ES2629337T3 - Anticuerpos contra PD-1 y anticuerpos contra PD-L1 y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo contra PD-L1 que se puede obtener del hibridoma accesible con el número de depósito CNCM I- 4080 o I-4081.

Description

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También se describe un método de producción de una célula hospedadora recombinante que expresa un anticuerpo de acuerdo con la invención, comprendiendo dicho método las etapas de: (i) introducir in vitro o ex vivo un ácido nucleico recombinante o un vector como se describe anteriormente competente, (ii) cultivar in vitro o ex vivo la célula hospedadora recombinante obtenida y (iii) opcionalmente, seleccionar las células que expresan y/o secretan dicho anticuerpo. Dichas células hospedadoras recombinantes pueden usarse para la producción de anticuerpos de la invención.

Métodos de producción de anticuerpos de la invención

Los anticuerpos de la invención pueden producirse por cualquier técnica conocida en la técnica, tal como, sin limitación, cualquier técnica química, biológica, genética o enzimática, en solitario o en combinación.

Conociendo la secuencia de aminoácidos de la secuencia deseada, un experto en la materia puede producir fácilmente dichos anticuerpos, por técnicas convencionales para la producción de polipéptidos. Por ejemplo, pueden sintetizarse usando el método bien conocido en fase sólida, preferiblemente usando un aparato disponible en el mercado de síntesis de péptidos (tal como el fabricado por Applied Biosystems, Foster City, California) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Como alternativa, los anticuerpos de la invención pueden sintetizarse por técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden obtenerse como productos de expresión de ADN después de la incorporación de secuencias de ADN que codifican los anticuerpos en vectores de expresión y la introducción de dichos vectores en hospedadores eucariotas o procariotas adecuados que expresarán los anticuerpos deseados, a partir de los cuales pueden aislarse posteriormente usando técnicas bien conocidas.

En particular, la invención se refiere adicionalmente a un método de producción de un anticuerpo de la invención, comprendiendo dicho método las etapas que consisten en: (i) cultivar una célula hospedadora transformada de acuerdo con la invención en condiciones adecuadas para permitir la expresión de dicho anticuerpo; y (ii) recuperar el anticuerpo expresado.

En otra realización particular, el método comprende las etapas de:

(i)

cultivar el hibridoma depositado como CNCM 1-4080 o CNCM 1-4081 en condiciones adecuadas para permitir la expresión del anticuerpo; y

(ii)

recuperar el anticuerpo expresado.

Los anticuerpos de la invención se separan adecuadamente del medio de cultivo por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía en hidroxil apatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

En un aspecto particular, un anticuerpo quimérico humano puede producirse obteniendo secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios VL y VH como se describe previamente, construyendo un vector de expresión de anticuerpo quimérico humano insertándolos en un vector de expresión para una célula animal que tiene células que codifican CH de anticuerpo humano y CL de anticuerpo humano, y expresando la secuencia codificante introduciendo el vector de expresión en una célula animal.

En cuanto al dominio CH de un anticuerpo quimérico humano, puede ser cualquier región que pertenezca a una inmunoglobulina humana, pero aquellas de la clase IgG son adecuadas y una cualquiera de las subclases que pertenezcan a la clase IgG, tal como IgG1, lgG2, lgG3 e lgG4, también puede usarse. Además, en cuanto a la CL de un anticuerpo quimérico humano, puede ser cualquier región que pertenezca a Ig, y pueden usarse aquellas de la clase kappa o clase lambda.

Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican técnicas convencionales de ADN recombinante y transfección génica que son bien conocidos en la técnica (véanse los documentos de patente US5.202.238; y US5.204.244).

Un anticuerpo humanizado puede producirse obteniendo secuencias de ácido nucleico que codifican dominios CDR, como se describe previamente, construyendo un vector de expresión de anticuerpo humanizado insertándolos en un vector de expresión para una célula animal que tiene genes que codifican (i) una región constante de cadena pesada idéntica a la de un anticuerpo humano y (ii) una región constante de cadena ligera idéntica a la de un anticuerpo humano, y expresando los genes introduciendo el vector de expresión en una célula animal.

El vector de expresión del anticuerpo humanizado puede ser de un tipo en que un gen que codifica una cadena pesada de anticuerpo y un gen que codifica una cadena ligera de anticuerpo existen en vectores diferentes o de un tipo en que ambos genes existen en el mismo vector (de tipo tándem). Respecto a la facilidad de construcción de un vector de expresión de anticuerpo humanizado, la facilidad de introducción en células animales y el equilibrio entre los niveles de expresión de las cadenas H y L del anticuerpo en células animales, el vector de expresión de anticuerpo humanizado del tipo tándem es preferido. Ejemplos de vector de expresión de anticuerpo humanizado de

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Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación con capacidad de inyectarse. Estos pueden ser, en particular, soluciones isotónicas, estériles, salinas (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de dichas sales) o composiciones secas, especialmente liofilizadas que tras la adicción, dependiendo del caso, de agua esterilizada o de solución salina fisiológica, permiten la constitución de soluciones inyectables.

Las dosis usadas para la administración pueden adaptarse como una función de diversos parámetros y, en particular, como una función del modo de administración usado, de la patológica relevante o, como alternativa, de la duración deseada del tratamiento.

Para preparar composiciones farmacéuticas, puede disolverse o dispersarse una cantidad eficaz del anticuerpo en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones o de dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida que exista una facilidad de inyección. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y de almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de los microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Un anticuerpo de la invención puede formularse en una composición en una forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido sódico, potásico, de amonio, de calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

El vehículo también puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede conseguirse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azucares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse por el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los componentes activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con otros diversos ingredientes enumerados anteriormente, según lo necesario, seguido por esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y secado por congelación que producen un polvo del ingrediente más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada a esterilidad previamente del mismo.

También se contempla la preparación de soluciones más concentradas o altamente concentradas para inyección directa, donde se prevé el uso de DMSO como disolvente para producir una penetración extremadamente rápida, suministrando altas concentraciones de los agentes activos a un área de tumor pequeña.

Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una diversidad de formas de dosificación, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también pueden emplearse cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse adecuadamente si fuera necesario y el diluyente líquido primero tiene que volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles que pueden emplearse

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serán conocidos para los expertos en la materia a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosificación podría disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión (véase, por ejemplo, "Remington’s Pharmaceutical Sciences" 15ª edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente se producirá alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual.

Los anticuerpos de la invención pueden formularse en una mezcla terapéutica para que comprenda aproximadamente de 0,0001 a 1,0 miligramos, o aproximadamente de 0,001 a 0,1 miligramos, o aproximadamente de 0,1 a 1,0 o incluso aproximadamente 10 miligramos por dosis o similar. También pueden administrarse múltiples dosis.

Además de los compuestos formulados para administración parenteral, tales como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para administración oral; cápsulas de liberación temporizada; y cualquier otra forma actualmente usada.

En ciertos aspectos, el uso de liposomas y/o de nanopartículas se contempla para la introducción de anticuerpos en células hospedadoras. La formación y el uso de liposomas y/o de nanopartículas es conocida para los expertos en la materia.

Las nanocápsulas generalmente pueden atrapar compuestos de una manera estable y reproducible. Para evitar los efectos secundarios debidos a la sobrecarga de polímeros intracelulares, dichas partículas ultra finas (con tamaño de aproximadamente 0,1 µm) generalmente se diseñan usando polímeros capaces de degradarse in vivo. Se contemplan nanopartículas de polialquil-cianoacrilato biodegradables que cumplen estos requisitos, para su uso en la presente invención y dichas partículas pueden prepararse fácilmente.

Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de bicapas concéntricas multilamelares (también llamadas vesículas multilamelares (MLV)). Las MLV generalmente tienen diámetros de 25 nm a 4 µm. La sonicación de las MLV provoca la formación de vesículasunilamelares pequeñas (SUV) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 Å, que contienen una solución acuosa en el centro. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, de la fuerza iónica y de la presencia de cationes divalentes.

La invención se ilustrará adicionalmente en vista de las siguientes figuras y ejemplo.

Descripción de las figuras

Figura 1: análisis de SPR usando Biacore de unión competitiva de PD-L1 y PD-L2 a PD-1.

(A)

Una representación esquemática de la inhibición de la unión competitiva superficial usada en (B).

(B)

Los chips de PD-1 se pre-incubaron con una cantidad creciente de PD-L2 (de 0 a 1000 UR) y PD-L1 se inyectó a 10 µg/ml durante 2 minutos a un caudal de 10 µl/min sin retirar PD-L2 unido. Los sensogramas que muestran la unión de PD-L1 a diferente nivel de ocupación de PD-L2 están superpuestos.

(C)

Una representación esquemática de la inhibición en solución usada en (D).

(D)

Las proteínas recombinantes PD-1 a 10 µg/ml se pre-incubaron con concentraciones crecientes de PD-L2 (de 0 a 60 µg/ml) y se inyectaron durante 2 minutos a un caudal de 10 µl/min en el chip de PD-L1. Los valores UR controlados 10 segundos después del final de la inyección se representaron como una función de la concentración de PD-L2 (escala logarítmica).

Figura 2: El anticuerpo PD1.3 bloquea la unión de PD-1 tanto a PD-L1 como a PD-L2 y potencia la activación de células T.

(A)

Una representación esquemática de la inhibición de unión competitiva superficial usada en (B) y en (C). En una primera etapa las proteínas PD-1 inmovilizadas se saturan usando los Fab de anticuerpo y los ligandos PD-1 correspondientes se inyectan como un analito soluble en una segunda etapa. (B y C) Las proteínas PD-L1lg (B) y PD-L2lg (C) se inyectaron a 10 µg/ml durante 2 minutos a un caudal de 10 µl/min en un chip de PD-1 (ninguno) o un chip de PD-1 pre-incubado con Fab anti-PD-1, PD1.3 o PD1.6. Los sensogramas que muestran la unión de los ligandos de PD-1 en las diferentes situaciones están superpuestos. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos diferentes.

(D)

Los mAb PD1.3 evitan la unión de PD-L1 Fc y PD-L2 Fc a células que expresan PD-1. (E y F) El mAb PD1.3 es capaz de inducir la producción de IFN-γ e IL-10 en células T CD4 tras la interacción con DC. Se co-cultivaron iDC alogénicas con células T CD4+ con anti-PD1.3, PD1.6 o control de isotipo. Los cultivos se incubaron durante 5 días, los sobrenadantes se retiraron para el análisis de citoquinas. Se determinaron los niveles de producción de IFN-γ (E) y la producción de IL-10 (F) por duplicado por detección ELISA. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos diferentes.

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El mab PD1.3 evita la unión tanto de PD-L1 como de PD-L2 a PD-1

En una configuración adicional de experimentos, se investigó si los mAb contra PD-1 podían evitar de una forma inversa la unión tanto de PD-L1 como de PD-L2. Como se muestra en la figura 2, los paneles B y C, anti-PD1.3 pero no PD1.6 inhibía completamente la unión tanto de PD-L1 (figura 2B y 2C, paneles superiores) como la de PD-L2 (figura 2B y 2C, paneles inferiores) a PD-1. De una manera recíproca, el mAb PD1.3 bloqueaba de una manera dependiente de la dosis la unión de PD-1 Fc a chips de PD-L1 (datos no mostrados). Por análisis FACS, el mAb PD1.3 puede inhibir la unión de PD-1 Fc a células que expresan PD-L1 y PD-L2 (figura 2C).

Los mab contra PD-1 pueden modular la activación de células T por células dendríticas inmaduras alogénicas

A continuación se investigaron las capacidades funcionales de los mAb dirigidos contra PD-1. Se ensayó su capacidad de inducir la activación de células T alogénicas contra una activación subóptima, concretamente monocitos inmaduros derivados de células dendríticas. El mAb que inhibe la interacción del ligando de PD-1, PD1.3, pero no PD1.3 inhibidor, era capaz de potenciar la activación de células T CD4 como se indica por una producción aumentada de IFN-γ e IL10 (figura 2, paneles D) y la proliferación de células T (datos no mostrados).

En conjunto, estos datos demuestran que los dos ligandos compiten por la unión a PD-1 y, a la inversa, que un mAb anti-PD-1 inhibidor puede evitar fácilmente la unión de los ligandos de PD-1 y, como consecuencia, puede potenciar la activación de células T.

PD-L1 y PD-L2 difieren en sus mecanismos moleculares de unión a PD-1

A continuación se investigaron los mecanismos de la unión de PD-L1 y de PD-L2 a PD-1. Para concretar las diferentes etapas de esta interacción, se realizó un estudio cinético cuidadoso. Se realizaron ensayos de unión cinética para determinar la constante de disociación en equilibrio entre PD-1 y las proteínas de fusión de PD-L1 y PD-L2. Primero se analizaron los datos de unión usando el modelo de Langmuir 1:1. Para PD-L2/PD-1 el ajuste fue muy bueno y produjo una KD de 9,97 nM. Aunque ambos analitos recombinantes eran bivalentes, el modelo de Langmuir se ajustaba muy bien a los datos, lo que indica que los dos sitios de unión de cada molécula probablemente interactúen al mismo tiempo. Por tanto, el valor de KD muy probablemente representa un valor de avidez.

Para PD-L1/PD-1, así como PD-L1/CD80, el ajuste usando el modelo de Langmuir fue muy malo e inapropiado.

De hecho, como se muestra en la figura 3, panel A, los dos ligandos interactuaban con PD-1 con características distintas. PD-L1 se asociaba rápidamente y se disociaba también muy rápido. Por el contrario, la unión de PD-L2 se retardaba con una pendiente diferente y era más robusta. Los valores residuales diferían mucho. Por tanto, se observaron dos fenómenos distintos en la fase de disociación de PD-L1 y PD-1. Una fase prematura, durante la que PD-L1 se disociaba rápidamente de PD-1 al inicio de la disociación, estaba seguida por una fase posterior caracterizada por una tasa de disociación lenta con señales que parecen más estables, mientras que la disociación de PD-L2 y PD-1 era más homogénea. A partir de los diferentes modelos ensayados para el ajuste, el "modelo de modificación conformacional" dio el ajuste mejor y más fiable y produjo una constante de disociación aparente (KD#) de 10,7 y 56,5 nM sobre los chips de PD-1.

Puede predecirse a partir del "modelo de modificación conformacional" que aumentar el tiempo de inyección también aumentaría la estabilidad de la unión. Para ensayar esta hipótesis entonces se comparó la unión de PD-L1 y PD-L2 a chips de PD-1 siguiendo dos configuraciones, se inyectaron 10 µg/ml de las proteínas de fusión PD-L1 o PD-L2 durante 7 o 1 minuto, respectivamente. Los sensogramas representados en la figura 3B demuestran claramente que el tiempo de contacto influye en la estabilidad de la unión de PD-L1 al chip de PD-1. La disociación de PD-L1 del chip de PD-1 fue más lenta cuando el tiempo de inyección era más largo.

Como control, la cinética de disociación de PD-L2 no se veía afectada por el aumento del tiempo de inyección (figura 3B).

En conjunto, estos datos demuestran diferencias sorprendentes en los mecanismos de interacción de PD-L1 y de PD-L2 con PD-1. Los datos obtenidos con PD-L1 se ajustan a un modelo donde se necesitará un cambio de conformación para su unión eficaz con su receptor.

Finalmente se analizó si este modelo de cambio conformacional estaba restringido a la interacción de PD-L1:PD-1 y, por tanto, se debía al ligando o se observaba con otro ligando PD-L1 como CD80. Como se muestra en la figura 3A, la unión de PD-L1 a CD80 también estaba asociada con el modelo de cambio conformacional. En conjunto, estos datos indican que PD-L1 y PD-L2 difieren en su unión a PD-1. Aunque se unen a sus ligandos, concretamente a PD1 y a CD80 con mecanismos similares de asociación y disociación.

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Claims (1)

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