CN109022465A - 多肽构建体及其用途 - Google Patents

多肽构建体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN109022465A
CN109022465A CN201810868213.4A CN201810868213A CN109022465A CN 109022465 A CN109022465 A CN 109022465A CN 201810868213 A CN201810868213 A CN 201810868213A CN 109022465 A CN109022465 A CN 109022465A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ifn
antibody
cell
antigen
construct
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810868213.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109022465B (zh
Inventor
D·S·小威尔逊
S·L·波古伊
G·E·米科塞尔
T·陶拉
W·科维
A·G·多伊勒
A·克拉克
M·波拉德
S·特兰
J·T-C·林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd
Original Assignee
Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2011904502A external-priority patent/AU2011904502A0/en
Application filed by Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd filed Critical Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd
Publication of CN109022465A publication Critical patent/CN109022465A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109022465B publication Critical patent/CN109022465B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5406—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5412—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及多肽构建体及其用途。本发明提供了多肽构建体，其包含连接至结合细胞表面相关抗原的抗体或其抗原结合部分的肽或多肽信号传递配体，其中所述配体包含降低其对缺少所述抗原表达的细胞的效力的至少一个氨基酸取代或缺失。

Description

多肽构建体及其用途
相关申请
本申请是国际申请日为2012年10月29日的国际申请PCT/AU2012/001323进入中国、申请号为201280064672.8的题为“多肽构建体及其用途”的发明专利申请的分案申请。本申请要求在2011年10月28日提交的标题为“多肽构建体及其用途”的澳大利亚专利申请2011904502的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及包含连接至抗体的突变的、弱化的多肽配体的多肽构建体，其中所述抗体将所述突变配体指向在其表面表达与所述抗体结合的抗原和所述配体的受体的细胞。本发明进一步涉及包括使用这些多肽构建体的治疗方法。
背景技术
已描述多种肽和多肽配体通过与细胞表面上的受体相互作用而发挥功能，并且由此刺激、抑制或另外调节生物应答，通常涉及带有所述受体的细胞内的信号转导途径。这类配体的实例包括肽和多肽激素、细胞因子、趋化因子、生长因子、凋亡诱导因子等。天然配体可以是可溶的，或者可以连接到另一细胞的表面。
由于这类配体的生物活性，一些具有作为治疗剂的潜在用途。一些肽或多肽配体已由管理机构批准作为治疗产品，包括例如，人生长激素、胰岛素、干扰素(IFN)-α2b、IFNα2a、IFNβ、红细胞生成素、G-CSF和GM-CSF。很多这些和其他配体已展示了在治疗应用中的潜能，但也显示出在向人类患者施用时的毒性。毒性的一个原因是这些配体中的大多数引发多种细胞上的受体，包括介导治疗作用的那些细胞之外的细胞。例如，在使用IFNα2b治疗多发性骨髓瘤时，其效用至少部分地在于其结合于骨髓瘤细胞上的I型干扰素受体，这进而引发减少的增殖并因此限制疾病进展。然而，遗憾的是，这种IFN还结合体内的多种其他正常细胞，引发多种其他细胞应答，其中一些是有害的(例如，流感样症状、嗜中性白血球减少、抑郁)。配体的这种“脱靶(off target)”活性的结果是，很多配体不适合作为药物候选物。在本文中，“脱靶活性”是指对于配体的天然受体，但在介导治疗有益作用的那些细胞之外的细胞表面上的活性。
即便一些配体，例如IFNα2b，批准用于治疗医学状况，它们由于其“脱靶”生物活性而耐受不良。脱靶活性和相关的不良耐受性还意味着，这些基于肽配体的药物中的一些不能以足够高的剂量施用，以对介导治疗作用的靶细胞产生最佳治疗作用。
类似地，自二十世纪80年代中期以来，已知干扰素，特别是IFNα，能够提高凋亡并且减少某些癌细胞的增殖。这些生物活性由癌细胞表面上的I型干扰素受体介导，其在受到刺激时，启动各种信号转导途径，导致增殖降低和/或诱导终末分化或凋亡。IFNα已由FDA批准用于治疗多种癌症，包括黑素瘤、肾细胞癌、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性骨髓性白血病(CML)和毛细胞性白血病。IFNα对肿瘤细胞的“直接”作用由IFNα对这些细胞上的I型IFN受体的直接结合介导，并刺激凋亡、终末分化或降低的增殖。IFNα对非癌细胞的“间接”作用是刺激免疫系统，这可通过导致免疫系统排斥肿瘤而产生额外的抗癌作用。
遗憾的是，I型干扰素受体也存在于大多数非癌细胞上。通过IFNα活化这些细胞上的这种受体导致多种促炎细胞因子和趋化因子的表达，导致毒性。这种毒性阻止了IFNα以对癌细胞发挥最大抗增殖和促凋亡活性的水平向个体给药。
Ozzello等人(Breast Cancer Research and Treatment 25：265-76，1993)描述了将人IFNα与肿瘤靶向抗体共价连接，从而将IFNα的直接抑制活性定位到肿瘤，作为降低肿瘤生长速率的途径，并且证实了这种缀合物在人癌症的异种移植模型中具有抗肿瘤活性。所观察到的抗癌活性的机制归因于IFNα对癌细胞的直接作用，因为在试验中使用的人IFNα没有可观地与鼠I型IFN受体相互作用，该相互作用可导致间接抗癌作用。然而，由于人IFNα与鼠细胞的结合的这种缺失，该作者不能评估抗体-INFα缀合物相对于游离IFNα的毒性。这些作者使用化学方法以将IFNα连接至抗体。
Alkan等人，(Journal of Interferon Research，volume 4，number 3，p.355-63，1984)证实了将人IFNα连接至结合E.B.病毒(EBV)膜抗原(MA)的抗体提高了其针对表达EBV-MA抗原的细胞的抗增殖活性。这种提高的效力依赖于靶细胞的抗原表达和抗体的结合特异性二者。所测试的细胞系是癌细胞系QIMR-WIL，成髓细胞白血病。该作者提出IFNα与抗体的连接可用作癌症的治疗，因为它可减少肿瘤生长。Alkan等人没有解决这些抗体-IFNα缀合物由于其与正常的抗原阴性细胞的相互作用而产生的潜在毒性。
还已知抗体和IFNα之间的连接可通过制备融合蛋白构建体完成。例如，IDEC(WO01/97844)公开了人IFNα与靶向肿瘤抗原CD20的IgG重链C-末端的直接融合。其他小组已公开了在IgG重链C-末端和IFNα之间的各种接头的用途。例如，US 7,456,257公开了抗体重链恒定区的C-末端可通过序列(GGGGS)n(其中n可以是1、2或3)的插入的富含丝氨酸-甘氨酸(S/G)接头连接至IFNα，并且无论接头长度如何，融合蛋白构建体的IFNα活性没有显著差异。
Morrison等人(US2011/0104112A1；和Xuan C，Steward KK，Timmerman JM，Morrison SL.Targeted delivery of interferon-α via fusion to anti-CD20 resultsin potent antitumor activity against B-cell lymphoma.Blood 2010；115：2864-71)也公开了连接至靶向癌症的IgG抗体重链C-末端的IFNα，具有插入的S/G接头，并且观察到IgG和接头与IFNα的融合降低了IFNα对于不在细胞表面上表达对应抗原的细胞的活性。与作用于人细胞的人非融合蛋白IFNα(游离IFNα)相比，这些融合蛋白构建体的降低的IFN活性是适度的，但鼠IFNα对鼠细胞的作用看起来更为显著。如Morrison等人和US 7,456,257中观察到的，由于融合至抗体的C-末端而导致的人IFNα活性降低是适度的，并且通常认为是不利的，因为这降低了配体的效力。例如，Rossi等人(Blood vol.114，No.18，pp3864-71)指出了这种缺陷，他们使用可选的策略将IFNα连接至肿瘤靶向抗体，其连接方式导致观察到没有IFNα活性的损失。
现有技术通常教导使用有效的IFN并且将这种IFN靶向癌细胞。尽管这种方法导致IFN对癌细胞的活性提高，但没有解决IFN对正常的“脱靶”细胞的活性的问题。在上述现有技术实例中，抗体-IFNα融合蛋白的人IFNα部分，在暴露于不在其细胞表面表达对应抗原的人细胞时，保持高比例的天然IFNα活性。这种活性可导致由于融合蛋白的IFNα部分活化非癌的正常(“脱靶”)细胞而产生的毒性。因此，存在降低基于配体的药物的“脱靶”活性，同时保持这些配体的“中靶(on-target)”治疗作用的需求。保持目标特异性配体活性并且同时降低基于配体的治疗剂的非目标毒性，将对在治疗上有用的配体产生更大的治疗浓度窗口。例如，使用以下形式的人IFNα将是期望的，所述形式可使其活性指向癌细胞，同时使其对正常人细胞的作用最小化。理想地，将最大程度地刺激癌细胞上的I型干扰素受体，同时非癌细胞上的相同受体将经历最小的刺激。需要以如下方式将人IFNα靶向癌细胞，使其对于展示抗原的癌细胞比不展示抗原的正常细胞具有显著更高的活性。相同的逻辑适用于其他潜在的治疗性配体，例如其他细胞因子、肽和多肽激素、趋化因子、生长因子、凋亡诱导因子等。
发明内容
本发明已发现当具有大幅降低配体对其受体的亲和力的一个或多个突变的肽或多肽信号传递配体连接到将所述突变配体靶向展示抗体的对应抗原的靶细胞的抗体时，保持了所述配体对抗原阳性的靶细胞(target antigen-positive cells)的活性，同时大幅降低了所述配体对抗原阴性的非靶细胞(non-target antigen-negative cells)的活性。最终结果是如下的配体信号传递分子，其对抗原阳性靶细胞上的它的受体的活化的效力比对抗原阴性非靶细胞强很多，这提供了降低由脱靶配体活性导致的毒性的方法。
因此，本发明的第一方面提供了多肽构建体，其包含连接到结合细胞表面相关抗原的抗体或其抗原结合部分的肽或多肽信号传递配体，其中所述配体包含降低其对缺少所述抗原表达的细胞的效力的至少一个氨基酸取代或缺失。
在第二方面，本发明提供了治疗个体的肿瘤的方法，包括向所述个体施用本发明的多肽构建体。
在第三方面，本发明提供了本发明的多肽构建体在癌症治疗中的用途。
在第四方面，本发明提供了包含本发明的多肽构建体和药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。
在第五方面，本发明提供了降低肽或多肽信号传递配体对带有配体受体的抗原阴性细胞的效力，同时保持所述配体对带有配体受体的抗原阳性细胞的效力至与抗原阴性细胞相比时更大程度的方法，所述方法包括修饰所述配体，以使所述配体包含使其对抗原阴性细胞的效力降低的至少一个氨基酸取代或缺失，并将所述修饰的配体连接到抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是对在抗原阳性细胞但不在抗原阴性细胞上的细胞表面相关抗原特异性的。
不同于未弱化的“天然”或“野生型”人配体与抗体或其抗原结合部分的连接(这通常导致配体对抗原阳性细胞的效力比抗原阴性细胞高1-15倍)，本发明证实，将突变的弱化形式的配体连接到相同的抗体，能够对抗原阳性细胞产生比对抗原阴性细胞更高的效力。
在一个实施方式中，所述信号传递配体是IFNα或IFNβ，并且使用如本文所述的“脱靶”测试和“中靶(ARP)”或“中靶(Daudi)”测试，与游离的野生型配体相比，所述多肽构建体显示至少10，至少100，至少1000，至少10000，或至少100000倍的超过抗原阴性细胞的对抗原阳性细胞的更大选择性。
本发明还提供了抗体-弱化配体融合蛋白，其中所述弱化配体是IFNα或IFNβ，并且其中所述融合蛋白构建体，在注射到具有建立的人肿瘤的小鼠时，能够消除肿瘤。
本发明还提供了抗体-弱化配体融合蛋白，其中所述弱化配体是IFNα或IFNβ，并且其中所述融合蛋白构建体，在注射到具有体积大于500立方毫米的建立的人肿瘤的小鼠时，能够消除肿瘤。
本发明还提供了抗体-弱化配体融合蛋白，其中所述弱化配体是IFNα或IFNβ，并且其中所述融合蛋白构建体，在作为单个一次性治疗注射到具有建立的人肿瘤的小鼠时，能够消除肿瘤。
抗体-弱化配体融合蛋白，其中所述弱化配体是IFNα或IFNβ，并且其中所述融合蛋白构建体能够消除小鼠中的建立的骨髓瘤肿瘤和建立的淋巴瘤肿瘤二者。
在这些情况的每一种中，优选所述细胞表面相关抗原是CD38。
在一个实施方式中，所述包含至少一个氨基酸取代或缺失的信号传递配体的氨基酸序列与野生型配体氨基酸序列具有大于90％或大于95％、或大于96％，或大于97％，或大于98％或大于99％的序列同一性。
在一个实施方式中，所述构建体是融合蛋白。
在某些实施方式中，所述信号传递配体连接到抗体或其抗原结合部分的重链的C-末端。在某些实施方式中，所述信号传递配体连接到抗体或其抗原结合部分的轻链的C-末端。在这些实施方式的任一个中，所述配体可直接连接到抗体或其抗原结合部分的重链或轻链的C-末端(即，没有插入的额外接头)。
在一个实施方式中，所述细胞表面相关抗原选自I型MHC或PD-1。
在某些实施方式中，所述细胞表面相关抗原是骨髓瘤相关抗原，其选自CD38、HM1.24、CD56、CS1、CD138、CD74、IL-6R、Blys(BAFF)、BCMA、HLA-SR、激肽原、β2微球蛋白、FGFR3、ICAM-1、蛋白裂解酶(matriptase)、CD52、EGFR、GM2、α4-整联蛋白、IFG-1R和KIR，且配体是IFNα。
在一个实施方式中，所述信号传递配体选自IFNα2b、IFNβ、IL-4或IL-6中的任一个。
在所述信号传递配体是IFNα的某些实施方式中，氨基酸取代或缺失可以是在氨基酸位置R33、R144或A145中的任何一个或多个。在某些实施方式中，所述信号传递配体是IFNα，且所述取代选自R144A(SEQ ID NO：30)、R144S(SEQ ID NO：40)、R144T(SEQ ID NO：41)、R144Y(SEQ ID NO：43)、R144I(SEQ ID NO：35)、R144L(SEQ ID NO：37)、A145D(SEQ ID NO：44)、A145H(SEQ ID NO：47)、A145Y(SEQ ID NO：58)、A145K(SEQ ID NO：49)、R33A+YNS(SEQID NO：65)、R33A(SEQ ID NO：16)和R144A+YNS(SEQ ID NO：68)。
在所述信号传递配体是IFNα且细胞表面相关抗原是CD38的某些实施方式中，所述抗体是选自G003、G005、G024、MOR03077、MORO3079、MORO3080、MORO3100、38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31、38SB39、OKT10、X355/02、X910/12、X355/07、X913/15、R5D1、R5E8、R10A2中的任一种或其抗原结合部分，或与R5D1、R5E8或R10A2具有大于95％，大于96％，大于97％，大于98％或大于99％氨基酸序列同一性的抗体。
在细胞表面相关抗原是CD38的某些实施方式中，所述多肽构建体的信号传递配体是IFNα，且所述治疗是用于个体中选自多发性骨髓瘤、白血病或淋巴瘤的癌症。在具体实施方式中，还使用类视黄醇，例如全反式视黄酸治疗所述个体。在细胞表面相关抗原是CD38的某些实施方式中，所述肿瘤或癌症可选自多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病或急性骨髓性白血病。
在所述配体连接到抗体的实施方式中，所述抗体可以是IgG4。在具体实施方式中，IgG4包含S228P氨基酸取代。
在所述多肽构建体的信号传递配体是IFNα的某些实施方式中，抗体或其抗原结合部分可结合至病毒感染细胞上的细胞表面相关抗原。在这些实施方式中，细胞表面相关抗原可选自病毒编码的蛋白、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰丝氨酸结合蛋白。在细胞表面相关抗原是磷脂酰丝氨酸或磷脂酰丝氨酸结合蛋白的实施方式中，所述构建体可用于治疗丙型肝炎。
在所述多肽构建体的信号传递配体是IFNα或IFNβ的某些实施方式中，细胞表面相关抗原选自CD20、CD38、CD138或CS1。在配体是IFNα或IFNβ的某些实施方式中，所述肿瘤或癌症可选自多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肾细胞癌、慢性骨髓性白血病或毛细胞性白血病。
在具体实施方式中，所述构建体是G005-HC-L0-IFNα(A145D)IgG4。
在所述多肽构建体的信号传递配体是IFNβ的某些实施方式中，所述细胞表面相关抗原是T细胞、骨髓细胞或抗原呈递细胞的细胞表面相关蛋白。
在所述多肽构建体的信号传递配体是IFNβ的某些实施方式中，所述细胞表面相关抗原可选自CD3、CD4、CD8、CD24、CD38、CD44、CD69、CD71、CD83、CD86、CD96、HLA-DR、PD-1、ICOS、CD33、CD115、CD11c、CD14、CD52和PD-1。在这些实施方式中，所述构建体可用于治疗以过度炎症表征的疾病，例如自身免疫性疾病。
在所述多肽构建体的信号传递配体是IFNβ的某些实施方式中，所述至少一个氨基酸取代或缺失选自R35A、R35T、E42K、M62I、G78S、A141Y、A142T、E149K、R152H。在这些实施方式中，IFNβ也可具有C17S或C17A取代。
在某些实施方式中，所述多肽构建体的信号传递配体是IFNγ。在这些实施方式中，所述细胞表面相关抗原可以是肿瘤相关抗原。在其他实施方式中，所述细胞表面相关抗原可选自CD14、FSP1、FAP、PDGFRα和PDGFRβ。在这些实施方式中，所述构建体可用于治疗以过度纤维化表征的疾病。
在所述多肽构建体的信号传递配体是IFNγ的某些实施方式中，所述至少一个氨基酸取代或缺失选自残基A23和D24的缺失，S20I取代、A23V取代、D21K取代和D24A取代。
在所述多肽构建体的信号传递配体是IL-4的某些实施方式中，所述细胞表面相关抗原选自CD3、CD4、CD24、CD38、CD44、CD69、CD71、CD96、PD-1、ICOS、CD52和PD-1。
在所述多肽构建体的信号传递配体是IL-6的某些实施方式中，所述细胞表面相关抗原选自CD3、CD4、CD24、CD38、CD44、CD69、CD71、CD96、PD-1、ICOS、CD52和PD-1。
在所述多肽构建体的信号传递配体是HGF的某些实施方式中，所述细胞表面相关抗原选自ASGR1、ASGR2、FSP1、RTI140/Ti-α、HTI56和VEGF受体。
在所述多肽构建体的信号传递配体是TGFβ的某些实施方式中，所述细胞表面相关抗原选自CD3、CD4、CD8、CD24、CD38、CD44、CD69、CD71、CD83、CD86、CD96、HLA-DR、PD-1、ICOS、CD33、CD115、CD11c、CD14、CD52和PD-1。
在所述多肽构建体的信号传递配体是红细胞生成素的某些实施方式中，所述细胞表面相关抗原选自CD241(RCHE基因的产物)、CD117(c-kit)、CD71(转铁蛋白受体)、CD36(血小板反应蛋白受体)、CD34、CD45RO、CD45RA、CD115、CD168、CD235、CD236、CD237、CD238、CD239和CD240。
在所述多肽构建体的信号传递配体是白细胞介素-10的某些实施方式中，所述细胞表面相关抗原选自CD11c、CD33或CD115、CD14、FSP1、FAP或PDGFR(α或β)。
在第六方面，提供了具有可变区域的抗-CD38抗体，命名为X910/12、X913/15、X355/02、X355/07、R5D1、R5E8或R10A2，具有如下所述的序列：
本领域技术人员能够使用已知的方法容易地从这些序列确定CDR序列。本领域技术人员将意识到，这些CDR序列可用在与以上列举的SEQ ID NO中所指出的那些不同的构架序列中。
附图说明
图1显示了本发明的某些实施方式的示意图，其包含由2条重链和2条轻链组成的抗体，其中一个或两个弱化的信号传递配体连接到每条重链或每条轻链，或二者。
图2显示了本发明的抗体-弱化配体融合蛋白如何通过活化在其细胞表面展示对应于所述抗体的抗原的细胞上的受体引起信号传递的一种可能途径。融合蛋白通过其特异性抗原活化在所述抗体结合的相同细胞上的受体。
图3显示了人CD38的氨基酸序列(SEQ ID NO：131)。
图4显示了本发明的某些示例性信号传递配体的氨基酸序列。(a)人IFNα2b、IFNβ1、IFNβ1b和IFNγ；(b)IL-4和IL-6。
图5显示了本发明的某些抗体-弱化配体融合蛋白的氨基酸序列。
(a)G005-HC-L0-IFNα(A145D)IgG4：(b)nBT062-HC-L0-IFNα(A145D)IgG4：(c)G005-HC-L0-IFNβ(R35A)IgG4：(d)HB95-HC-L16-IL-6(R179E)IgG1：和(e)J110-HC-L6-IL-4(R88Q)IgG1。融合蛋白的命名描述在实施例中。
图6显示IFNα2b、抗体-IFN融合蛋白构建体利妥昔单抗-IFNα2b(利妥昔单抗-HC-L6-IFNαIgG1)和帕利珠单抗-IFNα2b(同种型-HC-L6-IFNαIgG1)，在下文实施例中描述为“脱靶”测定的干扰素活性测定中的非抗体-抗原靶向干扰素活性。在所有附图中，“IFNα当量”是指游离的或连接至抗体的干扰素分子的摩尔浓度。“IFN”是指游离的(非融合蛋白)野生型干扰素。
图7显示在下文实施例中描述为“中靶(Daudi)测定”的抗增殖测定中，利妥昔单抗-IFNα2b融合蛋白构建体(利妥昔单抗-HC-L6-IFNαIgG1)与IFNα2b相比的抗体-抗原靶向干扰素活性。
图8显示在下文实施例中描述的“中靶(Daudi)测定”中，相比于帕利珠单抗-IFNα融合蛋白构建体(同种型-HC-L6-IFNα IgG1)的非靶向活性，利妥昔单抗-IFNα融合蛋白构建体(利妥昔单抗-HC-L6-IFNα IgG1)的抗体-抗原靶向干扰素活性。
图9显示IFNα2b、抗体-IFN融合蛋白构建体利妥昔单抗-IFNα2b(利妥昔单抗-HC-L6-IFNa IgG1)和帕利珠单抗-IFNα2b(同种型-HC-L6-IFNα IgG1)，和已突变以降低其干扰素活性的利妥昔单抗-IFNα2b构建体的某些变体的非抗体-抗原靶向的干扰素活性。这个测定在实施例中描述为“脱靶测定”。
图10显示抗体-IFN融合蛋白构建体利妥昔单抗-IFNα2b(利妥昔单抗-HC-L6-IFNαIgG1)，和经突变以降低干扰素活性的利妥昔单抗-IFNα2b的两种变体的非抗体-抗原靶向的干扰素活性。这个测定在实施例中描述为“脱靶测定”。
图11显示与帕利珠单抗-IFNα2b(同种型-HC-L6-IFNα IgG1)融合蛋白构建体的非靶向活性相比，并与IFNα2b相比，抗体-IFN融合蛋白构建体利妥昔单抗-IFNα2b(利妥昔单抗-HC-L6-IFNα IgG1)，和已突变以降低其干扰素活性的利妥昔单抗-IFNα2b构建体的变体的抗体-抗原靶向的干扰素活性。这个测定在实施例中描述为“中靶(Daudi)测定”。
图12显示抗体-IFN融合蛋白构建体利妥昔单抗-IFNα2b(利妥昔单抗-HC-L6-IFNαIgG1)，和经突变以降低干扰素活性的两种变体的抗体-抗原靶向的干扰素活性。这个测定在实施例中描述为“中靶(Daudi)测定”。
图13显示了本文公开的某些新型人CD38抗体的序列。
图14显示了通过流式细胞术检测新型人抗-CD38抗体与CD38+细胞系RPMI-8226的结合的结果。X轴是以微克/ml计的抗体浓度，且y轴表示平均荧光强度。
图15显示基于抗CD38抗体G005，与抗CD38-IFNα融合蛋白构建体(G005-HC-L0-IFNα IgG4)相比的，IFNα2b的非抗体-抗原靶向的IFN活性。这个测定在实施例中描述为“脱靶测定”。
图16显示IFNα2b相比于抗CD38-IFNα融合蛋白构建体(G005-HC-L0-IFNα IgG4)对多发性骨髓瘤细胞系ARP-1(CD38+)的抗增殖活性。这个测定在实施例中描述为“中靶(ARP)测定”。
图17显示IFNα2b相比于在IFN部分中带有点突变的多种抗CD38-IFNα融合蛋白构建体的非抗体-抗原靶向的IFN活性。这些融合蛋白构建体的抗体可变区来自抗体G005。这个测定在实施例中描述为“脱靶测定”。
图18显示IFNα2b相比于在IFN部分中带有点突变的多种抗CD38-IFNα融合蛋白构建体的非抗体-抗原靶向的IFN活性。这些融合蛋白的抗体可变区来自抗体G005。这个测定在实施例中描述为“脱靶测定”。
图19显示IFNα2b相比于在IFN部分中带有点突变的两种抗CD38-IFNα融合蛋白构建体的非抗体-抗原靶向的IFN活性。这些融合蛋白构建体的抗体可变区来自抗体G005。这个测定在实施例中描述为“脱靶测定”。
图20显示IFNα2b相比于在IFN部分中带有突变的抗CD38-IFNα融合蛋白构建体对淋巴瘤细胞系Daudi的抗增殖活性。这些融合蛋白构建体的抗体可变区来自抗体G005。这个测定在实施例中描述为“中靶(Daudi)测定”。
图21显示IFNα2b和在IFN部分中带有A145G突变的多种抗CD38-IFNα融合蛋白的抗增殖活性。融合蛋白构建体具有6个氨基酸的L6接头或没有接头(L0)，并且是IgG1或IgG4同种型。这些融合蛋白构建体的抗体可变区来自抗体G005。这个测定在实施例中描述为“中靶(Daudi)测定”。
图22显示IFNα2b和在IFN部分中带有A145G突变的两种抗CD38-IFNα融合蛋白的抗增殖活性。两种融合蛋白构建体都具有通过6个氨基酸的接头(L6)或没有接头(L0)而连接至轻链的C-末端的IFN部分。这些融合蛋白构建体的抗体可变区来自抗体G005。这个测定在实施例中描述为“中靶(Daudi)测定”。
图23显示IFNα2b相比于在IFN部分中带有R144A突变的抗CD38-IFNα融合蛋白构建体对多发性骨髓瘤细胞系ARP-1的抗增殖活性。此试验比较了作为同种型(IgG1相比于IgG4)以及在抗体重链C-末端和突变IFN的N-末端之间是否存在L6接头的情况的组合，融合蛋白构建体的效力。这些融合蛋白构建体的抗体可变区来自抗体G005。这个测定在实施例中描述为“中靶(ARP)测定”。
图24显示IFNα2b相比于在IFN部分中带有A145G突变的抗CD38-IFNα融合蛋白构建体对多发性骨髓瘤细胞系ARP-1的抗增殖活性。此试验比较了作为同种型(IgG1相比于IgG4)以及在抗体重链C-末端和突变IFN的N-末端之间是否存在L6接头的情况的组合，融合蛋白构建体的效力。这些融合蛋白构建体的抗体可变区来自抗体G005。这个测定在实施例中描述为“中靶(ARP)测定”。
图25显示在IFN部分中带有不同点突变的多种抗CD38-IFNα融合蛋白构建体的非抗体-抗原靶向的IFN活性。这些融合蛋白构建体的抗体可变区来自抗体G005。这个测定在实施例中描述为“脱靶测定”。
图26显示在IFN部分中带有不同点突变的多种抗CD38-IFNα融合蛋白构建体的非抗体-抗原靶向的IFN活性。这些融合蛋白构建体的抗体可变区来自抗体G005。这个测定在实施例中描述为“脱靶测定”。
图27显示在IFN部分中带有不同点突变的多种抗CD38-IFNα融合蛋白构建体的非抗体-抗原靶向的IFN活性。这些融合蛋白构建体的抗体可变区来自抗体G005。这个测定在实施例中描述为“脱靶测定”。
图28显示在IFN部分中带有不同点突变的多种抗CD38-IFNα融合蛋白构建体的非抗体-抗原靶向的IFN活性。这些融合蛋白构建体的抗体可变区来自抗体G005。这个测定在实施例中描述为“脱靶测定”。
图29显示IFNα2b相比于在IFN部分中带有不同点突变的多种抗CD38-IFNα融合蛋白构建体的非抗体-抗原靶向的IFN活性。这些融合蛋白构建体的抗体可变区来自抗体G005。这个测定在实施例中描述为“脱靶测定”。
图30显示在IFN部分中带有不同点突变的多种抗CD38-IFNα融合蛋白构建体的非抗体-抗原靶向的IFN活性。这些融合蛋白构建体的抗体可变区来自抗体G005。这个测定在实施例中描述为“脱靶测定”。
图31显示在IFN部分中带有多种突变的抗CD38-IFNα融合蛋白构建体对多发性骨髓瘤细胞系ARP-1的抗增殖活性。这些融合蛋白构建体的抗体可变区来自抗体G005。这个测定在实施例中描述为“中靶(ARP)测定”。
图32显示IFNα2b相比于在IFN部分中带有多种突变的抗CD38-IFNα融合蛋白构建体对多发性骨髓瘤细胞系ARP-1的抗增殖活性。这些融合蛋白构建体的抗体可变区来自抗体G005。这个测定在实施例中描述为“中靶(ARP)测定”。
图33显示IFNα2b相比于在IFN部分中带有R144A突变的抗CD38-IFNα融合蛋白构建体对多发性骨髓瘤细胞系ARP-1的抗增殖活性。此试验比较了在相同的突变IFN融合蛋白的背景下的不同抗体可变区域。这个测定在实施例中描述为“中靶(ARP)测定”。
图34显示IFNα2b相比于在IFN部分中带有A145D突变的抗CD38-IFNα融合蛋白构建体对多发性骨髓瘤细胞系ARP-1的抗增殖活性。此试验比较了在相同的突变IFN融合蛋白构建体的背景下的不同抗体可变区域。这个测定在实施例中描述为“中靶(ARP)测定”。
图35显示IFNα2b和在IFN部分中带有R144A突变的多种抗CD38-IFNα融合蛋白构建体的非抗体-抗原靶向的IFN活性。此试验比较了在相同的突变IFN融合蛋白构建体的背景下的不同抗体可变区域。这个测定在实施例中描述为“脱靶测定”。
图36显示IFNα2b和在IFN部分中带有A145D突变的多种抗CD38-IFNα融合蛋白构建体的非抗体-抗原靶向的IFN活性。此试验比较了在相同的突变IFN融合蛋白构建体的背景下的不同抗体可变区域。这个测定在实施例中描述为“脱靶测定”。
图37显示IFNα2b相比于在IFN部分中带有A145D突变的抗CD38-IFNα融合蛋白构建体对多发性骨髓瘤细胞系ARP-1的抗增殖活性。此试验比较了在相同的突变IFN融合蛋白构建体的背景下的不同抗体可变区域。这个测定在实施例中描述为“中靶(ARP)测定”。
图38显示IFNα2b和在IFN部分中带有A145D突变的多种抗CD38-IFNα融合蛋白构建体的非抗体-抗原靶向的IFN活性。此试验比较了在相同的突变IFN融合蛋白构建体的背景下的不同抗体可变区域。这个测定在实施例中描述为“脱靶测定”。
图39显示在IFN部分中带有A145D突变的两种抗体-IFNα融合蛋白构建体对多发性骨髓瘤细胞系ARP-1的抗增殖活性。nBT062抗体结合CD138，而“同种型”抗体则没有结合(它来源于抗体2D12)。这个测定在实施例中描述为“中靶(ARP)测定”。
图40(a)显示IFNα2b和在IFN部分中带有A145D突变的两种抗体-IFNα融合蛋白构建体对多发性骨髓瘤细胞系ARP-1的抗增殖活性。HB95抗体结合人I型MHC(其表达在ARP-1细胞上)，而“同种型”抗体则没有结合(它来源于抗体2D12)。帕利珠单抗，如2D12一样，没有结合ARP-1细胞。(b)显示了相同的测定，比较了其中抗体部分是Fab片段而不是全长抗体的抗体-弱化的IFNα融合蛋白构建体。对于(a)和(b)两图，此测定在实施例中描述为“中靶(ARP)测定”。
图41显示了IFNα和在IFN部分中带有A145D突变的两种抗体-IFNα融合蛋白构建体的抗病毒活性的测量。这种细胞致病作用抑制测定使用细胞系A549和EMC病毒。HB95抗体结合人I型MHC(其表达在A549细胞上)，而来源于抗体2D12的“同种型”抗体则没有结合。
图42显示IFNβ、抗CD38-IFNβ融合蛋白构建体和在IFN部分中带有弱化性R35A突变的相同融合蛋白构建体的非抗体-抗原靶向的IFN活性。这个测定在实施例中描述为“脱靶测定”。
图43显示IFNβ、抗CD38-IFNβ融合蛋白构建体和在IFN部分中带有弱化性R35A突变的相同融合蛋白构建体对多发性骨髓瘤细胞系ARP-1的抗增殖活性。这些融合蛋白构建体的抗体可变区来自抗体G005。这个测定在实施例中描述为“中靶(ARP)测定”。“Ifn当量”是指游离的或连接至抗体的干扰素分子的摩尔浓度。
图44显示了IL-4和以下三种抗体-IL-4融合蛋白构建体的非抗体-抗原靶向的IL-4活性[“脱靶(HB-IL4)测定”]：J110-HC-L6-IL-4 IgG1，融合至野生型IL-4的抗PD1抗体；J110-HC-L6-IL-4(R88Q)，其与此前提到的融合蛋白构建体相同，除了在IL-4部分的弱化性R88Q突变；和基于2D12抗体的同种型-HC-L6-IL-4(R88Q)，其不结合本发明测定中使用的任何细胞并且融合至弱化的IL-4。“IL-4当量”是指游离的或连接至抗体的IL-4分子的摩尔浓度。
图45显示了比较IL-4和以下三种抗体-IL-4融合蛋白构建体的活性的“中靶(Th1转换(diversion))测定”：J110-HC-L6-IL-4 IgG1，融合至野生型IL-4的抗PD1抗体；J110-HC-L6-IL-4(R88Q)，其与此前提到的融合蛋白构建体相同，除了在IL-4部分的弱化性R88Q突变；和基于2D12抗体的同种型-HC-L6-IL-4(R88Q)，其不结合本发明测定中使用的任何细胞并且融合至弱化的IL-4。“IL-4当量”是指游离的或连接至抗体的IL-4分子的摩尔浓度。
图46显示了“IL-6生物测定”，其比较IL-6和各种抗体-IL-6融合蛋白构建体，所述构建体结合靶细胞(基于HB95抗体，其结合靶细胞上的I型MHC)，或不结合靶细胞(基于同种型对照抗体2D12)，融合至野生型IL-6或带有弱化性R179E突变的IL-6。“IL-6当量”是指游离的或连接至抗体的IL-6分子的摩尔浓度。
图47显示了各种化合物对SCID小鼠中的皮下H929骨髓瘤肿瘤的生长的影响。标记为“治疗”的棒显示了使用化合物治疗的持续时间。“同种型”抗体基于抗体2D12。G005是抗CD38抗体。
图48显示了各种化合物对全身性接种人骨髓瘤细胞系MM1S的NOD-SCID小鼠的存活(Kaplan-Meier图)的影响。标记为“治疗”的棒显示了使用化合物治疗的持续时间。G005是抗CD38抗体。
图49显示了各种化合物对NOD-SCID小鼠中的皮下Daudi淋巴瘤肿瘤的生长的影响。标记为“治疗”的棒显示了使用化合物治疗的持续时间。“同种型”抗体基于抗体2D12。G005是抗CD38抗体。
图50显示了各种剂量的抗-CD38-弱化的IFNα融合蛋白构建体(G005-HC-L6-IFNα(A145G)IgG1)和同种型对照-弱化的IFNα融合蛋白构建体(同种型-HC-L6-IFNα(A145G)IgG1)对SCID小鼠中的皮下H929骨髓瘤肿瘤的生长的影响。标记为“治疗”的棒显示了使用化合物治疗的持续时间。“同种型”抗体基于抗体2D12。
图51显示了抗-CD38-弱化的IFNα融合蛋白构建体相比于同种型对照抗体-弱化的IFNα融合蛋白构建体对SCID小鼠中的皮下H929骨髓瘤肿瘤的生长的影响。在这些融合蛋白构建体的背景下，将IgG1与IgG4比较。标记为“治疗”的棒显示了使用化合物治疗的持续时间。“同种型”抗体基于抗体2D12。
图52显示了抗-CD38-弱化的IFNα融合蛋白构建体(X355/02-HC-L0-IFNα(A145D)IgG4)相比于同种型对照抗体-弱化的IFNα融合蛋白构建体对SCID小鼠中的皮下H929骨髓瘤肿瘤的生长的影响。标记为“治疗期”的棒显示了使用化合物治疗的持续时间。“同种型”抗体基于抗体2D12。
图53显示了各种化合物对SCID小鼠中的皮下H929骨髓瘤肿瘤的生长的影响。G005是抗CD38抗体。
图54显示了各自以10mg/kg的剂量多轮施用的抗-CD38-弱化的IFNα融合蛋白构建体(G005-HC-L6-IFNα(A145G)IgG4)和同种型对照-弱化的IFNα融合蛋白构建体(同种型-HC-L6-IFNα(A145G)IgG4)对SCID小鼠中的皮下H929骨髓瘤肿瘤的生长下影响。“同种型”抗体基于抗体2D12。
图55显示了抗-CD38-弱化的IFNα融合蛋白构建体(G005-HC-L6-IFNα(A145G)IgG4)对SCID小鼠中的皮下H929骨髓瘤肿瘤的生长的影响。给药(由箭头标示)在肿瘤体积中值达到730mm3时启动。
图56显示了通过IFNa2b、抗-CD38-弱化的IFNα融合蛋白构建体(G005-HC-L0-IFNα(A145D)IgG4)和同种型对照抗体-弱化的IFNα融合蛋白构建体2D12-HC-L0-IFNα(A145D)IgG4对正常人骨髓单核细胞(BM MNC)的集落形成的抑制作用。抗体-弱化的IFNα融合蛋白构建体在这个测定中显示约10,000倍降低的效力。
图57显示了IFNα2b相比于抗体-弱化的IFNα融合蛋白构建体(同种型-HC-L6-IFNα(A145G)IgG1；同种型可变区基于抗体2D12)对人外周血单核细胞(PBMCs)的细胞因子生产的影响。(a)IP-10和MCP-1；(b)MCP-3和IL-1α。
具体实施方式
本发明的构建体是抗体-弱化配体构建体，其由于弱化配体对细胞表面受体的作用而在活化信号传递途径方面具有升高的抗原-特异性指数。这些构建体是基于意外的发现，即，在抗体-配体构建体的背景下，可将配体部分以如下方式突变，使配体对抗原阴性细胞的活性剧烈弱化，同时配体对抗原活性细胞的活性仅适度地(如果有的话)弱化。与游离配体相比，这样的构建体对抗原-阳性细胞相比于抗原-阴性细胞展示出1、2、3、4或5个数量级更大的效力。在一个实施方式中，抗体-弱化配体构建体保留至少1％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％的如非弱化的游离(即，没有连接至抗体的)配体的对抗原-阳性细胞的效力。此外，在一个实施方式中，所述抗体-弱化配体构建体保留非弱化的游离(即，没有连接至抗体的)配体的最大活性的至少30％、至少50％、至少75％或至少90％；在本上下文中，“最大活性”应理解为是指在剂量-应答曲线的高平台部分(此处试剂的进一步增加不进一步提高应答的量)的信号传递活性(或其下游作用)的量。
如本文使用的“特异性”不必是绝对名称，但常常是相对术语，表示抗体-配体融合蛋白构建体对抗原-阳性细胞相比于抗原-阴性细胞的选择性程度。因此，例如，可将构建体称为具有“对抗原-阳性细胞相比于抗原-阴性细胞100倍的特异性”，并且这可表示构建体对表达所述抗原的细胞具有比没有表达的细胞高100倍的效力。在一些情况下，构建体相比抗原-阳性对比抗原-阴性细胞的这种特异性程度，可以不是基于构建体对抗原-阳性对比抗原-阴性细胞的效力的绝对比例，而是构建体对每种细胞类型的效力相比于游离的、非弱化配体对相同相同细胞类型的效力的绝对比例。这种用于定量抗体-配体构建体的特异性程度的“比例的比例”方法考虑到配体对不同细胞类型的效力的任何内在差异，并且通过表25中的抗原特异性指数(ASI)的计算举例说明。用于确定抗体-配体融合构建体的效力的测定例示在实施例中，并且包括基于细胞的测定，其用于增殖、凋亡，受体和细胞内蛋白的磷酸化、转移、分化(例如天然CD4+T细胞向Th1、Th17、Th2相比于Treg细胞的分化)，基因表达或分泌至培养基中的基因产物的增加或减少等。
因此，在第一方面，本发明提供了多肽构建体，其包含连接至结合细胞表面相关抗原的抗体或其抗原结合部分的肽或多肽信号传递配体，其中所述配体包含降低其对缺少所述抗原表达的细胞的效力的至少一个氨基酸取代或缺失。
在一个实施方式中，本发明提供了多肽构建体，其包含连接至结合肿瘤相关抗原的抗体或其抗原结合部分的IFN，其中所述IFN包含降低其对缺少所述抗原表达的细胞的效力的至少一个氨基酸取代或缺失。这样的多肽能对抗原-阳性肿瘤细胞发挥高效力的INF的抗增殖活性，同时对体内的抗原-阴性的非肿瘤细胞发挥低得多的效力。
第二方面，本发明提供了治疗个体中的肿瘤的方法，包括向所述个体施用本发明的多肽构建体。
如本文使用的术语“抗体-配体构建体”是指共价连接至信号传递配体的抗体或其抗原结合片段，所述信号传递配体已通过减少对于不表达对应于抗体的抗原的细胞的配体效力的一个或多个取代或缺失而弱化。
本文中所用的术语“抗体”广泛地指由四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)构成的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其保留了Ig分子的必需表位结合特征的任何功能性片段、突变体、变体或其衍生物。此类突变体、变体或衍生物抗体形式是本领域已知的，下面讨论其非限制性实施方式。
在全长抗体中，各重链由重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。各轻链由轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为称作互补决定区(CDR)的超可变区，该超可变区散布于称为构架区(FR)的更保守的区。各VH和VL由三个CDR和四个FR构成，其以下列次序从氨基端向羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以为任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
本文中所用术语抗体的“抗原结合结构域”或“抗原结合部分”指的是保留了特异性地结合抗原(例如CD38)的能力的抗体或蛋白质的一个或多个片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。此类抗体实施方式还可以是双特异性(bispecific)、双重特异性(dual specific)的或多重特异性(multi-specific)的形式，特异性地结合两个或多个不同的抗原。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含通过在铰链区的二硫键连接的两个Fab片段和铰链区部分的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)结构域抗体(dAb)(Ward等人，1989Nature 341 544-6；Winter等人，PCT公开WO 90/05144 A1，通过引用并入本文)，其包含单个可变结构域；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但可以使用重组方法，通过能够使其制成单个蛋白质链的合成接头，将它们接合，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人，1988 Science 242 423-6；Huston等人，1988 Proc Natl Acad Sci USA 85 5879-83)。此类单链抗体也意在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”中。还涵盖了其它形式的单链抗体，例如双抗体(diabodies)。双抗体是二价的、双特异性的抗体，其中在单个多肽链上表达VH和VL结构域，但使用太短以至于不允许相同链上两个结构域之间配对的接头，由此迫使该结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger，P.等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.等人，1994，Structure2：1121-1123)。此类抗体结合部分在本领域中是已知的(Kontermann和Dubel编辑，Antibody Engineering 2001 Springer-Verlag.New York.第790页，ISBN 3-540-41354-5)。在一个实施方式中，所述抗体结合部分是Fab片段。
本文中描述的抗体可以是人源化抗体。术语“人源化抗体”应理解为是指包含类人可变区(human-like variable region)的蛋白质，其包括移植到或插入到来自人抗体的FR中的来自源于非人物种(例如小鼠或大鼠或非人灵长类动物)的抗体的CDR(这种类型的抗体也称为“CDR移植抗体”)。人源化抗体还包括其中人蛋白质的一个或多个残基被一个或多个氨基酸取代修饰和/或人蛋白质的一个或多个FR残基用相应的非人残基替换的蛋白质。人源化抗体还可以包含既非在人抗体中或也非在非人抗体中发现的残基。该蛋白质的任何附加区(例如Fc区)通常是人的。人源化可以使用本领域已知的方法进行，例如US 5225539、US 6054297、US 7566771或US 5585089。术语“人源化抗体”还涵盖超人源化蛋白质，例如如在US 7732578中所述。
本文中所述的抗体可以是人的。本文中所用的术语“人抗体”指的是具有在人中(例如在人种系或体细胞中)发现的可变抗体区和任选恒定抗体区的蛋白质，或具有来自使用此类区制得的文库的可变抗体区和任选恒定抗体区的蛋白质。“人”抗体可以包括并非由人序列编码的氨基酸残基，例如通过在体外的随机或定点突变引入的突变(特别是包括在少数蛋白质残基中，例如在蛋白质的1、2、3、4、或5个残基中的保守性置换或突变的突变)。这些“人抗体”不一定需要作为人的免疫应答而产生，相反，它们可以使用重组手段(例如筛选噬菌体展示文库)和/或通过包含编码人抗体恒定和/或可变区的核酸的转基因动物(例如小鼠)和/或使用定向选择(例如如US 5565332中所述)产生。该术语还涵盖此类抗体的亲和力成熟形式。就本公开目的而言，人蛋白质还被认为包括含有来自人抗体的FR或包含来自人FR的共有序列的序列的FR，并且其中CDR的一种或多种是随机或半随机的，例如如US6300064和/或US6248516中所述。
本发明的多肽的抗体部分可以是任何类型的全长抗体，优选IgG1、IgG2或IgG4。此类抗体的恒定结构域优选是人的。此类抗体的可变区可以是非人类来源的，或优选的是人类来源或人源化的。可使用抗体片段替换全长抗体。
术语“抗体”还包括工程化的抗体。如可理解的，有工程化抗体的很多变体(例如，如上文描述的小鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人源化和人单克隆抗体、单链可变抗体片段(scFv′s)、微抗体(minibodies)、适体，以及双特异性抗体和双抗体)。
单链可变区结构域(称作dAbs)例如，公开在(Ward等人，Nature 341：544-546，1989；Hamers-Casterman等人，Nature 363：446-448，1993；Davies和Riechmann，FEBSLett.339：285-290，1994)。
微抗体是完整抗体的小的形式，其在单链中编码完整抗体的基本元件。适合地，微抗体由融合至免疫球蛋白分子的铰链区和CH3结构域的天然抗体的VH和VL结构域构成，如，例如在美国专利号5,837,821中的公开。
在可选的实施方式中，工程化抗体可包含非免疫球蛋白来源的蛋白构架。例如，可参考(Ku和Schutz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6552-6556，1995)，其公开了经过抗原结合选择，具有随机化以产生CDRs的两个环的4-螺旋束的蛋白(four-helix bundleprotein)细胞因子b562。
存在过量的非抗体识别蛋白或蛋白结构域支架，其可用作本发明的构建体中的抗原结合结构域。这些包括支架，其基于细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)(Evibody；US7,166,697)；人转铁蛋白(Trans-body)；来自蛋白A的Z结构域的三螺旋束(Affibody)；单体或三聚的人C-型凝集素结构域(Tetranectin)；第十人III型纤连蛋白结构域(AdNectin)；人或牛胰蛋白酶抑制剂的Kunitz型结构域；昆虫防卫素A(IICA29)，APPI(Kuntiz结构域)；脂质运载蛋白，FABP，胆汁三烯-结合蛋白，载脂蛋白(Apoloproptein)D(Anticalins)；人α-晶体蛋白或泛素分子(Affilin)；胰蛋白酶抑制剂II(Microbody)；α2p8或锚蛋白重复序列(重复-基序蛋白)，卡律蝎毒素(蝎毒素)，Min-23，纤维素结合结构域(Knottins)；新制癌菌素，CBM4-2和淀粉酶抑肽。
进一步地，除了由如上文所述的抗体来源的结构域或非抗体折叠物提供的支架之外，还有可用作本发明中的配体结合结构域的天然发生的配体结合蛋白或蛋白结构域。例如，具有配体结合性质的蛋白结构域包括受体的细胞外结构域，信号传递蛋白的PDZ模块，例如Ras-结合蛋白AF-6、粘附分子和酶。
本发明进一步涵盖对象抗体中的氨基酸的化学类似物。氨基酸的化学类似物的应用可用于尤其是稳定例如在需要的情况下施用于个体的分子。本文预期的氨基酸类似物包括但不限于侧链的修饰、在肽、多肽或蛋白合成期间引入非天然氨基酸和/或其衍生物，以及交联剂的应用，和对蛋白质分子或其类似物加以构象约束的其他方法。
本发明预期的侧链修饰的实例包括氨基基团的修饰，例如通过与醛反应，随后使用NaBH4还原的还原烷基化；使用甲基乙酰亚胺酯的脒化；使用乙酸酐的酰化；使用氰酸盐(酯)的氨基基团的甲氨酰化；使用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)的氨基基团的三硝基苄基化；使用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐的氨基基团的酰化；和使用吡哆醛-5-磷酸随后使用NaBH4还原的赖氨酸的吡哆醛化(pyridoxylation)。
精氨酸残基的胍基团可通过使用试剂，例如2，3-丁二酮、苯乙二醛和乙二醛形成杂环缩合产物修饰。
可通过经O-酰基异脲形成的碳二亚胺活化，随后后续的衍生化，例如衍生成相应的酰胺，而修饰羧基基团。
可通过以下方法修饰巯基基团，例如使用碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化；对磺基丙氨酸的过甲酸氧化；与其他硫醇化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺、马来酐或其它取代的马来酰亚胺的反应；使用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯基磺酸、苯基氯化汞、2-氯汞-4-硝基苯酚和其他汞制剂的汞制剂衍生物的形成；使用氰酸盐(酯)在碱性pH的甲氨酰化。
色氨酸残基可通过，例如使用N-溴代琥珀酰亚胺氧化，或使用2-羟基-5-硝基苯甲基溴化物或亚磺酰卤对吲哚环的烷基化，而修饰。另一方面，可通过使用四硝基甲烷的硝化以形成3-硝基酪氨酸衍生物，而改变酪氨酸残基。
组氨酸残基的咪唑环的修饰，可通过使用碘乙酸衍生物的烷基化，或使用焦碳酸二乙酯的N-乙酯基化而完成。
在肽合成期间引入非天然氨基酸和衍生物的实例包含但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。本文预期的非天然氨基酸的列表显示在表1中。
表1
交联剂可用于例如稳定3D构象，使用同-双功能交联剂，例如具有(CH2)n间隔基团(n＝1至n＝6)的双功能亚胺酯、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，和异-双功能试剂，其通常包含氨基反应性部分，例如N-羟基琥珀酰亚胺和另一基团特异性反应性部分，例如马来酰亚胺或二硫代部分(SH)或碳二亚胺(COOH)。
使用本领域公知的方法，通过例如亲和力成熟以提高结合，或通过除去预测的II型MHC结合基序来降低免疫原性。可以通过调节其功能特性，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、血清半衰期、生物分布和与Fc受体结合或任何这些方法的组合来进一步增强本文描述的抗体的治疗实用性。这种调节可以通过蛋白质工程、糖工程或化学方法来实现。取决于所需的治疗应用，可以有利地提高或降低这些活性的任一种。
糖工程的实例使用了方法，如Shinkawa T.等人，2003(J Biol Chem278：3466-73)中所述。
用于抗体的亲和力成熟的多种方法在本领域是已知的。这些方法的许多基于通过诱变并接着为提高的亲和力而选择和/或筛选生成变体蛋白的组或文库的一般策略。诱变通常在DNA水平进行，例如通过易错PCR法(Thie，Voedisch等人2009)，通过基因改组(Kolkman和Stemmer 2001)，通过使用诱变化学物质或辐射，通过使用具有易错复制机的“增变”株(Greener 1996)或通过利用天然亲和力成熟机制的体细胞高度突变方法(Peled，Kuang等人，2008)。还可以在RNA水平下进行诱变，例如通过使用Qβ复制酶(Kopsidas，Roberts等人，2006)。允许筛选改进的变体蛋白的基于文库的方法可以基于各种展示技术，如噬菌体、酵母、核糖体、细菌或哺乳动物细胞，并且在本领域是公知的(Benhar 2007)。亲和力成熟可以通过更有针对性/更有预测性的方法来实现，例如通过定点诱变或通过来自3D蛋白质建模的发现所指导的基因合成(参见例如Queen，Schneider等人，1989或美国专利6,180,370或美国专利5,225,539)。
提高ADCC的方法已描述于Ferrara，Brunker等人，2006；Li，Sethuraman等人，2006；Stavenhagen，Gorlatov等人，2007；Shields，Namenuk等人，2001；Shinkawa，Nakamura等人，2003；和WO 2008/006554。
提高CDC的方法已描述于Idusogie，Wong等人，2001；Dall′Acqua，Cook等人，2006；Michaelsen，Aase等人，1990；Brekke，Bremnes等人，1993；Tan，Shopes等人，1990；和Norderhaug，Brekke等人，1991。
描述提高ADCC和CDC的方法的文献包括Natsume，In等人，2008。这些文献的每一篇的公开内容通过交叉引用包含在本文中。
用于调节抗体血清半衰期和生物分布的多种方法基于改变抗体与新生Fc受体(FcRn)之间的相互作用，所述新生Fc受体是在保护IgG免受分解代谢并保持高血清抗体浓度中起关键作用的受体。Dall’Acqua等人描述了在IgG1的Fc区中增强与FcRn的结合亲和力的取代，由此提高血清半衰期(Dall′Acqua，Woods等人，2002)，并进一步证实了用M252Y/S254T/T256E的三取代的增强的生物利用率与ADCC活性的调节(Dall′Acqua，Kiener等人，2006)。还参见美国专利号6,277,375；6,821,505；和7,083,784。Hinton等人已经描述了赋予提高的体内半衰期的在位置250和428处的恒定结构域氨基酸取代(Hinton，Johlfs等人，2004)(Hinton，Xiong等人，2006)。还参见美国专利号7,217,797。Petkova等人已经描述了赋予提高的体内半衰期的在位置307、380和434处的恒定结构域氨基酸取代(Petkova，Akilesh等人，2006)。还参见Shields等人2001和WO 2000/42072。调节与Fc受体的结合以及随后通过这些受体介导的功能(包括FcRn结合和血清半衰期)的恒定结构域氨基酸取代的其它实例描述在美国专利申请号20090142340；20090068175；和20090092599中。
已知连接抗体分子的聚糖影响抗体与Fc受体和聚糖受体的相互作用并由此影响抗体活性，包括血清半衰期(Kaneko，Nimmerjahn等人，2006Jones，Papac等人，2007；和Kanda，Yamada等人，2007)。因此，调节期望的抗体活性的某些糖形可以赋予治疗优势。产生工程化的糖形的方法是本领域已知的，并且包括但不限于美国专利号6,602,684；7,326,681；7,388,081；和WO 2008/006554中描述的那些。
通过添加聚乙二醇(PEG)延长半衰期已经广泛用于延长蛋白质的血清半衰期，如例如由Fishburn2008所综述的。
可认识到，可在本发明的序列中进行保守性氨基酸取代。所述“保守性取代”是指具有类似性质的氨基酸。如本说明书中使用的，以下组的氨基酸视为保守性取代：H、R和K；D、E、N和Q；V、I和L；C和M；S、T、P、A和G；和F、Y和W。
如本文中使用的术语“细胞相关抗原”广泛地是指表达在细胞，包括感染性或外源细胞，或病毒表面上的任何抗原。
在本发明的某些方面，本发明的多肽构建体或组合物可用于治疗癌症患者。本文预期的癌症包括：通过不受控的细胞生长(例如，肿瘤形成)，且没有这些细胞至特化细胞和不同细胞的任何分化表征的一组疾病和病症。此类疾病和病症包括：ABL1原癌基因、AIDS相关的癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、囊性癌、肾上腺皮质癌、病因不明的髓样化生、脱发、腺泡状软组织肉瘤、肛门癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星形细胞瘤、共济失调毛细血管扩张症、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干胶质瘤、脑和中CNS肿瘤、乳腺癌、CNS肿瘤、类癌瘤、宫颈癌、儿童脑肿瘤、儿童癌症、儿童白血病、儿童软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、结肠直肠癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、导管癌、内分泌癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏肉瘤、肝外胆管癌、眼癌，眼：黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、范可尼贫血、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠癌、胃肠类癌瘤、泌尿生殖系统癌症、生殖细胞瘤、妊娠性滋养层细胞疾病、神经胶质瘤、妇科癌症、血液系统恶性肿瘤、毛细胞性白血病、头颈癌、肝细胞癌、遗传性乳腺癌、组织细胞增生症、霍奇金病、人乳头状瘤病毒、葡萄胎、高钙血症、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞-组织细胞增生症、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、李弗劳明综合征、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、男性乳腺癌、肾的恶性横纹肌样肿瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移癌、口癌、多发性内分泌腺瘤病、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、骨髓增生性疾病、鼻癌、鼻咽癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤病、奈梅亨破损综合征、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食道癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造口术卵巢癌、胰腺癌、鼻窦癌、副甲状腺癌、腮腺癌、阴茎癌、外周性神经外胚层肿瘤、脑垂体癌、真性红细胞增多症、前列腺癌、罕见癌症和相关的病症、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、Rothmund-Thomson综合症、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、Sezary综合征、皮肤癌、小细胞肺癌(SCLC)、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、鳞状细胞癌(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌(膀胱)、移行细胞癌(肾-骨盆-/-输尿管)、滋养细胞癌、尿道癌、泌尿系统癌、膜板块蛋白(uroplakins)、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、外阴癌、Waldenstrom-巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。在一个实施方式中，所述癌症选自多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。
如预期用于癌症的治疗，本发明的构建体的抗体部分可结合至肿瘤相关抗原，即由癌细胞选择性表达，或相对于大多数正常细胞在癌细胞中过表达的细胞表面抗原。本领域中已知有很多肿瘤相关抗原(TAAs)。TAAs的非限定性实例包括酶酪氨酸酶；黑色素瘤抗原GM2；甲胎蛋白(AFP)；癌胚抗原(CEA)；粘蛋白1(MUC1)；人表皮生长因子受体(Her2/Neu)；T-细胞白血病/淋巴瘤1(TCL1)癌蛋白。与多种不同癌症相关的示例性TAAs为端粒酶(hTERT)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；尿激酶纤溶酶原激活物及其受体(uPA/uPAR)；血管内皮生长因子及其受体(VEGF/VEGFR)；细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN/CD147)；表皮生长因子(EGFR)；血小板衍生的生长因子及其受体(PDGF/PDGFR)和c-kit(CD117)。
US 2010/0297076中提供了其他TAA的列表，其公开通过引用并入本文。特别感兴趣的是与多发性骨髓瘤细胞相关的细胞表面抗原，包括但不限于CD38、CD138、CS1和HM1.24。在一个实施方式中，用于抗体-弱化配体构建体，例如抗体-弱化干扰素构建体的抗原是CD38。
CD38是46kDa的II型跨膜糖蛋白。它具有20个氨基酸的短N-末端胞质尾巴，单跨膜螺旋和256个氨基酸的长细胞外结构域(Bergsagel，P.，Blood；85：436，1995和Liu，Q.，Structure，13：1331，2005)。它表达在很多免疫细胞的表面上，包括CD4和CD8阳性T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、浆细胞和显著比例的正常骨髓前体细胞(Malavasi，F.，Hum.Immunol.9：9，1984)。然而，在淋巴细胞中，表达看起来依赖于细胞的分化和活化状态。静息的T和B细胞是阴性的，而不成熟的且活化的淋巴细胞主要是CD38表达阳性的(Funaro，A.，J.Immunol.145：2390，1990)。其他的研究指出在非造血器官，例如胰腺、脑、脾和肝中的mRNA表达(Koguma，T.，Biochim.Biophys.Acta 1223：160，1994.)。
CD38是多功能的胞外酶，其参与跨膜信号传递和细胞粘附。它还被称作环ADP核糖水解酶，因为取决于细胞外pH，它能够将NAD+和NADP+转化成cADPR、ADPR和NAADP。这些产物诱导细胞内的Ca2+-动员，这抗原导致酪氨酸磷酸化和细胞的活化。CD38还是能够与配体CD31相互作用的受体。经CD31的受体活化导致细胞内事件，包括Ca2+动员、细胞活化、增殖、分化和迁移(Deaglio，S.，Trends in Mol.Med.14：210，2008中的综述)。
CD38以高水平表达在多发性骨髓瘤细胞上，在T-和B-系急性淋巴性白血病的大多数病例，某些急性髓细胞性白血病，滤泡中心细胞淋巴瘤和T淋巴母细胞淋巴瘤中。(Malavasi，F.，J.Clin Lab Res.22：73，1992)。最近，CD38表达已成为B-系慢性淋巴性白血病(B-CLL)的可靠预后标志物(Ibrahim，S.，Blood.98：181，2001和Durig，J.，Leuk.Res.25：927，2002)。独立的小组已经证实，呈现CD38+克隆的B-CLL患者表征为不良的临床病程，和疾病的更晚期阶段，对化疗的应答差和较短的生存时间(Morabito，F.，Haematologica.87：217，2002)。CD38在淋巴瘤的恒定和增强表达使得这成为治疗性抗体技术的有吸引力的靶标。
用于开发靶向癌症的抗体-弱化配体融合蛋白构建体的优选抗原，是与体内的大多数其他、未转化细胞相比，在癌细胞上显示选择性或更多表达的抗原。这类抗原的非蛋白实例包括：鞘脂、神经节苷脂GD2(Saleh等人，1993，J.Immunol.，151，3390-3398)、神经节苷脂GD3(Shitara等人，1993，Cancer Immunol.Immunother.36：373-380)、神经节苷脂GM2(Livingston等人，1994，J.Clin.Oncol.12：1036-1044)、神经节苷脂GM3(Hoon等人，1993，Cancer Res.53：5244-5250)，和能够展示在蛋白或糖脂上的Lewisx、lewisy和lewisxy碳水化合物抗原。蛋白抗原的实例是HER-2/neu、人乳头瘤病毒-E6或-E7、MUC-1；KS 1/4泛癌抗原(Perez和Walker，1990，J.Immunol.142：3662-3667；Bumal，1988，Hybridoma 7(4)：407-415)；卵巢癌抗原CA125(Yu等人，1991，Cancer Res.51(2)：468-475)；前列腺酸式磷酸盐(Tailor等人，1990，Nucl.Acids Res.18(16)：4928)；前列腺特异性抗原(Henttu和Vihko，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.160(2)：903-910；Israeli等人，1993，Cancer Res.53：227-230)；黑色素瘤相关抗原p97(Estin等人，1989，J.Natl.Cancer Instit.81(6)：445-446)；黑色素瘤抗原gp75(Vijayasardahl等人，1990，J.Exp.Med.171(4)：1375-1380)；前列腺特异性膜抗原；癌胚抗原(CEA)(Foon等人，1994，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.13：294)、MUC16(抗体包括MJ-170、MJ-171、MJ-172和MJ-173[US 7,202,346]、3A5[US 7,723,485])、NMB(US 8,039,593)、恶性人类淋巴细胞抗原-APO-1(Bernhard等人，1989，Science 245：301-304)；高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)(Natali等人，1987，Cancer 59：55-63；Mittelman等人，1990，J.Clin.Invest.86：2136-2144)；伯基特淋巴瘤抗原-38.13；CD19(Ghetie等人，1994，Blood 83：1329-1336)；人B-淋巴瘤抗原-CD20(Reff等人，1994，Blood83：435-445)；GICA 19-9(Herlyn等人，1982，J.Clin.Immunol.2：135)，CTA-1和LEA；CD33(Sgouros等人，1993，J.Nucl.Med.34：422-430)；癌胚抗原，例如肝癌的甲胎蛋白或膀胱肿瘤癌胚抗原(Hellstrom等人，1985，Cancer.Res.45：2210-2188)；分化抗原，例如人肺癌抗原L6或L20(Hellstrom等人，1986，Cancer Res.46：3917-3923)；纤维肉瘤的抗原；人白血病T细胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Chatterjee等人，1988，J.Immunol.141：1398-1403)；肿瘤特异性的移植类型的细胞表面抗原(TSTA)，例如病毒诱导的肿瘤抗原，包括T-抗原、DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒的包膜抗原；拟糖蛋白，乳腺癌抗原，例如EGFR(表皮生长因子受体)、多形上皮粘蛋白(PEM)(Hilkens等人，1992，Trends in Bio.Chem.Sci.17：359)；多形上皮粘蛋白抗原；人乳脂肪球抗原；结肠直肠肿瘤相关抗原，例如TAG-72(Yokata等人，1992，Cancer Res.52：3402-3408)、CO 17-1A(Ragnhammar等人，1993，Int.J.Cancer 53：751-758)；分化抗原(Feizi，1985，Nature 314：53-57)，例如见于胃腺癌中的I(Ma)、见于骨髓细胞中的SSEA-1、见于乳腺上皮癌中的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、M18和M39，见于结肠直肠癌中的D156-22、TRA-1-85(H血型)、见于结肠腺癌中的C14、见于肺腺癌中的F3、见于胃癌中的AH6、见于胚胎癌细胞中的Y半抗原、TL5(A血型)、见于胰腺癌中的E1系列(B血型)抗原、见于胚胎癌细胞中的FC10.2、胃腺癌抗原、见于腺癌中的CO-514(Lea血型)、见于腺癌中的NS-10、CO-43(Leb血型)、见于A431细胞中的G49、见于结肠癌中的19.9；胃癌粘蛋白；见于黑色素瘤中的R24、见于结肠腺癌中的MH2(ALeb/Ley血型)、见于胚胎癌细胞中的4.2、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2和M1：22：25：8，和SSEA-3和SSEA-4。HMW-MAA(SEQ ID NO：433)，也称作黑色素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖，是2322个残基的膜结合蛋白，其在超过90％的手术去除的良性痣和黑色素瘤病变中过表达(Camploi，等人，Crit Rev Immunol.；24：267，2004)。因此，它可以是潜在的靶标细胞表面相关抗原。
本发明的融合蛋白构建体靶向的其他示例性癌抗原包括(示例性的癌症显示在括号中)：CD5(T-细胞白血病/淋巴瘤)、CA15-3(癌)、CA19-9(癌)、L6(癌)、CA242(结直肠癌)、胎盘碱性磷酸酶(癌)、前列腺酸性磷酸酶(前列腺癌)、MAGE-1(癌)、MAGE-2(癌)、MAGE-3(癌)、MAGE-4(癌)、转铁蛋白受体(癌)、p97(黑色素瘤)、MUC1(乳腺癌)、MART1(黑色素瘤)、CD20(非霍奇金淋巴瘤)、CD52(白血病)、CD33(白血病)、人绒毛膜促性腺激素(癌)、CD38(多发性骨髓瘤)、CD21(B细胞淋巴瘤)、CD22(淋巴瘤)、CD25(B细胞淋巴瘤)、CD37(B细胞淋巴瘤)、CD45(急性成骨髓性白血病)、HLA-DR(B细胞淋巴瘤)、IL-2受体(T-细胞白血病和淋巴瘤)、CD40(淋巴瘤)、各种粘蛋白(癌)、P21(癌)、MPG(黑色素瘤)、Ep-CAM(上皮肿瘤)、叶酸受体α(卵巢癌)、A33(结直肠癌)、G250(肾癌)、铁蛋白(霍奇金淋巴瘤)、de2-7EGFR(胶质母细胞瘤、乳腺癌、和肺癌)、成纤维细胞活化蛋白(上皮细胞癌)和生腱蛋白金属蛋白酶(胶质母细胞瘤)。一些特异性的有用抗体包括但不限于BR64(Trail等人，1997，Cancer Research57：100105)、BR96mAb(Trail等人，1993，Science 261：212-215)、针对CD40抗原的mAbs，例如S2C6mAb(Francisco等人，2000，Cancer Res.60：3225-3231)或其他抗CD40抗体，例如美国专利公开号2003-0211100和2002-0142358中公开的那些；针对CD30抗原的mAbs，例如AC10(Bowen等人，1993，J.Immunol.151：5896-5906；Wahl等人，2002Cancer Res.62(13)：3736-42)或MDX-0060(美国专利公开号2004-0006215)和针对CD70抗原的mAbs，例如1F6mAb和2F2mAb(参见例如美国专利公开号2006-0083736)或抗体2H5，10B4、8B5、18E7、69A7(US8,124,738)。其他抗体已在别处综述(Franke等人，2000，Cancer Biother.Radiopharm.15：45976；Murray，2000，Semin.Oncol.27：6470；Breitling，F.和Dubel，S.，RecombinantAntibodies，John Wiley，and Sons，New York，1998)。
在某些实施方式中，有用的抗体可结合表达在靶细胞上的受体或受体的复合体。所述受体或受体复合体可包含免疫球蛋白基因超家族成员、主要组织相容性蛋白、细胞因子受体、TNF受体超家族成员、趋化因子受体、整联蛋白、凝集素、补体控制蛋白、生长因子受体、激素受体或神经递质受体。适合的免疫球蛋白超家族成员的非限定实例是CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD22、CD79、CD90、CD152/CTLA-4、PD-1、B7-H4、B7-H3和ICOS。适合的TNF受体超家族成员的非限定实例是TACI、BCMA、CD27、CD40、CD95/Fas、CD134/0X40、CD137/4-1BB、TNFR1、TNFR2、RANK.骨保护素、APO 3、Apo2/TRAIL R1、TRAIL R2、TRAIL R3.和TRAIL R4。适合的整合蛋白的非限定性实例是CD11a、CD11b、CD11c、CD18、CD29、CD41、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD103和CD104。适合的凝集素的非限定性实例是S型、C型和I型凝集素。CEA的抗体的实例显示在表2中。
表2
结合表达在人B细胞上的CD22抗原的抗体包括例如HD6、RFB4、UV22-2、To15、4KB128和人源化的抗CD22抗体(hLL2)(参见例如Li等人，(1989)Cell.Immunol.111：85-99；Mason等人，(1987)Blood 69：836-40；Behr等人，(1999)Clin.Cancer Res.5：3304s-3314s；Bonardi等人，(1993)Cancer Res.53：3015-3021)。
CD33的抗体包括例如HuM195(参见例如Kossman等人，(1999)Clin.Cancer Res.5：2748-2755；US5693761)和CMA-676(参见例如Sievers等人，(1999)Blood 93：3678-3684)。
说明性的抗MUC-1抗体包括但不限于Mc5(参见例如Peterson等人，(1997)CancerRes.57：1103-1108；Ozzello等人，(1993)Breast Cancer Res.Treat.25：265-276)，和hCTMO1(参见例如Van Hof等人，(1996)Cancer Res.56：5179-5185)。
说明性的抗TAG-72抗体包括但不限于CC49(参见例如Pavlinkova等人，(1999)Clin.Cancer Res.5：2613-2619)、B72.3(参见例如Divgi等人，(1994)Nucl.Med.Biol.21：9-15)，以及在美国专利号5,976,531中公开的那些。
说明性的抗HM1.24抗体包括但不限于小鼠单克隆抗HM1.24抗体和人源化的抗HM1.24IgG1κ抗体(参见例如Ono等人，(1999)Mol.Immuno.36：387-395)。
在某些实施方式中，靶向部分包括抗-HER2抗体。erBB 2基因，更常称为(Her-2/neu)，是编码跨膜受体的致癌基因。已开发出针对Her-2/neu的几种抗体，包括曲妥珠单抗(例如HERCEPTINTM；Fornier等人，(1999)Oncology(Huntingt)13：647-58)、TAB-250(Rosenblum等人，(1999)Clin.Cancer Res.5：865-874)、BACH-250(同前)、TA1(Maier等人，(1991)Cancer Res.51：5361-5369)，和美国专利号5,772,997；5,770,195(mAb 4D5；ATCCCRL 10463)；和美国专利号5,677,171中描述的mAbs。
已开发出特异性结合HER2的多种抗体，并且一些用于临床使用。它们包括，例如曲妥珠单抗(例如HERCEPTINTM.，Fornier等人，(1999)Oncology(Huntingt)13：647-658)、TAB-250(Rosenblum等人，(1999)Clin.Cancer Res.5：865-874)、BACH-250(同前)、TA1(参见例如Maier等人，(1991)Cancer Res.51：5361-5369)和美国专利号5,772,997；5,770,195，和5,677,171中描述的抗体。
其他完全的人抗-HER2/neu抗体对本领域技术人员而言是熟知的。此类抗体包括但不限于C6抗体，例如C6.5、DPL5、G98A、C6MH3-B1、B1D2、C6VLB、C6VLD、C6VLE、C6VLF、C6MH3-D7、C6MH3-D6、C6MH3-D5、C6MH3-D3、C6MH3-D2、C6MH3-D1、C6MH3-C4、C6MH3-C3、C6MH3-B9、C6MH3-B5、C6MH3-B48、C6MH3-B47、C6MH3-B46、C6MH3-B43、C6MH3-B41、C6MH3-B39、C6MH3-B34、C6MH3-B33、C6MH3-B31、C6MH3-B27、C6MH3-B25、C6MH3-B21、C6MH3-B20、C6MH3-B2、C6MH3-B16、C6MH3-B15、C6MH3-B11、C6MH3-B1、C6MH3-A3、C6MH3-A2.和C6ML3-9。这些和其他抗HER2/neu抗体描述于美国专利号6,512,097和5,977,322，PCT公开WO 97/00271，Schier等人，(1996)J Mol Biol 255：28-43、Schier等人，(1996)J Mol Biol 263：551-567等。
更普遍地，针对表皮生长因子受体家族的多种成员的抗体良好地适合用作本发明的构建体中的靶向抗体或其抗原结合部分。此类抗体包括但不限于美国专利号5,844,093和5,558,864，和欧洲专利号706,799A中描述的抗EGF-R抗体。其他说明性的抗-EGFR家族抗体包括但不限于抗体，例如C6.5、C6ML3-9、C6MH3-B1、C6-BID2、F5、HER3.A5、HER3.F4、HER3.H1、HER3.H3、HER3.E12、HER3.B12、EGFR.E12、EGFR.C10、EGFR.B11、EGFR.E8、HER4.B4、HER4.G4、HER4.F4、HER4.A8、HER4.B6、HER4.D4、HER4.D7、HER4.D11、HER4.D12、HER4.E3、HER4.E7、HER4.F8和HER4.C7等(参见例如美国专利公开US 2006/0099205 A1和US 2004/0071696 A1，其通过引用并入本文)。
在靶细胞上表达足够水平的细胞表面相关抗原是有利的，由此将足够治疗量的多肽构建体呈现到靶细胞表面上的配体受体。因此，在具体实施方式中，细胞表面相关抗原以大于12,600拷贝/细胞或大于15,000拷贝/细胞的密度表达。测定细胞表面抗原的拷贝数量的方法是本领域技术人员熟知且易于获得的，例如由Jilana(Am J Clin Pathol 118：560-566，2002)提供的方法。
细胞表面相关抗原以使多肽构建体能够接触靶细胞上的细胞表面抗原和配体受体二者的构型在细胞表面上表达是有利的。因此，在具体实施方式中，细胞表面相关抗原具有细胞外结构域，其具有小于240kD的分子量。
抗体或其抗原结合部分以足够的亲和力结合细胞表面相关抗原，以促进配体结合至细胞表面上的配体受体，这可以是有利的。因此，在本发明的具体实施方式中，多肽构建体显示，如通过EC50测量的，从50nM，从25nM，从10nM或从5nM至0.1pM的抗原结合亲和力。
如美国专利号6,512,097和5,977,322中所述，其他抗-EGFR家族成员的抗体可容易地通过改组轻链和/或重链，随后通过一轮或多轮的亲和力选择产生。因此，在某些实施方式中，本发明预期使用VL和/或VH区域中的一个、两个或三个CDR，其为上文所述的抗体和/或上文所述出版物中描述的CDR。
在各种实施方式中，靶向抗体或其抗原结合部分包含特异性或优先结合CD20的抗体或其抗原结合部分。抗-CD20抗体是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于利妥昔单抗、替伊莫单抗，和托西莫单抗，AME-133V(Applied Molecular Evolution)、奥瑞珠单抗(Roche)、奥法木单抗(Genmab)、TRU-015(Trubion)和IMMU-106(Immunomedics)。
WO 2010/105290公开了命名为″SC104″的抗体，和一系列人源化变体，其结合一系列肿瘤细胞上表达的抗原。
在一个实施方式中，抗体连接和配体中的弱化突变使抗原特异性指数(ASI)提高大于10倍，优选大于50倍，优选大于100倍，优选大于1000倍，或优选大于10000倍。抗原特异性指数(ASI)在本文中定义为相对于游离的非突变多肽配体，本发明的多肽构建体对靶抗原-阳性细胞的信号传递活性效力增加的倍数，乘以相对于游离的非突变多肽配体，本发明的多肽构建体对靶抗原-阴性细胞的信号传递活性效力降低的倍数。术语“效力”在本上下文中可通过EC50值定量表示，EC50值是剂量-应答曲线的数学中点，在剂量-应答曲线中，剂量是指配体或抗体-配体构建体在测定中的浓度，且应答是指细胞对具体剂量的配体的信号传递活性的定量应答。因此，例如，通常通过相同的方法测量时，当第一化合物显示具有比第二化合物对相同细胞的EC50低10倍的EC50(例如以摩尔单位表示)时，第一化合物称作具有高10倍的效力。反过来，通常通过相同的方法测量时，当第一化合物显示具有比第二化合物对相同细胞的EC50高10倍的EC50时，第一化合物称作具有低10倍的效力。
尽管大部分测试的抗体显示弱化IFNα的有效靶向，本发明人确定了两种抗原的实例，其中弱化IFNα对靶标表达细胞系的靶向没有显示明显大于游离的未突变配体的ASI。第一个实例通过抗原CSPG4(也称作HMW-MAA，高分子量黑色素瘤相关抗原)表明。我们在使用A375或CHL-1细胞系的中靶增殖测定中，测试了两种不同的抗HMW-MAA-抗体-IFNα融合蛋白构建体。我们在测试的剂量下，没有看到任一细胞系或抗体的抑制活性(EC50s＞21nM)。这种抗原的细胞外结构域非常大(取决于糖基化，细胞外结构域MW约240kD-450kD)。结合非常大的抗原的某些抗体-IFN融合蛋白构建体可能受到空间上限制，而不能同时与相同细胞上的IFN受体相互作用。然而，可能靶向这种抗原的其他表位的其他抗体可以支持靶向的IFN活性。尽管有这种可能性，但优选本发明的多肽构建体的抗体或其抗原结合部分结合这样的抗原，其中其细胞外结构域具有小于240kD的分子量。
没有显示有效活性的抗体-弱化IFNα融合蛋白构建体的第二实例是基于结合骨髓抗原CD33的抗体。CD33以相对低的水平表达在KG-1细胞上，报道为12,600拷贝/细胞(Sutherland，MAbs.1(5)：481-490，2009)。使用抗-CD33抗体-弱化IFNα融合蛋白构建体的KG-1细胞治疗在所测试的所有浓度都没有抑制增殖(IC50＞76nM)。我们认为这种靶标的相对低的拷贝数量在一些情况下，可能限制抗体-弱化的IFN融合蛋白构建体的效力，这取决于其他因素，例如表位位置、IFN受体的受体密度等。然而，可能靶向这个抗原上的其他表位的其他抗体可以支持靶向的IFN活性，或者具有低拷贝数的CD33的其他细胞仍然例如，由于较高的内在IFN敏感性而响应此类融合蛋白构建体。尽管有这种可能性，但优选本发明的多肽构建体的抗体或其抗原结合部分结合这样的抗原，其中，所述抗原以大于12600拷贝/细胞，优选大于15000拷贝/细胞的密度存在于细胞上。
抗体没有提供对癌细胞的足够靶向性的抗体-弱化融合蛋白构建体的另一实例是连接到弱化IFNα的抗-GM2神经节苷脂抗体。在这种情况下，抗体针对碳水化合物表位，并且作为典型的此类抗体，具有低亲和性(通过流式细胞术，结合靶细胞的EC50为～50nM)。因此，本发明的优选实施方式显示对其抗原的高亲和性结合，且EC50s优选低于50nM，更优选低于25nM，仍更优选低于10nM且理想地低于5nM。此外，优选的实施方式包含结合蛋白和肽表位而不是碳水化合物表位的抗体。
多发性骨髓瘤是本发明的某些实施方式特别感兴趣的，即包含针对多发性骨髓瘤抗原和弱化的IFN肽的融合蛋白构建体。表3列出了多发性骨髓瘤抗原和抗体的实例，和参考的抗体序列。
表3
作为本发明的融合蛋白构建体的抗体靶标，CD38是特别感兴趣的。针对CD38的抗体包括，例如AT13/5(参见例如Ellis等人，(1995)J.Immunol.155：925-937)、HB7等。表4公开了可用于本上下文中的几种已知的CD38抗体：
表4
如本文使用的术语“信号传递配体”广泛地包括参与细胞信号传递途径的活化的任何配体，包括能够活化或抑制细胞表面受体的任何分子。此术语应理解为包括参考能够穿过细胞膜的脂双层以活化细胞内的细胞信号传递途径的分子。如本文使用的术语“多肽信号传递配体”是指长度6个氨基酸至长度1000个氨基酸的肽和多肽序列，其结合在某些细胞上的具体细胞表面分子(“受体”)，并且由此在这些细胞中传导一个或多个信号。本发明预期的示例性的信号传递配体和多肽信号传递配体包括但不限于细胞因子、趋化因子、生长因子、激素、神经递质和凋亡诱导因子。
适合的细胞因子的非限定性实例包括白细胞介素的IL-1、IL-2 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL_25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、Il-35及其亚家族；干扰素(IFN)亚家族，包括I型干扰素(IFN-α(IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21)，IFN-β(IFN-β1(IFNB1)和IFN-β3(IFNB3))，IFN-ω((IFNW1)，IFNWP2，IFNWP4，IFNWP5，IFNWP9，IFNWP15，IFNWP18.和IFNWP19和IFNK)，II型干扰素(IFN-γ)和III型干扰素(IFN-ε、-κ、-ω、-δ、-τ，和-γ)和干扰素样分子(限制素、IL-28A、IL-28B，和IL-29；IL-1家族包括IL-1α、IL-1β、IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)和IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9和IL1F10，和IL-17家族包括IL-17A，IL-17B，IL-17C，IL-17D，IL-17E(IL-25)，和IL-17F。在一个实施方式中，所述肽或多肽信号传递配体选自IFN、IL-4和IL-6。在一个实施方式中，所述肽或多肽信号传递配体选自IFNα、IFNα2b、IFNβ1、IFNβ1b和IFNγ。优选地，IFNα的序列选自SEQ ID Nos：1-3、80-90、434和435。
示例性的趋化因子包括例如RANTES、MCAF、MIP1-α、IP-10、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1或CCL2)、白细胞介素-8(IL-8)、CXCL13、XCL1(淋巴细胞趋化因子-α)、XCL2(淋巴细胞趋化因子-β)和CXXXC趋化分子(fractalkine)(CX3CL1)。
生长因子的非限定性实例包括例如：肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMPs)、脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌衍生生长因子(HDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、迁移刺激因子、筒箭毒碱(Myostatin)(GDF-8)、神经生长因子(NGF)和其它神经营养因子，血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PlGF)、对IL-3和IL-6的IL-1-辅因子、IL-2-T细胞生长因子、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6和IL-7。
示例性的凋亡诱导因子包括FasL和TRAIL。
示例性的激素包括肽激素，例如TRH和后叶加压素，蛋白激素，如胰岛素和生长激素，糖蛋白激素，如促黄体激素，促卵泡激素和促甲状腺激素，脂质和磷脂衍生的激素如类固醇激素如睾酮和皮质醇，固醇激素，如骨化三醇，类花生酸如前列腺素。
适合的神经递质的非限定性实例包括单胺和其他生物胺：多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(norepinephrine)(去甲肾上腺素(noradrenaline)；NE，NA)、肾上腺素(epinephrine)(肾上腺素(adrenaline))、组胺、5-羟色胺(SE，5-HT)、生长抑素、P物质、阿片肽和乙酰胆碱(ACh)。
抗体和配体之间的连接可以通过在配体和抗体的重链或轻链或二者之间产生融合蛋白，经简单的肽键而产生。配体可以连接在抗体的重链或轻链的N-或C-末端，带有或没有插入的接头肽序列。在一个实施方式中，配体通过肽键连接到抗体或其抗原结合部分。在一个实施方式中，配体直接或使用长度为1-20个氨基酸的插入接头连接到人、人源化或嵌合IgG1、IgG2或IgG4的重链的C-末端。
突变的多肽配体可通过化学缀合、非共价蛋白-蛋白相互作用的方式，或通过遗传融合，连接到抗体或抗体片段。用于将本文描述的配体与抗体缀合的方法可以是本领域普通技术人员容易完成的。如将易于确定的，可使用常用的化学偶联方法，通过例如游离氨基、羧酸或巯基基团，将配体连接至抗体。配体也可以通过羰基(-CHO)连接至抗体；这些醛基团可通过氧化糖蛋白中的碳水化合物基团而产生。
一些常用的交联剂包括，戊二醛，其将蛋白或肽分子连接至肽或多肽的N-末端或脂肪族胺基基团；碳二亚胺(EDC)，其将蛋白或肽连接至蛋白或肽的C-末端或侧链羧基基团；琥珀酰亚胺酯类(例如，MBS、SMCC)，其缀合游离氨基基团或来自Cys残基的硫醇；联苯胺(BDB)，其连接至Tyr残基；高碘酸盐，其连接至碳水化合物基团，和异硫氰酸盐(isothiocyanate)。预期商业化学缀合试剂盒的应用。
在一些实施方式中，通过各种长度的间隔臂连接标签，以减少潜在的空间位阻。例如，可在配体和抗体之间使用化学接头。示例性的接头序列是本领域技术人员容易确定的，并且很可能包括接头，例如C6、C7和C12氨基修饰剂，和包含硫醇基团的接头。
本发明的抗体-配体融合蛋白构建体具有在配体中的突变或缺失，其导致配体对于缺失抗体结合的抗原的细胞表面表达的细胞上的其受体的刺激活性降低。
在本发明的一个方面，所述配体是干扰素，其实例为I型干扰素(IFN-α(alpha)、IFN-β(beta)、IFN-κ(kappa)、IFN-δ(delta)、IFN-ε(epsilon)、[FN-τ(tau)、IFN-ω(omega)和IFN-ζ(zeta，也称作限制素)，II型干扰素(IFN-γ)或III型干扰素(IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3)(Pestka，Immunological Reviews 202(1)：8-32，2004)。
I型干扰素都通过I型干扰素受体传递信号，该受体由IFNAR1和IFNAR2构成。当I型IFN结合IFNAR1和IFNAR2时发生信号传递，由此使它们一起与IFN形成复合体。这启动了细胞内事件的级联(“信号传递”)，这尤其导致多种干扰素调节的基因的表达中的改变。由I型干扰素受体的活化引发的细胞内信号传递事件的细节由例如Platanias(Nature Reviews5：375-86.2005)描述。I型干扰素包括各种干扰素-α。已知的人干扰素-α是：IFNα1b、α2α、α2β、α4b、α5、α6、α7、α8、α10、α1a/13、α14、α16、α17、αvδα21、α2c和α4a。一些实施方式包含IFNα2b，其序列SEQ ID NO：3显示在图4中。几种形式的IFNs已批准用于几种适应症，如表5中所示(其还显示了批准的IFNβ和γ的列表)：
表5
基于人IFNα2b的序列(SEQ ID NO：3)，可用于降低其效力的IFNα2b中的突变的非限定性实例描述在表6和7中：
表6：干扰素突变体的相对生物活性
表7：干扰素突变体与其受体的相对亲和力
已知这些突变体对1型干扰素受体IFNAR1和IFNAR2的结合减低，和/或在基于细胞的测定的基础上已知IFNα效力降低。
这些表格中的数据公开在以下文献中：
Piehler，Jacob，Roisman，Laila C.，Schreiber，Gideon(2000).New structural andfunctional aspects of the Type I interferon-receptor interaction revealed bycomprehensive mutational analysis of the binding interface.J.Biol.Chem.275：40425-40433.
Jaitin，Diego A.，Roisman，Laila C.，Jaks，Eva，Gavutis，Martynas，Piehler，Jacob，Van der Heyden，Jose，Uze，Gilles，Schreiber，Gideon(2006).Inquiring into thedifferential action of interferons(IFNs)：an IFN-α2 mutant with enhancedaffinity to IFNAR1 is functionally similar to IFN-β.Mol.Cell.Biol.26：1888-1897.
Slutzki，Michal，Jaitin，Diego A.，Yehezkel，Tuval Ben，Schreiber，Gideon(2006).Variations in the unstructured C-terminal tail of interferons contribute todifferential receptor binding and biological activity.J.Mol.Biol.360：1019-1030.
Kalic，Eyal，Jaitin，Diego A.，Abramovich，Renne，Schreiber，Gideon(2007).Aninterferon α2 mutant optimized by phage display for IFNAR1 binding confersspecifically enhanced antitubor activities.J.Biol.Chem.282：11602-11611.
Pan，Manjing，Kalie，Eyal，Scaglione.Brian J.，Raveche，Elizabeth S.，Schreiber，Gideon，Langer，Jerome A.(2008).Mutation of te IFNAR-1 receptor binding site ofhuman IFN-α2 generates Tyep I IFN competitive antagonists.Biochemistry 47：12018-12027.
Kalie，Eyal，Jaitin，Diego A.，Podoplelova，Yulia，Piehler，Jacob，Schreiber，Gideon(2008).The Stability of the ternary interferon-receptor complex ratherthan the affinity to the individual subunits dictates differential biologicalactivities.J.Biol.Chem.283：32925-32936。
本文中有时使用缩写“YNS”表示包含以下突变：H57Y、E58N和Q61S的IFNα变体。
本发明还预期IFNα中上述突变或缺失的组合。
本发明还预期本发明的构建体与其他药物的组合和/或加上其他治疗方案或药征(modalities)，例如放射疗法或手术。当本发明的构建体与已知的治疗剂组合使用时，所述组合可顺序(连续地或由没有治疗的时期所间隔)，或同时或作为混合物施用。在癌症的情况下，有多种可用于本背景中的已知抗癌剂。还预期组合的治疗涵盖使用本发明构建体治疗随后为已知的治疗，或使用已知试剂治疗随后使用本发明的构建体治疗，例如作为维持治疗。例如，在癌症的治疗中，预期本发明的构建体可以与以下组合施用：烷化剂(例如氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺顺铂(ifosfamidecysplatin)，或含铂的烷化类试剂如顺铂(cysplatin)、卡铂和奥沙利铂)，抗代谢剂(如嘌呤或嘧啶类似物或抗叶酸剂，如硫唑嘌呤和巯嘌呤)，蒽环类药物(如柔红霉素、多柔比星、表柔比星伊达比星、戊柔比星、米托蒽醌、或蒽环类药物类似物)，植物碱(如长春花生物碱或紫杉烷，如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、紫杉醇或多西他赛)，拓扑异构酶抑制剂(例如，I型或II型拓扑异构酶抑制剂)，鬼臼毒素(例如依托泊苷或替尼泊苷)，或酪氨酸激酶抑制剂(例如甲磺酸伊马替尼、尼洛替尼，或达沙替尼)。
在治疗多发性骨髓瘤的情况下，预期本发明的构建体可以与现有疗法组合施用，例如类固醇如地塞米松，蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米或卡非佐米)，免疫调节药物(例如沙利度胺，来那度胺或泊马度胺)，或诱导化疗随后自体造血干细胞移植，使用或没有其它化学治疗剂如美法仑盐酸盐或上面列出的化疗剂。
在治疗霍奇金淋巴瘤的情况下，预期本发明的构建体可以与现有的治疗方法组合使用，例如ABVD(亚德里亚霉素(多柔比星)、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪)，或Stanford V(多柔比星、博来霉素、长春碱、长春新碱、氮芥、依托泊苷、泼尼松)，或BEACOPP(多柔比星、博莱霉素、长春新碱、环磷酰胺、甲基苄肼、依托泊苷、泼尼松)。
在非霍奇金淋巴瘤或其他淋巴瘤的情况下，预期本发明的构建体可以与现有的治疗方法组合施用。批准用于非霍奇金淋巴瘤的药物的实例包括：Abitrexate(甲氨蝶呤)、Adriamycin PFS(盐酸多柔比星)、Adriamycin RDF(盐酸多柔比星)、Ambochlorin(苯丁酸氮芥)、Amboclorin(苯丁酸氮芥)、Arranon(奈拉滨)、盐酸苯达莫司汀、Bexxar(托西莫单抗和碘I131托西莫单抗)、Blenoxane(博莱霉素)、博莱霉素、硼替佐米、苯丁酸氮芥、Clafen(环磷酰胺)、环磷酰胺、Cytoxan(环磷酰胺)、地尼白介素、DepoCyt(脂质体阿糖胞苷)、盐酸多柔比星、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、Folotyn(普拉曲沙)、替伊莫单抗、Istodax(罗米地辛)、Leukeran(苯丁酸氮芥)、Linfolizin(苯丁酸氮芥)、脂质体阿糖胞苷、Matulane(盐酸甲基苄肼)、甲氨蝶呤、Methotrexate LPF(甲氨蝶呤)、Mexate(甲氨蝶呤)、Mexate-AQ(甲氨蝶呤)、Mozobil(普乐沙福)、奈拉滨、Neosar(环磷酰胺)、Ontak(地尼白细胞介素)、普乐沙福、普拉曲沙、Rituxan(利妥昔单抗)、利妥昔单抗、罗米地辛、托西莫单抗和碘I131托西莫单抗、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、Velban(硫酸长春碱)、Velcade(硼替佐米)，和Velsar(硫酸长春碱)、硫酸长春碱、Vincasar PFS(硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、伏立诺他、Zevalin(替伊莫单抗)、Zolinza(伏立诺他)。用于治疗非霍奇金淋巴瘤的药物组合的实例包括CHOP(C＝环磷酰胺，H＝盐酸多柔比星(羟基柔红霉素)，O＝硫酸长春新碱(安可平)，P＝泼尼松)；COPP(C＝环磷酰胺，O＝硫酸长春新碱(安可平)，P＝盐酸甲基苄肼，P＝泼尼松)；CVP(C＝环磷酰胺，V＝硫酸长春新碱，P＝泼尼松)；EPOCH(E＝依托泊苷，P＝泼尼松，O＝硫酸长春新碱(安可平)，C＝环磷酰胺，H＝盐酸多柔比星(羟基柔红霉素))；ICE(I＝异环磷酰胺，C＝卡铂，E＝依托泊苷)和R-CHOP(R＝利妥昔单抗，C＝环磷酰胺，H＝盐酸多柔比星(羟基柔红霉素)，O＝硫酸长春新碱(安可平)，P＝泼尼松。
还预期类视黄醇与基于干扰素的融合蛋白构建体的组合。类视黄醇是在很多生物功能中发挥主要作用的分子家族，所述生物功能包括生长、视觉、繁殖、上皮细胞分化和免疫功能(Meyskens，F.等人，Crit Rev Oncol Hematol 3：75，1987；Herold，M.等人，ActaDermatovener 74：29 1975)。使用单独或与其他试剂组合的视黄醇全反式视黄酸或ATRA的早期临床前研究证实了针对急性早幼粒细胞白血病(APL)、骨髓增生异常综合征、慢性粒细胞性白血病(CML)、蕈状真菌病和多发性骨髓瘤的活性(Smith，M.J.Clin.Oncol.10：839，1992中的综述)。这些研究导致批准ATRA用于APL的治疗。目前，有超过100项临床试验，评估ATRA与其他治疗组合用于治疗血液恶性肿瘤、肾癌、肺癌、鳞状细胞癌等活性。特别感兴趣并且直接涉及本发明的是证实干扰素-α治疗在与ATRA组合时的效力增强的研究。这描述对于套细胞淋巴瘤(Col，J.等人，Cancer Res.72：1825，2012)、肾细胞癌(Aass，N.等人，J.Clin.Oncol.23：4172，2005；Motzer，R.J.Clin.Oncol.18：2972，2000)、CML、黑色素瘤、骨髓瘤和肾细胞癌(Kast，R.Cancer Biology and Therapy，7：1515，2008)和乳腺癌(Recchia，F.等人，J.Interferon Cytokine Res.15：605，1995)。我们因此预期我们的靶向的弱化IFN在与治疗剂量的ATRA在临床中组合使活性增强。此外，Mehta(Mol Cancer Ther3(3)：345-52，2004)证实了使用视黄酸体外处理白血病细胞诱导CD38抗原的表达。因此，干扰素的效力增强加上靶CD38的诱导表达将指示在表达CD38或可由ATRA诱导表达CD38的IFN-敏感性癌症的治疗中，ATRA和我们的抗-CD38抗体-弱化IFNα的组合疗法。此类癌症的实例是多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、CML和AML。
此外，尽管上述构建体是基于IFNα2b，但还可以在任何其他IFNαs或IFNβ的背景下产生突变或缺失。在本发明的另一个实施方式中，I型IFN是IFNβ。IFN-β批准用于治疗多发性硬化(MS)。IFN-β可通过突变或缺失弱化，并且随后连接到靶向参与这种疾病的发病的细胞的抗体。IFN-β是MS中的有效药物，但其使用与不利事件相关，包括注射部位炎症、流感样症状、白细胞减少、肝功能障碍和抑郁，导致患者亚群中的中断治疗。通过将IFN-β活性直接指向致病细胞，可避免这些不利事件。
MS的发病机理被认为是由多个事件启动和进展，包括通过toll-样受体的树突状细胞和小胶质细胞的先天活化，促炎性和抗炎性/调节细胞因子之间的不平衡，CD4+T细胞至Th1和Th17表型的分化，通过抗原呈递细胞(APCs)的Th1细胞的活化，调节性T(Treg)细胞数量的减少，和活化免疫细胞跨越血脑屏障(BBB)的迁移。所述疾病的临床发作的主要驱动因素被认为是自体反应性髓磷脂特异性Th1细胞(Gandhi，2010 J Neuroimmunol 221：7；Boppana，2011 Mt Sinai J Med 78：207；Loma，2011 Curr Neuropharmacol 9：409中的综述)。
在本发明的实施方式中，弱化形式的IFN-β可连接至靶向T细胞特异性细胞表面标记物的抗体，用于治疗多发性硬化或IFN-β可以是有效的其他自体免疫适应症。IFN-β对T细胞的直接作用包括抑制增殖(Rep，1996 J Neuroimmunol 67：111)，下调共刺激分子CD40L(Teleshova，2000 Scand J Immunol.51：312)，降低金属蛋白酶活性，导致穿越BBB的迁移减少(Stuve，1996 Ann Neurol 40：853；Uhm，1999 Ann Neurol 46：319)，通过上调细胞内CTLA-4和细胞表面Fas分子诱导凋亡(Hallal-Longo，2007 J Interferon Cytokine Res27：865)，下调抗凋亡蛋白(Sharief，2001 J Neuroimmunol.120：199；Sharief，2002 JNeuroimmunol.129：224)，和恢复Treg功能(De Andres，2007 J Neuroimmunol 182：204；Korporal，2008 Arch Neurol 65：1434；Sarasella，2008 FASEB J 22：3500；Chen，2012 JNeuroimmunol 242：39)。
因此，在本发明的一个方面，将弱化的IFN-β连接至靶向所有T细胞(其包括CD4+、CD8+、Treg、Th1、Th2和Th17细胞)的抗CD3抗体。这种全面性方法确保完全覆盖所有的T细胞，因为已报道所有这些细胞类型在MS发病机理中的作用，并且受到IFN-β治疗的影响(Dhib-Jalbut，2010 Neurology 74：S17；Prinz，2010Trends Mol Med 16：379；Graber，2010 Clin Neurol Neurosurg 112：58和Loma，2011 Curr Neuropharmacol 9：409)。可引入本发明的融合蛋白构建体中的CD3抗体的实例列出在表8中。
表8
可选地，弱化IFN-β-抗-CD4融合蛋白构建体提出了更限制性的方法，但将靶向自体反应性和调节性T细胞，包括Th1和Th17细胞和CD4+CD25+Treg细胞。此外，树突状细胞(DCs)的亚类也表达CD4，并且已公开了IFN-β对DC的直接治疗作用(Shinohara，2008Immunity 29：68；Dann，2012 Nat Neurosci 15：98)。可引入本发明的融合蛋白构建体中的CD4抗体的实例列出在表9中。
表9
已报道了CD8+T细胞在MS中的作用(Friese，2005 Brain 128：1747；Friese，2009Ann Neurol 66：132)，以及IFN-β对MS患者中的CD8+T细胞的直接作用(Zafranskaya，2006Immunol 121：29)。因此，使用抗CD8抗体将弱化IFN-β直接导向CD8+T细胞可对MS患者产生临床益处。CD8抗体的实例显示在表10中。
表10
活化T细胞的标记物，包括但不限于CD25、CD38、CD44、CD69、CD71、CD83、CD86、CD96、HLA-DR、ICOS和PD-1，也代表这种方法的有吸引力的靶标，这是由于认为活化的T细胞是导致MS中脱髓鞘的自体反应性的主要驱动因素(Gandhi，2010 J Neuroimmunol 221：7；Boppana，2011 Mt Sinai J Med 78：207；Loma，2011 Curr Neuropharmacol 9：409)。可将靶向这些抗原中的任一个的抗体连接到弱化的IFNβ。可用于本发明的示例性抗体包括以下：CD71抗体，包括BA120g(US 7736647)，和Wang等人(Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao(Academic journal of the first medical college of PLA)22(5)：409-411，2002)中提到的各种抗体。针对CD83的抗体的实例包括20B08、6G05、20D04、11G05、14C12、96G08和95F04(US 7,700,740)。针对CD86的抗体的实例包括1G10H6D10(US 6,071,519)。HLA-DR抗体包括HD3、HD4、HD6、HD7、HD8和HD10(US 7,262,278)，DN1921和DN1924(US2005/0208048)。按照如此方法，一个有吸引力的靶标可以是PD-1，其表达在新近活化的T细胞上。理想地，可使用非拮抗抗体，例如下文进一步详细讨论的J110抗体。
ICOS抗体的实例包括JMabs(US 6,803,039)和JMab 136(US2011/0243929)。
针对这些靶标的抗体的这些实例的进一步内容显示在表11和12中。
表11
表12
在本发明的另一实施方式中，弱化形式的IFN-β可融合至靶向骨髓细胞的细胞表面标记物的抗体，已知骨髓细胞通过驱动T细胞活化和分化而有助于MS发病。例如，可靶向泛髓系标记物CD33、CD115，或树突状细胞标记物CD11c。可优选广泛的靶向方法，例如，使用针对CD33或CD115的抗体，因为每种骨髓细胞亚类对MS疾病发病的准确贡献和对IFN-β的应答尚有争议(Prinz，2008 Immunity 28：675；Shinohara，2008 Immunity 29：68；Dann，2012Nat Neurosci 15：98)。可用于本发明中的抗CD33抗体包括My9-6(US 7,557,189)，美国专利申请US2012/0082670中描述的14种抗体的任一种，或称作huM195的抗体(US5693761)。可使用的抗CD115抗体包括Ab1和Ab16(US 8,206,715)或CXIIG6(US2011/0178278)。可用于本发明中的CD11c抗体的实例是mab 107(US 7,998,738，ATCC保藏号PTA-11614)。可选地，可将弱化的IFN-β指向主要存在于巨噬细胞上的CD14抗原。CD14抗体的实例显示在表13中。
表13
在又另一实施方式中，靶向表达CD52的细胞可将IFN-β递送至所有的淋巴细胞，并且还有单核细胞和外周树突状细胞(Buggins，2002 Blood 100：1715；Ratzinger，2003Blood 101：1422)，它们是负责MS中自体反应T细胞的增殖和分化的关键APCs。这种方法可将IFN-β活性指向已知直接受到IFN-β影响的关键细胞类型，并可促进其在MS中的治疗活性。可用于本发明的CD52抗体的实例包括但不限于DIVHv5/DIVKv2(US 7,910,104)，(US2012/0100152)中公开的任何CD52抗体或CAMPATH。
由于其共有的内在免疫学病因，任何上述抗体-靶向的弱化IFNβ融合蛋白构建体可在除多发性硬化之外的其他炎性或自身免疫性疾病的背景下具有治疗活性。
本文预期的自身免疫性疾病尤其包括：斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病多发性硬化、肾上腺的自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、口炎性腹泻-皮炎、慢性疲劳综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘、慢性炎性多神经病、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮、Crest综合征、冷凝集素病、克罗恩病、肠易激综合征、炎性肠病、疱疹样皮炎、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛、肾小球肾炎、格雷夫斯病、Guillain-Barre综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、扁平苔藓、狼疮、梅尼埃尔氏病、混合性结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、心肌炎、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征(polyglancular syndromes)、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、憩室炎(pochitis)、原发性无丙球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、雷诺氏现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿关节炎(rheumatoid arrthritis)、结节病、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎和白癜风。特别感兴趣的是白塞氏病和慢性葡萄膜炎黄斑水肿和其他类型的葡萄膜炎，因为已显示IFNα表现治疗益处(Deuter，Dev Ophthalmol.51：90-7.2012)。
本公开预期的炎性疾病状况的实例包括但不限于导致意味着保护受到损伤或疾病影响的组织的某些区域中的发红、肿大、疼痛和发热感觉的反应的那些疾病和病症。可使用本公开的方法治疗的炎性疾病包括但不限于痤疮、心绞痛、关节炎、吸入性肺炎、病、脓胸、肠胃炎、炎症、肠感冒、NEC、坏死性小肠结肠炎、盆腔炎性疾病、咽炎、PID、胸膜炎、喉咙疼痛(raw throat)、发红(redness)、发红(rubor)、咽喉痛(sore throat)、胃感冒和尿路感染、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病。
人干扰素-β1的序列显示如下：(SEQ ID NO：191)
使用上述编号方案(残基1-166)，已知降低其活性的人IFNβ中的突变(在星号指出的位置)包括在表14中列出的那些。
表14：IFNβ活性弱化突变
IFNβ突变 弱化倍数* 参考文献
野生型 1
R27A 3.3 1
R35A+C17S 280 3
R35T 10 1
E42K ＞10 2
D54N 1.4 2
M621 8.7 2
G78S 6.2 2
K123 2.5 1
C141Y ＞25 2
A142T ＞10 2
R147A+C17S** 1.7 3
E149K ＞5 2
R152H 4.7 2
*基于抗增殖活性
**产生C17S突变以除去IFNβ1的天然序列中未配对的半胱氨酸。
参考文献
(1)Runkel，L.，Pfeffer，L.，Lewerenz.M.，Mogensen，K.(1998).Differences inActivity between α and β Type I Interferons Explored by MutationalAnalysis.J.Biol.Chem.273：8003-8008
(2)Stewart，A.G.，Adair，J.R.，Catlin，G.，Hynes.C.，Hall，J.，Dav ies.J.，Dawson，K.&Porter，A.G.(1987).Chemical mutagenesis of human interferon-beta：construction，expression in E.coli.and biological activity of sodiumbisulfite-induced mutations，DNA 6：119-128.
(3)内部结果。
在本发明的仍另一个实施方式中，IFN是IFNλ(WO 2007/029041 A2)，其可用于对IFNα或IFNβ描述更详尽的任何应用。
基于I型IFN受体对癌细胞的直接刺激，I型IFN可具有抗癌活性。这已显示用于多种类型的癌症，包括多发性骨髓瘤、黑色素瘤、B细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、毛细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、卵巢癌、纤维肉瘤、宫颈癌、膀胱癌、星形细胞瘤、胰腺癌等(Borden，Cancer Research 42：4948-53，1982；Chawla-Sarkar，Clinical CancerResearch 7：1821-31，2001；Morgensen，Int J.Cancer 28：575-82，1981；Otsuka，BritishJournal of Haematology 103：518-529，1998；Lindner，J of Interferon and CytokineResearch 17：681-693，1997；Caraglia，Cell Death and Differentiation 6：773-80，1999；Ma，World J Gastroenterol 11(10)：1521-8，2005)。本领域技术人员将认识到本发明具有得自于针对肿瘤相关抗原的抗体与突变的I型干扰素的组合的很多方面，并且所得的融合蛋白构建体可用于降低表达相应的肿瘤相关抗原的各种干扰素敏感的癌症的增殖。还可理解，可将I型干扰素与其他试剂组合以进一步改进其功效。
I型干扰素也可展示抗病毒性质。例如，FDA已批准IFNα2b用于慢性丙型肝炎感染的治疗，并且也可在其他病毒感染的治疗中具有实用性。根据美国和欧洲的指南，聚乙二醇化的IFN-α是目前用于丙型肝炎的标准护理方案的一部分，但在80％以上的患者中产生副作用，常导致治疗的中断(Aman，2012；Calvaruso，2011)。在本发明的一个方面，具有弱化突变的I型IFN连接到结合病毒感染细胞的抗体。由上述抗体识别的抗原可能是在宿主细胞表面上瞬时表达的病毒蛋白，或者，它可以是内源的宿主细胞产生的抗原，其在病毒感染后在细胞表面上的暴露程度大于感染之前。可充当抗体部分的靶标的示例性病毒蛋白包括但不限于：丙型肝炎病毒包膜糖蛋白E1和E2；乙型肝炎表面抗原(HBsAg)；疱疹病毒病毒包膜糖蛋白B、C、D、E、G、H、I、J、K、L、M和UL32，和包膜蛋白UL49A；人免疫缺陷病毒(HIV)、包膜蛋白糖蛋白(gp)120和gp41；腺病毒纤维蛋白的旋钮结构域；水痘-带状疱疹病毒包膜糖蛋白(gB、gC、gE、gH、gI、gK、gL)；EB病毒的病毒糖蛋白gp350和病毒蛋白BMRF-2；人巨细胞病毒UL16；细小病毒B19病毒衣壳蛋白VP1-3；人星状病毒结构蛋白，例如VP26，VP29和VP32；诺如病毒结构蛋白VP1和衣壳蛋白VP2；脊髓灰质炎病毒的病毒衣壳蛋白VP0、VP1、VP2、VP3和VP4；鼻病毒的病毒衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4；和登革热病毒的病毒颗粒衣壳蛋白(C)，前膜/膜(prM/M)蛋白和包膜(E)蛋白。
在一个实施方式中，可使用抗体靶向IFN-α活性，所述抗体通过中间蛋白，例如膜联蛋白V或β2-糖蛋白1，直接或间接地结合磷脂酰丝氨酸(PS)，PS是细胞膜的内层(innerleaflet)的磷脂组分。然而，凋亡中的细胞或感染病毒的细胞，使PS暴露在外膜上，其中它变得易接近抗体。PS暴露于癌细胞的表面上(Reidl，L.等人，J Immunol.14：3623，1991)，肿瘤中的血管内皮(Ran，S.等人，Cancer Res.62：6132.2002；He，J.等人，Clin CancerRes.15：6871，2009)，和病毒感染的细胞(Soares，M.等人，Nat Med.14：1357，2008)。已描述了间接(经β2-糖蛋白1)靶向PS的抗体，巴维昔单抗。它介导抗体依赖的细胞毒性并且在体内癌模型的成员中有效，包括人乳腺癌和淋巴瘤异种移植物，和大鼠成胶质细胞瘤模型，以及病毒疾病模型(Ran，S.等人，Clin Cancer Res；11：1551，2005；He，J.等人，Clin CancerRes.15：6871，2009；Soares，M.等人，Nat Med.14：1357，2008)。目前，将其作为用于肺癌治疗的治疗性抗体开发(DeRose，P.等人，Immunotherapy.3：933，2011；Gerber，D.等人，ClinCancer Res.17：6888，2011)。可选的抗体可基于抗PS抗体9D2的可变区(Cancer ResNovember 1，2002 62；6132)。靶向PS的又另一个可选方案是将抗体Fab部分替换为天然的PS结合蛋白，例如膜联蛋白或β2-糖蛋白1。与弱化形式的IFN-α融合的抗PS抗体(或可选地，直接或间接的PS结合蛋白)可将IFN-α活性靶向到感染表达PS的病毒的细胞，而不显示与IFN-α相关的全身安全性问题。某些肿瘤细胞，例如肺癌细胞，也在其细胞表面上表达PS，因此，连接到弱化IFN的PS抗体(或可选地，直接或间接的PS结合蛋白)也可具有在某些癌症治疗中的用途。
应理解抗体-靶向的弱化IFNλ也可以按照很大程度上与IFNα相似的方式用于靶向病毒感染的细胞(S.V.Kotenko，G.Gallagher，V.V.Baurin等人，“IFN-λs mediateantiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex，”Nature Immunology，vol.4，no.1，pp.69-77，2003)。
在一个实施方式中，II型IFN，即INFγ，也可被弱化并连接到将其指向特定细胞类型的抗体。IFNγ具有针对癌细胞的抗增殖性质(Kalvakolanu，Histol.Histopathol 15：523-37，2000；Xu，Cancer Research 58：2832-7，1998；Chawla-Sarkar，Apoptosis 8：237-49，2003；Schiller，J Interferon Resarch 6：615-25，1986)Sharifi已描述了如何制备融合蛋白，其中IFNγ已融合至靶向肿瘤的抗体的C-末端(Sharifi，Hybridoma andHybridomics 21(6)：421-32，2002)。在这个文献中，Sharifi公开了如何在哺乳动物细胞中生产抗体-IFNγ融合蛋白，并且显示抗体和IFN都是有功能的。可选地，在融合蛋白中可使用如Lander(J Mol Biol.2000 May 26；299(1)：169-79)描述的单链二聚体形式的IFNγ。除了IFNγ对靶向的肿瘤细胞的抗增殖作用之外，它还可以具有特异性地对乳腺癌细胞的另一种作用：已显示IFNγ恢复乳腺癌细胞的抗雌激素敏感性(Mol Cancer Ther.2010May；9(5)：1274-1285)，并且，因此连接至乳腺癌抗原抗体的弱化IFNγ与抗雌激素疗法的组合在治疗上可能是有用的。通过经突变弱化IFNγ，可产生癌选择性更好的IFNγ形式。Waschutza(Eur J.Biochem.256：303-9，1998)已描述了IFNγ中的两个弱化突变，即des-(A23，D24)，其中缺失残基A23和D24；和des-(N25，G26)，其中缺失残基N25和G26。des-(A23，D24)突变体与野生型IFNγ相比，具有降低～18倍的对IFNγ受体的亲和力，且与野生型IFNγ相比，具有降低～100倍的抗病毒活性。des-(N25，G26)变体与野生型IFNγ相比，具有降低～140倍的对IFNγ受体的亲和力，且与野生型IFNγ相比，具有降低～10倍的抗病毒活性。包含针对肿瘤细胞表面靶标的抗体和IFNγ的弱化突变体的融合蛋白的实例包括以下：如Sharifi所述使用7个氨基酸的接头，可将利妥昔单抗作为与这些弱化的IFNγ之一的融合蛋白使用，以产生由SEQ ID NOS：378(重链)和276(轻链)构成的融合蛋白构建体“利妥昔单抗-HC-L7-IFNγ(Δ[A23，D24])IgG1”。预期这样的融合蛋白构建体具有针对CD20恶性肿瘤，例如B细胞淋巴瘤的有效抗增殖活性。可以适合融合至细胞靶向抗体的其他弱化IFNγ突变体由Lundell(J Biol.Chem.269(23)：16159-62，1994)描述，即S20I(～50x降低的亲和力)、D21K(～100x降低的亲和力)、A23Q(～2,500-倍降低的结合)、A23V(～2,000-倍降低的结合)和D24A(～4-倍降低的结合)。这些弱化的IFNγ可以与抗-CD38抗体组合用作融合体，以产生融合蛋白构建体“X355/02-HC-L7-IFNγ(S20I)IgG1”(由SEQID NOS：380(重链)和226(轻链)构成)或“R10A2-HC-L7-IFNγ(D21K)IgG1”(由SEQ ID NOS：382(重链)和270(轻链)构成)。可开发用于本发明的IFNγ中的其他弱化突变由Fish(Drug DesDeliv.1988Feb；2(3)：191-206.)描述。
靶向的弱化IFNγ还可用于治疗以病理纤维化表征的各种适应性，包括肾纤维化、肝纤维化和特发性肺纤维化(IPF)。IPF是肺疾病的慢性进展形式，表征为不明原因的纤维化，主要发生在老年人中。尽管由医学需要，但在有效的治疗策略的开发中几乎没有进展(O’Connell，2011 Adv Ther 28：986)。肺纤维化还可以由药物、颗粒、微生物或辐射暴露而诱导。下文涉及由已知试剂诱导的IPF和肺纤维化二者，并且潜在地用于在其他类型器官，包括肝和肾中的纤维化的治疗。
成纤维细胞在肺的纤维化疾病中发挥关键作用，并且其活化导致胶原沉积(collagen disposition)，产生过量疤痕和肺结构的破坏。然而，几乎没有这些致病性成纤维细胞的来源的信息，尽管已提出几种前体细胞类型，包括骨髓祖细胞、单核细胞、循环纤维细胞和内源细胞，例如常驻间充质细胞和上皮细胞(Stevens，2008 Proc Am Thorac Soc5：783；King，2011 Lancet 378：1949)。
来自外周血的CD14+单核细胞能够分化为纤维细胞，即成纤维细胞的前体，并且这个过程受到干扰素-γ(IFN-γ)的抑制。IFN-γ对单核细胞的直接作用在体外分化研究中证实，支持将弱化形式的IFN-γ靶向CD14+单核细胞，用于纤维化疾病的治疗的策略(Shao，2008 J Leukoc Biol 83：1323)。
存在IFN-γ能够抑制成纤维细胞的增殖和活化的试验证据(Rogliani，2008 TherAdv Respir Dis 2：75)，并且已经在临床前模型中成功地研究这个事实以减少瘢痕和纤维化。在IPF患者中研究皮下施用的IFN-γ的益处的临床试验没有达到存活益处的主要终点(O’Connell，2011 Adv Ther 28：986；King，2011)。目前的方法集中在通过气溶胶形式的吸入直接递送重组IFN-γ(Diaz，2012 J Aerosol Med Pulm Drug Deliv 25：79)，从而使肺能够获得足够的IFN-γ活性，以在整体安全的全身剂量产生益处。
将IFN-γ活性直接递送至成纤维细胞可以是提高对这种试剂的临床应答并且同时减少其副作用的有力方法。将弱化IFN-γ融合至靶向成纤维细胞特异性标记物的抗体可有利于这种方法。存在几种富集在成纤维细胞中的成纤维细胞表面分子。它们包括例如成纤维细胞特异性蛋白(FSP1；Strutz，1995 J Cell Biol 130：393)、成纤维细胞活化蛋白(FAP；Park，1999 J Biol Chem 274：36505；Acharya，2006 Hum Pathol 37：352)和血小板衍生的生长因子受体(PDGFR-α和-β；Trojanowska，2008 Rheumatology(Oxford)47S5：2)。这些分子的表达在获自IPF患者的肺活检样品中升高，并且它们已作为药物靶标直接参与IPF或其发病机理(Lawson，2005 Am J Respir Crit Care Med 171：899；Acharya，2006Hum Pathol 37：352；Abdollahi，2005 J Exp Med 201：925)。针对FAP和PDGF受体的抗体的实例显示在表15和16中。
表15
表16
在肝纤维化的临床前模型中，通过靶向PDGFR-β的脂质体将IFN-γ递送至肝星状细胞，其为成纤维细胞的等价物并且负责肝纤维化中的胶原分泌，从而增强IFN-γ的抗纤维化作用(Li，2012 J Control Release 159：261)。这些数据支持该构思和通过将IFN-γ活性直接递送至纤维化疾病(包括IPF和肝纤维化)中的成纤维细胞获得的潜在治疗益处，并且证实了PDGFR-β作为用于这种方法的靶标。
本发明还预期III型IFNs，包括IFNλ1(IL29)、IFNλ2(IL28A)，和IFNλ3(IL28B)的弱化和基于抗体的靶向(S.V.Kotenko，G.Gallagher，V.V.Baurin等人，“IFN-λs mediateantiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex，”Nature Immunology，vol.4，no.1，pp.69-77，2003.，P.Sheppard，W.Kindsvogel，W.Xu，等人，“IL-28，IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R，”NatureImmunology，vol.4，no.1，pp.63-68，2003)。这些IFNs通过由IFNλR1链(也称作IL28Rα)和IL10R2链(与IL10、IL22和IL26受体复合体共享[A.Lasfar，W.Abushahba，M.Balan，和K.A.Cohen-Solal，“Interferon lambda：a new sword in cancer immunotherapy，”Clinical and Developmental Immunology，vol.2011，Article ID 349575，11 pages，2011])构成的受体发挥作用。IFNλRs表达在大多数细胞类型上，并且介导与I型IFNs类似的信号传递途径。已证实λIFNs针对几种病毒(包括HBV和HCV)的抗病毒活性(E.M.Coccia，M.Severa，E.Giacomini等人，“Viral infection and toll-like receptor agonistsinduce a differential expression of type I and λ interferons in humansplasmacytoid and monocyte-derived dendritic cells，”European Journal ofImmunology，vol.34，no.3，pp.796-805，2004；M.D.Robek，B.S.Boyd，和F.V.Chisari，“Lambda interferon inhibits hepatitis B and C virus replication，”Journal ofVirology，vol.79，no.6，pp.3851-3854，2005；N.Ank，H.West，C.Bartholdy，K.Eriksson，A.R.Thomsen，和S.R.Paludan，“Lambda interferon(IFN-λ)，a type III IFN，is inducedby viruses and IFNs and displays potent antiviral activity against selectvirus infections in vivo，”Journal of Virology，vol.80，no.9，pp.4501-4509，2006；S.E.Doyle，H.Schreckhise，K.Khuu-Duong等人，“Interleukin-29 uses a type 1interferon-like program to promote antiviral responses in human hepatocytes，”Journal of Hepatology，vol.44，no.4，pp.896-906，2006；T.Marcello，A.Grakoui，G.Barba-Spaeth等人，“Interferons α and λ inhibit hepatitis C virus replicationwith distinct signal transduction and gene regulation kinetics，”Gastroenterology，vol.131，no.6，pp.1887-1898，2006)。使用IFNλ用于丙型肝炎治疗的临床研究已显示是有希望(E.L.Ramos，“Preclinical and clinical development ofpegylated interferon-lambda 1 in chronic hepatitis C，”Journal of Interferonand Cytokine Research，vol.30，no.8，pp.591-595，2010)。本发明的一个方面是使用例如上述用于弱化形式的IFNα的靶向的靶向抗体，将突变的弱化形式的IFNλ靶向病毒感染的细胞。突变的弱化形式的IFNλ也可用于靶向癌细胞，如上文对IFNα所详细描述的那样。
非-IFN配体也在本发明的预期之内，并且也可通过突变弱化，随后通过抗体或其片段靶向至特异性细胞类型。抗炎性细胞因子白细胞介素-10(IL-10)在先天和适应性免疫应答期间发挥核心作用。IL-10形成同二聚体并且结合表达在APCs上的IL-10受体复合体，导致II型MHC的表达减少和促炎性细胞因子和趋化因子的产生减少，从而抑制T细胞发育和分化。然而，IL-10还参与诱导几种免疫细胞(包括B细胞)的增殖(Hofmann，2012 ClinImmunol 143：116)。
IL-10的表达减少与人和啮齿动物中的多种自身免疫性病症相关，包括牛皮癣、炎性肠病和类风湿关节炎。IL-10缺陷型小鼠发生慢性小肠结肠炎，这可以通过施用IL-10预防，但这些发现的临床转化在患者中产生多种失败的试验。这些失败的一种解释是局部IL-10浓度可能太低，甚至在最大耐受的全身施用下也是如此(Herfarth，2002 Gut 50：146)。另一种解释可能是IL-10对B细胞的免疫刺激作用和导致促炎性IFN-γ的产生，如在IL-10治疗的克罗恩病患者中所证实的(Tilg，2002 Gut 50：191)。
将弱化的IL-10融合至APCs特异性抗体，例如通过CD11c靶向树突状细胞，或更广泛表达的骨髓标记物，如CD33或CD115，可系统性地降低活性生物活性，并且同时提高IL-10的靶向局部活性浓度。此外，可减少或消除证实的通过B细胞的促炎性作用。抗体-IL10融合蛋白的生产此前已有描述(Schwager Arthritis Res Ther.11(5)：R142，2009)。
存在IL-10在各种模型中的抗纤维化作用的证据。纤维化的标志是通过成纤维细胞产生的胶原的过表达和沉积，导致瘢痕组织形成。IL-10直接抑制通过人成纤维细胞的细胞外基质合成(Reitamo，1994 J Clin Invest 94：2489)，并且通过下调TGF-β，在大鼠肝纤维化模型中是抗纤维化的(Shi，2006 World J Gastroenterol 12：2357；Zhang，2007Hepatogastroenterology 54：2092)。IL-10的临床使用受到其半衰期短的影响，并且PEG化形式已在纤维化的临床前模型中显示有前景的药代动力学改进和功效(Mattos，2012 JControl Release 162：84)。通过与将其指向成纤维细胞的抗体融合而靶向IL-10活性，在纤维化疾病，包括肺和肝纤维化中产生治疗益处。如上文对IFN-γ-靶向的描述中所述的针对成纤维细胞特异性蛋白，例如成纤维细胞活化蛋白和血小板衍生的生长因子受体的抗体，可将弱化的IL-10直接递送至成纤维细胞。
重组红细胞生成素(EPO)是用于治疗贫血的广泛使用且有效的激素，常见于癌症患者中。它通过经EPO受体(EPOR)的信号传递发挥作用，该受体不仅由造血系统的细胞表达，而且还表达在非造血细胞上，包括来自各种肿瘤类型的细胞。很多研究已检查了EPO和EPO-R刺激在体外和体内的癌症模型中的作用，并且多个研究已证实了对肿瘤生长的刺激作用，其直接作用于癌细胞，或通过肿瘤中的血管发生增加发挥作用(Jelkmann，2008 CritRev Oncol Hematol 67：39中的综述)。在多个临床研究中，使用EPO的治疗已经与提高的肿瘤生长和降低的生存相关，导致推荐和黑箱(black box)警告以在临床上可行地尽可能地限制并监控癌症患者中的EPO暴露(Farrell，2004 The Oncologist 9：18；Jelkmann，2008Crit Rev Oncol Hematol 67：39；Elliott，2012)。
红细胞生成是多步过程，其中多能干细胞经历严密控制的分化和增殖步骤。这个过程中的中间细胞类型是红系集落形成单位(CFU-E)细胞，其表达高水平的EPOR，依赖于EPO生存，并且看起来是具有这种依赖性的分化过程中的主要细胞类型(Elliott，2008 ExpHematol 36：1573)。
使用特异性标记物将EPO活性靶向CFU-E细胞将大幅降低EPO对癌症和其他非造血细胞的影响，同时保持驱动红细胞形成和增加血红蛋白水平的能力。CFU-E细胞的全基因组分析揭示了几种潜在的候选细胞标记物，包括Rh-相关糖蛋白，例如CD241和Rh血型系统的成员，例如RCHE基因的产物(Terszowski，2005 Blood 105：1937)。
表达在CFU-E和几种其他红细胞生成的中间物上的另外的示例性表面标记物包括CD117(c-kit)、CD71(转铁蛋白受体)和CD36(血小板反应蛋白受体)(Elliott，2012Biologics 6：163)，但这些标记物也在某些癌细胞中过表达，因为它们都参与一般的生长和增殖，并且因此代表用于在癌症患者中靶向EPO活性的吸引力较低的靶标，但这种方法可有益于具有不表达这些靶标的肿瘤的患者。CD117抗体包括SR-1(US 7,915,391)和抗体DSMACC 2007、2008和2009(US 5,545,533)。用于弱化EPO的靶向的其他抗原包括CD34、CD45RO、CD45RA、CD115、CD168、CD235、CD236、CD237、CD238、CD239和CD240。
将EPO活性融合至抗体也可大大提高治疗活性的程度。重组EPO的半衰期在人中是约5小时，并且这可能在将弱化的EPO融合至抗体时提高至数周。这种方法可有益于接受贫血治疗的患者，他们典型地每周接受多次给药，通常经静脉注射。重要的是，已显示对EPO的治疗反应主要由保持EPO浓度的时间长度控制，而不是由浓度水平控制(Elliott，2008 ExpHematol 36：1573)。
另一个实例是转化生长因子β(TGF-β)，它是T细胞介导的免疫应答的调控和免疫耐受的诱导中的关键因子。TGF-β敲除小鼠死于多灶性炎症和自身免疫性病症，表明免疫抑制作用(Shull，1992 Nature 359：693)。然而，TGF-β还显示通过细胞外基质调控中的显著作用和通过促进成纤维细胞迁移、增殖和活化而诱导纤维化疾病(Rosenbloom，2010 AnnIntern Med 152：159；Wynn，2011 J Exp Med 208：1339；King，2011 Lancet 378：1949)。
在TGF-β的存在下，CD4+CD25-幼稚T细胞可转化成Treg细胞，其能够抑制抗原特异性T细胞体内扩增并且预防鼠哮喘模型中的过敏的发病(Chen，2003 J Exp Med 198：1875)。炎性反应也促进急性肝疾病的转变和至慢性纤维化和硬化的永续性(perpetuation)，并且TGF-β可有助于通过其对Treg分化的作用抑制这些反应(Dooley，2012 Cell Tissue Res 347：245)。类似地，针对炎性肠病中的幼稚T细胞的TGF-β可导致炎症的控制和抑制(Feagins，2010 Inflamm Bowel Dis 16：1963)。
将TGF-β特异性地靶向CD4+T细胞可影响TGF-β的抗炎潜力，同时使其促纤维化性质最小化，并且能够提供对抗自身免疫性疾病的新策略。或者，可使用T细胞活化标记物将TGF-β单独地靶向活化的T细胞，如上文对IFNβ靶向的讨论所述的那样。按照如此方法，一个有吸引力的靶标可以是例如PD-1，其表达在新近活化的CD4 T细胞上。理想地，可使用非拮抗抗体，例如下文进一步详细讨论的J110抗体。
另一实例是白细胞介素-4(IL-4)，它是诱导幼稚CD4+T细胞分化成Th2细胞的细胞因子。在活化后，Th2细胞产生更多的IL-4，并且因此，IL-4被认为是Th2-介导的免疫应答的主要驱动因素。Th1/Th2不平衡(有利于Th1)促进自身免疫性疾病和其他炎性疾病的观念首先在二十世纪80年代被假定(Kidd，2003 Altern Med Rev 8：223中的综述)，并且实际上，已记载了Th1/Th17细胞作为牛皮癣(Ghoreschi，2007 Clin Dermatol 25：574)、某些类型的炎性肠病，特别是克罗恩病(Sanchez-Munoz，2008 World J Gastroenterol 14：4280)，或严重相对于轻度形式的哮喘(Hansbro，2011 Br J Pharmacol 163：81)中的疾病驱动因素的作用。
在传染病的临床前模型中，免疫应答从Th1向Th2的偏离和通过IL-4的巨噬细胞的活化保护免于免疫病理作用(Hunig，2010 Med Microbiol Immunol 199：239)，并且牛皮癣患者的IL-4疗法导致诱导Th2分化和临床得分的改进(Ghoreschi，2003 Nat Med 9：40)。
向Th2的转移可在某些疾病类型中提供治疗益处。向CD4+T细胞递送IL-4可完成这一点，或者可将IL-4活性靶向巨噬细胞以保护免于免疫病理作用(Ghoreschi，2007 ClinDermatol 25：574；Hunig，2010 Med Microbiol Immunol 199：239)。
可开发用于设计本发明的抗体-弱化IL-4融合蛋白构建体的IL-4中的弱化突变包括表17中列出的那些。
表17
ND。没有发现特异性结合。
在此表格中的IL-4突变体及其结合特性和生物活性描述于Wang Y，Shen B和Sebald w.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997 March 4；94(5)：1657-62。
在又另一个实例中，也可将白细胞介素-6(IL-6)弱化并靶向特定的细胞类型。肿瘤能够逃脱抗肿瘤免疫的机制是招募Treg细胞至肿瘤微环境，导致肿瘤位点的耐受性。IL-6是参与调节Treg和Th17细胞之间的平衡的细胞因子并且诱导Th17细胞的发育，同时它抑制Treg分化(Kimura，2010 Eur J Immunol 40：1830)。
IL-6，通过将幼稚T细胞的终末分化偏向Th17谱系，或Th17细胞的重编程，具有在癌症背景下逆转Treg细胞的肿瘤相关的免疫抑制的潜能，从而使免疫系统能够控制肿瘤。
这种策略已经在胰腺癌的鼠模型中证实是成功的，其中与带有不表达IL-6的肿瘤的小鼠相比，使用表达IL-6的肿瘤细胞注射的小鼠证实肿瘤生长的显著延迟和增强的存活，伴随Th17细胞在肿瘤微环境中的增加(Gnerlich，2010 J Immunol 185：4063)。
T细胞的过继转移是实体恶性肿瘤(Rosenberg，2011 Clin Cancer Res 17：4550)和血液恶性肿瘤(Kochenderfer，2012 Blood 119：2709)的有效治疗。利用使用多种预处理方案的过继T细胞转移的5个不同临床试验的分析显示，Treg耗尽的深度和持续时间与临床应答率相关，突出了残留Treg控制抗肿瘤反应的重要作用(Yao，2012 Blood 119：5688)。在小鼠中，存活Treg和过继转移治疗效力之间的直接关联强烈支持这些临床观察结果(Baba，2012 Blood 120：2417)。
Tregs在控制抗肿瘤活性中的重要性通过成胶质细胞瘤患者中在使用抗IL-2受体抗体达利珠单抗耗尽Treg后，对肽接种的体液应答显著增加而得到进一步的例证(Sampson，2012 PloS ONE 7：e31046)。
综上，公开的数据强烈支持Treg在抑制针对肿瘤的免疫应答中的作用。通过将IL-6活性指向CD4+细胞以刺激Th17分化并降低Treg形成，预期到增强的抗肿瘤应答。这些可以伴随或不伴随接种策略而实现。将弱化的IL-6融合至针对T细胞抗原(例如靶向CD4)的抗体或活化的T细胞抗原(例如PD-1)，将提供向靶标细胞的全面直接递送。
IL-6的弱化突变体包括表18中列出的那些。
表18
这些IL-6突变体及其性质由Kalai M等人Blood.1997 Feb 15；89(4)：1319-1333描述。
另一实例是作为肝细胞的促分裂原而发现的肝细胞生长因子(HGF)(Nakamura，2010 Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci 86：588中的综述)。肝细胞生长因子是调节细胞生长和运动性的多效细胞因子，在很多器官中的血管生成和组织再生和修复中发挥核心作用。
HGF通过其受体MET发挥作用，MET在上皮和内皮细胞上表达。HGF与MET的结合导致多种细胞内磷酸化和信号传递事件，产生多种生物应答，包括迁移、增殖和形态发生。对于胚胎发生是必不可少的，HGF在成体中的主要功能是组织修复(Nakamura，2010 Proc JpnAcad Ser B Phys Biol Sci 86：588)。
HGF已显示改变上皮细胞的命运，并且通过其对TGF-β信号传递的干扰减少上皮-间质转化(EMT)，拮抗成纤维细胞发生的过程(Shukla，2009 Am J Respir Cell Mol Biol40：643)。在器官损伤后，TGF-β驱动产生HGF的成纤维细胞转化成产生胶原的肌成纤维细胞，而HGF则依次抑制由肌成纤维细胞的TGF-β产生(Mizuno，2004 Am J Physiol RenalPhysiol 286：F134)。外源HGF或活化MET受体的模拟物，通过恢复由组织损伤导致的这种不平衡发挥作用，并且因此被认为是用于治疗受损组织和纤维化疾病的有前景的药物候选(Nakamura，2010 Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci 86：588)。
最初在肝损伤和肝炎模型中研究(Roos，1992 Endocrinology 131：2540；Ishiki，1992 Hepatology 16：1227)，随后证实了HGF在很多其他受损器官中的治疗益处，包括损伤和纤维化的肺、胃肠、肾和心血管模型(Nakamura，2011 J Gastroenterol Hepatol 26：188)。
在纤维化的体内模型系统中，当预防性或治疗性地施用在暴露于博来霉素的鼠肺中(Yaekashiwa，1997 Am J Respir Crit Care Med 156：1937；Mizuno，2005 FASEB J 19：580)，在小鼠中的梗阻性肾病模型中(Yang，2003 Am J Physiol Renal Physiol 284：F349)和大鼠中的肝纤维化模型中(Matsuda，1997 Hepatology 26：81)，HGF预防纤维化变化的进展并且减少胶原积累；HGF还预防心肌病仓鼠中的纤维化(Nakamura，2005 Am JPhysiol Heart Circ Physiol 288：H2131)。
HGF作为治疗剂的局限性包括其半衰期短，这需要高于生理学的全身浓度以达到局部有效水平，以及其受体MET在癌症中的作用。MET能够活化上皮细胞中的致癌途径。这两种局限性都可以通过生成抗体-HGF融合蛋白构建体并将其靶向至再生或纤维化组织而克服。这种策略可产生具有长得多的半衰期的主要指向相关细胞类型的治疗剂。
临床试验已研究了HGF或HGF模拟物在肝衰竭、慢性下肢溃疡、肢体缺血、外周动脉病，心肌梗塞后心血管疾病和神经系统疾病中的治疗潜能和再生活性(de Andrade 2009Curr Opin Rheumatol 21：649；Nakamura，2011 J Gastroenterol Hepatol 26：188；Madonna，2012 Thromb Haemost 107：656)。
肝纤维化，通常是由感染或酗酒导致的慢性肝损伤的结果，与其他器官中的纤维化一样，都表征为细胞外基质，包括(肌)成纤维细胞产生的胶原的过量积累。受损的肝细胞释放炎性细胞因子，并且所产生的炎性环境刺激肝星状细胞(HSC)转化成产生胶原的成纤维细胞。细胞外基质蛋白的积累产生瘢痕组织，其导致肝硬化(Bataller，2005 J ClinInvest 115：209)。存在HGF对体外肝细胞和HSC的直接作用的证据(Kwiecinski，2012 PloSOne 6：e24568；Namada，2012 J Cell Physiol DOI 10.1002/jcp.24143)。将HGF特异性靶向肝细胞或HSC可导致肝纤维化患者中的治疗益处，同时消除HGF的不需要的全身作用。
用于肝细胞的可能膜蛋白包括，例如ASGR1，脱唾液酸糖蛋白的亚基，其用作肝特异性药物递送的靶标(Stockert，1995 Physiol Rev 75：591)，或，可选地这个受体的另一个亚基ASGR2。成纤维细胞特异性蛋白(FSP1)表达在肝损伤后增加，并且可用于靶向纤维化肝组织中的成纤维细胞或炎性巨噬细胞(Osterreicher，2011 Proc Natl Acad Sci USA108：308)。
在肺纤维化患者中，肺结构的损失表征为肺泡上皮细胞的损失，活化的成纤维细胞的持续增殖，和细胞外基质的广泛改变(Panganiban，2011 Acta Pharmacol Sin 32：12)。
为了治疗肺纤维化，可通过使其弱化(通过突变)或使其连接到针对这些细胞上的特异性细胞表面蛋白(例如RTI40/Tiα或HTI56)的抗体，而将HGF活性递送至肺泡上皮细胞(McElroy，2004 Eur Respir J 24：664)。
上皮细胞特异性标记物，包括VEGF受体(Stuttfeld，2009 IUBMB Life 61：915)可用于靶向血管，用于多种病理学适应症，包括下肢缺血的内皮细胞层强化。VEGF受体抗体的实例显示在表19中。
表19
信号传递配体的很多其他实例也是本领域中已知的，并且如上述非限定性示例性实施方式中所述，可以被弱化并连接到结合特定靶细胞上的抗原的抗体(或其片段)，从而允许配体在这些靶细胞上产生其生物信号，至远大于它在抗原阴性细胞上产生其信号的程度。对肿瘤增殖具有直接负面作用的配体的实例包括TNFα、TRAIL、Fas配体、IFNβ、IFNγ或IFNλ，其可靶向如上文对INFα所讨论的各种肿瘤细胞表面抗原。
在本发明的很多方面，明确提出了各种配体中的特异突变。然而，本领域中存在熟知用于鉴定信号传递配体中其他突变的方法，用于蛋白诱变的很多方法是本领域中已知的。这样的方法包括随机诱变，例如使蛋白暴露于UV照射，或诱变化学品并选择具有期望特征的突变体。也可通过在寡核苷酸合成中使用掺入的核苷酸完成随机诱变，或者在增加核苷酸的错误掺入的条件下进行PCR，从而产生突变体。另一种技术是定点诱变，其向DNA中引入特定变化。定点诱变的一个实例是在使用DNA聚合酶的引物延伸反应中使用诱变寡核苷酸。这种方法允许在特定位点引入的点突变、或缺失或DNA小段的插入。定点方法可在这种技术如丙氨酸扫描诱变中系统性地完成，从而将残基系统性地突变成丙氨酸并且测定其对肽活性的影响。以这种方式分析肽的每个氨基酸残基以确定肽的重要区域。
另一实例是组合诱变，其允许对具体特征筛选大量突变体。在这种技术中，可将几个选择的位置或短DNA段穷尽修饰以获得突变体蛋白的全面文库。这种技术的一个方法是切除部分DNA并替换成在期望的突变位点包含所有可能组合的序列文库。所述区段可以是酶活性位点，或具有结构显著性或免疫原性的序列。然而，区段也可随机插入到基因中，以评估蛋白的具体部分的结构或功能意义。
筛选突变配体以测定功效的方法包括测定配体和靶标之间的复合体的存在。一种形式的测定涉及竞争结合测定。在这样的竞争结合测定中，靶标通常是标记的。从任何假定的复合体分离游离的靶标，并且游离(即没有形成复合体的)标记的量是所测试的试剂与靶分子的结合的量度。还可测量结合而非游离靶标的量。还可标记化合物而不是靶标，并测量在所测试的药物存在和不存在的情况下，结合靶标的化合物的量。
无细胞测定的一个实例是结合测定。尽管不直接针对功能，但调节剂以特异形式结合靶分子的能力是相关生物作用的有力证据。例如，由于空间、变构或电荷-电荷相互作用，分子与靶标的结合可以本质上(in and of itself)是抑制性的。靶标可以是游离在溶液中，固定在支持物上，表达在细胞表面中或细胞表面上。靶标或化合物可以是标记的，从而允许测定结合。通常，靶标将是标记的种类，以减少标记会干扰或强化结合的机会。竞争性结合形式可如此进行，其中试剂的一种是标记的，并且可测量游离标记相对于结合标记的量，以测定对结合的影响。
依赖于测定，可能需要培养。使用多种不同生理测定的任一种检测细胞。可选地，可进行分子分析，例如蛋白表达、mRNA表达(包括全细胞或polyA RNA的差异展示)等。可用于筛选蛋白变体的体外生物测定的非限定性实例显示在以下实施例中，并且还包括凋亡测定、迁移测定、侵入测定、半胱天冬酶活化测定、细胞因子产生测定等。
本发明还提供了包含本发明的多肽的组合物。这些可以进一步包含任何合适的助剂的至少一种，例如但不限于稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等。优选药学上可接受的助剂。此类无菌溶液的非限制性实例及其制备方法在本领域是公知的，例如但不限于Gennaro编辑，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Co.(Easton，Pa.)1990。可以如本领域中公知或如本文中所述那样常规选择适于抗体组合物的施用模式、溶解性和/或稳定性的药学上可接受载体。
可用于本发明组合物的药物赋形剂和添加剂包括但不限于蛋白、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如，糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，例如糖醇类、醛糖酸类、酯化糖类等；以及多糖或糖聚合物)，其可以单独或组合地存在，单独或组合地构成1-99.99重量％或1-99.99体积％。示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白，如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也可以在缓冲能力方面起作用的代表性的氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。一种优选的氨基酸是组氨酸。第二优选的氨基酸是精氨酸。
适用于本发明的碳水化合物赋形剂包括例如单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇类，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(山梨醇)、肌醇等。用于本发明的优选的碳水化合物赋形剂是甘露糖醇、海藻糖和棉子糖。
抗体组合物还可以包括缓冲剂或pH调节剂；通常，缓冲剂是由有机酸或碱制备的盐。代表性的缓冲剂包括有机酸盐，如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；Tris、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐或磷酸盐缓冲剂。用于本发明组合物的优选缓冲剂是有机酸盐，如柠檬酸盐。
此外，本发明的组合物可以包含聚合赋形剂/添加剂，如聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖(聚合糖)、葡聚糖结合剂(例如，环糊精，如2-羟基丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如聚山梨酯，例如和)、脂质(例如磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇)和螯合剂(例如EDTA)。
适用于本发明的抗体组合物的这些和其它已知药物赋形剂和/或添加剂在本领域中是己知的，例如如在“Remington：The Science&Practice of Pharmacy”，第19版，Williams&Williams，(1995)和在“Physician’s Desk Reference”，第52版，MedicalEconomics，Montvale，N.J.(1998)中所列举的，其公开内容通过引用全部并入本文。优选的载体或赋形剂材料是碳水化合物(例如糖和糖醇)和缓冲剂(例如柠檬酸盐)或聚合剂。
在整个本说明书中，词语“包含(comprise)”、或变体如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将理解为意味着包括所述要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组，但不排除任何其它要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组。
本说明书中提及的所有出版物通过引入并入本文。本说明书中已经包括在内的文献、法案、材料、装置、论文等的任何讨论仅是用于提供本发明范围的目的。并不视为认可这些内容的任何或全部构成现有技术基础的一部分或者是本发明相关领域中的公知常识，这是由于在本申请的每个权利要求的优先权日之前，其存在于澳大利亚或别处。
必须注意，如本说明书中所用的单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数方面，除非上下文另行明确指出。因此，例如，“一个(a)”的提法包括单个以及两个或多个；“一个(an)”的提法包括单个以及两个或多个；“该”的提法包括单个以及两个或多个等。
已经概括地描述了本发明，通过参考下列实施例将更容易理解本发明，下列实施例以说明的方式提供，且不旨在是限制性的。
发明的实施例
抗体-IFNα融合蛋白构建体的产生
表达载体：
通过基于PCR的基因组装，从18条(重链)和16条(轻链)DNA寡核苷酸产生编码利妥昔单抗(Anderson等人，美国专利5,843,439，1998年12月1日)和帕利珠单抗(Johnson，美国专利5,824,307，1998年10月20日)可变区的DNA，其根据公开的氨基酸序列设计。编码G005抗-CD38单克隆抗体和nBT062抗CD138单克隆抗体的可变区的DNA分别得自De Weers等人(美国专利7829673)和Daelken等人(WO 2009/080832)的出版物，并且在序列修饰以消除稀有密码子和非优选限制性位点后，交由Integrated DNA Technology，Inc.(Coralville，IA)合成。
分别从杂交瘤W6/32(ATCC HB-95，Barnstable等人(1978)，Cell 14：9-20)、J110(International Patent Organism Depositary FERM-8392，Iwai等人，(2002)，Immunol.Lett，83：215-220)和2D12(ATCC CRL-1689，Schlesinger等人，(1983)，Virol.125：8-17)克隆后，使用SMART RACE cDNA Amplification试剂盒(Clontech，Mountain View，CA)和小鼠Ig-引物组(Novagen/EMD Chemicals，San Diego，CA)测定编码抗人HLA单克隆抗体(HB95)、抗人PD-1单克隆抗体(J110)和抗黄热病毒单克隆抗体(2D12)的可变区的DNA序列。序列测定和新分离的抗-CD38抗体的亚克隆描述在以下部分。
通过PCR从HEK细胞系的基因组DNA分离编码人干扰素-α2b(IFNα2b；SEQ ID NO：3的氨基酸序列)的DNA。从蛋白序列例如分别从NP_002167、NP_000580和NP_000591设计人干扰素-β1(IFNβ1，SEQ ID NO：91)、人白细胞介素-4(IL-4，SEQ ID NO：119)和人白细胞介素-6(IL-6，SEQ ID NO：123)的序列，并使用本领域技术人员通常已知的方法，由IntegratedDNA Technology，Inc.(Coralville，IA)或GenScript USA Inc.(Piscataway，NJ)合成。使用本领域中熟知的重叠延伸PCR技术，将细胞因子序列的改变，例如添加接头或点突变，引入到细胞因子基因。
随后，根据本领域技术人员熟知的克隆方法，使用重叠延伸PCR技术和限制性位点，将编码细胞因子的基因片段克隆到pTT5表达载体(Durocher，Nucleic Acids Researchvolume 30，number 2，E1-9页，2002)中，该载体包含作为裸Ig或作为细胞因子基因融合形式的，人IgG1重链的完整或部分恒定区(例如Swissprot登录号PO1857)、人IgG4重链恒定区(例如Swissprot登录号P01861，并入取代S228P)、人Igκ恒定区(Swissprot登录号P01834)或人Igλ恒定区(Swissprot登录号P0CG05)。
IgG和IgG干扰素融合蛋白构建体的产生：
使用Plasmid Plus Maxi试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备编码IgGs和IgG-细胞因子融合蛋白构建体的DNA质粒，并且随后使用商购可得的转染试剂和OptiMEM培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)，转染到在补充0.1％Pluronic F-68、4mM L-谷氨酰胺(Invitrogen，Carlsbad，CA)的F17合成培养基中生长的HEK293-6E细胞(CNRC，Montreal，Canada)中。允许在补充5％CO2并温和振荡的培养箱中表达6天后，分离培养基，并进行使用蛋白G-琼脂糖珠(GE Healthcare，Piscataway，NJ)的IgG亲和纯化。随后，浓缩纯化的IgG和IgG-细胞因子融合蛋白构建体，并使用Amicon超离心过滤设备(Millipore，Billerica，MA)缓冲交换至磷酸缓冲盐水(PBS)pH 7.4，随后使用NanoDrop 2000分光光度计(ThermoScientific，Waltham，MA)测量蛋白浓度。
尽管在HEK系统中表达的不同抗体-细胞因子融合蛋白构建体具有不同的产量，但它们中的几种，特别是基于IFNα的那几种，以至少100mg/L培养基产生，显示高溶解性，并且如通过尺寸排阻色谱测定的不凝集。
抗体和抗体-配体构建体融合蛋白构建体的氨基酸序列在下文描述。对于其中细胞因子融合至重链和轻链的C-末端的抗体-细胞因子融合蛋白构建体，使用以下命名规则。
[mab的名称]-[与重链(“HC”)或轻链(“LC”)的连接]-[接头名称]-[配体名称][(突变)][同种型]。
因此，例如，构建体“利妥昔单抗-HC-L6-IFNα(A145G)IgG1”是抗体利妥昔单抗，和具有插入接头L6的连接至IgG1重链的C-末端的IFNα2b(带有A145G点突变)。
试验中使用的接头如下：
L0：无接头(抗体链的C末端与细胞因子的N-末端直接融合)
L6：SGGGGS(SEQ ID NO：132)
L16：SGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：133)。
用于测量抗体-IFNα融合蛋白构建体的抗原靶向活性的方法
“中靶(Daudi)测定”：此测定用于定量IFN和抗体-IFN融合蛋白构建体对展示抗原的细胞的抗增殖活性，所述抗原对应于IFN与之融合的抗体，并可用作计算本文定义的抗原敏感性指数(ASI)的测定的一部分。Daudi细胞表达CD20和CD38二者作为细胞表面相关抗原。使用来自Promega(Madison，Wisconsin)的试剂Cat#G7570测量细胞的生存力。这是基于ATP的定量测定培养物中的细胞生存力的基于荧光的测定。信号强度与微滴定板孔中的活细胞的数量成比例。测定的细节如下：
将Daudi细胞(得自ATCC，Manassas，VA)培养在T75烧瓶(TPP，Trasadingen，Switzerland，目录号90076)中，至在含有10％胎牛血清(FBS；Hyclone，Logan，UT目录号SH30070.03)的RPMI 1640(Mediatech，Inc.，Manassas，VA，cat#10-040-CV)中0.5x 105至0.8x 105之间的活细胞/ml的优选密度。通过在400g离心5分钟收获细胞，倾去上清，并将细胞沉淀重悬在RPMI 1640+10％FBS中。随后，计数细胞，并将密度调整至RPMI 1640+10％FBS中3.0x 105细胞/ml。随后，将50μl细胞悬浮液等分至96孔圆底组织培养平板(下文称作“试验平板”)(TPP，目录号92067)的每个孔中。在分离的无菌96孔板(下文称作“稀释平板”；Costar，Corning，NY目录号3879)上，将测试物连续稀释在RPMI 1640+10％FBS，一式两份。随后，将50μl/孔从稀释平板转移到试验平板。随后，将试验平板在37℃和5％CO2下孵育4天。
将制造商提供的测定缓冲液和测定底物的混合物(下文称作“CellTiterGlo试剂”，根据制造商的说明混合)以100μl/孔添加到试验平板。将平板振荡2分钟。随后，将100μl/孔从试验平板转移到96孔平底白色不透明平板(下文称作“测定平板”；BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ目录号353296)。随后，允许测定平板的内容物在室温下避光稳定15分钟。在Victor 3V Multilabel Counter(Perkin Elmer，Waltham，MA，型号1420-041)上，在光度计通道上读取平板，并测量发光。结果表示为“相对发光单位(RLU)”。
使用Prism 5(Graphpad，San Diego，CA)，使用非线性回归和三参数曲线拟合分析数据，以测定曲线的中点(EC50)。对于每个测试物，计算相对游离IFNα2b(或相对于IFNα2b的具有已知效力的一些其他形式的IFN)的效力作为EC50s比例。
本领域普通技术人员可理解，有很多也可使用的用于测量细胞生存力的其他常用测定。
“中靶(ARP)测定”(本文中有时也称作“靶向测定”)：多发性骨髓瘤细胞系ARP-1由阿肯色大学医学中心骨髓瘤研究所(Myeloma Institute at the University ofArkansas Medical Center)(Little Rock，AK)所长Bart Barlogie MD，PhD惠赠。它描述于Hardin J.等人，(Interleukin-6 prevents dexamethasone-induced myeloma celldeath.Blood；84：3063，1994)中。使用ARP-1细胞(CD38+)测试CD38靶向抗体-IFN融合蛋白构建体。培养和测定条件与上述用于基于Daudi的测定的相同，除以下例外：将ARP-1培养至4.0x 105至6.0x 105细胞/ml的密度。在测定前，将ARP-1浓度调整至1.0x 104细胞/ml。
用于测量抗体-IFNα融合蛋白构建体的非抗原靶向活性的方法
“脱靶测定”(本文中有时也称作“非靶向测定”)：大体上如制造商所述进行来自PBLInterferon Source(Piscataway，NJ，目录号51100)的iLite测定，并添加人IgG封闭步骤。制造商将iLite细胞系描述为“源自商购可得的人前单核细胞系(pro-monocytic humancell line)的稳定转染的细胞系，其特征在于在细胞表面表达II型MHC抗原，特别是人淋巴细胞抗原(HLA-DR)”。此细胞系包含稳定转染的荧光素酶基因，其表达由干扰素-应答元件(IRE)驱动，其允许基于发光输出量化干扰素活性。从-80℃冰箱取出制造商提供的iLite平板(下文称作“测定平板”)和稀释剂，并允许平衡至室温。随后，将50μl/孔的稀释剂添加至测定平板。将制造商提供的报告细胞的小瓶从-80℃冰箱取出，并在37℃水浴中解冻。随后，将25μl等分试样的细胞分配至测定平板的每个孔中。随后，将12.5μl稀释到RPMI 1640+10％FBS(Sigma Chemicals，St.Louis，MO；目录号I4506)中的8mg/ml人IgG添加到每个孔中。将内容物混合并在37℃孵育15分钟。在单独的“稀释平板”上，将测试物连续稀释在RPMI1640+10％FBS中，一式两份。随后，将12.5μl的测试物从稀释平板转移到测定平板。随后，将测定平板在37℃和5％CO2下孵育17小时。从-80℃冰箱取出制造商提供的测定缓冲液和底物，并允许平衡至室温2小时。将制造商提供的测定缓冲液添加至制造商提供的底物小瓶，并根据制造商的说明充分混合以产生“发光溶液”。随后，将100μl的发光溶液添加至测定平板的每个孔。将平板振荡2分钟。随后，将平板在室温下避光孵育5分钟，并最后在Victor 3VMultilabel Counter在光度计通道上读取，并测量发光且表示为RLU。如上文对“中靶(Daudi)测定”所述，使用Graphpad Prism 5分析数据。为了在iLite测定中测试抗-CD38抗体-IFN融合蛋白构建体，将制造商提供的稀释剂补充2mg/ml人IgG和0.5mg/ml抗-CD38抗体(相同的抗体克隆作为抗体-IFN融合蛋白构建体测试，以封闭抗-CD38抗体-IFN融合蛋白构建体与iLite细胞上表达的CD38的任何结合)。
结果：抗体-IFNα融合蛋白构建体的抗原-特异性
图6显示了游离IFNα2b(SEQ ID NO：3；图中的“IFNα”)，以及融合至两种不同抗体(利妥昔单抗和帕利珠单抗，同种型对照抗体)的重链的C-末端的IFNα2b，作用于iLite细胞系的干扰素活性。这种细胞系不展示对于这些抗体的任一种的抗原，因此，这个测定揭示了在不存在基于抗体-抗原的靶向的情况下各种含IFNα2b蛋白的效力。这个测定的细节描述在上文标题“用于测定抗体-IFNα融合蛋白构建体的非抗原靶向活性的方法”下，并且下文中简称为“脱靶测定”。“利妥昔单抗-HC-L6-IFNα IgG1”是指靶向CD20的嵌合抗体利妥昔单抗，其中轻链(SEQ ID NO：276)没有改变但IgG1型重链(SEQ ID NO：277)已在其C末端连接6个氨基酸的接头序列(“L6；”SGGGGS，SEQ ID NO：132)，其后为IFNα2b的序列(SEQ ID NO：3)；这个重链-接头-IFNα序列显示为SEQ ID NO：280。“同种型-HC-L6-IFNα IgG1”是指靶向RSV的人源化抗体帕利珠单抗，其中轻链(SEQ ID NO：290)没有改变但IgG1型重链(SEQ ID NO：291)已在其C末端连接6个氨基酸的接头序列(“L6；”SGGGGS，SEQ ID NO：132)，其后为IFNα2b的序列(SEQ ID NO：3)；这个重链-接头-IFNα2b序列显示为SEQ ID NO：294。在这个测定中，游离的IFNα2b显示通过干扰素应答元件(IRE)活化基因表达的EC50是1.9pM。通过将IFNα2b连接至利妥昔单抗，其效力降低3.1倍(5.9/1.9＝3.1)。在将IFNα2b连接至帕利珠单抗时，观察到类似的、适度的效力降低。同样地，在这个研究中使用的细胞系在其细胞表面不具有对应于这些抗体中的任一种的抗原，证明IgG与IFNα2b的N-末端的连接导致其非抗原靶向的IFN活性的适度的(3-4x)降低。这与其他人报道的一致(例如在US 7,456,257中)。单独(没有融合至干扰素)的帕利珠单抗和利妥昔单抗都没有在这个测定中显示任何活性(数据未显示)。
为了测定抗体-IFNα2b融合蛋白构建体相对于游离IFNα2b是否对确实在其细胞表面展示相应抗原的细胞具有增强的活性，检测了它们对展示利妥昔单抗的CD20抗原但没有展示对应于帕利珠单抗的RSV F蛋白抗原的Daudi细胞的作用。在这种情况下使用的测定，上文描述为“用于测量抗体-IFNα融合蛋白构建体的抗原靶向活性的方法”或简称为“中靶(Daudi)测定”测量测试物对Daudi细胞的生存力的影响。使用这些细胞，利妥昔单抗-IFNα2b融合蛋白构建体(利妥昔单抗-HC-L6-IFNα IgG1)比游离IFNα2b的效力高3.25倍(1.3/0.4＝3.25)(图7)。换而言之，利妥昔单抗与IFNα2b的连接产生对于抗原阴性细胞略降低(3.1倍)的活性(图6)，但对抗原-阳性细胞略提高(3.25倍)的活性(图7)。因此，整体上，在这个试验中抗体连接将抗原-特异性指数(ASI)提高了10倍(3.1x 3.25)，ASI定义为相对于游离IFNα2b对抗原阳性细胞的效力增加倍数乘以相对于游离IFNα2b对抗原阴性细胞的效力降低倍数。重复试验测量了为14的ASI，如表20，第二行中所示。使用EC50(剂量-应答曲线的数学中点)作为本文所示计算中效力的量度。换言之，当化合物A显示比化合物低10倍的EC50时，将其称作具有高10倍的效力。
图8中所示的结果与依赖于抗体-抗原反应性的基于抗体的靶向一致：利妥昔单抗-IFNα融合蛋白构建体(利妥昔单抗-HC-L6-IFNα-IgG1)在降低CD20+Daudi细胞的生存力方面的功效比其抗原不存在于Daudi细胞上的帕利珠单抗-IFNα融合蛋白构建体(同种型-HC-L6-IFNα-IgG1)高12倍(2.2/0.18＝12)。
由于将其连接至抗体而发生的IFNα活性的适度降低不足以抑制构建体的IFNα组分在人个体中的毒性。因此，向IFNα2b引入各种突变以降低其活性和毒性。例如，产生5种不同的突变体形式的IFNα2b，并且，在每种情况下，通过6个氨基酸的接头L6(具有序列SGGGGS(SEQ ID NO：132))连接至利妥昔单抗的重链的C-末端。这些构建体与利妥昔单抗-野生型IFN融合蛋白构建体、利妥昔单抗-HC-L6-IFNα IgG1(也用于图6-8中所示的试验中)比较。5种突变体形式为R144A、A145G、R33A+YNS、R33A和R144A+YNS。这些变体的序列在下文描述。上表6和7中显示了基于此前表征其他IFN突变体预期的对I型干扰素受体的亲和力降低程度，和干扰素活性的预期弱化量。
图9、10和表20显示了这些利妥昔单抗-弱化IFNα2b融合蛋白构建体的每一种相对于游离的野生型IFNα2b对抗原阴性(即，CD20-阴性)细胞的干扰素活性的降低程度。利妥昔单抗-IFNα2b融合蛋白构建体的R144A突变体(由SEQ ID NOS：282(重链)和276(轻链)构成)显示干扰素活性降低386倍(2200/5.7＝386)。A145G和R33A+YNS形式(分别由各自与SEQ IDNO：276的轻链组合的SEQ ID NOS：284和286的重链构成)分别显示活性降低491倍(2800/5.7＝491)和1,071倍(6100/5.7＝1,071)。图10显示了R144A+YNS融合蛋白构建体(由SEQID NOS：288(重链)和276(轻链)构成)相对于缺少IFN突变的利妥昔单抗融合蛋白构建体(利妥昔单抗-HC-L6-IFNα IgG1)的干扰素活性的降低程度；由于利妥昔单抗-HC-L6-IFNαIgG1对抗原阴性细胞的效力比游离的野生型IFNα2b低3.8倍(来自图9的数据；22/5.7＝3.8)，这表示融合蛋白构建体的R144A+YNS形式比游离的野生型IFNα2b效力低1,150倍(303x 3.8＝1,150)。融合蛋白构建体的R33A形式(由SEQ ID NOS：436(重链)和276(轻链)构成)弱化到如此高的程度，以至于它在非靶向测定中显示没有可检测到的活性。
表20
*游离IFNα2b没有与这些行中的测试物在同日测试。因此，这些测量基于测试物与利妥昔单抗-HC-L6-IFNα IgG1的比较，其在同日和相同的平板上测定，乘以基于在不同日测量的IFNα2b相比于利妥昔单抗-HC-L6-IFNα IgG1的相对活性(即，在从上起第二行中显示的数据)的校正因子。
意外地，在抗原-阳性细胞(Daudi，CD20+)上测量这些高度弱化的利妥昔单抗-突变体IFNα2b融合蛋白的干扰素活性的量时，与野生型IFNα2b形式的利妥昔单抗-IFNα2b融合蛋白构建体相比一般很少弱化(图11-12)，并且因此突变的干扰素仍具有活化“中靶”细胞上的IFN受体的能力同时具有大幅降低的活化“脱靶”细胞上的IFN受体的能力。例如，R33A+YNS形式的构建体对抗原阳性(Daudi)细胞的活性仅比利妥昔单抗-IFNα2b野生型构建体低2.2倍(0.74/0.33＝2.2)。这与对抗原阴性细胞的活性降低277倍(6100/22＝277；图9)相反。在利妥昔单抗-IFNα2b融合蛋白构建体的背景下，IFNα2b中的突变导致对抗原阴性细胞的活性弱化显著大于对于抗原阳性细胞的活性弱化。因此，利妥昔单抗-HC-L6-IFNα2b(R33A+YNS)IgG1融合蛋白构建体展示比利妥昔单抗-HC-L6-IFNα2b IgG1(10至14倍)或游离IFNα2b(1-倍，根据定义)大幅提高的抗原-特异性指数(ASI，1，700-倍)，表明其在体内的脱靶效应将大幅降低。
在IFNα2b部分中带有突变的其他利妥昔单抗-IFNα2b构建体也意外地显示相对于其对抗原阴性细胞的效力降低(图9和10)，对抗原-阳性细胞的活性几乎没有降低(图11和12)。除了R33A形式的融合蛋白构建体之外，如下文讨论，弱化突变导致对抗原阴性细胞的干扰素活性相对于游离的野生型IFNα2b降低384-1,160倍，但对抗原阳性细胞显示的效力是野生型IFNα2b的0.23-1.2倍。R33A突变融合蛋白构建体，其在没有抗体-抗原靶向的情况下具有不可检测的IFN活性，在存在抗体-靶向的情况下仍显示显著的活性；R33A形式的融合蛋白构建体的效力在中靶测定中比缺少这种弱化突变的相同融合蛋白构建体低1620倍(340/0.21＝1,620-倍弱化)。这与在缺少基于抗体靶向的情况下，由相同突变导致的至少100,000-倍弱化截然不同。这些结果总结在表20中。
为了测定融合蛋白构建体的IFNα组件中的突变相比于抗原阳性细胞其对抗原阴性细胞的活性大幅降低的能力的这种显著差异是否能够延伸到靶向其他抗原的其他融合蛋白构建体，将靶向多发性骨髓瘤抗原CD38(SEQ ID NO：131)的抗体融合至野生型和弱化形式的IFNα并表征。这些试验的一部分使用抗体G005(De Weers等人，(美国专利7829673))进行；这种人抗体的重链和轻链序列分别显示为SEQ ID NOS：135和134。
此外，产生了几种新型人和大鼠抗CD38抗体，如下文所述。
新型CD38抗体的开发
设计用于表达的CD38构建体
将人和食蟹猴CD38蛋白的细胞外结构域(ECD)分别设计为包含可切割的N-末端前导序列，AvitagTM、多组氨酸标签和凝血酶切割位点以分别产生蛋白SEQ ID NO：127和128。它们反向翻译成DNA序列并通过本领域技术人员已知的方法通过合成寡核苷酸组装从头合成。在基因合成后，将基因亚克隆至载体pTT5(Durocher，Nucleic Acids Research volume30，number 2，E1-9页，2002)，以产生构建体，用于通过HEK293E细胞(Durocher，如上)中的瞬时表达产生可溶分泌形式的这些蛋白。
用于抗体表达的载体的构建
将重链和轻链可变区序列亚克隆到载体pTT5的变体中，该变体包含人IgG1重链恒定区(例如Swissprot登录号PO1857)、人IgG4重链恒定区(例如Swissprot登录号P01861，并入取代S228P)、人κ恒定区(Swissprot登录号P01834)或人λ恒定区(Swissprot登录号P0CG05)，以产生全长抗体链。
构建体在HEK293-6E细胞中的瞬时表达
将HEK293-6E细胞培养在完全细胞生长培养基(1L的F17培养基(InvitrogenTM)、9mL的Pluronic F68(InvitrogenTM)、2mM谷氨酰胺，含20％(w/v)的胰蛋白胨NI和以50μl/100mL培养物的遗传霉素(50mg/mL，InvitrogenTM))中。在转染前一日，通过离心收集细胞并重新悬浮在新鲜培养基(无遗传霉素)中。次日，将DNA与商购转染试剂混合，并向培养物滴加DNA转染混合物。将培养物在37℃和5％CO2和120rpm，无遗传霉素的条件下孵育过夜。次日，每500mL培养物添加12.5mL胰蛋白胨和250μl遗传霉素。将培养物在37℃、5％CO2和120rpm孵育。7天后，通过离心收获上清液并准备用于纯化。
抗体的表达和纯化
重链和轻链在HEK293-6E细胞中的瞬时共表达(如上所述)产生抗体，随后通过蛋白A层析纯化所述抗体。简要而言，将源自这些转染物的上清液调整至pH 7.4，随后上载到HiTrap蛋白A柱(5mL，GE Healthcare)上。使用50mL的1x PBS(pH 7.4)清洗柱子。使用0.1M柠檬酸pH 2.5进行洗脱。使用Zeba脱盐柱(Pierce)将洗脱的抗体脱盐至1X PBS(pH 7.4)中。使用SDS-PAGE分析抗体。使用BCA测定试剂盒(Pierce)测定抗体的浓度。
从组织培养上清液纯化组氨酸-标签化的蛋白
使用固定金属离子亲和层析(IMAC)从组织培养上清液纯化人和食蟹猴CD38细胞外结构域(ED)蛋白。简要而言，将蛋白上清液稀释在结合缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，30mM咪唑，pH 7.4)中，随后上载到HisTrapTM FF柱(1mL，GE Healthcare)中。使用5mL结合缓冲液(pH 7.4)清洗柱子，并且使用20mM磷酸钠，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH 7.4进行洗脱。将洗脱的蛋白脱盐，并使用带有Ultracel-10膜的Amicon Ultra-15离心滤器单元(Millipore)缓冲液交换至1X PBS(pH 7.4)中。使用Nanodrop分光光度计评估蛋白在280nm的吸光度(A280)，并使用预期的消光系数校正读数以测定蛋白浓度。
用于噬菌体展示的抗原的生物素化
根据制造商的指示(Avidity LLC，Aurora，CO)，将人和食蟹猴CD38 ED的AvitagTM基序生物素化。根据制造商的说明，通过使用7KD分子量截止值(MWCO)Zeba离心柱(ThermoScientific，Logan，UT)脱盐至1x PBS，从生物素化蛋白除去过量的未缀合生物素。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印记的组合确认CD38ED蛋白的成功生物素化。使用链霉抗生物素蛋白-HRP(BD Biosciences，San Diego，CA)探测Western印记，并使用TMB(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)显色。对于每种抗原，都检测到单生物素化的CD38 ED。
通过噬菌体展示产生抗-CD38抗体
从包含约2.5x 1011个单独人FAb片段的幼稚噬菌粒文库分离结合人和食蟹猴CD38ED二者的Fab。产生噬菌体抗体片段文库的方法在“Phage display：A Practical Approach”(Eds.Clackson和Lowman；Oxford University Press，Oxford，UK)和“Antibody PhageDisplay Methods and Protocols”(Eds.O’Brien和Aitken；Humana Press Inc，NJ 07512)中讨论。简而言之，基于来自供体样品的RNA扩增抗体重链和轻链可变区域。随后，将抗体重链和轻链可变区插入到噬菌粒载体中，以产生融合至噬菌体外壳蛋白的抗体片段的文库。本文使用的抗体文库是高多样性的表达Fab形式的抗体片段的幼稚噬菌粒文库。
在两次淘选“运动(campaign)”(即使用不同试剂或淘选条件的离散噬菌体展示试验)的过程中，从噬菌体展示文库分离抗CD38 FAb。总体方案遵循Marks等人概述的方法(Marks，J.D.和Bradbury，A.，2004，Methods Mol Biol，248，161-76)。
每次噬菌体展示运动包括三轮淘选。对于每一轮，通过与封闭缓冲液(PBS中4％脱脂乳，pH 7.4)按1∶1混合并在室温下孵育1小时，将～2.5x 1012个噬菌体颗粒封闭。随后，通过与50-200pmols包含相同生物素化标签基序的无关抗原一起孵育45分钟，预先耗尽封闭的噬菌体文库的在淘选中使用的任何生物素化蛋白标签基序结合剂。通过添加过量(75-300μL)的如对文库所述封闭的链霉抗生物素蛋白-包被的Dynabeads(Invitrogen)，捕获标签-和链霉抗生物素蛋白-结合剂。使用磁铁固定珠子(包括与其连接的标签-和链霉抗生物素蛋白-结合剂)并弃去。
通过将封闭且预先耗尽的文库与50-200pmols的生物素化重组CD38 ED在2mL离心管中混合并在室温下旋转2小时，进行文库淘选。随后，添加100μL链霉抗生物素蛋白-偶联的Dynabeads(Invitrogen，Carlsbad，CA)，并将混合物如上文所述进一步孵育15分钟。使用一系列洗涤除去非特异性结合的噬菌体。每次洗涤包括使用磁性架将珠子复合物从溶液拉出至管壁上，抽吸上清液，并且随后将珠子重新悬浮在新鲜清洗缓冲液中。使用PBS清洗缓冲液(1x PBS，含0.5％脱脂乳)或PBS-T清洗缓冲液(1x PBS，补充0.05％TWEEN-20[Sigma-Aldrich，St.Louis，MO]和0.5％脱脂乳)，将此重复多次。通过与20倍过量的未生物素化的CD38 ED在室温下孵育1小时，或与0.5mL的100mM三乙胺(TEA)(Merck Chemicals，Darmstadt)在室温下孵育20分钟，从生物素化-CD38 ED-珠子复合物洗脱在清洗过程后保持结合的噬菌体。通过添加0.25mL的1M Tris-HCl pH 7.4(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中和TEA-洗脱的“产物(output)”噬菌体。
在第一轮和第二轮淘选结束时，将产物噬菌体添加到10mL指数生长的TG1大肠杆菌的培养物中(2x酵母-胰蛋白胨(2YT)生长培养基)，并允许在37℃无振荡条件下的30分钟孵育期间感染细胞，随后在250rpm振荡额外30分钟。随后，按照标准方案，回收作为噬菌体颗粒的编码噬菌体展示产物的噬菌粒(Marks，J.D.和Bradbury，A.，2004，Methods MolBiol，248，161-76)。在第三轮淘选结束时，使用产物噬菌体感染TG1细胞，并以足够的稀释度平铺在2YT琼脂(补充2％葡萄糖和100μg/mL羧苄青霉素)上以产生分离的大肠杆菌菌落。使用这些菌落接种1mL液体培养物，以允许表达用于在筛选试验中使用的Fab片段。
基于ELISA筛选结合CD38的Fabs
使用每个单独的大肠杆菌菌落表达能够筛选CD38 ED结合活性的Fab。将菌落接种到96孔深孔板(Costar)中的1mL起子培养物(补充100μg/mL羧苄青霉素和2％葡萄糖)中，并在37℃和350rpm(Innova R44振荡器；1英寸轨道)振荡下孵育过夜。将这些起子培养物以1∶100稀释到1mL表达培养物(2YT补充100μg/mL羧苄青霉素)中，并生长至0.5-0.8的光密度(600nm)。通过添加终浓度1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Fab表达。并将培养物在25℃孵育16小时。
通过离心(2,000g，10mins)收集细胞，并进行溶菌酶提取，来制备Fab样品。将细胞沉淀重新悬浮在200μL裂解缓冲液(160μg/mL溶菌酶、10μg/mL RNA酶A、5μg/mL DNA酶和完全蛋白酶抑制剂(Roche，Nutley，NJ))，并在21℃以400rpm振荡30分钟。在添加进一步的100μl裂解缓冲液后，如上文所述，将反应物进一步孵育30分钟。在3,000g离心10分钟后分离澄清的裂解物，并在4℃贮存备用。
为了通过酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选源自噬菌体展示生物淘选的人CD38 ED-结合剂，将人CD38细胞外结构域(ED)(如上文所述在HEK 293-6E细胞中产生并生物素化)以1μg/mL捕获在链霉抗生物素蛋白包被的ELISA平板(Nunc)上。随后，清洗平板，并将单独的Fab样品(制备如上所述)添加到ELISA平板上的单个孔。允许Fab与捕获的CD38 ED在室温下结合1小时，并且随后使用PBS-T(1xPBS补充0.1％)清洗3次。通过在室温与抗V5-HRP缀合抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)一起孵育30分钟，以检测融合至Fab重链的C-末端的V5标签来检测结合CD38 ED的Fab。清洗平板以除去未结合的抗体，并通过与50μL 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Sigma-Adrich，St.Louis，MO)一起孵育产生测定信号，并使用50μL 1MHCl淬灭。使用微板读数器(BMG Labtech)读取A450nm的测定信号。结果表示为原始A450nm值，其中大于平均测定背景2倍的任何信号定义为“阳性”。
在随后的测定中，通过将生物素化的食蟹猴CD38 ED包被到链霉抗生物素蛋白包被的ELISA平板上并按上文所述进行，评估与食蟹猴CD38 ED的Fab交叉反应性。分离编码与人和食蟹猴CD38 ED二者交叉反应性的Fab的质粒，并测序。在筛选的结合人和食蟹猴CD38ED的大约1,000个Fab中，鉴定出6个在基因方面独特的Fab。表21总结了获得的Fab序列数据。这些抗体中一些的可变区显示在图13中。
表21
运动编号 FAb名称 VH序列 VK/VL序列
1 X910/12 SEQ ID NO：395 SEQ ID NO：394
1 X913/15 SEQ ID NO：397 SEQ ID NO：396
2 X355/01 SEQ ID NO：421 SEQ ID NO：420
2 X355/02 SEQ ID NO：391 SEQ ID NO：390
2 X355/04 SEQ ID NO：423 SEQ ID NO：422
2 X355/07 SEQID NO：393 SEQ ID NO：392
通过克隆到pTT5载体(如上所述)中将所有Fab转化成IgG1形式，在HEK293-6E细胞中表达，并通过如上文所述的蛋白A亲和层析纯化所得的IgGs。
评估IgGs与人CD38阳性细胞系RPMI-8226的结合
在基于流式细胞术的测定中，测试噬菌体衍生的抗体结合模型人CD38阳性骨髓瘤细胞系RPMI-8226(得自Health Protection Agency Culture Collections，Porton Down，Salisbury，SP4 0JG，UK)的能力。简要而言，将活RPMI-8226细胞(2x 105个，通过台盼蓝排除判断)与96孔板中的100μl的FACS缓冲液(PBS加1％胎牛血清，FCS)中不同浓度的每种抗体，或与人IgG1同种型对照抗体制剂(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，在冰上避光孵育。使用FACS缓冲液将细胞清洗两次，随后在100μl包含山羊抗人IgG(Fc-特异性，缀合至异硫氰酸荧光素，FITC；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的FACS缓冲液中孵育20分钟。在使用FACS缓冲液清洗后，将细胞重新悬浮在FACS缓冲液中，并在FACS Canto(BD Biosciences，SanDiego，CA)上，使用EV、侧向散射和FL-1门控，通过流式细胞术分析抗体结合。结果表示为相对于蛋白浓度绘制的平均荧光强度(MFI)(图14)。
通过基因免疫产生抗-CD38抗体
通过用大鼠的相应常规蛋白免疫的基因免疫产生针对人CD38 ED的单克隆抗体。对于基因免疫，人CD38 ED的DNA序列在SEQ ID NO：129中提供。相应的在概念上翻译的蛋白序列在SEQ ID NO：130中给出。SEQ ID NO：129的DNA序列克隆到质粒中，用于使用限制性酶技术的基因免疫。所得质粒的表达允许分泌在N-或C-末端通过c-myc表位标记的可溶性CD38ED。使用c-myc表位确认CD38 ED的表达。
随后，根据公开的方案(Kilpatrick等人，Hybridoma 17：569-576，1998)，使用Helios基因枪(Bio-Rad，Germany)，由质粒免疫大鼠6次。在免疫质粒的末次应用后一周，通过未标签化的重组人CD38 ED的皮内注射强化每只大鼠。通过凝血酶切割从SEQ ID NO：127除去蛋白标签产生用于这个目的的未标签的人CD38 ED，随后在尺寸排阻柱上纯化。
4天后，处死大鼠，并使用聚乙二醇(HybriMaxTM；Sigma-Aldrich，Germany)将其淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以100,000个细胞/孔接种在96孔微滴定板中，并培养在补充10％胎牛血清和用于杂交瘤选择的HAT添加剂的DMEM培养基(Kilpatrick等人，1998，如上)中。
用于人和食蟹猴CD-38交叉反应性的筛选杂交瘤上清液
通过在室温下孵育1小时，将每种杂交瘤上清液的一式两份的100μL样品包被到maxisorp ELISA平板(Nunc Plasticware，Thermo Scientific，Rochester，NY 14625，USA)的单独的孔上。将平板在1xPBS-T中清洗三次，并且随后通过添加2％BSA/1xPBS封闭。在室温下温育1小时后，如上文所述清洗平板。向每种大鼠抗体的一式两份的孔的一个孔添加终体积100μL 1xPBS中的0.1μg生物素化的人CD38。向每种大鼠抗体的一式两份的孔的第二个孔添加终体积100μL 1xPBS中的0.1μg生物素化的食蟹猴CD38 ED。在使用链霉抗生物素蛋白-HPR缀合物(BD Biosciences，San Diego，CA)检测结合的生物素化的CD38 ED之前，如上文所述清洗平板孔。如上清洗平板以除去未结合的链霉抗生物素蛋白-HPR缀合物，并通过与50μL 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Sigma-Adrich，St.Louis，MO)一起孵育产生测定信号，并使用50μL 1M HCl淬灭。使用微板读数器(BMG Labtech，Cary，NC)在A450nm读取测定信号。在所测试的15种杂交瘤上清液中，如通过ELISA所测定的，所有15种都结合人CD38 ED且7种结合食蟹猴CD38 ED(表22)。交叉反应性抗体称作R5D1、R7F11、R5E8、R10A2、R10B10、R3A6和R7H11。
大鼠抗体对人CD38阳性细胞系RPMI-8226结合的流式细胞术
将活RPMI-8226细胞(2x 105个，如通过台盼蓝排除判断)与100μL的大鼠杂交瘤上清液一起在冰上避光孵育20分钟。将细胞使用FACS缓冲液(1x PBS加1％FCS)清洗两次，随后在包含抗大鼠IgG-FITC缀合物(Sigma-Aldrich)的100μl的FACS缓冲液中孵育20分钟。在使用FACS缓冲液清洗细胞后，将它们重新悬浮在FACS缓冲液中，并在FACS Canto(BDBiosciences，San Diego，CA)上，使用EV、侧向散射和FL-1门控，通过流式细胞术分析抗体结合。结果表示为平均荧光强度(MFI)。在通过ELISA显示与人CD38ED结合阳性的15个大鼠抗体中，通过FACS，5个显示对表达在人骨髓瘤细胞系RPMI-8226上的CD38的弱或可忽略的结合(表22)。
表22
FACS结合背景MFI平均值是153。
大鼠抗体的分子表征
选择6种大鼠抗体杂交瘤-R5D1、R7F11、R5E8、R10A2、R10B10和R7H11-用于分子表征。根据制造商的指示，使用TRI试剂(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)进行从每种克隆的沉淀杂交瘤细胞的RNA提取。根据制造商的指示(Clontech[Mountain View，CA]SMART RACE试剂盒；Ambion Life Technologies[Foster City，CA]RLM-RACE试剂盒)，使用cDNA末端的快速扩增(RACE)逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增每种抗体的可变区。用于通过5’-RACE扩增大鼠重链可变结构域的基因特异性反向PCR引物设计为退火至可得的大鼠重链恒定区序列。类似地，用于扩增大鼠轻链的基因特异性反向PCR引物设计为退火至大鼠κ链恒定区序列，同时，设计进一步的引物以退火至大鼠λ链恒定区序列。
根据制造商的指示(Life Technologies；Clontech)，使用PfuUltraII聚合酶(Agilent)进行5’-RACE PCR。在5’-RACE PCR后，通过琼脂糖凝胶电泳分离产物，并从凝胶切出近似于基于反向引物在恒定区中的位置预期的大小的条带。根据制造商的指示，使用Qiaquick离心凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶块纯化DNA。根据制造商的指示，使用StrataClone平端PCR克隆试剂盒(Agilent，Santa Clara，CA)克隆插入DNA并在大肠杆菌中增殖。培养来自转化的单克隆，并使用GenEluteTM质粒miniprep试剂盒(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)制备质粒DNA。将DNA插入片段测序，并在概念上翻译的蛋白序列中确定抗体可变区。
使用连接至重链可变区的人IgG1恒定序列上的大鼠抗体可变区序列，和人κ或λ骨架(保持与大鼠抗体中相同的轻链同种型)构建载体。每种克隆的所得可变区序列列出在表23中。在pTT5载体的背景下，相应重链和轻链在HEK293-6E细胞中后续共表达，随后按照上文所述通过蛋白A纯化所得IgGs。
表23
大鼠抗体 轻链同种型 重链(VH) 轻链(VL)
R5D1 κ SEQ ID NO：399 SEQ ID NO：398
R5E8 κ SEQ ID NO：401 SEQ ID NO：400
R10A2 κ SEQ ID NO：403 SEQID NO：402
R10B10 λ SEQ ID NO：425 SEQ ID NO：424
R7H11 λ SEQ ID NO：427 SEQ ID NO：426
R7F11 κ SEQ ID NO：429 SEQ ID NO：428
人和食蟹猴CD38的抗CD38抗体的亲和力
测量所产生的针对人和食蟹猴CD38的抗体选择的结合亲和力。简要而言，使用BiacoreT200，使用胺偶联将蛋白A固定到CM5研究级传感器芯片的流动池(Flow Cell，FC)1(FC1)和FC2(或可选地FC3和FC4)，获得约2000RU。在整个试验中，使用FC1作为空白。试验在HBS-P缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，0.005％v/v表面活性剂P20)中进行。在20μl/分钟的流速下，将20μl的5μg/mL的抗体通过FC2。人CD38 ED或单独的食蟹猴CD38 ED以25nM至200nM范围的浓度通过FC1和FC2的表面。使用10mM甘氨酸，pH 1.0进行表面的再生。从FCS减去FC1传感图数据，并使用1∶1朗缪尔方程拟合曲线，以产生kd、ka和KD数值。此数据显示在人噬菌体衍生的Fab向人IgG和大鼠抗体向嵌合大鼠-人IgGs的转化中保持人和食蟹猴CD38的交叉反应性(表24)。
表24
抗体 CD38配体 ka(l/Ms)x105 kd(l/s) KD(nM)
X355/02 IgG1 人 1.18 0.000892 7.6
X355/02 IgG1 食蟹猴 0.834 0.002282 27.4
X355/07 IgG1 人 1.15 0.00132 11.4
X355/07 IgG1 食蟹猴 11.3 0.01375 12.2
R10A2 IgG1 人 6.6 0.0004.79 0.7
R10A2 IgG1 食蟹猴 8.98 0.001928 2.2
R5D1 IgG1 人 2.43 0.000239 1.0
R5D1 IgG1 食蟹猴 11.1 0.001102 1.0
R5E8 IgG1 人 4.05 0.00118 2.9
R5E8 IgG1 食蟹猴 4.52 0.001898 4.2
抗-CD38-弱化IFN融合蛋白构建体
为了测定使用融合至弱化IFNα的抗-CD20抗体获得的意外结果是否可使用其他抗体，并且特别是靶向与CD20无关抗原的抗体重复，制备包含完整人IgG1：κ抗-CD38抗体G005(由SEQ ID NOS：135(重链)和134(轻链)构成)和IFNα(SEQ ID NO：3)，带有或没有各种弱化突变的融合蛋白构建体。图15显示了示用iLite试剂盒的“脱靶测定”(如上文所述)的结果。由于通过流式细胞术在iLite细胞系上观察到痕量CD信号(未显示)，对于使用抗CD38-IFN融合蛋白构建体的所有iLite试验，通过添加过量的裸(例如，无与其融合的IFN或IFN变体)抗-CD38抗体封闭CD抗原；在每种情况下，封闭裸CD38抗体使用的浓度是0.5mg/ml。同样在每种情况下，使用作为IFN或IFN-变体融合蛋白构建体测定的相同抗体克隆封闭与CD38的任何相互作用。
图15显示了游离野生型IFNα2b(IFNα)(SEQ ID NO：3)相比于融合至CD38抗体G005(De Weers等人，(美国专利7829673))的C-末端的野生型IFNα2b的脱靶活性。后一种融合蛋白构建体(G005-HC-L0-IFNα IgG4)是IgG4：κ同种型，并且在重链的C-末端和IFNα的第一残基之间没有插入接头，并且通过SEQ ID NOS：150(重链)和134(轻链)描述。如图15中所示，抗CD38抗体-未弱化的IFNα2b融合蛋白构建体在脱靶测定(例如，在缺少CD-靶向的情况下)中的效力比游离IFNα2β低27倍(19.5/0.726＝27)。图16显示在“中靶(ARP1)测定”中相同的两个构建体之间的比较，其中，允许抗-CD38抗体结合CD38，其以高水平表达在ARP-1细胞系上。G005-HC-L0-IFNα IgG4融合蛋白构建体比游离IFNα2b的效力高3.6倍(14.7/4.08＝3.6)，大概是由于IFN向CD38+骨髓瘤细胞的靶向递送。因此，G005-HC-L0-IFNα IgG4融合蛋白构建体具有97的抗原特异性指数(ASI)(27x 3.6＝97；表25)。
表25
为了测定ASI是否能够如对抗CD20-IFNα融合蛋白构建体所观察的那样增加，由通过突变弱化抗CD38-IFNα融合蛋白构建体的IFN部分而构建几种变体。在G005或其他CD38单克隆抗体的背景下进行多种不同的弱化突变。此外，制备不同IgG同种型(IgG1和IgG4)和接头长度(L0，无接头；L6，6个氨基酸的接头(SGGGGS，SEQ ID NO：132))的构建体。运行如上文详述的脱靶测定和两种类型的中靶测定(使用Daudi和ARP-1)，并且结果显示在图17-38中且列表在表25-33中。下文的讨论参考这些表格中的数据(其均源自图17-38)总结了这些结果。
表26表征了CD38抗体G005，其以不同构型经重链C-末端融合至具有R144A弱化突变的IFNα。这个表格中的实例是IgG1和IgG4同种型，并且在抗体重链和IFN之间没有接头(L0)，或者具有插入的6个氨基酸的接头L6(由分别与SEQ ID NO：134(轻链)组合的SEQ IDNOS：138、140、152、146(重链)构成)。在所有情况下，融合蛋白构建体对抗原阴性iLite细胞的效力都显著降低(与游离IFNα相比降低8,300至100,000倍)，但对CD38阳性细胞(Daudi)基本维持由游离IFNα展示的效力。例如，G005-HC-L0-IFNα(R144A)IgG4构建体(由SEQ IDNOS：152(重链)和134(轻链)构成)对抗原阴性细胞具有比游离的野生型IFNα低105-倍的效力，但其对抗原阳性细胞的效力相对于游离野生型IFNα仅降低3.5倍(2.7/0.77＝3.5)(表26)。这给出了这种融合蛋白构建体的29,000的抗原特异性指数(ASI)。
表26
表27显示了使用另一种IFNα弱化突变A145G作为与以IgG1或IgG4同种型的相同G005抗体的构建体的实例，其没有接头或带有L6接头(由分别与SEQ ID 134(轻链)组合的SEQ ID NOS：142、144、148(重链)构成)。例如，G005-HC-L6-IFNα(A145G)IgG4构建体(由SEQID NOS：148(重链)和134(轻链)构成)显示ASI为20000。
表27
表28显示了其中突变IFNα连接至轻链而不是重链的实施例，其没有插入接头或带有L6接头(由各自与SEQ ID NO：135(重链)分别组合的SEQ ID NOS：210或208(轻链)构成)。在这两种情况下，融合蛋白构建体分别显示了5900和7200的高ASI。
表28
表29和30证实了相同的融合蛋白构建体的ASI，但使用可选细胞系(ARP-1，骨髓瘤)测定对CD38+细胞的活性。使用这种方法，这些融合蛋白构建体的ASI在1,200-55,000的范围。
表29
表30
表25中列出了在G005-HC-L0-IFNα IgG4融合蛋白构建体背景下的突变形式的IFNα的多种其他实例。这些突变体的大部分(R144突变为A、S、E、G、H、N、Q、T、Y、I、L或V(分别由各自与SEQ ID NO：134(轻链)组合的SEQ ID NOS：152、172、156、158、160、168、170、174、178、162、166、176(重链)构成)和A145突变为G、D、H、I、K、L、N、Q、R或Y(各自分别与SEQ IDNO：134(轻链)组合的SEQ ID NOS：184、180、186、188、190、192、194、196、198、206(重链))，显示与游离的野生型IFNα相比显著弱化的IFNα活性。在这个背景下中，A145V和A145S突变体没有显示可评估的弱化。这些点突变、弱化形式的IFNα的任一种可用于本发明的背景下作为抗体融合蛋白构建体。某些IFN变体可由于显示更高的ASI，而是优选的。其他考虑，例如表达水平、免疫原性、生物物理特征等，也可在评估构建体的最佳适用性时考虑。在本文中描述的多种IFNα变体中，本文所示的在抗体-融合蛋白构建体的背景下产生高ASI的那些包括：R144A、R144S、R144T、R144Y、R144I、R144L、R145G、R145D、R145H、R145Y(表25)、R33A+YNS(如包含SEQ ID NOS：286(重链)和276(轻链)的构建体中所示)、R33A(如包含SEQ IDNOS：436(重链)和276(轻链)的构建体中所示)和R144A+YNS(例如，如包含SEQ ID NOS：288(重链)和276(轻链)的构建体中所示)。
与SEQ ID NO：182(重链)和134(轻链)的构建体中的A145E突变相比，在SEQ IDNOS：180(重链)和134(轻链)的构建体中的A145D突变产生了预想不到的结果。尽管两种构建体具有类似的氨基酸序列，差别仅在于单个亚甲基基团，但它们显示对IFNα的非靶向活性显著不同的作用。A145E突变对IFNα活性具有最低的影响，然而，A145D突变显著降低了活性(20,000倍)，并且产生具有高ASI的构建体(9,840)。
表31-33中显示了抗-CD38抗体-弱化IFNα融合蛋白构建体的其他实例。除了G005抗体构建体之外，这些表格还显示了中靶活性，脱靶活性，和基于某些新型抗体的抗CD38抗体-弱化IFNα融合蛋白构建体的ASI。这些抗体与IFNα A145D或R144A突变的融合蛋白构建体包括以下：
由SEQ ID NOS：248(重链)和SEQ ID NO：242(轻链)构成的X910/12-HC-L0 IFNα(A145D)IgG4；
由SEQ ID NOS：246(重链)和SEQ ID NO：242(轻链)构成的X910/12-HC-L0 IFNα(R144A)IgG4；
由SEQ ID NOS：256(重链)和SEQ ID NO：250(轻链)构成的X913/15-HC-L0 IFNα(A145D)IgG4；
由SEQ ID NOS：254(重链)和SEQ ID NO：250(轻链)构成的X913/15-HC-L0 IFNα(R144A)IgG4；
由SEQ ID NOS：232(重链)和SEQ ID NO：226(轻链)构成的X355/02-HC-L0 IFNα(A145D)IgG4；
由SEQ ID NOS：230和SEQ ID NO：226(轻链)构成的X355/02-HC-L0 IFNα(R144A)IgG4；
由SEQ ID NOS：240(重链)和SEQ ID NO：234(轻链)构成的X355/07-HC-L0 IFNα(A145D)IgG4；
由SEQ ID NOS：238和SEQ ID NO：234(轻链)构成的X355/07-HC-L0 IFNα(R144A)IgG4；
由SEQ ID NOS：262(重链)和258(轻链)构成的R5D1-HC-L0 IFNα(A145D)IgG4；
由SEQ ID NOS：268(重链)和264(轻链)构成的R5E8-HC-L0 IFNα(A145D)IgG4；和
由SEQ ID NOS：274(重链)和270(轻链)构成的R10A2-HC-L0 IFNα(A145D)IgG4。
这些融合蛋白构建体都显示高ASI，在3,820(X910/12-HC-L0-IFNα(R144A)IgG4)至166,000(X355/02-HC-L0-IFNα(A145D)IgG4)的范围。
表31
表32
表33
上述实施例证实了，连接至靶向CD20(SEQ ID NO：430)或CD38(SEQ ID NO：131)的抗体的突变弱化形式的IFNα显示对抗原阳性靶细胞的IFN信号传递效力比对抗原阴性脱靶细胞高若干数量级。下文的结果提供了使用使弱化的IFNα靶向两个其他抗原：CD138和1型MHC的抗体的进一步的实施例。
CD138(SEQ ID NO：432)，也称作粘结蛋白聚糖-1，是认为作为粘附分子发挥作用的硫酸肝素蛋白聚糖。它表达在大多数多发性骨髓瘤细胞上(Dhodapkar，Blood；91：2679，1998)。产生由突变弱化的IFNα和CD138靶向抗体nBT062(Ikeda，Clin Can Res.，15：4028，2009；USPTO#20090175863，由SEQ ID NOS：330(重链)和326(轻链)构成)组成的融合蛋白构建体。如图39中所示，这种融合蛋白构建体，与抗-CD38-弱化的IFNα融合蛋白类似，显示对多发性骨髓瘤细胞(ARP-1，中靶测定)比对非靶向的同种型融合蛋白(基于抗体2D12)高得多的抗增殖效力。图39显示28pM浓度(所测试的第四高浓度)的nBT062-HC-L0-IFNα(A145D)显示对ARP-1骨髓瘤细胞系的抗增殖活性高于6nM(所测试的最高浓度)的同种型-HC-L0-IFNα(A145D)蛋白的活性。
已描述为用于治疗癌症的抗体治疗的潜在靶标的另一抗原是I型MHC(参见例如Stein，Leuk.Lymphhoma 52(2)：273-84，2011)。为了确定本发明是否可适用于这种靶标，从ATCC(HB95)获得抗体W6/32(Barnstable等人，(1978)，Cell 14：9-20)。这种抗体与人HLAA、B、C分子上的单型决定簇反应。克隆抗体可变区，并使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech，Mountain View，CA)和小鼠Ig-引物组(Novagen/EMD Chemicals，San Diego，CA)测序。重链和轻链可变区的氨基酸序列分别显示为SEQ ID NOS：411和410。表达嵌合形式的HB95，具有融合至带有A145D突变的IFNα的鼠可变区和人IgG4κ恒定区(HB95-HC-L0-IFNα(A145D)IgG4，由SEQ ID NOS：316(重链)和312(轻链)构成)，并且将其活性与以相同方式融合至相同IFNα突变体的同种型对照抗体(同种型-HC-L0-IFNα(A145D)IgG4，其中同种型可变区源自抗体2D12)比较。如上文对CD38-靶向抗体所述进行“中靶(ARP-1)”测定(ARP-1是I型MHC阳性的)。结果显示在图40a中。I型MHC-靶向的弱化IFNα比同种型对照-弱化的IFNα融合蛋白构建体对相同细胞的效力高若干数量级，在野生型IFNα的约9倍(139/16＝8.7)之内。尽管HB95-HC-L0-IFNα(A145D)IgG4显示低于100pM的显著活性，但同种型-HC-L0-IFNα(A145D)IgG4即使在6nM也没有显示显著的活性。
图40b证实了抗体片段可取代全长抗体并且提供类似的性质，即高ASI。此图显示各种Fab-弱化的IFNα融合蛋白构建体对ARP-1细胞增殖的影响。两个非-ARP-1靶向的构建体，“帕利珠单抗-HC-L6-IFNα(A145D)Fab”(由SEQ ID NOS：298(重链)和290(轻链)构成)和“2D12-HC-L6-IFNα(A145D)Fab”(由SEQ ID NOS：356(重链)和344(轻链)构成)，显示对这种细胞系的效力非常低(EC50从2,410-17,000)。相反，当融合蛋白构建体的Fab部分确实靶向细胞表面抗原(在此情况下为I型MHC)时，如对于融合蛋白构建体“HB95-HC-L6-IFNα(A145D)Fab”(由SEQ ID NOS：320(重链)和312(轻链)构成)，效力甚至比游离野生型IFNα更高。抗原靶向的弱化构建体比非靶向的弱化构建体的效力高2,760-19,450倍。
靶向的弱化IFNα的抗病毒活性
IFNα的抗病毒活性是熟知的，并且重组IFNα是FDA批准的用于丙型肝炎感染的治疗。比较了宿主细胞表面靶向的相比于非靶向的抗体-弱化的IFNα融合蛋白构建体对I型MHC阳性的A549细胞上的EMC病毒的细胞病变活性的影响。
方法：
如Rubinstein(J.Virol.37，755-8，1981)所述，使用细胞病变作用抑制(CPE)测定测量IFN活性。简要而言，将每孔104个人腺癌A549细胞(ATCC，Manassas，Kansas)与测试样品或IFN(人IFN-α2A)孵育过夜。随后，使用EMC病毒攻击细胞48-56小时，随后使用结晶紫染色。进行病毒CPE测定，随后溶解结晶紫并测量570nm的吸光度。使用带有可变斜率的4-参数S形拟合(GraphPad Prism)进行非线性回归分析。IFNα活性的一个单位定义为使细胞病变作用减低50％所需的干扰素的量。根据由National Institutes of Health提供的用于人IFNα2的国际参考标准测定所述单位(参见Pestka，S.″Interferon Standards and GeneralAbbreviations，″，在Methods in Enzymology中(S.Pestka，ed.)，Academic Press，NewYork vol 119，pp.14-23，1986)。在这个测定中测试的样品是IFNα(Intron A，倒三角)，抗-I型MHC靶向的弱化IFNα(名为HB95-HC-L0-IFNα(R145D)IgG4，实心方块)，和同种型对照(2D12)-弱化的IFNα(同种型-HC-L0-IFNα(R145D)IgG4；三角)。数据绘制为相对于IFNα摩尔当量的生存力。
结果：
结果显示在图41中。在这个测定中，IFNα如所预期地保护A549细胞免于病毒诱导的细胞病变细胞死亡(CPE)，显示出0.18pM的EC50。将R145D突变引入到IFNα(并将其连接到不结合A549细胞的抗体)使其抗病毒效力降低108,000倍(19,461/0.18＝108,167)。相反，通过将相同的突变体IFN连接至A549靶向抗体(HB95)，效力提高～17,000倍(19,461/1.15＝16,923)。这对应于16,900的ASI(19,461/1.15＝16,922)。
靶向的弱化IFNβ
多种出版物(见上文)中也已显示IFNβ对各种类型的癌细胞具有抗增殖活性。因此，制备抗CD38抗体(G005)和IFNβ(SEQ ID NO：91)之间的融合蛋白构建体G005-HC-L0-IFNβIgG4(由SEQ ID NOS：212(重链)和134(轻链)构成)，和相同但携带已知会降低IFNβ效力的单点突变(R35A)的构建体(Runkel等人，J.Biol.Chem.273：8003-8(1998)，由SEQ ID NOS：214(重链)和134(轻链)构成)。在两种构建体中，IFNβ的位置17的未配对的半胱氨酸突变成丝氨酸，以改进表达产量并产生同质性。图42显示了这三种蛋白在其中没有抗体-辅助靶向时的条件下的活性(使用iLite试剂盒的“脱靶测定”)。在这个测定中，将IgG连接至IFNβ的N-末端使其效力弱化72倍(57.6/0.799＝72).。通过在这个融合蛋白构建体中产生R35A突变，其效力进一步降低280倍(16,100/57.6＝280)，从而使它比游离的野生型IFNβ的效力低20150倍(16,100/0.799＝20,150)。完全相反地，图43显示了在其中CD38抗体可将IFNβ靶向细胞的条件下，这三种蛋白的效力相当近似。在这个测定中，抗体弱化的IFNβ融合蛋白构建体(G005-HC-L0-IFNβ(R35A)IgG4)的效力仅比抗体-非弱化的IFNβ融合蛋白构建体低1.4倍(46.9/32.7＝1.4)，且其效力仅比游离野生型IFNβ低4.5倍(46.9/10.5＝4.5)。此数据总结在表34中。这证实了意外的发现，即，如对IFNα所观察到的(表20)，作为抗体-IFN融合蛋白构建体的一部分的干扰素中的弱化突变能够不相称地影响非靶向相比于靶向细胞，对于IFNβ也是如此。在抗CD38-IFNβ融合蛋白构建体的本实施例中，弱化突变在抗体能够将IFN指向靶细胞时的条件下使效力降低仅1.4倍，相比之下，对于其中融合蛋白构建体不能靶向细胞表面抗原的细胞则为280倍。结果是，本实施例中的抗体弱化的IFNβ融合蛋白构建体显示4,630的ASI(表34)。还发现IFNβ中的R147A突变，作为R35A突变的可选方案，产生具有显著高于游离IFNβ的ASI的抗体IFNβ融合蛋白构建体(数据未显示)。以下实施例将显示这种“选择性弱化”也可用在结构上与IFNα和β无关的配体，即IL-4和IL-6，而观察到。
表34
白细胞介素-4(IL-4)
IL-4是具有多种生理活性的螺旋束细胞因子，包括使T辅助细胞发育偏向Th2且远离Th1的能力。由于Th1细胞在某些自身免疫环境中发挥病理作用，能够在治疗上有利地使用IL-4影响T辅助细胞发育远离Th1，即产生“Th1转向”。为了避免与IL-4对其他细胞类型的活性相关的副作用，可有利地通过使其突变而将IL-4活性弱化，并且随后将其连接到可将其指向活化(优选新近活化的)辅助T细胞的抗体。为此目的选择的抗体是J110，其为Iwai等人(Immunol Lett.83：215-20，2002)描述的小鼠抗人PD-1克隆。PD-1(SEQ ID NO：431)表达在新近活化的Th0细胞上。
J110抗体(鼠可变区和人IgG1：κ恒定区；J110重链和轻链可变区的氨基酸序列分别显示为SEQ ID NOS：409和408)融合至人IL-4(SEQ ID NO：119)，后者用插入的6个氨基酸的接头L6(SGGGGS，SEQ ID NO：132)连接至重链的C-末端。在这个110-HC-L6-IL4IgG1蛋白(由SEQ ID NOS：304(重链)和300(轻链)构成)之外，还制备了在IL-4组件中具有单取代的它的变体J110-HC-L6-IL-4(R88Q)IgG1(由SEQ ID NOS：306(重链)和300(轻链)构成)。已报道IL-4中的R88Q突变降低其体外效力(Kruse，EMBO Journal vol.12no.13 pp.5121-5129，1993)。
方法：
很大程度上如HEK-Blue IL4/IL13细胞系的制造商所述进行“脱靶(HB-IL4)测定”。HEK-BlueTM IL-4/IL-13细胞专门设计为监测由IL-4诱导的STAT6途径的活化。所述细胞通过将人STAT6基因引入到HEK293细胞以获得完全活性的STAT6信号传递途径而产生。HEK-BlueTM IL-4/IL-13细胞在融合至4个STAT6结合位点的IFNβ最小启动子的控制下，稳定表达报告基因，分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)。HEK-BlueTM IL-4/IL-13细胞中STAT6途径的活化诱导SEAP报告基因的表达。随后，SEAP被分泌至培养基并且可使用显色试剂QUANTI-BlueTM定量。简要而言，将HEK-Blue IL4/IL13细胞(Invivogen，San Diego CA目录号hkb-stat6)解冻并培养在已经热灭活的DMEM培养基(Mediatech，Manassas VA，目录号10-013-CV)+10％FBS(Hyclone，Logan UT，目录号SH30070.03)(HI FBS)中。继代一次后，向培养基添加10μg/ml杀稻瘟素(Invivogen目录号ant-bl-1)和100微克/ml博来霉素(Invivogen目录号ant-zn-1)。再一次继代后，允许细胞达到60-80％汇合并且随后使用细胞剥离器(Mediatech，目录号25-056-Cl)提起。将细胞在DMEM+HI FBS清洗两次，并计数。将细胞调节至DMEM+HI FBS中2.8x 105活细胞/ml，并以每孔180μl的等分至平底96孔组织培养板(下文称作“试验平板”)。随后，每孔添加20μl稀释到DMEM+HI FBS中的IL-4或融合蛋白构建体。将平板在37℃5％CO2孵育16-24小时。根据制造商的指示制备QUANTI-Blue(Invivogen，目录号rep-qb1)。将QUANTI-Blue(160μl)等分到平底平板(下文称作“测定平板”)的每个孔中。随后，将40μl上清液/孔从试验平板转移到测定平板。随后，将测定平板在37℃孵育1-3小时。在来自Perkin-Elmer的1420-41型Victor 3V Multilabel Counter上读取630nm的测定平板吸光度。使用Graph Pad Prism分析数据。
设计“中靶(Th1转向)测定”以监测根据其IFN-γ的表达确定的，为Th1表型的CD4+T细胞的百分比。由此，通过IFN-γ-阳性CD4 T细胞的减少定量Th1转向。测定进行如下：如制造商的描述，使用1.0μg/107珠抗-人CD3ε抗体(R&D Systems，Minneapolis MN，目录号MAB100)、1.0μg/107珠抗-人CD28抗体(R&D Systems，目录号MAB342)和3μg/107珠人IgG(R&DSystems，目录号1-001-A)制备“装载的”Dynabeads(M450 Epoxy珠，Invitrogen Dynal，Oslo，Norway目录号140.11)。PBMCs得自于Stanford Blood Center；Palo Alto CA。根据制造商的指示，使用幼稚CD4+试剂盒(Miltenyi Biotech目录号130-094-131)，从白细胞减少系统(LRS)锥体细胞(cones)纯化幼稚CD4+T细胞。将总计4.0x 105个纯化的幼稚CD4+T-细胞等分至24孔组织培养板(下文称作“试验平板”)的每个孔中的1.3ml RPMI 1640(Mediatech，目录号10-040-CV)+10％HI FBS+100单位/ml IL-2(Peprotech，目录号200-02)，下文称作Media-Q中。随后，每孔添加4.0x 105个“装载的”Dynabeads。将IL-12(Peprotech，目录号200-12)稀释在Media-Q中，并将100μl添加至适当的孔中，得到10ng/ml的终浓度。将融合蛋白构建体或IL-4稀释在Media-Q中，并将100μl添加至适当的孔中。将Media-Q添加到适当的孔，以使每个孔的总体积至1.5ml。将试验平板在37℃和5％CO2孵育5天。在第5天早晨，向所有孔添加50ng/ml终浓度的佛波酯(Phorbol myristate acetate，PMA)，并还向所有孔添加终浓度1.0μg/ml的离子霉素。添加终浓度1.0μg/ml培养液的布雷菲德菌素A。将试验平板在37℃和5％CO2孵育最少4小时。随后，回收试验平板的每个孔的约1/3体积，并根据由上述试剂盒提供的说明书并使用试剂盒提供的试剂，进行制备细胞内流式细胞术。使用缀合于AF647的抗人干扰素-γ抗体(eBiosciences.com，目录号51-7319-42)，对细胞的细胞内干扰素-γ染色。通过在使用Cell Quest软件的Becton DickinsonFACSort上的流式细胞术分析样品。使用FloJo软件分析获得样品，并使用Graph Pad Prism软件将数据绘图。
结果：
在没有基于抗体的靶向的情况下，如通过“脱靶(HB-IL4)测定”测量，IL-4显示1.26pM的EC50(图44；表35)。IgG1与IL4的连接(例如构建体J110-HC-L6-IL4 IgG1，其中野生型人IL-4序列用插入接头L6连接到识别PD-1的嵌合J110抗体的C-末端)使效力降低5.46倍(6.88/1.26＝5.46)。通过向这个构建体的IL-4部分引入R88Q点突变，效力进一步降低至比游离IL-4低35,600倍(44,800/1.26＝35,555)。第二抗体-IL-4(R88Q)融合蛋白构建体(同种型-HC-L6-IL4(R88Q)IgG1，由SEQ ID NOS：358(重链)和344(轻链)构成)显示类似的效力。此试验中使用的同种型抗体是2D12。
表35
“中靶(Th1转向)测定”结果显示在图45中。幼稚(Th0)CD4细胞的活化诱导PD-1表达，使得抗PD1-IL-4融合蛋白构建体可将IL-4靶向它们。在这个测定中，游离的野生型IL4显示11.4pM的EC50。显著地，在“脱靶(HB-IL4)测定”中的效力比游离野生型IL-4低35,600倍的抗PD1-弱化的IL-4融合蛋白构建体(J110-HC-L6-IL4(R88Q)IgG1)，在这个中靶测定中的效力几乎与IL4相同(效力的1/4；11.4/46.1＝0.25)。未弱化的PD-1靶向的融合蛋白构建体(J110-HC-L6-IL4 IgG1)的效力仅比弱化形式略高(效力高1.45倍；46.1/31.8＝1.45)。非靶向的弱化IL-4融合蛋白构建体(同种型-HC-L6-IL4 R88Q)IgG1的效力显著低于靶向的弱化融合蛋白构建体，但其效力太低，以至于在这个试验中不能准确测定EC50。
白细胞介素-6(IL-6)
IL-6(SEQ ID NO：123)具有对不同细胞类型的许多活性，并且它可有利于以其他活性为代价开发这些活性的一些。例如，通过靶向新活化的CD4+T细胞(通过连接至抗-PD1抗体，例如，如上文用IL-4靶向的实施例)，可将T辅助细胞群从Treg途径转移并有利于Th17途径。这可会对癌症患者有利。
方法：
“IL-6生物测定”使用HEK-BlueTM IL-6细胞(Invivogen，目录号hkb-il6)进行，其是监测IL-6对JAK-STAT途径活化的工程化报告细胞系。这些细胞通过将人IL-6R基因引入到HEK293细胞而产生。此外，进一步使用在融合至四个STAT3结合位点的IFNβ最小启动子的控制下表达SEAP的报告基因转染细胞。在这些细胞中，IL-6刺激STAT3的活化并导致SEAP的分泌。随后，在使用SEAP检测培养基QUANTI-BlueTM时，监测SEAP。测定基本根据制造商(Invivogen)的说明书运行。简要而言，将HEK-Blue IL6细胞解冻并培养在已经热灭活的DMEM(Mediatech，Manassas VA，目录号10-013-CV)+10％FBS(Hyclone，Logan UT，目录号SH30070.03)(HI FBS)中。继代一次后，向培养基添加200μg/ml HygroGold，(Invivogen目录号ant-hg-1)和100μg/ml博来霉素(Invivogen目录号ant-zn-1)。再一次继代后，允许细胞达到60-80％汇合并且随后使用细胞剥离器(Mediatech，目录号25-056-Cl)提起。随后，将细胞在DMEM+HI FBS清洗两次，并计数。将细胞调节至DMEM+HI FBS中2.8x 105活细胞/ml，并以每孔180μl的等分至平底96孔组织培养板(下文称作“试验平板”)中。随后，每孔添加20μl稀释到DMEM+HI FBS中的IL-6或融合蛋白构建体。将平板在37℃和5％CO2孵育16-24小时。将根据制造商的说明书制备QUANTI-Blue(Invivogen，目录号rep-qb1)，随后等分(160μl/孔)到平底平板(下文称作“测定平板”)的每个孔中。随后，将40μl上清液/孔从试验平板转移到测定平板。将测定平板在37℃孵育1-3小时。在来自Perkin-Elmer的1420-41型Victor 3V Multilabel Counter上读取630nm的测定平板吸光度。使用Graph Pad Prism分析数据。
为了测试IL-6是否能够被弱化和靶向，从而可实现高抗原特异性指数(ASI)，将携带16聚体接头(L16，SGGGGSGGGGSGGGGS，SEQ ID NO：133)的IL-6在N-末端融合至靶向I型MHC的抗体，使用HB95抗体(其结合至人I型MHC抗原，如上文描述)相比于同种型对照抗体2D12(也如上文所述)。在上文所述的“IL-6生物测定”中，比较非靶向的同种型对照融合蛋白构建体2D12-HC-L16-IL6 IgG1(由SEQ ID NOS：360(重链)和344(轻链)构成)与游离IL-6(图46)。抗体融合体显示比游离IL-6低约10倍的效力(10.9/1.04＝10.5)。通过向这个融合蛋白构建体引入R179E突变(已知降低IL-6的效力；Kalai，Blood 89(4)：1319-33，1997))，所得构建体(2D12-HC-L16-IL6(R179E)IgG1，由SEQ ID NOS：362(重链)和344(轻链)构成)进一步弱化，显示比游离的野生型IL-6低79,400倍的效力(82,600/1.04＝79,400)。相反，在将弱化的IL-6连接至结合HEK-BlueTM IL-6细胞上的抗原(I型MHC)的抗体(HB95)时(HB95-HC-L16-IL-6(R179E)IgG1，由SEQ ID NOS：324(重链)和312(轻链)构成)，效力相比于非靶向的抗体弱化的IL-6融合蛋白构建体提高953倍(82,600/86.7＝953)。这个效力仅比靶向的野生型IL-6融合蛋白构建体(HB95-HC-L16-IL6 IgG1，由SEQ ID NOS：322(重链)和312(轻链)构成)的低6.99倍(86.7/12.4＝6.99)。换而言之，在不存在抗体-抗原靶向的情况下且在抗体IL-6融合蛋白构建体的背景下，R179E突变使IL-6效力降低7580倍(82,600/10.9＝7,580)，相比之下，在存在靶向的情况下仅6.99倍。
抗体-靶向的弱化IFNα的体内研究
为了确认本发明的抗体-弱化的配体融合蛋白构建体在体内有活性，使用由针对表达在多发性骨髓瘤细胞表面上的CD38的抗体和弱化形式的IFNα2b组成的构建体进行几个试验。在大多数研究中，将其与非靶向的对照融合蛋白构建体(下文称作“同种型对照”)比较。同种型对照抗体的可变区源自抗体2D12，其针对黄热病病毒而产生(Shlesinger，Virology125：8-17，1983)。
在第一个试验中，使用在无免疫应答(SCID)小鼠的皮下生长的多发生骨髓瘤细胞系NCI-H929(ATCC CRL-9068，Gazdar，Blood 67：1542-1549，1986)的异种移植模型。
方法：
在8-12周龄CB.17 SCID小鼠侧腹部皮下注射50％基质胶中的1x107个NCI-H929肿瘤细胞。当平均肿瘤大小达到120-150mm3时，将小鼠分入各10只小鼠的5个组，并在0时间(T0)开始治疗。所有治疗通过腹膜内注射(i.p.)给予，每周2次，进行5周(由图下的棒指示)。除干扰素-α之外，所有化合物以200μg/剂量(约10mg/kg)给药。IFNα2b(Intron ScheringCorp.，Merck，Whitehouse Station，NJ)以2百万单位/剂量给予。通过卡尺测量，每周两次测量肿瘤体积。终点为2,000mm3的肿瘤体积。
结果：
结果显示在图47中。与媒介物相比(实心圆)，使用干扰素-α(实心菱形)治疗这种多发性骨髓瘤皮下(s.c.)实体瘤稍稍延迟了这些小鼠中的肿瘤生长(P＜0.05)。使用裸抗-CD38抗体(G005 IgG1，由SEQ ID NOS：135(重链)和134(轻链)构成)的治疗(实心方形)与媒介物相比对肿瘤生长没有显著影响。在第30天，这两组中的所有小鼠都达到终点(2,000mm3)。非靶向的同种型对照-弱化的IFNα融合蛋白构建体(同种型-HC-L6-IFNα(A145G)IgG1，由SEQID NOS：348(重链)和344(轻链)构成)(空心倒三角)没有显示延迟肿瘤生长的显著活性，大概由于抗体-IFNα融合蛋白构建体的长半衰期和导致的全身暴露延长。相反，CD38-靶向的弱化IFNα融合蛋白构建体(G005-HC-L6-IFNα(A145G)IgG1，由SEQ ID NOS：144(重链)和134(轻链)构成)显示与非靶向的融合蛋白构建体(P＜0.0001.)或其他测试物质相比显著的抗肿瘤活性。在第22天，靶向的抗CD38-弱化的IFNα融合蛋白构建体使所有(10/10)小鼠中的肿瘤完全消退至检测不到的水平，并且在整个研究持续时间中没有复发。
在基于细胞系MM1S的全身性多发性骨髓瘤模型(Crown Bioscience Inc.，SantaClara；Greenstein，Exp Hematol.Apr；31(4)：271-82,2003)中测试抗-CD38-弱化的IFNα融合蛋白构建体(G005-HC-L6-IFNα(A145G)IgG1)。
方法：
在由200rad(60Co)照射后24小时，向6-8周龄的NOD-SCID小鼠静脉内注射0.1ml磷酸缓冲盐水(PBS)中的1x107MM1S肿瘤细胞。在0时间，将小鼠分入每组10只小鼠的4个组，并在7天后开始治疗。所有处理经腹膜内给予，每周2次，进行9周。除干扰素-α之外(以2百万单位/剂量给予)，所有化合物以200μg/剂量(约10mg/kg)给药。每周两次监测体重和整体健康，并且存活为终点。
结果：
结果显示在图48中。与媒介物相比，单独使用干扰素-α(Intron A)治疗这种全身性多发性骨髓瘤肿瘤使中值存活时间(MST)增加18天(MST分别为74相比于56)。使用裸抗-CD38抗体(G005)的治疗仅稍稍延长了存活(MST 62天)。在靶向的抗-CD38-弱化的IFNα(G005-HC-L6-IFNα(A145G)IgG1)治疗的组中的小鼠在整个研究期间都没有显示疾病的体征。所有(10/10)小鼠在结束是看起来都是健康的。
基于伯基特氏淋巴瘤细胞系Daudi(ATCC CCL-213，Klein，Cancer Res.28：1300-1310，1968)，进行使用第三个癌症模型的体内研究。Daudi细胞是CD38+的。
方法：
在用200rad(60Co)照射后1天，在6-8周龄NOD-SCID小鼠侧腹部皮下注射50％基质胶中的1x107个Daudi伯基特氏淋巴瘤细胞。当平均肿瘤大小达到169mm3时(第20日)，将小鼠分入各10只小鼠的5个组，并开始治疗。所有处理经腹膜内给予，每周2次，进行4周。除干扰素-α之外(以2百万单位(MIU)/剂量给予)，所有化合物以200μg/剂量(约10mg/kg)给药。通过卡尺测量，每周两次测量肿瘤体积。终点为2,000mm3的肿瘤体积。
结果：
结果显示在图49中。与媒介物相比(实心圆)，使用裸抗CD38抗体(实心方形)治疗这种伯基特氏淋巴瘤皮下(s.c.)肿瘤没有显著延迟在这些小鼠中的肿瘤生长。IFNα治疗确实产生与媒介物相比肿瘤生长的显著延迟(5.5天)，然而这一组在第40天达到2,000mm3的终点。非靶向的同种型对照融合蛋白构建体(同种型-HC-L6-IFNα(A145G)IgG1；空心倒三角)显示延迟肿瘤生长的显著活性，但这一组在第57天达到2,000mm3的终点。如在H929模型中所观察到的(上文)，这种非靶向的活性很可能是由于干扰素的半衰期延长，从而增加肿瘤对细胞因子的暴露。靶向的抗CD38-弱化的干扰素融合蛋白构建体(实心三角)使肿瘤显著消退，以至于在第30天没有小鼠具有明显的肿瘤。然而，这个组中的一些小鼠，确实显示在治疗中断后的肿瘤重新生长。此数据的进一步分析显示在表36中。
表36
a.平均值+/-SEM
b.在第37天，治疗组的肿瘤体积除以媒介物组的肿瘤体积的比例
c.在第37天与媒介物对照相比。
这个异种移植试验显示CD38-靶向的弱化IFNα融合蛋白构建体除了多发性骨髓瘤之外，在治疗淋巴瘤中也是有效的。
将不同剂量的抗CD38-弱化的IFNα融合蛋白构建体对骨髓瘤肿瘤生长的作用与非CD38-靶向的融合蛋白构建体比较。为了这些比较，使用NCI-H929皮下多发生骨髓瘤模型。
方法：
在8-12周龄CB.17 SCID小鼠侧腹部皮下注射50％基质胶中的1x107个NCI-H929肿瘤细胞。当平均肿瘤大小达到120-150mm3时，将小鼠分入各10只小鼠的9个组，并开始治疗(时间0)。所有治疗经腹膜内给予，每周2次，进行5周。在这个研究中，比较不同浓度(参见剂量的图例)的两种化合物：靶向的抗-CD38-弱化的干扰素(实心灰色符号)和非靶向的同种型对照干扰素(空心符号)。通过卡尺测量，每周两次测量肿瘤体积。终点为2,000mm3的肿瘤体积。
结果：
结果显示在图50中。抗-CD38-靶向的弱化IFNα融合蛋白构建体(G005-HC-L6-IFNα(A145G)IgG1)的剂量滴定证实在测试的所有化合物剂量下，甚至在0.01mg/kg的显著效力。仅在最高(10mg/kg)剂量下，在10/10小鼠中观察到完全肿瘤消除。相反，同种型对照-弱化的IFN化合物(同种型-HC-L6-IFNα(A145G)IgG1)仅在最高剂量(10mg/kg)显示显著的活性。0.01mg/kg剂量的CD38靶向的弱化IFN显示与剂量高1000倍(10mg/kg)的同种型对照弱化的IFN融合蛋白构建体类似的抗肿瘤活性，强调了CD38-靶向的重要性。
下一个实施例显示了本发明的抗体还包括IgG4同种型的那些。
方法：
在8-12周龄CB.17 SCID小鼠侧腹部皮下注射50％基质胶中的1x107个NCI-H929肿瘤细胞。当平均肿瘤大小达到120-150mm3时，将小鼠分入各10只小鼠的5个组，并开始治疗(时间0)。所有治疗经腹膜内给予，每周2次，进行5周。所有化合物以70μg/剂量(约3.5mg/kg)给药。通过卡尺测量，每周两次测量肿瘤体积。终点为2,000mm3。
结果：
结果显示在图51中。这个研究比较了两种不同同种型形式的靶向相比于非靶向的融合蛋白构建体的活性；比较了IgG1同种型(G005-HC-L6-IFNα(A145G)IgG1(靶向的，实心方形)和同种型-HC-L6-IFNα(A145G)IgG1(非靶向的，空心方形))和IgG4同种型(G005-HC-L6-IFNα(A145G)IgG4，由SEQ ID NOS：148(重链)和134(轻链)构成(靶向的，实心菱形)和同种型-HC-L6-IFNα(A145G)IgG4，由SEQ ID NOS：350(重链)和344(轻链)构成(非靶向的，空心菱形))。重要的是注意到，在这个研究中的小鼠以低于此前观察到100％肿瘤消除的研究中的剂量进行治疗。意外地，肿瘤体积表明，在这个模型中，IgG4形式比IgG1形式效力更高。由于人IgG1抗体具有比IgG4抗体更大的效应子功能(Hooper，Ann Clin Lab Sci.；8：201，1978；Ward，Ther Immunol，2：77，1995.)，将会预期IgG1形式，即便没有比IgG4形式更有效，也至少与IgG4形式一样有效。在研究结束时，CD38靶向的弱化IFN，IgG4治疗组(实心菱形)中的8/10小鼠没有肿瘤，而在IgG1形式对应组(实心方形)中仅有3/10没有肿瘤。
下一个实施例将抗体-靶向IFN的体内效力的观察延伸到第二种突变形式的IFNα，其中A145已经突变成天冬氨酸(D)。此外，下述试验利用了不同的CD38抗体，即基于人抗体克隆X355/02的可变区的抗体；(SEQ ID NOS：391(VH)和390(Vλ))。这个构建体和在上文体内试验中所示的构建体之间的第三种区别是除去了接头(称为“L0”)，即突变的IFNα直接融合到抗体重链的C-末端。
方法：
在8-12周龄CB.17 SCID小鼠侧腹部皮下注射50％基质胶中的1x107个NCI-H929肿瘤细胞。当平均肿瘤大小达到120-150mm3时，将小鼠分入各10只小鼠的3个组，并随后开始治疗(时间0)。所有治疗经腹膜内给予，每周2次，进行5周。所有化合物以60μg/剂(约3mg/kg)给药。通过卡尺测量，每周两次测量肿瘤体积。终点为2,000mm3的肿瘤体积。
结果：
结果显示在图52中。这种抗CD38-弱化的IFNα融合蛋白构建体(X355/02-HC-L0-IFNα(A145D)IgG4，由SEQ ID NOS：232(重链)和226(轻链)构成)在肿瘤消除中也非常有效，显示抗CD38-弱化的IFNα融合蛋白构建体在体内模型中有效治疗的人骨髓瘤的能力不受限于单一的可变结构域、IFNα突变或抗体和IFN之间的接头。同种型对照融合蛋白构建体显示显著较低的抗骨髓瘤活性，与基于CD38的靶向性一致。
下一个实施例显示了在上述相同的异种移植模型中，抗CD38抗体弱化的IFNα融合蛋白构建体比用于治疗多发性骨髓瘤的标准药物更有效。
方法：
在8-12周龄CB.17 SCID小鼠侧腹部皮下注射50％基质胶中的1x107个NCI-H929肿瘤细胞。当平均肿瘤大小达到120-150mm3时，将小鼠分入各10只小鼠的组，并开始治疗(时间0)。治疗以图例中所述的剂量和方案施用。通过卡尺测量，每周两次测量肿瘤体积。终点为2,000mm3。
结果：
结果显示在图53中。在这个研究中，将抗-CD38靶向的融合蛋白构建体(G005-HC-L0-IFNα(A145D)IgG4，由SEQ ID NOS：180(重链)和134(轻链)构成)的活性与标准治疗硼替佐米(Velcade)、美法仑(Alkeran)和地塞米松比较。在抗-CD38靶向的弱化干扰素组中，8/10只在第60天没有肿瘤(实心三角)，而在其他组中的所有小鼠在第50天达到终点。
下一个实施例显示抗CD38-弱化的IFN融合蛋白构建体能够完全消除在小鼠模型中建立的人多发性骨髓瘤肿瘤，即便在以单剂量给予融合蛋白构建体时。
方法：
在8-12周龄CB.17 SCID小鼠侧腹部皮下注射50％基质胶中的1x107个NCI-H929肿瘤细胞。当平均肿瘤大小达到120-150mm3时，将小鼠分入各10只小鼠的组，并随后开始治疗(T0)。使用抗CD38抗体-弱化的干扰素融合蛋白构建体的治疗根据以下方案施用：单剂量在第0天(实心三角)，两个剂量(在第0天和第3天；实心方形)，4个剂量(在第0、3、8和11天；实心菱形)和6个剂量(在第0、3、8、11、15和18天；实心黑色圆形)。一组在第0、3、8、11、15和18天接受6个剂量的同种型对照弱化的干扰素融合蛋白构建体(空心方形)。媒介物处理组以灰色实心圆形显示。通过卡尺测量，每周两次测量肿瘤体积。终点为2,000mm3。
结果：
结果显示在图54中。这个研究意外地显示单个剂量的G005-HC-L6-IFNα(A145G)IgG4融合蛋白构建体足以在第15天消除所有10/10只小鼠中的建立的肿瘤；此外，在第60天，在这个单剂量组的任何小鼠中肿瘤都没有重新生长。对使用靶向弱化干扰素的所有4个给药方案都是如此。同种型对照组仅在6个剂量的方案测试，并且显示显著较低的活性。单个剂量的化合物能够有效治愈建立的多发生骨髓瘤肿瘤的动物是无前例的且非常惊人的，因为抗肿瘤治疗通常给药多次以观察到功效。
下一个实施例证实了甚至非常大的肿瘤也可通过使用抗-CD38-弱化的IFN融合蛋白构建体的治疗消除。
方法：
来自紧接此前研究的一个组(n＝9)不进行治疗直到平均肿瘤体积达到730mm3。随后，该组在第12、15、19、22、26和29天接受6个剂量的抗-CD38靶向的弱化干扰素(箭头)。
结果：
结果显示在图55中。这个组中的8/9只小鼠在第30天显示完全的肿瘤消除，并且在研究结束时在这些小鼠的任一只中没有重新出现肿瘤。这些小鼠中的3只具有＞1000mm3的起始肿瘤。由于骨髓瘤死亡的唯一小鼠是在治疗开始时具有1,800mm3的肿瘤体积的一只；它在次日达到2,000mm3的终点。这个结果非常意外，并且没有报道其他化合物在任何动物模型中消除这种体积的骨髓瘤肿瘤。
在上述体外试验(表27)中显示，在抗体不将弱化的IFNα靶向所测试的细胞(脱靶测定)的条件下，G005-HC-L6-IFNα(A145G)IgG4融合蛋白构建体的效力比游离野生型IFNα2b低约25,000倍。以下试验的目的在于确定融合蛋白构建体在与IFNα毒性相关的IFN活性的先体外后体内(ex vivo)测定中是否也显示IFN活性的剧烈弱化。这种IFNα对造血作用的作用可通过测定IFNα对源自原代人骨髓单核细胞的多种集落形成单位的影响而先体外后体内测量。在其对集落形成的影响方面比较IFNα相比于抗体-弱化的IFNα融合蛋白构建体。
方法：
将来自3名供体的冷冻正常人骨髓单核细胞(AllCells，Inc.，Emeryville，CA)在RPMI-1640培养基和10％胎牛血清(FBS)(完全培养基)中解冻，并使用相同的培养基清洗2次。清洗后，将细胞以1.75x106个细胞/ml保持在这种培养基中。将细胞悬浮液用MethoCultH4434典型培养基(Stem Cell Technologies，目录号04434)稀释至0.7x105个细胞/ml的细胞终浓度。随后将细胞充分混合，并将3ml的这种混合物等分至每个管。
Intron A(Schering Corp.Merck，NJ)和融合蛋白构建体(G005-HC-L0-IFNα(145D)IgG4和同种型-HC-L0-IFNα(145D)IgG4)在完全培养基中稀释成10倍连续稀释物，并将150μl的每种稀释物添加到包含3ml在Methocult H4434培养基中的骨髓细胞的管中。以1.1ml/35mm组织培养皿(Stem Cell Technologies，cat#27115)平铺混合物。随后，将平板在37℃和5％CO2的充分加湿的培养箱中孵育2周。使用格栅记分皿(gridded scoringdish)(Stem Cell Technologies，Cat#27500)，在显微镜上计数集落，并记录集落/平板的数值。通过每个平板的集落数除以没有添加测试物的平板中的集落数，计算给定测试物的集落回收百分比。使用这种方法测试了所有3种人骨髓MNC。
结果：
结果显示在图56中。数据表明靶向(抗-CD38，G005)和非靶向(同种型；2D12)的弱化干扰素融合蛋白构建体都均有类似的活性，表明在正常骨髓细胞上观察到的CD38表达不可能表达在集落形成细胞上，因为使用靶向处理观察到非常小的集落形成抑制。两种融合蛋白构建体在抑制集落形成中都具有比野生型游离IFNα低约10,000x倍的活性，因此确认A145D突变使抗体-IFNα融合蛋白构建体的IFN活性弱化，并且表明这种弱化的IFN-抗体融合蛋白构建体可具有与IFNα本身相比更好的安全性概况。
可先体外后体内测量的IFNα的另一种活性是刺激细胞因子和趋化因子分泌。使用各种浓度的IFNα相比于抗体-弱化的IFNα融合蛋白构建体同种型-HC-L6-IFNα(A145G)IgG1(基于2D12抗体)刺激正常人PBMC，并测量所得的细胞因子产生。
方法：
使用Xvivo-15培养基(Lonza，目录号04-418Q)清洗来自4名正常供体的正常人外周血单核细胞(PBMC)，并以1x106个细胞/ml的细胞密度重新悬浮在相同的培养基中。随后，将细胞与4mg/ml的人IgG孵育，并在37℃孵育30分钟以封闭任何非特异性IgG结合。随后，不经清洗，将250μl等分试样的细胞添加到24孔组织培养处理平板的孔。随后，向这些孔添加250μl不同浓度的游离IFNα或IgG-弱化的IFNα融合蛋白构建体(同种型-HC-L6-IFNα(A145G)IgG1；同种型抗体是2D12)。随后，将平板在37℃，5％CO2中孵育过夜。次日，将平板离心沉降，并从每个孔收集200μl的上清液。将上清液保持冷冻，直到使用Luminex细胞因子测定的分析。
Luminex测定：使用来自Millipore的Premix 42-plex(Cat#MPXHCYTO60KPMX42)，我们能够测量通过由测试物刺激PBMC产生的人细胞因子的水平。根据制造商的说明书，将培养上清液与预混合的包被有抗-细胞因子抗体的聚苯乙烯微珠一起孵育。清洗后，将生物素化的检测抗体混合物加入到珠-捕获的分析物中。最后，将反应混合物与链霉抗生物素蛋白PE一起孵育，并在Luminex分析仪上测量PE的荧光强度。通过基于试剂盒中提供的对照构建的标准曲线内推出结果。
结果：
结果显示在图57中。四种细胞因子(IP-10、MCP-1、MCP-3和IL-1α)响应IFNα暴露而一致地上调。抗体-弱化的IFNα融合蛋白构建体(同种型-HC-L6-IFNα(A145G)IgG1)显示比野生型IFNα刺激降低1,000-5,000倍的效力。这确认了突变确实产生显著弱化的生物活性。图(a)显示了IP-10(估计弱化～1,000倍)和MCP-1(估计弱化约5,000倍)的剂量-应答曲线；图(b)显示了MCP-3(估计弱化～2,500倍)和IL1α(估计弱化约1,300倍)的剂量-应答曲线。
序列表
表37：单个多肽链序列
表38：与包含2条多肽链的蛋白相关的SEQ ID NOs
表39-可变结构域
表40-其他单多肽链序列

Claims (20)

1.编码多肽构建体的核酸构建体，所述多肽构建体包含连接至结合细胞表面相关抗原的抗体或其抗原结合部分的肽或多肽信号传递配体，其中所述配体包含降低其对缺少所述抗原表达的细胞的效力的至少一个氨基酸取代或缺失。
2.编码多肽构建体的核酸构建体，所述多肽构建体包含连接至结合细胞表面相关抗原的抗体或其抗原结合部分的肽或多肽信号传递配体，其中所述信号传递配体是与野生型相比包含选自R144A、R144S、R144T、R144Y、R144I、R144L、A145D、A145H、A145Y、A145K、R33A+YNS、R33A和R144A+YNS的突变的弱化的干扰素α(IFNα)。
3.权利要求1或2所述的构建体，其中所述肽或多肽信号传递配体经肽键连接至所述抗体或其抗原结合部分。
4.权利要求1-3中任一项所述的构建体，其中所述肽或多肽信号传递配体直接或经长度为1-20个氨基酸的接头连接至所述抗体或其抗原结合部分。
5.权利要求1-4中任一项所述的构建体，其中所述肽或多肽信号传递配体连接至所述抗体或其抗原结合部分的轻链或重链恒定区的C-末端。
6.权利要求1-5中任一项所述的构建体，其中所述细胞表面相关抗原包含具有小于240kD分子量的细胞外结构域。
7.权利要求1-6中任一项所述的构建体，其中所述细胞表面相关抗原以大于每个细胞12,600个拷贝或大于每个细胞15,000个拷贝的密度存在于所述细胞上。
8.权利要求1-7中任一项所述的构建体，其中所述抗体或其抗原结合部分以从50nM、从25nM、从10nM、或从5nM至1pM的亲和力结合所述细胞表面相关抗原。
9.权利要求1-8中任一项所述的构建体，其中所述细胞表面相关抗原选自CD38、HM1.24、CD56、CS1、CD20、CD74、IL-6R、Blys(BAFF)、BCMA、HLA-SR、激肽原、β2微球蛋白、FGFR3、ICAM-1、蛋白裂解酶、CD52、EGFR、GM2、α4-整联蛋白、IFG-1R、KIR、CD3、CD4、CD8、CD24、CD44、CD69、CD70、CD71、CD83、CD86、CD96、HLA-DR、PD-1、ICOS、CD33、CD115、CD11c、CD14、CD52、CD14、FSP1、FAP、PDGFRα、PDGFRβ、ASGR1、ASGR2、Ep-Cam、FSP1、RTI140/Ti-α、HTI56、VEGF受体、RCHE基因的产物CD241、CD117(c-kit)、CD71(转铁蛋白受体)、CD36(血小板反应蛋白受体)、CD34、CD45RO、CD45RA、CD115、CD168、CD235、CD236、CD237、CD238、CD239和CD240。
10.权利要求1-9中任一项所述的构建体，其中所述抗体或其抗原结合部分是Fab片段。
11.权利要求1-10中任一项所述的构建体，其中所述构建体具有大于50的抗原-特异性指数。
12.权利要求11所述的构建体，其中所述构建体具有大于100的抗原-特异性指数。
13.权利要求12所述的构建体，其中所述构建体具有大于1000的抗原-特异性指数。
14.质粒，其包含权利要求1-13中任一项所述的构建体。
15.宿主细胞，其包含权利要求1-14中任一项所述的构建体或质粒。
16.生产多肽构建体的方法，所述多肽构建体包含连接至结合细胞表面相关抗原的抗体或其抗原结合部分的肽或多肽信号传递配体，其中所述信号传递配体是与野生型相比包含选自R144A、R144S、R144T、R144Y、R144I、R144L、A145D、A145H、A145Y、A145K、R33A+YNS、R33A和R144A+YNS的突变的弱化的干扰素α(IFNα)，所述方法包含在允许表达核酸构建体或质粒并回收表达的多肽构建体的条件下培养权利要求15所述的宿主细胞。
17.多肽构建体，其包含连接至结合Ep-CAM的抗体或其抗原结合部分的肽或多肽信号传递配体，其中所述信号传递配体是与野生型相比包含选自R144A、R144S、R144T、R144Y、R144I、R144L、A145D、A145H、A145Y、A145K、R33A+YNS、R33A和R144A+YNS的突变的弱化的干扰素α(IFNα)，
18.权利要求17所述的多肽构建体，其中所述肽或多肽信号传递配体经肽键连接至所述抗体或其抗原结合部分。
19.权利要求17或权利要求18所述的多肽构建体，其中所述肽或多肽信号传递配体直接或经长度为1-20个氨基酸的接头连接至所述抗体或其抗原结合部分。
20.权利要求17-19中任一项所述的多肽构建体，其中所述肽或多肽信号传递配体连接至所述抗体或其抗原结合部分的轻链或重链恒定区的C-末端。
CN201810868213.4A 2011-10-28 2012-10-29 多肽构建体及其用途 Active CN109022465B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2011904502A AU2011904502A0 (en) 2011-10-28 Polypeptide constructs and uses thereof
AU2011904502 2011-10-28
CN201280064672.8A CN104203982B (zh) 2011-10-28 2012-10-29 多肽构建体及其用途
PCT/AU2012/001323 WO2013059885A2 (en) 2011-10-28 2012-10-29 Polypeptide constructs and uses thereof

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280064672.8A Division CN104203982B (zh) 2011-10-28 2012-10-29 多肽构建体及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109022465A true CN109022465A (zh) 2018-12-18
CN109022465B CN109022465B (zh) 2022-04-29

Family

ID=48168677

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810868213.4A Active CN109022465B (zh) 2011-10-28 2012-10-29 多肽构建体及其用途
CN201280064672.8A Active CN104203982B (zh) 2011-10-28 2012-10-29 多肽构建体及其用途

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280064672.8A Active CN104203982B (zh) 2011-10-28 2012-10-29 多肽构建体及其用途

Country Status (15)

Country Link
US (3) US9611322B2 (zh)
EP (1) EP3559049A4 (zh)
JP (3) JP6184965B2 (zh)
KR (2) KR102037541B1 (zh)
CN (2) CN109022465B (zh)
AU (2) AU2012327877B2 (zh)
BR (1) BR112014009925B1 (zh)
CA (1) CA2851892C (zh)
EA (2) EA201700111A1 (zh)
IL (2) IL232247B (zh)
MX (1) MX360741B (zh)
NZ (1) NZ756727A (zh)
SG (2) SG10201603411WA (zh)
WO (1) WO2013059885A2 (zh)
ZA (1) ZA201402819B (zh)

Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL217296B1 (pl) * 2002-11-15 2014-07-31 Genmab As Wyizolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, wytwarzająca je hybrydoma, kodujący to przeciwciało wektor ekspresyjny i zawierająca je kompozycja farmaceutyczna, immunokoniugat, bispecyficzna lub multispecyficzna cząsteczka obejmująca kwasy nukleinowe kodujące ciężki i lekki łańcuch transfektoma, ich zastosowania, zwłaszcza w medycynie, obejmująca te kwasy ex vivo eukariotyczna lub prokariotyczna komórka gospodarza oraz nie będące człowiekiem zwierzę transgeniczne lub roślina, sposób in vitro hamowania wzrostu i/lub proliferacji komórek wyrażających CD25 lub eliminowania komórek wyrażających CD25, sposób wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25, zestaw diagnostyczny do wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25
EP1914242A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
CN102268089A (zh) 2011-07-05 2011-12-07 上海交通大学 Agr2阻断抗体及其用途
CA2851892C (en) 2011-10-28 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
US9492562B2 (en) * 2012-01-20 2016-11-15 Vib Vzw Targeted human-interferon fusion proteins
EP2822575B1 (en) 2012-03-03 2020-05-06 ImmunGene, Inc. Engineered antibody-interferon mutant fusion molecules
CA2898100C (en) 2013-01-14 2023-10-10 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
FI3677591T3 (fi) * 2013-04-29 2023-04-03 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd38-vasta-aineet ja fuusiot heikennetylle interferonille alfa-2b
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
ES2757501T3 (es) 2013-07-18 2020-04-29 Vib Vzw Fusocinas que implican citocinas con afinidades de unión al receptor fuertemente reducidas
BR112016001128A2 (pt) 2013-07-19 2018-01-23 Vib Vzw membros da família il-1 modificados direcionados
AU2014292355B2 (en) 2013-07-19 2019-08-01 Centre Hospitalier Regional Universitaire De Montpellier Targeting of cytokine antagonists
KR102268688B1 (ko) 2013-07-19 2021-06-24 브이아이비 브이지더블유 표적화된 변형된 tnf 패밀리 구성원
KR102480433B1 (ko) * 2014-02-07 2022-12-21 맥마스터 유니버시티 3기능성 t 세포-항원 커플러 및 이의 제조 방법 및 용도
US9603927B2 (en) 2014-02-28 2017-03-28 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
US9732154B2 (en) * 2014-02-28 2017-08-15 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
BR112016022385A2 (pt) 2014-03-28 2018-06-19 Xencor, Inc anticorpos específicos que se ligam a cd38 e cd3
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
MA39070A1 (fr) * 2014-07-31 2017-11-30 Sanofi Sa Anticorps anti-cd38 spécifiques pour le traitement de cancers humains
US10786578B2 (en) 2014-08-05 2020-09-29 Novartis Ag CKIT antibody drug conjugates
US10617757B2 (en) * 2014-08-08 2020-04-14 The Regents Of The University Of California Methods for treating multiple myeloma
MY192918A (en) 2014-09-09 2022-09-15 Janssen Biotech Inc Combination therapies with anti-cd38 antibodies
KR102639037B1 (ko) * 2014-10-29 2024-02-20 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 인터페론 α2b 변이체
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
EA037065B1 (ru) 2014-11-26 2021-02-01 Ксенкор, Инк. Гетеродимерные антитела, связывающие cd3 и cd38
TN2017000223A1 (en) 2014-11-26 2018-10-19 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens
US10793630B2 (en) 2014-12-04 2020-10-06 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute myeloid leukemia
JP6827426B2 (ja) 2015-05-20 2021-02-10 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 軽鎖アミロイドーシス及びその他のｃｄ３８陽性血液悪性疾患の治療のための抗ｃｄ３８抗体
JP2018516950A (ja) * 2015-06-12 2018-06-28 イミュンジーン, インコーポレイテッドImmunGene, Inc. がん治療のための集中インターフェロン免疫療法
MX2018000265A (es) 2015-06-22 2018-05-23 Janssen Biotech Inc Terapias de combinacion para enfermedades malignas hematologicas con anticuerpos anti-cd38 e inhibidores de survivina.
US20170044265A1 (en) 2015-06-24 2017-02-16 Janssen Biotech, Inc. Immune Modulation and Treatment of Solid Tumors with Antibodies that Specifically Bind CD38
RU2611685C2 (ru) * 2015-07-20 2017-02-28 Илья Владимирович Духовлинов Гуманизированное моноклональное антитело, специфичное к синдекану-1
CN105254717B (zh) * 2015-08-18 2018-08-24 中山大学 与cd34分子特异性结合的多肽及其应用
US10781261B2 (en) 2015-11-03 2020-09-22 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
ES2862425T3 (es) 2015-11-03 2021-10-07 Janssen Biotech Inc Formulaciones subcutáneas de anticuerpos anti-CD38 y sus usos
WO2017077382A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Orionis Biosciences Nv Bi-functional chimeric proteins and uses thereof
CA3007030A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and psma
EP3411397A1 (en) 2016-02-05 2018-12-12 Orionis Biosciences NV Cd8 binding agents
US11661455B2 (en) 2016-02-05 2023-05-30 Orionis Biosciences BV Chimeric protein comprising an interferon alpha 2mutant and a PD-L1 binding moiety
CA3016849A1 (en) 2016-03-07 2017-09-14 Vib Vzw Cd20 binding single domain antibodies
CN106065033A (zh) * 2016-03-17 2016-11-02 中国药科大学 一种细胞因子融合抗体的制备及其应用
EP3448995A1 (en) * 2016-04-25 2019-03-06 Universität Basel Allele editing and applications thereof
US11753463B2 (en) 2016-05-13 2023-09-12 Orionis Biosciences BV Therapeutic targeting of non-cellular structures
EP3454887B1 (en) 2016-05-13 2021-01-20 Orionis Biosciences BV Targeted mutant interferon-beta and uses thereof
CA3026151A1 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
EA037848B1 (ru) 2016-07-14 2021-05-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Биохимический Агент" Гибридный белок, полинуклеотид, генетическая конструкция, продуцент, препарат для регенерации хряща (варианты)
WO2018014068A1 (en) * 2016-07-19 2018-01-25 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Attenuated type i ifn cd47 combination therapy
EP3487522A4 (en) 2016-07-19 2020-04-01 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd ANTI-CD47 COMBINATION THERAPY
CN110114368A (zh) * 2016-10-24 2019-08-09 奥睿尼斯生物科学公司 靶向突变干扰素-γ及其用途
TW201829463A (zh) * 2016-11-18 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗hla-g抗體及其用途
CN106854248A (zh) * 2016-12-09 2017-06-16 中国药科大学 一种细胞因子突变体融合抗体的制备及其应用
IL267113B1 (en) * 2016-12-21 2024-05-01 Cephalon Llc Antibodies that bind specifically to human IL-15 and their uses
US11384154B2 (en) 2017-02-06 2022-07-12 Orionis Biosciences BV Targeted chimeric proteins and uses thereof
WO2018144999A1 (en) 2017-02-06 2018-08-09 Orionis Biosciences, Inc. Targeted engineered interferon and uses thereof
CA3050601A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Vib Vzm Immune-cell targeted bispecific chimeric proteins and uses thereof
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
EP3618870A4 (en) * 2017-05-01 2021-04-21 The Trustees of The University of Pennsylvania MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST ALPHA-SYNUCLEIN FIBRILLES
EP3630162A1 (en) * 2017-05-24 2020-04-08 Novartis AG Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use
CN111093689A (zh) * 2017-07-03 2020-05-01 转矩医疗股份有限公司 免疫刺激融合分子及其用途
WO2019023156A1 (en) * 2017-07-24 2019-01-31 Rutgers, The State University Of New Jersey PHOSPHATIDYLSERIN-TARGETING FUSION MOLECULES AND METHODS OF USE
PL3661954T3 (pl) 2017-08-03 2022-05-16 Amgen Inc. Muteiny interleukiny 21 i sposoby leczenia
JP7423511B2 (ja) 2017-08-09 2024-01-29 オリオンズ バイオサイエンス インコーポレイテッド Ｐｄ－１およびｐｄ－ｌ１結合物質
EP3665201A4 (en) 2017-08-09 2021-06-02 Orionis Biosciences, Inc. CD8 BINDERS
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
US11643472B2 (en) 2017-10-12 2023-05-09 Mcmaster University T cell-antigen coupler with Y182T mutation and methods and uses thereof
CN111565751A (zh) 2017-10-31 2020-08-21 詹森生物科技公司 治疗高危多发性骨髓瘤的方法
TW201930344A (zh) 2018-01-12 2019-08-01 美商安進公司 抗ｐｄ-１抗體及治療方法
US20200354424A1 (en) * 2018-01-26 2020-11-12 Orionis Biosciences, Inc. Xcr1 binding agents and uses thereof
EP3749295A4 (en) 2018-02-05 2022-04-27 Orionis Biosciences, Inc. FIBROBLAST BINDING AGENTS AND USES THEREOF
US10640562B2 (en) 2018-07-17 2020-05-05 Mcmaster University T cell-antigen coupler with various construct optimizations
US11110123B2 (en) 2018-07-17 2021-09-07 Triumvira Immunologics Usa, Inc. T cell-antigen coupler with various construct optimizations
WO2020120730A1 (en) 2018-12-14 2020-06-18 Morphosys Ag Antibody formulations
CA3133643A1 (en) * 2019-03-28 2020-10-01 Orionis Biosciences, Inc. Therapeutic interferon alpha 1 proteins
WO2020198662A1 (en) * 2019-03-28 2020-10-01 Orionfs Biosciences, Inc. Clec9a-based chimeric protein complexes
AU2020261039A1 (en) * 2019-04-23 2021-12-09 Sanofi Anti-CD38 antibodies and formulations
US11655302B2 (en) * 2019-06-10 2023-05-23 Sanofi Anti-CD38 antibodies and formulations
EP3999101A1 (en) 2019-07-18 2022-05-25 ENYO Pharma Method for decreasing adverse-effects of interferon
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
CN113717942B (zh) * 2020-05-26 2024-04-30 华东师范大学 一种联合嵌合抗原受体和i型干扰素的免疫治疗方法及其应用
US11919958B2 (en) 2020-08-19 2024-03-05 Xencor, Inc. Anti-CD28 compositions
WO2022072495A2 (en) * 2020-10-01 2022-04-07 Academia Sinica Potent neutralizing antibodies for prevention and treatment of covid-19
AU2022232375A1 (en) 2021-03-09 2023-09-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
JP2024509274A (ja) 2021-03-10 2024-02-29 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｇｐｃ３に結合するヘテロ二量体抗体
CN117321087A (zh) 2021-03-26 2023-12-29 先天制药公司 包含与细胞因子融合用于nk细胞衔接的nkp46结合位点、癌抗原结合位点的多特异性蛋白质
US12016923B2 (en) 2021-06-01 2024-06-25 Triumvira Immunologics Usa, Inc. Claudin 18.2 T cell-antigen couplers and uses thereof
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
JP2024521405A (ja) 2021-06-09 2024-05-31 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム Ｎｋｐ４６、サイトカイン受容体、腫瘍抗原およびｃｄ１６ａに結合する多特異性タンパク質
CA3234007A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 Yunovia Co., Ltd. Immunocytokine containing il-21r mutein
WO2023178253A2 (en) * 2022-03-18 2023-09-21 Igm Biosciences, Inc. Use of a multimeric anti-pd-l1 binding molecule in combination with a monoclonal antibody therapy
CN115057946B (zh) * 2022-06-30 2023-05-16 四川省医学科学院·四川省人民医院 干扰素在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用
WO2024040247A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interferon proproteins and uses thereof
US20240067691A1 (en) 2022-08-18 2024-02-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interferon receptor agonists and uses thereof
WO2024104412A1 (en) * 2022-11-16 2024-05-23 I-Mab Biopharma Co., Ltd. Attenuated interferon proteins and fragments and multifunctional polypeptides and conjugates
CN117430716B (zh) * 2023-10-16 2024-05-31 珠海臻谱基因科技有限公司 靶向保守的HIV gp41亚基近膜端外区的重组干扰素药物及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040132977A1 (en) * 2002-09-09 2004-07-08 Rene Gantier Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
WO2006020580A2 (en) * 2004-08-09 2006-02-23 Alios Biopharma Inc. Synthetic hyperglycosylated, protease-resistant polypeptide variants, oral formulations and methods of using the same
CN101045156A (zh) * 2006-03-29 2007-10-03 刘宏利 特异靶向性药物及其用途

Family Cites Families (137)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2148299B (en) 1983-09-01 1988-01-06 Hybritech Inc Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life
US4908431A (en) 1986-01-22 1990-03-13 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Monoclonal antibodies to human kininogen and methods of preparing same
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US5846534A (en) 1988-02-12 1998-12-08 British Technology Group Limited Antibodies to the antigen campath-1
AU4128089A (en) 1988-09-15 1990-03-22 Rorer International (Overseas) Inc. Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5976531A (en) 1990-04-19 1999-11-02 The Dow Chemical Company Composite antibodies of human subgroup IV light chain capable of binding to tag-72
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
US5650150A (en) * 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
SK281142B6 (sk) 1991-03-06 2000-12-11 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschr�Nkter Haftung Humanizovaná monoklonálna protilátka, expresné vektory a farmaceutický prostriedok
ES2134212T3 (es) 1991-04-25 1999-10-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo humano reconstituido contra el receptor de la interleuquina 6 humano.
US5545533A (en) 1991-05-25 1996-08-13 Boehringer Mannheim Gmbh Monoclonal antibodies against c-kit and method of detecting a malignancy using c-kit specific antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5824307A (en) 1991-12-23 1998-10-20 Medimmune, Inc. Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus
US6042828A (en) 1992-09-07 2000-03-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Humanized antibodies to ganglioside GM2
EP0627932B1 (en) 1992-11-04 2002-05-08 City Of Hope Antibody construct
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5441734A (en) * 1993-02-25 1995-08-15 Schering Corporation Metal-interferon-alpha crystals
US5840299A (en) 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
AU2071695A (en) 1994-03-17 1995-10-03 Merck Patent Gmbh Anti-EGFR single-chain FVS and anti-EGFR antibodies
EP0706799B1 (en) 1994-09-16 2001-11-14 MERCK PATENT GmbH Immunoconjugates II
US20020164788A1 (en) 1994-12-02 2002-11-07 The Wellcome Foundation Limited Humanized antibodies to CD38
US6071519A (en) 1995-06-07 2000-06-06 Innogenetics N.V. Immunotoxins specific for CD86 expressing cells
DE69638269D1 (de) 1995-06-14 2010-11-18 Univ California Hochaffine humane antikörper gegen tumorantigene
DE69621940T2 (de) 1995-08-18 2003-01-16 Morphosys Ag Protein-/(poly)peptidbibliotheken
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
ATE350478T1 (de) 1996-05-04 2007-01-15 Astrazeneca Ab Monoklonaler antikoerper gegen cea, konjugate die dieses antikoerper enthalten und deren therapeutische verwendung in einem adept-system
US6417337B1 (en) 1996-10-31 2002-07-09 The Dow Chemical Company High affinity humanized anti-CEA monoclonal antibodies
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6872568B1 (en) 1997-03-17 2005-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5 antibodies
GB9709421D0 (en) * 1997-05-10 1997-07-02 Zeneca Ltd Chemical compounds
CA2296770A1 (en) 1997-07-14 1999-01-28 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
DE69942021D1 (de) 1998-04-20 2010-04-01 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
CA2343094A1 (en) 1998-10-16 2000-04-27 Biogen, Inc. Interferon-beta fusion proteins and uses
DK2264177T3 (en) 1998-12-09 2016-01-11 Phyton Holdings Llc Glycoproteins with human-type glycosylation
US7223397B1 (en) 1999-01-07 2007-05-29 Research Development Foundation Potentiation of anti-CD38-Immunotoxin cytotoxicity
PL220113B1 (pl) 1999-01-15 2015-08-31 Genentech Inc Wariant macierzystego polipeptydu zawierającego region Fc, polipeptyd zawierający wariant regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania receptora Fc gamma (FcγR), polipeptyd zawierający wariant regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania noworodkowego receptora Fc (FcRn), kompozycja, wyizolowany kwas nukleinowy, wektor, komórka gospodarza, sposób otrzymywania wariantu polipeptydu, zastosowanie wariantu polipeptydu i sposób otrzymywania wariantu regionu Fc
EP1161266A4 (en) 1999-03-12 2007-09-19 Univ Georgetown MATRIPTASE, SERINE PROTEASE, AND USE THEREOF
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
ATE336514T1 (de) 2000-02-11 2006-09-15 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
US7063845B2 (en) 2000-04-28 2006-06-20 Gemini Science, Inc. Human anti-CD40 antibodies
US7521047B2 (en) 2000-05-12 2009-04-21 Gpc Biotech Ag Human polypeptides causing or leading to the killing of cells including lymphoid tumor cells
JP3597140B2 (ja) 2000-05-18 2004-12-02 日本たばこ産業株式会社 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
WO2001097844A1 (en) 2000-06-22 2001-12-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
CA2412701A1 (en) 2000-06-28 2002-01-03 Glycofi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
EP1174440A1 (en) 2000-07-19 2002-01-23 U-BISys B.V. A selectively-expressed epitope on the human CD38 molecule detected by a phage display library-derived human scFv antibody fragment
US7323552B2 (en) 2000-07-31 2008-01-29 The General Hospital Corporation Variant integrin polypeptides and uses thereof
ES2727425T3 (es) 2000-12-12 2019-10-16 Medimmune Llc Moléculas con semividas prolongadas, composiciones y usos de las mismas
JP2004531217A (ja) 2001-01-05 2004-10-14 ファイザー・インク インスリン様成長因子ｉ受容体に対する抗体
FR2823764B1 (fr) 2001-04-24 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides du gene ifn alpha-17
US20020193569A1 (en) 2001-06-04 2002-12-19 Idec Pharmaceuticals Corporation Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
JP4509570B2 (ja) 2001-07-03 2010-07-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒトｄｒ４抗体及びその使用法
MXPA05000511A (es) 2001-07-12 2005-09-30 Jefferson Foote Anticuepros super humanizados.
AR035119A1 (es) 2001-08-16 2004-04-14 Lilly Co Eli Anticuerpos humanos antagonistas anti-htnfsf13b
CN1571797A (zh) 2001-10-15 2005-01-26 麒麟麦酒株式会社 抗hla－dr抗体
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US20040185040A1 (en) 2001-11-21 2004-09-23 Celltech R & D Limited Modulating immune responses
CA2471702C (en) 2002-01-09 2013-03-19 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies against cd30
DE60333732D1 (de) 2002-03-01 2010-09-23 Immunomedics Inc Internalisierung von anti cd74 monoklonalen antikörpern und deren verwendungen
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7332585B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The California University Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
US7332580B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The University Of California Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
US7202346B2 (en) 2002-07-03 2007-04-10 Immunogen Inc. Antibodies to non-shed Muc1 and Muc16, and uses thereof
EP1539950A1 (en) 2002-09-09 2005-06-15 Nautilus Biotech Rational directed protein evolution using two-dimensional rational mutagenesis scanning
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
HUE026914T2 (en) 2002-11-07 2016-08-29 Immunogen Inc Anti-CD33 antibodies and a method of treating acute myeloid leukemia
PL376673A1 (pl) 2003-02-18 2006-01-09 Merck Patent Gmbh Białka fuzyjne mutein interferonu alfa o ulepszonych właściwościach
US7709610B2 (en) 2003-05-08 2010-05-04 Facet Biotech Corporation Therapeutic use of anti-CS1 antibodies
EP1694706B1 (en) 2003-11-01 2012-04-04 Merck Patent GmbH Modified anti-cd52 antibody
EP2236172A1 (en) 2003-11-04 2010-10-06 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Combination therapy comprising anti-CD20 and anti-CD40 antibodies for the treatment of B cell-related cancers
EP1711527A4 (en) 2003-12-15 2008-09-03 Dendreon Corp HLA-DR SPECIFIC ANTIBODIES, COMPOSITIONS AND METHODS
MXPA06008700A (es) 2004-02-06 2007-01-19 Morphosys Ag Anticuerpos anti-cd38 humanos y usos para los mismos.
RS54056B1 (en) 2004-02-06 2015-10-30 Morphosys Ag ANTI-CD38 HUMAN ANTIBODIES AND THEIR USES
US8034352B2 (en) 2005-04-06 2011-10-11 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Tetrameric cytokines with improved biological activity
US7273608B2 (en) 2004-03-11 2007-09-25 City Of Hope Humanized anti-CEA T84.66 antibody and uses thereof
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
AU2005259221B2 (en) 2004-07-01 2011-02-10 Innate Pharma Antibodies binding to receptors KIR2DL1, -2, 3 but not KIR2DS4 and their therapeutic use
CA2583208C (en) 2004-10-15 2015-08-25 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders
EP1842857B1 (en) * 2004-11-12 2011-03-09 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Mutant interferon proteins and use thereof
WO2006099875A1 (en) 2005-03-23 2006-09-28 Genmab A/S Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
TW200745162A (en) 2005-05-24 2007-12-16 Morphosys Ag Generation and profiling of fully human hucal gold-derived therapeutic antibodies specific for human CD38
EP1899368A2 (en) 2005-05-26 2008-03-19 Schering Corporation Interferon-igg fusion
US7736647B2 (en) 2005-06-15 2010-06-15 Monoclonal Antibodies Therapeutics Anti-CD71 monoclonal antibodies and uses thereof for treating malignant tumor cells
WO2007000769A2 (en) 2005-06-29 2007-01-04 Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science RECOMBINANT INTERFERON α2 (IFNα2) MUTANTS
EP2397497A3 (en) 2005-07-18 2013-11-27 Amgen, Inc Human anti-B7RP1 neutralizing antibodies
JP5172679B2 (ja) 2005-09-09 2013-03-27 インペリアル イノベーションズ リミテッド 呼吸器疾患の治療のためのインターフェロン−λ療法
JP2009509510A (ja) 2005-09-26 2009-03-12 メダレックス インコーポレーティッド Ｃｄ７０に対するヒトモノクローナル抗体
US20070190068A1 (en) * 2005-10-10 2007-08-16 Richard Hart uPAR-binding molecule-drug conjugates and uses thereof
TWI428444B (zh) 2005-10-12 2014-03-01 Morphosys Ag 由全長人類ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ-衍生之對人類ＣＤ３８有特異性之治療抗體之產生及鑑定
AU2006308648A1 (en) 2005-10-31 2007-05-10 Duke University Antibodies and immunotoxins that target human glycoprotein NMB
GB0525214D0 (en) 2005-12-12 2006-01-18 Bioinvent Int Ab Biological materials and uses thereof
TWI395754B (zh) 2006-04-24 2013-05-11 Amgen Inc 人類化之ｃ-ｋｉｔ抗體
EP1878747A1 (en) 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
FR2905375A1 (fr) 2006-08-29 2008-03-07 Biomethodes Sa Variants ameliores de l'interferon alpha humain
CA2660795C (en) 2006-09-18 2014-11-18 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target hm1.24
RS59005B1 (sr) 2006-09-26 2019-08-30 Genmab As Anti-cd38 plus kortikosteroidi plus nekortikosteroidni hemoterapeutik za tretiranje tumora
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
US11535673B2 (en) 2007-04-05 2022-12-27 President and Fellows of Harvard CoHege Chimeric activators: quantitatively designed protein therapeutics and uses thereof
EP2703011A3 (en) 2007-05-07 2014-03-26 MedImmune, LLC Anti-icos antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
JP5290276B2 (ja) 2007-05-08 2013-09-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド システイン改変抗ｍｕｃ１６抗体および抗体−薬物結合体
WO2008145139A1 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Fusion or linked proteins with extended half life
US8248984B2 (en) 2007-06-20 2012-08-21 I Squared Llc System and method for interfacing devices
AU2008282729B2 (en) * 2007-08-01 2015-07-16 Scott & White Healthcare A fold-back diabody diphtheria toxin immunotoxin and methods of use
WO2009017838A2 (en) * 2007-08-01 2009-02-05 Exelixis, Inc. Combinations of jak-2 inhibitors and other agents
US20090076249A1 (en) 2007-09-19 2009-03-19 Michel De Weers Antibodies against CD38 for treatment of multiple myeloma
EP2200634B1 (en) 2007-09-21 2015-02-11 The Regents of The University of California Targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
US20100261275A1 (en) 2007-12-10 2010-10-14 Yves Durocher Production of Recombinant Interferon Proteins
US8092804B2 (en) 2007-12-21 2012-01-10 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα)-173
CA2710453C (en) 2007-12-26 2019-07-02 Biotest Ag Agents targeting cd138 and uses thereof
ES2543201T3 (es) 2007-12-26 2015-08-17 Biotest Ag Métodos y agentes que mejoran la dirección a las células tumorales que expresan CD138
US8470977B2 (en) 2008-03-14 2013-06-25 Transgene S.A. Antibody against the CSF-1R
WO2010002862A2 (en) 2008-07-01 2010-01-07 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Fibroblast growth factor receptor 3 (fgfr3) binding proteins
SG173577A1 (en) 2009-03-16 2011-09-29 Cephalon Australia Pty Ltd Humanised antibodies with anti-tumour activity
TWI614267B (zh) 2009-05-13 2018-02-11 建新公司 抗人類ｃｄ５２免疫球蛋白
TWI713942B (zh) 2010-05-04 2020-12-21 美商戊瑞治療有限公司 與集落刺激因子１受體（ｃｓｆ１ｒ）結合之抗體類
EP2580243B1 (en) 2010-06-09 2019-10-16 Genmab A/S Antibodies against human cd38
US8909257B2 (en) 2010-06-19 2014-12-09 Qualcomm Incorporated Positioning protocol conveyance
US8877899B2 (en) 2010-09-27 2014-11-04 Morphosys Ag Anti-CD38 antibody and lenalidomide or bortezomib for the treatment of multipe myeloma and NHL
UA112062C2 (uk) 2010-10-04 2016-07-25 Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх Cd33-зв'язувальний агент
BR112013016235B1 (pt) 2010-12-22 2020-03-31 Cephalon Australia Pty Ltd Anticorpo isolado, uso de um anticorpo, ácido nucleico, célula transformada e composição farmacêutica
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
CA2851892C (en) 2011-10-28 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
US9492562B2 (en) 2012-01-20 2016-11-15 Vib Vzw Targeted human-interferon fusion proteins
EP2822575B1 (en) 2012-03-03 2020-05-06 ImmunGene, Inc. Engineered antibody-interferon mutant fusion molecules
WO2014028502A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 ImmunGene Inc. Engineered antibody-interferon fusion molecules for treatment of autoimmune diseases
KR20150111958A (ko) 2013-01-25 2015-10-06 바이엘 머티리얼사이언스 아게 부피 홀로그램 및 인쇄 특징부를 갖는 보안 소자
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
FI3677591T3 (fi) 2013-04-29 2023-04-03 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd38-vasta-aineet ja fuusiot heikennetylle interferonille alfa-2b
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
KR102639037B1 (ko) 2014-10-29 2024-02-20 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 인터페론 α2b 변이체

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040132977A1 (en) * 2002-09-09 2004-07-08 Rene Gantier Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
WO2006020580A2 (en) * 2004-08-09 2006-02-23 Alios Biopharma Inc. Synthetic hyperglycosylated, protease-resistant polypeptide variants, oral formulations and methods of using the same
CN101045156A (zh) * 2006-03-29 2007-10-03 刘宏利 特异靶向性药物及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
NZ623812A (en) 2016-02-26
AU2018200221A1 (en) 2018-02-01
EP3559049A2 (en) 2019-10-30
KR20190123353A (ko) 2019-10-31
JP2017193580A (ja) 2017-10-26
EA034989B1 (ru) 2020-04-15
US20140248238A1 (en) 2014-09-04
CA2851892C (en) 2021-09-14
AU2012327877B2 (en) 2017-10-12
EP3559049A4 (en) 2019-12-04
NZ715807A (en) 2019-07-26
WO2013059885A3 (en) 2014-07-17
NZ734996A (en) 2019-09-27
US9611322B2 (en) 2017-04-04
IL232247B (en) 2018-07-31
IL232247A0 (en) 2014-06-30
CN104203982B (zh) 2018-08-31
KR20140101744A (ko) 2014-08-20
JP2015500796A (ja) 2015-01-08
MX2014005108A (es) 2015-02-12
AU2018200221B2 (en) 2020-01-16
AU2012327877A1 (en) 2014-05-15
CN109022465B (zh) 2022-04-29
IL260045B (en) 2020-06-30
JP2020010697A (ja) 2020-01-23
BR112014009925B1 (pt) 2022-09-20
JP6184965B2 (ja) 2017-08-23
CA2851892A1 (en) 2013-05-02
US20170233449A1 (en) 2017-08-17
EA201700111A1 (ru) 2018-02-28
CN104203982A (zh) 2014-12-10
US20160367695A1 (en) 2016-12-22
WO2013059885A2 (en) 2013-05-02
US10981986B2 (en) 2021-04-20
KR102037541B1 (ko) 2019-10-29
KR102096224B1 (ko) 2020-04-03
SG11201401518TA (en) 2014-05-29
BR112014009925A2 (pt) 2020-09-24
MX360741B (es) 2018-11-14
JP7111669B2 (ja) 2022-08-02
IL260045A (en) 2018-07-31
EA201400488A1 (ru) 2014-11-28
SG10201603411WA (en) 2016-07-28
NZ756727A (en) 2022-12-23
ZA201402819B (en) 2015-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104203982B (zh) 多肽构建体及其用途
AU2018393424B2 (en) Triabody, preparation method and use thereof
JP2022191360A (ja) 抗ｃｄ４０抗体および使用方法
CN111484555B (zh) 新型双特异性cd3/cd20多肽复合物
US20150010539A1 (en) Anti-cd25 antibodies and their uses
TW200932263A (en) Antibodies that bind IL-4 and/or IL-13 and their uses
TW201041592A (en) Anti-TNF-α antibodies and their uses
US20200277366A1 (en) MULTI-SPECIFIC ANTIBODY MOLECULES HAVING SPECIFICITY FOR TNF-ALPHA, IL-17A and IL-17F
US20150010538A1 (en) Anti-cd25 antibodies and their uses
US20210244825A1 (en) Il-21 antibodies
JP2022504826A (ja) ４－１ｂｂ及び腫瘍関連抗原に結合する抗体構築物ならびにその使用
US20220073620A1 (en) Antibody fusion protein, preparation method therefor and application thereof
JP7386877B2 (ja) 新規の抗ｉｆｎａｒ１抗体
WO2023274183A1 (zh) Cd16抗体及其应用
WO2022206900A1 (zh) 抗人血清白蛋白(hsa)的纳米抗体及其应用
JP2023551981A (ja) 多重特異性抗体及び抗体の組み合わせ
JP2019516785A (ja) 親和性を操作した血清タンパク質担体結合ドメイン
JP2023523794A (ja) 人工操作免疫グロブリン
US20220289846A1 (en) Antibodies to human programmed death receptor pd-1
US20240190983A1 (en) Novel TNFR2 Binding Molecules
WO2022117032A1 (zh) 抗cd22的纳米抗体及其用途
US20240124575A1 (en) Human cd33 antibody and use thereof
JP2022121522A (ja) 汎用性抗体フレームワークを用いたイエウサギ抗体のヒト化
RU2567006C2 (ru) Гуманизация антител кролика с использованием универсального каркаса антитела
CN114573703A (zh) 一种t细胞衔接器治疗剂的开发和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant