ES2917000T3 - Interferón-gamma mutante diana y usos del mismo - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere, en parte, a las proteínas quiméricas que comprenden interferón mutante-γ y su uso como agentes terapéuticos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Interferón-gamma mutante diana y usos del mismo

Campo

La presente invención se refiere, en parte, a proteínas quiméricas que comprenden interferón-y mutante.

Antecedentes

Los interferones (IFNs) son una familia de proteínas sintetizadas en las células de los mamíferos en respuesta a la estimulación por parte de virus, mitógenos y otras sustancias. Los interferones han mostrado que tienen actividades antivirales, antiproliferativas e inmunomoduladoras. Se han identificado más de veinte interferones distintos en el ser humano, y se clasifican en interferones de tipo I, de tipo II y de tipo III.

Entre los diversos interferones, el interferón-gamma (IFN-y) es el único miembro de la clase de interferones de tipo II. El IFN-y tiene una menor actividad antiviral específica que los interferones de tipo I, como el interferón-a y el interferón-p, pero presenta más propiedades inmunomoduladoras que los interferones de tipo I. El IFN-y ejerce sus efectos biológicos a través de interacciones específicas con el receptor IFN-y, que es un complejo de las subunidades del receptor IFN-y 1 y del receptor IFN-y 2. El IFN-y se une al receptor del IFN-y como un dímero y al unirse activa la vía JAK-STAT.

Se han desarrollado composiciones farmacéuticas que comprenden IFN-y humano recombinante de tipo salvaje (por ejemplo, ACTIMMUNE). Sin embargo, la administración de IFN-^y humano recombinante implica inyecciones frecuentes debido a la corta vida media del plasma. Además, el uso de IFN-y humano recombinante se ha asociado a efectos secundarios como fiebre, escalofríos, sudoración, dolor de cabeza, mialgia, somnolencia, dolor, eritema, elevación de las enzimas hepáticas, granulo y trombopenia reversibles y cardiotoxicidad.

En consecuencia, sigue existiendo la necesidad de mejorar las composiciones de IFN-y para el tratamiento de enfermedades y trastornos causando una toxicidad y unos efectos secundarios mínimos.

El documento EP 2343081 A1 y Bansal et al. (Plos One 2014, 9 (29:e89878) divulgan moléculas de IFN-y humano modificadas con mayor seguridad.

Sumario

La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención se refiere a proteínas quiméricas que comprenden un interferón-gamma (IFN-y) humano modificado como agente de señalización que tiene una o más mutaciones en comparación con un IFN-^y de tipo silvestre, seleccionándose las mutaciones entre un truncamiento en el extremo C de 14, 15 o 16 residuos de aminoácidos o una sustitución doble A23G y D24G. En varias realizaciones, el IFN-^y modificado comprende una o más mutaciones que reducen su actividad biológica. En varias realizaciones, el IFN-y modificado comprende una o más mutaciones que reducen su afinidad y/o actividad biológica por un receptor terapéutico. En una realización, el receptor terapéutico es el receptor IFN-y, que está compuesto por las subunidades del receptor IFN-^y 1 y del receptor IFN-y 2. En una realización, el IFN-y modificado comprende una o más mutaciones que reducen su afinidad y/o actividad biológica por la subunidad del receptor 1 del IFN-y. En otra realización, el IFN-y modificado comprende una o más mutaciones que reducen la actividad de la subunidad del receptor 2 del IFN-^y. En una realización, el IFN-Y modificado comprende una o más mutaciones que reducen su afinidad y/o actividad biológica por la subunidad del receptor 1 del IFN-^y y comprende una o más mutaciones que reducen la actividad de la subunidad del receptor 2 del IFN-y. En varias realizaciones, las mutaciones pueden ser sustituciones de aminoácidos o truncamientos de proteínas. En algunas realizaciones, las mutaciones pueden implicar la formación de una sola cadena de IFN-y. En algunas realizaciones, la proteína quimérica comprende uno o más agentes de señalización adicionales, por ejemplo, sin limitación, un interferón, una interleucina y un factor de necrosis tumoral, que pueden ser modificados. En varias realizaciones, la proteína quimérica de la invención proporciona una seguridad mejorada en comparación con un IFN-y de tipo salvaje no modificado.

La proteína quimérica también comprende una o más fracciones dirigidas que tienen dominios de reconocimiento (por ejemplo, dominios de reconocimiento de antígeno, incluyendo sin limitación varios formatos de anticuerpos, incluidos los anticuerpos de dominio único) que se unen específicamente a un diana (por ejemplo, antígeno, receptor) de interés. En varias realizaciones, las fracciones dirigidas tienen dominios de reconocimiento que se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) de interés, incluidas las que se encuentran en una o más células inmunitarias, que pueden incluir, sin limitación, células T, linfocitos T citotóxicos, células T auxiliares, células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), macrófagos antitumorales (por ejemplo, macrófagos M1), células B y células dendríticas. En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) de interés y reclutan eficazmente una o más células inmunitarias. En algunas realizaciones, las dianas (por ejemplo, antígenos, receptores) de interés pueden encontrarse en una o más células tumorales. En algunas realizaciones, las presentes proteínas quiméricas pueden reclutar una célula inmunitaria, por ejemplo, una célula inmunitaria que puede matar y/o suprimir una célula tumoral, a un sitio de acción (como, a modo de ejemplo no limitativo, el microambiente tumoral). En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) de interés que forma parte de una estructura no celular.

Las presentes proteínas quiméricas pueden encontrar uso en el tratamiento de diversas enfermedades o trastornos como el cáncer, las infecciones, los trastornos inmunitarios, las enfermedades autoinmunes, las enfermedades cardiovasculares, la curación de heridas, las enfermedades relacionadas con la isquemia, las enfermedades neurodegenerativas, las enfermedades metabólicas y muchas otras enfermedades y trastornos, y la presente invención abarca diversos procedimientos de tratamiento.

Cualquier aspecto o forma de realización divulgada en el presente documento puede combinarse con cualquier otro aspecto o forma de realización divulgada en el presente documento.

Breve descripción de las figuras

Habiendo descrito así la materia objeto divulgada en términos generales, se hará referencia ahora a las Figuras adjuntas, que no están necesariamente dibujadas a escala, y en las que:

La FIG. 1 muestra las secuencias alineadas para el IFN-^y de tipo salvaje y sin las secuencias de señal N-terminal (P-522; SEQ ID NO: 947) y el IFN-y modificado (P-662 a P-676, respectivamente, SEQ ID NO: 948 a SEQ ID NO: 962).

Las FIG. 2A a FIG. 2P son gráficos que muestran la actividad del reportero pGAS en células transfectadas con un plásmido CD20 o un vector vacío y estimuladas con proteínas quiméricas de la presente invención. Los datos se muestran como media ± d.s.

Las FIG. 3A a FIG. 3H son gráficos que muestran las intensidades de inmunofluorescencia de las células transfectadas con un plásmido CD20 o un vector vacío y estimuladas con proteínas quiméricas de la presente invención. Las células fueron sondadas con un anticuerpo fosfo-STATI. Los datos se muestran como media ± STDEV.

Descripción detallada

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que las proteínas quiméricas diana que incluyen un IFN-^y modificado con afinidad y/o actividad biológica reducida para uno o más receptores presentan propiedades terapéuticas beneficiosas y efectos secundarios reducidos. Se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas quiméricas y su uso en el tratamiento de diversas enfermedades. La administración de las proteínas quiméricas y las composiciones farmacéuticas de la divulgación consigue reducir significativamente los efectos secundarios.

Interferón-Gamma modificado

La presente invención proporciona una proteína quimérica que incluye un agente de señalización que es una versión modificada de un interferón-gamma (IFN-^y) humano con afinidad y/o actividad biológica reducida para uno o más receptores. El IFN-^y humano modificado tiene una o más mutaciones en comparación con un IFN-^y de tipo salvaje, siendo las mutaciones seleccionadas entre un truncamiento en el C-terminal de 14, 15 o 16 residuos de aminoácidos o una doble sustitución A23G y D24G. Los interferones (IFN) son una conocida familia de citoquinas secretadas por una gran variedad de células eucariotas. Los interferones tienen una variedad de actividades biológicas, incluyendo propiedades antivirales, inmunomoduladoras, inmunoreguladoras y antiproliferativas, y se han utilizado como agentes terapéuticos para el tratamiento de diversas enfermedades.

Entre los diversos interferones, el IFN-^y es el único miembro de la clase de interferones de tipo II. El IFN-^y es producido predominantemente por las células asesinas naturales (NK) y las células T asesinas naturales (NKT) como parte de la respuesta inmunitaria innata. El IFN-y también es producido por los linfocitos T citotóxicos (CTL) CD4 Th1 y CD8 efectores, los macrófagos, las células dendríticas y las células B. El IFN-^y activado forma un dímero que actúa a través de un receptor heterodimérico (es decir, el receptor IFN-^y o IFN-^yR) compuesto por las subunidades del receptor IFN-y 1 y del receptor IFN-y 2. El receptor IFN-y 1 es la principal subunidad de unión al ligando, mientras que el receptor IFN-y 2 es necesario para la transducción de señales y también aumenta la afinidad del receptor IFN-^y 1 por su ligando. La unión del dímero de IFN-^y al receptor activa la vía de señalización JAK-STAT para provocar diversos efectos biológicos.

El IFN-^y humano es un polipéptido que comprende 166 residuos de aminoácidos. En una realización, el IFN-^y humano tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 946, en el que el péptido señal comprende los primeros 23 aminoácidos.

Como se utiliza en la presente memoria, el IFN-y humano también puede referirse al IFN-y humano maduro sin el péptido señal N-terminal. En esta realización, el IFN-^y humano maduro comprende 143 aminoácidos y tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 947.

En algunas realizaciones, el IFN-^y humano es una forma glicosilada de IFN-^y humano. En algunas realizaciones, el IFN-y humano es una forma no glicosilada de IFN-y humano.

Las secuencias de IFN-y son conocidas en la técnica. En diversas realizaciones, el IFN-y modificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 60%, o al menos aproximadamente un 61%, o al menos aproximadamente un 62%, o al menos aproximadamente un 63%, o al menos aproximadamente un 64%, o al menos aproximadamente un 65%, o al menos aproximadamente un 66%, o al menos aproximadamente un 67%, o al menos aproximadamente un 68%, o al menos aproximadamente un 69%, o al menos aproximadamente un 70%, o al menos aproximadamente un 71%, o al menos aproximadamente un 72%, o al menos aproximadamente un 73%, o al menos aproximadamente un 74%, o al menos aproximadamente un 75%, o al menos aproximadamente un 76%, o al menos aproximadamente un 77%, o al menos aproximadamente un 78%, o al menos aproximadamente un 79%, o al menos aproximadamente un 80%, o al menos aproximadamente un 81%, o al menos aproximadamente un 82%, o al menos aproximadamente un 83%, o al menos aproximadamente un 84%, o al menos aproximadamente un 85%, o al menos aproximadamente un 86%, o al menos aproximadamente un 87%, o al menos aproximadamente un 88%, o al menos aproximadamente un 89%, o al menos aproximadamente un 90%, o al menos aproximadamente un 91%, o al menos aproximadamente un 92%, o al menos aproximadamente un 93%, o al menos aproximadamente un 94%, o al menos aproximadamente un 95%, o al menos aproximadamente un 96%, o al menos aproximadamente un 97%, o al menos aproximadamente un 98%, o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de tipo salvaje conocidas del IFN-y (por ejemplo, aproximadamente un 60%, o aproximadamente un 61%, o aproximadamente un 62%, o aproximadamente un 63%, o aproximadamente un 64%, o aproximadamente un 65%, o aproximadamente un 66%, o aproximadamente un 67%, o aproximadamente un 68%, o aproximadamente un 69%, o aproximadamente un 70%, o aproximadamente un 71%, o aproximadamente un 72%, o aproximadamente un 73%, o aproximadamente un 74%, o aproximadamente un 75%, o aproximadamente un 76%, o aproximadamente un 77%, o aproximadamente un 78%, o aproximadamente un 79%, o aproximadamente un 80%, o aproximadamente un 81%, o aproximadamente un 82%, o aproximadamente un 83%, o aproximadamente un 84%, o aproximadamente un 85%, o aproximadamente un 86%, o aproximadamente un 87%, o aproximadamente un 88%, o aproximadamente un 89%, o aproximadamente un 90%, o aproximadamente un 91%, o aproximadamente un 92%, o aproximadamente un 93%, o aproximadamente un 94%, o aproximadamente un 95%, o aproximadamente un 96%, o aproximadamente un 97%, o aproximadamente un 98%, o aproximadamente un 99% de identidad de secuencia).

En algunas realizaciones, el IFN-^y modificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 60%, o al menos aproximadamente un 61%, o al menos aproximadamente un 62%, o al menos aproximadamente un 63%, o al menos aproximadamente un 64%, o al menos aproximadamente un 65%, o al menos aproximadamente un 66%, o al menos aproximadamente un 67%, o al menos aproximadamente un 68%, o al menos aproximadamente un 69%, o al menos aproximadamente un 70%, o al menos aproximadamente un 71%, o al menos aproximadamente un 72%, o al menos aproximadamente un 73%, o al menos aproximadamente un 74%, o al menos aproximadamente un 75%, o al menos aproximadamente un 76%, o al menos aproximadamente un 77%, o al menos aproximadamente un 78%, o al menos aproximadamente un 79%, o al menos aproximadamente un 80%, o al menos aproximadamente un 81%, o al menos aproximadamente un 82%, o al menos aproximadamente un 83%, o al menos aproximadamente un 84%, o al menos aproximadamente un 85%, o al menos aproximadamente un 86%, o al menos aproximadamente un 87%, o al menos aproximadamente un 88%, o al menos aproximadamente un 89%, o al menos aproximadamente un 90%, o al menos aproximadamente un 91%, o al menos aproximadamente un 92%, o al menos aproximadamente un 93%, o al menos aproximadamente un 94%, o al menos aproximadamente un 95%, o al menos aproximadamente un 96%, o al menos aproximadamente un 97%, o al menos aproximadamente un 98%, o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con el IFN-^y humano que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:946 (e.g., aproximadamente un 60%, o aproximadamente un 61%, o aproximadamente un 62%, o aproximadamente un 63%, o aproximadamente un 64%, o aproximadamente un 65%, o aproximadamente un 66%, o aproximadamente un 67%, o aproximadamente un 68%, o aproximadamente un 69%, o aproximadamente un 70%, o aproximadamente un 71%, o aproximadamente un 72%, o aproximadamente un 73%, o aproximadamente un 74%, o aproximadamente un 75%, o aproximadamente un 76%, o aproximadamente un 77%, o aproximadamente un 78%, o aproximadamente un 79%, o aproximadamente un 80%, o aproximadamente un 81%, o aproximadamente un 82%, o aproximadamente un 83%, o aproximadamente un 84%, o aproximadamente un 85%, o aproximadamente un 86%, o aproximadamente un 87%, o aproximadamente un 88%, o aproximadamente un 89%, o aproximadamente un 90%, o aproximadamente un 91%, o aproximadamente un 92%, o aproximadamente un 93%, o aproximadamente un 94%, o aproximadamente un 95%, o aproximadamente un 96%, o aproximadamente un 97%, o aproximadamente un 98%, o aproximadamente un 99% de identidad de secuencia).

En algunas realizaciones, el IFN-^y modificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 60%, o al menos aproximadamente un 61%, o al menos aproximadamente un 62%, o al menos aproximadamente un 63%, o al menos aproximadamente un 64%, o al menos aproximadamente un 65%, o al menos aproximadamente un 66%, o al menos aproximadamente un 67%, o al menos aproximadamente un 68%, o al menos aproximadamente un 69%, o al menos aproximadamente un 70%, o al menos aproximadamente un 71%, o al menos aproximadamente un 72%, o al menos aproximadamente un 73%, o al menos aproximadamente un 74%, o al menos aproximadamente un 75%, o al menos aproximadamente un 76%, o al menos aproximadamente un 77%, o al menos aproximadamente un 78%, o al menos aproximadamente un 79%, o al menos aproximadamente un 80%, o al menos aproximadamente un 81%, o al menos aproximadamente un 82%, o al menos aproximadamente un 83%, o al menos aproximadamente un 84%, o al menos aproximadamente un 85%, o al menos aproximadamente un 86%, o al menos aproximadamente un 87%, o al menos aproximadamente un 88%, o al menos aproximadamente un 89%, o al menos aproximadamente un 90%, o al menos aproximadamente un 91%, o al menos aproximadamente un 92%, o al menos aproximadamente un 93%, o al menos aproximadamente un 94%, o al menos aproximadamente un 95%, o al menos aproximadamente un 96%, o al menos aproximadamente un 97%, o al menos aproximadamente un 98%, o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con el IFN-y humano que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:947(e.g., aproximadamente un 60%, o aproximadamente un 61%, o aproximadamente un 62%, o aproximadamente un 63%, o aproximadamente un 64%, o aproximadamente un 65%, o aproximadamente un 66%, o aproximadamente un 67%, o aproximadamente un 68%, o aproximadamente un 69%, o aproximadamente un 70%, o aproximadamente un 71%, o aproximadamente un 72%, o aproximadamente un 73%, o aproximadamente un 74%, o aproximadamente un 75%, o aproximadamente un 76%, o aproximadamente un 77%, o aproximadamente un 78%, o aproximadamente un 79%, o aproximadamente un 80%, o aproximadamente un 81%, o aproximadamente un 82%, o aproximadamente un 83%, o aproximadamente un 84%, o aproximadamente un 85%, o aproximadamente un 86%, o aproximadamente un 87%, o aproximadamente un 88%, o aproximadamente un 89%, o aproximadamente un 90%, o aproximadamente un 91%, o aproximadamente un 92%, o aproximadamente un 93%, o aproximadamente un 94%, o aproximadamente un 95%, o aproximadamente un 96%, o aproximadamente un 97%, o aproximadamente un 98%, o aproximadamente un 99% de identidad de secuencia).

El IFN-^y modificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una o más mutaciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, las una o más mutaciones de aminoácidos pueden seleccionarse independientemente entre sustituciones, inserciones, deleciones y truncamientos.

En algunas realizaciones, las mutaciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos, y pueden incluir sustituciones conservadoras y/o no conservadoras.

Las "sustituciones conservadoras" pueden realizarse, por ejemplo, sobre la base de la similitud de la polaridad, la carga, el tamaño, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los residuos de aminoácidos implicados. Los 20 aminoácidos naturales pueden agruparse en los siguientes seis grupos de aminoácidos estándar: (1) hidrófobo: Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrófilo neutro: Cys, Ser, Thr; Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

Como se utiliza en el presente documento, las "sustituciones conservadoras" se definen como intercambios de un aminoácido por otro aminoácido enumerado dentro del mismo grupo de los seis grupos de aminoácidos estándar mostrados anteriormente. Por ejemplo, el intercambio de Asp por Glu retiene una carga negativa en el polipéptido así modificado. Además, la glicina y la prolina pueden sustituirse entre sí en función de su capacidad para interrumpir las a-hélices.

Como se utiliza en la presente memoria, las "sustituciones no conservadoras" se definen como intercambios de un aminoácido por otro aminoácido incluido en un grupo diferente de los seis grupos de aminoácidos estándar (1) a (6) mostrados anteriormente.

En varias realizaciones, las sustituciones también pueden incluir aminoácidos no clásicosfpor ejemplo selenocisteína, pirrolisina, W-formilmetionina p-alanina, GABA y ácido 8-aminolevulínico, ácido 4-aminobenzoico (PABA), isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino butírico, Y-Abu, £-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, omitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosma, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, p-alanina, aminoácidos fluorados, aminoácidos de diseño como los p-metilaminoácidos, los C a-metilaminoácidos, los N a-metilaminoácidos y los análogos de aminoácidos en general).

En varias realizaciones, el IFN-y se modifica para tener una o más mutaciones. En algunas realizaciones, las mutaciones permiten que el IFN-y modificado tenga una o más de las actividades atenuadas, como una o más de las afinidades de unión reducidas, una actividad endógena reducida y una bioactividad específica reducida en relación con la forma no mutada, por ejemplo, la forma de tipo salvaje del IFN-y. Por ejemplo, la una o más de las actividades atenuadas, como la afinidad de unión reducida, la actividad endógena reducida y la bioactividad específica reducida en relación con la forma no mutada, por ejemplo, de tipo salvaje, del IFN-y puede ser en un receptor terapéutico como el receptor del IFN-y. En consecuencia, en varias realizaciones, las mutaciones permiten que el agente soluble modificado tenga una toxicidad sistémica reducida, efectos secundarios reducidos y efectos fuera de diana reducidos en relación con la forma no mutada, por ejemplo, la forma de tipo salvaje de IFN-y.

En varias realizaciones, el IFN-y se modifica para que tenga una mutación que reduzca su afinidad de unión y/o su actividad en un receptor terapéutico como el receptor IFN-y que comprende las subunidades del receptor IFN-y 1 y del receptor IFN-y 2. En algunas realizaciones, la actividad proporcionada por el IFN-y de tipo salvaje es el agonismo en el receptor terapéutico (por ejemplo, la activación de un efecto celular en un sitio de la terapia). Por ejemplo, el IFN-^y de tipo salvaje puede activar el receptor terapéutico. En tales realizaciones, la mutación hace que el IFN-y modificado tenga una actividad activadora reducida en el receptor terapéutico.

En algunas realizaciones, la afinidad y/o la actividad reducida en el receptor terapéutico (por ejemplo, el receptor de IFN-y) son restaurables mediante la unión con una fracción dirigida. En otras realizaciones, la afinidad y/o la actividad reducidas en el receptor terapéutico no son sustancialmente restaurables mediante la unión con la fracción dirigida. En varias realizaciones, las proteínas quiméricas terapéuticas de la presente invención reducen los efectos fuera del diana porque el IFN-y tiene mutaciones que debilitan la afinidad de unión y/o la actividad en un receptor terapéutico. En varias realizaciones, esto reduce los efectos secundarios observados con, por ejemplo, el IFN-y de tipo salvaje. En varias realizaciones, el IFN-y modificado es sustancialmente inactivo en el camino hacia el sitio de la actividad terapéutica y tiene su efecto sustancialmente en los tipos de células específicamente dirigidas, lo que reduce en gran medida los efectos secundarios no deseados.

En varias realizaciones, el IFN-y modificado tiene una o más mutaciones que hacen que el IFN-y tenga una afinidad y/o una actvidad atenuada o reducida, por ejemplo, la unión (por ejemplo, Kd) y/o la activación (medible como, por ejemplo, K^A y/o EC⁵⁰) para uno o más receptores terapéuticos (por ejemplo, el receptor de IFN-^y). En varias realizaciones, la afinidad y/o actvidad reducida en el receptor terapéutico permite atenuar la actividad y/o la señalización del receptor terapéutico.

En varias realizaciones, el IFN-y modificado tiene una o más mutaciones que reducen su unión a la subunidad del receptor 1 del IFN-^y o su afinidad y/o actividad biológica. En una realización, el IFN-y modificado tiene afinidad y/o actividad reducida en la subunidad del receptor 1 del IFN-y. En varias realizaciones, el IFN-y modificado es IFN-y humano que tiene una o más mutaciones en los residuos de aminoácidos implicados en la unión a la subunidad del receptor 1 de IFN-^y. En algunas realizaciones, el IFN-y modificado es IFN-y humano que tiene una o más mutaciones en aminoácidos localizados en la interfaz con la subunidad del receptor 1 de IFN-y. En varias realizaciones, la una o más mutaciones están en aminoácidos seleccionados de, pero no limitados a Q1, V5, E9, K12, H19, S20, V22, A23, D24, N25, G26, T27, L30, K108, H111, E112, 1114, Q115, A118, E119, y K125 (cada uno con respecto a SEQ ID NO: 947, que es un IFN-y humano de tipo salvaje y que carece de su secuencia señal N-terminal). En algunas realizaciones, la una o más mutaciones son sustituciones seleccionadas de V5E, S20E, V22A, A23G, A23F, D24G, G26Q, H111A, H111D, I114A, Q115A, y A118G (cada una con respecto a SEQ ID NO: 947). En las realizaciones, la una o más mutaciones son sustituciones seleccionadas de V22A, A23G, D24G, H111A, H111D, I114A, Q115A y A118G; estos IFN-ys modificados tienen una secuencia de aminoácidos, respectivamente, de SEQ ID NO: 953, SEQ ID NO: 954, y SEQ ID NO: 956 a SEQ ID NO: 961).

En una realización, el IFN-y modificado comprende las mutaciones A23G y D24G, este IFN-y modificado tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 955. Se divulga el IFN-y modificado que comprende las mutaciones I114A y A118G, este IFN-y modificado tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 962. Se divulga el IFN-y modificado que comprende las mutaciones V5E, S20E, A23F y G26Q.

Se divulga el IFN-y modificado que tiene una o más de las siguientes mutaciones: supresión del residuo A23, supresión del residuo D24, una sustitución S20I, una sustitución A23V, una sustitución D21K y una sustitución D24A. En algunas realizaciones, el IFN-y modificado tiene una o más mutaciones que reducen su unión o su afinidad y/o actividad biológica para la subunidad del receptor 2 del IFN-y.

En algunas realizaciones, el IFN-y modificado tiene una o más mutaciones que reducen su unión o su afinidad y/o actividad biológica para las subunidades del receptor 1 y del receptor 2 del IFN-y.

En algunas realizaciones, el IFN-y modificado tiene una o más mutaciones que reducen su unión a o su afinidad y/o actividad biológica para el receptor 1 de IFN-^y y una o más mutaciones que reducen sustancialmente o abaten la unión a o su afinidad y/o actividad biológica para el receptor 2 de IFN-y. En algunas realizaciones, las proteínas quiméricas con dicho iFN-y modificado pueden proporcionar una actividad selectiva a diana del receptor 1 del IFN-y (por ejemplo, la actividad del receptor 1 del IFN-^y se puede restaurar mediante la dirección a través de la fracción dirigida).

En algunas realizaciones, el IFN-^y modificado tiene una o más mutaciones que reducen su unión o su afinidad y/o actividad biológica por el receptor 1 de IFN-^y y una o más mutaciones que reducen su unión o su afinidad y/o actividad biológica por el receptor 1 de IFN-y. En algunas realizaciones, las proteínas quiméricas con dicho IFN-y modificado pueden proporcionar una actividad del receptor 1 de IFN-^y selector de diana y/o del receptor 1 de IFN-^y (por ejemplo., las actividades del receptor 1 de IFN-^y y del receptor 2 de IFN-^y son restaurables mediante la dirección a través de la fracción dirigida).

En varias realizaciones, el IFN-y modificado está truncado en el extremo C. En algunas realizaciones, el IFN-y modificado es un IFN-y maduro que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 947 con deleciones en el extremo C-terminal. En tales realizaciones, el IFN-y maduro comprende un truncamiento C-terminal de 14,15 o 16 residuos de aminoácidos.

En varias realizaciones, el IFN-y modificado es un IFN-y de cadena única como se describe, por ejemplo, por Randal et al. (2001) Structure 9:155-163 y Randal et al. (1998) Protein Sci. 7:1057-1060. En algunas realizaciones, el IFN-y de cadena única comprende una primera cadena de IFN-y unida en su C-terminal al N-terminal de una segunda cadena de IFN-y. En diversas realizaciones, la primera y la segunda cadena de IFN-y están unidas por un enlazador, como se describe en otra parte del presente documento.

En algunas realizaciones, la primera cadena de IFN-y comprende un truncamiento C-terminal de 14, 15 o 16 residuos de aminoácidos. En algunas realizaciones, la segunda cadena de IFN-y comprende un truncamiento C-terminal de 14, 15 o 16 residuos de aminoácidos. En diversas realizaciones, la primera y/o segunda cadena de IFN-y comprenden una o más mutaciones de aminoácidos en Q1, V5, E9, K12, H19, S20, V22, A23, D24, N25, G26, T27, L30, K108, H111, E112, I114, Q115, A118, E119 y K125, como se describe en otra parte del presente documento. En diversas realizaciones, la primera y/o segunda cadena de IFN-y comprenden una o más sustituciones seleccionadas entre V5E, S20E, V22A, A23G, A23F, D24G, G26Q, H111A, H111D, I114A, Q115A y A118G. En diversas realizaciones, la primera y/o segunda cadena de IFN-y comprenden una o más sustituciones seleccionadas entre V22A, A23G, D24G, H111A, H111D, I114A, Q115A y A118G. En diversas realizaciones, la primera y/o segunda cadena de IFN-y comprenden la sustitución A23G y la D24G. En diversas realizaciones, la primera y/o segunda cadena de IFN-y comprenden la sustitución I114A y la A118G. En otra realización, las mutaciones son ^v 5^e , S20E, A23F y G26Q.

En diversas realizaciones, una primera y/o segunda cadena de IFN-y comprende una o más sustituciones como se divulga en el presente documento y la primera y/o segunda cadena de IFN-y comprende un truncamiento C-terminal como se divulga en el presente documento.

En varias realizaciones, una primera y/o segunda cadena de IFN-y comprende una o más sustituciones como se divulga en el presente documento y un truncamiento C-terminal como se divulga en el presente documento.

La estructura cristalina del IFN-y humano es conocida y se describe, por ejemplo, por Ealick et al., (1991) Science, 252: 698-702. En concreto, se ha mostrado que la estructura del IFN-y humano incluye un núcleo de seis a-hélices y una secuencia desplegada extendida en la región C-terminal. En varias realizaciones, el IFN-y modificado tiene una o más mutaciones en una o más hélices que reducen su afinidad de unión y/o su actividad biológica en un receptor terapéutico (por ejemplo, el receptor IFN-y).

En varias realizaciones, el IFN-^y modificado tiene aproximadamente un 1%, o aproximadamente un 3%, aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 15%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 25%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 35%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 45%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 65%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 75%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 85%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 95%, o aproximadamente un 10%-20%, aproximadamente un 20%-40%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 40%-60%, aproximadamente un 60%-80%, aproximadamente un 80%-100% de la afinidad y/o la actividad biológica para el receptor terapéutico (por ejemplo Receptor IFN-y o cualquiera de sus subunidades receptor IFN-y 1 y receptor IFN-y 2) en relación con el IFN-y de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la afinidad de unión y/o la actividad biológica es al menos aproximadamente 2 veces menor, aproximadamente 3 veces menor, aproximadamente 4 veces menor, aproximadamente 5 veces menor, aproximadamente 6 veces menor, aproximadamente 7 veces menor, aproximadamente 8 veces menor, aproximadamente 9 veces menor, al menos aproximadamente 10 veces menor, al menos aproximadamente 15 veces menor, al menos aproximadamente 20 veces menor, al menos aproximadamente 25 veces menor, al menos aproximadamente 30 veces menor, al menos aproximadamente 35 veces menor, al menos aproximadamente 40 veces menor, al menos aproximadamente 45 veces menor, al menos aproximadamente 50 veces menor, al menos aproximadamente 100 veces menor, al menos aproximadamente 150 veces menor, o al menos aproximadamente 10-50 veces menor, aproximadamente 50-100 veces menor, aproximadamente 100-150 veces menor, aproximadamente 150-200 veces menor, o más de 200 veces menor en relación con el IFN-y de tipo salvaje.

En varias realizaciones, el IFN-y modificado comprende una o más mutaciones que reducen la actividad endógena del IFN-y a aproximadamente el 75%, o aproximadamente el 70%, o aproximadamente el 60%, o aproximadamente el 50%, o aproximadamente el 40%, o aproximadamente el 30%, o aproximadamente el 25%, o aproximadamente el 20%, o aproximadamente el 10%, o aproximadamente el 5%, o aproximadamente el 3%, o aproximadamente el 1%, por ejemplo, en relación con el IFN-^y de tipo salvaje.

En algunas realizaciones, el IFN-y modificado comprende una o más mutaciones que hacen que el IFN-y modificado tenga una afinidad y/o actividad biológica reducida por un receptor. En algunas realizaciones, la afinidad de unión y/o la actividad biológica del IFN-y modificado para un receptor es menor que la afinidad de unión y/o la actividad biológica de la fracción dirigida para su receptor. En algunas realizaciones, este diferencial de afinidad de unión y/o de actividad biológica se da entre el IFN-y/receptor modificado y la fracción/receptor dirigida en la misma célula. En algunas realizaciones, esta afinidad de unión y/o actividad biológica, diferencial permite que el IFN-y modificado tenga efectos localizados, en la diana y minimice los efectos fuera de la diana que subyacen a los efectos secundarios que se observan con el IFN-y de tipo salvaje. En algunas realizaciones, esta afinidad de unión y/o actividad biológica es aproximadamente al menos 2 veces, o aproximadamente al menos 5 veces, o aproximadamente al menos 10 veces, o aproximadamente al menos 15 veces menor, o aproximadamente al menos 25 veces, o aproximadamente al menos 50 veces menor, o aproximadamente al menos 100 veces, o aproximadamente al menos 150 veces menor.

La actividad de unión al receptor puede medirse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la afinidad y/o la actividad de unión pueden evaluarse mediante el análisis del gráfico de Scatchard y el ajuste por ordenador de los datos de unión (por ejemplo, Scatchard, 1949) o mediante espectroscopia de interferencia reflectométrica en condiciones de flujo, como describen Brecht et al. (1993).

En varias realizaciones, la actividad atenuada en el receptor terapéutico, la afinidad debilitada y/o la actividad biológica en el receptor terapéutico son restaurables mediante la unión con una fracción dirigida, que tiene alta afinidad por un antígeno en el sitio de la actividad terapéutica (por ejemplo, un anticuerpo o formato de anticuerpo descrito en el presente documento). La dirección se realiza mediante la unión del IFN-y modificado a una fracción dirigida. En una realización, el IFN-y modificado está vinculado a una fracción dirigida a través de su amino-terminal. En otra realización, el IFN-y modificado está vinculado a una fracción de destino a través de su carboxi-terminal. Las presentes proteínas quiméricas proporcionan una acción terapéutica localizada, a la diana y controlada por acción terapeútica en el receptor terapéutico.

En varias realizaciones, una proteína quimérica de la presente invención comprende un IFN-y que comprende una o más sustituciones como se divulga en el presente documento y/o un truncamiento C-terminal como se divulga en el presente documento.

Agentes terapéuticos que comprenden el presente interferón-Y modificado

Fracción dirigida a reclutamiento celular

Las proteínas quiméricas de la presente invención comprenden además una o más fracciones dirigidas que tienen dominios de reconocimiento que se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) de interés. En realizaciones ejemplares, la proteína quimérica puede comprender dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más fracciones dirigidas. En varias realizaciones, la diana (por ejemplo, antígeno, receptor) de interés puede encontrarse en una o más células inmunitarias, que pueden incluir, sin limitación, células T, linfocitos T citotóxicos, células T auxiliares, células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), macrófagos antitumorales (por ejemplo, macrófagos M1), células B, células dendríticas o subconjuntos de las mismas. En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) de interés y reclutan eficazmente, de forma directa o indirecta, una o más células inmunitarias. En algunas realizaciones, la diana (por ejemplo, antígeno, receptor) de interés puede encontrarse en una o más células tumorales. En algunas realizaciones, las proteínas quiméricas de la invención comprenden dos o más fracciones dirigidas. En tales realizaciones, las proteínas quiméricas pueden dirigirse a dos células diferentes (por ejemplo, para hacer una sinapsis) o a la misma célula (por ejemplo, para obtener un efecto de agente señalizador más concentrado). En algunas realizaciones, las presentes proteínas quiméricas pueden reclutar directa o indirectamente a una célula inmunitaria, por ejemplo, en algunas realizaciones, a un sitio terapéutico (por ejemplo, un locus con una o más células de la enfermedad o células a modular para un efecto terapéutico). En algunas realizaciones, las presentes proteínas quiméricas pueden reclutar directa o indirectamente una célula inmunitaria, por ejemplo, una célula inmunitaria que puede matar y/o suprimir una célula tumoral, a un sitio de acción (como, a modo de ejemplo no limitativo, el microambiente tumoral).

En varias realizaciones, las fracciones dirigidas pueden reclutar directa o indirectamente células, tales como células de la enfermedad y/o células efectoras. En varias realizaciones, el agente de señalización (por ejemplo, el IFN-y modificado) puede modular una o más células que son dirigidas por las fracciones dirigidas (por ejemplo, las células reclutadas, como las células de la enfermedad y/o las células efectoras). Por ejemplo, el agente de señalización (por ejemplo, IFN-y modificado) puede modular una o ambas células diana (y las células diana pueden ser efectoras y/o células de la enfermedad), dependiendo de si las células diana expresan un receptor para el agente de señalización. En algunas realizaciones, las presentes proteínas quiméricas son capaces de, o encuentran uso en procedimientos que implican, cambiar el equilibrio de las células inmunes a favor del ataque inmune de un tumor. Por ejemplo, las presentes proteínas quiméricas pueden cambiar la proporción de células inmunitarias en un lugar de importancia clínica a favor de las células que pueden matar y/o suprimir un tumor (por ejemplo, células T, linfocitos T citotóxicos, células T auxiliares, células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), macrófagos antitumorales (por ejemplo, M1), células B, células dendríticas, o subconjuntos de las mismas) y en oposición a las células que protegen los tumores (por ejemplo, células supresoras derivadas de los mieloides (MDSCs), células T reguladoras (Tregs); neutrófilos asociados a los tumores (TANs), macrófagos M2, macrófagos asociados a los tumores (TAMs), o subconjuntos de los mismos). En algunas realizaciones, la presente proteína quimérica es capaz de aumentar una proporción de células T efectoras con respecto a las células T reguladoras.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) asociada a las células T. En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento reclutan directa o indirectamente células T. En una realización, los dominios de reconocimiento se unen específicamente a las células T efectoras. En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento recluta directa o indirectamente a las células T efectoras, por ejemplo, en algunas realizaciones, a un sitio terapéutico (por ejemplo, un locus con una o más células de la enfermedad o célula a ser modulada para un efecto terapéutico). Las células T efectoras ilustrativas incluyen células T citotóxicas (por ejemplo, ap TCR, CD3+, CD8+, CD45RO+); células T efectoras CD4+ (por ejemplo, ap TCR, CD3+, CD4+, CCR7+, CD62Lhi, IL-7R/CD127+); células T efectoras CD8+ (por ejemplo, ap T_cR, _cD3+, CD8+, CCR7+, CD62Lhi, IL-7R/CD127+); células T efectoras de memoria (por ejemplo, CD62LIow, CD44+, TCR, CD3+, IL-7R/CD127+, IL-15R+, CCR7low); células T de memoria central (p.ej, CCR7+, CD62L+, CD27+; oCCR7hi, CD44+, CD62Lhi, TCR, CD3+, IL-7R/CD127+, IL-15R+); células T efectoras CD62L+; células T efectoras CD8+ (TEM), incluyendo células T efectoras tempranas (CD27+ CD62L-) y células T efectoras tardías (CD27- CD62L-) (TemE y TemL, respectivamente); Células T efectoras CD127(+)CD25 (low/-); células T efectoras CD127(')CD25('); células efectoras de memoria de células madre CD8+ (TSCM) ( por ejemplog., CD44 (baja)CD62L (alta)CD122 (alta)sca(+)); células T efectoras TH1 (por ejemplo, CXCR3+, CXCR6+ y CCR5+; o ap TCR, CD3+, CD4+, IL-12R+, IFNyR+, CXCR3+), células T efectoras TH2 (por ejemplo CCR3+, CCR4+ y CCR8+; o ap TCR, CD3+, CD4+, IL-4R+, IL-33R+, CCR4+, IL-17RB+, CRTH2+); células T efectoras TH9 (por ejemplo, ap TCR, CD3+, CD4+); células T efectoras TH17 (por ejemplo ap TCR, CD3+, CD4+, IL-23R+, CCR6+, IL-1R+); células T efectoras CD4+CD45RO+CCR7+, células T efectoras ICOS+; células T efectoras CD4+CD45RO+CCR7('); y células T efectoras que secretan IL-2, IL-4 y/o IFN-y.

Los antígenos de células T ilustrativos de interés incluyen, por ejemplo (e incluyendo los dominios extracelulares, cuando sea aplicable) CD8, CD3, SLAMF4, IL-2Ra, 4-1BB/TNFRSF9, IL-2 R p, ALCAM, B7-1, IL-4 R, B7-H3, BLAME/SLAMFS, CEACAM1, IL-6 R, CCR3, IL-7 Ra, CCR4, CXCRI/IL-S RA, CCR5, CCR6, IL-10R a, CCR 7, IL-I 0 R p, CCRS, IL-12 R p 1, CCR9, IL-12 R p 2, CD2, IL-13 R a 1, IL-13, CD3, CD4, ILT2/CDS5j, ILT3/CDS5k, ILT4/CDS5d, ILT5/CDS5a, lutegrina a 4/CD49d, CDS, Integrina a E/CD103, CD6, Integrina a M/CD 11 b, CDS, Integrina a X/CD11c, Integrina p 2/CDIS, KIR/CD15S, CD27/TNFRSF, KIR2DL1, CD2S, KIR2DL3, CD30/TNFRSFS, KIR2DL4/CD15Sd, CD31/PECAM-1, KIR2DS4, Ligando CD40/TNFSF5, LAG-3, CD43, LAIR1, CD45, LAIR2, CDS3, Leucotrieno B4-R1, CDS4/SLAMF5, NCAM-L1, CD94, NKG2A, CD97, NKG2C, CD229/SLAMF3, NKG2D, CD2F-10/SLAMF9, NT-4, CD69, NTB-A/SLAMF6, Cadena _y común/IL-2 R _y, Osteopontina, CRACC/SLAMF7, PD-1, CRTAM, PSGL-1, CTLA-4, RANK/TNFRSF11A, CX3CR1, CX3CL1, L-Selectina, CXCR3, SIRP p 1, CXCR4, SLAM, CXCR6, TCCR/WSX-1, DNAM-1, Timopoyetina, EMMPRIN/CD147, TIM-1, EphB6, TIM-2, Fas/TNFRSF6, TIM-3, Fas Ligand/TNFSF6, TIM-4, Fcy RIII/CD16, TIM-6, TNFR1/TNFRSF1A, Granulysin, TNF RIII/TNFRSF1B, TRAIL RI/TNFRSFIOA, ICAM-1/CD54, TRAIL R2/TNFRSF10B, ICAM-2/CD102, TRAILR3/TNFRSF10C,IFN-yR1, TRAILR4/TNFRSF10D, IFN-y R2, TSLP, IL-1 R1 y TSLP R. En varias realizaciones, una fracción dirigida de la proteína quimérica se une a uno o más de estos antígenos de células T ilustrativos.

A modo de ejemplo no limitante, en varias realizaciones, la presente proteína quimérica tiene una fracción dirigida dirigida contra un marcador de punto de control expresado en una célula T, por ejemplo, uno o más de PD-1, CD28, CTLA4, ICOS, BTLA, KIR, LAG3, CD137, OX40, CD27, CD40L, TIM3 y A2aR.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) asociada a las células B. En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento reclutan directa o indirectamente a las células B, por ejemplo, en algunas realizaciones, a un sitio terapéutico (por ejemplo, un locus con una o más células de la enfermedad o célula a ser modulada para un efecto terapéutico). Los antígenos de células B ilustrativos de interés incluyen, por ejemplo, CD10, CD19, _cD20, CD21, CD22, C_d23, C_d24, CD37, CD38, CD39, CD40, CD70, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CD78, CD79a/b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD89, CD98, CD126, CD127, CDw130, CD138, CDw150 y antígeno de maduración de células B (BCMA). En varias realizaciones, una fracción dirigida de la proteína quimérica se une a uno o más de estos antígenos de células B ilustrativos.

A modo de ejemplo adicional, en algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) asociada a las células asesinas naturales. En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento reclutan directa o indirectamente a las células asesinas naturales, por ejemplo, en algunas realizaciones, a un sitio terapéutico (por ejemplo, un locus con una o más células de la enfermedad o célula a ser modulada para un efecto terapéutico). Los antígenos de interés de las células asesinas naturales incluyen, por ejemplo, TIGIT, 2B4/SLAMF4, KIR2DS4, CD155/PVR, KIR3DL1, CD94, LMIR1/CD300A, CD69, LMIR2/CD300c, CRACC/SLAMF7, LMIR3/CD300LF, DNAM-1, LMIR5/CD300LB, Fc-epsilon RII, LMIR6/CD300LE, Fc-y RI/CD64, MICA, Fc-y RIIB/CD32b, MICB, Fc-y RIIC/CD32c, MULT-1, Fc-y RIIA/CD32a, Nectin-2/CD112, Fc-y RIII/CD16, NKG2A, FcRH1/IRTA5, NKG2C, FcRH2/IRTA4, NKG2D, FcRH4/IRTA1, NKp30, FcRH5/IRTA2, NKp44, Fc-tipo receptor 3/CD16-2, NKp46/NCR1, NKp80/KLRF1, NTB-A/SLAMF6, Rae-1, Rae-1 a, Rae-1 p, Rae-1 delta, H60, Rae-1 epsilon, ILT2/CD85j, Rae-1 _y, ILT3/CD85k, TREM-1, ILT4/CD85d, TREM-2, ILT5/CD85a, TREM-3, KIR/CD158, TREML1/TLT-1, KIR2DL1, ULBP-1, KIR2DL3, ULBP-2, KIR2DL4/CD158d y ULBP-3. En varias realizaciones, una fracción dirigida de la proteína quimérica se une a uno o más de estos antígenos ilustrativos de células NK.

Además, en algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) asociada a los macrófagos/monocitos. En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento reclutan directa o indirectamente a los macrófagos/monocitos, por ejemplo, en algunas realizaciones, a un sitio terapéutico (por ejemplo, un locus con una o más células de la enfermedad o célula a ser modulada para un efecto terapéutico). Los antígenos ilustrativos de macrófagos/monocitos de interés incluyen, por ejemplo, SIRPIa, B7-1/CD80, ILT4/CD85d, B7-H1, ILT5/CD85a, Cadena p común, Integrina a 4/CD49d, BLAME/SLAMF8, Integrina a X/CDIIc, CCL6/C10, Integrina p 2/CD18, CD155/PVR, Integrina p 3/CD61, CD31/PECAM-1, Latexina, CD36/SR-B3, Leucotrieno B4 R1, CD40/TNFRSF5, LIMPIIISR-B2, CD43, LMIR1/CD300A, CD45, LMIR2/CD300c, CD68, LMIR3/CD300LF, CD84/SLAMF5, LMIR5/CD300LB, CD97, LMIR6/CD300LE, CD163, LRP-1, CD2F-10/SLAMF9, MARCO, CRACC/SLAMF7, MD-1, ECF-L, MD-2, EMMPRIN/CD147, MGL2, Endoglina/CD105, Osteoactivina/GPNMB, Fc-y RI/CD64, Osteopontina, F^c-^y RIIB/CD32b, PD-L2, Fc-y RIIC/CD32c, Siglec-3/CD33, Fc-Y RIIA/CD32a, SIGNR1/CD209, Fc-y RIII/CD16, SLAM, GM-CSF R a, TCCR/WSX-1, ICAM-2/CD102, TLR3, IFN-y RI, TLR4, IFN-gannna R2, TREM-I, IL-I RII, TREM-2, ILT2/CD85j, TREM-3, ILT3/CD85k, TREML1/TLT-1, 2B4/SLAMF 4, IL-10 R a, ALCAM, IL-10 R p, Aminopeptidasa N/ANPEP, ILT2/CD85j, Cadena p común, ILT3/CD85k, Clq R1/CD93, ILT4/CD85d, CCR1, ILT5/CD85a, CCR2, Integrina a 4/CD49d, CCR5, Integrina a M/CDII b, CCR8, Integrina a X/CDIIc, CD155/PVR, Integrina p 2/CD18, CD14, Integrina p 3/CD61, CD36/SR-B3, LAIR1, CD43, LAIR2, CD45, Leucotrieno B4-R1, CD68, LIMPIIISR-B2, CD84/SLAMF5, LMIR1/CD300A, CD97, LMIR2/CD300c, LMIR3/CD300LF, factor de coagulación III/factor tisular, LMIR5/CD300LB, CX3CR1, CX3CL1, LMIR6/CD300LE, CXCR4, LRP-1, CXCR6, M-CSF R, DEP-1/CD148, MD-1, DNAM-1, MD-2, EMMPRIN/CD147, MMR, Endoglin/CD105, NCAM-L1, Fcy RI/CD64, PSGL-1, Fc-y RIIIICD16, RP105, G-CSF R, L-Selectina, GM-CSF R a, Siglec-3/CD33, HVEM/TNFRSF14, SLAM, ICAM-1/CD54, TCCR/WSX-1, ICAM-2/CD102, TREM-I, IL-6 R, TREM-2, CXCRI/IL-8 RA, TREM-3 y TREMLI/TLT-1. En varias realizaciones, una fracción dirigida de la proteína quimérica se une a uno o más de estos antígenos ilustrativos de macrófagos/monocitos.

Además, en algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) asociada a las células dendríticas. En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento reclutan directa o indirectamente a las células dendríticas, por ejemplo, en algunas realizaciones, a un sitio terapéutico (por ejemplo, un locus con una o más células de la enfermedad o célula a ser modulada para un efecto terapéutico). Los antígenos ilustrativos de células dendríticas de interés incluyen, por ejemplo, CLEC9A, XCR1, RANK, CD36/SRB3, LOX-1/SR-E1, CD68, MARCO, CD163, SR-A1/MSR, CD5L, SREC-1, CL-PI/COLEC12, SREC-II, LIMPIIISRB2, RP105, TLR4, TLR1, TLR5, TLR2, TLR6, TLR3, TLR9, Ligando 4-IBB/TNFSF9, IL-12/IL-23 p40, 4-Amino-1,8-naftalimida, ILT2/CD85j, CCL21/6Ckine, ILT3/CD85k, 8-oxo-dG, ILT4/CD85d, 8D6A, ILT5/CD85a, A2B5, lutegrina a 4/CD49d, Aag, Integrina p 2/CD18, AMICA, Langerina, B7-2/CD86, Leucotrieno B4 RI, B7-H3, LMIR1/CD300A, BLAME/SLAMF8, LMIR2/CD300c, Clq R1/CD93, LMIR3/CD300LF, CCR6, LMIR5/CD300LB CCR7, LMIR6/CD300LE, CD40/TNFRSF5, MAG/Siglec-4-a, CD43, MCAM, CD45, MD-1, CD68, MD-2, CD83, MDL-1/CLEC5A, CD84/SLAMF5, MMR, CD97, NCAMLI, CD2F-10/SLAMF9, Osteoactivina GPNMB, Chern 23, PD-L2, CLEC-1, RP105, CLEC-2, CLEC-8, Siglec-2/CD22, CRACC/SLAMF7, Siglec-3/CD33, DC-SIGN, Siglec-5, DC-SIGNR/CD299, Siglec-6, DCAR, Siglec-7, DCIR/CLEC4A, Siglec-9, DEC-205, Siglec-10, Dectina-1/CLEC7A, Siglec-F, Dectina-2/CLEC6A, SIGNR1/CD209, DEP-1/CD148, SIGNR4, DLEC, SLAM, EMMPRIN/CD147, TCCR/WSX-1, F^cy R1/CD64, TLR3, Fc-y RIIB/CD32b, TREM-1, Fc-Y RIIC/CD32c, TREM-2, Fc-y RIIA/CD32a, TREM-3, Fc-Y RIII/CD16, TREML1/TLT-1, ICAM-2/CD102 y Vanilloid R1. En varias realizaciones, una fracción dirigida de la proteína quimérica se une a uno o más de estos antígenos ilustrativos de DC.

En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) en células inmunitarias seleccionadas entre, pero no limitadas a, megacariocitos, trombocitos, eritrocitos, mastocitos, basófilos, neutrófilos, eosinófilos o subconjuntos de los mismos. En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento reclutan directa o indirectamente megacariocitos, trombocitos, eritrocitos, mastocitos, basófilos, neutrófilos, eosinófilos, o subconjuntos de los mismos, por ejemplo, en algunas realizaciones, a un sitio terapéutico (por ejemplo, un locus con una o más células de la enfermedad o célula a modular para un efecto terapéutico).

En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) asociada a los megacariocitos y/o trombocitos. Los antígenos megacariocíticos y/o trombocitarios ilustrativos de interés incluyen, por ejemplo, GP Ilb/Illa, GPIb, vWF, PF4 y TSP. En varias realizaciones, una fracción dirigida de la proteína quimérica se une a uno o más de estos antígenos ilustrativos de megacariocitos y/o trombocitos.

En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) asociada a los eritrocitos. Los antígenos eritrocitarios ilustrativos de interés incluyen, por ejemplo, el c D34, el CD36, el CD38, el CD41a (glicoproteína plaquetaria Ilb/Illa), el CD41b (GPllb), el c D71 (receptor de transferrina), el CD105, la glicoforina A, la glicoforina C, el c-kit, el H^lA-DR, el H2 (MHC-II) y los antígenos Rhesus. En varias realizaciones, una fracción dirigida de la proteína quimérica se une a uno o más de estos antígenos eritrocitarios ilustrativos.

En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) asociada a los mastocitos. Los antígenos de mastocitos ilustrativos de interés incluyen, por ejemplo, SCFR/CD117, FceRI, CD2, CD25, CD35, CD88, CD203c, C5R1, CMAI, FCERIA, FCER2, TPSABI. En varias realizaciones, una fracción dirigida de la proteína quimérica se une a uno o más de estos antígenos de mastocitos.

En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) asociada a los basófilos. Los antígenos ilustrativos de los basófilos de interés incluyen, por ejemplo, FceRI, CD203c, CD123, CD13, CD107a, CD107b y CD164. En varias realizaciones, una fracción dirigida de la proteína quimérica se une a uno o más de estos antígenos de los basófilos.

En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) asociada a los neutrófilos. Los antígenos ilustrativos de interés de los neutrófilos incluyen, por ejemplo, 7D5, CD10/CALLA, CD13, CD16 (FcRIII), proteínas CD18 (LFA-1, CR3 y p150, 95), CD45, CD67 y CD177. En varias realizaciones, una fracción dirigida de la proteína quimérica se une a uno o más de estos antígenos de neutrófilos.

En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) asociada a los eosinófilos. Los antígenos de interés de los eosinófilos incluyen, por ejemplo, CD35, CD44 y CD69. En varias realizaciones, una fracción dirigida de la proteína quimérica se une a uno o más de estos antígenos de eosinófilos.

En varias realizaciones, el dominio de reconocimiento puede unirse a cualquier diana, antígeno, receptor o marcador de superficie celular apropiado conocido por el experto en la materia. En algunas realizaciones, el antígeno o marcador de superficie celular es un marcador específico de tejido. Los marcadores ilustrativos específicos de tejido incluyen, pero no se limitan a, marcadores de superficie de células endoteliales como ACE, CD14, CD34, CDH5, ENG, ICAM2, MCAM, NOS3, PECAMI, PROCR, SELE, SELP, TEK, THBD, VCAMI, VWF; marcadores de superficie de células de músculo liso como ACTA2, MYHIO, MYHI 1, MYH9, MYOCD; marcadores de superficie de células de fibroblastos (estroma) como ALCAM, CD34, COLIAI, COL1A2, COL3A1, FAP, PH-4; marcadores de superficie de células epiteliales como CDID, K6IRS2, KRTIO, KRT13, KRT17, KRT18, KRT19, KRT4, KRT5, KRT8, MUCI, TACSTDI; marcadores de neovasculatura como CD13, TFNA, Alfa-v beta-3 (avp3), E-selectina; y marcadores de superficie de adipocitos como ADIPOQ, FABP4 y RETN. En varias realizaciones, una fracción dirigida de la proteína quimérica se une a uno o más de estos antígenos. En varias realizaciones, una fracción dirigida de la proteína quimérica se une a una o más de las células que tienen estos antígenos.

En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) asociada a las células tumorales. En algunas realizaciones, los dominios de reconocimiento reclutan directa o indirectamente células tumorales. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el reclutamiento directo o indirecto de la célula tumoral es a una o más células efectoras (por ejemplo, una célula inmune como se describe en el presente documento) que puede matar y/o suprimir la célula tumoral.

Las células tumorales, o células cancerosas, se refieren a un crecimiento incontrolado de células o tejidos y/o a un aumento anormal de la supervivencia celular y/o a la inhibición de la apoptosis que interfiere con el funcionamiento normal de los órganos y sistemas corporales. Por ejemplo, las células tumorales incluyen cánceres benignos y malignos, pólipos, hiperplasia, así como tumores latentes o micrometástasis. Las células tumorales ilustrativas incluyen, pero no se limitan a las células de: carcinoma de células basales, cáncer del tracto biliar; cáncer de vejiga; cáncer de hueso; cáncer de cerebro y del sistema nervioso central; cáncer de mama; cáncer de peritoneo; cáncer de cuello uterino; coriocarcinoma; cáncer de colon y recto; cáncer de tejido conectivo; cáncer del sistema digestivo cáncer de endometrio; cáncer de esófago; cáncer de ojo; cáncer de cabeza y cuello; cáncer gástrico (incluido el cáncer gastrointestinal); glioblastoma; carcinoma hepático; hepatoma; neoplasia intraepitelial; cáncer de riñón o renal; cáncer de laringe; leucemia; cáncer de hígado; cáncer de pulmón (por ej.g., cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón); melanoma; mieloma; neuroblastoma; cáncer de la cavidad oral (labio, lengua, boca y faringe); cáncer de ovario; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cáncer de recto; cáncer del sistema respiratorio; carcinoma de las glándulas salivales; sarcoma; cáncer de piel; cáncer de células escamosas; cáncer de estómago; cáncer de testículo; cáncer de tiroides; cáncer de útero o de endometrio; cáncer del aparato urinario; cáncer de vulva; linfoma, incluido el linfoma de Hodgkin y el linfoma no Hodgkin, así como el linfoma de células B (incluido el linfoma no Hodgkin (LNH) de bajo grado/folicular; linfoma linfocítico pequeño (LS); linfoma no Hodgkin de grado intermedio/folicular; linfoma no Hodgkin difuso de grado intermedio; linfoma no Hodgkin inmunoblástico de grado alto; linfoma no Hodgkin de células pequeñas de grado alto; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; la leucemia linfocítica crónica (LLC); la leucemia linfoblástica aguda (LLA); la leucemia de células pilosas; la leucemia mieloblástica crónica; así como otros carcinomas y sarcomas; y el trastorno linfoproliferativo postrasplante (TLP), así como la proliferación vascular anormal asociada a las facomatosis, el edema (por ej.g., el asociado a los tumores cerebrales) y el síndrome de Meigs.

Las células tumorales, o células cancerosas también incluyen, pero no se limitan a, carcinomas, por ejemplo, varios subtipos, incluyendo, por ejemplo, adenocarcinoma, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas y carcinoma de células transicionales), sarcomas (incluyendo, por ejemplo, hueso y tejido blando), leucemias (incluyendo, por ejemplo, mieloide aguda, linfoblástica aguda mieloide crónica, linfocítica crónica y de células pilosas), linfomas y mielomas (incluidos, por ejemplo, los linfomas Hodgkin y no Hodgkin, de cadena ligera, no secretores, MGUS y plasmocitomas) y cánceres del sistema nervioso central (incluidos, por ejemplo, los cerebrales (e.p.ej., gliomas (p.ej, astrocitoma, oligodendroglioma y ependimoma), meningioma, adenoma hipofisario y neuromas, y tumores de la médula espinal(por ejemplo, meningiomas y neurofibroma).

Los antígenos tumorales ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, MART-1 /Melan-A, gp100, Dipeptidyl peptidase IV (DPPIV), proteína de unión a la adenosina deaminasa (ADAbp), ciclofilina b, antígeno asociado al colorrectal (CRC)-0017-1A/GA733, Antígeno carcinoembrionario (CEA) y sus epítopos inmunogénicos CAP-1 y CAP-2, etv6, aml1, antígeno específico de la próstata (PSA) y sus epítopos inmunogénicos PSA-1, PSA-2 y PSA-3, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), receptor de células T/cadena CD3-zeta, antígenos tumorales de la familia MAGE (por ejemplog., MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), antígenos tumorales de la familia GAGE (por ejemplog., GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinasa, p53, familia MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, afetoproteína, E-cadherina, a-catenina, p-catenina e y-catenina, p120ctn, gp100 Pmel117, _pR_aME, NY-ESO-1, cdc27, proteína de poliposis adenomatosa coli (APC), fodrina, anexina 37, Ig-idiotipo, p15, gp75, Gangliósidos GM2 y GD2, productos virales como las proteínas del virus del papiloma humano, antígenos tumorales de la familia Smad, Imp-1, N_a , antígeno nuclear codificado por el VEB (EBNA)-1, glucógeno fosforilasa cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 CT-7, c-erbB-2, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD56, CD70, CD74, CD138, AGS16, MUC1 , GPNMB, Ep-CAM, PD-L1, PD-L2 y PMSA. En varias realizaciones, una fracción dirigida de la proteína quimérica se une a uno o más de estos antígenos tumorales.

En varias realizaciones, las proteínas quiméricas de la invención tienen fracciones dirigidas que tienen dominios de reconocimiento que se unen específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) que es parte de una estructura no celular. En algunas realizaciones, el antígeno o receptor no es un componente integral de una célula o estructura celular intacta. En algunas realizaciones, el antígeno o receptor es un antígeno o receptor extracelular. En algunas realizaciones, la diana es un marcador no proteico, no celular, incluyendo, sin limitación, ácidos nucleicos, incluyendo ADN o ARN, como, por ejemplo, ADN liberado de células tumorales necróticas o depósitos extracelulares como el colesterol.

En algunas realizaciones, la diana (por ejemplo, antígeno, receptor) de interés forma parte del componente no celular del estroma o de la matriz extracelular (ECM) o de los marcadores asociados a ella. Como se utiliza en la presente memoria, el estroma se refiere al marco conectivo y de apoyo de un tejido u órgano. El estroma puede incluir una compilación de células como fibroblastos/miofibroblastos, células gliales, epiteliales, grasas, inmunitarias, vasculares, de músculo liso e inmunitarias, junto con la matriz extracelular (MEC) y las moléculas extracelulares. En varias realizaciones, la diana (por ejemplo, antígeno, receptor) de interés forma parte del componente no celular del estroma, como la matriz extracelular y las moléculas extracelulares. Como se utiliza en la presente memoria, la MEC se refiere a los componentes no celulares presentes en todos los tejidos y órganos. La MEC está compuesta por una gran colección de componentes bioquímicamente distintos que incluyen, sin limitación, proteínas, glicoproteínas, proteoglicanos y polisacáridos. Estos componentes de la MEC suelen ser producidos por las células adyacentes y secretados en la MEC a través de la exocitosis. Una vez secretados, los componentes de la MEC suelen agregarse para formar una compleja red de macromoléculas. En varias realizaciones, la proteína quimérica de la invención comprende una fracción dirigida que reconoce una diana (por ejemplo, un antígeno o un receptor o una molécula no proteica) situada en cualquier componente de la MEC. Los componentes ilustrativos de la ECM incluyen, sin limitación, los proteoglicanos, los polisacáridos no proteoglicanos, las fibras y otras proteínas o no proteínas de la ECM, por ejemplo, polisacáridos y/o lípidos, o moléculas asociadas a la ECM (por ejemplo, proteínas o no proteínas, por ejemplo, polisacáridos, ácidos nucleicos y/o lípidos).

En algunas realizaciones, la fracción dirigida reconoce un diana (por ejemplo, antígeno, receptor) en los proteoglicanos de la MEC. Los proteoglicanos son proteínas glicosiladas. La unidad básica del proteoglicano incluye una proteína central con una o más cadenas de glicosaminoglicanos (GAG) unidas covalentemente. Los proteoglicanos tienen una carga neta negativa que atrae a los iones de sodio (Na+) con carga positiva, lo que atrae a las moléculas de agua por ósmosis, manteniendo la MEC y las células residentes hidratadas. Los proteoglicanos también pueden ayudar a atrapar y almacenar factores de crecimiento dentro de la MEC. Los proteoglicanos ilustrativos a los que pueden dirigirse las proteínas quiméricas de la invención incluyen, entre otros, el heparán sulfato, el condroitín sulfato y el queratán sulfato. En una realización, la fracción dirigida reconoce una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) en polisacáridos no proteoglicanos como el ácido hialurónico.

En algunas realizaciones, la fracción dirigida reconoce una diana (por ejemplo, antígeno, receptor) en las fibras ECM. Las fibras ECM incluyen fibras de colágeno y fibras de elastina. En algunas realizaciones, la fracción dirigida reconoce uno o más epítopos en colágenos o fibras de colágeno. Los colágenos son las proteínas más abundantes de la MEC. Los colágenos están presentes en la MEC en forma de proteínas fibrilares y proporcionan soporte estructural a las células residentes. En una o más realizaciones, la fracción dirigida reconoce y se une a varios tipos de colágenos presentes en la MEC, incluyendo, sin limitación, colágenos fibrilares (tipos I, II, III, V, XI), colágenos faciales (tipos IX, XII, XIV), colágenos de cadena corta (tipos VIII, X), colágenos de la membrana basal (tipo IV), y/o colágeno de tipo VI, VII o XIII. Las fibras de elastina proporcionan elasticidad a los tejidos, permitiéndoles estirarse cuando lo necesitan y volver a su estado original. En algunas realizaciones, la fracción diana reconoce uno o más epítopos en las elastinas o fibras de elastina.

En algunas realizaciones, la fracción dirigida reconoce una o más proteínas de la MEC, incluyendo, pero sin limitarse a, una tenascina, una fibronectina, una fibrina, una laminina o un nidógeno/entactina.

En una realización, la fracción dirigida reconoce y se une a la tenascina. La familia de glicoproteínas tenascina (TN) incluye al menos cuatro miembros, la tenascina-C, la tenascina-R, la tenascina-X y la tenascina W. Las estructuras primarias de las proteínas tenascina incluyen varios motivos comunes ordenados en la misma secuencia consecutiva: repeticiones aminoterminales de la heptada, repeticiones similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF), repeticiones del dominio de fibronectina tipo III y un dominio globular similar al carboxilo-terminal del fibrinógeno. Cada miembro de la proteína se asocia con variaciones típicas en el número y la naturaleza de las repeticiones de tipo EGF y fibronectina tipo III. También existen variantes de isoformas, en particular con respecto a la tenascina-C. Se conocen más de 27 variantes de empalme y/o isoformas de la tenascina-C. En una realización particular, la fracción dirigida reconoce y se une a la tenascina-CA1. Del mismo modo, la tenascina-R también presenta diversas variantes de empalme e isoformas. La tenascina-R suele existir en forma de dímeros o trímeros. La tenascina-X es el miembro más grande de la familia de la tenascina y se sabe que existe en forma de trímeros. La tenascina-W existe en forma de trímero. En algunas realizaciones, la fracción dirigida reconoce uno o más epítopos en una proteína tenascina. En algunas realizaciones, la fracción dirigida reconoce las formas monomérica y/o dimérica y/o trimérica y/o hexamérica de una proteína tenascina.

En una realización, las fracciones dirigidas reconocen y se unen a la fibronectina. Las fibronectinas son glicoproteínas que conectan las células con las fibras de colágeno en la MEC, permitiendo que las células se muevan a través de la MEC. Al unirse a las integrinas, las fibronectinas se desdoblan para formar dímeros funcionales. En algunas realizaciones, la fracción dirigida reconoce las formas monoméricas y/o diméricas de la fibronectina. En algunas realizaciones, la fracción dirigida reconoce uno o más epítopos de la fibronectina. En realizaciones ilustrativas, la fracción dirigida reconoce el dominio extracelular A (EDA) de la fibronectina o el dominio extracelular B (EDB) de la fibronectina. Los niveles elevados de EDA se asocian a diversas enfermedades y trastornos, como la psoriasis, la artritis reumatoide, la diabetes y el cáncer. En algunas realizaciones, la fracción dirigida reconoce la fibronectina que contiene la isoforma EDA y puede utilizarse para dirigir la proteína quimérica a las células enfermas, incluidas las células cancerosas. En algunas realizaciones, la fracción dirigida reconoce la fibronectina que contiene la isoforma EDB. En varias realizaciones, dichas fracciones dirigidas pueden utilizarse para dirigir la proteína quimérica a las células tumorales, incluida la neovasculatura del tumor.

En una realización, la fracción dirigida reconoce y se une a la fibrina. La fibrina es otra sustancia proteica que se encuentra a menudo en la red de la matriz de la MEC. La fibrina se forma por la acción de la proteasa trombina sobre el fibrinógeno, que hace que la fibrina se polimerice. En algunas realizaciones, la fracción dirigida reconoce uno o más epítopos de la fibrina. En algunas realizaciones, la fracción dirigida reconoce las formas monoméricas y polimerizadas de la fibrina.

En una realización, la fracción dirigida reconoce y se une a la laminina. La laminina es un componente principal de la lámina basal, que es una red proteica que sirve de base a las células y los órganos. Las lamininas son proteínas heterotriméricas que contienen una cadena a, una cadena p y una cadena Y. En algunas realizaciones, la fracción dirigida reconoce uno o más epítopos de la laminina. En algunas realizaciones, la fracción dirigida reconoce las formas monoméricas, diméricas y triméricas de la laminina.

En una realización, la fracción dirigida reconoce y se une a un nidógeno o entactina. Los nidógenos/entactinas son una familia de glicoproteínas sulfatadas muy conservadas. Constituyen el principal componente estructural de las membranas basales y tienen la función de unir las redes de laminina y colágeno IV en las membranas basales. Los miembros de esta familia son el nidógeno-1 y el nidógeno-2. En varias realizaciones, la fracción dirigida reconoce un epítopo en el nidógeno-1 y/o el nidógeno-2.

En varias realizaciones, la fracción dirigida comprende un dominio de reconocimiento de antígeno que reconoce un epítopo presente en cualquiera de las dianas (por ejemplo, proteínas ECM) descritas en el presente documento. En una realización, el dominio de reconocimiento de antígeno reconoce uno o más epítopos lineales presentes en la proteína. Como se utiliza en la presente memoria, un epítopo lineal se refiere a cualquier secuencia continua de aminoácidos presente en la proteína. En otra realización, el dominio de reconocimiento de antígeno reconoce uno o más epítopos conformacionales presentes en la proteína. Como se utiliza en la presente memoria, un epítopo de conformación se refiere a una o más secciones de aminoácidos (que pueden ser discontinuas) que forman una superficie tridimensional con características y/o formas y/o estructuras terciarias capaces de ser reconocidas por un dominio de reconocimiento de antígenos.

En varias realizaciones, la fracción dirigida puede unirse a la longitud completa y/o formas maduras y/o isotermas y/o variantes de empalme y/o fragmentos y/o cualquier otro análogo, variante o mutante natural o sintético de cualquiera de las dianas (por ejemplo, proteínas ECM) descritas en el presente documento. En varias realizaciones, la fracción dirigida puede unirse a cualquier forma de las proteínas descritas en el presente documento, incluidas las formas monoméricas, diméricas, triméricas, tetraméricas, heterodiméricas, multiméricas y asociadas. En varias realizaciones, la fracción dirigida puede unirse a cualquier forma modificada postraduccionalmente de las proteínas descritas en el presente documento, como las formas glicosiladas y/o fosforiladas.

En varias realizaciones, la fracción dirigida comprende un dominio de reconocimiento de antígeno que reconoce moléculas extracelulares como el ADN. En algunas realizaciones, la fracción dirigida comprende un dominio de reconocimiento de antígeno que reconoce el ADN. En una realización, el ADN se desprende en el espacio extracelular de las células tumorales necróticas o apoptóticas u otras células enfermas.

En varias realizaciones, la fracción dirigida comprende un dominio de reconocimiento de antígeno que reconoce una o más estructuras no celulares asociadas con las placas ateroscleróticas. Se conocen dos tipos de placas ateroscleróticas. La placa fibrolipídica (fibrograsa) se caracteriza por una acumulación de células cargadas de lípidos bajo la íntima de las arterias. Debajo del endotelio hay una capa fibrosa que cubre el núcleo ateromatoso de la placa. El núcleo incluye células cargadas de lípidos (macrófagos y células musculares lisas) con un elevado contenido de colesterol tisular y ésteres de colesterol, fibrina, proteoglicanos, colágeno, elastina y restos celulares. En las placas avanzadas, el núcleo central de la placa suele contener depósitos de colesterol extracelular (liberado por las células muertas), que forman zonas de cristales de colesterol con hendiduras vacías en forma de aguja. En la periferia de la placa hay células espumosas más jóvenes y capilares. También se localiza una placa fibrosa bajo la íntima, dentro de la pared de la arteria, lo que da lugar a un engrosamiento y expansión de la pared y, a veces, a un estrechamiento localizado de la luz con cierta atrofia de la capa muscular. La placa fibrosa contiene fibras de colágeno (eosinófilas), precipitados de calcio (hematoxilinófilos) y células cargadas de lípidos. En algunas realizaciones, la fracción dirigida reconoce y se une a uno o más de los componentes no celulares de estas placas, como la fibrina, los proteoglicanos, el colágeno, la elastina, los restos celulares y el calcio u otros depósitos o precipitados minerales. En algunas realizaciones, el residuo celular es un ácido nucleico, por ejemplo, ADN o ARN, liberado de las células muertas.

En varias realizaciones, la fracción dirigida comprende un dominio de reconocimiento de antígeno que reconoce una o más estructuras no celulares que se encuentran en las placas cerebrales asociadas con las enfermedades neurodegenerativas. En algunas realizaciones, la fracción dirigida reconoce y se une a una o más estructuras no celulares localizadas en las placas amiloides que se encuentran en el cerebro de los pacientes con la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, la fracción dirigida puede reconocer y unirse al péptido beta amiloide, que es un componente principal de las placas amiloides. En algunas realizaciones, la fracción dirigida reconoce y se une a una o más estructuras no celulares localizadas en las placas cerebrales encontradas en pacientes con la enfermedad de Huntington. En varias realizaciones, la fracción dirigida reconoce y se une a una o más estructuras no celulares que se encuentran en las placas asociadas a otras enfermedades neurodegenerativas o musculoesqueléticas, como la demencia con cuerpos de Lewy y la miositis con cuerpos de inclusión.

En algunas realizaciones, la presente proteína quimérica comprende dos o más fracciones dirigidas. En algunas realizaciones, la presente proteína quimérica tiene (i) una o más fracciones dirigidas contra una célula inmunitaria seleccionada entre una célula T, una célula B, una célula dendrítica, un macrófago, una célula NK, o subconjuntos de las mismas y (ii) una o más fracciones dirigidas contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado). En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida contra una célula T (incluyendo, sin limitación, una célula T efectora) y (ii) una fracción dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados(por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado). En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida contra una célula B y (ii) una fracción dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado). En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida contra una célula dendrítica y (ii) una fracción dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado). En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida contra un macrófago y (ii) una fracción dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado). En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida contra una célula NK y (ii) una fracción dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado).

A modo de ejemplo no limitante, en diversas realizaciones, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra una célula T, por ejemplo, mediada por la orientación a CD8, SLAMF4, IL-2 R a, 4-1 BB/TNFRSF9, IL-2 R p, ALCAM, B7-1, IL-4 R, B7-H3, BLAME/SLAMFS, CEACAM1, IL-6 R, CCR3, IL-7 Ra, CCR4, CXCRI/IL-S RA, CCR5, CCR6, IL-10R a, CCR 7, IL-I 0 R p, CCRS, IL-12 R p 1, CCR9, IL-12 R p 2, CD2, IL-13 R a 1, IL-13, CD3, CD4, ILT2/CDS5j, ILT3/CDS5k, ILT4/CDS5d, ILT5/CDS5a, lutegrina a 4/CD49d, CDS, Integrina a E/CD103, CD6, Integrina a M/CD 11 b, CDS, Integrina a X/CD11c, Integrina p 2/CDIS, KIR/CD15S, CD27/TNFRSF7, KIR2DL1, CD2S, KIR2DL3, CD30/TNFRSFS, KIR2DL4/CD15Sd, CD31/PECAM-1, KIR2DS4, Ligando CD40/TNFSF5, LAG-3, CD43, LAIR1, CD45, LAIR2, CDS3, Leucotrieno B4-R1, CDS4/SLAMF5, NCAM-L1, CD94, NKG2A, CD97, NKG2C, CD229/SLAMF3, NKG2D, CD2F-10/SLAMF9, NT-4, CD69, NTB-A/SLAMF6, Cadena ^y/IL-2 R ^y, Osteopontina, CRACC/SLAMF7, PD-1, CRTAM, PSGL-1, CTLA-4, RANK/TNFRSF11A, CX3CR1, CX3CL1, L-Selectina, CXCR3, SIRP p 1, CXCR4, SLAM, CXCR6, TCCR/WSX-1, DNAM-1, Timopoyetina, EMMPRIN/CD147, TIM-1, EphB6, TIM-2, Fas/TNFRSF6, TIM-3, Ligando Fas/TNFSF6, TIM-4, Fcy RMI/CD16, TIM-6, TNFR1/TNFRSF1A, Granulysin, TNF RIII/TNFRSF1B, TRAIL RI/TNFRSFIOA, ICAM-1/CD54, TRAIL R2/TNFRSF10B, ICAM-2/CD102, TRAILR3/TNFRSF10C,IFN-yR1, TRAILR4/TNFRSF10D, IFN-y R2, TSLP, IL-1 R1, o TSLP R; y (ii) una fracción dirigida se dirige contra una célula tumoral, junto con cualquiera de las células modificadas (por ejemplog., mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado).

A modo de ejemplo no limitante, en varias realizaciones, la presente proteína quimérica tiene una fracción dirigida dirigida contra (i) un marcador de punto de control expresado en una célula T, por ejemplo uno o más de PD-1, CD28, CTLA4, ICOS, BTLA, KIR, LAG3, CD137, OX40, Cd27, CD40L, TIM3 y A2aR y (ii) una fracción dirigida dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado).

En varias realizaciones, la presente proteína quimérica tiene una o más fracciones dirigidas contra PD-1. En algunas realizaciones, la proteína quimérica tiene uno o más fracciones dirigidas que se unen selectivamente a un polipéptido PD-1. En algunas realizaciones, la proteína quimérica comprende uno o más anticuerpos, derivados o formatos de anticuerpos, péptidos o polipéptidos, o proteínas de fusión que se unen selectivamente a un polipéptido PD-1.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-1 pembrolizumab (también conocido como MK-3475, KEYTRUDA), o fragmentos del mismo. El pembrolizumab y otros anticuerpos humanizados anti-PD-1 se divulgan por Hamid, et al. (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134­ 44, documentos US 8.354.509 y WO 2009/114335. En realizaciones ilustrativas, el pembrolizumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de: SEQ ID NO: 63; y/o una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-1, nivolumab (también conocido como BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538, OPDIVO), o fragmentos del mismo. El nivolumab (clon 5C4) y otros anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a PD-1 se divulgan en los documentos US 8.008.449 y Wo 2006/121168. En realizaciones ilustrativas, el nivolumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; y/o una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-1 pidilizumab (también conocido como CT-011, hBAT o hBAT-1), o fragmentos del mismo. El pidilizumab y otros anticuerpos monoclonales humanizados anti-PD-I se divulgan en los documentos US 2008/0025980 y WO 2009/101611. En realizaciones ilustrativas, el anticuerpo anti-PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 15-18 del documento US 2008/0025980: SEQ ID NO: 15 del documento US 2008/0025980 (SEQ ID NO: 67); SEQ ID NO: 16 del documento US 2008/0025980 (SEQ ID NO: 68); SEQ ID NO: 17 del documento US 2008/0025980 (SEQ ID NO: 69); SEQ ID NO: 18 del documento US 2008/0025980 (SEQ ID NO: 70); y/o una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NO: 20-24 del documento US 2008/0025980: SEQ ID NO: 20 del documento US 2008/0025980 (SEQ ID NO: 71); SEQ ID NO: 21 del documento US 2008/0025980 (SEQ ID NO: 72); SEQ ID NO: 22 del documento US 2008/0025980 (SEQ ID NO: 73); SEQ ID NO: 23 del documento US 2008/0025980 (SEQ ID NO: 74); SEQ ID NO: 24 del documento US 2008/0025980 (SEQ ID NO: 75).

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado de una cadena ligera que comprende SEQ ID NO:18 del documento US 2008/0025980 y un derivado de una cadena pesada que comprende SEQ ID NO:22 del documento US 2008/0025980.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado de AMP-514 (también conocido como MEDI-0680). En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado de la proteína de fusión PD-L2-Fc AMP-224, que se divulga en los documentos WO2010/027827 y WO 2011/066342. En dicha realización, la fracción dirigida puede incluir un dominio de orientación que comprende la SEQ ID NO:4 del documento WO2010/027827 (SEQ ID NO: 76) y/o un derivado de la proteína de fusión B7-DC que comprende el SEQ ID NO:83 del documento WO2010/027827 (SEQ ID NO: 77).

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del péptido AUNP 12 o cualquiera de los otros péptidos divulgados en los documentos US 2011/0318373 o 8,907,053. Por ejemplo, la fracción dirigida puede comprender un derivado de AUNP 12 (es decir, el compuesto 8 o SEQ ID NO:49 del documento US 2011/0318373) que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 78:

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-1 1E3, o fragmentos del mismo, como se divulga en el documento US 2014/0044738. En las realizaciones ilustrativas, 1E3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79; y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-1 1E8, o fragmentos del mismo, como se divulga en el documento US 2014/0044738. En realizaciones ilustrativas, el 1E8 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81; y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-1 1H3, o fragmentos del mismo, como se divulga en el documento US 2014/0044738. En realizaciones ilustrativas, el 1H3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83; y/o la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado de un VHH dirigido contra PD-1 como se divulga, por ejemplo, en los documentos US 8,907,065 y WO 2008/071447. En realizaciones ilustrativas, los VHHs contra _pD-1 comprenden los SEQ ID NOs: 347-351 del documento US 8.907.065: SEQ ID NO: 347 del documento US 8.907.065 (SEQ ID NO: 85); SEQ ID NO: 348 del documento US 8,907,065 (SEQ ID NO: 86); SEQ ID NO: 349 del documento US 8.907.065 (SEQ ID NO: 87); SEQ ID NO: 350 del documento US 8,907,065 (SEQ ID NO: 88); SEQ ID NO: 351 del documento US 8.907.065 (SEQ ID NO: 89).

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado de cualquiera de los anticuerpos anti-PD-1, o fragmentos de los mismos, como se divulga en los documentos US2011/0271358 y WO2010/036959. En realizaciones ilustrativas, el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende un derivado de una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 25-29 del documento US 2011/0271358: SEQ ID NO: 25 del documento US 2011/0271358 (SEQ ID NO: 90); SEQ ID NO: 26 del documento US 2011/0271358 (SEQ ID NO: 91); SEQ ID NO: 27 del documento US 2011/0271358 (SEQ ID NO: 92); SEQ ID NO: 28 del documento US 2011/0271358 (SEQ ID NO: 93); SEQ ID NO: 29 del documento US 2011/0271358 (SEQ ID NO: 94); y/o un derivado de una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NO: 30-33 del documento US 2011/0271358: SEQ ID NO: 30 del documento US 2011/0271358 (SEQ ID NO: 95); SEQ ID NO: 31 del documento US 2011/0271358 (SEQ ID NO: 96); SEQ ID NO: 32 del documento US 2011/0271358 (SEQ ID NO: 97); SEQ ID NO: 33 del documento US 2011/0271358 (SEQ ID NO: 98).

En varias realizaciones, la presente proteína quimérica comprende un derivado de uno o más anticuerpos dirigidos contra PD-1, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, seleccionados de TSR-042 (Tesaro, Inc.), REGN2810 (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), PDR001 (Novartis Pharmaceuticals), y BGB-A317 (BeiGene Ltd.)

En varias realizaciones, la presente proteína quimérica tiene una o más fracciones dirigidas contra PD-L1. En algunas realizaciones, la proteína quimérica tiene uno o más fracciones dirigidas que se unen selectivamente a un polipéptido PD-L1. En algunas realizaciones, la proteína quimérica comprende uno o más anticuerpos, derivados o formatos de anticuerpos, péptidos o polipéptidos, o proteínas de fusión que se unen selectivamente a un polipéptido PD-L1. En diversas realizaciones, la presente proteína quimérica comprende una primera fracción dirigida que se une a PD-L1 con baja afinidad.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 MEDI4736 (también conocido como durvalumab), o fragmentos del mismo. MEDI4736 es selectivo para PD-L1 y bloquea la unión de PD-L1 a los receptores PD-1 y CD80. El MEDI4736 y los fragmentos de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos en la presente memoria previstos comprenden una cadena pesada y una cadena ligera o una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera. La secuencia de MEDI4736 se divulga en el documento WO/2016/06272. En las realizaciones ilustrativas, MEDI4736 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99; y/o una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100.

En realizaciones ilustrativas, el MEDI4736 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 del documento WO/2016/06272 (SEQ ID NO: 101) y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 del documento WO/2016/06272 (SEQ ID NO: 102).

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 atezolizumab (también conocido como MPDL3280A, RG7446), o fragmentos del mismo. En realizaciones ilustrativas, el atezolizumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; y/o una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 avelumab (también conocido como MSB0010718C), o fragmentos del mismo. En realizaciones ilustrativas, el avelumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y/o una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 BMS-936559 (también conocido como 12A4, MDX-1105), o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos US 2013/0309250 y WO2007/005874. En realizaciones ilustrativas, el BMS-936559 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 3G10, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos US 2013/0309250 y WO2007/005874. En realizaciones ilustrativas, el 3G10 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 10A5, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos US 2013/0309250 y WO2007/005874. En realizaciones ilustrativas, 10A5 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111) y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 5F8, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos US 2013/0309250 y WO2007/005874. En realizaciones ilustrativas, el 5F8 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 10H10, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos US 2013/0309250 y WO2007/005874. En realizaciones ilustrativas, la 10H10 o un fragmento de unión a antígeno de la misma para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 1B12, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos US 2013/0309250 y WO2007/005874. En realizaciones ilustrativas, el 1B12 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO: 116 y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 7H1, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos US 2013/0309250 y WO2007/005874. En las realizaciones ilustrativas, 7H1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 11E6, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos US 2013/0309250 y WO2007/005874. En las realizaciones ilustrativas, la 11E6 o un fragmento de unión a antígeno de la misma para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118 y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 12B7, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos US 2013/0309250 y WO2007/005874. En realizaciones ilustrativas, el 12B7 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120 y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 13G4, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos US 2013/0309250 y WO2007/005874. En realizaciones ilustrativas, el 13G4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122 y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 1E12, o fragmentos del mismo, como se divulga en el documento US 2014/0044738. En las realizaciones ilustrativas, 1E12 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 124 y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 1F4, o fragmentos del mismo, como se divulga en el documento US 2014/0044738. En realizaciones ilustrativas, el 1F4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 126 y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 2G11, o fragmentos del mismo, como se divulga en el documento US 2014/0044738. En realizaciones ilustrativas, el 2G11 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128 y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 3B6, o fragmentos del mismo, como se divulga en el documento US 2014/0044738. En realizaciones ilustrativas, el 3B6 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130 y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 3D10, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos US 2014/0044738 y WO2012/145493. En realizaciones ilustrativas, la 3D10 o un fragmento de unión a antígeno de la misma para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132 y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado de cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 divulgados en los documentos US2011/0271358 y WO2010/036959. En realizaciones ilustrativas, el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 34-38 del documento US2011/0271358: SEQ ID NO: 34 del documento US2011/0271358 (SEQ ID NO: 134); SEQ ID NO: 35 del documento US2011/0271358 (SEQ ID NO: 135); SEQ ID NO: 36 del documento US2011/0271358 (SEQ ID NO: 136); SEQ ID NO: 37 del documento US2011/0271358 (SEQ ID NO: 137); SEQ ID NO: 38 del documento US2011/0271358 (SEQ ID NO: 138); y/o una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NO: 39-42 del documento US2011/0271358: SEQ ID NO: 39 del documento US2011/0271358 (SEQ ID NO: 139); SEQ ID NO: 40 del documento US2011/0271358 (SEQ ID NO: 140); SEQ ID NO: 41 del documento US2011/0271358 (SEQ ID NO: 141); SEQ ID NO: 42 del documento US2011/0271358 (SEQ ID NO: 142):

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 2.7A4, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos WO 2011/066389, US8,779,108 y US2014/0356353. En realizaciones ilustrativas, el 2.7A4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de: ^s E^q ID NO: 2 del documento WO 2011/066389 (SEQ ID NO: 143) y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 del documento WO 2011/066389 (SEQ ID NO: 144).

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 2.9D10, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos WO 2011/066389, US8,779,108 y US2014/0356353. En realizaciones ilustrativas, el 2.9D10 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de: _sE_q ID NO: 12 del documento WO 2011/066389 (SEQ ID N_o: 145) y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 del documento WO 2011/066389 (SEQ ID NO: 146).

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 2.14H9, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos WO 2011/066389, US8,779,108 y US2014/0356353. En realizaciones ilustrativas, el 2.14H9 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 del documento WO 2011/066389 (SEQ _iD NO: 101) y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 del documento WO 2011/066389 (SEQ ID NO: 147).

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 2.20A8, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos WO 2011/066389, US8,779,108 y US2014/0356353. En realizaciones ilustrativas, el 2.20A8 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 del documento WO 2011/066389 (SEQ iD NO: 148) y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 del documento WO 2011/066389 (SEQ ID NO: 149).

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 3.15G8, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos WO 2011/066389, US8,779,108 y US2014/0356353. En realizaciones ilustrativas, el 3.15G8 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 del documento WO 2011/066389 (SEQ _iD NO: 908) y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 del documento WO 2011/066389 (SEQ ID NO: 150).

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 3.18G1, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos WO 2011/066389, US8,779,108 y US2014/0356353. En realizaciones ilustrativas, el 3.18G1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 del documento WO 2011/066389 (SEQ iD NO: 151) y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 del documento WO 2011/066389 (SEQ ID NO: 152).

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 2.7A4OPT, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos WO 2011/066389, U_s8,779,108 y US2014/0356353. En realizaciones ilustrativas, la 2.7A4OPT o un fragmento de unión a antígeno de la misma para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 del documento WO 2011/066389 (SEQ ID N_o : 153) y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 del documento WO 2011/066389 (SEQ ID NO: 154).

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado del anticuerpo anti-PD-L1 2.14H9OPT, o fragmentos del mismo, como se divulga en los documentos WO 2011/066389, US8,779,108y US2014/0356353. En realizaciones ilustrativas, la 2.14H9OPT o un fragmento de unión a antígeno de la misma para su uso en los procedimientos en la presente memoria proporcionados comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72 del documento WO 2011/066389 (SEQ ID N_o : 101) y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 del documento WO 2011/066389 (SEQ ID NO: 102).

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado de cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 divulgados en el documento WO2016/061142. En realizaciones ilustrativas, el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende un derivado de una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 18, 30, 38, 46, 50, 54, 62, 70 y 78 del documento WO2016/061142: SEQ ID NO: 18 del documento WO2016/061142 (SEQ ID NO: 155); SEQ ID NO: 30 del documento WO2016/061142 (SEQ ID NO: 156); SEQ ID NO: 38 del documento WO2016/061142 (SEQ ID NO: 157); SEQ ID NO: 46 del documento WO2016/061142 (SEQ ID NO: 158); SEQ ID NO: 50 del documento WO2016/061142 (SEQ ID NO: 159); SEQ ID NO: 54 del documento WO2016/061142 (SEQ ID NO: 160); SEQ ID NO: 62 del documento WO2016/061142: (SEQ ID NO: 161); SEQ ID NO: 70 del documento WO2016/061142 (SEQ ID NO: 162); SEQ ID NO: 78 del documento WO2016/061142 (SEQ ID NO: 163); y/o un derivado de una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NO: 22, 26, 34, 42, 58,66,74,82 y 86 del documento WO2016/061142: SEQ ID NO: 22 del documento WO 2016/061142 (SEQ ID NO: 164); SEQ ID NO: 26 del documento WO 2016/061142 (SEQ ID NO: 165); SEQ ID NO: 34 del documento WO 2016/061142 (SEQ ID NO: 166); SEQ ID NO: 42 del documento WO 2016/061142 (SEQ ID NO: 167); SEQ ID NO: 58 del documento WO 2016/061142 (SEQ ID NO: 168); SEQ ID NO: 66 del documento WO 2016/061142 (SEQ ID NO: 169); SEQ ID NO: 74 del documento WO 2016/061142 (SEQ ID NO: 170); SEQ ID NO: 82 del documento WO 2016/061142 (SEQ ID NO: 171) SEQ ID NO: 86 del documento WO 2016/061142 (SEQ ID NO: 172).

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado de cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 divulgados en el documento WO2016/022630. En realizaciones ilustrativas, el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende un derivado de una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 y 46 del documento WO2016/022630: SEQ ID NO: 2 del documento WO 2016/022630 (SEQ ID NO: 173); SEQ ID NO: 6 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 174); SEQ ID NO: 10 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 175); SEQ ID NO: 14 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 176); SEQ ID NO: 18 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 177); SEQ ID NO: 22 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 178); SEQ ID NO: 26 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 179); SEQ ID NO: 30 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 180); SEQ ID NO: 34 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 181); SEQ ID NO: 38 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 182); SEQ ID NO: 42 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 183); SEQ ID NO: 46 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 184); y/o un derivado de una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 y 48 del documento WO 2016/022630: SEQ ID NO: 4 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 185); SEQ ID NO: 8 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 186); SEQ ID NO:12 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 187); SEQ ID NO: 16 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 188); SEQ ID NO: 20 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 189); SEQ ID NO: 24 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 190); SEQ ID NO: 28 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 191); SEQ ID NO: 32 del documento WO2016/022630(SEQ ID NO: 192); SEQ ID NO: 36 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 193); SEQ ID NO: 40 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 194); SEQ ID NO: 44 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 195); SEQ ID NO: 48 del documento WO 2016/022630(SEQ ID NO: 196).

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado de cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 divulgados en el documento WO2015/112900. En realizaciones ilustrativas, el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende un derivado de una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 38, 50, 82 y 86 del documento WO 2015/112900: SEQ ID NO: 38 del documento WO 2015/112900 (SEQ ID NO: 197); SEQ ID NO: 50 del documento WO 2015/112900 (SEQ ID NO: 198); SEQ ID NO: 82 del documento WO 2015/112900 (SEQ ID NO: 199); SEQ ID NO: 86 del documento WO 2015/112900 (SEQ ID NO: 200); y/o un derivado de una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NO: 42, 46, 54, 58, 62, 66, 70, 74 y 78 del WO 2015/112900: SEQ ID NO: 42 del documento WO2015/112900 (SEQ ID NO: 201); SEQ ID NO: 46 del documento WO 2015/112900 (SEQ ID NO: 202); SEQ ID NO: 54 del documento WO 2015/112900 (SEQ ID NO: 203); SEQ ID NO: 58 del documento WO 2015/112900 (SEQ ID NO: 204); SEQ ID NO: 62 del documento WO 2015/112900 (SEQ ID NO: 205); SEQ ID NO: 66 del documento WO 2015/112900 (SEQ ID NO: 206); SEQ ID NO: 70 del documento WO 2015/112900 (SEQ ID NO: 207); SEQ ID NO: 74 del documento WO 2015/112900 (SEQ ID NO: 208); SEQ ID NO: 78 del documento WO 2015/112900 (SEQ ID NO: 209).

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado de cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 divulgados en los documentos WO 2010/077634 y US 8,217,149. En realizaciones ilustrativas, el anticuerpo anti-PD-L1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende un derivado de una región de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 del documento WO 2010/077634 (SEQ ID N_o: 210) y/o un derivado de una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 del documento WO 2010/077634 (SEQ ID NO: 211).

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado de cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 que se pueden obtener del hibridoma accesible bajo los números de depósito CNCM I-4122, CNCM I-4080 y CNCM I-4081 como se divulga en el documento US 20120039906.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado de un VHH dirigido contra PD-L1 como se divulga, por ejemplo, en los documentos US 8,907,065 y WO 2008/071447. En realizaciones ilustrativas, los VHHs contra PD-L1 comprenden los SEQ ID NOs: 394-399 del documento US 8.907.065: SEQ ID NO: 394 del documento US 8,907,065 (SEQ ID NO: 212); SEQ ID NO: 395 del documento US 8.907.065 (SEQ ID NO: 213); SEQ ID NO: 396 del documento US 8.907.065 (SEQ ID NO: 214); SEQ ID NO: 397 del documento US 8.907.065 (SEQ ID NO: 215); SEQ ID NO: 398 del documento US 8.907.065 (SEQ ID NO: 216); SEQ ID NO: 399 del documento US 8.907.065 (SEQ ID NO: 217).

En varias realizaciones, la presente proteína quimérica tiene una o más fracciones dirigidas contra PD-L2. En algunas realizaciones, la proteína quimérica tiene uno o más fracciones dirigidas que se unen selectivamente a un polipéptido PD-L2. En algunas realizaciones, la proteína quimérica comprende uno o más anticuerpos, derivados o formatos de anticuerpos, péptidos o polipéptidos, o proteínas de fusión que se unen selectivamente a un polipéptido PD-L2. En diversas realizaciones, la presente proteína quimérica comprende una primera fracción dirigida que se une a PD-L2 con baja afinidad.

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado de un VHH dirigido contra PD-L2 como se divulga, por ejemplo, en los documentos US 8,907,065 y WO 2008/071447. En realizaciones ilustrativas, los VHHs contra PD-L2 comprenden los SEQ ID NOs: 449-455 del documento US 8.907.065: SEQ ID NO: 449 del documento US 8,907,065 (SEQ ID NO: 218); SEQ ID NO: 450 del documento US 8.907.065 (SEQ ID NO: 219); SEQ ID NO: 451 del documento US 8.907.065 (SEQ ID NO: 220); SEQ ID NO: 452 del documento US 8.907.065 (SEQ ID NO: 221); SEQ ID NO: 453 del documento US 8.907.065 (SEQ ID NO: 222); SEQ ID NO: 454 del documento US 8.907.065 (SEQ ID NO: 223); SEQ ID NO: 455 del documento US 8.907.065 (SEQ ID NO: 224).

En una realización, la fracción dirigida comprende un derivado de cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L2 divulgados en los documentos US2011/0271358 y WO2010/036959. En realizaciones ilustrativas, el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende un derivado de una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 43-47 del documento US 2011/0271358: SEQ ID NO: 43 del documento US2011/0271358 (SEQ ID NO: 225); SEQ ID NO: 44 del documento US 2011/0271358 (SEQ ID NO: 226); SEQ ID NO: 45 del documento US 2011/0271358 (SEQ ID NO: 227); SEQ ID NO: 46 del documento US 2011/0271358 (SEQ ID NO: 228); SEQ ID NO: 47 del documento US 2011/0271358 (SEQ ID NO: 229); y/o un derivado de una cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NO: 48-51 del documento US 2011/0271358: SEQ ID NO: 48 del documento US 2011/0271358 (SEQ ID NO: 230); SEQ ID NO: 49 del documento US 2011/0271358 (SEQ ID NO: 231); SEQ ID NO: 50 del documento US 2011/0271358 (SEQ ID NO: 232); SEQ ID NO: 51 del documento US 2011/0271358 (SEQ ID NO: 233).

En varias realizaciones, las fracciones dirigidas de la invención pueden comprender una secuencia que se dirige a PD-1, PD-L1, y/o PD-L2 que es al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 61%, al menos aproximadamente un 62%, al menos aproximadamente un 63%, al menos aproximadamente un 64%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 66%, al menos aproximadamente un 67%, al menos aproximadamente un 68%, al menos aproximadamente un 69%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 71%, al menos aproximadamente un 72%, al menos aproximadamente un 73%, al menos aproximadamente un 74%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 76%, al menos aproximadamente un 77%, al menos aproximadamente un 78%, al menos aproximadamente un 79%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 81%, al menos aproximadamente un 82%, al menos aproximadamente un 83%, al menos aproximadamente un 84%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 86%, al menos aproximadamente un 87%, al menos aproximadamente un 88%, al menos aproximadamente un 89%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 91%, al menos aproximadamente un 92%, al menos aproximadamente un 93%, al menos aproximadamente un 94%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99%, o aproximadamente un 100% idénticas a cualquiera de las secuencias divulgadas en el presente documentofpor ejemplog., aproximadamente el 60%, o aproximadamente un 61%, o aproximadamente un 62%, o aproximadamente un 63%, o aproximadamente un 64%, o aproximadamente un 65%, o aproximadamente un 66%, o aproximadamente un 67%, o aproximadamente un 68%, o aproximadamente un 69%, o aproximadamente un 70%, o aproximadamente un 71%, o aproximadamente un 72%, o aproximadamente un 73%, o aproximadamente un 74%, o aproximadamente un 75%, o aproximadamente un 76%, o aproximadamente un 77%, o aproximadamente un 78%, o aproximadamente un 79%, o aproximadamente un 80%, o aproximadamente un 81%, o aproximadamente un 82%, o aproximadamente aproximadamente un 83%, o aproximadamente un 84%, o aproximadamente un 85%, o aproximadamente un 86%, o aproximadamente un 87%, o aproximadamente un 88%, o aproximadamente un 89%, o aproximadamente un 90%, o aproximadamente un 91%, o aproximadamente un 92%, o aproximadamente un 93%, o aproximadamente un 94%, o aproximadamente un 95%, o aproximadamente un 96%, o aproximadamente un 97%, o aproximadamente un 98%, aproximadamente un 99% o aproximadamente un 100% de la identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias descritas en el presente documento).

En varias realizaciones, las fracciones dirigidas de la invención pueden comprender cualquier combinación de cadena pesada, cadena ligera, región variable de cadena pesada, región variable de cadena ligera, región determinante de la complementariedad (CDR) y secuencias de región marco que se dirigen a PD-1, PD-L1 y/o PD-L2 como se divulga en el presente documento.

Otros anticuerpos, derivados o formatos de anticuerpos, péptidos o polipéptidos, o proteínas de fusión que se unen o se dirigen selectivamente a PD-1, PD-L1 y/o P^d-^l2 se divulgan en los documentos WO 2011/066389, US 2008/0025980, US 2013/0034559, US 8,779,108, US 2014/0356353, US 8.609.089, US 2010/028330, US 2012/0114649, WO 2010/027827, WO 2011,/066342, US 8.907.065, WO 2016/062722, WO 2009/101611, WO2010/027827, WO 2011/066342, WO 2007/005874 , WO 2001/014556, US2011/0271358, WO 2010/036959, WO 2010/077634, US 8.217.149, US 2012/0039906, WO 2012/145493, US 2011/0318373, Patente US n° 8.779.108, US 20140044738, WO 2009/089149, WO 2007/00587, WO 2016061142, WO 2016,02263, WO 2010/077634y WO 2015/112900.

En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida contra un marcador de punto de control en una célula T, por ejemplo, PD-1 y (ii) una fracción dirigida contra una célula tumoral, por ejemplo, PD-L1 o PD-L2, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado). En una realización, la presente proteína quimérica tiene una fracción dirigida contra PD-1 en las células T y una segunda fracción dirigida contra PD-L1 en las células tumorales. En otra realización, la presente proteína quimérica tiene una fracción dirigida contra PD-1 en las células T y una segunda fracción dirigida contra PD-L2 en las células tumorales.

En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra una célula T, por ejemplo, mediada por la orientación a CD8 y (ii) una fracción dirigida dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado). En una realización, la presente proteína quimérica tiene una fracción dirigida contra CD8 en las células T y una segunda fracción dirigida contra PD-L1 o PD-L2 en las células tumorales.

En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra una célula T, por ejemplo, mediada por la orientación a CD4 y (ii) una fracción dirigida dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado). En una realización, la presente proteína quimérica tiene una fracción dirigida contra CD4 en las células T y una segunda fracción dirigida contra PD-L1 o PD-L2 en las células tumorales.

En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra una célula T, por ejemplo, mediada por la orientación a CD3, CXCR3, CCR4, CCR9, CD70, CD103, o uno o más marcadores de punto de control inmunitario y (ii) una fracción dirigida dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado). En una realización, la presente proteína quimérica tiene una fracción dirigida contra CD3 en las células T y una segunda fracción dirigida contra PD-L1 o PD-L2 en las células tumorales.

En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra una célula T, por ejemplo, mediada por la orientación a PD-1 y (ii) una fracción dirigida dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado).

A modo de ejemplo no limitante, en diversas realizaciones, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra una célula B, por ejemplo, mediada por la orientación a CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD38, CD39, CD40, CD70, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CD78, CD79a/b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD89, CD98, CD126, CD127, CDw130, CD138, CDw150 y antígeno de maduración de células B (BCMA); y (ii) una fracción dirigida está dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de las células modificadas (por ejemplog., mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado).

En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra una célula B, por ejemplo, mediada por la orientación a CD19, CD20 o CD70 y (ii) una fracción dirigida dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado).

En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra una célula B, por ejemplo, mediada por la orientación a CD20 y (ii) una fracción dirigida dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado). En una realización, la presente proteína quimérica tiene una fracción dirigida contra CD20 en las células B y una segunda fracción dirigida contra PD-L1 o PD-L2 en las células tumorales.

A modo de ejemplo no limitante, en diversas realizaciones, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra una célula NK, por ejemplo, mediada por la orientación a 2B4/SLAMF4, KIR2DS4, CD155/PVR, KIR3DL1, CD94, LMIR1/CD300A, CD69, LMIR2/CD300c, CRACC/SLAMF7, LMIR3/CD300LF, DNAM-1, LMIR5/CD300LB, Fc-epsilon RII, LMIR6/CD300LE, Fc-y RI/CD64, MICA, Fc-y RIIB/CD32b, MICB, Fc-y RIIC/CD32c, MULT-1, F^c-^y RIIA/CD32a, Nectin-2/CD112, Fc-y RIII/CD16, NKG2A, FcRH1/IRTA5, NKG2C, FcRH2/IRTA4, NKG2D, FcRH4/IRTA1, NKp30, FcRH5/IRTA2, NKp44, Fc-Receptor-like 3/CD16-2, NKp46/NCR1, NKp80/KLRF1, NTB-A/SLAMF6, Rae-1, Rae-1 a, Rae-1 p, Rae-1 delta, H60, Rae-1 epsilon, ILT2/CD85j, Rae-1 y, ILT3/CD85k, TREM-1, ILT4/CD85d, TREM-2, ILT5/CD85a, TREM-3, KIR/CD158, TREML1/TLT-1, KIR2DL1, ULBP-1, KIR2DL3, ULBP-2, KIR2DL4/CD158d, o ULBP-3; y (ii) una fracción dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de las células modificadas (por ejemplog., mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado).

En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra una célula NK, por ejemplo, mediada por la orientación a Kir1alfa, DNAM-1 o CD64 y (ii) una fracción dirigida dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificadosfpor ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-^y modificado).

En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra una célula NK, por ejemplo, mediada por la orientación a KIR1 y (ii) una fracción dirigida dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado). En una realización, la presente proteína quimérica tiene una fracción dirigida contra KIR1 en las células NK y una segunda fracción dirigida contra PD-L1 o PD-L2 en las células tumorales.

En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra una célula NK, por ejemplo, mediada por la orientación a TIGIT o KIR1 y (ii) una fracción dirigida dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado). En una realización, la presente proteína quimérica tiene una fracción dirigida contra TIGIT en las células NK y una segunda fracción dirigida contra PD-L1 o PD-L2 en las células tumorales.

A modo de ejemplo no limitante, en diversas realizaciones, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra una célula dendrítica, por ejemplo mediada por la orientación a CLEC-9A, XCR1, RANK, CD36/SRB3, LOX-1/SR-E1, CD68, MARCO, CD163, SR-A1/MSR, CD5L, SREC-1, CL-PI/COLEC12, SREC-II, LIMPIIISRB2, RP105, TLR4, TLR1, TLR5, TLR2, TLR6, TLR3, TLR9, ligando 4-IBB/TNFSF9, IL-12/IL-23 p40, 4-Amino-1,8-naftalimida, ILT2/CD85j, CCL21/6Ckine, ILT3/CD85k, 8-oxo-dG, ILT4/CD85d, 8D6A, ILT5/CD85a, A2B5, lutegrina a 4/CD49d, Aag, Integrina p 2/CD18, AMICA, Langerina, B7-2/CD86, Leucotrieno B4 RI, B7-H3, LMIR1/CD300A, BLAME/SLAMF8, LMIR2/CD300c, Clq R1/CD93, LMIR3/CD300LF, CCR6, LMIR5/CD300LB CCR7, LMIR6/CD300LE, CD40/TNFRSF5, MAG/Siglec-4-a, CD43, MCAM, CD45, MD-1, CD68, MD-2, CD83, MDL-1/CLEC5A, CD84/SLAMF5, MMR, CD97, NCAMLI, CD2F-10/SLAMF9, Osteoactivina GPNMB, Chern 23, PD-L2, CLEC-1, RP105, CLEC-2, Siglec-2/CD22, CRACC/SLAMF7, Siglec-3/CD33, DC-SIGN, Siglec-5, DC-SIGNR/CD299, Siglec-6, DCAR, Siglec-7, DCIR/CLEC4A, Siglec-9, DEC-205, Siglec-10, Dectin-1/CLEC7A, Siglec-F, Dectin-2/CLEC6A, SIGNR1/CD209, DEP-1/CD148, SIGNR4, DLEC, SLAM, EMMPRIN/CD147, TCCR/WSX-1, Fc-y R1/CD64, TLR3, Fc-y RIIB/CD32b, TREM-1, Fc-y RIIC/CD32c, TREM-2, Fc-y RIIA/CD32a, TREM-3, Fc-y RIII/CD16, TREML1/TLT-1, ICAM-2/CD102, o Vanilloid R1; y (ii) una fracción dirigida contra una célula tumoral o una célula inmunitaria, junto con cualquiera de las células modificadas (por ejemplog., mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado).

En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra una célula dendrítica, por ejemplo, mediada por la orientación a CLEC-9A, DC-SIGN, CD64, CLEC4A o DEC205 y (ii) una fracción dirigida dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado). En una realización, la presente proteína quimérica tiene una fracción dirigida contra CLEC9A en las células dendríticas y una segunda fracción dirigida contra PD-L1 o PD-L2 en las células tumorales.

En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra una célula dendrítica, por ejemplo, mediada por la orientación a CLEC9A y (ii) una fracción dirigida dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado). En una realización, la presente proteína quimérica tiene una fracción dirigida contra CLEC9A en las células dendríticas y una segunda fracción dirigida contra PD-L1 o PD-L2 en las células tumorales.

En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra una célula dendrítica, por ejemplo, mediada por la orientación a XCR1 y (ii) una fracción dirigida dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-^y modificado). En una realización, la presente proteína quimérica tiene una fracción dirigida contra XCR1 en las células dendríticas y una segunda fracción dirigida contra PD-L1 o PD-L2 en las células tumorales.

En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra una célula dendrítica, por ejemplo, mediada por la orientación a RANK y (ii) una fracción dirigida dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado). En una realización, la presente proteína quimérica tiene una fracción dirigida contra RANK en las células dendríticas y una segunda fracción dirigida contra PD-L1 o PD-L2 en las células tumorales.

A modo de ejemplo no limitante, en diversas realizaciones, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra un monocito/macrófago, por ejemplo, mediada por la orientación a SIRP1a, B7-1/CD80, ILT4/CD85d, B7-H1, ILT5/CD85a, Cadena p de Conmmon, Integrina a 4/CD49d, BLAME/SLAMF8, Integrina a X/CDIIc, CCL6/C10, Integrina p 2/CD18, CD155/PVR, Integrina p 3/CD61, CD31/PECAM-1, Latexina, CD36/SR-B3, Leucotrieno B4 R1, CD40/TNFRSF5, LIMPIIISR-B2, CD43, LMIR1/CD300A, CD45, LMIR2/CD300c, CD68, LMIR3/CD300LF, CD84/SLAMF5, LMIR5/CD300LB, CD97, LMIR6/CD300LE, CD163, LRP-1, CD2F-10/SLAMF9, MARCO, CRACC/SLAMF7, MD-1, ECF-L, MD-2, EMMPRIN/CD147, MGL2, Endoglina/CD105, Osteoactivina/GPNMB, Fc-y RI/CD64, Osteopontina, Fc-y RIIB/CD32b, PD-L2, Fc-y RIIC/CD32c, Siglec-3/CD33, Fcy RIIA/CD32a, SIGNR1/CD209, Fc-y RIII/CD16, SLAM, GM-CSF R a, TCCR/WSX-1, ICAM-2/CD102, TLR3, IFN-y RI, TLR4, IFN-gannna R2, TREM-I, IL-I RII, TREM-2, ILT2/CD85j, TREM-3, ILT3/CD85k, TREML1/TLT-1, 2B4/SLAMF 4, IL-10 R a, ALCAM, IL-10 R p, AminopeptidasaN/ANPEP, ILT2/CD85j, Cadena p común, ILT3/CD85k, Clq R1/CD93, ILT4/CD85d, CCR1, ILT5/CD85a, CCR2, CD206, Integrina a 4/CD49d, CCR5, Integrina a M/CDII b, CCR8, Integrina a X/CDIIc, CD155/PVR, Integrina p 2/CD18, CD14, Integrina p 3/CD61, CD36/SR-B3, LAIR1, CD43, LAIR2, CD45, Leucotrieno B4-R1, CD68, LIMPIIISR-B2, CD84/SLAMF5, LMIR1/CD300A, CD97, LMIR2/CD300c, CD163, LMIR3/CD300LF, Factor de coagulación III/Factor tisular, LMIR5/CD300LB, CX3CR1, CX3CL1, LMIR6/CD300LE, CXCR4, LRP-1, CXCR6, M-CSF R, DEP-1/CD148, MD-1, DNAM-1, MD-2, EMMPRIN/CD147, MMR, Endoglin/CD105, NCAM-L1, Fc-y RI/CD64, PSGL-1, Fc-y RIIIICD16, RP105, G-CSF R, L-Selectina, GM-CSF R a, Siglec-3/CD33, HVEM/TNFRSF14, SLAM, ICAM-1/CD54, TCCR/WSX-1, ICAM-2/CD102, TREM-I, IL-6 R, TREM-2, CXCRI/IL-8 RA, TREM-3, o TREMLI/TLT-1; y (ii) una fracción dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de las células modificadas (por ejemplog., mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado).

En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra un monocito/macrófago, por ejemplo, mediada por la orientación a B7-H1, CD31/PECAM-1, CD163, CCR2, o el receptor de manosa de macrófagos CD206 y (ii) una fracción dirigida dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado).

En una realización, la presente proteína quimérica tiene (i) una fracción dirigida dirigida contra un monocito/macrófago, por ejemplo, mediada por la orientación a SIRP1 a y (ii) una fracción dirigida dirigida contra una célula tumoral, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado). En una realización, la presente proteína quimérica tiene una fracción dirigida contra SIRP1 a en las células de macrófagos y una segunda fracción dirigida contra PD-L1 o PD-L2 en las células tumorales.

En varias realizaciones, la presente proteína quimérica tiene una o más fracciones dirigidas dirigidas contra un marcador de punto de control, por ejemplo uno o más de PD-1/PD-L1 o PD-L2, CD28/CD80 o CD86, CTLA4/ CD80 o CD86, ICOS/ICOSL o B7RP1, BTLA/HVEM, KIR, LAG3, CD137/CD137L, OX40/OX40L, CD27, CD40L, TIM3/Gal9, y A2aR.

En algunas realizaciones, la presente proteína quimérica comprende dos o más fracciones dirigidas dirigidas a las mismas o diferentes células inmunitarias. En algunas realizaciones, la presente proteína quimérica tiene (i) una o más fracciones dirigidas contra una célula inmunitaria seleccionada entre una célula T, una célula B, una célula dendrítica, un macrófago, una célula NK, o subconjuntos de las mismas y (ii) una o más fracciones dirigidas contra la misma u otra célula inmunitaria seleccionada entre una célula T, una célula B, una célula dendrítica, un macrófago, una célula NK, o subconjuntos de las mismas, junto con cualquiera de los agentes de señalización modificados (por ejemplo, mutantes) descritos en el presente documento (por ejemplo, IFN-y modificado).

En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula T y una o más fracciones dirigidas contra la misma u otra célula T. En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula T y una o más fracciones dirigidas contra una célula B. En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula T y una o más fracciones dirigidas contra una célula dendrítica. En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula T y una o más fracciones dirigidas contra un macrófago. En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula T y una o más fracciones dirigidas contra una célula NK. Por ejemplo, en una realización ilustrativa, la proteína quimérica puede incluir una fracción dirigida contra CD8 y una fracción dirigida contra Clec9A. En otra realización ilustrativa, la proteína quimérica puede incluir una fracción dirigida contra CD8 y una fracción dirigida contra CD3. En otra realización ilustrativa, la proteína quimérica puede incluir una fracción dirigida contra CD8 y una fracción dirigida contra PD-1.

En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula B y una o más fracciones dirigidas contra la misma u otra célula B. En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula B y una o más fracciones dirigidas contra una célula T. En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula B y una o más fracciones dirigidas contra una célula dendrítica. En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula B y una o más fracciones dirigidas contra un macrófago.

En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula B y una o más fracciones dirigidas contra una célula NK.

En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula dendrítica y una o más fracciones dirigidas contra la misma u otra célula dendrítica. En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula dendrítica y una o más fracciones dirigidas contra una célula T. En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula dendrítica y una o más fracciones dirigidas contra una célula B. En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula dendrítica y una o más fracciones dirigidas contra un macrófago. En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula dendrítica y una o más fracciones dirigidas contra una célula NK.

En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra un macrófago y una o más fracciones dirigidas contra el mismo u otro macrófago. En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra un macrófago y una o más fracciones dirigidas contra una célula T. En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra un macrófago y una o más fracciones dirigidas contra una célula B. En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra un macrófago y una o más fracciones dirigidas contra una célula dendrítica. En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra un macrófago y una o más fracciones dirigidas contra una célula NK.

En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula NK y una o más fracciones dirigidas contra la misma u otra célula NK. En una realización, la presente proteína quimérica comprende uno o más elementos dirigidos contra una célula NK y uno o más elementos dirigidos contra una célula T. En una realización, la presente proteína quimérica comprende uno o más elementos dirigidos contra una célula NK y uno o más elementos dirigidos contra una célula B. En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula NK y una o más fracciones dirigidas contra un macrófago. En una realización, la presente proteína quimérica comprende una o más fracciones dirigidas contra una célula NK y una o más fracciones dirigidas contra una célula dendrítica.

En una realización, la presente proteína quimérica comprende una fracción dirigida contra una célula tumoral y una segunda fracción dirigida contra la misma o diferente célula tumoral. En tales realizaciones, las fracciones dirigidas pueden unirse a cualquiera de los antígenos tumorales descritos en el presente documento.

En diversas realizaciones, las construcciones quiméricas se construyen como se describe en el documento WO 2013/107791, véanse los Materiales y Procedimientos Ejemplares y el Ejemplo 1.

En diversas realizaciones, la caracterización funcional de las construcciones quiméricas se lleva a cabo como en los Ejemplos 2-10 del documento WO 2013/107791.

Formatos de fracción dirigida

En varias realizaciones, la fracción dirigida de la presente proteína quimérica es un agente basado en una proteína capaz de unirse específicamente, como un anticuerpo o derivados del mismo. En una realización, la fracción dirigida comprende un anticuerpo. En varias realizaciones, el anticuerpo es una proteína multimérica de longitud completa que incluye dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada incluye una región variable (por ejemplo, V^h) y al menos tres regiones constantes (por ejemplo, CH1, CH2 y CH3), y cada cadena ligera incluye una región variable (V^l) y una región constante (C^l). Las regiones variables determinan la especificidad del anticuerpo. Cada región variable comprende tres regiones hipervariables, también conocidas como regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), flanqueadas por cuatro regiones marco (FR) relativamente conservadas. Las tres CDR, denominadas CDR1, CDR2 y CDR3, contribuyen a la especificidad de unión del anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

En algunas realizaciones, la fracción dirigida comprende derivados o formatos de anticuerpos. En algunas realizaciones, la fracción dirigida de la presente proteína quimérica es un anticuerpo de dominio único, un anticuerpo recombinante de cadena pesada (VHH), un anticuerpo de cadena única (scFv), un anticuerpo de cadena pesada de tiburón (VNAR), una microproteína (proteína de nudo de cisteína, knottin), una DARPin una tetranectina; un afibody; un transcuerpo; una anticalina; una adnectina; una afilina; un microcuerpo; un aptámero peptídico una alterasa; un anticuerpo plástico; un filocuerpo; un estradocuerpo; un maxicuerpo; un evicuerpo; un fynómero, una proteína de repetición de armadillo, un dominio de Kunitz, un avímero, un atrímero, un probodia, un inmunocuerpo, un triomab, un troicuerpo un pepcuerpo; un vaccicuerpo, un UniBody; afímeros, un DuoBody, un Fv, un Fab, un Fab', un F(ab')2, una molécula mimética de péptidos o una molécula sintética, como se describe en las patentes US o en la publicación de patentes Nos US 7.417.130, US 2004/132094, US 5.831.012, US 2004/023334, US 7.250.297, US 6.818.418, US 2004/209243, US 7.838.629, US 7.186.524, US 6.004.746, US 5.475.096, US 2004/146938, US 2004/157209, US 6.994.982, US 6.794.144, US 2010/239633, US 7.803.907, US 2010/119446y/o US 7.166.697. Véase también, Storz MAbs. 2011 Mayo-Jun; 3(3): 310-317.

En una realización, la fracción dirigida comprende un anticuerpo de dominio único, como VHH de, por ejemplo, un organismo que produce anticuerpos VHH como un camélido, un tiburón o un VHH diseñado. Los VHH son proteínas terapéuticas derivadas de anticuerpos que contienen las propiedades estructurales y funcionales únicas de los anticuerpos de cadena pesada naturales. La tecnología VHH se basa en anticuerpos totalmente funcionales de camélidos que carecen de cadenas ligeras. Estos anticuerpos de cadena pesada contienen un único dominio variable (VHH) y dos dominios constantes (CH² y CH³). Los VHH están disponibles comercialmente bajo la marca NANOBODY o NANOBODIES.

En una realización, la fracción dirigida comprende un VHH. En algunas realizaciones, el VHH es un VHH humanizado o un VHH camelizado.

En algunas realizaciones, el VHH comprende un dominio VH totalmente humano, por ejemplo, un HUMABODY (Crescendo Biologics, Cambridge, Reino Unido). En algunas realizaciones, el dominio V^h totalmente humano, por ejemplo un HUMABODY es monovalente, bivalente o trivalente. En algunas realizaciones, el dominio V^h totalmente humano, por ejemplo, un HUMABODY es mono o multiespecífico, como monoespecífico, biespecífico o triespecífico. Los dominios V^h totalmente humanos ilustrativos, por ejemplo, un HUMABODIES se describen en, por ejemplo, los documentos WO 2016/113555 y WO2016/113557.

En varias realizaciones, la fracción dirigida de la presente proteína quimérica es un agente basado en una proteína capaz de unirse específicamente a un receptor celular, como un ligando natural para el receptor celular. En varias realizaciones, el receptor celular se encuentra en una o más células inmunitarias, que pueden incluir, sin limitación, células T, linfocitos T citotóxicos, células T auxiliares, células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), macrófagos antitumorales (por ejemplo, macrófagos M1), células B, células dendríticas o subconjuntos de las mismas. En algunas realizaciones, el receptor celular se encuentra en megacariocitos, trombocitos, eritrocitos, mastocitos, basófilos, neutrófilos, eosinófilos o subconjuntos de los mismos.

En algunas realizaciones, la fracción dirigida es un ligando natural, como una quimiocina. Las quimiocinas ejemplares que pueden incluirse en la proteína quimérica de la invención incluyen, pero no se limitan a, CCL1, CCL2, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CLL25, CCL26, CCL27, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL2, CX3CL1, HCC-4 y LDGF-PBP. En una realización ilustrativa, la fracción dirigida puede ser XCL1, que es una quimiocina que reconoce y se une al receptor de células dendríticas XCR1. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL1, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR8. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL2, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR2 o CCR9. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL3, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR1, CCR5 o CCR9. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL4, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR1 o CCR5 o CCR9. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL5, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR1 o CCR3 o CCR4 o CCR5. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL6, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR1. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL7, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR2 o CCR9. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL8, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR1 o CCR2 o CCR2B o CCR5 o CCR9. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL9, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR1. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL10, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR1. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL11, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR2 o CCR3 o CCR5 o CCR9. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL13, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR2 o CCR3 o CCR5 o CCR9. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL14, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR1 o CCR9. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL15, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR1 o CCR3. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL16, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR1, CCR2, CCR5 o CCR8. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL17, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR4. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL19, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR7. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL20, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR6. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL21, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR7. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL22, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR4. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL23, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR1. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL24, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR3. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL25, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR9. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL26, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR3. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL27, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR10. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CCL28, que es una quimiocina que reconoce y se une a CCR3 o CCR10. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CXCL1, que es una quimiocina que reconoce y se une a CXCR1 o CXCR2. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CXCL2, que es una quimiocina que reconoce y se une a CXCR2. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CXCL3, que es una quimiocina que reconoce y se une a CXCR2. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CXCL4, que es una quimiocina que reconoce y se une a CXCR3B. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CXCL5, que es una quimiocina que reconoce y se une a CXCR2. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CXCL6, que es una quimiocina que reconoce y se une a CXCR1 o CXCR2. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CXCL8, que es una quimiocina que reconoce y se une a CXCR1 o CXCR2. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CXCL9, que es una quimiocina que reconoce y se une a CXCR3. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CXCL10, que es una quimiocina que reconoce y se une a CXCR3. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CXCL11, que es una quimiocina que reconoce y se une a CXCR3 o CXCR7. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CXCL12, que es una quimiocina que reconoce y se une a CXCR4 o CXCR7. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CXCL13, que es una quimiocina que reconoce y se une a CXCR5. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CXCL16, que es una quimiocina que reconoce y se une a CXCR6. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es LDGF-PBP, que es una quimiocina que reconoce y se une a CXCR2. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es XCL2, que es una quimiocina que reconoce y se une a XCR1. En otra realización ilustrativa, la fracción dirigida es CX3CL1, que es una quimiocina que reconoce y se une a CX3CR1.

En varias realizaciones, la presente proteína quimérica comprende fracciones dirigidas en varias combinaciones. En una realización ilustrativa, la presente proteína quimérica puede comprender dos fracciones dirigidas, en las que ambas fracciones dirigidas son anticuerpos o derivados de los mismos. En otra realización ilustrativa, la presente proteína quimérica puede comprender dos fracciones dirigidas, en las que ambas fracciones dirigidas son ligandos naturales para los receptores celulares. En otra realización ilustrativa, la presente proteína quimérica puede comprender dos fracciones dirigidas, en la que una de las fracciones dirigidas es un anticuerpo o un derivado del mismo, y la otra fracción dirigida es un ligando natural para un receptor celular.

En varias realizaciones, el dominio de reconocimiento de la presente proteína quimérica modula funcionalmente (a título no limitativo, neutraliza parcial o completamente) la diana (por ejemplo, antígeno, receptor) de interés, por ejemplo, inhibiendo sustancialmente, reduciendo o neutralizando un efecto biológico que tiene el antígeno. Por ejemplo, varios dominios de reconocimiento pueden estar dirigidos contra uno o más antígenos tumorales que están suprimiendo activamente, o tienen la capacidad de suprimir, el sistema inmunitario de, por ejemplo, un paciente portador de un tumor. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presente proteína quimérica modula funcionalmente las señales inhibidoras inmunitarias (por ejemplo, los inhibidores de puntos de control), por ejemplo, uno o más de TIM-3, BTLA, PD-1, CTLA-4, B7-H4, GITR, galectina-9, HVEM, PD-L1, PD-L2, B7-H3, CD244, CD160, TIGIT, SIRPa, ICOS, CD172a y TMIGD2. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presente proteína quimérica está diseñada para interrumpir, bloquear, reducir y/o inhibir la transmisión de una señal inmune inhibitoria, a modo de ejemplo no limitante, la unión de PD-1 con PD-L1 o PD-L2 y/o la unión de CTLA-4 con uno o más de AP2M1, CD80, CD86, SHP-2 y PPP2R5A.

En varias realizaciones, el dominio de reconocimiento de la presente proteína quimérica se une, pero no modula, funcionalmente la diana (por ejemplo, antígeno, receptor) de interés, por ejemplo, el dominio de reconocimiento es, o es similar a, un anticuerpo de unión. Por ejemplo, en varias realizaciones, el dominio de reconocimiento simplemente se dirige al antígeno o al receptor pero no inhibe, reduce o modula funcionalmente de forma sustancial un efecto biológico que tiene el antígeno o el receptor. Por ejemplo, algunos de los formatos de anticuerpos más pequeños descritos anteriormente (por ejemplo, en comparación con los anticuerpos completos) tienen la capacidad de dirigirse a epítopos de difícil acceso y proporcionar un mayor espectro de lugares de unión específicos. En varias realizaciones, el dominio de reconocimiento se une a un epítopo que está físicamente separado de un antígeno o sitio receptor que es importante para su actividad biológica (por ejemplo, el sitio activo del antígeno).

Dicha unión no neutralizante encuentra uso en procedimientos en los que la presente proteína quimérica se utiliza para reclutar directa o indirectamente células inmunitarias activas a un sitio de necesidad a través de un antígeno efector, como cualquiera de los descritos en el presente documento. Por ejemplo, la presente proteína quimérica puede utilizarse para reclutar directa o indirectamente células T citotóxicas a través de CD8 a una célula tumoral en un procedimiento de reducción o eliminación de un tumor (por ejemplo, la proteína quimérica puede comprender un dominio de reconocimiento anti-CD8 y un dominio de reconocimiento dirigido contra un antígeno tumoral). Puede ser deseable reclutar directa o indirectamente células T citotóxicas que expresen CD8, pero no modular funcionalmente la actividad de los CD8. Por el contrario, la señalización de los CD8 puede ser una pieza importante del efecto reductor o eliminador del tumor. A modo de ejemplo adicional, en varios procedimientos de reducción o eliminación de tumores, la presente proteína quimérica se utiliza para reclutar directa o indirectamente células dendríticas (DCs) a través de CLEC9A (por ejemplo, la proteína quimérica puede comprender un dominio de reconocimiento anti-CLEC9A y un dominio de reconocimiento dirigido contra un antígeno tumoral). Puede ser deseable reclutar directa o indirectamente a las DCs que expresan CLEC9A pero no modular funcionalmente la actividad de CLEC9A. Por el contrario, la señalización de CLEC9A puede ser una pieza importante del efecto reductor o eliminador del tumor.

En varias realizaciones, el dominio de reconocimiento de la presente proteína quimérica se une a XCR1, por ejemplo, en las células dendríticas. Por ejemplo, el dominio de reconocimiento, en algunas realizaciones comprende todo o parte de XCL1 o un agente anti-XCR1 no neutralizante.

En varias realizaciones, el dominio de reconocimiento de la presente proteína quimérica se une a un antígeno inmunomodulador (por ejemplo, inmunoestimulador o inmuninhibidor). En varias realizaciones, el antígeno inmunomodulador es uno o más de los siguientes: 4-1BB, OX-40, HVEM, GITR, CD27, CD28, CD30, CD40, ligando ICOS; ligando OX-40, LIGHT (CD258), ligando GITR, CD70, B7-1, B7-2, ligando CD30, ligando CD40, ICOS, ligando ICOS, ligando CD137 y TL1A. En varias realizaciones, dichos antígenos inmunoestimulantes se expresan en una célula tumoral. En varias realizaciones, el dominio de reconocimiento de la presente proteína quimérica se une, pero no modula, funcionalmente dichos antígenos inmunoestimulantes y, por tanto, permite el reclutamiento de células que expresan estos antígenos sin la reducción o pérdida de su capacidad potencial de reducción o eliminación de tumores.

En varias realizaciones, el dominio de reconocimiento de la presente proteína quimérica puede estar en el contexto de la proteína quimérica que comprende dos dominios de reconocimiento que tienen actividad neutralizante, o comprende dos dominios de reconocimiento que tienen actividad no neutralizante (por ejemplo, de unión), o comprende un dominio de reconocimiento que tiene actividad neutralizante y un dominio de reconocimiento que tiene actividad no neutralizante (por ejemplo, de unión).

Agentes de señalización adicionales

En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína quimérica que comprende uno o más agentes de señalización (por ejemplo, un agente inmunomodulador) además del IFN-y modificado en la presente memoria descrito. En realizaciones ejemplares, la proteína quimérica puede comprender dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más agentes de señalización además del IFN-y modificado descrito en el presente documento. En varias realizaciones, el agente de señalización adicional se modifica para tener una afinidad y/o actividad biológica reducida por uno o más de sus receptores, lo que permite atenuar la actividad (incluido el agonismo o el antagonismo) y/o evitar la señalización no específica o el secuestro indeseable de la proteína quimérica.

En varias realizaciones, el agente de señalización adicional es antagonista en su forma de tipo salvaje y lleva una o más mutaciones que atenúan su actividad antagonista. En diversas realizaciones, el agente de señalización adicional es antagonista debido a una o más mutaciones, por ejemplo, un agente de señalización agonista se convierte en un agente de señalización antagonista y, dicho agente de señalización convertido, opcionalmente, también lleva una o más mutaciones que atenúan su actividad antagonista (por ejemplo, como se describe en el documento WO 2015/007520).

En varias realizaciones, el agente de señalización adicional se selecciona entre versiones modificadas de citoquinas, factores de crecimiento y hormonas. Ejemplos ilustrativos de tales citocinas, factores de crecimiento y hormonas incluyen, pero no se limitan a, linfocinas, monocinas, hormonas polipeptídicas tradicionales, como la hormona de crecimiento humano, la hormona de crecimiento humano N-metionil y la hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glicoproteicas como la hormona estimulante del folículo (FSH), la hormona estimulante del tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de los fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral-a y factor de necrosis tumoral-p; sustancia inhibidora de la mulleriana; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso como el NGF-a; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformadores (TGFs) como el TGF-a y el TGF-p; factor de crecimiento similar a la insulina-I y -II ; factores osteoinductores; interferones como, por ejemplo, el interferón-a, el interferón-p y el interferón-y (y el interferón tipo I, II y III), factores estimulantes de colonias (CSF) como el macrophage-CSF (M-CSF); granulocitos-macrófagos-CSF (GM-CSF); y granulocitos-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) como, por ejemplo, IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, e IL-18; un factor de necrosis tumoral como, por ejemplo, TNF-a o TNF-p; y otros factores polipeptídicos que incluyen, por ejemplo, LIF y ligando de kit (KL). Como se utiliza en el presente documento, las citocinas, los factores de crecimiento y las hormonas incluyen proteínas obtenidas de fuentes naturales o producidas a partir de sistemas de cultivo de células bacterianas, eucariotas o de mamíferos recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.

En algunas realizaciones, el agente de señalización adicional es una versión modificada de un factor de crecimiento seleccionado de, pero no limitado a, factores de crecimiento transformantes (TGF) como TGF-a y TGF-p, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento similar a la insulina como factor de crecimiento similar a la insulina-I y -II, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), heregulina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

En una realización, el factor de crecimiento es una versión modificada de un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). Los FGFs ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15 murino, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, y FGF23.

En una realización, el factor de crecimiento es una versión modificada de un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Los VEGFs ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, y PGF e isoformas de los mismos incluyendo las diversas isoformas de VEGF-A como VEGF¹²¹, VEGF-^-ⁱ b, VEGF¹⁴⁵, VEGF-^,65, VEGF¹⁶⁵b, VEGF¹⁸⁹, y VEGF²⁰⁶.

En una realización, el factor de crecimiento es una versión modificada de un factor de crecimiento transformante (TGF). Los TGFs ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, TGF-a y TGF-p y subtipos de los mismos incluyendo los diversos subtipos de TGF-p incluyendo TGFpl, TGFp2 y TGFp3.

En algunas realizaciones, el agente de señalización adicional es una versión modificada de una hormona seleccionada de, pero no limitada a, gonadotropina coriónica humana, hormona liberadora de gonadotropina, un andrógeno, un estrógeno la hormona estimulante de la tiroides, la hormona estimulante del folículo, la hormona luteinizante, la prolactina, la hormona del crecimiento, la hormona adrenocorticotrópica, la hormona antidiurética, la oxitocina, la hormona liberadora de tirotropina, la hormona liberadora de la hormona del crecimiento, la hormona liberadora de corticotropina, la somatostatina, la dopamina, la melatonina, la tiroxina, la calcitonina, la hormona paratiroidea, los glucocorticoides, los mineralocorticoides, la adrenalina, la noradrenalina, la progesterona, la insulina, el glucagón, la amilina, calcitriol, calciferol, péptido atrial-natriurético, gastrina, secretina, colecistoquinina, neuropéptido Y, grelina, PYY3-36, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), leptina, trombopoyetina, eritropoyetina (EPO) y angiotensinógeno.

En algunas realizaciones, el agente de señalización adicional es un agente inmunomodulador, por ejemplo, uno o más de una interleucina, un interferón y un factor de necrosis tumoral.

En algunas realizaciones, el agente de señalización adicional es una interleucina, incluyendo por ejemplo la IL-1; IL-2; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-8; IL-9; IL-10; IL-11; IL-12; IL-13; IL-14; IL-15; IL-16; IL-17; IL-18; IL-19; IL-20; IL-21; IL-22; IL-23; IL-24; IL-25; IL-26; IL-27; IL-28; IL-29; IL-30; IL-31; IL-32; IL-33; IL-35; IL-36 o un fragmento, variante, análogo o miembro de su familia. Las interleucinas son un grupo de citoquinas multifuncionales sintetizadas por linfocitos, monocitos y macrófagos. Las funciones conocidas incluyen la estimulación de la proliferación de células inmunitarias (por ejemplo, células T helper, células B, eosinófilos y linfocitos), la quimiotaxis de neutrófilos y linfocitos T, y/o la inhibición de los interferones. La actividad de la interleucina puede determinarse mediante ensayos conocidos en la técnica: Matthews et al., en Lymphokines and Interferens: A Practical Approach, Clemens et al., eds, IRL Press, Washington, D.C. 1987, pp. 221-225 y Orencole & Dinarello (1989) Cytokine 1, 14-20.

En algunas realizaciones, el agente de señalización adicional es una versión modificada de un interferón, como los tipos de interferón I, II y III. Los interferones ilustrativos, incluyen, por ejemplo, interferón-a, interferón-p, otro interferón-Y, interferón _k, interferón £, interferón _t, e interferón W

En algunas realizaciones, el agente de señalización adicional es una versión modificada de un factor de necrosis tumoral (TNF) o una proteína de la familia del TNF, incluyendo, pero sin limitarse a, TNF-a, TNF-p, LT-p, CD40L, CD27L, CD30L, FASL, 4-1BBL, OX40L y TRAIL.

En varias realizaciones, el agente de señalización adicional es una forma modificada (por ejemplo, mutante) del agente de señalización que tiene una o más mutaciones. En varias realizaciones, las mutaciones permiten que el agente de señalización modificado tenga una o más actividades atenuadas, como una o más afinidades de unión reducidas, una actividad endógena reducida y una bioactividad específica reducida en relación con la forma no modificada o no mutada, es decir, la forma de tipo salvaje del agente de señalización (por ejemplo, comparando el mismo agente de señalización en una forma de tipo salvaje frente a una forma modificada (por ejemplo, mutante)). En algunas realizaciones, las mutaciones que atenúan o reducen la unión o la afinidad incluyen aquellas mutaciones que reducen o abaten sustancialmente la unión o la actividad. En algunas realizaciones, las mutaciones que atenúan o reducen la unión o la afinidad son diferentes de las mutaciones que reducen o abaten sustancialmente la unión o la actividad. En consecuencia, en varias realizaciones, las mutaciones permiten que el agente de señalización sea más seguro, por ejemplo, que tenga una toxicidad sistémica reducida, efectos secundarios reducidos y efectos fuera de la diana en relación con el agente de señalización no mutado, es decir, de tipo salvaje (por ejemplo, comparando el mismo agente de señalización en una forma de tipo salvaje frente a una forma modificada (por ejemplo, mutante)).

En varias realizaciones, el agente de señalización adicional se modifica para tener una o más mutaciones que reducen su afinidad de unión o actividad para uno o más de sus receptores. En algunas realizaciones, el agente de señalización se modifica para tener una o más mutaciones que reducen sustancialmente o abaten la afinidad de unión o la actividad para los receptores. En algunas realizaciones, la actividad proporcionada por el agente de señalización de tipo salvaje es el agonismo en el receptor (por ejemplo, la activación de un efecto celular en un sitio de la terapia). Por ejemplo, el agente de señalización de tipo salvaje puede activar su receptor. En tales realizaciones, las mutaciones dan lugar a que el agente de señalización modificado tenga una actividad activadora reducida o anulada en el receptor. Por ejemplo, las mutaciones pueden dar lugar a que el agente de señalización modificado entregue una señal de activación reducida a una célula diana o la señal de activación podría ser abladida. En algunas realizaciones, la actividad proporcionada por el agente de señalización de tipo salvaje es el antagonismo en el receptor (por ejemplo, el bloqueo o la amortiguación de un efecto celular en un sitio de la terapia). Por ejemplo, el agente de señalización de tipo salvaje puede antagonizar o inhibir el receptor. En estas realizaciones, las mutaciones hacen que el agente de señalización modificado tenga una actividad antagonista reducida o abladida en el receptor. Por ejemplo, las mutaciones pueden dar lugar a que el agente de señalización modificado entregue una señal inhibitoria reducida a una célula diana o la señal inhibitoria podría ser abladida. En diversas realizaciones, el agente de señalización es antagonista debido a una o más mutaciones, por ejemplo, un agente de señalización agonista se convierte en un agente de señalización antagonista (por ejemplo, como se describe en el documento WO 2015/007520) y, dicho agente de señalización convertido, opcionalmente, también lleva una o más mutaciones que reducen su afinidad o actividad de unión para uno o más de sus receptores o que reducen o abaten sustancialmente la afinidad o actividad de unión para uno o más de sus receptores.

En algunas realizaciones, la afinidad reducida y/o la actividad biológica en el receptor son restaurables mediante la unión con una o más de las fracciones dirigidas. En otras realizaciones, la afinidad reducida y/o la actividad biológica en el receptor no es sustancialmente restablecida por la actividad de una o más de las fracciones dirigidas.

En varias realizaciones, el agente de señalización adicional es activo en las células diana porque la(s) fraccion(es) dirigidas compensa(n) la unión faltante/insuficiente (por ejemplo, sin limitación y/o avidez) requerida para una activación sustancial. En varias realizaciones, el agente de señalización modificado es sustancialmente inactivo en el camino hacia el sitio de la actividad terapéutica y tiene su efecto sustancialmente en los tipos de células específicamente dirigidas, lo que reduce en gran medida los efectos secundarios no deseados.

En algunas realizaciones, el agente de señalización adicional puede incluir una o más mutaciones que atenúen o reduzcan la unión o afinidad por un receptor (es decir, un receptor terapéutico) y una o más mutaciones que reduzcan sustancialmente o abatan la unión o actividad en un segundo receptor. En tales realizaciones, estas mutaciones pueden estar en la misma o en diferentes posiciones (es decir, la misma mutación o múltiples mutaciones). En algunas realizaciones, la(s) mutación(es) que reduce(n) la unión y/o la actividad en un receptor es diferente de la(s) mutación(es) que reduce(n) o ablade(n) sustancialmente en otro receptor. En algunas realizaciones, la(s) mutación(es) que reduce(n) la unión y/o la actividad en un receptor es la misma que la(s) mutación(es) que reduce(n) o ablade(n) sustancialmente en otro receptor. En algunas realizaciones, las presentes proteínas quiméricas tienen un agente de señalización modificado que tiene tanto mutaciones que atenúan la unión y/o la actividad en un receptor terapéutico y, por lo tanto, permiten un efecto terapéutico más controlado y dirigido (por ejemplo, en relación con el agente de señalización de tipo salvaje) como mutaciones que reducen sustancialmente o eliminan la unión y/o la actividad en otro receptor y, por lo tanto, reducen los efectos secundarios (por ejemplo, en relación con el agente de señalización de tipo salvaje).

En algunas realizaciones, la reducción o ablación sustancial de la unión o la actividad no es sustancialmente restaurable con una fracción dirigida. En algunas realizaciones, la reducción o ablación sustancial de la unión o de la actividad se puede restablecer con una fracción dirigida. En varias realizaciones, la reducción sustancial o la ablación de la unión o la actividad de un segundo receptor también puede prevenir los efectos nocivos mediados por el otro receptor. Alternativamente, o además, la reducción sustancial o la ablación de la unión o la actividad en el otro receptor hace que el efecto terapéutico mejore, ya que hay un secuestro reducido o eliminado de las proteínas quiméricas terapéuticas lejos del sitio de acción terapéutica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, esto obvia la necesidad de altas dosis de las presentes proteínas quiméricas que compensan la pérdida en el otro receptor. Esta capacidad de reducir la dosis proporciona una menor probabilidad de efectos secundarios.

En varias realizaciones, el agente de señalización modificado adicional comprende una o más mutaciones que hacen que el agente de señalización tenga una afinidad reducida, sustancialmente reducida o abladida, por ejemplo unión (por ejemplo, K^d) y/o activación (por ejemplo, cuando el agente de señalización modificado es un agonista de su receptor, medible como, por ejemplo, K^a y/o EC⁵⁰) y/o inhibición (por ejemplo, cuando el agente de señalización modificado es un antagonista de su receptor, medible como, por ejemplo, Kⁱ y/o IC⁵⁰), para uno o más de sus receptores. En varias realizaciones, la afinidad reducida en el receptor del agente de señalización permite la atenuación de la actividad (incluido el agonismo o el antagonismo). En tales realizaciones, el agente de señalización modificado tiene aproximadamente aproximadamente un 1%, o aproximadamente aproximadamente un 3%, aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 15%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 25%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 35%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 45%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 65%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 75%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 85%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 95%, o e aproximadamente un 10% - 20%, aproximadamente 20% - 40%, aproximadamente un 50%, aproximadamente 40% - 60%, aproximadamente 60% - 80%, aproximadamente 80% -100% de la afinidad por el receptor en relación con el agente de señalización de tipo natural. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es al menos aproximadamente un 2 veces menor, aproximadamente un 3 veces menor, aproximadamente un 4 veces menor, aproximadamente un 5 veces menor, aproximadamente un 6 veces menor, aproximadamente un 7 veces menor, aproximadamente un 8 veces menor, aproximadamente un 9 veces menor, aproximadamente un 10 veces menor, aproximadamente un 15 veces menor, aproximadamente un 20 veces menor, aproximadamente un 25 veces menor, aproximadamente un 30 veces menor, al menos aproximadamente un 35 veces menos, al menos aproximadamente un 40 veces menos, al menos aproximadamente un 45 veces menos, al menos aproximadamente un 50 veces menos, al menos aproximadamente un 100 veces menos, al menos aproximadamente un 150 veces menos, o al menos aproximadamente un 10-50 veces menos, al menos aproximadamente un 50-100 veces menos, al menos aproximadamente un 100-150 veces menos, al menos aproximadamente un 150-200 veces menos, o más de 200 veces menos en relación con el agente señalizador de tipo salvaje.

En las realizaciones en las que la proteína quimérica tiene mutaciones que reducen la unión a un receptor y reducen o abaten sustancialmente la unión a un segundo receptor, la atenuación o reducción de la afinidad de unión de un agente de señalización modificado para un receptor es menor que la reducción o ablación sustancial de la afinidad para el otro receptor. En algunas realizaciones, la atenuación o reducción de la afinidad de unión de un agente de señalización modificado para un receptor es menor que la reducción o ablación sustancial de la afinidad para el otro receptor en aproximadamente un 1%, o en aproximadamente un 3%, aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 15%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 25%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 35%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 45%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 65%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 75%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 85%, aproximadamente un 90% o aproximadamente un 95%. En varias realizaciones, la reducción o ablación sustancial se refiere a una mayor reducción de la afinidad de unión y/o de la actividad biológica que la atenuación o la reducción.

En varias realizaciones, el agente de señalización modificado adicionalmente comprende una o más mutaciones que reducen la actividad endógena del agente de señalización a aproximadamente el 75%, o aproximadamente el 70%, o aproximadamente el 60%, o aproximadamente el 50%, o aproximadamente el 40%, o aproximadamente el 30%, o aproximadamente el 25%, o aproximadamente el 20%, o aproximadamente el 10%, o aproximadamente el 5%, o aproximadamente el 3%, o aproximadamente el 1%, por ejemplo, en relación con el agente de señalización de tipo salvaje

En varias realizaciones, el agente de señalización modificado adicionalmente comprende una o más mutaciones que hacen que el agente de señalización tenga una afinidad y/o actividad biológica reducida para un receptor de cualquiera de las citoquinas, factores de crecimiento y hormonas como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado adicionalmente comprende una o más mutaciones que hacen que el agente de señalización tenga una afinidad reducida por su receptor que es inferior a la afinidad de unión de la(s) fraccion(s) dirigida por su(s) receptor(es). En algunas realizaciones, este diferencial de afinidad de unión es entre el agente de señalización/receptor y la fracción de destino/receptor en la misma célula. En algunas realizaciones, este diferencial de afinidad de unión permite que el agente de señalización, por ejemplo, el agente de señalización mutado, tenga efectos localizados, en el diana, y minimice los efectos fuera de la diana que subyacen a los efectos secundarios que se observan con el agente de señalización de tipo salvaje. En algunas realizaciones, esta afinidad de unión es al menos aproximadamente un 2 veces, o al menos aproximadamente un 5 veces, o al menos aproximadamente un 10 veces, o al menos aproximadamente un 15 veces menor, o al menos aproximadamente un 25 veces, o al menos aproximadamente un 50 veces menor, o al menos aproximadamente un 100 veces, o al menos aproximadamente un 150 veces.

La actividad de unión al receptor puede medirse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la afinidad y/o la actividad de unión pueden evaluarse mediante el análisis de la trama de Scatchard y el ajuste por ordenador de los datos de unión (por ejemplo, Scatchard, 1949) o mediante espectroscopia de interferencia reflectométrica en condiciones de flujo, como describen Brecht et al. (1993).

Las secuencias de aminoácidos de los agentes de señalización de tipo salvaje descritos en el presente documento son bien conocidas en la técnica. Por consiguiente, en diversas realizaciones, el agente de señalización modificado adicional comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 60%, o al menos aproximadamente un 61%, o al menos aproximadamente un 62%, o al menos aproximadamente un 63%, o al menos aproximadamente un 64%, o al menos aproximadamente un 65%, o al menos aproximadamente un 66%, o al menos aproximadamente un 67%, o al menos aproximadamente un 68%, o al menos aproximadamente un 69%, o al menos aproximadamente un 70%, o al menos aproximadamente un 71%, o al menos aproximadamente un 72%, o al menos aproximadamente un 73%, o al menos aproximadamente un 74%, o al menos aproximadamente un 75%, o al menos aproximadamente un 76%, o al menos aproximadamente un 77%, o al menos aproximadamente un 78%, o al menos aproximadamente un 79%, o al menos aproximadamente un 80%, o al menos aproximadamente un 81%, o al menos aproximadamente un 82%, o al menos aproximadamente un 83%, o al menos aproximadamente un 84%, o al menos aproximadamente un 85%, o al menos aproximadamente un 86%, o al menos aproximadamente un 87%, o al menos aproximadamente un 88%, o al menos aproximadamente un 89%, o al menos aproximadamente un 90%, o al menos aproximadamente un 91%,o al menos aproximadamente un 92%, o al menos aproximadamente un 93%, o al menos aproximadamente un 94%, o al menos aproximadamente un 95%, o al menos aproximadamente un 96%, o al menos aproximadamente un 97%, o al menos aproximadamente un 98%, o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de tipo salvaje conocidas de los agentes de señalización descritos en el presente documento(por ejemplog., aproximadamente un 60%, o aproximadamente un 61%, o aproximadamente un 62%, o aproximadamente un 63%, o aproximadamente un 64%, o aproximadamente un 65%, o aproximadamente un 66%, o aproximadamente un 67%, o aproximadamente un 68%, o aproximadamente un 69%, o aproximadamente un 70%, o aproximadamente un 71%, o aproximadamente un 72%, o aproximadamente un 73%, o aproximadamente un 74%, o aproximadamente un 75%, o aproximadamente un 76%, o aproximadamente un 77%, o aproximadamente un 78%, o aproximadamente un 79%, o aproximadamente un 80%, o aproximadamente un 81%, o aproximadamente un 82%, o aproximadamente un 83%, o aproximadamente un 84%, o aproximadamente un 85%, o aproximadamente un 86%, o aproximadamente un 87%, o aproximadamente un 88%, o aproximadamente un 89%, o aproximadamente un 90%, o aproximadamente un 91%, o aproximadamente un 92%, o aproximadamente un 93%, o aproximadamente un 94%, o aproximadamente un 95%, o aproximadamente un 96%, o aproximadamente un 97%, o aproximadamente un 98%, o aproximadamente un 99% de identidad de secuencia).

En diversas realizaciones, el agente de señalización modificado adicional comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 60%, o al menos aproximadamente un 61%, o al menos aproximadamente un 62%, o al menos aproximadamente un 63%, o al menos aproximadamente un 64%, o al menos aproximadamente un 65%, o al menos aproximadamente un 66%, o al menos aproximadamente un 67%, o al menos aproximadamente un 68%, o al menos aproximadamente un 69%, o al menos aproximadamente un 70%, o al menos aproximadamente un 71%, o al menos aproximadamente un 72%, o al menos aproximadamente un 73%, o al menos aproximadamente un 74%, o al menos aproximadamente un 75%, o al menos aproximadamente un 76%, o al menos aproximadamente un 77%, o al menos aproximadamente un 78%, o al menos aproximadamente un 79%, o al menos aproximadamente un 80%, o al menos aproximadamente un 81%, o al menos aproximadamente un 82%, o al menos aproximadamente un 83%, o al menos aproximadamente un 84%, o al menos aproximadamente un 85%, o al menos aproximadamente un 86%, o al menos aproximadamente un 87%, o al menos aproximadamente un 88%, o al menos aproximadamente un 89%, o al menos aproximadamente un 90%, o al menos aproximadamente un 91%, o al menos aproximadamente un 92%, o al menos aproximadamente un 93%, o al menos aproximadamente un 94%, o al menos aproximadamente un 95%, o al menos aproximadamente un 96%, o al menos aproximadamente un 97%, o al menos aproximadamente un 98%, o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias divulgadas en el presente documento (e.g., aproximadamente un 60%, o aproximadamente un 61%, o aproximadamente un 62%, o aproximadamente un 63%, o aproximadamente un 64%, o aproximadamente un 65%, o aproximadamente un 66%, o aproximadamente un 67%, o aproximadamente un 68%, o aproximadamente un 69%, o aproximadamente un 70%, o aproximadamente un 71%, o aproximadamente un 72%, o aproximadamente un 73%, o aproximadamente un 74%, o aproximadamente un 75%, o aproximadamente un 76%, o aproximadamente un 77%, o aproximadamente un 78%, o aproximadamente un 79%, o aproximadamente un 80%, o aproximadamente un 81%, o aproximadamente un 82%, o aproximadamente un 83%, o aproximadamente un 84%, o aproximadamente un 85%, o aproximadamente un 86%, o aproximadamente un 87%, o aproximadamente un 88%, o aproximadamente un 89%, o aproximadamente un 90%, o aproximadamente un 91%, o aproximadamente un 92%, o aproximadamente un 93%, o aproximadamente un 94%, o aproximadamente un 95%, o aproximadamente un 96%, o aproximadamente un 97%, o aproximadamente un 98%, o aproximadamente un 99% de identidad de secuencia).

En varias realizaciones, el agente de señalización adicional modificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una o más mutaciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, las una o más mutaciones de aminoácidos pueden seleccionarse independientemente entre sustituciones, inserciones, deleciones y truncamientos.

En algunas realizaciones, las mutaciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos, y pueden incluir sustituciones conservadoras y/o no conservadoras como se describe en el presente documento.

Como se describe en el presente documento, los agentes de señalización modificados adicionales llevan mutaciones que afectan la afinidad y/o la actividad en uno o más receptores. En varias realizaciones, hay una afinidad y/o actividad reducida en un receptor terapéutico, por ejemplo, un receptor a través del cual se media un efecto terapéutico deseado (por ejemplo, agonismo o antagonismo). En varias realizaciones, los agentes de señalización modificados llevan mutaciones que reducen sustancialmente o abaten la afinidad y/o la actividad en un receptor, por ejemplo, un receptor a través del cual no se media un efecto terapéutico deseado (por ejemplo, como resultado de la promiscuidad de la unión). Los receptores de cualquier agente de señalización modificado, por ejemplo, una de las citoquinas, factores de crecimiento y hormonas descritas en el presente documento, son conocidos en la técnica. Las mutaciones ilustrativas que proporcionan una afinidad y/o actividad reducida (por ejemplo, agonística) en un receptor se encuentran en el documento WO 2013/107791 (por ejemplo, con respecto a los interferones), documento WO 2015/007542 (por ejemplo, con respecto a las interleucinas), y documento WO 2015/007903 (por ejemplo, con respecto al TNF). Las mutaciones ilustrativas que proporcionan una afinidad y/o actividad reducida (por ejemplo, antagonista) en un receptor terapéutico se encuentran en documento WO 2015/007520.

En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado adicionalmente comprende una o más mutaciones que hacen que el agente de señalización tenga una afinidad y/o actividad reducida por un receptor de citoquina de tipo I, un receptor de citoquina de tipo II, un receptor de quimioquina, un receptor de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR), los receptores de TGF-beta, un receptor de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig), y/o un receptor de la superfamilia de las tirosina quinasas.

En varias realizaciones, el receptor para el agente de señalización adicional es un receptor de citoquina de tipo I. Los receptores de citoquinas de tipo I son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a los receptores de IL2 (subunidad beta), IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL9, IL11, IL12, GM-CSF, G-CSF, LIF, CNTF, y también los receptores de trombopoyetina (TPO), prolactina y hormona del crecimiento. Los receptores de citoquinas de tipo I ilustrativos incluyen, entre otros, el receptor GM-CSF, el receptor G-CSF, el receptor LIF, el receptor CNTF, el receptor TPO y los receptores IIL de tipo.

En varias realizaciones, el receptor para el agente de señalización adicional es un receptor de citoquina de tipo II. Los receptores de citoquinas de tipo II son receptores multiméricos compuestos por subunidades heterólogas, y son receptores principalmente para los interferones. Esta familia de receptores incluye, entre otros, los receptores para el interferón-a, el interferón-p y el interferón-y, la IL10, la IL22 y el factor tisular. Los receptores de citoquinas de tipo II ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, el receptor de IFN-a (por ejemplo, IFNAR1 e IFNAR2), el receptor de IFN-p, el receptor de IFN-Y(por ejemplo, IFNGR1 e IFNGR2) y los receptores de IL de tipo II.

En varias realizaciones, el receptor para el agente de señalización adicional es un receptor acoplado a proteínas G. Los receptores de quimioquinas son receptores acoplados a proteínas G con una estructura de siete transmembranas y acoplados a proteínas G para la transducción de señales. Los receptores de quimioquinas incluyen, entre otros, los receptores de quimioquinas CC, los receptores de quimioquinas CXC, los receptores de quimioquinas CX3C y el receptor de quimioquinas XC (XCR1). Los receptores de quimioquinas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR3B, CXCR4, CXCR5, CSCR6, CXCR7, XCR1 y CX3CR1.

En varias realizaciones, el receptor para el agente de señalización adicional es un miembro de la familia TNFR. Los miembros de la familia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) comparten un dominio rico en cisteína (CRD) formado por tres enlaces disulfuro que rodean un motivo central de CXXCXXC creando una molécula alargada. Algunos ejemplos de miembros de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral son: CDI 20a (TNFRSFIA), CD 120b (TNFRSFIB), receptor de linfotoxina beta (LTBR, TNFRSF3), CD 134 (TNFRSF4), CD40 (CD40, TNFRSF5), FAS (FAS, TNFRSF6), TNFRSF6B (TNFRSF6B), CD27 (CD27, TNFRSF7), CD30 (TNFRSF8), CD137 (TNFRSF9), TNFRSFIOA (TNFRSFIOA), TNFRSFIOB, (TNFRSFIOB), TNFRSFIOC (TNFRSFIOC), TNFRSFIOD (TNFRSFIOD), RANK (TNFRSFI IA), Osteoprotegerina (TNFRSFI IB), TNFRSF12A (TNFRSF12A), TNFRSF13B (TNFRSF13B), TNFRSF13C (TNFRSF13C), TNFRSF14 (TNFRSF14), Receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR, TNFRSF16), TNFRSF17 (TNFRSF17), TNFRSF18 (TNFRSF18), TNFRSF19 (TNFRSF19), TNFRSF21 (TNFRSF21) y TNFRSF25 (TNFRSF25).

En varias realizaciones, el receptor para el agente de señalización adicional es un receptor TGF-beta. Los receptores del TGF-beta son receptores de serina/treonina quinasa de un solo paso. Los receptores de TGF-beta incluyen, entre otros, TGFBR1, TGFBR2 y TGFBR3.

En varias realizaciones, el receptor para el agente de señalización adicional es un receptor de la superfamilia Ig. Los receptores de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig) comparten una homología estructural con las inmunoglobulinas. Los receptores de la superfamilia Ig incluyen, entre otros, los receptores de interleucina-1, CSF-1R, PDGFR (por ejemplo, PDGFRA y PDGFRB) y SCFR.

En varias realizaciones, el receptor para el agente de señalización adicional es un receptor de la superfamilia de la tirosina quinasa. Los receptores de la superfamilia de la tirosina quinasa son bien conocidos en la técnica. Se conocen alrededor de 58 receptores tirosina quinasa (RTK), agrupados en 20 subfamilias. Los receptores de la superfamilia de la tirosina quinasa incluyen, entre otros, los receptores del FGF y sus diversas isoformas, como el FGFR1, el FGFR2, el FGFR3, el FGFR4 y el FGFR5.

En una realización, el agente de señalización modificado adicional es el interferón p. En dichas realizaciones, el agente de interferón p modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por el receptor IFN-a/p (IFNAR), es decir, las cadenas IFNAR1 y/o IFNAR2. En algunas realizaciones, el agente de interferón p modificado tiene afinidad y/o actividad sustancialmente reducidas para el receptor IFN-a/p (IFNAR), es decir, las cadenas IFNAR1 y/o IFNAR2.

En una realización, el agente de señalización modificado adicional es otro interferón ^y. En tales realizaciones, el agente de interferón y modificado también tiene afinidad y/o actividad reducida por el receptor de interferón-Y (IFNGR), es decir, las subunidades del receptor de interferón-Y 1 y/o del receptor de interferón-Y 2. En algunas realizaciones, el agente de interferón Y modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por el receptor de interferón-Y, es decir, las subunidades del receptor de interferón-Y 1 y/o del receptor de interferón-Y 2.

En algunas realizaciones, el agente de señalización adicional modificado es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). El VEGF es un potente factor de crecimiento que desempeña un papel importante en la angiogénesis fisiológica pero también patológica, regula la permeabilidad vascular y puede actuar como factor de crecimiento en las células que expresan receptores de VEGF. Otras funciones adicionales incluyen, entre otras, la estimulación de la migración celular en el linaje de los macrófagos y las células endoteliales. Existen varios miembros de la familia de factores de crecimiento VEGF, así como al menos tres receptores (VEGFR-1, VEGFR -2 y VEGFR -3). Los miembros de la familia del VEGF pueden unirse y activar más de un tipo de VEGFR. Por ejemplo, el VEGF-A se une a VEGFR-1 y -2, mientras que el V^e GF-C puede unirse a VEGFR-2 y -3. La activación de V^eG^f R-1 y -2 regula la angiogénesis, mientras que la activación de VEGFR-3 se asocia a la linfangiogénesis. La principal señal pro-angiogénica se genera a partir de la activación del VEGFR-2. Se ha informado de que la activación del VEGFR-1 está posiblemente asociada a un papel negativo en la angiogénesis. También se ha informado de que la señalización del VEGFR-1 es importante para la progresión de los tumores in vivo a través de las células positivas al VEGFR-1 derivadas de la médula ósea (contribuyendo a la formación del nicho premetastásico en el hueso). Se han desarrollado varias terapias basadas en anticuerpos terapéuticos dirigidos/neutralizadores del VEGF-A, principalmente para su uso en el tratamiento de diversos tumores humanos que dependen de la angiogénesis. Sin embargo, esto no está exento de efectos secundarios. Esto puede no ser sorprendente si se tiene en cuenta que estos actúan como inhibidores generales de la interacción VEGF/VEGFR, no específicos para las células o los tejidos. Por lo tanto, sería deseable restringir la inhibición de VEGF (por ejemplo, VEGF-A)/VEGFR-2 a células diana específicas (por ejemplo, células endoteliales de la vasculatura tumoral).

En algunas realizaciones, el VEGF es VEGF-A, VEGF-B, VEFG-C, VEGF-D, o VEGF-E e isoformas de los mismos, incluyendo las diversas isoformas de VEGF-A como VEGF121, VEGF-^-ib, VEGF145, VEGF165, VEGF-^b, VEGF189, y VEGF206. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene afinidad y/o actividad reducida por el VEGFR-1 (Flt-1) y/o el VEGFR-2 (KDR/Flk-1). En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por VEGFR-1 (Flt-1) y/o VEGFR-2 (KDR/Flk-1). En una realización, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida para el VEGFR-2 (KDR/Flk-1) y/o una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida para el VEGFR-1 (Flt-1). Se divulga un agente de señalización modificado de este tipo para su uso, por ejemplo, en procedimientos de curación de heridas o en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la isquemia (sin querer estar limitado por la teoría, mediada por los efectos del VEGFR-2 sobre la función de las células endoteliales y la angiogénesis). En varias realizaciones, se evita la unión a VEGFR-1 (Flt-1), que está vinculada a cánceres y actividades proinflamatorias. En varias realizaciones, el VEGFR-1 (Flt-1) actúa como un receptor señuelo y, por lo tanto, la reducción sustancial o la ablación de la afinidad y/o la actividad en este receptor evita el secuestro del agente terapéutico. En una realización, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por el VEGFR-1 (Flt-1) y/o una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por el VEGFR-2 (KDR/Flk-1). En algunas realizaciones, el VEGF es VEGF-C o VEGF-D. En dichas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por el VEGFR-3. Alternativamente, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por el VEGFR-3.

Las terapias proangiogénicas también son importantes en varias enfermedades (por ejemplo, cardiopatía isquémica, hemorragias, etc.), e incluyen terapias basadas en el VEGF. La activación del VEGFR-2 es proangiogénica (actúa sobre las células endoteliales). La activación del VEFGR-1 puede provocar la estimulación de la migración de las células inflamatorias (incluidos, por ejemplo, los macrófagos) y conducir a la permeabilidad hipervascular asociada a la inflamación. La activación de VEFGR-1 también puede promover la formación de nichos tumorales asociados a la médula ósea. Por lo tanto, en este caso sería deseable una terapia basada en el VEGF y selectiva para la activación del VEGFR-2. Además, sería deseable que se dirigiera específicamente a las células, por ejemplo, a las células endoteliales.

En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado adicional tiene una afinidad y/o actividad reducida(por ejemplo, antagonista) para el VEGFR-2 y/o tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida para el VEGFR-1. Cuando se dirige a las células endoteliales de la vasculatura tumoral a través de una fracción dirigida que se une a un marcador de células endoteliales tumorales (por ejemplo, PSMA y otros), dicha construcción inhibe la activación del VEGFR-2 específicamente en dichas células positivas al marcador, mientras que no activa el VEGFR-1 en el camino y en las células diana (si la actividad es abladida), eliminando así la inducción de respuestas inflamatorias, por ejemplo. Esto proporcionaría una terapia antiangiogénica más selectiva y segura para muchos tipos de tumores en comparación con las terapias neutralizadoras del VEGF-A.

En algunas realizaciones, el agente de señalización adicional modificado tiene afinidad y/o actividad reducida (por ejemplo, agonística) para el VEGFR-2 y/o tiene afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida para el VEGFR-1. Al dirigirse a las células endoteliales vasculares, dicha construcción, en algunas realizaciones, promueve la angiogénesis sin causar la inducción de respuestas inflamatorias asociadas a VEGFR-1. Por lo tanto, esta construcción tendría efectos proangiogénicos específicos con un riesgo sustancialmente reducido de efectos secundarios causados por la activación sistémica de VEGFR-2 así como de VEGR-1.

En una realización ilustrativa, el agente de señalización modificado es el VEGF165, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 237.

En otra realización ilustrativa, el agente de señalización modificado adicional es el VEGF165b, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 288.

En estas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una mutación en el aminoácido I83 (por ejemplo, una mutación de sustitución en I83, por ejemplo, I83K, I83R o I83H). Sin querer ceñirse a la teoría, se cree que dichas mutaciones pueden dar lugar a una menor afinidad de unión al receptor. Véase, por ejemplo, Patente US n° 9.078.860.

En una realización, el agente de señalización modificado adicional es el TNF-a. El TNF es una citocina pleiotrópica con muchas funciones diversas, entre ellas la regulación del crecimiento celular, la diferenciación, la apoptosis, la tumorigénesis, la replicación viral, la autoinmunidad, las funciones y el tráfico de las células inmunitarias, la inflamación y el choque séptico. Se une a dos receptores de membrana distintos en las células diana: TNFR1 (p55) y TNFR2 (p75). El TNFR1 presenta un patrón de expresión muy amplio, mientras que el TNFR2 se expresa preferentemente en ciertas poblaciones de linfocitos, Tregs, células endoteliales, ciertas neuronas, microglía, miocitos cardíacos y células madre mesenquimales. En respuesta a la activación de los receptores se activan vías biológicas muy distintas, aunque también hay cierto solapamiento. Como regla general, sin querer ligado a teoría alguna, la señalización del TNFR1 está asociada a la inducción de la apoptosis (muerte celular) y la señalización del TNFR2 está asociada a la activación de señales de supervivencia celular (por ejemplo, la activación de la vía NFkB). La administración de TNF es sistémicamente tóxica, y esto se debe en gran medida al compromiso del TNFR1. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la activación del TNFR2 también está asociada a una amplia gama de actividades y, al igual que con el TNFR1, en el contexto del desarrollo de terapias basadas en el TNF, es importante el control de la orientación y la actividad del TNF.

En algunas realizaciones, el agente de señalización adicional modificado tiene afinidad y/o actividad reducida para el TNFR1 y/o el TNFR2. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por el TNFR1 y/o el TNFR2. El TNFR1 se expresa en la mayoría de los tejidos y participa en la señalización de la muerte celular, mientras que el TNFR2 participa en la señalización de la supervivencia celular. Por consiguiente, en los procedimientos de tratamiento del cáncer, el agente de señalización modificado puede tener una afinidad y/o actividad reducida para el TNFR1 y/o una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida para el TNFR2. En estas realizaciones, las proteínas quiméricas pueden dirigirse a una célula para la que se desea la apoptosis, por ejemplo, una célula tumoral o una célula endotelial de la vasculatura tumoral. En los procedimientos de promoción de la supervivencia celular, por ejemplo, en la neurogénesis para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos, el agente de señalización modificado puede tener afinidad y/o actividad reducidas para el TNFR2 y/o afinidad y/o actividad sustancialmente reducidas o abladidas para el TNFR1. Dicho de otro modo, las presentes proteínas quiméricas, en algunas realizaciones, comprenden el agente TNF-a modificado que permite favorecer las señales de muerte o de supervivencia.

En algunas realizaciones, la proteína quimérica tiene un TNF modificado que tiene afinidad y/o actividad reducida para el TNFR1 y/o afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida para el TNFR2. Dicha quimera, en algunas realizaciones, es un inductor más potente de la apoptosis en comparación con un TNF de tipo salvaje y/o una quimera que sólo lleva una(s) mutación(es) que causa(n) una afinidad y/o actividad reducida para el TNFR1. Tal quimera puede encontrar uso en la inducción de la muerte de las células tumorales o la muerte de las células endoteliales de la vasculatura del tumor (por ejemplo, en el tratamiento de los cánceres). Además, estas quimeras pueden evitar o reducir la activación de las células Treg a través del TNFR2, por ejemplo, apoyando así la actividad antitumoral mediada por el TNFR1 in vivo.

En algunas realizaciones, la proteína quimérica tiene un TNF modificado que tiene afinidad y/o actividad reducida para el TNFR2 y/o afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida para el TNFR1. Dicha quimera, en algunas realizaciones, es un activador más potente de la supervivencia celular en algunos tipos de células, lo que puede ser una diana terapéutica específica en varios escenarios de enfermedades, incluyendo, sin limitación, la estimulación de la neurogénesis. Además, dichas quimeras favorecedoras de TNFR2 también son útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes (por ejemplo, Crohn, diabetes, esclerosis múltiple, colitis, etc. y muchas otras descritas en el presente documento). En algunas realizaciones, la quimera se dirige a las células T autorreactivas. En algunas realizaciones, la quimera promueve la activación de las células Treg y la supresión indirecta de las células T citotóxicas.

En algunas realizaciones, la quimera causa la muerte de las células T autorreactivas, por ejemplo, mediante la activación de TNFR2 y/o la evitación de TNFR1 (por ejemplo, un TNF modificado que tenga afinidad y/o actividad reducida para TNFR2 y/o afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida para TNFR1). Sin querer limitarnos a la teoría, estas células T autorreactivas tienen sus señales de apoptosis/supervivencia alteradas, por ejemplo, por la actividad/alteraciones de la vía NFkB.

Se divulga una quimera basada en TNFR2, que tiene aplicaciones terapéuticas adicionales en enfermedades, incluyendo varias enfermedades autoinmunes, enfermedades cardíacas, trastornos desmielinizantes y neurodegenerativos, y enfermedades infecciosas, entre otras.

En una realización, el TNF-a de tipo salvaje tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 239.

En tales realizaciones, el agente TNF-a modificado tiene mutaciones en una o más posiciones de aminoácidos 29, 31, 32, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 145, 146 y 147 que producen un TNF-a modificado con afinidad de unión al receptor reducida. Véase, por ejemplo, Patente US n° 7.993.636.

En algunas realizaciones, la fracción modificada de TNF-a humano tiene mutaciones en una o más posiciones de aminoácidos R32, N34, Q67, H73, L75, T77, S86, Y87, V91 , I97, T105, P106, A109, P113, Y115, E127, N137, D143 y A145, como se describe, por ejemplo, en el documento WO/2015/007903 (numeración según la secuencia del TNF humano, número de acceso del Genbank BAG70306, versión BAG70306.1 GI: 197692685). En algunas realizaciones, la fracción modificada de TNF-a humano tiene mutaciones de sustitución seleccionadas entre R32G, N34G, Q67G, H73G, L75G, L75A, L75S, T77A, S86G, Y87Q, Y87L, Y87A, Y87F, V91G, V91A, I97A, I97Q, I97S, T105G, P106G, A109Y, P113G, Y115G, Y115A, E127G, N137G, D143N, A145G y A145T. En una realización, la fracción de TNF-a humano tiene una mutación seleccionada entre Y87Q, Y87L, Y87A e Y87F. En otra realización, la fracción de TNF-a humano tiene una mutación seleccionada entre I97A, I97Q y I97S. En otra realización, la fracción de TNF-a humano tiene una mutación seleccionada entre Y115A e Y115G.

En algunas realizaciones, el agente TNF-a modificado tiene una o más mutaciones seleccionadas entre N39Y, S147Y e Y87H, como se describe en el documento WO2008/124086.

En una realización, el agente de señalización modificado adicional es el TNF-p. El TNF-p puede formar un homotrímero o un heterotrímero con la LT-p (LT-a1p2). En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene afinidad y/o actividad sustancialmente reducidas para TNFR1 y/o TNFR2 y/o mediador de entrada del virus del herpes (HEv M) y/o LT-pR.

En una realización, el TNF-p de tipo salvaje tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 240.

En tales realizaciones, el agente de TNF-p modificado puede comprender mutaciones en uno o más aminoácidos en las posiciones 106-113, que producen un TNF-p modificado con afinidad de unión al receptor y/o actividad reducida a TNFR2. En una realización, el agente de señalización modificado tiene una o más mutaciones de sustitución en las posiciones de aminoácidos 106-113. En realizaciones ilustrativas, las mutaciones de sustitución se seleccionan entre Q107E, Q107D, S106E, S106D, Q107R, Q107N, Q107E/S106E, Q107E/S106D, Q107D/S106E y Q107D/S106D. En otra realización, el agente señalizador modificado tiene una inserción de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 aminoácidos en las posiciones 106-113.

En algunas realizaciones, el agente modificado adicional es un miembro de la familia del TNF (por ejemplo, TNF-alfa, TNF-beta) que puede ser una versión trimérica de cadena única como se describe en el documento WO 2015/007903.

En algunas realizaciones, el agente modificado es un miembro de la familia del TNF (por ejemplo, TNF-alfa, TNF-beta) que tiene una afinidad y/o actividad reducida, esdecir, actividad antagonista (por ejemplo, actividad antagonista natural o actividad antagonista que es el resultado de una o más mutaciones, véase, por ejemplo, el documento WO 2015/007520) en el TNFR1. En estas realizaciones, el agente modificado es un miembro de la familia del TNF (por ejemplo, TNF-alfa, TNF-beta) que también, opcionalmente, tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por el TNFR2. En algunas realizaciones, el agente modificado es un miembro de la familia del TNF (por ejemplo, TNF-alfa, TNF-beta) que tiene afinidad y/o actividad reducida, esdecir, actividad antagonista(por ejemplo, actividad antagonista natural o actividad antagonista que es el resultado de una o más mutaciones, véase, por ejemplo, el documento WO 2015/007520) en el TNFR2. En estas realizaciones, el agente modificado es un miembro de la familia del TNF (por ejemplo, TNF-alfa, TNF-beta) que también, opcionalmente, tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por el TNFR1. Los constructos de tales realizaciones encuentran su uso, por ejemplo, en procedimientos para amortiguar la respuesta del TNF de una manera específica para las células. En algunas realizaciones, el miembro antagonista de la familia del TNF (por ejemplo, TNF-alfa, TNF-beta) es una versión trimérica de cadena única como se describe en el documento WO 2015/007903.

En una realización, el agente de señalización adicional modificado es TRAIL. En algunas realizaciones, el agente TRAIL modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por DR4 (TRAIL-RI) y/o DR5 (TRAIL-RII) y/o DcR1 y/o DcR2. En algunas realizaciones, el agente TRAIL modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por DR4 (TRAIL-RI) y/o DR5 (TRAIL-RII) y/o DcR1 y/o DcR2.

En una realización, el TRAIL de tipo salvaje tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 241.

En tales realizaciones, el agente TRAIL modificado puede comprender una mutación en las posiciones de aminoácidos T127-R132, E144-R149, E155-H161, Y189-Y209, T214-1220,K224-A226, W231, E236-L239, E249-K251, T261-H264 y H270-E271 (Numeración basada en la secuencia humana, número de acceso del Genbank NP_003801, versión 10 NP_003801.1, GI: 4507593; véase más arriba).

En una realización, el agente de señalización modificado adicional es TGFa. En tales realizaciones, el agente TGFa modificado tiene afinidad y/o actividad reducida por el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). En algunas realizaciones, el agente TGFa modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

En una realización, el agente de señalización adicional modificado es TGFp. En tales realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por TGFBR1 y/o TGFBR2. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por TGFBR1 y/o TGFBR2. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado opcionalmente tiene afinidad y/o actividad reducida o sustancialmente reducida para TGFBR3 que, sin querer estar limitado por la teoría, puede actuar como un depósito de ligando para los receptores de TGF-beta. En algunas realizaciones, el TGFp puede favorecer a TGFBR1 sobre TGFBR2 o a TGFBR2 sobre TGFBR1. Del mismo modo, la LAP, sin querer ligado teoría alguna, puede actuar como un depósito de ligando para los receptores del TGF-beta. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por TGFBR1 y/o TGFBR2 y/o una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por el Péptido Asociado a la Latencia (LAP). Dichas quimeras podrían ser utilizadas en la enfermedad de Camurati-Engelmann, o en otras enfermedades asociadas a una señalización inadecuada del TGFp.

En algunas realizaciones, el agente modificado adicional es un miembro de la familia TGF (por ejemplo, TGFa, TGFp) que tiene afinidad y/o actividad reducida, esdecir, actividad antagonista (por ejemplo, actividad antagonista natural o actividad antagonista que es el resultado de una o más mutaciones, véase, por ejemplo, el documento WO 2015/007520) en uno o más de los TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3. En estas realizaciones, el agente modificado es un miembro de la familia TGF (por ejemplo, TGFa, TGFp) que también, opcionalmente, tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida en uno o más de los TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3.

En algunas realizaciones, el agente modificado adicional es un miembro de la familia TGF (por ejemplo, TGFa, TGFp) que tiene afinidad y/o actividad reducida, es decir, actividad antagonista (porejemplo, actividad antagonista natural o actividad antagonista que es el resultado de una o más mutaciones, véase, por ejemplo, el documento WO 2015/007520) en TGFBR1 y/o TGFBR2. En estas realizaciones, el agente modificado es un miembro de la familia TGF (por ejemplo, TGFa, TGFp) que también, opcionalmente, tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida en TGFBR3.

En una realización, el agente de señalización modificado adicional es la IL-1. En una realización, el agente de señalización modificado es IL-1a o IL-1p. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por la lL-1R1 y/o la IL-1RAcP. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por la IL-1R1 y/o la IL-1RAcP. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por la IL-1R2. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por la IL-1R2. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los presentes agentes de IL-1 modificados evitan la interacción en IL-1R2 y, por lo tanto, reducen sustancialmente su función como señuelo y/o sumidero de agentes terapéuticos.

En una realización, la IL-1p de tipo salvaje tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 242.

La IL1 es una citoquina proinflamatoria y un importante regulador del sistema inmunitario. Es un potente activador de las respuestas de las células T CD4, aumenta la proporción de células Th17 y la expansión de las células productoras de IFN-y e IL-4. La IL-1 también es un potente regulador de las células T CD8+, que potencia la expansión, la diferenciación, la migración a la periferia y la memoria de los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno. Los receptores de la IL-1 comprenden la IL-1R1 y la IL-1R2. La unión y la señalización a través de la IL-1R1 constituyen el mecanismo por el que la IL-1 media en muchas de sus actividades biológicas (y patológicas). La IL1-R2 puede funcionar como un receptor señuelo, reduciendo así la disponibilidad de la IL-1 para su interacción y señalización a través de la IL-1R1.

En algunas realizaciones, la IL-1 modificada tiene afinidad y/o actividad reducida (porejemplo, actividad agonística) para la IL-1R1. En algunas realizaciones, la IL-1 modificada tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por la IL-1R2. En tales realizaciones, se restablece la señalización de IL-1/ IL-1R1 y se evita la pérdida de quimeras terapéuticas en IL-R2 y, por lo tanto, se reduce la dosis de IL-1 que se requiere ( porejemplo, en relación con el tipo salvaje o con una quimera que lleva sólo una mutación de atenuación para IL-R1). Dichas construcciones se utilizan, por ejemplo, en procedimientos de tratamiento del cáncer, incluyendo, por ejemplo, la estimulación del sistema inmunitario para montar una respuesta anticancerosa.

En algunas realizaciones, la IL-1 modificada tiene afinidad y/o actividad reducida (porejemplo, actividad antagonista, por ejemplo, actividad antagonista natural o actividad antagonista que es el resultado de una o más mutaciones, véase, porejemplo, el documento WO 2015/007520) para la IL-1R1. En algunas realizaciones, la IL-1 modificada tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por la IL-1R2. En tales realizaciones, la señalización de IL-1/ IL-1R1 no es restaurable y la prevención de la pérdida de quimeras terapéuticas en IL-R2 y, por lo tanto, una reducción de la dosis de IL-1 que se requiere (porejemplo, en relación con el tipo salvaje o una quimera que lleva sólo una mutación de atenuación para IL-R1). Dichas construcciones se utilizan, por ejemplo, en procedimientos de tratamiento de enfermedades autoinmunes, incluyendo, por ejemplo, la supresión del sistema inmunitario.

En tales realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una deleción de los aminoácidos 52-54 que produce una IL-1p humana modificada con afinidad de unión reducida para el IL-1R de tipo I y actividad biológica reducida. Véase, por ejemplo, el documento WO 1994/000491. En algunas realizaciones, la IL-1p humana modificada tiene una o más mutaciones de sustitución seleccionadas entre A117G/P118G, R120X, L122A, T125G/L126G, R127G, Q130X, Q131G, K132A, S137G/Q138Y, L145G, H146X, L145A/L147A, Q148X, Q148G/Q150G, Q150G/D151A, M152G, F162A, F162A/Q164E, F166A, Q164E/E167K, N169G/D170G, I172A, V174A, K208E, K209X, K209A/K210A, K219X, E221X, E221 S/N224A, N224S/K225S, E244K, N245Q (donde X puede ser cualquier cambio en el aminoácido, e.g., un cambio no conservativo), que presentan una unión reducida al IL-1R, como se describe, por ejemplo, en los documentos WO2015/007542 y WO/2015/007536 (base de numeración de la secuencia de IL-1 p humana, número de acceso del Genbank NP_000567, versión NP-000567.1 , GI: 10835145). En algunas realizaciones, la IL-1p humana modificada puede tener una o más mutaciones seleccionadas entre R120A, R120G, Q130A, Q130W, H146A, H146G, H146E, H146N, H146R, Q148E, Q148G, Q148L, K209A, K209D, K219S, K219Q, E221S y E221K. En una realización, la IL-ip humana modificada comprende las mutaciones Q131G y Q148G. En una realización, la IL-1p humana modificada comprende las mutaciones Q148G y K208E. En una realización, la IL-1p humana modificada comprende las mutaciones R120G y Q131G. En una realización, la IL-1p humana modificada comprende las mutaciones R120G y H146G. En una realización, la IL-1p humana modificada comprende las mutaciones R120G y K208E. En una realización, la IL-1p humana modificada comprende las mutaciones R120G, F162A y Q164E.

En una realización, el agente de señalización modificado adicional es la IL-2. En dicha realización, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por la IL-2Ra y/o la IL-2Rp y/o la IL-2Ry. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por la IL-2Rp y/o la IL-2Ry. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por la IL-2Ra. Se divulga la IL-2 modificada, que es agonista en lL-2Rp y/o IL-2Ry, para el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, las presentes construcciones pueden favorecer la activación atenuada de las células T CD8+ (que pueden proporcionar un efecto antitumoral), que tienen receptores de IL2 p y y y desfavorecer a las Tregs (que pueden proporcionar un efecto inmunosupresor, pro-tumoral), que tienen receptores de IL2 a, p y ^y. Además, en algunas realizaciones, las preferencias por la IL-2Rp y/o la IL-2R^y sobre la IL-2Ra evitan los efectos secundarios de la IL-2, como el edema pulmonar. Asimismo, las quimeras basadas en IL-2 son útiles para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, por ejemplo cuando la IL-2 modificada es antagonista ('porejemplo, actividad antagonista natural o actividad antagonista que es el resultado de una o más mutaciones, véase, por ejemplo, el documento WO 2015/007520) en IL-2Rp y/o IL-2Ry. Por ejemplo, las presentes construcciones pueden favorecer la supresión atenuada de las células T CD8+ (y, por lo tanto, amortiguar la respuesta inmunitaria), que tienen receptores de IL2 p y y y desfavorecer a las Tregs que tienen receptores de IL2 a, p y y. Alternativamente, en algunas realizaciones, las quimeras que llevan IL-2 favorecen la activación de Tregs, y por lo tanto la supresión inmune, y la activación de disfavor de las células T CD8+. Por ejemplo, estas construcciones se utilizan en el tratamiento de enfermedades o dolencias que se beneficiarían de la supresión inmunitaria, por ejemplo, los trastornos autoinmunes.

En algunas realizaciones, la proteína quimérica tiene fracciones dirigidas como los descritos en el presente documento dirigidos a las células T CD8+, así como un agente de IL-2 modificado que tiene afinidad y/o actividad reducidas para IL-2Rp y/o IL-2R^y y/o afinidad y/o actividad sustancialmente reducidas o abladidas para IL-2Ra. En algunas realizaciones, estas construcciones proporcionan una actividad de células T CD8+ dirigida y son generalmente inactivas (o tienen una actividad sustancialmente reducida) hacia las células Treg. En algunas realizaciones, dichos constructos tienen un efecto inmunoestimulante mejorado en comparación con la IL-2 de tipo salvaje (porejemplo, sin querer estar limitado por la teoría, al no estimular las Tregs), mientras que eliminan o reducen la toxicidad sistémica asociada a la IL-2.

En una realización, la IL-2 de tipo salvaje tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 243.

En tales realizaciones, el agente IL-2 modificado tiene una o más mutaciones en los aminoácidos L72 (L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R, o L72K), F42 (F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, o F42K) e Y45 (Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R o Y45K). Sin querer estar limitado por la teoría, se cree que estos agentes de IL-2 modificados tienen una afinidad reducida por el receptor de IL-2 de alta afinidad y conservan la afinidad por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, en comparación con la IL-2 de tipo salvaje. Véase, por ejemplo, la publicación de patente US n° 2012/0244112.

En una realización, el agente de señalización modificado adicional es la IL-3. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por el receptor de IL-3, que es un heterodímero con una cadena alfa única emparejada con la subunidad beta común (beta c o CD131). En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por el receptor de IL-3, que es un heterodímero con una cadena alfa única emparejada con la subunidad beta común (beta c o CD131).

En una realización, el agente de señalización adicional modificado es la IL-4. En dicha realización, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por los receptores de IL-4 de tipo 1 y/o 2. En una realización de este tipo, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por los receptores de IL-4 tipo 1 y/o tipo 2. Los receptores de IL-4 de tipo 1 están compuestos por la subunidad IL-4Ra con una cadena y común y se unen específicamente a la IL-4. Los receptores de IL-4 de tipo 2 incluyen una subunidad de IL-4Ra unida a una subunidad diferente conocida como IL-13Ra1. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene afinidad y/o actividad sustancialmente reducidas a los receptores de IL-4 de tipo 2.

En una realización, la IL-4 de tipo salvaje tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 244.

En tales realizaciones, el agente IL-4 modificado tiene una o más mutaciones en los aminoácidos R121 (R121A, R121D, R121E, R121F, R121H, R121I, R121K, R121N, R121P, R121T, R121W), E122 (E122F), Y124 (Y124A, Y124Q, Y124R, Y124S, Y124T) y S125 (S125A). Sin querer quedar ligado a teoría alguna, se cree que estos agentes de IL-4 modificados mantienen la actividad mediada por el receptor de tipo I, pero reducen significativamente la actividad biológica mediada por los otros receptores. Véase, por ejemplo, Patente US n° 6.433.157.

En una realización, el agente de señalización modificado adicional es la IL-6. La IL-6 señala a través de un complejo de receptores de citoquinas de tipo I en la superficie de las células, que incluye la cadena de IL-6R de unión al ligando (CD126) y el componente de transmisión de señales gp130. La IL-6 también puede unirse a una forma soluble de IL-6R (sIL-6R), que es la porción extracelular de la IL-6R. El complejo sIL-6R/IL-6 puede estar implicado en el crecimiento de las neuritas y en la supervivencia de las neuronas y, por tanto, puede ser importante en la regeneración de los nervios mediante la remielinización. En consecuencia, en algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por IL-6R/gp130 y/o sIL-6R. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por IL-6R/gp130 y/o sIL-6R.

En una realización, la IL-6 de tipo salvaje tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 245.

En tales realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una o más mutaciones en los aminoácidos 58, 160, 163, 171 o 177. Sin querer estar limitado por la teoría, se cree que estos agentes de IL-6 modificados presentan una afinidad de unión reducida a IL-6Ralpha y una actividad biológica reducida. Véase, por ejemplo, el documento WO 97/10338.

En una realización, el agente de señalización modificado adicional es la IL-10. En dicha realización, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por el receptor-1 de IL-10 y el receptor-2 de IL-10. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene afinidad y/o actividad sustancialmente reducidas para el receptor-1 de IL-10 y el receptor-2 de IL-10

En una realización, el agente de señalización modificado adicional es la IL-11. En dicha realización, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por IL-11Ra y/o IL-11Rp y/o gp130. En una realización de este tipo, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por IL-11Ra y/o IL-11Rp y/o gp130.

En una realización, el agente de señalización modificado adicional es la IL-12. En dicha realización, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por la IL-12Rp1 y/o la IL-12Rp2. En una realización de este tipo, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por la IL-12Rp1 y/o la IL-12Rp2.

En una realización, el agente de señalización modificado adicional es la IL-13. En dicha realización, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por el receptor de IL-4 (IL-4Ra) y IL-13Ra1. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene afinidad y/o actividad sustancialmente reducidas para el receptor de IL-4 (IL-4Ra) o IL-13Ra1.

En una realización, la IL-13 de tipo salvaje tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 246.

En tales realizaciones, el agente IL-13 modificado tiene una o más mutaciones en los aminoácidos 13, 16, 17, 66, 69, 99, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 112, 113 y 114. Sin querer ceñirse a la teoría, se cree que estos agentes de IL-13 modificados presentan una actividad biológica reducida. Véase, por ejemplo, el documento WO 2002/018422.

En una realización, el agente de señalización modificado adicional es la IL-18. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene afinidad y/o actividad reducida por la IL-18Ra y/o la IL-18Rp. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por la IL-18Ra y/o la IL-18Rp. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por la IL-18Ra tipo II, que es una isoforma de la IL-18Ra que carece del dominio TIR necesario para la señalización.

En una realización, la IL-18 de tipo salvaje tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 247.

En tales realizaciones, el agente de IL-18 modificado puede comprender una o más mutaciones en aminoácidos o regiones de aminoácidos seleccionadas de Y37-K44, R49-Q54, D59-R63, E67-C74, R80, M87-A97, N 127-K129, Q139-M149, K165-K171, R183 y Q190-N191, como se describe en WO/2015/007542 (numeración basada en la secuencia de IL-18 humana, número de acceso del Genbank AAV38697, versión AAV38697.1, GI: 54696650). En una realización, el agente de señalización modificado adicional es la IL-33. En dicha realización, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por el receptor ST-2 y la IL-1RAcP. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por el receptor ST-2 y la IL-1 RAcP.

En una realización, la IL-33 de tipo salvaje tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 248.

En tales realizaciones, el agente de IL-33 modificado puede comprender una o más mutaciones en aminoácidos o regiones de aminoácidos seleccionadas de I113-Y122, S127-E139, E144-D157, Y163-M183, E200, Q215, L220-C227 y T260-E269, como se describe en el documento WO/2015/007542 (numeración basada en la secuencia humana, número de acceso del Genbank NP_254274, versión NP_254274.1, Gi:15559209).

En una realización, el agente de señalización modificado es el factor de crecimiento epidérmico (EGF). El EGF pertenece a una familia de potentes factores de crecimiento. Entre sus miembros se encuentran el EGF, el HB-EGF y otros como el TGFalfa, la anfiregulina, las neuregulinas, la epiregulina y la betacelulina. Los receptores de la familia EGF incluyen EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3 y ErbB4. Estos pueden funcionar como subtipos de receptores homodiméricos y/o heterodiméricos. Los distintos miembros de la familia del EGF presentan una selectividad diferencial para los distintos subtipos de receptores. Por ejemplo, el EGF se asocia con ErbB1/ErbB1, ErbB1/ErbB2, ErbB4/ErbB2 y algunos otros subtipos heterodiméricos. El HB-EGF tiene un patrón similar, aunque también se asocia con el ErbB4/4. La modulación de la señalización del factor de crecimiento EGF (similar al EGF), de forma positiva o negativa, es de considerable interés terapéutico. Por ejemplo, la inhibición de la señalización de los EGFRs es de interés en el tratamiento de varios cánceres en los que la señalización de los EGFRs constituye una importante señal promotora del crecimiento. Alternativamente, la estimulación de la señalización de los EGFRs es de interés terapéutico para, por ejemplo, promover la curación de heridas (agudas y crónicas), la mucositis oral (un efecto secundario importante de varias terapias contra el cáncer, incluyendo, sin limitación, la radioterapia).

En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado adicional tiene afinidad y/o actividad reducida para ErbB1, ErbB2, ErbB3, y/o ErbB4. Este agente de señalización modificado puede utilizarse, por ejemplo, en procedimientos de tratamiento de heridas. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado se une a uno o más ErbB1, ErbB2, ErbB3 y ErbB4 y antagoniza la actividad del receptor. En dichas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por ErbB1, ErbB2, ErbB3, y/o ErbB4 que permite antagonizar la actividad del receptor de forma atenuada. Este agente de señalización modificado puede ser utilizado, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer. En una realización, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por el ErbB1. El ErbB1 es la diana terapéutica de los inhibidores de la quinasa; la mayoría tienen efectos secundarios porque no son muy selectivos (por ejemplo, gefitinib, erlotinib, afatinib, brigatinib e icotinib). En algunas realizaciones, la señalización antagonista atenuada de ErbB1 es más específica y tiene menos efectos secundarios que otros agentes dirigidos a los receptores de EGF.

En algunas realizaciones, el agente de señalización adicional modificado tiene afinidad y/o actividad reducida( por ejemplo, actividad antagonista natural o actividad antagonista que es el resultado de una o más mutaciones, véase, porejemplo, el documento WO 2015/007520) para ErbB1 y/o afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida para ErbB4 u otros subtipos con los que pueda interactuar. Mediante la dirección específica a través de la fracción dirigida, la supresión selectiva de células (antagonismo ,por ejemplo, actividad antagónica natural o actividad antagónica que es el resultado de una o más mutaciones, véase, por ejemplo, el documento WO 2015/007520) de la activación de los receptores ErbB1/ErbB1, sin comprometer otros subtipos de receptores potencialmente asociados a efectos secundarios de inhibición. Por lo tanto, a diferencia de los inhibidores de la quinasa del EGFR, que inhiben la actividad del EGFR en todos los tipos de células del organismo, dicho constructo proporcionaría un efecto farmacológico anti-EGFR (ErbB1) selectivo para la célula(por ejemplo, la célula tumoral con la señalización del EGFR activada debido a la amplificación del receptor, la sobreexpresión, etc.) con efectos secundarios reducidos.

En algunas realizaciones, el agente de señalización adicional modificado tiene afinidad y/o actividad reducida (por ejemplo, agonística) para ErbB4 y/o otros subtipos con los que puede interactuar. Al dirigirse a células diana específicas a través de la fracción diana, se consigue una activación selectiva de la señalización de ErbB1(por ejemplo, células epiteliales). Tal construcción puede encontrar uso en el tratamiento de heridas (promoviendo la curación) con efectos secundarios reducidos, especialmente para el tratamiento de condiciones crónicas y la aplicación distinta de la aplicación tópica de una terapéutica(por ejemplo, la curación de heridas sistémicas).

En una realización, el agente de señalización modificado es insulina o análogos de la insulina. En algunas realizaciones, la insulina o el análogo de la insulina modificados tienen una afinidad y/o actividad reducida por el receptor de la insulina y/o el receptor de IGF1 o IGF2. En algunas realizaciones, la insulina modificada o el análogo de la insulina tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por el receptor de la insulina y/o el receptor de IGF1 o IGF2. La respuesta atenuada en el receptor de la insulina permite el control de la diabetes, la obesidad, los trastornos metabólicos y similares, mientras que el alejamiento del receptor IGF1 o IGF2 evita los efectos pro-cáncer.

En una realización, el agente de señalización modificado es el factor de crecimiento similar a la insulina-I o el factor de crecimiento similar a la insulina-II (IGF-1 o IGF-2). En una realización, el agente de señalización modificado es el IGF-1. En dicha realización, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por el receptor de insulina y/o el receptor de IGF1. En una realización, el agente de señalización modificado puede unirse al receptor IGF1 y antagonizar la actividad del receptor. En dicha realización, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por el receptor IGF1 que permite antagonizar la actividad del receptor de forma atenuada. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por el receptor de insulina y/o el receptor de IGF1. En algunas realizaciones, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad reducida por el receptor IGF2 que permite antagonizar la actividad del receptor de forma atenuada. En una realización, el agente de señalización modificado tiene una afinidad y/o actividad sustancialmente reducida o abladida por el receptor de la insulina y, en consecuencia, no interfiere con la señalización de la insulina. Esto puede aplicarse al tratamiento del cáncer. Se dan a conocer los presentes agentes, que pueden evitar que la isoforma A del IR cause resistencia a los tratamientos contra el cáncer.

En una realización, el agente de señalización modificado es EPO. En varias realizaciones, el agente de EPO modificado tiene afinidad y/o actividad reducida por el receptor de EPO (EPOR) y/o el receptor de efrina (EphR) en relación con la EPO de tipo salvaje u otros agentes basados en EPO descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el agente de EPO modificado tiene afinidad y/o actividad sustancialmente reducidas para el receptor de EPO (EPOR) y/o el receptor de Eph (EphR). Los receptores de EPO ilustrativos incluyen, entre otros, un homodímero EPOR o un heterodímero EPOR/CD131. También se incluye como receptor de la ^e P^o el receptor betacomún (pcR). Los receptores Eph ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5 y EPHB6. En algunas realizaciones, la proteína EPO modificada comprende una o más mutaciones que hacen que la proteína EPO tenga una afinidad reducida por los receptores que comprenden uno o más receptores EPO o receptores Eph diferentesfporejemplo, heterodímeros, heterotrímeros, etc., incluyendo a título no limitativo: EPOR-EPHB4, EPOR-pcR-EPOR). También se proporcionan los receptores de Publicación de Patente EP No. 2492355 incluyendo, a título no limitativo, los NEPOR.

En una realización, la EPO humana tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 249, en el que el péptido señal comprende los primeros 27 aminoácidos.

En una realización, la proteína EPO humana es la forma madura de EPO (con el péptido de señalización escindido) que es una glicoproteína de 166 residuos de aminoácidos que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 250.

Se predice que la estructura de la proteína EPO humana comprende haces de cuatro hélices que incluyen las hélices A, B, C y D. En varias realizaciones, la proteína EPO modificada comprende una o más mutaciones localizadas en cuatro regiones de la proteína EPO que son importantes para la bioactividad, es decir, los residuos de aminoácidos 10-20, 44-51, 96-108 y 142-156. En algunas realizaciones, la una o más mutaciones están localizadas en los residuos 11-15, 44-51, 100-108 y 147-151. Estos residuos se localizan en la hélice A (Val11, Arg14 y Tyr15), la hélice C (Ser100, Arg103, Ser104 y Leu108), la hélice D (Asn147, Arg150, Gly151 y Leu155) y el bucle de conexión A/B (residuos 42-51). En algunas realizaciones, la proteína EPO modificada comprende mutaciones en residuos entre los aminoácidos 41-52 y los aminoácidos 147, 150, 151 y 155. Sin querer quedar ligado a teoría alguna, se cree que las mutaciones de estos residuos tienen efectos sustanciales tanto en la unión al receptor como en la actividad biológica in vitro. En algunas realizaciones, la proteína EPO modificada comprende mutaciones en los residuos 11, 14, 15, 100, 103, 104 y 108. Sin querer ceñirse a la teoría, se cree que las mutaciones de estos residuos tienen efectos modestos en la actividad de unión al receptor y efectos mucho mayores en la actividad biológica in vitro. Las sustituciones ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, una o más de Val11 Ser, Arg14Ala, Arg14Gln, Tyr15lle, Pro42Asn, Thr44lle, Lys45Asp, Val46Ala, Tyr51Phe, Ser100Glu, Ser100Thr, Arg103Ala, Ser104lle, Ser104Ala, Leu108Lys, Asn147Lys, Arg150Ala, Gly151Ala y Leu155Ala.

En algunas realizaciones, la proteína EPO modificada comprende mutaciones que afectan a la bioactividad y no a la unión, por ejemplo, las enumeradas por Eliot, et al. Mapping of the Active Site of Recombinant Human Erythropoietin 15 de enero de 1997; Blood: 89 (2),.

En algunas realizaciones, la proteína EPO modificada comprende una o más mutaciones que implican residuos de superficie de la proteína EPO que están involucrados en el contacto con el receptor. Sin querer ceñirse a la teoría, se cree que las mutaciones de estos residuos superficiales tienen menos probabilidades de afectar al plegamiento de la proteína, conservando así cierta actividad biológica.

Los residuos superficiales ilustrativos que pueden ser mutados incluyen, pero no se limitan a, los residuos 147 y 150. En realizaciones ilustrativas, las mutaciones son sustituciones que incluyen, una o más de N147A, N147K, R150A y R150E.

En algunas realizaciones, la proteína EPO modificada comprende una o más mutaciones en los residuos N59, E62, L67 y L70, y una o más mutaciones que afectan a la formación de enlaces disulfuro. Sin querer ceñirse a la teoría, se cree que estas mutaciones afectan al plegamiento y/o se predice que están en posiciones enterradas y, por tanto, afectan a la actividad biológica de forma indirecta.

En una realización, la proteína EPO modificada comprende una sustitución K20E que reduce significativamente la unión al receptor. Véase Elliott, et al., (1997) Blood, 89:493-502.

Otras mutaciones de EPO que pueden incorporarse a la proteína EPO quimérica de la invención se divulgan, por ejemplo, por Elliott, et al., (1997) Blood, 89:493-502 y Taylor et al., (2010) PEDS, 23(4): 251-260.

En varias realizaciones, el agente señalizador es una toxina o enzima tóxica. En algunas realizaciones, la toxina o enzima tóxica se deriva de plantas y bacterias. Las toxinas o enzimas tóxicas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, la toxina de la difteria, la toxina de Pseudomonas, la toxina del ántrax, las proteínas inactivadoras del ribosoma (RIP) como la ricina y la saporina, la modeccina, la abrina, la gelonina y la proteína antiviral de la maleza. Entre las toxinas adicionales se encuentran las divulgadas por Mathew et al., (2009) Cancer Sci 100(8): 1359-65. En tales realizaciones, las proteínas quiméricas de la invención pueden utilizarse para inducir la muerte celular de manera específica para cada tipo de célula. En tales realizaciones, la toxina puede ser modificada, por ejemplo, mutada, para reducir la afinidad y/o la actividad de la toxina para un efecto atenuado, como se describe con otros agentes de señalización en el presente documento.

Enlazadores

En algunas realizaciones, la presente proteína quimérica comprende opcionalmente uno o más enlazadores. En algunas realizaciones, la presente proteína quimérica comprende un enlazador que conecta la fracción dirigida y el agente de señalización (por ejemplo, IFN-y modificado). En algunas realizaciones, la presente proteína quimérica comprende un enlazador dentro del agente de señalización (por ejemplo, IFN-y modificado).

En algunas realizaciones se proporcionan vectores que codifican las presentes proteínas quiméricas enlazadas como una única secuencia de nucleótidos a cualquiera de los enlazadores descritos en el presente documento y pueden utilizarse para preparar dichas proteínas quiméricas.

En algunas realizaciones, la longitud del enlazador permite la unión eficiente de una fracción dirigida y el agente de señalización (por ejemplo, IFN-y modificado) a sus receptores. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la longitud del enlazador permite la unión eficiente de una de las fracciones dirigidas y el agente de señalización a los receptores de la misma célula.

En algunas realizaciones la longitud del enlazador es al menos igual a la distancia mínima entre los sitios de unión de una de las fracciones dirigidas y el agente de señalización a los receptores de la misma célula. En algunas realizaciones, la longitud del enlazador es al menos dos, o tres, o cuatro, o cinco, o diez, o veinte, o venticinco o cincuenta, o cien veces, o más la distancia mínima entre los sitios de unión de una de las fracciones dirigidas y el agente de señalización a los receptores de la misma célula.

Como se describe en el presente documento, la longitud del enlazador permite la unión eficiente de una de las fracciones dirigidas y el agente de señalización a los receptores en la misma célula, siendo la unión secuencial, por ejemplo, la unión de la molécula de orientación/receptor precede a la unión del agente de señalización/receptor. En algunas realizaciones, hay dos enlazadores en una sola quimera, cada uno de los cuales conecta el agente de señalización a una fracción de destino. En varias realizaciones, los enlazadores tienen longitudes que permiten la formación de un sitio que tiene una célula de enfermedad y una célula efectora sin impedimento estérico que impida la modulación de cualquiera de las dos células.

La invención contempla el uso de una variedad de secuencias de enlace. En diversas realizaciones, el enlazador puede derivarse de proteínas multidominio de origen natural o son enlazadores empíricos como se describe, por ejemplo, por Chichili et al., (2013), Protein Sci. 22(2):153-167, Chen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369. En algunas realizaciones, el enlazador puede diseñarse utilizando bases de datos de diseño de enlazadores y programas informáticos como los descritos por Chen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369 y Crasto et al., (2000), Protein Eng. 13(5):309-312. En varias realizaciones, el enlazador puede ser funcional. Por ejemplo, sin limitación, el enlazador puede funcionar para mejorar el plegamiento y/o la estabilidad, mejorar la expresión, mejorar la farmacocinética, y/o mejorar la bioactividad de la presente proteína quimérica.

En algunas realizaciones, el enlazador es un polipéptido. En algunas realizaciones, el enlazador tiene una longitud inferior a aproximadamente 100 aminoácidos. Por ejemplo, el enlazador puede tener una longitud inferior a aproximadamente 100, aproximadamente 95, aproximadamente 90, aproximadamente 85, aproximadamente 80, aproximadamente 75, aproximadamente 70, aproximadamente 65, aproximadamente 60, aproximadamente 55, aproximadamente 50, aproximadamente 45, aproximadamente 40, aproximadamente 35, aproximadamente 30, aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 19, aproximadamente 18, aproximadamente 17, aproximadamente 16, aproximadamente 15, aproximadamente 14, aproximadamente 13, aproximadamente 12, aproximadamente 11, aproximadamente 10, aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3 o aproximadamente 2 aminoácidos. En algunas realizaciones, el enlazador es un polipéptido. En algunas realizaciones, el enlazador tiene una longitud superior a aproximadamente 100 aminoácidos. Por ejemplo, el enlazador puede tener una longitud superior a aproximadamente 100, aproximadamente 95, aproximadamente 90, aproximadamente 85, aproximadamente 80, aproximadamente 75, aproximadamente 70, aproximadamente 65, aproximadamente 60, aproximadamente 55, aproximadamente 50, aproximadamente 45, aproximadamente 40, aproximadamente 35, aproximadamente 30, aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 19, aproximadamente 18, aproximadamente 17, aproximadamente 16, aproximadamente 15, aproximadamente 14, aproximadamente 13, aproximadamente 12, aproximadamente 11, aproximadamente 10, aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3 o aproximadamente 2 aminoácidos. En algunas realizaciones, el enlazador es flexible. En otra realización, el enlazador es rígido.

En algunas realizaciones dirigidas a proteínas quiméricas que tienen dos o más fracciones dirigidas, un enlazador conecta los dos fraccones dirigidas entre sí y este enlazador tiene una longitud corta y un enlazador conecta una fracción dirogida y un agente de señalización este enlazador es más largo que el enlazador que conecta los dos fraccones dirigidas . Por ejemplo, la diferencia de longitud de aminoácidos entre el enlazador que conecta las dos fracciones dirigidas y el enlazador que conecta una fracción dirigida y un agente de señalización puede ser de aproximadamente 100, aproximadamente 95, aproximadamente 90, aproximadamente 85, aproximadamente 80, aproximadamente 75, aproximadamente 70, aproximadamente 65, aproximadamente 60, aproximadamente 55, aproximadamente 50, aproximadamente 45, aproximadamente 40, aproximadamente 35, aproximadamente 30, aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 19, aproximadamente 18, aproximadamente 17, aproximadamente 16, aproximadamente 15, aproximadamente 14, aproximadamente 13, aproximadamente 12, aproximadamente 11, aproximadamente 10, aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3 o aproximadamente 2 aminoácidos.

En varias realizaciones, el enlazador se compone sustancialmente de residuos de glicina y serina (por ejemplo, aproximadamente el 30%, o aproximadamente el 40%, o aproximadamente el 50%, o aproximadamente el 60%, o aproximadamente el 70%, o aproximadamente el 80%, o aproximadamente el 90%, o aproximadamente el 95%, o aproximadamente el 97% de glicinas y serinas). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el enlazador es (Gly4Ser)n, donde n es de aproximadamente 1 a aproximadamente 8, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8. En una realización, la secuencia enlazadora es GGSGGSGGGGGGS (SEQ ID NO: 251). Otros enlazadores ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, enlazadores que tienen la secuencia LE, GGGGS (SEQ ID NO: 252), (GGGGS)n (n=1-4; SEQ ID NO: 253), GGGGGGGG (SEQ ID NO: 254), GGGGGG (SEQ ID NO: 255), (EAAAK)n (n=1-3; SEQ ID NO: 256), A(EAAAK)nA (n = 2-5; ; SEQ ID NO: 257), AEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 258), A(EAAAKHALEA(EAAAKHA(SEQ ID NO: 259), PAPAP (SEQ ID NO: 260), KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 261), EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO: 262), GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO: 263), y (XP)n, con X designando cualquier aminoácido, por ejemplo, Ala, Lys o Glu. En varias realizaciones, el enlazador es GGS.

En algunas realizaciones, el enlazador es uno o más de GGGSE (SEQ ID NO: 942), GSESG (SEQ ID NO: 943), GSEGS (SEQ ID NO: 944), GEGGSGEGSSGEGSSSEGGGSEGGGSEGGS (SEQ ID NO: 945), y un enlazador de G, S y E colocado al azar cada 4 intervalos de aminoácidos.

En algunas realizaciones, el enlazador es una región bisagra de un anticuerpo (por ejemplo, de IgG, IgA, IgD e IgE, incluidas las subclases (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, e IgA1 e IgA2)). En diversas realizaciones, el enlazador es una región bisagra de un anticuerpo (por ejemplo, de IgG, IgA, IgD e IgE, incluidas las subclases (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, e IgA1 e IgA2)). La región bisagra, que se encuentra en los anticuerpos de clase IgG, IgA, IgD e IgE, actúa como un espaciador flexible, permitiendo que la porción Fab se mueva libremente en el espacio. En contraste con las regiones constantes, los dominios bisagra son estructuralmente diversos, variando tanto en secuencia como en longitud entre las clases y subclases de inmunoglobulinas. Por ejemplo, la longitud y flexibilidad de la región de bisagra varía entre las subclases de IgG. La región bisagra de la IgG1 abarca los aminoácidos 216-231 y, al ser libremente flexible, los fragmentos Fab pueden girar sobre sus ejes de simetría y moverse dentro de una esfera centrada en el primero de los dos puentes disulfuro entre cadenas pesadas. La IgG2 tiene una bisagra más corta que la IgG1, con 12 residuos de aminoácidos y cuatro puentes disulfuro. La región bisagra de la IgG2 carece de un residuo de glicina, es relativamente corta y contiene una doble hélice rígida de poliprolina, estabilizada por puentes disulfuro adicionales entre cadenas pesadas. Estas propiedades restringen la flexibilidad de la molécula IgG2. La IgG3 se diferencia de las otras subclases por su exclusiva región de bisagra extendida (aproximadamente cuatro veces más larga que la bisagra de la IgG1), que contiene 62 aminoácidos (incluidas 21 prolinas y 11 cisteínas), formando una doble hélice de poliprolina inflexible. En la IgG3, los fragmentos Fab están relativamente alejados del fragmento Fc, lo que confiere a la molécula una mayor flexibilidad. La bisagra alargada de la IgG3 también es responsable de su mayor peso molecular en comparación con las otras subclases. La región bisagra de la IgG4 es más corta que la de la IgG1 y su flexibilidad es intermedia entre la de la IgG1 y la de la IgG2. La flexibilidad de las regiones bisagra disminuye en el orden lgG3>lgG1>lgG4>lgG2.

Según los estudios cristalográficos, la región de bisagra de la inmunoglobulina puede subdividirse funcionalmente en tres regiones: la región de bisagra superior, la región del núcleo y la región de bisagra inferior. Véase Shin et al., 1992 Immunological Reviews 130:87. La región superior de la bisagra incluye aminoácidos desde el extremo carboxilo del C^h1 hasta el primer residuo de la bisagra que restringe el movimiento, generalmente el primer residuo de cisteína que forma un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas. La longitud de la región superior de la bisagra se correlaciona con la flexibilidad segmentaria del anticuerpo. La región de bisagra del núcleo contiene los puentes disulfuro entre cadenas pesadas, y la región de bisagra inferior se une al extremo amino terminal del dominio C^h2 e incluye residuos en C^h2. Id. La región central de la bisagra de la IgG1 humana de tipo salvaje contiene la secuencia Cys-Pro-Pro-Cys que, cuando se dimeriza mediante la formación de enlaces disulfuro, da lugar a un octapéptido cíclico que se cree que actúa como pivote, confiriendo así flexibilidad. En diversas realizaciones, el presente enlazador comprende, uno, o dos, o tres de la región de bisagra superior, la región del núcleo y la región de bisagra inferior de cualquier anticuerpo (por ejemplo, de IgG, IgA, IgD e IgE, incluidas las subclases (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, e IgA1 e IgA2)). La región de bisagra también puede contener uno o más sitios de glicosilación, que incluyen varios tipos de sitios estructuralmente distintos para la fijación de carbohidratos. Por ejemplo, la IgA1 contiene cinco sitios de glicosilación dentro de un segmento de 17 aminoácidos de la región bisagra, lo que confiere resistencia al polipéptido de la región bisagra a las proteasas intestinales, lo que se considera una propiedad ventajosa para una inmunoglobulina secretora. En varias realizaciones, el enlazador de la presente invención comprende uno o más sitios de glicosilación. En varias realizaciones, el enlazador es un dominio bisagra-CH2-CH3 de un anticuerpo humano IgG4.

Si se desea, la presente proteína quimérica puede unirse a una región Fc de anticuerpo, que comprende uno o ambos dominios Ch2 y Ch3, y opcionalmente una región bisagra. Por ejemplo, los vectores que codifican las presentes proteínas quiméricas unidas como una única secuencia de nucleótidos a una región Fc pueden utilizarse para preparar dichos polipéptidos.

En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador sintético como el PEG.

En varias realizaciones, el enlazador puede ser funcional. Por ejemplo, sin limitación, el enlazador puede funcionar para mejorar el plegamiento y/o la estabilidad, mejorar la expresión, mejorar la farmacocinética, y/o mejorar la bioactividad de la presente proteína quimérica. En otro ejemplo, el enlazador puede funcionar para dirigir la proteína quimérica a un tipo de célula o localización particular.

En varias realizaciones, cada una de las proteínas quiméricas puede ser conjugada y/o fusionada con otro agente para extender la vida media o mejorar las propiedades farmacodinámicas y farmacocinéticas. En algunas realizaciones, las proteínas quiméricas pueden fusionarse o conjugarse con una o más de las siguientes sustancias: PEG, XTEN (porejemplo, como rPEG), ácido polisialico (POLYXEN), albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano o HAS), proteína similar a la elastina (ELP), PAS, HAP, GLK, CTP, transferrina y similares. En algunas realizaciones, la proteína quimérica puede fusionarse o conjugarse con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, como un fragmento Fc. Por ejemplo, la proteína quimérica puede fusionarse con el extremo N o el extremo C del dominio Fc de la inmunoglobulina (Ig) G humana. En diversas realizaciones, cada una de las proteínas quiméricas individuales se fusiona con uno o más de los agentes descritos en BioDrugs (2015) 29:215-239.

Producción de proteínas quiméricas

En el presente documento se describen procedimientos para producir las proteínas quiméricas de la invención. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican las proteínas quiméricas de la invención (porejemplo, las secuencias de ADN que codifican el agente de señalización modificado (por ejemplo, el IFN-p modificado) y la fracción dirigida y el enlazador) pueden sintetizarse químicamente utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Las secuencias de ADN sintético pueden ligarse a otras secuencias de nucleótidos apropiadas, incluyendo, por ejemplo, secuencias de control de expresión, para producir construcciones de expresión genética que codifiquen las proteínas quiméricas deseadas. En consecuencia, la presente divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica de la invención.

Los ácidos nucleicos que codifican la proteína quimérica de la invención pueden incorporarse (ligarse) en vectores de expresión, que pueden introducirse en las células huésped mediante técnicas de transfección, transformación o transducción. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican la proteína quimérica de la invención pueden introducirse en las células huésped mediante transducción retroviral. Las células huésped ilustrativas son las células E.coli, las células de ovario de hámster chino (CHO), las células de riñón embrionario humano 293 (HEK 293), las células HeLa, las células de riñón de hámster bebé (BHK), las células de riñón de mono (COS), las células de carcinoma hepatocelular humano (porejemplo, Hep G2) y las células de mieloma. Las células huésped transformadas pueden cultivarse en condiciones que permitan a las células huésped expresar los genes que codifican la proteína quimérica de la invención. En consecuencia, la presente divulgación proporciona vectores de expresión que comprenden ácidos nucleicos que codifican la proteína quimérica. La presente divulgación proporciona además células huésped que comprenden dichos vectores de expresión.

Las condiciones específicas de expresión y purificación variarán en función del sistema de expresión empleado. Por ejemplo, si un gen se va a expresar en E. coli, primero se clona en un vector de expresión colocando el gen diseñado a continuación de un promotor bacteriano adecuado, por ejemplo, Trp o Tac, y una secuencia señal procariota. En otro ejemplo, si el gen diseñado se va a expresar en células huésped eucariotas, por ejemplo, células CHO, se inserta primero en un vector de expresión que contenga, por ejemplo, un promotor eucariótico adecuado, una señal de secreción, potenciadores y varios intrones. La construcción genética puede introducirse en las células huésped mediante técnicas de transfección, transformación o transducción.

La proteína quimérica de la invención puede producirse cultivando una célula huésped transfectada con un vector de expresión que codifique la proteína quimérica en condiciones que permitan la expresión de la proteína. Después de la expresión, la proteína puede cosecharse y purificarse utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, por ejemplo, etiquetas de afinidad como la glutatión-S-transferasa (GST) y etiquetas de histidina o por cromatografía.

En consecuencia, la presente divulgación proporciona un ácido nucleico que codifica una proteína quimérica de la presente invención. La presente divulgación proporciona una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína quimérica de la presente invención.

La presente proteína quimérica puede expresarse in vivo, por ejemplo, en un paciente. Por ejemplo, la presente proteína quimérica puede administrarse en forma de ácido nucleico que codifica la presente quimérica. El ácido nucleico puede ser ADN o ARN. La presente proteína quimérica puede estar codificada por un ARNm modificado, es decir, un ARNm que comprende uno o más nucleótidos modificados. El ARNm modificado puede comprender una o las modificaciones que se encuentran en Patente US n° 8.278.036. El ARNm modificado puede comprender uno o más de m5C, m5U, m6A, s2U, y , y 2'-O-metil-U. Se divulga la administración un ARNm modificado que codifica una o más de las presentes proteínas quiméricas. Se divulgan vectores de terapia génica que comprenden los mismos. Se divulgan procedimientos de terapia génica que comprenden los mismos. El ácido nucleico puede estar en forma de un virus oncolítico, por ejemplo, un adenovirus, retrovirus, sarampión, herpes simple, virus de la enfermedad de Newcastle o vaccinia.

Sales y excipientes farmacéuticamente aceptables

Las proteínas quiméricas en la presente memoria descritas pueden poseer un grupo funcional suficientemente básico, que puede reaccionar con un ácido inorgánico u orgánico, o un grupo carboxilo, que puede reaccionar con una base inorgánica u orgánica, para formar una sal farmacéuticamente aceptable. Una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable se forma a partir de un ácido farmacéuticamente aceptable, como es bien conocido en la técnica. Tales sales incluyen las sales farmacéuticamente aceptables enumeradas en, por ejemplo, Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977) y The Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection, and Use. P. H. Stahl y C. G. Wermuth (eds.), Verlag, Zurich (Suiza) 2002.

Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, a modo de ejemplo no limitativo, sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucaronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, ptoluenosulfonato, canforesulfonato, pamoato, fenilacetato, trifluoroacetato, acrilato, clorobenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, metilbenzoato, o-acetoxibenzoato, naftaleno-2-benzoato, isobutirato, fenilbutirato, a-hidroxibutirato, butileno-1,4-dicarboxilato, hexina-1,4-dicarboxilato, caprato, caprilato, cinamato, glicolato, heptanoato, hippurato, malato, hidroximaleato, malonato, mandelato, mesilato, nicotinato, ftalato, teraftalato, propiolato, propionato, fenilpropionato, sebacato, suberato, p-bromobencenosulfonato, clorobencenosulfonato, etilsulfonato, 2-hidroxietilsulfonato, metilsulfonato, naftaleno-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, naftaleno-1,5-sulfonato, xilenosulfonato y sales de tartarato.

El término "sal farmacéuticamente aceptable" también se refiere a una sal de las composiciones de la presente invención que tiene un grupo funcional ácido, como un grupo funcional ácido carboxílico, y una base. Las bases adecuadas incluyen, pero no se limitan a, hidróxidos de metales alcalinos como el sodio, el potasio y el litio; hidróxidos de metales alcalinotérreos como el calcio y el magnesio; hidróxidos de otros metales, como el aluminio y el zinc; amoníaco, y aminas orgánicas, como mono-, di-, o tri-alquilaminas no sustituidas o hidroxi-sustituidas, diciclohexilamina; tributo amina; piridina; N-metil, N-etilamina dietilamina; trietilamina; mono-, bis-, o tris-(2-OH-alquilaminas inferiores), como mono-; bis-, o tris-(2-hidroxietil)amina, 2-hidroxi-terc-butilamina, o tris-(hidroximetil)metilamina, N,N-di-alquil-N-(hidroxil-alquil)-aminas, como N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)amina o tri-(2-hidroxietil)amina; N-metil-D-glucamina; y aminoácidos como arginina, lisina, y similares.

Se divulgan las composiciones en la presente memoria descritas en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Composiciones y formulaciones farmacéuticas

Se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas quiméricas descritas en la presente memoria y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento puede administrarse a un sujeto como componente de una composición que comprende un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden comprender opcionalmente una cantidad adecuada de un excipiente farmacéuticamente aceptable para proporcionar la forma de administración adecuada.

Los excipientes farmacéuticos pueden ser líquidos, como el agua y los aceites, incluidos los de origen petrolero, animal, vegetal o sintético, como el aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite mineral, el aceite de sésamo y similares. Los excipientes farmacéuticos pueden ser, por ejemplo, solución salina, goma acacia, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y similares. Además, pueden utilizarse agentes auxiliares, estabilizadores, espesantes, lubricantes y colorantes. Los excipientes farmacéuticamente aceptables pueden ser estériles cuando se administran a un sujeto. El agua es un excipiente útil cuando cualquier agente descrito en la presente memoria se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también pueden emplearse como excipientes líquidos, específicamente para soluciones inyectables. Entre los excipientes farmacéuticos adecuados se encuentran también el almidón, la glucosa, la lactosa, la sacarosa, la gelatina, la malta, el arroz, la harina, la tiza, el gel de sílice, el estearato de sodio, el monoestearato de glicerol, el talco, el cloruro de sodio, la leche desnatada en polvo, el glicerol, el propileno, el glicol, el agua, el etanol y similares. Cualquier agente descrito en el presente documento, si se desea, puede comprender también pequeñas cantidades de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes amortiguadores del pH. Otros ejemplos de excipientes farmacéuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 1447-1676 (Alfonso R. Gennaro eds., 19a ed. 1995).

La presente invención incluye las composiciones farmacéuticas descritas (y/o agentes terapéuticos adicionales) en varias formulaciones. Cualquier composición farmacéutica inventiva (y/o agentes terapéuticos adicionales) descrita en el presente documento puede adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, gotas, comprimidos, píldoras, gránulos, cápsulas, cápsulas que contienen líquidos, cápsulas de gelatina, polvos, formulaciones de liberación sostenida, supositorios, emulsiones, aerosoles, sprays, suspensiones, polvo liofilizado, suspensión congelada, polvo desecado, o cualquier otra forma adecuada para su uso. La composición puede presentarse en forma de cápsula. La composición puede tener la forma de un comprimido. La composición farmacéutica puede formularse en forma de cápsula de gelatina blanda. La composición farmacéutica puede formularse en forma de cápsula de gelatina. La composición farmacéutica puede formularse como un líquido. Cuando sea necesario, las composiciones farmacéuticas inventivas (y/o agentes adicionales) pueden incluir también un agente solubilizante. Además, los agentes pueden ser entregados con un vehículo adecuado o un dispositivo de entrega como se conoce en la técnica. Las terapias combinadas descritas en el presente documento pueden administrarse conjuntamente en un único vehículo o dispositivo de administración.

Las formulaciones que comprenden las composiciones farmacéuticas inventivas (y/o agentes adicionales) de la presente invención pueden presentarse convenientemente en formas de dosificación unitarias y pueden prepararse por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Tales procedimientos incluyen generalmente el paso de poner los agentes terapéuticos en asociación con un portador, que constituye uno o más ingredientes accesorios. Típicamente, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima el agente terapéutico con un portador líquido, un portador sólido finamente dividido, o ambos, y luego, si es necesario, dando forma al producto en formas de dosificación de la formulación deseada (por ejemplo, granulación húmeda o seca, mezclas de polvos, etc., seguidas por el tableteado utilizando procedimientos convencionales conocidos en la técnica). Cualquier composición farmacéutica (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento puede formularse de acuerdo con los procedimientos habituales como una composición adaptada para un modo de administración descrito en el presente documento.

Las vías de administración incluyen, por ejemplo: oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, sublingual, intranasal, intracerebral, intravaginal, transdérmica, rectal, por inhalación o tópica. La administración puede ser local o sistémica. La administración puede realizarse por vía oral. La administración puede ser por inyección parenteral. El modo de administración puede dejarse a la discreción del profesional, y depende en parte del lugar donde se encuentre la enfermedad. En la mayoría de los casos, la administración da lugar a la liberación de cualquier agente descrito en el presente documento en el torrente sanguíneo.

La proteína quimérica descrita en el presente documento puede formularse de acuerdo con los procedimientos habituales como una composición adaptada para la administración oral. Las composiciones para la administración oral pueden presentarse en forma de comprimidos, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, gránulos, polvos, emulsiones, cápsulas, jarabes o elixires, por ejemplo. Las composiciones administradas por vía oral pueden comprender uno o más agentes, por ejemplo, agentes edulcorantes como la fructosa, el aspartamo o la sacarina; agentes aromatizantes como la menta, el aceite de gaulteria o la cereza; agentes colorantes; y agentes conservantes, para proporcionar una preparación farmacéuticamente palatable. Además, cuando se presentan en forma de comprimidos o píldoras, las composiciones pueden estar recubiertas para retrasar la desintegración y la absorción en el tracto gastrointestinal, proporcionando así una acción sostenida durante un período de tiempo prolongado. Las membranas selectivamente permeables que rodean una conducción osmóticamente activa cualquier proteína quimérica descrita en el presente documento también son adecuadas para las composiciones administradas por vía oral. En estas últimas plataformas, el fluido del entorno que rodea la cápsula es absorbido por el compuesto impulsor, que se hincha para desplazar el agente o la composición del agente a través de una abertura. Estas plataformas de suministro pueden proporcionar un perfil de suministro esencialmente de orden cero, en contraposición a los perfiles de pico de las formulaciones de liberación inmediata. También puede ser útil un material de retardo como el monoestearato de glicerol o el estearato de glicerol. Las composiciones orales pueden incluir excipientes estándar como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa y carbonato de magnesio. Los excipientes pueden ser de grado farmacéutico. Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión como, por ejemplo, alcoholes isostearílicos etoxilados, sorbitol polioxilado y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar, tragacanto, etc., y sus mezclas.

Las formas de dosificación adecuadas para la administración parenteral (por ejemplo, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea e intraarticular) incluyen, por ejemplo, soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones y similares. También pueden fabricarse en forma de composiciones sólidas estériles (por ejemplo, composición liofilizada), que pueden disolverse o suspenderse en un medio inyectable estéril inmediatamente antes de su uso. Pueden contener, por ejemplo, agentes de suspensión o dispersión conocidos en la técnica. Los componentes de la formulación adecuados para la administración parenteral incluyen un diluyente estéril como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos como el alcohol bencílico o el metilparabeno; antioxidantes como el ácido ascórbico o el bisulfito sódico; agentes quelantes como el EDTA; tampones como los acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de la tonicidad como el cloruro sódico o la dextrosa.

Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). El soporte debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe preservarse contra los microorganismos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), y mezclas adecuadas de los mismos. Las composiciones proporcionadas en el presente documento, solas o en combinación con otros componentes adecuados, pueden hacerse en formulaciones de aerosol (es decir, "nebulizadas") para ser administradas por inhalación. Las formulaciones en aerosol pueden colocarse en propulsores presurizados aceptables, como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.

Cualquier composición farmacéutica (y/o agentes adicionales) descritos en la presente memoria pueden ser administrados por medios de liberación controlada o sostenida o por dispositivos de entrega que son bien conocidos por aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica. Los ejemplos incluyen, entre otros, los descritos en las patente US n°s 3.845.770, 3,916,899, 3,536,809, 3,598,123, 4,008,719, 5,674,5335,059,5955,591,7675,120,548, 5,073,543, 5,639 ,476, 5,354,556 y 5,733,556.

Dichas formas de dosificación pueden ser útiles para proporcionar una liberación controlada o sostenida de uno o más ingredientes activos utilizando, por ejemplo, hidropropilcelulosa, hidropropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, otras matrices poliméricas, geles, membranas permeables, sistemas osmóticos, recubrimientos multicapa, micropartículas, liposomas, microesferas o una combinación de los mismos para proporcionar el perfil de liberación deseado en proporciones variables. Las formulaciones adecuadas de liberación controlada o sostenida conocidas por los expertos en la materia, incluidas las descritas en el presente documento, pueden seleccionarse fácilmente para su uso con los ingredientes activos de los agentes descritos en el presente documento. La invención proporciona, por tanto, formas de dosificación unitarias adecuadas para la administración oral como, por ejemplo, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel y cápsulas adaptadas para la liberación controlada o sostenida. La liberación controlada o sostenida de un ingrediente activo puede ser estimulada por varias condiciones, incluyendo pero no limitado a, cambios en el pH, cambios en la temperatura, estimulación por una longitud de onda apropiada de luz, concentración o disponibilidad de enzimas, concentración o disponibilidad de agua, u otras condiciones fisiológicas o compuestos.

Un sistema de liberación controlada puede colocarse en la proximidad de la zona diana a tratar, requiriendo así sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Otros sistemas de liberación controlada discutidos en la revisión de Langer, 1990, Science 249:1527-1533) pueden ser utilizados.

Las formulaciones farmacéuticas son preferentemente estériles. La esterilización puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización del filtro puede realizarse antes o después de la liofilización y la reconstitución.

Administración y dosificación

Se apreciará que la dosis real de la proteína quimérica que se administrará según la presente invención variará según la forma de dosificación particular, y el modo de administración. Los expertos en la materia pueden tener en cuenta muchos factores que pueden modificar la acción de la proteína quimérica (por ejemplo, el peso corporal, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la vía de administración, la tasa de excreción, el estado del sujeto, las combinaciones de fármacos, la disposición genética y las sensibilidades a las reacciones). La administración puede realizarse de forma continua o en una o varias dosis discretas dentro de la dosis máxima tolerada. Los expertos en la materia pueden determinar las tasas de administración óptimas para una serie de condiciones dadas utilizando pruebas convencionales de administración de dosis.

Una dosis adecuada de la proteína quimérica puede estar en un intervalo de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 g/kg de peso corporal del sujeto, aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal del sujeto, aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del sujeto, aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del sujeto, por ejemplo, aproximadamente 0,01 mg/kg, aproximadamente 0,02 mg/kg, aproximadamente 0,03 mg/kg, aproximadamente 0,04 mg/kg, aproximadamente 0,05 mg/kg, aproximadamente 0,06 mg/kg, aproximadamente 0,07 mg/kg, aproximadamente 0,08 mg/kg, aproximadamente 0,09 mg/kg, aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,2 mg/kg, aproximadamente 0,3 mg/kg, aproximadamente 0,4 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg, aproximadamente 0,6 mg/kg, aproximadamente 0,7 mg/kg, aproximadamente 0,8 mg/kg, aproximadamente 0,9 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 1,1 mg/kg, aproximadamente 1,2 mg/kg, aproximadamente 1,3 mg/kg, aproximadamente 1,4 mg/kg, aproximadamente 1,5 mg/kg, aproximadamente 1,6 mg/kg, aproximadamente 1,7 mg/kg, aproximadamente 1,8 mg/kg, 1.9 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 g/kg de peso corporal, aproximadamente 10 g/kg de peso corporal, incluidos todos los valores y intervalos entre los mismos.

Las dosis individuales de la proteína quimérica pueden administrarse en formas de dosificación unitarias (p. ej, comprimidos o cápsulas) que contienen, por ejemplo, desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 100 g, desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 75 g, desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 50 g, desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 25 g, desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 10 g, desde aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 7,5 g, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 5 g, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 2,5 g, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1 g, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 90 mg, de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 80 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 70 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 60 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 40 mg de principio activo, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 5 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 3 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 1 mg por unidad de dosificación, o de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 80 mg por unidad de dosificación. Por ejemplo, una forma de dosificación unitaria puede ser de aproximadamente 0,01 mg, de aproximadamente 0,02 mg, de aproximadamente 0,03 mg, de aproximadamente 0,04 mg, de aproximadamente 0,05 mg, de aproximadamente 0,06 mg, de aproximadamente 0,07 mg, de aproximadamente 0,08 mg, de aproximadamente 0,09 mg, de aproximadamente 0,1 mg, de aproximadamente 0,2 mg, de aproximadamente 0,3 mg, de aproximadamente 0,4 mg, de aproximadamente 0,5 mg, de aproximadamente 0,6 mg, de aproximadamente 0,7 mg, de aproximadamente 0,8 mg, de aproximadamente 0,.9 mg, aproximadamente 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 4 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 7 mg, aproximadamente 8 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 15 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 25 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 35 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 45 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 55 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 65 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 75 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 85 mg, aproximadamente 90 mg, aproximadamente 95 mg, aproximadamente 100 mg, aproximadamente 200 mg, aproximadamente 500 mg, aproximadamente 1 g, aproximadamente 25 g, aproximadamente 5 g, aproximadamente 10 g, aproximadamente 25 g, aproximadamente 50 g, aproximadamente 75 g, aproximadamente 100 g, incluidos todos los valores y intervalos entre los mismos.

La proteína quimérica puede administrarse en una cantidad de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 100 g diarios, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 75 g diarios, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 50 g diarios, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 25 g diarios, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 10 g diarios, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 7,5 g diarios, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 5 g diarios, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 2,5 g diarios, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1 g diarios, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 100 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 95 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 90 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 85 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 80 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 75 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 70 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 65 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 60 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 55 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 50 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 45 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 40 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 35 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 30 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 25 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 20 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 15 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 5 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 3 mg diarios, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 1 mg diarios, o de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 80 mg diarios. La proteína quimérica puede administrarse en una dosis diaria de aproximadamente 0,01 mg, aproximadamente 0,02 mg, aproximadamente 0,03 mg, aproximadamente 0,04 mg, aproximadamente 0,05 mg, aproximadamente 0,06 mg, aproximadamente 0,07 mg, aproximadamente 0,08 mg, aproximadamente 0,09 mg, aproximadamente 0,1 mg, aproximadamente 0,2 mg, aproximadamente 0,3 mg, aproximadamente 0,4 mg, aproximadamente 0,5 mg, aproximadamente 0,6 mg, aproximadamente 0,7 mg, aproximadamente 0,8 mg, aproximadamente 0,9 mg, aproximadamente 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 4 mg aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 7 mg, aproximadamente 8 mg aproximadamente 9 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 15 mg, aproximadamente 20 mg aproximadamente 25 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 35 mg, aproximadamente 40 mg aproximadamente 45 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 55 mg, aproximadamente 60 mg aproximadamente 65 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 75 mg, aproximadamente 80 mg aproximadamente 85 mg, aproximadamente 90 mg, aproximadamente 95 mg, aproximadamente 100 mg aproximadamente 200 mg, aproximadamente 500 mg, aproximadamente _{1 g}, aproximadamente 25 g aproximadamente 5 g, aproximadamente 7,5 g, aproximadamente 10 g, aproximadamente 25 g, aproximadamente 50 g, aproximadamente 75 g, aproximadamente l0o g, incluidos todos los valores y intervalos entre los mismos. La composición farmacéutica que comprende la proteína quimérica puede administrarse, por ejemplo, más de una vez al día (por ejemplo, aproximadamente dos veces, aproximadamente tres veces, aproximadamente cuatro veces, aproximadamente cinco veces, aproximadamente seis veces, aproximadamente siete veces, aproximadamente ocho veces, aproximadamente nueve veces o aproximadamente diez veces al día), aproximadamente once veces al día, aproximadamente en días alternos aproximadamente una vez cada tres días, aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente una vez cada dos semanas, aproximadamente una vez al mes, aproximadamente una vez cada dos meses, aproximadamente una vez cada tres meses, aproximadamente una vez cada seis meses o aproximadamente una vez al año.

Terapia combinada y agentes terapéuticos adicionales

La composición farmacéutica puede coadministrarse junto con otro(s) agente(s) terapéutico(s). La coadministración puede ser simultánea o secuencial.

El agente terapéutico adicional y la proteína quimérica de la presente invención pueden administrarse a un sujeto simultáneamente. El término "simultáneamente", como se utiliza en el presente documento, significa que el agente terapéutico adicional y la proteína quimérica se administran con una separación temporal de no más de aproximadamente 60 minutos, como por ejemplo no más de aproximadamente 30 minutos, no más de aproximadamente 20 minutos, no más de aproximadamente 10 minutos, no más de aproximadamente 5 minutos o no más de un minuto. La administración del agente terapéutico adicional y de la proteína quimérica puede realizarse mediante la administración simultánea de una única formulación (por ejemplo, una formulación que comprenda el agente terapéutico adicional y la proteína quimérica) o de formulaciones separadas (por ejemplo, una primera formulación que incluya el agente terapéutico adicional y una segunda formulación que incluya la proteína quimérica).

La coadministración no requiere que los agentes terapéuticos se administren simultáneamente, si el momento de su administración es tal que las actividades farmacológicas del agente terapéutico adicional y la proteína quimérica se superponen en el tiempo, ejerciendo así un efecto terapéutico combinado. Por ejemplo, el agente terapéutico adicional y la proteína quimérica pueden administrarse secuencialmente. El término "secuencialmente", como se utiliza en la presente memoria, significa que el agente terapéutico adicional y la proteína quimérica se administran con una separación temporal de más de aproximadamente 60 minutos. Por ejemplo, el tiempo entre la administración secuencial del agente terapéutico adicional y la proteína quimérica puede ser de más de aproximadamente 60 minutos, más de aproximadamente 2 horas, más de aproximadamente 5 horas, más de aproximadamente 10 horas, más de un día, más de aproximadamente 2 días, más de aproximadamente 3 días, más de una semana de diferencia, más de dos semanas de diferencia o más de un mes de diferencia. Los tiempos óptimos de administración dependerán de las tasas de metabolismo, excreción y/o de la actividad farmacodinámica del agente terapéutico adicional y de la proteína quimérica que se administre. El agente terapéutico adicional o la célula proteica quimérica pueden administrarse primero.

La coadministración tampoco requiere que los agentes terapéuticos se administren al sujeto por la misma vía de administración. Más bien, cada agente terapéutico puede ser administrado por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía parenteral o no parenteral.

La proteína quimérica descrita en el presente documento puede actuar de forma sinérgica cuando se coadministra con otro agente terapéutico. La proteína quimérica y el agente terapéutico adicional pueden administrarse a dosis inferiores a las empleadas cuando los agentes se utilizan en el contexto de la monoterapia.

Se divulgan también agentes quimioterapéuticos como agentes terapéuticos adicionales. Por ejemplo, sin limitación, dicha combinación de las presentes proteínas quiméricas y el agente quimioterapéutico encuentran uso en el tratamiento de cánceres, como se describe en otra parte del presente documento. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen, entre otros, agentes alquilantes como la tiotepa y la ciclosfosfamida CYTOXAN; alquilsulfonatos como el busulfán, el improsulfán y el piposulfán; aziridinas como la benzodopa, la carboquona, la meturedopa y la uredopa; etileniminas y metilamelaminas como la altretamina, la trietilenemelamina, la trietilenfosforamida, la trietilenotiofosforamida y la trimetilolomelamina; acetogeninas (e.g., bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluido el análogo sintético topotecan); brioestatina; cally estatina; CC-1065 (incluidos sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptofecinasfpor ejemplo, criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluidos los análogos sintéticos, KW-2189 y CB 1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; a sarcodictiina; espongistatina; mostazas nitrogenadas como el clorambucil, la clorafanina, la colofofosfamida, la estramustina, la ifosfamida, la mecloretamina, el clorhidrato de mecloretamina, el melfalán, la novembichina, la fenesterina, la prednimustina, la trofosfamida y la mostaza uracilo nitrosureas como la carmustina, la clorozotocina, la fotemustina, la lomustina, la nimustina y la ranimnustina; antibióticos como los antibióticos de enedición (e.g., calicheamicina, especialmente calicheamicina gammall y calicheamicina omegall (véase, por ejemplo, Agnew, Chem. Ed. Intl. Inglés, 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluida la dinemicina A; bifosfonatos, como el clodronato; una esperamicina así como el cromóforo neocarzinostatina y los cromóforos antibióticos relacionados enediyne), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMICINA doxorubicina (incluyendo morfolino- doxorubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolinodoxorrubicina y deoxi doxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas como la mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos como el metotrexato y el 5-fluorouracilo (5-Fu ); análogos del ácido fólico como la denopterina, el metotrexato, la pteropterina, el trimetrexato análogos de las purinas como la fludarabina, la 6-mercaptopurina, la tiamiprina, la tioguanina; análogos de las pirimidinas como la ancitabina, la azacitidina, la 6-azauridina, el carmofur, la citarabina, la dideoxiuridina, la doxifluridina, la enocitabina, la floxuridina andrógenos como la calusterona, el propionato de dromostanolona, el epitiostanol, el mepitiostano, la testolactona; antiadrenales como la minoglutetimida, el mitotano, el trilostano; reponedores de ácido fólico como el ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maytansinoides como la maytansina y las ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacáridos PSK (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofuran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotritilamina; tricotecenos (por ejemplo, Toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, p. ej, TAXOL paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE formulación de nanopartículas de paclitaxel sin albúmina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 111), y TAXOTERE doxetaxel (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucil; GEMZAR gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos del platino como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE vinorelbina; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecán (Camptosar, CPT-11) (incluido el régimen de tratamiento de irinotecán con 5-FU y leucovorina); inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides como el ácido retinoico, el ácido todo-transretinoico (ATRA), la capecitabina; la combretastatina; la leucovorina (LV); el oxaliplatino, incluido el régimen de tratamiento con oxaliplatino (FOLFOX); el lapatinib (Tykerb); los inhibidores de PKC-a, Raf, H-Ras, EGFR (p. ej.g., erlotinib (Tarceva)) y VEGF-A que reducen la proliferación celular y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Además, los procedimientos de tratamiento pueden incluir el uso de radiación. Además, los procedimientos de tratamiento pueden incluir el uso de la terapia fotodinámica.

Se divulgan, entre otras cosas, en aplicaciones de enfermedades infecciosas, los antiinfecciosos como agentes terapéuticos adicionales. El antiinfeccioso puede ser un agente antiviral que incluye, pero no se limita a, Abacavir, Aciclovir, Adefovir, Amprenavir, Atazanavir, Cidofovir, Darunavir, Delavirdina, Didanosina, Docosanol, Efavirenz, Elvitegravir, Emtricitabina, Enfuvirtida, Etravirina, Famciclovir y Foscarnet. El antiinfeccioso puede ser un agente antibacteriano que incluya, entre otros, antibióticos de cefalosporina (cefalexina, cefuroxima, cefadroxil, cefazolina, cefalotina, cefaclor, cefamandole, cefoxitina, cefprozil y ceftobiprole); antibióticos de fluoroquinolona (cipro, Levaquin, floxin, tequin, avelox y norflox); antibióticos de tetraciclina (tetraciclina, minociclina, oxitetraciclina y doxiciclina); antibióticos de penicilina (amoxicilina, ampicilina, penicilina V, dicloxacilina, carbenicilina, vancomicina y meticilina) antibióticos monobactámicos (aztreonam); y antibióticos carbapenémicos (ertapenem, doripenem, imipenem/cilastatina y meropenem). Los antiinfecciosos pueden incluir agentes antipalúdicos (por ejemplo, cloroquina, quinina, mefloquina, primaquina, doxiciclina, arteméter/lumefantrina, atovacuona/proguanil y sulfadoxina/pirimetamina), metronidazol, tinidazol, ivermectina, pamoato de pirantel y albendazol.

Incluyendo, sin limitación, las aplicaciones autoinmunes, el agente terapéutico adicional puede ser un agente inmunosupresor. El agente inmunosupresor puede ser un agente antiinflamatorio, como un agente antiinflamatorio esteroideo o un agente antiinflamatorio no esteroideo (AINE). Los esteroides, en particular los corticosteroides suprarrenales y sus análogos sintéticos, son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de corticosteroides útiles en la presente invención incluyen, sin limitación, hidroxiltriamcinolona, alfa-metil dexametasona, beta-metil betametasona, dipropionato de beclometasona, benzoato de betametasona, dipropionato de betametasona, valerato de clobetasol, valerato de clobetasol, desonida, desoximetasona, dexametasona, diacetato de diflorasona, valerato de diflucortolona, fluadrenolona, acetónido de fluclorolona, pivalato de flumetasona, acetónido de fluosinolona, fluocinónido, butilester de flucortina, fluocortolona, acetato de fluprednideno (fluprednilideno), flurandrenolona, halcinónido, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, metilprednisolona, acetónido de triamcinolona, cortisona, cortodoxona, flucetonida, fludrocortisona, diacetato de difluorosona, acetónido de fluradrenolona, medrisona, amcinafel, amcinafida, betametasona y el resto de sus ésteres, cloroprednisona, clocortelona, clescinolona, diclorisona, difluprednato, flucloronida, flunisolida, fluorometalona, fluperolona, fluprednisolona, hidrocortisona, meprednisona, parametasona, prednisolona, prednisona, dipropionato de beclometasona. (AINE) que pueden utilizarse en la presente invención, incluyen, entre otros, el ácido salicílico, el ácido acetil salicílico, el salicilato de metilo, el salicilato de glicol, las salicilmidas, el ácido bencil-2,5-diacetoxibenzoico, el ibuprofeno, el fulindaco, el naproxeno, el ketoprofeno, el etofenamato, la fenilbutazona y la indometacina. El agente inmunosupresor puede ser citostático, como agentes alquilantes, antimetabolitos (por ejemplo, azatioprina, metotrexato), antibióticos citotóxicos, anticuerpos (por ejemplo, basiliximab, daclizumab y muromonab), antiinmunofilinasí'p. ej., ciclosporina, tacrolimus, sirolimus), interferones, opioides, proteínas de unión al TNF, micofenolatos y pequeños agentes biológicosfp.e/., fingolimod, miriocina). Otros agentes antiinflamatorios se describen, por ejemplo, en la patente US n° 4.537.776.

Se divulgan varios agentes utilizados para tratar la obesidad como agentes terapéuticos adicionales. Los agentes ilustrativos utilizados para el tratamiento de la obesidad incluyen, entre otros, orlistatfp. ej., ALLI, XENICAL), loracaserinafp. ej., b ElVIQ), fentermina-topiramato('p.e/., QSYMlA), sibutrammefp. ej., REDUCTIL o MERJDIA), rimonabant (ACOMPLLA), exenatidafp.ej., BYETTA), pramlintidap ej., SYMLIN) fentermina, benzfetamina, dietilpropión, fendimetrazma, bupropión y metformina. Los agentes que interfieren con la capacidad del cuerpo para absorber nutrientes específicos en los alimentos se encuentran entre los agentes adicionales, porejemplo, el orlistatfpor ejemplo, ALU, XENICAL), el glucomanano y la goma guar. Los agentes que suprimen el apetito también se encuentran entre los agentes adicionales, por ejemplo, las catecolaminas y sus derivados (como la fenteimina y otros fármacos basados en la anfetamina), varios antidepresivos y estabilizadores del estado de ánimofpor ejemplo, el bupropión y el topiramato), anoréxicosfpor ejemplo, la dexedrina, la digoxina). Los agentes que aumentan el metabolismo del cuerpo también se encuentran entre los agentes adicionales.

Los agentes terapéuticos adicionales pueden seleccionarse entre los supresores del apetito, los inhibidores de la recaptación de neurotransmisores, los agonistas dopaminérgicos, los agonistas serotoninérgicos, los moduladores de la señalización GABAérgica, los anticonvulsivos, los antidepresivos, los inhibidores de la monoaminooxidasa, los antagonistas del receptor de la sustancia P (NK1) agonistas y antagonistas de los receptores de melanocortina, inhibidores de la lipasa, inhibidores de la absorción de grasas, reguladores de la ingesta de energía o del metabolismo, moduladores de los receptores cannabinoides, agentes para el tratamiento de la adicción, agentes para el tratamiento del síndrome metabólico, moduladores del receptor activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR) antagonistas de la dipcptidil peptidasa 4 (DPP-4), agentes para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, agentes para el tratamiento de niveles elevados de triglicéridos, agentes para el tratamiento de niveles bajos de HDL, agentes para el tratamiento de la hipercolesterolemia y agentes para el tratamiento de la hipertensión. Algunos agentes para las enfermedades cardiovasculares son las estatinas (por ejemplo, lovastatina, atorvastatina, fluvastatina, rosuvastatina, simvastatina y pravastatina) y los agentes omega-3 (por ejemplo, LOVAZA, EPANQVA, VASCEPA, omega-3 esterificados en general, aceites de pescado, aceites de krill, aceites de algas). Los agentes adicionales pueden seleccionarse entre las anfetaminas, las benzodiazepinas, las suifonil ureas, las meglitinidas, las tiazolidinedionas, las biguanidas, los betabloqueantes, los inhibidores del XCE, los diuréticos, los nitratos, los bloqueadores de los canales de calcio, la fenlermina, la sibutramina iorcaserina, cetilistat, rimonabant, taranabant, topiramato, gabapentina, valproato, vigabatrina, bupropión, tiagabina, sertralina, fluoxetina, trazodona, zonisamida, metilfenidato, vareniclina, naltrexona, dietilpropión, fendimetracina, rcpaglinide, nateglinida, glimepirida, metformina, pioglitazona, rosiglilazona y sitagliptina.

Se divulga un agente utilizado para tratar la diabetes como agentes terapéuticos adicionales. Los agentes antidiabéticos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, la sulfonilurea (por ejemplo. DYMELOR (acetohexamida), DIABINESE (clorpropamida), ORINASE (tolbutamida) y TOLINASE (tolazamida), GLUCOTROL (glipizida), GLUCOTROL XL (liberación prolongada), DIABETA (gliburida), MICRONASE (gliburida), GLYNASE PRESTAB (gliburida) y AMARYL (glimepirida)); una biguanidaf por ejemplo metformina (GlUc OPHa Ge , GLUCOPHAGE XR, RIOMET, FORTAMET y G^lU^m E^t Z^a )); una tiazolidinediona('p.e/', ACTOS (pioglitazona) y AVANDIA (rosiglitazona); un inhibidor de la alfa-glucosidasafpor ejemplo, PRECOSE (acarbosa) y GLYSET (miglitol); una meglitinida (por ejemplo, PRANDIN (repaglinida) y STA^r LⁱX (nateglinida)); un inhibidor de la Dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV)( por ejemplo, JANUVIA (sitagliptina), NESINA (alogliptina), OⁿGLYZA (saxagliptina) y TRADJENTA (linagliptina)); un inhibidor del cotransportador de sodio y glucosa 2 (SGLT2) (por ejemplo, INVOKANA (canaglifozina)); y un comprimido combinadofpor ejemplo, GLUCOVANCE, que combina gliburida (una sulfonilurea) y metformina, METAGLIP, que combina glipizida (una sulfonilurea) y metformina, y AVANDAMET que utiliza metformina y rosiglitazona (AVANDIA) en un solo comprimido, KAZANO (alogliptina y metformina), OSENI (alogliptina más pioglitazona), METFORMIN oral, ACTOS oral, BYETTA subcutáneo, JANUVIA oral, WELCHOL oral, JANUMET oral, glipizida oral, glimepirida oral, GLUCOPHAGE oral, LANTUS subcutáneo, gliburida oral, ONGLYZA oral, AMARYI oral, LANTUS SOLOSTAR subcutáneo, BYDUREON subcutáneo, LEVEMIR FLEXPEN subcutáneo, ACTOPLUS MET oral, GLUMETZA oral, TRADJENTA oral, bromocriptina oral, KOMBIGLYZE XR oral, INVOKANA oral, PRANDIN oral, LEVEMIR subcutáneo, PARLODEL oral, pioglitazona oral, NOVOLOG subcutáneo, NOVOLOG FLEXPEN subcutáneo, VICTOZA 2-PAK subcutáneo, HUMALOG subcutáneo, STARLIX oral, FORTAMET oral, GLUCOVANCE oral, GLUCOPHAGE XR oral, NOVOLOG Mix 70-30 FLEXPEN subcutáneo, GLYBURIDE-METFORMIN oral, acarbosa oral, SYMLINPEN 60 subcutáneo, GLUCOTROI XL oral, NOVOLIN R inj, GLUCOTROL oral, DUETACT oral, sitagliptina oral, SYMLINPEN 120 subcutáneo, HUMALOG KWIKPEN subcutáneo, JANUMET XR oral, GLIPIZIDA-METFORMINA oral, CYCLOSET oral, HUMALOG MIX 75-25 subcutáneo, nateglinida oral, HUMALOG Mix 75-25 KWIKPEN subcutáneo, HUMULIN 70/30 subcutáneo, PRECOSE oral, APIDRA subcutáneo, Humulin R inj, Jentadueto oral, Victoza 3-Pak subcutáneo, Novolin 70/30 subcutáneo, NOVOLIN N subcutáneo, insulina detemir subcutáneo, gliburida micronizada oral, GLYNASE oral, HUMULIN N subcutáneo, insulina glargina subcutánea, RIOMET oral, pioglitazona-metformina oral, APIDRA SOLOSTAR subcutáneo, insulina lispro subcutáneo, GLYSET oral, HUMULIN 70/30 Pen subcutáneo, colesevelam oral, sitagliptina-metformina oral, DIABETA oral, insulina humana regular inj, HUMULIN N Pen subcutánea, exenatida subcutánea, HUMALOG Mix 50­ 50 KWIKPEN subcutánea, liraglutida subcutánea, KAZANO oral, repaglinida oral, clorpropamida oral, insulina aspart subcutánea, NOVOLOG Mix 70-30 subcutánea, HUMALOG Mix 50-50 subcutánea, saxagliptina oral, ACTOp LuS Met XR oral, miglitol oral, insulina NPH humana recombinada subcutánea, insulina NPH y regular humana subcutánea, tolazamida oral, mifepristona oral, insulina aspart protam-insulina aspart subcutánea, repaglinidametformina oral, saxagliptina-metformina oral, linagliptina-metformina oral, NESINA oral, OSENI oral, tolbutamida oral, insulina lispro protamina y lispro subcutánea, pramlintida subcutánea, insulina glulisina subcutánea, pioglitazona-glimepirida oral, PRANDIMET oral, NOVOLOG PenFill subcutáneo, linagliptina oral, exenatida microesferas subcutáneas, KORLYM oral, alogliptina oral, alogliptina-pioglitazona oral, alogliptina-metformina oral, canagliflozina oral, Lispro (HUMALOG); Aspart (NOVOLOG); Glulisina (APIDRA); Regular (NOVOLIN R o HUMULIN R); NPH (NOVOLIN N o HUMULIN N); Glargina (LANTUS); Detemir (LEVEMIR); HUMULIN o NOVOLIN 70/30; y NOVOLOG Mix 70/30 HUMALOG Mix 75/25 o 50/50.

Se divulga un agente utilizado para tratar la EM como agentes terapéuticos adicionales. Los agentes ilustrativos de la EM incluyen, pero no se limitan a diversas terapias modificadoras de la enfermedad:

Se divulga una terapia combinada con una transfusión de sangre. Por ejemplo, las presentes composiciones pueden complementar una transfusión de sangre. Se divulga una terapia combinada con suplementos de hierro.

Se divulga una terapia de combinación con uno o más agentes basados en la EPO. Por ejemplo, las presentes composiciones pueden utilizarse como adyuvantes de otros agentes basados en la EPO. Las presentes composiciones pueden utilizarse como terapia de mantenimiento de otros agentes basados en la EPO. Otros agentes basados en la EPO son los siguientes epoetina alfa, incluyendo sin limitación, DARBEPOETINA (ARANESP), EPOCEPT (LUPIN PHARMA), NANOKINE (NANOGEN PHARMACEUTICAL), EPOFIT (INTAS PHARMA), EPOGEN (AMGEN), EPOGIN, EPREX, (JANSSEN-CILAG), BINOCRIT7 (SANDOZ), PROCRIT; epoetina beta, incluyendo sin limitación, NEORECORMON (HOFFMANN-LA ROCHE), RECORMON, metoxipolietilenglicol-epoetina beta (MIRCERA, ROCHE) epoetina delta, incluyendo sin limitación, DYNEPO (proteína estimulante de la eritropoyesis, SHIRE PLC); epoetina omega, incluyendo sin limitación, EPOMAX; epoetina zeta, incluyendo sin limitación, SILAPO (STA^dA) y RETACRIT (HOSPIRA) y otras EPOs, incluyendo sin limitación, EPOCEPT (LUPIN PHARMACEUTICALS), EPOTRUST (PANACEA BIOTEC LTD), ERYPRO SAFE (BIOCON LTD.), REPOITIN (SERUM INSTITUTE OF INDIA LIMITED), VINTOR (EMCURE PHARMACEUTICALS), EPOFIT (INTAS PHARMA), ERYKINE (INTAS BIOPHARMACEUTICA), WEPOX (WOCKHARDT BIOTECH), ESPOGEN (LG LIFE SCIENCES), RELIPOIETIN (RELIANCE LIFE SCIENCES), SHANPOIETIN (SHANTHA BIOTECHNICS LTD), ZYROP (CADILA HEALTHCARE LTD.), EPIAO (RHUEPO) (SHENYANG SUNSHINE PHARMACEUTICAL CO. LTD), CINNAPOIETINA (CINNAGEN).

Se divulga una terapia de combinación con uno o más agentes inmunomoduladores, por ejemplo, sin limitación, agentes que modulan el punto de control inmunológico. El agente inmunomodulador puede dirigirse a uno o más de PD-1, PD-L1 y PD-L2. El agente inmunomodulador puede ser un inhibidor de PD-1. El agente inmunomodulador puede ser un anticuerpo específico para uno o más de PD-1, PD-L1 y PD-L2. Por ejemplo, el agente inmunomodulador puede ser un anticuerpo como, a título no limitativo, nivolumab, (ONO-4538/BMS-936558, MDX1106, OPDIVO, BRISTOL MYERS SQUIBB), pembrolizumab (KEYTRUDA, MERCK), pidilizumab (CT-011, CURE TECH), MK-3475 (MERCK), BMS 936559 (BRISTOL MYERS SQUIBB), MPDL328OA (ROCHE). El agente inmunomodulador puede dirigirse a uno o más de los CD137 o CD137L. El agente inmunomodulador puede ser un anticuerpo específico para uno o más de los CD137 o CD137L. Por ejemplo, el agente inmunomodulador puede ser un anticuerpo como, a título no limitativo, urelumab (también conocido como BMS-663513 y anticuerpo anti-4-1BB). La presente proteína quimérica puede combinarse con urelumab (opcionalmente con uno o más de nivolumab, lirilumab y urelumab) para el tratamiento de tumores sólidos y/o linfoma no Hodgkin de células B y/o cáncer de cabeza y cuello y/o mieloma múltiple. El agente inmunomodulador puede ser un agente dirigido a uno o más de CTLA-4, AP2M1, CD80, CD86, SHP-2 y PPP2R5A. El agente inmunomodulador puede ser un anticuerpo específico para uno o más de CTLA-4, AP2M1, Cd80, CD86, SHP-2 y PPP2R5A. Por ejemplo, el agente inmunomodulador puede ser un anticuerpo como, a título no limitativo, ipilimumab (MDX-010, MDX-101, Yervoy, BMS) y/o tremelimumab (Pfizer). La presente proteína quimérica puede combinarse con ipilimumab (opcionalmente con bavituximab) para el tratamiento de uno o más de los melanomas, el cáncer de próstata y el cáncer de pulmón. El agente inmunomodulador puede dirigirse a CD20. El agente inmunomodulador puede ser un anticuerpo específico de CD20. Por ejemplo, el agente inmunomodulador puede ser un anticuerpo como, a título no limitativo, Ofatumumab (GENMAB), obinutuzumab (GAZYVA), AME-133v (APPLIED MOLECULAR EVOLUTION), Ocrelizumab (GENENTECH), TRU-015 (TRUBION/EMERGENT), veltuzumab (IMMU-106).

Se divulga una terapia de combinación con uno o más agentes quiméricos descritos en los documentos WO 2013/10779, WO 2015/007536, WO 2015/007520, WO 2015/007542 y WO 2015/007903.

En algunas realizaciones, la proteína quimérica descrita en la presente memoria, incluye derivados que son modificados, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula a la composición de tal manera que la unión covalente no impide la actividad de la composición. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados incluyen la composición que ha sido modificada por, entre otras cosas, glicosilación, lipidación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivación por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitarse a la escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc.

En otras realizaciones, la proteína quimérica descrita en el presente documento comprende además un agente citotóxico, que comprende, en realizaciones ilustrativas, una toxina, un agente quimioterapéutico, un radioisótopo y un agente que causa apoptosis o muerte celular. Dichos agentes pueden conjugarse con una composición descrita en el presente documento.

La proteína quimérica descrita en el presente documento puede ser modificada postraduccionalmente para añadir partes efectoras como enlazadores químicos, partes detectables como, por ejemplo, colorantes fluorescentes, enzimas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos y partes quimioluminiscentes, o partes funcionales como, por ejemplo, estreptavidina, avidina, biotina, una citotoxina, un agente citotóxico y materiales radiactivos.

Los agentes citotóxicos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, metotrexato, aminopterina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina; agentes alquilantes como la mecloretamina, la tioepa, el clorambucil, el melfalán, la carmustina (BSNU), la mitomicina C, la lomustina (CCNU), la 1-metilnitrosourea, la ciclofosfamida, la mecloretamina, el busulfán, el dibromomanitol, la estreptozotocina, la mitomicina C, el cisdiclorodiamina platino (II) (DDP), el cisplatino y el carboplatino (paraplatino); las antraciclinas incluyen la daunorubicina (antes daunomicina), la doxorubicina (adriamicina), la detorubicina, la carminomicina, la idarubicina, la epirubicina, la mitoxantrona y el bisantreno los antibióticos incluyen la dactinomicina (actinomicina D), la bleomicina, la calicheamicina, la mitramicina y la antimicina (AMC); y los agentes antimitóticos como los alcaloides de la vinca, la vincristina y la vinblastina. Otros agentes citotóxicos son el paclitaxel (taxol), la ricina, la exotoxina de pseudomonas, la gemcitabina, la citocalasina B, la gramicidina D, el bromuro de etidio, la emetina, el etopósido, el tenopósido, la colchicina, la dihidroxiantracina diona, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, procarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, corticosteroides, mitotano (O,P'-(DDD)), interferones y mezclas de estos agentes citotóxicos.

Otros agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, agentes quimioterapéuticos tales como carboplatino, cisplatino, paclitaxel, gemcitabina, calicheamicina, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, mitomicina C, actinomicina D ciclofosfamida, vincristina, bleomicina, antagonistas del VEGF, antagonistas del EGFR, platinas, taxoles, irinotecán, 5-fluorouracilo, gemcitabina, leucovorina, esteroides, ciclofosfamida, melfalán, alcaloides de la vinca (por ejemplog., vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina), mustinas, inhibidores de la tirosina quinasa, radioterapia, antagonistas de las hormonas sexuales, moduladores selectivos de los receptores de andrógenos, moduladores selectivos de los receptores de estrógenos, antagonistas del PDGF, antagonistas del TNF, antagonistas de la IL-1, interleucinas (p. ej, IL-12 o IL-2), antagonistas de IL-12R, anticuerpos monoclonales conjugados con toxinas, anticuerpos monoclonales específicos de antígenos tumorales, Erbitux, Avastin, Pertuzumab, anticuerpos anti-CD20, Rituxan, ocrelizumab, ofatumumab, DXL625, HERCEPTIN®, o cualquier combinación de los mismos. Las enzimas tóxicas de plantas y bacterias, como la ricina, la toxina de la difteria y la toxina de Pseudomonas, pueden conjugarse con los agentes terapéuticosfpor ejemplo, los anticuerpos) para generar reactivos que maten a un tipo de célula específico (Youle, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980) Gilliland, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980) Krolick, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5419 (1980)).

Otros agentes citotóxicos incluyen ribonucleasas citotóxicas como las descritas por Goldenberg en la Patente US n° 6.653.104. Las realizaciones de la invención también se refieren a radioinmunoconjugados en los que un radionúclido que emite partículas alfa o beta se acopla de forma estable a la proteína quimérica, con o sin el uso de un agente formador de complejos. Estos radionúclidos incluyen emisores beta como el Fósforo-32, el Escandio-47, el Cobre-67, el Galio-67, el Itrio-88, el Itrio-90, la Lodina-125, la Lodina-131, el Samario-153, el Lutecio-177, el Renio-186 o el Renio-188, y emisores alfa como la Astatina-211, el Plomo-212, el Bismuto-212, el Bismuto-213 o el Actinio-225.

Las moléculas detectables ilustrativas incluyen además, pero no se limitan a, peroxidasa de rábano picante, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa y luciferasa. Otros materiales fluorescentes ilustrativos son, entre otros, la rodamina, la fluoresceína, el isotiocianato de fluoresceína, la umbeliferona, la diclorotriazinilamina, la ficoeritrina y el cloruro de dansilo. Otras moléculas quimioluminiscentes ilustrativas incluyen, entre otras, el luminol. Otros materiales bioluminiscentes ilustrativos son, entre otros, la luciferina y la aequorina. Otros materiales radiactivos ilustrativos son, entre otros, Yodo-125, Carbono-14, Azufre-35, Tritio y Fósforo-32. Procedimientos de tratamiento

Los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento tienen aplicación en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos, incluyendo, pero sin limitarse a, el cáncer, las infecciones, los trastornos inmunológicos, la anemia, las enfermedades autoinmunes, las enfermedades cardiovasculares, la curación de heridas, las enfermedades relacionadas con la isquemia, las enfermedades neurodegenerativas, las enfermedades metabólicas y muchas otras enfermedades y trastornos.

Además, cualquiera de los presentes agentes puede ser para el uso en el tratamiento, o la fabricación de un medicamento para el tratamiento de varias enfermedades y trastornos, incluyendo, pero no limitado a cáncer, infecciones, trastornos inmunológicos, enfermedades o condiciones inflamatorias, y enfermedades autoinmunes. Se divulga el tratamiento de, o un paciente que tiene una o más de, las enfermedades granulomatosas crónicas, osteopetrosis, fibrosis pulmonar idiopática, ataxia de Friedreich, dermatitis atópica, enfermedad de Chagas, cáncer, insuficiencia cardíaca, enfermedad autoinmune, enfermedad de células falciformes, talasemia, pérdida de sangre, reacción a transfusiones, diabetes, deficiencia de vitamina B12, enfermedad vascular del colágeno, síndrome de Shwachman, púrpura trombocitopénica, enfermedad celíaca, estado de deficiencia endocrina como hipotiroidismo o enfermedad de Addison, enfermedad autoinmune como enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide o artritis reumatoide juvenil, colitis ulcerosa, trastornos inmunológicos como fascitis eosinofílica, hipoinmunoglobulinemia o timoma/carcinoma tímico, enfermedad de injerto contra huésped, preleucemia, síndrome no hematológico (e.g., Down, Dubowwitz, Seckel), síndrome de Felty, síndrome urémico hemolítico, síndrome mielodisplásico, hemoglobinuria paroxística nocturna, osteomielofibrosis, pancitopenia, aplasia pura de células rojas, púrpura de Schoenlein-Henoch, paludismo, inanición proteica, menorragia, esclerosis sistémica, cirrosis hepática, estados hipometabólicos e insuficiencia cardíaca congestiva.

Se divulga el tratamiento de, o un paciente que tiene una o más de, las enfermedades granulomatosas crónicas, osteopetrosis, fibrosis pulmonar idiopática, ataxia de Friedreich, dermatitis atópica, enfermedad de Chagas, infecciones micobacterianas, cáncer, esclerodermia, hepatitis, hepatitis C, shock séptico y artritis reumatoide.

Se divulga el tratamiento de, o un paciente que tiene cáncer. Como se utiliza en la presente memoria, el cáncer se refiere a cualquier crecimiento incontrolado de células que pueda interferir con el funcionamiento normal de los órganos y sistemas corporales, e incluye tanto los tumores primarios como los metastásicos. Los tumores o cánceres primarios que migran de su ubicación original y siembran órganos vitales pueden acabar provocando la muerte del sujeto por el deterioro funcional de los órganos afectados. Una metástasis es una célula cancerosa o un grupo de células cancerosas, distinta de la localización del tumor primario, que resulta de la diseminación de las células cancerosas del tumor primario a otras partes del cuerpo. Las metástasis pueden acabar provocando la muerte del sujeto. Por ejemplo, los cánceres pueden incluir cánceres benignos y malignos, pólipos, hiperplasia, así como tumores latentes o micrometástasis.

Los cánceres ilustrativos que pueden ser tratados incluyen, pero no se limitan a, carcinomas, por ejemplo, varios subtipos, incluyendo, por ejemplo, adenocarcinoma, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas y carcinoma de células transicionales), sarcomas (incluyendo, por ejemplo, hueso y tejido blando), leucemias (incluyendo, por ejemplo, mieloide aguda, linfoblástica aguda mieloide crónica, linfocítica crónica y de células pilosas), linfomas y mielomas (incluidos, por ejemplo, los linfomas Hodgkin y no Hodgkin, de cadena ligera, no secretores, MGUS y plasmocitomas) y cánceres del sistema nervioso central (incluidos, por ejemplo, los cerebralesfe.g., gliomasfpor ejemplo, astrocitoma, oligodendroglioma y ependimoma), meningioma, adenoma hipofisario y neuromas, y tumores de la médula espinal (por ejemplo, meningiomas y neurofibroma).

Los cánceres ilustrativos que pueden tratarse incluyen, entre otros, el carcinoma de células basales, el cáncer del tracto biliar; el cáncer de vejiga; el cáncer de hueso; el cáncer de cerebro y del sistema nervioso central; el cáncer de mama; el cáncer de peritoneo; el cáncer de cuello uterino; el coriocarcinoma; el cáncer de colon y recto; el cáncer de tejido conectivo; cáncer del aparato digestivo; cáncer de endometrio; cáncer de esófago; cáncer de ojo; cáncer de cabeza y cuello; cáncer gástrico (incluido el cáncer gastrointestinal); glioblastoma; carcinoma hepático; hepatoma; neoplasia intraepitelial; cáncer de riñón o de riñón; cáncer de laringe; leucemia; cáncer de hígado; cáncer de pulmónfe.g., cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón); melanoma; mieloma; neuroblastoma; cáncer de la cavidad oral (labio, lengua, boca y faringe); cáncer de ovario; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cáncer de recto; cáncer del sistema respiratorio; carcinoma de las glándulas salivales; sarcoma; cáncer de piel; cáncer de células escamosas; cáncer de estómago; cáncer de testículo; cáncer de tiroides; cáncer de útero o de endometrio; cáncer del aparato urinario; cáncer de vulva; linfoma, incluido el linfoma de Hodgkin y el linfoma no Hodgkin, así como el linfoma de células B (incluido el linfoma no Hodgkin (LNH) de bajo grado/folicular; linfoma linfocítico pequeño (LS); linfoma no Hodgkin de grado intermedio/folicular; linfoma no Hodgkin difuso de grado intermedio; linfoma no Hodgkin inmunoblástico de grado alto; linfoma no Hodgkin de células pequeñas de grado alto; linfoma no Hodgkin de enfermedad voluminosa; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom la leucemia linfocítica crónica (LLC); la leucemia linfoblástica aguda (LLA); la leucemia de células pilosas; la leucemia mieloblástica crónica; así como otros carcinomas y sarcomas; y el trastorno linfoproliferativo postrasplante (TLP), así como la proliferación vascular anormal asociada a las facomatosis, el edema (por ej.g., el asociado a los tumores cerebrales) y el síndrome de Meigs.

Se divulga el tratamiento de, o un paciente que tiene una infección microbiana y/o una infección crónica. Las infecciones ilustrativas incluyen, entre otras, la enfermedad de Chagas, el VIH/SIDA, la tuberculosis, la osteomielitis, la hepatitis B, la hepatitis C, el virus de Epstein-Barr o el parvovirus, el virus de la leucemia de células T, el síndrome de sobrecrecimiento bacteriano, las infecciones fúngicas o parasitarias.

Se divulgan las presentes composiciones utilizadas para tratar o prevenir una o más enfermedades o condiciones inflamatorias, tales como inflamación, inflamación aguda, inflamación crónica, enfermedad respiratoria, aterosclerosis, reestenosis, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica shock séptico, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad inflamatoria pélvica, dolor, enfermedad inflamatoria ocular, enfermedad celíaca, síndrome de Leigh, deficiencia de glicerol quinasa, eosinofilia familiar (EF), ataxia espástica autosómica recesiva, enfermedad inflamatoria laríngea; tuberculosis, colecistitis crónica, bronquiectasias, silicosis y otras neumoconiosis.

Se divulgan las presentes composiciones utilizadas para tratar o prevenir una o más enfermedades o afecciones autoinmunes, tales como esclerosis múltiple, diabetes mellitus, lupus, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome de Guillain-Barre esclerodermias, síndrome de Goodpasture, granulomatosis de Wegener, epilepsia autoinmune, encefalitis de Rasmussen, esclerosis biliar primaria, colangitis esclerosante, hepatitis autoinmune, enfermedad de Addison, tiroiditis de Hashimoto, fibromialgia, síndrome de Menier; rechazo de trasplantes^ por ejemplog., prevención del rechazo de aloinjertos) anemia perniciosa, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, dermatomiositis, síndrome de Sjogren, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, miastenia gravis, síndrome de Reiter, enfermedad de Grave y otras enfermedades autoinmunes.

Se divulgan las presentes composiciones utilizadas para tratar, controlar o prevenir enfermedades cardiovasculares, como una enfermedad o condición que afecta al corazón y a la vasculatura, incluyendo, pero sin limitarse a ello, la enfermedad coronaria (CHD), la enfermedad cerebrovascular (CVD), la estenosis aórtica la enfermedad vascular periférica, la aterosclerosis, la arteriosclerosis, el infarto de miocardio (ataque cardíaco), las enfermedades cerebrovasculares (ictus), los ataques isquémicos transitorios (AIT), la angina de pecho (estable e inestable), la fibrilación auricular, la arritmia, la enfermedad vavular y/o la insuficiencia cardíaca congestiva.

Se divulgan las presentes composiciones utilizadas para tratar o prevenir uno o más trastornos relacionados con el metabolismo. Se divulga el tratamiento, el control o la prevención de la diabetes, incluida la diabetes de tipo 1 y de tipo 2 y la diabetes asociada a la obesidad. Las composiciones y los procedimientos pueden ser útiles para el tratamiento o la prevención de trastornos relacionados con la diabetes, incluyendo, sin limitación, la nefropatía diabética, la hiperglucemia, la intolerancia a la glucosa, la resistencia a la insulina, la obesidad, los trastornos lipídicos, la dislipidemia, la hiperlipidemia, la hipertrigliceridemia, la hipercolesterolemia, los niveles bajos de HDL, los niveles altos de LDL, la aterosclerosis y sus secuelas, la reestenosis vascular, el síndrome del intestino irritable enfermedad intestinal inflamatoria, incluida la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, otras afecciones inflamatorias, pancreatitis, obesidad abdominal, enfermedades neurodegenerativas, retinopatía, afecciones neoplásicas, tumores de células adiposas, carcinomas de células adiposas, como el liposarcoma, cáncer de próstata y otros tipos de cáncer, incluidos los cánceres gástrico, de mama, de vejiga y de colon, angiogénesis, enfermedad de Alzheimer, psoriasis, hipertensión arterial, síndrome metabólico (e.g., una persona tiene tres o más de los siguientes trastornos: obesidad abdominal, hipertrigliceridemia, colesterol HDL bajo, presión arterial alta y glucosa plasmática en ayunas elevada), hiperandrogenismo ovárico (síndrome de ovario poliquístico) y otros trastornos en los que la resistencia a la insulina es un componente, como la apnea del sueño. Las composiciones y los procedimientos pueden ser útiles para el tratamiento, el control o la prevención de la obesidad, incluidos los trastornos genéticos o ambientales, y los relacionados con la obesidad. Los trastornos relacionados con la obesidad están asociados a la obesidad, son causados por ella o son consecuencia de la misma. Algunos ejemplos de trastornos relacionados con la obesidad son la obesidad, la diabetes, la sobrealimentación, los atracones y la bulimia, la hipertensión, las concentraciones plasmáticas elevadas de insulina y la resistencia a la insulina, la dislipidemia, la hiperlipidemia, el cáncer de endometrio, de mama, de próstata, de riñón y de colon, la artrosis, la apnea obstructiva del sueño, los cálculos biliares, las cardiopatías, los ritmos cardíacos anormales y las arritmias, el infarto de miocardio insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad coronaria, muerte súbita, accidente cerebrovascular, enfermedad de ovario poliquístico, craneofaringioma, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Frohlich, sujetos con deficiencia de GH, variante normal de baja estatura, síndrome de Turner y otras condiciones patológicas que muestren una actividad metabólica reducida o una disminución del gasto energético en reposo como porcentaje de la masa total libre de grasa, por ejemplopor ejemplo, los niños con leucemia linfoblástica aguda. Otros ejemplos de trastornos relacionados con la obesidad son el síndrome metabólico, el síndrome de resistencia a la insulina, las anomalías hormonales reproductivas, las disfunciones sexuales y reproductivas, como el deterioro de la fertilidad, la infertilidad, el hipogonadismo en los hombres y el hirsutismo en las mujeres, los defectos fetales asociados a la obesidad materna, los trastornos de la motilidad gastrointestinal como el reflujo gastroesofágico relacionado con la obesidad, trastornos respiratorios, como el síndrome de hipoventilación por obesidad (síndrome de Pickwick), disnea, trastornos cardiovasculares, inflamación, como la inflamación sistémica de la vasculatura, la arteriosclerosis, la hipercolesterolemia, el dolor lumbar, la enfermedad de la vesícula biliar, la hiperuricemia, la gota y el cáncer de riñón, y un mayor riesgo anestésico. Las composiciones y los procedimientos también pueden ser útiles para tratar la enfermedad de Alzheimer.

Se divulgan las presentes composiciones utilizadas para tratar o prevenir una o más enfermedades respiratorias, tales como la fibrosis pulmonar idiopática (FPI), el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la bronquiectasia, la rinitis alérgica, la sinusitis, la vasoconstricción pulmonar, la inflamación, las alergias, la respiración impedida, el síndrome de dificultad respiratoria fibrosis quística, hipertensión pulmonar, vasoconstricción pulmonar, enfisema, síndrome pulmonar por hantavirus (SPH), síndrome de Loeffler, síndrome de Goodpasture, pleuresía, neumonitis, edema pulmonar, fibrosis pulmonar, sarcoidosis, complicaciones asociadas a la infección por virus sincitial respiratorio y otras enfermedades respiratorias.

La divulgación puede utilizarse para tratar o prevenir una o más enfermedades neurodegenerativas. Las enfermedades neurodegenerativas ilustrativas incluyen, entre otras, la ataxia de Friedreich, la esclerosis múltiple (incluyendo, sin limitación, la esclerosis múltiple benigna; la esclerosis múltiple remitente-recurrente (EMR); la esclerosis múltiple secundaria progresiva (EMSP); la esclerosis múltiple progresiva recidivante (EMPR); y la esclerosis múltiple primaria progresiva (EMP)), la enfermedad de Alzheimer. (incluyendo, sin limitación, la enfermedad de Alzheimer de inicio temprano, la enfermedad de Alzheimer de inicio tardío y la enfermedad de Alzheimer familiar (EAF), la enfermedad de Parkinson y el parkinsonismo (incluyendo, sin limitación, la enfermedad de Parkinson idiopática, el parkinsonismo vascular, Parkinsonismo inducido por fármacos, demencia con cuerpos de Lewy, parkinsonismo hereditario, parkinsonismo juvenil), enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ELA, incluyendo, sin limitación, ^e L^a esporádica, ELA familiar, ELA del Pacífico occidental, ELA juvenil, enfermedad de Hiramaya).

Las presentes proteínas quiméricas pueden encontrar uso en el tratamiento de heridas, por ejemplo, una herida que no cicatriza, una úlcera, un vago o una congelación, una herida crónica o aguda, una herida abierta o cerrada, una herida interna o externa (las heridas externas ilustrativas son las penetrantes y las heridas no penetrantes.

Las presentes proteínas quiméricas pueden encontrar uso en el tratamiento de la isquemia, a modo de ejemplo no limitativo, la isquemia asociada con el síndrome coronario agudo, la lesión pulmonar aguda (ALI), el infarto de miocardio agudo (AMI), el síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), la enfermedad oclusiva arterial, la arteriosclerosis defecto del cartílago articular, inflamación sistémica aséptica, enfermedad cardiovascular aterosclerótica, enfermedad autoinmune, fractura ósea, fractura ósea, edema cerebral, hipoperfusión cerebral, enfermedad de Buerger, quemaduras, cáncer, enfermedad cardiovascular, daño del cartílago, infarto cerebral, isquemia cerebral, derrame cerebral, enfermedad cerebrovascular, neuropatía inducida por quimioterapia, infección crónica, isquemia mesentérica crónica, claudicación, insuficiencia cardíaca congestiva, daño del tejido conectivo, contusión, enfermedad arterial coronaria (EAC), isquemia crítica de las extremidades (ICM), enfermedad de Crohn, trombosis venosa profunda, herida profunda, retraso en la cicatrización de la úlcera, retraso en la cicatrización de la herida, diabetes (tipo I y tipo II), neuropatía diabética, isquemia inducida por la diabetes, coagulación intravascular diseminada (CID), isquemia cerebral embólica, congelación, enfermedad de injerto contra huésped, telengiectasia hemorrágica hereditariaenfermedad vascular isquémica, lesión hiperóxica, hipoxia, inflamación, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad inflamatoria, lesión de los tendones, claudicación intermitente, isquemia intestinal, isquemia, enfermedad cerebral isquémica, cardiopatía isquémica, enfermedad vascular periférica isquémica, placenta isquémica, enfermedad renal isquémica, enfermedad vascular isquémica, lesión por isquemia-reperfusión, laceración, enfermedad de la arteria coronaria principal izquierda, isquemia de las extremidades, isquemia de las extremidades inferiores, infarto de miocardio, isquemia de órganos, osteoartritis, osteoporosis, osteosarcoma, enfermedad de Parkinson, enfermedad arterial periférica (EAP), enfermedad arterial periférica, isquemia periférica, neuropatía periférica, enfermedad vascular periférica, precáncer, edema pulmonar, embolia pulmonar, trastorno de remodelación, isquemia renal, isquemia retiniana, retinopatía, sepsis, úlceras cutáneas, trasplante de órganos sólidos, lesión medular, accidente cerebrovascular, quiste óseo subcondral, trombosis, isquemia cerebral trombótica, isquemia tisular, accidente isquémico transitorio (AIT), lesión cerebral traumática, colitis ulcerosa, enfermedad vascular del riñón, afecciones inflamatorias vasculares, síndrome de von Hippel-Lindau o heridas en tejidos u órganos

La divulgación se refiere a el tratamiento de una o más de las anemias, incluyendo la anemia resultante de la enfermedad renal crónica( por ejemplo, de la diálisis) y/o de un agente anticanceroso(porejemplo, quimioterapia y/o tratamiento del VIH (por ejemplo, Zidovudina (DCI) o azidotimidina (AZT)), enfermedad inflamatoria intestinal^ por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), anemia vinculada a condiciones inflamatorias( por ejemplo, artritis, lupus, EII), anemia ligada a la diabetes, esquizofrenia, paludismo cerebral, como anemia aplásica y mielodisplasia por el tratamiento del cáncer (por ejemplo, quimioterapia y/o radiación), y diversas enfermedades del síndrome mielodisplásico(por ejemplo, anemia de células falciformes, enfermedad de la hemoglobina SC, enfermedad de la hemoglobina C, alfa y beta-talasemias, anemia neonatal después de un nacimiento prematuro y condiciones comparables).

La divulgación se refiere al tratamiento de, o a un paciente que tiene anemia, es decir, una condición en la que el número de glóbulos rojos y/o la cantidad de hemoglobina que se encuentra en los glóbulos rojos está por debajo de lo normal. La anemia puede ser aguda o crónica. Por ejemplo, las anemias presentes incluyen, pero no se limitan a, la anemia por deficiencia de hierro, la anemia renal, la anemia de enfermedades crónicas/inflamación, la anemia perniciosa, como la anemia acílica macrocítica, la anemia perniciosa juvenil y la anemia perniciosa congénita, la anemia relacionada con el cáncer, la anemia relacionada con la quimioterapia (por ejemplo, anemia relacionada con la quimioterapia, anemia relacionada con la radioterapia), aplasia pura de glóbulos rojos, anemia refractaria con exceso de blastos, anemia aplásica, anemia siderobáltica con revestimiento en X, anemia hemolítica, anemia de células falciformes, anemia causada por la producción alterada de AEE, síndromes de mielodisplasia, anemia hipocrómica, anemia microcítica, anemia sideroblástica, anemia hemolítica autoinmune, anemia de Cooley, anemia mediterránea, anemia de Diamond Blackfan, anemia de Fanconi y anemia hemolítica inmune inducida por fármacos. La anemia puede provocar síntomas graves, como hipoxia, fatiga crónica, falta de concentración, piel pálida, presión arterial baja, mareos e insuficiencia cardíaca.

La divulgación se refiere al tratamiento de la anemia resultante de la insuficiencia renal crónica. La divulgación se refiere al tratamiento de la anemia resultante del uso de una o más terapias de reemplazo renal, incluyendo diálisis, hemodiálisis, diálisis peritoneal, hemofiltración, hemodiafiltración y trasplante renal.

La divulgación se refiere al tratamiento de la anemia en pacientes con enfermedad renal crónica que no están en diálisis. Por ejemplo, la divulgación se refiere a pacientes en estadio 1 de ERC, o estadio 2 de ERC, o estadio 3 de ERC, o estadio 4 de ERC, o estadio 5 de ERC. El presente paciente puede estar en el estadio 4 de la ERC o en el estadio 5 de la ERC. El presente paciente puede haber sido sometido a un trasplante de riñón. La divulgación se refiere al tratamiento de la anemia en un paciente que tiene una lesión renal aguda (AKI).

La anemia puede ser inducida por la quimioterapia. Por ejemplo, la quimioterapia puede ser cualquier quimioterapia mielosupresora. La quimioterapia puede ser una o más de Revlimid, Thalomid, dexametasona, Adriamicina y Doxil. La quimioterapia puede ser uno o más fármacos basados en el platino, incluyendo el cisplatino ( por ejemplo, PLATINOL) y el carboplatino (porejemplo, PARAPLATIN). La quimioterapia puede ser cualquiera de los agentes quimioterapéuticos descritos en el presente documento. La quimioterapia puede ser cualquier agente descrito porGroopman et al. J Natl Cancer Inst (1999) 91 (19): 1616-1634. Se divulgan las presentes composiciones y procedimientos utilizados en el tratamiento de la anemia relacionada con la quimioterapia en pacientes con cáncer en fase avanzada (por ejemplo, un cáncer en fase IV, o en fase III, o en fase II). Se dan a conocer las presentes composiciones y procedimientos utilizados en el tratamiento de la anemia relacionada con la quimioterapia en pacientes con cáncer que reciben quimioterapia de dosis densas u otros regímenes de quimioterapia agresivos. La divulgación se refiere al tratamiento de la anemia en un paciente que tiene uno o más cánceres basados en la sangre, como la leucemia, el linfoma y el mieloma múltiple. Estos cánceres pueden afectar directamente a la médula ósea. Además, la divulgación se refiere al cáncer metastásico que se ha extendido al hueso o a la médula ósea. La divulgación se refiere al tratamiento de la anemia en un paciente sometido a radioterapia. Esta radioterapia puede dañar la médula ósea, disminuyendo su capacidad de producir glóbulos rojos. La divulgación se refiere al tratamiento de la anemia en un paciente que tiene una reducción o deficiencia de uno o más de hierro, vitamina B12 y ácido fólico. La divulgación se refiere al tratamiento de la anemia en un paciente que tiene una hemorragia excesiva, incluyendo, sin limitación, después de la cirugía o de un tumor que está causando una hemorragia interna. La divulgación se refiere al tratamiento de la anemia en un paciente que tiene anemia de enfermedad crónica.

Los presentes procedimientos y composiciones pueden estimular la producción de glóbulos rojos. Los presentes procedimientos y composiciones pueden estimular la división y diferenciación de progenitores eritroides comprometidos en la médula ósea.

Se divulga el tratamiento de la anemia inducida por la quimioterapia en pacientes con cáncer. Los presentes procedimientos y composiciones pueden permitir la administración continuada de la proteína quimérica una vez finalizada la quimioterapia del paciente con cáncer. Los presentes procedimientos y composiciones pueden permitir el tratamiento de un paciente con cáncer sin reducir la dosis en relación con un paciente sin cáncer. Los presentes procedimientos y composiciones pueden permitir el tratamiento de un paciente con cáncer que recibe quimioterapia y se considera curable. El paciente con cáncer puede tener uno o más antecedentes de coágulos sanguíneos, una intervención quirúrgica reciente, períodos prolongados de reposo en cama o de actividad limitada y un tratamiento con un agente quimioterapéutico.

Kits

La divulgación también proporciona kits para la administración de cualquier agente descrito en el presente documento (por ejemplo, la proteína quimérica con o sin varios agentes terapéuticos adicionales). El kit es un conjunto de materiales o componentes, que incluye al menos una de las composiciones farmacéuticas inventivas descritas en el presente documento. Se divulga el kit que contiene al menos una de las composiciones farmacéuticas en la presente memoria descritas.

La naturaleza exacta de los componentes configurados en el kit depende de su finalidad. Se divulga el kit configurado con el fin de tratar a sujetos humanos.

Las instrucciones de uso pueden estar incluidas en el kit. Las instrucciones de uso suelen incluir una expresión tangible que describe la técnica que debe emplearse para utilizar los componentes del kit con el fin de obtener un resultado deseado, como el tratamiento del cáncer. Opcionalmente, el kit también contiene otros componentes útiles, tales como diluyentes, tampones, portadores farmacéuticamente aceptables, jeringas, catéteres, aplicadores, herramientas de pipeteo o medición, materiales de vendaje u otra parafernalia útil que será fácilmente reconocida por los expertos en la materia.

Los materiales y componentes ensamblados en el kit pueden ser proporcionados al practicante almacenados de cualquier manera conveniente y adecuada que preserve su operatividad y utilidad. Por ejemplo, los componentes pueden suministrarse a temperatura ambiente, refrigerada o congelada. Los componentes suelen estar contenidos en materiales de embalaje adecuados. El material de envasado puede construirse mediante procedimientos conocidos, preferiblemente para proporcionar un entorno estéril y libre de contaminantes. El material de embalaje puede tener una etiqueta externa que indique el contenido y/o la finalidad del kit y/o sus componentes.

Definiciones

Como se utiliza en la presente memoria, "un", "una" o "el" puede significar uno o más de uno.

A menos que se indique específicamente o resulte obvio por el contexto, como se utiliza en la presente memoria, el término "o" se entiende como inclusivo y abarca tanto "o" como "y".

Además, el término "aproximadamente", cuando se utiliza en relación con una indicación numérica referenciada, significa la indicación numérica referenciada más o menos hasta el 10% de esa indicación numérica referenciada, por ejemplo, dentro (más o menos) del 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% o 0,01% del valor indicado. Por ejemplo, la expresión "alrededor de los 50" abarca la franja de 45 a 55 años.

Una "cantidad eficaz", cuando se utiliza en relación con los usos médicos, es una cantidad que es eficaz para proporcionar un tratamiento medible, la prevención o la reducción de la tasa de patogénesis de una enfermedad de interés.

Como se utiliza en el presente documento, algo está "disminuido" si una lectura de actividad y/o efecto se reduce en una cantidad significativa, como por ejemplo en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98%, o más, hasta e incluyendo al menos aproximadamente un 100%, en presencia de un agente o estímulo en relación con la ausencia de dicha modulación. Como comprenderá un experto en la materia, en algunas realizaciones, la actividad disminuye y algunas lecturas posteriores disminuirán, pero otras pueden aumentar.

Por el contrario, la actividad está "aumentada" si una lectura de actividad y/o efecto se incrementa en una cantidad significativa, por ejemplo en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98%, o más, hasta e incluyendo al menos aproximadamente un 100% o más, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces, en presencia de un agente o estímulo, en relación con la ausencia de dicho agente o estímulo.

Como se menciona en la presente memoria, todos los porcentajes de composición son en peso de la composición total, a menos que se especifique lo contrario. Como se utiliza en el presente documento, la palabra "incluir", y sus variantes, pretende ser no limitativa, de manera que la redacción de elementos en una lista no excluye otros elementos similares que también pueden ser útiles en las composiciones y procedimientos de esta tecnología. Del mismo modo, los términos "puede" y "podrá" y sus variantes pretenden ser no limitantes, de manera que la redacción de que una realización puede o puede comprender ciertos elementos o características no excluye otras realizaciones de la presente tecnología que no contengan esos elementos o características.

Aunque el término abierto "que comprende", como sinónimo de términos como incluyendo, conteniendo o teniendo, se utiliza en la presente memoria para describir y reivindicar la invención, la presente invención, o las realizaciones de la misma, pueden describirse alternativamente utilizando términos alternativos como "que consiste en" o "que consiste esencialmente en"

Como se utiliza en el presente documento, las palabras "preferente" y "preferentemente" se refieren a las realizaciones de la tecnología que ofrecen ciertos beneficios, bajo ciertas circunstancias. Sin embargo, también se pueden preferir otras formas de realización, en las mismas u otras circunstancias. Además, la redacción de una o más realizaciones preferentes no implica que otras realizaciones no sean útiles, y no se pretende excluir otras realizaciones del ámbito de la tecnología.

La cantidad de las composiciones en la presente memoria descritas necesaria para lograr un efecto terapéutico puede determinarse empíricamente de acuerdo con los procedimientos convencionales para el propósito particular. Generalmente, para la administración de agentes terapéuticos con fines terapéuticos, los agentes terapéuticos se administran a una dosis farmacológicamente eficaz. Una "cantidad farmacológicamente eficaz", "dosis farmacológicamente eficaz", "cantidad terapéutica eficaz" o "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad suficiente para producir el efecto fisiológico deseado o una cantidad capaz de lograr el resultado deseado, en particular para tratar el trastorno o la enfermedad. Una cantidad eficaz, como se utiliza en el presente documento, incluiría una cantidad suficiente para, por ejemplo, retrasar el desarrollo de un síntoma del trastorno o enfermedad, alterar el curso de un síntoma del trastorno o enfermedad (por ejemplo, ralentizar la progresión de un síntoma de la enfermedad), reducir o eliminar uno o más síntomas o manifestaciones del trastorno o enfermedad, y revertir un síntoma de un trastorno o enfermedad. El beneficio terapéutico también incluye la detención o ralentización de la progresión de la enfermedad o trastorno subyacente, independientemente de que se produzca una mejora.

Las cantidades eficaces, la toxicidad y la eficacia terapéutica pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para aproximadamente el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en aproximadamente el 50% de la población). La dosis puede variar según la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada. La relación de dosis entre los efectos tóxicos y los terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD50/ED50. En algunas realizaciones, se prefieren las composiciones y los procedimientos que presentan grandes índices terapéuticos. Una dosis terapéutica eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro, incluyendo, por ejemplo, ensayos de cultivo celular. Asimismo, puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante que incluya el IC50 determinado en el cultivo celular, o en un modelo animal apropiado. Los niveles de las composiciones descritas en el plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento. Los efectos de cualquier dosis particular pueden ser monitoreados por un bioensayo adecuado. La dosis puede ser determinada por un médico y ajustada, según sea necesario, para adaptarse a los efectos observados del tratamiento.

En ciertas realizaciones, el efecto resultará en un cambio cuantificable de por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 30%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 70%, o por lo menos aproximadamente un 90%. En algaproximadamente unas realizaciones, el efecto se traducirá en aproximadamente un cambio cuantificable de aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 70%, o incluso aproximadamente un 90% o más. El beneficio terapéutico también incluye la detención o ralentización de la progresión de la enfermedad o trastorno subyacente, independientemente de que se produzca una mejora.

Como se utiliza en el presente documento, los "procedimientos de tratamiento" son igualmente aplicables al uso de una composición para tratar las enfermedades o trastornos descritos en el presente documento y/o a las composiciones para el uso y/o usos en la fabricación de un medicamento para tratar las enfermedades o trastornos descritos en el presente documento. Esta invención se ilustra además con los siguientes ejemplos no limitantes. Ejemplos

Los ejemplos que no entran en el alcance de las reivindicaciones son a título ilustrativo.

Las mutaciones potenciales en el interferón ^y humano que podrían conducir a la pérdida de la interacción con el receptor de IFNy, por ejemplo, la subunidad del receptor de IFNy 1 o 2, y para las cuales la interacción y la activación del receptor podrían restaurarse a través de un efecto AcTakine (es decir, una quimera de un agente de señalización y un agente de dirección) se eligieron basándose en el modelado de homología y el análisis de la estructura de complejos de receptores de interferón relacionados.

Ejemplo 1: Identificación de los residuos de contacto de IFN-y para la interacción con la subunidad del receptor 1 de IFN-y

Se construyeron modelos de homología para el complejo de IFN-^y humano con la subunidad del receptor 1 de IFN-^y. Se examina una lista de residuos de contacto entre el IFN-y con la subunidad del receptor 1 del IFN-y. A partir de este análisis, se mutaron las cadenas laterales de estos residuos para eliminar los contactos, sin introducir obstáculos estéricos.

Ejemplo 2: Construcción y caracterización de proteínas quiméricas que contienen IFN-^y

En este ejemplo, se construyeron y caracterizaron proteínas quiméricas que comprenden un anticuerpo recombinante de cadena pesada (VHH) dirigido a CD20 humano, un enlazador flexible 20*Gly-Gly-Ser y un IFNgamma humano modificado (hIFN-Y).

Se hicieron mutantes en hIFN-Y en sitios de aminoácidos que se creía que afectaban a la unión de hIFN-Y al receptor de interferón gamma 1 (IFNGR1) utilizando mutagénesis dirigida al sitio estándar de tipo salvaje (referido en la presente memoria como P-552 y como teniendo la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 947). Con respecto al SEQ ID NO: 947, las mutaciones puntuales incluidas: V22A, A23G, A23G+D24G, D24G, H111A, H111D, I114A, Q115A, A118G y I114A+A118G. Los nueve mutantes se denominan en la presente memoria, respectivamente, P-667 a P-676; los hIFN-Y modificados tienen secuencias de aminoácidos, respectivamente, de SEQ ID NO: 953 a SEQ ID NO: 962). Además, se realizaron cinco deleciones C-terminales de hIFN-y: una deleción de 5 aminoácidos (Ac5), una deleción de 7 aminoácidos (Ac7), una deleción de 14 aminoácidos (Ac14), una deleción de 15 aminoácidos (Ac15) y una deleción de 16 aminoácidos (Ac16). Las cinco deleciones C-terminales se denominan en la presente memoria, respectivamente, P-662 a P-666; los hIFN-Y modificados tienen secuencias de aminoácidos, respectivamente, de SEQ ID NO: 948 a SEQ ID NO: 952). Obsérvese que cada uno de los hIFN-Y de tipo salvaje y los hIFN-Y modificados utilizados en este ejemplo carecían de la secuencia de señal N-terminal de hIFN-Y; compárese SEQ ID NO: 946 a SEQ ID NO: 947. En la FIG. 1 se muestran ejemplos de hIFN-Y modificados.

La secuencia de codificación para la proteína quimérica hCD20 VHH -(GGS)20-tipo salvaje hIFN-Y - 6xHis o para una proteína quimérica hCD20 VHH -(GGS)20 -modificada hIFN-Y - 6xHis se clonó en el vector pMTW para su expresión en mamíferos. Las construcciones resultantes se transfectaron en células Hek293T utilizando polietilenimina. Las proteínas se purificaron de los sobrenadantes utilizando la Ni Sepharose® excel (GE Healthcare); el imidazol se eliminó de las muestras utilizando columnas PD10 (GE Healthcare).

El efecto de cada mutación de IFN-y se probó inicialmente en un ensayo de reportero de luciferasa GAS, que informó que el IFNGR1 de una célula ha sido unido por IFN-^y. Utilizando el reportero de luciferasa pGAS-TA, se comparó la capacidad de las proteínas quiméricas que comprenden el tipo salvaje o el hIFN-Y modificado para inducir la señalización de STAT1 en las células Hek293T CD20-positivas y en las células Hek293T CD20-negativas (simulado). En la presente memoria, utilizando fosfato de calcio, las células fueron transfectadas con el reportero de luciferasa GAS con o sin un plásmido de expresión de CD20. Dos días después de la transfección, se resuspendieron las células y se estimularon durante la noche con una dilución en serie (como se indica en las FIG.2A a FIG.2P) de una proteína quimérica que comprendía el IFN-^y de tipo salvaje o un mutante. La luciferasa se midió utilizando un lector EnSight™ (Perkin Elmer).

Como se muestra en las FIG. 2D a FIG. 2H y FIG. 2P, las variantes de supresión de 14 aminoácidos, de supresión de 15 aminoácidos y de supresión de 16 aminoácidos (respectivamente, P-664, P-665 y P-666), el mutante de punto único V22A (P-667), el mutante de punto único A23G (P-668) el mutante de doble punto A23G-D24G (P-669), el mutante de un solo punto D24G (P-670), y el mutante de doble punto I114A-A118G (P-676) tenían una mayor señal de luciferasa en las células que expresan CD20 frente a las células que fueron transfectadas de forma simulada. Así, estas proteínas quiméricas, que comprenden una fracción dirigida a CD20, activan específicamente la señalización en las células que expresan CD20 en su superficie.

Los efectos de las mutaciones de IFN-^y fueron entonces probados en un segundo ensayo que detecta la fosforilación de STAT1, que es un indicador de que el IFNGR1 de una célula ha sido unido por IFN-y. En la presente memoria, los Hek293T fueron transfectados con un plásmido de expresión de CD20 (CD20 positivo) o un vector vacío (CD20 negativo). Dos días después de la transfección, las células fueron estimuladas durante 15 minutos a 37°C con una dilución en serie (como se indica en las FIG.3A a FIG. 3H) de una proteína quimérica que comprende el tipo salvaje o un IFN-^y mutante. Después, las células se fijaron (10 minutos, 37°C, Fix Buffer I; ^bD Biosciences), se permeabilizaron (30 minutos, en hielo, Perm III Buffer I; B^d Biosciences), se lavaron y luego se tiñeron con un anticuerpo anti-STAT1 pY701 (BD Biosciences). Los datos se adquirieron con un FACSCalibur™ (BD Biosciences) y se analizaron con el software FlowJo® (FlowJo, LLC).

Como se muestra en las FIG. 3B a FIG. 3D y FIG. 3F, las variantes de deleción de 14 aminoácidos, de 15 aminoácidos y de 16 aminoácidos (respectivamente, P-664, P-665 y P-666) y el mutante puntual doble A23G-D24G (P-669) inducen la fosforilación de STAT1 en células positivas para CD20 frente a las células con transfección simulada (CD20 negativa). Así, estas cuatro proteínas quiméricas activan específicamente la señalización en las células que expresan CD20 en su superficie.

Por el contrario, el mutante puntual A23G (P-668; FIG. 3E), el mutante puntual D24G (P-670; FIG.3G), y el mutante puntual doble I114A-A118G (P-676; FIG.3H) indujo una fosforilación de STAT1 equivalente en las células que expresan CD20 y en las células que fueron transfectadas de forma simulada. Así, estas otras tres proteínas quiméricas activan inespecíficamente la señalización en el segundo ensayo, aunque activen específicamente la señalización en el primer ensayo.

Utilizando dos ensayos experimentales diferentes, las proteínas quiméricas que comprenden un VHH anti-CD20 humano y una de las tres deleciones de INF-^y (Ac14, Ac15, y Ac16) o una doble mutación puntual (A23G-D24G) se unen específicamente a IFNGR1 y lo activan en células que expresan CD20.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína quimérica que comprende:

(a) un IFN-y humano modificado, teniendo dicho IFN-y humano modificado una o más mutaciones en comparación con un IFN-y de tipo salvaje, seleccionándose las mutaciones entre un truncamiento en el extremo C de 14, 15 o 16 residuos de aminoácidos o una doble sustitución A23G y D24G;

(b) una o más fracciones dirigidas, dichas fracciones dirigidas comprenden dominios de reconocimiento que se unen específicamente a antígenos o receptores de interés; y en la que el IFN-y humano modificado y una o más fracciones dirigidas están opcionalmente conectados con uno o más enlazadores.

2. La proteína quimérica de la reivindicación 1, en la que la fracción dirigida comprende un dominio de reconocimiento que es un anticuerpo de longitud completa, un anticuerpo de dominio único, un anticuerpo recombinante de cadena pesada (VHH), un anticuerpo de cadena única (scFv), un anticuerpo de cadena pesada de tiburón (VNAR), una microproteína (por ejemplo, proteína de nudo de cisteína, knottin), una darpina, una anticalina, una adnectina, un aptámero, un Fv, un Fab, un Fab' o un F(ab')2.

3. La proteína quimérica de las reivindicaciones 1 o 2, en la que el IFN-y modificado presenta una afinidad reducida por el receptor de IFN-y.

4. La proteína quimérica de la reivindicación 3, en la que el IFN-^y modificado presenta una afinidad reducida por la subunidad del receptor 1 del IFN-y o la subunidad del receptor 2 del IFN-y.

5. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el IFN-^y modificado es un IFN-y de cadena única.

6. La proteína quimérica de la reivindicación 5, en la que el IFN-y de cadena única comprende una primera cadena de IFN-y unida a una segunda cadena de IFN-y.

7. La proteína quimérica de la reivindicación 6, en la que el C-terminal de la primera cadena de IFN-^y está unido al N-terminal de la segunda cadena de IFN-y.

8. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la una o más mutaciones confieren una afinidad y/o actividad biológica reducida que es restablecida mediante la unión a una o más fracciones dirigidas.

9. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la fracción dirigida se dirige contra una célula inmunitaria seleccionada opcionalmente entre una célula T, una célula T reguladora (Treg), una célula B, una célula supresora derivada de los mieloides (MDSC), una célula dendrítica, un macrófago y una célula NK.

10. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el dominio de reconocimiento es un V^hh o un V^hh humanizado.

11. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el dominio de reconocimiento modula funcionalmente el antígeno o receptor de interés.

12. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende dos o más fracciones dirigidas.

13. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además uno o más agentes de señalización modificados adicionales.

14. La proteína quimérica de la reivindicación 13, en la que el agente de señalización modificado comprende una o más mutaciones que confieren una afinidad y/o actividad biológica o actividad reducida para un receptor en relación con un agente de señalización de tipo salvaje.

15. La proteína quimérica de la reivindicación 14, en la que la mutación confiere una afinidad y/o actividad biológica reducida o una actividad reducida que es restablecida mediante la unión a una o más fracciones dirigidas.