포함하는 게놈을 갖는 비인간 배아 줄기 세포를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 비인간 배아 줄기 세포는 설치류 배아 줄기 세포이다. 일부 특정 실시 형태에서, 설치류 배아 줄기 세포는 마우스 배아 줄기 세포이며, 129 계통(strain), C57BL 계통, 또는 이들의 혼합체로부터 유래된다. 일부 특정 실시 형태에서, 설치류 배아 줄기 세포는 마우스 배아 줄기 세포이며, 129 계통과 C57BL 계통의 혼합체이다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 배아 줄기 세포는 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 또는 이들의 조합을 포함하는 CD274 유전자를 포함하는 게놈을 갖는다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 비인간 동물을 제조하기 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 배아 줄기 세포의 용도를 제공한다. 일부 특정 실시 형태에서, 비인간 배아 줄기 세포는 마우스 배아 줄기 세포이며, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CD274 유전자를 포함하는 마우스를 제조하기 위해 사용된다. 일부 특정 실시 형태에서, 비인간 배아 줄기 세포는 래트 배아 줄기 세포이며, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CD274 유전자를 포함하는 래트를 제조하기 위해 사용된다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 CD274 유전자를 포함하는 비인간 배아 줄기 세포를 포함하거나, 이로부터 제조되거나, 이로부터 얻거나, 이로부터 발생된 비인간 배아를 제공한다. 일부 특정 실시 형태에서, 비인간 배아는 설치류 배아이고; 일부 실시 형태에서는 마우스 배아이고; 일부 실시 형태에서는 래트 배아이다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 비인간 동물을 제조하기 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 배아의 용도를 제공한다. 일부 특정 실시 형태에서, 비인간 배아는 마우스 배아이며, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CD274 유전자를 포함하는 마우스를 제조하기 위해 사용된다. 일부 특정 실시 형태에서, 비인간 배아는 래트 배아이며, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CD274 유전자를 포함하는 래트를 제조하기 위해 사용된다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 표적화 벡터 또는 핵산 작제물을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 인간화 CD274 유전자를 포함하는 표적화 벡터 또는 핵산 작제물을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명은 인간 세포외 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 PD-L1 폴리펩티드; 일부 특정 실시 형태에서는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 아미노산 19-131, 19-227 또는 19-238을 포함하는 PD-L1 폴리펩티드를 인코딩하는 CD274 유전자를 포함하는 표적화 벡터(또는 핵산 작제물)를 제공한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 표적화 벡터 또는 핵산 작제물은 인간 CD274 유전자의 하나 이상의 엑손의 전부 또는 일부에 작동가능하게 연결된 비인간 CD274 유전자의 하나 이상의 엑손의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적화 벡터 또는 핵산 작제물은 인간 CD274 유전자의 하나 이상의 엑손을 플랭킹하는 5' 및 3' 비인간 CD274 비번역 영역(UTR)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적화 벡터 또는 핵산 작제물은 하나 이상의 선택 마커를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적화 벡터 또는 핵산 작제물은 하나 이상의 부위 특이적 재조합 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적화 벡터 또는 핵산 작제물은 인간 CD274 엑손 3 및 엑손 4를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적화 벡터 또는 핵산 작제물은 인간 CD274 엑손 3 및 엑손 4 그리고 인간 CD274 엑손 5의 전부 또는 일부를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 표적화 벡터 또는 핵산 작제물은 서열 번호 7을 포함한다. 일부 특정 실시 형태에서, 표적화 벡터 또는 핵산 작제물은 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11 중 어느 하나와 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 변형된 비인간 배아 줄기 세포를 제조하기 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 표적화 벡터 또는 핵산 작제물의 용도를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명은 변형된 비인간 세포를 제조하기 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 표적화 벡터 또는 핵산 작제물의 용도를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명은 변형된 비인간 배아를 제조하기 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 표적화 벡터 또는 핵산 작제물의 용도를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명은 비인간 동물을 제조하기 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 표적화 벡터 또는 핵산 작제물의 용도를 제공한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 내인성 CD274 유전자로부터 인간 서열을 포함하는 PD-L1 폴리펩티드를 발현하는 비인간 동물을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 비인간 배아 줄기 세포에서 내인성 CD274 유전자에 인간 PD-L1 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈 단편을 삽입시키는 단계; (b) 단계 (a)에서 발생된 비인간 배아 줄기 세포를 얻는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 설치류 배아 줄기 세포를 사용하여 비인간 동물을 생성하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 인간 서열은 인간 PD-L1 폴리펩티드의 아미노산 19-131, 19-227 또는 19-238을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 인간 CD274 엑손 3 및 엑손 4를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 인간 CD274 엑손 5의 전부 또는 일부를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 선택 마커를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 부위 특이적 재조합 부위를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은, 인간 부분과 내인성 부분을 가지며 이 두 부분이 비인간 CD274 프로모터에 작동가능하게 연결된, PD-L1 폴리펩티드를 인코딩하는 CD274 유전자를 포함하는 게놈을 갖는 비인간 동물을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은, 인간 부분과 내인성 부분을 가지며 이 두 부분이 비인간 CD274 프로모터에 작동가능하게 연결된, PD-L1 폴리펩티드를 인코딩하는 CD274 유전자를 포함하도록 비인간 동물의 게놈을 변형시킴으로써 상기 비인간 동물을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 비인간 CD274 프로모터는 설치류 CD274 프로모터이다. 일부 특정 실시 형태에서, 설치류 CD274 프로모터는 내인성 설치류 CD274 프로모터이다.

일부 실시 형태에서, 인간 부분은 인간 PD-L1 폴리펩티드의 아미노산 19-131, 19-227 또는 19-238을 포함한다.

일부 실시 형태에서, CD274 유전자는 인간 CD274 엑손 3 및 엑손 4를 포함하도록 변형된다. 일부 실시 형태에서, CD274 유전자는 인간 CD274 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 전부 또는 일부를 포함하도록 변형된다.

일부 실시 형태에서, 비인간 동물의 게놈을 변형시키는 것은 비인간 배아 줄기 세포에서 수행되고, 이어서 상기 비인간 배아 줄기 세포로 비인간 동물을 발생시킨다. 일부 특정 실시 형태에서, 비인간 배아 줄기 세포는 설치류 배아 줄기 세포이고; 일부 실시 형태에서는 마우스 배아 줄기 세포이고; 일부 실시 형태에서는 래트 배아 줄기 세포이다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 의해 얻을 수 있거나, 이로부터 발생되거나, 이로부터 생성된 비인간 동물을 제공한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 비인간 동물에서 종양 성장을 감소, 예방 또는 제거하는 방법을 제공하며, 이 방법은, 인간 부분과 내인성 부분을 가지며 이 두 부분이 비인간 동물 CD274 프로모터에 작동가능하게 연결된, PD-L1 폴리펩티드를 인코딩하는 CD274 유전자를 포함하는 게놈을 갖는 비인간 동물에게 인간 PD-L1을 표적화하는 약물을 투여하는 단계를 포함하고; 이 투여 단계는 비인간 동물에서 종양 성장이 감소, 예방 또는 제거되기에 충분한 조건 하에 및 시간 동안 수행된다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 비인간 동물에서 종양 세포를 치사시키는 방법을 제공하며, 이 방법은, 인간 부분과 내인성 부분을 가지며 이 두 부분이 비인간 동물 CD274 프로모터에 작동가능하게 연결된, PD-L1 폴리펩티드를 인코딩하는 CD274 유전자를 포함하는 게놈을 갖는 비인간 동물에게 인간 PD-L1을 표적화하는 약물을 투여하는 단계를 포함하고; 이 투여 단계는 약물이 비인간 동물에서 종양 세포의 치사를 매개하기에 충분한 조건 하에 및 시간 동안 수행된다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 인간 PD-L1을 표적화하는 약물의 약동학적 특성을 평가하는 방법을 제공하며, 이 방법은 인간 부분과 내인성 부분을 가지며 이 두 부분이 비인간 동물 CD274 프로모터에 작동가능하게 연결된, PD-L1 폴리펩티드를 인코딩하는 CD274 유전자를 포함하는 게놈을 갖는 비인간 동물에게 인간 PD-L1을 표적화하는 약물을 투여하는 단계; 및 인간 PD-L1을 표적화하는 약물의 하나 이상의 약동학적 특성을 결정하는 검정을 수행하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 인간 PD-L1을 표적화하는 약물의 효능을 평가하는 방법을 제공하며, 이 방법은, 인간 부분과 내인성 부분을 가지며 이 두 부분이 비인간 동물 CD274 프로모터에 작동가능하게 연결된, PD-L1 폴리펩티드를 인코딩하는 CD274 유전자를 포함하는 게놈을 갖는 비인간 동물에게 인간 PD-L1을 표적화하는 약물을 투여하는 단계; 및 인간 PD-L1을 표적화하는 약물의 효능을 결정하는 검정을 수행하는 단계를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물은, 인간 부분과 내인성 부분을 가지며 이 두 부분이 설치류 CD274 프로모터에 작동가능하게 연결된, PD-L1 폴리펩티드를 인코딩하는 CD274 유전자를 포함하는 게놈을 갖는 설치류이다. 다양한 실시 형태에서, 설치류 CD274 프로모터는 내인성 설치류 CD274 프로모터이다. 다양한 실시 형태에서, 인간 부분은 인간 PD-L1 폴리펩티드의 아미노산 19-131, 19-227 또는 19-238을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 인간 PD-L1을 표적화하는 약물은 PD-L1 길항제이다. 일부 실시 형태에서, 인간 PD-L1을 표적화하는 약물은 PD-L1 효능제이다. 일부 실시 형태에서, 인간 PD-L1을 표적화하는 약물은 항-PD-L1 항체이다. 일부 실시 형태에서, 인간 PD-L1을 표적화하는 약물은 비인간 동물에게 정맥내, 복강내, 근내, 또는 피하 투여된다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 약물 또는 백신의 식별 또는 검증 방법을 제공하며, 이 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 CD274 유전자를 포함하는 게놈을 갖는 비인간 동물에게 약물 또는 백신을 전달하는 단계, 및 약물 또는 백신에 대한 면역 반응, 약물 또는 백신의 안전성 프로파일, 또는 질병, 장애 또는 질환에 대한 효과 중 하나 이상을 모니터링하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 안전성 프로파일을 모니터링하는 단계는 비인간 동물이 약물 또는 백신을 전달한 결과로서 부작용 또는 불리한 반응을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 부작용 또는 불리한 반응은 이환율, 사망률, 체중 변화, 하나 이상의 효소(예를 들어, 간)의 수준 변화, 하나 이상의 기관의 중량 변화, 기능 상실(예를 들어, 감각, 운동, 기관 등), 하나 이상의 질병에 대한 감수성 증가, 비인간 동물의 게놈에 대한 변화, 음식 소비의 증가 또는 감소 및 하나 이상의 질병의 합병증으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 질병, 장애 또는 질환은 비인간 동물에서 유도된다. 일부 실시 형태에서, 비인간 동물에서 유도되는 질병, 장애 또는 질환은 치료가 필요한 1명 이상의 인간 환자가 앓고 있는 질병, 장애 또는 질환과 관련된다. 일부 특정 실시 형태에서, 약물은 항체이다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은, 의학에 사용하기 위한, 예를 들어 의약으로 사용하기 위한 약물 또는 백신의 개발에 있어서 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 용도를 제공한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 암 또는 신생물의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 용도를 제공한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 감염성 질병의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 용도를 제공한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 염증성 질병, 장애 또는 질환의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 용도를 제공한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 자가면역 질병, 장애 또는 질환의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 용도를 제공한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 CD274 유전자는 본 명세서에 기술된 바와 같은 CD274 유전자를 포함한다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 CD274 유전자는, 인간 부분과 내인성 부분을 가지며 이 두 부분이 설치류 CD274 프로모터에 작동가능하게 연결된, PD-L1 폴리펩티드를 인코딩한다. 다양한 실시 형태에서, 설치류 프로모터는 내인성 설치류 프로모터이다. 다양한 실시 형태에서, 인간 부분은 인간 CD274 엑손 3 및 엑손 4를 포함한다. 다양한 실시 형태에서, 인간 부분은 인간 CD274 엑손 3 및 엑손 4 그리고 CD274 엑손 5의 전부 또는 일부를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 PD-L1 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 PD-L1 폴리펩티드를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 전장 내인성 비인간 PD-L1 폴리펩티드를 검출가능하게 발현하지 않는다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 내인성 PD-L1 폴리펩티드의 세포외 부분을 검출가능하게 발현하지 않는다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 면역글로불린 V 도메인을 검출가능하게 발현하지 않고, 일부 실시 형태에서는 내인성 PD-L1 폴리펩티드의 면역글로불린 C 도메인이 그러하다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 설치류이고; 일부 실시 형태에서는 마우스이고; 일부 실시 형태에서는 래트이다.

본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은 등가적으로 사용된다. 본 출원에서 약/대략과 함께 또는 이것 없이 사용되는 임의의 수는 당업자에 의해 인식되는 임의의 정상적인 변동을 포함하려는 것이다.

본 발명의 다른 특징들, 목적들, 및 이점들은 후속하는 특정 실시 형태의 상세한 설명에서 명백하다. 그러나, 상세한 설명은 본 발명의 특정 실시 형태를 나타내지만 제한이 아닌 예시로만 제공된다는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 범주 내의 다양한 변화 및 변형이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.

하기 도면들로 이루어진 본 명세서에 포함된 도면은 예시를 위한 것일 뿐이며 제한을 위한 것은 아니다.
도 1은 비인간(예를 들어, 마우스) 및 인간 분화 클러스터 274(CD274) 유전자의 게놈 구성의 일정한 비율에 따르지 않은 도표를 도시한다. 엑손은 각 엑손 아래에 번호가 매겨져 있다. 비번역 영역(UTR)은 채워지지 않은 사각형으로 표시된다.
도 2는 비인간 분화 클러스터 274(CD274) 유전자의 인간화에 사용되는 예시적인 작제물의 일정한 비율에 따르지 않은 도표를 도시한다. 상단 도표는 네오마이신 카세트를 갖는 인간화 표적화 벡터를 나타내며, 하단 도표는 카세트가 결실된 인간화 표적화 벡터를 나타낸다. 선택된 뉴클레오티드 접합부 위치는 각 접합부 아래에 상응하는 서열 번호를 동반한 라인으로 표시된다. 예시적인 인간화 단편은 도 6에 제시되며, 다음과 같이 도시되어 있다: 인간화 단편 A: 인간 4,494 bp-네오마이신 카세트-인간 3,950 bp(서열 번호 7); 인간화 단편 B: 인간 4,494 bp-loxP-인간 3,950 bp(서열 번호 8); 인간화 단편 C: 인간 4,494 bp 단편(서열 번호 9); 인간화 단편 D: 인간 3,950 bp 단편(서열 번호 10).
도 3은 비인간(예를 들어, 마우스) 및 인간 분화 클러스터 274(CD274) 유전자의 게놈 구성의 일정한 비율에 따르지 않은 도표를 도시하며, 실시예 1에 기술된 검정에 사용되는 프로브들의 대략적인 위치를 나타낸다. 또한, 인간 CD274 유전자 내의 예시적인 인간화 단편(인간화 단편 E; 서열 번호 11) 및 마우스 Cd274 유전자의 부분의 예시적인 결실이 도시되어 있다.
도 4는 실시예 1에 기술된 바와 같은 내인성 PD-L1 유전자의 인간화에 대해 동형접합성인 마우스에서 21일에 걸친 예시적인 MC38.ova/hPD-L1 종양 성장 곡선을 도시한다. 대조 Ab: PD-L1에 대해 특이적이지 않은 항체, a-hPD-L1: 인간 PD-L1에 대해 특이적인 항체. 화살표는 실험 동안 항체 처리에 대한 일수를 나타낸다. 21일째에 무종양 마우스의 수가 각 처리 그룹에 대해 나타나 있다.
도 5는 항-PD-L1 또는 대조 항체로 처리한 후 실시예 1에 기술된 바와 같은 내인성 CD274 유전자에 대해 동형접합성인 마우스의 비장 세포에서 CD8b, CD3 및 PD-L1 mRNA 발현의 예시적인 실시간 PCR 분석을 도시한다. A, 그룹당 6 마리의 마우스의 평균. B, 각 처리 그룹에서 개별 마우스에 대한 발현 수준. 대조 Ab: PD-L1에 대해 특이적이지 않은 항체; a-PD-L1: 항-PD-L1 항체.
도 6은 예시적인 마우스, 인간 및 인간화 CD274 및 PD-L1 서열뿐만 아니라 비인간 CD274 유전자의 인간화를 위한 예시적인 인간 핵산 서열을 도시한다. mRNA 서열의 경우, 굵은 글꼴은 코딩 서열을 나타내며, 연속된 엑손은 표시되는 경우 밑줄이 그어진 텍스트가 번갈아 나오게 함으로써 구분되고; 인간화 mRNA 서열의 경우, 인간 서열은 괄호 안에 들어 있다. 단백질 서열의 경우, 신호 펩티드는 밑줄이 그어져 있고, 세포외 서열은 굵은 글꼴이고, 면역글로불린 V(IgV) 도메인 서열은 괄호 안에 있고, 세포내 서열은 이탤릭체이고; 인간화 단백질 서열의 경우, 비인간 서열은 보통 글꼴로 표시되고, 인간 서열은 굵은 글꼴로 표시된다. 인간화 단편 A: 인간 4,494 bp-네오마이신 카세트-인간 3,950 bp(서열 번호 7); 인간화 단편 B: 인간 4,494 bp-loxP-인간 3,950 bp(서열 번호 8); 인간화 단편 C: 인간 4,494 bp 단편(서열 번호 9); 인간화 단편 D: 인간 3,950 bp 단편(서열 번호 10).
정의
본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 제한되지 않는데, 이는 그러한 방법 및 조건이 달라질 수 있기 때문이다. 또한, 본 명세서에 사용되는 용어는 특정 실시 형태를 설명하기 위한 것일 뿐이며, 제한하려고 하는 것이 아님을 이해해야 하는데, 이는 본 발명의 범주가 청구범위에 의해 한정되기 때문이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 용어 및 문구는, 반대되는 것이 명확히 표시되거나 그 용어 또는 문구가 사용되는 문맥으로부터 아주 명백한 경우가 아니라면, 그 용어 및 문구가 당업계에서 획득한 의미를 포함한다. 본 명세서에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 특정 방법 및 재료가 이제 설명된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 하나 이상의 관심 값에 적용된 바와 같은 용어 "대략"은 명시된 기준 값과 유사한 값을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은, 달리 명시되지 않거나 문맥으로부터 달리 분명하지 않는 한, 어느 방향(초과 또는 미만)으로든 명시된 기준 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하에 속하는 값의 범위를 지칭한다(그러한 수치가 가능한 값의 100%를 넘는 경우는 제외함).
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "생물학적으로 활성"은 시험관내 또는 생체내(예를 들어, 유기체 내) 생물학적 시스템에서 활성을 갖는 임의의 작용제의 특징을 포함한다. 예를 들어, 유기체 내에 존재하는 경우 그러한 유기체 내에서 생물학적 효과를 갖는 작용제는 생물학적으로 활성인 것으로 간주된다. 특정 실시 형태에서, 단백질 또는 폴리펩티드가 생물학적으로 활성인 경우, 그 단백질 또는 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 공유하는 단백질 또는 폴리펩티드의 부분은 전형적으로 "생물학적으로 활성"인 부분으로 지칭된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 문구 "분화 클러스터 274 단백질", "CD274 단백질", "B7-H1 단백질", 또는 "PD-L1 단백질"은 세포 표면 단백질 리간드의 B7 패밀리에 속하는 막관통 단백질을 포함하며, 면역글로불린 가변 도메인 및 불변 도메인과 관련된 세포외 면역글로불린 V(IgV) 및 면역글로불린 불변 유사(IgC) 도메인, 및 막관통 및 세포질(또는 세포내) 도메인을 갖는다. PD-L1은 림프 계열(예를 들어, B 세포, T 세포, 수지상 세포, 대식세포, 단핵구 등) 및 비림프 계열(심장, 폐, 간, 췌장 등) 둘 모두에서 발현되며, 예를 들어 프로그램된 세포 사멸 1(PD-1)과 같은 막 표면 단백질들 사이의 상호작용에 관여하여 면역 기능을 조절한다. PD-L1의 발현은 사이토카인(예를 들어, 인터페론-γ)에 의해 조절되며, 많은 인간 암에서 상향 조절되는 것으로 보고되었고, 이는 이러한 암이 면역계에 의한 감시를 피하게 할 수 있다. PD-L1은, 예를 들어 세포내 감염, 말초 관용, T 세포 수용체 신호전달 및 T 세포 증식과 같은 몇 가지 세포 과정에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 대안적으로, 스플라이싱(splicing)된 CD274 아이소폼(isoform)이 마우스와 인간 사이에서 식별되었다. 예로서, 뮤린 및 인간 CD274 유전자의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 도 6에 제공되어 있다. 본 개시내용을 읽은 당업자는 게놈 내의 하나 이상(또는 전부)의 내인성 CD274 유전자가 하나 이상의 이종성 CD274 유전자(예를 들어, 다형 변이체, 서브타입 또는 돌연변이체, 다른 종으로부터의 유전자, 인간화 형태 등)에 의해 대체, 변형, 변경, 결실, 파괴 등이 될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "CD274 발현 세포", "B7-H1 발현 세포", 또는 "PD-L1 발현 세포"는 PD-L1 막관통 폴리펩티드를 발현하는 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, PD-L1 발현 세포는 이의 표면 상에 PD-L1 막관통 폴리펩티드를 발현한다. 일부 실시 형태에서, PD-L1 폴리펩티드는 (예를 들어, PD-1 수용체 폴리펩티드와의 상호작용을 통한) 세포 대 세포 상호작용을 매개하기에 충분한 양으로 세포의 표면 상에 발현된다. 예시적인 PD-L1 발현 세포는 B 세포, 수지상 세포, 대식세포, 단핵구 및 T 세포를 포함한다. PD-L1 발현 세포는 면역 반응을 증강 또는 약화시키기 위해 림프계 세포의 활성화 또는 억제를 조정한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 비인간 동물의 하나 이상의 세포의 표면 상에 발현되는 인간화 PD-L1 폴리펩티드를 통해 (본 명세서에 기술된 바와 같은) 다양한 세포 과정의 조절을 입증한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "필적하는"은, 서로 동일하지는 않을 수 있지만 서로간의 비교를 허용하기에 충분히 유사하여 관찰된 차이점 또는 유사점에 기반하여 결론이 합리적으로 도출될 수 있는, 둘 이상의 작용제, 엔티티(entity), 상황, 일련의 조건 등을 포함한다. 당업자는 임의의 주어진 정황에서 둘 이상의 그러한 작용제, 엔티티, 상황, 일련의 조건 등을 필적하는 것으로 간주하기에 어느 정도의 동일성이 요구되는 지를 문맥상 이해할 것이다.
보존적 아미노산 치환을 설명하기 위해 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "보존적"은 아미노산 잔기가 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)이 유사한 측쇄 R 기를 갖는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환됨을 포함한다. 대체로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 관심 기능적 특성, 예를 들어 리간드에 결합하는 수용체의 능력을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 화학적 특성이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예는, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신과 같은 지방족 측쇄; 세린 및 트레오닌과 같은 지방족 하이드록실 측쇄; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드 함유 측쇄; 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판과 같은 방향족 측쇄; 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘과 같은 염기성 측쇄; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 측쇄; 및 시스테인 및 메티오닌과 같은 황 함유 측쇄를 포함한다. 보존적 아미노산 치환 그룹은, 예를 들어 발린/류신/아이소류신, 페닐알라닌/티로신, 라이신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타메이트/아스파르테이트, 및 아스파라긴/글루타민을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 보존적 아미노산 치환은, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발(alanine scanning mutagenesis)에 사용된 바와 같은, 단백질 내의 임의의 천연 잔기의 알라닌으로의 치환일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Gonnet, G. H. et al., 1992, Science 256:1443-1445]에 개시된 PAM250 로그 가능도 매트릭스(log-likelihood matrix)에서 양성 값을 갖는 보존적 치환이 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 치환은 PAM250 로그 가능도 매트릭스에서 비음성(nonnegative) 값을 갖는 적당히 보존적인 치환이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "대조(군)"은 "대조(군)"이 결과의 비교 대상이 되는 표준이라는 당업계에서 이해되고 있는 의미를 포함한다. 전형적으로, 대조군은 변수를 따로 분리하여 이러한 변수에 대한 결론을 내림으로써 실험의 완전성을 증강시키기 위해 사용된다. 일부 실시 형태에서, 대조군은 비교측정치를 제공하기 위해 시험 반응 또는 검정과 동시에 수행되는 반응 또는 검정이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "대조군"은 "대조 동물"을 지칭할 수 있다. "대조 동물"은 본 명세서에 기술된 바와 같은 변형을 갖거나, 본 명세서에 기술된 것과 상이한 변형을 갖거나, 변형을 갖지 않을(즉, 야생형 동물일) 수 있다. 하나의 실험에서, "시험"(즉, 시험되는 변수)이 적용된다. 두 번째 실험에서, "대조군"은 시험되는 변수가 적용되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 대조군은 과거의 대조군(즉, 이전에 수행된 시험 또는 검정, 또는 이전에 공지된 양 또는 결과를 가짐)이다. 일부 실시 형태에서, 대조군은 인쇄되거나 다른 방식으로 저장된 기록이거나 이를 포함한다. 대조군은 양성 대조군 또는 음성 대조군일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "파괴"는 DNA 분자와의(예를 들어, 유전자 또는 유전자좌와 같은 내인성 상동 서열과의) 상동 재조합 사건의 결과를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 DNA 서열(들)의 삽입, 결실, 치환, 대체, 미스센스(missense) 돌연변이, 또는 프레임 시프트(frame-shift), 또는 이들의 조합을 달성하거나 나타낼 수 있다. 삽입은 전체 유전자 또는 유전자의 단편, 예를 들어 내인성 서열 이외의(예를 들어, 이종성 서열의) 기원을 가질 수 있는 엑손의 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물(예를 들어, 유전자에 의해 인코딩되는 단백질)의 발현 및/또는 활성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 인코딩되는 유전자 생성물(예를 들어, 인코딩되는 단백질)의 서열을 변경시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 인코딩되는 유전자 생성물(예를 들어, 인코딩되는 단백질)을 절단하거나 단편화할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 인코딩되는 유전자 생성물을 연장할 수 있고; 일부 그러한 실시 형태에서, 파괴는 융합 단백질의 조립을 달성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 수준에 영향을 미칠 수 있지만 활성에는 영향을 미치지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 활성에 영향을 미칠 수 있지만 수준에는 영향을 미치지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 수준에 대해 유의한 효과를 갖지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 활성에 대해 유의한 효과를 갖지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 수준 또는 활성에 대해 유의한 효과를 갖지 않을 수 있다.
용어 "결정", "측정", "감정", "평가", "검정" 및 "분석"은 임의의 측정 형태를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 요소가 존재하는지의 여부를 결정하는 것을 포함한다. 이들 용어는 정량적 및/또는 정성적 결정 둘 모두를 포함한다. 검정은 상대적 또는 절대적일 수 있다. "존재에 대해 검정"은 존재하는 어떤 것의 양을 결정하는 것 및/또는 그것이 존재하거나 부재하는지의 여부를 결정하는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 문구 "내인성 유전자좌" 또는 "내인성 유전자"는 본 명세서에 기술된 바와 같은 파괴, 결실, 대체, 변경, 또는 변형을 도입하기 전에 모(parent) 유기체 또는 기준 유기체에서 발견되는 유전자좌를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 내인성 유전자좌는 자연계에서 발견되는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 내인성 유전자좌는 야생형 유전자좌이다. 일부 실시 형태에서, 기준 유기체는 야생형 유기체이다. 일부 실시 형태에서, 기준 유기체는 유전자조작된 유기체이다. 일부 실시 형태에서, 기준 유기체는 실험실 번식 유기체(야생형 또는 유전자조작된 것 어느 것이든)이다.
문구 "내인성 프로모터"는 내인성 유전자와 자연적으로 관련되는, 예를 들어 야생형 유기체 내의, 프로모터를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "이종성"은 상이한 공급원으로부터의 작용제 또는 엔티티를 포함한다. 예를 들어, 특정 세포 또는 유기체에 존재하는 폴리펩티드, 유전자, 또는 유전자 생성물과 관련하여 사용되는 경우, 이 용어는 관련 폴리펩티드, 유전자, 또는 유전자 생성물이 1) 인간의 손에 의해 유전자조작되었고/되었거나; 2) 인간의 손을 통해(예를 들어, 유전자 조작을 통해) 세포 또는 유기체(또는 이의 전구체)에 도입되었고/되었거나; 3) 관련 세포 또는 유기체(예를 들어, 관련 세포 유형 또는 유기체 유형)에 의해 자연적으로 생성되지 않거나 이에 존재하지 않는 것임을 명확히 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"는 이종성(예를 들어, 외인성) 핵산 또는 단백질이 도입된 세포를 포함한다. 본 개시내용을 읽은 당업자는 이러한 용어가 특정 대상 세포를 지칭할 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 지칭하는 데에도 사용됨을 이해할 것이다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 여전히 포함된다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이거나 이를 포함한다. 대체로, 숙주 세포는 세포가 지정되어 있는 생명계와 무관하게 이종성 핵산 또는 단백질을 수용하고/하거나 생성하기에 적합한 임의의 세포이다. 예시적인 세포는 원핵생물 및 진핵생물의 세포(단세포 또는 다세포), 세균 세포(예를 들어, 대장균(E. coli), 바실러스 종(Bacillus spp.), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces spp.) 등의 계통), 미코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예를 들어, S. 세레비시아이(S. cerevisiae), S. 폼베(S. pombe), P. 파스토리스(P. pastoris), P. 메타놀리카(P. methanolica) 등), 식물 세포, 곤충 세포(예를 들어, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스 감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 등), 비인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 세포 융합물, 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마(quadroma)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트, 또는 마우스 세포이다. 일부 실시 형태에서, 세포는 진핵 세포이며, 하기 세포로부터 선택된다: CHO(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60(예를 들어, BHK21), Jurkat, Daudi, A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, 세르톨리(Sertoli) 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포, 및 앞서 언급된 세포로부터 유래된 세포주. 일부 실시 형태에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자를 포함하며, 예를 들어 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어, PER.C6® 세포)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 단리된 세포이거나 이를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 조직의 일부이다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 유기체의 일부이다.
용어 "인간화(humanized)"는, 비인간 동물에서 자연계에서 발견되는 특정 유전자 또는 단백질의 구조와 실질적으로 또는 동일하게 상응하는 부분을 포함하며, 또한 관련 특정 비인간 유전자 또는 단백질에서 발견되는 것과는 상이하며 대신에 상응하는 인간 유전자 또는 단백질에서 발견되는 필적하는 구조와 더욱 가깝게 상응하는 부분을 포함하는, 구조(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열)를 갖는 핵산 또는 단백질을 지칭하기 위해 당업계에서 이해되는 의미에 따라 본 명세서에서 사용된다. 일부 실시 형태에서, "인간화" 유전자는, 실질적으로 인간 폴리펩티드(예를 들어, 인간 단백질 또는 이의 부분, 예를 들어 이의 특징적인 부분)의 아미노산 서열과 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자이다. 한 가지 예를 들면, 막 수용체의 경우, "인간화" 유전자는 인간 세포외 부분의 아미노산 서열과 같은 아미노산 서열을 갖는 세포외 부분 및 비인간(예를 들어, 마우스) 폴리펩티드의 아미노산 서열과 같은 나머지 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 인간화 유전자는 인간 유전자의 DNA 서열의 적어도 부분을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간화 유전자는 인간 유전자의 전체 DNA 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간화 단백질은 인간 단백질에 나타나는 부분을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간화 단백질은 인간 단백질의 전체 서열을 포함하며, 인간 유전자의 호모로그(homolog) 또는 오르토로그(ortholog)에 상응하는 비인간 동물의 내인성 유전자좌로부터 발현된다.
서열의 비교와 관련하여 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "동일성"은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하는 데 사용될 수 있는 당업계에 공지된 다수의 상이한 알고리즘에 의해 결정된 바와 같은 동일성을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 동일성은, 10.0의 오픈 갭 페널티(open gap penalty), 0.1의 익스텐드 갭 페널티(extend gap penalty)를 이용하며 Gonnet 유사성 매트릭스를 사용하는 ClustalW v. 1.83 (slow) 정렬(MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008)을 사용하여 결정된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "개선", "증가", "제거" 또는 "감소", 또는 이의 문법적 등가 표현은 기준선 측정치, 예를 들어 본 명세서에 기술된 처리의 개시 전 동일한 개체(또는 동물)에서의 측정치, 또는 본 명세서에 기술된 처리가 없는 대조 개체(또는 동물) 또는 다수의 대조 개체(또는 동물)에서의 측정치에 대한 값을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "단리된"은, (1) (자연계에서든 그리고/또는 실험 환경에서든) 최초로 생성된 경우 이것이 회합되어 있었던 성분들 중 적어도 일부로부터 분리되고/되거나, (2) 인간의 손에 의해 설계, 생성, 제조, 및/또는 제작된 물질 및/또는 엔티티를 포함한다. 단리된 물질 및/또는 엔티티는 이들이 최초로 회합되어 있었던 다른 성분들의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로부터 분리될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 단리된 작용제는 순도가 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 물질은 이것에 실질적으로 다른 성분이 없는 경우 "순수"하다. 일부 실시 형태에서, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 물질은, 예를 들어 하나 이상의 담체 또는 부형제(예컨대, 완충제, 용매, 물 등)와 같은 특정의 다른 성분과 배합된 후에도 여전히 "단리된" 또는 심지어 "순수"한 것으로 간주될 수 있고; 이러한 실시 형태에서, 물질의 단리 또는 순도 퍼센트는 이러한 담체 또는 부형제를 포함시키지 않고 계산된다. 한 가지 예를 들면, 일부 실시 형태에서, 자연계에서 발생하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 생물학적 중합체는, a) 이의 기원 또는 유래 공급원으로 인해 자연계에서 이의 천연 상태에서 이와 동반되는 성분들 중 일부 또는 전부와 회합되어 있지 않거나; b) 자연계에서 이를 생성하는 종으로부터 동일한 종의 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 실질적으로 없거나; c) 자연계에서 이를 생성하는 종의 것이 아닌 세포 또는 다른 발현 시스템에 의해 발현되거나 이로부터의 성분들과 다른 방식으로 회합되어 있는 경우, "단리된" 것으로 간주된다. 따라서, 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 화학적으로 합성되거나 자연계에서 생성하는 것과 상이한 세포 시스템에서 합성되는 폴리펩티드는 "단리된" 폴리펩티드로 간주된다. 대안적으로 또는 부가적으로, 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 정제 기술이 적용된 폴리펩티드는, a) 자연계에서 이것이 회합되어 있고/있거나 b) 최초로 생성된 경우 이것이 회합되어 있는 다른 성분과 분리되었다면, "단리된" 폴리펩티드로 간주될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 문구 "비인간 동물"은 인간이 아닌 임의의 척추동물 유기체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 비인간 동물은 원구류(cyclostome), 경골 어류, 연골 어류(예를 들어, 상어 또는 가오리), 양서류, 파충류, 포유류, 및 조류이다. 일부 실시 형태에서, 비인간 포유류는 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소, 또는 설치류이다. 일부 실시 형태에서, 비인간 동물은 설치류, 예를 들어 래트 또는 마우스이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 문구 "핵산"은 이의 가장 넓은 의미로 올리고뉴클레오티드 사슬에 도입되거나 도입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, "핵산"은 포스포다이에스테르 결합을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬에 도입되거나 도입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 문맥으로부터 명백해질 것인 바와 같이, 일부 실시 형태에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기(예를 들어, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 포함하고; 일부 실시 형태에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 사슬을 포함한다. 일부 실시 형태에서, "핵산"은 RNA이거나 이를 포함하고; 일부 실시 형태에서, "핵산"은 DNA이거나 이를 포함한다. 일부 실시 형태에서, "핵산"은 하나 이상의 천연 핵산 잔기이거나, 이들을 포함하거나, 이들로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, "핵산"은 하나 이상의 핵산 유사체이거나, 이들을 포함하거나, 이들로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 핵산 유사체는, 이것이 포스포다이에스테르 골격(backbone)을 이용하지 않는다는 점에서 "핵산"과 상이하다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, "핵산"은, 당업계에 공지되어 있고 골격에 포스포다이에스테르 결합 대신 펩티드 결합을 가지며 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주되는, 하나 이상의 "펩티드 핵산"이거나, 이들을 포함하거나, 이들로 이루어진다. 대안적으로 또는 부가적으로, 일부 실시 형태에서, "핵산"은 포스포다이에스테르 결합보다는 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 5'-N-포스포르아미다이트 결합을 갖는다. 일부 실시 형태에서, "핵산"은 하나 이상의 천연 뉴클레오시드(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘)이거나, 이들을 포함하거나, 이들로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, "핵산"은 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화 염기, 삽입된(intercalated) 염기, 및 이들의 조합)이거나, 이들을 포함하거나, 이들로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, "핵산"은 천연 핵산 내에서와 비교하여 하나 이상의 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, "핵산"은 RNA 또는 단백질과 같은 기능적 유전자 생성물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, "핵산"은 하나 이상의 인트론을 포함한다. 일부 실시 형태에서, "핵산"은 하나 이상의 엑손을 포함한다. 일부 실시 형태에서, "핵산"은 천연 공급원으로부터의 단리, 상보적인 주형에 기반한 중합에 의한 효소적 합성(생체내 또는 시험관내), 재조합 세포 또는 시스템에서의 복제, 및 화학적 합성 중 하나 이상에 의해 제조된다. 일부 실시 형태에서, "핵산"은 길이가 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 20개, 225개, 250개, 275개, 300개, 325개, 350개, 375개, 400개, 425개, 450개, 475개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1500개, 2000개, 2500개, 3000개, 3500개, 4000개, 4500개, 5000개 또는 그 이상인 잔기이다. 일부 실시 형태에서, "핵산"은 단일 가닥이고; 일부 실시 형태에서, "핵산"은 이중 가닥이다. 일부 실시 형태에서, "핵산"은, 폴리펩티드를 인코딩하거나 이를 인코딩하는 서열의 상보체인, 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, "핵산"은 효소 활성을 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 문구 "작동가능하게 연결된"은 기술된 성분들이 그들의 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병치(juxtaposition)를 포함한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 양립가능한 조건 하에서 달성되는 방식으로 결찰된다. "작동가능하게 연결된" 서열은 관심 유전자와 인접해 있는 발현 제어 서열과, 관심 유전자를 제어하기 위해 거리를 두고 작용하거나 트랜스(trans)로 작용하는 발현 제어 서열 둘 모두를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "발현 제어 서열"은, 이들이 결찰되는 코딩 서열의 발현 및 처리를 수행하는 데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열들을 포함한다. "발현 제어 서열"은, 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 처리 신호, 예를 들어 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 요망되는 경우, 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 이러한 제어 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 상이하다. 예를 들어, 원핵생물의 경우, 이러한 제어 서열은 대체로 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함하는 한편, 진핵생물의 경우, 전형적으로 이러한 제어 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "제어 서열"은 발현 및 처리에 이들의 존재가 필수적인 성분들을 포함하려는 것이며, 또한 이들의 존재가 유리한 추가 성분들, 예를 들어 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 임의의 중합체 사슬을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드는 자연계에서 발생하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드는 자연계에서 발생하지 않는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드는 서로 별개로 자연계에서 발생하는 부분들(즉, 둘 이상의 상이한 유기체로부터의 부분들, 예를 들어 인간 부분과 비인간 부분)을 함유하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드는 인간 손의 작용을 통해 설계되고/되거나 생성된다는 점에서 유전자조작된 아미노산 서열을 갖는다.
질병, 장애, 및/또는 질환의 발생과 관련하여 사용되는 경우, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "예방한다" 또는 "예방"은, 질병, 장애 및/또는 질환의 발병 위험을 감소시키고/시키거나 질병, 장애 또는 질환의 하나 이상의 특징 또는 증상의 개시를 지연시키는 것을 포함한다. 예방은 질병, 장애 또는 질환의 개시가 사전 정의된 기간 동안 지연된 경우 완료된 것으로 간주될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "재조합"은 재조합 수단에 의해 설계, 유전자조작, 제조, 발현, 생성 또는 단리된 폴리펩티드(예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 PD-L1 폴리펩티드), 예를 들어 숙주 세포에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 폴리펩티드, 재조합성 조합 인간 폴리펩티드 라이브러리로부터 단리된 폴리펩티드(문헌[Hoogenboom H. R., 1997 TIB Tech. 15:62-70]; 문헌[Hoogenboom H., and Chames P., 2000, Immunology Today 21:371-378]; 문헌[Azzazy H., and Highsmith W. E., 2002, Clin. Biochem. 35:425-445; 문헌[Gavilondo J. V., and Larrick J. W., 2002, BioTechniques 29:128-145]), 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자도입된 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체(예를 들어, 문헌[Taylor, L. D., et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295]; 문헌[Little M. et al., 2000, Immunology Today 21:364-370]; 문헌[Kellermann S. A. and Green L. L., 2002, Current Opinion in Biotechnology 13:593-597]; 문헌[Murphy, A.J., et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111(14):5153-5158] 참조) 또는 선택된 서열 요소들을 서로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 폴리펩티드를 지칭하려는 것이다. 일부 실시 형태에서, 이러한 선택된 서열 요소들 중 하나 이상은 자연계에서 발견된다. 일부 실시 형태에서, 이러한 선택된 서열 요소들 중 하나 이상은 가상으로(in silico) 설계된다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 이러한 선택된 서열 요소는, 예를 들어 천연 또는 합성 공급원으로부터의, 공지된 서열 요소의 (예를 들어, 생체내 또는 시험관내) 돌연변이유발에 기인한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 재조합 폴리펩티드는 관심 공급원 유기체(예를 들어, 인간, 마우스 등)의 게놈에서 발견되는 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 재조합 폴리펩티드는 2개의 상이한 유기체(예를 들어, 인간과 비인간 유기체)에서 서로 별개로 자연계에서 발생하는 서열(즉, 둘 이상의 상이한 유기체로부터의 것, 예를 들어 인간 부분과 비인간 부분)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 재조합 폴리펩티드는 (예를 들어, 시험관내 또는 생체내, 예컨대 비인간 동물에서의) 돌연변이유발로부터 생성된 아미노산 서열을 가지므로, 이 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 폴리펩티드 서열로부터 비롯되며 이와 관련되지만 생체내에서 비인간 동물의 게놈 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
용어 "대체"는 숙주 유전자좌 내(예를 들어, 게놈 내)에서 발견되는 "대체된" 핵산 서열(예를 들어, 유전자)을 그 유전자좌로부터 제거하고 그 자리에 상이한 "대체" 핵산을 위치시키는 과정을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 일부 실시 형태에서, 대체된 핵산 서열과 대체 핵산 서열은, 예를 들어 이들이 서로 상동성이고/이거나 상응하는 요소(예를 들어, 단백질 코딩 요소, 조절 요소 등)를 함유한다는 점에서 서로 필적한다. 일부 실시 형태에서, 대체된 핵산 서열은 프로모터, 인핸서, 스플라이스 도너(donor) 부위, 스플라이스 리시버(receiver) 부위, 인트론, 엑손, 비번역 영역(UTR) 중 하나 이상을 포함하고; 일부 실시 형태에서, 대체 핵산 서열은 하나 이상의 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 대체 핵산 서열은 대체된 핵산 서열의 호모로그이다. 일부 실시 형태에서, 대체 핵산 서열은 대체된 서열의 오르토로그이다. 일부 실시 형태에서, 대체 핵산 서열은 인간 핵산 서열이거나 이를 포함한다. 대체 핵산 서열이 인간 핵산 서열이거나 이를 포함하는 경우를 포함하는 일부 실시 형태에서, 대체된 핵산 서열은 설치류 서열(예를 들어, 마우스 또는 래트 서열)이거나 이를 포함한다. 그렇게 배치된 핵산 서열은 그렇게 배치된 서열을 얻는 데 사용되는 공급원 핵산 서열의 일부인 하나 이상의 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 5'-비번역 영역 또는 3'-비번역 영역 등)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시 형태에서, 대체는, 내인성 서열의 발현이 아닌 그렇게 배치된 핵산 서열(이종성 서열을 포함함)로부터의 유전자 생성물의 생성을 초래하는, 내인성 서열의 이종성 서열로의 치환이며; 대체는 내인성 서열에 의해 인코딩되는 단백질과 유사한 기능을 갖는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 의한 내인성 게놈 서열의 치환(예를 들어, 내인성 게놈 서열은 PD-L1 단백질을 인코딩하고, DNA 단편은 하나 이상의 인간 PD-L1 단백질을 인코딩함)이다. 다양한 실시 형태에서, 내인성 유전자 또는 이의 단편은 상응하는 인간 유전자 또는 이의 단편으로 대체된다. 상응하는 인간 유전자 또는 이의 단편은, 대체되는 내인성 유전자 또는 이의 단편의 오르토로그이거나, 구조 및/또는 기능에 있어서 이와 실질적으로 유사하거나 동일한 인간 유전자 또는 단편이다.
용어 "기준"은 관심 작용제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값이 비교되는 표준 또는 대조 작용제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값을 기술하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 일부 실시 형태에서, 기준 작용제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은, 관심 작용제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값의 시험 또는 결정과 실질적으로 동시에 시험되고/되거나 결정된다. 일부 실시 형태에서, 기준 작용제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은, 선택적으로 유형적 매체에 들어 있는, 과거의 기준이다. 일부 실시 형태에서, 기준은 대조군을 지칭할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "기준"은 "기준 동물"을 포함할 수 있다. "기준 동물"은 본 명세서에 기술된 바와 같은 변형을 갖거나, 본 명세서에 기술된 것과 상이한 변형을 갖거나, 변형을 갖지 않을(즉, 야생형 동물일) 수 있다. 전형적으로, 당업자에게 의해 이해되는 바와 같이, 기준 작용제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은, 관심 작용제, 동물(예를 들어, 포유류), 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값을 결정 또는 특성규명하는 데 이용되는 것들에 필적하는 조건 하에서 결정 또는 특성규명된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로"는 관심 특징 또는 특성의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 조건을 포함한다. 생물학 분야의 당업자는 생물학적 및 화학적 현상이, 설사 있다고 해도 드물게, 완성되고/되거나 완전성에 이르거나 절대적인 결과를 달성 또는 회피함을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재된 완전성의 잠재적인 부족을 포착하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 문구 "실질적 상동성"은 아미노산 또는 핵산 서열들 사이의 비교를 포함한다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 2개의 서열은 이들이 상응하는 위치에 상동성 잔기를 함유하는 경우 대체로 "실질적으로 상동성"인 것으로 간주된다. 상동성 잔기는 동일한 잔기일 수 있다. 대안적으로, 상동성 잔기는 적절하게 유사한 구조적 및/또는 기능적 특징을 갖는 동일하지 않은 잔기일 수 있다. 예를 들어, 당업자에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 특정 아미노산은 전형적으로 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산으로 분류되고/되거나 "극성" 또는 "비극성" 측쇄를 갖는 것으로 분류된다. 하나의 아미노산을 동일한 유형의 다른 아미노산으로 치환하는 것은 종종 "상동성" 치환으로 간주될 수 있다. 전형적인 아미노산 범주화가 표 1 및 표 2에 요약되어 있다.
[표 1]

[표 2]

당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 상업용 컴퓨터 프로그램으로 입수가능한 것들, 예를 들어 뉴클레오티드 서열의 경우 BLASTN 및 아미노산 서열의 경우 BLASTP, 갭 도입(gapped) BLAST, 및 PSI-BLAST를 포함하는 다양한 알고리즘 중 어느 것을 사용하여 비교될 수 있다. 예시적인 이러한 프로그램은 문헌[Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410]; 문헌[Altschul, S. F. et al., 1997, Methods in Enzymology]; 문헌[Altschul, S. F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402]; 문헌[Baxevanis, A.D., and B. F. F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998]; 및 문헌[Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998]에 기술되어 있다. 상동성 서열을 식별하는 것 이외에, 상기 언급된 프로그램은 전형적으로 상동성 정도의 표시를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 2개의 서열은, 이들의 상응하는 잔기 중 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 잔기의 관련 스트레치(stretch)에 걸쳐 상동성인 경우 실질적으로 상동성인 것으로 간주된다. 일부 실시 형태에서, 관련 스트레치는 완전한 서열이다. 일부 실시 형태에서, 관련 스트레치는 적어도 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개 또는 그 이상의 잔기이다. 일부 실시 형태에서, 관련 스트레치는 완전한 서열을 따라 인접한 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 관련 스트레치는 완전한 서열을 따라 불연속 잔기, 예를 들어 폴리펩티드 또는 이의 부분의 폴딩된 형태에 의해 모아진 비인접 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 관련 스트레치는 적어도 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개 또는 그 이상의 잔기이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 문구 "실질적 동일성"은 아미노산 또는 핵산 서열들 사이의 비교를 포함한다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 2개의 서열은 이들이 상응하는 위치에 동일한 잔기를 함유하는 경우 대체로 "실질적으로 동일한"인 것으로 간주된다. 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 상업용 컴퓨터 프로그램으로 입수가능한 것들, 예를 들어 뉴클레오티드 서열의 경우 BLASTN 및 아미노산 서열의 경우 BLASTP, 갭 도입 BLAST, 및 PSI-BLAST를 포함하는 다양한 알고리즘 중 어느 것을 사용하여 비교될 수 있다. 예시적인 이러한 프로그램은 문헌[Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410]; 문헌[Altschul, S. F. et al., 1997, Methods in Enzymology]; 문헌[Altschul, S. F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402]; 문헌[Baxevanis, A.D., and B. F. F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998]; 및 문헌[Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998]에 기술되어 있다. 동일한 서열을 식별하는 것 외에도, 상기 언급된 프로그램은 전형적으로 동일성 정도의 표시를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 2개의 서열은, 이들의 상응하는 잔기 중 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 잔기의 관련 스트레치에 걸쳐 동일한 경우 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 일부 실시 형태에서, 관련 스트레치는 완전한 서열이다. 일부 실시 형태에서, 관련 스트레치는 적어도 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개 또는 그 이상의 잔기이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 문구 "표적화 벡터" 또는 "표적화 작제물"은 표적화 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 표적화 영역은 표적 세포, 조직 또는 동물의 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하며, 상동 재조합을 통해 세포, 조직 또는 동물의 게놈 내의 위치로의 표적화 작제물의 통합을 제공한다. 부위 특이적 재조합효소 인식 부위(예를 들어 loxP 또는 Frt 부위)를 사용하여 표적화하는 표적화 영역도 포함된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 표적화 작제물은, 특정의 관심 핵산 서열 또는 유전자, 선택가능 마커, 제어 및/또는 조절 서열, 및 이러한 서열을 수반하는 재조합에 도움을 주거나 이를 용이하게 하는 단백질의 외인성 첨가를 통해 매개되는 재조합을 가능하게 하는 다른 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 표적화 작제물은, 내인성 서열에 의해 인코딩되는 단백질과 유사한 기능을 갖는 단백질의 전부 또는 일부를 인코딩하는 이종성 유전자인 관심 유전자의 전부 또는 일부를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 표적화 작제물은, 내인성 서열에 의해 인코딩되는 단백질과 유사한 기능을 갖는 단백질의 전부 또는 일부를 인코딩하는 관심 인간화 유전자의 전부 또는 일부를 추가로 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "변이체"는 기준 엔티티와 유의한 구조적 동일성을 나타내지만 기준 엔티티와 비교하여 하나 이상의 화학적 모이어티(moiety)의 존재 또는 수준에서 기준 엔티티와 구조적으로 상이한 엔티티를 포함한다. 다수의 실시 형태에서, "변이체"는 또한 이의 기준 엔티티와 기능적으로 상이하다. 대체로, 특정 엔티티가 기준 엔티티의 "변이체"로 적절히 간주되는지의 여부는 기준 엔티티와 이의 구조적 동일성 정도에 기반한다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 기준 엔티티는 특정의 특징적 구조 요소를 갖는다. "변이체"는 정의하자면 하나 이상의 그러한 특징적 구조 요소를 공유하는 별개의 화학적 엔티티이다. 몇 가지 예를 들면, 작은 분자는, 특징적 코어 구조 요소(예를 들어, 거대고리 코어) 및/또는 하나 이상의 특징적 펜던트(pendent) 모이어티를 가질 수 있어서, 이 작은 분자의 변이체는 코어 구조 요소와 특징적 펜던트 모이어티는 공유하지만 다른 펜던트 모이어티 및/또는 코어 내에 존재하는 결합의 유형(단일 대 이중, E 대 Z 등)은 상이한 것이고, 폴리펩티드는 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖고/갖거나 특정 생물학적 기능에 기여하는 복수의 아미노산으로 이루어진 특징적 서열 요소를 가질 수 있고, 핵산은 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖는 복수의 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 특징적 서열 요소를 가질 수 있다. 예를 들어, "변이체 폴리펩티드"는 아미노산 서열의 하나 이상의 차이 및/또는 폴리펩티드 골격에 공유 결합된 화학적 모이어티(예를 들어, 탄수화물, 지질 등)의 하나 이상의 차이의 결과로서 기준 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 일부 실시 형태에서, "변이체 폴리펩티드"는 기준 폴리펩티드와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 99%의 전반적 서열 동일성을 나타낸다. 대안적으로 또는 부가적으로, 일부 실시 형태에서, "변이체 폴리펩티드"는 기준 폴리펩티드와 적어도 하나의 특징적 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 기준 폴리펩티드는 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, "변이체 폴리펩티드"는 기준 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 공유한다. 일부 실시 형태에서, "변이체 폴리펩티드"는 기준 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성이 결여되어 있다. 일부 실시 형태에서, "변이체 폴리펩티드"는 기준 폴리펩티드와 비교하여 감소된 수준의 하나 이상의 생물학적 활성을 나타낸다. 다수의 실시 형태에서, 관심 폴리펩티드는, 이러한 관심 폴리펩티드가 특정 위치에서의 소수의 서열 변경을 제외하고는 모체(parent)의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 경우 모 폴리펩티드 또는 기준 폴리펩티드의 "변이체"로 간주된다. 전형적으로, 모체와 비교하여 변이체 내의 잔기의 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만이 치환된다. 일부 실시 형태에서, "변이체"는 모체와 비교하여 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 1개의 치환된 잔기를 갖는다. 종종, "변이체"는 매우 적은 수(예를 들어, 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 2개 미만, 또는 1개 미만)의 치환된 기능적 잔기(즉, 특정 생물학적 활성에 참여하는 잔기)를 갖는다. 또한, "변이체"는 전형적으로 모체와 비교하여 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 부가 또는 결실을 가지며 종종 부가 또는 결실을 갖지 않는다. 더욱이, 임의의 부가 또는 결실은 전형적으로 약 25개 미만, 약 20개 미만, 약 19개 미만, 약 18개 미만, 약 17개 미만, 약 16개 미만, 약 15개 미만, 약 14개 미만, 약 13개 미만, 약 10개 미만, 약 9개 미만, 약 8개 미만, 약 7개 미만, 약 6개 미만의 잔기이며, 통상적으로 약 5개 미만, 약 4개 미만, 약 3개 미만, 또는 약 2개 미만의 잔기이다. 일부 실시 형태에서, 모 폴리펩티드 또는 기준 폴리펩티드는 자연계에서 발견되는 것이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 관심의 특정 폴리펩티드의 복수의 변이체가, 특히 이 관심 폴리펩티드가 감염체(infectious agent) 폴리펩티드인 경우, 자연계에서 통상적으로 발견될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 이에 회합된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 숙주 세포, 예를 들어 진핵 세포 및/또는 원핵 세포에서 이에 연결된 핵산의 염색체외 복제 및/또는 발현을 수행할 수 있다. 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"라 지칭된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "야생형"은 자연계에서 (돌연변이, 병든, 변경된 등과 대비하여) "정상" 상태 또는 상황에서 발견되는 바와 같은 구조 및/또는 활성을 갖는 엔티티를 포함하는 이의 당업계에서 이해되는 의미를 갖는다. 당업자는 야생형 유전자 및 폴리펩티드가 종종 다수의 상이한 형태(예를 들어, 대립유전자)로 존재함을 인식할 것이다.

본 발명은 다른 것들 중에서 암, 자가면역 질병 및 감염성 병원체의 치료뿐만 아니라 면역 세포 반응 및 기능의 검정을 위한 PD-L1 조정자(예를 들어, 항-PD-L1 항체)의 치료 효능을 결정하기 위해 프로그램된 사멸-리간드 1(Programmed death-ligand 1)(PD-L1) 폴리펩티드를 인코딩하는 인간화 유전 물질을 갖는 개선된 및/또는 유전자조작된 비인간 동물을 제공한다. 이러한 비인간 동물은 PD-L1 조정자의 치료 효능 및 PD-1:PD-L1 (또는 PD-L1:B7-1) 차단에 대한 이의 잠재력을 결정하는 데 있어서 개선점을 제공할 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명은 다양한 암, 자가면역 질병의 치료를 위해서뿐만 아니라 면역 반응을 증강시켜 감염 원인을 치료 및/또는 개선하기 위해 항-PD-L1을 그리고 일부 실시 형태에서는 항-PD-1 요법을 개발하는 데 특히 유용하다. 특히, 본 발명은 비인간 동물의 세포 표면 상에서의 인간화 PD-L1 폴리펩티드의 발현을 초래하는 설치류 CD274 유전자의 인간화를 포함한다. 이러한 인간화 PD-L1 비인간 동물은 항종양 면역 반응을 촉진하는 항-PD-L1 치료제의 효능을 결정하기 위해 인간 PD-L1⁺ 세포의 공급원을 제공하는 능력을 갖는다. 이러한 인간화 PD-L1 비인간 동물은 또한 자가면역 질병, 장애, 또는 질환을 개선하는 항-PD-L1 치료제의 효능을 결정하기 위해 인간 PD-L1⁺ 세포의 공급원을 제공하는 능력을 갖는다. 또한, 이러한 인간화 PD-L1 비인간 동물은 다양한 암, 자가면역 질병 및 감염성 질병을 치료하기 위한 항-PD-L1 치료제의 스크리닝 및 개발을 위한 생체내 시스템을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 치료 효능은 본 발명의 비인간 동물에서 질병, 장애, 또는 질환의 징후 및/또는 증상의 감소 또는 소멸에 의해 입증될 수 있고; 일부 실시 형태에서는 질병, 장애, 또는 질환의 징후 및 증상의 전부가 아닌 일부의 감소 또는 소멸에 의해 입증될 수 있고; 일부 실시 형태에서는 질병, 장애, 또는 질환이 여전히 비인간 동물의 몸에 있을 수 있지만 질병, 장애, 또는 질환의 모든 징후 또는 증상의 감소 또는 소멸에 의해 입증될 수 있다. 다양한 실시 형태에서, 질병, 장애 또는 질환은 암과 관련된다. 다양한 실시 형태에서, 질병, 장애 또는 질환은 자가면역 질병, 장애 또는 질환과 관련된다. 다양한 실시 형태에서, 질병, 장애 또는 질환은 감염성 병원체(예를 들어, 세균)와 관련된다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 비인간 동물의 세포 표면 상에 발현되는 인간화 PD-L1 폴리펩티드를 통한 PD-1:PD-L1 신호전달의 차단을 통해 조정된 면역 반응을 입증한다. 일부 실시 형태에서, 인간화 PD-L1 폴리펩티드는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 면역글로불린 V 및 C 도메인의 전부 또는 일부에 상응하는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 인간화 PD-L1 폴리펩티드는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 세포외 도메인의 실질적으로 전부에 상응하는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 인간화 PD-L1 폴리펩티드는 설치류 PD-L1 폴리펩티드의 세포질 도메인에 상응하는 서열을 갖고; 일부 실시 형태에서는 설치류 PD-L1 폴리펩티드의 막관통 및 세포질 도메인에 상응하는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 인간화 PD-L1 폴리펩티드는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 아미노산 잔기 19-238(또는 19-227, 또는 19-131)에 상응하는 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 비인간 동물 및 이종성 종(예를 들어, 인간)으로부터의 유전 물질을 함유하는 CD274 유전자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간 CD274 유전자의 엑손 3, 엑손 4, 및 엑손 5의 전부 또는 일부를 포함하는 인간화 CD274 유전자를 포함한다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 엑손 3에 상응하는 약 4,494 bp의 인간 CD274 유전자 및 엑손 3의 3'의 약 4,160 bp의 인간 게놈 서열을 포함하는 인간화 CD274 유전자를 포함한다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간 CD274 유전자의 엑손 4의 5'의 약 1,253 bp의 인간 게놈 서열, 엑손 4, 인트론 4 및 엑손 5의 처음 32 bp에 상응하는 약 3,950 bp의 인간 CD274 유전자를 포함하는 인간화 CD274 유전자를 포함한다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 부위 특이적 재조합 부위(예를 들어, loxP 부위)와 병치된 약 4,494 bp 및 약 3,950 bp의 인간 CD274 유전자를 포함하는 인간화 CD274 유전자를 포함하며, 이러한 4,494 bp 및 3,950 bp는 인간 CD274 유전자의 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 처음 32 bp에 상응한다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간 CD274 유전자의 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 처음 32 bp에 상응하는 약 8,444 bp의 인간 CD274 유전자를 포함하는 인간화 CD274 유전자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트와 같은 설치류)은 비인간 Cd274 유전자(예를 들어, 내인성 비인간 Cd274 유전자)의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 5의 부분, 엑손 6 및 엑손 7에 작동가능하게 연결된 인간 CD274 유전자의 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 부분을 포함하는 인간화 CD274 유전자를 포함하고; 특정 실시 형태에서, 인간화 CD274 유전자는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 세포외 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부 및 비인간 PD-L1 폴리펩티드의 막관통 및 세포질 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함하는 인간화 PD-L1 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 도 2에 도시된 인간화 CD274 유전자를 포함한다.

본 발명의 다양한 태양은 하기 섹션에 상세히 설명되어 있다. 섹션의 사용은 본 발명을 제한하려고 하는 것이 아니다. 각 섹션은 본 발명의 임의의 태양에 적용될 수 있다. 본 출원을 통해, "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다.

분화 클러스터 274(CD274) 유전자

프로그램된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1, 이는 B7-H1로도 지칭됨)로 명명되는 폴리펩티드를 인코딩하는 CD274는 B7 패밀리 구성원인 B7-1 및 B7-2를 사용하여 인간 발현 서열 태그(EST) 데이터베이스를 검색함으로써 알아내었다(문헌[Dong, H. et al., 1999, Nature Med. 5(12):1365-1369]; 문헌[Freeman, G. J. et al., 2000, J. Exp. Med. 192(7):1027-1034]). CD274 유전자는, 각각이 PD-L1 폴리펩티드의 구별되는 부분을 인코딩하는 7개의 엑손으로 이루어진다: 엑손 1: 비코딩이며 5'UTR를 함유함; 엑손 2: 신호 서열; 엑손 3: 면역글로불린 V(IgV) 도메인; 엑손 4: 면역글로불린 C(IgC) 도메인; 엑손 5: 세포외 도메인 및 막관통 도메인의 C-말단부; 엑손 6: 세포내 도메인; 및 엑손 7: 세포내 도메인의 약 6개 아미노산 잔기 및 3'UTR. PD-L1 폴리펩티드는 낮은 퍼센트 서열 동일성(약 20%)에도 불구하고 다른 B7 패밀리 구성원(B7-1 및 B7-2)과 공통적인 구조적 구성을 공유한다. 대조적으로, 마우스와 인간의 PD-L1 폴리펩티드 서열은 약 70% 서열 동일성을 공유한다(상기 문헌[Freeman, G. J. et al.] 참조). PD-L1은 심장, 골격근, 태반, 및 폐에서 강하게 발현되고, 흉선, 비장, 신장 및 간에서 약하게 발현되며, 뇌, 결장 또는 소장에서는 발현되지 않는다(상기 문헌[Dong, H. et al.] 참조). 또한, PD-L1은 마우스의 T 세포, B 세포, 골수 세포(예를 들어, 수지상 세포, 대식세포, 비만 세포 등) 및 각질세포 상에 항시적으로 발현되는 반면, 인간의 동일한 세포에서의 발현은 활성화 후에 이루어지는 것으로 보고되어 있다(예를 들어, 문헌[Keir, M.E., et al., 2008, Annu. Rev. Immunol. 26:677-704]에서 검토됨). 실제로, 마우스 및 인간 유전자 둘 모두에 대한 CD274 프로모터는 인터페론 조절 인자 1(IRF-1)에 대한 결합 부위를 함유하는 것으로 보고되었으며, 이는 인간 암 세포에서 PD-L1 상향 조절을 담당하는 것으로 제안되었다(문헌[Lee, S. J. et al., 2006, FEBS Lett. 580(3):755-762]). PD-L1 스플라이스 변이체가 보고되었지만(예를 들어, 아래 및 문헌[He, X. H. et al., 2005, Acta Pharmacol Sin. 26(4):462-468] 참조), 임의의 질병과의 인과 관계는 아직 발견되지 않았다. PD-L1은 PD-1과 구조적으로 유사한 다른 단백질(CTLA4, CD28, ICOS)과의 어떠한 상호작용도 없이 독점적으로 PD-1과 결합한다(상기 문헌[Dong, H. et al.] 및 문헌[Freeman, G. J. et al.] 참조). PD-1과의 PD-L1 결합은 면역 세포에서 다양한 자극 또는 억제 기능을 유발하며, 이러한 기능 중 일부는 세포 증식, 사이토카인 생성, 및 T 세포 수용체 및 B 세포 수용체 신호전달을 포함한다. PD-L1(뿐만 아니라 PD-L2)은 또한 양방향 신호전달에 관여하는 것으로 제안되었다(예를 들어, 문헌[Dong, H. et al., 2003, J. Clin. Invest. 111:363-370]; 문헌[Kuipers, H. et al., 2006, Eur. J. Immunol. 36:2472-2782] 참조). 흥미롭게도, PD-L1은 CD28에 대한 리간드인 B7-1(CD80)과 결합하는 것으로 밝혀졌지만, CD28 자체와의 상호작용은 보고되지 않았다(문헌[Butte, M. J. et al., 2007, Immunity 27:111-122]). B7-1과의 이러한 독특한 상호작용은 T 세포 반응과 관용의 조절에서 이의 관련성에 대해 특히 중요하였다. 실제로, 이의 보조자극 및 보조억제 기능에 의해 제공되는 다수의 기능적 결과로 인해, PD-L1은 자가면역 질병과 염증성 질병의 치료뿐만 아니라 암의 치료를 위한 잠재적 표적으로서 많은 관심을 끌어왔다. 사실, 항-PD-L1 요법은 현재 인간 임상 실험에서 시험 중에 있다(예를 들어, 문헌[Pedoeem, A. et al., 2014, Clin. Immunol. 153:145-152]; 및 문헌[Philips, G.K. and Atkins, M., 2014, Intern. Immunol. 8 pages] 참조).

PD-L1을 발현하는 많은 세포 유형(예를 들어, 비림프계 세포)에 걸친 PD-L1 매개 기능 및 다른 B7 패밀리 구성원과의 독특한 상호작용의 더 철저하고 상세한 이해는 장래에 암 및 자가면역의 치료를 위한 실제적인 표적 요법을 개발하는 데 필요하다.

CD274 및 PD-L1(B7-H1) 서열

예시적인 뮤린, 인간 및 인간화 CD274 및 PD-L1 서열이 도 6에 제시되어 있다. 비인간 CD274 유전자의 인간화를 위한 예시적인 인간 핵산 서열이 또한 도 6에 제시되어 있다. mRNA 서열의 경우, 굵은 글꼴은 코딩 서열을 나타내며, 연속된 엑손은 표시되는 경우 밑줄이 그어진 텍스트가 번갈아 나오게 함으로써 구분되고; 인간화 mRNA 서열의 경우, 인간 서열은 괄호 안에 들어 있다. 단백질 서열의 경우, 신호 펩티드는 밑줄이 그어져 있고, 세포외 서열은 굵은 글꼴이고, 면역글로불린 V(IgV) 도메인 서열은 괄호 안에 있고, 세포내 서열은 이탤릭체이고; 인간화 단백질 서열의 경우, 비인간 서열은 보통 글꼴로 표시되고, 인간 서열은 굵은 글꼴로 표시된다.

CD274 전사체 변이체는 당업계에 공지되어 있다. 하나의 전사체 변이체는 정준 서열(canonical sequence)과 비교하여 5' 코딩 영역에서 인프레임(in-frame) 엑손이 결여되어 있으며(도 6 참조), 잔기 17-130(즉, IgV 도메인 + 약 5개의 아미노산 잔기)의 결실을 초래한다. 이 변이체의 mRNA 및 단백질 서열은, 본 명세서에 참고로 포함되는, Genbank 수탁 번호 NM_001267706.1 및 NP_001254635.1에서 각각 발견될 수 있다. 다른 변이체는 K178D 치환 및 잔기 179-290의 결실을 갖는 가용성 단백질을 인코딩한다. 이 변이체의 mRNA 및 단백질 서열은, 본 명세서에 참고로 포함되는, Genbank 수탁 번호 XM_006716759.1 및 XP_006716822.1에서 각각 발견될 수 있다. 세 번째 변이체는 정준 서열과 비교하여 대체 내부 세그먼트가 결여되어 있는 것으로 기술되었고(NR_052005.1), 따라서 비코딩 변이체로서 표시되는데, 이는 5'-최대 지지(most supported) 번역 개시 코돈의 사용이 전사체를 넌센스 매개 mRNA 붕괴(NMD)에 대한 후보가 되게 하기 때문이다. 다른 아이소폼은 본 명세서에 참고로 포함되는 WO 2014/197369호에 기술되어 있다.

인간화 CD274 비인간 동물

PD-L1 폴리펩티드를 인코딩하는 비인간 동물의 내인성 유전자좌(예를 들어, CD274 유전자좌)의 유전자 변형에 기인하여 비인간 동물의 세포 표면 상에 인간화 PD-L1 폴리펩티드를 발현하는 비인간 동물이 제공된다. 본 명세서에 기술된 적합한 예는 설치류, 일부 실시 형태에서는 마우스를 포함한다.

인간화 CD274 유전자는 일부 실시 형태에서는 이종성 종(예를 들어, 인간)으로부터의 유전 물질을 포함하며, 인간화 CD274 유전자는 이종성 종으로부터의 유전 물질의 인코딩된 부분을 포함하는 PD-L1 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 인간화 CD274 유전자는 세포의 원형질 막 상에 발현되는 PD-L1 폴리펩티드의 세포외 부분을 인코딩하는 이종성 종의 게놈 DNA를 포함한다. 상기 인간화 CD274 유전자를 함유하는 비인간 동물, 비인간 배아 및 세포를 제조하기 위한 비인간 동물, 배아, 세포 및 표적화 작제물이 또한 제공된다.

일부 실시 형태에서, 내인성 CD274 유전자는 결실된다. 일부 실시 형태에서, 내인성 CD274 유전자는 변경되며, 내인성 CD274 유전자의 부분이 이종성 서열(예를 들어, 인간 CD274 서열의 전부 또는 일부)로 대체된다. 일부 실시 형태에서, 내인성 CD274 유전자의 전부 또는 실질적으로 전부가 이종성 유전자(예를 들어, 인간 CD274 유전자)로 대체된다. 일부 실시 형태에서, 이종성 CD274 유전자의 부분이 내인성 CD274 유전자좌에서 내인성 비인간 CD274 유전자에 삽입된다. 일부 실시 형태에서, 이종성 유전자는 인간 유전자이다. 일부 실시 형태에서, 변형 또는 인간화는 내인성 CD274 유전자의 2개 카피 중 하나에 대해 이루어지며, 이는 인간화 CD274 유전자에 대해 이형접합성인 비인간 동물을 발생시킨다. 다른 실시 형태에서, 인간화 CD274 유전자에 대해 동형접합성인 비인간 동물이 제공된다.

다양한 태양에서, 비인간 동물은 내인성 비인간 CD274 유전자좌에서 인간 CD274 유전자의 전부 또는 일부를 함유한다. 일부 실시 형태에서, 비인간 동물은 내인성 비인간 CD274 유전자좌 외부의 위치에 인간 CD274 유전자를 함유한다. 따라서, 이러한 비인간 동물은 이종성 CD274 유전자를 갖는 것으로 기술될 수 있다. 내인성 CD274 유전자좌(또는 내인성 CD274 유전자좌 외부)의 대체된, 삽입된, 변형된 또는 변경된 CD274 유전자 또는 이러한 유전자로부터 발현되는(또는 비인간 동물의 게놈의 다른 부분으로부터 발현되는) 폴리펩티드는, 예를 들어 PCR, 웨스턴 블롯, 서던 블롯, 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 또는 대립유전자 이득(gain) 또는 손실(loss) 검정을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 비인간 동물은 인간화 CD274 유전자에 대해 이형접합성이다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 도 6의 인간 CD274 mRNA 서열에 나타나는 세 번째 엑손과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 갖는 세 번째 엑손을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 도 6의 인간 CD274 mRNA 서열에 나타나는 세 번째 엑손과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 세 번째 엑손을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 도 6의 인간 CD274 mRNA 서열에 나타나는 세 번째 엑손과 동일한 서열을 갖는 세 번째 엑손을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 도 6의 인간 CD274 mRNA 서열에 나타나는 네 번째 엑손과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 갖는 네 번째 엑손을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 도 6의 인간 CD274 mRNA 서열에 나타나는 네 번째 엑손과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 네 번째 엑손을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 도 6의 인간 CD274 mRNA 서열에 나타나는 네 번째 엑손과 동일한 서열을 갖는 네 번째 엑손을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 도 6의 인간화 CD274 mRNA 서열에 나타나는 다섯 번째 엑손과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 갖는 다섯 번째 엑손을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 도 6의 인간화 CD274 mRNA 서열에 나타나는 다섯 번째 엑손과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 다섯 번째 엑손을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 도 6의 인간화 CD274 mRNA 서열에 나타나는 다섯 번째 엑손과 동일한 서열을 갖는 다섯 번째 엑손을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는, 각각이 도 6의 인간화 CD274 mRNA 서열에 나타나는 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 엑손과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 갖는 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 엑손을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는, 각각이 도 6의 인간화 CD274 mRNA 서열에 나타나는 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 엑손과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 엑손을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는, 각각이 도 6의 인간화 CD274 mRNA 서열에 나타나는 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 엑손과 동일한 서열을 갖는 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 엑손을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는, 각각이 도 6의 마우스 Cd274 mRNA 서열에 나타나는 첫 번째, 두 번째, 여섯 번째 및 일곱 번째 엑손과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 갖는 첫 번째, 두 번째, 여섯 번째 및 일곱 번째 엑손을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는, 각각이 도 6의 마우스 Cd274 mRNA 서열에 나타나는 첫 번째, 두 번째, 여섯 번째 및 일곱 번째 엑손과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 첫 번째, 두 번째, 여섯 번째 및 일곱 번째 엑손을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 인간화 CD274 유전자는, 각각이 도 6의 마우스 Cd274 mRNA 서열에 나타나는 첫 번째, 두 번째, 여섯 번째 및 일곱 번째 엑손과 동일한 서열을 갖는 첫 번째, 두 번째, 여섯 번째 및 일곱 번째 엑손을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 서열 번호 12와 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 포함하는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 서열 번호 12와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 서열 번호 12와 동일한 서열을 포함하는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 서열 번호 13 또는 서열 번호 16과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 포함하는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 서열 번호 13 또는 서열 번호 16과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 서열 번호 13 또는 서열 번호 16과 동일한 서열을 포함하는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 서열 번호 13과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 첫 번째 서열 및 서열 번호 16과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 두 번째 서열을 포함하는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 서열 번호 13과 실질적으로 동일한 첫 번째 서열 및 서열 번호 16과 실질적으로 동일한 두 번째 서열을 포함하는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 서열 번호 13과 동일한 첫 번째 서열 및 서열 번호 16과 동일한 두 번째 서열을 포함하는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 서열 번호 13, 서열 번호 16 및 부위 특이적 재조합효소 인식 부위를 포함하며, 상기 부위 특이적 재조합효소 인식 부위는 상기 인간화 CD274 유전자의 인트론 내에 위치한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 서열 번호 13, 서열 번호 16 및 loxP 부위를 포함하며, 상기 loxP 부위는 상기 인간화 CD274 유전자의 인트론 내에 위치한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 CD274 엑손 3과 CD274 엑손 4 사이에 인트론을 포함하는 CD274 유전자를 포함하며, 상기 인트론은 서열 번호 17과 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 CD274 엑손 3과 CD274 엑손 4 사이에 인트론을 포함하는 CD274 유전자를 포함하며, 상기 인트론은 서열 번호 17과 동일한 서열을 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 16 및 서열 번호 17을 포함하는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15 및 서열 번호 16을 포함하는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 도 6의 인간화 CD274 뉴클레오티드 코딩 서열에 나타나는 뉴클레오티드 코딩 서열과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 뉴클레오티드 코딩 서열(예를 들어, cDNA 서열)을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 도 6의 인간화 CD274 뉴클레오티드 코딩 서열에 나타나는 뉴클레오티드 코딩 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 코딩 서열(예를 들어, cDNA 서열)을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 도 6의 인간화 CD274 뉴클레오티드 코딩 서열에 나타나는 뉴클레오티드 코딩 서열과 동일한 뉴클레오티드 코딩 서열(예를 들어, cDNA 서열)을 갖는 CD274 유전자를 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 mRNA 서열은 도 6의 인간화 CD274 mRNA 서열과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 mRNA 서열은 도 6의 인간화 CD274 mRNA 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 mRNA 서열은 도 6의 인간화 CD274 mRNA 서열과 동일한 서열을 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 도 6의 PD-L1 폴리펩티드 서열과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 아미노산 서열을 갖는 PD-L1 폴리펩티드를 인코딩한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 도 6의 PD-L1 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 PD-L1 폴리펩티드를 인코딩한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간화 CD274 유전자는 도 6의 PD-L1 폴리펩티드 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 PD-L1 폴리펩티드를 인코딩한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6에 나타나는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 세포외 부분과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 아미노산 서열을 갖는 세포외 부분을 갖는다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6에 나타나는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 세포외 부분과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 세포외 부분을 갖는다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6에 나타나는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 세포외 부분과 동일한 아미노산 서열을 갖는 세포외 부분을 갖는다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6의 인간 또는 인간화 PD-L1 폴리펩티드에 나타나는 아미노산 잔기 19-131과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6의 인간 또는 인간화 PD-L1 폴리펩티드에 나타나는 아미노산 잔기 19-131과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6의 인간 또는 인간화 PD-L1 폴리펩티드에 나타나는 아미노산 잔기 19-131과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6의 인간 또는 인간화 PD-L1 폴리펩티드에 나타나는 아미노산 잔기 19-227과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6의 인간 또는 인간화 PD-L1 폴리펩티드에 나타나는 아미노산 잔기 19-227과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6의 인간 또는 인간화 PD-L1 폴리펩티드에 나타나는 아미노산 잔기 19-227과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6의 인간 또는 인간화 PD-L1 폴리펩티드에 나타나는 아미노산 잔기 19-238과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6의 인간 또는 인간화 PD-L1 폴리펩티드에 나타나는 아미노산 잔기 19-238과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6의 인간 또는 인간화 PD-L1 폴리펩티드에 나타나는 아미노산 잔기 19-238과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6에 나타나는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 면역글로불린 V(IgV) 도메인과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 아미노산 서열을 갖는 IgV 도메인을 갖는다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6에 나타나는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 면역글로불린 V(IgV) 도메인과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 IgV 도메인을 갖는다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6에 나타나는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 면역글로불린 V(IgV) 도메인과 동일한 아미노산 서열을 갖는 IgV 도메인을 갖는다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는, 각각이 도 6에 나타나는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 면역글로불린 V(IgV) 도메인 및 면역글로불린 C(IgC) 도메인과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 아미노산 서열을 갖는 IgV 도메인 및 IgC 도메인을 갖는다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는, 각각이 도 6에 나타나는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 면역글로불린 V(IgV) 도메인 및 면역글로불린 C(IgC) 도메인과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 IgV 도메인 및 IgC 도메인을 갖는다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는, 각각이 도 6에 나타나는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 면역글로불린 V(IgV) 도메인 및 면역글로불린 C(IgC) 도메인과 동일한 아미노산 서열을 갖는 IgV 도메인 및 IgC 도메인을 갖는다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는, 각각이 도 6에 나타나는 마우스 PD-L1 폴리펩티드의 막관통 도메인 및 세포내 도메인과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 아미노산 서열을 갖는 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 갖는다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는, 각각이 도 6에 나타나는 마우스 PD-L1 폴리펩티드의 막관통 도메인 및 세포내 도메인과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 갖는다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는, 각각이 도 6에 나타나는 마우스 PD-L1 폴리펩티드의 막관통 도메인 및 세포내 도메인과 동일한 아미노산 서열을 갖는 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 갖는다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6에 나타나는 인간화 PD-L1 폴리펩티드의 아미노산 서열과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6에 나타나는 인간화 PD-L1 폴리펩티드의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생성된 PD-L1 폴리펩티드는 도 6에 나타나는 인간화 PD-L1 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

특이적 다형성 형태, 대립유전자 변이체(예를 들어, 단일 아미노산 차이) 또는 대안적으로 스플라이싱된 아이소폼을 포함하는 인간화 PD-L1 폴리펩티드를 발현하는 비인간 동물을 제조하기 위한 조성물 및 방법이 제공되며, 이러한 조성물 및 방법은 인간 프로모터 및 인간 조절 서열(들)로부터 이러한 폴리펩티드를 발현하는 비인간 동물을 제조하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 내인성 프로모터 및 내인성 조절 서열(들)로부터; 일부 실시 형태에서는 내인성 설치류 프로모터 및 내인성 설치류 조절 서열(들)로부터 이러한 폴리펩티드를 발현하는 비인간 동물을 제조하는 조성물 및 방법이 또한 제공된다. 방법은 내인성 CD274 유전자에 상응하는 비인간 동물의 게놈의 정확한 위치에 인간 PD-L1 폴리펩티드(예를 들어, 인간 CD274 DNA 서열)의 전부 또는 일부를 인코딩하는 유전 물질을 삽입하여 전부 또는 일부가 인간인 PD-L1 폴리펩티드를 발현하는 인간화 CD274 유전자를 생성하는 것을 포함한다. 대안적으로, 인간 PD-L1 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 인코딩하는 유전 물질의 삽입은 비인간 동물의 게놈의 무작위 위치에서, 즉, 내인성 CD274 유전자의 외부에서 이루어질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 방법은 인간 CD274 유전자의 엑손 3 내지 엑손 5(또는 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 부분)에 상응하는 게놈 DNA를 비인간 동물의 내인성 CD274 유전자 내로 삽입함으로써 삽입된 엑손에 의해 인코딩되는 아미노산을 함유하는 인간 부분을 함유하는 PD-L1 폴리펩티드를 인코딩하는 인간화 유전자를 생성하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 방법은 전장(또는 cDNA) 인간 CD274 유전자에 상응하는 게놈 DNA를 비인간 동물의 게놈 내로 무작위로 삽입함으로써 전장 인간 PD-L1 폴리펩티드를 인코딩하는 인간 CD274 도입유전자를 생성하는 것을 포함한다.

적절한 경우, 인간 PD-L1 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 인코딩하는 유전 물질 또는 폴리뉴클레오티드 서열(들)의 코딩 영역은 비인간 동물에서의 발현에 최적화된 코돈을 포함하도록 변형될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,670,356호 및 미국 특허 제5,874,304호 참조). 코돈 최적화 서열은 합성 서열이며, 바람직하게는 코돈 최적화되지 않은 모 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 동일한 폴리펩티드(또는 전장 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 전장 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 단편)를 인코딩한다. 일부 실시 형태에서, 인간 PD-L1 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 인코딩하는 유전 물질의 코딩 영역은 특정 세포 유형(예를 들어, 설치류 세포)에 대한 코돈 사용빈도(codon usage)를 최적화하기 위해 변경된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비인간 동물(예를 들어, 설치류)의 내인성 CD274 유전자 내로 삽입될 인간 CD274 유전자의 엑손 3 내지 엑손 5(또는 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 부분)에 상응하는 게놈 DNA의 코돈은 비인간 동물의 세포에서의 발현에 최적화될 수 있다. 이러한 서열은 코돈 최적화 서열로서 기술될 수 있다.

인간화 CD274 유전자 접근법은 내인성 유전자의 비교적 최소의 변형을 이용하며, 비인간 동물에서 천연 CD274 매개(즉, PD-L1 매개) 신호 전달을 야기하는데, 이는 예를 들어 CD274 유전자의 게놈 서열이 단일 단편에서 변형되고, 따라서 필요한 조절 서열 및 일부 실시 형태에서는 인트론 서열을 포함시킴으로써 정상 기능성을 보유하기 때문이다. 따라서, 이러한 실시 형태에서, CD274 유전자 변형은 다른 주변 유전자 또는 다른 내인성 CD274 상호작용 유전자(예를 들어, Pdcd1 등)에 영향을 미치지 않는다. 또한, 다양한 실시 형태에서, 변형은 원형질 막 상에서의 기능적 PD-L1 막관통 폴리펩티드의 조립에 영향을 미치지 않으며, 변형에 의해 영향을 받지 않는 폴리펩티드의 세포질 부분과 결합 및 이를 통한 후속 신호 전달을 통해 정상적인 이펙터 기능을 유지한다.

설치류(예를 들어, 마우스) Cd274 유전자 및 인간 CD274 유전자의 게놈 구성의 개략도(일정한 비율에 따르지 않음)가 도 1에 제시되어 있다. 인간 CD274 유전자의 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 부분을 함유하는 게놈 단편을 사용하여 내인성 설치류(예를 들어, 마우스) Cd274 유전자를 인간화하기 위한 예시적인 작제물이 도 2에 제시되어 있다. 예시된 바와 같이, 인간 CD274 유전자의 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 부분을 함유하는 게놈 DNA는 표적화 작제물에 의해 내인성 설치류(예를 들어, 마우스) Cd274 유전자좌 내로 삽입된다. 이러한 게놈 DNA는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 세포외 부분(예를 들어, 아미노산 잔기 19-238)을 인코딩하는 유전자의 부분을 포함한다. 그렇게 요망되는 경우, 인간 CD274 유전자의 엑손 3 및 엑손 4를 함유하는 게놈 DNA는, 인간 PD-L1 폴리펩티드의 면역글로불린 V 도메인과 면역글로불린 C 도메인(예를 들어, 아미노산 잔기 19-227)을 인코딩하는 유전자의 부분을 포함하도록 표적화 작제물에 의해 내인성 설치류(예를 들어, 마우스) Cd274 유전자좌 내로 삽입될 수 있다. 대안적으로, 인간 CD274 유전자의 엑손 3만을 함유하는 게놈 DNA는, 인간 PD-L1 폴리펩티드의 면역글로불린 V 도메인(예를 들어, 아미노산 잔기 19-131)을 인코딩하는 유전자의 부분만을 포함하도록 표적화 작제물에 의해 내인성 설치류(예를 들어, 마우스) Cd274 유전자좌 내로 삽입될 수 있다. 본 개시내용을 읽은 당업자는, 요망되는 인코딩된 PD-L1 폴리펩티드에 따른 본 명세서에 기술된 방법에 따라 인간 CD274 유전자의 다양한 양의 유전 물질이 비인간 동물의 게놈 내로 삽입될 수 있음을 이해할 것이다.

내인성 CD274 유전자좌에 인간화 CD274 유전자를 갖는 비인간 동물(예를 들어, 마우스)은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 선택가능 마커 유전자와 함께 인간 CD274 유전자의 전부 또는 일부를 도입하는 표적화 벡터가 제조될 수 있다. 도 2는 인간 CD274 유전자의 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 부분(약 32 bp)의 삽입을 포함하는 마우스 게놈의 내인성 Cd274 유전자좌를 도시한다. 도시된 바와 같이, 표적화 작제물은 내인성 뮤린 Cd274 유전자의 엑손 3의 상류에 있는 서열을 함유하는 5' 상동성 아암(약 92.9 Kb), 이어서 인간 CD274 유전자의 엑손 3을 함유하는 게놈 DNA 단편(약 4494 bp), 내인성 뮤린 Cd274 유전자에 대해 반대의 전사 방향인 약물 선택 카세트(예를 들어, 양측 상에서 loxP 서열에 의해 플랭킹되는 네오마이신 내성 유전자; 약 5 Kb), 인간 CD274 유전자의 엑손 4 및 엑손 5의 부분을 함유하는 게놈 DNA 단편(약 3950 bp), 및 내인성 뮤린 Cd274 유전자의 엑손 5의 부분 및 엑손 6과 엑손 7을 함유하는 하류에 있는 게놈 서열을 함유하는 3' 상동성 아암(약 67.6 Kb)을 함유한다. 표적화 작제물은 자가 결실(self-deleting) 약물 선택 카세트(예를 들어, loxP 서열에 의해 플랭킹되는 네오마이신 내성 유전자; 모두가 본 명세서에 참고로 포함되는, 미국 특허 제8,697,851호, 미국 특허 제8,518,392호 및 미국 특허 제8,354,389호 참조)를 함유한다. 상동 재조합 시, 내인성 뮤린 Cd274 유전자의 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 부분은 표적화 벡터에 함유된 서열(즉, 인간 CD274 유전자의 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 부분)에 의해 대체되어, 약 8,964 bp의 결실을 야기한다. 인간화 CD274 유전자가 생성되며, 이는 인간 CD274 유전자의 삽입된 게놈 DNA에 의해 인코딩되는 아미노산을 함유하는 인간화 PD-L1 폴리펩티드를 발현하는 세포 또는 비인간 동물을 생성시킨다. 약물 선택 카세트는 발생 의존적 방식으로 제거되는데, 즉, 상기 기술된 인간화 CD274 유전자를 함유하는 생식선 세포를 갖는 마우스로부터 유래된 자손은 발생 동안 분화된 세포로부터 선택가능 마커를 탈락시킬 것이다.

마우스(즉, 인간 부분과 마우스 부분을 포함하는 PD-L1 폴리펩티드를 인코딩하는 CD274 유전자를 갖는 마우스)에서 인간화 CD274 유전자를 이용하는 실시 형태가 본 명세서에서 광범위하게 논의되어 있지만, 인간화 CD274 유전자를 포함하는 다른 비인간 동물이 또한 제공된다. 일부 실시 형태에서, 이러한 비인간 동물은 내인성 CD274 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간화 CD274 유전자를 포함한다. 일부 특정 실시 형태에서, 내인성 CD274 프로모터는 내인성 설치류 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 이러한 비인간 동물은 내인성 유전자좌로부터 인간 PD-L1 폴리펩티드의 아미노산 잔기 19-238(또는 19-227 또는 19-131)을 포함하는 인간화 PD-L1 폴리펩티드를 발현한다. 이러한 비인간 동물은, 예를 들어 포유류, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 소(예컨대, 암소, 황소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 흰족제비(ferret), 영장류(예컨대, 마모셋, 붉은털원숭이) 등을 포함하는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 PD-L1 폴리펩티드를 발현하도록 유전자 변형될 수 있는 것들 중 어느 것을 포함한다. 비인간 CD274 오르토로그의 예시적인 서열은, 예를 들어 본 명세서에 참고로 포함되는 닭 PD-L1(XM_424811.3 및 XP_424811.3), 침팬지(XM_001140705.2 및 XP 001140705.1), 암소 PD-L1(NM_001163412.1 및 NP_001 156884.1), 및 개 PD-L1(XM.541302.3 및 XP_541302.3), 원숭이(NM_001083889.1 및 NP 001077358.1), 및 래트(NM_001191954.1 및 NP_001178883.1)를 포함한다. 예를 들어, 적합한 유전자 변형가능한 ES 세포를 쉽게 입수할 수 없는 비인간 동물의 경우, 유전자 변형을 포함하는 비인간 동물을 제조하기 위해 다른 방법이 이용된다. 이러한 방법은, 예를 들어 비ES 세포 게놈(예컨대, 섬유모세포 또는 유도된 다능성 세포)을 변형시키고 체세포 핵 전달(SCNT)을 이용하여 유전자 변형된 게놈을 적합한 세포, 예컨대 탈핵된 난모세포에 전달하고, 배아를 형성하기에 적합한 조건 하에서 비인간 동물에서 변형된 세포(예컨대, 변형된 난모세포)를 잉태시키는 것을 포함한다(예를 들어, 문헌[Wilmut, I. et al., 1997, Nature 385:810-813]; 국제 특허 출원 공개 WO 97/07668호 및 WO 97/07669호 참조).

비인간 동물 게놈(예를 들어, 돼지, 암소, 설치류, 닭 등의 게놈)을 변형시키는 방법은, 예를 들어 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease, ZFN) 또는 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)를 이용하여 인간화 CD274 유전자를 포함하도록 게놈을 변형시키는 것을 포함한다.

또한, 본 명세서에 기술된 바와 같은 인간화 CD274 유전자를 갖는 비인간 동물은 CD274 핵산 서열을 도입유전자로서 비인간 동물의 게놈에 무작위로 도입함으로써 생성될 수 있다. 맥락에 따라, cDNA 또는 게놈 인간 CD274 서열이 이용될 수 있다. 예를 들어, 도입유전자의 발현 효율 및 수준을 증가시키기 위해 인트론 서열 및 폴리아데닐화 신호가 도입유전자에 포함될 수 있다. 조직 특이적 조절 서열(들)은 특정 세포 유형에 PD-L1 폴리펩티드의 발현을 지시하기 위해 CD274 도입유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 항시적 프로모터는 인코딩되는 PD-L1 폴리펩티드가 과발현(즉, 야생형 비인간 동물에서 관찰되지 않는 조직에서 그리고/또는 더 높은 수준으로 발현)되도록 CD274 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.

유전자도입 시조(founder) 비인간 동물은 이의 게놈 내의 CD274 도입유전자의 존재 및/또는 비인간 동물의 조직 또는 세포 내의 PD-L1 mRNA의 발현에 기반하여 식별될 수 있다. 이어서, 유전자도입 시조 비인간 동물을 사용하여 CD274 도입유전자를 함유하는 추가의 비인간 동물을 번식시킬 수 있다. 더욱이, 인간 PD-L1 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 인코딩하는 도입유전자를 함유하는 유전자도입 비인간 동물은 다른 도입유전자(예를 들어, Pdcd1, 또는 CD80 도입유전자)를 함유하는 다른 유전자도입 비인간 동물과 추가로 번식시킬 수 있다.

유전자도입 비인간 동물은 또한 도입유전자의 조절되거나 지시된 발현을 가능하게 하는 선택된 시스템을 함유하도록 생성될 수 있다. 예시적인 시스템은 박테리오파지 P1의 Cre/loxP 재조합효소 시스템(예를 들어, 문헌[Lakso, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236] 참조) 및 S. 세레비시아이(S. cerevisiae)의 FLP/Frt 재조합효소 시스템(문헌[O'Gorman, S. et al, 1991, Science 251:1351-1355])을 포함한다. 이러한 동물은, 예를 들어 1 마리는 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 도입유전자(예를 들어, CD274 도입유전자)를 함유하고 다른 1 마리는 재조합효소(예를 들어, Cre 재조합효소)를 인코딩하는 도입유전자를 함유하는 2 마리의 유전자도입 동물을 교미시킴으로써, "이중" 유전자도입 동물의 작제를 통해 제공될 수 있다.

본 발명의 비인간 동물은, 종종 비인간 동물의 의도된 용도에 따라, 추가의 인간 또는 인간화 유전자를 포함하도록 상기 기술된 바와 같이 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 추가의 인간 또는 인간화 유전자의 유전 물질은 상기 기술된 바와 같은 유전자 변형을 갖는 세포(예를 들어, 배아 줄기 세포)의 게놈의 추가 변경을 통해 또는 요망되는 경우 다른 유전자 변형된 계통을 사용하는 당업계에 공지된 육종 기술을 통해 도입될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 B7 리간드 패밀리 및/또는 CD28 수용체 패밀리(예를 들어, Pdcd1(PD-1) 등)로부터 선택되는 하나 이상의 인간 또는 인간화 유전자를 추가로 포함하도록 제조된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 표적화 벡터를 변형된 계통으로부터의 세포에 도입시킴으로써 제조될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간 또는 인간화 프로그램된 세포 사멸 1(Pdcd1) 유전자를 추가로 포함하도록 제조된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 인간화 CD274 유전자 및 이종성 종(예를 들어, 인간)으로부터의 유전 물질을 포함하며, 유전 물질은 B-7 리간드 패밀리 또는 CD28 수용체 패밀리로부터 선택되는 하나 이상의 이종성 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 인코딩한다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 인간화 CD274 유전자 및 이종성 종(예를 들어, 인간)으로부터의 유전 물질을 포함하며, 유전 물질은 이종성(예를 들어, 인간) PD-1 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 인코딩한다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 내인성 부분과 인간 부분을 포함하는 Pdcd1 유전자를 추가로 포함하며, 인간 부분은 인간 PD-1 폴리펩티드의 세포외 도메인을 인코딩하고, 내인성 부분은 내인성 PD-1 폴리펩티드의 세포내 도메인을 인코딩하고; 일부 실시 형태에서, 인간 부분과 내인성 부분은 내인성 Pdcd1 프로모터에 작동가능하게 연결되고; 일부 실시 형태에서는 내인성 설치류 Pdcd1 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 인간화 CD274 유전자를 포함하는 비인간 동물은 본 명세서에 참고로 포함되는 2015년 6월 19일자로 출원된 미국 특허 출원 제14/744,592호에 기술된 바와 같은 하나 이상의 변형을 (예를 들어, 교차 육종 또는 다중 유전자 표적화 전략을 통해) 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 인간화 CD274 유전자를 포함하는 설치류(즉, 인간화 CD274 유전자가 인간 PD-L1 폴리펩티드로부터의 세포외 부분과 설치류 PD-L1 폴리펩티드로부터의 세포내 부분을 갖는 PD-L1 폴리펩티드를 인코딩하도록 내인성 설치류 Cd274 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 5의 3' 부분, 엑손 6 및 엑손 7에 작동가능하게 연결된 인간 CD274 유전자의 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 5' 부분)가 인간화 Pdcd1 유전자를 포함하는 설치류(예를 들어, 인간화 Pdcd1 유전자가 인간 PD-1 폴리펩티드로부터의 세포외 부분과 설치류 PD-1 폴리펩티드로부터의 세포내 부분을 갖는 PD-1 폴리펩티드를 인코딩하도록 내인성 설치류 Pdcd1 유전자의 엑손 1, 엑손 3의 3' 부분, 엑손 4 및 엑손 5에 작동가능하게 연결된 인간 PDCD1 유전자의 엑손 2 및 엑손 3의 5' 부분; 예를 들어 본 명세서에 참고로 포함되는 2015년 6월 19일자로 출원된 미국 특허 출원 제14/744,592호 참조)와 교배된다. 일부 실시 형태에서, 인간화 Pdcd1 유전자는 비인간(예를 들어, 설치류) Pdcd1 엑손 1, 엑손 4 및 엑손 5, 인간 Pdcd1 엑손 2 및 Pdcd1 엑손 3을 포함하며, Pdcd1 엑손 3은 인간 부분과 비인간 부분을 포함하고, 상기 비인간 엑손과 인간 엑손은 작동가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, Pdcd1 엑손 3의 인간 부분은 PD-1 스토크(stalk) 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, Pdcd1 엑손 3의 인간 부분은 인간 Pdcd1 엑손 3의 약 71 bp를 포함한다. 일부 실시 형태에서, Pdcd1 엑손 3의 비인간 부분은 막관통 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, Pdcd1 엑손 3의 비인간 부분은 약 91 bp의 설치류 Pdcd1 엑손 3을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 인간화 Pdcd1 유전자는 인간 PD-1 폴리펩티드로부터의 세포외 부분(예를 들어, 실질적으로 전체 세포외 도메인), 설치류 PD-1 폴리펩티드로부터의 막관통 부분(예를 들어, 실질적으로 전체 막관통 도메인), 및 세포내 부분(예를 들어, 실질적으로 전체 세포내 도메인)을 포함하는 인간화 PD-1 폴리펩티드를 인코딩한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 포유류이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 작은 포유류, 예를 들어 뛰는쥐상과(Dipodoidea) 또는 쥐상과(Muroidea)의 것이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 유전자 변형된 동물은 설치류이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 설치류는 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 설치류는 쥐상과로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 유전자 변형된 동물은 칼로미스쿠스과(Calomyscidae)(예를 들어, 마우스라이크 햄스터(mouse-like hamster)), 비단털쥐과(Cricetidae)(예를 들어, 햄스터, 뉴월드(New World) 래트 및 마우스, 들쥐), 쥐과(Muridae)(트루(true) 마우스 및 래트, 게르빌루스쥐(gerbil), 가시쥐(spiny mouse), 돌기 래트(crested rat)), 붉은숲쥐과(Nesomyidae)(클라이밍(climbing) 마우스, 락(rock) 마우스, 흰꼬리쥐(white-tailed rat), 마다카스카르 래트 및 마우스), 가시겨울잠쥐과(Platacanthomyidae)(예를 들어, 가시겨울잠쥐(spiny dormouse)) 및 소경쥐과(Spalacidae)(예를 들어, 뒤쥐(mole rat), 대나무쥐 및 조커(zokor))로부터 선택되는 과에서 유래된다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 발명의 유전자 변형된 설치류는 트루 마우스 또는 래트(쥐과), 게르빌루스쥐, 가시쥐 및 돌기 래트로부터 선택된다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 발명의 유전자 변형된 마우스는 쥐과의 구성원으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 설치류이다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 발명의 설치류는 마우스 및 래트로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 마우스이다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola로부터 선택되는 C57BL 계통의 마우스인 설치류이다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 발명의 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 계통으로 이루어진 군으로부터 선택되는 129 계통이다(예를 들어, 문헌[Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836]; 문헌[Auerbach, W. et al., 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032] 참조) 일부 특정 실시 형태에서, 본 발명의 유전자 변형된 마우스는 전술한 129 계통과 전술한 C57BL/6 계통의 혼합체이다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 발명의 마우스는 전술한 129 계통의 혼합체, 또는 전술한 BL/6 계통의 혼합체이다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 혼합체의 129 계통은 129S6(129/SvEvTac) 계통이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 마우스는 BALB 계통, 예를 들어, BALB/c 계통이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 마우스는 BALB 계통과 다른 전술한 계통의 혼합체이다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 래트이다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 발명의 래트는 위스타(Wistar) 래트, LEA 계통, 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 계통, 피셔(Fischer) 계통, F344, F6, 및 다크 아구티(Dark Agouti)로부터 선택된다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 래트 계통은 위스타, LEA, 스프라그 돌리, 피셔, F344, F6, 및 다크 아구티로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 계통의 혼합체이다.

인간화 CD274 유전자를 갖는 비인간 동물을 이용하는 방법

CD274 돌연변이체 및 유전자도입 비인간 동물(예를 들어, 마우스) 및 세포가 보고되었다(문헌[Iwai, Y. et al., 2002, Proc. Nat. Acad. Sci. 99(19):12293-12297]; 문헌[Latchman, Y. E. et al., 2004, Proc. Nat. Acad. Sci. 101(29):10691-10696]; 문헌[Subudhi, S. K. et al., 2004, J. Clin. Invest. 113(5):694-700]; 문헌[Guleria, I. et al., 2005, J. Exp. Med. 202(2):231-237]; 문헌[Keir, M.E. et al., 2006, J. Exp. Med. 203(4):883-895]; 문헌[Tanaka, K. et al., 2007, J. Immunol. 179:5204-5210]; 문헌[Wang, C. et al., 2008, Diabetes 57:1861-1869]; 문헌[Wen, X. et al., 2008, Transplant. 86(11):1596-1602]; 문헌[Plege, A. et al., 2009, Transpl. 87(7):975-982]; 문헌[Cao, Y. et al., 2010, Cancer Res. 71(4):1235-1243]; 문헌[Plege, A. et al., 2010, Eur. Soc. Organ Transplant. 23:1293-1300]; 문헌[Ritprajak, P. et al., 2010, J. Immunol. 184:4918-4925]; 문헌[Yantha, J. et al., 2010, Diabetes 59:2588-2596]; 문헌[Ding, Q. et al., 2011, J. Leukocyte Biol. 90:77-86]; 문헌[Tang, L. et al., 2011, Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi 27(4):357-359]; 문헌[Ghazizadeh, S. et al., 2012, 20(1):196-203]). 이러한 돌연변이체 및 유전자도입 동물은 PD-L1 발현 및 기능의 분자적 측면, 및 면역 반응, 특히 T 세포 반응을 조절하는 데에 있어서 PD-1:PD-L1 경로의 역할을 결정하는 데 유용하였다. 그러나, 이러한 동물은 얻은 결과의 입증된 가변성에 부분적으로 기반한 한계를 수반하였다. 많은 유전자도입 PD-L1 동물은 내인성 PD-L1을 과발현시키도록 설계된 도입유전자의 사용을 이용하였지만(예를 들어, 상기 문헌[Ghazizadeh et al.] 참조), 다른 동물은 유전자도입 PD-L1 발현을 조직 특이적 프로모터에 연결하는 데 초점을 맞추었다(예를 들어, 문헌[Ritprajak et al.] 참조). 이들 동물 중 일부는 야생형 전사 프로파일과 연관되지 않은 유전자도입 PD-L1의 발현 패턴을 나타내었다(예를 들어, 상기 문헌[Wang et al. and Yantha et al.] 참조). 또한, 동일한 공급원의 유전 물질(예를 들어, 마우스 중의 마우스 PD-L1 도입유전자)의 사용으로 인해, PD-L1 과발현은 도입유전자의 가능한 위치 효과로 인해 유전자도입 PD-L1보다는 내인성 PD-L1에 상응할 수 있었다. 일부 경우, 이러한 동물은 질병의 가속된 발달을 입증하였고, 이에 따라 도입유전자가 아마도 하나 이상의 표현형을 생성시키거나 변형시켰을 수 있음으로써 PD-L1 기능의 분석을 복잡하게 했을 것이라는 우려를 불러 일으킨다. 이러한 결과는 합리적으로 작제물 설계에 기인한 것일 수 있다. 인간 PD-L1과 관련하여, CMV 구동 인간 PD-L1을 안정하게 발현하도록 유전자조작된 돼지 장내 내피 세포가 미니어처 돼지 피부 이식 모델에서 이용되었고, 동종이식 모델에서 이소성 인간 PD-L1 발현에 중요한 통찰력을 제공하였다(상기 문헌[Ding et al.] 참조). 기존의 PD-L1 유전자도입 비인간 동물은 PD-L1 및 PD-1:PD-L1 경로의 일부 생물학적 기능을 밝히는 데 유용한 것으로 증명되었지만, 상기 입증된 바와 같이, PD-L1 매개 생물학을 이용하는 현재의 생체내 시스템은 불완전하다. PD-1:PD-L1 경로의 분자적 측면 및 암 및 자가면역과 관련된 면역 반응의 조절에서의 이의 역할은 유전자도입 동물(예를 들어, 마우스)에서 이의 최대 잠재력까지 이용되지 않았다.

본 발명의 비인간 동물은 다양한 검정에 유용한 인간(또는 인간화) PD-L1을 발현하는 생물학적 물질(예를 들어, 세포)의 개선된 생체내 시스템 및 공급원을 제공한다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 PD-L1을 표적화하고/하거나 PD-1:PD-L1 신호전달을 조정(예를 들어, PD-1과의 상호작용을 간섭)하고/하거나 다른 결합 파트너(예를 들어, B7-1)와의 PD-L1 상호작용을 조정하는 치료제를 개발하기 위해 사용된다. 이러한 동물은 생체내 연구에 사용되는 많은 다른 동물 모델과 대조적으로 완전히 면역적격이므로 특히 유용하고; 이에 따라, 요법의 효과 분석은 감약된 면역 상태에 의해 복잡해지지 않는다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간 PD-L1과 결합하는 후보 치료제(예를 들어, 항체)를 식별, 스크리닝 및/또는 개발하기 위해 사용된다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간 PD-1 및/또는 인간 B7-1과 인간 PD-L1과의 상호작용을 차단하는 후보 치료제(예를 들어, 항체)를 스크리닝하고 개발하기 위해 사용된다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 세포 표면 상에서의 인간화 PD-L1 폴리펩티드의 길항제 및/또는 효능제의 결합 프로파일을 결정하기 위해 사용되고; 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간 PD-L1과 결합하는 하나 이상의 후보 치료 항체의 에피토프 또는 에피토프들을 결정하는 데 사용된다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 항-PD-L1 항체의 약동학적 프로파일을 결정하는 데 사용된다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 하나 이상의 비인간 동물 및 하나 이상의 대조 또는 기준 비인간 동물은 각각 다양한 용량(예를 들어, 0.1 mg/㎏, 0.2 mg/㎏, 0.3 mg/㎏, 0.4 mg/㎏, 0.5 mg/㎏, 1 mg/㎏, 2 mg/㎏, 3 mg/㎏, 4 mg/㎏, 5 mg/mg, 7.5 mg/㎏, 10 mg/㎏, 15 mg/㎏, 20 mg/㎏, 25 mg/㎏, 30 mg/㎏, 40 mg/㎏, 또는 50 mg/㎏ 또는 그 이상)의 하나 이상의 후보 치료 항-PD-L1 항체에 노출된다. 후보 치료 항체는 비경구적(parenteral) 및 비주사적(non-parenteral) 투여 경로를 포함하는 임의의 요망되는 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 비경구적 경로는, 예를 들어 정맥내, 동맥내, 간문맥내, 근내, 피하, 복강내, 척수내, 수강내, 뇌혈관내, 두개내, 흉막내 또는 다른 주사 경로를 포함한다. 비주사적 경로는, 예를 들어 경구, 비강, 경피, 폐, 직장, 협측, 질, 안구를 포함한다. 투여는 또한 연속 주입, 국소 투여, 임플란트(겔, 막 등)로부터의 지속 방출, 및/또는 정맥내 주사에 의해 이루어질 수 있다. 혈액은 다양한 시점(예를 들어, 0시간, 6시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 또는 최대 30 일 또는 그 이상의 일수)에서 비인간 동물(인간화 및 대조)로부터 단리된다. 총 IgG, 항-치료 항체 반응, 응집 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물로부터 얻어지는 샘플을 사용하여 투여된 후보 치료 항체의 약동학적 프로파일을 결정하기 위해 다양한 검정이 수행될 수 있다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 PD-L1 신호전달(또는 PD-1:PD-L1 신호전달, 또는 PD-L1:B7-1 매개 상호작용)을 차단 또는 조정하는 치료 효과 및 세포 변화의 결과로서의 유전자 발현에 대한 효과를 측정하기 위해 사용된다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물 또는 이로부터 단리된 세포는 비인간 동물의 세포 표면 상에서 인간화 PD-L1 폴리펩티드(또는 PD-L1 폴리펩티드의 인간 부분)와 결합하는 후보 치료제에 노출되고, 후속 기간 후에, PD-L1 의존성 과정(또는 상호작용), 예를 들어, 유착, 아폽토시스, 사이토카인 생성, 염증, 증식, 자가 관용 및 바이러스 감염(또는 반응)에 대한 효과에 대해 분석된다.

본 발명의 비인간 동물은 인간화 PD-L1 폴리펩티드를 발현하고, 이에 따라, 결합 및 기능 검정에 사용하기 위해, 예를 들어, 특히 길항제 또는 효능제가 인간 PD-L1 서열 또는 에피토프에 대해 특이적이거나 대안적으로 PD-1 및/또는 B7-1과 회합하는 인간 PD-L1 서열 또는 에피토프에 대해 특이적인 경우, PD-L1 길항제 또는 효능제의 결합 또는 기능에 대해 검정하기 위해, 인간화 PD-L1의 공급원 역할을 하도록 세포, 세포주, 및 세포 배양물이 발생될 수 있다. 다양한 실시 형태에서, 후보 치료 항체와 결합하는 PD-L1 에피토프는 본 발명의 비인간 동물로부터 단리된 세포를 사용하여 결정될 수 있다.

다양한 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물에 의해 발현되는 인간화 PD-L1 폴리펩티드는 변이체 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 인간 PD-L1 폴리펩티드 변이체는 NCBI로부터 SNP GeneView 웹페이지에 열거된 것들을 포함하며, 표 3에 요약되어 있다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간화 PD-L1 폴리펩티드 변이체를 발현한다. 다양한 실시 형태에서, 변이체는 리간드 결합과 관련된 아미노산 위치에서 다형성이다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간 PD-L1의 다형성 폴리펩티드 변이체와의 상호작용을 통한 리간드 결합의 효과를 결정하는 데 사용된다. 일부 특정 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 표 3에 나타나는 인간 PD-L1 폴리펩티드 변이체를 발현한다.

[표 3]

본 발명의 비인간 동물로부터의 세포는 단리되어 즉석에서 사용될 수 있거나, 수 세대 동안 배양 상태로 유지될 수 있다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물로부터의 세포는 (예를 들어, 바이러스의 사용을 통해) 불멸화되고, 무기한으로 (예를 들어, 연속 배양으로) 배양 상태로 유지된다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 세포 및/또는 비인간 동물은 항원에 대한 면역 반응(예를 들어, T 세포 반응)에서 PD-L1 매개 기능을 결정하기 위해 다양한 면역화 계획에서 사용된다. 일부 실시 형태에서, 인간(또는 인간화) PD-L1과 결합하거나 이의 하나 이상의 기능을 차단하는 후보 치료제가 본 발명의 비인간 동물에서 특성규명된다. 적합한 측정은 다양한 세포 검정, 증식 검정, 혈청 면역글로불린 분석(예를 들어, 항체 역가), 세포독성 검정, 리간드-수용체 상호작용의 특성규명(예를 들어, 면역침전 검정) 및 리간드-리간드 상호작용의 특성규명을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 PD-L1 매개 기능을 특성규명하기 위해 사용된다. 일부 실시 형태에서, 항원은 자가면역 질병, 장애 또는 질환과 관련된다. 일부 실시 형태에서, 항원은 염증성 질병, 장애 또는 질환과 관련된다. 일부 실시 형태에서, 그러한 항원은 신생물과 관련된다. 일부 실시 형태에서, 항원은 감염체(예를 들어, 세균)와 관련된다. 일부 실시 형태에서, 항원은 시험 항원(예를 들어, 오브알부민 또는 OVA)이다. 일부 실시 형태에서, 항원은 치료가 필요한 1명 이상의 인간 환자가 앓고 있는 질병 또는 질환과 관련된 표적이다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간 PD-L1을 표적화하는 후보 치료제의 약물독성학적 측면을 시험하기 위해 자가항체 생성의 역가를 결정하는 혈청 검정에 사용된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물에서의 자가항체 생성은 비인간 동물에서 유도되는 하나 이상의 자가면역 질병, 장애 또는 질환으로부터 기인한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은, 주어진 항원에 대한 특이적 T 세포 의존성 반응 및 B 세포 의존성 반응을 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역 반응의 PD-L1 의존성 조절을 조정하는 화합물 또는 생물학적 작용제의 치료 잠재력을 결정하기 위해 하나 이상의 항원을 사용한 시험투여에 사용된다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 세포 및/또는 비인간 동물은 인간 PD-L1 신호전달을 조정하는 후보 치료제를 스크리닝하고 개발하기 위해 생존 및/또는 증식 검정(예를 들어, B 세포 또는 T 세포를 이용함)에 사용된다. PD-L1의 활성화 또는 억제는 T 세포 반응의 조절에서 중요한 역할을 하며, PD-L1에 의한 자가 관용의 조절은 PD-L1의 세포외 도메인의 특정 에피토프의 활성화로부터 기인할 수 있어서, 따라서 후보 PD-L1 조정자(예를 들어, 길항제 또는 효능제)가 본 발명의 비인간 동물의 세포 및/또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 비인간 동물을 사용하여 식별, 특성규명 및 개발될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 세포 및/또는 비인간 동물은 PD-L1의 존재 및 부재 하에서 특정 세포(들)(예를 들어, 암 세포)의 증식 또는 아폽토시스에 대한 효과를 결정하기 위해 생존 또는 사멸 검정(들)에서 사용된다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 세포 및/또는 비인간 동물은 이식된 인간 세포 또는 조직에 대한 생리학적(예를 들어, 면역) 반응에서 PD-L1 매개 기능을 결정하기 위해 이종성(예를 들어, 인간) 세포 또는 조직의 이종이식에 사용된다. 일부 실시 형태에서, 인간 PD-L1과 결합하거나 이의 하나 이상의 기능을 차단하는 후보 치료제는 본 발명의 비인간 동물에서 특성규명된다. 적합한 측정은 다양한 세포 검정, 증식 검정, 혈청 면역글로불린 분석(예를 들어, 항체 역가), 세포독성 검정, 및 리간드-수용체 상호작용의 특성규명(면역침전 검정)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 PD-L1 매개 기능을 특성규명하기 위해 사용된다. 일부 실시 형태에서, 항원은 신생물과 관련된다. 일부 실시 형태에서, 항원은 자가면역 질병, 장애 또는 질환과 관련된다. 일부 실시 형태에서, 항원은 염증성 질병, 장애 또는 질환과 관련된다. 일부 실시 형태에서, 항원은 치료가 필요한 1명 이상의 인간 환자가 앓고 있는 질병 또는 질환과 관련된 표적이다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 이종(xenogenic)의 림프구 및 이의 면역 기능의 PD-L1 의존성 조절을 조정하는 화합물 또는 생물학적 작용제의 치료 잠재력을 결정하기 위해 이식 또는 입양 전달(adoptive transfer) 실험에서 사용된다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간 T 세포로 이식되고; 일부 실시 형태에서는 비감작(naive) T 세포로 이식되고; 일부 실시 형태에서는 활성화된 T 세포로 이식된다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물의 세포는 T 세포 의존성 반응 및 기능의 PD-L1 의존성 조절을 조정하는 화합물 또는 생물학적 작용제의 치료 잠재력을 결정하기 위해 T 세포 검정에 사용된다. 예시적인 T 세포 검정은, ELISpot, 세포내 사이토카인 염색, 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 제한, 바이러스 억제 검정, 세포독성 검정, 증식 검정 및 조절성 T 세포 억제 검정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물의 세포는 인간 PD-L1을 조정하는 후보 치료제를 스크리닝하고 개발하기 위해 세포 이주(cell transmigration) 검정에 사용된다. 세포 이주는 내피를 가로지르는 세포의 이동을 수반하며, 이주 검정은 백혈구 또는 종양 세포에 의한 내피와의 상호작용 및 이의 이주의 측정을 허용한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물의 세포는 종양 세포의 PD-L1 의존성 조절 및/또는 아폽토시스를 조정하는 화합물 또는 생물학적 작용제의 치료 잠재력을 결정하기 위해 종양 세포 성장(또는 증식) 검정에 사용된다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물의 세포는 T 세포로부터의 사이토카인 방출(예를 들어, 인터페론-γ, 인터류킨-10)의 PD-L1 의존성 조절을 조정하는 화합물 또는 생물학적 작용제의 치료 잠재력을 결정하기 위해 사이토카인 생성 검정에 사용된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물의 세포는 인간 PD-L1을 표적화하는 약물 또는 PD-L1 결합 파트너(예를 들어, PD-1, B7-1, 또는 이들의 가용성 버전)와 인간화 PD-L1과의 상호작용으로부터 기인하는 세포내 사이토카인 방출의 검출(및/또는 측정)을 위해 사용된다.

다양한 실시 형태에서, 자가면역 질병, 장애 또는 질환은, 자가면역 질병, 장애 또는 질환의 하나 이상의 기능(또는 측면)의 PD-L1 의존성 조절을 조정하는 화합물 또는 생물학적 작용제의 치료 잠재력을 결정하기 위한 생체내 시스템을 제공하기 위해 본 발명의 하나 이상의 비인간 동물에서 유도된다. 본 발명의 하나 이상의 비인간 동물에서 유도될 수 있는 예시적인 자가면역 질병, 장애 또는 질환은 당뇨병, 실험적 자가면역 뇌척수염(예를 들어, 다발성 경화증에 대한 모델), 류마티스성 관절염, 및 전신성 홍반성 루푸스를 포함한다.

본 발명의 비인간 동물은 약물 또는 백신의 분석 및 시험을 위한 생체내 시스템을 제공한다. 다양한 실시 형태에서, 후보 약물 또는 백신은 본 발명의 하나 이상의 비인간 동물에게 전달될 수 있고, 이어서 약물 또는 백신에 대한 면역 반응, 약물 또는 백신의 안전성 프로파일, 또는 질병 또는 질환에 대한 효과 중 하나 이상 및/또는 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상을 결정하기 위해 비인간 동물의 모니터링이 이루어질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 백신은 바이러스, 예를 들어 인간 면역결핍 바이러스 또는 간염 바이러스(예를 들어, HCV)를 표적화한다. 안전성 프로파일을 결정하는 데 사용되는 예시적인 방법은 독성, 최적 용량 농도, 약물 또는 백신의 효능, 및 가능한 위험 인자의 측정을 포함한다. 이러한 약물 또는 백신은 이러한 비인간 동물에서 개선되고/되거나 개발될 수 있다.

본 발명의 비인간 동물은 입양 전달을 통한 인간 세포 대 세포 상호작용의 메커니즘을 밝히는 개선된 생체내 시스템을 제공한다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 종양 이종이식편이 이식되고, 이어서 고형 종양 또는 다른 악성종양의 근절에 있어서 유효성을 결정하기 위해 입양 전달에 의해 비인간 동물에 이식될 수 있는 종양 침윤 림프구의 제2 이식이 이루어질 수 있다. 이러한 실험은 비인간 동물의 내인성 PD-L1과의 경쟁없이 인간 PD-L1의 독점적 존재로 인해 인간 세포로 수행될 수 있다. 또한, 이종이식에서 사용하기 위한 치료법 및 약제가 이러한 비인간 동물에서 개선 및/또는 개발될 수 있다.

본 발명의 비인간 동물은 인간 PD-L1을 표적화하는 약물의 약동학적 특성을 평가하기 위한 생체내 시스템을 제공한다. 다양한 실시 형태에서, 인간 PD-L1을 표적화하는 약물은 본 발명의 하나 이상의 비인간 동물에게 전달 또는 투여될 수 있고, 이어서 비인간 동물에 대한 약물의 효과를 결정하기 위해 비인간 동물(또는 이로부터 단리된 세포)의 모니터링 또는 이에 대한 하나 이상의 검정의 수행이 이루어질 수 있다. 약동학적 특성은 동물이 약물을 다양한 대사산물로 처리하는 방법(또는 독성 대사산물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 약물 대사산물의 존재 또는 부재의 검출), 약물 반감기, 투여 후 약물의 순환 수준(예를 들어, 약물의 혈청 농도), 항-약물 반응(예를 들어, 항-약물 항체), 약물 흡수 및 분포, 투여 경로, 배출 경로 및/또는 약물의 제거율을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 약물(예를 들어, PD-L1 조정자)의 약동학적 및 약력학적 특성은 본 발명의 비인간 동물의 사용 시 또는 사용을 통해 모니터링된다.

본 발명의 비인간 동물은 인간 PD-L1을 표적화하는 약물의 온-타겟(on-target) 독성을 평가하기 위한 생체내 시스템을 제공한다. 다양한 실시 형태에서, 인간 PD-L1을 표적화하는 약물은 본 발명의 하나 이상의 비인간 동물에게 전달 또는 투여될 수 있고, 이어서 비인간 동물에 대한 약물의 온-타겟 독성 효과를 결정하기 위해 비인간 동물(또는 이로부터 단리된 세포)의 모니터링 또는 이에 대한 하나 이상의 검정의 수행이 이루어질 수 있다. 전형적으로, 약물은 이의 표적의 하나 이상의 기능을 조정하기 위한 것이다. 한 가지 예를 들면, PD-L1 조정자는 하나 이상의 세포 표면 상에서 PD-L1 분자와 어떤 방식으로 상호작용함으로써 PD-L1 매개 기능(예를 들어, PD-L1 신호전달 및/또는 PD-L1 상호작용)을 조정하기 위한 것이고, 일부 실시 형태에서는 하나 이상의 PD-L1 결합 파트너와의 상호작용을 차단함으로써 그러하다. 일부 실시 형태에서, 이러한 조정자는 이 조정자의 요망되는 약리학적 작용(들)의 과장인 불리한 효과를 가질 수 있다. 이러한 효과는 온-타겟 효과라 명명된다. 예시적인 온-타겟 효과는 너무 많은 용량, 만성 활성화/비활성화, 및 올바르지 않은 조직에서의 올바른 작용을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물의 사용 시 또는 사용을 통해 식별되는 PD-L1을 표적화하는 약물의 온-타겟 효과는 PD-L1의 이전에 공지되지 않은 기능(들)을 결정하는 데 사용된다.

본 발명의 비인간 동물은 인간 PD-L1을 표적화하는 약물의 오프-타겟(off-target) 독성을 평가하기 위한 생체내 시스템을 제공한다. 다양한 실시 형태에서, 인간 PD-L1을 표적화하는 약물은 본 발명의 하나 이상의 비인간 동물에게 전달 또는 투여될 수 있고, 이어서 비인간 동물에 대한 약물의 오프-타겟 독성 효과를 결정하기 위해 비인간 동물(또는 이로부터 단리된 세포)의 모니터링 또는 이에 대한 하나 이상의 검정의 수행이 이루어질 수 있다. 오프-타겟 효과는 약물이 의도하지 않은 표적과 상호작용하는 경우(예를 들어, 공통 에피토프에 대한 교차반응성) 발생할 수 있다. 이러한 상호작용은 의도된 또는 의도되지 않은 조직에서 발생할 수 있다. 한 가지 예를 들면, 약물의 거울상 이성질체(에난티오머)는 오프-타겟 독성 효과를 유발할 수 있다. 또한, 약물은 다양한 수용체 서브타입과 부적절하게 상호작용하며 의도하지 않게 이를 활성화시킬 수 있다. 예시적인 오프-타겟 효과는 올바르지 않은 표적이 발견되는 조직과 무관하게 올바르지 않은 조직의 올바르지 않은 활성화/억제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 PD-L1을 표적화하는 약물의 오프-타겟 효과는, 약물을 본 발명의 비인간 동물에게 투여한 효과를 하나 이상의 기준 비인간 동물과 비교함으로써 결정된다.

일부 실시 형태에서, 검정을 수행하는 것은 약물이 투여되는 비인간 동물의 표현형 및/또는 유전자형에 대한 효과를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 검정을 수행하는 것은 PD-L1 조정자(예를 들어, 길항제 또는 효능제) 또는 PD-L1을 표적화하는 약물에 대한 로트 대 로트(lot-to-lot) 가변성을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 검정을 수행하는 것은 본 발명의 비인간 동물과 기준 비인간 동물에 투여된 PD-L1을 표적화하는 약물의 효과 사이의 차이를 결정하는 것을 포함한다. 다양한 실시 형태에서, 기준 비인간 동물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 변형을 갖거나, 본 명세서 기술된 바와 상이한 변형(예를 들어, 변경, 파괴, 결실, 삽입, 변형 등이 되거나 다른 방식으로 비기능적인 CD274 유전자를 갖는 것)을 갖거나 변형을 갖지 않을(즉, 야생형 비인간 동물일) 수 있다.

인간 PD-L1을 표적화하는 약물의 약동학적 특성, 온-타겟 독성, 및/또는 오프-타겟 독성을 평가하기 위해 비인간 동물에서(또는 이로부터 단리된 세포에서 및/또는 이를 사용하여) 측정될 수 있는 예시적인 파라미터는, 응집, 자가포식, 세포 분열, 세포 사멸, 보체 매개 용혈, DNA 완전성, 약물 특이적 항체 역가, 약물 대사, 유전자 발현 어레이, 대사 활성, 미토콘드리아 활성, 산화 스트레스, 식세포작용, 단백질 생합성, 단백질 분해, 단백질 분비, 스트레스 반응, 표적 조직 약물 농도, 비-표적 조직 약물 농도, 전사 활성 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 약제학적으로 유효한 용량의 PD-L1 조정자(예를 들어, PD-L1을 표적화하는 약물)를 결정하는 데 사용된다.

본 발명의 비인간 동물은 암에서 사용하기 위한 후보 치료제의 개발 및 특성규명을 위한 개선된 생체내 시스템을 제공한다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 종양(또는 종양 세포)이 이식되고, 이어서 하나 이상의 후보 치료제의 투여가 이루어질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 후보 치료제는 다중 특이적 항체(예를 들어, 이중 특이적 항체) 또는 항체 칵테일(cocktail)을 포함할 수 있고; 일부 실시 형태에서, 후보 치료제는 순차적으로 또는 동시에 투여되는 둘 이상의 단일 특이적 항체의 투여와 같은 병용 요법을 포함한다. 종양은 하나 이상의 후보 치료제의 투여 전에 비인간 동물 내의 하나 이상의 위치에 확립되기에 충분한 시간이 주어질 수 있다. 종양 세포 증식, 성장, 생존 등은 후보 치료제(들)의 투여 전 및 후 둘 모두에서 측정될 수 있다. 후보 치료제의 세포독성은 또한 요망되는 경우 비인간 동물에서 측정될 수 있다.

본 발명의 비인간 동물은 감염성 질병에서 사용하기 위한 후보 치료제의 개발 및 특성규명을 위한 개선된 생체내 시스템을 제공한다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 주사에 의해 바이러스(예를 들어, MHV, HIV, HCV 등) 또는 병원체(예를 들어, 세균)로 감염되고, 이어서 하나 이상의 후보 치료제의 투여가 이루어질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 후보 치료제는 다중 특이적 항체(예를 들어, 이중 특이적 항체) 또는 항체 칵테일을 포함할 수 있고; 일부 실시 형태에서, 후보 치료제는 순차적으로 또는 동시에 투여되는 둘 이상의 단일 특이적 항체의 투여와 같은 병용 요법을 포함하고; 일부 실시 형태에서 후보 치료제는 백신을 포함할 수 있다. 바이러스 또는 병원체는, 바이러스 또는 병원체의 감염과 관련된 하나 이상의 증상이 비인간 동물에서 발생하도록 비인간 동물 내의 하나 이상의 위치 또는 세포에서 확립되기에 충분한 시간이 주어질 수 있다. T 세포 증식 및 성장은 후보 치료제(들)의 투여 전 및 후 둘 모두에서 측정될 수 있다. 또한, 생존, 혈청 및/또는 세포내 사이토카인 분석, 간 및/또는 비장 조직병리학이 바이러스 또는 병원체에 감염된 비인간 동물에서 측정될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 바이러스 감염과 관련된 기관 손상의 정도를 결정하는 데 사용된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 특정 바이러스에 감염된 비인간 동물의 다양한 기관에서 사이토카인 발현 프로파일 및/또는 유전자 발현 프로파일을 결정하는 데 사용된다.

본 발명의 비인간 동물은 인간 세포를 표적화하는 치료 약물의 효능을 평가하는 데 이용될 수 있다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 하나 이상의 비인간 동물은 인간 세포가 이식되고, 이러한 인간 세포를 표적화하는 약물 후보가 이러한 비인간 동물에게 투여된다. 이어서, 약물의 치료 효능은 약물 투여 후 비인간 동물에서 인간 세포를 모니터링함으로써 결정된다. 비인간 동물에서 시험될 수 있는 약물은 작은 분자 화합물, 즉, 분자량이 1500 kD, 1200 kD, 1000 kD, 또는 800 돌턴 미만인 화합물, 및 큰 분자 화합물(예를 들어, 단백질, 예컨대 항체) 둘 모두를 포함하며, 이들은 인간 세포를 표적화(예를 들어, 이에 결합하고/하거나 이에 대해 작용)함으로써 인간 질병 및 질환의 치료를 위한 의도된 치료 효과를 가진다.

일부 실시 형태에서, 약물은 항암 약물이며, 인간 세포는 원발성 암의 세포 또는 원발성 암으로부터 확립된 세포주의 세포일 수 있는 암 세포이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간 암 세포가 이식되고, 항암 약물이 비인간 동물에게 투여된다. 약물 효능은 비인간 동물에서 인간 암 세포의 성장 또는 전이가 약물의 투여의 결과로서 억제되는지의 여부를 평가함으로써 결정될 수 있다.

특정 실시 형태에서, 항암 약물은 인간 암 세포 상의 항원과 결합하는 항체 분자이다. 특정 실시 형태에서, 항암 약물은 인간 암 세포 상의 항원 및 다른 인간 세포, 예를 들어 B 세포 및 T 세포와 같은 인간 면역계의 세포(또는 "인간 면역 세포") 상의 항원에 결합하는 이중 특이적 항체이다.

실시예

하기 실시예는 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 어떻게 제조하고 사용하는지를 설명하기 위해 제공되는 것이며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범주를 제한하려고 하는 것은 아니다. 달리 표시되지 않는 한, 온도는 섭씨로 표시되고, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.

실시예 1. 내인성 분화 클러스터 274(CD274) 유전자의 인간화

본 실시예는 설치류(예를 들어, 마우스)와 같은 비인간 동물에서 프로그램된 세포 사멸-리간드 1(PD-L1)을 인코딩하는 내인성 CD274 유전자를 인간화하는 예시적인 방법을 설명한다. 본 실시예에 설명된 방법은 임의의 인간 서열, 또는 요망되는 경우 서열들(또는 서열 단편들)의 조합을 사용하여 비인간 동물의 내인성 CD274 유전자를 인간화하기 위해 이용될 수 있다. 본 실시예에서는, 마우스의 내인성 Cd274 유전자의 인간화를 위해 Genbank 수탁 NM_014143.3(서열 번호 11)에 나타나는 인간 CD274 유전자의 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5(일부)를 함유하는 약 8,444 bp의 인간 DNA 단편을 이용한다. 내인성 Cd274 유전자의 N-말단 IgV 도메인과 IgC2형 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 인코딩하는 유전 물질의 인간화를 위한 표적화 벡터는 VELOCIGENE® 기술을 사용하여 작제하였다(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제6,586,251호 및 문헌[Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-659] 참조).

간략하게 말하면, 내인성 마우스 Cd274 유전자의 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5(일부)의 코딩 서열(약 8942 bp)이 결실되고, 인간 PD-L1 폴리펩티드의 아미노산 19-238을 인코딩하는 약 8444 bp의 인간 DNA 단편을 사용하여 인간 CD274 유전자의 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5(일부)가 삽입되도록, 마우스 세균 인공 염색체(bacterial artificial chromosome)(BAC) 클론 RP23-467A9(Invitrogen)를 변형시켰다. 엑손 1, 엑손 2, 엑손 6 및 엑손 7뿐만 아니라 비번역 영역(UTR)을 함유하는 내인성 DNA가 보유되었다. 약 8,444 bp의 인간 DNA 단편의 서열 분석에 의해 모든 인간 CD274 엑손(즉, 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 일부) 및 스플라이싱 신호를 확인하였다. 서열 분석은 서열이 인간 CD274 전사체 NM014143.3과 일치함을 나타내었다. 먼저, 약 8,444 bp의 인간 DNA 단편을 두 부분으로 하여 증폭시켰다(도 2, 상단). 인간 CD274 엑손 2 및 인트론 3의 일부를 함유하는 5' 부분(약 4,494 bp)을 NheI 제한 부위를 함유하는 3' 프라이머 및 마우스 상동 박스를 함유하는 5' 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켜 세균 상동 재조합을 용이하게 하였다. 인트론 3의 일부, 엑손 4, 인트론 4 및 엑손 5의 일부(약 32 bp)를 함유하는 3' 부분(약 3,950 bp)을 XhoI 제한 부위를 함유하는 5' 프라이머 및 마우스 상동 박스를 함유하는 3' 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켜 세균 상동 재조합을 용이하게 하였다. PCR 생성물을 겔 정제하고, 상응하는 제한 엔도뉴클레아제로 개별적으로 분해하였다. NheI-XhoI 제한 부위를 이용하여 약 4,494 bp의 DNA 단편과 약 3,950 bp의 DNA 단편을 약 4,996 bp의 자가 결실 네오마이신 카세트(loxP-hUb1-em7-Neo-pA-mPrm1-Crei-loxP; 본 명세서에 모두 참고로 포함되는 미국 특허 제8,697,851호, 미국 특허 제8,518,392호 및 미국 특허 제8,354,389호 참조)의 5' 말단 및 3' 말단에 인간 CD274 코딩 서열을 함유하는 DNA 단편과 역배향으로 결찰시켰다. 후속 선택은 네오마이신을 이용하였다. 의도적으로, 인간 CD274 엑손 5(즉, 처음 32 bp)의 부분과 내인성 Cd274 엑손 5 사이의 접합부는 엑손 5에서 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 보존하였고(도 2), 독특한 CD274 엑손 5(AACTACCTCTGGCACATCCTCCAAATGAAA GGACTCACTG GGTGCTTCTG GGATCCATCC TGTTGTTCCT CATTGTAGTG TCCACGGTCC TCCTCTTCTT GAGAAAACAA G; 서열 번호 12)를 생성시켰다. 생성된 표적화 벡터는, 5'에서 3'으로, BAC 클론 RP23-467A9로부터의 약 92.9 kb의 마우스 게놈 DNA를 함유하는 5' 상동 아암, 인간 CD274 유전자의 엑손 3 및 인트론 3의 일부를 함유하는 약 4,494 bp의 인간 DNA 단편, loxP 부위에 의해 플랭킹되는 자가 결실 네오마이신 카세트, 인간 CD274 유전자의 인트론 3의 일부, 엑손 4, 인트론 4 및 엑손 5의 처음 32 bp를 함유하는 약 3950 bp의 인간 DNA 단편, 및 BAC 클론 RP23-467A9로부터의 약 67.6 kb의 마우스 게놈 DNA를 함유하였다.

상기 기술된 변형된 RP23-467A9 클론을 사용하여 마우스 배아 줄기(ES) 세포를 일렉트로포레이팅(electroporating)하여 엑손 3에서 엑손 5의 일부까지 인간화된 내인성 CD274 유전자를 포함하는 변형된 ES 세포를 생성시켰다(즉, 약 8,964의 내인성 Cd274 유전자의 결실 및 약 8,444 bp의 인간 CD274 서열의 삽입). 인간화 CD274 유전자를 함유하는 양성으로 표적화된 ES 세포는 인간 CD274 서열(예를 들어, 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 일부)의 존재를 검출하며 마우스 Cd274 서열(예를 들어, 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 일부 및/또는 엑손 1, 엑손 2, 엑손 6 및 엑손 7)의 결실 및/또는 보유를 확인한 검정(상기 문헌[Valenzuela et al.] 참조)에 의해 식별하였다. 표 4는 상기 기술된 바와 같은 내인성 마우스 Cd274 유전자(도 3에 도시됨)의 인간화를 확인하는 데 사용된 프라이머와 프로브의 예시적인 서열을 제시한다.

다양한 접합부에 걸친 뉴클레오티드 서열은 도 2에 도표로 도시되어 있다. 상류 삽입 지점에 걸친 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, 이는 삽입 지점의 하류에 있는 인간 CD274 서열과 인접하는 내인성 마우스 Cd274 서열(아래에 괄호 안에 들어 있음)을 나타낸다: (TAACCTTTTA CCCAGGTTTT CAGATGTGTT TGGAGGAGTT TTCTGTCTTC TGAGGGCTGG TCCTCTTTCCT TTTCAGCGTT TACT) GTCAGGTTCC CAAGGACCTA TATGTGGTAG AGTATGGTAG CAATATGACA ATTGAATGCA AATTCCCAGTAGAA (서열 번호 13).

자가 결실 네오마이신 카세트의 5' 말단에 걸친 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, 이는 삽입 지점의 하류에 있는 카세트 서열(아래에 괄호 안에 들어 있고, NheI 제한 부위는 이탤릭체로 표시되고, loxP 서열은 굵은 글꼴로 표시됨)과 인접하는 인간 CD274 서열을 나타낸다: TTTGTATTAA CTCTCTGTGA AGAAATTACC TCACAAATCT ATTGCTGTC (GCTAGCTCGCTACCTT AGGACCGTTA TAGTTACTAG C ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTCCAGACATG ATAAGATACA TTGATGAGTT TGGACAAACC ACAACTAGAA TGCAGTGAAA AAAATGCTTT ATTTGTGAAA TTTGTGATGC TATTGCTTTA TTTGTAACCA TTATAAGCTG) (서열 번호 14).

자가 결실 네오마이신 카세트의 3' 말단에 걸친 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, 이는 삽입 지점의 하류에 있는 인간 CD274 서열과 인접하는 카세트 서열(아래에 괄호 안에 들어 있고, loxP 서열은 굵은 글꼴로 표시되고, XhoI 제한 부위는 이탤릭체로 표시됨)을 나타낸다: (GTGAGGAGGG GGGCGCCCGC GGGAGGCGCC AAAACCCGGC GCGGAGGCCA TGCAT ATAACTTCGT ATAGCATACA TTATACGAAG TTATCTCGAG) CTTGGTAAAG GAATGGAGAA TTAAGGCTCT AGATCATTAG TGGTTACACT ATAGTATTAG AAGTAAAAAA AAGATTATAC CAACAAAATA AGAACATGTT AATGTACTTG TAATGAATAA ACATGAATAA AGCTCTTATG CTATA (서열 번호 15).

인간 CD274 서열의 3' 말단에 걸친 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, 이는 마우스 Cd274 서열(아래에 괄호 안에 들어 있음)과 인접하는 인간 CD274 서열을 나타낸다: TTTATCTTTA GTCAGTTTGT TTTCGTTTTGT TTTGTTTTTC AGAACTACCT CTGGCACATC CTCCAAATGA AAGG (ACTCACTGGG TGCTTCTGGG ATCCATCCTG TTGTTCCTCA TTGTAGTGTC CACGGTCCTC CTCTTCTTGA GAAAACAAGG TATTTCCTCCATTG) (서열 번호 16).

네오마이신 카세트의 결실 후 삽입 지점에 걸친 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, 이는 남아 있는 카세트 서열 loxP 서열(아래에 괄호 안에 들어 있고, NheI 제한 부위와 XhoI 제한 부위는 이탤릭체로 표시되고, loxP 서열은 굵은 글꼴로 표시됨)과 병치된 인간 게놈 서열을 나타낸다: TCCTAGCCG TTTTGTATTA ACTCTCTGTG AAGAAATTAC CTCACAAATCT ATTGCTGTC (GCTAGCTCGCTACCTT AGGACCGTTA TAGTTACTAGCATAACTTCGT ATAGCATACATTATACGAAGTTAT CTCGAG)CTTGGTAAAGGAATGGAGAATTAAGGCTCTAGATCATTAGTGGTTACACTATAGTATTAGAAGTAAAAAAAAGATTATACCAACAAAATAAGAA (서열 번호 17).

이어서, VELOCIMOUSE® 방법(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 문헌[Poueymirou et al., 2007, Nature Biotech. 25(1):91-99] 참조)을 사용하여 양성 ES 세포 클론을 사용하여 암컷 마우스에 이식하여 인간 CD274 엑손 3, 엑손 4 및 인간 CD274 엑손 5의 일부가 내인성 마우스 Cd274 유전자에 삽입된 한 배 새끼를 발생시켰다. 내인성 Cd274 유전자의 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5의 일부(즉, 약 8,444 bp의 인간 DNA 단편)의 인간화를 갖는 마우스를, 인간 CD274 유전자 서열의 존재를 검출했던 검정(상기 문헌[Valenzuela et al.] 참조)을 사용하여 꼬리 자름(tail snip)으로부터 단리된 DNA의 유전자형판별에 의해 다시 확인하고 식별하였다. 새끼를 유전자형판별하고, 인간화 Pdcd1 유전자 작제물에 대해 이형접합성인 동물의 코호트를 특성규명을 위해 선택한다. 또한 마우스를 동형접합성으로 번식시킨다.

[표 4]

실시예 2. 활성화된 T 세포 상에서의 인간화 PD-L1의 발현

본 실시예는 실시예 1에 따라 인간화 CD274 유전자를 함유하도록 변형된 비인간 동물(예를 들어, 설치류)이 활성화된 림프구 표면 상에 인간화 PD-L1 폴리펩티드를 발현함을 입증한다. 본 실시예에서, 야생형 마우스 및 실시예 1에 기술된 바와 같은 인간화 CD274 유전자를 함유하는 게놈을 갖는 마우스로부터의 활성화된 T 세포를 시판 항-PD-L1 항체로 염색하여 자극 및 비자극된 T 세포에서 PD-L1의 발현을 결정하였다.

간략하게 말하면, 야생형 마우스 및 실시예 1에 기술된 바와 같은 내인성 CD274 유전자에 대해 동형접합성인 마우스로부터 비장을 채취하고, 기계적 해리에 의해 단일 세포 현탁액으로 처리하였다. 세포를 배지(10% FBS로 보충된 RPMI)에서 세척하고, 1×10⁶개/mL로 재현탁하고, 200 μL(200,000개 세포)를 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 선택된 웰의 세포를 72시간 동안 항-CD3 및 항-CD28 항체(둘 모두 1 ㎍/mL)로 자극하였다. 세포를 CD3, CD4, CD8 및 인간(클론 MIH1, BD Biosciences) 또는 마우스(클론 10F.9G2, eBioscience) PD-L1을 인식하는 항체를 사용하여 제조사의 사양에 따라 FACS를 위해 염색하였다. 염색된 세포를 LSRII 유동 세포계측기에서 이동시키고, 데이터를 FLOWJO™ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. CD8⁺ T(CD3⁺CD8⁺) 및 CD4⁺ T(CD3⁺CD4⁺) 세포를 게이팅(gating)하고, 인간 및 마우스 PD-L1의 발현에 대해 분석하였다. 예시적인 평균 형광 강도 값이 표 5에 제시되어 있다.

표 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 기술된 바와 같은 인간화 CD274 유전자를 갖는 마우스는 활성화된 T 세포 상에 인간 부분과 내인성 부분을 포함하는 PD-L1 폴리펩티드를 발현한다. 인간 부분은, 완전 인간 PD-L1 폴리펩티드에 반응성이며 야생형 마우스에서 마우스 PD-L1 폴리펩티드를 인식하지 않는 항체에 의한 인식을 통해 검출가능하게 발현된다. 대조적으로, 항-마우스 PD-L1 항체 클론 10F.9G2는 항-CD3/항-CD28 자극 후 야생형 마우스에서의 마우스 PD-L1에 대한 높은 수준의 염색 및 인간화 PD-L1 마우스에서의 주변적 수준의 염색을 입증하였다. 이는 인간 PD-L1에 대한 부분적 교차반응성으로 인한 것일 가능성이 가장 높다.

[표 5]

실시예 3. PD-L1 조정자의 생체내 효능

본 실시예는 실시예 1에 따른 인간화 CD274 유전자를 함유하도록 변형된 비인간 동물(예를 들어, 설치류)이 PD-L1 조정자(예를 들어, 항-PD-L1 항체)를 스크리닝하고 종양 성장 감소 및/또는 종양 세포 치사와 같은 다양한 특징을 결정하기 위해 생체내 검정에 사용될 수 있음을 입증한다. 본 실시예에서, MC38.ova 종양 세포가 피하 주사된 (실시예 1에 기술된 바와 같은) 내인성 CD274 유전자의 인간화에 대해 동형접합성인 마우스에서 여러 항-PD-L1 항체를 스크리닝하여 종양 퇴행을 촉진하는 최적 항체 용량 및 항-PD-L1 항체가 종양 세포의 치사를 매개하는 정도를 결정한다.

간략하게 말하면, 마우스를 연구 1의 경우 체중에 따라 5개의 처리 그룹 또는 대조 그룹으로 고르게 나누거나(그룹당 n = 5 마리 내지 8 마리의 마우스) 연구 2의 경우 7개 처리 그룹으로 무작위배정하였다(n = 5 마리 내지 6 마리의 마우스). 연구 1의 동물을 아이소플루란 흡입에 의해 마취시키고, 이어서 DMEM 100 μL 현탁액 중의 1×10⁶개의 MC38.ova 세포를 우측 옆구리에 피하 주사하였다(0일째). 종양 면역원성을 증가시키고 명확히 규정된 항원성 오브알부민 펩티드에 대한 T 세포 면역 반응의 모니터링을 가능하게 하기 위해 닭 오브알부민을 발현하도록 MC38.Ova(마우스 결장 선암종) 세포를 유전자조작하였다. MC38.ova 세포를 또한 SFFV 바이러스 프로모터의 제어 하에 전장 인간 PD-L1을 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시키고, 인간 PD-L1에 대해 특이적인 항체(클론 MIH1, BD Biosciences)를 사용하여 유동 세포계측법에 의해 인간 PD-L1의 양성 발현(MC38.ova/hPD-L1)에 대해 분류하였다. MC38.ova 세포는 또한 낮은 수준의 내인성 마우스 PD-L1을 발현한다. 연구 1의 처리 그룹에는 3일째, 7일째, 10일째, 14일째, 및 17일째에 3개의 항-PD-L1 항체 중 하나 또는 PD-L1에 대해 특이적이지 않은 2개의 아이소타입 대조 항체 중 하나를 500 ㎍ 복강내 주사하였다. 한 그룹의 동물은 미처리된 상태로 두었다. 연구 2의 동물에게도 1×10⁶개의 MC38.Ova/hPD-L1 세포를 피하 이식하였지만(0일째), 연구 2의 처리 그룹에는 10 mg/㎏ 또는 5 mg/㎏의 용량의 항-PD-L1 항체(Ab A, Ab B, 또는 Ab C) 또는 대조 항체(즉, PD-L1에 대해 특이적이지 않음)를 복강내 투여하였다. 처리 그룹에는 3일째, 7일째, 10일째, 14일째, 및 17일째에 항체를 투여하였다. 각 연구에 대한 실험 투여 및 처리 프로토콜이 표 6에 제시되어 있다.

[표 6]

각 연구의 경우, 실험 지속기간(연구 1의 경우 17일, 연구 2의 경우 21일) 동안 주당 2회 캘리퍼 측정에 의해 종양 부피를 모니터링하였고, 각 연구의 종료 시에 생존율(%)을 기록하였다. 각 연구의 종료 시에 또한 무종양 마우스의 수를 기록하였다. 평균 종양 부피(㎣±SD), 생존율(%), 및 무종양 마우스의 수로 표현되는 예시적인 결과가 표 7 및 표 8에 제시되어 있다. 예시적인 종양 성장 곡선은 도 4에 제공되어 있다.

[표 7]

[표 8]

연구 1의 경우, 3개의 항-PD-L1 항체는 모두 500 ㎍/마우스에서 종양 퇴행을 촉진하는 데 효과적이었고, Ab B 및 Ab C가 투여된 처리 그룹으로부터의 모든 마우스는 17일째에 무종양이었다(표 7). Ab A 처리 그룹의 경우, 5 마리의 마우스 중 4 마리(80%)가 17일째까지 무종양이었던 반면, 대조 그룹의 경우 무종양 동물은 없었다. 일원 ANOVA와 던넷(Dunnett)의 다중 비교 사후 검사는 0.05 미만의 p 값으로 항-PD-L1 항체와 대조 항체를 사용한 처리 사이의 종양 부피의 유의한 차이를 나타내었다. 대조군 2는 무관한 매칭(matching)된 아이소타입 대조 항체이며, 대조군 1은 무관한 비매칭된 아이소타입 대조 항체이다.

연구 2의 경우, 선택된 항-PD-L1 항체의 투여는 종양 성장의 억제를 가져왔고, 이에 의해 종양 퇴행을 촉진시켰다(표 8). 시험된 모든 항-PD-L1 항체는 10 mg/㎏ 및 5 mg/㎏에서 효과적이었고, 실험 과정 전체에 걸쳐 용량 의존성 방식으로 처리된 마우스에서 종양 퇴행을 촉진시켰다. 대조 항체로 처리된 동물 중 무종양 동물은 없었다(표 8). 일원 ANOVA와 터키(Tukey)의 다중 비교 사후 검사는 0.05 미만 또는 그 이하의 p 값으로 항-PD-L1 항체와 대조 항체를 사용한 처리 사이의 종양 부피의 유의한 차이를 나타내었다. 대조군 1은 무관한 매칭된 아이소타입 대조군이다.

도 4 및 표 7과 표 8에 나타난 바와 같이, 항-PD-L1 항체는 실시예 1에 기술된 바와 같은 인간화 CD274 유전자를 갖는 마우스의 예방적 MC38.ova/hPD-L1 종양 성장 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제하였다. 10 mg/㎏ 및 5 mg/㎏에서 항-PD-L1 항체 요법은 실험 과정 전체에 걸쳐 모든 마우스에서 종양 퇴행을 촉진시켰고, 그 결과 21일째까지 10 mg/㎏ 그룹의 경우 6 마리의 마우스 중 3 마리가 무종양 상태로 남아 있었고, 5 mg/㎏ 처리 그룹의 경우 5 마리의 마우스 중 2 마리가 무종양 상태로 남아 있었지만, 대조 그룹의 경우 어떠한 동물도(0/6) 무종양 상태로 남아 있지 않았다(도 4). 일원 ANOVA와 던넷의 다중 비교 사후 검사는 0.01 미만의 p 값(5 mg/㎏ 처리 그룹) 및 0.0001 미만의 p 값(10 mg/㎏ 처리 그룹)으로 항-PD-L1과 대조 항체 처리 사이의 21일째 종양 부피에서 유의한 차이를 나타내었다.

유사한 실험에서, 항-PD-L1 항체로 처리된 종양을 가진 마우스의 비장세포에서 CD8⁺ 및 CD3⁺ T 세포 반응을 측정함으로써, 실시예 1에 기술된 바와 같은 인간화 CD274 유전자를 함유하는 마우스에서의 손상되지 않은 기능적 PD-L1 신호전달을 조사하였다.

간략하게 말하면, 21일째 실험 종료 시에 항-PD-L1 항체 또는 대조 항체로 처리된 실시예 1에 기술된 바와 같은 인간화 CD274 유전자를 함유하는 마우스로부터 비장세포를 단리하였다(상기 설명됨). 총 RNA를 단리하고, 마우스 CD8b, 마우스 CD3ζ(Mm00446171_m1, Applied Biosystems), 인간 PD-L1 및 마우스 PD-L1에 특이적인 올리고뉴클레오티드 및 TAQMAN™ 프로브 믹스(표 9)를 사용하여 역전사 cDNA에 대해 실시간 PCR을 수행하였다. 샘플을 마우스 사이클로필린 B의 발현에 대하여 정규화하였다. 예시적인 결과가 도 5에 제공되어 있다.

[표 9]

도 5에 도시된 바와 같이, 항-hPD-L1 항체의 투여는 인간화 CD274 유전자를 함유하고(실시예 1에 기술된 바와 같음) MC38.ova/hPD-L1 종양을 갖는 마우스의 비장세포에서 CD8⁺ 및 CD3⁺ T 세포 수의 증가를 유도하였다. 이는 MC38.ova 세포에 의한 PD-L1 발현이 항종양 CD8⁺ T 세포의 증식을 서프레싱(suppressing)할 수 없었다는 점에서 인간화 CD274 유전자를 함유하는 마우스(실시예 1에 기술된 바와 같음)가 세포 표면 상의 인간화 PD-L1을 통한 적절한 발현 및 신호전달을 입증함을 확인해준다. 전반적으로, 대조군 처리된 마우스와 비교하여 T 세포의 입증된 증가가 두 처리 그룹 모두에 대해 관찰되었지만, 일원 ANOVA와 던넷의 다중 비교 사후 검사를 사용하는 CD8b(0.01 미만의 p 값) 및 CD3(0.001 미만의 p 값) 수준의 통계적 차이는 10 mg/㎏ 항-PD-L1 항체 처리 그룹과 대조군 처리 그룹 사이에서만 달성되었다.

인간 PD-L1 mRNA 발현은 인간 PD-L1 폴리펩티드의 세포외 부분에 대해 설계된 인간 특이적 프로브(표 9)로 측정하였고, 세포 표면 상에서의 인간화 PD-L1 단백질의 적절한 발현을 확인하였다(도 5). 부가적으로, 마우스 PD-L1의 세포외 부분을 검출하도록 설계된 프라이머(표 9)를 사용한 마우스 PD-L1 mRNA 발현의 측정은 생성물을 생성하지 못했다. 이들 데이터는 표 5에 제시된 유동 세포계측 결과를 확인해주는 것으로, 즉, 인간화 PD-L1 마우스는 실제로 세포 표면 상에 손상되지 않고 기능적인 인간화 PD-L1을 발현한다.

종합해 보면, 본 실시예는 PD-L1을 표적화하는 약물(예를 들어, 항체)의 생체내 효능을 평가하기 위해 본 발명의 비인간 동물이 사용될 수 있으며, 이러한 동물이 항-PD-L1 항체의 치료 효과를 구별하는 데 유용함을 입증한다. 더욱이, 본 명세서에 기술된 비인간 동물은 PD-L1을 표적화하는 약물이 종양의 퇴행을 촉진하고/하거나 종양 세포의 치사를 중재할 수 있는 정도를 평가하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 비인간 동물(예를 들어, 마우스)은 세포 표면 상에서의 기능적 인간화 PD-L1 폴리펩티드의 발현 및 종양 모델에서 CD8⁺ T 세포의 PD-L1 의존성 서프레션의 억제를 통한 면역 반응의 적절한 PD-L1 조절을 입증한다.

균등물

본 발명의 적어도 하나의 실시 형태의 여러 태양을 이렇게 설명하였는 바, 당업자는 다양한 변경, 변형, 및 개선이 당업자에게 용이하게 떠오를 것임을 인식할 것이다. 이러한 변경, 변형, 및 개선은 본 개시 내용의 일부로 의도되며, 본 발명의 사상 및 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 따라서, 전술한 설명 및 도면은 단지 예일 뿐이며, 본 발명은 하기 청구범위에 의해 상세하게 기술된다.

청구항 요소를 수식하기 위해 청구범위에서 "제1", "제2", "제3" 등과 같은 서수 용어를 사용하는 것은 그 자체로 다른 요소에 대한 하나의 청구항 요소의 임의의 우선 순위, 선행, 또는 순서, 또는 방법의 행위들이 수행되는 시간 순서를 내포하지 않고, 청구항 요소를 구별하기 위해 특정 명칭을 갖는 하나의 청구항 요소를 (서수 용어를 사용한 것을 제외하고는) 동일한 명칭을 갖는 다른 요소와 구별하기 위한 표지로서 단지 사용된다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같은 단수 형태는 명확히 반대되는 표시가 없는 한 복수의 대상을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 그룹의 하나 이상의 구성원들 사이에 "또는"을 포함하는 청구범위 또는 상세한 설명은, 반대되는 표시가 없거나 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 그룹 구성원들 중 하나, 하나 초과, 또는 모두가 주어진 생성물 또는 방법에 존재하거나 이에 사용되거나 이와 다른 방식으로 관련되는 경우 만족되는 것으로 간주된다. 본 발명은 그룹 중 정확히 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 방법에 존재하거나, 이에 사용되거나 이와 다른 방식으로 관련되는 실시 형태를 포함한다. 또한, 본 발명은 하나 초과의 또는 전체 그룹 구성원이 주어진 생성물 또는 방법에 존재하거나, 이에 사용되거나 이와 다른 방식으로 관련되는 실시 형태를 포함한다. 또한, 본 발명은, 달리 표시되거나 모순 또는 불일치가 발생하리라는 것이 당업자에게 명백하지 않는 한, 열거된 청구항들 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한들, 요소들, 절들, 기술적인 용어들 등이 동일한 기본 청구항에 종속된 다른 청구항(또는 관련된 경우, 어느 다른 청구항)에 도입되는 모든 변화, 조합, 및 순열을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 요소들이 목록으로 제시되는 경우(예를 들어, 마쿠시(Markush) 그룹 또는 유사한 형식으로), 요소들의 각 하위 그룹이 또한 개시되며, 임의의 요소(들)가 그룹으로부터 제거될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 대체로, 본 발명, 또는 본 발명의 태양이 특정 요소, 특징 등을 포함하는 것으로 언급되는 경우, 본 발명의 특정 실시 형태 또는 본 발명의 태양은 그러한 요소, 특징 등으로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다는 것을 이해해야 한다. 단순화를 위해, 이들 실시 형태는 본 명세서에서 모든 경우에 그다지 많은 단어로 구체적으로 설명되지 않았다. 또한, 본 발명의 임의의 실시 형태 또는 태양은, 특정 배제가 본 명세서에 언급되어 있는지의 여부와 무관하게 청구범위로부터 명시적으로 배제될 수 있다는 것을 이해해야 한다.

당업자는 본 명세서에 기술된 검정 또는 다른 공정에서 얻어진 값에 기인할 수 있는 편차 또는 오차의 전형적인 표준을 인식할 것이다. 본 발명의 배경을 설명하고 그 실시에 관한 추가 세부사항을 제공하기 위해 본 명세서에 언급된 간행물, 웹사이트 및 다른 참고 자료는 본 명세서에 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> NON-HUMAN ANIMALS HAVING A HUMANIZED CLUSTER OF DIFFERENTIATION 274 GENE <130> 31971 (10133WO01) <150> 62/106,525 <151> 2015-01-22 <150> 62/089,549 <151> 2014-12-09 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3653 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 gaaatcgtgg tccccaagcc tcatgccagg ctgcacttgc acgtcgcggg ccagtctcct 60 cgcctgcaga tagttcccaa aacatgagga tatttgctgg cattatattc acagcctgct 120 gtcacttgct acgggcgttt actatcacgg ctccaaagga cttgtacgtg gtggagtatg 180 gcagcaacgt cacgatggag tgcagattcc ctgtagaacg ggagctggac ctgcttgcgt 240 tagtggtgta ctgggaaaag gaagatgagc aagtgattca gtttgtggca ggagaggagg 300 accttaagcc tcagcacagc aacttcaggg ggagagcctc gctgccaaag gaccagcttt 360 tgaagggaaa tgctgccctt cagatcacag acgtcaagct gcaggacgca ggcgtttact 420 gctgcataat cagctacggt ggtgcggact acaagcgaat cacgctgaaa gtcaatgccc 480 cataccgcaa aatcaaccag agaatttccg tggatccagc cacttctgag catgaactaa 540 tatgtcaggc cgagggttat ccagaagctg aggtaatctg 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agtgttctgg gtctgcaaaa attttgatta ctcatctcat 3720 ctgtaaaaca ttttgaactc gtgtgtttgt gcatgcacat ttgtgtgtaa ttataaaaat 3780 tttactttct gttaatatat aagttgtatc ataagaaact gccgtttttg aagagcaaaa 3840 aaaggttgaa tgttaccagt tacatctggt tcaacctaat agacatttgt acaaaaacag 3900 acattttaag aggttgaaat aaaaatttaa taaacaatat tttcagtttt tactaattgt 3960 gatgcttcac tatcattagc taatatgtca aggcataata taccttaggg tgaactttat 4020 cattaacaaa ggtggatggt gtcaataatc ttgaggtttg tgttttttta tataacactg 4080 cgaggtctaa ttaagtactt actgtttacc acctcataca gtggccgata aaaagtgtca 4140 cttctgctgt ttcctctggg ttgtgcttga attattagta ttatcttcag tcctcagttt 4200 ctttgtggga aactttttaa ttagttgttt aattttgtaa gatggttagt ttagtcaaaa 4260 ttagataaga gaatttgaaa atccgtagct accccaaagc aacctacaca taagaactat 4320 tatttttgtg ttttgaaatc ataattttat tgatttccag tgtttccact ggtagtggtt 4380 tcattgatat aggagtatca aaacatcact cattatttat ttcagtttca tttgatccta 4440 gccgttttgt attaactctc tgtgaagaaa ttacctcaca aatctattgc tgtccttggt 4500 aaaggaatgg agaattaagg ctctagatca ttagtggtta cactatagta ttagaagtaa 4560 aaaaaagatt ataccaacaa aataagaaca tgttaatgta cttgtaatga ataaacatga 4620 ataaagctct tatgctatat aggtgcacta aacaatctac tagaattgtc agcaaactac 4680 gtatcttaat cctgaaaggg tcccaaacca atgatctaaa attgaatcaa actttcttcc 4740 ttgagcataa ttacttaaat gatttattaa aatagccagc atttaaaagc ttaaaatgta 4800 aatatcataa tgtggtatcc tagatagcat cccagaacag aaaaaggata ttagggaaaa 4860 actggaggaa tggaataaat tatgcagttt agttattaat aatgtactaa cgtccttagt 4920 tatgacgatt gtaccatggt aatgtaagat actaacaata gaggaaaccg ggtaaggagt 4980 atacagtaac tctatactat ctttgcaact tttttgtaaa tttaaaactt ctaaaataaa 5040 gaacaaattt aaacattaaa aagtatcacc aggaacatat atcactgttt acagatgaaa 5100 tactatgtat tttcatatct aatttctgat cattgacttc aaatcagaaa agtgaatgac 5160 acctcaaaat caggttttct gtttactgaa gtctaagaaa agaaagcata ccagctggag 5220 agattcatgt ttataaagac agatttataa caacaaaaat aaaatatcca agaataaatt 5280 taagaagaag cactttactg agaaacatat gaaaacctga acaaatggag agggatattt 5340 tgtatttgaa tagaaagact tctggtttaa agataattct ctttaaatta ttttttgtag 5400 aaatttaagg ggtacaagag cagtgttgtc acatggatat attacatagt ggtgaagtct 5460 ggggttttag tgtaaattaa tctttacatt ttgtttgagc ccaataaatg taccaacatg 5520 atttttatag aaagatagtc attcctatta atccaaactt gtcccaactt tgaattgaat 5580 tgaggcagag ctagcaggtg ttccccacgg ctgaggcatc tgaacattaa gcatatccct 5640 ctgagaacca gcctgcattg atactctttc taatgtggac agcatcaagc tatgtacgta 5700 gttctgtgct cagcaaaagc cctgacttct ttttgtttat gtcctagccc catacaacaa 5760 aatcaaccaa agaattttgg ttgtggatcc agtcacctct gaacatgaac tgacatgtca 5820 ggctgagggc taccccaagg ccgaagtcat ctggacaagc agtgaccatc aagtcctgag 5880 tggtaagacc accaccacca attccaagag agaggagaag cttttcaatg tgaccagcac 5940 actgagaatc aacacaacaa ctaatgagat tttctactgc acttttagga gattagatcc 6000 tgaggaaaac catacagctg aattggtcat cccaggtaat attctgaatg tgtccattaa 6060 aatatgtcta acactgtccc ctagcaccta gcatgatgtc tgcctatcat agtcattcag 6120 tgattgttga ataaatgaat gaatgaataa cactatgttt acaaaatata tcctaattcc 6180 tcacctccat tcatccaaac catattgtta cttaataaac attcagcaga tatttatgga 6240 atataccttt tgttccatgc attgtagtac tcattggata cacatagaat aataagactc 6300 agttcacact cttcaggaaa cagataaaaa actaagaaac aaacaaaaaa caggcaatcc 6360 aacaccatgt gggaaatgct ttcatagccg ggaaacctgg ggaatacctg agaggaatac 6420 tcaattcagg ccttgtttca ggaatccaaa tcctggcaca tcagagctgc ttccctcttt 6480 ccagggtggc aggaaataaa tggaacatat ttttctatct tatgccaaac atgagggacc 6540 ctttctcccc ggtgcctctc ccaaggtagt ctacaatatt tcaactctag cagtctgctt 6600 agtgcataga acatgaggct gtgtgtccct gggcaaatta ctagacttct gtgtgcttca 6660 ctttccctgt aggattataa tctactgagc aagcttattg taagggtcag attagcaaca 6720 gtgtatgaaa atgatttgag accattgcct gcacaaattc aactattttt ttttatctca 6780 ctactctaca gaagtaggta gggtgggaga cagagtctga tgagaggctc agaatgtgaa 6840 agaaagtgag gcgagtgagc atgatattta atataaacac aaagatattc tgagaagagc 6900 tgctcactgc cccctccccc aatacatgtt gataggaaaa tgccacgtac ttcagcaaaa 6960 acaactgaaa aattagatag aaaagtcaat caataggaaa agataatcca ggacggtgtt 7020 gtgaacagaa agagggggaa aaaactttag aaaatgatgg ggatgctctt actggggtac 7080 gagtcctcag gtattgaact ggctttcagt aaaagctaga ttagtgggtt cctgccattt 7140 acaagctgtt ttatgacaac ttacttgttg ggtggcctac agtaactcac ctaactgcac 7200 tgagtctgtt tcctcatctg taaattgggg attttttttt aaatacctgg catgcctaac 7260 tcataaagtt gttctgaaac tgaaataaaa catacgtgaa caggcattgt aaactgtaag 7320 ttacggaaaa agctggctgt tgttgtgtct ttaaagtttc acctgggtag tcaaagatgg 7380 atcatgggtc tcagtggaga gctgagccag gcaggagctg actaagggtg agaggtggga 7440 gttagcagcc tctgaacatc tgtgtaccat gggaccccct ttcctcctgc atggtacccc 7500 agacaaggag cctagtaaga gatactaatg gcttgttgtc cagagatgtt caaactgcag 7560 agaaagataa gacaacaagc attggcctcc aatcatgatg acagatagga ggaggtggga 7620 gctccttagc agtgctggtt ggccttccat gttctactgt gggccatctc tgccatgtac 7680 tgtaggctac tagcttctat attaaagaat gcaagagggg ccaggagcgg aggctcatgc 7740 ctgtaatctc agcactttgg gaggccaagg tgggcagatc acttgaggtc aggagtttgt 7800 gaccagcctg gccaacatgg tgaaactctg cctttactaa aaatataaaa attagctggg 7860 tgtggtggtg tgcacctgta atcccagcta ctcgggagac tgaggcacaa gaattgcttg 7920 aacctgggag gcggaagttg cagtgagccc agattgcgcc actgcactcc accctgggca 7980 acagagaaag actctgcctc aaaaaaaaaa aaaaaaagca agaggaagtg aaataatcaa 8040 ggccgccatt taatagtgag cagccactcc atgtggtact gtgcaagcac attataaata 8100 ttagcctcac aagaaatgta ttagcatttg tattttgtac actggttaag tatcttgccc 8160 aagacctcaa aactggttaa gggcagcaga atttagcccc agcaccacct tttcaaagcc 8220 tgggcttctc acacttctcc atgctgttcc cattttaaca caggtatctc gccattccag 8280 ccactcaaac tttggcattt aagaaaatta tcctaaagct aaactaaact tcaaggatga 8340 ccattctcct gaccccttcc catcaaaatt ttatctttag tcagtttgtt ttcgttttgt 8400 tttgtttttc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aagg 8444 <210> 12 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 aactacctct ggcacatcct ccaaatgaaa ggactcactg ggtgcttctg ggatccatcc 60 tgttgttcct cattgtagtg tccacggtcc tcctcttctt gagaaaacaa g 111 <210> 13 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 13 taacctttta cccaggtttt cagatgtgtt tggaggagtt ttctgtcttc tgagggctgg 60 tcctctttcc ttttcagcgt ttactgtcag gttcccaagg acctatatgt ggtagagtat 120 ggtagcaata tgacaattga atgcaaattc ccagtagaa 159 <210> 14 <211> 240 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 14 tttgtattaa ctctctgtga agaaattacc tcacaaatct attgctgtcg ctagctcgct 60 accttaggac cgttatagtt actagcataa cttcgtatag catacattat acgaagttat 120 tccagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa 180 aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg 240 <210> 15 <211> 240 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 15 gtgaggaggg gggcgcccgc gggaggcgcc aaaacccggc gcggaggcca tgcatataac 60 ttcgtatagc atacattata cgaagttatc tcgagcttgg taaaggaatg gagaattaag 120 gctctagatc attagtggtt acactatagt attagaagta aaaaaaagat tataccaaca 180 aaataagaac atgttaatgt acttgtaatg aataaacatg aataaagctc ttatgctata 240 <210> 16 <211> 169 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 16 tttatcttta gtcagtttgt tttcgttttg ttttgttttt cagaactacc tctggcacat 60 cctccaaatg aaaggactca ctgggtgctt ctgggatcca tcctgttgtt cctcattgta 120 gtgtccacgg tcctcctctt cttgagaaaa caaggtattt cctccattg 169 <210> 17 <211> 230 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 17 tcctagccgt tttgtattaa ctctctgtga agaaattacc tcacaaatct attgctgtcg 60 ctagctcgct accttaggac cgttatagtt actagcataa cttcgtatag catacattat 120 acgaagttat ctcgagcttg gtaaaggaat ggagaattaa ggctctagat cattagtggt 180 tacactatag tattagaagt aaaaaaaaga ttataccaac aaaataagaa 230 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 18 ccggctgttg aaggaccag 19 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 19 tctccctggg aaatgctgca cttcag 26 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 20 tgcatcctgc aatttcacat ctg 23 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 21 acacaggtat ctcgccattc c 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 22 agccactcaa actttggcat t 21 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 23 ggtcatcctt gaagtttagt ttagc 25 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 24 caggacgcag gcgtttac 18 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 25 ctgcataatc agctacggtg gtgcgg 26 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 26 ttcagcgtga ttcgcttgta g 21 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 27 ctggagtgcc caagagtc 18 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 28 cagacatgga agaaacacaa cccgcac 27 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 29 ctgctaagcc gcttctgtc 19 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 30 gctctggctg gtcttcagta tg 22 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 31 agcagctctg ccctcat 17 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 32 ttgccgtatg gttggtttga ac 22 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 33 acagcctgct gtcacttgc 19 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 34 tacgggcgtt tactgtcac 19 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 35 accacatata ggtccttggg aac 23 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 36 ttctcaatgt gaccagcagt c 21 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 37 agggtcaacg ccacagcgaa tga 23 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 38 tcctgttctg tggaggatgt g 21

Claims

내인성 CD274 유전자좌에서 인간화된 CD274 유전자를 포함하는 게놈을 갖는, 인간화된 CD274 폴리펩티드를 발현하기 위한 유전자 변형된 설치류로서,
상기 인간화된 CD274 유전자는
(i) 내인성 설치류 CD274 폴리펩티드의 세포내 서열 및 막관통 서열을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(ii) 설치류 CD274 프로모터
에 작동가능하게 연결된 인간 CD274 폴리펩티드의 세포외 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고,
상기 설치류는 인간화된 CD274 폴리펩티드를 발현하고,
상기 설치류는 마우스 또는 래트인, 유전자 변형된 설치류.
제1 항에 있어서, 내인성 설치류 CD274 폴리펩티드의 세포내 서열 및 막관통 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 내인성 설치류 CD274 유전자의 엑손 6, 엑손 7, 및 엑손 5의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 설치류.
제1 항에 있어서, 인간화된 CD274 유전자는 내인성 설치류 CD274 유전자의 엑손 1 및 엑손 2를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 설치류.
제1 항에 있어서, 인간 CD274 폴리펩티드의 세포외 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 CD274 유전자의 엑손 3, 엑손 4, 및 엑손 5의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 설치류.
제1 항에 있어서, 인간 CD274 폴리펩티드의 세포외 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 CD274 폴리펩티드의 아미노산 19-238을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 설치류.
제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류 CD274 프로모터는 내인성 설치류 CD274 프로모터인 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 설치류.
제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 CD274 유전자는 인간 CD274 유전자의 게놈 단편으로의 내인성 설치류 CD274 유전자의 게놈 단편의 대체로부터 기인하고, 인간 CD274 유전자의 게놈 단편은 인간 CD274 유전자의 엑손 3, 엑손 4, 및 엑손 5의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 설치류.
제7 항에 있어서, 인간화된 CD274 유전자는 내인성 설치류 CD274 유전자의 엑손 1 및 엑손 2, 인간 274 유전자의 엑손 3, 엑손 4, 및 엑손 5의 일부, 그리고 내인성 설치류 CD274 유전자의 엑손 6, 엑손 7, 및 엑손 5의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 설치류.
내인성 CD274 유전자좌에서 인간화된 CD274 유전자를 포함하는 게놈을 갖는, 인간화된 CD274 폴리펩티드를 발현하기 위한 단리된 설치류 세포로서,
상기 인간화된 CD274 유전자는
(i) 내인성 설치류 CD274 폴리펩티드의 세포내 서열 및 막관통 서열을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(ii) 설치류 CD274 프로모터
에 작동가능하게 연결된 인간 CD274 폴리펩티드의 세포외 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고,
단리된 설치류 세포는 인간화된 CD274 폴리펩티드를 발현하고, 마우스 세포 또는 래트 세포인, 단리된 설치류 세포.
내인성 CD274 유전자좌에서 인간화된 CD274 유전자를 포함하는 게놈을 갖는, 인간화된 CD274 폴리펩티드를 발현하기 위한 단리된 설치류 조직으로서,
상기 인간화된 CD274 유전자는
(i) 내인성 설치류 CD274 폴리펩티드의 세포내 서열 및 막관통 서열을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(ii) 설치류 CD274 프로모터
에 작동가능하게 연결된 인간 CD274 폴리펩티드의 세포외 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고,
단리된 설치류 조직은 인간화된 CD274 폴리펩티드를 발현하고, 마우스 조직 또는 래트 조직인, 단리된 설치류 조직.
내인성 CD274 유전자좌에서 인간화된 CD274 유전자를 포함하는 게놈을 갖는, 인간화된 CD274 폴리펩티드를 발현하는 설치류를 제조하기 위한 단리된 설치류 배아 줄기 (ES) 세포로서,
상기 인간화된 CD274 유전자는
(i) 내인성 설치류 CD274 폴리펩티드의 세포내 서열 및 막관통 서열을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(ii) 설치류 CD274 프로모터
에 작동가능하게 연결된 인간 CD274 폴리펩티드의 세포외 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고,
인간화된 CD274 유전자는 인간화된 CD274 폴리펩티드를 인코딩하고,
설치류 ES 세포는 마우스 ES 세포 또는 래트 ES 세포인, 단리된 설치류 배아 줄기 세포.
인간화된 CD274 폴리펩티드를 발현하는 설치류 동물을 제조하기 위한 설치류 배아로서, 설치류 배아는 제11 항의 배아 줄기 세포를 포함하고, 마우스 배아 또는 래트 배아인, 설치류 배아.
인간화된 CD274 폴리펩티드를 발현하는 유전자 변형된 설치류를 제조하는 방법으로서,
(a) 인간 CD274 폴리펩티드의 세포외 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 단리된 설치류 ES 세포의 내인성 설치류 CD274 유전자에 삽입하여 인간화된 CD274 유전자를 형성하는 단계로서,
상기 인간화된 CD274 유전자는
(i) 내인성 설치류 CD274 폴리펩티드의 세포내 서열 및 막관통 서열을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(ii) 설치류 CD274 프로모터
에 작동가능하게 연결된 인간 CD274 폴리펩티드의 세포외 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단계; 및
(b) (a)에서 얻어진 인간화된 CD274 유전자를 포함하는 설치류 ES 세포를 사용하여 설치류를 제조하는 단계로서, 설치류의 게놈은 내인성 설치류 CD274 유전자좌에서 인간화된 CD274 유전자를 포함하고, 설치류는 인간화된 CD274 폴리펩티드를 발현하고 마우스 또는 래트인, 단계
를 포함하는, 방법.
인간화된 CD274 유전자를 포함하는 게놈을 갖는, 인간화된 CD274 폴리펩티드를 발현하는 유전자 변형된 설치류를 제조하는 방법으로서, 방법은
변형된 게놈이 내인성 CD274 유전자좌에서 인간화된 CD274 유전자를 포함하도록 설치류의 게놈을 변형시키는 단계를 포함하는 단계로서, 상기 인간화된 CD274 유전자는
(i) 내인성 설치류 CD274 폴리펩티드의 세포내 서열 및 막관통 서열을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(ii) 설치류 CD274 프로모터
에 작동 가능하게 연결된 인간 CD274 폴리펩티드의 세포외 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단계; 및
변형된 설치류 게놈을 포함하는 설치류를 제조하는 단계로서, 설치류는 인간화된 CD274 폴리펩티드를 발현하는, 단계
를 포함하는, 방법.
제13 항 또는 제14 항에 있어서, 인간 CD274 폴리펩티드의 세포외 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 CD274 유전자의 엑손 3, 엑손 4, 및 엑손 5의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13 항 또는 제14 항에 있어서, 인간 CD274 폴리펩티드의 세포외 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 CD274 폴리펩티드의 아미노산 19-238을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13 항 또는 제14 항에 있어서, 내인성 설치류 CD274 폴리펩티드의 세포내 서열 및 막관통 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 내인성 설치류 CD274 유전자의 엑손 6, 엑손 7, 및 엑손 5의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13 항 또는 제14 항에 있어서, 인간화된 CD274 유전자는 내인성 설치류 CD274 유전자의 엑손 1 및 엑손 2를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13 항 또는 제14 항에 있어서, 설치류 CD274 프로모터는 내인성 설치류 CD274 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제13 항 또는 제14 항에 있어서, 인간 CD274 유전자는 인간 CD274 유전자의 게놈 단편으로의 내인성 설치류 CD274 유전자의 게놈 단편의 대체로부터 기인하고, 인간 CD274 유전자의 게놈 단편은 인간 CD274 유전자의 엑손 3, 엑손 4, 및 엑손 5의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제20 항에 있어서, 인간화된 CD274 유전자는 내인성 설치류 CD274 유전자의 엑손 1 및 엑손 2, 인간 CD274 유전자의 엑손 3, 엑손 4, 및 엑손 5의 일부, 그리고 내인성 설치류 CD274 유전자의 엑손 6, 엑손 7, 및 엑손 5의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
종양을 치료할 수 있는 약물을 스크리닝하는 방법으로서, 방법은
(a) 종양 세포를 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항의 설치류에 투여하여 설치류에서 종양이 형성되는 단계,
(b) 약물을 단계 (a)의 설치류에 투여하는 단계, 및
(c) 단계 (b)의 설치류에서 종양 성장이 감소되는지를 결정하는 단계로서, 종양 성장을 감소시키는 약물은 종양을 치료할 수 있는 단계
를 포함하는, 방법.
제22 항에 있어서, 약물은 인간 CD274에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제22 항에 있어서, 약물은 설치류에 정맥내, 복강내, 근내, 또는 피하 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
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