BR112014009925B1 - Construtores de polipeptídeos e seus usos - Google Patents

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Sarah L Pogue
Glen E Mikesell
Tetsuya Taura
Wouter Korver
Anthony G Doyle
Adam Clarke
Matthew Pollard
Stephen Tran
Jack Tzu Chiao Lin
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Abstract

CONSTRUTORES DE POLIPEPTÍDEOS E SEUS USOS. A presente invenção fornece um construtor de peptídeo ou polipeptídeo de sinalizando ligando para um anticorpo ou antígeno ligando porção destes que liga para um antígeno associado a superfície de célula, caracterizando por: o ligando compreender pelo menos uma substituição ou deleção de aminoácido que reduz sua potência em células que falta a expressão do dito antígeno.

Description

APLICAÇÕES RELATIVAS
Esta aplicação reivindica os benefícios do Pedido de Patente Australiana 2011904502 intitulado "Polipeptideo Construtores e usos destes", depositada em 28 de outubro de 2011, o conteúdo inteiro da qual é incorporado neste documento por referência.
CAMPO DA INVENÇÀO
A presente invenção relata para construções de polipeptideo compreendendo mutantes, ligandos de polipeptideo atenuados ligados para anticorpos, caracterizado por: os anticorpos direcionarem os ligandos mutados para células que expressam em suas superficies os antigenos para os quais os ditos anticorpos ligam,- tanto quando os receptores para os ditos ligandos. A invenção adicionalmente relata para métodos de tratamento envolvendo o uso destas construções de polipeptideo.
ANTECEDENTES DA INVENÇÀO
Numerosos ligandos de peptideo e polipeptideo foram descritos para funcionar por interação com um receptor em uma superfície de célula, e deste modo estimulando, inibindo, ou de outra maneira modulando uma resposta biológica, usualmente envolvendo caminhos de sinal de transdução dentro da célula que comporta o dito receptor. Exemplos de tais ligandos incluem peptideo e polipeptideo hormônios, citocinas, quimocinas, fatores de crescimento, fatores de indução de apoptose e semelhantes. Natural ligandos podem ser solúveis ou podem ser ligados para a superfície de outra célula.
Devido a atividade biológica de tais ligandos, algúns têm uso potencial como terapêuticos. Vários peptideos ou ligandos de polipeptideo foram aprovados pela agenda reguladora como produtos terapêuticos, incluindo, por exemplo, hormônio do crescimento humano, insulina, interferon (IFN)-Cc2b, IFNcc2a, IFN, eritropoietina, G-CSF 5 e GM-CSF. Muitos destes e outros ligandos têm demonstrado potencial em aplicações terapêuticas, mas têm também exibido toxicidade quando administrado para pacientes humanos. Uma razão para tal toxicidade é que muitos de tais ligandos desencadeiam receptores em uma variedade de 10 células, incluindo células outras que estas mediando o efeito terapêutico. Por exemplo, quando IFNcc2b é usado para tratar mieloma múltiplasua utilidade esta presente, pelo menos em parte, em sua ligação para receptores de interferon tipo I em células de mieloma, que por sua vez 15 desencadeia proliferação reduzida e por tanto limites da progressão da doença. Infelizmente, embora, estes IFN ligam também para numerosas outras, células normais dentro do corpo, disparando uma variedade de outras respostas celulares, algumas destas são prejudiciais (exemplo 20 sintomas de gripe, neutropenia, depressão). Uma consequência de tal "fora do alvo" atividade de ligandos é que muitos ligandos não são adequado como droga candidata. Neste contesto, "atividade fora de alvo" refere-se para atividade no receptor natural do ligando, mas na superficie 25 de células outras que estas que mediam efeito terapeuticamente benéfico.
Embora alguns destes ligandos, tal como IFNcc2b, sejam aprovados para o tratamento de condições médicas eles são pobremente tolerado devido suas atividades biológicas 30 "fora de alvo". A atividade fora de alvo e associada a tolerabilidade baixa e também significa que algumas destas drogas baseadas em ligando de peptídeo não podem ser administradas a dosagens suficientemente alta para produzir efeito terapêutico ótimo nas células alvas que mediam o efeito terapêutico. Similarmente, é conhecido desde meados da década de 1980 que interferons, em particular IFNa, são capazes de aumentar apoptose e reduzir proliferação de certas células de câncer. Estas atividades biológicas são mediadas por receptores de interferon tipo I na superficie das células de câncer que, quando estimulado, inicia vários caminhos de sinal de transdução influenciando para reduzir proliferação e/ou a indução de diferenciação terminal ou apoptose. IFNa foi aprovado pelo FDA para o tratamento de vários cânceres incluindo melanoma, carcinoma de célula renal, linfoma de célula B, mieloma múltipla, leucemia mielóide crônica(Crônica Myelogenous Leucemia- CML) e leucemia de célula pilosa. Um efeito "direto" de IFNa em células de tumores é mediado por ligação de IFNa diretamente para o receptor IFM tipo I nestas células e estimulado apoptose, diferenciação terminal ou redução de proliferação. Um efeito "indireto" de IFNa em células de não cancerosas é o de estimular o sistema imune, o que pode produzir um efeito adicional anti câncer fazendo o sistema imune de rejeitar o tumor.
Infelizmente, o receptor de interferon tipo I está também presente em muitas células não cancerosas. Ativação deste receptor em tais células por IFNa causa a expressão de numerosas citocinas pró-inflamatória e quimocinas, conduzindo para toxicidade. Tal toxicidade previne a dosagem doIFNa para um individuo a niveis que exceda o máximo da atividade anti-proliferativo e pró-apoptótica nas células de câncer.
Ozzello et al. (Breast Cancer Researchand Tratament 25:265-76, 1993) descreve IFNa humano covalentemente ligado para um anticorpo alvo do tumor, deste modo localizando a direta atividade inibidora de IFNa para o tumor como um caminho de reduzir a razão de crescimento do tumor, e demonstrando que tais conjugados têm atividade anti tumor em um modelo de xenotransplante de um câncer humano. O mecanismo da observada atividade anticâncer foi atribuido para um efeito direto de IFNa nas células de câncer, uma vez que IFNa humano usado nos experimentos não interagiu sensivelmente com o receptor IFN tipo I murino, o que poderia ter levado a um efeito indireto anticâncer. Porque esta falta de ligação do IFNa humano para as células de murino, embora, os autores não puderam evoluir a toxicidade do anticorpo IFNa conjugado relativo ao INFa livre. Estes autores usaram um método quimico para ligar o IFNa para o anticorpo.
Alkan et al., (JournalofInterferon Research, volume 4, número 3, p. 355-63, 1984) demonstraram que ligação de IFNa humano para um anticorpo que liga para o virus Epstein-Barr (EBV) membrana de antigeno (MA) aumentou sua atividade antiproliferativa contra células que expressam o antigeno EBV-MA. Este aumento de potência foi dependente em ambas as expressões de antigeno para as células alvo e a especificidade do ligando do anticorpo. A linha de célula testada foi a linha de célula de câncer QIMR-WIL, uma leucemia mieloblástica. Os autores sugeriram que a ligação de IFNa para um anticorpo pode ser usada como um tratamento para câncer uma vez que reduz o crescimento do tumor. Alkan et al não abordou a potencial toxicidade destes anticorpo- IFNa conjugados resultantes das suas interações com células normais de antigeno negativo.
É também conhecido que a ligações entre um anticorpo e IFNa pode ser realizada pela fusão do construtor de proteina. Por exemplo, IDEC (WOO 1/97844) divulga uma fusão direta de IFNa humano para o terminal C da cadeia pesada de um IgG com alvo no antigeno de tumor CD20. Outros grupos têm discutido o uso de vários ligandos entre o terminal C de uma cadeia pesada IgG e o IFNa. Por exemplo, US 7,456,257 revela que o terminal C de uma cadeia pesada de anticorpo de região constante pode ser conectada para o IFNa via um interveniente ligando rico em serina-glicina (S/G) da sequência (GGGGS)n, onde n pode ser 1, 2 ou 3, e que não existe diferença significante na atividade de IFNa do construtor de proteina de fusão independentemente do comprimento do ligando. [Morrison et al. (US2011/0104112 Al; e Xuan C, Steward KK, Timmerman JM, Morrison SL. Entregamalvo de interferon-a via fusão com o anti-CD20 resultando em potente atividade antitumor contra linfoma de célula B. Blood 2010;115:2864-71) também divulgou ligação de IFNcc para o terminal C dacadeia pesada de umanticorpolgG que tem como alvo câncer, com umintervenienteligando S/G, e observou que afusão do IgG e o ligador de IFNcc reduz a atividade de IFNcc em células que não expressam o correspondente antigeno na superficie da célula. A reduzida atividadede IFN destas construções de proteina de fusão foi modesta quando comparado para proteina de fusão IFNcc de não humano(livre de IFN) atuando em células humanas, mas aparentemente são mais significante para IFNcc murinho em células de murino. Aredução na atividade de IFNcc humano que resultada fusão com o terminal C de um anticorpo, como observado por Morrison et al, e em US 7,456,257 é modesta e é geralmente considerada para ser uma desvantagem uma vez que reduz potência do ligando. Esta desvantagem foi apontada, por exemplo, por Rossi et al (Blood vol. 114, No. 18, pp3864-71), que utilizou uma estratégia alternativa para ligar o IFNcc com um tumor com alvo no anticorpo, de tal modo que não observou perda de atividade de IFNcc.
Em geral arte anterior ensina o uso de um potente IFN e segmenta este IFN de células de câncer. Embora esta abordagem resulte em um aumento na atividade do IFN contra células de câncer, e não aborda a questão da atividade de IFN em células normais "fora do aivo". Exemplos na arte anterior referidos acima, a porção delFNcc do anticorpo IFN humano de proteina de fusão mantém uma proporção alta de atividade IFNcc quando exposta para células humanas que não expressam o correspondente antigeno em suas superficies de célula. Esta atividade pode conduzir para elevar a toxicidade da ativação de células não cancerosas, normais ("fora do alvo") pela porção de IFNcc da proteina de fusão. Consequentemente, existe uma necessidade para reduzira atividade "fora de alvo" de drogas baseadas em ligando, enquanto retém "fora de alvo", efeito terapêutico de tais ligandos. A manutenção da atividade do ligando especifico para o alvo e ao mesmo tempo uma redução da toxicidade de agentes terapêuticos baseado em ligando não alvo criaria uma janela maior de concentrações terapêuticas para ligandos terapeuticamente úteis. Seria por exemplo desejável o uso IFNcc humano em uma 'forma tal que sua atividade possa ser direcionada para as células de câncer enquanto minimiza seu efeito em células humanas normais. Idealmente o receptor de interferon tipo I em células de câncer poderia ser maximamente estimulado, enquanto o mesmo receptor de células não cancerosas iria experimentar uma estimulação minima. Existe uma necessidade para alvo de IFNcc humano para células de câncer em um modo que seria dramaticamente mais estimulada a atividade em células de câncer, que mostram o antigeno, que em células normais, que não mostram o antigeno. A mesma lógica aplicada para outras potencialidades terapêuticas de ligandos, exemplo outras citocinas, hormônios de peptideo e polipeptideo, quimocinas, fatores de crescimento, fatores induzindo apoptose e semelhantes.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os presente inventores revelaram que um ligando de sinalização de peptideo ou polipeptideo, têm uma ou mais mutações que substancialmente reduz a afinidade do ligando para o seu receptor, é ligado para um anticorpo que tem como alvo o ligando mutante para células alvo que mostra o antigeno correspondente ao anticorpo, a atividade do ligando do antigeno alvo de células positivas é mantida enquanto a atividade do ligando em células antigenas negativa não alvo é substancialmente reduzida. O resultado é um ligando de molécula de sinalização que tem uma maior potênciana ativação de seus receptores na célula alvo do antigeno positivo comparado com células não alvo do antigeno negativo, que fornece meios para reduzir o aumento da toxicidade da atividade de ligando não alvo.
De acordo com, um primeiro aspecto da presente invenção fornece uma construção de polipeptideo compreendendo uma sinalização de ligando de peptideo ou polipeptideo ligando com um anticorpo ou antigeno ligando porções destes que liga comum antigeno associado a superfície de célula, caracterizado por: oligando compreender pelo menos uma substituição ou deleção de 5 aminoácido que reduz a potência ou reduza ausência de expressão de células do dito antigeno.
Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento de um tumor em um indivíduo, compreendendo administrar para o indivíduo o construtor de 10 polipeptideo da presente invenção.
Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece o uso do polipeptideo construtor da presente invenção no tratamento de câncer.
Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece uma 15 composição compreendendo o polipeptideo construtor da presente invenção e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
Em um quinto aspecto, a presente invenção fornece método de reduzir a potência de sinalização de ligando de 20 peptideo ou polipeptideo em uma célula de antigeno negativo que suporta o receptor de ligando enquanto mantém a potência do ligando em uma célula de antigeno positivo que suporta o receptor de ligando para uma extensão maior quando comparado com a célula de antigeno negativo, o 25 método compreende modificar o ligando tal que o ligando compreenda pelo menos uma substituição ou deleção de aminoácido que reduz sua potência em uma célula de antigeno negativo ligando o ligador modificado com um anticorpo ou porção de ligação de antigeno deste, caracterizado por: o 30 anticorpo ou porção de ligação de antigeno deste ser especifico para antigeno em uma célula de antigeno positivo associado a superfície de célula, mas não em uma célula de antígeno negativo.
Ao contrario da ligação de um não atenuado ligando humano "nativo" ou "tipo selvagem" para um anticorpo ou porção ligando antígeno deste, que tipicamente resulta de potência de 1 a 15 vezes maior do ligando no antígeno positivo comparado com células de antígeno negativo, a presente invenção demonstra que a ligação de mutado, formas atenuadas do ligando com o anticorpo é capaz de gerar maior potência nas células de antígeno positivo comparado com células de antígeno negativo.
Em uma concretização o ligando de sinalização é IFNa ou IFNP e o construtor de polipeptídeo mostra pelo menos 10, pelo menos 100, pelo menos 1.000, pelo menos 10.000 ou pelo menos 100.000 vezes maior seletividade em relação as células de antígeno positivo sobre células de antígeno negativo comparado com livre, ligando tipo selvagem usando o ensaio "fora de alvo" e os ensaios "no alvo (ARP)" ou "no alvo (Daudi)" descritos neste documento.
A presente invenção também fornece um ligando de proteína de fusão atenuando anticorpo, caracterizado por:o ligando atenuado ser IFNa ou IPNβ e caracterizado por:o construtor de proteína de fusão, quando injetado em um rato com um estabelecido tumor humano, poder eliminar o tumor.
A presente invenção também forneces um anticorpo atenuando ligando de proteína de fusão, caracterizado por:o ligando ser IFNa ou IPNβ e caracterizado por: o construtor de proteína de fusão, quando injetado em um rato com um estabelecido tumor humano com um volume de mais de 500 milímetros cúbicos, poder eliminar o tumor.
A presente invenção também fornece umligando de proteína de fusão atenuando anticorpo, caracterizado por: o ligando atenuado ser IFNa ou IPNβ e caracterizado por:o construtor de proteína de fusão, quando injetado como um tratamento de uma única vez em um rato com um estabilizado tumor humano, poder eliminar o tumor.
Um ligando de proteína de fusão atenuando anticorpo, caracterizado por:o ligando atenuado ser IFNcc ou IFN e caracterizado por:o construtor de proteína de fusão poder eliminar ambos estabilizados tumores de mieloma e estabelecidos tumores de linfoma em um rato.
Em cada um destes casos é preferível que o antigeno associado com a superfície de célula seja CD 38.
Em uma concretização, a sequência de aminoácido do ligando de sinalização compreender pelo menos uma substituição ou deleção de aminoácido sendo maior que 90% ou maior que 95%, ou maior que 95%, ou maior que 97%, ou maior que 98% ou maior que 99% da sequência identidade com a sequência de ligando de aminoácido do tipo selvagem.
Em uma concretização, o construtor é uma proteína de fusão.
Em certas concretizações o ligando de sinalização é ligado para o terminal C da cadeia pesada do anticorpo ou porção ligando antigeno deste. Em certas concretizações a sinalização do ligando é ligado para o terminal C da cadeia leve do anticorpo ou porção ligando antigeno deste. Em uma destas concretizações, o ligando pode ser ligado diretamente para o terminal C da cadeia leve ou pesada do anticorpo ou porção ligando antigeno deste (isto é, um interveniente ligador adicional).
Em uma concretização o antigeno associado a superficie de célula é selecionado da classe I MHC ou PD-1.
Em certas concretizações, o antigeno associado com superficie de célula é um antigeno associado com mieloma que é selecionado do grupo consistindo de CD38, HM1.24, CD56, CS1, CD138, CD74, IL-6R, Blis (BAFE), BCMA, HLA-SR, Kininogen, beta2 microglobulina, FGFR3, ICAM-1, matriptase, CD52, EGFR, GM2, alpha4-integrin, IFG-IR e KIR, e oligando é um IFNa.
Em uma concretização, ligando de sinalização é selecionado de qualquer um dos IFNa2b, IPNβ, IL-4 ou IL-6.
Em certas concretizações em que a sinalização do ligando é um IFNa, a substituição ou deleção de aminoácido pode ser de qualquer uma ou mais das posições de aminoácido R33, R144 ou A145. Em certas concretizações o ligando de sinalização é um IFNa e a substituição é selecionada do grupo consistindo de R144A (SEQ ID NO: 30), R144S (SEQ ID NO:40), R144T (SEQ ID NO:41), R144Y (SEQ ID NO:43), R144I (SEQ ID NO:35), R144L (SEQ ID NO:37), A145D (SEQ ID NO:44), A145H (SEQ ID NO:47), A145Y (SEQ ID NO:58), A145K (SEQ ID NO: 49), R33A+YNS (SEQ ID NO: 65), R33A (SEQ ID NO: 16) e R144A+YNS (SEQ ID NO:68).
Em certas concretizações em que oligando de sinalização é um IFNa e o antigeno associado a superficie de célula é CD38, o anticorpo é selecionado de qualquer um de G003, G005, G024, MOR03077, MORO3079, MORO3080, MORO3100, 38SB13, 38SB18, 38SB19, 38SB30, 38SB31, 38SB39, OKTIO, X355/02, X910/12, X355/07, X913/15, R5D1, R5E8, R10A2, ou uma porção deste ligando antigeno, ou um anticorpo com maior qué 95%, maior que 96%, maior que 97%, maior que 98% ou pelo menos 99% da sequência identidade de aminoácido com qualquer um dos R5D1, R5E8 ou R10A2.
Em certas concretizações em o antigeno associado a superficie de célula é CD38, o ligando de sinalização do 5 polipeptide o construtor é um IFNa, o tratamento é para um câncer em um indivíduo selecionado de mieloma múltiplo, uma leucemia ou um linfoma. Em particular um retinóide, tal como qualquer ácido retinóico trans. Em certas concretizações em que o antigeno associado com superficie 10 de célula é CD38, o tumor ou câncer pode ser selecionado de mieloma múltipla, linfoma não Hodgkin, leucemia mielogena crônica, leucemia linfocitico crônica ou leucemia mielogena aguda.
Em concretizações em que o ligando é ligado para um 15 anticorpo, o anticorpo pode ser um IgG4. Em particular concretizações o IgG4 compreende uma substituição de aminoácido S228P.
Em certas concretizações em que o ligando de sinalização do polipeptideo construtor é um IFNa, o porção 20 deste ligando anticorpo ou antigeno pode ligar para um antigeno associado a superficie de célula em células viralmente infectadas. Nestas concretizações o antigeno associado a superficie de célula pode ser selecionado de proteina viralmente codificada, uma proteina codificando 25 fosfatidilserina ou fosfatidilserina . Em concretizações em que a superficie de célula associada a antigeno é fosfatidilserina ou uma proteina ligando fosfatidilserina o construtor pode ser usado para tratar Hepatite C.
Em certas concretizações em que o ligando de 30 sinalização do polipeptideo construtor é IFNà ou IENβ, a superficie de célula associada a antigeno é selecionada de CD20, CD38, CD138 ou CS1. Em certas concretizações em que o ligando é IFNaou IENβ, o tumor ou câncer pode ser selecionado de mieloma múltipla, melanoma, célula de carcinoma renal, leucemia mielogena crônica ou leucemia de 5 célula pelosa.
Em uma particular concretização o construtor é G005- HC-LO-IFNa (A145D) IgG4 .
Em certas concretizações em que o ligando de sinalização do polipeptideo construtor é um IFNP, a 10 superfície de célula associada a antigeno pode ser uma célula T, uma célula mielóide ou um antigeno presente em célula de proteina associada a superficie de célula.
Em certas concretizações em que oligando de sinalização do polipeptideo construtor é um IFNP, a 15 superficie de célula associada a antigeno pode ser selecionada do grupo consistindo de CD3, CD4, CD8, CD24, CD38, CD44, CD69, CD71, CD83, CD86, CD96, HLA-DR, PD-1, ICOS, CD33, CD115, CD1 1c, CD14, CD52 e PD-1. Nestas concretizações, o construtor pode ser usado para tratar uma 20 doença caracterizada por excesso de inflamação, tal como uma doença autoimune.
Em certas concretizações em que o ligando de sinalização do polipeptideo construtor é um IFNP, pelo menos uma substituição ou deleção de aminoácido é 25 selecionada do grupo consistindo de R35A, R35T, E42K, M62I, G78S, A141Y, A142T, E149K, R152H. Nestas concretizações, o IFNP pode também possuir uma substituição de C17S ou C17A.
Em certas concretizações o ligando de sinalização do polipeptideo construtor é um IFNy. Nestas concretizações, a 30 superficie de célula associada a antigeno pode ser um antigeno associado a tumor. Em outras concretizações, a superfície de célula associada a antígeno pode ser selecionada do grupo consistindo de CD 14, FSP1, FAP, PDGFR alfa e PDGFR beta. Nestas concretizações, o construtor pode ser usado para tratar uma doença caracterizada por excesso de fibrose.
Em certas concretizações em gue o ligando de sinalização do polipeptideo construtor é um IFNy, pelo menos uma substituição ou deleção de aminoácido é selecionada do grupo consistindo de uma deleção de resíduos A23 e D24, uma substituição de S20I, uma substituição de A23V, uma substituição de D21K e uma substituição de D24A.
Em certas concretizações em que o ligando de sinalização do polipeptideo construtor é um IL-4, a superfície de célula associada a antígeno é selecionada do grupo consistindo de CD3, CD4, CD24, CD38, CD44, CD69, CD71, CD96, PD-1, ICOS, CD52 e PD-1.
Em certas concretizações em que o ligando de sinalização do polipeptideo construtor é um IL-6, a superfície de célula associada a antígeno é selecionada do grupo consistindo de CD3, CD4, CD24, CD38, CD44, CD69, CD71, CD96, PD-1, ICOS, CD52 e PD-1.
Em certas concretizações em que o ligando de sinalização do polipeptideo construtor é um HGF, a superfície de célula associada antígeno é selecionada do grupo consistindo de ASGR1, ASGR2, FSP1, RTI140/Ti-alpha, HTI56 e um receptor VEGF.
Em certas concretizações em que o ligando de sinalização do polipeptideo construtor é um TGFp, a superfície de célula associada antígeno é selecionada do grupo consistindo de CD3, CD4, CD8, CD24, CD38, CD44, CD69, CD71, CD83, CD86, CD96, HLA-DR, PD-1, ICOS, CD33, CD115, CD1 1c, CD14, CD52 e PD-1.
Em certas concretizações em que o ligando de sinalização do polipeptideo construtor é umeritropoietina, a superficie de célula associada antigeno é selecionada do grupo consistindo de CD241 o produto do gene de RCHE, CD117 (c-kit), CD71 (receptor de transferrin), CD36 (receptor de thrombospondina), CD34, CD45RO, CD45RA, CD115, CD168, CD235, CD236, CD237, CD238, CD239 e CD240.
Em certas concretizações em que o ligando de sinalização do polipeptideo construtor é um interleucina-10 e a superficie de célula associada antigeno é selecionada do grupo consistindo de CD1 1c, CD33 ou CD115, CD14, FSP1, FAP, ou PDGFR (alpha ou beta).
Em um sexto aspecto existe o fornecimento de anti- CD38 anticorpos com regiões variáveis designadas X910/12, X913/15, X355/02, X355/07, R5D1, R5E8, ou R10A2, com sequências agrupadas como segue:
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Destas sequências uma pessoa experiente no campo pode rapidamente identificar as sequências CDR usando métodos conhecidos. Como será reconhecido por trabalhador experiente estas sequências CDR podem ser usadas em diferentes sequências framework para estas especificadas abaixo nas SEQ ID NO's.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS
A Figura 1 mostra um esquemático de certas concretizações da presente invenção que compreende um anticorpo consistindo de 2 cadeias pesadas e 2 cadeias leves, em que um ou dois atenuados ligando de sinalizações está ou estão ligados para cada uma das cadeia pesada ou cada uma das cadeia leve, ou ambas.
A Figura 2 mostra um esquemático ilustrando uma possivel abordagem como o ligando de proteina de fusão atenuando anticorpo da presente invenção causa sinalização para ativar receptores em células que apresentam o antigeno correspondendo para o dito anticorpo em suas superficies de células. A proteina de fusão ativa o receptor na mesma célula que o anticorpo é ligado, via seu antigeno especifico.
A Figura 3 mostra as sequências de aminoácido do CD38 humano (SEQ ID NO: 131) .
A Figura 4 mostra as sequências de aminoácido de certos exemplares ligandos de sinalização da presente invenção: (a) IFNcc humano2b, IPNβl, IFN lb e IFNy; (b) IL- 4 e IL-6.
A Figura 5 mostra as sequências de aminoácido de certos ligandos de proteina de fusão atenuando anticorpo da presente invenção: (a) G005-HC-L0-IFNa (A145D) IgG4; (b) nBT062-HC-L0-IFNa (A145D) IgG4; (c) G005-HC-L0-IFNP (R35A) IgG4; (d) HB95-HC-L16-IL-6 (R179E) IgGl; e (e) J110-HC-L6- IL-4 (R88Q) IgGl. A nomenclatura para as proteina de fusão é descrita nos exemplos.
A Figura 6 mostra a atividade de inteferom direcionada para anticorpo não antigeno de IFNcc2b, e do anticorpo-IFN dos construtores de proteina de fusão Rituximab-IFN 2b (Rituximab-HC-L6-IFNcc IgGl) e Palivizumab-IFNcc2b (Isotipo-HC-L6-IFN IgGl) no ensaio de atividade de interferon descrito nos exemplos abaixo como o ensaio "fora do alvo". Através de outras figuras "equivalentes IFNcc" refere-separa a concentração molar de moléculas de interferon, livre ou ligada para um anticorpo. "IFN" refere-se para livre (não proteina de fusão) interferon tipo selvagem. "
A Figura 7 mostra a atividade de interferon direcionada para anticorpo-antigeno do Rituximab-IFN 2b construtor de proteina de fusão (Rituximab-HC-L6-IFNa IgGl) comparado com IFNcc2b no ensaio antiproliferative descrito nos exemplos abaixo como o "ensaio no alvo (Daudi)."
A Figura 8 mostra a atividade de interferon direcionada para anticorpo antigeno do Rituximab-IFN construtor de proteina de fusão (Rituximab-HC-L6-IFNa IgGl) comparado com uma atividade não alvo de Palivizumab-IFN construtor de proteina de fusão (Isotipo-HC-L6-IFNa IgGl) no "ensaio no alvo (Daudi)" descrito nos exemplos abaixo.
A Figura 9 mostra a atividade de interferon direcionada para anticorpo não antigeno de IFNcc2b, do anticorpo IFN construtor de proteina de fusão Rituximab- IFNcc2b (Rituximab-HC-L6-IFNa IgGl) e Palivizumab-IFNcc2b (Isotipo-HC-L6-IFNcc IgGl), ' e de certos variantes de Rituximab-IFN 2b construtor que foi mutado para reduzir atividade de interferon. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio fora de alvo".
A Figura 10 mostra a atividade de interferon direcionada para anticorpo IFN de construtor de proteina de fusão Rituximab-IFNcc2b (Rituximab-HC-L6-IFNcc IgGl) e de dois variantes de Rituximab-IFNcc2b que foram mutado para reduzir atividade de interferon. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio fora de alvo".
A Figura 11 mostra a atividade de interferon direcionada para anticorpo antigenoIFN construtor de proteina de fusão Rituximab-IFNcc2b (Rituximab-HC-L6-IFNcc IgGl) e de variantes de Rituximab-IFNa2b construtor que foi mutado para reduzir sua atividade de interferon comparada com atividade não alvo do Palivizumab-IFNcc2b (rsotipo-HC- L6-IFNCC IgGl) construtor de proteina de fusão e comparado com IFNcc2b. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio no alvo(Daudi)."
A Figura 12 mostra a atividade de interferon direcionada para anticorpo antigenoo do anticorpo-IFN construtor de proteina de fusão Rituximab-IFNcc2b (Rituximab-HC-L6-IFNcc IgGl) e de dois variantes que foram mutados para reduzir atividade de interferon. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio no alvo (Daudi)."
A Figura 13 mostra as sequências de certos novos anticorpos CD38 humano descritos neste documento.
A Figura 14 mostra o resultado da detecção de ligação de novos anticorpos anti-CD38 humano com um CD38+ linha de célula RPMI-8226 por citometria de fluxo. O eixo x é a concentração de anticorpo em microgramas/ml e o eixo y representa a intensidade média de fluorescência.
A Figura 15 mostra a atividade de IFN direcionada para anticorpo não antigeno de IFNcc2b comparado com um anti- CD38-IFNcc construtor de proteina de fusão (G005-HC-L0- IFNCC IgG4), baseada no anti-CD38 anticorpo G005. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio fora de alvo."
A Figura 16 mostra a atividade antiproliferativa de IFNcc2b versus um construtor de proteina de fusão anti- CD38-IFN (G005-HC-L0-IFNCC IgG4) na linha de célula ARP-1 de mieloma múltipla(CD38 + ) . 0 ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio no alvo (ARP)".
A Figura 17 mostra a atividade IFN direcionada de anticorpo não antigeno de IFNcc2b versus vários anti-CD38- IFNcc construtores de proteina de fusão conduzindo ponto de mutações nas porções IFN. As regiões variáveis de anticorpo destes construtores de proteina de fusão foram derivadas do anticorpo G005. O ensaio é descrito nos exemplos como ©"ensaio fora do alvo."
A Figura 18 mostra atividade de IFNcc2b versus vários anti-CD38-IFNcc construtores de proteina de fusão direcionada para o anticorpo não antigeno conduzindo os pontos de mutações na porção IFN. As regiões variáveis de anticorpo destes construtores de proteina de fusão foram derivadas do anticorpo G005. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio fora do alvo."
A Figura 19 mostra a atividade de IFN direcionada para anticorpo não antigeno de IFNcc2b versus dois anti-CD38- IFNcc construtores de proteina de fusão conduzindo ponto de mutações na porção IFN. As regiões variáveis de anticorpo destes construtores de proteina de fusão foram derivados do anticorpo G005. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio fora do alvo."
A Figura 20 mostra a atividade antiproliferativa de IFNcc2b versus anti-CD38-IFNcc construtores de proteina de fusão com mutações na porção IFN na linha de célula e linfoma Daudi. As regiões variáveis de anticorpo destes construtores de proteina de fusão foram derivados do anticorpo G005. O ensaio é descrito nos exemplos como o"ensaio no alvo (Daudi)."
A Figura 21 mostra a atividade anti-proliferativa de IFNcc2b e vários anti-CD38-IFNa proteina de fusão com a mutação A145G na porção IFN. Construtores de proteina de fusão têm 6 ligadores de aminoácido(L6) ou nenhum ligador (L0) e são do isotipo IgGl ou IgG4. As regiões variáveis de anticorpo destes construtores de proteina de fusão foram derivados do anticorpo G005. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio no alvo (Daudi)".
A Figura 22 mostra a atividade anti-proliferativa de IFNcc2b e duas proteina de fusão anti-CD38-IFNcc com a mutação A145G na porção IFN. Ambos os construtores de proteina de fusão têm a porção IFN ligada para o terminal da cadeia leve, com um ligador de seis aminoácido (L6) ou nenhum ligador (L0). As regiões variáveis de anticorpo destes construtores de proteina de fusão foram derivados do anticorpo G005. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio no alvo (Daudi)".
A Figura 23 mostra a atividade antiproliferativa em linha de célula ARP-1 de mieloma múltipla de IFNcc2b versus antÍ-CD38-IFNcc construtores de proteina de fusão com a mutação R144A na porção IFN. O experimento compara a potência dos construtores de proteina de fusão como uma função de isotipo (IgGl versus IgG4) e a presença ou ausência dos ligandos L6 entre a cadeia pesada de anticorpo terminal Ceo Terminal N do mutado IFN. As regiões variáveis de anticorpo destes construtores de proteina de fusão foram derivadas do anticorpo G005. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio no alvo (ARP)".
A Figura 24 mostra a atividade antiproliferativa nas linhas de célula ARP-1 de mieloma múltipla de IFNcc2b versus anti-CD38-IFNcc construtores de proteina de fusão com a mutação A145G na porção IFN. O experimento compara a potência dos construtores de proteina de fusão como uma função de isotipo (IgGl versus IgG4) e a presença ou ausência do ligador L6 entre a cadeia de anticorpo pesada terminal Ceo Terminal N do mutado IFN. As regiões variáveis de anticorpos estes construtores de proteina de fusão foram derivadas do anticorpo G005. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio no alvo (ARP)".
A Figura 25 mostra a Atividade IFN de vários anti- CD38-IFNCC construtores de proteina de fusão diorecionada a anticorpo não antigeno com diferentes pontos de mutações na porção IFN. As regiões variáveis de anticorpo destes construtores de proteina de fusão foram derivados do anticorpo G005. 0 ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio fora de alvo".
A Figura 26 mostra a atividade de vários anti-CD38- IFNCC construtores de proteina de fusão direcionada para anticorpo não antigeno com diferentes pontos de mutações na porção IFN. As regiões variáveis de anticorpo destes construtores de proteina de fusão foram derivadas do anticorpo G005. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio fora de alvo".
A Figura 27 mostra a atividade IFN de vários anti- CD38-IFNCC construtores de proteina de fusão direcionada para anticorpo não antigeno com diferentes pontos de mutações na porção IFN. As regiões variáveis de anticorpo destes construtores de proteina de fusão foram derivados do anticorpo G005. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio fora de alvo".
A Figura 28 mostra atividade IFN de vários anti-CD38- IFNCC construtores de proteina de fusão direcionada para anticorpo não antigeno com diferentes pontos de mutações na porção IFN. As regiões variáveis de anticorpo destes construtores de proteina de fusão foram derivadas do anticorpo G005. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio fora de alvo".
A Figura 29 mostra a atividade IFN de IFNcc2b versus vários anti-CD38-IFNcc construtores de proteina de fusão direcionada para anticorpo não antigeno com diferentes pontos de mutações na porção IFN. As regiões variáveis de anticorpo destes construtores de proteina de fusão foram derivados do anticorpo G005. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio fora de alvo".
A Figura 30 mostra a atividade IFN de vários anti- CD38-IFNCC construtores de proteina de fusão direcionada para anticorpo não antigeno de diferentes pontos de mutações na porção IFN. As regiões variáveis de anticorpo destes construtores de proteina de fusão forma derivadas do anticorpo G005. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio fora de alvo".
A Figura 31 mostra a atividade antiproliferativa de linha de célula ARP-1 em mieloma múltipla de anti-CD38- IFNcc construtores de proteina de fusão com as várias mutações na 'porção IFN. As regiões variáveis de anticorpo destes construtores de proteina de fusão forma derivados do anticorpo G005. O ensaio é descrito nos exemplos como ©"ensaio no alvo (ARP)".
A Figura 32 mostra a atividade antiproliferativa de linha de célula ARP-1 em mieloma múltipla de IFNcc2b versus anti-CD38-IFNcc construtores de proteina de fusão com as várias mutações na porção IFN. As regiões variáveis de anticorpo destes construtores de proteina de fusão forma derivadas do anticorpo G005. 0 ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio no alvo (ARP)".
A Figura 33 mostra a atividade antiproliferativa de linha de célula ARP-1 em mieloma múltipla de IFNcc2b versus anti-CD38-IFNcc construtores de proteina de fusãocom a mutação R144A na porção IFN. O experimento compara diferentes regiões variáveis de anticorpo no contexto do mesmo mutado IFN proteina de fusão. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio no alvo (ARP)".
A Figura 34 mostra a atividade antiproliferativa de linha de célula ARP-1 em mieloma múltipla de IFNcc2b versus anti-CD38-IFNcc construtores de proteina de fusãocom a mutação A145D na porção IFN. 0 experimento compara diferentes regiões variáveis de anticorpo no contexto do mesmo mutado IFN proteina de fusão. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio no alvo (ARP)".
A Figura 35 mostra atividade IFN de IFNcc2b e vários anti-CD38-IFNcc construtores de proteina de fusão direcionada para anticorpo não antigeno com a mutação R144A na porção IFN. O experimento compara diferentes regiões variáveis de anticorpo no contexto do mesmo mutado IFN construtor de proteina de fusão. O ensaio é descrito nos exemplos como o"ensaio fora do alvo'."
A Figura 36 mostra atividade IFM de IFNcc2b e vários anti-CD38-IFNcc construtores de proteina de fusão direciona para anticorpo não antigeno com a mutação A145D na porção IFN. 0 experimento compara diferentes regiões variáveis de 5 anticorpo no contexto do mesmo mutado IFN construtor de proteina de fusão. 0 ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio fora do alvo."
A Figura 37 mostra a atividade antiproliferativa de linha de célula ARP-1 em mieloma múltiplade IFNcc2b versus 10 anti-CD38-IFNcc construtores de proteina de fusãocom a mutação A14 5D na porção IFN. O experimento compara diferentes regiões variáveis de anticorpo no contexto do mesmo mutado IFN construtor de proteina de fusão. O ensaio é descrito nos exemplos como o"ensaio no alvo (ARP)". _
A Figura 38 mostra atividade IFN de IFNcc2b e vários anti-CD38-IFNcc construtores de proteina de fusão direcionado para anticorpo não antigeno com a mutação A145D na porção IFN. O experimento compara diferentes regiões variáveis de anticorpo no contexto do mesmo mutado IFN 20 construtor de proteina de fusão. 0 ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio fora do alvo."
A Figura 39 mostra a atividade proliferativa em linha de célula de mieloma múltipla ARP-1 de dois anticorpos IFN construtores de proteina de fusão com a A145D mutação na 25 Porção IFN. 0 anticorpo nBT062 liga CD138 para o "isotipo" não anticorpo (é derivado do anticorpo 2D 12) . O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio no alvo (ARP)".
A Figura 40 (a) mostra a anti atividade proliferativa em linha de célula de mieloma múltipla ARP-1 de IFNcc2b e 30 dois anticorpo- IFN construtores de proteina de fusão com á A145D mutação na Porção IFN. 0 HB95 anticorpo liga humano classe I MHC (que é expresso nas células ARP-1) onde o "isotipo" anticorpo não (é derivado do anticorpo 2D12). Palivizumab, como 2D12, não liga para as células ARP-1, (b) mostra o mesmo ensaio, comparação construtores de proteina de fusão atenuando anticorpo IFNa em que a porção de anticorpo é um fragmento Fab em vez de um tamanho completo de anticorpo. Para ambos (a) e (b) painéis, o ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio noalvo (ARP)".
A Figura 41 mostra medida da atividade antiviral de IFNa e dois anticorpo-IFNa construtores de proteina de fusão com a A145D mutação na porção IFN. Este ensaio de inibição do efeito citopático utilizado na linha de célula A549 e o virus EMC. O anticorpo HB95 liga MHC classe I humano (que é expresso nas élulas 549) onde anticorpo "isotipo" não deriva do anticorpo 2D 12.
A Figura 42 mostra a atividade IFN de IPNβ direcionada para anticorpo não antigeno, um anti-CD38-IFN construtor de proteina de fusão e um idêntico construtor de proteina de fusão, mas com a atenuação da R35A mutação na porção IFN. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio fora do alvo."
A Figura 43 mostra a atividade antiproliferativa na linha de célula de mieloma múltipla ARP-1 de INβ, um anti- CD38-IFN construtor de proteina de fusão e um idêntico construtor de proteina de fusão mas com atenuação R35A mutação na porção IFN. As regiões variáveis de anticorpo destes construtores de proteina de fusão são derivados do anticorpo G005. O ensaio é descrito nos exemplos como o "ensaio no alvo (ARP)". "Equivalentes IFN" refere-se para a concentração molar de moléculas de interferon, livre ou ligado para um anticorpo.
A Figura 44 mostra a atividade IL-4 direcionada para anticorpo não antigeno ["ensaio fora do alvo (HB-IL4) "] de IL-4 e três anticorpos IL-4 construtores de proteina de fusão: JI 10-HC-L6-IL-4 IgGl, um anti-PDl anticorpo fundido para o tipo selvagem IL-4; JI 10-HC-L6-IL-4 (R88Q), que é idêntico para o construtor de proteina de fusão anteriormente mencionado exceto pela atenuação R88Q mutação na porçãoIL-4; e Isotipo-HC-L6-IL-4 (R88Q), baseado na 2D 12 anticorpo, que não liga para qualquer das células usadas nos ensaios da presente invenção, e é fundido para o atenuado IL-4. "IL-4 equivalentes" refere-se para a concentração molar de moléculas IL-4, livre ou ligado para um anticorpo.
A Figura 45 mostra o "ensaio no alvo (desvio de Thl) "comparando a atividade de IL-4 e três anticorpos IL-4 construtores de proteina de fusão: JI 10-HC-L6-IL-4 IgGl, um anticorpo anti-PDl fundido para o tipo selvagem IL-4; J110-HC-L6-IL-4 (R88Q), que é idêntico para o construtor de proteina de fusão previamente mencionado exceto pela atenuação R88Q mutação na porção IL-4; e Isotipo-HC-L6-IL-4 (R88Q) , baseado no 2D 12 anticorpo, que não liga para qualquer das células usadas nos ensaios da presente invenção, e é fundido para o atenuado IL-4. "IL-4 equivalentes" refere-se para a concentração molar de moléculas IL-4, livre ou ligado para um anticorpo.
A Figura 46 mostra o "IL-6 bioensaio" comparando IL-6 com vários anticorpo-IL-6 construtores de proteina de fusão que não liga para as células alvo (baseado na HB95 anticorpo, que liga para o MHCclasse I nas células alvo) ou não liga para células alvo (baseado no anticorpo de controle isotipo 2D 12), fundido para o tipo selvagem IL-6 ou IL-6 com a atenuação R179E mutação. "IL-6 equivalentes" refere-se para a concentração molar de moléculas IL-6, livre ou ligado para um anticorpo.
A Figura 47 mostra o efeito de vários compostos no crescimento de tumores subcutâneos de mieloma H929 em ratos SCID. A barra etiquetada "tratamento" mostra a duração do tratamento com os compostos. O "isotipo" anticorpo foi baseado em anticorpo 2D 12. G005 é um anticorpo anti-CD38.
A Figura 48 mostra o efeito de vários compostos na sobrevivência (Kaplan-Meier graph) de ratos NOD-SCID sistemicamente inoculado com a linha de célula de mieloma humana MM1S. A barra etiquetada "tratamento" mostra a duração do tratamento com os compostos. G005 é um anticorpo anti-CD38.
A Figura 49 mostra o efeito de vários compostos no crescimento de subcutâneos tumores linfoma Daudi em ratos NOD-SCID. A barra etiquetada "tratamento" mostra a duração do tratamento com os compostos. 0 "isotipo" anticorpo foi baseado em anticorpo 2D 12.G005 é um anticorpo anti-CD38.
A Figura 50 mostra o efeito de um anti-CD38-atenuado IFNcc construtor de proteina de fusão(G005-HC-L6-IFNCC (A145G) IgGl) e um isotipo de controle atenuado IFNcc construtor de proteina de fusão(Isotipo-HC-L6-IFNcc (A145G) IgGl) no crescimento de tumores subcutâneos de mieloma H929 em ratos SCID, em várias doses. A barra etiquetada "tratamento" mostra a duração do tratamento com os compostos. O "isotipo" anticorpo foi baseado em anticorpo 2D 12.
A Figura 51 mostra o efeito de anti-CD38 atenuado IFNcc construtores de proteina de fusão versus isotipo de controle de anticorpo atenuando IFNcc construtores de proteina de fusão, no crescimento de tumores subcutâneos de mieloma H929 em ratos SCID. IgGl é comparado para IgG4 no contexto destes construtores de proteina de fusão. A barra etiquetada "tratamento" mostra a duração do tratamento com 5 os compostos. 0 "isotipo" anticorpo foi baseado em anticorpo 2D 12.
A Figura 52 mostra o efeito de um anti-CD38-atenuado IFNcc construtor de proteina de fusão(X355/02-HC-L0-IFNCC (A145D) IgG4) versus um isotipo de controle anticorpo 10 atenuado IFNcc construtores de proteina de fusão no crescimento de tumores subcutâneos de mieloma H929 em ratos SCID. A barra etiquetada "fase do tratamento" mostra a duração do tratamento com os compostos. O "isotipo" anticorpo foi baseado em anticorpo 2D12.
A Figura 53 mostra o efeito de vários compostos no crescimento de tumores subcutâneo de mieloma H929 em ratos SCID. G005 é um anticorpo anti-CD38.
A Figura 54 mostra o efeito de um anti-CD38-atenuado IFNcc construtor de proteina de fusão(G005-HC-L6-IFNCC 20 (A145G) IgG4) e um isotipo controle-atenuado IFNcc construtor de proteina de fusão(Isotipo-HC-L6-IFNcc (A145G) IgG4) no crescimento de tumores subcutâneo de mieloma H929 em ratos SCID, com várias etapas de administração, cada uma com uma dose de 10 mg/kg. O "isotipo" anticorpo foi baseado 25 em anticorpo 2D12.
A Figura 55 mostra o efeito de um anti-CD38-atenuado IFNcc construtor de proteina de fusão (G005-HC-L6-IFNCC (A145G) IgG4) no crescimento de tumores subcutâneos de mieloma H929 em ratos SCID. Dosagem (indicado por setas) 30 foi iniciada quando o volume médio do tumor alcançou 730 mm.
A Figura 56 mostra a inibição de formação de colônia de células de mononuclear da medula óssea normal humana (BM MNC) por IFNa2b, urn anti-CD38-atenuado IFNcc construtor de proteina de fusão(G005-HC-L0-IFNCC (A145D) IgG4) e urn 5 isotipo de controle anticorpo-atenuado IFNcc construtor de proteina de fusão 2D12-HC-L0-IFNCC (A145D) IgG4. 0 anticorpo atenuado IFNcc construtores de proteina de fusão mostra redução de potência de cerca de 10.000 vezes neste ensaio.
A Figura 57 mostra o efeito de IFNcc2b versus um anticorpo-atenuado IFNcc construtor de proteina de fusão(Isotipo-HC-L6-IFNcc (A145G) IgGl; as regiões variáveis de isotipo são baseadas em anticorpo 2D 12) na produção decitocina pelo sangue periférico humano de células mononuclear (PBMCs). (a) IP- 10 e MCP-1; (b) MCP-3 e IL-lcc.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÀO
Os construtores da presente invenção são construtores ligando atenuado por anticorpo, que mostra uma elevada 20 especificidade de antigeno indexada com relação a ativação do caminho de sinalização devido a ação do atenuado ligando em um receptor de superficie de célula. Estes construtores são baseados na surpreendente revelação que, no contexto de construtores ligando anticorpo, a porção do ligando pode 25 ser mutada em um caminho que a atividade do ligando em células antigenas negativas é dramaticamente atenuada, enquanto a atividade do ligando em células antigenas positivas é apenas modesta, se de todo, atenuada. Tais construtores apresentam um, dois, três, quatro ou cinco 30 ordens de maior magnitude de potência nas’ células antigeno positiva comparada com células antigeno negativo que do ligando livre. Em uma concretização, o construtor ligando atenuando anticorpo retém pelo menos 1%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50% da potência nas células antigeno positiva como 5 ligando livre não atenuado (isto é, não ligado com anticorpo). Em adição, em uma concretização o anticorpo atenuado ligando construtor retém pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 75% ou pelo menos 90% da atividade máxima do ligando livre não atenuado (isto é, não ligando 10 com um anticorpo); neste contexto, "atividade máxima" pode ser entendida como significando a quantidade de atividade de sinalização (ou efeito downstream deste) no máximo, a porção plana da curva de resposta de dose, onde adicionalmente aumenta no agente adicionalmente não aumenta 15 a quantidade de resposta). "Especificidade" como usado neste documento não é necessariamente uma designação absoluta mas frequentemente um termo relativo significando o grau de seletividade de um construtor de proteina de fusão ligando anticorpo para uma 20 célula antigeno positiva comparada com uma célula antigeno negativo. Assim por exemplo, um construtor pode ser dito para ter "100 vezes a especificidade para célula antigeno positiva comparada com célula antigeno negativa" e isto indicará que o construtor tem 100 vezes mais potência as 25 células que expressam o antigeno comparado com as células que não. Em alguns casos, este grau de especificidade de um construtor comparado com células antigeno positivo versus antigeno negativo pode não ser baseado em uma razão absoluta de potência do construtor em células antigeno 30 positivo versus antigeno negativo, mas da potência do construtor em cada tipo de célula relativa para a potência do livre, ligando não atenuado no mesmo tipo de célula. Esta "proporção da razão" abordada por quantificação do grau de especificidade de um construtor ligando anticorpo leva em consideração as diferenças inerentes na potência de 5 um ligando em diferentes tipos de célula é exemplificado pelos cálculos de índice de Especificidade de Antigeno (Antigen Specificity Index - ASI) na Tabela 25. Ensaios para determinar a potência de construtores de fusão ligando anticorpo são exemplificados nos exemplos e inclui ensaios 10 baseados em célula por proliferação, apoptose, fosforilação de receptores e proteinas intracelular, migração, diferenciação (por exemplo, diferenciação de células naive CD4+ T em células Thl, Thl7, Th2 versus células Treg), aumento ou redução deexpressão em gene ou produto de secreção de gene no meio, etc.
De acordo com, um primeiro aspecto a presente invenção fornece um construtor de polipeptideo compreendendo um ligando de sinalização de peptideo ou polipeptideo ligado para um anticorpo ou porção deste 20 ligando antigeno que liga para uma superficie de célula associada a antigeno caracterizado por: o ligando I compreender pelo menos uma substituição ou deleção d aminoácido que reduz sua potência em células que falta a expressão de do dito antigeno.
Em uma concretização a presente invenção fornece um polipeptideo construtor compreendendo IFN ligado para um anticorpo ou porção deste ligando antigeno que liga para um antigeno associado a tumor caracterizado por: o IFN compreender pelo menos uma substituição ou deleção de 30 aminoácido que reduz sua potência em células faltando a expressão do dito antigeno. Tais polipeptideos terão capazes de exercer com potência ata a atividade antiproliferativa de IFN's nas células de antigeno positivo de tumor enquanto exerce uma potência mais baixa nas células de tumor de antigeno negativo, células de não tumr 5 dentro do corpo
Em um segundo aspecto presente invenção fornece um método de tratamento de tumor em um indivíduo compreendendo administrar para o indivíduo o construtor de polipeptideo da presente invenção.
O termo "construtor ligando anticorpo" como usado neste documento refere-separa um anticorpo ou fragmentos deste ligando antigeno covalentemente ligado para um ligando de sinalização que foi atenuado por uma ou mais substituições ou deleções que reduz a potência ligando em 15 células que não expressam o antigeno correspondente ao anticorpo.
O termo "anticorpo", como usado neste documento, amplamente refere-se para qualquer molécula de imunoglobulina (Ig) compreendendo de quatro cadeias de 20 polipeptideo, duas cadeias pesadas (H) duas cadeias leves (L) , ou qualquer fragmento funcional, mutante, variante, ou derivação destes, que retém a característica essencial da ligação do epitope de uma molécula Ig. Tal formatos de anticorpo mutante, variante, ou derivativo são conhecidos 25 na matéria, concretizações não limitantes destas são discustidas abaixo.
Em um anticorpo de comprimento completo, cadacadeia pesada é composta de uma região variável de cadeia pesada (abreviada neste documento como HCVR ou VH) e uma 30 região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é composta de três dominios, CHI, CH2 e CH3.
Cada cadeia leve é composta de uma região variável de cadeia leve (abreviada neste documento como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é composta de um dominio, CL. Regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hiper variabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade(complementarity determining regions - CDR) , intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (framework regions - FR). Cada VH e VL é composto de três CDRs e quatro FRs, organizados de terminal amino para terminal carboxinasseguintes ordens: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasses.
O termo "dominio ligando antigeno" ou "porção ligando antigeno" de um anticorpo, como usado neste documento, refere-se para um ou mais fragmentos de um anticorpo ou proteina que retém a habilidade para especificamente ligar para um antigeno (exemplo, CD38). Foi mostrado que a função de ligação de antigeno de um anticorpo pode ser realizado por fragmentos de um anticorpo de comprimento inteiro. Tais concretizações de anticorpo podem também ter formatos biespecifico, especifico dual, ou multiespecifico, e especificamente ligando para dois ou mais antigenos diferentes. Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo "porção ligando antigeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo dos dominios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab em adição a uma porção da região de dobra, ligado por uma ponte de disulfeto na região de dobra; (iii) um fragmento Fd consistindo dos dominios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv consistindo dos dominios VL e VH de um ramo simples de um anticorpo , (v) um dominio de anticorpo (dAb) (Ward et al. 1989 Nature 341 544-6, Winter et al, PublicaçãoPCT WO 90/05144 incorporados neste documento por referência), que comprende um dominio variável simples; e (vi) uma isolada região de determinação de complementaridade (Complementarity Determining Region - CDR) . Além disso, embora os dois dominios de fragmento do Fv, VL e VH, sejam codificado por genes separados, eles podem ser ligados, usando métodos recombinantes, por uma ligação sintética que permite que sejam feitas como uma cadeia simples de proteina em que os pares de regiões VL e VH formam moléculas monovalentes (conhecido como cadeia simples Fv (scFv) ; ver exemplo, Bird et al. 1988 Science 242 423-6; Huston et al. 1988 Proc Natl Acad Sei U S A 85 5879-83). Tal cadeia simples de anticorpos são também pretendidas para englobar dentro do termo "porção ligando antigeno" de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia simples, tal como diacorpos, são também englobadas. Diacorpos são anticorpos bivalentes, biespecificos em que os dominios VH e VL são expressos em uma cadeia simples de polipeptideo, mas usando um ligador que é tão curto para permitir pares entre os dois dominios na mesma cadeia, deste modo forçando os dominios para emparelhar com dominios complementares de outras cadeias e criar dois sites de ligação de antigeno (ver exemplo, Holliger, P., et al, 1993, Proc. Natl. Acád. Sei. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J. , et al, 1994, Structure 2:1121-1123). Tais porções ligando anticorposão conhecidos na matéria (Kontermann e Dubel eds., Antibody Engineeanel 2001 Springer- Verlag. New York. 790 pp., ISBN 3-540-41354-5). Em umaconcretização a porção ligando anticorpoé um fragmento Fab.
O anticorpo descrito neste documento pode ser um anticorpo humanizado. O termo "anticorpo humanizado" será entendido para referir-se para uma proteina compreendendo uma região variável como humana, que inclui CDRs de um anticorpo de uma espécie não humana (exemplo, rato ou camundongo ou primata não humano) enxertado em ou inserido nos FRs de um anticorpo humano (este tipo de anticorpo é também referido como um "anticorpo enxertado de CDR"). Anticorpos humanizados também incluem proteinas em que um ou mais residues da proteina humana são modificados por uma ou mais substituições de aminoácido substituições e/ou um ou mais residues FR da proteina humana são recolocadas pelo correspondentes residues não humanos. Anticorpos humanizados podem também compreender residuos que são encontrados no anticorpo humano ou no anticorpo não humano. Quaisquer regiões adicionais da proteina (exemplo, região Fc) são geralmente humanas. Humanização pode ser realizada usando um método conhecido na matéria, exemplo, US5225539, US6054297, US7566771 ou US5585089. O termo "anticorpo humanizado" também engloba um anticorpo superhumanizado, exemplo, como descritoem US7,732,578.
O anticorpo descrito neste documento pode ser humano. O termo "anticorpo humano" como usado neste documento refere-se para proteinas tendo variável e, opcionalmente, regiões constantes de anticorpo encontrados em humanos, exemplo em linha de germe humana ou células somáticas ou de bibliotecas produzidas usando tais regiões. O anticorpo "humano" pode incluir residues de aminoácido não codificado por sequências humanas, exemplo mutações introduzidas por mutações aleatórias ou direcionada a site in vitro (em particular mutaçõesqueenvolve substituições conservativas ou mutações em um número pequeno de residues da proteina, exemplo em 1, 2, 3, 4 ou 5 dos residues da proteina). Estes "anticorpos humanos" não necessariamente necessitam de serem gerados como um resultado de uma resposta imune de um humano, assim, eles podem ser gerados usando meios recombinantes (exemplo, seleção de uma biblioteca de apresentação de fago) e/ou por um animal transgênico (exemplo, um rato) compreendendo ácido nucléico codificando regiões constantes e/ou variáveis de anticorpo e/ou usando seleção guiada (exemplo, como descrito em US5, 565,332) . Este termo também engloba formas de afinidade maturada de tais anticorpos. Para o propósito da presente revelação, uma proteina humana também será considerada para incluir uma proteina compreendendo FRs de um anticorpo humano ou FRs compreendendo sequências de uma sequência de consenso de FRs humano e em que um ou mais dos CDRs são aleatórios ou semi aleatórios, exemplo, como descrito em US 6300064 e/ou US 6248516.
As porções de anticorpo de polipeptideos da presente invenção podem ser anticorpos de comprimento inteiro de qualquer classe, preferencialmente IgGl, IgG2 ou IgG4. Os dominios constantes de tais anticorpos são preferencialmente humano. As regiões variáveis de tais anticorpos podem ser de origem não humana ou, preferencialmente, ser de origem humana ou ser humanizado. Fragmentos de anticorpo pode também ser usado no lugar dos anticorpos de comprimento inteiro.
O termo "anticorpo" também inclui anticorpos desenvolvidos. Como será apreciado existem muitas variações de anticorpos desenvolvidos (exemplo monoclonal de rato, quimérico, humanizado e anticorpos monoclonais humano, cadeia variável simples de fragmentos de anticorpo scFv's), minicorpos, aptameros, tanto quanto biespecifico anticorpos e diacorpos como descrito acima).
Os dominios de região simples variáveis (denominados dAbs) são, por exemplo, descrito em (Ward et al. , Nature 341: 544-546, 1989; Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448, 1993; Davies & Riechmann, FEBS Lett. 339: 285-290, 1994).
Minicorpos são versões pequenas de anticorpos completos, que codifica em uma cadeia simples os elementos essenciais de um anticorpo completo. Adequadamente, o minicorpo é composto dos dominio VH e VL de um anticorpo nativo fundido para a região de dobra e dominio CH3 da molécula de imunoglobulina como, por exemplo, descrito em Patente U.S. No 5,837,821.
Em uma concretização alternativa, o anticorpo desenvolvido pode compreender não derivados de imunoglobulina, estrutura de proteina. Por exemplo, referência pode ser feita para (Ku & Schutz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6552-6556, 1995) que revela um feixe de quatro hélice de proteina citocroma b562 tendo duas voltas randomizada para criar CDRs, que foram selecionados por ligação de antigeno.
Existe uma multiplicidade de proteinas de reconhecimento de não anticorpo ou suporte de dominio de proteina que podem ser utilizadas como dominio de ligação de antigeno nos construtores desta invenção. Isto inclui suportes baseado em antigeno 4 (CTLA-4) associado a citotóxico T linfócito (Evibody; US 7,166,697); transferrina humana (Trans-body); um feixo de três hélice de dominio Z de Proteina A (Affibody); um dominio de lecitina tipo C monomérica ou trimérica humana (Tetranectin); o décimo dominio de fibronectina humana tipo III (AdNectin); o domónio de tipo Kunitzde inibidor humano ou bovinode tripsina; Defensin A de inseto (IICA29), APPI (Kuntiz domains); lipocalins, FABP, proteiba ligando Bilin, Apolopropteina D (Anticalins); a-cristalainahumana ou molécula deubiquitina (Affilin); inhibitor de tripsina tipoll (Microbody); a2p8 ou Ankirina repetida (repeat-motif proteinas), Charibdotoxina (Scorpion toxins), Min-23, dominio ligando celulose (Knottins); Neocarzinostatina, CBM4-2 e Tendamistat.
Além disso, em adição ao suporte fornecido pelo dominio derivado de anticorpo ou dobra de não anticorpo como descrito acima, existem ligando de proteinas de ligação de ocorrência natural ou dominios de proteina que podem ser utilizados como o dominio de ligação do ligando desta invenção. Por exemplo, dominios de proteina que possuem propriedades de ligação de ligando incluem dominios extracelulares de receptores, proteinas de módulos de sinalização PDZ, tal como proteinas Ras-binding AF-6, moléculas de adesão, e enzimas.
A presente invenção adicionalmente engloba análogos quimicos de aminoácidos de anticorpos de indivíduos. O uso de análogos quimico de aminoácidos é útil inter alia para estabilizar as moléculas tal como se requerida para ser administrada para o indivíduo. Os análogos de aminoácido contemplados neste documento incluem, mas não são limitados para, modificações de cadeias laterais, incorporação de aminoácido não natural e/ou seus derivados durante sintese de peptideo, polipeptideo ou proteina e o uso de ligação cruzada e outros métodos que impõem restrições conformacional em moléculas protéicas ou seus análogos.
Exemplos de modificações de cadeia lateral contempladas pela presente invenção incluem modificações de grupos amino tal como por alcilação redutiva por reação com um aldeido seguido por redução com NaBH4; amidinação com metilacetimidato; acilação com anidrido acético; carbamoilação de grupos amino com cianato; trinitrobenzilação de grupos amino com 2, 4, 6-ácido sulfônico de trinitrobenzena (TNBS); acilação de grupos amino com anidreto succinico e anidreto de tetrahidroftálico; e piridoxilação de lisina com piridoxal- 5 -fosfato seguido por redução com NaBH4.
O grupo guanidina de residues de arginina pode ser modificado pela formação de produtos de condensação de heterociclico com reagentes tais como 2,3-butanediona, fenilglioxal e glioxal.
O grupo carboxil pode ser modificado por ativação de carbodiimida via formação de O-acilisourea seguido por subsequente derivatização, por exemplo, para uma correspondente amida.
Os grupos Sulfidril podem ser modificados por métodos tais como carboximetilação com ácido iodoacático ou iodoacetamida; oxidação de ácido performico para ácido cistéico; formação de uma mistura de disulfetos com outros compostos de tiol; reação com maleimida, anidreto maléico ou outrô substituída maleimida; formação de derivativos mercurial usando 4-cloromercuribenzoato, 4- cloromercurifenilsulfónico ácido, fenilmercuriocloreto, 2- cloromercurio-4-nitrofenol e outrosmercurios; carbamoilação com cianatoem pH alkaline.
Residues de Triptofan pode ser modificado por, por exemplo, por oxidação com N-bromosuccinimida ou alcilação do anelde indole com 2-hidroxi-5-nitrobenzil bromide ou sulfenil halides. Residues de tirosinade de outra maneira podem ser alterados por nitração com tetranitrometano para formar a 3-nitrotirosina derivativa.
Modificação do anel de imidazole de um anel de residue de histidinas pode ser acompanhada por alcilação com ácido iodo acético derivativos ou N-carbetoxilação com dietilpirocarbonato.
Exemplos de incorporação de aminoácido não naturais e derivativos de sintese de anel de peptideo incluem, mas não são limitados para, uso de norleucina, 4-amino ácido butirico, 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico ácido, 6- aminohexanoico ácido, t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, 4-amino-3-hidroxi-6- metilheptanóico ácido, 2-tienilalamina e/ou D-isômeros de aminoácido. A lista de aminoácido não natural, contemplado neste documento é mostrada na Tabela 1. Tabela 1
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Ligações cruzadas podem ser usadas, por exemplo, para estabilizar conformações 3D, usando homo-bifuncional Ligações cruzadas tal como o bifuncional imido ésteres tendo grupos (CH2)n espaçador com n=l a n=6, glutaraldeido, N-hidroxisuccinimida ésteres e hetero-bifuncional reagentes que usualmente contém um amino-reativa porção tal como N- hidroxisuccinimida e outrogrupoespecifico-porção reativa tal como maleimido ou ditioporção (SH) ou carbodiimida (CÓOH).
Usando métodos bem conhecido na matéria para aumentar ligação, por exemplo, a maturação de afinidade, ou para reduzir imunogenicidade por remoção de motivos de ligação de MHC classe II preditos. A utilidade terapêutica dos anticorpos descritos neste documento pode ser adicionalmente aumentada por modulação de suas características funcionais, tal como anticorpo-dependente célula-mediada por citotoxicidade (ADCC), citocidade dependente de complemento (complement-dependent cytotoxicidade- CDC), meia vida de soro, biodistribuição e ligação para receptores Fc ou a combinação de qualquer destes. Essa modulação pode ser melhorada pelo desenvovimento de proteina, desenvolvimento de glicol ou métodos quimicos. Dependendo da aplicação terapêutica requerida, pode ser vantajoso para aumentar ou reduzir qualquer destas atividades.
Um exemplo de desenvolvimento de glico usando o método Potelligent® método como descrito em Shinkawa T. et al., 2003 (J Biol Chem 278: 3466-73).
Numerosos métodos para maturação de afinidade de anticorpos são conhecidos na matéria. Muitos destes são baseado na estretégia geral de geração de painéis ou bibliotecas de proteinas variantes por mutagênese seguido por seleção e/ou escolha para melhorar a afinidade. Mutagênese é frequentemente realizada no nivel de DNA, por exemplo por error propenso de PCR (Thie, Voedisch et al. 2009), por gene shuffling (Kolkman e Stemmer 2001), pelo uso de quimica mutagênica ou irradiação, pelo uso de 'mutator' cepas propensas a error com maquinaria de replicação (Greener 1996) ou por abordagens de hipermutação somática que subordina maturação de afinidade natural de maquinaria(Peled, Kuang et al. 2008). Mutagênese pode também ser realizada no nivel de RNA, por exemplo pelo uso do replicase QP (Kopsidas, Roberts et al. 2006). Métodos baseados em biblioteca que permitem seleção para melhorar proteinas variantes podem ser baseados em várias tecnologias de display tal como fago, levedura, ribosoma, bactéria ou células mamárias, e são bem conhecidos na matéria (Benhar 2007). Maturação de afinidade pode ser melhorada por melhor direcionamento/método preditivo por exemplo por mutagênese direcionada a site ou síntese de gene guiado por conclusão de modelo de proteina 3D (ver por exemplo Queen, Schneider et al. 1989 ou Patente US 6,180,370 ou Patente US 5,225,539).
Métodos para aumentar ADCC foram descritos por Ferrara, Brunker et al. 2006; Li, Sethuraman et al. 2006; Stavenhagen, Gorlatov et al. 2007; Shields, Namenuk et al. 2001; Shinkawa, Nakamura et al. 2003; e WO 2008/006554.
Métodos para aumentar CDC foram descritos por Idusogie, Wong et al. 2001; Dall'Acqua, Cook et al. 2006; Michaelsen, Aase et al. 1990; Brekke, Bremnes et al. 1993; Tan, Shopes et al. 1990; e Norderhaug, Brekke et al. 1991.
Referências descrevendo métodos para aumentar ADCC e CDC incluem Natsume, In et al. 2008. A divulgação de cada uma destas referências é incluida neste documento por referência cruzada.
Um número de métodos para modulação de meia vida de soro do anticorpo e biodistribuição são baseados em modificação da interação entre anticorpo e o receptor neonatal Fc (neonatal Fc receptor- FcRn), um receptor com um papel principal na proteção IgG de catabolismo, e manutenção de alta concentração de soro de anticorpo. Dall'Acqua et al descreve substituições na região Fc de IgGl que melhora afinidade de ligação para FcRn, deste modo aumentando meia vida de soro (Dall'Acqua, Woods et al. 2002) e adicionalmente demonstra aumentada biodisponibilidade e modulação de atividade ADCC com tripla substituição de M252Y/S254T/T256E (Dall'Acqua, Kiener et al. 2006). Ver também Patentes US Nos 6,277,375; 6,821,505; e 7,083,784. Hinton et al descreveu dominio constante de substituições de aminoácidonas posições 250 e 428 que confere aumento da meia vida in vivo (Hinton, Johlfs et al. 2004). (Hinton, Xiong et al. 2006). Ver também Patente US No 7,217,797. Petkova et al descreveu dominio constante de substituições de aminoácido nas posições 307, 380 e 434 que confere aumento da meia vida in vivo (Petkova, Akilesh et al. 2006). Ver também Shields et al 2001 e WO 2000/42072. Outros exemplos de dominio constante de modificações de aminoácido que modula ligação para receptores Fc e subsequente função mediada por estes receptores, incluindo ligação FcRn e meia vida de soro, são descritos na Pedido de Patente US. Nos 20090142340; 20090068175 e 20090092599.
Os glicanos ligados para moléculas de anticorpo são conhecidos por influenciar interação de anticorpo com receptores Fc e receptores glicano e deste modo influência atividade de anticorpo, incluindo meia vida de soro(Kaneko, Nimmerjahn et al. 2006; Jones, Papac et al. 2007; e Kanda, Yamada et al. 2007). Assim, certas glicoformas que modulam desejadas atividades de anticorpo podem conferir vantagens terapêuticas. Métodos para gerar desenvolvimento de glicoformas são conhecidos na matéria e incluem, mas não são limitados para estes descrito na Patente US Nos 6,602,684; 7,326,681; 7,388,081 e WO 2008/006554.
Extensão de meia vida por adição de polietileno glicol (PEG) foi amplamente usado para extender a meia vida do soro de proteinas, como revisto, por exemplo, por Fishburn 2008 .
Como será reconhecido é possivel fazer conservativas substituições de aminoácidos dentro das sequências da invenção corrente. Por "substituições conservativas" significa aminoácidos tendo propriedades similares. Como usado nesta especificação os seguintes grupos de aminoácidos são para serem vistas como substituições conservativas: H, R e K; D,E,N e Q; V, I e L; C e M; S, T, P, A e G; e F, Y e W.
O termo "antigeno associado a superficie de célula", como usado neste documento, amplamente refere-se para qualquer antigeno expresso nas superficies de células, incluindo células infecciosas ou células estranha ou viruse.
Em certos aspectos da presente invenção, os construtores de polipeptideo ou composições da presente invenção podem ser usados para tratar pacientes com câncer. Cânceres contemplados neste documento incluem: um grupo de doenças e desordens que são caracterizadas por crescimento celular descontrolado (exemplo formação de tumor) sem qualquer diferenciação destas células em células especializadas e diferentes. Tais doenças e desordens incluem ABL1 protooncogene, cânceres relacionado com AIDS, neuroma acústico, leucemia linfocitica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adenocistica, câncer adrenocortical, metaplasia mieloide agnogenica, alopecia, sarcoma alveolar de parte mole, câncer anal, angiosarcoma, anemia aplástica, astrocitoma, ataxia-telangiectasia, carcinoma de célula basal (pele), câncer de bexiga, cânceres de osso, câncer de intestino, glioma do tronco celebrai, tumores do Celebris e tumores do sistema nervoso central, câncer de mama, tumores carcinoides, câncer cervical, tumores celebrais na infância, câncer da infância, leucemia da infância, sarcoma de tecido mole da infância, condrosarcoma, coriocarcinoma, leucemia finfociticacrônica, leucemia mieloide crônica, cânceres colorectal, linfoma de Célula T cutânea, protuberantes dermato fibrosarcoma, tumor de célula redonda pequena desmoplastica, carcinoma ductal, cânceres endocrino, câncer endometrial, ependimoma, cânceres ofageal, sarcoma de
Ewing, câncer das vias biliares extra-hepáticas, câncer de olho, melanoma, retinoblastoma, câncerdo tubo fallopian, anemia fanconi, fibrosarcoma, câncer da vesicula biliar, câncer gástrico, cânceres gastrointestinal, câncer carcinoide gastrointestinal, cânceres geniturinário, célula tumores de germe, doença trofoblástica gestacional, glioma, cânceres ginaecological, malignancias hematological, leucemia de célula cabeluda, câncer de pescoço e cabeça, câncer hepatocelular, câncer de mama hereditário, histiocitose, doença de Hodgkin, papillomavirus humano, hidatidiforme mole, hipercalcemia, câncer hipofaringe, melanoma intraocular, câncer de célula ilhota, sarcoma de Kaposi, câncer de rim, histocitose de célula Langerhan, câncer laringeal,“leiomiosarcoma, leucemia, sindrome de Li- Fraumeni, câncer de lábio, liposarcoma, câncer de figado, câncer de pulmão, linfedema, linfoma, linfomade Hodgkin, linfoma não Hodgkin, câncer de mama masculino, tumor renal de rabdóide maligno, blastoma de medula, melanoma, câncer de célula merkel, mesotelioma, câncer metastático, câncer de nariz, neoplasia endócrina múltipla, micose fungoide, sindrome de mielodisplasia, mielomamúltiplo, desordens mielo proliferativa, câncer nasal, câncer nasofaringeal, nefroblastoma, neuroblastoma, neurofibromatose, sindrome de quebra Nijmegen, câncerde pele não melanoma, câncer de pulmão de células não pequenas (non-small-cell-lung-cancer- NSCLC), cânceres oculares, câncer oesofageal, câncer de cavidade oral, câncer orofarinx, osteosarcoma, câncer de ovariano ostomi, câncer de pancreas, câncer paranasal, câncer de paratiróide, câncer de glândula parótida, câncer peniano, tumores ’neuroectodermal periferal, câncer pituitário, policitemia vera, câncer prostato, cânceres raros e desordens associadas, célula de carcinoma renal, retinoblastoma, rabdomio sarcoma, sindrome de Rothmund- Thomson, câncer de glândula salivaria, sarcoma, schwannoma, sindrome de Sezary, câncer de pelo, câncer de célula pequena de pulmão (Small Cell Lung Cancer SCLC), câncer do intestino fino, sarcoma de tecido mole, tumores do cordão espinhal, carcinoma de célula escamosa(pele), câncer de estomago, sarcomasinovial, câncer testicular, câncer de timo, câncer de tiroide, câncer de célula transicional (bexiga), câncer de célula transicional (renal-pelvis-/- ureter), câncer trofoblástico, câncer uretral, câncer do sistema urinário, uroplakins, sarcomauterino, câncer do útero, câncer vaginal, câncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom e tumorde Wilms. Em uma concretização o tumor é selecionado de um grupo de mieloma múltiplo ou linfomanão hodgkin.
Como contemplado para o tratamento de câncer, as antigenos de superficie de célula que são seletivamente expresso por células de câncer ou sobre expressa em células de câncer relativo para as células mais normais. Existem muitos antigenos associados com tumor (Tumour- Associated Antigens - TAAs) conhecidos na matéria. Exemplos não limitantes de TAAs incluem enzima tirosinase; antigeno melanoma GM2; alfafetoproteina (AFP); antigeno carcinoembrionica (CEA); Mucin 1 (MUC1); epidermal humano receptor do fator de crescimento (Her2/Neu); célula T leucemia/linforna 1 (TCL1) oncoproteina. Exemplares TAAs associados com um número de diferentes de cânceres são telomerase (hTERT); prostato-especifico membrane antigeno (PSMA); ativador uroquiinase plasminogeno é seu receptor (uPA/uPAR); fator de crescimento de vascular endotelial e seureceptor (VEGF/VEGFR); matriz extracelular metalloproteinase induzida (EMMPRIN/CD147); fator de crescimento epidermal (EGFR); fator de crescimento derivado de plaquetas e seu receptor (PDGF/PDGFR) e c-kit (CD117).
Uma lista de outros TAAs é apresentado em US 2010/0297076, a revelação da qual é incluida neste documento por referência. De particular interesse são antigenos de superficie de célula associado com células de mieloma múltipla, incluindo, mas não limitado a CD38, CD138, CS1, e HM1.24. Em uma concretização um antigeno para construtores de ligando atenuado por anticorpo, por exemplo, um construtor de interferon atenuando anticorpo, é CD38.
O CD38 é um 46kDa tipo II transmembrana glicoproteina. Tendo uma cauda citoplasmática de terminal-N curto de 20 aminoácidos, a transmembrana hélice simples e um dominio extracelular longo de 256 aminoácidos (Bergsagel, P., Blood; 85:436, 1995 e Liu, Q. , Structure, 13: 1331, 2005). É expresso na superficie de muitas células immune incluindo CD4 e CD8 células T positiva, células B, células NK, monocitos, plasma células e em uma proporção significantede células normais precursoras de medula óssea (Malavasi, F., Hum. Imunol. 9:9, 1984). Em linfocitos, embora, a expressão aparece como sendo dependente na diferenciação e estado de ativação da célula. Céulas T e B em repouso são negativas, enquanto linfocitos imaturos e ativados são predominantemente positivo para expressão CD38.(Funaro, A., J. Imunol. 145:2390, 1990). Estudos adicionais indica expressão mRNA em orgãos não hematopoliéticotal como pâncreas, cérebro, baço e figado (Koguma, T., Biochim. Biophys. Acta 1223: 160, 1994.)
O CD38 é uma ectoenzima multifuncional que é envolvida na sinalização de transmembrana e adesão de célula. É também conhecido como ciclico ADP ribose hidrólise porque pode transformar NAD+ e NADP+em cADPR, ADPR e NAADP, dependendo do extracelular pH. Estes produtos induzem mobilização Ca2+ dentro da célula que pode conduzir para fosforilação de tirosina e ativação da célula. CD38 é também um receptor que pode interagir com um ligando, CD31. Ativação de receptor via CD31 conduz para eventos intracelular incluindo mobilização deCa2+, ativação de célula, proliferação, diferenciação e migração (revisado em Deaglio, S., Trends in Mol. Med. 14:210, 2008.)
O CD38 é expresso em niveis alto nas células de mieloma múltipla, na maioria dos casos de leucemia linfoblástica de linhagem T e B aguda, algumas leucemias mielocitica aguda, linfomas de células folicular de centro e linfomas linfoblásticos T. (Malavasi, F. , J. Clin Lab Res. 22:73, 1992). Mais recentemente, expressão CD38 tornou-se um marcador de prognóstico confiável em leucemia linfoblástica de linhagem B crônica (B-CLL) (Ibrahim, S., Blood. 98: 181, 2001 e Durig, J., Leuk. Res. 25:927, 2002). Grupos independentes demonstraram que os pacientes com LLC- B apresentam um clone CD38 + e são caracterizados por um curso clinico desfavorável com um estágio mais adiantado da doença, falta de capacidade de resposta à quimioterapia e menor tempo de sobrevivência (Morabito, F., Haematologica. 87:217,2002). A expressão consistente e aumento de CD38 em tumores linfóides torna este um alvo atraente para as tecnologias de anticorpos terapêuticos.
Antigenos preferidos para o desenvolvimento de construtoes ligando de proteina de fusão atenuando anticorpo que tem como alvo câncer são antigenos que mostra seletiva ou maior expressão nas células de câncer que na maioria das outras, células não transformadas dentro do corpo. Exemplos de não proteinas de tais antigenos incluem, esfingolipideos, ganglioside GD2 (Saleh et al, 1993, J. Imunol., 151, 3390-3398), ganglioside GD3 (Shitara et al, 1993, Cancer Imunol. Imunother. 36:373-380), ganglioside GM2 (Livingston et al, 1994, J. Clin. Oncol. 12: 10361044), ganglioside GM3 (Hoon et al, 1993, Cancer Res. 53:5244-5250) e Lewis*, lewis Y e lewis xyantigeno de carboidrato que pode ser visto em proteinas ou glicolipideos. Exemplos de antigenos de proteina são HER- 2/neu, papillomavirus-Eδhumano ou -E7, MUC-1; KS 1/4 pancarcinoma antigeno (Perez e Walker, 1990, J. Imunol. 142:3662-3667; Bumal, 1988, Hybridoma 7(4):407-415); antigeno de carcinoma de ovário CA125 (Yu et al, 1991, Cancer Res. 51 (2) :468-475); fosfato de ácido prostático (Tailor et al, 1990, Nucl. Acids Res. 18(16) :4928) ; antigeno especifico prostato(Henttu e Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2):903-910; Israeli et al, 1993, Cancer Res. 53:227-230); antigeno associado a melanoma p97 (Estin et al, 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-446); antigeno de melanoma gp75 (Vijayasardahl et al, 1990, J. Exp. Med. 171(4): 1375- 1380); antigeno especifico de membrana prostata; antigeno carcino embriónico(CEA) (Foon et al, 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13:294), MUC16 (anticorpos include MJ-170, MJ-171, MJ-172 e MJ-173 [US 7,202,346] ,3A5 [US 7,723,485]).NMB (US 8,039,593), antigeno do linfócito humano maligno APO- 1 (Bernhard et al, 1989, Science 245:301-304); antigeno de melanoma de peso molecular alto(HMW-MAA) (Natali et al, 1987, Cancer 59:55-63; Mittelman et al, 1990, J. Clin. Invest. 86:2136-2144); antigenoo de linfoma de Burkitt 38.13; CD19 (Ghetie et al, 1994, Blood 83: 1329-1336); antigeno de linfoma B humano CD20 (Reff et al, 1994, Blood 83:435-445); GICA 19-9 (Herlyn et al, 1982, J. Clin. Imunol. 2: 135), CTA-1 e LEA; CD33 (Sgouros et al, 1993, J. Nucl. Med. 34:422-430); antigenos oncofetal tal como alfa- feto proteina para câncer de figado ou antigeno de tumor oncofetal de bexiga (Hellstrom et al, 1985, Cancer. Res. 45:2210-2188); antigeno de diferenciação tai como antigeno de carcinoma de pulmão humano L6 ou L20 (Hellstrom et al, 1986, Cancer Res. 46:3917-3923); antigenos de fibrosarcoma; antigeno de leucemia de célula B humano Gp37 (Bhattacharya- Chatterjee et al, 1988, J. Imunol. 141: 1398-1403); antigeno de tumor especifico de transplante tipo superficie de célula(TSTA) tai como antigenos de tumor induzido viralmente incluindo antigeno T, virus de tumor de DNA e antigenosenvelopede virus de tumor de RNA; antigenos de neoglico proteinas, câncer de mama tai como EGFR (Epidermal receptor de fator de crescimento), polimórfico epitelial mucin (PEM) (Hilkens et al, 1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359); antigeno polimórfico epitelial mucin; antigeno globule de leite gorduroso humano; antigenos associados de tumor coloretai tai como TAG-72 (Yokata et al, 1992, Cancer Res. 52:3402-3408), CO 17-1 A (Ragnhammar et al, 1993, Int. J. Cancer 53:751-758); antigeno de diferenciação (Feizi, 1985, Nature 314:53-57) tai como I(Ma) encontrado em adenocarcinomas gástrico, SSEA-1 encontrado em células mielóide, VEP8, VEP9, Mil, VIM-D5, Ml 8 e M39 encontrado em câncères de mama epitelial, D156-22 encontrado em câncer coloretai, TRA-1-85 (sanguegrupo H), C14 encontrado em adenocarcinoma colonico, F3 encontrado em adenocarcinoma de pulmão, AH6 encontrado em câncer gástrico, Y hapten encontrado em células de carcinoma embrional, TL5 (sangue grupo A), Séries El (sanguegrupo B) antigenos encontrado em câncer pancreatico, FC10.2 encontrado em células de carcinoma embrional, antigeno adenocarcinoma gástrico, C0514 (sangue grupo Lea) encontrado em adenocarcinoma, NS-10 encontrado em adenocarcinomas, CO-43 (sanguegrupo Leb) , G49 encontrado em células A431, 19.9 encontrado em câncer de colon; câncer gástrico mucins; R24 encontrado em melanoma, MH2 (sangue grupo ALeb/Ley) encontrado em adenocarcinoma colonico, 4.2, Dl.l, OFA-1, GM2, OFA-2 e M 1:22:25: 8 encontrado em carcinoma de células embrional e SSEA-3 e SSEA-4 . HMW-MAA (SEQ I'D NO: 4 33), também conhecido como melanoma condroitin sulfato proteoglican, é uma proteina ligando residues de membrana de 2322 gue é expresso acima de 90% do benigno nevi cirurgicamente removido e lesões de melanoma (Camploi, et. al, Crit Rev Imunol. ;24:267,2004). Portanto, pode ser um alv opotencial de antigenoo associado a superficie células.
Outro exemplo de antigenos de câncer para ser alvo de construtores de proteina de fusão da presente invenção inclui (cânceres exemplares são mostrado no parênteses): CD5 (leucemiade célula T /linfoma), CA15-3 (carcinomas), CA19-9 (carcinomas), L6 (carcinomas), CA 242 (coloretal), placental alcalinafosfatase (carcinomas), ácido prostático fosfatase (prostate), MAGE-1 (carcinomas), MAGE-2 (carcinomas), MAGE-3 (carcinomas), MAGE -4 (carcinomas), receptor de transferrin(carcinomas), p97 (melanoma), MUC1 (câncer de mama), MARTI (melanoma), CD20 (linfoma de Hodgkin), CD52 (leucemia), CD33 (leucemia), gonadotropin coriônico humano(carcinoma) , CD38 (mielomamúltipla), CD21 (B-célula), CD22 (linfoma), CD25 (linfomade célulaB), CD37 (linfoma de célula B) , CD45 (leucemia mieloblástica humana), HLA-DR (linfoma de célula B), receptor IL-2 (leucemia de célula T e linfomas), CD40 (linfoma), vários mucins (carcinomas), P21 (carcinomas), MPG (melanoma), Ep- CAM (Epithelial Tumors), Folate-receptor alfa (Ovarian), A33 (Coloretal) , G250 (renal), Ferritin (linfomaHodgkin), de2-7 EGER (glioblastoma, mama, e pulmão), Proteina de ativação de Fibroblast© (epitelial) e tenascin metalloproteinases (glioblastoma). Alguns especificos, anticorpos úteis incluem, mas não são limitados para, BR64 (Trail et al, 1997, Cancer Research 57: 100 105), BR96 mAb (Trail et al, 1993, Science 261:212-215), mAbs contra o CD40 antigeno, tal como S2C6 mAb (Francisco et al., 2000, Cancer Res. 60:3225-3231) ou outros anticorpos anti-CD40, tal como estes descritos em Publicação de Patentes U.S. Nos. 2003-0211100 e 2002-0142358; mAbs contra o antigeno CD30, tal como AC10 (Bowen et al., 1993, J. Imunol. 151:5896-5906; Wahl et al, 2002 Cancer Res. 62(13):3736-42) ou MDX-0060 (Publicação de Patente U.S. No. 2004-0006215) e mAbs contra antigeno CD70, tal como 1F6 mAb e 2F2 mAb (ver, exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 2006-0083736) ou anticorpos 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7 (US 8,124,738). Outros anticorpos foram revistos em outros lugares (Franke et al., 2000, Cancer Biother. Radiopharm. 15:459 76; Murray, 2000, Semin. Oncol. 27:64 70; Breitling, F. , e Dubel, S., Recombinant Antibodies, John Wiley, e Sons, New York, 1998).
Em certas concretizações, anticorpos úteis podem ligar para um receptor ou um complexo de receptores expressos em uma célula alvo. 0 receptor membro de superfamilia ou complexo de receptor pode compreender um gene de imunoglobulina, a maior proteina de histo compatibilidade, um receptor de citocina, um receptor membro da superfamilia membro TNF, um receptor de quimocina, um integrin, uma lecina, uma proteina de controle de complemento, um receptor de fator de crescimento, um receptor de hormônio ou um receptor neurotransmissor. Exemplos não limitantes de apropriados membros da superfamiia de imunoglobulinas são CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD22, CD79, CD90, CD152/CTLA-4, PD-1, B7- H4, B7-H3, e ICOS. Exemplos não limitantes de adequados membros da superfamiia de receptor TNF são TACI, BCMA, CD27, CD40, CD95/Fas, CD134/0X40, CD137/4-1BB, TNFR1, TNFR2, RANK, osteoprotegerin, APO 3, Apo2/TRAIL Rl, TRAIL R2, TRAIL R3, e TRAIL R4. Exemplos não limitantes de adequados integrins são CD 11 a, CD Í ib, CD1 1c, CD18, CD29, CD41, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD103 e CD 104. Exemplos não limitantes de adequadas lecitinas são licitinas tipo S, tipo C, e tipo I. Exemplos de anticorpos para CEA são mostrado na Tabela 2. Tabela 2
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Anticorpos que ligam o antigeno CD22 expresso em células B humanas incluem, por exemplo, HD6, RFB4, UV22-2, Tol5, 4KB128 e um anticorpo anti-CD22 humanizado(hLL2) (ver, exemplo, Li et al. (1989) Cell. Imunol. Ill: 85-99; Mason et al. (1987) Blood 69: 836-40; Behr et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 3304s-3314s; Bonardi et al. (1993) Cancer Res. 53: 3015-3021).
Anticorpos para CD33 incluem, por exemplo, HuM195 (ver, exemplo, Kossman et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 2748-2755; US5693761) e CMA-676 (ver, exemplo, Sievers et al, (1999) Blood 93: 3678-3684).
Ilustrativos anticorpos anti-MUC-1 incluem, mas não são limitados para Mc5 (ver, exemplo, Peterson et al. (1997) Cancer Res. 57: 1103-1108; Ozzello et al. (1993) Breast Cancer Res. Treat. 25: 265-276), e hCTMOl (ver, exemplo, Van Hof et al. (1996) Cancer Res. 56: 5179-5185).
Ilustrativos anticorpos anti-TAG-72 incluem, mas não são limitados para CC49 (ver, exemplo, Pavlinkova et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 2613-2619), B72.3 (ver, exemplo, Divgi et al. (1994) Nucl. Med. Biol. 21: 9-15), e estes descritos em Patente 0. S. No. 5,976,531.
Ilustrativos anticorpos anti-HMl.24 incluem, mas não são limitados para um anticorpo monoclonal anti-HMl.24de rato e um anticorpo humanizado anti-HMl.24 IgGlkappa (ver, exemplo, Ono et al. (1999) Mol. Imuno. 36: 387-395).
Em certas concretizações a porção alvejada compreende um qnticorpo anti-HER2. O gene erBB 2, mais comumente conhecido como (Her-2/neu), é um oncogene codificando um receptor transmembrana. Vários anticorpos desenvolvidos contra Her-2/neu, incluindo trastuzumab (exemplo, HERCEPTIN™; Fornier et al. (1999) Oncology (Huntingt) 13: 647-58), TAB-250 (Rosenblum et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 865-874), BACH-250 (Id.), TAI (Maier et al. (1991) Cancer Res. 51: 5361-5369), e o mAbs descritonas Patentes U.S. Nos. 5,772,997; 5,770,195 (mAb 4D5; ATCC CRL 10463); e Patente U.S. No. 5,677,171.
Um número de anticorpos foram desenvolvidos especificamente para ligar HER2 e alguns são para uso clinico. Estes incluem, por exemplo, trastuzumab (exemplo, HERCEPTIN™., Fornier et al. (1999) Oncology (Huntingt) 13: 647-658), TAB-250 (Rosenblum et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 865-874), BACH-250 (Id.), TAI (ver, exemplo, Maier et al. (1991) Cancer Res. 51: 5361-5369), e osanticorposdescritosnas Patentes U.S. Nos. 5,772,997; 5,770,195, e 5,677,171.
Outros anticorpos anti-HER2/neu completamente humanos são bem conhecidos para experientes na matéria. Tais anticorpos incluem, mas não são limitados para os anticorpos C6 tais como C6.5, DPL5, G98A, C6MH3-B 1, B1D2, C6VLB, C6VLD, C6VLE, C6VLF, C6MH3-D7, C6MH3-D6, C6MH3-D5, C6MH3-D3, C6MH3-D2, C6MH3-D1, C6MH3-C4, C6MH3-C3, C6MH3-B9, C6MH3-B5, C6MH3-B48, C6MH3-B47, C6MH3-B46, C6MH3-B43, C6MH3-B41, C6MH3-B39, C6MH3-B34, C6MH3-B33, C6MH3-B31, C6MH3-B27, C6MH3-B25, C6MH3-B21, C6MH3-B20, C6MH3-B2, C6MH3-B16, C6MH3-B15, C6MH3-B11, C6MH3-B1, C6MH3-A3, C6MH3- A2, e C6ML3-9. Estes e outros anticorpos anti-HER2/neu são descritos em Patentes U.S. Nos. 6,512,097 e 5,977,322, na Publicação PCT WO 97/00271, em Schier et al. (1996) J Mol Biol 255: 28-43, Schier et al. (1996) J Mol Biol 263: 551567, e semelhantes.
Mais geralmente, anticorpos direcionados para vários membros da familia de receptor de fator de crescimento epidermal são bem adequados para uso como alvos de construtores de anticorpos ou porções destes ligando antigeno da presente invenção. Tais anticorpos incluem, mas não são limitados para anticorpos anti-EGF-R como descrito nas Patentes U. S. Nos. 5,844,093 e 5,558,864, e na Patente Europa No. 706,799A. Outras ilustrativas familias de anticorpos anti-EGFR incluem, mas não são limitados para anticorpos tais como C6.5, C6ML3-9, C6MH3-B1, C6-B1D2, F5, HER3.A5, HER3.F4, HER3.H1, HER3.H3, HER3.E12, HER3.B12, EGFR.E12, EGFR.C10, EGFR.B11, EGFR.E8, HER4.B4, HER4.G4, HER4.F4,HER4.A8, HER4.B6, HER4.D4, HER4.D7, HER4.D11, HER4.D12, HER4.E3, HER4.E7, HER4.F8 e HER4.C7 e semelhantes (ver, exemplo, Publicações de Patente U.S. 2006/0099205 Al e US 2004/0071696 Al que são incorporadas neste documento por referência).
Pode ser vantajoso para antigeno associado a superficies de célula para ser expresso em niveis suficientes na célula alvo em que uma quantidade suficientemente terapêutica de construtores de polipeptideo está presente para receptores de ligando na superficie de célula alvo. De acordo, com particulares concretizações, o antigeno associado a superficie de célula é expresso a uma densidade maior que 12.600 cópias por célula ou maior que 15.000 cópias por célula. Métodos para determinar o número de cópias de um antigeno de superficie de célula são bem conhecidos e prontamente avaliado por uma pessoa experiente na matéria, por exemplo o método fornecido por Jilana (Am J Clin Pathol 118:560-566, 2002)
Pode ser vantajoso para o antigeno associado a superficie 'de célula ser expresso em uma configuração na superficie de célula tal que o construtor de polipeptideo é capaz de contatar ambos o antigeno de superficie de célula e o receptor ligando na célula alvo. De acordo, com particulares concretizações os antigenos associados a superficie de célula têm um dominio extracelular tendo um peso molecular de menos que 240kD.
Pode ser vantajoso para o anticorpo ou antigeno ligando porção deste para ligar para o antigeno associado com superficie de célula de suficiente afinidade para facilitar ligação de ligando para o receptor de ligando na superficie de célula. De acordo, com particulares concretizações da presente invenção os construtores de polipeptideo exibem uma afinidade de ligação de antigeno, como medido por EC50, de 50 nM, de 25 nM, de 10 nM ou de 5 nM a 0,1 pM. -
Como descrito nas Patentes U.S. Nos. 6,512,097 e 5,977,322, outros membros da familia de anticorpos anti- EGFR podem prontamente ser produzido por mistura de cadeia leve e/ou pesada seguido por uma ou mais etapas de seleção de afinidade. Assim em certas concretizações, esta invenção contempla o uso de um, dois, ou três região CDRs VL e/ou VH que são CDRs descritos nos anticorpos acima identificado e/ou publicações acima identificadas.
Em várias concretizações o anticorpo alvo ou porções destes ligando antigeno compreende porções destes ligando anticorpo ou antigeno que especificamente ou preferencialmente liga CD20. Anticorpos anti-CD20 são bem conhecidos para experientes na matéria e incluem, mas não são limitados para Rituximab, Ibritumomab, e Tositumomab, AME-133v (Applied Molecular Evolution), Ocrelizumab (Roche), Ofatumumab (Genmab), TRU-015 (Trubion) e EVIMU-106 (Imunomedics). WO 2010/105290 revela um anticorpo designado "SC104" junto com um intervalo de variantes humanizados que liga um antigeno expresso em um intervalo de células de tumor.
Em uma concretização, a ligação de anticorpo e atenuação de mutação no ligando aumenta o indice de especificidade do antigeno (Antigen- Specificity Index - ASI) maior que 10 vezes, preferencialmente maior que 50 vezes, preferencialmente maior que 100 vezes, preferncialmente maior que 1000 vezes, ou preferencialmete maior que 10.000 vezes. O indice de especificidade do antigeno (ASI) é definido neste documento como as vezes de aumento da potência na atividade de sinalização do constructor e polipeptideo da invenção relativa para o ligando de polipeptideo não mutado livre no antigeno de célula positiva alvo multiplicado pelas vezes da potência reduzida na atividade de sinalização relativa ao ligando de polipeptideo ligando não mutado livre nos antigeno de células negativa. O termo "potência" neste contexto pode ser quantitativamente representado pelo valor de EC50, que é matematicamente o ponto médio de uma curva de resposta de dose, em que a dose refere-se para a concentração de ligando ou construtor ligando anticorpo em um ensaio, e resposta refere-se para a resposta quantitativa das células para a atividade de sinalização do ligando a uma dose particular. Assim, por exemplo, quando o primeiro composto é mostrado para possuir um EC50 (expresso por exemplo em unidades Molar) que é 10 vezes menor que um EC50 do segundo composto nas mesmas células, tipicamente quando medido pelo mesmo método, o primeiro composto é dito para ter uma potência 10 vezes maior. Reciprocamente, quando o primeiro composto é mostrado por possuir um EC50 que é 10 vezes maior que o EC50 do segundo composto nas mesmas células, tipicamente quando medido pelo mesmo método, o primeiro composto é ditto para ter uma potência 10 vezes mais baixa.
Embora a grande maioria de anticorpos testados mostraram direcionamento eficiente de atenuado IFNa os presentes inventores identificaram exemplos de dois antigenos alvo da atenuação de IFNa para uma linha de célula que expressa o alvo não exibiu um ASI que foi essencialmente mais elevado que para o ligando livre, ligando não mutado. 0 primeiro exemplo é demonstrado pelo antigeno CSPG4 (também conhecido como HMW-MAA, antigeno associado a melanoma de peso molecular alto). Testamos dois diferentes construtores de proteina de fusão anti-HMW-MAA- anticorpo-IFNa em um ensaio de proliferaçãode alvo usando linhas de célula A375 ou CHL-1. Não vimos inibição de atividade em linha de inha de célula ou anticorpo nas doses testadas (EC50s > 21 nM) . O dominio extracelular destes antigeno é excepcionalmente grande (dominio extracelular MW aproximadamente 240kD -450kD dependendo da glicosilação). É possivel que certos construtores de proteina de fusão de anticorpo-IFN que ligam antigenos muito grandes possam ser estericamente restrito para interação simultânea com os receptores IFN nas mesmas células. Isto é, embora, possivel que outros anticorpos que têm como alvo outros epitopes destes antigeno pode suportar a atividade de direcionar para IFN. Apesar desta possibilidade ser preferível que o anticorpo ou porções destes ligando antigeno do construtor de polipeptideo da presente invenção liga um antigeno caracterizado por: o dominio extracelular destes ter um peso molecular menor que 240kD.
Um segundo exemplo de um constructor de proteína de fusão atenuando anticorpo IFNa que não mostra potente atividade foi baseado em um anticorpo que liga para o antigeno mieloide CD33. CD33 é expressa um nível relativamente baixo de células KG-1, reportado como 12.600 cópias por célula (Sutherland, MAbs. 1(5): 481-490, 2009). Tratamento de células KG-1 com um anticorpo de construtor de proteína de fusão atenuando anti-CD33 IFNa falhou ao inibir proliferação de todas as doses testadas (IC50 > 76 nM). Acreditamos que o número relativamente baixo de cópias deste alvo pode em alguns casos, depender de outros fatores tal como posição do epitope, a densidde de receptor dos receptores IFN, etc, limite da potência dos construtores de proteína de fusão atenuando anticorpo IFN. Isto é, embora, possível que outros anticorpos que direciona outros epitopes nestes antigeno pode suportar atividade alvo de IFN, ou que outras células com baixo número de cópias de CD33 pode não obstante responder para tal construtor de proteína de fusão devido a sensitividade alta de intrínsico IFN, por exemplo. Apesar desta possibilidade é preferível que o anticorpo ou porções destes ligando antigeno do construtor de polipeptideo da presente invenção liga um antigeno caracterizado por: o antigeno ser presente na célula a uma densidade maior que 12.600 cópias por célula, preferencialmente maior que 15.000 cópias por célula.
Um outro exemplo de um construtor de proteína de fusão atenuando anticorpo em que o anticorpo não fornece suficiente direcionamento para as células de câncer foi um anticorpo anti-GM2 ganglioside ligado para um atenuado IFNa. Neste caso, o anticorpo foi para um carboidrato epitope e, como típico de tais anticorpos, têm uma afinidade baixa (EC50 para ligação com células alvo foi 50 nM por fluxo de citometria) . Além disso, preferidas concretizações da presente invenção mostra afinidade alta de ligação para seus antigenos, com EC50s preferencialmente 5 abaixo de 50 nM, mais preferencialmente abaixo de 25 nM, ainda mais preferencialmente abaixo de 10 nM e idealmente abaixo de 5 nM. Em adição, preferidas concretizações compreendem anticorpos que ligam para proteina e peptideo epitopes tanto quanto carboidrato epitopes.
Mieloma múltipla é de particular interesse para certas concretizações da presente invenção, denominadas construtores de proteina de fusão compreendendo anticorpos para antigenos de mieloma múltipla atenuando IFN peptideos. A Tabela 3 lista exemplos de antigenos de anticorpos 15 mieloma múltipla, com a referência para sequências de anticorpo. Tabela 3
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CD38 é de particular interesse como um anticorpo alvo para construtor de proteina de fusão da presente invenção.
Anticorpos para CD38 incluem por exemplo, AT13/5 (ver, exemplo, Ellis et al. (1995) J. Imunol. 155: 925-937), HB7, e semelhantes. Tabela 4 Revela Vários Conhecidos Anticorpos CD38 que podem 5 ser usados neste contexto: Tabela 4
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O termo "Ligando de Sinalização" como usado neste documento amplamente includui qualquer ligando envolvido na ativação de caminho de sinalização de célula, incluindo qualquer molécula capaz de ativação ou inibição de receptores de superficie de célula. O termo também será entendido como incluindo referência a moléculas que pode passer através de duas camadas de lipideo da membrana da célula para ativação de caminho de sinalização de célula dentro da célula. O termo "ligando de sinalização de polipeptideo" como usado neste documento refere-se para sequências de peptideos e polipeptideos de comprimento de 6 aminoácidos através de 1.000 aminoácidos no comprimento, que ligam para particulares moléculas de superficies de células("receptores") em certas células e deste modo transmite um sinal ou sinais dentro destas células. Exemplares ligandos de sinalização e ligandos de sinalização de polipeptideo contemplados pela presente invenção incluem, mas não são limitados para citocinas, quimocinas, fatores de crescimento, hormônios, neurotransmissores, e incluindo fatores de apoptose.
Exemplos não limitantes de adquadas citocinas incluem os interleucinas IL-1, IL-2 IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL- 16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL_25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL- 33, 11-35 e suas subfamilias; o interferon (IFN) incluindo subfamilias de Interferon tipo I (IFN- (IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNAIO, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA21), IFN-β (IFN-βl (IFNB1) e IFN-P3 (IFNB3)), IFN-w ((IFNWl), IFNWP2, IFNWP4, IFNWP5, IFNWP9, IFNWP15, IFNWP18, e IFNWP19 e IFNK), Interferon tipo II (IFN-y) e Interferon tipo III (IFN-epsilon, -kappa, -omega, -delta, -tau, e -gamma) e moléculas como interferon (limitin, IL-28A, IL-28B, e IL-29; the IL-1 incluindofamilia IL-la, IL-Iβ, the IL-1 Receptor antagonista (IL-IRA) e IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9 e IL1F10 e the IL-17 incluindo familia IL-17A, IL-17B, IL- 170, IL-17D, IL-17E (IL-25), e IL-17F. Em umaconcretização o ligando de sinalização de peptideo ou polipeptideo é selecionado do grupo consistindo de urn IFN, IL-4 e IL-6. Em uma concretização o ligando de sinalização de peptideo ou polipeptideo é selecionado do grupo consistindo de IFNa, IFNa2b, IFNpi, IFNpib e IFNy. Preferencialmente a sequência de IFNa é selecionada das SEQ ID NOs 1 a 3, 80 a 90, 434 e 435.
Exemplares quimocinas incluem, por exemplo, RANTES, MCAF, MIPl-alpha, IP-10, monocito proteina-1 quimiotáticas (MCP-1 ou CCL2), interleucina-8 (IL-8), CXCL13, XCL1 (lymphotactin-a), XCL2 (lymphotactin-β) e fractalcina (CX3CLI).
Exemplos não limitantes de fatores de crescimento incluem, por exemplo, Adrenomedullin (AM), Angiopoietin (Ang), fator de motilidade Autocrine, morfogenética proteinas de osso (Bone morphogenetic proteins - BMPs), fator neurotrófico derivado do cérebro (Brain-derived neurotrophic factor - BDNF), Fator de Crescimento Epidermal (Epidermal Growth Factor - EGF), Eritropoietina (Erythropoietin - EPO), Fibroblasto fator de crescimento ’(Fibroblast Growth Factor -FGF) , Fator gliais derivadas de linha celular neurotrófico (Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor - GDNF), Fator estimulante de colônias de granulócitos (Granulocyte Colony- Stimulating Factor - G-CSF), Fator estimulante de colônias de granulócitos macrófagos (Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor - GM-CSF), Fator de diferenciação decrescimento 9 (Growth Differentiation Factor-9 - GDF9), Fator de crescimento de hepatócitos (Hepatocyte Growth Factor - HGF) , fator de crescimento derivadoHepatoma (HDGF), Fator de crescimento como Insulina (Insulin-like Growth Factor - IGF), Fator estimulando migação, Miostatina (GDF-8), Factor de crescimento do nervo (Nerve Growth Factor - NGF) e outro\ neurotrofinas, Factor de crescimento derivado de plaquetas (Platelet-derived growth factor - PDGF), Trombopoietina (Thrombopoietin - TPO), Fator de crescimento transformador alfa(TGF-α), fator de crescimento beta transformado (TGF-P), Fator alfa de tumor de necrose (Transforming growth Factor alpha TNF-α), Factor de crescimento vascular endotelial (Vascular Endothelial Growth Factor - VEGF), Fator de crescimento placentário (Placental Growth Factor - P1GF), IL-1- Cofator para IL-3 e IL-6, IL-2- T- fator de crescimento de célula, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6 e IL-7.
Exemplares fatores induzindo apoptose inclui FasL e TRAIL.
Exemplares hormônios incluem hormônios de peptideo tais como TRH e vaso pressão, hormônios de proteina tais como insulina e hormônio do crescimento, hormônios de glicoproteina tais como hormônio Luteinizing, hormônio estimulando follicle e hormônio estimulando tiróide, hormônios derivados de 'Lipideos e fosfolipideo tais como hormônios de esteróide exemplo testosterona e Cortisol, hormônios de Esteroltais como calcitriol, eicosanoids tais como prostaglandinas.
Exemplos não limitantes de adequados neurotransmissores incluem monoaminas e outras aminas biogênicas: dopamina (DA), norepinefrina (noradrenaline; NE, NA) , epinefrina (adrenalina), histamina, serotonina (SE, 5-HT), somatostatina, substância P, péptidos opióides e acetilcolina (ACh),
A ligação entre o anticorpo e o ligando pode ser feita via uma ligação simples de peptideo para criar uma proteina de fusão entre o ligando e a cadeia pesada ou leve, ou ambas,do anticorpo. O ligando pode ser ligado ao N- ou terminal C da cadeia leve ou pesada do anticorpo,com ou sem um interveniente ligador da sequência de p-eptideo. Em uma concretização o ligando é ligado para o anticorpo ou antigeno ligando porções deste via uma ligação de peptideo. Em uma concretização, o ligando é ligado para o terminal C da cadeia pesada de um humano, humanizado ou quimérico IgGl, IgG2 ou IgG4, diretamente ou com um interveniente ligador de 1 a 20 aminoácidosde comprimento.
Os mutados ligandos de polipeptideo pode ser ligado para o fragmento de anticorpo ou anticorpo por meio de conjugação quimica, interações não covalentes proteina- proteina, ou por fusão genética. Métodos para conjugação dos ligandos descritos neste documento com anticorpos pode ser prontamente acompanhada por um experiente na matéria. Como será prontamente acertado, comumente usando métodos de acoplamento quimico pode ser utilizado para ligar ligandos ao anticorpos via por exemplo, amino livre, ácido carboxilico, ou grupos sulfidril. Ligandos podem também ser ligados ao anticorpos via Carbonils (-CHO); estes grupos de aldeído pode ser criado por grupos oxidante de carboidrato em glicoproteínas.
Alguns reagentes de ligação cruzada comumente usados incluem glutaraldeído que ligam moléculas de proteína ou peptídeo para o N-terminal ou grupos de amina alifítica de peptídeos ou polipeptídeos, carbodiimida (EDC) que liga proteínas ou peptídeos para o terminal C ou grupos carboxil de cadeia lateral de proteínas ou peptídeos, succinimida ésteres (exemplo MBS, SMCC) que conjuga grupos amino livre, tiois de resíduos Cis, benzidina (BDB) que liga para resíduos Tir, periodato que liga para grupos carboidrato e isotiocianato. O uso de kits comercial de conjugação química é contemplado.
Em algumas concretizações, etiquetados são ligado via espaço de braço de vários comprimentos para reduzir potencial impedimento estérico. Por exemplo, um ligador químico pode ser usado entre o ligando e o anticorpo. Exemplar sequências de ligador pode ser prontamente determinada por um experiente na matéria, e são comumente incluídos ligadores tal como C6, C7 e C12 amino modificados e ligadores compreendendo grupos tiol.
Os construtores de proteína de fusão ligando anticorpo na presente invenção têm mutações ou deleções no ligando que rende aos ligandos menos ativo na estimulação de seus receptores em células que faltam expressão de superfície de célula do antígeno para o qual o anticorpo liga. Em um aspecto da presente invenção, o ligando é um interferon, exemplos dos quais são interferons tipo I (IFN- a (alfa), IFN-β (beta), IFN-K (kappa), IFN-δ (delta), IFN-ε (epsilon), IFN-t (tau), IFN-w (omega), e IFN-Ç (zeta, também conhecido como limitina) , interferons tipo II (IFN- Y) OU tipo III interferons (IFN-ÀI, IPN-À2 e IEN-À3) (Pestka, Imunological Reviews 202(1):8-32, 2004).
Interferons Tipo I todos os sinais do receptor de interferon Tipo I, que é feito do IFNAR1 e IFNAR2. Sinalização ocorre quando um IFN tipo I liga IFNARl e IFNAR2, trazendo-os assim para formar um complexo como IFN. Isto inicia uma cascata de eventos intracelular (a "sinalização") o que conduz, entre outras coisas, a troca na expressão de numerosos regulados genes de interferon. Detalhes dos eventos de sinalização intracelular desencadeado por ativação do receptor de interferon tipo I é descrito, por exemplo, por Platanias, (Nature Reviews 5:375-86. 2005). Interferons Tipo I incluem vários interferon-alfas. Conhecidos interferons-alfas humanos são IFNcclb, cc2cc, 2β, cc4b , cc5, cc6, cc7, cc8, cclO, ccl a/13, ccl4, ccl6, ccl7, vδ «21, cc2c e cc4a. Algumas concretizações compreende IFNcc2b, a sequência da qual a, SEQ ID NO:3, é mostrado na Figura 4. IFNs foram aprovados em várias formas para várias indicações, como delineado na Tabela 5 (que também mostra as listas de aprovados IPNβ e ys) : Tabela 5
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Exemplos não limitantes de mutações em IFNcc2b que podem ser usados para reduzir sua potência são descritos nas' Tabelas 6 e 7, baseado na sequência de IFNcc humano2b 5 (SEQ ID NO:3): Tabela 6. Atividades Biológicas Relativa de Interferon Mutantes
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Tabela 7. Afinidade Relativa de Interferon Mutantes para seus Receptores
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Estes mutantes têm reduções conhecidas na ligação para o receptor e interferon tipo 1 IFNAR1 ou IFNAR2, e/ou conhecidas reduções na potência IFNa baseada em ensaios de célula.
Os dados nestas tabelas foram descritos nas seguintes referências: Piehler, Jacob, Roisman, Laila C, Schreiber, Gideon (2000). New structural and functional aspects of the Tipo I interferon-receptor interaction revealed by comprehensive mutaçãoal analysis of the binding interface. /. Biol. Chem. 275: 40425-40433. Jaitin, Diego A„ Roisman, Laila C, , Jaks, Eva, Gavutis, Martynas, Piehler, Jacob, Van der Heyden, Jose, Uze, Gilles, Schreiber, Gideon (2006). Inquiring into the differential action interferons (IFNs): an IFN-CC2 mutant with enhanced affinity to IFNAR1 is functionally similar to IFN-β. Mol. Cell. Biol. 26: 1888-1897. Slutzki, Michal, Jaitin, Diego A. , Yehezkel, Tuval Ben, Schreiber, Gideon (2006). Variations in the unstructured C-terminal tail of interferons contribute to differential receptor binding and biological activity. J. Mol. Biol. 360: 1019-1030. Kalie, Eyal, Jaitin, Diego A., Abramovich, Renne, Schreiber, Gideon (2007). An interferon cc2 mutant optimized by phage display for IFNAR1 binding confers specifically enhanced antitubor activities. /. Biol. Chem. 282: 11602-11611. Pan, Manjing, Kalie, Eyal, Scaglione, Brian J., Raveche, Elizabeth S., Schreiber, Gideon, Langer, Jerome A. (2008). Mutation of te IFNAR-1 receptor binding site of humano IFN-CC2 generates Tyep I IFN competitive antagonists. Biochemistry 47: 12018 12027. Kalie, Eyal, Jaitin, Diego A., Podoplelova, Yulia, Piehler, Jacob, Schreiber,Gideon (2008). The Stability of the ternary interferon-receptor complex rather than the affinity to the individual subunits dictates differential biological activities. J. Biol. Chem. 283: 32925-32936.
A abreviação "YNS" é algumas vezes usado neste documento para representar IFNcc variantes incluindo as seguintes mutações: H57Y, E58N e Q61S.
A presente invenção também contempla combinações das mutações ou deleções em IFNcc acima mencionadas.
A invenção também contempla a combinação dos construtores da presente invenção com outras drogas e/ou em adição para outros regimes de tratamento ou modalidades tais como terapia de radiação ou cirurgia. Quando os construtores da presenLe invenção são usados em combinação com conhecido agentes terapêuticos a combinação pode ser administrada na sequência (continuamente ou quebrada por periodos de não tratamento) ou concorrentemente ou como uma mistura. No caso de câncer, existem numerosos agentes anticâncer conhecidos que podem ser usado neste contexto.
Tratamento em combinação é também contemplado para englobar o tratamento com o construtor da invenção seguido por um conhecido tratamento, ou tratamento com um conhecido agente 5 seguido por tratamento com o construtor da invenção, por exemplo, como terapia de manutenção. Por exemplo, no tratamento de câncer é contemplado que os construtores da presente invenção podem ser administrados em combinação com um agente de alcilação (tais como mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, ifosfamidacisplatina, ou agentes contendo platina como alcilação tais como cisplatina, carboplatina e oxaliplatina), um antimetabolito (tais como uma purina ou pirimidina analóga ou um agente de antifolato-, tais como azatioprina e mercaptopurina) , um antraciclina (tais como Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin Idarubicin, Valrubicin, Mitoxantrone, ou antraciclina análoga), uma planta alcalóide (tais como uma vinca alcalóide ou um taxana, tal como Vincristina, Vinblastina, Vinorelbina, Vindesina, paclitaxel ou Dosetaxel), um inibidor topoisomerasa (tal como um inibidor de topoisomerase tipo I ou tipo II), um Podof ilotoxina (tais como etoposida ou teniposida) , ou um inibidor tirosinacinase (tais como imatinib mesilate, Nilotinib, ou Dasatinib). No caso do tratamento de mieloma múltipla, é contemplado que os construtores da presente invenção podem ser administrados em combinação com terapias correntes, tais como esteróides tais como inibidores de dexametasona, proteasoma (tais como bortezomib ou carfilzomib), drogas 30 imunomodulatoras (tais como talidomida, lenalidomida ou pomalidomida) , ou quimioterapia induzida seguido por autólogos haematopoietico transplante de célula tronco, com ou sem outros agentes quimo terapêuticos tais como Melfalan hidrocloreto ou os agentes quimo terapêuticos listados acima.
No caso do tratamento de linfoma de Hodgkin, é contemplado que os construtores da presente invenção podem ser administrados em combinação com abordagens terapêuticas corentes, tais como ABVD (Adriamycin (doxorubicin), bleomicina, vinblastina, e dacarbazina) , ou Stanford V (doxorubicina, bleomicina, vinblastina, vincristina, mecloretamina, etoposida, prednisona), ou BEACOPP (doxorubicina, bleomicina, vincristina, ciclofosfamida, procarbazina, etoposida, prednisona).
No caso de linfoma não Hodgkinou outros linfomas, é contemplado que os construtores da presente invenção podem ser administrado em combinação com abordagens terapêuticas correntes. Exemplos de drogas aprovadas para linfoma não Hodgkin incluindo Abitrexate (Metotrexate) , Adriamicina PFS (Doxorubicin Hidrocloreto), Adriamicina RDE (Doxorubicina Hidrocloreto) , Amboclorina (Chlorambucil), Amboclorina (Chlorambucil), Arranon (Nelarabine), Bendamustina Hidrocloreto, Bexxar (Tositumomab e lodina I 131 Tositumomab), Blenoxana (Bleomycin), Bleomycin, Bortezomib, Clorambucil, Clafen (Ciclofosfamida), Ciclofosfamida, Citoxana (Ciclofosfamida), Denileucina Diftitoxa, DepoCit (Liposomal Citarabina), Doxorubicina Hidrocloreto, DTIC-Dome (Dacarbazine) , Folex (Metotrexate), Folex PFS (Metotrexato), Folotin (Pralatrexate), Ibritumomab Tiuxetan, Istodax (Romidepsin), Leúkeran (Chlorambucil), Linfolizin (Chlorambucil), Liposomal Citarabina, Matulano (Procarbazine Hidrocloreto), Metotrexate, Metotrexate LPF (Metotrexate) , Mexate (Metotrexate) , Mexate-AQ (Metotrexate), Mozobil (Plerixafor), Nelarabine, Neosar (Ciclofosfamida), Ontak (Denileukin Diftitox), Plerixafor, Pralatrexate, Rituxan (Rituximab), Rituximab, Romidepsin, Tositumomab e lodina 1 131 Tositumomab, Treanda (Bendamustine Hydrocloreto), Velban (Vinblastina Sulfato), Velcade (Bortezomib), e Velsar (Vinblastine Sulfato), Vinblastine Sulfato, Vincasar PFS (Vincristine Sulfato), Vincristine Sulfato, Vorinostat, Zevalin (Ibritumomab Tiuxetan), Zolinza (Vorinostat). Exemplos de combinações de droga usadas no tratamento de linfoma não Hodgkin incluindo CHOP (C = Ciclofosfamida, H = Doxorubicin, Hidrocloreto (Hidroxidaunomicin), 0 = Vincristine Sulfato (Oncovin), P = Prednisona); COPP (C = Ciclofosfamida, 0 = Sulfato de Vincristina (Oncovin), P = Procarbazine Hidrocloreto, P = Prednisone); CVP (C = Ciclofosfamida, V = Vincristine Sulfato, P = Prednisone); EPOCH (E = Etoposide, P = Prednisone, 0 = Vincristine Sulfato (Oncovin), C = Ciclofosfamida, H = Doxorubicin Hidrocloreto (Hidroxidaunomycin)); ICE (I = Ifosfamida, C = Carboplatina, E = Etoposide) e R-CHOP (R = Rituximab, C = Ciclofosfamida, H = Doxorubicin Hidrocloreto (Hidroxidaunomicina), 0 = Sulfato de Vincristina (Oncovin), P = Prednisone. Combinação de retinóides com construtores de proteina de fusão baseado em interferon é também contemplada. Retinóides são uma familia de moléculas que apresenta um papel importante em muitas funções biológicas incluindo crescimento, visão, reprodução, diferenciação de célula epitélial e função imune (Meyskens, F. et al. Crit Rev Oncol Hematol 3:75, 1987, Herold, M. et al. Acta Dermatovener 74:29 1975). Estudos pré clínicos anteriores como todos os retinol trans ácido retinóico ou ATRA, sozinho ou em combinação com outros agentes, demonstraram 5 atividade contra leucemia pró mielocítica aguda(Acute Promyelocytic Leukemia - APL), síndrome de mielodisplasia, leucemia mielogenosa crônica (Crônica Myelogenous Leukemia- CML) , fungoidesmicose mieloma múltipla(resvisto em Smith, M. J. Clin. Oncol. 10:839, 1992). Este estudo conduz para a 10 aprovação de ATRA para o tratamento de APL. Atualmente existem mais de 100 tratamentos clínicos evoluindo para a atividade de ATRA em combinação com outras terapias para o tratamento de hematológicas malignas, cânceres de rim, cânceres de pulmão, carcinomas de célula escamosa e outros.
De particular interesse e pertencendo diretamente para esta invenção são os estudos demonstrando aumentada eficácia do tratamento de interferon quando combinado com ATRA. Isto é descrito por linfoma de célula coberta(Col, J. et al. Cancer Res. 72: 1825, 2012), célula carcinoma renal (Aass, 20 N. et al. J. Clin. Oncol. 23:4172, 2005; Motzer, R. J. Clin. Oncol. 18:2972, 2000), CML, melanoma, mieloma e célula carcinoma renal (Kast, R. Cancer Biology and Therapy, 7: 1515, 2008) e câncer de mama (Recchia, F. et al. J. Interferon Citocina Res. 15:605, 1995). Nós previmos 25 a mesma atividade aumentada de seus alvos atenuado IFNs quando combinado com dosagem terapêutica clínica de ATRA.Em adição, Mehta (Mol Cancer Ther 3(3):345-52, 2004) demonstrou que tratamento in vitro de células de leucemia com ácido retinóico induziu a expressão de antígeno CD38. 30 Assim, a eficácia aumentada de interferon mais a induzida expressão do alvo CD38 indicou uma terapia de combinação de ATRA com os IFNcc atenuando anticorpo anti-CD38 no tratamento de cânceres sensível a IFN que expressa CD38 ou pode ser induzido por ATRA para expressar CD38. Exemplo de tais cânceres são mieloma múltipla, linfoma não Hodgekin, CML e AML. Em adição, enquanto os construtores acima são baseados em IFNcc2b, as mutações ou deleções também podem ser feitas no contexto de qualquer dos outros IFNccs ou IPNβ. Em uma outra concretização da presente invenção, o IFN tipo I é um IPNβ. IFN-β é aprovado para o tratamento de esclerose múltipla (Multiple Sclerosis MS) . IFN-β pode ser atenuado por mutação ou deleção e então ligado para um anticorpo que tem como alvo células envolvidas na patogênese desta doença. IFN-β é uma droga efetiva em MS, mas seu uso é associado com eventos adversos, incluindo inflamação do site de injeção, sintomas como gripe, leucocitopenia, disfunção do fígado e depressão, conduzido por descontinuaçâo em um sub grupo de pacientes. Pelo direcionamento de atividade IFN-β diretamente para células patogênicas, destes eventos adversos podem ser evitados.
Patogênese de MS é pensada para iniciar e progredir por um número de eventos, incluindo ativação inata de células dendritícas e microgliais através de receptores semelhantes a toll, em desequilíbrio entre pró inflamatória e anti-inflamatória/regulatória citocinas, diferenciação de células CD4+ T em fenotipos Thl e Thl7, ativação de células Thl por antigeno apresentando células (APCs), redução no número de reguladores (Treg) células T e migração de células imunes ativadas através da barreira de sangue do cérebro (blood-brain barrier -BBB). Um indutor primário de episódios clínicos da doença são ensinado para ser auto reativo, especificas células Thl de mielina (revisto em Gandhi, 2010 J Neuroimunol 221:7; Boppana, 2011 Mt Sinai J Med 78:207; Loma, 2011 Curr Neuropharmacol 9:409).
Em uma concretização da invenção, uma versão atenuada de de IFN-β pode ser ligada para um anticorpo tendo como alvo uma superficie de célula especifica marcada por células T, para o tratamento de esclerose múltipla ou outras indicações autoimune onde IFN-β pode ser efetiva. Efeitos diretos de IFN-β em células T inclui inibição de proliferação (Rep, 1996 J Neuroimunol 67: 111), redução da regulação da molécula CD40L co-estimuladora (Teleshova, 2000 Scand J Imunol. 51:312), redução de atividade metaloproteinase conduzida para reduzir migração através de BBB (Stuve, 1996 Ann Neurol 40:853; Uhm, 1999 Ann Neurol 46:319), indução de apoptose por regulação para cima de intracelular CTLA-4 e superficie de célula de moléculas Fas (Hallal-Longo, 2007 J Interferon Citocina Res 27:865), regulação para baixo de proteinas anti-apoptótica (Sharief, 2001 J Neuroimunol. 120: 199; Sharief, 2002 J Neuroimunol. 129:224), e restauração de função Treg (De Andres, 2007 J Neuroimunol 182:204; Korporal, 2008 Arch Neurol 65: 1434; Sarasella, 2008 FASEB J 22:3500; Chen, 2012 J Neuroimunol 242:39).
Além disso, em um aspecto da presente invenção, um atenuado IFN-β é ligado para um anticorpo anti-CD3 que tem como alvo todas as células T, que inclui células CD4 + , CD8 + , Treg, Thl, Th2 e Thl 7. Esta abordagem abrangente garante cobertura complete de todas as células T, como todos esses tipos de célula têm relatado papel em patogênese e são afetados por tratamento de IFN-~ ( DhibJalbut, 2010 Neurology 74: Sl 7; Prinz, 2010 Trends Mol Med 16:379; Graber, 2010 Clin Neurol Neurosurg 112:58 e Loma, 2011 Curr Neuropharmacol 9:409). Exemplos de anticorpos CD3 que podem ser incorporados em construtores de proteina de fusão da presente invenção são listados na Tabela 8. Tabela 8
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Alternativamente, um atenuado construtor de proteina de fusão IFN-P-anti-CD4 apresenta uma abordagem mais restritiva, mas pode ter como alvo de células T auto 10 reativa e reguladora, incluindo células Thl e Thl7 e células CD4+CD25+ Treg. Em adição, sub grupos de células dendriticas(DCs) também expressam CD4 e direciona efeitos terapêuticos de IFN-βem DCs descritos em (Shinohara, 2008 Immunity 29:68; Dann, 2012 Nat Neurosci 15:98). Exemplos de 15 anticorpos CD4 que podem ser incorporados nos construtores de proteina de fusão da presente invenção são listados na Tabela 9. Tabela 9
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0205] Um papel para células CD8+ T em MS foi reportado (Friese, 2005 Brain 128: 1747; Friese, 2009 Ann Neurol 66: 132), tanto quanto um efeito direto de IFN-β em células 5 CD8+ T em pacientes MS (Zafranskaya, 2006 Imunol 121:29).Além disso, direcionado urn IFN-β atenuado diretamente para células CD8+ T com um anticorpo anti-CD8 podem resultar benefícios clinicos para pacientes MS.
Exemplos de anticorpos CD8 são mostrados naTabela 10. Tabela 10
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Marcas de células T ativadas, incluindo, mas não limitado para CD25, CD38, CD44, CD69, CD71, CD83, CD86, CD96, HLA-DR, ICOS e PD-1, também representam atrativo alvos para esta abordagem, um vez que células T ativadas são pensadas para ser o maior condutor de auto reatividade resultando em demielinação em MS (Gandhi, 2010 J Neuroimunol 221:7; Boppana, 2011 Mt Sinai J Med 78:207; Loma, 2011 Curr Neuropharmacol 9:409). Anticorpos direcionados para qualquer destes antigenos podem ser ligados para um INβ atenuado. Exemplos de anticorpos que podem ser usado na presente invenção incluem os seguintes: anticorpos CD71 incluindo BA120g (US 7736647) e vários anticorpos mencionados em Wang et al (Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao (Academic journal of the first medica college© fPLA) 22 (5) :409-411, 2002). Exemplos de anticorpos para CD83 inclui 20B08, 6G05, 20D04, 11G05, 14C12, 96G08 e 95F04 (US 7,700,740). Um exemplo de um anticorpo para CD86 inclui 1G10H6D10 (US 6,071,519). HLA-DR anticorpos inclui HD3, HD4, HD6, HD7, HD8 e HD10 (US 7,262,278), DN1921 e DN1924 (US2005/0208048) . Um alvo atrativo para estas linhas pode ser PD-1, que é expresso em recentemente ativadas células T. Idealmente, um anticorpo não antagonizado pode ser usado, tal como o J1 10 adicionalmente discutido em detalhe abaixo. Exemplos de anticorpos para ICOS inclui JMabs (US 6,803,039) e JMab 136 (US2011/0243929).
Adicionais destes exemplos de anticorpos para este alvo são mostrados nas Tabelas 11 e 12 Tabela 11
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Tabela 12
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Em uma outra concretização da invenção, uma versão 5 atenuada de IFN-β pode ser fundida para um anticorpo tendo como alvo de superficie de célula que marca as células mielóides, conhecidas por contribuir para patogênese MS por dirigir ativação e diferenciação de célula T. Por exemplo, o pan-mielóide marca CD33, CD115, ou acélula dendritica 10 marca CD1 1c pode ser usada como alvo. Uma abordagem ampla de direcionamento pode ser preferida, por exemplo, usando anticorpos contra CD33 ou CD115, uma vez que a exata contribuição de cada um dos sub grupos de célula mielóide para patogênese de doença MS e resposta para IFN-βfoi 15 disputada (Prinz, 2008 Immunity 28:675; Shinohara, 2008 Immunity 29:68; Dann, 2012 Nat Neurosci 15:98). Anticorpos para CD33 que pode ser usado na presente invenção inclui My9-6 (US 7,557,189), qualquer dosl4 anticorposdescritona Deposito de Patente US US2012/0082670, ou o anticorpo conhecido como huM195 (US5693761). Anticorpos para CD115 que podem ser usados incluem Abl e Abl6 (US 8,206,715) ou 5 CXIIG6 (US2011/0178278).Um exemplo de um anticorpo CD1 1c que pode ser usado de acordo com a presente invenção é mab 107 (US 7,998,738, ATCC númeo de deposito PTA-11614). O atenuado IFN-β pode alternativamente ser direcionado para o anigeno CD 14, presente primariamente em macrofagos.
Exemplos de CD 14 anticorpos são mostrado na Tabela 13. Tabela 13
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Ainda em uma outra concretização, alvos expressando células CD52 pode entregar IFN-β para todos linfocitos e, 15 em adição, para monocitos e células dendriticas periferal (Buggins, 2002 Blood 100: 1715; Ratzinger, 2003 Blood 101: 1422), que são a chave APCs responsável para proliferação e diferenciação de auto reativa células T em MS. Esta abordagem direciona a atividade de IFN-β para célula chave tipos conhecidos por ser diretamente afetada por IFN-β e facilitar sua atividade terapêutica em MS. Exemplos de anticorpos CD52 que podem ser usados de acordo com a presente invenção inclui, mas não são limitados para DIVHv5/DIVKv2 (US 7,910,104), qualquer dos anticorpos CD52 descritos em (US2012/0100152) ou CAMPATH.
Qualquer dos acima mencionados, IFNP construtores de proteina de fusão atenuando anticorpo alvo pode ter atividade terapêutica no contexto de outras doenças inflamatórias e autoimunes além de esclerose múltipla, devido suas imunógias adjacentes comuns.
Doenças autoimune contempladas neste documento incluem inter alopecia areata alia, espondilite -anquilosante, sindrome antifosfolipide, doença esclerose múltipla auto-imune de Addison, doença auto-imune da glândula supra-renal, anemia hemolitica auto-imune, hepatite auto-imune, oforite auto-imune e orquite, doença de Behcet, penfigóide bolhoso, cardiomiopatia, doença celiaca, dermatite crônica sindrome da fadiga (CFIDS) , desmielinizante inflamatória crónica, polineuropatia inflamatória crônica, Sindroma de Churg-Strauss, penfigóide cicatricial, sindroma de crista, a doença de aglutinina fria, doença de Crohn, sindrome do intestino irritável, doença inflamatória do intestino, dermatite herpetiforme, lúpus discóide, crioglobulinemia mista essencial, fibromialgia, glomerulonefrite, doença de Grave, sindrome de Guillain-Barre, tiroidite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, idiopática trombocitopenia púrpura (PTI), nefropatia por IgA, diabetes dependente de insulina (Tipo I),' liquen plano, lúpus, doença de Ménière, doença mista do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, miastenia grave, miocardite, pênfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, policondrite, sindromes poliglancular, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, pochitis, agamaglobulinemia principal, cirrose biliar primária, psoriase, fenômeno de Raynaud, sindrome de Reiter, febre reumática, artrite reumatóide, sarcoidose, esclerodermia, sindrome de Sjõgren, sindrome de dura homem, lúpus eritematoso sistêmico, arterite de Takayasu, arterite temporal / arterite de células gigantes, colite ulcerativa, uveite , vasculite e vitiligo. De particular interesse é a doença Belie e edema macular uveitico crónica e outros tipos de uveite, uma vez que IFNcc foi mostrado para processar o beneficio terapêutico (Deuter, Dev Ophthalmol. 51:90-7. 2012) -
Exemplos de condições de doença inflamatória contempladas pela presente revelação incluem, mas não são limitados para estas doença e desordens que resultam em uma resposta de vermelhidão, inchaço, dor, e uma sensação de calor em certas áreas que destina-se a proteger os tecidos afetados por dano ou doença. Doenças inflamatórias que podem ser tratadas usando os métodos da presente revelação, incluem, sem ser limitado para, acne, angina, artrite, pneumonia de aspiração, doença, empiema, gastroenterite, inflammação, gripe intestinal, NEC, enterocolite necrosante, doença inflamatória pélvica, faringite, PID, pleurisia, garganta cru, vermelhidão, rubor, dor de garganta, infecções do trato urinário e gripe de estômago, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, desmielinizante polirradiculo neuropatia inflamatória crônica, desmielinizante inflamatória crônica, polineuropatia, demielinação inflamatória crônica poliradiculo neuropatia.
A sequência de interf eron-β'i humana é mostrada abaixo: (SEQ ID NO: 191) 1 MSYNLLGFLQ RSSNFQCQKL LWQLNGRLEY CLKDRMNFDI PEEIKQLQQF 50 51 QKEDAALTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKT 100 101 VLEEKLEKED FTRGKLMSSL HLKRYYGRIL HILKAKEYSH CAWTIVRVEI 150 151 LRNFYFINRL TGILRN 166
Usando o esquema de numeração acima (residues 1-166), conhecidas mutações (nas posições indicadas pelos asteriscos) em IENβ humano que reduz sua atividade inclui estes listados na Tabela 14. Tabela 14. Mutações de Atividade Atenunada de IFN
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baseada em atividade anti-proliferação ** a mutação C17S foi de modo a remover a não paridade de cisteina na sequência nativade INβl Referências: (1) Runkel, L. , Pfeffer, L., Lewerenz, M., Mogensen, K. (1998). Differences in Activity entre a andβTipo I Interferons Explored by Mutational Analysis. J. Biol. Chem. 273: 8003-8008 (2) Stewart, A. G., Adair, J. R., Catlin, G., Hynes, C, Hall, J., Dav ies, J., Dawson, K. & Porter, A. G. (1987). Chemical mutagenesis of humano interferon-beta: construction, expressão in E. coli, and bioloical activity of sodium bisulfite-induced mutations. DNA 6: 119 -128. (3) In-house results
Ainda em uma outra concretização da presente invenção, o IFN é IFN-À(WO 2007/029041 A2), que pode ser usado for qualquer das aplicações descritas mais detalhadamente para IFNcc ou INβ. IFNs Tipo I pode ter atividade anti-câncer baseado em uma estimulação direta do receptor IFN tipo I em células de câncer. Isto foi mostrado para numerosos tipos de câncer incluindo mieloma múltipla, melanoma, linfoma de célula B, câncer de pulmão de célula não pequena, célula de carcinoma renal, leucemia de célula pelosa, leucemia mielogenosa crônica, câncer de ovário, fibrosarcoma, câncer cervical, câncer de bexiga, astrocitoma, câncer pancreático, etc (Borden, Cancer Research 42:4948-53, 1982; Chawla-Sarkar, Clinica Cancer Research 7: 1821-31, 2001; Morgensen, Int J. Cancer 28:575-82, 1981; Otsuka, British Journal de Haematology 103:518-529, 1998; Lindner, JofInterferonandCitocina Research 17:681-693, 1997; Caraglia, Cell Dea than diferenciação 6:773-80, 1999; Ma, World J Gastroenterol 11(10): 1521-8, 2005). Um experiente na material reconhecerá que a presente invenção têm vários aspectos resultantes de combinação de anticorpos mutado para antigenos associados a tumor com interferons tipo I, e que os construtores resultantes de proteina de fusão podem ser usados para reduzir a proliferação de vários cânceres sensiveis a interferon que expressa o correspondente antigenos associado a tumor. Também sera apreciado que interferons tipo I podem ser combinados com outros agentes para adicionalmente melhorar suas eficácia.
O Interferons Tipo I pode também apresentar propriedades anti-viral. IFNcc2b, por exemplo, foi aprovado pelo FDA para o tratamento de infecções de hepatite C crônica, e pode ter utilidade também no tratamento de outras infecções viral. IFN-apegilatado é atualmente parte de regimes de cuidado padrão para hepatite C, de acordo com Guias Americano e Europeu, mas resultando em efeito colateral em mais de 80% de pacientes, frequentemente conduzindo para descontinuidade de tratamento (Aman, 2012; Calvaruso, 2011) . Em um aspecto da presente invenção, um IFN tipo I com uma mutação atenuada é ligado para um anticorpo que liga para células viralmente infectadas. O antigeno para ser reconhecido referenciado acima pelos anticorpos pode ser uma proteina virai que é transientemente expressa em uma superficie de célula hospedeira, ou pode ser um antigeno produzido por célula endógena hospedeira que é exposta na superficie de célula para uma maior extensão depois da infecção viral que antes da infecção. Exemplares proteinas virai que poderiam servir como alvos para a porção de anticorpo incluem, mas não são limitadas para, Hepatite C viral do envelope glicoproteinas, El e E2; superficie de antigeno de Hepatite B (HBsAg); virus de Herpes viral glicoproteinas do envelope B, C, D, E, G, H, I, J, K, L, M e UL32, e envelope de proteina UL49A; Deficiência de virus de imunidade humana (Human Immune Virus - HIV) envelope de proteinas glicoproteina (gp) 120 e gp41; Dominio de acelerador de adeno viroses da fibra de proteina; virus da Varicela zoster envelopando paglico proteinas (gB, gC, gE, gH, gl, gK, gL) ; Epstein-barr virus glicoproteina gp350 e viral proteina BMRF-2; citomegalo virus UL16 humano; Parvovirus B19 viral capsid proteinas VP 1-3; proteinas de estrutura astro virus de hunano, exemplo VP26, VP29 e VP32; proteina VP1 de estrutura de Noro virose e capsid proteina VP2; Poliovirus viral capsid proteinas VP0, VP1, VP2, VP3 e VP4 Rhinovirus viral capsid proteinas VP1, VP2, VP3 e VP4; e particulas de proteinas capsid de virus da dengue (C) , pré-membrana/membrana (prM/M) e envelope (E).
Em uma concretização, atividade de IFN-a pode ser alvo com um anticorpo que liga, diretamente ou indiretamente via uma proteina intermediária tal como anexina V ou beta2- glicoproteina 1, para fosfatidil serina (PS), um componente fosfolipideos do parte da membrana celular. Células sofrendo apoptose, todavia, ou células infectadas com viruses, exposto PS no interior da membrana, onde se torna acessivel para anticorpos. PS é exposto na superficie de células de câncer (Reidl, L. et al., J Imunol. 14:3623, 1991), um endotélio vascular em tumores (Ran, S. et al., Cancer Res. 62:6132. 2002; He, J. et al., Clin Cancer Res. 15:6871, 2009), e células infectadas de virus (Soares, M. et al., Nat Med. 14: 1357, 2008). Um anticorpo indiretamente (via beta2 glicoproteina 1) tem alvo PS, bavituximab, foi descrito. A mediada de citotoxicida de dependentes de anticorpos é efetiva em um número de modelos de câncer in vivo, incluindo câncer de mama humana e xeno enxerto de linfoma e um modelo de glioblastoma de rato,bem como em modelo de doenças virais (Ran, S. et al, Clin Cancer Res;l 1: 1551, 2005; He, J. et al, Clin Cancer Res.15:6871, 2009; Soares, M. et al, Nat Med. 14: 1357, 2008). Atualmente, foi desenvolvido como um anticorpo terapêutico para tratamento de câncer de pulmão (DeRose, P. et al, Imunoterapia. 3:933, 2011; Gerber, D. et al, Clin Cancer Res.17:6888, 2011). Alternativos anticorpos podem ser baseado em regiões variáveis do anticorpo anti-PS 9D2 (Cancer Res November 1, 2002 62; 6132). Ainda em alternativa para direcionamento de PS seria a substituição das porções de anticorpo Fab com uma proteina ligando natural PS tal annexin V ou beta2-glicoproteina 1. Um anticorpo anti-PS (ou alternativamente uma proteina ligando diretamente ou indiretamente PS) fundida com uma versão atenuada de IFN-a para direcionamento de atividade IFN-a PS expressando células infectadas com virus sem apresentar os problemas de segurança sistêmicos relacionados com IFN-a. Certas células de tumor, Tais como células de câncer de pulmão, também expressam PS em suas superficies de células, assim um anticorpo (ou alternativamente proteinas ligando diretamente ou indiretamente PS) como PS, ligado para um IFN atenuado, pode também ter uso no tratamento de certos cânceres.
Será entendido que IPNÀ atenuando anticorpo alvo também pode ser usado e, muitas das mesmas maneiras como IFNcc para o tratamento de alvo de células viralmente infectada (S. V. Kotenko, G. Gallagher, V. V. Baurin et al, "IFN-ls mediate antiviral protection of a distinct classe II receptor de citocina complex," Nature Imunology, vol. 4, no. 1, pp. 69-77, 2003).
Em uma concretização IFNs Tipo II, denominado INFy, pode também ser atenuado e ligado para anticorpos que direciona então para especificas células tipo. IFNy tem propriedades anti-proliferativa através de células de câncer (Kalvakolanu, Histol. Histopathol 15:523-37, 2000; Xu, Cancer Research 58:2832-7, 1998; Chawla-Sarkar, Apoptosis 8:237-49, 2003; Schiller, J Interferon Resarch 6:615-25, 1986). Sharifi tem descrito como faze uma proteina de fusão em que urn IFNy foi fundido para o terminal C de um anticorpo alvo de tumor (Sharifi, Hybridoma e Hybridomics *21 (6) : 421-32, 2002). Nesta referência, Sharifi descreve como produzir proteina de fusão de anticorpo IFNy em células mamárias e mostra que ambos os anticorpo e o IFN foram funcionais. Alternativamente, um dimer de cadeia simples dimer versão de IFNy,como descrito por Lander (J Mol Biol. 2000 May 26; 299(1): 169-79) pode ser usado na proteina de fusão. Em adição ao efeito anti-proliferativa de IFNy's nas células de tumor alvo, pode também ter outro efeito especificamente em células de câncer de mama: IFNy foi mostrado para restaurar sensitividade de anti estrogênio para células de câncer de peito (Mol Cancer Ther. 2010 May; 9(5): 12741285) e assim um atenuado-IFNy ligado para um anticorpo antigeno de câncer de mama pode ser terapeuticamente útil em combinação com terapia de antiestrogênico. Por atenuar IFNy via mutação, uma forma mais seletiva de câncer de IFNy pode ser produzido. Duas mutações atenuadas em IFNy foram descritas por Waschutza (Eur J. Biochem. 256:303-9, 1998), denominado des-(A23, D24), em que resíduos A23 e D24 são deletados, e des-(N25, G26), em que resíduos N25 e G26 são deletados. 0 des-(A23, D24) mutante tem uma redução de afinidade de aproximadamente 18 vezes para o receptor IFNy comparado para tipo selvagem IFNy, e tem uma redução de atividade antiviral de aproximadamente comparado para o tipo selvagem IFNy. O des-(N25, G26) variante tem uma redução de afinidade de aproximadamente 140 para o receptor IFNy comparado para o tipo selvagem IFNy, e tem uma redução de atividade antiviral de aproximadamente 10 vezes comparado para o tipo selvagem IFNy. Exemplos de proteína de fusão compreendem anticorpos para alvo de tumor de superfície de células atenuado mutantes de IFNy incluem os seguintes: Rituximab pode ser usado como proteína de- fusão com um dos atenuado IFNy usando um ligador de 7 aminoácidos descrito por Sharifi para produzir o construtor proteína de fusão "Rituximab-HC-L7-IFNy (A [A23,D24]) IgGl," composto de SEQ ID NOS:378 (cadeia pesada) e 276 (cadeia leve)). Tal um construtor de proteína de fusão será esperado para ter potente atividade anti proliferativa contra CD20 malignidades tal como linfoma de célula B. Outro atenuado mutantes de IFNy que pode ser apropriado para fundir com anticorpos alvo de célula foram descritos por Lundell (J Biol. Chem. 269(23): 16159-62, 1994), denominado S20I (afinidade reduzida de aproximadamente 50 vezes), D21K (afinidade reduzida de aproximadamente 100 vezes ) , A23Q (ligação reduzida aproximadamente 2.500 vezes), A23V (ligação reduzida aproximadamente 200 vezes) e D24A (ligação reduzida aproximadamente 4 vezes). Estes atenuado IFNy podem ser usados como fusões em combinação com anticorpos anti-CD38, para gerar o construtor de proteína de fusão "X355/02-HC-L7-IFNy (S20I) IgGl" (composto de SEQID NOS:380 (cadeia pesada) e 226 (cadeia leve)) ou "R10A2-HC-L7-IFNy(D21K) IgGl" (composto de SEQ ID NOS:382 (cadeia pesada) e 270 (cadeia leve)). Outras atenuações de mutaçõe sem IFNy que pode ser exposta para a presente invenção foram descritos por Fish (Drug Des Deliv. 1988 Feb; 2(3): 191-206.)
O alvo atenuado de IFNy pode também ser usado para tratar várias indicações caracterizada por fibrose patológica, incluindo fibrose do rim, fibrose do figado e fibrose idiopatica pulmonar(IPF). IPF é uma forma progressiva de doença de pulmão crônica, caracterizado por fibrose de causa não conhecida ocorrendo primariamente em adultos idosos. Apesar das necessidades médicas existe pequeno progresso no desenvolvimento efetivo de estratégicas terapêuticas (O'Connell, 2011 Adv Ther 28:986).Fibrose pulmonar pode também ser induzida por exposição de droga, particulas, microorganismos ou irradiação.Os seguintes relatos para ambos IPF e fibrose de pulmão induzido por agentes conhecidos e potencialmente para tratamento de fibrose em outros tipos de organismo, incluindo figado e rins. Fibroblasto exerce um papel importante em doenças fibroticas do pulmão e sua ativação permite para disposição de colágeno, resultando em excessivo escaranel e destruição da arquitetura do pulmão. Ainda existe pouca informação na origem destes fibroblastos patogênico, através de vários precursores e célula tipos tendo sido proposto, incluindo medula óssea progenitores, monocitos, fibrocitos de circulação, e células endógenas, tais como residentes mesencimal e células epiteliais (Stevens, 2008 Proc Am Thorac Soc 5:783; King, 2011 Lancet 378: 1949). Os monocitos CD14+de sangue periferal são capazes de diferenciação em fibrocitos, os precursores de fibroblastos,este processo é inibido por interferon-y (IFN- y) . Um efeito direto de IFN-y em monócitos foi demonstrado em estudo de diferenciação in vitro, suportando a estratégia de direcionar forma atenuada de IFN-y para CD14+ monocitos para o tratamento de doença fibrótica (Shao, 2008 J Leukoc Biol 83: 1323). Experimental evidência existe que IFN-y é capaz de inibir proliferação e ativação de fibroblastos (Rogliani, 2008 Ther Adv Respir Dis 2:75) e este fato foi exportado com sucesso em modelos pré clinicos para reduzir cicatrizes e fibrose. Estudo clinico em IPF de pacientes administrado subcutaneamente IFN-y não apresentou os benefícios primários (O'Connell, 2011 Adv Ther 28:986; King, 2011). Atuais focos de abordagens na entrega direta de recombinante IFN-y através da inalação de uma forma de aerossol (Diaz, 2012 J Aerosol Med Pulm Drug Deliv 25:79), tal que os pulmões possam melhorar suficientemente a atividade de IFN-y para produzir beneficio global seguro na sistemática de dose.
Entrega de atividade IFN-y diretamente para fibroblastos pode ser método útil para aumenta a resposta clinica para este agente e ao mesmo tempo reduzir seu efeito colateral. Atenuada fusão de IFN-y para anticorpos com alvo em marca de fibroblasto especifico pode facilitar esta abordagem. Existem vários fibroblastos de moléculas de superficie de célula que são enriquecidos de fibroblastos. Estes incluem, por exemplo, proteinas especificas de fibroblastos de FSP1; Strutz, 1995 J Cell Biol 130:393), proteina de ativação de fibroblasto (FAP; Park, 1999 J Biol Chem 274:36505; Acharya, 2006 Hum Pathol 37:352), e plaquetas derivada de receptores de fator de crescimento(PDGFR-α e -β; Trojanowska, 2008 Rheumatology (Oxford) 47S5:2). Expressão destas moléculas é elevada na biopse de pulmão obtida de pacientes de PF e elas foram diretamente implicadas como alvo de droga em IPF ou sua patogênese (Lawson, 2005 Am J Respir Crit Care Med 171:899; Acharya, 2006 Hum Pathol 37:352; Abdollahi, 2005 J Exp Med 201:925). Exemplos de anticorpos para FAP e os receptores PDGF são mostrados na Tabelas 15 e 16. Tabela 15
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Tabela 16
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Em um modelo pré clinico de fibrose de figado, IFN-y foi entregue para células hepáticas estreladas, o equivalente de fibroblastos e responsável pela secreção de colágeno em fibrose de figado, através de liposomes alvo PDGFR-β, deste modo aumentando o efeito anti-fibrótico de IFN-y (Li, 2012 J Control Release 159:261). Estes dados suportam o conceito e o potencial beneficio terapêutico ganho por entrega de atividade IFN-y diretamente para fibroblastos em doenças fibróticas, incluindo IPF e fibrose de figado, e validado PDGFR-β como um alvo para esta abordagem.
A presente invenção também contempla a atenuação e direcionamento de IFNs tipo III baseado em anticorpo, incluindo 1FNXI (IL29), 1FNX2 (IL28A), e 1FNX3 (IL28B) (S. V. Kotenko, G. Gallagher, V. V. Baurin et al., "IFN- ls mediada proteção antiviral através de um distinto receptor classe II de citocina complexa," Nature Imunology, vol. 4, no. 1, pp. 69-77, 2003., P. Sheppard, W. Kindsvogel, W. Xu, et al., "IL-28, IL-29 e seu receptor de citocina classe II IL-28R," Nature Imunology, vol. 4, no. 1, pp. 63-68, 2003). Estes IFNs atuam através de receptores composto do IFN cadeia IR1 (também conhecido como IL28R) e a cadeia IL10R2 (misturada com IL10, IL22, e IL26 receptor complexos [A. Lasfar, W. Abushahba, M. Balan, e K. A. Cohen-Solal, Interferon lambda: a new sword in cancer immunotherapia," Clinical and Desenvolvimento al Imunology, vol. 2011, Article ID 349575,11 pages, 2011]). IFNiRs são expressos em muitos tipos de célula e media caminhos de sinalização similares como o IFNs tipo I. A atividade antiviral de À IFNs foi demonstrada contra várias viroses incluindo HBV e HCV (E. M. Coccia, M. Severa, E. Giacomini et al. , "Virai infection and toll-like receptor agonists induce a differential expression of type I e À interferons in humans plasmacy toid and monocyte-derived dendriticas cells," European Journal de Imunology, vol. 34, no. 3, pp. 796-805, 2004; M. D. Robek, B. S. Boyd, e F. V. Chisari, "Lambda interferon inhibits hepatitis Band C virus replication," Journal de Virology, vol. 79, no. 6, pp. 3851-3854, 2005; N. Ank, H. West, C. Bartholdy, K. Eriksson, A. R. Thomsen, e S. R. Paludan, "Lambda interferon (IFN- .), a tipo III IFN, é induced by viruses and IFNs and displays potente antiviral atividade against select virus infections in vivo," Journal de Virology, vol. 80, no. 9, pp. 4501-4509, 2006; S. E. Doile, H. Schreckhise, K. Khuu-Duong et al., "Interleucina-29 uses a tipo 1 interferon-like program to promote antiviral responses in humano hepatocitos," Journal of Hepatology, vol. 44, no. 4, pp. 896-906, 2006; T. Marcélulao, A. Grakoui, G. Barba-Spaeth et al., "Interferons a and À inhibit hepatitis C virus replicationwithdistinct signal transduction and gene regulation kinetics," Gastroenterology, vol. 131, no. 6, pp. 1887-1898, 2006). Estudos clinicos com IPNÀ para o tratamento de hepatite C mostram promissor (E. L. Ramos, "Preclinical and clinical development of pegilated interferon-lambda 1 in cronica hepatitis C, " Journal de Interferon e Citocina Research, vol. 30, no. 8, pp. 591- 595, 2010). Um aspecto da presente invenção é para alvo de um mutado, atenuado para um IPNÀ através de células viralmente infectadas, usando, por exemplo, os anticorpos alvo descritos acima para direcionamento de uma forma atenuada de IFNcc. Mutado, formas atenuadas de um IPNÀ pode também ser usada para células alvo de câncer, como descrito em mais detalhe em IFNcc, acima.
Ligandos não IFN são também contemplados na presente invenção e podem também ser atenuados por mutação e então direcionados para especificas células tipos por anticorpos ou fragmentos destes. A citocina anti-inflamatória interleucina-10 (IL-10) representa um papel central dual inato e resposta imune adaptava. Formas de IL-10 um homodimer e liga para o receptor complexo IL-10 expresso no" APCs, permitindo a redução da expressão de MHC classe II e reduzindo produção de pró-inflamatórias citocinas e quimocinas, deste modo inibindo desenvolvimento e diferenciação de Célula T. Embora, IL-10 também tenha implicação em induzira proliferação de várias células imunes, incluindo células B (Hofmann, 2012 Clin Imunol 143: 116) .
Expressão reduzida de IL-10 é associada com um número de desordens autoimune em humanos e roedores, incluindo psoriase, doença inflamatória de rins e artrite reumatóide. Rato deficiente em IL-10 desenvolve enterocolite crônica, que pode ser proveniente da administração de IL-10, mas a translação clinica desta conclusão resultou em um número de tratamento falhos em pacientes. Uma explanação destas falhas é que as concentrações locais IL-10 pode ser muita baixa, da máxima tolerável da administração sistêmica (Herfarth, 2002 Gut 50: 146). Uma outra explicação pode ser o efeito imuno estimulatório de IL-10 em células B e a resultante produção do pró inflamatória IFN-Y, como foi demonstrado em pacientes IL- 10- e doença de Crohn tratada (Tilg, 2002 Gut 50: 191).
Atenuada fusão de IL-10 para um anticorpo especifico para APCs, exemplo células dendriticas alvo através de CD1 lc, ou mais amplamente expressando marcas mielóide, como CD33 ou CD115, reduzirá sistemicamente atividade biológica ativa e ao mesmo tempo aumenta as concentrações locais de alvo ativo de IL-10. Em adição, o demonstrado efeito pró- inflamatório através de células B será reduzido ou eliminado. A produção de proteina de fusão de anticorpo- IL 10 foram descritos previamente (Schwager Artrite Res Ther. 11(5): R142, 2009).
Existe evidência para um papel anti-fibrótico de IL- 10 em vários modelos. A marca de fibrose é a maior produção e deposito de colágeno produzido por fibroblastos, resultando em formação de tecido scaranel.IL-10 diretamente inibe sintese de matriz extracelular para fibroblastos humanos (Reitamo, 1994 J Clin Invest 94:2489) e é anti- fibrótica em um modelo de fibrose hepática de camundongo através do abaixamento da regulação de TGF-β (Shi, 2006 World J Gastroenterol 12:2357; Zhang, 2007 Hepatogastroenterology 54:2092).Clinico uso de IL-10 é dificultado por sua curta meia vida e uma versão PEGilatada foi mostrada promovendo melhoras farmacocinética e eficácia. Em um modelo pré clinico de fibrose (Mattos, 2012 J ControlRelease 162:84). Atividade IL-10 direcionada através da fusão com um anticorpo direcionado para fibroblastos pode resultar em benefícios terapêuticos em doenças fibróticas, incluindo pulmão e fibrose de figado.
Anticorpos contra fibroblasto de especificas proteinas tais como proteina de ativação de fibroblasta e plaqueta derivada de receptores do fator de crescimento, como descrito acima direcionamento de IFN-y, pode entregar atenuado IL-10 diretamente para fibroblastos.
Recombinante eritropoietina (EPO) é um amplamente usado e hormônio efetivo para o tratamento de anemia, frequente em pacientes de câncer. Atua para sinalizar através do receptor EPO (EPOR) , que não só expresso em células do sistema hematopoliético, mas também em células não hematopoliética, incluindo células de vários tipos de tumor. Muitos estudos examinaram o papel da estimulação de EPO e EPO-R em modelos de câncer in vitro e in vivo, e um número de estudos demonstraram um efeito estimulador em crescimento de tumor, diretamente em células de câncer, ou através de aumento de angiogenese nos tumores (revisto em Jelkmann, 2008 Crit Rev Oncol Hematol 67:39). Em vários tratamentos clinicos, tratamento com EPO foi associado com aumentado crescimento de tumor e reduzindo sobrevivência, permitindo a recomendação e caixa preta para limitar e monitorara exposição de EPO em pacientes de câncer tanto quanto clinicamente possivel (Farrell, 2004 The Oncologist 9: 18; Jelkmann, 2008 Crit Rev Oncol Hematol 67:39; Elliott, 2012).
Eritropolese é um processo de multi passos, em que pluri potente células tronco experimenta forte controle dos passos de diferenciação e proliferação. Um intermediário tipo de célula neste processo, é uma formação de unidade de colônia de célula eritroide (CFU-E) , que expressa niveis alto de EPOR, depende em EPO por sobrevivência e aparece para ser o principal tipo de célula no processo de diferenciação com esta dependência (Elliott, 2008 Exp Hematol 36: 1573).
Atividade direcionando EPO para células CFU-E usando marcas especificas substancialmente reduzindo o efeito de EPO em câncer e outras células não hematopoliética, enquanto mantém a habilidade para dirigir formação de eritrócito e aumentar niveis de hemoglobina. Análise ampla de Genoma de células CFU-E revelam vários potenciais candidatos a marcadores de célula, incluindo licoproteinas associadas a Rh, exemplo CD241 e membros do sistema de grupo de sangue Rh, exemplo produto do gene RCHE (Terszowski, 2005 Blood 105: 1937).
Adicional exemplos de marcadores de superficie expressa no CFU-Es, e vários outros intermediários de eritropoiese, inclui CD 117 (c-kit), CD71 (receptor de transferrin) e CD36 (receptor de trombo espondina) (Elliott, 2012 Biologies 6: 163), mas estes marcadores são expressos em certas células de câncer tanto quanto eles são todos envolvidos em crescimento e proliferação geral, e desta forma representa menor alvo atrativo para direcionar atividade EPO em pacientes de câncer, mas esta abordagem pode beneficiar pacientes com tumores não expressando estes alvos. AnticorposCD117 incluem SR-1 (US 7,915,391) e anticorpos DSM ACC 2007, 2008 e 2009 (US 5,545,533). Outros antigenos para direcionar um atenuado EPO incluem CD34, CD45RO, CD45RA, CD115, CD168, CD235, CD236, CD237, CD238, CD239 e CD240.
Atividade de fusão EPO para um anticorpo também aumenta grandemente a extensão da atividade terapêutica. ’ Ameia vida de recombinante EPO é cerca de 5 horas em humanos e isto pose ser facilmente aumentada para semanas quando atenuado EPO é fundido por um anticorpo. Esta abordagem pode beneficiar pacientes tratados para anemia, que são doses tipicamente múltiplas vezes por semana, frequentemente através de injeções intravenosas. Importantemente, foi mostrado que a resposta terapêutico para EPO é primariamente controlada pelo comprimento de vezes de concentrações de EPO que são mantidas, e não pelos niveis de concentração (Elliott, 2008 Exp Hematol 36: 1573).
Um outro exemplo é transformação do fator de crescimento β (TGF-β) que é um fator critico na regulação de resposta imune mediada por Célula Te a indução de tolerância imune. Morte fatal dos rato de inflamação TGF-β multifocal e desordens auto-imole, sugerindo um efeito imuno supressivo (Shull, 1992 Nature 359:693). Embora, TGF- β também mostrou indução de doença fibrótica através de um papel importante na regulação da matriz extracelular e por promover migração, proliferação e ativação de fibroblasto (Rosenbloom, 2010 Ann Intern Med 152: 159; Wynn, 2011 J Exp Med 208: 1339; King, 2011 Lancet 378: 1949).
Na presença de TGF-β, CD4+CD25 naive Células T podem ser convertidas em células T reg, que podem suprimir antigeno especifico de expansão de Célula T in vivo e prevenir patogénese alergia em um modelo de asma de murino (Chen, 2003 J Exp Med 198: 1875). Resposta inflamatória também contribui para a transição de doença de figado aguda e perpetuação em fibrose crônica e cirrose e TGF-β pode auxiliar dampen destas respostas através de seu efeito na diferenciação de Treg (Dooley, 2012 Cell Tissue Res 347:245). Similarmentè, TGF-β direcionado para naive Células Tem doença de inflamatório do intestino pode permitir o controle e supressão de inflamação (Feagins, 2010 Inflamm Bowel Dis 16: 1963). TGF-β direcionado especificamente para Células T CD4 + pode aumentar a potência de anti-inflamatóriade TGF-β, enquando minimiza suas propriedades pró fibrótica; e pode fornece ruma nova estratégia para combater autoimune desordens. Alternativamente, TGF-β pode ser direcionado somente para ativar Células T usando um marcador de ativação de Célula T, como descrito acima pela discussão de alvo IPNβ. Um alvo atrativo para estas linhas pode ser, por exemplo, PD-1, que é expresso em recentemente ativadas Células TCD4. Idealmente, um anticorpo não antagonista pode ser usado, tal como o anticorpo J1 10 discutido em adicionais detalhes abaixo. -
Um outro exemplo é Interleucina-4 (IL-4) que é uma citocina que induz a diferenciação de Células CD4+ T naive em células Th2. Em ativação, células Th2 produzem mais IL- 4,como um resultado, IL-4 é considerado uma direção principal de resposta imune mediada por Th2. O conceito de um desequilíbrio de Thl/Th2 (favorável Thl) contribuindo para autoimmune e outras doenças inflamatórias foi primeiramente postulada em 1980s (revista em Kidd, 2003 Altern Med Rev 8:223), e apresenta, um papel nas células Thl/Thl7 como orientadoras de doenças de psoriase (Ghoreschi, 2007 Clin Dermatol 25:574), certos tipos de doenças inflamatórias de bexiga, em particular doença de Crohn (Sanchez-Munoz, 2008 World J Gastroenterol 14:4280), ou formas severas e suáveis de asma(Hansbro, 2011 Br J Pharmacol 163:81), foram documentadas.
Em modelo pré clinicos de doenças de infecções, devido a reposta de caminho imune de Thl a Th2 e ativação de macrófagos por protetor IL-4 de imuno patologia (Hunig, 2010 Med Microbiol Imunol 199:239), e terapiaIL-4 de pacientes de psoriase resultaram em uma indução de diferenciação de Th2 e um aumento nos escores clinicos 5 (Ghoreschi, 2003 Nat Med 9:40).
Variações através de Th2 pode fornecer um beneficio terapêutico em certos tipos de doenças. Entrega de IL-4 paraCélulasCD4+T pode acompanhar, ou atividade IL-4 pode ser direcionada para macrófagos para proteção de 10 imunopatologia (Ghoreschi, 2007 Clin Dermatol 25:574; Hunig, 2010 Med Microbiol Imunol 199:239).
Atenuações de mutações em IL-4 gue pode ser explorada no projeto de 11-4 construtores de proteina de fusão atenuando anticorpo da presente invenção incluem estes 15 listados na Tabela 17. Tabela 17
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ND. Especifica ligação não encontrada.
Os mutantes IL-4 nesta tabela, e suas propriedades de ligação e atividade biológica, foram descritos por Wang Y, Shen B e Sebald W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997 March 4; 94(5): 1657-62.
Ainda em um outro exemplo, Interleucina-6 (IL-6) pode também ser atenuado e direcionado para especificas células tipos. Um mecanismo para estes tumores pode evitar imunidade anti-tumor é pode recrutar células Treg para o microambiente do tumor, resultando em tolerância para sites de tumor. IL-6 é uma citocina envolvida na regulação do balanço entre células Treg e Thl7 e induz o desenvolvimento de células Thl7, enquanto inibe sua diferenciação Treg (Kimura, 2010 Eur J Imunol 40: 1830). IL-6, por distorcer da diferenciação terminal de CélulasCD4+ T naive na direção a linhagem Thl7, ou reprogramação de células Thl7, tem o potencial para por células Treg no contexto de câncer associado com imune supressão de tumor reverso, deste modo habilitando o sistema imune para controlar os tumores.
Esta estratégia fornece utilidade em um modelo murino de câncer pancreático em que o rato injetado com células de tumor expressando IL-6 demonstrou um significante retardo em crescimento de tumor e aumentada sobrevivência, acompanhado por um aumento em células Thl7 em micro ambiente de tumor, comparado para tumores em ratos não expressando IL-6 (Gnerlich, 2010 J Imunol 185:4063).
Transferência adotiva de Células T é um tratamento efetivo para malignidades sólidas (Rosenberg, 2011 Clin Cancer Res 17:4550) e hematológicas (Kochenderfer, 2012 Blood 119:2709). Análise de cinco diferentes tratamentos clinicos em que transferência adotiva de Célula T foi empregada usando uma variedade de regimes pré condicionados revelou a profundidade e duração de depleção de Treg correlata com razão de resposta clinica, destacando o importante papel de controle residual de Tregs da resposta de anti-tumor (Yao, 2012 Blood 119:5688). Em ratos, uma ligação direta entre Tregs sobreviventes e eficácia de terapia de transferência adotiva fortemente suporta estas observações clinicas (Baba, 2012 Blood 120:2417).
A importância de Tregs no controle de atividade anti-tumor é adicionalmente exemplificada por um significante aumento na resposta humoral por vacinação de peptideo em pacientes de glioblastoma antes depleção de Tregs com o receptor anticorpo de anti-IL-2 daclizumab (Sampson, 2012 PloS ONE 7:e31046).
Tomados juntos, os dados publicados fortemente suporta um papel para Tregs na inibição de resposta imune contra tumores. Pelo direcionamento de atividade IL-6 para células CD4+de modo aestimulardiferenciaçãoThl7 e reduzir formação de Treg, aumentada resposta de anti-tumor são esperado. Este pode ser aumentado com ou sem estratégica de vacinas adotadas. Fusão atenuada de IL-6 para um anticorpo contra um antigeno de Célula T(exemplo alvo de CD4) ou uma ativado antigeno de Célula T(tais como PD-1) fornecerá uma entrega compreensiva diretamente para as células alvo. Mutantes Atenuados de IL-6 incluem estes listados na Tabela 18. Tabela 18
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Estes IL-6 mutantes e suas propriedades foram descritas por Kalai M et.al. Blood. 1997 Feb 15;89(4): 1319-1333 Um outro exemplo é fator de crescimento hepatócito (HGF) revelado como um mitógeno para hepatócitos (revisto em Nakamura, 2010 Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sei 86:588). Fator de crescimento de hepatócito é uma citocina pleiotrópica que regula crescimento de célula e motilidade, criando um papel central em angiogênese e geração de tecido e reparo em muitos órgãos. HGF através de seu receptor, MET, que é expresso em células epitelial e endotelial.Ligação de HGF para MET resulta em um número de intracelular fosforilação e eventos de sinalização, conduzindo para uma variedade de respostas biológicas incluindo migração, proliferação e morfogênese. Essencial para embriogênese, função primária de HGF's em adultos é reparo de tecido (Nakamura, 2010 Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sei 86:588). HGF foi mostrado para alterar o destino de células epiteliais e reduzir transição epitelial mesencimal (EMT) através de sua interferência com sinalização de TGF-β, antagonizando o processo de fibroblastogenese (Shukla, 2009 Am J Respir Cell Mol Biol 40:643). Depois de dano de órgão, TGF-β conduz conversão de fibroblastos produzindo HGF em miofibroblastas produzindo colágeno, enquanto HGF por sua vez inibe produção de TGF-β por miofibroblastos (Mizuno, 2004 Am J Physiol Renal Physiol 286:F134). Exógenos HGF, ou imitando ativação do receptor MET, atua para restaurar este desequilíbrio imposto por lesão de tecido,e são além disso considerado promissora droga candidata para tratamento de tecido danificado e doenças fibróticas (Nakamura, 2010 Proc 5 Jpn Acad Ser B Phys Biol Sei 86:588).
Inicialmente estudos em modelos para lesões de figado e hepatite (Roos, 1992 Endocrinology 131:2540; Ishiki, 1992 Hepatology 16: 1227), HGF subsequentemente demonstrou beneficio terapêuticos em muitas lesões de órgãos 10 adicionais, incluindo modelos pulmonares, gastrointestinal, renal e cardiovascular de lesões e fibrose (Nakamura, 2011 J Gastroenterol Hepatol 26: 188).
Modelo de sistema de fibrose in vivo, HGF previne a progressão de trocas fibróticas e reduz acumulação de 15 colágeno quando administrado profilaticamente ou terapeuticamente em pulmões de murino exposto para bleomicina (Yaekashiwa, 1997 Am J Respir Crit Care Med 156: 1937; Mizuno, 2005 FASEB J 19:580), em um modelo de nefropatia obstrutiva em rato (Yang, 2003 Am J Physiol 20 Renal Physiol 284:F349) e em modelos de fibrose de figado em ratos (Matsuda, 1997 Hepatology 26:81); HGF também previne fibrose em hamster cardio miopático(Nakamura, 2005 Am J Physiol Heart Circ Physiol 288:H2131).
Limitação de HGF como um terapêutico inclui sua curta meia 25 vida, que requer concentrações sistêmicas supra fisiológicas para alcançar niveis localmente efetivo, e o papel de seu receptor, MET, em câncer. MET pode ativar caminhos oncogenico em células epitelial. Ambas destas limitações podem ser superada por geração de um construtor 30 de anticorpo de proteina de fusão direcionado para HGF para regenerar ou tecido fibrótico.Esta estratégica produz um terapêutico com uma muito maior meia vida direcionado primariamente para relevantes tipos de células T.
Verificações clinicas investigaram o potencial terapêutico e atividade regenerativa de HGF, ou imitadores de HGF, em falhas hepáticas, úlceras de perna crônica, isquemia, doença arterial periférica, doença cardiovascular após infarto do miocárdio e doenças neurológicas(de Andrade 2009 Curr Opin Rheumatol 21:649; Nakamura, 2011 J Gastroenterol Hepatol 26: 188; Madonna, 2012 Thromb Haemost 107:656).
Fibrose de figado, tipicamente o resultado de lesões crônica de figado causada por infecções ou abuso de álcool, como fibrose em outros órgãos caracterizado por acumulo excessivo de matriz extracelular, incluindo colágeno produzido por (mio) fibroblastos. Hepatocitos com lesões libera citocinas inflamatórias e os resultantes estimulos inflamatórios hepático transformam as células estreladas(HSC) em fibroblastos, produzindo colágeno. O acumulo de proteinas de matriz extracelular resulta em cicatriz de tecido, que conduz para cirrose de figado (Bataller, 2005 J Clin Invest 115:209). Existe evidência para um efeito direto de HGF em hepatocitos e HSC in vitro (Kwiecinski, 2012 PloS One 6:e24568; Namada, 2012 J Cell Physiol DOI 10.1002/jcp.24143) .HGF direcionado especificamente para hepatocitos ou HSC pode resultar um beneficio terapêutico em pacientes de fibrose de figado, enquanto elimina efeito sistêmico indesejado de HGF.
Possiveis proteinas de membrana para hepatocitos incluem, por exemplo, ASGR1, uma sub unidade da proteina sialoglico, usada como um alvo especifico para entrega de droga de figado (Stockert, 1995 Physiol Rev 75:591)’, ou alternativamente outra subunidade deste receptor, ASGR2.
Expressão de proteina especifica de fibroblast© (FSP1) é aumentada depois de lesões do figado e pode ser usado para alvo de fibroblastos ou macrófagos inflamatórios em tecido fibrótico do figado (Osterreicher, 2011 Proc Natl Acad Sei USA 108:308).
Em pacientes com fibrose de pulmão, a perda da arquitetura pulmonar é caracterizada por uma perda de células alveolar epitelial, a persistente proliferação de ativados fibroblastos e a intensiva alteração da matriz extracelular (Panganiban, 2011 Acta Pharmacol Sin 32: 12).
Para tratar fibrose de pulmão, atividade HGF pode ser entregue para células alveolar epitelial pela atenuação (por mutação) e ligação para um anticorpo contra uma especifica proteina de superficie de célula nas células, tais comoRTI40/Tia ou HTI56 (McElroy, 2004 Eur Respir J 24:664).
Marcadores específicos de célula endotelial, incluindo receptores VEGF (Stuttfeld, 2009 IUBMB Life 61:915) podem ser usado para direcionar vasos sanguíneos para camada de célula endotelial melhorada por um número de indicações patológicas, incluindo isquemia de hindlimb.
Exemplos de anticorpos receptor VEGF são mostrado na Tabela 19. Tabela 19
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Muitos outros exemplos de ligandos de sinalização são também conhecidos na matéria, e podem como descrito nas concretizações exemplares não limitantes acima, ser atenuado e ligado para um anticorpo (ou fragmentos destes) que liga para um antigeno em células alvo especificas, deste modo permitindo que oligando gere seu sinal biológico sobre as células alvo para um grau maior do que gera o sinal em células de antigeno negativo. Exemplos de ligandos que têm direto efeito negativo em proliferação de tumor incluem TNFa, TRAIL, Fas Ligando, IFNP, IFNy ou IFN , que podem ser direcionados para várias superficie de célula de antigenos de tumor como discutido acima para INFa.
Em muitos dos aspectos da presente invenção, mutações especificas em vários ligandos são explicitamente mencionadas. Existem, embora, métodos bem conhecidos na matéria para identificação de outras mutações em sinalização de ligandos, numerosos métodos para mutagênese de proteinas são conhecidos na matéria. Tais métodos incluem mutagênese aleatória por exemplo, exposição a proteina para radiação UV ou quimicas mutagênicas e seleção de mutantes com características desejadas. Mutagênese aleatória pode também ser feita usando dopagem de nucleotideos em sintese de oligonucleotideos, ou conduzindo uma reação PCR em condições que aumenta a incorporação de nucleotideo, deste modo gerando mutantes. Uma outra técnica é mutagênese direcionada a site que introduz trocas especificas para o DNA. Um exemplo de mutagênese direcionada a site é usando oligonucleotideos mutagênico em uma reação de extensão de iniciador com polimerase de DNA. Este método permite para ponto de mutação, ou deleção ou inserção de pequenos trechos de DNA para ser introduzido em sites específicos. A abordagem de direcionamento de site pode ser feita sistematicamente em tal técnica como explorando mutagênese de alamina por meio de resíduos que são sistematicamente mutado para alamina e seu efeito em atividade de peptideo é determinada. Cada um dos residues de aminoácido do peptideo é analisado desta maneira determinar as regiões importantes dos peptideos.
Um outro exemplo é mutagênese combinatória que permite a exploração de um grande número de mutantes para uma característica particular. Nesta técnica, umas poucas posições selecionadas ou uma exploração curta de DNA pode ser exaustivamente modificada para obter uma compreensiva biblioteca de proteinas mutantes.Uma abordagem desta técnica é para contribuir uma porção de DNA e recolocar com uma biblioteca de sequências contendo todas as possíveis combinações dos sites de mutação desejados. O segmento pode ser em um site de enzima ativa, ou sequências que têm significância estrutural ou propriedade imunogenica. Um segmento embora possa também ser inserido aleatoriamente em um gene de modo a acessar a estrutura ou funcional significância de particular parte da proteina.
Método de exploração de ligandos mutados para determinar potência inclui ensaios para a presença de um complexo entre o ligando e o alvo. Uma forma de ensaio envolve competitivos ensaios de ligação.Em tais ensaios de ligação competitiva, o alvo é tipicamente etiquetado. 0 alvo livre é separado de qualquer complexo putativo e a quantidade de etiqueta livre (isto é não complexada) é uma medida da ligação do agente sendo testado para molécula alvo. Um pode também medira quantidade de ligação, como livre, alvo. É também possivel para etiquetar o composto como o alvo e para medir a quantidade de composto ligando ao alvo na presença e na ausência da droga sendo testada.
Um exemplo de um ensaio de célula livre é um ensaio de ligação. Embora não diretamente endereçando função, a habilidade de um modulador para ligar a uma molécula alvo de um modo especifico é fortemente evidência de um efeito biológica relatado. Por exemplo, ligação de uma molécula para um _alvo pode, em si mesmo, ser inibidora, devido a estérico, alostérico ou interações carga-carga. alvo pode ser livre em solução, fixado para um suporte, expresso em ou na superficie de uma célula. 0 alvo ou o composto pode ser etiquetado, deste modo permitindo determinação de ligação. Usualmente, o alvo será a espécie etiquetada, reduzindo a chance que o etiquetado interfira com ou aumente ligação. Formatos de ligações competitivas podem ser realizados enquanto um dos agentes é etiquetado, e um pode medira quantidade de etiqueta livre versus etiqueta ligada para determinar o efeito na ligação.
Dependendo do ensaio, cultura pode ser requerida. A célula é examinada usando qualquer de uma variedade de diferentes ensaios fisiológico. Alternativamente, análise molecular pode ser realizada, por exemplo, expressão de proteina, expressão de mRNA (incluindo apresentação diferencial 'de célula completa ou poli RNA) e outros. Exemplos não limitantes de ensaios biológicos in vitro que podem ser usados para selecionar proteína variantes são mostrados nos Exemplos abaixo e também incluem ensaios de apoptose, ensaios de migração, ensaios de invasão, ensaios de ativação de caspase, ensaios de produção de caspase- citocinae semelhantes.
A presente invenção também fornece composições compreendendo os polipeptídeos da presente invenção. Estas composições podem adicionalmente compreender pelo menos um de qualquer adequados auxiliares, tais como, mas não limitado para, diluente, ligadores, estabilizadores, tampões, sais, solventes lipofílicos, preservativos, adjuvantes ou semelhantes. Auxiliares farmaceuticamente aceitáveis são preferidos. Exemplos não limitantes de, e métodos de preparação de tais -soluções estéreis são bem conhecidas na matéria, tal como, mas não limitada para, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990. Transportadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser rotineiramente selecionados que são adequados para o modo de administração, solubilidade e/ou estabilidade da composição de anticorpo como bem conhecido na matéria ou como descrito neste documento.
Excipientes e aditivos farmacêuticos úteis na presente composição incluem,mas não são limitados para proteínas, peptídeos, aminoácido, lipídeos, e carboidratos (exemplo, açúcares, incluindo monosacarídeos, di-, tri-, tetra-, e oligosacharídeos; derivativos de açúcares tais como auditores, ácidos aldonico, açúcares esterifiçados e semelhantes; e polisacarídeos ou polímeros de açúcar), que podem estar presente simples ’ ou em combinação, compreendendo sozinho ou em combinação 1-99,99% por peso ou volume. Exemplar excipiente de proteina inclui albumina de soro, tais como albumina de soro humano (HSA) , albumina recombinante humana (rHA), gelatina, caseina, e semelhantes. Representativos aminoácidos que também podem funcionar em uma capacidade de tampão incluem alamina, glicina, arginina, betaine, histidina, ácido glutâmico, aspártico ácido, cisteina, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalamina, aspartame, e semelhantes. Um preferido aminoácido é histidina. Um segundo preferido aminoácido é arginina.
Excipientes de carboidratos adequados para uso na invenção incluem, por exemplo, monosacarideos, tais como fructose, maltose, galactose, glucose, D-mannose, sorbose, e semelhantes; disacarideos, tais como lactose, sucrose, trehalose, cellaobiose, e semelhantes; polisacarideos, tais como rafinose, melezitose, maltodextrins, dextrans, starches, e semelhantes; e alditois, tais como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol), mioinositol e semelhantes. Preferidos excipientes de carboidratos para uso na presente invenção são manitois, trehalose, e rafinose.
Composições de anticorpos também podem incluir um tampão ou um agente de ajuste de pH; tipicamente, o tampão é um sal preparado de um ácido ou base orgânica. Representativos tampões incluem ácido de sais orgânico, tais como tampões de sais de ácido citrico, ácido ascórbico, ácido gluconico, ácido carbonico, ácido tartárico, ácido sucinico, ácido acético, ou ácido ftálico; Tris, hidrocloreto de trometamina, ou fosfato. Preferidos tampões para uso nas presentes composições são sais de ácido orgânicos, tais como citrato.
Adicionalmente, as composições da invenção podem incluir excipientes/aditivos poliméricos, tais como polivinil pirrolidonas, ficolis (um açúcar polimérico), dextratos (exemplo, ciclodextrins, tais como2- hidroxipropil-P-ciclodextrin), polietilenoglicois, agentes de sabor, agentes antimicrobial, adoçantes, antioxidantes, agentes antiéstatico, surfactantes (exemplo, polisorbatos tais como"TWEEN® 20" e "TWEEN® 80"), lipideos (exemplo, fosfolipideos, ácidos graxos), esteróides (exemplo, colesterol), e agentes quelantes (exemplo, EDTA).
Estes e adicionalmente conhecidos excipientes e/ou aditivos farmacêuticos adequados para o uso nas composições de anticorpo de acordo com a invenção são conhecidos na matéria, exemplo, como listado em "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19 th ed., Williams & Williams, (1995), e no "Physician's Desk Referência", 52 nd ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998), as descrições dos quais são inteiramente incorporados neste documento por referência. Transportadores ou excipientes materiais peferenciais são carboidratos (exemplo, sacarideos e alditois) e tampões (exemplo, citrato) ou agentes poliméricos.
Através desta especificação a palavra "compreendendo", ou variações tais como"compreende" ou "compreendido", será entendido para ampliar a inclusão de um definido elemento, inteiro ou partes, ou grupo de elementos, inteiro ou partes, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou partes, ou grupo de elementos, inteiro ou partes.
Todas as publicações mencionadas nesta especficação são neste documento incorporadas por referência. Qualquer discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou semelhantes que foram incluidos na presente especificação é somente para o propósito de prover um contexto para a presente invenção. É não para ser como uma admissão que qualquer parte ou todas as materiais formam parte da base da material anterior ou foram geral comum de conhecimentono relevante campo para a presente invenção como existente na Australia ou em outro lugar antes da data de prioridadede cada reivindicação desta aplicação. Precisa ser notado que, como usado nas especificações individuais, a forma singular de "a", "o" e "um" incluem aspectos plurais a menos que claramente indicado de outra maneira no contexto. Assim, por exemplo, referência para "a" inclui um único tanto quanto dois ou mais; referência para "o" inclui um único tanto quanto dois ou mais; referência para "um" inclui um único tanto quanto dois ou mais e assim por diante.
Tendo descrito geralmente a invenção, a mesma será mais prontamente entendida por referência para os seguintes exemplos, que são providos por meios de ilustração e não serão entendidos como limitante.
EXEMPLOS DA INVENÇÃO Produção de Anticorpo IFN Construtores de Proteina de Fusão Vetores de Expressão:
O DNA que codifica para regiões variáveis de rituximab (Anderson et ah, Patente US 5,843,439, Dec. 1, 1998) e palivizumab (Johnson, Patente US 5,824,307, Oct. 20, 1998) foram gerados de 18 (cadeia pesada) e 16 (cadeia leve) DNA oligonucleotides, que foram designados de acordo coma publicação de sequências de aminoácido, por PCR-baseada na montagem de gene. ODNA que codificadas regiões variáveis do G005 anti-CD38 e nBT062 anti-CD 138 monoclonal anticorpos foram projetada das publicações por De Weers et al. (Patente US 7829673) e por Daelken et al. (WO 2009/080832), respectivamente, e individualmente para ser sintetizado por Integrated DNA Technology, Inc. (Coralville, IA) depois da modificação da sequência para eliminar codons raros e não preferenciais sites de restrição.
As sequências de DNA que codifica as regiões variáveis de anti-humano HLA (HB95), anti-humano PD-1 (JI 10) e antivirus da febre amarela (2D12) monoclonal anticorpos foram determinado depois de clonagem de hibridoma W6/32 (ATCC HB- 95, Barnstabela et al. (1978),Cell 14:9-20), J1 10 (International Patent Organism Depositary FERM-8392, Iwai et al. (2002), Imunol. Lett, 83:215-220) e 2D12 (ATCC CRL- 1689, Schlesinger et al. (1983), Virol. 125:8-17), respectivamente, usando urn kit de amplificação SMART RACE cDNA (Clontech, Mountain View, CA) e Mouse Ig-Primer Sets (Novagen/EMD Chemicals, San Diego, CA).A determinação de sequência e sub-clonagem de recentes isolados anti- CD38 anticorpos é descrito nas seguintes seções.
O DNA que codifica interferon-2b humano(IFNcc2b; sequência de aminoácido de SEQ ID NO:3) foi isolada de genômico DNA de uma linha de célula HEK por PCR. As sequências de humano interferon-βi (IFN 1, SEQ ID NO:91), humano interleucina-4 (IL-4, SEQ ID NO: 119) e humano interleucina-6 (IL-6, SEQ ID NO: 123) foram designadas sequências de proteina tais comoNP_002167, NP_000580 e NP_000591, respectivamente, e sintetizado por Integrated DNA Technology, Inc. (Coralville, IA) ou GenScript USA Inc. (Piscataway, NJ) usando métodos comumente conhecidos para estes experientes na matéria. Alterações das sequências de citocina, por exemplo,a adição de ligadores ou ponto de mutações, foram introduzidos para os genes de citocina usando técnicas de sobreposição de extensão PCR bem conhecidos na matéria.
A citocina que codifica fragmentos de gene foram então clonado no vetor de expressão pTT5 (Durocher, nucleic acid Research volume 30, número 2, pages El-9, 2002) contendo uma cadeia pesada completa ou parcial de região constante de humano IgGl (tais como protocolo de acesso Swiss número P01857), uma cadeia pesada de região constante de humano IgG4 (tais como protocolo de acesso Swiss número P01861 incorporando substituição S228P), humano Ig kappa região constante (protocolo de acesso Swiss número P01834) ou humano Ig lambda região constante (protocolo de acesso Swiss número P0CG05) como a naked Ig ou como uma forma de gene de fusão de citocina usando técnicas de extensão de sobreposição PCR e restrição de sites de acordo com método de clonagens bem conhecido para estes experientes na matéria.
Produção de construtores de proteína de fusão interferon IgG e IgG:
0 DNA plasmideos que codifica o IgGs e IgG-citocina construtores de proteína de fusão foram preparados usando Plasmid Plus Maxi kit (Qiagen, Valencia, CA) e então transfectado em células HEK293-6E (CNRC, Montreal, Canada) crescida em meio sintéticoF17 suplementado com 0,1% Pluronic F-68, 4 mM L-glutamine (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando um reagente de transfecção comercialmente disponível e meio OptiMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Depois permitido para expressão por 6 dias em uma incubadora abastecida com5% CO2 e lentamente agitada, o meio de cultura foi isolado e individualmente puruficado para afinidade IgG usando contas de Proteina G-agarose (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Purificado construtores de proteina de fusão de IgG e IgG-citocina foram então concentrados e trocado para tampão de fosfato salino (PBS) pH 7,4 usando dispositivo de filtro centrifugo Amicon Ultra (Millipore, Billerica, MA) , seguido por determinação da concentração de proteina usando um espectro fotometro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA).
Embora diferentes construtores de proteina de fusão de anticorpo-citocina foram expressos no sistema HEK com diferentes rendimentos, vários deles, em particular vários destes baseados em IFNcc, foram produzidos a pelo menos 100 mg/1 de media, mostrando solubilidade - alta e não agregado como determinado pela cromatografia de exclusão de tamanho.
As sequências de anticorpos de aminoácido e construtor construtores de proteina de fusão ligando anticorpo são descrito abaixo. Para construtores de proteina de fusão de anticorpo-citocina em que a citocina foi fundida para o terminal C da cadeia pesada ou leve, as seguintes convenção de nomeação foi usada: [name de mab] - [ligado paracadeia pesada ("HC") ou cadeia leve ("LC")] - [nome do ligando] -[nome do ligando] [(mutação)] [isotipo].
Assim por exemplo o construtor "Rituximab-HC-L6-IFNcc (A145G) IgGl" é o anticorpo rituximab,comIFNcc2b (com o A145G ponto de mutação) , ligado para o terminal C do IgGl cadeia pesada, com um interveniente ligador L6.
Os ligadores usado nos experimentos forma como segue: LO: não ligador (fusão direcionada para o terminal C de uma cadeia de anticorpo com o Terminal N da citocina) L6: SGGGGS (SEQ ID NO: 132) L16: SGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 133)
Método para medir a atividade de construtores de proteina de fusão direcionado a antigeno de anticorpo -IFN
"Ensaio no alvo (Daudi) ": Este ensaio foi usado para quantificara atividade anti proliferativa de construtores de proteina de fusão IFNs de anticorpo- IFN em células que apresentam o antigeno correspondente para o anticorpo para o qual o IFN é fundido, e pode ser usado como parte do ensaio para calcular o indice sensitividade de antigeno (ASI) definido neste documento. A expressão de células Daudi ambas CD20 e CD38 como superficie de célula associada a antigenos. A viabilidade de células foi medida usando o reagente CellTiter-Glo®, Cat #G7570, de Promega (Madison, Wisconsin).Isto é um ensaio baseado em luminescência que determina a viabilidade de células em cultura baseada em quantificação de ATP. O tamanho do sinal é proporcional ao número de células viáveis em uma placa de cultura microtiter. Os detalhes do ensaio são como segue:
Células Daudi (obtidas de ATCC, Manassas, VA) foram cultivadas em um frasco T75 (TPP, Trasadingen, Switzerland, cat# 90076) para preferida densidade de entre 0,5 x 105 e 0,8 x 105células viáveis/ml em RPMI 1640 (Mediatech, Inc., Manassas, VA, cat # 10-040-CV) com 10% Soro Fetal Bovino (FBS; Hyclone, Logan, UT cat# SH30070.03). As células foram colhidas por centrifugação a 400g por cinco minutos, decantação de supernadantes, e resuspendendo apelete de célula em RPMI 1640 + 10% FBS. As células foram então contadas e a densidade foi ajustada para 3,0 x 105células/ml em RPMI 1640 + 10% FBS.Então, 50 μCda suspensão da célula foram colocada em aliquota em cada placa de cultura de 96 cultura de tecido de fundo redondo (daqui para frente, "experimental plate") (TPP, cat# 92067). Em uma separada, placa de cultura 96estéril(daqui para frente, "dilution plate"; Costar, Corning, NY cat# 3879), materiais do teste foram serialmente diluidos em duplicata em RPMI 1640 + 10% FBS. Então, 50 μt/cultura foi transferido da placa de diluição para a placa de experimento.0 placa de experimento foi então incubada por o quatro dias a 37 C com 5% CO2.
Uma mistura do tampão de ensaio fornecido pelo fabricante e substrato de ensaio (daqui para frente, "CellTiterGlo reagente", misturada de acordo com as instruções do fabricante) foi acrescentada para a placa de experimento a 100 μl/cultura. A placa foi agitada por dois minutos. Então, 100 μl/cultura foram transferidos para a placa de experimento para uma placa de 96 culturas de fundo plano branco opaco (daqui para frente, "placa de ensaio"; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ cat# 35 3296). O conteúdo da placa de ensaio foi então permitido para estabilizar no escuro por 15 minutos a temperatura ambiente. A placa foi em um Contador Victor 3V Multilabel (Perkin Elmer, Waltham, MA, model# 1420-041) no canal de luminometria e luminescência foi medida. Os Resultados são apresentados como"unidade de luminescência relativo (RLU)".
Os Dados foram analisados usando Prism 5 (Graphpad, San Diego, CA) usando regressão não linear e três curvas de parâmetro ajustada para determinar o ponto médioda curva (EC50). Para cada artigo de teste, potência relativa para IFNcc2b livre (ou algumas outras formas de IFN com uma conhecido potência relativa para IFNcc2b) foi calculada como uma razão de EC50s.
Um experiente na matéria apreciará que existem muitos outros ensaios comumente usados para medir célula viabilidade que podem também ser usados.
"Ensaio no alvo (ARP)" (também algumas vezes referido neste documento como um "ensaio alvo"): Alinha de célula múltiplade mieloma ARP-1 foi um presente de Bart Barlogie MD, PhD, Director of the Myeloma Institute at the University de Arkansas Medical Center (Little Rock, AK). É descrito em Hardin J. et al., (Interleucina-6 prevents dexamethasone-induced myelomaccell death. Blood; 84:3063, 1994). Células ARP-1 (CD38+) foram usadas para testar construtores de proteina de fusão CD38 direcionados para anticorpo-IFN. Condições de cultura e ensaio foram os mesmos como para o ensaio baseado em Daudi marcado acima, com as seguintes exceções: ARP-1 foi cultivado para uma densidade de 4,0 x 105 a 6,0 x 105 células/ml. A concentração de ARP-1 foi ajustada para 1,0 x 104 células/ml antes do ensaio.
Método para medir atividade de anticorpo-IFN um construtor de proteina de fusão direcionado para não antigeno
"Ensaio fora do alvo" (também algumas vezes referido neste documento como o ensaio "não direcionado"): O ensaio iLite de PBL Interferon Source (Piscataway, NJ,Cat# 51100), foi realizado largamente como descrito pelo fabricante com a adição de um passo de bloquear IgG humano.
A linha de célula iLite é descrita pelo fabricante como "uma linha de célula transfectada estável derivada de uma linha de célula pró monocitica humana comercialmente disponivel caracterizada pela expressão de antigenos MHC Classe II, em particular o antigeno linfócito humano (HLA- DR) , na superficie de célula." Alinha de célula contém um gene luciferase transfectado estável, a expressão da qual é conduzida por um elemento de resposta de interferon (IRE), que permite para a atividade interferon para ser quantificada baseada em saida de luminescência. A placa ILite fornecida pelo fabricante (daqui para frente "placa de ensaio") e diluente foram removidos do congelador a - 80°C e permitido para equilibrar para a temperatura ambiente. Então, 50 μl do diluente foram acrescentados por cultura para a placa de ensaio. O frasco abastecido pelo fabricante reportando células foi removido do congelador de -80°C e colocado em um banho de água em 37°C. Então, aliquotas de 25 μl de células foram dispensadas em cada cultura da placa de ensaio. Depois, 12,5 μl de 8 mg/ml IgG - humano que foi diluido em RPMI 1640 + 10% FBS (Sigma Chemicals, St. Louis, MO; cat# 14506) foi acrescentado por cultura. Os conteúdos foram misturados e incubados a 37°C por 15 minutos.Em uma separada "placa dos artigos de teste foram transferidos para a placa de diluição para a placa de ensaio. A placa de ensaio foi então incubada a 37°C com 5% CO2 por 17 horas. O tampão de ensaio fornecido pelo fabricante e substrato foi removido do congelador a -80°C e permitido para equilibrar a temperatura ambiente por duas horas. O tampão de ensaio fornecido pelo fabricante foi acrescentado para o frasco de substrato fornecido pelo fabricante e bem misturado de acordo comas instruções do fabricante para criara "solução de luminescência." Então, 100 μl da solução de luminescência foram acrescentadas para cada cultura da placa de ensaio. A placa foi agitada por 2 minutos.A placa foi então incubada a temperatura ambiente pór 5 minutos no escuro e finalmente lida em um Contador Victor 3V Multilabel no canal de luminometria e a luminescência medida e apresentada como RLU. Os dados foram analisados com Graphpad Prism 5 como descrito pelo 'ensaio no alvo (Daudi)," acima. Para o teste de construtores de proteina de fusão anti-CD38 anticorpo-IFN no ensaio iLte, o diluente fornecido pelo fabricante foi suplementado com 2 mg/ml IgG humano e 0,5 mg/ml anticorpo anti-CD38 (o mesmo clone de anticorpo sendo testado como um construtor proteina de fusão de anticorpo-IFN, para bloquear qualquer ligação dos construtores de proteina de fusão anti-CD38 anticorpo-IFN para CD38 expresso nas células iLite).
Resultados: Especificidade de Antigeno de anticorpo IFN um construtor de proteina de fusão
A Figura 6 mostra a atividade de interferon IFNcc2b livre (SEQ ID NO:3; "IFNcc" na figura) tanto quanto IFNcc2b fundido para o terminal C da cadeia pesada de dois diferentes anticorpos (rituximab e palivizumab, um anticorpo de controle de isotipo), como atuando na linha de célula iLite. Estalinha de célula não apresenta o antigeno para estes anticorpos, assim este ensaio revela a potência de várias proteinas contendo IFNcc2b na ausência de anticorpo baseado em alvo de antigeno. Os detalhes deste ensaio são descritos acima no Titulo "Método para Medição atividade de anticorpo- IFNcc construtores de proteina de fusão direcionado para não antigeno "e é depois aqui abreviado como o "ensaio fora do alvo." "Rituximab-HC-L6- IFNCC IgGl" refere-separa o quimérico anticorpo Rituximab direcionado para CD20, em que a cadeia leve (SEQ ID NO:276) é não é alterada, mas a cadeia pesada classe IgGl (SEQ ID NO:277) foi, ligado para seu terminal C, uma sequência de ligador de 6 aminoácidos’ ("L6;" SGGGGS, SEQ ID NO: 132), seguido pela sequência para IFNcc2b (SEQ ID NO:3); esta sequência IFNcc ligador de cadeia pesada é mostrada como SEQ ID NO:280. "Isotipo-HC-L6-IFNcc IgGl" refere-separa o anticorpo humanizado Palivizumab direcionado para RSV-, em que a cadeia leve (SEQ ID NO:290) é não é alterada, mas a cadeia pesada classe IgGl (SEQ ID NO:291) foi, ligado para seu terminal C, uma sequência de ligador de 6 aminoácidos ("L6;" SGGGGS, SEQ ID NO: 132), seguido pela sequência para IFNcc2b (SEQ ID NO:3); esta sequência IFNcc2b que liga a cadeia pesada é mostrada como SEQ ID NO:294. Este ensaio, IFNcc2b livre mostrou um EC$o para ativar expressão de gene através de um elemento de resposta de interferon (IRE) de 1,9 pM.Por ligação de IFNcc2b para Rituximab, teve 3,1 vezes (5,9/1,9 = 3.1) reduzida sua potência.Uma similar, redução modesta na potência foi observada quando IFNcc2b foi ligado para Palivizumab. Outra vez a linha de célula usada neste estudo não teve o antigeno correspondente para estes anticorpos em sua superficie de célula, demonstrando que ligação de um IgG para o Terminal N de IFNcc2b causou uma modesta (3-4 vezes) redução na atividade IFN direcionada a não antigeno. Isto é consistente com o que foi reportado por outros (por exemplo em US 7,456,257). Nem Palivizumab nem Rituximab sozinho (sem a fusão para um interferon) mostraram qualquer atividade neste ensaio (dados não mostrada).
Para determine se o anticorpo- IFN cc2b construtores de proteina de fusão aumentou atividade relativo ao IFNcc2b livre em células que apresentam o correspondente antigeno em sua superficie de célula, seu efeito em células Daudi, que apresenta o antigeno CD20 de Rituximab, mas que não apresenta o antigeno de proteina RSV F correspondente a Palivizumab, foi examinado. O ensaio usado neste caso, descrito acima como "Método para medir atividade de anticorpo- IFNcc construtores de proteina de fusão direcionado a antigeno" ou simplesmente o "ensaio no alvo (Daudi)," mede o efeito da substância de teste na viabilidade de células Daudi. Com estas células, o Rituximab-IFNcc2b construtor de proteina de fusão (Rituximab-HC-L6-IFNCC IgGl) foi 3,25 vezes (1,3/0,4 = 3,25) mais potente que IFNcc2b livre (Figura 7) . Em outras palavras, a ligação de Rituximab para IFNcc2b resultou em ligeiramente reduzida atividade (3,1 vezes) através de células de antigeno negativo (Figura 6) mas ligeiramente aumentada atividade (3,25 vezes) através células de antigeno positivo (Figura 7). Globalmente, o anticorpo ligado embora aumente o indice de especificidade do antigeno (ASI), definido como as vezes aumentadas da potência relativas ao IFNcc2b livre nas células de antigeno positivo multiplicado pelas vezes reduzidas da potência relativa ao IFNcc2b livre nas células de antigeno negativo, por 10 vezes (3,1 x 3,25) neste experimento. Uma repetição dos experimentos mediu um ASI de 14, como mostrado na Tabela 20, linha 2. O EC50 (ponto médio matemático da resposta da curva de dose) foi usado como uma medida de potência nos cálculos apresentados neste documento. Em outras palavras, quando o composto A mostrou um EC50 que é 10 vezes mais baixo que o composto B, foi dito para ter uma potência 10 vezes maior.
Os resultados apresentados na Figura 8 são consistentes com anticorpo baseada em alvo dependente da reatividade de antigeno de anticorpo: o Rituximab-IFNcc construtor de proteina de fusão (Rituximab-HC-L6-IFNcc- IgGl) foi 12 vezes (2,2/0,18 = 12) mais potente na redução de viabilidade das células Daudi CD20+que o Palivizumab- IFNcc construtor de proteina de fusão (Isotipo-HC-L6-IFNcc- IgGl), o antigeno para o qual mão está presente nas células Daudi.
A modesta redução na atividade de IFNcc que ocorre como um resultado da ligação para um anticorpo pode não ser suficiente para prevenir a toxicidade dos IFNcc componentes do construtor em individuos humanos. Várias mutações foram desta forma introduzidas no IFNcc2b de modo a reduzir sua atividade e toxicidade. Por exemplo, cinco versões de mutantes diferentes de IFNcc2b foram geradas se, em cada caso, liga para o terminal C da cadeia pesada de Rituximab via o ligador de 6 aminoácidos L6, que tem a sequência SGGGGS (SEQ ID NO: 132). Estes construtores foram comparados para o Rituximab tipo selvagem IFN construtor de proteina de fusão, Rituximab-HC-L6-IFNcc IgGl (como também usado nos experimentos mostrados nas Figuras 6-8). As cinco versões de mutante foram R144A, A145G, R33A+YNS, R33A e R144A+YNS. As sequências destes variantes são descrito abaixo. O grau esperado de redução de afinidade para os receptores tipo I de interferon baseada em anteriores caracterização para outros mutantes de IFN, e a quantidade de atenuação esperada na atividade de interferon, é mostrado nas Tabelas 6 e 7, acima.
As Figuras 9, 10 e Tabela 20 mostram o grau de redução de atividade de interferon para cada um destes Rituximab- atenuado IFNcc2b construtores de proteina de fusão relativo ao livre, tipo selvagem IFN 2b, em células de antigeno negativo (isto é, CD20-negativo). O mutante R144A da Rituximab-IFN 2b construtor de proteina de fusão (composto de SEQ ID NOS:282 (cadeia pesada) e 276 (cadeia leve)) mostrou 386 vezes de redução de atividade de interferon (2200/5,7 = 386). As versões A145G e R33A+YNS (composto da cadeia pesadas de SEQ ID NOS:284 e 286, respectivamente, cada uma das quais são combinada com a cadeia leve de SEQ ID NO:276) mostrou 491 vezes (2800/5,7 = 491) e 1,071 vezes (6100/5,7 = 1.071) de redução de atividade, respectivamente. A Figura 10 mostra o grau de redução de atividade de interferon para o R144A+YNS construtor de proteina de fusão (composto de SEQ ID NOS:288 (cadeia pesada) e 276 (cadeia leve)) para ser 303 vezes (1700/5,6 = 303) relativo ao Rituxumab construtor de proteina de fusão faltando às mutações IFN (Rituximab-HC-L6-IFNcc IgGl); uma vez que Rituximab-HC-L6-IFNCC IgGl é 3,8 vezes menos potente em células de antigeno negativo que livre, tipo selvagem IFNcc2b (dados da Figura 9; 22/5,7 = 3,8), isto significa que a versão R144A+YNS do construtor de proteina de fusão foi 1,150 vezes menos potente que o livre, tipo selvagem IFNcc (303 x 3,8 = 1,150). A versão R33A do construtor de proteina de fusão (composto de SEQ ID NOS:436 (cadeia pesada) e 276 (cadeia leve)) foi atenuado para um grau alto que é mostrado atividade não detectável no ensaio de não direcionado em ensaio de não alvo. Tabela 20
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selvagem IFNcc2b versão do Rituximab-IFNcc2b construtor de proteina de fusão (Figuras 11-12), e assim os mutados de interferons ainda possuindo habilidade para ativar o receptor IFN em células "não alvo" continua tendo uma habilidade amplamente reduzida para ativação nas células "fora do alvo". Por exemplo, as versões de R33A+YNS dos construtores foi só 2,2vezes (0,74/0,33 = 2,2) menos ativo que o Rituximab-IFNcc2b tipo selvagem construtor no antigeno de células positiva (Daudi).Isto foi em contraste para 277 vezes (6100/22 = 277; Figura 9) redução da atividade em células antigeno negativa.As mutações no IFNcc2b, no contexto do Rituximab-IFNcc2b construtor de proteina de fusão, causou uma substancialmente maior atenuação de atividade em "células antigeno negativa que células de antigeno positivo. Como um resultado, o Rituximab-HC-L6-IFNcc2b (R33A+YNS) IgGl construtor de proteina de fusão exibiu um substancialmente maior indice de especificidade de antigeno (ASI, 1,700-vezes) comparado para Rituximab-HC-L6-IFNcc2b IgGl (10 a 14 vezes) ou IFNcc2b livre (1 vez, por definição), sugerindo que seu efeito fora do alvo in vivo será substancialmente reduzido.
Outros construtores de Rituximab-IFN 2b com mutações na porção IFNcc2b também mostraram surpreendentemente menor redução de atividade em células de antigeno positivo (Figuras 11 e 12) relativo para suas reduzidas potência em células de antigeno negativo (Figuras 9 e 10). Com a exceção da versão R33A do construtor de proteina de fusão, discutido acima, a atenuação de mutações causou de 384 - 1.160 vezes redução na atividade de interferon relativo ao tipo selvagem IFNcc2b livre ’ em células de antigeno negativo, mas mostrou de 0,23 - 1,2 vezes da potência do tipo selvagem IFNcc2b em células de antigeno positivo. 0 mutado R33A de construtor de proteina de fusão, que teve atividade IFN não detectável na ausência de antigeno alvo de anticorpo, ainda mostrando significante atividade na presença de anticorpo alvo; a potência da versão R33A do construtor de proteina de fusão foi 1.620 vezes mais baixa que o mesmo construtor de proteina de fusão faltando esta atenuação de mutação no ensaio no alvo (340/0,21 = 1.620 vezes atenuação) . Isto é um contraste para pelo menos 100.000 vezes a atenuação causada pela mesma mutação na ausência de anticorpo baseada em alvo (Figura 10) . Estes resultados são sumarizados na Tabela 20.
Para determinar se esta dramática diferença na habilidade das mutações no componente Edna dos construtores de proteina de fusão para substancialmente reduzir sua atividade em células de antigeno negativo quando comparado para células de antigeno positivo pode ser estendida para outros construtores de proteina de fusão direcionando outros antigenos, antigeno CD 38 de mieloma múltipla direcionando anticorpos (SEQ ID NO: 131) foram fundido para ambos os tipos selvagem e formas atenuadas de IFNa e caracterizado. Alguns destes experimentos foram realizados usando o anticorpo G005 (De Weers et al. (Patente US 7829673)); as sequências das cadeias leves e pesadas para este anticorpo humano são mostradas como SEQ ID NOS: 135 e 134, respectivamente.
Em adição, vários novos anticorpos humano e camundongo contra CD38 foram produzidos,como descrito abaixo.
Desenvolvimento de Novos Anticorpos CD38 Formação de construtores CD38 por expressão
O dominio extracelular (ECD) de proteinas CD38 de humano e macacos cinomolgos foi cada formado para incluir uma sequência lider de N-terminal clivado, um Avitag™, uma etiqueta de poli histidina e um site de clivagem de trombina para render proteinas SEQID NO: 127 e 128 respectivamente. Estes foram transladado de volta na sequências de DNA e sintetizado de novo por montagem de sintético oligonucleotideos por métodos conhecido para estes experientes na matéria. Seguindo sintese de gene, os genes foram subclonado no vetor pTT5 (Durocher, Nucleic Acid Research volume 30, número 2, páginas El -9, 2002) para render construtores para produzir secretada forma solúvel destas proteinas via expressão de transiente em células HEK293E (Durocher, supra).
Construção de Vetores para Expressão de Anticorpo
Sequências de região variável de cadeia pesada e leve foram subclonada sem variantes do vetor pTT5 contendo uma região constante de cadeia pesada de IgGl humano (tais como protocolo de acesso Swiss número P01857 ), uma região constante de cadeia pesada de IgGl humano (tais como protocolo de acesso Swiss número P01861 incorporando substituição S228P), região constante de kappa humano (protocolo de acesso Swiss número P01834) ou região de lambda humana (protocolo de acesso Swiss número P0CG05) para render cadeias de anticorpo de comprimento inteiro.
Expressão de Transiente de Construtores em Células HEK293- 6E
Células HEK293-6E foram cultivadas em meio de crescimento completo de célula (meio 11 de F17 (Invitrogen™), 9 ml de Pluronic E68 (Invitrogen™), 2mM
Glutamina contendo 20% (p/v) Triptona NI (Organotechnie®) com Geneticina (50 mg/ml, Invitrogen™) a 50 μl/100 ml cultura). Um dia antes da transfecção, células foram colhidas por centrifugação e ressuspendidas em meio fresco (sem Geneticin) . No dia seguinte DNA foi misturado com um reagente de transfecção comercial e a mistura de transfecção de DNA acrescentada para a cultura à conta gota. A cultura foi incubada durante a noite a 37 °C com 5% CO2 e 120 rpm sem Geneticin. No próximo dia, 12,5 ml de Triptona foi acrescentado com 250 μl de Geneticina por 500 ml de cultura. A cultura foi incubada a 37 °C, 5% CO2 e 120 rpm.Depois de 7 dias, os supernadantes foram colhidos por centrifugação e foi pronto por purificação.
Expressão e Purificação de Anticorpos
Co-expressão de Transiente de cadeias pesadas e leves em células HEK293-6E (como descrito acima) gerou anticorpos que foram subsequentemente purificados por cromatografia de proteina A. Resumidamente, supernadantes derivados destas transfecções foram ajustados para pH 7,4 antes de serem carregados em uma coluna HiTrap Proteina A (5 ml, GE Healthcare) . A coluna foi lavada com 50 ml de lx PBS (pH 7,4). Elução foi realizada usando 0,1 M de ácido citrico pH 2,5.0 anticorpo eludido foi dessalinizado usando colunas de Zeba Dessalinizada (Pierce) em IX PBS (pH 7,4). Os anticorpos foram analisados usando SDS-PAGE. A concentração do anticorpo foi determinada usando o kit de ensaio BCA (Pierce).
Purificação de Proteinas direcionada por Histidina de Supernadantes de Tecido de Cultura
Cromatografia de afinidade de ion de metal imobilizado (IMAC) foi usado para purificar proteinas de dominio extracelular de humano e macacos cinomolgos (ED) de supernadantes de tecido de cultura. Simplificadamente, proteinas supernadantes foram diluidas no tampão de ligação (20 mN fosfato de sódio, 0,5 M NaCl, 30 mN imidazole, pH 7,4) antes de serem carregados na coluna HisTrap™ FF (1 ml, GE Healthcare) . A coluna foi lavada com 5 ml de tampão de ligação (pH 7,4) e elução foi realizada usando 20 mM de fosfato de sódio, 0,5 M NaCl, 500 mM imidazole, pH 7,4. As proteinas eludidas foram dessalinizadas e trocado o tampão usando unidade de filtro Amicon Ultra- 15 centrifuga com Ultracel-10 membrana (Millipore) em 1 X PBS (pH 7,4). A absorbância a 280 nm (A2go) da proteina foi assegurada usando um espectrofotômetro Nanodrop e leitura corrigida usando os coeficientes de extinção prevista para determinar concentrações de proteina.
Biotinilação de Antigenos para Apresentação de Fago
Os motifs Avitag™ de humano e macacos cinomolgos CD38 EDs foram biotinilatado de acordo com direções do fabricante (Avidity LLC, Aurora, CO). Excesso não conjugado de biotina foi removido das proteinas biotinilatada por dessalinização em lx PBS usando uma molécula 7KD peso de corte (MWCO) coluna de rotação Zeba (Thermo Scientific, Logan, UT) de acordo com instruções do fabricante. Bem sucedidas biotinilação de proteinas CD38 ED foi confirmada usando uma combinação de poliacrilamida gel eletroforese e Western blotting. Western blots foram sondadas usando Strep tavidin-HRP (BD Biosciences, San Diego, CA) e desenvolvido usando TMB (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO). Para cada antigeno, monomérico biotinilatado CD38 ED foi detectado.
Geração de anticorpos de Anti-CD38 por Exibição de Fago
FAbs que ligam para ambos humano e macacos cinomolgos CD38 EDs foram isolados de uma biblioteca de fagomides naive compreendendo aproximadamente 2,5 x 1011 individuais fragmentos de FAb humano. Métodos de geração de biblioteca de fragmento de anticorpo de fago são discutidos em "Phage display: A Practical Approach" (Eds. ClacksonandLowman; Oxford University Press, Oxford, UK) e "Antibody Phage Display Methods and Protocols" (Eds. O'BrienandAitken; Humana Press Inc, NJ 07512). Resumidamente, regiões variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpo foram amplificadas baseada em RNA de amostra doadora. Regiões variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpo foram então inserida sem vetores de fagomideo para gerar uma biblioteca de fragmentos de anticorpo fundido para uma proteina coberta de fago. A biblioteca de anticorpo usada neste documento boi uma biblioteca de fagomideo naive de alta diversidade que expressou fragmentos de anticorpo no formato Fab.
Anti-CD38 FAbs foram isolado da biblioteca de exibição de fago no cursos de duas "campanhas" de buscas (isto é, experimentos discretos de exibição de fago com diferentes reagentes ou condições de busca).O protocolo geral seguiu o método sublinhado por Marks et al. (Marks, J.D. & Bradbury, A., 2004, Métodos Mol Biol, 248, 161-76).
Cada campanha de exposição de fago envolveu três etapas de busca.Para cada etapa, aproximadamente 2,5 x 1012 partículas de fago foram bloqueadas por mistura de 1: 1 com tampão de bloqueio (4% leite magro em PBS, pH 7,4) e incubação por 1 hora a temperatura ambiente. A biblioteca de fago bloqueada foi então pré esvaziada por qualquer etiqueta de proteina biotinilatado de ligadores motif usado em busca através de incubação por 45 minutos com 50-200 pmols de um antigeno irrelevante contendo uma idêntica etiqueta de motif biotinilatado. Ligadores de Tag e estreptavidina foram capturados pela adição de um excesso (75-300M) de Dynabeads coberto de estreptavidina (Invitrogen), que foram bloqueadas como descrito para a biblioteca. As contas (incluindo ligadores de etiqueta e estreptavidina ligados para eles) foram imobilizadas usando um magneto e descartado.
Busca de biblioteca foi conduzida por mistura de biblioteca bloqueada e pré esgotada com 50-200 pmols de biotinilatado recombinante CD38 ED em um 2 ml tubo de micro centrifuga e rotacionado por 2 horas a temperatura ambiente. Então, 100\l de Dynabeads acoplada com estreptavidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram acrescentados e a mistura foi incubada por adicionais 15 minutos como descrito previamente. Fago não especificamente ligado foi removido usando uma série de lavagens.Cada lavagem envolveu retirada de contas complexas da solução na parede do tubo usando um rack magnético, aspiração dos supernadantes e então ressuspendendo as contas em tampão de lavagem fresco. Isto foi repetido múltiplas vezes com tampão de lavagem PBS (lx PBS com 0,5% leite magro) ou tampão de lavagem PBS-T (lx PBS suplementado com 0,05% TWEEN-20 [Sigma- Aldrich, St. Louis, MO] e 0,5% leite magro). Fagos que permaneceram ligados depois do processo de lavagem foram iludido complexo de contas biotinilatada CD38 ED por incubação com um excesso de vinte vezes de não biotinilatado CD38 ED por 1 hora a temperatura ambiente ou 0,5 ml de 100 mM trietilamina e (TEA) (Merck Chemicals, Darmstadt) por 20 minutos a temperatura ambiente. TEA- eludido de fago de saida foram neutralizados pela adição de 0,25 ml de 1 M Tris-HCl pH 7,4 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) .
No fim da primeiro e segunda etapa de busca, os fagos de saida foram acrescentados a 10 ml de cultura de crescimento exponencial TGI E. coli (2x levedura-triptona (2YT) meio de crescimento) e permitiu para infectaras células durante os 30 minutos de incubação a 37 °C sem agitação, então com agitação de 250 rpm por 30 minutos adicionais. Os fagomideos que codifica a saida de exposição de fago foram então separados como particulas de fago seguindo um protocolo padrão (Marks, J.D. & Bradbury, A., 2004, Métodos Mol Biol, 248, 161-76). No fim da terceira etapa de busca, células TGI foram infectadas com fago de saida e foram colocados em 2YT agar (suplementado com 2% de glicose e 100 μg/ml carbenicilina) a uma diluição suficiente para produzir discretas colônias de E. coli. Estas colônias foram usadas para inocular 1 ml de culturas liquida para permitir expressão de fragmentos FAb para uso em experimentos de seleção.
Seleção baseada em ELISA de FAbs por ligação de CD38
Cada colônia individual E. coli foi usada para expressar um FAb que pode ser selecionado por atividade de ligação CD38 ED. Colônias foram inoculadas em 1 ml de culturas de partida (suplementado com 100 μg/ml carbenicilina e 2% glicose) em 96-culturas de placas de cultura (Costar) e incubada durante a noite a 37 °C com agitação de 350 rpm (Innova R44 shaker; 1 inch orbit). Estas culturas de partida foram diluidas em 1: 100 em 1 ml de cultura de expressão (2YT suplementada com 100 μg/ml carbenicilina) e crescimento para uma densidade ótima de (600 nm) de 0,5-0,8. Expressão FAb foi induzida por adição de isopropil-beta-D-tiogalactopirano no site (IPTG) para uma concentração final de 1 mM. Culturas foram incubadas a 25°C por 16 horas.
Amostras de Ab foram preparadas por células colhidas por centrifugação (2.000g, 10 minutos) e realizada uma extração de lisozima.A pastilha de célula foi ressuspendida em 200 de tampão lisis (160 μg/ml lisozima, 10 μg/mL RNase A, 5 μg/ml DNase e inibidores de protease completo (Roche, Nutley, NJ)) e agitado a 400 rpm por 30 minutos a 21°C. Seguindo adição de um adicional 100 μl de tampão lisis, as reações foram incubadas por adicionais 30 minutos como descrito previamente. Lisados clarificados foram isolados seguindo centrifugação a 3.000g por 10 minutos e armazenado a 4 °C até ser requerido.
A seleção por ensaio de imuno sorbento ligando enzima (ELISA) para ligandos CD38 ED humano derivado da exposição de fago bio selecionado, dominio extracelular de CD38 humano (ED) (produzido em células HEK 293-6E e biotinilatado como descrito acima) foi capturado em placas de ELISA cobrindo estreptavidina (Nunc) a 1 μg/ml. As placas foram então lavadas e amostras individuais FAb (preparada como descrito acima) foram acrescentadas para culturas individuais em placas ELISA. FAbs foram permitidos para ligar o CD38 ED capturado por uma hora à temperatura ambiente e então lavado três vezes com PBS-T (IxPBS suplementado com 0,1% Tween®20) . FAbs que ligam para CD38 ED foram detectados por incubação por 30 minutos a temperatura ambiente com um anticorpo conjugado com anti- V5-HRP (Invitrogen, Carlsbad, CA) para detectara etiqueta V5 fundida para o terminal C da cadeia pesada FAb. Placas foram lavadas para remover anticorpo não ligado e o sinal de ensaio desenvolvido por incubação com 50 μl3,3',5,5'- Tetrametilbenzidina (Sigma-Adrich, St. Louis, MO) e extinta com 50 μl 1 M HC1. Sinais de ensaio foram lidos aA450 nm usando um microplaca de leitura (BMG Labtech). Os resultados foram expressos como um valor bruto de A450 nm, onde qualquer sinal 2 vezes maior que a media do piso do ensaio foi definido como 'positivo'.
Nos últimos ensaios FAb de reatividade cruzada com macacos cinomolgos CD38 ED foi assegurado por cobertura biotinilatada de macacos cinomolgos CD38 ED emplacas ELISA coberta com estreptavidina e procedendo como descrito acima. Plasmideos que codifica FAbs de reatividade cruzada com ambos humano e macacos cinomolgos CD38 ED foram isolados e sequenciados. Dos aproximadamente 1.000 FAbs selecionados por ligação para humano e macacos cinomolgos CD38 ED, seis FAbs únicos foram identificados geneticamente. A Tabela 21 apresenta o resumo dos dados das sequências FAb obtidas. As regiões variáveis de alguns destes anticorpos são mostrados na Figura 13. Tabela 21
Figure img0044
Todos os FAbs foram convertidos no formato IgGl por clonagem nos vetores pTT5 (descrito acima), expresso em
células HEK293-6E e um resultante IgGs purificado por cromatografia de afinidade de proteina A como descrito acima.
Avaliando ligação de IgGs para humano CD38 linha de célula positiva RPMI-8226
A habilidade de anticorpos derivado de fago para ligar o modelo CD38 linha de célula positiva humana de mieloma RPMI-8226 (obtida de Health Protection Agency Culture Collections, Porton Down, Salisbury, SP4 OJG, UK) em ensaios baseados em citometria de fluxo foi testada.Resumidamente, células RPMI-8226 viável (2 x 105, como julgado por exclusão de azul de tripano) foram incubadas com cada anticorpo ou com um anticorpo de controle de isotipo IgGi humano para preparação (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) a várias concentrações em 100 μl de tampão FACS (PBS plus 1% soro de cabra fetal, FCS) em 96 placas de cultura por 20 minutos em gelo no escuro. As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS depois incubadas por 20 minutos em 100 μl de tampão FACS contento anti-humano IgG de Coelho (Fc-especifico, conjugado para isotiocianatofluorescein, FITC; Sigma- Aldrich, St. Louis, MO). Depois lavado com tampão FACS, as células foram ressuspensas em tampão FACS e analisadas por ligação de anticorpo por citometria de fluxo em um FACS Canto (BD Biosciences, San Diego, CA) usando EV, dispersão lateral e FL-1 gating. Os resultados são expressos como intensidade fluorescente média (MFI) plotado contra concentração de proteina (Figura 14).
Geração de Anticorpos de Anti-CD38 por Imunização Genética
Anticorpos Monoclonais contra CD38 ED humano foram gerados por imunização genética com correspondente proteina convencional de imunização de camundongos. Por imunização genética, a sequência de DNA de humano CD38 ED é provida na SEQ ID NO: 129. A correspondente conceitualmente transladada sequência é dada na SEQ ID NO: 130. A sequência de DNA de SEQ ID NO: 129 foi clonada em um plasmideo por imunização genética usando tecnologia de restrição de enzima. Expressão do plasmideo resultante permitiu a secreção de solúvel CD38 ED alvo por um epitope c-myc no terminal N ou C. O epitope c-myc foi utilizado para confirmar expressão de CD38 ED.
Os Ratos foram então imunizados seis vezes com plasmideo usando um gene Helios gum (Bio-Rad, Germany) de acordo com a publicação de procedimento (Kilpatrick et ah, Hybridoma 17: 569^576, 1998). Uma semana depois da última aplicação da imunização de plasmideo, cada camundongo foi impulsionado por injeção intradermal de não alvo recombinante humano CD38 ED. Não alvo humano CD38 ED para este propósito foi produzido por remoção da etiqueta da proteina da SEQ ID NO: 127 por clivagem de trombina seguido por coluna de purificação por exclusão de tamanho.
Quatro dias depois, os camundongos foram sacrificados e seus linfocitos fundido com células de mieloma usando polietilenoglicol (HybriMax™; Sigma- Aldrich, Germany), semeada 100.000 células por cultura em placas microtiter de 96 cultura e cresceram em meio DMEM suplementado com 10% soro bovino fetal e aditivo HAT por seleção de hibridoma (Kilpatrick et al., 1998, supra).
Supernadantes selecionado por seleção de hibridoma para humano e macaco cinomolgos CD-38 de reatividade cruzada
Amostra duplicada de 100 μl de cada supernadante de hibridoma foi coberto com culturas separadas de uma placa
ELISA maxisorp (Nunc Plasticware, Thermo Scientific, Rochester, NY 14625, USA) através de incubação na temperatura ambiente por uma hora. As placas foram lavadas três vezes em IxPBS-T e subsequentemente bloqueadas por adição de 2%BSA/lxPBS. Seguindo incubação por 1 hora a temperatura ambiente, as placas foram lavadas como descrito previamente. Para uma cultura de cada anticorpo de camundongo a cultura duplicada foi acrescentado 0,lug de biotinilatado CD38 humano em um volume final de 100 μl IxPBS. Para uma segunda cultura de cada anticorpo de camundongo duplicata foi acrescentado 0,lug de biotinilatado de macaco cinomolgos CD38 ED em um volume final de 100 μl IxPBS. Placas de cultura foram lavadas como descrito previamente antes da detecção de ligação biotinilatada CD38 ED usando um conjugado Streptavidin-HRP (BD Biosciences, San Diego, CA) . As placas foram lavadas como acima para remover não ligados de Streptavidin-HRP conjugado e o sinal de ensaio desenvolvido por incubação com 50μl3,3',5,5'-Tetrametilbenzidine (Sigma- Aldrich) e extinto com 50μl 1 M HC1. Sinais de ensaio foram lidos a A450 nm usando uma microplaca de leitura (BMG Labtech, Cary, NC). Das 15 supernadantes de hibridoma testado, todas as quinze ligações de CD38 ED humano e sete ligações de macaco cinomolgos CD38 ED (Tabela 22) como determinado por ELISA. Os anticorpos de reativação cruzada são referidos como R5D1, R7F11, R5E8, R10A2, R10B10, R3A6 e R7H11.
Citometria de fluxo ligando anticorpos de camundongo CD38 linha de célula RPMI-8226 positiva humana
Células RPMI-8226 viável (2 x 105, como julgado por exclusão de azul de tripano) foram incubadas com 100\l de supernadante de hibridoma de camundongo por 20 minutos em gelo no escuro. As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS (lx PBS plus 1% FCS) antes da incubação por 20 minutos em 100 μl de tampão FACS contendo anti-rato IgG- FITC conjugado (Sigma-Aldrich) . Depois das células lavadas 5 em tampão FACS, elas foram ressuspensas em tampão FACS e analisadas por anticorpo ligado por citometria de fluxo em um FACS Canto (BD Biosciences, San Diego, CA) usando EV, dispersão lateral e FL-1 gating. Os Resultados foram expressos como intensidade fluorescente média (MFI). Dos 15 10 anticorpos de camundongos exibindo ligação positiva para CD38 ED humano por ELISA, os cinco picos mostrados ou ligações para CD38 expressou uma linha de célula de mieloma humano RPMI-8226 por FACS (Tabela 22). Tabela 22
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Ligação de FACS background MFI médio foi 153 Caracterização Molecular de Anticorpos de Camundongo
Seis anticorpos hibridomas de camundongo - R5D1, R7F11, R5E8, R10A2, R10B10 e R7H11 - foram selecionados por caracterização molecular. Extração de RNA de pastilhas de células de hibridoma de cada clone foi realizado usando reagente TRI (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) de acordo com direções do fabricante. As regiões variáveis de cada anticorpo foram amplificadas usando Amplificação Rápida de cDNA Ends (RACE) transcrição reversa de reação de cadeia de polimerase (RT-PCR) metodologia de acordo com direções do fabricante (Clontech [Mountain View, CA] SMART RACE kit; Ambion Life Technologies [Foster City, CA] RLM-RACE kit). Especifico gene reverso de PCR iniciadores para amplificar o dominio da região variável da cadeia pesada de camundongo por 5 '-RACE foram designados para as sequências disponíveis de região constante de cadeia pesada de camundongo. Similarmente, especifico gene reverso PCR imiciadores para amplificar cadeia leve, os ratos foram designada para emparelhar as sequências de região constante sequências da cadeia kappa de camundongo enquanto adicionalmente iniciadores foram designados para emparelhar para sequências de região constante cadeia lambda. O 5'-RACE PCR foi realizado de acordo com direções do fabricante (Life Technologies; Clontech) usando PfuUltrall polimerase (Agilent). Seguindo 5 '-RACE PCR, produtos foram separados por agarose gel electroforese e bandas de aproximadamente tamanho predito baseado na locação do iniciador reverso na região constante foram extirpados do gel. DNA foi purificado de porções de agarose gel usando um kit de extração Qiaquick spin gel (Qiagen) de acordo com instruções do fabricante. Inserção de DNA foi clonado e propagado em E.coli usando a StrataClone Blunt PCR Cloning Kit (Agilent, Santa Clara, CA) de acordo com instruções do fabricante. Colônias simples de transformações foram cultivadas e DNA plasmideo preparado usando um kit GenElute™ plasmid miniprep (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Inserção de DNA foram sequenciadas e regiões variáveis de anticorpo identificadas na conceitualmente transladada sequências de proteina.
Vetores foram construídos usando as sequências de região variável de anticorpo de rato enxertado em sequências da região variável constante de IgGl humano para a cadeia pesada, humano kappa ou lambda backbones (mantendo a mesmo cadeia leve isotipo como no anticorpos de rato). As resultantes sequências de região variável de cada clone são listadas na Tabela 23. Subsequente co-expressão da correspondente cadeia pesada e leve de células HEK293-6E, no contexto dos vetores pTT5, foi seguido por purificação da proteina A do resultante IgGs como descrito acima. Tabela 23
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Afinidade de anticorpos anti-CD38 por humano e macacos cinomolgos CD38
As afinidades de ligação de anticorpos selecionados produzido contra humano e macacos cinomolgos CD38 foram medidos.Resumidamente, usando um Biacore T200, Proteina A foi imobilizada em Célula de Fluxo (FC) 1 (FC1) e FC2 (ou alternativamente FC3 e FC4) de uma grade de chip sensor CM5 pesquisado usando acoplada amina, deu aproximadamente 2000 RU. FC1 foi usado como um inexpressivo durante os experimentos. Os experimentos foram corrido em tampão HBSe P20. A uma razão de fluxo de 20 μl/min, 20 μl de 5 μg/ml de anticorpo foi passada por FC2. CD38 ED Humano ou separadamente, macacos cinomolgos CD38 ED foi passado sobre a- superficie de FC1 e FC2 a um intervalo de concentrações de 25 nM a 200 nM. Regeneração da superficie foi realizada usando lOmM Glicina, pH 1,0.Os dados do sensorgrama FC1 foi subtraído de FCS e as curvas foram ajustadas usando um 1:1 equação Langmuir para gerar os valores kd, ka e KD. Estes dados mostram quere atividade cruzada para humano e macaco cinomolgos CD38 é mantida na conversão do derivado fago Fabs humano em IgGs humano e anticorpos de camundongo no quimérico camundongo-IgGs humano (Tabela 24). Tabela 24
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Construtores de proteina de fusão IFN atenuando Anti-CD38
Para determinar se o surpreendente resultante obtido com um anticorpo anti-CD20 fundido para um atenuado IFNcc pode ser replicado com outros anticorpos, e em particular anticorpos direcionado para um antigeno não relatado para CD20, construtores de proteina de fusão compreende um anticorpo G005 IgGL kappa anti-C D38 completo humano (composto de SEQ ID NOS: 135 (cadeia pesada) e 134 (cadeia leve)) e IFNcc (SEQ ID NO: 3), com ou sem várias atenuação de mutações foi feita. A Figura 15 mostra os resultados do "ensaio fora do alvo" (como descrito acima) usando o kit iLite. Por causa do fraco CD38 o sinal foi observado na linha de célula iLite por citometria de fluxo (não mostrada) , o antigeno CD38 foi bloqueado pela adição de excesso de naked (exemplos em IFN ou IFN variantes fundido para isto) anticorpo anti-CD38 para todos os experimentos iLite usando construtores de proteina de fusão anti-CD38- IFN; em cada caso, a concentração de naked CD38 bloqueando anticorpo usado foi 0,5 mg/ml. Também em cada caso, o mesmo anticorpo clone sendo ensaiado como um IFN ou IFN- variante de construtor de proteina de fusão foi usado para bloquear qualquer interação com CD38. A Figura 15 mostra a atividade fora do alvo do tipo selvagem IFNcc2b livre (IFNcc) (SEQ ID NO:3) versus tipo selvagem IFNcc2b fundido para o terminal C do CD38 anticorpo G005 (De Weers et al. (Patente US 7829673). O último construtor de proteina de fusão (G005-HC-L0-IFNCC IgG4) foi de IgG4: kappa isotipo e não teve interveniente ligador entre o terminal C da cadeia pesada e o primeiro residue do IFNcc e é descrito pela SEQ ID NOS: 150 (cadeia pesada) e 134 (cadeia leve). Como ilustrado na figure 15, o anticorpo anti CD38 não atenuado IFNa2b construtor de proteina de fusão foi 27 vezes menos potente (19,5/0,726 = 27) que o IPN 2β livre no ensaio fora do alvo (exemplo na ausência de CD38-t alvo). A Figura 16 mostra uma comparação entre os mesmos dois construtores no "ensaio no alvo (ARP1)", em que o anticorpo anti-CD38 foi permitido para ligar para CD38, que foi expresso a niveis alto na linha de célula ARP-1. O G005-HC-L0-IFNCC IgG4 construtor de proteina de fusão foi 3,6 vezes (14,7/4,08 = 3,6) mais potente que IFNcc2b livre, presumidamente devido à entrega do alvo do IFN para as células de mieloma CD38+. Além disso, o G005-HC-L0-IFNCC IgG4 construtor de proteina de fusão foi um antigeno especificamente indexado (ASI) de 97 (27 x 3,6 = 97; Tabela 25). Tabela 25
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De modo a determinar se o ASI pode ser aumentado, como foi observada para os construtores de proteina de fusão anti-CD20-IFNcc, vários variarttes foram construídos pela atenuação da Porção IFN do construtor de proteina de fusão anti-CD38-IFNcc por mutação. Numerosos diferentes atenuações de mutações foram feita no contexto do G005 ou outros anticorpos CD38 monoclonal. Em adição, construtores de diferentes IgG exóticos (IgGl e IgG4) e ligadores de comprimento (LO, não ligador; L6, 6 ligador de aminoácido (SGGGGS, SEQ ID NO: 132)) foram feito. O ensaio fora do alvo e dois tipos de ensaios no alvo (usando Daudi e ARP- 1), ambos descrito em detalhe acima, foram corrido e os resultados são mostrados nas Figuras 17-38 e tabulados nas Tabelas 25-33. A discussão abaixo sumariza estes resultados com referências aos dados nestas tabelas (todos dos quais são derivados das Figuras 17-38). A Tabela 26 caracteriza o CD38 anticorpo G005, fundido em vários configurações via o terminal C da cadeia pesada para IFNa com a R144A atenuação de mutação. Exemplos nestas tabela são de IgGl e IgG4 isotipo e não tem ligação entre a cadeia pesada de anticorpo e o IFN, LO, ou tem um interveniente ligador de 6 aminoácido, L6 (composto da SEQ ID NOS: 138,140,152,146 (cadeia pesada) cada uma combinada com 134 (cadeia leve)). Em todos os casos, os construtores 5 de proteina de fusão tiveram dramaticamente reduzida a potência nas células iLite do antigeno negativo (a redução de 8.300 a 100.000 vezes comparado para IFNa livre), mas substancialmente manteve a potência exibida para IFNa livre nos CD38 de células positivas (Daudi). O G005-HC-L0-IFNa 10 (R144A) IgG4 construtor (composto da SEQ ID NOS: 152 (cadeia pesada) e 134 (cadeia leve)), por exemplo, tem 105 vezes menor potência gue o livre, tipo selvagem IFNa no antigeno de células negativa versus livre, tipo selvagem IFNa nas células de antigeno positivo (Tabela 26). Isto deu 15 índice de Especificidade de Antigeno (ASI) de 29.000 para estes construtores de proteina de fusão. Tabela 26
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A Tabela 27 mostra exemplos usando um outro IFNa atenuando mutação, A145G,como um construtor com o mesmo anticorpo G005 no IgGl ou IgG4 isotipos, sem ligador ou 5 ligador L6 (composto da SEQ ID NOS: 142, 144, 148 (cadeia pesada) cada um combinado com SEQ ID 134 (cadeia leve)). 0 G005-HC-L6-IFNa (A145G) IgG4 construtor (composto da SEQ ID NOS: 148 (cadeia pesada) e 134 (cadeia leve)), por exemplo, mostrou um ASI de 20.000. Tabela 27
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A Tabela 28 mostra exemplos em que o mutado IFNcc é ligado para a cadeia leve tanto quanto a cadeia pesada, com não interveniente ligador ou o ligador L6 (composto de SEQ 5 ID NOS:210 ou 208 (cadeia leve), respectivamente, cada um combinado com SEQ ID NO: 135 (cadeia pesada)). Em ambos os casos, os construtores de proteina de fusão demonstraram um alto ASI de 5.900 e 7.200, respectivamente. Tabela 28
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As Tabelas 29 e 30 demonstram o ASI para os mesmos construtores de proteina de fusão, mas usou uma alternativa linha de célula (ARP-1, uma mieloma) para determinar a 5 atividade em células CD38+, Usando este método, o ASIs para estes construtores de proteina de fusão ficaram no intervalo de 1.200-55.000. Tabela 29
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Tabela 30
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Numerosos outro exemplos de versões mutadas de IFNcc, no contexto do G005-HC-L0-IFNCC IgG4 construtor de proteina de fusão são agrupados na Tabela 25. A maioria destes mutantes (R144 mutado para A, S, E, G, H, N, Q, T, Y, I, L ou V (composto da SEQ ID NOS: 152, 172, 156, 158, 160, 168, 170, 174, 178, 162, 166, 176 (cadeia pesada), respectivamente, cada um combinado com SEQ ID NO: 134 (cadeia leve) ) e A145 mutado para G, D, H, I, K, L, N, Q, R 10 ou Y (SEQ ID NOS: 184, 180, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 206 (cadeia pesada), respectivamente, cada um combinado com SEQ ID NO: 134 (cadeia leve) ) mostrando significante atenuação de atividade de IFNcc comparado para o tipo selvagem IFNcc livre. Neste contesto, o A 145 V e A145S mutantes não mostraram apreciável atenuação. Qualquer destes ponto de mutação, atenuando versões de IFNcc pode ser usado no contexto da presente invenção como anticorpos construtores de proteina de fusão. Certas IFN variantes podem ser preferidos devido ao mostrado alto ASIs.Outras considerações, tal como nivel de expressão, imunogenicidade, características biofísicas, etc., podem também ser consideradas na evolução de construtores para ótima utilidade. Dos numerosos IFNcc variantes descritos neste documento, estes mostrado para rende rum alto ASI no contexto de um construtor dede proteina de fusão de anticorpo incluem R144A, R144S, R144T, R144Y, R144I, R144L, R145G, R145D, R145H, R145Y (Tabela- 25), R33A+YNS (como ilustrado no construtor compreendendo SEQ ID NOS:286 (cadeia pesada) e 276 (cadeia leve)), R33A (como ilustrado no construtor compreende SEQ ID NOS:436 (cadeia pesada) e 276 (cadeia leve)) e R144A+YNS (tais como as ilustrado no construtor compreende SEQ ID NOS:288 (cadeia pesada) e 276 (cadeia leve)).
A mutação de A145D no construtor da SEQ ID NOS: 180 (cadeia pesada) e 134 (cadeia leve) comparado para o A145E mutação no construtor de SEQ ID NO: 182 (cadeia pesada) e 134 (cadeia leve) produziu resultado não esperado. Embora ambos construtores tenham similar sequências de aminoácido, diferenciados só por um grupo simples demetilen, eles mostraram efeitos dramaticamente diferentes na atividade de não alvo do IFNcc. A A145E mutação teve minimo impacto na atividade IFNcc, embora, a A145D mutação drasticamente reduziu a atividade (por 20.000 vezes) 'e resultou em um construtor com alto ASI (9,840).
Outros exemplos de anticorpos construtores de proteina de fusão de anti-CD38 atenuando IFNa são mostrados nas Tabelas 31-33. Em adição para o G005 anticorpo construtores, estas tabelas a atividade no alvo, atividade fora do alvo, e o ASI para os IFNa construtores de proteína de fusão atenuando anticorpo anti-CD38 baseado em certos novos anticorpos. Construtores de proteína de fusão destes anticorpos com o IFNa A145D ou R144A mutações incluem os seguintes: X910/12-HC-L0 IFNa (A145D) IgG4 composto de SEQ ID NOS:248 (cadeia pesada) e SEQ ID NO:242 (cadeia leve) X910/12-HC-L0 IFNa (R144A) IgG4 composto de SEQ ID NOS:246 (cadeia pesada) e SEQ ID NO:242 (cadeia leve) X913/15-HC-L0 IFNa (A145D) IgG4 composto de SEQ ID - NOS:256 (cadeia pesada) e SEQ ID NO:250 (cadeia leve)); X913/15-HC-L0 IFNa (R144A) IgG4 composto de SEQ ID NOS: 254 (cadeia pesada) e SEQ ID NO:250 (cadeia leve)) X355/02-HC-L0 IFNa (A145D) IgG4 composto de SEQ ID NOS:232 (cadeia pesada) e SEQ ID NO:226 (cadeia leve); X355/02-HC-L0 IFNa (R144A) IgG4 composto de SEQ ID NOS:230 e SEQ ID NO:226 (cadeia leve); X355/07-HC-L0 IFNa (A145D) IgG4 composto de SEQ ID NOS:240 (cadeia pesada) e SEQ ID NO:234 (cadeia leve); X355/07-HC-L0 IFNa (R144A) IgG4 composto de SEQ ID NOS:238 e SEQ ID NO:234 (cadeia leve); R5D1-HC-L0 IFNa (A145D) IgG4 composto de SEQ ID NOS:262 (cadeia pesada) e 258 (cadeia leve); R5E8-HC-L0 IFNa (A145D) IgG4 composto de SEQ ID NOS:268 (cadeia pesada) e 264 (cadeia leve); e R10A2-HC-L0 IFNa (A145D) IgG4 composto de SEQ ID NOS:274 (cadeia pesada) e 270 (cadeia leve).
Estes construtores de proteína de fusão todos mostraram alto ASIs, no intervalo de 3.820 (X910/12-HC-L0- IFNCC (R144A) IgG4) a 166.000 (X355/02-HC-L0-IFNCC (A145D) IgG4). Tabela 31
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Tabela 32
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Tabela 33
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Os exemplos abaixo demostram que mutados, atenuando formas de IFNa, ligados para anticorpos com alvo em CD20 (SEQ ID NO:430) ou CD38 (SEQ ID No:131), mostram ordens de 5 magnitudes de potência mais alta na sinalização de IFN nas células alvo de antigeno positivo que nas células de antigeno negativo fora do alvo. Os resultados abaixo fornecem também exemplos usando anticorpos que tem com alvo o atenuado IFNa para dois outros antigenos:CD138 e MHC 10 classe I.
O CD 138 (SEQ ID NO:432), também chamado Syndecan-1, é um sulfato de heparina proteoglican que é conhecido pela função como uma molécula de adesão. É expresso em muitas células de mieloma múltipla (Dhodapkar, Blood; 91: 2679, 15 1998). Construtores de proteina de fusão consistem de mutado, atenuado IFNa e o CD138-alvo anticorpo nBT062 (Ikeda, Clin Can Res., 15:4028, 2009; USPTO #20090175863, composto de SEQ ID NOS:330 (cadeia pesada) e 326 (cadeia leve)) foram gerados. Como mostrado na Figura 39, estes construtores de proteina de fusão, como o anti-CD38- atenuado IFNa construtores de proteina de fusão, mostrou muito maior potência anti-proliferativa em células de mieloma múltipla (ARP-1, ensaio no alvo) com um não alvo, isotipo de proteina de fusão (baseado no anticorpo 2D12). Figura 39 mostra que a concentração de 28pM (4thmaior concentração testada) de nBT062-HC-L0-IFNa (A145D) mostra maior atividade anti proliferativa na linha de célula ARP-1 de mieloma que 6 nM (maior concentração testada) do isotipo-HC-LO-IFNa (A145D) proteina.
Um outro antigeno que foi descrito como um potencial alvo para anticorpo- de terapia para tratar câncer é a Classe I MHC (ver por exemplo Stein, Leuk. Lymphhoma 52 (2) : 273-84, 2011). De modo a determinar se foi possivel aplicara presente invenção em relação a estes alvo, anticorpo W6/32 (Barnstabela et al. (1978), Cell 14:9-20), foi obtido por ATCC (HB95). Este anticorpo reage com monomorficos determinantes em humano HLA moléculas A,B,C. As regiões variáveis de anticorpo foram clonadas e sequenciadas usando SMART RACE cDNA kit de amplificação (Clontech, Mountain View, CA) e Rato Ig-Primer Sets (Novagen/EMD Chemicals, San Diego, CA) . As sequências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve são mostradas como SEQ ID NOS: 411 e 410, respectivamente. A versão quimérica de HB95, com as regiões variáveis de murinho e região constantes IgG4 kappa humano, fundido para IFNa com a A145D mutação (HB95-HC-L0-IFNa (A145D) IgG4, composto dé SEQ ID NOS:316 (cadeia pesada) e 312 (cadeia leve)) foi expressa, e sua atividade foi comparada para um isotipo de controle de anticorpo fundido no mesmo modo para o mesmo IFNa mutante (Isotipo-HC-LO- IFNcc (A145D) IgG4, onde as regiões variáveis de isotipo foram derivadas de anticorpo 2D 12). O "ensaio no alvo (ARP-1)" foi corrido como descrito acima para o CD38- anticorpos alvo (ARP-1 é classe I MHC-positiva). Os resultados são mostrados na Figura 40a. A classe I MHC- direcionando atenuado IFNa tem ordens de magnitude mais potente que o isotipo controle-atenuado IFNa construtor de proteina de fusão na mesma células, dentro de cerca de 9 vezes (139/16 = 8,7) do tipo selvagem IFNa. Enquanto HB95- HC-LO-IFNa (A145D) IgG4 mostra significante atividade abaixo 100 pM, o isotipo-HC-LO-IFNa (A145D) _IgG4 mostra não significante atividade em 6 nM.
A Figura 40b demonstra que fragmentos de anticorpo podem ser substituído por anticorpos de comprimento inteiro fornece similar propriedades, denominado ASIs alto. Estas figuras mostram os efeitos de vários construtores de proteina de fusão Fab atenuando IFNa na proliferação de células ARP-1. Dois construtores não ARP-1 direcionado a construtores, "Palivizumab-HC-L6-IFNa (A145D) Fab" (composto de SEQ ID NOS:298 (cadeia pesada) e 290 (cadeia leve)) e "2D12-HC-L6-IFNa (A145D) Fab" (composto de SEQ ID NOS:356 (cadeia pesada) e 344 (cadeia leve)), mostra potência muito baixa nesta linha de célula (EC50's de 2,410-17,000). Por contraste, quando a porção Fab do construtor de proteina de fusão não é alvo da superficie de antigeno de célula, neste caso classe I MHC, como para o construtor de proteina de fusão "HB95-HC-L6-rFNa (A145D) Fab" (composto de SEQ ID NOS: 320 (cadeia pesada) e 312 (cadeia leve)), a potência é ainda menor que livre, tipo selvagem IFNa. O atenuado construtor direcionado para antigeno é 2.760-19.450vezes mais potente que o atenuado construtores não direcionado.
Atividade Antiviral do alvo, atenuado IFNa
A atividade de anti-viral IFNa é bem conhecida e recombinante IFNa é um tratamento aprovado pelo FDA infecções viral de hepatite C. 0 efeito de um hospedeiro de superficie de célula alvo versus anticorpo não alvo atenuando IFNa construtor de proteina de fusão na atividade citopática do virus EMC em células A54 9, que são MHC positivo classe I, foi comparado.
Métodos:
Atividade IFN foi medida usando o efeito citopática de inibição (CPE) ensaio como descrito por Rubinstein (J. Virol. 37, 755-8, 1981). Resumidamente, 104 células de adeno carcinoma humano A549 (ATCC, Manassas, Kansas) por cultura foram incubadas com amostra de teste ou IFN (humano IFN-CC2A) durante a noite. Células foram então desafiadas com virus EMC por 48-56 horas, seguido por mancha com cristal violeta. Um determinação visual CPE foi realizada, seguido por solubilização do cristal violeta e absorbância medida a 570 nm. Analise de regressão não linear foi realizada usando um 4 parâmetros senoidais ajustado com á inclinação variável (GraphPad Prism). Uma unidade de atividade IFNa é definida como a quantidade de interferon requerido para reduzir o efeito citopática por 50%. As unidades são determinadas com relação ao padrão de referência internacional para IFNcc humano 2, fornecido pelo National Institutes de Health (ver Pestka, S. "Interferon Standards and General Abbreviations," in Métodos in Enzymology (S. Pestka, ed.), Academic Press, New York vol 119, pp. 14-23, 1986). As amostras testadas neste ensaio foram IFNa (Intron A, inverted triangles), Anti-MHC classe I alvo atenuado IFNa designado HB95-HC-L0-IFNa (R145D) IgG4 (quadrado fechado), e isto é controle (2D12)- atenuado IFNa (Isotipo-HC-LO-IFNa (R145D) IgG4; triangles). Os dados é plotado como viabilidade versus equivalentes molar de IFNa.
Resultados:
Os Resultados são mostrado na Figura 41. Neste ensaio, IFNa protetor de células A549 de célula citopática morta induzida viralmente (CPE) como esperado, mostrou um EC50 de 0,18 pM. Introduzindo a R145D mutação para o IFNa (e ligando para um anticorpo que não liga para as células A549) reduz sua potência anti-viral por 108.000 vezes (19.461/0,18 = 108.167). Por contraste, pela ligação do mesmo mutante IFN para um A549 anticorp oalvo (HB95), a potência é aumentada por aproximadamente 17.000 vezes (19.461/1.15 = 16.923). Isto corresponde a um ASI de 16.900 (19.461/1.15 = 16,.922).
IFN atenuado Alvo
O IFN também foi mostrado nas numerosas publicações (ver acima) para ter anti atividade proliferativa em vários tipos de células de câncer. Um construtor de proteina de fusão entre um anticorpo anti-CD38 (G005) e IFN (SEQ ID NO:91), G005-HC-L0-IFN IgG4 (composto de SEQ ID NOS:212 (cadeia pesada) e 134 (cadeia leve)) tento quanto um idêntico construtor mas conduzindo um ponto de mutação simples (R35A), conhecido para reduzir IPNβ potência (Runkel et al. J. Biol. Chem. 273:8003-8 (1998), composto de SEQ ID NOS:214 (cadeia pesada) e 134 (cadeia leve)) foi portanto feito. Em ambos construtores, a cisteina não emparelhada na posição 17 de IENβ foi mutada para uma serina deu um melhorar rendimento de expressão e homogeneidade de produto. Figura 42 mostra a atividade destas três proteinas sob condições onde não existe alvo assistindo de anticorpo ("ensaio fora do alvo" usando kit iLite). Neste ensaio, a ligação de um IgG no Terminal N de IENβ atenua sua potência por 72 vezes (57,6/0,799 = 72). Por fazer a R35A mutação neste construtor de proteina de fusão, sua potência é adicionalmente reduzida por 280 vezes (16.100/57,6 = 280) assim isto é 20.150 vezes (16.100/0,799 =20.150) menos potente que o livre, tipo selvagem IFN. Em forte contraste, a Figura 43 mostra a potência destas três proteinas sob condições em que o anticorpo CD38 pode ser alvo de IPNβ para células é bastante similar. Neste ensaio, o construtor de proteina de fusão IFN atenuando anticorpo- (G005-HC-L0-IFN (R35A) IgG4) só é 1,4 vezes (46,9/32,7 = 1,4) menos potente que o construtor de proteina de fusão não atenuando anticorpo IPNβ e só 4,5 vezes (46,9/10,5 = 4,5) menos potente que o livre, tipo selvagem IENβ. Este dado é sumarizado na Tabela 34. Isto demonstra que a surpreendente conclusão que atenuações d mutações em um interferon que é parte de um IFN construtor de proteina de fusão de anticorpo pode desproporcionalmente afetar não alvo versus células alvo, como observado pelo IFNa (Tabela 20),também mantendo verdade para IPNβ. No presente exemplo do construtores de proteina de fusão anti-CD38-IFA, a atenuação da mutação reduziu a potência só por 1,4 vezes sob condições quando o anticorpo pode direcionar o IFN para as células alvo, versus 280 vezes para células em que o construtor de proteina de fusão pode não ser alvo do antígeno de superfície de célula. Como um resultado, o IPNβ construtor de proteína de fusão atenuando anticorpo no presente exemplo mostra um ASI de 4.630 (Tabela 34). A R147A mutação em IPNβ, como uma alternativa para o R35A 5 mutação, foi também encontrada para produzir IPNβ construtores de proteína de fusão de anticorpo com um significantemente maior ASI que IPNβ livre (dado não mostrado). Os exemplos abaixo mostram que esta "atenuação seletiva" pode também ser observada com ligandos que são 10 estruturalmente não relatado para IFNa e β, denominado para IL-4 e IL-6. Tabela 34
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Interleucina-4 (IL-4)
O IL-4 é uma citocina de feixe de hélice com múltiplasatividades fisiológicas, incluindo a habilidade de influenciar célula T helper e o desenvolvimento para Th2 e mais afastado Thl. Uma vez que célula Thl desempenha um papel patológico em certos grupos autoimune, pode ser terapeuticamente vantajoso IL-4 para influenciar desenvolvimento de células T helper e mais afastado Thl, isto é para criar um "desvio Thl." Para evitar efeitos colaterais relacionado com atividade IL-4's em outras células tipos, será vantajoso para atenuar atividade IL-4's 5 por mutação, e então ligar para um anticorpo que direcionará para ativadas (preferencialmente recentemente ativada) Células T helper. 0 anticorpo escolhido par este propósito foi J1 10, um anti-humano PD-1 de rato clonado escrito por Iwai et.al. (Imunol Lett. 83:215-20, 2002). PD- 10 1 (SEQ ID NO:431) é expresso nas recentemente ativadas células ThO.
O anticorpo J1 10 (regiões variáveis de murino e região constantes IgGL kappa de humano; as sequências de regiões variáveis de cadeia pesada e leve de aminoácido de 15 J 110 são mostradas como SEQ ID NOS: 409 e 408, respectivamente) foi fundida para IL-4 humano (SEQ ID NO:1 19) , a última sendo ligada para o terminal C da cadeia pesadas com uma interveniência de seis ligador de amido ácido, L6 (SGGGGS, SEQ ID NO: 132). Em adição para esta 20 proteina J110-HC-L6-IL4 IgGl (composto de SEQ ID NOS:304 (cadeia pesada) e 300 (cadeia leve)), uma variante desta com um substituição simples no componente IL-4, J1 10-HC- L6-IL-4 (R88Q) IgGl (composto de SEQ ID NOS:306 (cadeia pesada) e 300 (cadeia leve)) foi feita. A R88Q mutação em 25 IL-4 foi reportada para reduzir sua potência in vitro (Kruse, EMBO Journal vol.12 no.13 pp.5121 -5129, 1993).
Métodos:
O "ensaio fora do alvo (HB-IL4)" foi realizado largamente como descrito pelo fabricante da linha de célula 30 HEK-Blue IL4/IL13. Células ’ HEK-Blue™ IL-4/IL-13 são especificamente designadas para monitorar a ativação do caminho STAT6, que é induzido por IL-4. As células foram geradas por introdução do gene STAT6 humano nas células HEK293 para obter um completamente ativo caminho de sinalização STAT6. As células HEK-Blue™ IL-4/IL-13 expressa 5 estabilidade para gene reporte, secretada fosfatase alcalina embrionária (secreted embryonic alkaline fosfatase - SEAP), sob o controle do promoter IENβ minimamente fundido para quatro sites de ligação STAT6. Ativação do caminho STAT6 em células HEK-Blue™ IL-4/IL-13 induza 10 expressão do gene repórter SEAP. SEAP é então secretado no meio e pode ser quantificado usando o reagente colorimétrico QUANTI-Blue™. Resumidamente, células HEK-Blue IL4/IL13 (Invivogen, San Diego CA cat# hkb-stat6) foram descongeladas e cultivadas em meio DMEM (Mediatech, 15 Manassas VA, cat# 10-013-CV) + 10% FBS (Hyclone, Logan UT, cat# SH30070.03) que tinha sido inativada pelo calor (Hl FBS) . Depois de uma passagem, 10 g/ml blasticidina (Invivogen cat# ant-bl-1) e 100 microgramos/ml Zeocin (Invivogen cat# ant-zn-1) foram acrescentados para o meio 20 de cultura. Depois de mais uma passagem, células foram permitidas para atingir 60-80% confluência e então elevadas com Célula Stripper (Mediatech, cat# 25-056-Cl). As Células foram lavadas duas vezes em DMEM + Hl FBS e contadas. As Células foram ajustadas para 2,8 x 105 células viáveis/ml 25 em DMEM + Hl FBS e 180 μl foi colocada em aliquotas por cultura em uma placa de fundo plano de 96 culturas de tecido (a seguir, a "placa do experimento ") . Então, 20μl de IL-4 ou construtor de proteina de fusão, diluido em DMEM + Hl FBS, foi acrescentado por cultura. A placa foi 30 incubada a 37°C 5% CO2 por 16-24 horas. QUANTI-Blue (Invivogen, cat# rep-qbl) foi preparado de acordo com as direções do fabricante. QUANTI-Blue (160 μl) foi colocada em aliquota em cada cultura de uma placa de fundo plano (daqui para frente, a "placa de ensaio"). Então, 40 μl supernadante por cultura da placa do experimento foi transferido para a placa de ensaio. A placa de ensaio foi então incubada a 37°C por 1-3 horas. A absorbância da placa de ensaio a 630nm foi lida em um modelo 1420-41 Victor 3V Multilabel Counter de Perkin-Elmer. 0 dado foi analisado usando Graph Pad Prism.
O ensaio "ensaio no alvo (desvio Thl)" foi designa dopara monitorar a percentagem de Células CD4+T que foram de fenotipo Thl,como definido por sua expressão de IFN-y. Desvio de Thl é deste modo quantificado por uma redução em IFN- Y -positivo Célula CD4Ts. O ensaio foi realizado como segue: "carregado" Dynabeads (M450 Epoxy beads, Invitrogen Dynal, Oslo, Norway cat# 140.11) foram feito como descrito pelo fabricante com 1,0 g/10 contas anti-humano CD3 epsilon anticorpo (R&D Systems, Minneapolis MN, cat# MABIOO), 1,0 μg/107contas anti-humano CD28 anticorpo (R&D Systems, cat# MAB342) e 3 μg/107contas IgG humano (R&D Systems, cat# 1001 -A). PBMCs foram obtidos de Stanford Blood Center; Palo Alto CA. Células CD4+T Naive foram purificadas pelos cones do Sistema de Redução de Leucócitos (Leukocyte Reduction System - LRS) usando o kit CD4+ naive (Miltenyi Biotech cat# 130-094-131) de acordo com as direções do fabricante. A total de 4,0 x 105 células purificada naive CD4+ T foram colocadas em aliquota para cada cultura da placa de cultura de 24 placa e tecido (daqui para frente, a "placa do experimento") em 1,3 ml em RPMI 1640 (Mediatech, cat# 10- 040-CV) + 10% HI FBS + 100 unidades/ml IL-2 (Peprotech, cat# 200-02), daqui para frente referido como Media-Q.
Então, 4,0 x 105 "carregado" Dynabeads foram acrescentados por cultura. IL-12 (Peprotech, cat# 200-12) foi diluído em Media-Q e 100 μl foi acrescentado para apropriadas culturas, dando uma concentração final de 10 ng/ml. Construtores de proteína de fusão ou IL-4 foram diluídos em Media-Q e 100 μl foram acrescentados para apropriadas culturas. Meio-Q foi acrescentado para apropriadas culturas para obter o volume total de cada cultura de 1,5 ml. A placa de experimento foi incubada a 37 °C com 5% CO2 por cinco dias. Na manhã do quinto dia, Phorbol miristate acetato (PMA) foi acrescentado para todas as culturas a uma concentração final de 50 ng/ml e ionomicina foi também acrescentada para todas as culturas a uma concentração final de 1,0 μg/ml. Brefeldin A foi acrescentado para a concentração final de 1,0 μg/ml de cultura. A placa do experimento foi incubada a 37 °C com 5% CO2 por um mínimo de quatro horas. Aproximadamente 1/3 do volume de cada cultura da placa do experimento foi então recuperada e individualmente preparada para Citometria de fluxo Intracelular de acordo comas instruções do fornecedor com os Kits acima mencionados e utilizando os reagentes fornecidos com o kit. As células foram manchadas por interferon-gama intracelular com um anti humano interferon- gama anticorpo conjugado com AF647 (eBiosciences.com, cat# 51-7319-42). As amostras foram analisadas por citometria de fluxo em um Becton Dickinson FACSort usando Cell Quest software. As amostras adquiridas foram analisadas usando FloJo Software e dados foram desenhados usando Graph Pad Prism software.
Resultados:
Na ausência de anticorpo baseado em alvo,como medido pelo ensaio "ensaio fora de alvo (HB-IL4)," IL4 mostrou EC50 de 1,26 pM (Figura 44; Tabela 35). A ligação de um IgGl para IL4 (exemplo o construtor JI 10-HC-L6-IL4 IgGl, 5 em que a sequência do tipo selvagem IL-4 humano foi ligado para o terminal C do anticorpo quimérico J1 10 que reconhece PD-1, com um interveniente ligador (L6) reduza potência por 5,46 vezes (6,88/1,26 = 5,46). Por introdução do R88Q ponto de mutação na porção de IL-4 deste 10 construtor, a potência foi adicionalmente reduzida para 35.600 vezes (44,800/1,26 = 35,555) abaixo de IL-4 livre. Um segundo anticorpo-4 (R88Q) construtor de proteina de fusão (Isotipo-HC-L6-IL4 (R88Q) IgGl, composto da SEQ ID NOS:358 (cadeia pesada) e 344 (cadeia leve)) mostrou 15 similar potência. O anticorpo isotipo usado neste experimento foi 2D 12. Tabela 35
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O "ensaio no alvo (desvio Thl) ensaio" os resultados são mostrados na Figura 45. Ativação das células (ThO) CD4 naive induz expressão PD-1, tal que o construtores de proteina de fusão de anti-PDl-IL-4 pode direcionar o IL-4 para eles. Neste ensaio, livre, tipo selvagem IL4 mostra um EC50 de 11,4 pM. Notavelmente, o IL-4 construtor de proteina de fusão atenuando anti-PDl (J110-HC-L6-IL4 (R88Q) IgGl), que" foi 35.600 vezes menos potente que o livre, tipo selvagem IL-4 no "ensaio no alvo (HB-IL4)," foi quase potente IL-4 neste ensaio no alvo (l/4“ como potente; 11,4/46,1 = 0,25). O construtor de proteina de fusão não atenuado, direcionando PD-1 (JI 10-HC-L6-IL4 IgGl) foi só ligeiramente mais potente que a forma atenuada (l,45x mais potente; 46,1/31,8 = 1,45). O não alvo, atenuado IL-4 construtor de proteina de fusão (Isotipo-HC-L6-IL4 R88Q) IgGl, foi significantemente menos potente que o direcionado atenuado construtor de proteina de fusão, mas sua potência foi muito baixo para determinar com precisão um EC50 neste experimento.
Interleucina-6 (IL-6)
O IL-6 (SEQ ID NO: 123) tem numerosas atividades em diferentes tipos de células T e pode ser vantajoso para explorar algumas destas atividades na expansão de outras. Por exemplo, por direcionar novas atividades de Células CD4+T (via ligação para um anticorpo anti-PDl, como no exemplo acima com IL-4 direcionando, por exemplo), um pode ajustar a população de célula T helper longe do caminho Treg e em favor do caminho Thl7. Isto pode ser para um paciente de câncer.
Métodos:
O "IL-6 bioensaio" foi realizado usando as células HEK-Blue™ IL-6 (Invivogen, cat# hkb-il6) , uma projetada linha de célula repórter que monitora a ativação do caminho JAK- STAT por IL-6. Estas células foram geradas por introdução do gene IL-6R humano em células HEK293. Em adição, as células foram adicionalmente transfectadas com uma Expressão de gene repórter SEAP sob o controle do IENβ promoter minimamente fundido para outros sites de ligação STAT3. Nestas células, IL-6 estimulou a ativação de STAT3 e conduziu para a secreção de SEAP. SEAP é então monitorado quando usando a detecção SEAP meio QUANTI-Blue™. O ensaio foi corrido essencialmente de acordo com as instruções do fabricante (Invivogen). Resumidamente, células HEK-Blue IL6 foram descongeladas e cultivadas em DMEM (Mediatech, Manassas VA, cat# 10-013-CV) + 10% FBS (Hiclone, Logan UT, cat# SH30070.03) que foram inativadas por calor (Hl FBS). Depois de uma passagem, 200 iglm\ HigroGold, (Invivogen cat# ant-hg-1) e 100 g/ml Zeocin, (Invivogen cat# ant-zn-1) foi acrescentado para o meio de cultura. Depois de mais uma passagem, células foram permitidas para atingir 60-80% confluência e então ajustadas com Cell Stripper (Mediatech, cat# 25-056-Cl). As Células foram então duas vezes em DMEM + Hl FBS e contadas. As células foram ajustadas para 2,8 x 105 células viáveis/ml em DMEM + Hl FBS e 180 ul foi colocada em alíquota por cultura ém fundo plano de 96 culturas da placa de cultura de tecido (daqui para frente, a "placa de experimento"). Então, 20 μl de IL-6 ou construtor de proteina de fusão, diluido em DMEM + HI FBS, foi acrescentado por cultura. A placa foi incubada a 37 °C com 5% CO2 por 16-24 horas. QUANTI-Blue (Invivogen, cat# rep-qbl), preparado de acordo comas instruções do fabricante, foi então colocada em aliquota (160 μl por cultura) em cada uma das culturas da placa de fundo plano (daqui para frente, a "placa de ensaio"). Então, 40 μl de supernadante por cultura da placa do experimento foi transferida para as culturas da placa de ensaio. A placa de ensaio foi incubada a 37°C por 1-3 horas. A absorbância da placa de ensaio a 630nm foi lida em um modelo 1420-41 Victor 3V Multilabel Counter de Perkin-Elmer. 0 dado foi analisado usando Graph Pad Prism. - De modo a testar se IL-6 pode ser atenuado e alvo, tal que um alto índice de Especificidade de Antigeno (ASI) possa ser melhorado, IL-6 conduziu um ligador 16-mer (L16, SGGGGSGGGGSGGGGS, SEQ ID NO: 133) no Terminal N foi fundido para um anticorpo alvo classe I MHC, usando o anticorpo HB95 (que liga o antigeno classe I MHC humano, como descrito acima) versus um isotipo de controle de anticorpo, 2D 12 (também descrito acima) . O não alvo, isotipo de controle de construtor de proteina de fusão, 2D12-HC-L16- IL6 IgGl (composto de SEQ ID NOS:360 (cadeia pesada) e 344 (cadeia leve) ) , foi comparado para IL-6 livre no "IL-6 bioensaio" descrito acima (Figura 46). O anticorpo de fusão mostrou 10 vezes menos potência que o livre IL-6 (10,9/1,04 = 10,5). Por (introdução da R179E mutação (conhecido para reduzir a potência de IL-6; Kalai, Blood 89(4): 1319-33, 1997)) neste construtor de proteína de fusão, o construtor resultante (2D12-HC-L16-IL6(R179E) IgGl, composto de SEQ ID NOS:362 (cadeia pesada) e 344 (cadeia leve)) foi adicionalmente atenuado, mostrando uma potência 79,400 vezes menor que o livre, tipo selvagem IL-6 (82,600/1,04 = 79,400). Por contraste, quando o atenuado IL-6 foi ligado para um anticorpo (HB95) que liga para um antigeno (classe I MHC) nas células HEK-Blue™ IL-6 (HB95-HC-L16-IL-6(R179E) IgGl, composto de SEQ ID NOS: 324 (cadeia pesada) e 312 (cadeia leve)), a potência foi aumentada comparado para o construtor de proteina de fusão não alvo atenuando anticorpo IL-6 por 953 vezes (82.600/86,7 = 953). Esta potência é só 6, 99 vezes menor quedo alvo, tipo selvagem IL-6 construtor de proteina de fusão (HB95-HC-L16-IL6 IgGl, composto de SEQ ID NOS:322 (cadeia pesada) e 312 (cadeia leve); 86,7/12,4 = 6,99). Em outras palavras, na ausência de antigeno direcionando anticorpo e no contexto de construtores de proteina de fusão anticorpo-IL-6, a R179E mutação reduz a potência IL-6 por 7,580 vezes (82,600/10,9 = 7,580) comparado para a mesma 6,99 vezes na presença de alvo.
Estudos in vivo de anticorpo alvo atenuado IFNa.
Para confirmar que os construtores de proteina de fusão atenuando ligação de anticorpo da presente invenção foram ativos in vivo em vários experimentos, usando construtores consistindo de anticorpos para CD38, que é expresso na superficie de células de mieloma múltipla e atenuada versões de IFNcc2b, foram realizadas. E em muitos estudos isto foi comparado para construtores de proteina de fusão não direcionando controle referido acima como "controle de isotipo". As regiões variáveis para o isotipo de controle de anticorpos foram derivados do anticorpo 2D 12 que foi levantado contra o virus da febre amarela (Shlesinger, Virology 125: 8- 17, 1983).
Nos primeiros experimentos, um modelo de xeno transplante em que a linha de célula de mieloma múltipla NCI-H929 (ATCC CRL-9068, Gazdar, Blood 67: 1542-1549, 1986) é crescido subcutaneamente em imuno compromissado (SCID) rato foi usado.
Métodos:
De oito a doze semanas de idade ratos CB.17 SCID foram injetados subcutaneamente no flanco com 1x10 NCI-H929 células de tumor em 50% Matrigel. Quando o tamanho médio do tumor alcançou 120- 150 mm , os ratos foram agrupados em 5 grupos de 10 ratos cada e tratamento começou no tempo zero (TO) . Todos os tratamentos foram dados por injeção intraperitoneal, (i.p.) duas vezes por semana em 5 semanas (indicado por barra sub grafada). Todos os compostos foram dosados a 200 μg/dose (aproximadamente 10 mg/kg) exceto para for Interferon-a. IFNcc2b (Intron A®, Scheanel Corp., Merck, Whitehouse Station, NJ) foi dado a 2 milhões de unidades/dose. 0 volume do tumor foi medida duas vezes semanalmente por medição de paquimetro. O ponto final foi o volume do tumor de 2.000 mm3.
Resultados:
Os Resultados são mostrados na Figura 47. Tratamento de mieloma múltipla subcutânea (s.c.) tumor sólido com interferon-a (diâmetros fechados) ligeiramente atrasou o crescimento do tumor nestes ratos comparado para veiculo (P <0,05, circulos fechados). Tratamento com anticorpo naked anti-CD38 (G005 IgGl, composto de SEQ ID NOS: 135 (cadeia pesada) e 134 (cadeia leve)), (quadrado fechado) não teve efeito significante no crescimento do tumor comparado para veiculo. Todos os ratos nestes dois grupos alcançaram ponto final de (2.000 mm) no dia 30. O construtor de proteina de fusão atenuando não alvo de isotipo de controle IFNa (Isotipo-HC-L6-IFNa (A145G) IgGl, composto de SEQ ID NOS:348 (cadeia pesada) e 344 (cadeia leve) (triângulos invertidos abertos) não mostraram atividade significante no retardo do crescimento do tumor, presumivelmente devido à longa meia vida do construtor de proteina de fusão de anticorpo IFNa e resultando aumento da exposição sistêmica. O construtor de proteina de fusão L6-IFNa direcionando atenuado CD38 IFNa (G005-HC- (A145G) IgGl, composto de SEQ ID NOS: 144 (cadeia pesada) e 134 (cadeia leve)), por contraste, mostrou dramática atividade comparada para o construtor de proteina de fusão não alvo (P <0,0001.) ou de outras substâncias de teste. O construtor de proteina de fusão IFNa atenuando alvo anti-CD38 completamente resolveu tumores em todos (10/10) ratos para niveis não detectáveis pelo dia 22 com não recorrência através da duração do estudo.
O IFNa construtor de proteina de fusão (G005-HC-L6- IFNα (A145G) IgGl) atenuando anti-CD38 foi testado em modelo sistêmico de mieloma múltipla baseado na linha de célula MM1S (Crown Bioscience Inc., Santa Clara; Greenstein, Exp Hematol. Apr;31 (4) :271-82,2003).
Métodos:
De seis a oito semanas de idade ratos NOD-SCID foram injetados intravenosamente com IxlO7 MM1S células de tumor em 0,1 ml de tampão de fosfato salino (PBS) 24 horas depois de irradiação com 200 rad (60Co). Os ratos foram agrupados em 4 grupos de 10 ratos cada um no tempo zero e os tratamentos começaram 7 ias depois. Todos os tratamentos foram dados i.p. duas vezes semanalmente por 9 semanas. Todos os compostos foram dosados a 200 μg/dose (aproximadamente 10 mg/kg) exceto Interferon-a (dado a 2 milhões de unidades/dose). Peso corporal e saúde geral foram monitoradas duas vezes semanalmente e sobrevivência foi o ponto final.
Resultados:
Os Resultados são mostrados na Figura 48. Tratamento deste sistêmico tumor de mieloma múltipla com interferon-a (Intron A) sozinho aumentou tempo médio de sobrevivência (MST) por 18 dias comparado para veiculo (MST 74 versus 56, respectivamente.) Tratamento com anticorpo naked anti-CD38 (G005) só ligeiramente aumentou a sobrevivência (MST 62 dias) . Nove dos* ratos no IFNa atenuado alvo anti-CD38 (G005-HC-L6-IFNa (A145G) IgGl) o grupo tratado mostrou sinais da doença durante o tempo de estudo. Todos (10/10) ratos aparentavam saudáveis no termino.
Um estudo in vivo usando um terceiro modelo de câncer, baseado em linfoma linha de célula DaudiBurkitt (ATCC CCL-213, Klein, Cancer Res. 28: 1300-1310, 1968) foi realizado. AS células Daudi são CD38+.
Métodos:
De seis a oito semanas de idade ratos NOD-SCID foram injetados subcutaneamente no flanco com 1x10 células Daudi tumor de linfoma Burkitt em 50% Matrigel um dia depois de irradiação com 200rad (60Co). Quando o tamanho médio do tumor alcançou 169 mm3 (Day 20), ratos foram agrupados em 5 grupos de 10 ratos cada e o tratamento começou. Todos os tratamentos foram dados i.p. duas vezes por semana por 4 semanas. Todos os compostos foram dosados a 200 μg/dose (aproximadamente 10 mg/kg) exceto Interferon, que foi dado a 2 milhões de unidades (MIO) /dose. O volume do tumor foi medido duas vezes semanalmente por medição de paquímetro. O volume do tumor no ponto final foi de 2.000 mm .
Resultados:
Os Resultados são mostrados na Figura 49. O Tratamento deste linfoma de Burkitt tumor s.c. com o anticorpo naked anti-CD38 (quadrado fechado) não retardou significantemente o crescimento do tumor nestes ratos comparado para veiculo (circulo fechado). O tratamento de IFNa resultado em um retardo significante no retardo de crescimento do tumor comparado para veiculo (5,5 dias) embora este grupo alcançasse o ponto final de 2,000 mm por 40 dias. O construtor de proteina de "fusão não alvo do isotipo de controle (Isotipo-HC-L6-IFNcc (A145G) IgGl; triângulo invertido aberto) mostrou significante atividade no retardo do crescimento do tumor, mas este grupo alcançou o ponto final de 2,000 mm no dia 57. Como observado no modelo H929 (acima), esta atividade não alvo é provavelmente devido à meia vida estendida do interferon, deste modo aumentando exposição do tumor para a citocina. O construtor de proteina de fusão atenuando alvo interferon anti-CD38 (triângulo fechado) dramaticamente resolveu tumores tal que nove dos dez ratos tinham tumores palpáveis pelo dia 30. Alguns dos ratos neste grupo, embora, mostraram crescimento de tumores depois da descontinuação de tratamento. Análise adicional destes dados é apresentada na Tabela 36. Tabela 36
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a. Média +/-SEM b. Razão do tamanho do tumor por grupo de tratamento dividido pelo tamanho do tumor do grupo do veiculo no 37 c. Vs. veiculo de controle no dia 37 Este experimento de xenoenxerto mostra que IFNa construtores de proteina de fusão atenuando alvo CD38 pode ser efetivo no tratamento de linfomas em adição a mieloma múltiplos.
O efeito de diferentes destes construtor de proteina de fusão anti-CD38-atenuado IFNa, foram comparado para construtor de proteina de fusão do não alvo-CD38, no crescimento de tumor de mieloma tumor. Para estas comparações, o NCI- H929 modelo de mieloma múltiplas.c. foi usado.
Métodos:
De oito a doze semanas de idade ratos CB.17 SCID ratos foram injetados subcutaneamente no flanco com 1x10 NCTH929 células tumor em 50% Matrigel. Quando o tamanho médio do tumor alcançou de 120-150 mm,os ratos foram agrupados em 9 grupos de 10 ratos cada um e o tratamento começou (tempo zero). Todos os tratamentos foram dados i.p. duas vezes por semana por 5 semanas. Dois compostos, interferon atenuando alvo anti-CD38 (símbolos cinza fechado) e interferon de controle de isotipo não alvo (símbolos abertos), foram comparados neste estudo a doses diferentes (ver legenda para doses) . O volume do tumor foi medido duas vezes semanalmente por medida de paquímetro. O ponto final do tumor do foi o volume de 2.000 mm .
Resultados:
Os Resultados são mostrados na Figura 50. A dose de titração de IFNcc construtor de proteína de fusão atenuando anti-CD38-alvo (G005-HC-L6-IFNCC (A145G) IgGl) demonstrou significante eficácia em todas as doses do composto testado, até 0,01 mg/kg. A eliminação complete do tumor foi observada em 10/10 ratos só na maior (10 mg/kg) dose. Por contraste, o composto IFN atenuando controle de isotipo (Isotipo-HC-L6-IFNcc (A145G) IgGl) mostrou significante atividade só na dose mais alta (10 mg/kg). A dose de 0,01 mg/kg do CD38 alvo, o IFN construtor de proteína de fusão mostrou similar atividade para o atenuado anti-tumor para o controle de isotipo de 1.000 vezes a dose maior (10 mg/kg), enfatizando a importância do alvo CD38-.
O próximo exemplo mostra que os anticorpos da presente invenção também incluem estes isotipo IgG4.
Métodos:
De oito a doze semanas de idade ratos CB.17 SCID foram injetados subcutaneamente no flanco com 1x10 NCTH929 células tumor em 50% Matrigel. Quando o peso médio alcançou de 120-150 mm,os ratos foram agrupados em 5 grupos de 10 ratos cada e o tratamento começou (tempo zero). Todos os tratamentos foram dados i.p., duas vezes semanalmente por 5 semanas. Todos os compostos foram dosados a 70 μg/dose (aproximadamente 3,5 mg/kg). O volume do tumor foi medido duas vezes semanalmente por medida de paquímetro. O ponto fina foi 2.000 mm.
Resultados:
Os Resultados são mostrados na Figura 51. Este estudo compara a atividade do alvo versus construtores de proteína de fusão não alvo em dois diferentes formatos de isotipo; isotipo IgGl (G005-HC-L6-IFNCC (A145G) IgGl (alvo, quadrado fechado) e Isotipo-HC-L6-IFNcc (A145G) IgGl (não-alvo, quadrado aberto)) e IgG4 isotipo (G005-HC-L6-IFNcc (A145G) IgG4, composto de SEQ ID NOS: 148 (cadeia pesada) e 134 (cadeia leve) (alvo, diâmetro fechado) e Isotipo-HC-L6- IFNcc (A145G) IgG4, composto de SEQ ID NOS:350 (cadeia pesada) e 344 (cadeia leve) (não alvo, diâmetro fechado)) foram comparados. É importante notar que os ratos neste estudo foram tratados a uma dose mais baixa que em estudos anteriores onde foi observado 100% de eliminação do tumor. O volume do tumor indica que, surpreendentemente, o formato IgG4 é mais potente que o formato IgGl neste modelo. Uma vez que anticorpos IgGl humano têm função de maior efeito que anticorpos IgG4 (Hooper, Ann Clin Lab Sci.;8:201, 1978; Ward, Ther Imunol, 2:77, 1995.), seria de esperar que o formato de IgGl tivesse sido, pelo menos, tão eficaz, se não mais, do que o formato de IgG4. No final do estudo, 8/10 ratos no alvo CD38, atenuado IFN, grupo tratado IgG4 (diâmetro fechado) estavam livre de tumor livre enquanto só 3/10 estavam livre de tumor no formato IgGl parte contada (quadrado fechado).
O próximo exemplo estendeu a observação de eficácia in vivo de um IFN alvo de anticorpo para uma segunda forma mutada de IFNcc em que o A 145 foi mutado para ácido aspártico(D). Em adição, o experimento abaixo utilizou um diferente anticorpo CD38, isto é, um baseado na regiões variáveis de anticorpo humano clone X355/02; (SEQ ID NOS:391 (VH) e 390 (vÀ) ) . Uma terceira diferença entre este construtor e o primeiro apresentado nos precedentes 5 experimentos in vivo é que o ligador é removido (referido como "LO"), isto é,o mutado IFNcc é fundido diretamente para o C terminal da cadeia de pesada de anticorpo.
Métodos:
De oito a doze semanas de idade ratos CB.17 SCID foram injetados subcutaneamente no flanco com 1x10 NCI-H929 células tumor em 50% Matrigel. Quando o peso médio dos tumores alcançou 120-150 mm,os ratos foram agrupados em 3 grupos de 10 ratos cada e então o tratamento começou (tempo zero). Todos os tratamentos foram dados i.p. duas vezes semanalmente por 5 semanas. Todos os compostos foram dosados a 60 μg/dose (aproximadamente 3 mg/kg). O volume do tumor foi medido duas vezes semanalmente por medida de paquímetro. O ponto final foi o volume do tumor de 2.000 mm.
Resultados:
Os Resultados são mostrado na Figura 52. Este construtor de proteina de fusão IFNcc atenuando anti-CD38- (X355/02-HC-L0-IFNCC (A145D) IgG4, composto de SEQ ID NOS:232 (cadeia pesada) e 226 (cadeia leve)) foi também 25 muito efetivo na eliminação do tumor, mostrando que a habilidade do construtores de proteina de fusão IFNcc atenuando anti-CD38 para efetivamente tratar mieloma humano em um modelo in vivo não é restrito para um dominio de variável simples, mutação ou ligador IFN cc entre os 30 anticorpo e o IFN. 0 construtor de proteina de fusão controle de isotipo mostrou significantemente menor atividade anti-mieloma, consistente com o alvo baseado em CD38.
O próximo exemplo mostra que um construtor de proteina de fusão IFNcc atenuando anticorpo anti-CD38 é mais efetivo que drogas padrão usadas para tratar mieloma múltipla no mesmo modelo de xenotransplante descrito acima.
Métodos:
De oito a dez semanas de idade ratos CB.17 SCID foram injetados subcutaneamente no flanco com 1x10 NCI-H929 células de tumor em 50% Matrigel. Quando o tamanho médio do tumor alcançou 120-150 mm ,os ratos foram agrupados em grupos de 10 ratos cada e o tratamento começou (tempo zero) . Tratamentos foram administrados doses e regimes descrito na legenda. © volume do tumor foi medido duas vezes por semana por medida de paquímetro. O ponto final foi 2.000 mm .
Resultados:
Os Resultados são mostrado na Figura 53. Neste estudo a atividade do construtor de proteina de fusão direcionando para anti-CD38 (G005-HC-L0-IFNCC (A145D)IgG4, composto de SEQ ID NOS: 180 (cadeia pesada) e 134 (cadeia leve)) foi comparado com terapias padrão Bortezomib (Velcade), Melphalan (Alkeran) , e Dexamethasone. Dos alvos anti-CD38, atenuado grupo de interferon, 8/10 estavam livre do tumor em 60 dias (triângulos fechados), mas todos os ratos em todos os grupos alcançaram o ponto final em torno de 50 dias.
O próximo exemplo mostra que um construtor de proteina de fusão IFN atenuando anti-CD38 pode completamente eliminar estabelecidos tumores de mieloma múltipla humano em um modelo de rato, quando o construtor de proteina de fusão é dado como uma dose simples.
Métodos:
De oito a doze semanas de idade ratos CB.17 SCID foram injetados subcutaneamente no flanco com 1x10 NCTH929 células de tumor em 50% Matrigel. Quando o tamanho médio do tumor alcançou 120-150 mm os ratos foram agrupados em grupos de 10 ratos cada um e então o tratamento começou (TO) . 0 tratamento com Interferon construtor proteina de fusão atenuando anticorpo anti-CD38 foram administrados de acordo com os seguintes regimes: dose simples no dia 0 (triângulos fechado) , duas doses (nos dias 0 e dia 3; quadrados fechados), 4 doses (nos dias 0, 3, 8, e 11; diâmetros fechado) e 6 doses (nos dias 0, 3,-8, 11, 15 e 18; circulos preto fechados). Um grupo recebeu 6 doses do interferon construtor de proteina de fusão atenuando controle de isotipo controle nos dias 0, 3, 8, 11, 15 e 18 (quadrados abertos). O grupo de tratamento de veiculo é mostrado nos circulos completo cinza. O volume do tumor foi medido duas vezes por semana por medida de paquímetro. O ponto final foi de 2.000 mm.
Resultados:
Os Resultados são mostrados na Figura 54. Este estudo surpreendentemente mostrou que uma dose simples do G005-HC- L6-IFNCC (A145G) IgG4 construtor de proteina de fusão foi suficiente para eliminar tumores estabilizados em todos os ratos 10/10 em 15 dias; adicionalmente mais, pelo dia 60, nenhum dos tumores reapareceu em qualquer um dos ratos neste grupo de dose simples. Isto foi verdade para todos os 4 regimes de dosagem com o interferon atenuando alvo. O grupo de controle de isotipo só foi testado no regime de dosagem 6 e mostrou considerável menor atividade. Que uma dose simples de um composto pode efetivamente curar animais de tumores estabilizados de mieloma múltipla não é precedente e extremamente surpreendente uma vez que 5 terapias anti-tumor são tipicamente de dosagem de múltiplas vezes de modo a observar a eficácia.
O próximo exemplo demonstra que tumores muito grande podem ser eliminados por tratamento com IFN construtor de proteina de fusão atenuando um anti-CD38.
Métodos:
Um grupo (n = 9) do estudo imediatamente precedente não foi tratado até que o volume médio do tumor alcançou 730 mm. Este grupo então recebeu 6 doses de interferon atenuando alvo anti-CD38 nos dias 12, 15, 19, 22, 26 e 29 15 (linhas) .
Resultados:
Os Resultados são mostrado na Figura 55. 8/9 ratos neste grupo mostrou completa eliminação de tumor por 30 dias e nenhum dos tumores reapareceram em qual um destes 20 ratos até o fim do estudo. Três destes ratos partiram com tumores >1000mm. Só um rato que morreu da mieloma foi um que tinha um volume de tumor de 1.800 mm no inicio do tratamento; e alcançou 2.000 mm no ponto dos dias seguintes. Este resultado é muito surpreendente e nenhum 25 outro composto reportou para eliminar tumores de mieloma deste tamanho em qualquer modelo animal.
Foi mostrado que nos experimentos in vitro acima (Tabela 27) que o construtor de proteina de fusão IgG4 de G005-HC-L6-IFNCC (A145G) tem cerca de 25.000 vezes menor 30 potência que livre, tipo selvagem IFNcc2b sob condições onde o anticorpo não direciona o atenuado IFNcc para as células sendo testado (ensaio fora do alvo). Os seguintes experimentos auxiliaram para determinar se o construtor de proteina de fusão também mostrou atenuação dramática de atividade IFN em um ensaio ex vivo de atividade IFN que é relevante para a toxicidade de IFNcc. Este efeito de IFNcc em hematopoiese pode ser medida ex vivo pela determinação do efeito de IFNcc no número de formação de unidades de colônias derivadas de primária mononuclear células de medula óssea humana. O IFNcc versus o IFNcc construtores de proteina de fusão atenuando anticorpo foram comparados em termos de seus efeito na formação de colônia.
Métodos:
As células de medula óssea humana mononuclear normais congeladas de (All Cells, Inc., Emeryville, CA) de 3 doadores foram resfriado em meio RPMI-1640 mais 10% soro bovino fetal (FBS) (meio completo) e lavado como mesmo medido duas vezes. Depois de lavadas, as células foram colocadas neste meio a l,75xl06 células/ml. As suspensões de células foram diluidas com meio MetoCult H4434 Classic (Stem Cell Technologies, Cat# 04434) para uma concentração final de célula de 0,7xl05 células/ml. As células foram então muito bem misturadas e 3 ml desta mistura foi colocada em aliquota em cada tubo.
Intron A (Scheanel Corp. Merck, NJ) e construtores de proteina de fusão (G005-HC-L0-IFNcc (145D) IgG4 e Isotipo- HC-LO-IFNcc (145D) IgG4) foram diluidos dez vezes em diluições seriais em meio completo e 150 μl de cada diluição foi acrescentado aos tubos contendo os 3 ml das células de medula óssea no meio Metocult H4434. As misturas foram colocadas na placa a 1,1 ml por 35mm de disco de cultura de tecido (Stem Cell Technologies, cat#27115). As placas foram então incubadas em um incubador umidificado de cultura a 37°C com 5% C02 por duas semanas.
As colônias foram contadas em um microscópio usando um gridded scoringdish (Stem Cell Technologies, Cat#27500) e o número de colônias/placa foi registrado. Percentagem de colônias recuperadas para um dada substância de teste foi calculada por dividir o número de colônias por placa pelo número de colônias nas placas com nenhuma substância de teste acrescentada. Um total de três medula óssea humana MNC foram testados usando este método.
Resultados:
Os resultados são mostrados na Figura 56. Os dados indicam que interferon de construtores de proteina de fusão atenuando ambos os alvos (anti-CD38, G005) e o não alvo (isotipo; 2D 12) têm similar atividade, indicando que as expressão CD38 observada em células normal de medula óssea não é igualmente expressa nas células do alvo. Ambos os construtores de proteina de fusão têm aproximadamente 10.000 vezes menos atividade em inibir formação de colônia que o tipo selvagem, IFNa livre, assim confirmando que o A145D mutação atenua a atividade de construtores de proteina de fusão IFNa de IFN do anticorpo e sugerindo que cada atenuado de construtores de proteina de fusão IFN anticorpo terá um superior perfil de segurança compara do para seu próprio IFNa.
Outra atividade de IFNa que pode ser medida ex vivo é a estimulação de citocina e secreção de quimocina. PBMCs normal humano foram estimulado com várias concentrações de IFNa versus o IFNa construtor de proteina de fusão atenuando anticorpo Isotipo-HC-L6-IFNa (A145G) IgGl (baseado no anticorpo 2D12), e medida a resultante produção de citocina.
Métodos:
Células mononuclear de sangue periferal humano normal (PBMC) de quatro doadores normais foram lavadas com meio x vivo-15 (Lonza, Cat# 04-418Q) e ressuspenso no mesmo meio a uma densidade de célula de IxlO6 células/ml. As células foram então incubadas com IgG humano a 4 mg/ml e incubadas a 37 °C por 30 minuto para bloquear qualquer não especifica ligação de IgG. Sem lavagem, 250 μl de células colocadas em aliquota foram então acrescentadas para as culturas de placas tratadas de tecido de cultura de 24 culturas. Para estas culturas foram então acrescentados 250 μl de IFNa livre TOU um IFNa construtor de proteina de fusão atenuando IgG (Isotipo-HC-L6-IFNa (A145G) IgGl; o anticorpo isotipo é 2D12) a várias concentrações. As placas foram então incubadas durante a noite a 37°C em 5% CO2. No dia seguinte, as placas foram centrifugadas e 200 μl de supernadante foi coletado de cada cultura. Supernadantes foram colocados para congelar até análise usando um ensaio de citocina Luminex.
Ensaios Luminex: usando o Premix 42-plex de Millipore (Cat#MPXHCYTO60KPMX42) foram capazes de medir o nivel de produção de citocinas humana pelo PBMCs estimulado pela substância de teste. A cultura de supernadantes foi incubada com a pré mistura de microbeads de poliestireno que foram cobertas com anticorpos de anti-citocina de acordo comas instruções do fabricante. Depois dé lavado, o cocktail de anticorpo de detecção biotinilatado foi introduzido para o analito capturado de contas. Finalmente a mistura da reação foi incubada com Estreptavidina PE e a intensidade de fluorescente de PE foi medida no analisador Luminex. Os resultados foram interpolados pela construção da curva baseada nos controles fornecidos no kit.
Resultados:
Os resultados são mostrados na Figura 57. Quatro citocinas (IP- 10, MCP-1, MCP-3 e IL-lcc) foram consistentemente super regulada em resposta a exposição de IFNa. O IFNa construtor de proteina de fusão atenuando anticorpo (Isotipo-HC-L6- IFNa (A145G) IgGl) mostrou 1.0005.000 vezes redução de potência comparado para a estimulação do tipo selvagem IFNa. Isto confirma que a mutação feita resultou em uma significante atenuação de atividade biológica. Painel (a) mostra as curvas de resposta de doses para IP- 10 (estimado a aproximadamente 1.000 vezes de atenuação) e MCP-1 (estimado aproximadamente 5.000 vezes de atenuação); painel (b) mostra as curvas de resposta de doses para MCP-3 (estimada aproximadamente 2.500 vezes de atenuação) e ILla (estimada a cerca de 1.300 vezes de atenuação). TABELAS DE SEQUÊNCIA Tabela 37 - Sequências de Cadeia Simples de Polipeptideo
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Tabela 38 SEQ ID NOs relacionadas para proteínas compreendendo 2 cadeias de polipeptídeos
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TABELA 39 - DOMÍNIOS VARIAVEIS
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Tabela 40 Outras Sequências de Cadeia Simples de Polipeptídeo
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Claims (11)

1. Construção de polipeptídio, compreendendo um interferon (IFN) ligado a um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a um antígeno associado à superfície celular, caracterizado pelo fato de que o IFN é um interferon a atenuado (IFNa) compreendendo, em relação ao tipo selvagem, a mutação conforme representado em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em R144A (SEQ ID N0: 30), R144S (SEQ ID N0: 40), R144T (SEQ ID N0: 41), R144Y (SEQ ID N0: 43), Rl44I (SEQ ID N0: 35), R144L (SEQ ID N0: 37), A145D (SEQ ID N0: 44), Al45H (SEQ ID N0: 47), A145Y (SEQ ID N0: 58), A145K (SEQ ID N0 : 49), R33A + YNS (SEQ ID N0: 65) e R144A + YNS (SEQ ID N0: 68).
2. Construção de polipeptídio de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o IFN está ligado ao anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno por meio de uma ligação peptídica.
3. Construção de polipeptídio de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o IFN está ligado ao anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno diretamente ou através de um ligante de 1 a 20 aminoácidos de comprimento.
4. Construção de polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o IFN está ligado ao terminal C da cadeia leve ou região constante da cadeia pesada do anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo.
5. Construção de polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao antígeno associado à superfície celular com uma afinidade de 50 nM, 25 nM, 10 nM, ou de 5 nM a 1pM.
6. Construção de polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o antígeno associado à superfície celular é selecionado a partir do grupo que consiste em CD38, HM1.24, CD56, CS1, CD20, CD74, IL-6R, Blys (BAFF), BCMA, HLA-SR, Kininogênio, beta2 microglobulina, FGFR3, ICAM-1, matriptase, CD52, EGFR, GM2, alfa4- integrina, IFG-1R, KIR, CD3, CD4, CD8, CD24, CD44, CD69, CD71, CD83, CD86, CD96, HLA-DR, PD-1, ICOS, CD33, CD115, CD11c, CD14, CD52, CD14, FSP1, FAP, PDGFR alfa, PDGFR beta, ASGR1, ASGR2, FSP1, RTI140 / Ti-alfa, HTI56, receptor VEGF, CD241 o produto do gene RCHE, CD117 (c- kit), CD71 (receptor de transferrina), CD36 (receptor de trombospondina), CD34, CD45RO, CD45RA, CD115, CD168, CD235, CD236, CD237, CD238, CD239 e CD240.
7. Construção de polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo ou um fragmento Fab.
8. Construção de polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a construção tem um Índice de Especificidade do Antígeno maior do que 50, de preferência maior do que 100, de preferência maior do que 1000.
9. Composição caracterizada por compreender a construção de polipeptídio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
10. Utilização da construção de polipeptídio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 caracterizada por ser utilizada na preparação de um medicamento para o tratamento do cancro.
11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o câncer é mieloma múltiplo ou linfoma não-Hodgkin.
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Families Citing this family (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003295471B2 (en) 2002-11-15 2011-08-25 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against CD25
EP1914242A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
CN102268089A (zh) 2011-07-05 2011-12-07 上海交通大学 Agr2阻断抗体及其用途
JP6184965B2 (ja) 2011-10-28 2017-08-23 テバ・ファーマシューティカルズ・オーストラリア・ピーティワイ・リミテッド ポリペプチド構築物およびその使用
EP2804877B1 (en) 2012-01-20 2018-08-22 VIB vzw Targeted mutant alpha-helical bundle cytokines
EP2822575B1 (en) 2012-03-03 2020-05-06 ImmunGene, Inc. Engineered antibody-interferon mutant fusion molecules
WO2014110601A1 (en) 2013-01-14 2014-07-17 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
AU2013388126B2 (en) * 2013-04-29 2019-03-07 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
CN110835376B (zh) 2013-07-18 2023-08-04 弗拉芒区生物技术研究所 涉及具有强烈降低的受体结合亲和力的细胞因子的融合因子
KR102305608B1 (ko) * 2013-07-19 2021-09-28 브이아이비 브이지더블유 사이토카인 길항제의 표적화
ES2686668T3 (es) 2013-07-19 2018-10-19 Vib Vzw Miembros de la familia TNF modificados dirigidos
SG11201600167SA (en) 2013-07-19 2016-02-26 Vib Vzw Targeted modified il-1 family members
BR112016009403A2 (pt) * 2013-10-31 2017-09-19 Sanofi Sa Anticorpos anti-cd38 específicos para tratamento de cânceres humanos
ES2959480T3 (es) * 2014-02-07 2024-02-26 Univ Mcmaster Acoplador de células T - antígeno trifuncional y métodos y usos del mismo
US9732154B2 (en) * 2014-02-28 2017-08-15 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
US9603927B2 (en) 2014-02-28 2017-03-28 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
CR20160506A (es) 2014-03-28 2017-03-10 Xencor Inc Anticuerpos biespecíficos que se unen a cd38 y cd3
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
WO2016020791A1 (en) * 2014-08-05 2016-02-11 Novartis Ag Ckit antibody drug conjugates
US10617757B2 (en) * 2014-08-08 2020-04-14 The Regents Of The University Of California Methods for treating multiple myeloma
EP3191187B1 (en) 2014-09-09 2021-07-28 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-cd38 antibodies
EP3212216A4 (en) * 2014-10-29 2018-04-18 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Interferon alpha2b variants
CA2968878A1 (en) * 2014-11-26 2016-06-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd38
DK3223845T3 (da) 2014-11-26 2021-08-16 Xencor Inc Heterodimere antistoffer, der binder cd3 og cd20
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
IL307913A (en) * 2014-12-04 2023-12-01 Janssen Biotech Inc Anti-CD38 antibodies for the treatment of acute myeloid leukemia
BR112017024877A2 (pt) 2015-05-20 2019-09-17 Janssen Biotech, Inc. anticorpo anti-cd38 e seu uso no tratamento de amiloidose de cadeia leve e outras malignidades hematológicas positivas para cd38
AU2016274897B2 (en) * 2015-06-12 2021-02-25 Immungene, Inc. Focused interferon immunotherapy for treatment of cancer
CR20170587A (es) 2015-06-22 2018-04-03 Janssen Biotech Inc Terapias de combinación para enfermedades malignas hematológicas con anticuerpos anti-cd38 e inhibidores de survivina
US20170044265A1 (en) 2015-06-24 2017-02-16 Janssen Biotech, Inc. Immune Modulation and Treatment of Solid Tumors with Antibodies that Specifically Bind CD38
RU2611685C2 (ru) * 2015-07-20 2017-02-28 Илья Владимирович Духовлинов Гуманизированное моноклональное антитело, специфичное к синдекану-1
CN105254717B (zh) * 2015-08-18 2018-08-24 中山大学 与cd34分子特异性结合的多肽及其应用
US10781261B2 (en) 2015-11-03 2020-09-22 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
CN108472369A (zh) 2015-11-03 2018-08-31 詹森生物科技公司 抗cd38抗体的皮下制剂及其用途
CA3003969A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Orionis Biosciences Nv Bi-functional chimeric proteins and uses thereof
CN108699136B (zh) 2015-12-07 2022-03-18 Xencor股份有限公司 结合cd3和psma的异二聚抗体
JP6991979B2 (ja) 2016-02-05 2022-03-04 オリオニス バイオサイエンシズ ビーブイ Ｃｄ８結合物質
US11661455B2 (en) 2016-02-05 2023-05-30 Orionis Biosciences BV Chimeric protein comprising an interferon alpha 2mutant and a PD-L1 binding moiety
US11248057B2 (en) 2016-03-07 2022-02-15 Vib Vzw CD20 binding single domain antibodies
CN106065033A (zh) * 2016-03-17 2016-11-02 中国药科大学 一种细胞因子融合抗体的制备及其应用
CA3022266A1 (en) * 2016-04-25 2017-11-02 Universitat Basel Allele editing and applications thereof
EP3454887B1 (en) 2016-05-13 2021-01-20 Orionis Biosciences BV Targeted mutant interferon-beta and uses thereof
CN109563141A (zh) * 2016-05-13 2019-04-02 奥里尼斯生物科学公司 对非细胞结构的治疗性靶向
WO2017218707A2 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
EA037848B1 (ru) 2016-07-14 2021-05-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Биохимический Агент" Гибридный белок, полинуклеотид, генетическая конструкция, продуцент, препарат для регенерации хряща (варианты)
WO2018014068A1 (en) * 2016-07-19 2018-01-25 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Attenuated type i ifn cd47 combination therapy
CN110087673A (zh) * 2016-07-19 2019-08-02 梯瓦制药澳大利亚股份有限公司 抗cd47联合治疗
CA3040802A1 (en) 2016-10-24 2018-05-03 Orionis Biosciences Nv Targeted mutant interferon-gamma and uses thereof
TW201829463A (zh) * 2016-11-18 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗hla-g抗體及其用途
CN106854248A (zh) * 2016-12-09 2017-06-16 中国药科大学 一种细胞因子突变体融合抗体的制备及其应用
CA3046387A1 (en) * 2016-12-21 2018-06-28 David Jose Simon LAINE Antibodies that specifically bind to human il-15 and uses thereof
MX2019009255A (es) * 2017-02-06 2019-11-05 Orionis Biosciences Nv Proteínas quiméricas dirigidas y sus usos.
WO2018144999A1 (en) 2017-02-06 2018-08-09 Orionis Biosciences, Inc. Targeted engineered interferon and uses thereof
US11246911B2 (en) 2017-02-07 2022-02-15 Vib Vzw Immune-cell targeted bispecific chimeric proteins and uses thereof
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
WO2018204352A1 (en) * 2017-05-01 2018-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Monoclonal antibodies against alpha-synuclein fibrils
JP2020520671A (ja) * 2017-05-24 2020-07-16 ノバルティス アーゲー 抗体−サイトカイングラフト化タンパク質及び使用方法
WO2019010224A1 (en) * 2017-07-03 2019-01-10 Torque Therapeutics, Inc. FUSION MOLECULES TARGETING IMMUNE REGULATORY CELLS AND USES THEREOF
EP3658186A4 (en) * 2017-07-24 2020-08-12 Rutgers, The State University of New Jersey FUSION MOLECULES TARGETING PHOSPHATIDYLSERINE AND THEIR METHODS OF USE
HUE058233T2 (hu) 2017-08-03 2022-07-28 Amgen Inc Interleukin-21-muteinek és kezelési eljárások
WO2019032661A1 (en) * 2017-08-09 2019-02-14 Orionis Biosciences Inc. CD8 LIAISON AGENTS
JP7423511B2 (ja) 2017-08-09 2024-01-29 オリオンズ バイオサイエンス インコーポレイテッド Ｐｄ－１およびｐｄ－ｌ１結合物質
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
US11618787B2 (en) 2017-10-31 2023-04-04 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating high risk multiple myeloma
CR20200330A (es) 2018-01-12 2020-12-23 Amgen Inc Anticuerpos anti-pd-1 y métodos de tratamiento
US20200354424A1 (en) * 2018-01-26 2020-11-12 Orionis Biosciences, Inc. Xcr1 binding agents and uses thereof
EP3749295A4 (en) 2018-02-05 2022-04-27 Orionis Biosciences, Inc. FIBROBLAST BINDING AGENTS AND USES THEREOF
US11110123B2 (en) 2018-07-17 2021-09-07 Triumvira Immunologics Usa, Inc. T cell-antigen coupler with various construct optimizations
SG11202104012QA (en) 2018-12-14 2021-05-28 Morphosys Ag Antibody formulations
EP3947429A4 (en) * 2019-03-28 2023-05-17 Orionis Biosciences, Inc. CLEC9A-BASED CHIMERA PROTEIN COMPLEXES
US11440943B2 (en) 2019-03-28 2022-09-13 Orionis Biosciences, Inc. Therapeutic interferon alpha 1 proteins
US11655302B2 (en) * 2019-06-10 2023-05-23 Sanofi Anti-CD38 antibodies and formulations
AU2020312735A1 (en) 2019-07-18 2021-12-16 Enyo Pharma Method for decreasing adverse-effects of interferon
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
WO2021239020A1 (zh) * 2020-05-26 2021-12-02 上海邦耀生物科技有限公司 一种联合嵌合抗原受体和i型干扰素的免疫治疗方法及其应用
AU2021329378A1 (en) 2020-08-19 2023-03-23 Xencor, Inc. Anti-CD28 compositions
WO2022072495A2 (en) * 2020-10-01 2022-04-07 Academia Sinica Potent neutralizing antibodies for prevention and treatment of covid-19
CN117157319A (zh) 2021-03-09 2023-12-01 Xencor股份有限公司 结合cd3和cldn6的异二聚抗体
WO2022192586A1 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
AU2022246048A1 (en) 2021-03-26 2023-08-31 Innate Pharma Multispecific proteins comprising an nkp46-binding site, a cancer antgienge binding site fused to a cytokine for nk cell engaging
AU2022288123A1 (en) 2021-06-09 2023-11-30 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp46, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2023052846A2 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 Ildong Pharmaceutical Co., Ltd. Immunocytokine containing il-21r mutein
WO2023178253A2 (en) * 2022-03-18 2023-09-21 Igm Biosciences, Inc. Use of a multimeric anti-pd-l1 binding molecule in combination with a monoclonal antibody therapy
CN115057946B (zh) * 2022-06-30 2023-05-16 四川省医学科学院·四川省人民医院 干扰素在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用
WO2024040247A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interferon proproteins and uses thereof
US20240067691A1 (en) 2022-08-18 2024-02-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interferon receptor agonists and uses thereof
CN117430716A (zh) * 2023-10-16 2024-01-23 珠海臻谱基因科技有限公司 靶向保守的HIV gp41亚基近膜端外区的重组干扰素药物及其应用

Family Cites Families (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2148299B (en) 1983-09-01 1988-01-06 Hybritech Inc Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life
US4908431A (en) 1986-01-22 1990-03-13 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Monoclonal antibodies to human kininogen and methods of preparing same
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US5846534A (en) 1988-02-12 1998-12-08 British Technology Group Limited Antibodies to the antigen campath-1
AU4128089A (en) 1988-09-15 1990-03-22 Rorer International (Overseas) Inc. Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5976531A (en) 1990-04-19 1999-11-02 The Dow Chemical Company Composite antibodies of human subgroup IV light chain capable of binding to tag-72
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
US5650150A (en) * 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
EP1362868A3 (en) 1991-03-06 2004-02-11 MERCK PATENT GmbH Humanized and chimeric monoclonal antibodies that bind epidermal growth factor receptor (EGF-R)
DE122009000019I1 (de) 1991-04-25 2009-07-16 Chugai Seiyaku K K 5 1 Rekombinierte humane antikörper gegen den humanen interleukin-6 rezeptor
US5545533A (en) 1991-05-25 1996-08-13 Boehringer Mannheim Gmbh Monoclonal antibodies against c-kit and method of detecting a malignancy using c-kit specific antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5824307A (en) 1991-12-23 1998-10-20 Medimmune, Inc. Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus
US6042828A (en) 1992-09-07 2000-03-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Humanized antibodies to ganglioside GM2
EP0627932B1 (en) 1992-11-04 2002-05-08 City Of Hope Antibody construct
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
US5441734A (en) * 1993-02-25 1995-08-15 Schering Corporation Metal-interferon-alpha crystals
US5840299A (en) 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
RU2170257C2 (ru) 1994-03-17 2001-07-10 Мерк Патент Гмбх Анти-эфрр одноцепочечный fv, химерное анти-эфрр антитело и способ его получения, фармацевтическая композиция для лечения опухолей, средство для диагностики локализации или оценки роста опухоли
ES2167391T3 (es) 1994-09-16 2002-05-16 Merck Patent Gmbh Inmunoconjugados ii.
US20020164788A1 (en) 1994-12-02 2002-11-07 The Wellcome Foundation Limited Humanized antibodies to CD38
CA2222247A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Innogenetics N.V. Immunotoxins specific for cd80 and cd86 expressing cells
WO1997000271A1 (en) 1995-06-14 1997-01-03 The Regents Of The University Of California Novel high affinity human antibodies to tumor antigens
AU725609C (en) 1995-08-18 2002-01-03 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
HUP9901562A3 (en) 1996-05-04 2000-06-28 Astrazeneca Ab Monoclonal antibody to cea, conjugates comprising said antibody, and their therapeutic use in an adept system
US6417337B1 (en) 1996-10-31 2002-07-09 The Dow Chemical Company High affinity humanized anti-CEA monoclonal antibodies
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6872568B1 (en) 1997-03-17 2005-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5 antibodies
GB9709421D0 (en) * 1997-05-10 1997-07-02 Zeneca Ltd Chemical compounds
BR9812267B1 (pt) 1997-07-14 2013-11-26 Hormônio de crescimento recombinante.
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
MXPA01003790A (es) 1998-10-16 2002-09-18 Biogen Inc Proteinas de fusion beta - interferon y sus usos.
CA2354377C (en) 1998-12-09 2007-04-10 Tatsuji Seki A method for manufacturing glycoproteins having human-type glycosylation
US7223397B1 (en) 1999-01-07 2007-05-29 Research Development Foundation Potentiation of anti-CD38-Immunotoxin cytotoxicity
NZ539776A (en) 1999-01-15 2006-12-22 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
CA2362670A1 (en) 1999-03-12 2000-09-14 Georgetown University Matriptase, a serine protease and its applications
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
DK1252192T3 (da) 2000-02-11 2006-11-20 Merck Patent Gmbh Forbedring af antistofbaserede fusionsproteiners serumhalveringstid
US7063845B2 (en) 2000-04-28 2006-06-20 Gemini Science, Inc. Human anti-CD40 antibodies
US7521047B2 (en) 2000-05-12 2009-04-21 Gpc Biotech Ag Human polypeptides causing or leading to the killing of cells including lymphoid tumor cells
JP3597140B2 (ja) 2000-05-18 2004-12-02 日本たばこ産業株式会社 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
AU6541801A (en) * 2000-06-22 2002-01-02 Idec Pharma Corp Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
ATE440959T1 (de) 2000-06-28 2009-09-15 Glycofi Inc Verfahren für die herstellung modifizierter glykoproteine
EP1174440A1 (en) 2000-07-19 2002-01-23 U-BISys B.V. A selectively-expressed epitope on the human CD38 molecule detected by a phage display library-derived human scFv antibody fragment
US7323552B2 (en) 2000-07-31 2008-01-29 The General Hospital Corporation Variant integrin polypeptides and uses thereof
EP2354149B1 (en) 2000-12-12 2017-08-30 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
CA2433800C (en) 2001-01-05 2016-09-13 Pfizer Inc. Antibodies to insulin-like growth factor i receptor
FR2823764B1 (fr) 2001-04-24 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides du gene ifn alpha-17
US20020193569A1 (en) 2001-06-04 2002-12-19 Idec Pharmaceuticals Corporation Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
EP2192130A1 (en) 2001-07-03 2010-06-02 Genentech, Inc. Human DR4 antibodies and uses thereof
WO2004006955A1 (en) 2001-07-12 2004-01-22 Jefferson Foote Super humanized antibodies
AR035119A1 (es) 2001-08-16 2004-04-14 Lilly Co Eli Anticuerpos humanos antagonistas anti-htnfsf13b
EP1369431A4 (en) 2001-10-15 2005-01-12 Kirin Brewery ANTI-HLA-DR ANTIBODIES
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US20040185040A1 (en) 2001-11-21 2004-09-23 Celltech R & D Limited Modulating immune responses
KR100668538B1 (ko) 2002-01-09 2007-01-16 메다렉스, 인코포레이티드 Ｃｄ３０에 대한 인간 모노클로날 항체
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
ATE477276T1 (de) 2002-03-01 2010-08-15 Immunomedics Inc Internalisierung von anti cd74 monoklonalen antikörpern und deren verwendungen
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US7332580B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The University Of California Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
US7332585B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The California University Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
JP2006502110A (ja) 2002-07-03 2006-01-19 イミュノジェン・インコーポレーテッド 非放出Ｍｕｃ１およびＭｕｃ１６に対する抗体、およびその使用
US7611700B2 (en) * 2002-09-09 2009-11-03 Hanall Pharmaceuticals, Co., Ltd. Protease resistant modified interferon alpha polypeptides
WO2004022747A1 (en) 2002-09-09 2004-03-18 Nautilus Biotech Rational directed protein evolution using two-dimensional rational mutagenesis scanning
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
CA2504818C (en) 2002-11-07 2013-04-23 Immunogen, Inc. Anti-cd33 antibodies and method for treatment of acute myeloid leukemia using the same
US7456257B2 (en) 2003-02-18 2008-11-25 Merck Patent Gmbh Fusion proteins of interferon alpha muteins with improved properties
US7709610B2 (en) 2003-05-08 2010-05-04 Facet Biotech Corporation Therapeutic use of anti-CS1 antibodies
EP1694706B1 (en) 2003-11-01 2012-04-04 Merck Patent GmbH Modified anti-cd52 antibody
ATE516819T1 (de) 2003-11-04 2011-08-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Verfahren zur behandlung von b-zell-bedingtem krebs
EP1711527A4 (en) 2003-12-15 2008-09-03 Dendreon Corp HLA-DR SPECIFIC ANTIBODIES, COMPOSITIONS AND METHODS
ES2541436T3 (es) 2004-02-06 2015-07-20 Morphosys Ag Anticuerpos humanos anti-CD38 y usos para ellos
US8263746B2 (en) 2004-02-06 2012-09-11 Morphosys Ag Anti-CD38 human antibodies and uses thereof
US8034352B2 (en) 2005-04-06 2011-10-11 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Tetrameric cytokines with improved biological activity
WO2005086875A2 (en) 2004-03-11 2005-09-22 City Of Hope A humanized anti-cea t84.66 antibody and uses thereof
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
WO2006003179A2 (en) 2004-07-01 2006-01-12 Novo Nordisk A/S Antibodies binding to receptors kir2dl1, -2, 3 but not kir2ds4 and their therapeutic use
KR20070085227A (ko) 2004-08-09 2007-08-27 앨리오스 바이오파마 인크. 합성 초글리코실화, 프로테아제 저항성 폴리펩티드 변이체,경구 제제 및 이를 이용한 방법
EP1799262A4 (en) 2004-10-15 2009-10-21 Seattle Genetics Inc ANTI-CD70 ANTIBODIES AND ITS USE FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF CANCER DISORDERS AND IMMUNE DISORDERS
EP1842857B1 (en) * 2004-11-12 2011-03-09 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Mutant interferon proteins and use thereof
RS59399B1 (sr) 2005-03-23 2019-11-29 Genmab As Antitela protiv cd38 za lečenje multiplog mijeloma
EP2799451A1 (en) 2005-05-24 2014-11-05 MorphoSys AG Generation and profiling of fully human HuCAL GOLD®-derived therapeutic antibodies specific for human CD38
CA2609613A1 (en) 2005-05-26 2006-11-30 Schering Corporation Interferon-igg fusion
US7736647B2 (en) 2005-06-15 2010-06-15 Monoclonal Antibodies Therapeutics Anti-CD71 monoclonal antibodies and uses thereof for treating malignant tumor cells
EP2476428B1 (en) 2005-06-29 2013-08-21 Yeda Research and Development Co. Ltd. Recombinant interferon alpha 2 (IFN alpha 2) mutants
EP2397496A3 (en) 2005-07-18 2013-05-29 Amgen, Inc Human anti-B7RP1 neutralizing antibodies
EP1922081B1 (en) 2005-09-09 2012-08-15 Imperial Innovations Limited Interferon lambda therapy for treatment of respiratory diseases
CA2623236A1 (en) 2005-09-26 2007-04-05 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to cd70
WO2007044892A2 (en) * 2005-10-10 2007-04-19 American Diagnostica, Inc. Upar-binding molecule-drug conjugates and uses thereof
JP5362359B2 (ja) 2005-10-12 2013-12-11 モルフォシス アーゲー ヒトＣＤ３８に特異的な完全ヒトＨｕＣＡＬＧＯＬＤ由来の治療抗体の生成とプロファイリング
JP2009513147A (ja) 2005-10-31 2009-04-02 アメリカ合衆国 ヒト糖タンパクｎｍｂをターゲットにする抗体および免疫毒素
GB0525214D0 (en) 2005-12-12 2006-01-18 Bioinvent Int Ab Biological materials and uses thereof
CN101045156B (zh) * 2006-03-29 2012-05-02 刘宏利 特异靶向性药物及其用途
TWI395754B (zh) 2006-04-24 2013-05-11 Amgen Inc 人類化之ｃ-ｋｉｔ抗體
EP1878747A1 (en) 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
FR2905375A1 (fr) 2006-08-29 2008-03-07 Biomethodes Sa Variants ameliores de l'interferon alpha humain
US8394374B2 (en) 2006-09-18 2013-03-12 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target HM1.24
LT2081595T (lt) 2006-09-26 2019-07-10 Genmab A/S Anti-cd38 plius kortikosteroidai, plius nekortikosteroidinis chemoterapinis agentas, skirti vėžio gydymui
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
WO2008124086A2 (en) 2007-04-05 2008-10-16 President And Fellows Of Harvard College Chimeric activators: quantitatively designed protein therapeutics and uses thereof
KR20100017514A (ko) 2007-05-07 2010-02-16 메디뮨 엘엘씨 항 ｉｃｏｓ 항체, 및 종양, 이식 및 자가면역성 질환 치료에서의 이의 용도
EP2144628B1 (en) 2007-05-08 2012-10-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-muc16 antibodies and antibody drug conjugates
US20110045007A1 (en) 2007-05-31 2011-02-24 Genmab A/S Fusion or linked proteins with extended half life
US8248984B2 (en) 2007-06-20 2012-08-21 I Squared Llc System and method for interfacing devices
WO2009017838A2 (en) * 2007-08-01 2009-02-05 Exelixis, Inc. Combinations of jak-2 inhibitors and other agents
EP2187971A2 (en) * 2007-08-01 2010-05-26 The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services A fold-back diabody diphtheria toxin immunotoxin and methods of use
US20090076249A1 (en) 2007-09-19 2009-03-19 Michel De Weers Antibodies against CD38 for treatment of multiple myeloma
EP2853267B1 (en) 2007-09-21 2016-12-07 The Regents of the University of California Targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
US20100261275A1 (en) 2007-12-10 2010-10-14 Yves Durocher Production of Recombinant Interferon Proteins
US8092804B2 (en) 2007-12-21 2012-01-10 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα)-173
ES2543201T3 (es) 2007-12-26 2015-08-17 Biotest Ag Métodos y agentes que mejoran la dirección a las células tumorales que expresan CD138
RU2537265C2 (ru) 2007-12-26 2014-12-27 Биотест Аг Агенты против клетки-мишени, нацеленные на cd138, и их применение
US8470977B2 (en) 2008-03-14 2013-06-25 Transgene S.A. Antibody against the CSF-1R
WO2010002862A2 (en) 2008-07-01 2010-01-07 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Fibroblast growth factor receptor 3 (fgfr3) binding proteins
UA108349C2 (uk) 2009-03-16 2015-04-27 Сефалон Острейліа Пті Лтд Гуманізоване антитіло з протипухлинною активністю
TWI614267B (zh) 2009-05-13 2018-02-11 建新公司 抗人類ｃｄ５２免疫球蛋白
NZ603193A (en) 2010-05-04 2014-07-25 Five Prime Therapeutics Inc Antibodies that bind csf1r
EP3613774A1 (en) 2010-06-09 2020-02-26 Genmab A/S Antibodies against human cd38
US8909257B2 (en) 2010-06-19 2014-12-09 Qualcomm Incorporated Positioning protocol conveyance
DK2621531T3 (en) 2010-09-27 2017-02-27 Morphosys Ag ANTI-CD38 ANTIBODY AND LENALIDOMIDE OR BORTEZOMIB FOR TREATMENT OF MULTIPLE MYELOM AND NHL
UA112062C2 (uk) 2010-10-04 2016-07-25 Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх Cd33-зв'язувальний агент
KR101941514B1 (ko) 2010-12-22 2019-01-23 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 개선된 반감기를 가지는 변형된 항체
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
JP6184965B2 (ja) 2011-10-28 2017-08-23 テバ・ファーマシューティカルズ・オーストラリア・ピーティワイ・リミテッド ポリペプチド構築物およびその使用
EP2804877B1 (en) 2012-01-20 2018-08-22 VIB vzw Targeted mutant alpha-helical bundle cytokines
EP2822575B1 (en) 2012-03-03 2020-05-06 ImmunGene, Inc. Engineered antibody-interferon mutant fusion molecules
WO2014028502A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 ImmunGene Inc. Engineered antibody-interferon fusion molecules for treatment of autoimmune diseases
CN105051620A (zh) 2013-01-25 2015-11-11 拜耳材料科技股份有限公司 具有体积全息图和印刷特征的安全元件
AU2013388126B2 (en) 2013-04-29 2019-03-07 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
EP3212216A4 (en) 2014-10-29 2018-04-18 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Interferon alpha2b variants

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