RS61218B1 - Životinja koja nije čovek sa humanizovanim klasterom diferencijacije 274 gena - Google Patents

Description

Opis

UNAKRSNE REFERENCE U VEZI SA PRIJAVAMA

STANJE TEHNIKE

[0001] Uprkos značajnom napretku u lečenju autoimunosti, raka i zaraznih bolesti, glavni izazovi u globalnoj zdravstvenoj industriji ostaju. Ovi glavni izazovi su delimično posledica sposobnosti ćelija da moduliraju imuni odgovor putem polipeptida na ćelijskoj površini. Preko nekih ćelijskih površinskih polipeptida ćelije i mikroorganizmi su uzurpirali signalne puteve kako bi umanjili mehanizme nadzora imunološkog sistema domaćina i inhibirali imuni odgovor na njih, što dovodi do razvoja fenotipa bolesti. Ipak, nedostaje razvoj in vivo sistema za optimalno određivanje terapeutskog potencijala novih cilјanih terapija za autoimunost, rak i zarazne bolesti koji su dizajnirani da moduliraju imuni odgovor na takve patologije bolesti i utvrde molekularne aspekte kako takve ćelije manipulišu imunološkim odgovorima. Takvi in vivo sistemi obezbeđuju izvor za testove za procenu terapijske efikasnosti i razvoj sredstava kandidata za lečenje autoimunosti, raka i zaraznih bolesti u budućnosti.

[0002] WO 2011/066389 opisuje humana monoklonska antitela usmerena protiv B7-H1 i njihovu upotrebu u dijagnozi i lečenju bolesti povezanih sa B7-H1.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0003] Predmetni pronalazak obuhvata prepoznavanje da je poželjno da se proizvedu nehumane životinje kako bi se omogućili poboljšani in vivo sistemi za identifikaciju i razvoj novih terapija i, u nekim realizacijama, terapijskih režima, koji se mogu koristiti za lečenje autoimunosti, zapaljenskih oboljenja i raka. Predmetni pronalazak obuhvata takođe prepoznavanje da je poželjno da se proizvedu ne-humane životinje kako bi se omogućili poboljšani in vivo sistemi za identifikaciju i, u nekim realizacijama, terapijskih režima, koji se mogu koristiti za lečenje autoimunosti, zapaljenskih infektivnih bolesti. Dalje, predmetni pronalazak, takođe, obuhvata prepoznavanje da su poželjne ne-humane životinje koje imaju humanizovani CD274 gen i /ili na drugi način eksprimuju, sadrže ili proizvode humani ili humanizovani PD-L1 polipeptid su poželjni, na primer za upotrebu u identifikovanju i razvoju terapija koje regulišu podizanje anti-tumorskog i/ili antimikrobnog imuniteta. Glodari iz ovog pronalaska obezbeđuju unapređene in vivo sisteme za identifikaciju i razvoj kombinovane terapije koji uklјučuju cilјanje PD-L1 ili indirektno cilјanje PD-L1 vezujućeg partnera (npr. PD-1, B7-1).

[0004] Predmetni pronalazak obezbeđuje glodara koji ima genom koji sadrži CD274 gen koji uklјučuje genetski materijal iz dve različite vrste (npr. čovek i glodar). CD274 gen glodara, kako je ovde opisano, kodira PD-L1 polipeptid koji sadrži humane i delove glodara, pri čemu su humani i delovi glodara povezani zajedno i formiraju funkcionalni PD-L1 polipeptid. Deo glodara uklјučuje endogeni deo. CD274 gen glodara, kako je ovde opisano, kodira PD-L1 polipeptid koji sadrži vanćelijski domen, u celini ili delimično, humanog PD-L1 polipeptida.

[0005] Predmetni pronalazak obezbeđuje glodara koji eksprimuje PD-L1 polipeptid, a PD-L1 polipeptid sadrži humani deo i endogeni deo. U nekim realizacijama, PD-L1 polipeptid predmetnog pronalaska se prevodi u ćeliju glodara sa ne-humanim signalnim peptidom; u nekim određenim realizacijama, signalnim peptidom glodara.

[0006] Endogeni deo sadrži intracelularni deo endogenog PD-L1 polipeptida. Endogeni deo dalje sadrži transmembranski deo endogenog PD-L1 polipeptida. U nekim realizacijama, endogeni deo ima sekvencu amino-kiseline koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identična odgovarajućoj sekvenci amino-kiseline mišjeg PD-L1 polipeptida prikazanog na slici 6. U nekim realizacijama, endogeni deo ima sekvencu amino-kiseline koja je suštinski identična odgovarajućoj sekvenci amino-kiseline mišjeg PD-L1 polipeptida koja je prikazana na slici 6. U nekim realizacijama, endogeni deo ima sekvencu amino-kiseline koja je identična odgovarajućoj sekvenci amino-kiseline mišjeg PD-L1 polipeptida koja je prikazana na slici 6.

[0007] U nekim realizacijama, humani deo sadrži amino-kiseline 19-238 humanog PD-L1 polipeptida. U nekim realizacijama, humani deo sadrži amino-kiseline 19-277 humanog PD-L1 polipeptida. U nekim realizacijama, humani deo sadrži amino-kiseline 19-131 humanog PD-L1 polipeptida. U nekim realizacijama, humani deo sadrži sekvencu amino-kiseline koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična odgovarajućoj sekvenci amino-kiseline humanog PD-L1 polipeptida koja se pojavljuje na slici 6. U nekim realizacijama, humani deo sadrži sekvencu aminokiseline koja je u osnovi identična odgovarajućoj sekvenci amino-kiseline humanog PD-L1 polipeptida koja je prikazana na slici 6. U nekim realizacijama, humani deo sadrži sekvencu amino-kiseline koja je identična odgovarajućoj sekvenci amino-kiseline humanog PD-L1 polipeptida koja je prikazana na slici 6.

[0008] PD-L1 polipeptid je kodiran CD274 genom koji sadrži endogenu sekvencu CD274 glodara i sekvencu humanog CD274. U nekim određenim realizacijama, CD274 gen sadrži endogene CD274 eksone 1, 2, 6 i 7. U nekim određenim realizacijama, endogeni CD274 gen dalje sadrži endogeni CD274 ekson 5 u celini ili delimično. U nekim realizacijama, gen CD274 koji uklјučuje endogenu sekvencu CD274 glodara i humanu CD274 sekvencu nalazi se na endogenom CD274 lokusu.

[0009] U nekim realizacijama, CD274 gen predmetnog pronalaska sadrži sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98 % identična sa SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 ili SEQ ID NO:16. U nekim realizacijama, CD274 gen predmetnog pronalaska sadrži sekvencu koja je u osnovi identična sa SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 ili SEQ ID NO:16. U nekim realizacijama, CD274 gen predmetnog pronalaska sadrži sekvencu koja identična sa SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 ili SEQ ID NO:16.

[0010] U nekim realizacijama, gen CD274 predmetnog pronalaska sadrži SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16. U nekim realizacijama, CD274 gen ovog pronalaska sadrži SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 16. U nekim realizacijama, gen CD274 predmetnog pronalaska sadrži SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 13. U nekim realizacijama, gen CD274 predmetnog pronalaska sadrži SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 17. U nekim realizacijama, CD274 gen predmetnog pronalaska sadrži SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 17.

[0011] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje humanizovani CD274 lokus. Humanizovani CD274 lokus je endogeni CD274 lokus koji je genetski modifikovan tako da uklјučuje sekvencu humanog CD274. U nekim realizacijama, ovaj pronalazak pruža humanizovani CD274 lokus koji sadrži jedan ili više eksona gena CD274 glodara operativno povezanih sa jednim ili više eksona, u celini ili delimično, humanog CD274 gena. U nekim realizacijama, humanizovani CD274 lokus dalje sadrži 5’ i 3’ neeksprimovane regione (UTR) CD274 koji nije humani, a koji obrubljuju jedan ili više eksona humanog CD274 gena. Humanizovani CD274 lokus je pod kontrolom endogenog promotora glodara.

[0012] U nekim realizacijama, humanizovani CD274 lokus sadrži CD274 eksone 1, 2, 6 i 7 glodara koji su operativno povezani sa humanim CD274 eksonima 3 i 4. U nekim realizacijama, humanizovani CD274 lokus sadrži eksone 1, 2, 6 i 7 glodarskog CD274, humane CD274 eksone 3 i 4, i dalje sadrži CD274 ekson 5, koji CD274 ekson 5 sadrži humani deo i deo glodara, i pri čemu su dati eksoni koji su deo glodara i humani eksoni operativno povezani. U nekim realizacijama, humani deo CD274 eksona 5 uklјučuje nukleotide koji kodiraju ostatke amino-kiselina koji su deo vanćelijskog domena humanog PD-L1 polipeptida. U nekim realizacijama, humani deo CD274 eksona 5 uklјučuje nukleotide koji kodiraju ostatke amino-kiselina 229-238 humanog PD-L1 polipeptida. U nekim realizacijama, humani deo CD274 eksona 5 uključuje oko 32 bp humanog CD274 eksona 5. U nekim realizacijama, deo glodara CD274 eksona 5 uključuje nukleotide koji kodiraju transmembransku sekvencu. U nekim realizacijama, deo glodara CD274 eksona 5 uklјučuje oko 69 bp CD274 glodara eksona 5. U nekim određenim realizacijama, humanizovani CD274 lokus sadrži CD274 ekson 5 koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 12. U nekim određenim realizacijama, humanizovani CD274 lokus sadrži CD274 ekson 5 koji kodira amino-kiseline koje odgovaraju L229-R238 humanog PD-L1 polipeptida i amino-kiseline koje odgovaraju T238-K263 PD-L1 polipeptida glodara.

[0013] Predmetni pronalazak obezbeđuje glodara koji sadrži CD274 gen koji sadrži endogeni deo i humani deo, pri čemu su endogeni i humani delovi operativno povezani sa CD274 promotorem glodara. Promotor CD274 je endogeni promotor CD274 glodara.

[0014] U nekim realizacijama, endogeni deo sadrži endogene CD274 eksone 1, 2, 6 i 7. U nekim realizacijama, endogeni deo dalje obuhvata endogeni CD274 ekson 5 u celini ili delom. U nekim realizacijama, endogeni CD274 eksoni 1, 2 i 5 u celini ili delimično, 6 i 7 endogenog CD274 gena su najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identični odgovarajućim eksonima 1, 2, 5 u celini ili delimično, 6 i 7 mišjeg Cd274 gena koji se pojavljuje na slici 6. U nekim realizacijama, endogeni CD274 eksoni 1, 2, 5 u celini ili delimično, 6 I 7 endogenog CD274 gena su u osnovi identični odgovarajućim eksonima 1, 2, 5 u celini ili delimično, 6 I 7 mišjeg Cd274 gena koji se pojavljuje na slici 6. U nekim realizacijama, endogeni CD274 eksoni 1, 2, 5 u celini ili delimično, 6 I 7 endogenog CD274 gena su u osnovi identični odgovarajućim eksonima 1, 2, 5 u celini ili delimično, 6 I 7 mišjeg Cd274 gena koji se pojavljuje na slici 6.

[0015] U nekim realizacijama, humani deo kodira amino-kiseline 19-131, 19-227 ili 19-238 humanog PD-L1 polipeptida.

[0016] U nekim realizacijama, humani deo sadrži eksone 3 i 4 humanog CD274 gena. U nekim realizacijama, humani deo dalje sadrži humani CD274 ekson 5 u celini ili delimično. U nekim realizacijama, humani CD274 eksoni 3, 4 i 5 u celini ili delimično, su najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identični odgovarajućim eksonima 3, 4 i 5, u celini ili delimično, humanog CD274 gena koji se pojavljuje na slici 6. U nekim realizacijama, humani CD274 exons 3, 4, i 5 u celini ili delimično, su u osnovi identični odgovarajućim eksonima 3, 4 i 5, u celini ili delimično, humanog CD274 gena koji se pojavljuje na slici 6. U nekim realizacijama, humani CD274 eksoni 3, 4 i 5 u celini ili delimično, identični su odgovarajućim eksonima 3, 4 i 5, u celini ili delimično humanog CD274 gena koji se pojavljuje na slici 6. U nekim realizacijama, humani deo sadrži sekvencu koja je kodon-optimizovana za ekspresiju kod glodara; u nekim određenim realizacijama, za ekspresiju kod miša ili pacova.

[0017] U nekim realizacijama, humani deo sadrži sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, ili najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ili SEQ ID NO:12. U nekim realizacijama, humani deo sadrži sekvencu koja je u osnovi identična SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ili SEQ ID NO:12. U nekim realizacijama, humani deo sadrži sekvencu koja je u osnovi identična SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ili SEQ ID NO:12. U nekim realizacijama, humani deo sadrži sekvencu koja uključuje SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ili SEQ ID NO:12. U nekim realizacijama, humani deo sadrži sekvencu koja je identična ili suštinski identična SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8 ili SEQ ID NO:11. U nekim realizacijama, humani deo sadrži SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8 ili SEQ ID NO:11.

[0018] U nekim realizacijama, glodar predmetnog pronalaska ima genom koji sadrži gen CD274 koji sadrži SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 ili njihovu kombinaciju.

[0019] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje PD-L1 polipeptid proizveden, eksprimovan ili stvoren od glodara kako je ovde opisano. U nekim određenim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden, eksprimovan ili stvoren od glodara, kao što je ovde opisano, sadrži sekvencu amino-kiselina koja je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identična sa humanim PD-L1 polipeptidom koji se pojavljuje na slici 6. U nekim određenim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden, eksprimovan ili stvoren od glodara kako je ovde opisano sadrži sekvencu aminokiselina koja je u osnovi identična humanizovanom PD-L1 polipeptidu koji se pojavlјuje na slici 6. U nekim određenim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden, eksprimovan ili stvoren od glodara kako je ovde opisano sadrži sekvencu amino-kiselina koja je identična humanizovanom PD-L1 polipeptidu koji se pojavlјuje na slici 6.

[0020] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovanu ćeliju ili tkivo glodara kako je ovde opisano. Izolovana ćelija ili tkivo sadrži CD274 gen kako je ovde opisano. U nekim realizacijama, ćelija je iz limfoidne loze. U nekim realizacijama, ćelija potiče iz mijeloidne loze. U nekim realizacijama, ćelija se bira između B ćelije, dendritične ćelije, makrofaga, monocita i T ćelije. U nekim realizacijama, tkivo se bira između masnog tkiva, bešike, mozga, dojke, koštane srži, oka, srca, creva, bubrega, jetre, pluća, limfnog čvora, mišića, pankreasa, plazme, seruma, kože, slezine, želuca, timusa, testisa, jajnika i njihove kombinacije.

[0021] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovanu matičnu ćeliju embriona glodara čiji genom sadrži CD274 gen kako je ovde opisano. U nekim realizacijama, embrionalna matična ćelija glodara je embrionalna matična ćelija miša i potiče od soja 129, C57BL soja ili njihove smeše. U nekim realizacijama, embrionalna matična ćelija glodara je embrionalna matična ćelija miša i smeša 129 i C57BL sojeva.

[0022] U nekim realizacijama, embrionalna matična ćelija glodara predmetnog pronalaska ima genom koji sadrži CD274 gen koji sadrži SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 ili njihovu kombinaciju.

[0023] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu embrionalnih matičnih ćelija glodara, kako je ovde opisano, za stvaranje glodara. U nekim određenim realizacijama, embrionalna matična ćelija koja nije humana je embrionalna matična ćelija miša i koristi se za pravljenje miša koji sadrži CD274 gen kako je ovde opisano. U nekim određenim realizacijama, embrionalna matična ćelija koja nije humana je embrionalna matična ćelija pacova i koristi se za dobijanje pacova koji sadrži CD274 gen kako je ovde opisano.

[0024] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje embrion glodara koji sadrži, napravlјen je od, dobijen je ili je stvoren od matične ćelije embriona glodara koja sadrži CD274 gen kako je ovde opisano. Embrion je embrion glodara; u nekim realizacijama, mišji embrion; u nekim realizacijama embrion pacova.

[0025] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu embriona glodara, kako je ovde opisano, za stvaranje glodara. U nekim određenim realizacijama, embrion koji nije humani je mišji embrion i koristi se za dobijanje miša koji sadrži CD274 gen kako je ovde opisano. U nekim određenim realizacijama, embrion koji nije humani je embrion pacova i koristi se za dobijanje pacova koji sadrži CD274 gen kako je ovde opisano.

[0026] Ovde je, takođe, otkriven ciljajući vektor ili konstrukt nukleinske kiseline. Ovde je, takođe, stavljen na uvid javnosti ciljajući vektor ili konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži humanizovani CD274 gen kao što je ovde opisano. Ovde je, takođe, stavljen na uvid javnosti ciljajući vektor (ili konstrukt nukleinske kiseline) koji sadrži CD274 gen koji kodira PD-L1 polipeptid koji u celini ili u delu sadrži humani vanćelijski domen u celini ili delimično; u nekim određenim realizacijama, PD-L1 polipeptid koji sadrži amino-kiseline 19-131, 19-227 ili 19-238 humanog PD-L1 polipeptida.

[0027] U nekim primerima, ciljajući vektor ili konstrukt nukleinske kiseline ovog pronalaska sadrži jedan ili više eksona, u celini ili delimično, CD274 gena koji nije humani, a koji je operativno povezan sa jednim ili više eksona, u celini ili delimično, humanog CD274 gena. U nekim primerima, ciljajući vektor ili konstrukt nukleinske kiseline sadrži 5’ i 3’ neprevedenih regiona CD274 (UTR) koji nije humani, a koji obrubljuju jedan ili više eksona humanog CD274 gena. U nekim primerima, ciljajući vektor ili konstrukt nukleinske kiseline sadrži jedan ili više selekcionih markera. U nekim primerima, ciljajući vektor ili konstrukt nukleinske kiseline sadrži jedno ili više mesta rekombinacije specifične za lokacije. U nekim primerima, ciljajući vektor ili konstrukt nukleinske kiseline sadrži humane CD274 eksone 3 i 4. U nekim primerima, ciljajući vektor ili konstrukt nukleinske kiseline sadrži humane CD274 eksone 3 i 4 i humani CD274 ekson 5 u celini ili delimično.

[0028] U nekim primerima, ciljajući vektor ili konstrukt nukleinske kiseline sadrži SEQ ID NO:7. U nekim određenim primerima, ciljajući vektor ili konstrukt nukleinske kiseline sadrži sekvencu koja je identična ili suštinski identična bilo kojoj od SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 i SEQ ID NO:11.

[0029] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu ciljajućeg vektora ili konstrukta nukleinske kiseline kako je ovde opisano za izradu modifikovane matične ćelije embriona glodara. U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu ciljajućeg vektora ili konstrukta nukleinske kiseline kako je ovde opisano za izradu modifikovane ćelije glodara. U nekim primerima, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu ciljajućeg vektora ili konstrukta nukleinske kiseline kako je ovde opisano za stvaranje modifikovanog embriona glodara. U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu ciljajućeg vektora ili konstrukta nukleinske kiseline kako je ovde opisano za stvaranje glodara.

[0030] U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje glodara koji eksprimuje PD-L1 polipeptid iz endogenog CD274 gena, pri čemu PD-L1 polipeptid sadrži humanu sekvencu, a postupak uključuje (a) inserciju genomskog fragmenta u endogeni CD274 gen u embrionalnoj matičnoj ćeliji glodara, pri čemu dati genomski fragment sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humani PD-L1 polipeptid u celini ili delimično; (b) dobijanje embrionalne matične ćelije glodara generisane u (a); i (c) stvaranje glodara pomoću embrionalne matične ćelije glodara iz (b).

[0031] U nekim realizacijama, humana sekvenca sadrži amino-kiseline 19-131, 19-227 ili 19-238 humanog PD-L1 polipeptida.

[0032] U nekim realizacijama, nukleotidna sekvenca sadrži humane CD274 eksone 3 i 4. U nekim realizacijama, nukleotidna sekvenca nadalje sadrži humani CD274 ekson 5, u celini ili delimično. U nekim realizacijama, nukleotidna sekvenca sadrži jedan ili više selekcionih markera. U nekim realizacijama, nukleotidna sekvenca sadrži jedno ili više mesta rekombinacije specifične za lokacije.

[0033] U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za pravljenje glodara čiji genom sadrži CD274 gen koji kodira PD-L1 polipeptid koji ima humani deo i endogeni deo, a delovi su operativno povezani sa CD274 promotorom glodara, postupak uključuje modifikaciju genoma glodara tako da sadrži CD274 gen koji kodira PD-L1 polipeptid koji ima humani deo i endogeni deo, a delovi operativno povezani sa CD274 promotorom glodara, čineći tako pomenutu ne-humanu životinju. CD274 promotor je endogeni promotor CD274 glodara.

[0034] U nekim realizacijama, humani deo sadrži amino-kiseline 19-131, 19-227 ili 19-238 humanog PD-L1 polipeptida.

[0035] U nekim realizacijama, gen CD274 je modifikovan da uklјučuje humane CD274 eksone 3 i 4. U nekim realizacijama, gen CD274 je modifikovan da uklјučuje humane CD274 eksone 3, 4 i 5 u celini ili delimično.

[0036] U nekim realizacijama, modifikovanje genoma glodara vrši se u embrionalnoj matičnoj ćeliji glodara, praćeno stvaranjem glodara sa datom matičnom ćelijom glodara. Embrionalna matična ćelija je embrionalna matična ćelija glodara; u nekim realizacijama, embrionalna matična ćelija miša; u nekim realizacijama embrionalna matična ćelija pacova.

[0037] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje glodara koji se može dobiti, stvoriti ili proizvesti postupkom kako je ovde opisano.

[0038] Ovde je otkriven postupak smanjenja, prevencije ili eliminacije rasta tumora kod glodara, postupak obuhvata korake davanja leka koji cilja humani PD-L1 glodara čiji genom sadrži CD274 gen koji kodira PD-L1 polipeptid koji ima humani deo glodara i endogeni deo, a delovi operativno povezani sa CD274 promotorom glodara; davanje se vrši pod uslovima i u vremenu dovoljnom da se rast tumora kod glodara smanji, spreči ili eliminše.

[0039] Ovde je otkriven postupak ubijanja tumorskih ćelija kod glodara, postupak koji obuhvata korake davanja leka koji cilja humani PD-L1 glodara čiji genom sadrži CD274 gen koji kodira PD-L1 polipeptid koji ima humani i endogeni deo, a delovi su operativno povezani sa CD274 promotorom glodara; davanje se vrši pod uslovima i sa dovoljno vremena da lek posreduje u ubijanju ćelija tumora kod glodara.

[0040] Ovde je otkriven postupak procene farmako-kinetičkih svojstava leka koji cilja humani PD-L1, postupak koji obuhvata korake davanja leka koji cilja humani PD-L1 glodara čiji genom sadrži CD274 gen koji kodira PD-L1 polipeptid koji ima humani deo i endogeni deo, a delovi su operativno povezani sa CD274 promotorom glodara; i obavljanje testa za utvrđivanje jednog ili više farmako-kinetičkih svojstava leka koji cilja humani PD-L1.

[0041] Ovde je otkriven postupak za procenu efikasnosti leka koji cilja humani PD-L1, postupak koji obuhvata korake davanja leka koji cilja humani PD-L1 glodara čiji genom sadrži CD274 gen koji kodira PD-L1 polipeptid koji ima humani deo i endogeni deo, a delovi su operativno povezani sa CD274 promotorom glodara; i obavljanje testa za utvrđivanje leka koji cilja humani PD-L1.

[0042] Životinja, kao što je ovde opisana, je glodar čiji genom uključuje CD274 gen koji kodira PD-L1 polipeptid koji ima humani deo i endogeni deo, a delovi su operativno povezani sa CD274 promotorom glodara. CD274 promotor glodara je endogeni CD274 promotor glodara. U raznim realizacijama, humani deo sadrži amino-kiseline 19-131, 19-227 ili 19-238 humanog PD-L1 polipeptida.

[0043] U nekim realizacijama, lek koji cilja humani PD-L1 je PD-L1 antagonist. U nekim realizacijama, lek koji cilja humani PD-L1 je PD-L1 agonist. U nekim realizacijama, lek koji cilja humani PD-L1 je anti-PD-L1 antitelo. U nekim realizacijama, lek koji cilja humani PD-L1 daje se glodaru intravenski, intraperitonealno, intramuskularno ili supkutano.

[0044] Ovde je otkriven postupak za identifikaciju ili validaciju leka ili vakcine, postupak obuhvata korake isporuke leka ili vakcine glodaru čiji genom sadrži CD274 gen kao ovde opisan i monitoring jednog ili više imunoloških odgovora na lek ili vakcinu, bezbednosnog profila leka ili vakcine, ili efekta na bolest, poremećaj ili stanje. U nekim realizacijama, monitoring sigurnosnog profila uključuje utvrđivanje da li glodar pokazuje neželjena dejstva ili neželjene reakcije kao rezultat davanja leka ili vakcine. U nekim realizacijama, neželjeno dejstvo ili neželjena reakcija se bira između morbiditeta, smrtnosti, promene telesne težine, promene nivoa jednog ili više enzima (npr. jetre), promene težine jednog ili više organa, gubitka funkcije (npr. senzorna, motorička, organska, itd.), povećana osetljivost na jednu ili više bolesti, promene genoma glodara, povećanje ili smanjenje potrošnje hrane i komplikacije jedne ili više bolesti. U nekim realizacijama, bolest, poremećaj ili stanje su izazvani kod glodara. U nekim realizacijama, bolest, poremećaj ili stanje izazvano kod glodara povezano je sa bolešću, poremećajem ili stanjem od kojih pati jedan ili više ljudskih pacijenata kojima je potrebno lečenje. U nekim određenim realizacijama, lek je antitelo.

[0045] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu glodara kako je ovde opisano u razvoju leka ili vakcine za upotrebu u medicini, kao što je upotreba u vidu leka.

[0046] Ovde je otkrivena upotreba životinje koja nije čovek (ne-humane) kako je ovde opisana u proizvodnji leka za lečenje karcinoma ili neoplazme.

[0047] Ovde je otkrivena upotreba ne-humane životinje kako je ovde opisana u proizvodnji leka za lečenje zarazne bolesti.

[0048] Ovde je otkrivena upotreba ne-humane životinje kako je ovde opisana u proizvodnji leka za lečenje zapalјenske bolesti, poremećaja ili stanja.

[0049] Ovde je otkrivena upotreba ne-humane životinje kako je ovde opisana u proizvodnji leka za lečenje autoimune bolesti, poremećaja ili stanja.

[0050] U različitim realizacijama, CD274 gen predmetnog pronalaska uklјučuje CD274 gen kako je ovde opisano. U različitim realizacijama, CD274 gen predmetnog pronalaska kodira PD-L1 polipeptid koji ima humani deo i endogeni deo, a delovi su operativno povezani sa CD274 promotorom glodara. Promotor glodara je endogeni promotor glodara. U različitim realizacijama, humani deo sadrži humane CD274 eksone 3 i 4. U različitim realizacijama, humani deo sadrži humane CD274 eksone 3 i 4 i humani CD274 ekson 5 u celini ili delimično.

[0051] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid predmetnog pronalaska uklјučuje PD-L1 polipeptid kako je ovde opisano.

[0052] U različitim realizacijama, glodar ovog pronalaska ne eksprimuje detektabilno endogeni PD-L1 polipeptid pune dužine. U različitim realizacijama, glodar predmetnog pronalaska ne eksprimuje detektabilno vanćelijski deo endogenog PD-L1 polipeptida. U različitim realizacijama, glodar predmetnog pronalaska ne eksprimuje detektabilno imunoglobulinski V domen i, u nekim realizacijama, imunoglobulinski C domen endogenog PD-L1 polipeptida.

[0053] Životinja ovog pronalaska je glodar; u nekim realizacijama miš; u nekim realizacijama, pacov.

[0054] Kako su upotrebljeni u ovoj prijavi, izrazi „oko“ i „približno“ se koriste kao ekvivalenti. Bilo koji broj koji se koristi u ovoj prijavi sa ili bez oko/približno ima za cilj da pokriva sve normalne fluktuacije koje su poznate stručnjaku iz odgovarajuće tehnike.

[0055] Ostale karakteristike, predmeti i prednosti ovog pronalaska su očigledni u detalјnom opisu određenih realizacija koji sledi. Treba, međutim, shvatiti, da je detaljni opis, koji ukazuje na određene realizacije, dat samo kao ilustracija, a ne kao ograničenje. Različite promene i modifikacije unutar obima pronalaska će postati jasne stručnjacima u tehnici iz detaljnog opisa.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0056] Ovde je priloženi crtež, koji je sačinjen od sledećih slika, je samo radi ilustracije, a ne kao ograničenje.

Slika 1 prikazuje dijagram, ne u razmeri, genomske organizacije ne-humanog gena (npr. miša) i humanog klastera diferencijacije 274 (CD274) gena. Eksoni su numerisani ispod svakog eksona. Neprevedeni regioni (UTR) označeni su otvorenim pravougaonicima. Slika 2 prikazuje ilustraciju, koja nije u razmeri, primernih konstrukata korišćenih u humanizaciji ne-humanog klastera diferencijacije 274 (CD274) gena. Gornji dijagram predstavlјa humanizovani ciljajući vektor sa kasetom neomicina, dok donji dijagram predstavlјa humanizovani ciljajući vektor sa izbrisanom kasetom. Odabrane lokacije nukleotidnog spajanja označene su linijom ispod svakog spoja zajedno sa odgovarajućim ID brojem sekvence. Primeri fragmenta humanizacije prikazani su na slici 6 i ilustrovani su na sledeći način: fragment humanizacije A: humana 4.494 bp-neomicin kaseta-humani 3.950 bp (SEQ ID NO:7); fragment humanizacije B: humani 4.494 bp-loxP-humani 3.950 bp (SEQ ID NO:8); fragment humanizacije C: humani 4.494 bp fragment (SEQ ID NO:9); fragment humanizacije D: humani 3.950 bp fragment (SEQ ID NO:10).

Slika 3 prikazuje dijagram, ne u razmeri, genomske organizacije ne-humanog gena (npr. miša) i humani klaster diferencijacije 274 (CD274) gena koji ukazuje na približne lokacije proba korišćenih u ispitivanju opisanom u Primeru 1. Takođe su prikazani primer fragmenta humanizacije (humanizacioni fragment E; SEQ ID NO:11) u humanom CD274 genu i primer delecije dela mišjeg Cd274 gena.

Slika 4 prikazuje primere MC38.ova/hPD-L1 kriva rasta tumora tokom 21 dana kod mišjih homozigota za humanizaciju endogenog gena PD-L1 kao što je opisano u Primeru 1. Kontrola Ab: antitelo koji nije specifično za PD-L1, ahPD-L1: antitelo specifično za humani PD-L1. Strelice označavaju dane za tretman antitelom u toku eksperimenta. Broj miševa bez tumora 21. dana prikazan je za svaku grupu za tretman.

Slika 5 pokazuje primer PCR analize u realnom vremenu ekspresije CD8b, CD3 i PD-L1 mRNK u slezini kod mišjih homozigota za endogenI gen CD274 kao što je opisano u Primeru 1 posle tretmana anti-PD-L1 antitelom ili kontrolnim antitelima. A, prosečno šest miševa po grupi. B, nivoi ekspresije za pojedinačne miševe u svakoj grupi za tretman. Kontrola Ab: antitelo nije specifično za PD-L1; a-PD-L1: anti-PD-L1antitelo.

Slika 6 prikazuje primere sekvence mišjih, humanih i humanizovanih CD274 i PD-L1 kao i primer sekvence humane nukleinske kiselinske za humanizaciju gena CD274 koji nije humani. Za sekvence mRNK, podebljana slova označava kodirajuću sekvencu, a uzastopni eksoni, gde su naznačeni, razdvajaju se naizmeničnim podvučenim tekstom; za humanizovane mRNK sekvence, humane sekvence su sadržane u zagradama. Za proteinske sekvence, signalni peptidi su podvučeni, vanćelijske sekvence su podebljanih slova, sekvence V domena imunoglobulina (IgV) su unutar zagrada, a intracelularne sekvence su u kurzivu; a za humanizovane proteinske sekvence, sekvence koje nisu humane su označene običnim slovima, a humane sekvence su označene podebljanim slovima. Fragment humanizacije A: humana 4.494 bp-neomicin kaseta-humani 3.950 bp (SEQ ID NO:7); fragment humanizacije B: humani 4.494 loxP- humani 3.950 bp (SEQ ID NO:8); fragment humanizacije C: humani 4.494 bp fragment (SEQ ID NO:9); fragment humanizacije D: humani 3.950 bp fragment (SEQ ID NO: 10).

DEFINICIJE

[0057] Ovaj pronalazak nije ograničen na ovde opisane posebne postupke i eksperimentalne uslove, jer takvi postupci i uslovi mogu varirati. Takođe, treba razumeti da je ovde upotrebljena terminologija samo u svrhu opisivanja određenih realizacija i da nije namenjena ograničavanju, pošto je obim predmetnog pronalaska definisan u patentnim zahtevima.

[0058] Ako nije drugačije definisano, svi ovde korišćeni izrazi i značenja uključuju značenja koja izrazi i fraze imaju u tehnici, osim ako je suprotno jasno naznačeno ili jasno vidljivo iz konteksta u kojem se koristi izraz ili fraza. Iako se bilo koji postupak i materijal sličan ili ekvivalentan ovde opisanima mogu koristiti u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, sada će biti opisani određeni postupci i materijali.

[0059] Izraz „približno”, kako je ovde upotrebljen za jednu ili više vrednosti od interesa, odnosi se na vrednost koja je slična navedenoj referentnoj vrednosti. U određenim realizacijama, izraz „približno" ili „oko" odnosi se na raspon vrednosti koje spadaju u 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ili manje u bilo kojem smeru (veće ili manje od) navedene referentne vrednosti, osim ako je drugačije navedeno ili je drugačije vidljivo iz konteksta (osim u slučaju kada bi takav broj premašio 100% moguće vrednosti).

[0060] Izraz „biološki aktivan", kako se ovde koristi, uključuje odliku bilo kog sredstva koje ima aktivnost u biološkom sistemu, in vitro ili in vivo (npr. u organizmu). Na primer, sredstvo koje, kada je prisutno u organizmu, ima biološko dejstvo unutar tog organizma, smatra se da je biološki aktivno. U posebnim realizacijama, gde je protein ili polipeptid biološki aktivan, deo tog proteina ili polipeptida koji deli barem jednu biološku aktivnost proteina ili polipeptida obično se naziva „biološki aktivnim” delom.

[0061] Izraz „klaster diferencijacije 274 proteina“, „CD274 protein“, „B7-H1 protein“, ili „PD-L1 protein“ kako se ovde koristi, uklјučuje transmembranski protein koji pripada porodici B7 liganda proteina ćelijskih površina i ima vanćelijski imunoglobulin V (IgV) i imunoglobulinske konstantne (IgC) domene, koji su povezani sa varijabilnim i konstantnim domenima imunoglobulina, i transmembranske i citoplazmatske (ili unutarćelijske) domene. PD-L1 se eksprimuje i u limfoidnim (npr. B ćelija, T ćelija, dendritična ćelija, makrofagi, monociti, itd.) i u nelimfoidnim linijama (srce, pluća, jetra, pankreas, itd.) i uklјučen je u interakcije između membranskih površinskih proteina kao što je, na primer, programirana ćelijska smrt 1 (PD-1) radi regulisanja imunološke funkcije. Ekspresija PD-L1 reguliše se citokinima (npr. interferonγ) i prijavlјeno je da je regulisan naviše u mnogim humanim vrstama raka, što može omogućiti da takve vrste raka izbegnu nadzor od strane imunog sistema. Pokazalo se da je PD-L1 uklјučen u nekoliko ćelijskih procesa kao što su, na primer, unutarćelijska infekcija, periferna tolerancija, signalizacija T ćelijskih receptora, i proliferacija T ćelija. Alternativno su splajsovane CD274 izoforme identifikovane između miša i čoveka. Kao ilustracija, nukleotidne i amino-kiselinske sekvence mišjih i humanih CD274 gena, prikazane su na slici 6. Stručnjaci u tehnici nakon čitanja ovog otkrića prepoznaće da jedan ili više endogenih CD274 gena u genomu (ili svi) mogu biti zamenjeni, modifikovani, izmenjeni, izbrisani, poremećeni itd. jednim ili više heterolognih CD274 gena (npr. polimorfnim varijantama, podtipovima ili mutantima, genima druge vrste, humanizovanim oblicima, itd.).

[0062] „CD274-eksprimujuća ćelija“, „B7-H1- eksprimujuća ćelija“, ili „PD-L1- eksprimujuća ćelija“ kako se ovde koristi, uklјučuje ćeliju koja eksprimuje PD-L1 transmembranski polipeptid. U nekim realizacijama, PD-L1- eksprimujuća ćelija eksprimuje PD-L1 transmembranske polipeptide na svojoj površini. U nekim realizacijama, PD-L1 polipeptidi su eksprimovani na površinu ćelije u količini koja je dovolјna da posreduje u interakcijama ćelijaćelija (npr. interakcijama sa PD-1 receptorskim polipeptidima). Primer ćelija koje eksprimuju PD-L1 uključuju B ćelije, dendritične ćelije, makrofage, monocite i T ćelije. PD-L1-eksprimujuće ćelije moduliraju aktivaciju ili inhibiciju limfoidnih ćelija da bi pojačale ili umanjile imuni odgovor. U nekim realizacijama, glodari iz predmetnog pronalaska pokazuju regulaciju različitih ćelijskih procesa (kao što je ovde opisano) humanizovanim PD-L1 polipeptidima eksprimovanim na površini još jedne ćelije ne-humane životinje.

[0063] Izraz „uporediv", kao što se ovde koristi, uključuje dva ili više sredstava, entiteta, situacija, skupova uslova, itd. koji možda nisu identični jedni drugima, ali koji su dovoljno slični da omogućuju poređenje među sobom tako da se zaključci mogu razumno izvući na osnovu uočenih razlika ili sličnosti. Stručnjaci sa uobičajenim veštinama razumeće, u kontekstu, koji stepen identiteta je potreban u datim okolnostima da bi se dva ili više takvih sredstava, entiteta, situacija, skupova uslova, itd., smatrala uporedivim.

[0064] Izraz „konzervativni", kao što se ovde koristi da opiše konzervativnu supstituciju aminokiselina, uključuje supstituciju amino-kiselinskog ostatka sa drugim amino-kiselinskim ostatkom koji ima R grupu bočnog lanca sa sličnim hemijskim svojstvima ( npr. naelektrisanje ili hidrofobnost). Uopšteno, konzervativna supstitucija amino-kiselina neće bitno promeniti funkcionalna svojstva od interesa za protein, na primer, sposobnost receptora da se veže za ligand. Primeri grupa amino-kiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju: alifatske bočne lance kao što su glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; alifatskohidroksilne bočne lance, kao što su serin i treonin; bočne lance koji sadrže amide kao što su asparagin i glutamin; aromatične bočne lance kao što su fenilalanin, tirozin i triptofan; bazne bočne lance kao što su lizin, arginin i histidin; kisele bočne lance kao što su aspartanska kiselina i glutaminska kiselina; i bočne lance koji sadrže sumpor, poput cisteina i metionina. Konzervativne supstitucione grupe amino-kiselina uključuju, na primer, valin/leucin/izoleucin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alanin/valin, glutamat/aspartat i asparagin/glutamin. U nekim realizacijama, konzervativna supstitucija amino-kiselina može biti supstitucija bilo kog nativnog ostatka u proteinu alaninom, kao što je korišćeno u, na primer, alanin skenirajućoj mutagenezi. U nekim realizacijama, napravljena je konzervativna supstitucija koja ima pozitivnu vrednost u matrici log-verovatnoće PAM250 opisanoj u Gonnet, G. H. et al., 1992, Science 256:1443-1445. U nekim realizacijama, supstitucija je umereno konzervativna supstitucija pri čemu supstitucija ima nenegativnu vrednost u matrici log-verovatnoće PAM250.

[0065] Izraz „kontrola", kao što se ovde koristi, uključuje značenje „kontrole“ koje je podrazumevano u tehnici, i koje je standard sa kojim se upoređuju rezultati. Obično se kontrole koriste za povećanje integriteta u eksperimentima izolovanjem promenljivih da bi se mogao izvesti zaključak o takvim promenljivim. U nekim realizacijama, kontrola je reakcija ili ispitivanje koje se izvodi istovremeno sa testnom reakcijom ili ispitivanjem da bi se dobio upoređivač. Kako se ovde koristi, „kontrola" može da se odnosi na „kontrolnu životinju." „Kontrolna životinja" može imati modifikaciju kao što je ovde opisano, modifikaciju koja je drugačija nego što je ovde opisano, ili nema modifikacije (tj. životinja sa divljim tipom). U jednom eksperimentu primenjuje se „test" (tj. promenljiva koja se testira). U drugom eksperimentu se ne primenjuje "kontrola" promenljiva koja se testira. U nekim realizacijama, kontrola je istorijska kontrola (tj. prethodno sprovedeni test ili ispitivanje, ili određena količina ili rezultat koji je prethodno poznat). U nekim realizacijama, kontrola je ili sadrži odštampan ili na drugi način sačuvan zapis. Kontrola može biti pozitivna ili negativna kontrola.

[0066] Izraz „disrupcija", kao što se ovde koristi, uključuje rezultat homologne rekombinacije sa molekulom DNK (npr. sa endogenom homolognom sekvencom kao što je gen ili lokus gena). U nekim realizacijama, disrupcija može postići ili predstavljati inserciju, deleciju, supstituciju, zamenu, besmislenu mutaciju, ili promenu okvira DNK sekvenci ili bilo koje njihove kombinacije. Insercije mogu da uključuju ubacivanje celih gena ili fragmenata gena, npr., eksona, koji mogu biti različitog porekla od endogene sekvence (npr. heterologne sekvence). U nekim realizacijama, disrupcija može povećati ekspresiju i/ili aktivnost gena ili genskog proizvoda (npr. proteina kodiranog genom). U nekim realizacijama, disrupcija može smanjiti ekspresiju i/ili aktivnost gena ili genskog proizvoda. U nekim realizacijama, disrupcija može promeniti sekvencu gena ili kodiranog genskog proizvoda (npr. kodiranog proteina). U nekim realizacijama, disrupcija može skratiti ili fragmentisati gen ili kodirani genski proizvod (npr. kodirani protein). U nekim realizacijama, disrupcija može proširiti gen ili kodirani genski proizvod; u nekim takvim realizacijama može doći do poremećaja sklapanja fuzionisanog

1

proteina. U nekim realizacijama, disrupcija može uticati na nivo, ali ne i aktivnost gena ili genskog proizvoda. U nekim realizacijama, disrupcija može uticati na aktivnost, ali ne i na nivo gena ili genskog proizvoda. U nekim realizacijama, disrupcija možda neće imati značajan uticaj na nivo gena ili genskog proizvoda. U nekim realizacijama, disrupcija možda neće imati značajan uticaj na aktivnost gena ili genskog proizvoda. U nekim realizacijama, disrupcija možda neće imati značajan uticaj bilo na nivo ili aktivnost gena ili genskog proizvoda.

[0067] Izrazi „određivanje”, „merenje”, „ocena”, „procenjivanje”, „ispitivanje” i „analiziranje” koriste se naizmenično da bi označili bilo koji oblik merenja i uključuju određivanje da li je neki element prisutan ili ne. Ovi izrazi uključuju i kvantitativne i/ili kvalitativne determinante. Ispitivanje može biti relativno ili apsolutno. "Ispitivanje prisustva” može biti utvrđivanje količine nečeg prisutnog i/ili utvrđivanje da li je nešto prisutno ili ne.

[0068] Izraz „endogeni lokus“ ili „endogeni gen“, kako se ovde koristi, uklјučuje genetski lokus pronađen u roditelјskom ili referentnom organizmu pre uvođenja poremećaja, delecije, zamene, alternacije ili modifikacije kako je ovde opisano. U nekim realizacijama, endogeni lokus ima sekvencu koja se nalazi u prirodi. U nekim realizacijama, endogeni lokus je lokus divljeg tipa. U nekim realizacijama, referentni organizam je organizam divljeg tipa. U nekim realizacijama, referentni organizam je stvoreni organizam. U nekim realizacijama, referentni organizam je laboratorijski uzgojen organizam (bilo da je divlji ili stvoreni).

[0069] Izraz „endogeni promotor" uključuje promotor koji je prirodno povezan, na primer, u organizmu divljeg tipa, sa endogenim genom.

[0070] Izraz „heterologni", kao što se ovde koristi, uključuje sredstvo ili entitet iz drugog izvora. Na primer, kada se koristi u vezi sa polipeptidom, genom ili genskim proizvodom ili je prisutan u određenoj ćeliji ili organizmu, izraz pojašnjava da je relevantni polipeptid, gen ili genski proizvod: 1) napravio čovek; 2) je unet u ćeliju ili organizam (ili njihov prekursor) od strane čoveka (npr., genetskim inženjeringom); i/ili 3) nije prirodno proizveden ili prisutan u odgovarajućoj ćeliji ili organizmu (npr. relevantni tip ćelije ili tip organizma).

[0071] Izraz „ćelija domaćin", kao što se ovde koristi, uključuje ćeliju u koju je uvedena heterologna (npr. egzogena) nukleinska kiselina ili protein. Stručnjaci u tehnici posle čitanja ove objave razumeće da se takvi pojmovi ne odnose samo na određenu predmetnu ćeliju, već se koriste i da se odnose na potomstvo takve ćelije. Budući da se u sledećim generacijama mogu dogoditi određene modifikacije ili zbog mutacija ili uticaja okoline, takvo potomstvo ne može, u stvari, biti identično matičnoj ćeliji, ali je još uvek uključeno u opseg izraza "ćelija domaćin", kao što se ovde koristi. U nekim realizacijama, ćelija domaćin jeste ili sadrži prokariotsku ili eukariotsku ćeliju. Generalno, ćelija domaćin je svaka ćelija koja je pogodna za prijem i/ili proizvodnju heterologne nukleinske kiseline ili proteina, bez obzira na biološko carstvo za koje je ćelija označena. Primerne ćelije uključuju one prokariota i eukariota (jednoćelijske ili višećelijske), bakterijske ćelije (npr. sojevi E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp. itd.), Ćelije mikobakterija, gljivične ćelije, ćelije kvasca ( npr. S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, itd.), biljne ćelije, ćelije insekata (npr. SF-9, SF-21, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, Trichoplusia ni, itd.), životinjske ćelije koje nisu humane, humane ćelije ili fuzije ćelija kao što su, na primer, hibridomi ili kvadromi. U nekim realizacijama, ćelija je ćelija hrčka, pacova ili miša. U nekim realizacijama, ćelija je eukariotska i bira se iz sledećih ćelija: CHO (npr. CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr. COS-7), ćelija mrežnjače, Vero, CV1, bubrega (npr. HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK ), HeLa, HepG2, VI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60 (npr. BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermalni), CV-1, U937, 3T3, L ćelija, C127 ćelija, SP2/0, NS-0, MMT 060562, ćelija Sertoli, BRL 3A ćelija, ćelija HT1080, ćelija mijeloma, tumorska ćelija i ćelijska linija izvedena iz gore pomenute ćelije. U nekim realizacijama, ćelija sadrži jedan ili više virusnih gena, npr. ćeliju retine koja eksprimuje virusni gen (npr. ćeliju PER.C6®). U nekim realizacijama, ćelija domaćin jeste ili sadrži izolovanu ćeliju. U nekim realizacijama, ćelija domaćin je deo tkiva. U nekim realizacijama, ćelija domaćin je deo organizma.

[0072] Izraz „humanizovan", kao što se ovde koristi u skladu sa značenjem razumljivim od strane stručnjaka upućuje na nukleinske kiseline ili proteine čija struktura (tj. nukleotidne ili amino-kiselinske sekvence) obuhvata delove koji u osnovi ili identično odgovaraju strukturama određenog gena ili proteina koji se nalaze u prirodi kod ne-humanih životinja, a takođe uključuju delove koji se razlikuju od onih koji se nalaze u odgovarajućem određenom genu ili proteinu koji nije humani, i umesto toga, oni bliže odgovaraju uporedivim strukturama koje su pronađene u odgovarajućem humanom genu ili proteinu. U nekim realizacijama, „humanizovani" gen je onaj koji kodira polipeptid koji u osnovi ima sekvencu amino-kiseline kao humani polipeptid (npr. humani protein ili njegov deo - npr. njegov karakteristični deo). Daćemo samo jedan primer, u slučaju membranskog receptora, "humanizovani" gen može kodirati polipeptid koji ima ekstracelularni deo, u celini ili delom, koji ima sekvencu aminokiseline kao humani ekstracelularni deo i preostalu sekvencu kao onu kod polipeptida koji nije humani (npr. mišjeg). U nekim realizacijama, humanizovani gen sadrži najmanje deo sekvence DNK humanog gena. U jednoj realizaciji, humanizovani gen sadrži čitavu sekvencu DNK humanog gena. U nekim realizacijama, humanizovani protein sadrži sekvencu koja ima deo koji se pojavljuje u humanom proteinu. U nekim realizacijama, humanizovani protein sadrži čitavu sekvencu humanog proteina i eksprimuje se iz endogenog lokusa ne-humane životinje, a koji odgovara homologu ili ortologu humanog gena.

[0073] Izraz „identičnost", kao što se ovde koristi, u vezi sa upoređivanjem sekvenci, uključuje identitet određen utvrđenim brojem različitih algoritama poznatih u tehnici, koji se mogu koristiti za merenje identičnosti nukleotida i/ili sekvenci amino-kiselina. U nekim realizacijama, identičnosti kao što je ovde opisano određuju se pomoću ClustalW v.1.83 (sporog) poravnanja korišćenjem vrednosti otvorene praznine od 10.0, vrednosti za produženi razmak od 0.1 i korišćenjem Gonetove matrice sličnosti (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).

[0074] „Pobolјšati“, „povećati“, „eliminisati“ ili „smanjiti“, kako se ovde koriste ili njihovi gramatički ekvivalenti, označavaju vrednosti koje su u odnosu na osnovno merenje, kao što je merenje kod istog pojedinca (ili životinje) pre početka ovde opisanog tretmana, ili merenje kod kontrolne osobe (ili životinja) ili većeg broja kontrolnih osoba (ili životinja) u odsustvu ovde opisanog tretmana.

[0075] Izraz „izolovan", kao što se ovde koristi, uključuje supstancu i/ili entitet koji je (1) odvojen od barem nekih komponenti sa kojima je povezan kada je inicijalno proizveden (bilo u prirodi i/ili u eksperimentalnom okruženju) i/ili (2) dizajniran, proizveden, pripremljen i/ili proizveden od strane čoveka. Izolovane supstance i/ili entiteti mogu se odvojiti od oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, 97%, oko 98%, oko 99%, ili više od oko 99% ostalih komponenti sa kojima su bili u početku povezani. U nekim realizacijama, izolovana sredstva su oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili više od oko 99% čista. Supstanca je „čista” ako je u osnovi bez drugih komponenti. U nekim realizacijama, kao što će razumeti stručnjaci u tehnici, supstanca se još može smatrati „izolovanom” ili čak „čistom”, nakon što je kombinovana sa određenim drugim komponentama kao što su, na primer, jedan ili više nosača ili ekscipijenasa (npr. pufer, rastvarač, voda, itd.); u takvim realizacijama, izračunava se procenat izolacije ili čistoće materije, bez uključivanja takvih nosača ili ekscipijenasa. Dajući samo jedan primer, u nekim realizacijama, biološki polimer, poput polipeptida ili polinukleotida koji se javlja u prirodi, smatra se „izolovanim” kada: a) na osnovu svog porekla ili izvora dobijanja nije povezan sa nekim ili svim komponentama koje ga prate u svom izvornom stanju u prirodi; b) u osnovi ne sadrži druge polipeptide ili nukleinske kiseline iste vrste od vrsta koje ih proizvode u prirodi; ili c) je eksprimovan ili je na neki drugi način povezan sa komponentama ćelije ili drugog sistema ekspresije koji nije od vrste koja ga proizvodi u prirodi. Tako se, na primer, u nekim realizacijama polipeptid koji je hemijski sintetizovan ili se sintetiše u ćelijskom sistemu različitom od onoga koji ga proizvodi u prirodi, smatra „izolovanim” polipeptidom. Alternativno ili dodatno, u nekim realizacijama, polipeptid koji je podvrgnut jednoj ili više tehnika prečišćavanja može se smatrati „izolovanim” polipeptidom u meri u kojoj je odvojen od drugih komponenti: a) sa kojima je povezan u prirodi; i/ili b) sa kojim je povezan kada je prvobitno proizveden.

[0076] Izraz „ne-humana životinja", kao što se ovde koristi, uključuje bilo koji organizam kičmenjaka koji nije čovek. U nekim realizacijama, ne-humana životinja je ciklostom, košljoriba, rušljoriba (npr. ajkula ili raža), vodozemac, gmizavac, sisar i ptica. U nekim realizacijama, ne-humani sisar je primat, koza, ovca, svinja, pas, krava ili glodar. U nekim realizacijama, ne-humana životinja je glodar, poput pacova ili miša.

[0077] Izraz „nukleinska kiselina", kao što se ovde koristi, u svom najširem smislu, uključuje bilo koje jedinjenje i/ili supstancu koja jeste ili se može ugraditi u lanac oligonukleotida. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina "je jedinjenje i/ili supstanca koja jeste ili se može ugraditi u lanac oligonukleotida putem fosfodiestarske veze. Kao što će biti jasno iz konteksta, u nekim realizacijama, "nukleinska kiselina", uključuje pojedinačne ostatke nukleinske kiseline (npr. nukleotide i/ili nukleozide); u nekim realizacijama, "nukleinska kiselina", uključuje oligonukleotidni lanac koji sadrži pojedinačne ostatke nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina", jeste ili sadrži RNK; u nekim realizacijama, "nukleinska kiselina", jeste ili sadrži DNK. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" jeste, sadrži ili se sastoji od jednog ili više ostataka prirodne nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, „nukleinska kiselina", jeste, sadrži ili se sastoji od jednog ili više analoga nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, analog nukleinske kiseline razlikuje se od "nukleinska kiselina" po tome što ne koristi fosfodiestarsku kičmu. Na primer, u nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" jeste, sadrži ili se sastoji od jednu ili više " peptidnih nukleinskih kiselina ", koje su poznate u tehnici i imaju peptidne veze umesto fosfodiestarskih veza u kičmi, razmatrane su u okviru obima predmetnog pronalaska. Alternativno ili dodatno, u nekim realizacijama, „nukleinska kiselina” ima jednu ili više fosforotioatnih i/ili 5’-N-fosforamiditnih veza umesto fosfodiestarskih veza. U nekim realizacijama, „nukleinska kiselina” jeste, sadrži ili se sastoji od jednog ili više prirodnih nukleozida (npr. adenozina, timidina, guanozina, citidina, uridina, deoksiadenozin, deoksitimidin, deoksiguanozin i deoksi citidin). U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" jeste, sadrži ili se sastoji od jednog ili više nukleozidnih analoga (npr.2-aminoadenozina, 2-tiotimidina, inozina, pirolo-pirimidina, 3-metil adenozina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenozina, C5-bromouridina, C5-fiuorouridina, C5-jodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenozina, 7-deazaadenozina, 7-deazaguanozina, 8-oksoadenozina, 8-oksoguanozina, O(6) -metilguanina, 2-tiocitidina, metilovane baze, interkalirane baze i njihove kombinacije). U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" sadrži jedan ili više modifikovanih šećera (npr. 2'-fluororiboza, riboza, 2'-deoksiriboza, arabinoza i heksoza) u poređenju sa onima u prirodnim nukleinskim kiselinama. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" ima nukleotidnu sekvencu koja kodira funkcionalni genski proizvod kao što je RNK ili protein. U nekim realizacijama, „nukleinska kiselina" uključuje jedan ili više introna. U nekim realizacijama, a „nukleinske kiseline“ uklјučuje jedan ili više eksona. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" se priprema jednom ili više izolacija iz prirodnog izvora, enzimskom sintezom polimerizacijom na osnovu komplementarnog uzorka (in vivo ili in vitro), reprodukcijom u rekombinantnoj ćeliji ili sistemu i hemijskom sintezom. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" je najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 ili više ostataka dugačka. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" je jednolančana; u nekim realizacijama, "nukleinska kiselina"]” je dvolančana. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" ima nukleotidnu sekvencu koja sadrži najmanje jedan element koji kodira, ili je komplement sekvence koja kodira, polipeptid. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" ima enzimsku aktivnost.

[0078] Izraz "operativno povezan", kao što se ovde koristi, uključuje jukstapoziciju u kome su opisane komponente u odnosu koji im omogućava da funkcionišu na predviđeni način. Kontrolna sekvenca "operativno povezana", na kodirajuću sekvencu se liguje na takav način da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže pod uslovima kompatibilnim sa kontrolnim sekvencama. „Operativno povezane” sekvence obuhvataju i kontrolne sekvence ekspresije koje su susedne genu od interesa i kontrolnim sekvencama ekspresije koje transregulišu ili su na daljini radi kontrole gena od interesa. Izraz "kontrolna sekvenca ekspresije", kao što se ovde koristi, uključuje polinukleotidne sekvence, koje su neophodne da bi se izvršila ekspresija i obrada kodirajućih sekvenci za koje su vezani. "Kontrolna sekvenca ekspresije", uključuju: odgovarajuće inicijacije transkripcije, terminacije, promotorne i pojačivačke sekvence; efikasni

1

RNK signali za obradu kao što su splajsujući i poliadenilacioni signali; sekvence koje stabilizuju citoplazmatsku mRNA; sekvence koje povećavaju efikasnost translacije (tj., Kozak konsenzusna sekvenca); sekvence koje povećavaju stabilnost proteina; i po želji, sekvence koje pojačavaju lučenje proteina. Priroda takvih kontrolnih sekvenci razlikuje se u zavisnosti od organizma domaćina. Na primer, u prokariotima, takve kontrolne sekvence obično uključuju promotor, mesto vezivanja ribozoma i sekvencu za završavanje transkripcije, dok u eukariotima obično takve kontrolne sekvence uključuju promotore i sekvencu za završavanje transkripcije. Izraz „kontrolne sekvence", treba da obuhvati komponente čiji je prisustvo neophodno za ekspresiju i obradu, a može uključivati i dodatne komponente čija je prisutnost korisna, na primer, vodećih sekvenci i fuzionih partnerskih sekvenci.

[0079] Izraz „polipeptid", kao što se ovde koristi, uključuje bilo koji polimerni lanac aminokiselina. U nekim realizacijama, polipeptid ima sekvencu amino-kiselina koja se javlja u prirodi. U nekim realizacijama, polipeptid ima sekvencu amino-kiselina koja se ne pojavljuje u prirodi. U nekim realizacijama, polipeptid ima sekvencu amino-kiselina koja sadrži delove koji se javljaju u prirodi odvojeno jedan od drugog (tj. od dva ili više različitih organizama, na primer, humane i ne-humane delove). U nekim realizacijama, polipeptid ima sekvencu amino-kiselina koja je napravljena tako da je dizajnirana i/ili proizvedena radom ruku čoveka.

[0080] „Sprečiti“ ili „prevencija“, kako se ovde koristi kada se koristi u vezi sa pojavom bolesti, poremećaja i/ili stanja, uklјučuje smanjenje rizika od razvoja bolesti, poremećaja i/ili stanja i/ili odlaganje pojave jedne ili više karakteristika ili simptoma bolesti, poremećaja i/ili stanja. Prevencija se može smatrati potpunom kada je početak bolesti, poremećaja ili stanja odložen u unapred definisanom vremenskom periodu.

[0081] Izraz „rekombinantni", kao što se ovde koristi, je namenjen da uputi na polipeptide (npr. PD-L1 polipeptide kao što je ovde opisano) koji su dizajnirani, kreirani, pripremljeni, izraženi, stvoreni ili izolovani rekombinantnim sredstvima, kao što su polipeptidi eksprimovani korišćenjem rekombinantnog vektora ekspresije transfektovanog u ćeliju domaćina, polipeptide izolovane iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanog polipeptida (Hoogenboom H. R., 1997 TIB Tech. 15:62-70; Hoogenboom H., i Chames P., 2000, Immunology Today 21:371-378; Azzazy H., i Highsmith W. E., 2002, Clin. Biochem.35:425-445; Gavilondo J. V., i Larrick J. W., 2002, BioTechniques 29:128-145), antibodies isolated from an animal (e.g., a mouse) that is transgenic for human immunoglobulin genes (see e.g., Taylor, L. D., et al., 1992, Nucl. Acids Res.20:6287-6295; Little M. et al., 2000, Immunology Today 21:364-370; Kellermann S. A. and Green L. L., 2002, Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Murphy, A.J., et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.111(14):5153-5158) ili polipeptide koji su pripremljeni, eksprimovani, stvoreni ili izolovani na bilo koji drugi način koji uključuje spajanje odabranih elemenata sekvence jedan za drugi. U nekim realizacijama, jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvence nalaze se u prirodi. U nekim realizacijama, jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvence je dizajnirano in silico.U nekim realizacijama, jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvence rezultat je mutageneze (npr. in vivoili in vitro) poznatog elementa sekvence, npr. iz prirodnog ili sintetičkog izvora. Na primer, u nekim realizacijama, rekombinantni polipeptid sadrži sekvence nađene u genomu organizma izvora koji nas zanima (npr. čoveka, miša itd.). U nekim realizacijama, rekombinantni polipeptid sadrži sekvence koje se u prirodi javlјaju odvojeno jedna od druge (tj. od dva ili više različitih organizama, na primer, humanih delova i delova koji nisu humani) u dva različita organizma (npr. kod čoveka i organizma koji nije ljudski). U nekim realizacijama, rekombinantni polipeptid ima sekvencu amino-kiseline koja je rezultat mutageneze (npr. in vitroili in vivo, na primer kod ne-humane životinje), tako da su sekvence amino-kiselina rekombinantnih polipeptida sekvence koje, iako potiču iz i povezane su sa sekvencama polipeptida, ne mogu prirodno postojati unutar genoma ne-humane životinje in vivo.

[0082] Izraz „zamenska" se ovde koristi da uputi na postupak kroz koji je „zamenjena” sekvenca nukleinske kiseline (npr. gen) koja se nalazi u lokusu domaćina (npr. u genomu) uklonjena iz tog lokusa i na svoje mesto je postavljena je drugačija „zamenska” nukleinska kiselina. U nekim realizacijama, zamenjene sekvence nukleinske kiseline i zamenske sekvence nukleinske kiseline su uporedive jedna sa drugom, na primer, one su homologne jedna drugoj i/ili sadrže odgovarajuće elemente (npr. elemente koji kodiraju proteine, regulatorne elemente, itd.). U nekim realizacijama, zamenjena sekvenca nukleinskih kiselina uključuje jedan ili više promotora, pojačivača, splajsujuće mesto za donora, mesta prijemna splajsa, intron, ekson, neprevedene regije (UTR); u nekim realizacijama, zamenska sekvenca nukleinske kiseline uključuje jednu ili više kodirajućih sekvenci. U nekim realizacijama, zamenska sekvenca nukleinske kiseline je homolog zamenjene sekvence nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, zamenska nukleinska kiselina je ortolog zamenjene sekvence. U nekim realizacijama, zamenska nukleinska kiselina jeste ili sadrži sekvencu humane nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, uključujući gde zamenska sekvenca nukleinske kiseline jeste ili sadrži sekvencu humane nukleinske kiseline, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline jeste ili sadrži sekvencu glodara (npr. sekvencu miša ili pacova). Tako postavljena nukleinska kiselina može da sadrži jednu ili više regulatornih sekvenci koje su deo izvorne sekvence nukleinske kiseline koja se koristi za dobijanje tako postavljene sekvence (npr., promotora, pojačivača, 5’- ili 3’- neprevedene regije, itd.). Na primer, u različitim realizacijama, zamena je supstitucija endogene sekvence heterolognom sekvencom koja rezultira proizvodnjom genskog proizvoda iz tako postavljene sekvence nukleinske kiseline (koja sadrži heterolognu sekvencu), ali ne i ekspresijom endogene sekvence; zamena je od endogene genske sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira protein koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom sekvencom (npr. endogena genomska sekvenca kodira PD-L1 protein, a DNK fragment kodira jedan ili više humanih PD-L1 proteina). U različitim realizacijama, endogeni gen ili njegov fragment je zamenjen odgovarajućim humanim genom ili njegovim fragmentom. Odgovarajući humani gen ili njegov fragment je humani gen ili fragment koji je ortolog ili je u osnovi sličan ili isti u strukturi i/ili funkciji, endogenom genu ili njegovom fragmentu koji je zamenjen.

[0083] Izraz „referenca” se ovde koristi da opiše standardno ili kontrolno sredstvo, životinju, kohortu, jedinku, populaciju, uzorak, sekvencu ili vrednost protiv koje se sredstvo, životinja, kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost od interesa poredi. U nekim realizacijama, referentno sredstvo, životinja, kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost testira se i/ili određuje u suštini istovremeno sa testiranjem ili određivanjem sredstva, životinje, kohorte, pojedinca, populacije, uzorka, sekvence ili vrednosti od interesa. U nekim realizacijama, referentno sredstvo, životinja, kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost predstavlja istorijsku referencu, opciono realizovanu u opipljivom medijumu. U nekim realizacijama, referenca se može odnositi na kontrolu. Kao što se ovde koristi, „referenca” može sadržavati „referentnu životinju”. „Referentna životinjamože imati modifikaciju kako je ovde opisana, modifikaciju koja je drugačija nego što je ovde opisano ili može biti bez modifikacije (tj. životinja divljeg tipa). Uobičajeno, kao što će stručnjaci u tehnici podrazumevati, referentno sredstvo, životinja, kohort, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost se određuje ili karakteriše pod uslovima uporednim sa onima korišćenim za određivanje ili karakterizaciju sredstva, životinje (npr., sisara), kohorta, pojedinca, populacije, uzorka, redosleda ili vrednosti od interesa.

[0084] Izraz „u osnovi”, kao što se ovde koristi, uključuje kvalitativni uslov ispoljavanja ukupnog ili skoro ukupnog obima ili stepena karakteristike ili svojstva od interesa. Stručnjak u biološkoj tehnici razumeće da biološke i hemijske pojave retko, ako ikad, završe i/ili pristupe dovršenosti ili postignu ili izbegnu apsolutni rezultat. Izraz „u osnovi” se ovde koristi za hvatanje potencijalnog nedostatka potpunosti koji je svojstven mnogim biološkim i hemijskim pojavama.

[0085] Izraz „suštinska homologija”, kao što se ovde koristi, uključuje poređenje između sekvenci amino-kiselina ili sekvenci nukleinskih kiselina. Kao što će razumeti stručnjaci u tehnici, dve sekvence se obično smatraju „suštinski homolognim”, ako sadrže homologne ostatke na odgovarajućim pozicijama. Homologni ostaci mogu biti identični ostaci. Alternativno, homologni ostaci mogu biti neidentični ostaci koji će imati odgovarajuće slične strukturne i/ili funkcionalne karakteristike. Na primer, kao što je dobro poznato stručnjacima iz tehnike, određene amino-kiseline su po pravilu klasifikovane kao "hidrofobne" ili "hidrofilne" amino-kiseline i/ili kao da imaju "polarni" ili "nepolarni" bočni lanac. Supstitucija jedne aminokiseline drugom istog tipa često se može smatrati "homolognom" supstitucijom. Uobičajene kategorizacije amino-kiselina sumirane su u tabelama 1 i 2.

1

1 Nespecifikovane ili nepoznate Xaa X

amino-kiseline

[0086] Kao što je dobro poznato u tehnici, sekvence amino-kiselina ili nukleinskih kiselina mogu se porediti koristeći bilo koji od različitih algoritama, uključujući one dostupne u komercijalnim računarskim programima, kao što su BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, BLAST sa razmacima i PSI-BLAST za sekvence amino-kiselina. Primeri takvih programa opisani su u Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, S. F. et al., 1997, Methods in Enzymology; Altschul, S. F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402; Baxevanis, A.D., i B. F. F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; i Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998. Pored identifikacije homolognih sekvenci, gore navedeni programi obično daju i stepen homologije. U nekim realizacijama, dve sekvence smatraju se suštinski homolognim ako je barem 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više njihovih odgovarajućih ostataka homologno u odnosu na odgovarajući deo ostataka. U nekim realizacijama, relevantni deo je potpuna sekvenca. U nekim realizacijama, relevantni deo je najmanje 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ili više ostataka. U nekim realizacijama, relevantni deo uključuje susedne ostatke duž kompletne sekvence. U nekim realizacijama, relevantni deo uklјučuje diskontinuirane ostatke duž kompletne sekvence, na primer, neuzastopne ostatke okuplјene prekloplјenom konformacijom polipeptida ili njegovog dela. U nekim realizacijama, relevantni deo je najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više ostataka.

[0087] Izraz "suštinski identičan", kao što se ovde koristi, uključuje poređenje između sekvenci amino-kiselina ili nukleinskih kiselina. Kao što je ponato stručnjacima u tehnici, dve sekvence se obično smatraju "suštinski identičnim" ako sadrže identične ostatke na odgovarajućim pozicijama. Kao što je dobro poznato u tehnici, sekvence amino-kiselina ili nukleinskih kiselina mogu se porediti korišćenjem bilo koji od različitih algoritama, uključujući one dostupne u komercijalnim računarskim programima, kao što su BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, BLAST sa razmacima i PSI-BLAST za sekvence amino-kiselina. Primeri takvih programa opisani su u Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, S. F. et al., 1997, Methods in Enzymology; Altschul, S. F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402; Baxevanis, A.D., i B. F. F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol.132), Humana Press, 1998. Pored identifikacije identičnih sekvenci, gore pomenuti programi obično daju indikaciju stepena identiteta. U nekim realizacijama, dve sekvence se smatraju suštinski identičnim ako je barem 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više odgovarajućih ostataka identično u relevantnom delu ostataka. U nekim realizacijama, relevantni deo je potpuna sekvenca. U nekim realizacijama, relevantni deo je najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više ostataka.

[0088] Izraz "ciljajući vektor" ili "ciljajući konstrukt", kao što se ovde koristi, uključuje polinukleotidni molekul koji sadrži ciljajući region. Ciljajući region sadrži sekvencu koja je identična ili suštinski identična sekvenci u ciljnoj ćeliji, tkivu ili životinji i omogućava integraciju ciljajućeg konstrukta u položaj unutar genoma ćelije, tkiva ili životinje putem homologne rekombinacije. Ciljajući regioni koji koriste lokacije za prepoznavanje rekombinacija specifičnih za lokaciju (npr. loxP ili Frt mesta) su takođe uključeni. U nekim realizacijama, ciljajući konstrukt predmetnog pronalaska dalje sadrži sekvencu nukleinskih kiselina ili gen od posebnog interesa, selekcioni marker, kontrolne i/ili regulatorne sekvence i druge sekvence nukleinske kiseline koje omogućavaju rekombinaciju posredovanu egzogenim dodavanjem proteina koji pomažu u ili olakšavaju rekombinaciju koja uključuje takve sekvence. U nekim realizacijama, ciljajući konstrukt predmetnog pronalaska dalje sadrži gen od interesa u celosti ili delimično, pri čemu je gen od interesa heterologni gen koji kodira protein, u celini ili delimično, koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom sekvencom. U nekim

1

realizacijama, ciljajući konstrukt predmetnog pronalaska dalje sadrži humanizovani gen od interesa, u celini ili delimično, pri čemu humanizovani gen od interesa kodira protein, u celini ili delimično, koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom sekvencom.

[0089] Izraz „varijanta", kao što se ovde koristi, obuhvata entitet koji pokazuje značajan strukturni identitet sa referentnim entitetom, ali se strukturno razlikuje od referentnog entiteta u prisustvu ili nivou jedne ili više hemijskih grupa u poređenju sa referentnim entitetom. U mnogim realizacijama, "varijanta" se, takođe, funkcionalno razlikuje od svog referentnog entiteta. Uopšteno, da li se određeni entitet ispravno smatra "varijantom" referentnog entiteta, zasniva se na njegovom stepenu strukturnog identiteta sa referentnim entitetom. Kao je poznato stručnjacima u tehnici, bilo koji biološki ili hemijski referentni entitet ima određene karakteristične strukturne elemente. "varijanta", po definiciji, je različiti hemijski entitet koji deli jedan ili više takvih karakterističnih strukturnih elemenata. Da bismo dali nekoliko primera, mali molekul može imati karakteristični strukturni element jezgra (npr. jezgro makrocikla) i/ili jedan ili više karakterističnih visećih grupa, tako da je varijanta malog molekula ona koja deli strukturni element jezgra i karakteristične viseće grupe, ali se razlikuje kod ostalih visećih grupa i/ili u vrstama veza (jednostruke nasuprot dvostrukoj, E protiv Z, itd.) unutar jezgra, polipeptid može imati karakteristični element sekvence koji se sastoji od većeg broja aminokiselina koje imaju označene pozicije jedna u odnosu na drugu u linearnom ili trodimenzionalnom prostoru i/ili doprinose određenoj biološkoj funkciji, nukleinska kiselina može imati karakteristični element sekvence koji se sastoji od većeg broja nukleotidnih ostataka koji imaju određene položaje jedan u odnosu na drugi u linearnom ili trodimenzionalnom prostoru. Na primer "varijanta polipeptida" može se razlikovati od referentnog polipeptida kao rezultat jedne ili više razlika u sekvenci amino-kiselina i/ili jedne ili više razlika u hemijskim delovima (npr. ugljeni hidrati, lipidi, itd.) kovalentno vezanim za polipeptidnu kičmu. U nekim realizacijama, "varijanta polipeptida" pokazuje ukupni identitet sekvence sa referentnim polipeptidom koji je najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ili 99%. Alternativno ili dodatno, u nekim realizacijama, "varijanta polipeptida" ne deli barem jedan karakteristični element sekvence sa referentnim polipeptidom. U nekim realizacijama, referentni polipeptid ima jednu ili više bioloških aktivnosti. U nekim realizacijama, "varijanta polipeptida" deli jednu ili više bioloških aktivnosti referentnog polipeptida. U nekim realizacijama, "varijanta polipeptida" nedostaje jedna ili više bioloških aktivnosti referentnog polipeptida. U nekim realizacijama, "varijanta polipeptida“ pokazuje smanjeni nivo jedne ili više bioloških aktivnosti u poređenju sa referentnim polipeptidom. U mnogim realizacijama, polipeptidom od interesa se smatra "varijanta" “ roditelja ili referentnog polipeptida ako polipeptid od interesa ima sekvencu amino-kiselina koja je identična onoj roditeljskoj (matičnoj) ali sa malim brojem izmena sekvenci na određenim pozicijama. Uobičajeno je manje od 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ostataka u varijanti supstituisano u poređenju sa matičnim. U nekim realizacijama, "varijanta" ima 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 supstituisanih ostataka u poređenju sa matičnim. Često, "varijanta" ima veoma mali broj (npr. manji od 5, 4, 3, 2 ili 1) supstituisanih funkcionalnih ostataka (tj. ostataka koji učestvuju u određenoj biološkoj aktivnosti ). Dalje, "varijanta" obično nema više od 5, 4, 3, 2 ili 1 dodataka ili delecija i često nema dodataka ili delecija, u poređenju sa matičnim. Štaviše, bilo kakvi dodaci ili delecije su obično manji od oko 25, oko 20, oko 19, oko 18, oko 17, oko 16, oko 15, oko 14, oko 13, oko 10, oko 9, oko 8, oko 7, oko 6, i obično su manje od oko 5, oko 4, oko 3 ili oko 2 ostatka. U nekim realizacijama, roditeljski ili referentni polipeptid je onaj koji se nalazi u prirodi. Kao što će razumeti stručnjaci u tehnici, u prirodi se može naći veći broj varijanti određenog polipeptida od interesa, posebno kada je polipeptid od interesa polipeptid sa infektivnim agensom.

[0090] Izraz „vektor", kao što se ovde koristi, uključuje molekul nukleinske kiseline koji je sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu sa kojom je povezan. U nekim realizacijama, vektori su sposobni za ekstrahromozomsku replikaciju i/ili ekspresiju nukleinskih kiselina na koje su povezani u ćeliji domaćinu, kao što je eukariotska i/ili prokariotska ćelija. Vektori koji mogu usmeravati ekspresiju operativno povezanih gena ovde se zovu „ekspresioni vektori."

1

[0091] Izraz „divljeg tipa", kao što se ovde koristi, ima značenje razumljivo u struci koje uključuje entitet koji ima strukturu i/ili aktivnost kakvu nalazimo u prirodi u „normalnoj" (nasuprot mutantnom, bolesnom, izmenjenom, itd.) stanju ili kontekstu. Stručnjaci u tehnici će razumeti da geni i polipeptidi divljeg tipa često postoje u više različitih oblika (npr. aleli).

DETALJNI OPIS ODREĐENIH REALIZACIJA

[0092] Predmetni pronalazak pruža, između ostalog, pobolјšane i/ili stvorene ne-humane životinje koje imaju humanizovani genetski materijal koji kodira polipeptid liganda programirane smrti 1 (PD-L1) za određivanje terapijske efikasnosti modulatora PD-L1 (npr. anti-PD-Ll antitelo) za lečenje raka, autoimunih bolesti i zaraznih patogena, kao i testove u odgovorima i funkciji imunih ćelija. Zamišljeno je da takve ne-humane životinje obezbede poboljšanje u određivanju terapijske efikasnosti PD-L1 modulatora i njihovog potencijala za blokadu PD- 1:PD-L1 (or PD-L1:B7-1). Stoga je predmetni pronalazak posebno koristan za razvoj anti- PD-Ll i, u nekim realizacijama, anti-PD-1 terapija za lečenje različitih vrsta raka, autoimunih bolesti kao i za povećanje imunih odgovora za lečenje i/ili poboljšanje zarazne etiologije. Naročito, predmetni pronalazak obuhvata humanizaciju glodarskog CD274 gena što rezultira eksprimovanjem humanizovanog PD-L1 polipeptida na površini ćelija glodara. Takve humanizovane PD-L1 ne-humanih životinja imaju sposobnost da obezbede izvor humanih PD-L1+ ćelija za određivanje efikasnosti anti- PD-Ll terapija za unapređenje anti-tumorskih imunih odgovora. Takve humanizovane PD-L1 životinje nehumane takođe imaju kapacitet da obezbede izvor humanih PD-L1+ ćelija za određivanje efikasnosti anti-PD-Ll terapeutskih sredstava za ublažavanje autoimune bolesti, poremećaja ili stanja. Dalјe, takve humanizovane PD-L1 ne-humane životinje pružaju in vivo sistem za skrining i razvoj anti-PD-Ll terapija za lečenje različitih vrsta raka, autoimunih bolesti i zaraznih bolesti. U nekim realizacijama, efikasnost lečenja može se pokazati kod glodara iz ovog pronalaska smanjenjem ili nestankom znakova i/ili simptoma bolesti, poremećaja ili stanja; u nekim realizacijama, smanjenje ili nestanak nekih, ali ne svih, znakova i simptoma bolesti, poremećaja ili stanja; u nekim realizacijama, smanjenje ili nestajanje svih znakova i simptoma bolesti, poremećaja ili stanja, iako bolest, poremećaj ili stanje još uvek mogu biti u telu glodara. U različitim realizacijama, bolest, poremećaj ili stanje su povezani sa rakom. U različitim realizacijama, bolest, poremećaj ili stanje su povezani sa autoimunom bolešću, poremećajem ili stanjem. U različitim realizacijama, bolest, poremećaj ili stanje su povezani sa zaraznim patogenom (npr. bakterijom).

[0093] U nekim realizacijama, glodari ovog pronalaska pokazuju modulisani imuni odgovor blokadom PD-1: PD-L1 signalizacije kroz humanizovani PD-L1 polipeptid eksprimovan na površini ćelija glodara. U nekim realizacijama, humanizovani PD-L1 polipeptidi imaju sekvencu koja odgovara imunoglobulinskim V i C domenima, u celini ili delimično, humanog polipeptida PD-L1. U nekim realizacijama, humanizovani PD-L1 polipeptidi imaju sekvencu koja odgovara u osnovi svim vanćelijskim domenima humanog polipeptida PD-L1. U nekim realizacijama, humanizovani PD-L1 polipeptidi imaju sekvencu koja odgovara citoplazmatskom domenu PD-L1 polipeptida glodara; u nekim realizacijama, sekvenca koja odgovara transmembranskim i citoplazmatskim domenima PD-L1 polipeptida glodara. U nekim realizacijama, humanizovani PD-L1 polipeptidi imaju sekvencu koja odgovara ostacima amino-kiselina 19-238 (ili 19-227, ili 19-131) humanog PD-L1 polipeptida. Glodari ovog pronalaska sadrže gen CD274 koji sadrži genetski materijal glodara i čoveka. U nekim realizacijama, glodari predmetnog pronalaska sadrže humanizovani CD274 gen, pri čemu humanizovani CD274 gen sadrži ekson 3, ekson 4 i ekson 5 u celini ili delimično humanog CD274 gena. U nekim određenim rešenjima, glodari ovog pronalaska sadrže humanizovani CD274 gen, pri čemu humanizovani CD274 gen sadrži oko 4.494 bp humanog CD274 gena koji odgovara eksonu 3 i oko 4.160 bp humane genomske sekvence 3’ eksona 3. U nekim određenim realizacijama glodari predmetnog pronalaska sadrže humanizovani CD274 gen, pri čemu humanizovani gen CD274 sadrži oko 3.950 bp humanog gena CD274 gena koji odgovara oko 1.253 bp humane genomske sekvence 5’ eksona 4, eksona 4, introna 4 i prvim 32 bp eksona 5 humanog CD274 gena. U nekim određenim

1

realizacijama, glodari predmetnog pronalaska sadrže humanizovani CD274 gen, pri čemu humanizovani CD274 gen sadrži oko 4.494 bp i oko 3.950 bp humanog CD274 gena u kombinaciji sa lokacijom rekombinacije specifične za lokaciju (npr. loxP lokacija), čiji 4.494 bp i 3.950 bp odgovaraju eksonu 3, eksonu 4 i prvim 32 bp eksona 5 humanog CD274 gena. U nekim određenim rešenjima, glodari ovog pronalaska sadrže humanizovani CD274 gen, pri čemu humanizovani CD274 gen sadrži oko 8.444 bp humanog CD274 gena koji odgovara eksonu 3, eksonu 4 i prvim 32 bp eksona 5 humanog CD274 gena. U nekim realizacijama, glodari kao što su miševi ili pacovi predmetnog pronalaska sadrže humanizovani gen CD274, pri čemu humanizovani gen CD274 sadrži ekson 3, ekson 4 i deo eksona 5 humanog CD274 gena, operativno povezan sa eksonima 1, 2, delom eksona 5, eksonom 6 i 7 nehumanog CD274 gena (npr. endogeni ne-humani Cd274 gen); i u specifičnim realizacijama, humanizovani CD274 gen kodira humanizovani PD-L1 polipeptid koji uklјučuje čitav ili suštinski čitav ekstracelularni (vanćelijski) domen humanog PD-L1 polipeptida i sve ili suštinski sve transmembranske i citoplazmatske domene glodara PD- L1 polipeptid. U nekim određenim rešenjima, glodari predmetnog pronalaska sadrže humanizovani CD274 gen prikazan na slici 2.

[0094] Različiti aspekti pronalaska detaljno su opisani u sledećim odeljcima. Upotreba odeljaka nije namenjena da ograniči pronalazak. Svaki odeljak može da se odnosi na bilo koji aspekt ovog pronalaska. Kroz ovu prijavu, upotreba „ili“ znači „i/ili“ osim ako nije drugačije navedeno.

Klaster diferencijacije 274 (CD274) gena

[0095] CD274, koji kodira polipeptid nazvan ligand programirane ćelijske smrti 1 (PD-L1, takođe poznat i kao B7-H1), otkriven je pretraživanjem baze podataka oznaka humane eksprimovane sekvence (EST) koristeći članove porodice B7 B7-1 i B7-2 (Dong, H. et al., 1999, Nature Med.5(12):1365-1369; Freeman, G. J. et al., 2000, J. Exp. Med.192(7):1027-1034). Gen CD274 se sastoji od sedam eksona od kojih svaki kodira različite delove PD-L1 polipeptida; ekson 1: nekodiranje i sadrži 5'UTR; ekson 2: sekvenca signala; ekson 3: V domen imunoglobulina (IgV); ekson 4: C domen imunoglobulina (IgC); ekson 5: C-terminalni deo vanćelijskog domena i transmembranski domen; ekson 6: unutarćelijski domen; i ekson 7: ∼ 6 amino-kiselinskih ostataka unutarćelijskog domena i 3'UTR. Polipeptid PD-L1 deli zajedničku strukturnu organizaciju sa ostalim članovima porodice B7 (B7-1 i B7-2) uprkos niskom procentu identiteta sekvence (∼20%). Suprotno tome, PD-L1 polipeptidne sekvence miša i čoveka dele oko 70% identiteta sekvence (Freeman, G. J. et al., supra). PD-L1 se snažno eksprimuje u srcu, skeletnim mišićima, placenti i plućima, slabo eksprimuje u timusu, slezini, bubrezima i jetri, a nije eksprimovan u mozgu, debelom crevu ili tankom crevu (Dong, H. et al., supra). Dalјe, PD-L1 se konstitutivno eksprimuje na T ćelijama, B ćelijama, mijeloidnim ćelijama (npr. dendritične ćelije, makrofagi, mastociti, itd.) i keratinocitima kod miša, dok je ekspresija u istim ćelijama kod lјudi prijavlјena nakon aktivacije ( npr. reviewed in Keir, M.E., et al., 2008, Annu. Rev. Immunol.26:677-704). U stvari, prijavlјeno je da promotor CD274 i za mišje i za humane gene sadrži mesta vezivanja za interferonski regulatorni faktor 1 (IRF-1), za koji se sugeriše da je odgovoran za PD-L1 regulaciju u ćelijama humanog raka (Lee, S. J. et al., 2006, FEBS Lett.580(3):755-762). Prijavlјene su PD-L1 varijante splajsova (vidi, na primer, u daljem tekstu i He, X. H. et al., 2005, Acta Pharmacol Sin.26(4):462-468), međutim, još uvek nije otkrivena uzročna veza sa bilo kojom bolešću. PD-L1 vezuje PD-1 isklјučivo bez ikakvih interakcija sa drugim proteinima strukturno sličnim PD-1 (CTLA4, CD28, ICOS; videti Dong. Dong, H. et al. and Freeman, G. J. et al., supra). Angažovanje PD-L1 sa PD-1 dovodi do različitih stimulativnih ili inhibitornih funkcija imunih ćelija, od kojih neke uklјučuju proliferaciju ćelija, proizvodnju citokina i signalizaciju receptora T i receptora B ćelija. Za PD-L1 (kao i PD-L2) takođe je pretpostavljeno da je uklјučen u dvosmernu signalizaciju (npr. vidi Dong, H. et al., 2003, J. Clin. Invest.111:363-370; Kuipers, H. et al., 2006, Eur. J. Immunol.36:2472-2782). Zanimlјivo je da se pokazalo da PD-L1 veže B7-1 (CD80), ligand za CD28, iako nije zabeležena nikakva interakcija sa samim CD28 (Butte, M. J. et al., 2007, Immunity 27:111-122). Ova jedinstvena interakcija sa B7-1 je posebno važna zbog njegovih

2

implikacija u regulaciji odgovora T-ćelija i tolerancije. Zapravo, zbog višestrukih funkcionalnih ishoda koje pružaju njegove kostimulatorne i kohibitorne funkcije, PD-L1 je privukao veliko interesovanje kao potencijalni cilј za lečenje autoimunih i inflamatornih bolesti, kao i za lečenje raka. U stvari, anti-PD-Ll terapija se trenutno ispituje u kliničkim ispitivanjima na lјudima (vidi, npr. Pedoeem, A. et al., 2014, Clin. Immunol.153:145-152; and Philips, G.K. and Atkins, M., 2014, Intern. Immunol.8 strana).

[0096] Potrebno je temeljnije i detalјnije razumevanje funkcija posredovanih PD-L1 u mnogim tipovima ćelija u kojima se eksprimuje (npr. ne-limfoidne ćelije) i jedinstvene interakcije sa drugim članovima porodice B7 kako bi se razvile praktične cilјane terapije za lečenje raka i autoimunosti u budućnosti.

CD274 i PD-L1 (B7-H1) sekvence

[0097] Primeri mišje, humane i humanizovane CD274 i PD-L1 sekvence prikazani su na slici 6. Primerne sekvence humane nukleinske kiseline za humanizaciju gena CD274 koji nije humani, takođe su prikazane na slici 6. Za sekvence mRNK, podebljana slova označava kodirajuću sekvencu, a uzastopni eksoni, gde su naznačeni, razdvajaju se naizmeničnim podvučenim tekstom; za humanizovane mRNK sekvence, humane sekvence su sadržane u zagradama. Za proteinske sekvence, signalni peptidi su podvučeni, vanćelijske sekvence su podebljanih slova, sekvence V domena imunoglobulina (IgV) su unutar zagrada, a intracelularne sekvence su u kurzivu; a za humanizovane proteinske sekvence, sekvence koje nisu humane su označene običnim slovima, a humane sekvence su označene podebljanim slovima.

[0098] Varijante CD274 transkripcije su poznate u struci. Jednoj varijanti transkripta nedostaje ekson u okviru u 5’ kodirajućem regionu u poređenju sa kanonskom sekvencom (vidi Sliku 6) i rezultira brisanjem ostataka 17-130 (tj. IgV domen plus ∼5 ostataka amino-kiselina). Sekvence mRNK i proteina ove varijante mogu se naći na pristupnim brojevima Genbank NM_001267706.1 i NP_001254635.1, tim redosledom. Druga varijanta kodira rastvorlјivi protein koji ima supstituciju K178D i deleciju ostataka 179-290. Sekvence mRNK i proteina ove varijante mogu se naći na pristupnim brojevima Genbank XM 006716759.1 i XP_006716822.1, tim redosledom. Opisana je treća varijanta (NR_052005.1) koja nema alternativni unutrašnji segment u poređenju sa kanonskom sekvencom i, prema tome, predstavlјena je kao nekodirajuća varijanta, jer upotreba 5'-najpodržanijeg početnog kodona translacije čini transkript kandidatom za besmisleno posredovano raspadanje mRNK (NMD). Ostali izoformi su opisani u WO 2014/197369.

Humanizovani CD274 Glodari

[0099] Obezbeđeni su glodari koji eksprimuju humanizovane PD-L1 polipeptide na površini ćelija glodara koji su rezultat genetske modifikacije endogenog lokusa (npr., CD274 lokusa) glodara koji kodira PD-L1 polipeptid. Pogodni primeri opisani ovde uključuju glodare, u nekim realizacijama, miševe.

[0100] Humanizovani CD274 gen sadrži genetski materijal čoveka, pri čemu humanizovani CD274 gen kodira PD-L1 polipeptid koji sadrži kodirani deo genetskog materijala čoveka. Humanizovani CD274 gen predmetnog pronalaska sadrži genomsku DNK čoveka koja kodira vanćelijski deo polipeptida PD-L1 koji se eksprimuje na plazma membrani ćelije. Takođe su obezbeđeni glodari, embrioni, ćelije i konstrukti za cilјanje za stvaranje glodara, embriona glodara i ćelija koje sadrže pomenuti humanizovani CD274 gen.

[0101] U nekim realizacijama, endogeni CD274 gen je izbrisan. U nekim realizacijama, endogeni CD274 gen je izmenjen, pri čemu je deo endogenog CD274 gena zamenjen heterolognom sekvencom (npr., humanom CD274 sekvencom, u celini ili delimično). U nekim realizacijama, ceo ili u osnovi ceo endogeni CD274 gen je zamenjen heterolognim genom (npr., humanim CD274 genom). U nekim realizacijama, deo heterolognog CD274 gena je insertovan u endogeni CD274 gen koji nije humani na endogenom CD274 lokusu. U nekim realizacijama, heterologni gen je humani gen. U nekim realizacijama, modifikacija ili humanizacija se vrši na jednoj od dve kopije endogenog CD274 gena, što stvara ne-humanu životinju a koja je heterozigotna u odnosu na humanizovani gen CD274. U drugim realizacijama obezbeđen je glodar koji je homozigotan za humanizovani CD274 gen.

[0102] U različitim realizacijama, glodar sadrži humani CD274 gen, u celini ili delimično, na endogenom lokusu CD274 glodara. U nekim realizacijama, glodar sadrži humani CD274 gena, na lokaciji izvan endogenog ne-humanog CD274 lokusa. Prema tome, takvi glodari mogu se opisati kao da imaju heterologni CD274 gen. Zamenjeni, insertovani, modifikovani ili izmenjeni CD274 gen na endogenom CD274 lokusu (ili izvan endogenog CD274 lokusa) ili polipeptid eksprimovan iz takvog gena (ili eksprimovan iz bilo kog dela genoma ne-humane životinje) može se otkriti korišćenjem različitih metoda, uključujući, na primer, PCR, Western blot, Southern blot, test polimorfizma dužine restrikcionog fragmenta (RFLP) ili test na dobitak ili gubitak alela. U nekim realizacijama, glodar je heterozigotan u odnosu na humanizovani CD274 gen.

[0103] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnog pronalasku uključuje CD274 gen koji ima treći ekson sa sekvencom od najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnom trećem eksonu koji se pojavljuje u humanizovanoj sekvenci CD274 mRNK sa slike 6.

[0104] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uključuje CD274 gen koji ima treći ekson koji ima sekvencu koja je u osnovi identična trećem eksonu koji se pojavljuje u humanizovanoj sekvenci CD274 mRNK sa slike 6.

[0105] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uključuje CD274 gen koji ima treći ekson koji ima sekvencu koja je identična trećem eksonu i koji se pojavljuje u humanizovanoj sekvenci CD274 mRNK sa slike 6.

[0106] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uključuje CD274 gen koji ima četvrti ekson sa sekvencom od najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnom četvrtom eksonu koji se pojavljuje u humanizovanoj sekvenci CD274 mRNK sa slike 6.

[0107] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uključuje CD274 gen koji ima četvrti ekson koji ima sekvencu koja je u osnovi identična četvrtom eksonu koji se pojavljuje u humanizovanoj sekvenci CD274 mRNK sa slike 6.

[0108] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uključuje CD274 gen koji ima četvrti ekson koji ima sekvencu koja je identična četvrtom eksonu i koji se pojavljuje u humanizovanoj sekvenci CD274 mRNK sa slike 6.

[0109] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uključuje CD274 gen koji ima peti ekson sa sekvencom od najmanje 50% (npr. 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnom petom eksonu koji se pojavljuje u humanizovanoj sekvenci CD274 mRNK sa slike 6.

[0110] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uključuje CD274 gen koji ima peti ekson koji ima sekvencu koja je u osnovi identična petom eksonu koji se pojavljuje u humanizovanoj sekvenci CD274 mRNK sa slike 6.

[0111] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji ima peti ekson koji ima sekvencu koja je identična petom eksonu koji se pojavlјuje u humanizovanoj CD274 mRNK sekvenci sa slike 6.

[0112] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uključuje CD274 gen koji ima treći, četvrti i peti ekson koji svaki ima sekvencu od najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu trećem, četvrtom ili petom eksonu koji se pojavljuje u humanizovanoj sekvenci CD274 mRNK sa slike 6.

[0113] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji ima treći, četvrti i peti ekson, svaki od kojih ima sekvencu koja je u osnovi identična trećem, četvrtom i petom eksonu koji se pojavlјuju u humanizovanoj CD274 mRNK sekvenci sa slike 6.

[0114] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji ima treći, četvrti i peti ekson, a svaki ima sekvencu koja je identična trećem, četvrtom i petom eksonu koji se pojavlјuju u humanizovanoj CD274 mRNK sekvenci Slika 6.

[0115] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji ima prvi, drugi, šesti i sedmi ekson, a svaki ima sekvencu najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu prvom, drugom, šestom i sedmom eksonu koji se pojavlјuju u mošjoj Cd274 mRNK sekvenci sa slike 6.

[0116] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji ima prvi, drugi, šesti i sedmi ekson, svaki od kojih ima sekvencu koja je u osnovi identična prvom, drugom, šestom i sedmom eksonu koji se pojavlјuju u mišjoj Cd274 mRNK sekvenci sa slike 6.

[0117] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji ima prvi, drugi, šesti i sedmi ekson, a svaki ima sekvencu koja je identična prvom, drugom, šestom i sedmom eksonu koji se pojavlјuju u mišjoj Cd274 mRNK sekvenci sa slike 6.

[0118] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uključuje CD274 gen koji sadrži sekvencu od najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnom SEQ ID NO:12.

[0119] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji sadrži sekvencu koja je u osnovi identična SEQ ID NO:12.

[0120] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji sadrži sekvencu koja je identična SEQ ID NO:12.

[0121] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uključuje CD274 gen koji sadrži sekvencu od najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnom SEQ ID NO:13 ili SEQ ID NO: 16.

[0122] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uključuje CD274 gen koji sadrži sekvencu koja je u osnovi identična SEQ ID NO:13 ili SEQ ID NO:16.

[0123] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uključuje CD274 gen koji sadrži sekvencu koja je identična SEQ ID NO:13 ili SEQ ID NO:16.

[0124] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji sadrži prvu sekvencu najmanje 50% (npr. 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu SEQ ID NO: 13 i drugu sekvencu najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu SEQ ID NO: 16.

[0125] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji sadrži prvu sekvencu koja je u osnovi identična SEQ ID NO: 13 i drugu sekvencu koja je u osnovi identična SEQ ID NO: 16.

[0126] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji sadrži prvu sekvencu koja je identična SEQ ID NO: 13 i drugu sekvencu koja je identična SEQ ID NO: 16.

[0127] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku sadrži SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 i mesto za prepoznavanje rekombinaze specifične za mesto, pri čemu se navedeno mesto za prepoznavanje rekombinaze specifične za mesto nalazi unutar introna datog humanizovanog CD274 gena.

[0128] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku sadrži SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 i loxP mesto, pri čemu je dato loxP mesto se nalazi unutar introna pomenutog humanizovanog CD274 gena.

2

[0129] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji sadrži intron između CD274 eksona 3 i CD274 eksona 4, pri čemu dati intron sadrži sekvencu koja je u osnovi identična SEQ ID NO: 17.

[0130] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji sadrži intron između CD274 eksona 3 i CD274 eksona 4, pri čemu dati intron sadrži sekvencu koja je identična SEQ ID NO: 17.

[0131] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji sadrži SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16 i SEQ ID NO:17.

[0132] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji sadrži SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 i SEQ ID NO:16.

[0133] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji ima nukleotidnu kodirajuću sekvencu (npr. sekvencu cDNK) koja je najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična nukleotidnoj kodirajućoj sekvenci koji se pojavlјuje u humanizovanoj CD274 nukleotidnoj kodirajućoj sekvenci na slici 6.

[0134] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji ima nukleotidnu kodirajuću sekvencu (npr. sekvencu cDNK) koja je u osnovi identična nukleotidnoj kodirajućoj sekvenci koji se pojavlјuje u humanizovanoj CD274 nukleotidnoj kodirajućoj sekvenci na slici 6.

[0135] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema ovom pronalasku uklјučuje CD274 gen koji ima nukleotidnu kodirajuću sekvencu (npr. sekvencu cDNK) koja je identična nukleotidnoj kodirajućoj sekvenci koja se pojavlјuje u humanizovanoj CD274 nukleotidnoj kodirajućoj sekvenci na slici 6.

[0136] U različitim realizacijama, humanizovana CD274 sekvenca mRNK prema predmetnom pronalasku sadrži sekvencu koja je najmanje 50% (npr. 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična humanizovanoj sekvenci CD274 mRNK koja se pojavljuje na slici 6.

[0137] U različitim realizacijama, humanizovana CD274 mRNK sekvenca prema predmetnom pronalasku sadrži sekvencu koja je u osnovi identična sa humanizovanom CD274 mRNK sekvencom sa slike 6.

[0138] U različitim realizacijama, humanizovana CD274 mRNK sekvenca prema predmetnom pronalasku sadrži sekvencu koja je identična humanizovanoj CD274 mRNK sekvenci sa slike 6.

[0139] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku kodira PD-L1 polipeptid koji ima sekvencu amino-kiseline najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu sekvenci PD-L1 polipeptida sa slike 6.

[0140] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku kodira PD-L1 polipeptid koji ima sekvencu amino-kiseline koja je u osnovi identična PD-L1 polipeptidnoj sekvenci sa Slike 6.

[0141] U različitim realizacijama, humanizovani CD274 gen prema predmetnom pronalasku kodira PD-L1 polipeptid koji ima sekvencu amino-kiseline koja je identična PD-L1 polipeptidnoj sekvenci sa Slike 6.

[0142] U različitim realizacijama, humanizovani PD-L1 polipeptid proizveden od strane glodara iz predmetnog pronalaska ima vanćelijski deo koji ima sekvencu amino-kiseline najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu vanćelijskom delu humanog PD-L1 polipeptida koji se pojavljuje na slici 6.

[0143] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara predmetnog pronalaska ima vanćelijski deo koji ima sekvencu amino-kiseline koja je u osnovi identična vanćelijskom delu humanog PD-L1 polipeptida koji se pojavlјuje na slici 6.

[0144] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara predmetnog pronalaska ima vanćelijski deo koji ima sekvencu amino-kiseline koja je identična vanćelijskom delu humanog PD-L1 polipeptida koji se pojavlјuje na slici 6.

[0145] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara ovog pronalaska sadrži sekvencu amino-kiseline najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu ostacima amino-kiseline 19-131 koji se pojavlјuju u humanom ili humanizovanom PD-L1 polipeptidu sa slike 6.

[0146] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara ovog pronalaska sadrži sekvencu amino-kiseline koja je u osnovi identična ostacima amino-kiseline 19-131 koji se pojavlјuju u humanom ili humanizovanom PD-L1 polipeptidu sa slike 6.

[0147] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara ovog pronalaska sadrži sekvencu amino-kiseline koja je identična ostacima amino-kiseline 19-131 koji se pojavlјuju u humanom ili humanizovanom PD-L1 polipeptidu sa slike 6.

[0148] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara ovog pronalaska sadrži sekvencu amino-kiseline najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična ostacima amino-kiseline 19-227 koji se pojavlјuju u humanom ili humanizovanom PD-L1 polipeptidu sa slike 6.

[0149] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara ovog pronalaska sadrži sekvencu amino-kiseline koja je u osnovi identična ostacima amino-kiseline 19-227 koji se pojavlјuju u humanom ili humanizovanom PD-L1 polipeptidu sa slike 6.

[0150] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara ovog pronalaska sadrži sekvencu amino-kiseline koja je identična ostacima amino-kiseline 19-227 koji se pojavlјuju u humanom ili humanizovanom PD-L1 polipeptidu sa slike 6.

[0151] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara ovog pronalaska sadrži sekvencu amino-kiseline najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu ostacima amino-kiseline 19-238 koji se pojavlјuju u humanom ili humanizovanom PD-L1 polipeptidu sa slike 6.

[0152] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara ovog pronalaska sadrži sekvencu amino-kiseline koja je u osnovi identična ostacima amino-kiseline 19-238 koji se pojavlјuju u humanom ili humanizovanom PD-L1 polipeptidu sa slike 6.

[0153] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara ovog pronalaska sadrži sekvencu amino-kiseline koja je identična ostacima amino-kiseline 19-238 koji se pojavlјuju u humanom ili humanizovanom PD-L1 polipeptidu sa slike 6.

[0154] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara iz ovog pronalaska ima V domen imunoglobulina (IgV) koji ima sekvencu amino-kiseline najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu IgV domenu humanog PD-L1 polipeptida koji se pojavlјuje na slici 6.

[0155] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara predmetnog pronalaska ima V domen imunoglobulina (IgV) koji ima sekvencu amino-kiseline koja je u osnovi identična IgV domenu humanog PD-L1 polipeptida koji se pojavlјuje na slici 6.

[0156] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara predmetnog pronalaska ima V domen imunoglobulina (IgV) koji ima sekvencu amino-kiseline koja je identična IgV domenu humanog polipeptida PD-L1 koji se pojavlјuje na slici 6.

[0157] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara ovog pronalaska ima V domen imunoglobulina (IgV) i C domen imunoglobulina (IgC), svaki od kojih ima sekvencu amino-kiseline najmanje 50% (npr.50%, 55 %, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu IgV domenu i IgC domenu humanog polipeptida PD-L1 koji se pojavlјuje na slici 6.

[0158] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara ovog pronalaska ima V domen imunoglobulina (IgV) i C domen imunoglobulina (IgC), svaki od kojih ima

2

sekvencu amino-kiseline koja je u osnovi identična IgV domenu i IgC domen humanog polipeptida PD-L1 koji se pojavlјuje na slici 6.

[0159] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara ovog pronalaska ima V domen imunoglobulina (IgV) i C domen imunoglobulina (IgC), svaki od kojih ima sekvencu amino-kiseline koja je identična IgV domenu i IgC domenu humanog polipeptida PD-L1 koji se pojavlјuje na slici 6.

[0160] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara predmetnog pronalaska ima transmembranski domen i unutarćelijski domen, svaki od njih ima sekvencu amino-kiseline najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu sa transmembranskim domenom i unutarćelijskom domenom mišjeg PD-L1 polipeptida koji se pojavlјuje na slici 6.

[0161] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara predmetnog pronalaska ima transmembranski domen i unutarćelijski domen, svaki od njih ima sekvencu amino-kiseline koja je u osnovi identična transmembranskom domenu i unutarćelijskom domenu mišjeg PD-L1 polipeptida koji se pojavlјuje na slici 6.

[0162] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara predmetnog pronalaska ima transmembranski domen i unutarćelijski domen, svaki od njih ima sekvencu amino-kiseline koja je identična transmembranskom domenu i unutarćelijskom domenu mišjeg PD-L1 polipeptida koji pojavlјuje se na slici 6.

[0163] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid stvoren od strane glodara iz predmetnog pronalaska ima sekvencu amino-kiseline najmanje 50% (npr. 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu sekvenci amino-kiseline humanizovanog PD-L1 polipetida koja se pojavljuje na slici 6.

[0164] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara ovog pronalaska ima sekvencu amino-kiseline koja je u osnovi identična sekvenci amino-kiseline humanizovanog PD-L1 polipeptida koji se pojavlјuje na slici 6.

[0165] U različitim realizacijama, PD-L1 polipeptid proizveden od glodara ovog pronalaska ima sekvencu amino-kiseline koja je identična sekvenci amino-kiseline humanizovanog PD-L1 polipeptida koji se pojavlјuje na slici 6.

[0166] Obezbeđene su kompozicije i postupci za pravlјenje glodara koji eksprimuju humanizovani PD-L1 polipeptid, uklјučujući specifične polimorfne oblike, alelne varijante (npr. razlike u pojedinačnim amino-kiselinama) ili alternativno spojene izoforme. U nekim realizacijama, takođe su obezbeđene kompozicije i postupci za pravljenje glodara koje eksprimuju takve polipeptide iz endogenog promotora i endogene regulatorne sekvence. Postupci uklјučuju umetanje genetskog materijala koji kodira humani polipeptid PD-L1 (npr. humanu CD274 DNK sekvencu) delom na tačnoj lokaciji u genomu glodara koja odgovara endogenom CD274 genu, stvarajući tako humanizovani CD274 gen koji delimično eksprimuje PD-L1 polipeptid koji je humani. Alternativno, umetanje genetskog materijala koji kodira humani PD-L1 polipeptid u celini ili delimično može se izvršiti na nasumičnom mestu u genomu glodara, tj. izvan endogenog CD274 gena. U nekim realizacijama, postupci uključuju ubacivanje genomske DNK koja odgovara eksonima 3-5 (ili eksonima 3, 4 i delu eksona 5) humanog CD274 gena u endogeni CD274 gen glodara stvarajući tako humanizovani gen koji kodira PD-L1 polipeptid koji sadrži humani deo koji sadrži amino-kiseline koje su kodirane insertovanim eksonima. U nekim primerima, postupci uklјučuju nasumično umetanje genomske DNK koja odgovara humanom CD274 genu pune dužine (ili cDNK) u genom glodara stvarajući tako humani CD274 transgen koji kodira humani PD-L1 polipeptid pune dužine.

[0167] Po potrebi, kodirajuća oblast genetskog materijala ili polinukleotidne sekvence koja kodira humani PD-L1 protein u celini ili delimično može biti modifikovana tako da uključi kodone koji su optimizovani za ekspresiju iz ćelija ne-humane životinje (npr. vidi američki patent br. 5,670,356 i 5,874,304). Kodon optimizovane sekvence su sintetičke sekvence i poželjno kodiraju identični polipeptid (ili biološki aktivni fragment polipeptida pune dužine koji ima u osnovi istu aktivnost kao i polpeptid pune dužine) kodiran nekodonski optimizovanim roditeljskim polinukleotidom. U nekim realizacijama, kodirajuća oblast genetskog materijala koji kodira humani PD-L1 polipeptid, u celini ili delimično, može da sadrži izmenjenu sekvencu

2

za optimizaciju upotrebe kodona za određenu vrstu ćelije (npr. ćelije glodara). Na primer, kodoni genomske DNK koji odgovaraju eksonima 3-5 (ili eksonima 3, 4 i delu eksona 5) humanog CD274gena koji će biti insertovan u endogeni CD274 gen ne-humane životinje (npr. glodara) mogu biti optimizovani za eksprimovanje u ćeliji ne-humane životinje. Takva sekvenca se može opisati kao kodon optimizovana sekvenca.

[0168] Pristup humanizovanog CD274 gena koristi relativno minimalnu modifikaciju endogenog gena i rezultira transdukcijom signala posredovanog prirodnim CD274 (npr. posredovanog PD-L1) kod ne-humane životinje, zato što je, na primer, genomska sekvenca CD274 gena modifikovana u jednom fragmentu i stoga zadržava normalnu funkcionalnost uključivanjem potrebnih regulatornih sekvenci i, u nekim realizacijama, intron sekvenci. Stoga, u takvim realizacijama, modifikacija gena CD274 ne utiče na druge okolne gene ili druge endogene gene koji stupaju u interakciju sa CD274 (npr. Pdcdl, itd.). Dalje, u različitim realizacijama, modifikacija ne utiče na sastavljanje funkcionalnog PDL1 transmembranskog polipeptida na ćelijskoj membrani i održava normalne efektorske funkcije vezivanjem i naknadnom transdukcijom signala kroz citoplazmatski deo polipeptida, na koji modifikacija ne utiče.

[0169] Shematski prikaz (nije u razmeri) genomske organizacije Cd274 gena glodara (npr. miša) i humanog CD274 gena je prikazan na slici 1. Primerni konstrukti za humanizaciju endogenog Cd274 gena glodara (npr. miša) koji koristi genomski fragment koji sadrži eksone 3, 4 i deo eksona 5 humanog CD274 gena su prikazani na slici 2. Kao što je ilustrovani, genomski DNK koji sadrži eksone 3, 4 i deo eksona 5 humanog CD274 gena je ubačen u endogenog glodara (npr. miša) Cd274 gena pomoću ciljajućeg konstrukta. Ova genomska DNK uključuje deo gena koji kodira vanćelijski deo (npr. amino-kiselinske ostatke 19-238) humanog PD-L1 polipeptida. Ako se tako želi, genomska DNK koja sadrži eksone 3 i 4 humanog CD274 gena se može ubaciti u endogeni Cd274 genski lokus glodara (npr. miša) ciljajućim konstruktom tako da uklјučuje deo gena koji kodira V i C domene imunoglobulina (npr. ostaci amino-kiselina 19-227) humanog PD-L1 polipeptida. Alternativno, genomska DNK koja sadrži samo ekson 3 humanog CD274 gena se može ubaciti u endogeni Cd274 genski lokus glodara (npr. miša) ciljajućim konstruktom tako da uklјučuje samo deo gena koji kodira V domen imunoglobulina (npr. ostaci amino-kiselina 19-131) humanog PD-L1 polipeptida. Stručnjaci nakon čitanja ovog pronalaska shvatiće različite količine genetskog materijala humanog CD274 gena mogu biti umetnute u genom životinje koja nije čovek, prema ovde opisanoj metodologiji, u zavisnosti od želјenog kodiranog PD-L1 polipeptida.

[0170] Ne-humana životinja (npr. miš) koja ima humanizovani CD274 gen na endogenom CD274 lokusu može se napraviti bilo kojim postupkom poznatim u tehnici. Na primer, može se napraviti ciljajući vektor koji uvodi humani CD274 gen u celini ili delimično sa selektivnim marker genima. Slika 2 ilustruje endogeni Cd274 lokus mišjeg genoma koji sadrži inserciju eksona 3, 4 i deo eksona 5 (oko 32 bp) humanog CD274 gena. Kao što je prikazano, ciljajući konstrukt sadrži 5’ homologni krak koji sadrži sekvencu ushodno od eksona 3 endogenog mišjeg Cd274 gena (∼92.9 Kb), praćen genomskim DNK fragmentom koji sadrži ekson 3 humanog CD274 gena (∼4494 bp), ketridža za izbor leka (npr. gen za otpornost na neomicin sa obe strane okružen loxP sekvencama; -5 Kb) na suprotnom transkripcionom smeru u odnosu na endogeni mišji Cd274 gen, fragment genomske DNK koji sadrži eksone 4 i deo eksona 5 humanog CD274 gena (∼3950 bp), i 3’ homologni krak koji sadrži deo ekson 5 endogenog mišjeg Cd274 gena i genomske sekvence nishodno koja uključuje eksone 6 i 7 (∼67.6 Kb). Ciljajući konstrukt sadrži samo-brišući kertridž za izbor leka (npr. gen za otpornost na neomicin sa obe strane okružen loxP sekvencama; vidi američki patent br. 8,697,851, 8,518,392 i 8,354,389). Nakon homologne rekombinacije, eksoni 3, 4 i deo eksona 5 endogenog mišjeg Cd274 gena su zamenjeni sekvencom sadržanom u ciljajućem vektoru (tj. eksonima 3, 4 i delom eksona 5 humanog CD274 gena) što rezultira delecijom od oko 8.964 bp. Humanizovani CD274 gen se dobija i rezultuje u ćeliji ili ne-humanoj životinji a koja eksprimuje humanizovani PD-L1 polipeptid koji sadrži amino-kiseline kodirane ubačenom DNK humanog CD274 gena. Kertridž za izbor lekova uklanja se na način zavisan od razvoja, to jest, potomstvo dobijeno od miševa čije će gonocitne ćelijske linije koje sadrže

2

humanizovani CD274 gen opisan gore, izbaciti selektirajući marker iz diferenciranih ćelija tokom razvoja.

[0171] Iako su realizacije koji koriste humanizovani CD274 gen u mišu (tj. miš sa CD274 genom koji kodira PD-L1 polipeptid koji uključuje humani deo i deo miša) ovde su detaljno razmotreni, drugi glodari koje sadrži humanizovani CD274 gen su takođe obezbeđeni. Takvi glodari sadrže humanizovani CD274 gen koji je operativno povezan sa endogenim CD274 promotorem. Endogeni promotor CD274 je endogeni promotor glodara. U nekim realizacijama, takvi glodari eksprimuju humanizovani PD-L1 polipeptid iz endogenog lokusa, pri čemu humanizovani PD-L1 polipeptid sadrži ostatke amino-kiselina 19-238 (ili 19-227 ili 19-131) humanog PD-L1 polipeptida. Takvi glodari uklјučuju bilo koje od onih koji mogu biti genetski modifikovani da eksprimuju PD-L1 polipeptid kao što je ovde opisano, uklјučujući, na primer, miša, pacova, itd. Primer sekvence ne-humanih CD274 ortologa uklјučuje, na primer, piletići PD-L1 (XM_424811.3 i XP_424811.3), šimpanzin (XM_001140705.2 i XP 001140705.1), kravlji PD-L1 (NM_001163412.1 i NP_001 156884.1) i pasji PD-L1 (XM .541302.3 i XP_541302.3), majmunski (NM_001083889.1 i NP 001077358.1) i pacovski (NM_001191954.1 i NP_001178883.1). Na primer, za one ne-humane životinje za koje pogodne genetski modifikovane ES ćelije nisu lako dostupne, koriste se drugi postupci da se napravi ne-humana životinja i koja sadrži genetsku modifikaciju. Takvi postupci uključuju, na primer, modifikaciju ne-ES ćelijskog genoma (npr. fibroblast ili indukovanu pluripotentnu ćeliju) i korišćenje nuklearnog prenosa somatske ćelije (SCNT) za prenos genetski modifikovanog genoma u odgovarajuću ćeliju, npr. enukleani oocit, i gestaciju modifikovane ćelije (npr. modifikovanog oocita) kod ne-humane životinje, pod pogodnim uslovima da formira embrion. (videti, npr. Wilmut, L et al., 1997, Nature 385:810-813; objavu međunarodnih patentnih prijava br. WO 97/07668 i WO 97/07669).

[0172] Postupci za modifikaciju genoma ne-humane životinje (npr. genoma svinje, krave, glodara, pileta, itd.) uključuju, na primer, korišćenje Cinkov prst nukleaze (ZFN) ili efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN) radi modifikacije genoma koji uključuje humanizovani CD274 gen.

[0173] Životinja koja nije čovek koja ima humanizovani CD274 gen, kao što je ovde opisano, takođe, može biti stvorena nasumičnim uvođenjem sekvence nukleinske kiseline CD274 u genom ne-humane životinje kao transgena. U zavisnosti od konteksta, mogu se koristiti cDNK ili genomske sekvence humanog CD274. Na primer, intronske sekvence i signali poliadenilacije mogu biti uklјučeni u transgen da bi se povećala efikasnost i nivo ekspresije transgena. Regulatorne sekvence specifične za tkivo mogu biti operativno povezane sa CD274 transgenom da bi usmerile ekspresiju PD-L1 polipeptida na određene tipove ćelija. Konstitutivni promotor može biti operativno povezan sa sekvencom nukleinske kiseline CD274, tako da je kodirani PD-L1 polipeptid prekomerno eksprimovan (tj. eksprimovan na višem nivou i/ili u tkivima koja nisu primećena kod divlјeg tipa ne-humane životinje).

[0174] Transgena osnivačka ne-humana životinja može se identifikovati na osnovu prisustva CD274 transgena u njenom genomu i/ili ekspresije mRNK PD-L1 u tkivima ili ćelijama nehumane životinje. Transgena osnivačka ne-humana životinja može se zatim koristiti za uzgajanje dodatnih ne-humanih životinja koje nose transgen CD274. Štaviše, transgene nehumane životinje koje nose transgen koji kodira humani PD-L1 polipeptid, u celini ili delimično, mogu dalјe da se uzgajaju sa drugim transgenim ne-humanim životinjama koje nose druge transgene (na primer, Pdcd1 ili CD80 transgen).

[0175] Transgene nehumane životinje mogu se takođe proizvesti da sadrže sisteme odabrane koji omogućavaju regulisanu ili usmerenu ekspresiju transgena. Primerni sistemi uklјučuju Cre/loxP rekombinazni sistem bakteriofaga P1 (vidi, npr. Lakso, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236) i FLP / Frt rekombinazni sistem S. cerevisiae (O’Gorman, S. et al, 1991, Science 251:1351-1355). Takve životinje se mogu dobiti konstrukcijom „dvostrukih“ transgenih životinja, na primer, parenjem dve transgene životinje, jedna koja sadrži transgen koji kodira odabrani polipeptid (npr. CD274 transgen), a druga koja sadrži transgen koji kodira rekombinazu (npr. Cre rekombinazu).

[0176] Glodari iz ovog pronalaska mogu se pripremiti kako je gore opisano, ili koristeći postupke poznate u tehnici, da sadrže dodatne humane ili humanizovane gene, često u

2

zavisnosti od namere upotrebe glodara. Može se uvesti genetski materijal takvih dodatnih humanih ili humanizovanih gena dalјim izmenama genoma ćelija (npr. embrionalnih matičnih ćelija) koje imaju genetske modifikacije kako je gore opisano ili tehnikama oplemenjivanja poznatim u tehnici sa drugim genetski modifikovanim sojevima po želјi. U nekim realizacijama, glodari iz ovog pronalaska su pripremlјeni da dalјe sadrže jedan ili više humanih ili humanizovanih gena izabranih iz porodice B7 liganda i/ili porodice CD28 receptora (npr. Pdcdl (PD-1), itd.). U nekim realizacijama, glodari iz ovog pronalaska mogu se pripremiti uvođenjem ciljajućeg vektora, kako je ovde opisano, u ćeliju iz modifikovanog soja. U nekim realizacijama, glodari ovog pronalaska su pripremlјeni da dalјe sadrže humani ili humanizovani gen Programirane ćelijske smrti 1 (Pdcdl). U nekim realizacijama, glodari ovog pronalaska sadrže humanizovani CD274 gen, kako je ovde opisan, i genetski materijal heterolognih vrsta (npr. ljudi), pri čemu genetski materijal kodira, u celini ili delimično, jedan ili više izabranih heterolognih polipeptida iz porodice B-7 liganda ili porodice CD28 receptora. U nekim određenim realizacijama, glodari predmetnog pronalaska sadrže humanizovani CD274 gen kako je ovde opisan i genetski materijal heterolognih vrsta (npr. ljudi), pri čemu genetski materijal delimično kodira heterologni (npr. humani) PD-1 polipeptid. U nekim određenim rešenjima, glodari ovog pronalaska dalјe sadrže Pdcdl gen koji sadrži endogeni deo i humani deo, pri čemu humani deo kodira vanćelijski domen humanog polipeptida PD-1, a endogeni deo kodira unutarćelijski domen endogeni PD-1 polipeptida; u nekim realizacijama, humani i endogeni delovi su operativno povezani sa endogenim Pdcdl promotorem; u nekim realizacijama, endogenim promotorom Pdcdl glodara.

[0177] Na primer, kao što je ovde opisano, ne-humane životinje koje sadrže humanizovani CD274 gen mogu dalјe sadržati (npr. strategijama ukrštanja ili višestrukog cilјanja gena) jednu ili više modifikacija kao što je opisano u SAD Patentnoj prijavi br. 14/744,592, podnetoj 19. juna 2015. godine. U određenim realizacijama, glodar koji sadrži humanizovani CD274 gen (tj. Ekson 3, 4 i 5’ deo eksona 5 humanog CD274 gena koji je operativno vezan za ekson 1, 2, 3’ deo eksona 5, 6 i 7 endogenog Cd274 gena glodara tako da humanizovani CD274 gen kodira PD-L1 polipeptid koji ima vanćelijski deo humanog PD-L1 polipeptida i unutarćelijski deo PD-L1 polipeptida glodara) je ukršten na glodara koji sadrži humanizovani Pdcdl gen (npr. ekson 2 i 5’ deo eksona 3 humanog PDCD1 gena koji je operativno vezan za ekson 1, 3’ deo eksona 3, 4 i 5 endogenog Pdcd1 gena glodara tako da humanizovani Pdcdl gen kodira PD-1 polipeptid koji ima vanćelijski deo od humanog PD-1 polipeptida i unutarćelijski deo PD-1 polipeptida glodara; vidi, npr. U.S. Patentna prijava No.14/744,592, podneta 19. juna 2015). U nekim realizacijama, humanizovani Pdcdl gen sadrži ne-humane (npr. glodarske) Pdcdl eksone 1, 4 i 5, humani Pdcdl ekson 2 i Pdcdl ekson 3, koji Pdcdl ekson 3 sadrži humani deo i deo koji nije humani, i pri čemu dati eksoni koji su humani i koji nisu humani su operativno povezani. U nekim realizacijama, humani deo Pdcdl ekson 3 uključuje nukleotide koji kodiraju PD-1 stabljičku sekvencu. U nekim realizacijama, humani deo Pdcdl ekson 3 uključuje oko 71 bp humanog Pdcdl eksona 3. U nekim realizacijama, deo koji nije humani Pdcdl eksoa 3 uključuje nukleotide koji kodiraju transmembransku sekvencu. U nekim realizacijama, deo koji nije humani Pdcdl ekson 3 uključuje oko 91 bp glodarskog Pdcdl eksona 3. U specifičnim realizacijama, humanizovani Pdcdl gen kodira humanizovani PD-1 polipeptid koji uklјučuje vanćelijski deo (npr. u osnovi čitav vanćelijski domen) iz humanog polipeptida PD-1, transmembranski deo (npr. u osnovi ceo transmembranski domen) i unutarćelijski deo (npr. u osnovi ceo unutarćelijski domen) PD-1 polipeptida glodara.

[0178] Genetski modifikovana životinja ovog pronalaska je glodar. U nekim realizacijama, glodar predmetnog pronalaska se bira između miša, pacova i hrčka. U nekim realizacijama, glodar predmetnog pronalaska je izabran iz nadporodice Muroidea. U nekim realizacijama, ovde opisana genetski modifikovana životinja iz predmetnog pronalaska potiče iz porodice izabrane iz Calomyscidae (npr. hrčaka sličnih miševima), Cricetidae (npr. hrčaka, pacova i miševa iz Novog sveta, voluharica), Muridae (pravi miševi i pacovi, gerbili, ježoliki miševi, grivasti pacovi), Nesomyidae (miševi penjači, kameni miševi, belorepi pacovi, Hypogeomys antimena), Platacanthomyidae (npr. Platacanthomys lasiurus), i Spalacidae (npr., krtice, Rhizomys sinensis i zokori). U nekim određenim realizacijama, genetski modifikovani glodari iz predmetnog pronalaska biraju se od pravog miša ili pacova (porodice Muridae), gerbila

2

(pustinjskog pacova), ježolikog miša i grivastog pacova. U nekim određenim realizacijama, genetski modifikovani miš iz predmetnog pronalaska potiče od člana porodice Muridae. Životinja ovog pronalaska je glodar. U nekim određenim rešenjima, glodar predmetnog pronalaska se bira između miša i pacova. U nekim realizacijama, glodar predmetnog pronalaska je miš.

[0179] U nekim realizacijama, ne-humana životinja iz predmetnog pronalaska je glodar koji je miš C57BL soja odabranog između C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, i C57BL/Ola. U nekim određenim realizacijama, miš iz predmetnog pronalaska je soj 129 izabran iz grupe koja se sastoji od soja koji je 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr.

129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (vidi npr. Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. et al., 2000, Biotechniques 29(5): 1024-1028, 1030, 1032). U nekim određenim realizacijama, genetski modifikovani miš iz predmetnog pronalaska je kombinacija gore pomenutog soja 129 i pomenutog soja C57BL/6. U nekim određenim realizacijama, miš iz predmetnog pronalaska je mešavina gore pomenutih 129 sojeva ili mešavina gore pomenutih sojeva BL/6. U nekim određenim realizacijama, soj 129 kombinacije kako je ovde opisano je soj 129S6 (129/SvEvTac). U nekim realizacijama, miš predmetnog pronalaska je soj BALB, na primer, soj BALB / c. U nekim realizacijama, miš predmetnog pronalaska je mešavina soja BALB i drugog gore pomenutog soja.

[0180] U nekim realizacijama, glodar predmetnog pronalaska je pacov. U nekim određenim realizacijama, pacov iz predmetnog pronalaska odabran je od pacova Wistar, soja LEA, soja Sprague Dawley, Fischerovog soja, L344, L6, i Dark Agouti. U nekim određenim realizacijama, soj pacova ovde opisan je kombinacija dva ili više sojeva odabranih iz grupe koja se sastoji od Wistar, LEA, Sprague Dawley, Lischer, F344, F6 i Dark Agouti.

Postupci primene ne-humanih životinja a koje imaju humanizovane CD274 gene

[0181] CD274 mutantne i transgene ne-humane životinje (npr. miševi) i ćelije su zabeležene (Iwai, Y. et al., 2002, Proc. Nat. Acad. Sci.99(19):12293-12297; Latchman, Y. E. et al., 2004, Proc. Nat. Acad. Sci. 101(29):10691-10696; Subudhi, S. K. et al., 2004, J. Clin. Invest.

113(5):694-700; Guleria, I. et al., 2005, J. Exp. Med.202(2):231-237; Keir, M.E. et al., 2006, J. Exp. Med.203(4):883-895; Tanaka, K. et al., 2007, J. Immunol.179:5204-5210; Wang, C. et al., 2008, Diabetes 57:1861-1869; Wen, X. et al., 2008, Transplant. 86(11):1596-1602; Plege, A. et al., 2009, Transpl.87(7):975-982; Cao, Y. et al., 2010, Cancer Res.71(4):1235-1243; Plege, A. et al., 2010, Eur. Soc. Organ Transplant. 23:1293-1300; Ritprajak, P. et al., 2010, J. Immunol. 184:4918-4925; Yantha, J. et al., 2010, Diabetes 59:2588-2596; Ding, Q. et al., 2011, J. Leukocyte Biol.90:77-86; Tang, L. et al., 2011, Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi 27(4):357-359; Ghazizadeh, S. et al. Mol. Ther., 2012, 20(1):196-203). Takve mutirane i transgene životinje bile su korisne u određivanju molekularnih aspekata ekspresije i funkcije PD-L1 i uloge puta PD-1: PD-L1 u regulisanju imunoloških odgovora, posebno odgovora T ćelija. Međutim, oni dolaze sa ograničenjima koja se delimično zasnivaju na demonstriranoj varijabilnosti dobijenih rezultata. Mnoge transgene PD-L1 životinje su koristile upotrebu transgena dizajniranih da prekomerno eksprimuju endogeni PD-L1 (vidi, na primer, Ghazizadeh et al., supra), dok su se druge fokusirale na povezivanje transgene ekspresije PD-L1 sa tkivno-specifičnim promotorima (vidi, npr. Ritprajak et al., supra). Neke od ovih životinja su pokazale ekspresijske obrasce transgenih PD-L1 koji ne koreliraju transkripcionim profilima divlјeg tipa (videti, na primer, Wang et al. i Yantha et al., supra). Dalje, zbog upotrebe istog izvornog genetskog materijala (tj. mišjeg PD-L1 transgena u mišu), prekomerna ekspresija PD-L1 možda je odgovarala endogenom PD-L1, a ne transgenskom PD-L1 zbog mogućih efekata transgena na poziciju. U nekim slučajevima su takve životinje pokazale ubrzani razvoj bolesti i, prema tome, izazivaju zabrinutost da je transgen možda stvorio ili modifikovao jedan ili više fenotipa, komplikujući tako analizu funkcije PD-L1. Ovi rezultati se opravdano mogu pripisati dizajnu konstrukta. U kontekstu humanog PD-L1, endotelne crevne ćelije svinja stvorene da stabilno eksprimuju humani PD-L1 vođen CMV-om, primenjene su u minijaturnom modelu transplantacije kože svinja i pružile su važan uvid u ektopičnu humanu ekspresiju PD-L1 u alograftskom modelu (Ding et al., supra). Postojeće PD-L1 transgene nehumane životinje pokazale su se korisnim u razjašnjavanju neke biološke funkcije PD-L1 i puta PD-1:PD-L1, međutim, kako je gore pokazano, trenutni in vivo sistemi koji koriste PD-L1 posredovanu biologiju su nepotpuni. Molekularni aspekti puta PD- 1 :PD-L1 i njegova uloga u regulaciji imunoloških odgovora u kontekstu raka i autoimunosti nisu u potpunosti iskorišćeni kod transgenih životinja (npr. miševa).

[0182] Glodari iz predmetnog pronalaska obezbeđuju poboljšani in vivo sistem i izvor bioloških materijala (npr. ćelija) koji eksprimuju humani (ili humanizovani) PD-L1 koji su korisni za razne testove. U različitim realizacijama, glodari iz ovog pronalaska se koriste za razvoj terapeutskih sredstava koja cilјaju PD-L1 i/ili moduliraju PD-1 : PD-L1 signalizaciju (npr. ometanjem interakcija sa PD-1) i/ili moduliraju interakcije PD-L1 sa drugim vezujućim partnerima (npr. B7-1). Takve životinje su posebno korisne jer su potpuno imunokompetentne za razliku od mnogih drugih životinjskih modela koji se koriste za in vivo studije; prema tome, analiza efekta terapija nije komplikovana ugroženim imunološkim statusom. U različitim realizacijama, glodari iz ovog pronalaska se koriste za identifikaciju, pregled i/ili razvoj terapeutskih sredstava (npr. antitela) koja vezuju humani PD-L1. U različitim realizacijama, glodari predmetnog pronalaska se koriste za pregled i razvoj terapeutskih sredstava (npr. antitela) koja blokiraju interakciju humanog PD-L1 sa humanim PD-1 i/ili humanim B7-1. U različitim realizacijama, glodari iz ovog pronalaska se koriste za određivanje profila vezivanja antagonista i/ili agonista humanizovanog PD-L1 polipeptida na površini ćelije glodara kako je ovde opisano; u nekim realizacijama, glodari iz ovog pronalaska se koriste za određivanje epitopa ili više epitopa jednog ili više kandidatnih terapijskih antitela koja vezuju humani PD-L1.

[0183] U različitim realizacijama, glodari iz ovog pronalaska se koriste za određivanje farmakokinetičkih profila anti-PD-Ll antitela. U različitim realizacijama, jedan ili više glodara iz predmetnog pronalaska i jedna ili više kontrolnih ili referentnih ne-humanih životinja su izložene jednom ili više potencijalnih terapijskih anti-PD-L1 antitela u različitim dozama (npr.

0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, ili 50 mg/kg ili više). Kandidatska terapijska antitela se mogu dozirati na bilo koji željeni način davanja, uključujući parenteralne i neparterteralne puteve primene. Parenteralni putevi uključuju, na primer, intravenske, intraarterijske, intraportalne, intramuskularne, supkutane, intraperitonealne, intraspinalne, intratekalne, intracerebro ventrikularne, intrakranijalne, intrapleuralne ili druge puteve ubrizgavanja. Neparenteralni putevi uključuju, npr., oralni, nazalni, transdermalni, plućni, rektalni, bukalni, vaginalni, okularni. Davanje može biti i kontinuiranom infuzijom, lokalnom administracijom, neprekidnim oslobađanjem iz implantata (gelovi, membrane ili slično) i/ili intravenskom injekcijom. Krv je izolovana iz ne-humanih životinja koje (humanizovane i kontrolisane) u različitim vremenskim tačkama (npr.0 h, 6 h, 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, ili do 30 ili više dana). Mogu se izvesti različiti testovi za određivanje farmakokinetičkih profila primenjenih kandidatskih terapijskih antitela korišćenjem uzoraka dobijenih od ne-humanih životinja kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na, ukupni IgG, antiterapeutski odgovor antitela, aglutinaciju, itd.

[0184] U različitim realizacijama, glodari iz ovog pronalaska se koriste za merenje terapijskog efekta blokiranja ili modulacije PD-L1 signalizacije (ili PD-1 : PD-L1 signalizacije, ili PD-L1 : B7-1 posredovanih interakcija) i efekta na ekspresija gena kao rezultat ćelijskih promena. U različitim realizacijama, glodar iz predmetnog pronalaska ili ćelije izolovane od njih izložene su kandidatskoj terapiji koja vezuje humanizovani PD-L1 polipeptid (ili humani deo PD-L1 polipeptida) na površinu ćelije glodara i posle nekog perioda analizirane su na efekte na procese zavisne od PD-L1, na primer, adheziju, apoptozu, proizvodnju citokina, upale, proliferaciju, samotoleranciju i virusnu infekcija (ili odgovore na).

[0185] Glodari iz predmetnog pronalaska eksprimuju humanizovane PD-L1 polipeptide, tako ćelije, ćelijske linije i ćelijske kulture mogu biti generisane da služe kao izvor humanizovanog PD-L1 za upotrebu u vezujućim i funkcionalnim testovima, npr. za ispitivanje vezivanja ili funkcija PD-L1 antagonista ili agonista, posebno gde je antagonist ili agonist specifičan za

1

humanu PD-L1 sekvencu ili epitop ili, alternativno, specifičan za humanu PD-L1 sekvencu iz ili epitop koji se povezuje sa PD- 1 i/ili B7-1. U različitim realizacijama, PD-L1 epitopi vezani za potencijalna terapijska antitela mogu se odrediti korišćenjem ćelija izolovanih iz glodara ovog pronalaska.

[0186] U različitim realizacijama, humanizovani PD-L1 polipeptid eksprimovan glodarom kao što je ovde opisan, može da sadrži varijantu sekvence amino-kiselina. Primerne varijante polipeptida humanog PD-L1 uključuju one navedene na SNP GeneView internet stranici NCBI-a i sumirane su u Tabeli 3. U različitim realizacijama, glodari ovog pronalaska eksprimuju humanizovanu varijantu PD-L1 polipeptida. U različitim realizacijama, varijanta je polimorfna na poziciji amino-kiseline povezane sa vezanjem liganda. U različitim realizacijama, glodari ovog pronalaska se koriste za određivanje efekta vezivanja liganda interakcijom sa polimorfnom polipeptidnom varijantom humanog PD-L1. U nekim određenim realizacijama, glodari ovog pronalaska eksprimuju humanu PD-L1 polipeptidnu varijantu koja se pojavlјuje u Tabeli 3.

2

[0187] Ćelije iz glodara iz predmetnog pronalaska mogu se izolovati i koristiti ad hoc, ili se mogu održavati u kulturi tokom mnogih generacija. U različitim realizacijama glodara, ćelije glodara iz ovog pronalaska su učinjene besmrtnim (npr. upotrebom virusa) i održavane u kulturi neograničeno (npr. u serijskim kulturama).

[0188] U različitim realizacijama, ćelije i/ili glodari predmetnog pronalaska se koriste u različitim režimima imunizacije za određivanje funkcija posredovanih PD-L1 u imunološkom odgovoru na antigen (npr. odgovora T ćelija). U nekim realizacijama, kandidati za terapiju koji vezuju ili blokiraju jednu ili više funkcija humanog (ili humanizovanog) PD-L1 su naznačeni kod glodara ovog pronalaska. Pogodna merenja uključuju različite ćelijske testove, testove proliferacije, analizu serumskog imunoglobulina (npr. titar antitela), analize citotoksičnosti, karakterizaciju interakcija ligand-receptor (npr. imunoprecipitacioni testovi) i karakterizaciju interakcija ligand-ligand. U nekim primerima, glodari, predmetnog pronalaska, koriste se za karakterizaciju funkcija posredovanih PD-L1 koje regulišu imuni odgovor na antigen. U nekim realizacijama, antigen je povezan sa autoimunom bolešću, poremećajem ili stanjem. U nekim realizacijama, antigen je povezan sa upalnom bolešću, poremećajem ili stanjem. U nekim primerima taj antigen je povezan sa neoplazmom. U nekim primerima, antigen je povezan sa zaraznim agensom (npr. bakterijom). U nekim realizacijama, antigen je testni antigen (npr. ovalbumin ili OVA). U nekim realizacijama, antigen je meta povezana sa bolešću ili stanjem od koga pati jedan ili više ljudskih pacijenata kojima je potrebno lečenje.

[0189] U različitim realizacijama, glodari iz predmetnog pronalaska se koriste u serumskom ispitivanju za određivanje titra proizvodnje autoantitela za testiranje farmako-toksikoloških aspekata kandidata za terapeutike koji ciljaju humani PDL1. U nekim primerima, proizvodnja autoantitela kod glodara ovog pronalaska proizilazi iz jedne ili više autoimunih bolesti, poremećaja ili stanja izazvanih kod glodara.

[0190] U različitim realizacijama, glodari iz predmetnog pronalaska se koriste za testiranje jednog ili više antigena za određivanje terapijskog potencijala jedinjenja ili bioloških agenasa za modulaciju regulacije imunog odgovora, zavisne od PD-L1, uključujući ali bez ograničenja na, specifične odgovore zavisne od T ćelija i B ćelija na određeni antigen.

[0191] U različitim primerima, ćelije i/ili glodari iz predmetnog pronalaska se koriste u testu preživljavanja i/ili proliferacije (npr. korišćenjem B ili T ćelija) za ispitivanje i razvoj kandidata za terapeutike koji moduliraju signalizaciju humanog PD-L1. Aktivacija ili gubitak PD-L1 igra važnu ulogu u regulaciji odgovora T ćelija, a regulacija samotolerancije pomoću PD-L1 može biti rezultat aktiviranja specifičnih epitopa vanćelijskog domena PD-L1, dakle, kandidatski PD-L1 modulatori (npr. antagonisti ili agonisti) mogu biti identifikovani, okarakterisani i razvijeni upotrebom ćelija glodara iz predmetnog pronalaska a koje su ovde opisane i/ili ovde opisanih glodara. U nekim realizacijama, ćelije i/ili glodari iz predmetnog pronalaska koriste se u testu preživljavanja ili smrti kako bi se odredio efekat na proliferaciju ili apoptozu određene ćelije(a) (npr. ćelija raka) u prisustvu i odsustvu PD-L1.

[0192] U različitim realizacijama, ćelije i/ili glodari iz predmetnog pronalaska koriste se u ksenotransplantaciji heteroloških (npr. humanih) ćelija ili tkiva za određivanje PD-L1 posredovanih funkcija u fiziološkom (npr. imunološkom) odgovoru na presađene ćelije ili tkiva čoveka. U nekim realizacijama, kandidati za terapiju koji vezuju ili blokiraju jednu ili više funkcija humanog PD-L1 su naznačeni kod glodara ovog pronalaska. Pogodna merenja uključuju različite ćelijske testove, testove proliferacije, analizu serumskog imunoglobulina (npr. titar antitela), analize citotoksičnosti i karakterizaciju interakcija ligand -receptor (imunoprecipitacijski testovi). U nekim primerima, glodari ovog pronalaska se koriste za karakterizaciju funkcija posredovanih PD-L1 koje regulišu imuni odgovor na antigen. U nekim realizacijama, antigen je povezan sa neoplazmom. U nekim realizacijama, antigen je povezan sa autoimunom bolešću, poremećajem ili stanjem. U nekim realizacijama, antigen je povezan sa upalnom bolešću, poremećajem ili stanjem. U nekim realizacijama, antigen je meta povezana sa bolešću ili stanjem od koga pati jedan ili više ljudskih pacijenata kojima je potrebno lečenje.

[0193] U različitim primerima, glodari iz predmetnog pronalaska koriste se u transplantacijskim ili usvajajućim eksperimentima prenosa kako bi se odredio terapeutski potencijal jedinjenja ili bioloških agenasa za modulaciju regulacije zavisne od PD-L1 novih limfocita i njihove imune funkcije. U različitim primerima, u glodare iz ovog pronalaska transplantirane su humane T ćelijama; u nekim primerima, nativne T ćelije; u nekim primerima aktivirane T ćelije.

[0194] U različitim primerima, ćelije glodara iz predmetnog pronalaska se koriste u T ćelijskim ispitivanjima da bi se odredio terapeutski potencijal jedinjenja ili bioloških agenasa da moduliraju PD-L1 zavisnu regulaciju odgovora i funkcije zavisne od T ćelije. Primeri testova T ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, ELISpot, bojenje unutarćelijskog citokina, ograničenja glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC), ispitivanja supresije virusa, ispitivanja citotoksičnosti, testovi proliferacije i regulatorni testovi supresije T ćelije.

[0195] U različitim primerima ćelije glodara ovog pronalaska se koriste u testovima transmigracije ćelija za pregled i razvoj terapeutskih kandidata koji moduliraju humani PD-L1. Ćelijska transmigracija uključuje migraciju ćelija preko endotela, a testovi transmigracije omogućavaju merenje interakcija i transmigraciju endotela leukocitima ili ćelijama tumora.

[0196] U različitim primerima, ćelije glodara iz predmetnog pronalaska koriste se za ispitivanje rasta tumorskih ćelija (ili proliferaciju) za određivanje terapijskog potencijala jedinjenja ili bioloških agenasa za modulaciju regulacije zavisne od PD-L1 i/ili apoptoze tumorskih ćelija.

[0197] U različitim primerima ćelije glodara ovog pronalaska koriste se u testovima za proizvodnju citokina za određivanje terapeutskog potencijala jedinjenja ili bioloških sredstava za modulaciju PD-L1 zavisne regulacije oslobađanja citokina iz T ćelija (npr. Interferon-γ, interleukin-10 ). U nekim primerima ćelije glodara ovog pronalaska se koriste za detekciju (i/ili merenje) oslobađanja unutarćelijskog citokina kao rezultata interakcije humanizovanog PD-L1 sa lekom usmerenim na humani PD-L1 ili PD-L1 vezujućeg partnera (npr. PD-1, B7-1 ili njihova rastvorlјiva verzija).

4

[0198] U različitim primerima, autoimuna bolest, poremećaj ili stanje se indukuje kod jedne ili više glodara iz predmetnog pronalaska da bi se dobio in vivo sistem za određivanje terapijskog potencijala jedinjenja ili bioloških agenasa za modulaciju regulacije zavisne od PD-L1 jedne ili više funkcija autoimune bolesti, poremećaja ili stanja. Primeri autoimunih bolesti, poremećaja ili stanja koja se mogu izazvati kod jedne ili više glodara iz predmetnog pronalaska uključuju dijabetes, eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis (npr. model za multiplu sklerozu), reumatoidni artritis i sistemski eritemski lupus.

[0199] Glodari ovog pronalaska obezbeđuju in vivo sistem za analizu i ispitivanje leka ili vakcine. U različitim realizacijama, lek kandidat može se isporučiti jednom ili više glodara ovog pronalaska, praćen nadgledanjem glodara kako bi se utvrdio jedan ili više imunoloških odgovora na lek, bezbednosni profil leka ili efekat na bolest ili stanje i/ili jedan ili više simptoma bolesti ili stanja. U nekim primerima, vakcina cilja virus poput npr. virusa humane imunodeficijencije ili virusa hepatitisa (npr. HCV). Primeri postupaka koji se koriste za određivanje profila sigurnosti uključuju merenja toksičnosti, optimalne koncentraciju doze, efikasnosti leka ili vakcine i moguće faktore rizika. Takvi lekovi ili vakcine mogu se poboljšati i/ili razviti u takvim ne-humanim životinjama.

[0200] Glodari iz ovog pronalaska obezbeđuju pobolјšanje in vivo sistema za razjašnjenje mehanizama interakcije humane ćelije sa ćelijom putem adoptivnog transfera. U različitim primerima, glodari predmetnog pronalaska mogu se implantacijom ksenografta tumora, nakon čega sledi druga implantacija limfocita koji infiltriraju tumor koji se mogu usaditi adoptivnim transferom da bi se utvrdila efikasnost u iskorenjivanju solidnih tumora ili drugih malignih tumora. Takvi eksperimenti se mogu izvoditi sa humanim ćelijama zbog ekskluzivnog prisustva humanog PD-L1 bez konkurencije sa endogenim PD-L1. Dalјe, terapije i farmaceutski proizvodi za upotrebu u ksenotransplantaciji mogu se pobolјšati i/ili razviti kod takvih glodara.

[0201] Glodari ovog pronalaska obezbeđuju in vivo sistem za procenu farmakokinetičkih svojstava leka koji cilјa na humani PD-L1. U različitim realizacijama, lek koji cilja humani PD-L1 može biti isporučen ili dat jednom ili više glodara ovog pronalaska, praćeno praćenjem ili obavljanjem jednog ili više ispitivanja na glodarima (ili ćelijama izolovanim od njih) za određivanje efekta leka na glodara. Farmakokinetička svojstva uključuju, ali nisu ograničena na, kako životinja prerađuje lek u različite metabolite (ili otkrivanje prisustva ili odsustva jednog ili više metabolita leka, uključujući, ali se ne ograničavajući na toksične metabolite), poluživot leka, nivo cirkulacije leka nakon davanja (npr. koncentracija leka u serumu), protivodgovor na lekove (npr. antitela protiv lekova), apsorpcija i distribucija leka, put primene, putevi izlučivanja i/ili pražnjenja leka. U nekim realizacijama, farmakokinetička i farmakodinamička svojstva lekova (npr. PD-L1 modulatori) se prate kod ili kroz upotrebu glodara iz ovog pronalaska.

[0202] Glodari ovog pronalaska obezbeđuju in vivo sistem za procenu toksičnosti leka koji cilјa humani PD-L1. U različitim realizacijama, lek koji cilja humani PD-L1 može se isporučiti ili dati jednom ili više glodara ovog pronalaska, praćeno ili nadgledanjem ili obavljanjem jednog ili više ispitivanja na glodarima (ili ćelijama izolovanim od njih) za određivanje vanciljnih toksičnih efekata leka na glodara. Obično su lekovi namenjeni da moduliraju jednu ili više funkcija svojih ciljeva. Dajući samo jedan primer, PD-L1 modulator namenjen je modulaciji funkcija posredovanih PD-L1 (npr. PD-L1 signalizacija i/ili interakcija PD-L1) kroz interakciju na neki način sa molekulom PD-L1 na površini jedne ili više ćelija i, u nekim realizacijama, blokirajući interakcije sa jednim ili više PD-L1 partnera za vezivanje. U nekim realizacijama, takav modulator može imati negativan efekat koji je preuveličavanje željenog farmakološkog(ih) delovanja modulatora. Takvi efekti se nazivaju efektima na cilju. Primeri efekata na cilju uključuju previsoku dozu, hroničnu aktivaciju / inaktivaciju i ispravno delovanje u pogrešnom tkivu. U nekim realizacijama, efekti na cilju leka koji ciljaju PD-L1 identifikovani u ili tokom upotrebe ne-humanih životinja iz predmetnog pronalaska koriste se za utvrđivanje prethodno nepoznate funkcije(a) PD-L1.

[0203] Glodari ovog pronalaska obezbeđuju in vivo sistem za procenu vanciljne toksičnosti leka koji cilјa humani PD-L1. U različitim realizacijama, lek koji cilja humani PD-L1 može se isporučiti ili dati jednom ili više glodara ovog pronalaska, praćeno ili nadgledanjem ili obavljanjem jednog ili više ispitivanja na glodarima (ili ćelijama izolovanim od njih) za određivanje vanciljnih toksičnih efekata leka na glodara. Vanciljni efekti mogu se pojaviti kada lek deluje u interakciji sa nenamernim ciljem (npr. unakrsna reaktivnost na uobičajeni epitop). Takve interakcije mogu se dogoditi u predviđenom ili nepredviđenom tkivu. Daćemo samo jedan primer, izomeri slike u ogledalu (enantiomeri) leka mogu dovesti do vanciljnih toksičnih efekata. Dalje, lek može neodovarajuće komunicirati sa i nenamerno aktivirati različite podtipove receptora. Primeri vanciljnih efekata uključuju netačno aktiviranje/inhibiciju netačnog cilja bez obzira na tkivo u kojem je pogrešan cilj pronađen. U nekim realizacijama, vanciljni efekti leka koji cilјa humani PD-L1 se određuju upoređivanjem efekata davanja leka glodarima iz ovog pronalaska sa jednim ili više referentnih glodara.

[0204] U nekim realizacijama, obavljanje testa uključuje određivanje efekta na fenotip i/ili genotip glodara, kojem se lek daje. U nekim realizacijama, obavljanje testa uključuje određivanje varijabilnosti serije do serije za PD-L1 modulator (npr. antagonist ili agonist) ili leka koji cilja PD-L1. U nekim realizacijama, obavljanje testa uključuje utvrđivanje razlike između efekata leka koji cilja PD-L1 koji se daje glodaru iz ovog pronalaska i referentne nehumane životinje. U različitim realizacijama, referentni glodari mogu imati modifikaciju kao što je ovde opisano, modifikaciju koja je drugačija nego što je ovde opisano (npr. imati izmenu, disrupciju, deleciju, inserciju, modifikaciju, itd. ili na drugi način nefunkcionalni CD274 gen) ili nemati modifikacije (tj. ne-humana životinja divljeg tipa).

[0205] Primeri parametara koji se mogu meriti kod glodara (ili u i/ili upotrebom ćelija izolovanih od njih) za procenu farmakokinetičkih svojstava, toksičnosti na cilju i/ili vanciljne toksičnosti leka koji cilja humani PD-L1 uključuju, ali nisu ograničeni na aglutinaciju, autofagiju, deljenje ćelija, ćelijsku smrt, hemolizu posredovanu komplementom, integritet DNK, titar antitela specifičnih za lekove, metabolizam leka, nizove ekspresije gena, metaboličku aktivnost, mitohondrijsku aktivnost, oksidativni stres, fagocitozu, biosintezu proteina, degradaciju proteina, izlučivanje proteina, reakciju na stres, koncentraciju lekova u ciljnom tkivu, koncentraciju lekova u neciljanom tkivu, transkripcionu aktivnost i slično. U različitim realizacijama, glodari iz ovog pronalaska se koriste za određivanje farmaceutski efikasne doze modulatora PD-L1 (npr. leka koji cilјa PD-L1).

[0206] Glodari iz ovog pronalaska obezbeđuju pobolјšanje in vivo sistema za razvoj i karakterizaciju kandidata za terapiju za upotrebu kod raka. U različitim realizacijama, glodarima predmetnog pronalaska može se implantirati tumor (ili ćelije tumora), nakon čega sledi primena jednog ili više kandidata za terapiju. U nekim realizacijama, kandidati za terapiju mogu da sadrže multi-specifično antitelo (npr. bi-specifično antitelo) ili koktel antitela; u nekim realizacijama, kandidati za terapiju uključuju kombinovanu terapiju kao što je, na primer, davanje dva ili više mono-specifičnih antitela doziranih sekvencijalno ili istovremeno. Tumor može da ima dovoljno vremena da se utvrdi na jednoj ili više lokacija unutar ne-humane životinje pre davanja jednog ili više kandidata za terapiju. Proliferacija, rast, preživljavanje ćelija tumora, itd., mogu se meriti pre i posle davanja kandidata za terapiju. Citoksičnost kandidata za terapiju takođe se može meriti u glodaru, po želji.

[0207] Glodari iz ovog pronalaska obezbeđuju pobolјšanje in vivo sistema za razvoj i karakterizaciju kandidata za terapiju za upotrebu u zaraznim bolestima. U različitim realizacijama, glodari iz predmetnog pronalaska mogu biti inficirani injekcijom sa virusom (npr. MHV, HIV, HCV, itd.) ili patogenom (npr. bakterijama), praćeno davanjem jednog ili više kandidata za terapiju. U nekim realizacijama, kandidati za terapiju mogu da sadrže multi specifično antitelo (npr. bi-specifično antitelo) ili koktel antitela; u nekim realizacijama, kandidati za terapiju uključuju kombinovanu terapiju kao što je, na primer, davanje monospecifičnih antitela doziranih sekvencijalno ili istovremeno; u nekim realizacijama, kandidati za terapiju mogu da sadrže vakcinu. Virusu ili patogenu može se omogućiti dovoljno vremena da se utvrdi na jednoj ili više lokacija ili ćelija unutar ne-humane životinje, tako da se kod nehumane životinje razvije jedan ili više simptoma povezanih sa infekcijom virusa ili patogena. Proliferacija i rast T ćelija može se meriti pre i posle primene kandidata za terapeutike. Dalje, preživljavanje, serumska i/ili intracelularna citokinska analiza, histopatologija jetre i/ili slezine mogu se meriti kod ne-humanih životinja koje su zaražene virusom ili patogenom. U nekim primerima, glodari ovog pronalaska se koriste za određivanje obima oštećenja organa povezanog sa virusnom infekcijom. U nekim primerima, glodari iz ovog pronalaska se koriste za određivanje profila ekspresije citokina i/ili profila ekspresije gena u različitim organima glodara zaraženih određenim virusom.

[0208] Glodari iz ovog pronalaska mogu se koristiti za procenu efikasnosti terapijskog leka koji cilјa na humane ćelije. U različitim realizacijama, u jednog ili više glodara iz ovog pronalaska transplantiraju se humane ćelije, a takvom glodaru se daje kandidat za lek koji cilјa takve humane ćelije. Terapeutska efikasnost leka se zatim određuje nadgledanjem humanih ćelija kod glodara nakon primene leka. Lekovi koji se mogu testirati na ne-humanim životinjama uključuju i jedinjenja malih molekula, tj. jedinjenja molekulske težine manjih od 1500 kD, 1200 kD, 1000 kD ili 800 daltona, i velika molekularna jedinjenja (kao što su proteini, npr. antitela), koja imaju namenjene terapeutske efekte za lečenje ljudskih bolesti i stanja targetiranjem (npr. vezivanjem i/ili dejstvom na) humane ćelije.

[0209] U nekim realizacijama, lek je lek protiv raka, a humane ćelije su ćelije raka, koje mogu biti ćelije primarnog raka ili ćelije ćelijskih linija uspostavljenih iz primarnog raka. U nekim realizacijama, glodaru iz ovog pronalaska se transplantiraju ćelije humanog raka, a glodaru se daje lek protiv raka. Efikasnost leka može se utvrditi procenom da li je rast ili metastaza ćelija raka čoveka kod glodara inhibiran kao posledica primene leka.

[0210] U specifičnim realizacijama, lek protiv raka je molekul antitela, koji vezuje antigen na humanim ćelijama raka. U određenim realizacijama, lek protiv raka je bi-specifično antitelo koje se vezuje za antigen na humanim ćelijama raka i za antigen na drugim humanim ćelijama, na primer, ćelijama humanog imunog sistema (ili „ljudske imune ćelije“) kao što su B ćelije i T ćelije.

PRIMERI

[0211] Sledeći primeri su dati kako bi se opisalo onima koji su prosečni stručnjaci kako da naprave i koriste postupke i kompozicije ovog pronalaska, ukoliko nije drugačije naznačeno, temperatura je izražena u Celzijusima, a pritisak je blizak atmosferskom ili jednak njemu.

Primer 1. Humanizacija endogenog klastera diferencijacije 274 (CD274) gena

[0212] Ovaj primer ilustruje ogledne postupke humanizacije endogenog CD274 gena koji kodira Programirani protein ćelijske smrti 1 (PD-L1) kod ne-humane životinje, poput glodara (npr. miša). Postupci opisani u ovom primeru mogu se koristiti za humanizaciju endogenog CD274 gena ne-humane životinje korišćenjem bilo koje humane sekvence ili kombinacije sekvenci (ili fragmenata sekvenci) po želji. U ovom primeru, fragment humane ∼8,444 bp DNK koji sadrži ekson 3, 4 i 5 (delom) humanog CD274gena koji se pojavljuje u GenBank pristupu NM_014143.3 (SEQ ID NO:11koristi se za humanizaciju mišjeg endogenog CD274 gena. Ciljajući vektor za humanizaciju genetskog materijala koji kodira vanćelijski domen koji uključuje N-terminalni IgV domen i domen IgC2-tipa, endogenog CD274 gena konstruisan je korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije (videti npr. US patent br.6,586,251 i Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech.21(6):652-659;

[0213] Ukratko, mišji bakterijski veštački hromosom (BAC), klon RP23-467A9 (Invitrogen) je modifikovan tako da se izbriše kodirajuća sekvenca eksona 3, 4 i 5 (delom) endogenog mišjeg Cd274 gena (-8942 bp) i insertuje eksone 3, 4 i 5 (delom) humanog CD274 gena koristeći fragment humane DNK od ∼8444 bp, koji kodira amino-kiseline 19-238 humanog PD-L1 polipeptida. Zadržana je endogena DNK koja sadrži ekson 1, ekson 2, ekson 6 i ekson 7, kao i neprevedene regije (UTR). Analiza redosleda fragmenta humane DNK od ∼8,444 bp potvrdila je sve humane CD274 eksone (tj., ekson 3, 4 i 5 delom) i splajsne signale. Analiza sekvenci otkrila je da sekvenca odgovara humanom CD274transkriptu NM014143.3. Prvo je fragment humane DNK od ∼8.444 bp pojačan u dva dela (slika 2, vrh). Deo od 5’ (∼4.494 bp) koji sadrži ekson 2 i deo introna 3 humanog CD274 je pojačan PCR-om koristeći 3’ prajmer koji je sadržao NheI restrikciono mesto i 5’ prajmer koji sadrži mišju homolognu kutiju radi olakšavanja bakterijske homologne rekombinacije.3 'deo ((∼3.950 bp) koji sadrži deo introna 3, ekson 4, intron 4 i deo eksona 5 (-32 bp) je pojačan PCR-om koristeći 5' prajmer koji je sadržao XhoI restrikciono mesto i 3’ prajmer koji sadrži mišju homolognu kutiju radi olakšavanja bakterijske homologne rekombinacije. PCR proizvodi su prečišćeni gelom i odvojeno svareni sa odgovarajućim restrikcionim endonukleazama. NheI-XhoI restrikciona mesta su korišćena za ligaciju fragmenata ∼4.494 bp i ∼3.950 bp DNK na 5’ i 3’ krajeve samobrišuće kasete neomicina od ∼4.996 bp (loxP-hUb1-em7-Neo-pA-mPrm1-Crei-loxP; videti US prijave patenata No’s.8,697,851, 8,518,392 i 8,354,389) u obrnutoj orijentaciji na fragmente DNK koji sadrže kodirajuću sekvencu humanog CD274 . Sledeća selekcija je koristila neomicin. Po dizajnu, spoj između dela humanog CD274 eksona 5 (tj. početnih 32 bp) i endogenog CD274 eksona 5 je sačuvao otvoreni okvir za čitanje u eksonu 5 (slika 2) i stvorio jedinstveni CD274 ekson 5 (AACTACCTCTGGCACATCCTCCAAATGAAA GGACTCACTG GGTGCTTCTG GGATCCATCC TGTTGTTCCT CATTGTAGTG TCCACGGTCC TCCTCTTCTT GAGAAAACAA G; SEQ ID NO:12). Dobijeni ciljajući vektor sadržavao je, od 5' do 3', 5' homologni krak koji sadrži ∼92.9 kb mišjeg genomskog DNK od BAC klona RP23-467A9, a ∼4,494 bp humanog DNK fragmenta koji sadrži ekson 3 i deo introna 3 humanog CD274 gena, a samobrišući ketridž neomicina okružen loxP mestima, a -3950 bp humani DNK fragment koji sadrži deo introna 3, ekson 4, intron 4 i prvi 32 bp eksona 5 humanog CD274 gena, i ∼67.6 kb mišjeg genomskog DNK iz BAC klona RP23-467A9.

[0214] Modifikovani klon RP23-467A9 opisan gore, korišćen je za elektroporaciju mišjih embrionalnih matičnih (ES) ćelija za stvaranje modifikovanih ES ćelija koje sadrže endogeni CD274 gen koji je humanizovan od eksona 3 do dela eksona 5 (tj. delecijom of ∼8,964 endogenog Cd274gena i insercijom ∼8,444 bp humane CD274 sekvence). Pozitivno ciljane ES ćelije koje sadrže humanizovani CD274 gen identifikovane su testom (Valenzuela et al., supra) koji je otkrio prisustvo humanih CD274sekvenci (npr. ekson 3, 4 i deo eksona 5) i potvrdio gubitak i/ili zadržavanje mišjih CD274 sekvenci (npr. eksona 3, 4 i dela eksona 5, i/ili eksona 1, 2, 6 i 7). Tabela 4 prikazuje četvrte primerne sekvence prajmera i sondi koji su korišćeni za potvrđivanje humanizacije endogenog mišjeg Cd274 gena kao što je opisano gore (Slika 3).

[0215] Nukleotidne sekvence preko različitih spojeva prikazane su na dijagramima na slici 2. Nukleotidna sekvenca preko gornje tačke insercije obuhvatala je sledeće, što ukazuje na endogenu mišju Cd274sekvencu (sadržanu u zagradama u daljem tekstu) koja se nastavlja na humanu CD274 sekvencu na donjoj tački insercije: (TAACCTTTTA CCCAGGTTTT CAGATGTGTT TGGAGGAGTT TTCTGTCTTC TGAGGGCTGG TCCTCTTTCCT TTTCAGCGTT TACT) GTCAGGTTCC CAAGGACCTA TATGTGGTAG AGTATGGTAG CAATATGACA ATTGAATGCA AATTCCCAGTAGAA (SEQ ID NO: 13).

[0216] Nukleotidna sekvenca na 5' kraju samobrišućeg neomicinskog ketridža obuhvatala je sledeće, što ukazuje na humanu CD274 sekvencu susednom sa sekvencom kasete (koja se nalazi u zagradama u daljem tekstu sa NheI mestom restrikcije u kurzivu i loxP sekvencom podebljanim slovima) nishodno od tačke insercije:

[0217] Nukleotidna sekvenca na 3' kraju samobrišućeg neomicinskog ketridža obuhvatala je sledeće, što ukazuje na sekvencu kasete (koja se nalazi u zagradama u daljem tekstu sa loxP sekvencom podebljanim slovima i Xhol mestom restrikcije u kurzivu) susedno humanoj CD274 sekvenci nishodno od tačke insercije:

[0218] Nukleotidna sekvenca na 3' kraju humane CD274sekvence obuhvatala je sledeće, što ukazuje na humanu CD274 sekvencu koja je susedna mišjoj CD274 sekvenci (sadržanoj u zagradama u daljem tekstu): TTTATCTTTA GTCAGTTTGT TTTCGTTTTGT TTTGTTTTTC

AGAACTACCT CTGGCACATC CTCCAAATGA AAGG (ACTCACTGGG TGCTTCTGGG

ATCCATCCTG TTGTTCCTCA TTGTAGTGTC CACGGTCCTC CTCTTCTTGA

GAAAACAAGG TATTTCCTCCATTG) (SEQ ID NO: 16).

[0219] Nukleotidna sekvenca preko tačke insercije posle delecije neomicinske kasete obuhvatala je sledeće, što ukazuje na humane genomske sekvence smeštene na juksta položaju sa preostalom sekvencom kasete loxP sekvence (koja se nalazi u zagradama u daljem tekstu sa NheI i XhoI restrikcijskim mestima u kurzivu i loxP sekvencom podebljanim slovima): TCCTAGCCG TTTTGTATTA ACTCTCTGTG AAGAAATTAC CTCACAAATCT

ATTGCTGTC (GCTAGCTCGCTACCTT AGGACCGTTA TAGTTACTAGCATAACTTCGT

ATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCGAG)CTTGGTAAAGGAATGGAGAA

TTAAGGCTCTAGATCATTAGTGGTTACACTATAGTATTAGAAGTAAAAAAAA GATTATACCAACAAAATAAGAA (SEQ ID NO:17).

[0220] Pozitivni kloni ES ćelija su zatim korišćeni za implantaciju ženki miševa metodom VELOCIMOUSE® (videti npr. U.S. Pat. No. 7,294,754 i Poueymirou et al., 2007, Nature Biotech. 25(1):91-99) da bi se generisalo leglo mladunaca koji sadrže inserciju humanog CD274 eksona 3, 4 i dela humanog CD274 eksona 5 u endogeni CD274gen miša. Miševi koji nose humanizaciju eksona 3, 4 i 5 delom (tj. fragment humane DNK od ∼8,444 bp) endogenog Cd274 gena ponovo su potvrđeni i identifikovani genotipizacijom DNK izolovane iz repnih resica korišćenjem test modifikacije alela (Valenzuela et ah, supra) koji je otkrio prisustvo humanih CD274 genskih sekvenci. Mladunci su genotipizirani, a kohorte životinja heterozigotnih za humanizovani konstrukt Pdcdl gena odabrane su za karakterizaciju. Miševi se takođe uzgajaju do homozignosti.

Primer 2. Ekspresija humanizovanog PD-L1 na aktiviranim T ćelijama

[0221] Ovaj primer demonstrira da ne-humane životinje (npr. glodare) modifikovane tako da sadrže humanizovani CD274 gen u skladu sa Primerom 1 eksprimuju humanizovani PD-L1 polipeptid na površini aktiviranih limfocita. U ovom primeru, aktivirane T ćelije miševa divljeg tipa i miševa čiji genom sadrži humanizovani CD274 gen, kao što je opisano u Primeru 1, obojene su komercijalnim anti-PD-L1 antitelima da bi se odredila ekspresija PD-L1 u stimulisanim i nestimulisanim T ćelijama.

[0222] Ukratko, slezine su sakupljene i obrađene od miša divljeg tipa i homozigotnog miša za endogeni CD274 gen, kako je opisano u Primeru 1, u suspenzije pojedinačnih ćelija mehaničkom disocijacijom. Ćelije su isprane u medijumu (RPMI dopunjen 10% FBS) i ponovo suspendovane na 1x10<6>/mL i 200 mL (200.000 ćelija) je posuto u pločice sa 96 ležišta. Ćelije u odabranim ležištima su stimulisane sa antitelima protiv CD3 i protiv CD28 (oba pri 1 mg/mL) tokom 72 sata. Ćelije su obojene za FACS prema specifikacijama proizvođača sa antitelima koja prepoznaju CD3, CD4, CD8 i humani (klon MIH1, BD Biosciences) ili mišji (klon 10F.9G2, eBioscience) PD-L1. Obojene ćelije su analizirane na LSRII protočnom citometru, a podaci su analizirani pomoću FLOWJO™ softvera. CD8<+>T (CD3<+>CD8<+>) i CD4<+>T (CD3<+>CD4<+>) ćelije su zatvorene i analzirane za ekspresiju humanog i mišjeg PD-L1. Primerne srednje vrednosti intenziteta fluorescencije date su u tabeli 5.

[0223] Kao što je prikazano na tabeli 5, miševi koji nose humanizovani CD274 gen, kako je opisano u primeru 1, eksprimuju PD-L1 polipeptid koji sadrži humani deo i endogeni deo aktiviranih T ćelija. Humani deo se detektabilno eksprimuje prepoznavanjem antitela koje je reaktivno na potpuno humani PD-L1 polipeptid, a antitelo ne prepoznaje mišji PD-L1 polipeptid kod miševa divlјeg tipa. Suprotno tome, klon antitela PD-L1 antitela 10F.9G2 pokazao je visok nivo bojenja mišjeg PD-L1 kod miševa divlјeg tipa nakon stimulacije anti-CD3 / anti-CD28 i marginalni nivo bojenja kod miševa humanizovanog PD -L1. Ovo je najverovatnije zbog delimične unakrsne reaktivnosti na humani PD-L1.

Primer 3. In vivoefikasnost PD-L1 modulatora

[0224] Ovaj primer pokazuje da ne-humane životinje (npr. glodari) modifikovane tako da sadrže humanizovani CD274 gen u skladu sa primerom 1 mogu da se koriste u ispitivanju in vivo za skrining PD-L1 modulatora (npr. anti-PD-L1 antitela) i određivanje različitih karakteristika kao što su, na primer, smanjivanje rasta tumora i/ili ubijanje ćelija tumora. U ovom primeru, prikazano je nekoliko anti-PD-L1 antitela kod miševa homozigotnih za humanizaciju endogenog CD274 gena (kako je opisano u Primeru 1) supktuano injektiranog sa MC38.ova tumorskim ćelijama da bi se odredila optimalna doza antitela koja inhibira rast tumora i stepen do koga anti-PD-L1 antitela posreduju ubijanje ćelija tumora.

[0225] Ukratko, miševi su podelјeni ravnomerno prema telesnoj težini u pet tretmanskih ili kontrolnih grupa za Studiju 1 (n = 5 do 8 miševa po grupi) ili randomizovani u sedam

4

tretmanskih grupa za Studiju 2 (n = 5 do 6 miševa). Životinje iz studije 1 su anestezirane inhalacijom izoflurana, a zatim su im u desni bok supkutano ubrizgane ćelije 1x10<6>MC38.ova u suspenziji od 100 mL DMEM (dan 0). MC38.Ova (mišji adenokarcinom debelog creva) ćelije projektovane su da eksprimuju pileći ovalbumin kako bi se povećala imunogenost tumora i omogućilo praćenje imunoloških odgovora T-ćelija na dobro definisane antigene peptide ovalbumina. MC38.ova ćelije su, takođe, transdukovane lentivirusnim vektorom koji eksprimuje humani PD-L1 pune dužine pod kontrolom SFFV virusnog promotora, i sortirane za pozitivnu ekspresiju humanog PD-L1 (MC38.ova / hPD-L1) protočnom citometrijom koristeći antitelo specifično za humani PD-L1 (klon MIH1, BD Biosciences). MC38.ova ćelije, takođe, eksprimuju nizak nivo endogenog mišjeg PD-L1. Tretiranim grupama u studiji 1 intraperitonealno je ubrizgano 500 mg ili jednog od tri antitela na PD-L1, ili jednog od dva antitela za kontrolu izotipa, koja nisu specifična za PD-L1, dana 3, 7, 10, 14 i 17. Jedna grupa životinja je ostala netretirana. Životinjama iz studije 2 takođe su supkutano ugrađene 1x10<6>MC38.Ova/hPD-L1ćelije (dan 0), međutim, tretmanskoj grupi u studiji 2 je intraperitonealno davano anti-PD-L1 antitelo (Ab A, Ab B ili Ab C) ili kontrolna antitela (tj. nisu specifična za PD-L1) u dozama od 10 mg/kg ili 5 mg/kg. Tretmanskim grupama davana su antitela 3, 7, 10, 14. i 17. dana. Eksperimentalno doziranje i protokol lečenja za svaku studiju dati su u tabeli 6.

[0226] Za svaku studiju, zapremine tumora praćene su merenјem kaliperom dva puta nedelјno tokom trajanja eksperimenta (17 dana za studiju 1, 21 dan za studiju 2) i procenat preživlјavanja zabeležen je na kraju svake studije. Broj miševa bez tumora takođe se bodovao na kraju svake studije. Primerni rezultati, izraženi kao srednja zapremina tumora (mm<3>±SD), procenat preživlјavanja i broj miševa bez tumora dati su u tabelama 7 i 8. Primeri kriva rasta tumora dati su na slici 4.

[0227] Za Studiju 1, sva tri anti-PD-L1 antitela bila su efikasna u promovisanju regresije tumora pri 500 mg/mišu i svi miševi iz tretiranih grupa koje su primile Ab B i Ab C bili su bez tumora na dan 17 (Tabela 7). U tretmanskoj grupi Ab A, četiri od pet miševa (80%) nisu imali tumor do 17. dana, dok nijedna životinja u kontrolnim grupama nije bila bez tumora. Jednosmerna ANOVA sa Dunetovim post-testom višestrukog upoređivanja otkrila je značajnu razliku u veličini tumora između tretmana anti-PD-L1 antitelima i tretmana kontrolnim antitelima sa p vrednošću <0,05. Kontrola 2 je nepovezano podudarno izotipsko kontrolno antitelo, dok je kontrola 1 nepovezano nepodudarno izotipsko kontrolno antitelo.

[0228] Za Studiju 2, primena izabranih antitela na PD-L1 rezultirala je inhibicijom rasta tumora i time promovisala regresiju tumora (Tabela 8). Sva testirana antitela na PD-L1 bila su efikasna pri 10 mg/kg i 5 mg/kg i promovisala su regresiju tumora kod tretiranih miševa na način koji je zavisio od doze tokom eksperimenta. Nijedna životinja lečena kontrolnim antitelima nije bila bez tumora (Tabela 8). Jednosmerna ANOVA sa Tukeovim post-testom višestrukog upoređivanja otkrila je značajnu razliku u veličini tumora između tretmana anti-PD-L1 antitelima i tretmana kontrolnim antitelima sa p vrednošću <0,05 ili nižom. Kontrola 1 je nepovezana podudarna izotipska kontrola.

[0229] Kao što je prikazano na slici 4 i tabelama 7 i 8, anti-PD-L1 antitela značajno inhibiraju rast tumora u profilaktičkom modelu rasta tumora MC38.ova/hPD-L1 u kod miševa koji imaju humanizovani CD274 gen kao što je opisan u primeru 1. Anti-PD-L1 terapija antitelima sa 10 mg/kg i 5 mg/kg promovisala je regresiju tumora kod svih miševa tokom eksperimenta, što je rezultiralo da tri od šest miševa ostanu bez tumora u grupi od 10 mg/kg, a dva od pet miševa bez tumora u terapijskoj grupi od 5 mg/kg do 21. dana, dok nijedna životinja nije ostala bez tumora u kontrolnoj grupi (0/6) (slika 4). Jednosmerna ANOVA sa Dunetovim post-testom višestrukog upoređivanja otkrila je značajnu razliku u veličini tumora 21. dana između tretmana anti-PD-L1 i kontrolnim antitelima sa p vrednošću < 0,01 (5 mg/kg tretirana grupa) i p vrednost <0,0001 (10 mg/kg tretirana grupa).

[0230] U sličnom eksperimentu, netaknuta funkcionalna PD-L1 signalizacija kod miševa sa sadržajem humanizovanog CD274 gena, kao što je opisano u Primeru 1 ispitivana je merenjem CD8<+>i CD3<+>T ćelijskih odgovora u slezini miševa koji nose tumor a koji su tretirani anti- PD-L1 antitelom.

[0231] Ukratko, splenociti su izolovani od miševa koji su sadržali humanizovani CD274 gen kao što je opisano u Primeru 1, tretirani anti-PD-L1 ili kontrolnim antitelom na kraju eksperimenta 21. dana (gore opisano). Ukupna RNK je izolovana, a PCR u realnom vremenu je izvedena na reverzno transkribovanoj cDNK koristeći oligonukleotide i TAQMAN™ mešavinu sondi specifičnu za mišji CD8b, mišji CD3ζ (Mm00446171_ml, Applied Biosystems), humani PD-L1 i mišji PD-L1 (tabela 9). Uzorci su normalizovani u odnosu na ekspresiju mišjeg ciklofilina B. Primerni rezultati prikazani su na slici 5.

TABELA 9

[0232] Kao što je prikazano na slici 5, davanje anti-hPD-Ll antitela indukovalo je povećanje broja CD8<+>i CD3<+>T ćelija u splenocitima miševa koji sadrže humanizovani CD274 gen (kao

4

što je opisano u Primeru 1) i nose MC38.ova / hPD-L1 tumore. Ovo potvrđuje da miševi koji sadrže humanizovani CD274 gen (kao što je opisano u primeru 1) pokazuju pravilnu ekspresiju i signaliziranje putem humanizovanog PD-L1 na površini ćelije i da ekspresija PD-L1 od strane MC38.ova ćelija nije u stanju da suzbije proliferaciju anti- tumorskih CD8<+>T ćelija. Sve u svemu, zabeležen je porast T ćelija u poređenju sa kontrolno tretiranim miševima za obe grupe lečenja, međutim, statistička razlika u nivoima CD8b (p vrednost <0,01) i CD3 (p <0,001) korišćenjem jednosmernog ANOVA sa Dunnett višestrukim poređenjem posle testa je postignuta samo između 10 mg/kg anti-PD-Ll antitela i kontrolnih grupa za lečenje.

[0233] Ekspresija mRNK humane PD-L1 merena je humanim specifičnim sondama dizajniranim za vanćelijski deo PD-L1 polipeptida (tabela 9) i potvrdila je ispravnu ekspresiju humanizovanog PD-L1 proteina na ćelijskoj površini (slika 5). Pored toga, merenje ekspresije mRNK mišjeg PD-L1 sa prajmerima dizajniranim da otkriju vanćelijski deo mišjeg PD-L1 (tabela 9) nije uspelo da proizvede proizvod. Ovi podaci potvrđuju rezultate protočne citometrije predstavlјene u tabeli 5, tj. humanizovani PD-L1 miševi zaista eksprimuju humanizovani PD-L1 koji je netaknut i funkcionalan na ćelijskoj površini.

[0234] Uzeto zajedno, ovaj primer pokazuje da se ne-humane životinje iz predmetnog pronalaska mogu koristiti za procenu efikasnosti lekova in vivo (npr. antitela) koji ciljaju PD-L1, a takve životinje su korisne u razlikovanju terapeutskih efekata anti-PD-L1 antitela. Pored toga, ne-humane životinje ovde opisane mogu se koristiti za procenu u kojoj meri lekovi koji ciljaju PD-L1 mogu da pospešuju rast tumora i/ili posreduju u ubijanju ćelija tumora. Nehumane životinje (npr. miševi) ovog pronalaska pokazuju ekspresiju funkcionalnog humanizovanog PD-L1 polipeptida na površini ćelije i pravilnu PD-L1 regulaciju imunoloških odgovora inhibicijom PD-L1 zavisne supresije CD8<+>T ćelija u modelu tumora.

EKVIVALENTI

[0235] Opisavši tako nekoliko aspekata najmanje jedne realizacije ovog pronalaska, stručnjaci u tehnici će ceniti da će stručnjaci u ovoj oblasti lako doći do različitih promena, modifikacija i pobolјšanja. Shodno tome, prethodni opis i crtež su samo kao primer i pronalazak je detalјno opisan patentnim zahtevima koji slede.

[0236] Upotreba rednih izraza kao što su „prvi“, „drugi“, „treći“, itd. u zahtevima za modifikovanje elementa zahteva sama po sebi ne označava nikakav prioritet, presedan ili redosled jednog elementa zahteva nad drugim ili vremenski redosled kojim se izvode postupci neke metode, ali se koriste samo kao oznake za razlikovanje jednog elementa zahteva koji ima određeno ime od drugog elementa istog imena (ali za upotrebu rednog izraza) za razlikovanje elemenata zahteva.

[0237] Članovi „a“ i „an“ (u engleskom jeziku), kako su ovde upotreblјeni u specifikaciji i u zahtevima, ukoliko nije jasno naznačeno suprotno, trebalo bi razumeti da uklјučuju množinske reference. Tvrdnje ili opisi koji uklјučuju „ili“ između jednog ili više članova grupe smatraju se zadovolјenim ako je jedan, više njih ili su svi članovi grupe prisutni, uključeni ili su na neki drugi način relevantni za dati proizvod ili postupak, osim ako nije naznačeno suprotno ili na drugi način evidentno iz konteksta. Pronalazak uklјučuje realizacije u kojima je tačno jedan član grupe prisutan, uključen ili je na neki drugi način relevantan za dati proizvod ili postupak. Pronalazak, takođe, uklјučuje realizacije u kojima je više od jednog ili su svi članovi grupe prisutni, uključeni ili su na neki drugi način relevantni za dati proizvod ili postupak. Dalјe, treba razumeti da pronalazak obuhvata sve varijacije, kombinacije i permutacije u kojima se jedno ili više ograničenja, elemenata, klauzula, opisnih termina, itd., iz jednog ili više navedenih zahteva, uvodi u drugi zahtev zavistan od istog osnovnog zahteva (ili, prema potrebi, bilo koji drugi zahtev), ukoliko nije drugačije naznačeno ili ukoliko stručnjaku u ovoj oblasti ne bi bilo očigledno da bi moglo doći do kontradikcije ili nedoslednosti. Tamo gde su elementi predstavlјeni kao liste (npr. u Markush grupi ili sličnom formatu), podrazumeva se da je obelodanjena i svaka podgrupa elemenata i bilo koji element(i) mogu biti uklonjeni iz grupe. Treba razumeti da se, generalno, tamo gde se pronalazak ili aspekti pronalaska odnose na određene elemente, karakteristike itd., određene realizacije pronalaska ili aspekti pronalaska sastoje se, ili se u osnovi sastoje od, takvih elemenata, karakteristika, itd. Radi jednostavnosti, ove realizacije nisu u svakom slučaju posebno navedene u toliko reči ovde. Takođe, treba razumeti da se bilo koja realizacija ili aspekt pronalaska može izričito izuzeti iz zahteva, bez obzira na to da li je određeno izuzeće navedeno u specifikaciji.

[0238] Stručnjaci u tehnici će ceniti uobičajene standarde odstupanja ili greške koji se pripisuju vrednostima dobijenim u testovima ili drugim ovde opisanim procesima.

4

�

�

4

4

1

2

�

�

�

�

1

�

�

1

2

Claims (15)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Genetski modifikovani glodar čiji genom sadrži humanizovani klaster diferencijacije 274 (CD274) gena koji kodira humanizovani polipeptid liganda programirane smrti 1 (PD-L1) na endogenom CD274 lokusu, naznačen time što dati humanizovani CD274 gen sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijsku sekvencu humanog polipeptida PD-L1, operativno povezanu sa

(i) sekvencom nukleinske kiseline koja kodira unutarćelijsku sekvencu i transmembransku sekvencu endogenog PD-L1 polipeptida glodara i

(ii) endogenim promotorom CD274 glodara;

i pri čemu dati glodar eksprimuje humanizovani PD-L1 polipeptid na površini ćelije datog glodara.

2. Genetski modifikovani glodar prema zahtevu 1, naznačen time što sekvenca nukleinske kiseline koja kodira unutarćelijsku sekvencu i transmembransku sekvencu endogenog polipeptida PD-L1 glodara sadrži ekson 6, ekson 7 i deo eksona 5 endogenog CD274 gena glodara i opciono time što humanizovani gen CD274 dalјe sadrži ekson 1 i ekson 2 endogenog CD274 gena glodara.

3. Genetski modifikovani glodar u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačen time što sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijsku sekvencu humanog PD-L1 polipeptida sadrži ekson 3, ekson 4 i deo eksona 5 humanog CD274 gena.

4. Izolovana ćelija ili tkivo glodara čiji genom sadrži humanizovani CD274 gen koji kodira humanizovani PD-L1 polipeptid na endogenom CD274 lokusu, naznačen time što dati humanizovani CD274 gen sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijsku sekvencu humanog PD-L1 polipeptida, operativno povezanog sa

(i) sekvencom nukleinske kiseline koja kodira unutarćelijsku sekvencu i transmembransku sekvencu endogenog PD-L1 polipeptida glodara i

(ii) endogenim promotorom CD274 glodara; i

pri čemu izolovana ćelija ili tkivo glodara eksprimuje humanizovani PD-L1 polipeptid na površini date ćelije ili na površini ćelije datog tkiva.

5. Izolovana matična ćelija embriona glodara (ES) čiji genom sadrži humanizovani CD274 gen koji kodira humanizovani PD-L1 polipeptid na endogenom CD274 lokusu, pri čemu pomenuti humanizovani CD274 gen sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijsku sekvencu humanog PD-L1 polipeptida, operativno povezanu sa

(i) sekvencom nukleinske kiseline koja kodira unutarćelijsku sekvencu i transmembransku sekvencu endogenog PD-L1 polipeptida glodara i

(ii) endogenim promotorom CD274 glodara.

6. Embrion glodara generisan iz embrionalne matične ćelije prema patentnom zahtevu 5, gde dati embrion sadrži humanizovani CD274 gen na svom endogenom CD274 lokusu.

7. Postupak izrade genetski modifikovanog glodara, koji obuhvata

(a) umetanje sekvence nukleinske kiseline koja kodira vanćelijsku sekvencu humanog PD-L1 polipeptida u endogeni CD274 gen glodara u izolovanoj ES ćeliji glodara; i (b) pravlјenje glodara pomoću ES ćelije glodara iz (a), pri čemu genom glodara sadrži humanizovani CD274 gen koji kodira humanizovani PD-L1 polipeptid na endogenom

4

CD274 lokusu glodara, pri čemu dati humanizovani CD274 gen sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijsku sekvencu humanog PD-L1 polipeptida, operativno povezanu sa

(i) sekvencom nukleinske kiseline koja kodira unutarćelijsku sekvencu i transmembransku sekvencu endogenog PD-L1 polipeptida glodara i (ii) endogenim promotorom CD274 glodara; i

pri čemu glodar eksprimuje humanizovani PD-L1 polipeptid na površini ćelije datog glodara.

8. Postupak izrade genetski modifikovanog glodara čiji genom sadrži humanizovani CD274 gen koji kodira humanizovani PD-L1 polipeptid, postupak obuhvata

modifikovanje genoma glodara tako da modifikovani genom sadrži humanizovani CD274 gen na endogenom CD274 lokusu, pri čemu navedeni humanizovani CD274 gen sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijsku sekvencu humanog PD-L1 polipeptida, operativno povezanu sa

(i) sekvencom nukleinske kiseline koja kodira unutarćelijsku sekvencu i transmembransku sekvencu endogenog PD-L1 polipeptida glodara i

(ii) endogenim promotorom CD274 glodara; i

pri čemu glodar eksprimuje humanizovani polipeptid PD-L1 na površini ćelije datog glodara.

9. Postupak prema zahtevu 7 ili 8, naznačen time što sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijsku sekvencu humanog PD-L1 polipeptida sadrži ekson 3, ekson 4 i deo eksona 5 humanog CD274 gena.

10. Postupak prema zahtevu 7 ili 8, naznačen time, što sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijsku sekvencu humanog PD-L1 polipeptida kodira amino-kiseline 19-238 humanog PD-L1 polipeptida.

11. Postupak prema zahtevu 7 ili 8, naznačen time što sekvenca nukleinske kiseline koja kodira unutarćelijsku sekvencu i transmembransku sekvencu endogenog PD-L1 polipeptida glodara sadrži ekson 6, ekson 7 i deo eksona 5 endogenog CD274 gena glodara i opciono time što humanizovani gen CD274 dalјe sadrži ekson 1 i ekson 2 endogenog CD274 gena glodara.

12. Postupak skrininga za lek koji je u stanju da leči tumor, a postupak sadrži korake

(a) davanja tumorskih ćelija glodaru prema zahtevu 1, naznačen time što je glodar homozigot za humanizovanim CD274 genom, tako da se u glodaru formira tumor, (b) davanja leka glodaru iz koraka (a); i

(c) određivanja da li je rast tumora smanjen kod glodara iz koraka (b), pri čemu je lek koji smanjuje rast tumora sposoban za lečenje tumora.

13. Postupak prema zahtevu 12, naznačen time što je lek antitelo usmereno protiv humanog PD-L1 polipeptida.

14. Postupak prema zahtevu 12 ili 13, naznačen time što se lek glodaru daje intravenozno, intraperitonealno, intramuskularno ili supkutano.

15. Genetski modifikovani glodar prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, izolovana ćelija glodara ili tkivo prema patentnom zahtevu 4, izolovana matična ćelija embriona glodara prema patentnom zahtevu 5, embrion glodara prema patentnom zahtevu 6 ili postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 14, pri čemu je glodar miš ili pacov.