PL217296B1 - Wyizolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, wytwarzająca je hybrydoma, kodujący to przeciwciało wektor ekspresyjny i zawierająca je kompozycja farmaceutyczna, immunokoniugat, bispecyficzna lub multispecyficzna cząsteczka obejmująca kwasy nukleinowe kodujące ciężki i lekki łańcuch transfektoma, ich zastosowania, zwłaszcza w medycynie, obejmująca te kwasy ex vivo eukariotyczna lub prokariotyczna komórka gospodarza oraz nie będące człowiekiem zwierzę transgeniczne lub roślina, sposób in vitro hamowania wzrostu i/lub proliferacji komórek wyrażających CD25 lub eliminowania komórek wyrażających CD25, sposób wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25, zestaw diagnostyczny do wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25 - Google Patents

Wyizolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, wytwarzająca je hybrydoma, kodujący to przeciwciało wektor ekspresyjny i zawierająca je kompozycja farmaceutyczna, immunokoniugat, bispecyficzna lub multispecyficzna cząsteczka obejmująca kwasy nukleinowe kodujące ciężki i lekki łańcuch transfektoma, ich zastosowania, zwłaszcza w medycynie, obejmująca te kwasy ex vivo eukariotyczna lub prokariotyczna komórka gospodarza oraz nie będące człowiekiem zwierzę transgeniczne lub roślina, sposób in vitro hamowania wzrostu i/lub proliferacji komórek wyrażających CD25 lub eliminowania komórek wyrażających CD25, sposób wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25, zestaw diagnostyczny do wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25

Info

Publication number
PL217296B1
PL217296B1 PL377794A PL37779403A PL217296B1 PL 217296 B1 PL217296 B1 PL 217296B1 PL 377794 A PL377794 A PL 377794A PL 37779403 A PL37779403 A PL 37779403A PL 217296 B1 PL217296 B1 PL 217296B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody
human
cells
cell
seq
Prior art date
Application number
PL377794A
Other languages
English (en)
Other versions
PL377794A1 (pl
Inventor
Janine Schuurman
Catharina Emanuele Gerarda Havenith
Paul Parren
De Winkel Jan G. J. Van
Denise Leah Williams
Jørgen Petersen
Ole Baadsgaard
Original Assignee
Genmab As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genmab As filed Critical Genmab As
Publication of PL377794A1 publication Critical patent/PL377794A1/pl
Publication of PL217296B1 publication Critical patent/PL217296B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/06—Radiation therapy using light
    • A61N5/0613—Apparatus adapted for a specific treatment
    • A61N5/062—Photodynamic therapy, i.e. excitation of an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/04—Drugs for disorders of the respiratory system for throat disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/5759—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • G01N2333/7155—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Description

Opis wynalazku
Zgłoszenia pokrewne
Niniejsze zgłoszenie zastrzega pierwszeństwo z tymczasowego zgłoszenia patentowego USA nr serii 60/426 690, złożonego 15 listopada 2002, którego ujawnienie włącza się niniejszym jako odnośnik literaturowy.
Charakteryzujący się wysokim powinowactwem receptor dla interleukiny 2 (IL-2R) jest heterotrimerycznym receptorem umiejscowionym na powierzchni komórkowej, złożonym z łańcuchów polipeptydowych α, β i γ0 (KD 10-11 M). Łańcuch α o 55 kDa, znany również jako IL-2Ra, CD25, p55 i antygen Tac (aktywacji komórek T) jest unikatowy dla IL-2R. Łańcuchy β (CD122, P75) i yc (CD132) są częścią nadrodziny receptorów cytokin (receptory dla hematopoetyny) i są funkcjonalnymi składnikami innych receptorów dla cytokin, takich jak IL-15R (Waldmann (1993) Immunol. Todzień 14 (6): 264-70, Ellery i wsp. (2002) Cytokine Growth Factor Rev. 13 (1): 27-40). Charakteryzujący się średnim powinowactwem receptor jest dimerem złożonym z łańcucha β i yc (Kd 10-9 M), podczas gdy receptor charakteryzujący się niskim powinowactwem składa się z monomerycznej podjednostki α, która nie posiada zdolności przekazywania sygnału (KD 10-8 M) (Waldmann (1993) Immunol. Today 14 (6): 264-70).
Spoczynkowe komórki T, komórki B i monocyty wytwarzają niewiele cząsteczek CD25. Chociaż, po aktywacji receptor jest szybko transkrybowany i wytwarzany (Ellery i wsp. (2002) Cytokine Growth Factor Rev. 13 (1): 27-40, Morris i wsp. (2000) Ann. Rheum. Dis. 59 (Suppl. 1): 109-14). Komórki produkujące IL-2R o wysokim powinowactwie wytwarzają CD25 (podjednostkę CD25) w nadmiarze, co prowadzi do uzyskania profili wiązania IL-2, zarówno o wysokim powinowactwie, jak i niskim (Waldmann i wsp. (1993) Blood 82 (6): 1701-12, de Jong i wsp. (1996) J. Immunol.156 (4): 1339-48). CD25 jest wytwarzane na wysokim poziomie przez komórki T w niektórych chorobach autoimmunologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, twardzina skóry i zapalenie błony naczyniowej oka, jak również w chorobach skóry, np. łuszczycy i atopowym zapaleniu skóry i w różnych nowotworach limfoidalnych, np. białaczce limfatycznej z komórek T i w ziarnicy złośliwej (Waldmann (1993) Immunol. Todzień 14 (6): 264-70, Kuttler i wsp. (1999) J. Mol. Med. 77 (1): 226-9). Dodatkowo, wytwarzanie CD25 związane jest z odrzuceniem aloprzeszczepu i reakcjami przeszczepu przeciw gospodarzowi (Jones i wsp. (2002) J. Immunol. 168 (3): 1123-1130, Anasetti i wsp. (1994) Blood 84 (4): 1320-7).
Zatem, CD25 jest ważnym miejscem docelowym dla terapii z wykorzystaniem przeciwciał, przykładowo w redukcji zapalenia w chorobach autoimmunologicznych, leczeniu nowotworów i zapobieganiu odrzucenia przeszczepu. Jednakże, pomimo, że uzyskane wyniki i badania kliniczne jasno wskazują na CD25 jako przydatne miejsce docelowe dla immunoterapii, pokazują one również, że dostępne obecnie przeciwciała mysie i chimeryczne nie stanowią idealnych czynników terapeutycznych. Zatem, istnieje zapotrzebowanie na dalsze przeciwciała terapeutyczne skierowane wobec CD25, które są skuteczne w zapobieganiu i/lub leczeniu szeregu chorób, w których zaangażowane są komórki wyrażające CD25.
Wynalazek niniejszy ma na celu dostarczenie nowych leków z przeciwciał użytecznych do leczenia i/lub zapobiegania chorobom, w których zaangażowane są komórki wyrażające CD25, w tym odrzucenia przeszczepu narządu, tkanki i komórki, włączając odrzucenie aloprzeszczepu i heteroprzeszczepu, reakcję przeszczepu przeciw gospodarzowi, chorobom autoimmunologicznym, procesom zapalnym i nadmiernej proliferacji skóry oraz, pośród innych, nowotworom limfoidalnym. Przeciwciała objęte wynalazkiem są udoskonalone przez to, że są w pełni ludzkie, a zatem są potencjalnie mniej immunogenne u pacjentów. Przeciwciała są także korzystne dzięki ich nadrzędnym cechom funkcjonalnym (np. terapeutycznym).
Jak przedstawiono w niniejszym opisie, przeciwciała ludzkie według wynalazku wiążą się z CD25 w badaniach testu ELISA lub cytometrii przepływowej.
Przeciwciała ludzkie według wynalazku zazwyczaj wiążą się z CD25 ze stałą równowagi reakcji dysocjacji (KD) równą w przybliżeniu 10-8 M lub mniej, jak 10-9 M, lub mniej, 10-10 M, lub mniej, lub 10-11 M, lub jeszcze mniej, wówczas, gdy wielkość ta jest określana za pomocą rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) w urządzeniu BIAcore 3000, przy użyciu zrekombinowanego ludzkiego IL-2Ra jako liganda i przeciwciała jako składnika oznaczanego. Przeciwciała takie zazwyczaj nie reagują krzyżowo z pokrewnymi antygenami powierzchniowymi komórki i nie hamują zatem ich funkcji.
Ponadto, przeciwciała ludzkie według niniejszego wynalazku hamują (np. blokują) oddziaływanie CD25 z jego ligandem, IL-2. Przykładowo, wiązanie może być zahamowane w około 10%, 20%,
30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% lub 100%. Przykłady komórek, które wyrażają CD25 i których
PL 217 296 B1 funkcje komórkowe mogą być zatem hamowane przez przeciwciała ludzkie według wynalazku obejmują między innymi komórki T, komórki B i monocyty. Przykładowo, jak opisano w niniejszym opisie, przeciwciała ludzkie według wynalazku mogą hamować wiązanie IL-2 z CD25. Takie hamowanie wiązania IL-2 z CD25 hamuje jednocześnie różne mechanizmy komórkowe indukowane przez wiązanie IL-2. Przeciwciała ludzkie według wynalazku, co również ujawniono w niniejszym opisie, mogą hamować proliferację komórek T indukowaną przeciwciałem anty-CD3 w sposób zależny od dawki. Jak wykazano niniejszym, przeciwciała ludzkie według wynalazku mogą hamować reakcję mieszanych limfocytów (MLR) w sposób zależny od dawki. Hamowanie proliferacji w takich doświadczeniach można monitorować przez obniżenie akumulacji masy komórkowej w pomiarach ELISA lub obniżenie inkorporacji BrdU do DNA komórkowego.
W związku z powyższym, przedmiotem niniejszego wynalazku jest wyizolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, które wiąże ludzkie CD25 i hamuje wiązanie IL-2 z CD25, które to przeciwciało obejmuje regiony CDR1, CDR2 i CDR3 domeny VH i regiony CDR1, CDR2 i CDR3 domeny VL mające sekwencje aminokwasowe jak określono poniżej:
(i) SEKW. NR ID.: 23, 24, 25, 26, 27 i 28;
(ii) SEKW. NR ID.: 29, 30, 31, 32, 33 i 34;
(ii) SEKW. NR ID.: 35, 36, 37, 38, 39 i 40;
(iv) SEKW. NR ID.: 17, 18, 19, 20, 21 i 22.
Korzystnie, przeciwciało to wiąże ludzkie CD25 i hamuje wiązanie IL-2 z CD25, które to przeciwciało obejmuje regiony zmienne ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa obejmujące sekwencje aminokwasowe przedstawione, odpowiednio, w SEKW. NR ID.: 10 i 8, SEKW. NR ID.: 14 i 16, SEKW. NR ID.: 2 i 4, SEKW. NR ID.: 10 i 12. W innym, korzystnym wykonaniu przeciwciało to jest kodowane przez kwasy nukleinowe ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa obejmujące sekwencje nukleotydowe ich regionów zmiennych przedstawione, odpowiednio, w SEKW. NR ID.: 5 i 7, SEKW. NR ID.: 13 i 15, SEKW. NR ID.: 1 i 3 lub SEKW. NR ID.: 9 i 11.
Korzystnie, przeciwciało obejmuje:
(i) sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego pochodzącą z ludzkiej sekwencji zarodkowej VH1-69/JH4b lub VH1-69/JH5b i sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha lekkiego pochodzącą z ludzkiej sekwencji zarodkowej A27/JK4 lub A27/JK5; lub (ii) sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego pochodzącą z ludzkiej sekwencji zarodkowej VH1-69/D7-27/JH4b lub VH1-69/D7-27/JH5b i sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha lekkiego pochodzącą z ludzkiej sekwencji zarodkowej A27/JK4 lub A27/JK5.
W szczególnie korzystnej postaci przeciwciało wybrane jest z grupy składającej się z: przeciwciała IgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA1, lgA2, wydzielniczego IgA, IgD i IgE.
Przeciwciało według wynalazku oddysocjowuje od ludzkiego CD25 ze stałą równowagi reakcji ο α -| η -i -ί dysocjacji (KD) około 10-8 M lub mniej, jak 10-9 M, lub mniej, 10-10 M, lub mniej, lub 10-11 M, lub jeszcze mniej, na podstawie badania rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) w urządzeniu BIAcore 3000, przy użyciu ludzkich zrekombinowanych CD25 jako liganda i przeciwciała jako analitu.
Korzystnie, przeciwciało według wynalazku posiada jedną lub więcej następujących cech:
(a) swoistość wobec ludzkiego CD25, (b) hamuje wiązanie IL-2 z CD25, (c) eliminuje komórki T wytwarzające CD25, (d) przekształca komórki T w tolerancyjne, (e) hamuje proliferację komórek T wytwarzających CD25, (f) hamuje proliferację komórek T indukowaną przeciwciałem anty-CD3 z jednojądrowych komórek krwi obwodowej (PBMC), (g) hamuje reakcję mieszanych limfocytów (MLR), (h) zdolność internalizacji CD25 wytwarzanego na komórkach T.
Przeciwciało według wynalazku korzystnie jest niezmienionym przeciwciałem wybranym z grupy składającej się z: niezmienionego przeciwciała IgG1, korzystnie niezmienionego przeciwciała IgG1, κ niezmienionego przeciwciała IgG1, λ, niezmienionego przeciwciała lgG2, korzystnie niezmienionego przeciwciała lgG2, K niezmienionego przeciwciała lgG2, λ, niezmienionego przeciwciała IgM, niezmienionego przeciwciała IgA1, niezmienionego przeciwciała lgA2, niezmienionego przeciwciała wydzielniczego IgA, niezmienionego przeciwciała IgD i niezmienionego przeciwciała IgE, znamienne tym, że przeciwciało jest glikozylowane w komórce eukariotycznej.
PL 217 296 B1
W kolejnej korzystnej postaci wykonania przeciwciało według wynalazku jest fragmentem przeciwciała lub przeciwciałem o pojedynczym łańcuchu.
Przeciwciało według wynalazku jest w korzystnej postaci immunoglobulinową fuzją białkową domeny wiążącej obejmującą: (i) region zmienny łańcucha ciężkiego lub region zmienny łańcucha lekkiego jak określono w zastrz. 1, który jest w fuzji z polipeptydowym regionem zawiasowym immunoglobuliny, (ii) immunoglobulinowy region stały CH2 łańcucha ciężkiego w fuzji z regionem zawiasowym i (iii) immunoglobulinowy region stały CH3 łańcucha ciężkiego w fuzji z regionem stałym CH2.
Wynalazek niniejszy dotyczy również hybrydomy, która wytwarza ludzkie przeciwciało monoklonalne według wynalazku.
Korzystnie, hybrydoma według wynalazku obejmuje komórkę B uzyskaną ze zwierzęcia transgenicznego nie będącego człowiekiem, w której w wyniku rearanżacji segmentów genów V-(D)-J uzyskano funkcjonalny transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i funkcjonalny transgen ludzkiego łańcucha lekkiego, w fuzji z unieśmiertelnioną komórką, która wytwarza w wykrywalnej ilości przeciwciało monoklonalne według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest także transfektoma obejmująca kwasy nukleinowe kodujące ludzki łańcuch ciężki i ludzki łańcuch lekki, która wytwarza wykrywalne ilości przeciwciał według wynalazku.
Wynalazek dostarcza również ex vivo eukariotycznej lub prokariotycznej komórki gospodarza obejmującej kwasy nukleinowe kodujące ludzki łańcuch ciężki i ludzki łańcuch lekki, która wytwarza wykrywalne ilości przeciwciał według wynalazku.
Kolejnym przedmiotem niniejszego wynalazku jest transgeniczne zwierzę nie będące człowiekiem lub roślina obejmujące kwasy nukleinowe kodujące ludzki łańcuch ciężki i ludzki łańcuch lekki, które wytwarzają w wykrywalnej ilości przeciwciało według wynalazku.
Wynalazek dotyczy także wektora ekspresyjnego kodującego ludzkie przeciwciało monoklonalne według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało według wynalazku lub wektor ekspresyjny według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczany nośnik oraz, ewentualnie, zawierająca dodatkowy składnik terapeutyczny.
W korzystnej postaci wykonania przeciwciało według wynalazku zawiera dodatkowo linker chelatorowy do przyłączania radioizotopu.
W związku z powyższym, kolejnym przedmiotem niniejszego wynalazku jest immunokoniugat obejmujący przeciwciało według wynalazku połączone z czynnikiem cytotoksycznym, radioizotopem lub lekiem.
Wynalazek dostarcza również bispecyficzną lub multispecyficzną cząsteczkę obejmującą przeciwciało według wynalazku i charakteryzuje się specyficznością wiązania dla CD3, CD4, IL-15R, TNF-α związanego z błoną lub związanego z receptorem lub IL-15 związanej z błoną lub związanej z receptorem.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób in vitro hamowania wzrostu i/lub proliferacji komórek wyrażających CD25 lub eliminowania komórek wyrażających CD25 obejmujący stosowanie przeciwciała, kompozycji, immunokoniugatu, bispecyficznej lub multispecyficznej cząsteczki według wynalazku, w którym wzrost i/lub proliferacja komórek jest hamowana lub gdzie zachodzi zastopowanie wyrażania CD25 i w którym komórką wyrażającą CD25 jest opcjonalnie aktywowana komórka T.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem przedmiotem wynalazku są także przeciwciało, kompozycja, immunokoniugat, bispecyficzna lub multispecyficzna cząsteczka, lub wektor ekspresyjny według wynalazku do stosowania jako lek.
Wynalazek dostarcza ponadto przeciwciało, kompozycję, immunokoniugat, bispecyficzną lub multispecyficzną cząsteczkę lub wektor ekspresyjny według wynalazku do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu odrzucenia przeszczepu, reakcji przeszczep przeciw gospodarzowi, chorobie immunologicznej, autoimmunologicznej lub zapalnej, zapaleniu lub zaburzeniu nadmiernej proliferacji komórek skóry, zaburzenia hematologicznego, nowotworu, w którym jest korzystne zahamowanie naciekających regulatorowych komórek T CD25+ i nowotworu limfoidalnego, gdzie:
(i) odrzucenie przeszczepu jest odrzuceniem aloprzeszczepu lub heteroprzeszczepu, u pacjentów przechodzących przeszczepienie narządu lub tkanki, jak przeszczep serca, płuca, łącznie sercapłuca, tchawicy, nerki, wątroby, trzustki, przełyku, jelita, skóry, kończyny, pępowiny, komórki macierzystej układu krwiotwórczego, komórki wyspy trzustkowej;
PL 217 296 B1 (ii) reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi jest wybrana z grupy składającej się z: reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi przy transfuzji krwi i reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi przy przeszczepie szpiku;
(iii) choroba immunologiczna, autoimmunologiczna lub zapalna jest wybrana z grupy składającej się z: reumatoidalnego zapalenia stawów, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, artropatii łuszczycowej, cukrzycy typu 1, cukrzycy typu 2 wymagającej insuliny, stwardnienia rozsianego, układowego tocznia rumieniowatego, miastenii ciężkiej, choroby zapalnej jelita, choroby Crohna, zapalenia okrężnicy wrzodziejącego, akrodynii, zespołu Sjogrena, zapaleń tętnicy, w tym zapalenia tętnicy skroniowej olbrzymiokomórkowego, niedokrwistości aplastycznej, astmy, twardzicy skóry i zapalenia błony naczyniowej oka;
(iv) zapalenie lub zaburzenie nadmiernej proliferacji komórek skóry jest wybrane z grupy składającej się z: łuszczycy, w tym łuszczycy płytkowej, dłoniowo-stopowej łuszczycy krostkowej (PPP), liszaja płaskiego z nadżerkami, pęcherzycy pęcherzowej, pęcherzycy z oddzieleniem naskórka, kontaktowego zapalenia skóry i atopowego zapalenia skóry;
(v) zaburzenie hematologiczne jest wybrane z grupy składającej się z: białaczki/chłoniaka dojrzałych komórek T, chłoniaka z anaplastycznymi komórkami dużymi, białaczki Iimfoblastycznej przewlekłej (CLL)/białaczki Iimfoblastycznej z komórkami małymi (SLL), chłoniaka z obwodowych komórek T i wtórnej skrobiawicy;
(vi) nowotwór Iimfoidalny jest wybrany z grupy składającej się z: białaczki komórek T, choroby Hodgkina, białaczki kosmatokomórkowej lub chłoniaka skóry z limfocytów T, w tym ziarniniaka grzybiastego i zespołu Sezaryego;
(vii) nowotwór, w którym jest korzystne zahamowanie naciekających regulatorowych komórek T CD25+ jest wybrany z grupy składającej się z raka żołądka, raków przełyku, czerniaka złośliwego, raka jelita grubego, raka trzustki, raka piersi, raka płuca małokomórkowego, raka płuca niemałokomórkowego, raka szyjki macicy, raka jajnika i raka komórek nerkowych.
Korzystnie, to przeciwciało, kompozycja, immunokoniugat, bispecyficzna lub multispecyficzną cząsteczka lub wektor ekspresyjny stosuje się w leczeniu, które obejmuje oddzielne stosowanie u osobnika innego czynnika terapeutycznego i/lub terapii.
Zgodnie z korzystną postacią wykonania kompozycja, przeciwciało, immunokoniugat, bispecyficzną lub multispecyficzną cząsteczka lub wektor ekspresyjny obejmują czynnik terapeutyczny, który jest:
(i) czynnikiem immunosupresyjnym wybranym z grupy składającej się z: cyklosporyny, azatiopryny, kwasu mykofenolowego, mykofenolanu mofetylu, kortykosteroidów, takich jak prednizon, metotreksat, soli złota, sulfasalazyny, czynników przeciwmalarycznych, brekwinaru, leflunomidu, mizorybiny, 15-deoksyspergaliny, 6-merkaptopuryny, cyklofosfamidu, rapamycyny, takrolimusa (FK-506), OKT3 i globuliny przeciwtymocytowej;
(ii) czynnikiem przeciwzapalnym wybranym z grupy składającej się z: leku steroidowego, NSAID (niesteroidowy lek przeciwzapalny) i DMARD, takie jak metotreksat, hydroksychlorochina, sulfasalazyna, leflunomid, czynników blokujących receptory dla IL-1, np. anakinra i czynników blokujących TNF-α, np. etanerceptu, infliksimabu i adalimumabu, przeciwciał anty-IL-6R, CTLA4lg i przeciwciał anty-IL-15;
(iii) czynnikiem lub terapią do leczenia stanów zapalnych lub zaburzeń nadmiernej proliferacji skóry, wybranym z grupy składającej się z: smoły pogazowej, witaminy A, antraliny, kalcipotrienu, tarazotenu, kortykosteroidów, metotreksatu, retinoidów, np. acitretyny, cyklosporyny, etanerceptu, alefaceptu, efaluzimabu, 6-tioguaninu, mykofenoIanu mofetylu, takrolimusu (FK-506), hydroksymocznika i fototerapii takiej jak UVB (promieniowanie ultrafioletowe typu B szerokopasmowe i wąskopasmowe), UVA (promieniowanie ultrafioletowe typu A) i PUVA (metoksalen psoralenu z promieniowaniem ultrafioletowym typu A);
(iv) wybrany z grupy składającej się z: doksorubicyny, cisplatyny, bleomycyny, karmustyny, chlorambucylu i cyclofosfamidu.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało, kompozycja, immunokoniugat, bispecyficzna lub multispecyficzna cząsteczka, lub wektor ekspresyjny według wynalazku do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu:
(a) odrzuceniu przeszczepu, reakcji przeszczep przeciw gospodarzowi, chorobie immunologicznej, autoimmunologicznej lub zapalnej, zapaleniu, lub zaburzeniu nadmiernej proliferacji komórek skóry i nowotworu limfoidalnego, gdzie:
PL 217 296 B1 (i) odrzucenie przeszczepu jest odrzuceniem aloprzeszczepu lub heteroprzeszczepu, u pacjentów przechodzących przeszczepienie narządu lub tkanki, jak przeszczep serca, płuca, łącznie sercapłuca, tchawicy, nerki, wątroby, trzustki, przełyku, jelita, skóry, kończyny, pępowiny, komórki macierzystej układu krwiotwórczego, komórki wyspy trzustkowej;
(ii) reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi jest wybrana z grupy składającej się z: reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi przy transfuzji krwi i reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi przy przeszczepie szpiku;
(iii) choroba immunologiczna, autoimmunologiczna lub zapalna jest wybrana z grupy składającej się z: reumatoidalnego zapalenia stawów, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, artropatii łuszczycowej, cukrzycy typu 1, cukrzycy typu 2 wymagającej insuliny, stwardnienia rozsianego, układowego tocznia rumieniowatego, miastenii ciężkiej, choroby zapalnej jelita, choroby Crohna, zapalenia okrężnicy wrzodziejącego, akrodynii, zespołu Sjogrena, zapaleń tętnicy, w tym zapalenia tętnicy skroniowej olbrzymiokomórkowego, niedokrwistości aplastycznej, astmy, twardzicy skóry i zapalenia błony naczyniowej oka;
(iv) zapalenie lub zaburzenie nadmiernej proliferacji komórek skóry jest wybrane z grupy składającej się z: łuszczycy, w tym łuszczycy płytkowej, dłoniowostopowej łuszczycy krostkowej (PPP), liszaja płaskiego z nadżerkami, pęcherzycy pęcherzowej, pęcherzycy z oddzieleniem naskórka, kontaktowego zapalenia skóry i atopowego zapalenia skóry;
(v) nowotwór Iimfoidalny jest wybrany z grupy składającej się z: białaczki komórek T, choroby Hodgkina, białaczki kosmatokomórkowej lub chłoniaka skóry z limfocytów T, w tym ziarniniaka grzybiastego i zespołu Sezaryego;
(vi) nowotworowi, w którym jest korzystne zahamowanie naciekających regulatorowych komórek T CD25+ i który jest wybrany z grupy składającej się z: raka żołądka, raków przełyku, czerniaka złośliwego, raka jelita grubego, raka trzustki, raka piersi, raka płuca małokomórkowego, raka płuca nie małokomórkowego, raka szyjki macicy, raka jajnika i raka komórek nerkowych lub (vii) zaburzeniu hematologicznemu wybranemu z grupy składającej się z: białaczki/chłoniaka dojrzałych komórek T, chłoniaka z anaplastycznymi komórkami dużymi, białaczki Iimfoblastycznej przewlekłej (CLL)/białaczki Iimfoblastycznej z komórkami małymi (SLL), chłoniaka z obwodowych komórek T i wtórnej skrobiawicy.
Przedmiotem wynalazku jest dodatkowo sposób wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25, który obejmuje:
- kontaktowanie próbki z przeciwciałem określonym w dowolnym spośród zastrz. 1-10 w warunkach pozwalających na tworzenie kompleksu pomiędzy przeciwciałem i CD25 i
- wykrywanie tworzenia kompleksu.
Wynalazek dostarcza również zestaw diagnostyczny do wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25, który obejmuje przeciwciało według wynalazku, przy czym przeciwciało jest ewentualnie połączone z wykrywalnym znacznikiem oraz instrukcje jego stosowania.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało antyidiotypowe wiążące przeciwciało według wynalazku.
Korzystnie, przeciwciało to wiąże się do przeciwciała, które ma regiony zmienne ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa obejmujące sekwencje aminokwasowe przedstawione, odpowiednio, w SEKW. NR ID.: 2 i 4, SEKW. NR ID.: 6 i 8, SEKW. NR ID.: 10 i 12, SEKW. NR ID.: 14 i 16.
Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania przeciwciała antyidiotypowego według wynalazku do wykrywania w próbce poziomu ludzkiego przeciwciała monoklonalnego wobec CD25.
Jeszcze kolejnym przedmiotem wynalazku jest wyizolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem na ludzkim CD25, jak przeciwciało zdefiniowane przez regiony zmienne ludzkiego ciężkiego łańcucha i ludzkiego lekkiego łańcucha kappa obejmujące sekwencje aminokwasowe przedstawione odpowiednio w SEKW. NR ID.: 6 i 8, SEKW. NR ID.: 14, SEKW. NR ID.: 2 i 4, SEKW. NR ID.: 10 i 12. 16.
Jak zaznaczono powyżej, przeciwciała według wynalazku obejmują przeciwciała IgG1 (np. IgG1,K i IgG1^) i lgG4 (np. lgG4,K i lgG4,A). Jednakże, w niniejszym opisie ujawnione są także i inne izotypy przeciwciał, w tym lgG2, lgG3, IgM, IgA1, lgA2, wydzielnicze IgA, IgD i IgE. W praktycznej realizacji wynalazku przeciwciała te mogą być całymi przeciwciałami lub ich fragmentami wiążącymi antygen, w tym przykładowo fragmentami Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, pojedynczym łańcuchem Fv (scFv) lub przeciwciałami bispecyficznymi. Ponadto, fragmenty wiążące antygen obejmują immunoPL 217 296 B1 globulinowe fuzje białkowe domeny wiążącej obejmujące: (i) polipeptyd domeny wiążącej (taki jak region zmienny łańcucha ciężkiego lub region zmienny łańcucha lekkiego) w fuzji z peptydem regionu zawiasowego immunoglobuliny, (ii) stały region CH2 łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w fuzji z regionem zawiasowym oraz (iii) stały region CH3 łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w fuzji ze stałym regionem CH2. Takie immunoglobulinowe fuzje białkowe domeny wiążącej są ponadto ujawnione w opisach patentowych USA nr 2003/0 118 592 i 2003/0 133 939. Konkretne przeciwciała ludzkie obejmują te określone jako AB1, AB7, AB11 i AB12, kodowane przez kwasy nukleinowe ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa, obejmujące sekwencje nukleotydowe ich regionów zmiennych przedstawione, odpowiednio, w SEKW. NR ID.: 1, 5, 9 lub 13 i SEKW. NR ID.: 3, 7, 11 lub 15 oraz ich konserwatywne modyfikacje sekwencji. Przeciwciała ludzkie charakteryzują się posiadaniem ludzkiego łańcucha ciężkiego i regionów zmiennych ludzkiego łańcucha lekkiego kappa, obejmujących sekwencje aminokwasowe przedstawione, odpowiednio, w SEKW. NR ID.: 2, 6, 10 lub 14 i SEKW. NR ID.: 4, 8, 12 lub 16 oraz ich konserwatywne modyfikacje sekwencji.
Zgodnie z niniejszym opisem określenie „tolerancyjne, oznacza, że komórki T nie są zdolne do reakcji z antygenem po ponownej prowokacji tym antygenem.
Ludzkie przeciwciała anty-CD25 według niniejszego wynalazku można przekształcać w pochodne, łączyć lub wspólnie wytwarzać z innymi właściwościami wiążącymi. W szczególnym wykonaniu, przeciwciała są połączone z jedną lub większą liczbą miejsc wiążących inny docelowy antygen, taki jak antygen na komórce efektorowej.
Zgodnie z jednym aspektów niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wykrywania in vitro lub in vivo obecności CD25 w próbce lub u osobnika, np. do diagnozowania chorób związanych z CD25, korzystnie we wczesnym stadium. Może być to także przydatne w monitorowaniu choroby i wpływu leczenia za pomocą przeciwciała anty-CD25 oraz w określaniu i dobieraniu dawki przeciwciała, jaka powinna być podana. W jednym wykonaniu, wykrywanie obecności CD25 w próbce odbywa się przez kontaktowanie badanej próbki, ewentualnie wraz z próbką kontrolną, z ludzkim przeciwciałem monoklonalnym według wynalazku w warunkach pozwalających na powstawanie kompleksu pomiędzy przeciwciałem i CD25. Następnie, wykrywane jest tworzenie kompleksu (np. przy użyciu ELISA, cytometrii przepływowej lub hybrydyzacji typu Western blot). Wówczas, gdy z badaną próbką stosowana jest próbka kontrolna, kompleks jest wykrywany w obu próbkach i statystycznie istotna różnica w powstawaniu kompleksu pomiędzy próbkami wskazuje na obecność CD25 w badanej próbce. Sposób in vivo można prowadzić przy użyciu techniki wizualizacji takich jak PET (ang. positron emission tomography) lub SPECT (ang. single photon emission computed tomography).
Przeciwciała antyidiotypowe według wynalazku można stosować jako narzędzie immunodiagnostyczne do wykrywania i ilościowego oznaczania poziomów ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciw CD25 w laboratorium lub próbkach od pacjenta. Może to być przydatne do egzaminowania farmakokinetyki przeciwciała anty-CD25 lub określania i dobierania dawki przeciwciała anty-CD25 oraz monitorowania choroby i wpływu leczenia na pacjenta.
Mysie przeciwciała antyidiotypowe można wytwarzać np. za pomocą immunizacji myszy Balb/C ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi według wynalazku i wytwarzania hybrydoma ze śledzion tych myszy przez fuzję z komórkami szpiczaka, takimi jak NSl przy użyciu standardowych technik.
Jak opisano przykładowo w niniejszym opisie, przeciwciała ludzkie według wynalazku można uzyskać bezpośrednio z hybrydoma, które wytwarzają przeciwciało lub można sklonować (np. z hybrydoma lub faga, który prezentuje części przeciwciał wiążące antygen) i wytworzyć za pomocą technik rekombinacji w komórce gospodarza (np. komórce CHO (komórki jajowe chomika chińskiego)). Dalszymi przykładami komórek gospodarza są mikroorganizmy, takie jak E. coli i grzyby, takie jak drożdże. Alternatywnie, można je wytworzyć za pomocą technik rekombinacji w transgenicznym zwierzęciu nie będącym człowiekiem lub w roślinie. Zatem, w innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza sposobów wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się z ludzkim CD25. W jednym z wykonań, sposób obejmuje immunizację transgenicznego zwierzęcia nie będącego człowiekiem, np. transgeniczną mysz, jak opisano wcześniej (np. posiadającą genom obejmujący transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i transgen ludzkiego łańcucha lekkiego kodujący całe przeciwciało anty-CD25 według wynalazku lub jego część), oczyszczonym antygenem CD25 lub preparatem wzbogaconym w ludzki antygen CD25 i/lub komórkami wyrażającymi ludzki CD25. Następnie, ze zwierzęcia uzyskiwane są komórki B (np. komórki B ze śledziony) i poddawane fuzji z komórkami szpiczaka w celu utworzenia unieśmiertelnionych komórek hybrydom, które wydzielają ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciw CD25.
PL 217 296 B1
Konkretne cechy i korzyści wynikające z niniejszego wynalazku staną się bardziej zrozumiałe dla specjalisty w dziedzinie po zapoznaniu z poniższym opisem i zastrzeżeniami.
Krótki opis rysunku
Na fig. 1 przedstawiono sekwencje aminokwasowe regionów VJ łańcucha lekkiego (kappa) ludzkich przeciwciał monoklonalnych AB1, AB7, AB11 i AB12 (SEKW. NR ID.: 4, 8, 12, i 16, odpowiednio) z zaprojektowanymi odcinkami CDR.
Na fig. 2 przedstawiono sekwencje aminokwasowe regionów VDJ łańcucha ciężkiego ludzkich przeciwciał monoklonalnych AB1, AB7, AB11 i AB12 (SEKW. NR ID.: 2, 6, 10 i 14, odpowiednio) z zaprojektowanymi odcinkami CDR.
Na fig. 3 przedstawiono sekwencję aminokwasową (SEKW. NR ID.: 2) i odpowiadającą sekwencję nukleotydową (SEKW. NR ID.: 1) regionu VDJ łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego AB1 z zaprojektowanymi odcinkami CDR.
Na fig. 4 przedstawiono sekwencję aminokwasową (SEKW. NR ID.: 4) i odpowiadającą sekwencję nukleotydową (SEKW. NR ID.: 3) regionu VJ łańcucha lekkiego (kappa) ludzkiego przeciwciała monoklonalnego AB1 z zaprojektowanymi odcinkami CDR.
Na fig. 5 przedstawiono sekwencję aminokwasową (SEKW. NR ID.: 6) i odpowiadającą sekwencję nukleotydową (SEKW. NR ID.: 5) regionu VDJ łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego AB7 z zaprojektowanymi odcinkami CDR.
Na fig. 6 przedstawiono sekwencję aminokwasową (SEKW. NR ID.: 8) i odpowiadającą sekwencję nukleotydową (SEKW. NR ID.: 7) regionu VJ łańcucha lekkiego (kappa) ludzkiego przeciwciała monoklonalnego AB7 z zaprojektowanymi odcinkami CDR.
Na fig. 7 przedstawiono sekwencję aminokwasową (SEKW. NR ID.: 10) i odpowiadającą sekwencję nukleotydową (SEKW. NR ID.: 9) regionu VDJ łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego AB11 z zaprojektowanymi odcinkami CDR.
Na fig. 8 przedstawiono sekwencję aminokwasową (SEKW. NR ID.: 12) i odpowiadającą sekwencję nukleotydową (SEKW. NR ID.: 11) regionu VJ łańcucha lekkiego (kappa) ludzkiego przeciwciała monoklonalnego AB11 z zaprojektowanymi odcinkami CDR.
Na fig. 9 przedstawiono sekwencję aminokwasową (SEKW. NR ID.: 14) i odpowiadającą sekwencję nukleotydową (SEKW. NR ID.: 13) regionu VDJ łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego AB12 z zaprojektowanymi odcinkami CDR.
Na fig. 10 przedstawiono sekwencję aminokwasową (SEKW. NR ID.: 16) i odpowiadającą sekwencję nukleotydową (SEKW. NR ID.: 15) regionu VJ łańcucha lekkiego (kappa) ludzkiego przeciwciała monoklonalnego AB12 z zaprojektowanymi odcinkami CDR.
Na fig. 11 przedstawiono wykres przedstawiający hamowanie wiązania IL-2 z jego receptorem,
CD25, przez supernatanty z ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi AB1, AB7, AB11 i AB12, w po® równaniu z hamowaniem wiązania IL-2 przez Zenapax® (daclizumab, zrekombinowane, humanizowane anty-CD25 przeciwciało IgG1, Roche).
®
Na fig. 12 przedstawiono wykres przedstawiający hamowanie wiązania Zenapax® z CD25 przez ludzkie przeciwciała monoklonalne AB1, AB7, AB11 i AB12.
Na fig. 13 przedstawiono wykres przedstawiający hamowanie proliferacji komórek T indukowanej przeciwciałem anty-CD3 (przy użyciu PBMC) przez ludzkie przeciwciała monoklonalne AB1, AB7, ®
AB12, w porównaniu z hamowaniem przez przeciwciało kontrolne (hlgGI/κ) i Zenapax .
Na fig. 14 przedstawiono wykres przedstawiający hamowanie MLR przez ludzkie przeciwciała monoklonalne AB1, AB7, AB12, w porównaniu z hamowaniem przez przeciwciało kontrolne (hlgGl/κ) i Zenapax®.
Na fig. 15 przedstawiono fotografie z membraną FITC obrazujące internalizację CD25 przez AB12 wyznakowane FITC. Fig. 15A przedstawia wynik dla komórek blastycznych T preinkubowanych z AB12 wyznakowanym FITC po 18 godz. inkubacji w 37C i fig. 15B przedstawia wynik dla komórek blastycznych T hodowanych przez 18 godz. w 37°C w obecności AB12 wyznakowanego FITC. Dla porównania, fig. 15C przedstawia wynik dla komórek blastycznych T hodowanych przez 18 godz. w 37°C w obecności izotypowego przeciwciała kontrolnego (anty-KHL) wyznakowanego FITC.
Na fig. 16 przedstawiono internalizację CD25 przez AB12 wyznakowane FITC mierzone w cytometrze przepływowym, gdzie poziom średniej siły fluorescencji (MFI) powyżej 1 wskazuje, że zaszła internalizacja. Fig. 16A przedstawia wynik dla komórek blastycznych T preinkubowanych z AB12 wyznakowanym FITC AB12, odpowiednio, w 4°C i 37°C i fig. 16B przedstawia wynik dla komórek blastycznych T hodowanych w obecności AB12 wyznakowanego FITC, odpowiednio, w 4°C i 37°C.
PL 217 296 B1
Szczegółowy opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dostarcza terapii opartych na przeciwciałach do leczenia i diagnozowania różnych zaburzeń chorobowych, w które zaangażowane są komórki wyrażające CD25. Terapie według wynalazku wykorzystują ludzkie przeciwciała monoklonalne, które swoiście wiążą się z epitopem obecnym na CD25. Przeciwciała takie obejmują wszystkie znane izotypy, np. przeciwciała IgA, lgG1-4, IgE, IgM i IgD.
W jednym z wykonań przeciwciałem jest IgG1, w szczególności izotypy IgG1 ,κ lub IgG1 ,λ. W innym wykonaniu przeciwciałem jest lgG3, w szczególności izotypy lgG3^ lub lgG3,...... W jeszcze innym wykonaniu przeciwciałem jest lgG4, w szczególności izotypy lgG4,K lub lgG4,.. W kolejnym innym wykonaniu przeciwciałem jest IgA1 lub lgA2. W jeszcze dalszym wykonaniu przeciwciałem jest IgM.
W jednym z wykonań, ludzkie przeciwciała są wytwarzane w zwierzęciu transgenicznym nie będącym człowiekiem, np. myszy transgenicznej, zdolnej do wytwarzania wielu izotypów ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciw CD25) dzięki rekombinacji V-D-J i zmianie izotypu. Takim zwierzęciem transgenicznym może być także królik wytwarzający przeciwciała poliklonalne, jak ujawniono w patencie USA nr 2003/0 017 534. Zatem, wynalazek także obejmuje ludzkie przeciwciała monoklonalne, które swoiście wiążą się z CD25. Zatem, aspekty według wynalazku obejmują nie tylko przeciwciała, fragmenty przeciwciał i ich kompozycje farmaceutyczne, lecz także zwierzęta transgeniczne nie będące człowiekiem, komórki B, transfektomy komórek gospodarza i hybrydomy, które wytwarzają przeciwciała monoklonalne. Dostarczane są także sposoby użycia przeciwciał według wynalazku do blokowania lub hamowania komórek wytwarzających CD25 i są one przydatne w leczeniu zaburzeń związanych z CD25. Wynalazek obejmuje sposoby użycia przeciwciał według wynalazku do wykrywania komórek wyrażających CD25.
W celu łatwiejszego zrozumienia niniejszego wynalazku zdefiniowane zostaną pewne terminy. Dodatkowe definicje przedstawione są w szczegółowym opisie.
Terminy „CD25 i „antygen CD25 są tu używane wymiennie i obejmują dowolne warianty, izoformy i homologi gatunkowe ludzkiego CD25, które są naturalnie wytwarzane przez komórki lub są wytwarzane na komórkach transfekowanych genem CD25. Specjaliści znają synonimy CD25, w tym antygen CD25, p55 i antygen Tac (aktywacji komórek T). Wiązanie przeciwciała według wynalazku z antygenem CD25 hamuje i/lub blokuje wiązanie CD25 z ligandem, IL-2, a tym samym jego funkcje w komórkowe. Przykładowo, w jednym z wykonań, przeciwciała ludzkie według wynalazku hamują proliferację komórek T indukowaną przeciwciałem anty-CD3. W innym wykonaniu, ludzkie przeciwciała monoklonalne hamują MLR.
W użytym tu znaczeniu, termin „hamuje wzrost (np. w odniesieniu do komórek) obejmuje jakiekolwiek możliwe do zmierzenia obniżenie wzrostu komórek, kiedy są kontaktowane przeciwciałem anty-CD25 w porównaniu ze wzrostem tych samych komórek bez kontaktu z przeciwciałem antyCD25, np. hamowanie wzrostu komórek o co najmniej około 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%,
80%, 90%, 99% lub 100%.
W użytym tu znaczeniu, terminy „hamuje wiązanie i „blokuje wiązanie (np. w odniesieniu do hamowania/blokowania wiązania IL-2 z CD25) są stosowane wymiennie i obejmują zarówno częściowe, jak całkowite hamowanie/blokowanie. Hamowanie/blokowanie wiązania IL-2 z CD25 korzystnie redukuje lub zmienia normalny poziom lub typ przekazywania sygnału komórkowego, który występuje, kiedy IL-2 wiąże się z CD25 bez hamowania lub blokowania. Hamowanie i blokowanie obejmują także jakiekolwiek możliwe do zmierzenia obniżenie powinowactwa wiązania IL-2 z CD25, kiedy jest kontaktowany z przeciwciałem anty-CD25 w porównaniu z ligandem, który nie jest kontaktowany z przeciwciałem anty-CD25, np. blokowanie wiązania IL-2 z CD25 o co najmniej około 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% lub 100%.
Termin „przeciwciało w użytym tu znaczeniu obejmuje niezmienione przeciwciała i ich dowolny fragment wiążący antygen (tzn. „część wiążącą antygen) lub pojedynczy łańcuch. „Przeciwciało odnosi się do glikoproteiny obejmującej co najmniej dwa łańcuchy ciężkie (H) i dwa łańcuchy lekkie (L) połączone wewnętrznie za pomocą mostków dwusiarczkowych lub jej części wiążącej antygen. Każdy łańcuch ciężki składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (w skrócie oznaczonego tu jako VK) i regionu stałego łańcucha ciężkiego. Każdy łańcuch lekki składa się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego (w skrócie oznaczonego tu jako VL) i regionu stałego łańcucha lekkiego. Regiony VH i VL można dalej podzielić na regiony hiperzmienne, zwane regionami determinującymi dopasowanie (CDR), rozmieszczone pomiędzy regionami bardziej konserwowanymi, zwanymi regionami zrębowymi (FR). Każdy VH i VL składa się z trzech regionów CDR i czterech FR, ułożonych od końca aminowego
PL 217 296 B1 do karboksylowego w następującym porządku: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Regiony zmienne łańcuchów ciężkiego i lekkiego zawierają domenę wiążącą, która oddziałuje z antygenem. Regiony stałe przeciwciał mogą pośredniczyć w wiązaniu immunoglobulin do tkanek lub czynników gospodarza, w tym do różnych komórek systemu odpornościowego (np. komórek efektorowych) i pierwszego składnika (Clq) klasycznego układu dopełniacza.
Termin „część przeciwciała wiążąca antygen (lub po prostu „część przeciwciała) w użytym tu znaczeniu, odnosi się do jednego lub większej liczby fragmentów przeciwciała, które zachowują zdolność swoistego wiązania antygenu (np. CD25). Pokazano, że funkcja przeciwciała wiązania antygenu może być pełniona przez fragmenty niezmienionego przeciwciała lub przeciwciała o pełnej długości. Przykłady fragmentów wiążących objęte terminem „część przeciwciała wiążąca antygen obejmują: (i) fragment Fab, jednowalentny fragment składający się z domen VL, VH, CL i CH1, (ii) fragment F (ab')2, biwalentny fragment obejmujący dwa fragmenty Fab połączone mostkiem dwusiarczkowym w regionie zawiasowym, (iii) fragment Fd składający się z domen VH i CH1, (iv) fragment Fv składający się z domeny VL i VH, (v) fragment dAb (Ward i wsp., (1989) Nature 341: 544-546), składający się z domeny VH, (vi) wyizolowany region determinujący dopasowanie (CDR) i (vii) kombinację dwóch lub większej liczby wyizolowanych regionów CDR, które mogą być ewentualnie połączone syntetycznym łącznikiem. Ponadto, pomimo, że obie domeny fragmentu Fv, VL i VH, są kodowane przez oddzielne geny można je połączyć przy użyciu technik rekombinacji, przez syntetyczny łącznik, który umożliwia utworzenie z nich pojedynczego łańcucha białkowego, w którym pary regionów VL i VH tworzą monowalentne cząsteczki (znane jako pojedynczy łańcuch Fv (scFv), patrz np. Bird i wsp. (1988) Science 242: 423-426, i Huston i wsp. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Takie przeciwciała o pojedynczym łańcuchu są także objęte terminem „część przeciwciała wiążąca antygen. Dalszym przykładem są immunoglobulinowe fuzje białkowe domeny wiążącej obejmujące (i) polipeptydową domenę wiążącą w fuzji z polipeptydowym regionem zawiasowym immunoglobuliny, (ii) region stały CH2 łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w fuzji z regionem zawiasowym oraz (iii) region stały CH3 łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w fuzji z regionem stałym CH2. Polipeptydową domeną wiążącą może być region zmienny łańcucha ciężkiego lub region zmienny łańcucha lekkiego.
Fuzje białkowe domeny wiążącej są dalej ujawnione w patentach USA nr 2003/0 118 592 i 2003/0 133 939. Te fragmenty przeciwciał są uzyskane przy użyciu klasycznych technik znanych specjalistom i są przebadane pod kątem tego czy ich użyteczność jest taka sama jak niezmienionych przeciwciał.
Termin „epitop oznacza determinantę białkową zdolną do swoistego wiązania przeciwciała. Epitopy zazwyczaj składają się z chemicznie aktywnych powierzchniowych zgrupowań cząsteczek, takich jak aminokwasowe lub cukrowe łańcuchy boczne i zazwyczaj charakteryzują się specyficzną strukturą trójwymiarową, jak również specyficznym ładunkiem. Epitopy mogą być konformacyjne i niekonforrnacyjne, rozróżniane ma podstawie tego, że następuje utrata zdolności wiązania z tymi pierwszymi, lecz nie z tymi drugimi, po działaniu rozpuszczalnikami denaturującymi.
Termin „cząsteczka bispecificzna obejmuje dowolny czynnik, np. białko, peptyd, lub kompleks białkowy czy peptydowy, który posiada dwie różne swoistości wiązania. Przykładowo, cząsteczka może wiązać się z lub oddziaływać z (a) antygenem powierzchniowym komórki i (b) receptorem dla fragmentu Fe na powierzchni komórki efektorowej.
Termin „cząsteczka multispecyficzna lub „cząsteczka heterospecyficzna obejmuje dowolny czynnik, np. białko, peptyd lub kompleks białkowy, czy peptydowy, który posiada dwie różne swoistości wiązania. Przykładowo, cząsteczka może wiązać się z lub oddziaływać z (a) antygenem powierzchniowym komórki i (b) receptorem dla fragmentu Fc na powierzchni komórki efektorowej oraz (c) co najmniej jednym innym składnikiem. Zatem, wynalazek obejmuje, przy czym nie jest do nich ograniczony, bispecyficzne, trój specyficzne, tetraspecyficzne i inne multispecyficzne cząsteczki skierowane przeciw CD25 i innym miejscom docelowym, takim jak receptory dla fragmentu Fc na komórkach receptorowych.
Termin „przeciwciała bispecyficzne obejmuje także diciała (ang. diabodies). Diciała są biwalentnymi, bispecyficznymi przeciwciałami, w których domeny VH i VL są wytwarzane na pojedynczym łańcuchu polipeptydowym, lecz przy użyciu takiego łącznika, który jest zbyt krótki, aby mogło następować parowanie pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha, co forsuje parowanie domen komplementarnych z różnych łańcuchów i powstawanie dwóch miejsc wiążących antygen (patrz, np. Holliger, P. i wsp. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, Poljak, R. J. i wsp. (1994) Structure 2: 1121-1123).
PL 217 296 B1
Termin „pochodne ludzkiego przeciwciała dotyczy dowolnej zmodyfikowanej formy przeciwciała, np. koniugatu przeciwciała i innego czynnika lub przeciwciała.
Termin „ludzkie przeciwciało w użytym tu znaczeniu obejmuje przeciwciała posiadające region zmienny i stały z sekwencji ludzkich immunoglobulin linii zarodkowej. Przeciwciała ludzkie według wynalazku mogą także obejmować reszty aminokwasowe nie kodowane przez sekwencje ludzkich immunoglobulin linii zarodkowej (np. mutacje wprowadzone przez losową lub ukierunkowaną mutagenezę in vitro lub mutacje somatyczne in vivo). Chociaż termin „ludzkie przeciwciało w użytym tu znaczeniu nie obejmuje przeciwciał, w których do sekwencji ludzkiego zrębu zostały wszczepione sekwencje CDR pochodzące z linii zarodkowej innych gatunków ssaków, takich jak mysz.
Terminy „przeciwciało monoklonalne lub „kompozycja przeciwciała monoklonalnego w użytym tu znaczeniu dotyczy preparatu cząsteczek przeciwciał o jednej kompozycji molekularnej. Kompozycja przeciwciała monoklonalnego wykazuje pojedynczą specyficzność wiązania i powinowactwo do określonego epitopu. Zatem, termin „ludzkie przeciwciało monoklonalne dotyczy przeciwciał wykazujących pojedynczą specyficzność wiązania, które posiadają region zmienny i stały pochodzący z sekwencji ludzkich immunoglobulin linii zarodkowej. W jednym z wykonań, ludzkie przeciwciała monoklonalne są wytwarzane przez hybrydomę, która obejmuje komórkę B uzyskaną z transgenicznego lub transchromosomalnego zwierzęcia nie będącego człowiekiem, np. transgenicznej myszy, posiadającego genom obejmujący transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i transgen łańcucha lekkiego w fuzji z unieśmiertelnioną komórką.
Termin „zrekombinowne przeciwciało ludzkie, w użytym tu znaczeniu, obejmuje wszystkie ludzkie przeciwciała, które są przygotowane, wytworzone, stworzone lub wyizolowane technikami rekombinacji, takie jak (a) przeciwciała wyizolowane ze zwierzęcia (np. myszy), które jest transgeniczne lub transchromosomalne pod względem ludzkich genów immunoglobulinowych lub z utworzonej z nich hybrydomy (opisane dalej w sekcji I, poniżej), (b) przeciwciała wyizolowane z komórki gospodarza stransformowanej w celu wytwarzania przeciwciała, np. z transfektomy, (c) przeciwciała wyizolowane ze zrekombinowanej, kombinatorycznej biblioteki ludzkich przeciwciał oraz (d) przeciwciała przygotowane, wytworzone, stworzone lub wyizolowane dowolnymi sposobami z udziałem składania sekwencji genów ludzkich immunoglobulin z innymi sekwencjami DNA. Takie zrekombinowane przeciwciała ludzkie posiadają region zmienny i stały pochodzący z sekwencji ludzkich immunoglobulin linii zarodkowej. Jednakże w pewnych wykonaniach, takie zrekombinowane ludzkie przeciwciała można poddać mutagenezie in vitro (lub kiedy stosowane jest zwierzę transgeniczne dla sekwencji ludzkich Ig, mutagenezie somatycznej in vivo) i w związku z czym sekwencje aminokwasowe regionów VH i VL zrekombinowanych przeciwciał są sekwencjami, które pomimo, że pochodzą od i są pokrewne sekwencjom VL i VH ludzkiej linii zarodkowej, mogą nie występować naturalnie wśród zestawu ludzkich immunoglobulin linii zarodkowej in vivo.
Termin „transfektoma w użytym tu znaczeniu obejmuje zrekombinowane komórki eukariotycznego gospodarza wytwarzające przeciwciało, takie jak komórki CHO, komórki NS/0, komórki HEK293, komórki roślinne lub grzybowe, w tym komórki drożdży.
W użytym tu znaczeniu „przeciwciało heterologiczne jest określone w odniesieniu do nie będącego człowiekiem organizmu transgenicznego wytwarzającego takie przeciwciało. Termin ten dotyczy przeciwciała posiadającego sekwencję aminokwasową lub kodowanego przez odpowiadającą sekwencję nukleotydową znalezioną w organizmie, który nie jest transgenicznym zwierzęciem nie będącym człowiekiem i zazwyczaj pochodzącą z gatunku innego niż transgeniczne zwierzę nie będące człowiekiem.
„Wyizolowane przeciwciało w użytym tu znaczeniu odnosi się do przeciwciała, które jest zasadniczo wolne od innych przeciwciał posiadających odmienne antygenowe swoistości (np. wyizolowane przeciwciało, które swoiście wiąże CD25 jest zasadniczo wolne od przeciwciał, które swoiście wiążą antygeny inne niż CD25). Wyizolowane przeciwciało, które swoiście wiąże epitop, izoformę lub wariant ludzkiego CD25 może, jednakże, reagować krzyżowo z innymi pokrewnymi antygenami, np. z innych gatunków (np. homologami gatunkowymi CD25). Ponadto, wyizolowane przeciwciało może być zasadniczo wolne od innego materiału komórkowego i/lub związków chemicznych. W jednym z wykonań według wynalazku, kombinacja „wyizolowanych przeciwciał monoklonalnych posiadających różne swoistości jest połączona w dobrze zdefiniowaną kompozycję.
W użytym tu znaczeniu „wiązanie swoiste dotyczy wiązania przeciwciała do określonego antygenu. Zazwyczaj, przeciwciało wiąże się z powinowactwem odpowiadającym KD o około 10-8 M lub
-9 -10 -11 mniej, jak około 10-9 M, lub mniej, około 10-10 M, lub mniej lub około 10-11 M, lub jeszcze mniej, kiedy
PL 217 296 B1 jest określana za pomocą rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) w urządzeniu BIAcore 3000 przy użyciu zrekombinowanego IL-2Ra jako liganda i przeciwciała jako składnika oznaczanego i wiąże się z określonym antygenem z powinowactwem odpowiadającym KD, która jest co najmniej 10 razy niższa, korzystnie co najmniej 100 razy niższa, niż jej powinowactwo wiązania z niespecyficznym antygenem (np. BSA, kazeina) innym niż określony antygen lub blisko spokrewniony antygen. Zwroty „przeciwciało rozpoznające antygen i „przeciwciało swoiste wobec antygenu są stosowane tu zamiennie z terminem „przeciwciało, które wiąże swoiście antygen.
Termin „kd (sec-1) w użytym tu znaczeniu odnosi się do stałej szybkości równowagi reakcji dysocjacji dla określonej reakcji przeciwciało-antygen. Omawiana wartość jest także określana jako wartość koff.
-1 -1
Termin „ka (M-1 x sec-1) w użytym tu znaczeniu odnosi się do stałej szybkości równowagi reakcji asocjacji dla określonej reakcji przeciwciało-antygen.
Termin „KD (M) w użytym tu znaczeniu stałej odnosi się do stałej równowagi reakcji dysocjacji dla określonej reakcji przeciwciało-antygen.
Termin „KA (M-1) w użytym tu znaczeniu odnosi się do stałej równowagi reakcji asocjacji dla określonej reakcji przeciwciało-antygen i jest uzyskiwana przez podzielenie ka przez kd.
W użytym tu znaczeniu, „izotyp odnosi się do klasy przeciwciała (np. IgM lub IgG1), która jest kodowana przez geny regionu stałego łańcucha ciężkiego.
W użytym tu znaczeniu „zmiana izotypu odnosi się do zjawiska, dzięki któremu klasa lub izotyp przeciwciała zmienia się z jednej klasy Ig w inne klasy Ig.
W użytym tu znaczeniu „nie zmieniony izotyp odnosi się do klasy izotypowej łańcucha ciężkiego, która jest wytwarzana, kiedy nie zachodzi zmiana izotypu, gen CH kodujący nie zmieniony izotyp jest zazwyczaj pierwszym genem CH bezpośrednio poniżej funkcjonalnie przereanżowanego genu VDJ. Zmiana izotypu może być klasyczną i nie klasyczną zmianą izotypu. Klasyczna zmiana izotypu pojawia się dzięki zdarzeniom rekombinacji, które wymagają co najmniej jednego regionu sekwencji przełącznikowej biorącego udział w przestawieniu w transgenie. Nie klasyczna zmiana izotypu może, przykładowo, pojawić się dzięki rekombinacji homologicznej pomiędzy ludzką σμ i ludzką εμ (delecja związana z δ). Alternatywnie, mogą wystąpić mechanizmy nie klasycznej zmiany, takie jak, między innymi, rekombinacja intertransgenowa i/lub interchromosomowa i spowodować zmianę izotypu.
W użytym tu znaczeniu termin „sekwencja biorąca udział w zmianie dotyczy sekwencji DNA odpowiedzialnych za rekombinację dających zmianę. Sekwencją „donorową zmiany, zazwyczaj region zmiany μ, będzie sekwencja 5' (tzn. powyżej) regionu konstruktu, który ma ulec delecji podczas rekombinacji. Region „akceptorowy zmiany będzie pomiędzy regionem konstruktu, który ma ulec delecji i regionem stałym do wymiany (np. γ, ε, etc.).
W użytym tu znaczeniu „wzór glikozylacji określony jest jako wzór jednostek węglowodanowych, które są kowalencyjnie połączone z białkiem, bardziej konkretnie białkiem immunoglobuliny (przeciwciała). Wzór glikozylacji przeciwciała heterologicznego można scharakteryzować jako zasadniczo podobny do wzorów glikozylacji, które występują naturalnie na przeciwciałach wytwarzanych przez gatunek zwierzęcia transgenicznego nie będącego człowiekiem, gdzie specjalista w dziedzinie zauważy, że wzór glikozylacji przeciwciała heterologicznego przypomina bardziej wzór glikozylacji dla gatunku zwierzęcia transgenicznego nie będącego człowiekiem niż dla gatunku, z którego pochodzą geny CH transgenu.
Termin „występujący naturalnie w użytym tu znaczeniu zastosowanym wobec przedmiotu odnosi się do faktu, że przedmiot można znaleźć w przyrodzie. Przykładowo, naturalnie występującą jest sekwencja polipeptydowa lub polinukleotydowa obecna w organizmie (także w wirusach), którą można wyizolować z naturalnego źródła i która nie została w sposób zamierzony zmodyfikowana przez człowieka w laboratorium.
Termin „przerearanżowany w użytym tu znaczeniu odnosi się do konfiguracji locus łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego immunoglobuliny, w którym segment V leży w miejscu bezpośrednio przylegającym do segmentu D-J lub J w konformacji kodującej, odpowiednio, zasadniczo całą domenę VH lub VL. Przerearanżowany locus genu immunoglobuliny (przeciwciała) będzie zidentyfikowany przez porównanie z DNA linii pierwotnej, przerearanżowany locus będzie posiadał co najmniej jeden zrekombinowany heptamerowy/nonamerowy element homologiczny.
Termin „nieprzerearanżowany lub „konfiguracja linii pierwotnej w użytym tu znaczeniu w odniesieniu do segmentu V określa konfigurację, w której segment V nie uległ rekombinacji tak, aby bezpośrednio przylegać do segmentu D lub J.
PL 217 296 B1
Termin „cząsteczka kwasu nukleinowego, w użytym tu znaczeniu obejmuje cząsteczki DNA i cząsteczki RNA. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być jednoniciowa lub dwuniciowa, choć korzystnie jest dwuniciowym DNA.
Termin „wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego w użytym tu znaczeniu, w zastosowaniu do kwasów nukleinowych kodujących cale przeciwciała lub części przeciwciał (np. VH, VL, CDR3), które wiążą CD25, odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego, w którym sekwencje nukleotydowe kodujące niezmienione przeciwciało lub część przeciwciała są wolne od innych sekwencji kodujących całe przeciwciała lub części przeciwciał, które wiążą się z innymi antygenami niż CD25, gdzie inne sekwencje mogą naturalnie otaczać kwas nukleinowy w ludzkim DNA genomowym. W jednym z wykonań, ludzkie przeciwciało anty-CD25 zawiera zmienne regiony aminokwasowe łańcuch ciężkiego (VH) i łańcucha lekkiego (VL) z AB1, AB7, AB11 lub AB12 kodowane przez sekwencje nukleotydowe przedstawione, odpowiednio, w SEKW. NR ID.: 1, 5, 9 lub 13 i SEKW. NR ID.: 3, 7, 11 lub 15.
Jak tu ujawniono i zastrzeżono, sekwencje przedstawione w SEKW. NR ID.: 1-40 obejmują „konserwatywne modyfikacje sekwencji tzn. modyfikacje sekwencji nukleotydowej i aminokwasowej, które nie zaburzają lub zmieniają w sposób znaczący właściwości wiązania przeciwciała kodowanego przez sekwencję nukleotydową lub zawierającego sekwencję aminokwasową. Takie konserwatywne modyfikacje sekwencji obejmują podstawienia nukleotydowe i aminokwasowe, addycje i delecje. Modyfikacje można wprowadzić do sekwencji SEKW. NR ID.: 1-40 za pomocą standardowych technik znanych w dziedzinie, takich jak ukierunkowana mutageneza i mutageneza za pośrednictwem PCR. Konserwatywne podstawienia aminokwasowe obejmują te, w których reszta aminokwasowa jest wymieniona resztą aminokwasową posiadającą podobny łańcuch boczny. Zdefiniowano rodziny reszt aminokwasowych posiadające podobne łańcuchy boczne. Rodziny te obejmują aminokwasy z zasadowymi łańcuchami bocznymi (np. lizyna, arginina, histydyna), kwaśnymi łańcuchami bocznymi (np. kwas asparaginowy, kwas glutaminowy), polarnymi bez ładunku łańcuchami bocznymi (np. glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina, tryptofan), niepolarnymi łańcuchami bocznymi (np. alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina), łańcuchami bocznymi z rozgałęzieniem beta (np. treonina, walina, izoleucyna) i aromatycznymi łańcuchami bocznymi (np. tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna). Zatem, określona nieistotna reszta aminokwasowa w ludzkim przeciwciele anty-CD25 jest korzystnie wymieniona przez resztę aminokwasową z tej samej rodziny łańcucha bocznego.
Niniejszy wynalazek także obejmuje „pochodne sekwencji aminokwasowych przedstawionych w SEKW. NR ID.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 i 17-40 i konserwatywne modyfikacje tych sekwencji, gdzie jedna lub większa liczba reszt aminokwasowych jest zmieniona, np. przez acylację lub glycozylację, bez znaczącego zaburzenia lub zmiany właściwości wiązania przeciwciała z CD25.
Ponadto, niniejszy wynalazek obejmuje przeciwciała, w których jedną lub większą liczbę zmian wprowadzono do regionu Fc w celu zmiany funkcjonalnych lub farmakokinetycznych właściwości przeciwciał. Zmiany takie mogą prowadzić do zmniejszenia lub zwiększenia wiązania Clq i wiązania CDC lub FcyR cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC). Substytucje można przykładowo wprowadzić w jednej lub większej liczbie reszt aminokwasowych 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 i 322 regionu stałego łańcucha ciężkiego, powodując tym samym zmianę funkcji efektorowych przy jednoczesnym zachowaniu wiązania z antygenem w porównaniu z przeciwciałem niezmodyfikowanym, porównaj patenty USA nr 5 624 821 i nr 5 648 260. Ponadto, jako referencje należy podać WO nr 00/42 072 ujawniający przeciwciała ze zmienionymi regionami Fc, które zwiększają ADCC i WO nr 94/29 351 ujawniający przeciwciała z mutacjami w regionie końca N domeny CH2, które zmieniają zdolność przeciwciał do wiązania FcRI i tym samym obniżają zdolność przeciwciał do wiązania z Clq, co z kolei obniża zdolność przeciwciał do wiązania dopełniacza. Ponadto, Shields i wsp., J. Biol. Chem. (2001) 276: 6591-6604 przedstawili kombinacje wariantów, np. T256A/S298A, S298A/E333A, i S298A/E333A/K334A, które polepszają wiązanie FcyRIII.
Okres półtrwania przeciwciał in vivo można także poprawić modyfikując ratunkowy receptorowy epitop domeny stałej z cząsteczki Ig lub domeny stałej z cząsteczki typu Ig tak, że cząsteczka nie obejmuje niezmienionej domeny CH2 lub niezmienionego regionu Fc z Ig, porównaj patenty USA nr 6 121 022 i nr 6 194 551. Okres półtrwania in vivo można ponadto zwiększyć przez wytworzenie mutacji w regionie Fc, np. przez podstawie nie treoniny za leucynę w pozycji 252, treoniny za serynę w pozycji 254 lub treoniny za fenyloalaninę w pozycji 256, porównaj patent USA nr 6 277 375.
Ponadto, wzór glikozylacji przeciwciał można zmodyfikować w celu zmiany efektorowej funkcji przeciwciał. Przykładowo, przeciwciała można wytwarzać w transfektomie, w której nie następuje do14
PL 217 296 B1 danie jednostki fruktozy normalnie przyłączonej do węglowodanu przyłączonego do Asn w pozycji 297 z Fc, w celu wzmocnienia powinowactwa Fc do FcyRIII, co z kolei prowadzi do zwiększenia ADCC przeciwciał w obecności komórek NK, porównaj Shield i wsp. (2002) J. Biol. Chem., 277: 26733. Ponadto, modyfikację glikozylacji można przeprowadzić w celu zmodyfikowania CDC. Dalszą referencją może być WO nr 99/54 342 oraz Umana i wsp., Nat. Biotechnol. (1999) 17: 176 ujawniające linię komórek CHO skonstruowaną dla wytworzenia GntIII, dzięki czemu dochodzi do wytworzenia przeciwciał monoklonalnych ze zmienionymi glikoformami i polepszoną aktywnością ADCC.
Ponadto, fragment przeciwciała, np. fragmenty Fab, według wynalazku można pegylować w celu zwiększenia okresu półtrwania. Można to przeprowadzić przez znane specjalistom reakcje pegilacji, jak opisano przykładowo w Focus on Growth Factors (1992) 3: 4-10, EP nr 154 316 i EP nr 401 384.
Alternatywnie, w innym wykonaniu, mutacje można wprowadzić losowo w całej lub w części sekwencji kodującej przeciwciało anty-CD25, takie jak przy pomocy mutagenezy wysycanej i uzyskane zmodyfikowane przeciwciała anty-CD25 można badać pod kątem aktywności wiązania.
Zatem, przeciwciała kodowane przez ujawnione tu sekwencje nukleotydowe (regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i lekkiego) i/lub posiadające ujawnione tu sekwencje aminokwasowe (regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i lekkiego) (tzn. SEKW. NR ID.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 i 17-40) obejmują zasadniczo podobne przeciwciała kodowane przez lub posiadające podobne sekwencje, które zostały konserwatywnie zmodyfikowane. Poniżej dostarczona jest dalsza dyskusja na temat tego jak można wytwarzać takie zasadniczo podobne przeciwciała na podstawie częściowych sekwencji (tzn. regionów zmiennego łańcucha ciężkiego i lekkiego) ujawnionych tu jako SEKW. NR ID.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 i 17-40.
Dla sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych, termin „homologia wskazuje poziom identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami kwasów nukleinowych lub aminokwasowymi, wówczas gdy są optymalnie przyrównane i porównane z odpowiednimi wstawkami lub delecjami. Alternatywnie, zasadnicza homologia istnieje, kiedy segmenty DNA będą hybrydyzować w warunkach selektywnej hybrydyzacji z nicią komplementarną. Odsetek identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami jest funkcją liczby identycznych pozycji dla tych sekwencji (tzn. % homologii = liczba identycznych pozycji/całkowitej liczby pozycji x 100), przy uwzględnieniu liczby przerw i długość każdej przerwy, które trzeba koniecznie konieczne dla optymalnego przyrównania danych dwóch sekwencji. Porównanie tych sekwencji i ustalenie odsetka identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami można uzyskać przy użyciu algorytmu matematycznego, jak opisano w poniżej przykładach, które nie ograniczają omawianego zagadnienia.
Odsetek identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami nukleotydowymi można określić przy użyciu programu GAP w pakiecie oprogramowania GCG (dostępnym w http://www.gcg.com), przy użyciu macierzy NVSgapdna.CMP i wagi związanej z wprowadzeniem przerwy równej 40, 50, 60, 70 lub 80 oraz wagi związanej z wydłużaniem przerwy równej 1, 2, 3, 4, 5 lub 6. Odsetek identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami nukleotydowymi lub aminokwasowymi można określić także wykorzystując algorytm E. Meyersa i W. Millera (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)), który został wprowadzony do programu ALIGN (wersja 2.0), z użyciem tabeli wagi reszty PAM120, kary za wydłużanie przerwy równej 12 i kary za wprowadzenie przerwy równej 4. Dodatkowo, odsetek identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami aminokwasowymi można określić przy użyciu algorytmu Needlemana i Wunscha (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)), który jest wprowadzony do programu GAP w pakiecie oprogramowania GCG (dostępnym w http://www.gcg.com), z zastosowaniem macierzy Blossum 62 lub macierzy PAM250 i wagi związanej z wprowadzeniem przerwy równej 16, 14, 12, 10, 8, 6 lub 4 oraz wagi związanej z wydłużaniem przerwy równej 1, 2, 3, 4, 5 lub 6.
Sekwencje kwasu nukleinowego i białka według niniejszego wynalazku można następnie stosować jako „sekwencję zadaną do przeprowadzania przeszukiwania publicznych baz danych, przykładowo, w celu zidentyfikowania sekwencji pokrewnych. Takie przeszukiwanie można przeprowadzić przy użyciu programów NBLAST i XBLAST (wersja 2.0) według Altschula i wsp. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. W celu znalezienia sekwencji nukleotydowych homologicznych do cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku można prowadzić przeszukiwania sekwencji nukleotydowych za pomocą programu BLAST, stosując program NBLAST, przy wartości wyniku = 100, długości słowa = 12. W celu znalezienia sekwencji aminokwasowych homologicznych do cząsteczek białka według wynalazku można prowadzić przeszukiwania sekwencji białkowych za pomocą programu BLAST, stosując program XBLAST, przy wartości wyniku = 50, długości słowa = 3. Dla uzyskania przyrównania z przerwami dla celów porównawczych można wykorzystać program Gapped BLAST, jak opisano
PL 217 296 B1 w Altschul i wsp., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402. Przy wykorzystaniu programów BLAST i Gapped BLAST, można zastosować parametry kary dla odpowiednich programów (np. XBLAST i NBLAST), patrz http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Kwasy nukleinowe mogą być obecne w całych komórkach, w lizacie komórkowym lub w formie częściowo lub zasadniczo oczyszczonej. Kwas nukleinowy jest „wyizolowany lub „zasadniczo oczyszczony wówczas, gdy jest oddzielony od innych składników komórkowych lub innych zanieczyszczeń, np. innych komórkowych kwasów nukleinowych lub białek, za pomocą standardowych technik, jak działanie roztworu alkałicznego/SDS, wirowanie w gradiencie CsCl, chromatografia kolumnowa, elektroforeza w żelu agarozowym i inne techniki dobrze znane w dziedzinie, patrz F. Ausubel, i wsp., wyd. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing i Wiley Interscience, New York (1987).
W celu dostarczenia sekwencji genów kompozycje kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, najczęściej w postaci natywnej sekwencji (z wyjątkiem zmodyfikowanych miejsc restrykcyjnych i temu podobnych) z cDNA, DNA genomowego lub ich mieszanin, można mutować zgodnie ze standardowymi technikami. Jeśli jest pożądane w sekwencjach kodujących mutacje te mogą zaburzać sekwencję aminokwasową. W szczególności rozpatrywane są sekwencje DNA zasadniczo homologiczne do lub pochodzące z V, D, J, stałych, zmienionych i innych takich jakie tu opisano sekwencji (gdzie „pochodne oznacza, że sekwencja jest identyczna lub powstała w wyniku modyfikacji innej sekwencji).
Kwas nukleinowy jest „funkcjonalnie połączony, kiedy jest umieszczony w funkcjonalnej zależności z sekwencją innego kwasu nukleinowego. Na przykład, promotor lub enhancer jest funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą, jeśli wpływa na transkrypcję sekwencji. W odniesieniu do sekwencji regulacyjnych transkrypcji funkcjonalnie połączony oznacza, że sekwencje DNA są połączone w sposób ciągły i kiedy to konieczne dla połączenia dwóch regionów kodujących białko w sposób ciągły i w zgodnej ramce odczytu. Dla sekwencji zmiany, funkcjonalnie połączony oznacza, że sekwencje są zdolne do udziału w rekombinacji prowadzącej do zmiany.
Termin „wektor w użytym tu znaczeniu odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do transportowania innego kwasu nukleinowego, z którym jest połączona. Jednym z typów wektora jest „plazmid, który odnosi się do kolistej, dwuniciowej pętli DNA, do której mogą być dołączone przez ligację dodatkowe segmenty DNA. Innym typem wektora jest wektor wirusowy, gdzie dodatkowe segmenty DNA mogą być włączone przez ligację do genomu wirusowego. Pewne wektory są zdolne do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza, do której są wprowadzone (np. bakteryjne wektory o bakteryjnym miejscu startu replikacji i episomalne wektory ssacze). Inne wektory (np. nie episomalne wektory ssacze) można wprowadzać do genomu komórki gospodarza i tym samym podlegają one replikacji wraz z genomem gospodarza. Ponadto, pewne wektory są zdolne do bezpośredniej ekspresji genów, z którymi są one funkcjonalnie połączone. Wektory takie określa się tu jako „rekombinacyjne wektory ekspresyjne (lub po prostu „wektory ekspresyjne). Zasadniczo, wektory ekspresyjne do wykorzystania w technikach rekombinacji DNA często mają formę plazmidów. W niniejszej specyfikacji, „plazmid i „wektor mogą być stosowane zamiennie, jako że plazmid jest powszechnie stosowaną formą wektora. Chociaż, wynalazek obejmuje też inne formy wektorów ekspresyjnych, takie jak wektory wirusowe (np. defektywne pod względem replikacji retrowirusy, adenowirusy i wirusy towarzyszące adenowirusom), które niosą równoważne funkcje.
Termin „zrekombinowana komórka gospodarza (lub po prostu „komórka gospodarza) w użytym tu znaczeniu odnosi się do komórki, do której wprowadzono zrekombinowany wektor ekspresyjny. Powinno być jasne, że terminy te odnoszą się nie tylko do określonej komórki osobnika lecz także do potomstwa takiej komórki. Ponieważ w kolejnych pokoleniach mogą pojawić się pewne modyfikacje w następstwie mutacji lub wpływu środowiska, takie potomstwo może nie być, w rzeczywistości, identyczne z komórką rodzicielską, lecz nadal jest objęte zakresem terminu „komórka gospodarza w użytym tu znaczeniu. Zrekombinowane komórki gospodarza obejmują, przykładowo, transfektomy, takie jak komórki CHO i komórki NS/O.
W użytym tu znaczeniu, termin „osobnik obejmuje człowieka lub dowolne zwierzę nie będące człowiekiem. Termin „zwierzę nie będące człowiekiem obejmuje wszystkie kręgowce, np. ssaki i nie będące ssakami, takie jak naczelne nie będące człowiekiem, owca, pies, krowa, kury, płazy, gady itp.
Termin „zwierzę transgeniczne nie będące człowiekiem odnosi się do zwierzęcia nie będącego człowiekiem, które posiada genom obejmujący jeden lub większą liczbę transgenów lub transchromosomów ludzkiego łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego (zarówno zintegrowanych lub nie zintegrowanych
PL 217 296 B1 z naturalnym genomowym DNA zwierzęcia) i które jest zdolne do wytwarzania w pełni ludzkich przeciwciał. Przykładowo, mysz transgeniczna może posiadać transgen ludzkiego łańcucha lekkiego i transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego lub transchromosom ludzkiego łańcucha ciężkiego tak, że mysz wytwarza ludzkie przeciwciała anty-CD25 kiedy jest immunizowana antygenem CD25 i/lub komórkami wyrażającymi CD25. Transgen i/lub transchromosom ludzkiego łańcucha ciężkiego i lekkiego może być zintegrowany z DNA chromosomalnym myszy lub może być utrzymywany poza chromosomem. Takie myszy transgeniczne i transchromosomalne (wspólnie określane tu jako „myszy transgeniczne) są zdolne do wytwarzania wielu izotypów ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciw CD25 (np. IgG, IgA, IgM, IgD i/lub IgE) dzięki rekombinacji V-D-J i zmianie izotypu. Zwierzęta transgeniczne nie będące człowiekiem można także stosować do wytwarzania swoistego przeciwciała anty-CD25 przez wprowadzenie genów kodujących swoiste przeciwciało anty-CD25, przykładowo przez funkcjonalne połączenie genów z genem, który jest eksprymowany w mleku zwierzęcia.
W podrozdziałach poniżej opisano różne aspekty według wynalazku.
I. Wytwarzanie ludzkiego przeciwciała przeciw CD25
Ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku można wytwarzać różnorodnymi technikami, w tym klasycznymi metodami dla przeciwciał monoklonalnych, np. standardową techniką hybrydyzacji komórek somatycznych według Kohlera i Milsteina, Nature 256: 495 (1975). Chociaż, procedury hybrydyzacji komórek somatycznych są korzystne, w szczególności, można wykorzystać inne techniki wytwarzania przeciwciał monoklonalnych, np. transformację wirusem lub onkogenem limfocytów B lub techniki prezentacji na fagu przy użyciu bibliotek z genów dla ludzkich przeciwciał.
Korzystnym systemem zwierzęcym do wytwarzania hybrydom, które wydzielają przeciwciała monoklonalne jest system mysi. Wytwarzanie hybrydom w myszy jest bardzo dobrze ustawioną procedurą. Protokoły immunizacji i techniki izolacji immunizowanych limfocytów śledzionowych do fuzji są dobrze znane specjalistom. Partnerzy fuzji (np. komórki mysiego szpiczaka) i procedury fuzji są także dobrze znane.
W korzystnym wykonaniu, ludzkie przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw CD25 można wytwarzać przy użyciu myszy transgenicznych lub transchromosomalnych niosących większą część ludzkiego układu odpornościowego niż układu mysiego. Myszy transgeniczne i transchromosomalne obejmują myszy określane tu jako myszy HuMAb, np., odpowiednio, myszy HCo7 i HCo12 oraz myszy KM i są tu wspólnie określane jako „myszy transgeniczne.
Myszy HuMAb zawierają miniloci z ludzkim genem immunoglobulinowym, który koduje nieprzerearanżowane sekwencje ludzkiego łańcucha ciężkiego (μ i γ) i łańcucha lekkiego κ immunoglobuliny, wraz z wprowadzonymi mutacjami, które inaktywują endogenne Ioci łańcucha μ i κ (Lonberg, N. i wsp. (1994) Nature 368 (6474): 856-859). Zatem, myszy wykazują zredukowane wytwarzanie mysiego IgM lub łańcucha lekkiego κ i w odpowiedzi na immunizację, wprowadzone transgeny ludzkiego łańcucha ciężkiego i lekkiego, przechodzą zmianę klasy i mutację somatyczną dając ludzkie IgG o wysokim powinowactwie, przeciwciała monoklonalne κ (Lonberg, N. i wsp. (1994), powyżej, praca przeglądowa w Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, Lonberg, N. i Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol, tom 13: 65-93 oraz Harding, F. i Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764: 536-546). Wytwarzanie myszy HuMAb opisano szczegółowo w Taylor, L. i wsp. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295, Chen, J. i wsp. (1993) International Immunology 5: 647-656, Tuaillon i wsp. (1994) J. Immunol. 152: 2912-2920, Lonberg N. i wsp., (1994) Nature 368 (6474): 856-859, Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, Taylor, L. i wsp. (1994) International Immunology 6: 579-591, Lonberg, N. i Kuszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol, tom 13: 65-93, Harding, F. i Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764: 536-546, Fishwild, D. i wsp. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Patrz ponadto patent USA nr 5 545 806, 5 569 825, 5 625 126, 5 633 425, 5 789 650, 5 877 397, 5 661 016, 5 814 318, 5 874 299 oraz 5 770 429, wszystkie według Lonberga i Kaya, jak również patent USA nr 5 545 807 Surani i wsp., WO 98/24 884, WO 94/25 585, WO 93/1 227, WO 92/22 645, WO 92/03 918 oraz WO 01/09 187.
Myszy HCo7 posiadają dysrupcję JKD w swoich endogennych genach łańcucha lekkiego (kappa) (jak opisano w Chen i wsp. (1993) EMBO J. 12: 821-830), dysrupcję CMD w endogennych genach łańcucha ciężkiego (jak opisano w przykładzie I z WO 01/14424), myszy KCo5 transgen ludzkiego łańcucha lekkiego kappa (jak opisano w Fishwild i wsp. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851) i myszy HCo7 transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego (jak opisano w patencie USA nr 5 770 429).
Myszy HCo12 posiadają dysrupcję JKD w swoich endogennych genach łańcucha lekkiego (kappa) (jak opisano w Chen i wsp. (1993) EMBO J. 12: 821-830), CMD w endogennych genach łańPL 217 296 B1 cucha ciężkiego (jak opisano w przykładzie 1 z WO 01/14424 by Korman i wsp.), myszy KCo5 transgen ludzkiego łańcucha lekkiego kappa (jak opisano w Fishwild i wsp. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851) i myszy HCo12 transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego (jak opisano w przykładzie 2 z WO 01/14424 przez Kormana i wsp.).
W szczepie myszy KM, endogenny mysi gen łańcucha lekkiego kappa został poddany homozygotycznej dysrupcji, jak opisano w Chen i wsp. (1993) EMBO J. 12: 811-820 i endogenny mysi gen łańcucha został poddany homozygotycznej dysrupcji jak opisano w przykładzie I z WO 01/09187. Ten szczep myszy niesie transgen ludzkiego łańcucha lekkiego kappa, KCo5, jak opisano w Fishwild i wsp. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Ten szczep myszy niesie również transchromosom ludzkiego łańcucha ciężkiego złożony z fragmentu hCF chromosomu 14 (SC20), jak opisano w WO 02/43478.
Immunizacja
W celu wytworzenia w pełni ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciw CD25, myszy transgeniczne lub transchromosomalne zawierające geny ludzkiej immunoglobuliny (np. myszy HCo12, HCo7 lub KM) immunizowano preparatem wzbogaconym w antygen CD25, zrekombinowanym CD25 i/lub komórkami wyrażającymi CD25, jak opisano, przykładowo, w Lonberg i wsp. (1994), powyżej, Fishwild i wsp. (1996), powyżej i WO 98/24884. Alternatywnie, myszy można immunizować DNA kodującym ludzki CD25. Korzystnie, przy pierwszej infuzji myszy będą w wieku 6-16 tygodni. Przykładowo, do immunizacji myszy HuMAb drogą dootrzewnową można zastosować preparat wzbogacony w antygen CD25 lub zrekombinowany antygen CD25. W przypadkach, kiedy w wyniku immunizacji przy użyciu preparatu oczyszczonego lub wzbogaconego w antygen CD25 nie powstaną przeciwciała, myszy można także immunizować komórkami wyrażającymi CD25, np. linią komórkową, w celu pobudzenia odpowiedzi odpornościowych.
Łączne doświadczenia z różnymi antygenami pokazały, że myszy transgeniczne HuMAb najlepiej odpowiadają, kiedy są wstępnie immunizowane drogą dootrzewnową (IP) lub podskórną (SC) komórkami wyrażającymi CD25 w kompletnym lub niekompletnym adiuwancie Freunda, a następnie immunizowane IP (łącznie do 10 razy) komórkami wyrażającymi CD25, np. w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
Odpowiedź odpornościową można monitorować w czasie trwania procedury immunizacji w próbkach surowicy z krwi pobranej z przestrzeni zagałkowej. Surowicę można analizować za pomocą FACS (jak opisano poniżej) i myszy z wystarczającymi mianami ludzkiej immunoglobuliny antyCD25 można stosować do fuzji. Odpowiedź odpornościową myszy można wzmacniać przez podanie dożylne komórek wytwarzających CD25 przed, przykładowo 3 i 2 dniami przed, uśmierceniem i usunięciem śledziony i węzłów chłonnych.
Wytwarzanie hybrydom produkujących ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciw CD25
Do wytwarzania hybrydom produkujących ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciw CD25 z immunizowanych myszy izolowane są limfocyty śledzionowe i komórki z węzłów chłonnych i tworzone są ich fuzje z odpowiednimi liniami komórek unieśmiertelnionych, takich jak linia komórek szpiczaka myszy.
Uzyskane hybrydomy można następnie przeszukiwać pod kątem wytwarzania przeciwciał swoistych wobec antygenu. Przykładowo, zawiesiny pojedynczych komórek limfocytów śledzionowych z imunizowanych myszy można poddawać fuzji z komórkami szpiczaka SP2/0-Ag14 (ATCC, CRL 5
1581) z 50% PEG (w/v). Komórki można następnie wysiewać przy gęstości około 1 x 105 na studzienkę w płytce mikrotitracyjnej z płaskim dnem, a następnie inkubować przez dwa tygodnie w pożywce selekcyjnej zawierającej, oprócz normalnie stosowanych odczynników, 10% płodową surowicę klonalną, 5 Origen Hybrydoma Cloning Factor (IGEN) i IX HAT (Sigma). Po około dwóch tygodniach, komórki można hodować w pożywce, w której HAT jest zamienione przez HT (Sigma).
Poszczególne studzienki można pojedynczo przeszukiwać testem ELISA pod kątem przeciwciał zawierających ludzki łańcuch lekki kappa i analizować swoistość wobec CD25 przy pomocy FACS stosując komórki wyrażające CD25. Zazwyczaj po 7-10 dniach od wystąpienia intensywnego wzrostu hybrydomy, klony są przeszukiwane pod kątem wytwarzania IgG.
Hybrydomy wydzielające przeciwciało można przesiać, ponownie poddać przeszukiwaniu i jeśli są nadal pozytywne dla ludzkiego IgG, monoklonalne przeciwciała anty-CD25 można subklonować co najmniej dwukrotnie przez ograniczone rozcieńczanie.
Stabilne subklony można następnie hodować in vitro w celu wytworzenia w pożywce do hodowli komórkowej przeciwciała do charakterystyki.
PL 217 296 B1
Wytwarzanie transfektom produkujących ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciw CD25
Przeciwciała ludzkie według wynalazku można wytwarzać w transfektomie komórki gospodarza przy użyciu, przykładowo, kombinacji technik rekombinacji DNA i metod transfekcji genami dobrze znanych w dziedzinie (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
Przykładowo, do wytworzenia przeciwciał lub fragmentów tych przeciwciał, standardowymi technikami biologii molekularnej (np. amplifikacja PCR, ukierunkowana mutageneza) można uzyskać cząsteczki DNA kodujące częściowo lub pełnej długości łańcuchy lekkie i ciężkie i wprowadzić je do wektorów ekspresyjnych w taki sposób, że geny są funkcjonalnie połączone z sekwencjami kontrolującymi transkrypcję i translację. W tym kontekście termin „funkcjonalnie połączony oznacza, że gen dla przeciwciała jest połączony z wektorem dzięki reakcji Iigacji tak, że sekwencje kontrolujące transkrypcję i translację w wektorze służą funkcją regulacyjną dla transkrypcji i translacji genu dla przeciwciała. Wektor ekspresyjny i sekwencje kontrolujące ekspresję są tak dobrane, aby były zgodne z ekspresją w wybranej komórce gospodarza. Gen dla łańcucha lekkiego przeciwciała i gen dla łańcucha ciężkiego przeciwciała można wprowadzić do oddzielnych wektorów lub, częściej, oba geny są wprowadzane do tego samego wektora ekspresyjnego. Geny dla przeciwciał są wprowadzane do wektora ekspresyjnego standardowymi metodami (np. przy pomocy ligacji komplementarnych restrykcyjnych we fragmencie genu dla przeciwciała i w wektorze lub, jeśli nie ma miejsc restrykcyjnych, ligacji tępych końców). Do stworzenia genów dla przeciwciał o pełnej długości z dowolnego izotypu można zastosować regiony zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego opisanych tu przeciwciał dzięki wprowadzeniu ich do wektorów ekspresyjnych kodujących już regiony stałe łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego pożądanego izotypu tak, że segment VH jest funkcjonalnie połączony z segmentem(ami) CH w wektorze, a segment VL jest funkcjonalnie połączony z segmentem CL w wektorze. Dodatkowo lub alternatywnie, zrekombinowany wektor ekspresyjny może kodować peptyd sygnałowy, który ułatwia wydzielanie łańcucha przeciwciała z komórki gospodarza. Gen dla łańcucha przeciwciała można tak sklonować w wektorze, że peptyd sygnałowy jest połączony w ramce z końcem aminowym genu dla łańcucha przeciwciała. Peptyd sygnałowy może być immunoglobulinowym peptydem sygnałowym lub heterologicznym peptydem sygnałowym (tzn. peptydem sygnałowym z białka nie będącego globuliną).
Dodatkowo, do genów dla łańcucha przeciwciała, zrekombinowane wektory ekspresyjne według wynalazku niosą sekwencje regulacyjne, które kontrolują ekspresję genów dla łańcucha przeciwciała w komórce gospodarza. Termin „sekwencja regulacyjna obejmuje promotory, enhancery i inne elementy kontrolne ekspresji (np. sygnały poliadenylacji), które kontrolują transktypcję lub translację genów dla łańcucha przeciwciała. Takie sekwencje regulacyjne opisano, przykładowo w Goeddel, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Jest jasne dla specjalisty w dziedzinie, że projekt wektora ekspresyjnego, obejmujący wybór sekwencji regulacyjnych może zależeć od takich czynników, jak wybór komórki gospodarza do transformacji, poziomy ekspresji pożądanego białka, itd. Korzystne sekwencje regulacyjne dla ekspresji w ssaczych komórkach gospodarza obejmują elementy wirusowe, które kierują wysokim poziomem wytwarzania białka w komórkach ssaczych, takie jak promotory i/lub enhancery pochodzące z cytomegalowirusa (CMV), wirusa małpiego 40 (SV40), adenowirusa (np. główny późny promotor adenowirusa (AdMLP)) i z wirusa polioma. Alternatywnie, można użyć sekwencje regulacyjne nie pochodzące z wirusa, takie jak promotor ubikwityny lub promotor β-globin.
Dodatkowo, do genów dla łańcucha przeciwciała i sekwencji regulacyjnych, zrekombinowane wektory ekspresyjne według wynalazku mogą nieść dodatkowe sekwencje, takie jak sekwencje, które regulują replikację wektora w komórce gospodarza (np. miejsce startu replikacji) i geny markerów selekcyjnych. Gen markera selekcyjnego ułatwia selekcję komórek gospodarza do których został wprowadzony wektor (patrz np. patenty USA nr 4 399 216, 4 634 665 i 5 179 017, wszystkie według Axela i wsp.). Przykładowo, zazwyczaj gen markera selekcyjnego nadaje komórce gospodarza, do której został wprowadzony wektor oporność na leki, takie jak G418, higromycyna lub metotreksat. Korzystnie, geny markerów selekcyjnych obejmują gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) (do użycia w komórkach gospodarza dhfr- z selekcją/amplifikacją na metotreksat) i gen neo (dla selekcji na G418).
W celu wytworzenia łańcuchów lekkiego i ciężkiego, wektor(y) ekspresyjny kodujący łańcuchy ciężki i lekki jest transfekowany do komórki gospodarza za pomocą standardowych technik. Różne formy terminu „transfekcja obejmują szereg różnorodnych technik stosowanych powszechnie do wprowadzenia egzogennego DNA do prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza, np. elekrtoporację, wytrącanie wapniem-fosforanem, transfekcję DEAE-dekstranem i im podobne. Chociaż
PL 217 296 B1 teoretycznie możliwe jest wytworzenie przeciwciał według wynalazku zarówno w prokariotycznych, jak i eukariotycznych komórkach gospodarza, wytwarzanie przeciwciał w komórkach eukariotycznych, a korzystniej ssaczych komórkach gospodarza jest najkorzystniejsze, ponieważ takie komórki eukariotyczne, a w szczególności komórki ssacze, mają lepszą niż komórki prokariotyczne zdolność składania i wydzielania prawidłowo sfałdowanego i aktywnego immunologicznie przeciwciała.
Korzystne ssacze komórki gospodarza do wytwarzania zrekombinowanych przeciwciał według wynalazku obejmują komórki CHO (w tym komórki CHO dhfr-, opisane w Urlaub i Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, stosowane z markerem selekcyjnym DHFR, np. jak opisano w R. J. Kaufman i P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), komórki szpiczaka NS/0, komórki COS, komórki HEK293 i komórki SP2. Innym korzystnym systemem ekspresji, w szczególności z komórkami szpiczaka NS/O, jest system do ekspresji genów z GS (syntetaza glutationowa) ujawniony w WO nr 87/04462, WO nr 89/01036 i EP nr 338 841. Kiedy zrekombinowane wektory ekspresyjne kodujące geny dla przeciwciał są wprowadzone do ssaczych komórek gospodarza, przeciwciała są wytwarzane przez hodowane komórki gospodarza przez okres czasu wystarczający do ekspresji genu przeciwciała w komórkach gospodarza lub, korzystniej, następuje wydzielanie przeciwciała do pożywki hodowlanej, w której hodowane są komórki gospodarza. Przeciwciała można odzyskiwać z pożywki hodowlanej przy użyciu standardowych metod oczyszczania.
Dalsze sposoby rekombinacyjne do wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciw CD25
Alternatywnie, sklonowane geny przeciwciał można poddawać ekspresji w innych systemach ekspresyjnych, włączając komórki prokariotyczne, takie jak mikroorganizmy, np. E. coli do produkcji przeciwciał scFv, glony, jak również komórki owadzie. Ponadto, przeciwciała można wytwarzać w zwierzętach transgenicznych nie będących człowiekiem, jak w mleku z owcy i królików lub w jajach kurzych, czy w roślinach transgenicznych, patrz np. Verma, R. i wsp. (1998). Antibody engineering: Comparison of bacterial, yeast, insect and mammalian expression systems. J. Immunol. Meth. 216: 165-181, Pollock, i wsp. (1999). Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies. J. Immunol.Meth. 231: 147-157 i Fischer, R. i wsp. (1999). Molecular farming of recombinant antibodies in plants. Biol. Chem. 380: 825-839.
Zastosowanie częściowych sekwencji przeciwciał do wytwarzania niezmienionych przeciwciał
Przeciwciała oddziałują z docelowymi antygenami głównie przez reszty aminokwasowe położone w sześciu regionach CDR łańcucha ciężkiego i lekkiego. Z tego powodu, sekwencje aminokwasowe o obrębie regionów CDR są bardziej zróżnicowane pomiędzy poszczególnymi przeciwciałami niż sekwencje na zewnątrz regionów CDR. Ponieważ sekwencje CDR są odpowiedzialne za większość oddziaływań przeciwciało-antygen, możliwe jest wytworzenie zrekombinowanych przeciwciał, przypominających właściwości swoistych, naturalnie występujących przeciwciał, przez skonstruowanie wektorów ekspresyjnych, które obejmują sekwencje CDR ze swoistego, naturalnie występującego przeciwciała wszczepionego w sekwencje zrębowe innego przeciwciała o innych właściwościach (patrz np. Riechmann, L. i wsp. (1998) Nature 332: 323-327, Jones, P. i wsp. (1986) Nature 321: 522- 525 i Queen, C. i wsp. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10029-10033). Takie sekwencje zrębowe można uzyskać z publicznych baz danych DNA, które obejmują sekwencje genu przeciwciała linii zarodkowej. Te sekwencje linii zarodkowej będą różne od sekwencji genu dojrzałego przeciwciała ponieważ nie będą zawierały całkowicie złożonych genów zmiennych, które powstają przez łączenie V(D)J w czasie dojrzewania komórek B. Sekwencje genu linii zarodkowej będą także różniły się od sekwencji przeciwciała o wysokim powinowactwie z wtórnego repertuaru, które posiada mutacje w całym genie zmiennym choć zazwyczaj zgrupowane w sekwencjach CDR. Przykładowo, mutacje somatyczne stosunkowo nie są częste w końcu aminowym regionu I części zrębowej i w końcu karboksylowym regionu 4 części zrębowej. Ponadto, wiele mutacji somatycznych nie zmienia zasadniczo właściwości wiązania przeciwciała. Z tego względu, nie jest konieczne uzyskanie całej sekwencji DNA określonego przeciwciała w celu przekreowania niezmienionego rekombinowanego przeciwciała o właściwościach wiązania podobnych do tych dla przeciwciała wyjściowego (patrz WO nr 99/45962). Zazwyczaj wystarcza do tego celu częściowa sekwencja łańcucha ciężkiego i lekkiego łącząca regiony CDR. Częściowa sekwencja stosowana jest do określenia, który z segmentów genów części zmiennej i łączącej linii zarodkowej przyczynia się do rekombinacji genów części zmiennej przeciwciała. Sekwencja linii zarodkowej jest zatem stosowana do wypełnienia utraconych części regionów zmiennych. Sekwencje liderowe łańcucha ciężkiego i lekkiego są cięte podczas dojrzewania białka i nie przyczyniają się do właściwości końcowego przeciwciała. W celu dodania brakujących sekwencji, sklonowane sekwencje
PL 217 296 B1 cDNA można łączyć z syntetycznymi oligonukleotydami za pomocą reakcji ligacji lub amplifikacji PCR. Alternatywnie, cały region zmienny region można zsyntetyzować jako zestaw krótkich, zachodzących na siebie oligonukleotydów i w połączeniu z amplifikacją PCR stworzyć klon całego, syntetycznego regionu zmiennego. Proces ten posiada pewne zalety, takie jak eliminacja lub wprowadzenie określonych miejsc restrykcyjnych lub optymalizacja określonych kodonów.
Sekwencje nukleotydowe transkryptów łańcucha ciężkiego i lekkiego z hybrydom są stosowane do projektowania zachodzących na siebie zestawów syntetycznych oligonukleotydów do stworzenia syntetycznych sekwencji V z identycznymi jak sekwencje naturalne zawartościami kodującymi aminokwasy. Syntetyczne sekwencje łańcucha ciężkiego i kappa mogą różnić się od sekwencji naturalnych na trzy sposoby: zestawy powtarzających się nukleotydów są przerwane dla ułatwienia syntezy oligonukleotydów i amplifikacji PCR, wprowadzone są optymalne miejsca inicjacji translacji zgodne z zasadami Kozak (Kozak (1991) J. Biol. Chem. 266: 19867-19870) i powyżej miejsc inicjacji translacji wprowadzone są miejsca HindIII.
Dla obu regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego sekwencje nici z optymalnymi kodonami i odpowiadające obszary niekodujące, są rozerwane 30-50 nukleotydów od środka odpowiadającego nukleotydu niekodującego. Zatem, oligonukleotydy każdego łańcucha można złożyć w zachodzące na siebie dwuniciowe zestawy pokrywające segmenty 150-400 nukleotydów. Pule są następnie stosowane jako matryce do wytworzenia produktów amplifikacji PCR o długości 150-400 nukleotydów. Zazwyczaj, zestaw oligonukleotydów dla pojedynczego regionu zmiennego będzie podzielony na dwie pule, które są oddzielnie amplifikowane do wytworzenia dwóch zachodzących na siebie produktów PCR. Te zachodzące na siebie produkty są następnie łączone za pomocą amplifikacji PCR dając cały region zmienny. Może być także pożądane włączenie fragmentu zachodzącego z regionu stałego łańcucha ciężkiego i lekkiego (obejmującego miejsce BbsI łańcucha lekkiego kappa lub miejsce AgeI łańcucha ciężkiego gamma) przez amplifikację PCR dla wytworzenia fragmentów, które można łatwo sklonować w konstruktach wektorów ekspresyjnych.
Zrekonstruowane regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego są następnie łączone ze sklonowanym promotorem, sekwencją liderową, miejscem inicjacji translacji, regionem stałym, regionem 3' nie podlegającym translacji, sekwencjami poliadenylacji i terminacji transkrypcji w celu stworzenia konstruktu wektora ekspresyjnego. Konstrukty ekspresyjne łańcucha ciężkiego i lekkiego można następnie łączyć w pojedynczy wektor, kotransfekować, seryjnie transfekować lub transfekować oddzielnie do komórek gospodarza, które są następnie poddawane fuzji w celu wytworzenia komórek gospodarza wytwarzających oba łańcuchy.
Podobną procedurę można zastosować do wszczepienia nowej swoistości wobec antygenu do istniejącego dojrzałego przeciwciała. Korzystnie, wybrane jest akceptorowe przeciwciało, które pochodzi z tego samego genu zmiennego linii zarodkowej, co przeciwciało donorowe sekwencji CDR. Następnie, przy użyciu technik opisanych powyżej z przeciwciała donorowego przenoszona jest jedna lub większa liczba sekwencji CDR.
Przykłady plazmidów do użycia przy konstrukcji wektorów ekspresyjnych dla ludzkiego IgG,K opisano poniżej. Plazmidy są tak konstruowane aby amplifikowane przy pomocy PCR sekwencje cDNA łańcucha ciężkiego V i lekkiego V kappa można było zastosować przy rekonstrukcji pełnych minigenów łańcucha ciężkiego i lekkiego. Plazmidy te można użyć do wywarzenia całych, ludzkich przeciwciał IgGl,K lub IgG4,K. Podobne plazmidy można konstruować do wytwarzania innych izotypów łańcucha ciężkiego lub wytwarzania przeciwciał obejmujących łańcuchy lekkie lambda.
Zatem, w innym wykonaniu wynalazek dostarcza różne sposoby wytwarzania ludzkich przeciwciał anty-CD25. W jednym z wykonań sposób ten dotyczy wytworzenia przeciwciała obejmującego (1) regiony zrębowe ludzkiego łańcucha ciężkiego i sekwencje CDR ludzkiego łańcucha ciężkiego, gdzie co najmniej jedna z sekwencji CDR ludzkiego łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z sekwencji aminokwasowych CDR pokazanych na fig. 1-10 (lub odpowiadające reszty aminokwasowe w SEKW. NR ID.: 17-19, 23-25, 29-31 lub 35-37) i (2) regiony zrębowe ludzkiego łańcucha lekkiego i sekwencje CDR ludzkiego łańcucha lekkiego, gdzie co najmniej jedna z sekwencji CDR ludzkiego łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z sekwencji aminokwasowych CDR pokazanych na fig. 1-10 (lub odpowiadające reszty aminokwasowe w SEKW. NR ID.: 20-22, 26-28, 32-34 lub 38-40), gdzie przeciwciało zachowuje zdolność wiązania CD25.
Zdolność przeciwciała do wiązania CD25 można następnie określić przy użyciu standardowych testów wiązania, takich jak te przedstawione w przykładach (np. analiza FACS).
PL 217 296 B1
Ponieważ dobrze wiadomo, że domeny CDR3 łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała odgrywają szczególnie istotną rolę w nadawaniu przeciwciału swoistości wiązania/powinowactwa do antygenu, zrekombinowane przeciwciała według wynalazku wytworzone jak przedstawiono powyżej korzystnie obejmują sekwencje CDR3 z AB1, AB7, AB11 lub AB12 łańcucha ciężkiego i lekkiego. Przeciwciała ponadto mogą obejmować sekwencje CDR2 z AB1, AB7, AB11 lub AB12. Przeciwciała ponadto mogą obejmować sekwencje CDR1 z AB1, AB7, AB11 lub AB12. Zatem, wynalazek dostarcza dalej przeciwciała anty-CD25 obejmujące:
(1) regiony zrębowe ludzkiego łańcucha ciężkiego, region CDR1 ludzkiego łańcucha ciężkiego, region CDR2 ludzkiego łańcucha ciężkiego i region CDR3 ludzkiego łańcucha ciężkiego, gdzie region CDR3 ludzkiego łańcucha ciężkiego jest CDR3 z AB1, AB7, AB11 lub AB12, jak pokazano na fig. 1-10 (lub odpowiadającymi resztami aminokwasowymi w SEKW. NR ID.: 19, 25, 31 lub 37) i (2) regiony zrębowe ludzkiego łańcucha lekkiego, region CDR1 ludzkiego łańcucha lekkiego, region CDR2 ludzkiego łańcucha lekkiego i region CDR3 ludzkiego łańcucha ciężkiego lekkiego, gdzie region CDR3 ludzkiego łańcucha lekkiego jest CDR3 z AB1, AB7, AB11 lub AB12, jak pokazano na fig. 1-10 (lub odpowiadającymi resztami aminokwasowymi w SEKW. NR ID.: 22, 28, 34 lub 40), gdzie przeciwciało wiąże się z CD25. Przeciwciało może dalej obejmować CDR2 łańcucha ciężkiego i/lub CDR2 łańcucha lekkiego z AB1, AB7, AB11 lub AB12. Przeciwciało może dalej obejmować CDRl łańcucha ciężkiego i/lub CDRl łańcucha lekkiego z AB1, AB7, AB11 lub AB12.
Korzystnie, CDR1, 2 i/lub 3 skonstruowanego przeciwciała opisanego powyżej obejmuje dokładną sekwencję(e) aminokwasową jak ujawnione tu AB1, AB7, AB11 lub AB12. Chociaż, doświadczony specjalista zauważy, że możliwe są pewne pochodne dokładnych sekwencji CDR z AB1, AB7, AB11 lub AB12, które nadal zachowują zdolność przeciwciała do wiązania wydajnie CD25 (np. konserwatywne substytucje). Zatem, w innym wykonaniu, skonstruowane przeciwciało może składać się z jednej lub większej liczby sekwencji które są, przykładowo, w 90%, 95%, 98% lub 99,5% homologiczne z jedną lub większą liczbą sekwencji CDR z AB1, AB7, AB11 lub AB12.
Dodatkowo lub alternatywnie, do prostego wiązania CD25, skonstruowane przeciwciała, takie jak opisane tu powyżej można wybrać z pod kątem zachowania ich innych funkcjonalnych właściwości przeciwciała według wynalazku, takich jak:
(1) wysokie powinowactwo wiązania CD25, (2) hamowanie lub blokowanie wiązania CD25 z IL-2, (3) eliminacja komórek T wyrażających CD25, (4) przekształcenia komórek T w komórki tolerancyjne, (5) hamowanie proliferacji komórek T wyrażających CD25, (6) hamowanie proliferacji komórek T indukowanej przeciwciałem anty-CD3 z PBMC, (7) hamowanie MLR i/lub (8) internalizacja CD25 wyrażanego na komórkach T.
Charakterystyka wiązania ludzkich przeciwciał monoklonalnych z CD25
Ludzkie przeciwciała anty-CD25 według wynalazku można izolować i charakteryzować wieloma różnymi sposobami. Przykładowo, wybrane hybrydomy można hodować w odpowiednich kolbach do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych. Supernatanty można filtrować i zatężać przed chromatografią powinowactwa w sefarozie z białkiem A (dla przeciwciał izotypu IgG1) (Pharmacia, Piscataway, NJ) lub w sefarozie opłaszczonej przeciwciałem anty-ludzkie IgG lub sefarozie z białkiem protein G w przypadku przeciwciał izotypu IgG3. Wyeluowane IgG można sprawdzić za pomocą elektroforezy w żelu, a czystość potwierdzić za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Roztwór buforu można zamienić na PBS i stężenie można określić przy OD280 stosując współczynnik ekstynkcji 1,43. Przeciwciała monoklonalne można rozporcjować i przechowywać w -30°C.
W celu określenia, czy wyselekcjonowane ludzkie przeciwciała monoklonalne anty-CD25 wiążą się z unikatowym epitopem, można stosować ukierunkowaną lub wielokierunkową mutagenezę.
W celu określenia izotypu oczyszczonego przeciwciała, można przeprowadzić testy ELISA dla izotypów. Studzienki płytek mikrofiltracyjnych można opłaszczyć 10 g/ml anty-ludzkim Ig przez noc w 4°C. Po blokowaniu 5% BSA (bydlęca albumina surowicza), płytki są poddawane działaniu 10 g/ml przeciwciał monoklonalnych lub kontroli oczyszczonego izotypu, w temp. pokojowej przez 2 godz. Następnie studzienki można poddać działaniu ludzkich IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4, IgE, IgA1, IgA2 lub sond swoistych dla ludzkiego IgM skoniugowanych z alkaliczną fosfatazą. Po płukaniu, płytki są wywoływane substratem pNPP (1 mg/ml) i analizowane jest OD przy 405 nm.
PL 217 296 B1
W celu wykazania obecności przeciwciał anty-CD25 w surowicy immunizowanych myszy lub wiązania przeciwciał monoklonalnych z żywymi komórkami wyrażającymi CD25 wykorzystano cytometrię przepływową. Streszczając, linie komórkowe wyrażające CD25 (hodowane w standardowych warunkach wzrostu) są mieszane w różnych stężeniach z przeciwciałami monoklonalnymi w PBS zawierającym 0,1% BSA i 0,02% azydku sodowego i inkubowane w 4°C przez 30 min. Po płukaniu, komórki są poddawane działaniu przeciwciała anty-ludzkie IgG wyznakowanemu fluoresceiną w tych samych warunkach co barwienie pierwotnego przeciwciała. Próbki można analizować za pomocą cytometrii przepływowej stosując cytometr przepływowy (np. Becton Dickinson FACS instrument) stosując światło i rozproszenie boczne do bramkowania pojedynczych, żyjących komórki. Można zastosować test alternatywny do testu z cytometrią przepływową stosując mikroskopię fluorescencyjną (dodatkowo lub zamiast). Komórki można barwić dokładnie tak jak opisano powyżej i badać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta pozwala na wizualizację poszczególnych komórek, lecz może posiadać mniejszą czułość zależnie od gęstości antygenu.
Ludzkie przeciwciała IgG anty-CD25 można ponadto testować pod kątem reaktywności z antygenem CD25 za pomocą techniki typu Western blotting. Streszczając, można przygotować ekstrakty komórkowe z komórek wytwarzających CD25 i poddać rozdziałowi elektroforetycznemu w żelu poliakryloamidowym z siarczanem sodowo-dodecylowym (SDS). Po elektroforezie rozdzielone antygeny będą przeniesione na błony nitrocelulozowe, blokowane 20% odtłuszczonym mlekiem i poddawane działaniu sondy z badanych przeciwciał monoklonalnych. Wiązanie ludzkiego IgG można wykryć przy użyciu przeciwciała anty-ludzkie IgG z fosfatazą alkaliczną i wywołać substratem BCIP/NBT w tabletkach (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).
Hamowanie aktywności komórek wyrażających CD25
Dodatkowo do badania swoistości wiązania z CD25, ludzkie przeciwciała monoklonalne anty-CD25 można badać pod kątem ich zdolności do hamowania różnorodnych aktywności komórek, takich jak komórki T i inne limfocyty, wyrażających CD25. Przykładowo, stosując znane techniki można przeprowadzić testy proliferacji komórek T. W jednej technice, ludzkie PBMC są rozpuszczone w stosownym podłożu i następnie stymulowane, przykładowo, przeciwciałem anty-CD3, przed dodaniem różnych stężeń badanych przeciwciał w celu określenia, jaki mają one wpływ na proliferację komórek T. Proliferację komórek T dla oczyszczonych komórek T można także oszacować w obecności przeciwciał monoklonalnych anty-CD3 i anty-CD28.
Stosując znane techniki można także prowadzić testy dla MLR. Przykładowo, PBMC od pierwszego dawcy można naświetlać i mieszać z PBMC od drugiego dawcy. Następnie, do komórek można podawać różne stężenia przeciwciała i mierzyć odpowiedź MLR.
II. Produkcja zwierząt transgenicznych nie będących człowiekiem, które wytwarzają ludzkie przeciwciała monoklonalne anty-CD25
W jeszcze innym aspekcie wynalazek dostarcza transgeniczne i transchromosomalne zwierzęta nie będące człowiekiem, takie jak transgeniczne lub transchromosomalne myszy, które są zdolne do ekspresji ludzkich przeciwciał swoiście wiążących CD25. W szczególnym wykonaniu wynalazek dostarcza transgeniczną lub transchromosomalną mysz posiadającą genom obejmujący transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego tak, że mysz wytwarza ludzkie przeciwciała anty-CD25 gdy jest immunizowana komórkami wyrażającymi CD25. Transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego może być zintegrowany z chromosomalnym DNA myszy, jak w przypadku transgenicznych myszy, np. HuMAb, opisanych tu w szczegółach i w przykładach. Alternatywnie, transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego może być utrzymywany poza chromosomem, jak w przypadku transchromosomalnych myszy (np. KM), opisanych w WO nr 02/43478. Takie transgeniczne i transchromosomalne zwierzęta są zdolne do wytwarzania wielu izotypów ludzkich przeciwciał monoklonalnych wobec CD25 (np. IgG, IgA i/lub IgE) przez rekombinację V-D-J/V-J i zmianę izotypu. Zaprojektowanie zwierzęcia transgenicznego lub transchromosomalnego nie będącego człowiekiem, które odpowiada na stymulację obcym antygenem repertuarem przeciwciał heterologicznych wymaga, aby transgeny heterologicznych immunoglobulin zawarte w zwierzęciu transgenicznym prawidłowo funkcjonowały w szlaku rozwoju komórek B. Obejmuje to, przykładowo, zmianę izotypu transgenu heterologicznego łańcucha ciężkiego. Zatem, transgeny są tak konstruowane, aby mogła zajść zaindukowana zmiana izotypu i wystąpić jedna lub większa liczba następujących cech genów dla przeciwciał: (1) ekspresja na wysokim poziomie i specyficzna dla komórki, (2) funkcjonalna rearanżacja genów, (3) aktywacja i odpowiedź na alleliczne wykluczenie, (4) wytwarzanie wystarczającego repertuaru pierwotnego, (5) transdukcja sygnału, (6) hipermutacja somatyczna i (7) dominacja locus z transgenu dla przeciwciała podczas odpowiedzi odpornościowej.
PL 217 296 B1
Nie muszą być spełnione wszystkie z wymienionych kryteriów. Przykładowo, w tych wykonaniach, gdzie endogenne Ioci immunoglobulinowe zwierzęcia transgenicznego są w pełni uszkodzone, transgen nie wymaga aktywacji allelicznego wykluczenia. Ponadto, w tych wykonaniach, gdzie transgen obejmuje funkcjonalnie przerearanżowany funkcjonalny gen łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego immunoglobuliny, drugie kryterium dotyczące funkcjonalnej rearanżacji genu nie jest konieczne, przynajmniej dla tego transgenu, który jest już przerearanżowany. Jako podstawa immunologii molekularnej, patrz Fundamental Immunology, wyd. 2 (1989), Paul William E., wyd. Raven Press, N. Y.
W niektórych wykonaniach, transgeniczne i transchromosomalne zwierzęta nie będące człowiekiem stosowane do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych według wynalazku zawierają przerearanżowane, nie przerearanżowane lub kombinację przerearanżowanych i nie przerearanżowanych transgenów łańcucha ciężkiego i lekkiego linii zarodkowej zwierzęcia transgenicznego. Każdy z transgenów łańcucha ciężkiego obejmuje przynajmniej jeden gen CH. Dodatkowo, transgen łańcucha ciężkiego może zawierać funkcjonalne sekwencje dla przełączenia izotypu, które są zdolne do podtrzymywania przełączenia izotypu heterologicznego transgenu kodującego wiele genów CH w komórkach B zwierzęcia transgenicznego. Takimi sekwencjami dla zmiany izotypu mogą być te występujące naturalnie w locus immunoglobulinowym linii zarodkowej gatunku, który jest źródłem genów CH transgenu lub takimi sekwencjami zmiany mogą być pochodne tych, które występują w gatunku, który jest biorcą konstruktu transgenu (zwierzę transgeniczne). Przykładowo, konstrukt ludzkiego transgenu, który jest stosowany do wytwarzania myszy transgenicznych może dawać wyższą częstość przypadków zmiany izotypu jeśli wprowadza sekwencje zmiany podobne do tych występujących naturalnie w mysim locus łańcucha ciężkiego, ponieważ przypuszczalnie mysie sekwencje zmiany są optymalne dla funkcjonowania z mysim systemem rekombinazy biorącej udział w przełączaniu, podczas gdy ludzkie sekwencje zmiany nie są optymalne. Sekwencje zmiany można izolować i klonować klasycznymi metodami klonowania lub można syntetyzować de novo z zachodzących na siebie syntetycznych oligonukleotydów zaprojektowanych na podstawie informacji o opublikowanych sekwencjach odnoszących się do sekwencji immunoglobulinowych regionów zmiany (Mills i wsp., Nucl. Acids Res. 15: 7305-7316 (1991), Sideras i wsp., Intl. Immunol. 1: 631-642 (1989)). Dla każdego z powyższych zwierząt transgenicznych, funkcjonalnie przerearanżowane heterologiczne transgeny łańcucha ciężkiego i lekkiego immunoglobulin są odnajdowane w znaczącej frakcji komórek B zwierzęcia transgenicznego (co najmniej 10%).
Transgeny stosowane do wytwarzania zwierząt transgenicznych nie będących człowiekiem według wynalazku zawierają transgen łańcucha ciężkiego obejmujący DNA kodujący przynajmniej jeden segment genu zmiennego (V), jeden segment genu różnorodności (D), jeden segment genu łączn ikowego (J) i przynajmniej jeden segment genu regionu stałego. Transgen łańcucha lekkiego immunoglobuliny obejmuje DNA kodujący przynajmniej jeden segment genu zmiennego (V), jeden segment genu łącznikowego (J) i przynajmniej jeden segment genu regionu stałego. Segmenty genów kodujących łańcuch ciężki i lekki są heterologiczne dla zwierzęcia transgenicznego, ponieważ pochodzą z lub odpowiadają DNA kodującemu segmenty genów kodujących łańcuch ciężki i lekki immunoglobuliny z gatunku nie będącego transgenicznym zwierzęciem nie będącym człowiekiem. W jednym aspekcie według wynalazku, transgen jest tak skonstruowany, że poszczególne segmenty genów są nie przerearanżowane, tzn. nie uległy rearanżacji tak, aby kodowały funkcjonalny łańcuch lekki i ciężki immunoglobuliny. Takie nie przerearanżowane transgeny podtrzymują rekombinację segmentów genów V, D i J (rearanżacja funkcjonalna) i korzystnie podtrzymują wprowadzenie wszystkich lub części segmentu genu regionu D w uzyskiwany przerearanżowany łańcuch ciężki immunoglobuliny w transgenicznym zwierzęciu kiedy jest eksponowane na antygen CD25.
We wszystkich alternatywnych wykonaniach, transgeny obejmują nie przerearanżowane „minilocus. Takie transgeny zazwyczaj obejmują zasadniczo część segmentów C, D i J, jak również zestaw segmentów genów V. W takich konstruktach transgenu, różne sekwencje regulacyjne, np. promotory, enhancery, regiony zmiany klas, sekwencje donora składania RNA i akceptora składania RNA biorące udział w procesowaniu RHA, sygnały rekombinacji i im podobne, obejmują odpowiadające sekwencje pochodzące z DNA heterologicznego. Takie sekwencje regulacyjne można wprowadzić do transgenu z tego samego lub pokrewnego gatunku zwierzęcia nie będącego człowiekiem stosowanego według wynalazku. Przykładowo, segmenty genów ludzkiej immunoglobuliny można łączyć z sekwencją enhancera immunoglobuliny gryzonia do zastosowania w myszy transgenicznej. Alternatywnie, do transgenu można wprowadzać syntetyczne sekwencje regulacyjne, które nie są homologiczne z funkcjonalną sekwencją DNA, o której wiadomo, że występuje naturalnie w genomach ssaczych.
PL 217 296 B1
Syntetyczne sekwencje regulacyjne są zaprojektowane zgodnie z zasadami najwyższej zgodności, tak jak przykładowo te, które uwzględniają dopuszczalne sekwencje akceptorowe miejsce składania RNA lub motywu promotor/enhancer. Przykładowo, minilocus obejmuje część genomowego locus immunoglobuliny posiadającego przynajmniej jedną wewnętrzną (tzn. nie na końcu części) delecję części DNA nie będącego niezbędnym (np. sekwencji przerywnikowej, intronu lub ich części) w porównaniu z naturalnie występującym locus Ig linii zarodkowej.
Korzystne zwierzęta transgenicznye i transchromosomalne nie będące człowiekiem, np. myszy, bedą wykazywały wytwarzanie immunoglobulin o znaczącym repertuarze, idealnie zasadniczo podocnym do ludzkiego po dostosowaniu do objętości.
Idealnie repertuar będzie w przybliżeniu taki, jak pokazywany u człowieka po dostosowaniu do objętości, zazwyczaj z różnicą co najmniej około 10%, korzystnie 25 do 50% lub więcej. Zazwyczaj, produkowanych będzie co najmniej około tysiąc różnych immunoglobulin (idealnie IgG), korzystnie 104 do 106 lub więcej, w zależności od liczby różnych regionów V, J i D wprowadzonych do genomu myszy i zależnych od dodatkowej różnorodności wytwarzanej przez rearanżacje segmentów genów V(-D-)J i losowe wstawienia nukleotydów w regionach łącznikowych. Zazwyczaj będą wykazywały powinowactwo (KD) do wybranych antygenów poniżej 10-8 M, takie jak poniżej 10-9 M, 10-10 M lub 10-11 M lub nawet niższe.
Zwierzęta transgeniczne i transchromosomalne nie będące człowiekiem, np. myszy, jak opisano powyżej można immunizować, przykładowo komórkami wyrażającymi CD25. Alternatywn ie , zwierzęta transgeniczne można immunizować DNA kodującym Iudzki CD25. Zwierzęta będą następnie wytwarzać komórki B, które przechodzą zmianę klas przez rekombinację prowadzącą do zmiany (zmiana w cis) i wytwarzają immunoglobuliny reagujące z CD25. Immunoglobuliny będą ludzkimi przeciwciałami (także określanymi jako „przeciwciała o ludzkiej sekwencji), w których polipeptydy łańcucha ciężkiego i lekkiego są kodowane przez ludzkie sekwencje transgeniczne, które mogą obejmować sekwencje pochodne powstające w wyniku mutacji somatycznej i rekombinacyjnych połączeń regionu V, jak również sekwencje kodowane przez linie zarodkowe, takie ludzkie przeciwciała można określić jako zasadniczo identyczne z sekwencją polipeptydcwą kodowaną przez ludzkie segmenty genów VL i JL Iub VH, DH i JH, nawet jeśli inne sekwencje linii zarodkowej mogą być obecne w wyniku somatycznej mutacji i połączeń zróżnicowanej rekombinacji V-J i V-D-J. Regiony zmienne każdego łańcucha przeciwciała są zazwyczaj w co najmniej 80 procentach podobne do segmentów genów V i J linii zarodkowej, a w przypadku łańcuchów ciężkich, do segmentów genów V, D, i J linii zarodkowej, często w co najmniej 85 procentach podobne do ludzkich sekwencji linii zarodkowej obecnych w transgenie, częściej w 90 lub 95 procentach lub więcej podobne do ludzkich sekwencji linii zarodkowej obecnych w transgenie. Chociaż, ze względu na to, że sekwencje nie będące sekwencjami linii zarodkowej są wprowadzone przez mutacje somatyczne i łączenie VJ i VDJ, przeciwciała o ludzkich sekwencjach często posiadały pewne sekwencje regionów zmiennych, które nie są kodowane przez segmenty ludzkich genów V, D lub J, jak odkryto w ludzkim transgenie(ach) w linii zarodkowej myszy. Zazwyczaj, takie sekwencje nie będące sekwencjami linii zarodkowej (lub poszczególne pozycje nukleotydowe) będą grupowały się w lub w pobliżu sekwencji CDR lub w regionach, znanych jako grupujące mutacje somatyczne.
Inny aspekt według wynalazku obejmuje komórki B pochodzące z opisanych tu zwierząt transgenicznych lub transchromosomalnych nie będących człowiekiem. Komórki B można stosować do wytwarzania hybrydom wytwarzających ludzkie przeciwciała monoklonalne, które wiążą sie z wysokim powinowactwem np. stała równowagi reakcji dysocjacji (KD) poniżej 10-8 M) z ludzkim CC25. Zatem, w innymi wykonaniu wynalazek dostarcza hybrydcmę, która wytwarza ludzkie przeciwciało posiadające powinowactwo (KD) poniżej 10-8 M, takie jak poniżej 10-9 M, 10-10 M lub 10-11 M lub nawet niższe, kiedy jest określane za pomocą analizy typu „scatchard dla komórek wyrażających CD25 przy użyciu radioaktywnie wyznakowanego przeciwciała monoklonalnego lub przez ustalenie połowy maksymalnego stężenia wiązania przy użyciu analizy FACS lub za pomocą analizy z użyciem powierzchniowego rezonansu plazmonowego mierzonego w urządzeniu BIAcore.
Przeciwciało monoklonalne obejmuje łańcuch lekki o ludzkiej sekwencji złożony z (1) regionu zmiennego łańcucha lekkiego posiadającego sekwencję poiipeptydową, która jest zasadniczo identyczna z sekwencją polipeptydową kodowaną przez segment ludzkiego genu VL i segment ludzkiego JL i (2) regionu stałego łańcucha lekkiego kodowanego przez segment ludzkiego genu CL oraz łańcuch ciężki o ludzkiej sekwencji złożony z (1) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego posiadającego sekwencję polipeptydową, która jest zasadniczo identyczna z sekwencją polipeptydową kodowaną przez
PL 217 296 B1 segment ludzkiego genu VH, region D i ludzki segment JH i (2) regionu stałego kodowanego przez segment ludzkiego genu CH. Należy zauważyć, że ludzkie geny D mogą być zasadniczo zmienione przez rekombinację i przypadki mutacji somatycznych, tak, że pierwotne ludzkie sekwencje linii zarodkowej mogą nie być z łatwością rozpoznawane.
Rozwój ludzkich przeciwciał monoklonalnych wobec CD25 o wysokim powinowactwie może być ułatwiony dzięki metodzie zwiększania repertuaru segmentów ludzkich genów regionu zmiennego w zwierzęciu transgenicznym nie będącym człowiekiem, posiadającym genom obejmujący zintegrowany transgen ludzkiej immunoglobuliny, która obejmuje wprowadzenie do genomu transgenu genu V obejmującego segmenty genów regionu V, które nie są obecne w zintegrowanym transgenie ludzkiej immunoglobuliny. Często, transgen regionu V jest sztucznym chromosomem drożdży (YAC) obejmującym część zestawu segmentów ludzkich genów VH lub VL (VH), jaki może naturalnie wystąpić w genomie ludzkim lub może być złożony oddzielnie metodami rekombinacji, które mogą obejmować uszkodzone lub pominięte segmenty genów V. Często YAC zawiera co najmniej pięć lub więcej funkcjonalnych segmentów genów V. W takim wariancie, możliwe jest wytworzenie metodą zwiększenia repertuaru V zwierzęcia transgenicznego, które wytwarza łańcuch immunoglobuliny obejmujący sekwencję regionu zmiennego kodowaną przez segment genu regionu V obecny w transgenie regionu V i region C kodowany przez transgen ludzkiej Ig. Za pomocą metody zwiększania repertuaru V, można wytwarzać zwierzęta transgeniczne posiadające co najmniej 5 różnych genów V, tak jak nożna wytwarzać zwierzęta zawierające co najmniej około 24 genów V lub więcej. Niektóre segmenty genów V mogą nie być funkcjonalne (np. jak pseudogeny i im podobne), segmenty te można zachować lub jeśli pożądane selektywnie usunąć za pomocą metod rekombinacji dostępnych specjalistom.
Z linii zarodkowej myszy skonstruowanej tak, że zawiera funkcjonalny YAC posiadający zwiększony repertuar segmentów V, zasadniczo nieobecny w transgenie ludzkich Ig zawierającym segmenty genów J i C, cechę tę można przekazać i rozpowszechnić w innych tłach genetycznych, włączając tła, gdzie funkcjonalny YAC, posiadający zwiększony repertuar segmentów V, jest wprowadzony do linii zarodkowej zwierzęcia nie będącego człowiekiem posiadającym inny transgen ludzkich Ig. Wiele funkcjonalnych chromosomów YAC posiadających zwiększony zestaw segmentów V segment można wprowadzić do linii zarodkowej tak, aby pracowały z transgenem ludzkich Ig (lub wieloma transgenami ludzkich Ig). Jednakże, omawiane tu transgeny YAC, po wprowadzeniu do genomu powinny zasadniczo utracić sekwencje drożdżowe, takie jak sekwencje wymagane do autonomicznej replikacji w drożdżach, sekwencje takie można ewentualnie usunąć metodami inżynierii genetycznej (np. trawieniem restrykcyjnym i elektroforezą w zmiennym polu elektrycznym lub inną stosowną metodą), po replikacji w drożdżach nie są one dłużej potrzebne (tzn. przed wprowadzeniem do mysich komórek ES lub prozygoty mysiej). Metody przekazywania cechy ekspresji ludzkich sekwencji immunoglobulinowych obejmują hodowlę zwierząt transgenicznych posiadających transgen(y) ludzkich Ig i ewentualnie posiadających także funkcjonalny YAC ze zwiększonym repertuarem segmentów V. W YAC mogą być obecne zarówno segmenty genów VH jak i VL. Transgeniczne zwierzęta można krzyżować ze zwierzętami o dowolnym tle pożądanym przez specjalistę, w tym z tłami niosącymi inne ludzkie transgeny, w tym transgeny ludzkiego Ig i/lub transgeny kcdujące inne ludzkie ciałka z Iimfocytów.
Wynalazek dostarcza także ludzką immunoglobulinę o wysokim powinowactwie wytwarzaną przez mysz transgeniczną posiadającą transgen YAC o zwiększonym repertuarze regionu V. Chociaż powyżej opisano korzystne wykonania zwierząt transgenicznych według wynalazku, rozpatrywane są inne wykonania, które zaklasyfikowano do trzech kategorii:
I. Zwierzęta transgeniczne zawierające transgen nieprzerearanżowanych ciężkich i przerearanżowanych lekkich łańcuchów immunoglobulinowych,
II. Zwierzęta transgeniczne zawierające transgen nieprzerearanżowanych ciężkich i nie przerearanżowanych lekkich łańcuchów immunoglobulinowych oraz
III. Zwierzęta transgeniczne zawierające transgen przerearanżowanych ciężkich i nie przerearanżowanych lekkich łańcuchów immunoglobulinowych.
Korzystny porządek tych kategorii zwierząt transgenicznych jest następujący: II > I > III, gdzie endogenne geny łańcucha lekkiego (lub co najmniej gen κ) zostały znokautowane za pomocą rekombinacji homologicznej (lub innej metody) i I > II > III, gdzie endogenne geny łańcucha lekkiego nie zostały znokautowane i muszą być dominujące dzięki wykluczeniu ailelu.
III. Bispecyficzne/wielospecyficzne cząsteczki wiążące CD25
W jeszcze innym wykonaniu według wynalazku, ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciw
CD25 można derywatyzować lub łączyć z innymi funkcjonalnymi cząsteczkami, np. innym peptydem
PL 217 296 B1 lub białkiem (np. fragmentem Fab') w celu wytworzenia bispecyficznej lub wielospecyficznej cząsteczki, która wiąże się z wieloma miejscami wiążącymi lub docelowymi epitopami. Przykładowo, przeciwciało według wynalazku można funkcjonalnie połączyć (np. przez chemiczne sprzęgnięcie, fuzję genetyczną, połączenie niekowalencyjne lub inaczej) z jedną lub większą liczbą innych cząsteczek wiążących, takich jak inne przeciwciało, peptyd lub wiążące mimetyki.
Zatem, niniejszy wynalazek obejmuje bispecyficzne i multispecyficzne cząsteczki obejmujące co najmniej jedną pierwszą specyficzność wiązania dla CD25 i drugą specyficzność wiązania epitopu docelowego. W szczególnym wykonaniu według wynalazku, drugim epitopem docelowym jest CD3, CD4, IL-15R, TNF-α związany z błoną lub związany z receptorem, lub IL-15 związany z błoną, lub związany z receptorem. W innym wykonaniu, drugim epitopem docelowym jest receptor Fc, np. ludzki FcyRI (CD64), lub ludzki FcαRI (CD89), lub receptor komórek T. Zatem, wynalazek obejmuje bispecyficzne i multispecyficzne cząsteczki zdolne do wiązania z komórkami efektorowymi wytwarzającymi FcyR, FcαR lub FcεR (np. monocytami, makrofagami lub komórkami o różnokształtnych jądrach (PMN)) i komórkami wyrażającymii CD25. Te bispecyficzne i multispecyficzne cząsteczki umożliwiają trafienie komórek wyrażających CD25 w komórki efektorowe i podobnie do ludzkich przeciwciał monoklonalnych według wynalazku, wyzwalają aktywności komórek efektorowych za pośrednictwem receptora Fc, takie jak fagocytoza komórek wyrażających CD25, ADCC, uwalnianie cytokin lub wytwarzanie anionu nadtlenku.
Bispeeyficzne i multispecyficzne cząsteczki według wynalazku mogą ponadto obejmować trzecią specyficzność wiązania, dodatkowo do specyficzności wiązania anty-Fc i specyficzności wiązania anty-CD25. W jednym wykonaniu, trzecią specyficznością wiązania jest wiązanie części czynnika anty-wzmacniającego, np. cząsteczki, która wiąże się z białkiem powierzchniowym wymaganym do aktywności cytotoksycznej i tym samym zwiększa odpowiedź odpornościową wobec komórki docelowej. „Częścią czynnika anty-wzmacniającego może być przeciwciało, funkcjonalny fragment przeciwciała lub ligand, który wiąże się z daną cząsteczką, np. antygenem lub receptorem i powoduje wzmocnienie efektu determinant wiązania receptora dla fragmentu Fc lub antygenu komórek docelowych. „Część czynnika anty-wzmacniającego może wiązać receptor dla fragmentu Fc lub antygen komórek docelowych. Alternatywnie, część czynnika anty-wzmacniającego może wiązać jednostkę, która jest różna od jednostki, z którą wiąże się pierwsza i druga specyficzność. Przykładowo, część czynnika anty-wzmacniającego może wiązać komórki T cytotoksyczne (np. przez CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 lub inne komórki układu odpornościowego prowadząc do zwiększenia odpowiedzi odpornościowej wobec komórki docelowej).
W jednym z wykonań, bispecyficzne i multispecyficzne cząsteczki według wynalazku obejmują jako specyficzność wiązania cc najmniej jedno przeciwciało, w tym, np. Fab, Fab', F(ab')2/Fv lub scFv. Przeciwciało może być także dimerem łańcucha lekkiego lub łańcucha ciężkiego, lub dowolnym minimalnym ich fragmentem, takim jak Fv, lub konstruktem pojedynczego łańcucha, jak opisano w Ladner i wsp., patent USA nr 4 946 778. Przeciwciało może także być immunoglobulinową fuzją białkową domeny wiążącej, jak ujawniono w patencie USA nr 2003/0 118 592 i patencie USA nr 2003/0 133 939.
W innym wykonaniu, specyficzność wiązania receptora dla fragmentu Fc jest dostarczana przez ludzkie przeciwciało monoklonalne, którego wiązanie nie jest blokowane przez ludzką immunoglobulinę G (IgG). W użytym tu znaczeniu, termin „receptor dla IgG odnosi się do dowolnego z ośmiu genów łańcucha Y położonego na chromosomie 1. Geny te kodują cały dwunasto-transbłonowy receptor lub jego rozpuszczalne izoformy, które dzielą się na trzy klasy receptora dla fragmentu Fcy: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32) i FcyRIII (CD16). W jednym korzystnym wykonaniu, receptor dla fragmentu Fcy jest ludzkim receptorem FcyRI o wysokim powinowactwie.
Wytwarzanie i charakterystyka tych korzystnych przeciwciał monoklonalnych zostało opisane przez Fanger i wsp. w WO nr 88/00 052 i w patencie USA nr 4 954 617. Przeciwciała wiążą epitop z FcyRI, FcyRII lub FcyRIII w miejscu, które różni się od miejsca wiązania Fcy w receptorze, zatem, ich wiązanie nie jest blokowane zasadniczo przez fizjologiczne poziomy IgG. Swoistymi przeciwciałami anty-FcYRI przydatnymi według wynalazku sa MAo 22, MAb 32, MAb 44, MAb 62 i MAb 197. W innych wykonaniach, przeciwciało anty-FcYRI jest humanizowaną formą MAb 22 (H22). Wytwarzanie i charakterystyka przeciwciała H22 zostało opisane przez Graziano, R. F. i wsp. (1995) J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 i WO nr 94/10 332. Linia komórkowa wytwarzająca przeciwciało H22 została zdeponowana w American Type Culture Collection 4 listopada 1992 pod nazwą HA022CL1 i posiada numer dostępu CRL 11177.
PL 217 296 B1
W jeszcze innych korzystnych wykonaniach, specyficzność wiązania receptora dla fragmentu Fc jest dostarczana przez przeciwciało, które wiąże receptor dla ludzkich IgA, np. FcαRI (CD89), którego wiązanie korzystnie nie jest blokowane przez ludzką immunoglobulinę A (IgA). Termin „receptor dla IgA obejmuje produkt jednego genu a (FcαRI) położonego na chromosomie 19. Wiadomo, że gen ten koduje wiele izoform transbłonowych powstających w wyniku alternatywnego składania RNA o wielkości 55 do HO kDa. FcαRI (CD89) jest konstytutywnie wytwarzany na monocytach/makrofagach, eozynofilach i neutrofilach, lecz nie na populacjach komórek nie będących komórkami efektorowymi. FcαRI posiada średnie powinowactwo do IgA1 i IgA2, które wzrasta po ekspozycji na cytokiny, takie jak G-CSF lub GM-CSF (Morton, H. C. i wsp. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440). Opisano cztery przeciwciała monoklonalne swoiste dla FcαRI, zidentyfikowane jako A3, A59, A62 i A77, które wiążą FcRI na zewnątrz domeny wiążącej ligand IgA (Monteiro, R. C. i wsp., 1992, J. Immnunol. 148: 1764).
FcαRI i FcyRI są korzystnymi receptorami wyzwalającymi do zastosowania według wynalazku ponieważ: (1) są wytwarzane przede wszystkim na komórkach efektorowych układu odpornościowego, np. monocytach, komórkach PMN, makrofagach i komórkach dendrytycznych, (2) są wytwarzane na wysokich poziomach (np. 5000-100000 na komórkę), (3) są mediatorami aktywności cytotoksycznych (np. ADCC, fagocytozy) i (4) biorą udział we wzmacnianiu prezentacji antygenu, w tym własnych antygenów, wycelowanych do nich samych.
„Przeciwciało swoiste dla komórek efektorowych w użytym tu znaczeniu odnosi się do przeciwciała lub funkcjonalnego fragmentu przeciwciała, które wiąże receptor dla fragmentu Fc komórek efektorowych. Korzystne przeciwciała do zastosowania według przedmiotu wynalazku wiążą receptor dla fragmentu Fc komórek efektorowych w miejscu, które nie jest wiązane przez endogenną immunoglobulinę.
W użytym tu znaczeniu, termin „komórka efektorowa odnosi się do komórki układu odpornościowego, która jest wymagana w fazie efektorowej odpowiedzi odpornościowej, w przeciwieństwie do fazy poznawczej i aktywacji odpowiedzi odpornościowej. Przykłady komórek układu odpornościowego obejmują komórki pochodzenia szpikowego lub Iimfatycznego, np. limfocyty (np. komórki B i komórki T, w tym komórki T cytotoksyczne (CTL)), komórki zabójcy, komórki MK, makrefagi, monocyty, eczynofile, neutrcfile, komórki o wielokształtnych jadrach, granulccyty, komórki tuczne i bazefiie. niektóre komórki efektorewe wytwarzają swoiste receptory dla fragmentu Fc i niosą swoiste funkcje immunologiczne. W korzystnych wykonaniach, komórka efektorewa jest zdolna do indukcji ADCC, np. jest neutrofilem zdolnym do indukcji ADCC. Przykładowo, monocyty, makrofagi, które wytwarzają FcR są wymagane w swoistym zabijaniu komórek docelowych i prezentują antygeny innym komponentom układu odpornościowego lub wiążą się z komórkami prezentującymi antygeny. W innym wykonaniu, komórki efektorowe mogą przeprowadzać fagocytozę antygenu, komórki docelowej lub mikroorganizmu. Wytwarzanie określonych FcR na komórce efektorowej może być regulowane przez czynniki humoralne, takie jak cytokiny. Przykładowo, odkryto, że wytwarzanie FcyRI jest zwiększane przez interferon gamma (IFN-γ). Taka wzmocniona ekspresja zwiększa aktywność cytotoksyczną komórek niosących FcyRI wobec miejsc docelowych. Komórki efektorowe mogą przeprowadzać fagocytozę lub lizę docelowego antygenu lub komórki docelowej.
„Komórka docelowa powinna oznaczać dowolną komórkę osobnika (np. ludzką lub zwierzęcą), w którą może trafiać kompozycja (np. ludzkie przeciwciało monoklonalne, bispecyficzna lub multispecyficzna cząsteczka) według wynalazku. W korzystnym wykonaniu, komórka docelowa jest komórką wyrażającą lub nadprodukującą CD25. Komórki wyrażające CD25 zazwyczaj obejmują aktywowane komórki T, monocyty i komórki B.
Bispecyficzne i multispecyficzne cząsteczki według niniejszego wynalazku można wytworzyć przy użyciu technik chemicznych (patrz np. D. M. Kranz i wsp. (1931) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 5307), technik „polydoma (patrz patent USA nr 4 474 893, według Reading) lub technik rekombinacji DNA.
W szczególności, bispecyficzne i multispecyficzne cząsteczki według niniejszego wynalazku można wytwarzać przez koniugowanie składowych specyficzności wiązania, np. specyficzności wiązania anty-FcR i anty-CD25, stosując metody znane specjalistom i opisane w zamieszczonych tu przykładach.
Przykładowo, każdą specyficzność wiązania bispecyficznej i multispecyficznej cząsteczki można wytworzyć oddzielnie i następnie koniugować razem. Kiedy specyficznościami wiązania są białka lub peptydy, do kowalencyjnej koniugacji można użyć różne czynniki sprzęgające lub łączące krzyżo28
PL 217 296 B1 wo. Przykłady czynników łączących krzyżowo obejmują: białko A, karbodiimid, N-bursztynyloimidyloS-acetylotioactan (SATA), kwas 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoesowy) (DTNB), o-fenylenodimaleinoimid (oPDM), N-bursztynyloimidylo-3-(2-pirydyloditio)propionian (SPDP) i sulfonylobursztynyloimidylo 4-(N-maleinoimidometylo)cykloheksano-1-karboksyłan (sulfo-SMCC) (patrz np. Karpovsky i wsp. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686, Liu, M. A, i wsp. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648). Inne metody obejmują te opisane prze Paulus, Behring Ins. Mitt. (1985) nr 78, 118-132, Brennan i wsp., Science (1985) 229: 81-83 oraz Glennie i wsp., U. Immunol. (1987) 139: 2367-2375. Korzystnymi czynnikami koniugującymi są SATA i sulfo-SMCC, oba dostępne w Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Kiedy specyficznościami wiązania są przeciwciała, można je koniugować za pośrednictwem wiązania sulfhydrylowego regionów zawiasowych na końcu C dwóch łańcuchów ciężkich. W szczególnie korzystnym wykonaniu, region zawiasowy jest zmodyfikowany tak, aby zawierał przed skoniugowaniera nieparzystą liczbę reszt sulfhydrylowych, korzystnie jedną.
Alternatywnie, specyficzności wiązania mogą być kodowane w tym samym wektorze i wyrażane oraz składane w tej samej komórce gospodarza. Metoda ta jest szczególnie przydatna wówczas, gdy bispecyficzną i multispecyficzną cząsteczką jest MAb x MAb, MAb x Fab, Fab x F(ab')2 lub fuzja białkowa ligand x Fab. Bispecyficzna i multispecyficzna cząsteczka według wynalazku, np. cząsteczka bispecyficzna może być cząsteczką o pojedynczym łańcuchu, taką jak biswoiste przeciwciało o pojedynczym łańcuchu, która obejmuje jedno przeciwciało o pojedynczym łańcuchu i determinantę wiążącą lub cząsteczką bispecyficzną o pojedynczym łańcuchu obejmującą dwie determinanty wiążące. Bispecyficzne i multispecyficzne cząsteczki mogą także być cząsteczkami o pojedynczym łańcuchu lub mogą obejmować co najmniej dwie cząsteczki o pojedynczym łańcuchu. Metody wytwarzania takich bi- i multispecicznych cząsteczek opisano przykładowo w patentach USA nr 5 260 203, 5 455 030, 4 881 175, 5 132 405, 5 091 513, 5 476 786, 5 013 653, 5 258 498 i 5 482 858.
Wiązanie bispecyficznych i multispecyficznych cząsteczek do specyficznych miejsc docelowych można potwierdzić testem enzymo-immunolcgicznym (FLISA), testem radio-immunologicznym (RIA), analizą FACS, testem biologicznym (np. hamowanie wzrostu), analizą BIAcore lub analizą typu Western Blot. Każdy z tych testów zasadniczo wykrywa obecność kompleksów białko-przeciwciało ze szczególnym uwzględnieniem wykorzystania znakowanego reagenta (np. przeciwciała- swoistego dla nadanego kompleksu. Przykładowo, kompleksy FcR-przeciwciało można wykrywać przy użyciu np. przeciwciała połączonego z enzymem lub fragmentu przeciwciała, który rozpoznaje i swoiście wiąże się z kompleksami przeciwciało-FcR. Alternatywnie, kompleksy można wykrywać przy użyciu różnych innych testów immunologicznych. Przykładowo, przeciwciało można wyznakować radioaktywnie i stosować w teście radio-immunologicznym (RIA) (patrz, przykładowo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986). Radioaktywny izotyp można wykrywać przy użyciu licznika promieniowania γ lub licznika scyntylacyjnego lub autoradiografii.
IV. Immunokoniugaty
W innym aspekcie według wynalazku, ludzkie przeciwciała anty-CD25 są skoniugowane z cząstką terapeutyczną, taką jak cytotoksyna, lek (np. immunosupresyjny) lub radioizotop. Koniugaty takie są tu określane jako „immunokoniugaty. Immunokoniugaty, które obejmują jedną lub większą liczbę cytotoksyn określane są jako „immunotoksyny. Cytotoksyna lub czynnik cytotoksyczny obejmuje dowolny czynnik, który jest szkodliwy (np. zabójczy) dla komórek. Przykłady obejmują taksol, cytochalazynę B, gramicydynę D, bromek etydyny, emetynę, mitomycynę, etopczyd, tenopczyd, winkrystynę, winblastynę, koichicynę, doksorubicynę, daunorubicynę, dion dihydroksy antracyny, raitoksantron, mitramycynę, aktyncnycynę D, 1-dehydrotestosteron, glukokortykoidy, prokainę, tetrakainę, lidokainę, propranolol i puromycynę oraz ich analogi lub homologi.
Dogodne czynniki terapeutyczne do tworzenia inmunokoniugatów według wynalazku obejmują, lecz nie wyłącznie, antymetabolity (np. metotreksat, 6-merkaptopurynę, 6-tioguaninę, cytarabinę, fludarabinę, dekarbazynę 5-fluorouracylu), czynniki alkilujące (np. mechloretaminę, chlorambucil tioepanu, melfalan, karmustyn (BSNU) i lomustynę (CCNU), cyklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocynę, mitomycynę C i cisplatynę (cis-dichlorodiaminę platynową (II) (DDP)), antracykliny (np. daunorubicynę (dawniej daunomycyna) i doksorubicynę), antybiotyki (np. daktynomycynę (dawniej aktynomycyna), bleomycynę, mitramycynę i antramycynę (AMC)) oraz czynniki przeciwmitotyczne (np. winkristynę i winblastwinę). Inne przykłady cytotoksyn terapeutycznych, które można koniugować z przeciwciałem według wynalazku obejmują kalichemicyny i duokarmycyny.
PL 217 296 B1
Przeciwciała według niniejszego wynalazku można także koniugować z radioizotopem, np. jodem-131, itrem-90 lub indem-111, w celu wytworzenia radiofarmaceutyków cytotoksycznych do leczenia zaburzeń związanych z CD25, takich jak rak. Koniugaty przeciwciała według wynalazku można stosować do modyfikacji danej odpowiedzi biologicznej i nie jest wymagane, aby cząstka leku była ograniczona do klasycznych chemicznych czynników terapeutycznych. Przykładowo, cząstką leku może być białko Iub polipeptyd posiadający pożądaną aktywność biologiczną. Białka takie obejmują, przykładowo, toksynę aktywną enzymatycznie lub jej aktywny fragment, taką jak abryna, rycyna A, pseudomonasowa egzotcksyna A lub toksyna błonicy, lub czynnik aktywny na powierzchni komórki, taki jak fosfolipazy, np. fosfolipaza C.
Techniki do koniugowania takich cząstek terapeutycznych z przeciwciałami są dobrze znane, patrz np. Arnon i wsp., „Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, w Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld i wsp. (wyd.), str. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985), Hellstrom i wsp., „Antibodies For Drug Delivery w Controlled Drug Delivery (wyd. 2), Robinson i wsp. (wyd.), str. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987), Thorpe, „Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review w Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera i wsp. (wyd.), str. 475-506 (1985), „Analysis, Results and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy w Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin i wsp. (wyd.), str. 303-16 (Academic Press 1985) oraz Thorpe i wsp., „The Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev., 62: 119-58 (1932).
W dalszym wykonaniu, ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku są przyłączane do linkera-chelatora, (np. tiuksetanu) pozwalajcego na koniugację przeciwciała z radioizotopem.
V. Kompozycje farmaceutyczne
W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza kompozycje, w tym kompozycje farmaceutyczne, zawierające jedno lub kombinację ludzkich przeciwciał monoklonalnych według niniejszego wynalazku. Kompozycje można wytwarzać z farmaceutycznie dopuszczonymi nośnikami lub rozcieńczalnikami, jak również z dowolnymi innymi znanymi adiuwantami i zaróbkami zgodnie z klasycznymi technikami, takimi jak ujawnione w Remington: The Science and Practice of Pharmacy, wyd. 19, Gennaro, wyd. Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995.
Kompozycje według wynalazku można także podawać w terapii skojarzonej, tzn. w połączeniu z innymi czynnikami posiadającymi znaczenie dla leczenia choroby lub stanu. Przykładowo, terapia skojarzona może obejmować kompozycję według niniejszego wynalazku z co najmniej jednym czynnikiem immunosupresyjnym, co najmniej jednym czynnikiem przeciwzapalnym, co najmniej jednym czynnikiem przeciwłuszczycowym lub co najmniej czynnikiem chemioterapeutycznym.
W jednym z wykonań, takie czynniki terapeutyczne obejmują jeden lub większą liczbę czynników immunosupresyjnych, takich jak cyklosporyna, azatiopryna, kwas mykofenolowy, mykofenolan mofetylu, kortykosteroidy, takie jak prednizon, metotreksat, sole złota, sulfasalazyn, czynniki przeciwmalaryczne, brekwinar, leflunomid, mizorybina, 15-deoksyspergalina, 6-merkapocpuryna, cyklofosfamid, rapamycyna, takroiimus (FK-506), OKT3, globulina przeciw-tymocytowa, itd.
W kolejnym wykonaniu, kompozycje według wynalazku są podawane w połączeniu z dwoma lub większą liczbą czynników immunosupresyjnych, takich jak prednizon i cyklosporyna, prednizon, cyklosporyna i azatiopryna lub prednizon, cyklosporyna i mykofenoian mofetylu.
W kolejnym wykonaniu, takie czynniki terapeutyczne obejmują jeden lub większą liczbę czynników przeciwzapalnych, takich jak leki steroidowe lub NSAID (niesteroidowy lek przeciwzapalny). Korzystne czynniki obejmują, przykładowo, aspirynę i inne salicylany, inhibitory Cox-2, takie jak rofekoksyb i celekoksyb, NSAID, jak ibuprofen, fenoprofen, naproksen, sulindak, diklofenak, piroksycam, ketoprofen, diflunisal, nabumeton, etodolak, oksaprozyna i indometacyna.
W innym wykonaniu, takie czynniki terapeutyczne obejmują jeden lub większą liczbę DMARD, takich jak metotreksat, hydroksychlorochina, sulfasalazyna, inhibitory syntezy pirymidyny, np. leflunomid, czynniki blokujące receptory dla IL-1, np. anakinra i czynniki blokujące TNF-α, np. etanercept, infliksymab i adalimumab. Dalszymi odpowiednimi DMARD są przeciwciała anty-IL-6R, CTLA41g i przeciwciała anty-IL-15.
W innym wykonaniu, takie czynniki terapeutyczne obejmują jeden lub większą liczbę czynników do leczenia stanów zapalnych lub zaburzeń nadmiernej proliferacji skóry, takich jak leki domiejscowe, w tym smoła pogazowa, witamina A, antralin, kaicypotrien, tarazoten i kortykosteroidy, leki doustne lub do wstrzyknięcia, takie jak kortykosteroidy, metotreksat, retinoidy, np. acytretyna, cyklosporyna, eta30
PL 217 296 B1 nercept, alefacept, efaluzimab, 6-tioguanina, mykofencian mofetylu, takrclimus (FK-506) i hydroksymocznik. Innymi przykładani są CTLA41g i infliksymab. Inne sposoby leczenia mogą obejmować ekspozycję na słońce lub fototerapię, w tym UVB (promieniowanie ultrafioletowe typu B szerokopasmowe i wąskopasmowe), UVA (promieniowanie ultrafioletowe typu A) i PUVA (metoksalen psoralenu z promieniowaniem ultrafioletowym typu A).
W kolejnym wykonaniu, kompozycje według wynalazku są podawane w połączeniu z dwiema lub większą liczbą powyższych terapii, jak metotreksat + fototerapia (PUVA lub UVA), metotreksat + acitretyna, acitretyna + fototerapia (PUVA lub UVA), metotreksat + acitretyna + fototerapia (PUVA lub UVB), hydroksymocznik + fototerapia (PUVA lub UVB), hydroksymocznik + acitretyna, cyklosporyna + metotreksat lub kalcipotrien + fototerapia (UVB).
W jeszcze innym wykonaniu, takie czynniki terapeutyczne obejmują jeden lub większą liczbę chemioterapeutyków, takich jak doksorubicyna, cisplatyna, bleomycyna, karmustyna, cyklofosfamid, windesyna, winkrystyna i chlorambucil.
W jeszcze innym wykonaniu, niniejsze przeciwciała można podawać w połączeniu z radioterapią i/lub przeszczepem szpiku.
W jeszcze innym wykonaniu, niniejsze przeciwciała można podawać w połączeniu z innymi przeciwciałami, np. innymi ludzkimi immunosupresyjnymi przeciwciałami monoklonalnymi, takimi jak przeciwciała wiążące p75 receptora dla IL-2 lub przeciwciała wiążące np. MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD23, B7, CD40, CD45, IFN-γ, TNF-α, IL-4, 11-5, IL-6R, IL-7, IL-3, IL-10, CD11a, CC20 lub CC53 lub przeciwciała wiążące ich Iigandy, lub w połączeniu z innymi inmunomodulatorami, np. rozpuszczalnym IL-15R lub IL-10.
W użytym tu znaczeniu, „farmaceutycznie dopuszczony nośnik obejmuje jakiekolwiek i wszystkie rozpuszczalniki, podłoża dyspersyjne, czynniki opłaszczające, czynniki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybiczne, czynniki izotoniczne i opóźniające absorpcję i podobne, które nie zaburzają procesów fizjologicznych. Korzystnie, nośnik jest stosowny do podania dożylnego, domięśniowego, podskórnego, pozajelitowego, dokręgosłupowego lub skórnego (np. za pomocą zastrzyku lub infuzji).
„Farmaceutycznie dopuszczone sole odnoszą się do soli, które zachowują pożądaną aktywność biologiczną związku towarzyszącego i nie dają żadnych niepożądanych efektów toksykologicznych (patrz np. Berge, S. M., i wsp. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Przykłady takich soli obejmują kwaśne sole addycyjne i zasadowe sole addycyjne. Kwaśne sole addycyjne obejmują te będące pochodnymi nietoksycznych kwasów nieorganicznych, takich jak kwas chlorowodorowy, azotowy, fosforowy, siarkowy, bromowodorowy, jodowodorowy, fosforawy i im podobne, jak również nietoksycznych kwasów organicznych, takich jak alifatyczne kwasy mono- i dikarboksylowe, alkanowe kwasy z podstawieniem fenylowym, alkanowe kwasy hydroksylowe, kwasy aromatyczne, sulfonowe kwasy alifatyczne i aromatyczne i podobne. Zasadowe sole addycyjne obejmują te będące pochodnymi metali ziem alkalicznych, takich jak sód, potas, magnez, wapń i podobne, jak również nietoksycznych amin organicznych, takich jak N,N'-dibenzyIoetylenodiamina, N-metyloglukoamina, chloroprokaina, cholina, dietanoloamina, etylenodiamina, prokaina i podobne.
Kompozycje według niniejszego wynalazku, obejmujące kompozycje farmaceutyczne (terapeutyczne), można podawać różnymi znanymi sposobami. Doświadczeni specjaliści wiedzą, że droga i/lub sposób podawania różni się w zależności od pożądanych wyników. Aktywne składniki można wytwarzać z nośnikami, które będą chronić związek przed szybkim uwalnianiem, takimi jak preparaty kontrolujące uwalnianie, w tym implanty, plastry przezskórne i systemy dostarczania w mikrokapsułkach. Można stosować polimery biodegradowalne i biokompatybilne, takie jak octan etylenu winylu, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, polyortoestry i kwas polimlekowy. Sposoby wytwarzania takich preparatów są dobrze znane specjalistom, patrz np. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, wyd., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
W celu podania kompozycji według wynalazku określonymi drogami podawania może być konieczne opłaszczenie związku materiałem chroniącym przed inaktywacją. Przykładowo, związek można podawać osobnikowi w odpowiednim nośniku, przykładowo liposomach lub rozcieńczalniku. Farmaceutycznie dopuszczone rozcieńczalniki obejmują sól fizjologiczną i zbuforowane roztwory wodne. Liposomy obejmują emulsje CGF woda-w-oIeju-w-wodzie, jak również liposomy klasyczne (Strejan i wsp. (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27).
Farmaceutycznie dopuszczone nośniki obejmują sterylne roztwory wodne lub dyspergatory i sterylne proszki do przygotowania na poczekaniu sterylnych roztworów lub dyspergatorów gotowych do zastrzyku. Zastosowanie podłoży i czynników do farmaceutycznie aktywnych substancji jest znane
PL 217 296 B1 w dziedzinie. Użycie ich w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku jest rozważane z wyjątkiem sytuacji, kiedy klasyczne podłoże lub czynnik wyklucza się z aktywnym związkiem. Do kompozycji można także włączyć dodatkowe aktywne związki.
Kompozycje terapeutyczne zazwyczaj muszą być sterylne i stabilne w warunkach produkcyjnych i przechowywania. Kompozycja może być przygotowana w postaci roztworu, mikroemulsji, liposomu lub innej uporządkowanej struktury stosownej do wysokich stężeń leku. Nośnik może być rozpuszczalnikiem lub podłożem dyspergującym zawierającym, przykładowo wodę, etanol, poliol (przykładowo glicerol, glikol polipropylenowy i płynny glikol polietylenowy i podobne) i ich odpowiednie mieszaniny. Właściwą płynność można utrzymać, przykładowo, przez użycie czynników opłaszczających takich jak lecytyna, przez utrzymanie wymaganego rozmiaru cząstek w przypadku środka dyspersyjnego i przez użycie czynników powierzchniowo czynnych. W wielu przypadkach, korzystne będzie włączenie do kompozycji czynników izotonicznych, przykładowo, cukrów, polialkoholi, takich jak glicerol, manitol, sorbitol Iuo chlorku sodu. Przedłużoną absorpcję kompozycji do zastrzyków można osiągnąć przez włączenie do kompozycji czynnika, który opóźnia absorpcję, przykładowo soli mono- stearynianowych i żelatyny.
W jednym z wykonań ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku są podawane w postaci krystalicznej przez wstrzyknięcie podskórne, porównaj Yang i wsp. (2003) PNAS, 100 (12): 6934-6939.
Sterylne roztwory do zastrzyków można wytwarzać przez wprowadzenie do odpowiedniego rozpuszczalnika aktywnego związku w wymaganej ilości z jednym lub kombinacją składników wymienionych powyżej, jeśli to jest konieczne, a następnie sterylizację przez mikrofiltrację. Zazwyczaj, roztwory dyspersyjne są wytwarzane przez wprowadzenie aktywnego związku do sterylnego nośnika, który zawiera podstawowe podłoże dyspersyjne i inne wymagane składniki z wymienionych powyżej. W przypadku sterylnych proszków do wytwarzania sterylnych roztworów do wstrzyknięcia, korzystnymi metodami wytwarzania są suszenie w próżni i suszenie sublimacyjne (liofilizacja), które dają sproszkowany aktywny składnik i dowolny dodatkowy pożądany składnik z ich roztworu sterylizowanego wcześniej przez filtrację.
Sposoby podawania dawki są dostosowane tak, aby dostarczyć optymalną pożądaną odpowiedź (np. odpowiedź terapeutyczną). Przykładowo, można podać pojedynczy bolus, kilka podzielonych dawek można podawać przez dany okres czasu lub dawki można proporcjonalnie redukować lub zwiększać według wskazań wymogów sytuacji terapeutycznej. Jest to szczególnie korzystne przy przygotowywaniu kompozycji pozajelitowych w postaci jednostki dawkowania dla łatwego podawania i jednolitego dawkowania. Postać jednostki dawkowania, w użytym tu znaczeniu, odnosi się do fizycznie oddzielnych jednostek dostosowanych jako jednostkowe dawkowanie dla leczonego osobnika, każda jednostka zawiera ustaloną wcześniej ilość aktywnego związku obliczoną tak, aby wytwarzać pożądany efekt terapeutyczny w połączeniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. Opis postaci jednostki dawkowania według wynalazku jest podyktowany i bezpośrednio zależny od (a) unikatowej charakterystyki aktywnego związku i osiągnięcia określonego efektu terapeutycznego oraz (b) ograniczeń właściwych mieszaninie takiego aktywnego związku do leczenia wrażliwości u osobników.
Przykłady farmaceutycznie dopuszczonych antyoksydantów obejmują: (1) antyoksydanty rozpuszczalne w wodzie, takie jak kwas askorbinowy, chlorowodorek cysteiny, wodorosiarczan sodowy, pirosiarczyn sodowy, siarczyn sodowy i podobne, (2) antyoksydanty rozpuszczalne w olejach, takie jak palmitynian skorbylowy, butylowany hydroksyanizol (BHA), butylowany hydroksytoluen (BHT), lecytyna, galusan propylowy, tokoferol alfa i podobne oraz (3) czynniki chelatujące metal, takie jak kwas cytrynowy, kwas etylenodiaminotertraoctowy (EDTA), sorbitol, kwas winowy, kwas fosforowy i podobne.
Kompozycje terapeutyczne według niniejszego wynalazku można wytwarzać dla określonych dróg podawania, takich jak podawanie doustne, donosowe, miejscowe (w tym dopoliczkcwe i podjęzykowe), doodbytnicze, dopochwowe i/lub pozajelitowe. Preparaty mogą tradycyjnie być obecne w postaci jednostki dawkowania i mogą być przygotowane dowolnymi sposobami znanymi w dziedzinie farmacji. Ilość aktywnego składnika, którą można połączyć z materiałem nośnikowym do wytworzenia postać pojedynczej dawki będzie różna w zależności od osobnika poddawanego leczeniu i określonego sposobu podawania. Ilość aktywnego składnika, który można połączyć z materiałem nośnikowym do wytworzenia postaci pojedynczej dawki będzie zazwyczaj ilością kompozycji dającej efekt terapeutyczny. Zazwyczaj, poza stoma procentami, ilość ta będzie mieściła się w zakresie od około 0,01% do około 99% aktywnego składnika, korzystnie od około 0,1% do około 70%, korzystniej od około 1% do około 30%.
PL 217 296 B1
Preparaty według niniejszego wynalazku, odpowiednie do podawania dopochwowego także zawierają krążki maciczne, tampony, kremy, żele, pasty, pianki lub preparaty w sprayu zawierające nośniki uznane w dziedzinie jako odpowiednie. Postaci do podawania miejscowego lub przezskórnego kompozycji według wynalazku obejmują pudry, spraye, maści, pasty, kremy, płyny, żele, roztwory, plastry i preparaty do inhalacji. Aktywny związek może być zmieszany w sterylnych warunkach z farmaceutycznie dopuszczonym nośnikiem i z dowolnymi wymaganymi środkami konserwującymi, buforami lub propelentami.
Wyrażenia „podawanie pozajelitowe i „podawany pozajelitowo w użytym tu znaczeniu oznaczają sposoby podawania inne niż podawanie dojelitowe i miejscowe, zazwyczaj przez wstrzyknięcie i obejmuje, lecz nie wyłącznie, wstrzyknięcie i infuzję dożylną, domięśniową, dctętniczą, dooponową, wewnątrztorebkową, dooczodołową, dosercową, śródskórną, dootrzewnową, przez tchawicę, podskórną, ponadskórkową, dostawową, podtorebkową, podpajęczynówkową, dokanałową, nadtwardówkową i domostkową.
Przykłady odpowiednich nośników wodnych i nie, które można wykorzystać w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku obejmują wodę, etanol, poliole (takie jak glicerol, glikol propylenowy, glikol polietylenowy i podobne) i ich odpowiednie mieszaniny, oleje roślinne, takie jak olej z oliwek i odpowiednie do wstrzykiwania estry organiczne, takie jak oleinian etylowy. Właściwą płynność można utrzymać, przykładowo, przez użycie czynników spłaszczających, takich jak lecytyna, przez utrzymanie wymaganego rozmiaru cząstek w przypadku środków dyspersyjnych i przez użycie czynników powierzchniowo czynnych.
Kompozycje te mogą także zawierać adiuwanty, takie jak środki konserwujące, środki nawilżające, środki emulgujące i środki dyspersyjne. Zapobieganie obecności mikroorganizmów można zapewnić za pomocą procedur sterylizacji, powyżej i przez wprowadzenie różnych czynników przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych, przykładowo, parabenu, chlorobutanolu, fenolu, kwasu sorbinowego i podobnych. Może także być pożądane włączenie do kompozycji środków izotonicznych, takich jak cukry, chlorek sodowy i podobne. Dodatkowo, przedłużenie absorpcji postaci farmaceutycznej do wstrzyknięcia można osiągnąć przez włączenie czynników, które opóźniają absorpcję, takich jak monostearynian glinu i żelatyna.
Kiedy kompozycje według niniejszego wynalazku są podawane jako farmaceutyki ludziom i zwierzętom, mogą być podawane pojedynczo lub jako kompozycja farmaceutyczna zawierająca, przykładowo, 0,01 do 99,5% (korzystniej 0,1 do 90%) aktywnego składnika w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczonym nośnikiem.
Bez względu na wybraną drogę podawania, związki według niniejszego wynalazku, które można stosować w odpowiednio uwodnionej postaci i/lub kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku, są przygotowywane w farmaceutycznie dopuszczanych postaciach dawkowania za pomocą klasycznych metod znanych specjalistom.
Rzeczywiste poziomy dawkowania aktywnych składników w kompozycjach farmaceutycznych według niniejszego wynalazku mogą być różne ze względu na potrzebę uzyskania ilości aktywnego składnika, która jest skuteczna dla osiągnięcia pożądanej odpowiedzi terapeutycznej u określonego pacjenta, kompozycję i sposób podawania, bez efektu toksycznego dla pacjenta. Wybrany poziom dawkowania będzie zależny od różnych czynników farmakokinetycznych, w tym od aktywności wykorzystanych określonych kompozycji według niniejszego wynalazku lub ich estru, soli lub amidu, drogi podawania, czasu podawania, poziomu wydalania określonego wykorzystanego związku, czasu trwania leczenia, wykorzystania innych leków, związków i/lub materiałów w kombinacji z określonymi kompozycjami, wieku, pici, wagi, kondycji, ogólnego stanu zdrowia i wcześniejszej historii medycznej leczonego pacjenta i podobnych czynników znanych w medycynie.
Doświadczony lekarz lub weterynarz z łatwością określi i przepisze skuteczną ilość wymaganej kompozycji farmaceutycznej. Przykładowo, lekarz lub weterynarz mogą rozpocząć dawkowanie związków według wynalazku wykorzystanych w kompozycji farmaceutycznej na poziomie niższym niż wymagany dla osiągnięcia efektu terapeutycznego i stopniowo zwiększać dawkowanie do osiągnięcia pożądanego efektu. Zazwyczaj, stosowną dzienną dawką kompozycji według wynalazku będzie taka ilość związku, która jest najniższą skuteczną dawką dającą efekt terapeutyczny. Taka skuteczna dawka będzie zazwyczaj zależeć od czynników opisanych powyżej. Korzystne jest podawanie dożylne, domięśniowe, dootrzewnowe lub podskórne, korzystnie podawane w pobliżu miejsca docelowego. Kiedy jest możliwe podanie samego związku według niniejszego wynalazku, możliwe jest podawanie związku jako preparatu farmaceutycznego (kompozycja). Dawkowanie można określić lub dostosować
PL 217 296 B1 mierząc w próbce biologicznej ilość krążącego monoklonalnego przeciwciała anty-CD25 w różnych punktach czasowych po podaniu, przez użycie przeciwciał anty-idiotypowych celujących w przeciwciała anty-CD25.
Ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku można podawać celem zapobiegnięcia odrzucenia przeszczepu przez zaindukowanie leczenia, tzn. jako profilaktyczną krótkoterminową terapię, przez pojedyncze lub wielokrotne podawanie, przed przeszczepem i w bardzo wczesnej fazie po przeszczepie, np. krótko przed i do 3 miesięcy po przeszczepie.
W jednym z wykonań, przeciwciała monoklonalne według wynalazku mogą np. być podawane celem zapobiegnięcia odrzucenia przeszczepu w całkowitym dawkowaniu około 20 do 100 mg, np. podawane jako 15 lub 20 mg dożylne infuzje z pierwszą dawką podaną przed operacją i następnymi dawkami podanymi w ciągu pierwszych 10 dni po operacji. Alternatywnie, dawkowania można podawać przez wstrzyknięcie bolusa. W innym wykonaniu przeciwciała monoklonalne według wynalazku można podawać celem zapobiegnięcia odrzucenia przeszczepu w dawkowaniu od 0,5-1,5 mg/kg dożylnie, co drugi tydzień do pięciu dawek, z pierwszą dawką podaną przed operacją. Takie podawanie można łączyć z terapią immunosupresyjną, np. ze steroidami, takimi jak prednizon lub metyloprednizolon i cyklosporyna, steroidami, takimi jak prednizon lub metyloprednizolon, cyklosporyna i azatiopryna, lub steroidami, takimi jak prednizon lub metyloprednizolon, cyklosporyna i mykofenolan mofetylu. Podawanie ludzkich przeciwciał może korzystnie oszczędzić podawania steroidu lub prowadzić do szybkiego wycofania steroidu.
W innym wykonaniu, ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku nożna podawać celem leczenia lub zapobiegnięcia odrzucenia przeszczepu za pomocą sposobu podawania infuzji dożylnej złożonego z dwóch dawek (około 20 mg w dawce w dniu przeszczepu i około 20 mg 4 dnia po przeszczepie). Takie podawanie można łączyć z terapią immunosupresyjną, np. jak ujawniono powyżej. Przykładowo, 1 g mykofenolan mofetylu można podawać doustnie przed operacją i 500 mg metyloprednizolonu podczas indukowania uśpienia. Cyklosporynę można wprowadzić drugiego dnia po przeszczepie i można kontynuować podawanie po przeszczepie mykofenolanu mofetylu w ilości 1 g. Steroidy można zawęzić do 20 mg prednizonu podawanego doustnie czwartego dnia po operacji.
W jeszcze innym wykonaniu, ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku można podawać celem leczenia lub zapobiegnięcia odrzucenia przeszczepu za pomocą terapii indukcyjnej składającej się z dwóch dawek, z podaniem pierwszej dawki 1 mg/kg 1 godz. przed zabiegiem i drugiej dawki 4 dni po przeszczepie. Takie podawanie można łączyć z terapią immunosupresyjną, np. taką jak ujawniono powyżej.
Ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku można podawać celem leczenia lub zapobiegnięcia odrzucenia przeszczepu za pomocą długoterminowej terapii, np. przez podawanie dawki w zakresie od 10 do 150 mg, takim jak 20 do 40 mg, w tygodniowych okresach lub miesięcznych okresach, przykładowo 3 do 8 tygodniowych podań, ewentualnie z następującymi po tym podaniami przez jeden lub większą liczbę miesięcy. W terapii długoterminowej terapię utrzymywaną za pomocą cyklosporyny można zredukować Iub pominąć.
Terapeutyczne kompozycje przeciwciała można podawać przez urządzenia medyczne znane w dziedzinie. Przykładowo, w korzystnym wykonaniu, kompozycję terapeutyczną według wynalazku można podawać w bezigłowym urządzeniu do podskórnego wstrzyknięcia, takim jak urządzenia ujawnione w patentach USA nr 5 399 163, nr 5 383 851, nr 5 312 335, nr 5 064 413, nr 4 941 880, nr 4 790 824 lub nr 4 596 556. Przykłady dobrze znanych aplikatorów i modułów przydatnych według niniejszego wynalazku obejmują: patent USA nr 4 487 603, który ujawnia mikroinfuzyjną pompę do wszczepienia dawkującą lek na kontrolowanym poziomie, patent USA nr 4 486 194, który ujawnia urządzenie terapeutyczne do podawania leków przez skórę, patent USA nr 4 447 233, który ujawnia pompę do infuzji leku celem dostarczania leku przy ściśle określonym poziomie infuzji, patent USA nr 4 447 224, który ujawnia aparat infuzyjny do wszczepienia o zmiennym przepływie do ciągłego podawania leku, patent USA nr 4 439 196, który ujawnia osmotyczny system dostarczania leku posiadający wielokomorowe przedziały oraz patent USA nr 4 475 196, który ujawnia osmotyczny system dostarczania leku. Specjalistom znanych jest wiele innych aplikatorów, systemów dostawczych i modułów.
W pewnych wykonaniach, ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku można przygotowywać w preparatach dla zapewnienia prawidłowej dystrybucji in vivo. Przykładowo, bariera krew-mózg (BEB) wyklucza wiele wysoko hydrofilowych związków. Dla zapewnienia, że związki terapeutyczne według wynalazku przejdą BBB, jeśli pożądane, nożna je przygotować w preparatach, przykładowo, w liposomach. Dla zapoznania się z metodami prcdukcji liposomów, patrz np. patenty USA nr nr
PL 217 296 B1
522 811, 5 374 543 i 5 399 331. Liposomy mogą obejmować jedną lub większą liczbę cząstek, które są selektywnie transportowane do specyficznych komórek lub narządów, co wzmacnia docelowe dostarczanie leku (patrz np. V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Przykłady cząstek do docelowego dostarczania obejmują folan lub biotinę (patrz np. US nr 5 416 016 to Low i wsp.), mannozydy (Umezawa i wsp., (1988) Blochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038), przeciwciała (P. G. Bloeman i wsp. (1995) FEBS Lett. 357: 140, M. Owais i wsp. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180), powierzchniowo czynny receptor dla białka A (Briscoe i wsp. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134), różne gatunki, które mogą obejmować preparaty według wynalazków, jak również związki wynalezionych cząsteczek, pl20 (Schreier i wsp. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090), patrz także K. Keinanen, M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123, J. J. Killion, I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. W jednym z wykonań według wynalazku, związki terapeutyczne według wynalazku są przygotowane w liposomach, w korzystniejszym wykonaniu, liposomy obejmują cząstki do docelowego dostarczania. W najkorzystniejszym wykonaniu, związki terapeutyczne w liposomach są dostarczane przez wstrzykniecie bolusa w pobliżu pożądanego obszaru, np. w miejscu zapalenia lub zakażenia, lub miejscu nowotworu. Kompozycja musi być płynna w takim stopniu, aby istniała możliwość łatwego pobierania strzykawką. Musi być ona stabilna w warunkach produkcji i przechowywania i musi być chroniona przed zanieczyszczającym działaniem mikroorganizmów, takich jak bakterie i grzyby.
Skuteczne dawkowanie i tryby dawkowania ludzkich przeciwciał monoklonalnych według wynalazku zależą od leczonej choroby lub stanu chorobowego i mogą być określone przez specjalistów w dziedzinie.
„Dawkowanie skuteczne terapeutycznie w zapobieganiu odrzucenia przeszczepu korzystnie będzie redukować liczbę i siłę przypadków wczesnego odrzucenia przeszczepu.
„Dawkowanie skuteczne terapeutycznie w reumatoidalnym zapaleniu stawów będzie prowadziło, według Amerykańskiego Kolegium Reumatologii (ACR), do poprawy w przebiegu leczenia reumatoidalnego zapalenia u pacjentów wynoszącej ACR20, korzystnie wynoszącej ACR50 i jeszcze korzystniej wynoszącej ARC70.
Kryteria poprawy wynoszącej ACR20 są określone przy pomocy następujących parametrów: > 20% poprawa: ilości bolesnych stawów (ang. Tender Joint Count, TJC) i ilości obrzękniętych stawów (ang. Swollen Joint Count, SJC) i 20% poprawa 3 z 5 następujących wskaźników: ocena dolegliwości bólowych przez pacjenta (za pomocą skali VAS), ocena aktywności choroby przez pacjenta (za pomocą skali VAS), ocena aktywności choroby przez lekarza (za pomocą skali VAS), ocena upośledzenia fizycznego przez pacjenta (za pomocą kwestionariusza HAQ) i wartości wskaźników zapalenia (CRP Iuo ERS (czyli GE, po polsku ESR to wartość CB)).
Analogicznie są zdefiniowane warunki poprawy ACR50 i ACR70, jeśli wystąpiła odpowiednio 50% i 70% poprawa powyższych parametrów. Dla zapoznania się dalszymi szczegółami, patrz Felson i wsp. w American College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis, Arthritis Rheumatism (1995) 38: 727-735.
Alternatywnie, dawkowanie skuteczne terapeutycznie dla reumatoidalnego zapalenia stawów można określać za pomocą DAS (współczynnik aktywności choroby), w tym DAS28 i, korzystniej, DAS56, zdefiniowane przez EULAR.
„Dawkowanie skuteczne terapeutycznie dla łuszczycy prowadzi do uzyskania u pacjentów indeksu PASI50, korzystniej PASI75, a jeszcze korzystniej PASI90 lub ogólnego zmniejszenia łuszczycy oszacowanego na podstawie polepszenia po leczeniu lekiem w porównaniu ze stanem sprzed leczenia. PASI (Psoriasis Area and Severity Index) jest systemem badania stosowanym do oceny powierzchni objętej chorobą i ciężkości choroby. Indeks PASI50 jest określony jako 50% poprawa. Analogicznie, zdefiniowane są odpowiednio indeksy PASI75 i PASI90 jako 75% i 90% poprawa.
„Dawkowanie skuteczne terapeutycznie w terapii nowotworowej można mierzyć na podstawie odpowiedzi nowotworu u osobnika, które mogą być pełne lub częściowe. Odpowiedź pełna (ang. complete response, CR) określona jest jako brak klinicznych, radiologicznych lub innych dowodów choroby. Odpowiedź częściowa (ang. partial response, PR) charakteryzuje się redukcją rozmiaru nowotworu ponad 50%. Średni czas progresji jest miarą charakteryzującą trwanie odpowiedzi na nowotwór u pacjenta.
„Dawkowanie skuteczne terapeutycznie w terapii nowotworowej można mierzyć na podstawie jego zdolności ustabilizowania postępowania choroby. Zdolność związku do hamowania nowotworu można oszacować w systemie modelu zwierzęcego przewidującym skuteczność dla nowotworów ludzkich.
PL 217 296 B1
Alternatywnie, tę własność kompozycji można oszacować przez zbadanie zdolności związku do hamowania wzrostu komórkowego lub indukcji apoptozy w znanych praktykującym specjalistom testach in vitro. Skuteczna terapeutycznie ilość może zmniejszyć wielkość nowotworu lub z drugiej strony złagodzić objawy choroby u osobnika. Specjalista w dziedzinie będzie w stanie określić takie ilości na podstawie czynników takich jak wielkość osobnika, ostrość objawów u osobnika i wybrana określona kompozycja lub droga podawania.
VI. Zastosowania i metody wynalazku
Przeciwciała ludzkie według niniejszego wynalazku, jak i ich pochodne/koniugaty i kompozycje, mają liczne zastosowania obejmujące leczenie zaburzeń, w których pośredniczy CD25 lub zaburzeń obejmujących komórki wyrażające CD25.
W jednym z wykonań, przeciwciała ludzkie według niniejszego wynalazku można podawać in vivo podmiotowi, aby zablokować lub zahamować wiązanie CD25 z jego iigandem (IL-2). To, z kolei, można wykorzystać do zapobiegania lub hamowania różnych chorób związanych z komórkami niosącymi CD25.
Przyładowymi chorobami, które można leczyć (np. łagodzić) lub którym nożna zapobiegać są, lecz nie wyłącznie, odrzucenie przeszczepu, w tym odrzucenie aloprzeszczepu i heteroprzeszczepu, u pacjentów, którzy przechodzą lub przeszli przeszczepienie narządu lub tkanki, jak przeszczep serca, płuca, łącznie serca-płuca, tchawicy, nerki, wątroby, trzustki, przełyku, jelita, skóry, przeszczep kończyny, przeszczep pępowiny, przeszczep komórki macierzystej układu krwiotwórczego, przeszczep komórki wyspy trzustkowej itd. Pacjenci tacy obejmują dorosłych, ale mogą również być pacjentami pediatrycznymi.
Przeciwciała według niniejszego wynalazku można, zatem profilaktycznie stosować w odrzuceniu aloprzeszczepu i heteroprzeszczepu lub do odwrócenia, leczenia lub innego złagodzenia epizodów ostrego odrzucenia aloprzeszczepu lub heteroprzeszczepu.
Dalsze choroby, które można leczyć obejmują reakcję przeszczepu przeciw gospodarzowi, np. reakcję przeszczepu przeciw gospodarzowi przy transfuzji krwi i reakcję przeszczepu przeciw gospodarzowi przy przeszczepie szpiku, choroby zapalne, immunologiczne lub autoimmunologiczne, takie jak reumatoidalne zapalenia stawów, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, artropatia łuszczycowa, cukrzyca typu 1, cukrzyca typu 2 wymagająca insuliny, stwardnienie rozsiane, układowy toczeń rumieniowaty, miastenia ciężka, choroba zapalna jelita, choroba Crohna, zapalenie okrężnicy wrzodziejące, akrodynia, zespół Sjogrena, zapalenia tętnicy, w tym zapalenie tętnicy skroniowej olbrzymiokomórkowe, niedokrwistość aplastyczna, astma, twardzica skóry i zapalenie błony naczyniowej oka, zapalenie lub zaburzenia nadmiernej proliferacji komórek skóry, np. łuszczyca, w tym łuszczyca płytkowa, dłoniowo-stopowa łuszczyca krostkowa (PPP), liszaj płaski z nadżerkami, pęcherzyca pęcherzowa, pęcherzyca z oddzieleniem naskórka, zapalenie skóry kontaktowe i zapalenie skóry atopowe oraz różnorodne nowotwory limfoidalne, np. białaczka z komórkami T, choroba Hodgkina, białaczka kosmatokomórkowa lub chłoniak skórny z limfocytów T, w tym ziarniniak grzybiasty i zespół Sezaryego.
Dalszymi chorobami, które można leczyć są:
- nowotwory złośliwe, w których korzystne jest hamowanie naciekających regulatorowych komórek T CD25+, takie jak rak żołądka, raki przełyku, czerniak złośliwy, rak jelita grubego, rak trzustki, rak piersi, rak płuca małokomórkowy, rak płuca nie małokomórkowy, rak szyjki macicy, rak jajnika i rak komórek nerkowych,
- zaburzenia hematologiczne, takie jak białaczka/chłoniak komórek T dojrzałych, chłoniak z anaplastycznymi komórkami dużymi, białaczka limfoblastyczna przewlekła (CLL)/białaczka limfoblastyczna z komórkami małymi (SLL), chłoniak z obwodowych komórek T i wtórna skrcbiawica,
- zaburzenia skórne, takie jak piodermia zgorzelinowa, ziarniniak obrączkowy, alergiczne kontaktowe zapalenie skóry, pemfigoid bliznowaty i opryszczka ciężarnych,
- zaburzenia wątrobowo-żołątkowo-jelitowe, takie jak zapalenie okrężnicy kolagenowe, stwardniające zapalenie dróg żółciowych, przewlekłe aktywne zapalenie wątroby, zapalenie wątroby w toczniu rumieniowatym, autoimmunologiczne zapalenie wątroby, zapalenie wątroby alkoholowe, zapalenie trzustki przewlekłe i zapalenie trzustki ostre,
- zaburzenia sercowe, takie jak zapalenie mięśnia sercowego i zapalenie osierdzia,
- zaburzenia naczyniowe, takie jak stwardnienie tętnic, zapalenie tętnicy skroniowej olbrzymiokomórkowe/zespół bólu wielomięśniowego z wysokim OB, zapalenie tętnicy Takayasu, zapalenie guzkowate tętnic, zespół Kawasakiego, ziarniak Wegenera, zapalenie wielonaczyniowe mikroskopijne,
PL 217 296 B1 zespół Churga i Straussa, zapalenie naczyń leukocytoklastyczne i zapalenie naczyń leukocytoklastyczne wtórne,
- zaburzenia nerkowe, takie jak ostre zapalenie kłębuszków nerkowych ostre, przewlekłe zapalenie kłębuszków nerkowych, zapalenie nerek z małymi zmianami i zespół Goodpasturea,
- zaburzenia płucne, takie jak zapalenie pęcherzyków płucnych, zapalenie oskrzelików zarostowe, pylica krzemowa i pylica berylowa,
- zaburzenia neurologiczne, takie jak stwardnienie rozsiane, choroba Alzheimera, miastenia ciężka, polineurcpatia demielinacyjna przewlekła i zapalenie wielokorzeniowe, w tym zespół Guillaina i Barrego,
- zaburzenia tkanki łącznej, takie jak zapalenie wielochrząstkowe nawracające, sarkoidoza, uogólniony toczeń rumieniowaty, toczeń CNS, tcczeń rumieniowaty przewlekły, toczeń rumieniowaty z zapaleniem nerek, zespół zmoczenia przewlekłego i ból wiókienek mięśniowych,
- zaburzenia endokrynologiczne, takie jak choroba Gravesa, wole Hashimoto i zapalenie tarczycy podostre oraz
- zakażenia wirusowe, takie jak niedowład kończyn dolnych kurczowy tropikalny.
Odpowiednie drogi podawania in vivo i in vitro kompozycji przeciwciał (np. przeciwciał ludzkich i immunokoniugatów) według niniejszego wynalazku są dobrze znane w dziedzinie i mogą być wybierane przez osoby z przeciętnymi umiejętnościami. Przykładowo, kompozycje przeciwciał można podawać przez wstrzyknięcie (np. dożylne lub podskórne). Odpowiednie dawkowania stosowanych cząsteczek będą zależeć od wieku i wagi podmiotu oraz stężenia i/lub preparatu kompozycji przeciwciał.
Przeciwciało można podawać samo lub wraz z innym środkiem leczniczym, takim jak środek immunosupresyjny, środek przeciwzapalny, środek do leczenia zapalenia lub zaburzeń nadmiernej proliferacji skóry, środek chemioterapeutyczny lub cytotoksyna, działająca w połączeniu lub synergistycznie z kompozycją przeciwciał do leczenia lub zapobiegania chorobom związanym z komórkami wyrażającymi CD25, zwłaszcza aktywowanymi komórkami T.
Jak opisano poprzednio, ludzkie przeciwciała anty-CD25 według niniejszego wynalazku mogą być podawane razem z jednym lub innymi bardziej skutecznymi czynnikami, np. czynnikiem immunosupresyjnym lub czynnikiem przeciwzapalnym w celu zwiększenia ogólnego oddziaływania przeciwzapalnego. Przeciwciało może być połączone z czynnikiem (jako immunokompleks) lub może być podawane rozdzielnie z czynnikiem. W tym ostatnim przypadku (podawanie rozdzielne), przeciwciało można podawać przed, po lub równocześnie z czynnikiem.
Do zakresu niniejszego wynalazku należą również zestawy obejmujące kompozycje przeciwciał według wynalazku (np. ludzkie przeciwciała i immunokoniugaty) wraz z instrukcjami ich użycia. Zestawy mogą ponadto zawierać jeden lub większą liczbę dodatkowych czynników, takich jak środek immunosupresyjny lub jedno, lub większą liczbę dodatkowych przeciwciał ludzkich według wynalazku.
Zgodnie z tym, pacjentom leczonym kompozycjami przeciwciał według wynalazku można dodatkowo podawać (przed, równolegle lub po podaniu ludzkich przeciwciał według wynalazku) inny środek leczniczy, taki jak środek immunosupresyjny, środek przeciwzapalny, środek do leczenia zapalenia lub zaburzeń nadmiernej proliferacji skóry lub środek chemioterapeutyczny, który wzmacnia lub powiększa efekt terapeutyczny przeciwciał ludzkich.
W jeszcze innym wykonaniu, immunokoniugaty według wynalazku można stosować dc docelowego naprowadzania składników (np. czynników leczniczych, znaczników, cytctoksyn, czynników immunosupresyjnych, itd.) do komórek, które na swej powierzchni mają związany CD25 dzięki połączeniu takich składników z przeciwciałem.
Zatem, wynalazek dostarcza również sposoby do lokalizacji ex vivo lub in vitro komórek wyrażających CD25 (np. za pomocą wykrywalnego znacznika, takiego jak radioizotop, czynnik fluorescencyjny, enzym lub kofaktor enzymu). W innym wykonaniu, wynalazek dostarcza sposoby zabijania komórek, które wiążą na swojej powierzchni CD25 za pomocą podawania immunotoksyn według niniejszego wynalazku.
W dalszym wykonaniu, przeciwciała według wynalazku można stosować do diagnozowania in vivo lub in vitro chorób, w których aktywowane komórki wyrażające CD25 pełnią czynną rolę w patogenezie za pomocą wykrywania poziomów CD25 lub poziomów komórek zawierających CD25 na powierzchni błon.
Przykładowo, można to osiągnąć przez kontaktowanie badanej próbki, ewentualnie wraz z próbką kontrolną, z przeciwciałem ludzkim w warunkach pozwalających na tworzenie kompleksu pomiędzy przeciwciałem i CD25.
PL 217 296 B1
Tworzenie się kompleksu jest następnie wykrywane (np. przy użyciu testu ELISA). Kiedy razem z badaną próbką stosuje się próbkę kontrolną kompleks jest wykrywany w obu próbkach i jakakolwiek znacząca różnica pomiędzy próbkami w tworzeniu się kompleksów wskazuje na obecność CD25 w próbce badanej.
Niniejszy wynalazek jest dalej zilustrowany za pomocą następujących przykładów, które nie powinny być interpretowane jako ograniczające.
Przykłady
P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie ludzkich przeciwciał przeciw CD25
Antygen: uzyskano linię komórkową transfektanta wyrażającą na powierzchni komórkowej CD25 w celu użycia jej jako czynnika do immunizowania myszy HuMAb i charakteryzowania przeciwciał ancy-CD25.
Linia komórkowa była linią komórek CHO skonstruowaną do wyrażania zewnątrzkomórkowych domen CD25 sprzężonych z transbłonową domeną receptora czynnika wzrostu płytek krwi.
Sekwencje CD25 amplifikowano z cDNA przygotowanego z komórek HUT102, a sekwencje receptora czynnika wzrostu płytek krwi uzyskano z wektora pDISPLAY (Invitrogen Corporation).
Konstrukt ekspresyjny kodujący fuzję białkową skonstruowano w wektorze ekspresyjnym.
Linię komórkową transfertanta CHO poddano 2 cyklom amplifikacji z 5 nM i 50 nM metotreksatem w celu podniesienia poziomów wyrażania CD25.
Hodowla transfectomy CHO-CD25: komórki transfektomy CHO-CD25 (Medarex Inc., NJ, USA) hodowano w podłożu CHO-S-SFM II (Gibco BRL), z hipoksantyną, bez tymidyny, z penicyliną (5000 U/ml), streptomycyną (5000 mg/ml, BioWhittaker, Belgia) i metotreksatem (stężenie końcowe 50 nM, Sigma).
Komórki odświeżano co dwa do trzech dni.
Myszy transgeniczne: Myszy HCo7 i HCo12 trzymano w filtrowanych klatkach i sprawdzano czy są w dobrej kondycji fizycznej w dniach immunizacji, skrwawiania i w dniu połączenia.
Wszystkie myszy wytwarzające wybrane hybrydomy były płci męskiej. Myszy o ID. NR 23185, 23196, 23197 i 23198 posiadały genotyp (CMD)++, (HCo7) 11952+, (JKD)++, (KCo5) 9272+.
Mysz o ID. NR 23175 posiadała genotyp (CMD)+-, (HCo12) 15087+, (JKD), (KCo5) 9272+. Poszczególne oznaczenia transgenowe podano w nawiasach, po nich podane numery linii dla losowo wintegrowanych transgenów.
Symbole -++ i + wskazują na hemozygoty lub hemizygoty, chociaż ze względu na to, że myszy są rutynowo badane z użyciem testu opartego na technice PCR, nie było możliwe rozróżnienie pomiędzy heterozygotami i homozygotami dla losowo wintegrowanych trangenów ludzkich Ig.
Oznaczenie A+ może być nadane myszom, które są w rzeczywistości homozygotyczne wobec tych elementów.
Procedura i schemat immunizacji: myszy immunizowano antygenem w dwóch formach: żywymi komórkami (komórki CHO transfekowane CD25, opisane powyżej) i oczyszczonym białkiem (zrekombinowane ludzkie CD25 (rhCD25), zrekombinowane białko z systemów R & D Systems wyrażane przez NS/0 (nr kat. 223-2A/CF), Mineapolis, MN).
Rozpuszczalne rhCD25 mieszano z pełnym adiuwantem Freunda (CFA) lub niepełnym adiuwantem Freunda (IFA).
Adiuwant Freunda pochodził z Gibco-BRL, Rockville, MD.
Myszom wstrzykiwano do jamy wewnątrzotrzewnowej 0,2 ml przygotowanego antygenu.
Ostateczne immunizacje przez w żyłę ogonową przeprowadzono z użyciem rozpuszczalnego CD25 w jałowym PBS lub soli fizjologicznej (0,9% NaCl).
Immunizacje stransfekowanymi komórkami, 1,0-2,0 x 107 komórek na mysz, podawano do jamy wewnątrzotrzewnowej (i. p.) w 0,2 ml jałowej soli fizjologicznej.
Wszystkie immunizacje przeprowadzano przez wstrzyknięcie do jamy wewnątrzotrzewnowej. Trzy i dwa dni przed fuzją, podawano dożylnie (i. v.) dawki przypominające.
Schemat immunizacji opisano w tabeli 1.
Badaniem były objęte wszystkie spośród kohorty dwunastu (12) myszy o genotypach Hco7 i Hco12.
PL 217 296 B1
T a b e l a 1
Data aktywności Immunizacja: adiuwant, antygen Skrwawianie i miano*/fuzje
Dzień 1 1,5 x 107 żywych komórek transfekowanych CD25, IP w soli fizjologicznej
Dzień 12 CFA, rhCD25 (20 pg)
Dzień 21 1,5 x 107 żywych komórek transfekowanych CD25, IP w soli fizjologicznej
Dzień 28 CFA, rhCD25 (20 pg)
Dzień 35 Miano
Dzień 42 Fuzja 23175/23197
Dzień 42 1,5 x 107 żywych komórek transfekowanych CD25, IP w soli fizjologicznej
Dzień 56 CFA, rhCD25 (20 pg)
Dzień 63 Miano
Dzień 68 1,5 x 107 żywych komórek transfekowanych CD25, IP w soli fizjologicznej
Dzień 71 Fuzja 23196/23198
Dzień 81 Miano
Dzień 85 Fuzja 23185
* Dla mian, zobacz tabelę 2
Miana myszy: miana dla myszy # 23175, 23185, 23196, 23197 i 23193 pokazano poniżej w tabeli 2. Miana pokazane w tabeli 2 wskazują rozcieńczenia surowicy, które były dodatnie w badaniach specyficznych dla CD25. Odpowiedź na antygen po powtórnych immunizacjach pokazuje wysoki poziom odpowiedzi i myszy przygotowywano do fuzji.
T a b e l a 2
# myszy Miano dnia 35 Miano dnia 63 Miano dnia 81
23175 12800
23185 6400 12800 12800
23196 6400 25600
23197 50000
23198 3200 25600
Procedura fuzji: do fuzji wykorzystano linię komórek szpiczaka SP2/0-ag14 (ATCC CRL 1581, seria F-15037). Zawartość oryginalnej fiolki ATCC rozmrażano i zakładano hodowlę.
Z tak założonej hodowli przygotowano zestaw roztworów wyjściowych zamrożonych w fiolkach. Komórki utrzymywano w hodowli przez 6-8 tygodni, z pasażowaniem ich dwa razy w tygodniu.
DMEM z dużą zawartością glukozy: (Mediatech Cellgro, nr 1001233) zawierający 10% EBS (Hyclcne nr kat. SH3C071), anty-biotyk-środek przeciwgrzybiczy (100 x) (Gibco, nr 15240062) i 0,1% L-glutaminę użyto dc hodowli komórek szpiczaka. Do podłoży wzrostowych hybrydomy dodano dodatkowe uzupełnienia obejmujące 5% czynnik klonowania hybrydomy Origen (Igen), 4,5 x 10-6 M pirogro-5 -4 -5 nian sedu, HAT (1,0 x 10-5 M hipeksantyna, 4,0 x 10-4 M aminopteryna, 1,6 x 10-5 M tymidyna, Sigma) i bydlęcą surowicę płodową (Hyclone, Logan, Utah).
Śledziona myszy nr 23197 miała prawidłowy rozmiar i posiadała 4,0 x 108 żywych komórek. Śledziona myszy nr 23175 miała prawidłowy rozmiar i posiadała 2,6 x 108 żywych komórek. Śledziony myszy nr 23196 i 23198 miały prawidłowe rozmiary i posiadały odpowiednio 2,4 x 108 i 2,0 x 108 żyPL 217 296 B1 wych komórek. Ostatnia śledziona z myszy nr 23185 miała prawidłowy rozmiar i posiadała 1,9 x 108 żywych komórek. Splenocyty poddawano fuzji zgodnie ze standardową procedurą.
Podłoża stosowane dla pokoleń hybrydom (fuzja): do hodowli komórek szpiczaka zastosowano podłoże DMEM z dużą zawartością glukozy (Mediatecn, seria 10013264) zawierające 10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS), (Hyclone, Logan, Utah, SH30071 seria AJE10321) antybiotyk-środek przeciwgrzybiczy (GibcoBRL, seria 15240062) i 0,1% L-glutaminy (Gibco, seria 1013845). Do podłoży wzrostowych hybrydomy dodano dodatkowe uzupełnienia obejmujące 5% czynnik klonowania hybrydomy Origen (Igen, seria 36600 i 36782 i 36684), 4,5 x 10-4 M pirogronian sodu, HAT (Sigma, H 0262): 1,0 x 10-4 M hipoksantyna, 4,0 x 10-7 M aminopteryna, 1,6 x 10-5 M tymidyna lub HT (Sigma, H 0137): 1,0 x 10-4 M hipoksantyna, 1,6 x 10-5 M tymidyna.
Immunizowanym myszom usuwano śledzionę i węzły chłonne i narządy te umieszczano w probówce zawierającej DMEM + FBS. Probówkę przenoszono do pokoju z hodowlą tkankową i ze śledziony i węzłów chłonnych sporządzano zawiesinę pojedynczych komórek i komórki liczono. Przenoszono właściwą objętość komórek SP2/0 (ATCC CRL 1531, seria F-15087, 6 komórek śledziony lub węzłów chłonnych na 1 komórkę SP2/C), komórki mieszano i zawieszano.
Dodawano około 1,2 ml PEG (1 minutę podczas delikatnego wirowania probówki w zlewce zawierającej wodę o temperaturze 37°C). Probówkę pozostawiano na 90 sekund, dodawano 15 ml DMEM i przeprowadzano płukanie podłożem.
Po żwirowaniu komórek usuwano supernatant, a komórki zawieszano ponownie. Do probówki dodawano dziesięć (10) ml podłoża zawierającego HAT. Po inkubacji trwającej 30-60 min. w inkubatorze z CO2, komórki osadzano na płytkach hodowlanych z 96 studzienkami, 200 μl/studzienkę (około 1 x 107 komórek na płytkę z 96 studzienkami).
Siódmego dnia, komórki były odżywiane podłożem zawierającym HT, 250 μl/studzienkę (podłoże HT jest podłożem HAT bez aminopteryny).
Wstępne badania ELISA w poszukiwaniu ludzkich przeciwciał IgG,K przeprowadzono 7-10 dni po fuzji. Zawartości studzienek dodatnie dla ludzkich IgG,K badano następnie na płytkach ELISA opłaszczonych rozpuszczalnym CD25. Hybrydomy dodatnie dla antygenu przenoszono następnie na płytki z 24 studzienkami, a w końcu do butelek z hodowlą tkankową. Hybrydomy dodatnie dla antygenu zabezpieczano na kilku etapach procesu rozwoju przez zamrożenie komórek w podłożu do zamrażania Origen DMSO (Fisher nr kat. IG-5G-C715).
Protokół ELISA do wykrywania IgG,K (stosowany do badania fuzji): płytki do ELISA cpłaszczano przez noc anty-ludzkim-κ, 1 μg/ml (Immunotech, seria 0173) lub anty-Iudzkim-γ, 1 μg/mi (Jackson, seria 109-006-098), 50 μg/studzienkę. Płytki opróżniano i pozostałe miejsca wiążące blokowano PBS z dodatkiem tween-20 (0,05%) i 5% surowicy kurzej (PBSTC) przez 1 godz. w temperaturze pokojowej (RT). Płytki płukano trzykrotnie PBS z dodatkiem 0,05% tween-20 (PBST).
Supernatanty otrzymane z fuzji i podklonów zazwyczaj badano w postaci rozcieńczonej 1:2 w PBSTC. Jako kontrolę dodatnią stosowano ludzkie IgG (Calbiochem). Po około 2-godzinnej inkubacji próbek, płytki płukano PBST, a do studzienek dodawano drugie przeciwciało, koniugowane anty-ludzkie-IgG-Fc-HRP (Jackson, seria 109-036 098), rozcieńczone 1:5000 w PBSTC (100 μ^. Po 1-godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, wywoływano reakcję ELISA stosując ABTS (Sigma) zgodnie z zaleceniami producenta.
Określanie izotypu z zastosowaniem ELISA: płytki do ELISA z 96 studzienkami (Greiner, Germany) opłaszczano przez noc (100 μl/studzienkę, temperatura pokojowa (RT)) mysim-anty-ludzkim IgGl (CLB, Holandia, roztwór wyjściowy rozcieńczyć 1:5000) lub mysim-anty-ludzkim IgG3 (CLB, roztwór wyjściowy rozcieńczyć 1:10000).
Po trzykrotnym płukaniu płytek PBST (150 μl/studzienkę), płytki inkubowano w temp. pokojowej przez 1 godz. z PBSTC. Następnie, dodawano supernatanty klonów ludzkich przeciwciał monoklonalnych CD25 (100 μl/studzienkę, 2 godz. w temperaturze pokojowej).
Jako kontrole dodatnie służyły supernatanty anty-KLH IgGl (1 μg/ml) i anty-KLH IgG3 (1 μg/ml).
Jako kontrole ujemne służyło podłoże hodowlane i PBSTC.
Po płukaniu w PBST (3 x), dodawano kozie--anty-hlgG-HRP (Fc swoiste, Jackson Labs, Maine, USA) (1 godz. w temperaturze pokojowej). Do wykrywania IgG1 koniugat rozcieńczano 1:500, podczas gdy do wykrywania IgG3 koniugat rozcieńczano 1:2000. Po płukaniu w PBST (3 x), przygotowywano 10 mg ABTS (Roche) w 10 ml buforu ABTS (Roche) i do każdej studzienki dodawano po 100 pl. Po 20 min. odczytywano absorpcję przy długości fali 405 nm stosując czytnik do ELISA (EL 808, BioTek Instruments, Vermont, USA).
PL 217 296 B1
W oparciu o procedurę immunizacji wybrano 4 swoiste antygenowo hybrydomy, z których wszystkie pochodziły od myszy HCo: AB1, AB7, AB11 i AB12. Wykryto, że izotypami dla tych czterech klonów było IgGl,K.
Przeciwciała według wynalazku mogą być wyrażane w postaci zrekombinowanej jako inne izotypy, przykładowo IgG2, IgG3, IgG4, IgM i IgA.
Podłoża stosowane do utrzymywania hybrydom po selekcji: Wszystkie linie komórkowe hybrydom ludzkich przeciwciał monoklonalnych wobec CD25 hodowano w modyfikowanym podłożu Eagle Dulbecco (Biowhittaker, seria BE12-709F) z dodatkiem 10% FCS (Wisent Multicell optimum C241), 2 mM L-glutaminy (Glutamax-II), 50 IU/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny (pen/strep), 2 μΜ β-ΜΕ (wszystkie otrzymane z Gibco BRL, Life Technologies, Szkocja), 24% HCF (Origen, Igen International Inc., Gaithersburg, USA).
Oczyszczanie przeciwciał: przed oczyszczaniem lub zagęszczaniem ludzkich przeciwciał swoistych wobec CD2 5 z supernatantu hodowli, supernatant hodowli komórkowej musi podlegać filtracji przez filtr nałożony na butelkę do jednorazowego użytku podłączoną do próżni, w celu usunięcia dużej objętości materiału, takiego jak części komórek lub inne zanieczyszczenia. Próbkę można zagęścić, ™ jeśli objętość próbki wynosi ponad 500 ml do objętości poniżej 500 ml stosując pojemnik Prep/scale™ TFF, 1 ft2 (Millipore, USA).
Oczyszczanie białka A z przeciwciał swoistych wobec CD25 przeprowadzono stosując chromatografię powinowactwa.
Po zrównoważeniu 5 ml kolumny z białkiem A (ProtA 5 ml SP, wersja 041201, Amersham Pharmacia Biotech AB, Szwecja) przy użyciu PBS o pH 7,4 i zalaniu próbki-pompy A przy użyciu PBS o pH 7,4, na kolumnę nanoszono supernatant zawierający przeciwciała swoiste wobec CD25, niezwiązaną próbkę spłukiwano i systemowa pompa B płukała kolumnę przy użyciu 0,1 M kwasu cytrynowego o pH 5 (bufor elucyjny 1).
Następnie, bydlęce IgG (obecne w supernatancie hodowli) wypłukiwano za pomocą pompy systemowej B stosując bufor elucyjny 1. Po opłukaniu pompy systemowej A 0,1 M kwasem cytrynowym o pH 3 (bufor elucyjny 2), ludzkie przeciwciała swoiste wobec CD25 wypłukiwano za pomocą pompy systemowej A stosują bufor elucyjny 2.
Pompa systemowa B była następnie płukana 0,1 M kwasem cytrynowym o pH 2 (bufor elucyjny 3) i wszystkie pozostałe IgG związane z kolumną wypłukiwano za pomocą pompy systemowej B stosując bufor elucyjny 3.
Wypłukane przeciwciała swoiste wobec CD25 neutralizowano 10% (v/v) 2 M Tris-HCl (Sigma) o pH S i zbierano w pule frakcje pikowe.
Zebrane w pule frakcje pikowe, wypłukane w etapie 2, dializowano wobec PBS (30 ml oczyszczonego materiału wobec 5 I PBS) przez 18 godz. w temperaturze 4°C. Do zabezpieczania i przechowywania oczyszczonego materiału, próbki zagęszczano.
Stężenie ludzkich IgG określano stosując test nefelometryczny (Dade-Behring, BNII) przy użyciu poliklonalnych przeciwciał anty-IgG (CLB, Amsterdam, Holandia, seria M1090).
Przeciwciała porcjowano do probówek, szybko zamrażano i przechowywano w temperaturze
-80°C.
P r z y k ł a d 2. Sekwencjonowanie ludzkich przeciwciał przeciw CD25
Sekwencjonowanie regionów VL i VH przeciwciał
Sekwencjonowanie: po klonowaniu w wektorze pGEMT-Vector System II regiony VDJ sekwencjonowano. Sekwencjonowanie wykonywano w Baseclear (Leiden, Holandia). Sekwencje przyrównywano z sekwencjami linii zarodkowej genu V w Vbase (www.mrc-cpe.cam.ac.uk/int-ro/doc/public/intro.htm).
Przygotowywanie RNA: całkowity RNA przygotowywano z 5 x 106 komórek czterech (4) różnych linii komórkowych hybrydom ludzkiego CD25 (AB1, AB7, AB11, AB12) stosując zestaw Rneasy (Qiagen, Westburg, Leusden, Holandia), zgodnie z zaleceniami producenta.
Przygotowywanie cDNA: komplementarny DNA (cDNA) do RNA z komórek hybrydomy ludzkiego CD25 przygotowywano z 3 μg całkowitego RNA z odwrotną transkryptazą AMV z buforem (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy), oligo d(T)15 (Promega, Madison, WI, USA), dNTP (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy) i RNAzyną (Promega) zgodnie z zaleceniami producenta 12OGC, wersja 3).
PL 217 296 B1
Regiony VH i VL ampłifikovzano stosując następująca startery do PCR:
VH:
startery ER1 5'
AB62 CAg gTK CAg CTg gTg CAg TC (SEKW. NR ID. :41)
AB63 SAg gTg CAg CTg KTg gAg TC (SEKW. NR ID. : 42)
AB65 gAg gTg CAg CTg gTg CAg TC (SEKW. NR ID. : 43 >
Startery liderowe 5'VH
AB85 ATg gAC Tgg ACC Tgg AgC ATC (SEKW. NR ID.:44)
AB86 ATg gAA TTg ggg CTg AgC Tg (SEKW. NR ID.:45)
AB87 ATg gAg TTT ggR CTg AgC Tg (SEKW. NR ID.:46)
AB88 ATg AAA CAC CTg Tgg TTC TTC (SEKW. NR ID.:47)
AB89 ATg ggg TCA ACC gCC ATC CT (SEKW. NR ID.:48 >
Starter VH 3'
AB90 TgC CAg ggg gAA gAC CgA Tgg (SEKW. NR ID. .:49)
startery FR1 5'
AB 8 RAC ATC CAg ATg AYC CAg TC (SEKW. NR ID.; : 50)
AB 9 gYC ATC YRg ATg ACC CAg TC (SEKW. NR ID.: :51)
AB10 gAT ATT gTg ATg ACC CAg AC (SEKW. NR ID.: : 52)
AB11 gAA ATT gTg TTg ACR CAg TC (SEKW. NR ID.: : 53)
AB12 gAA ATW gTR ATg ACA CAg TC (SEKW. NR ID.: :54)
AB13 gAT gTT gTg ATg ACA CAG TC (SEKW. NR ID.: :55)
AB14 gAA ATT gTg CTg ACT CAg TC (SEKW. NR ID.: :56)
Startery liderowe 5'VK
AB123 CCC : gCT Cag CTC : CTg ggg CTC CTg (SEKW. N
ID.:57)
AB124 CCC TgC TCA gCT CCT ggg gCT gC (SEKW. NR
ID.:58)
AB125 CCC AgC gCA gCT TCT CTT CCT CCT gC (SEKW.
NR ID.:59)
AB126 ATg gAA CCA Tgg AAg CCC CAg CAC AgC (SEKW. NR ID.:60)
Starter VK 3'
AB16 Cgg gM gAT gAA gAC AgA Tg (SEKW. NR ID.:61)
PL 217 296 B1
W powyższych sekwencjach starterów K, S, R, Y i W mają następujące znaczenia:
K = G lub T
S = C lub G
R = A lub G
Y = C lub T
W = A lub T
Warunki PCR zastosowane do amplifikacji regionów VH i VL do klonowania: łańcuchowe reakcje polimerazy (PCR) przeprowadzano z polimerazą AmpliTag (Perkin Elmer) w termocyklerze T1 Thermocykler 96 (Biometra, Westburg, Leusden, Holandia).
Protokół cykli PCR:
94°C 2 min.
cykli
94°C 30 sek.
65°C 30 sek., minus 1 na cykl
72°C 30 sek.
cykli
94°C 30 sek.
55°C 30 sek.
72°C 30 sek.
72°C 10 min. schłodzenie do 4°C
Klonowanie VH i VL w wektorze pGEMT-Vectcr System II: po analizie produktów PCR w żelu agarozowym, produkty oczyszczano stosując zestaw QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen, Westburg, Leusden, Holandia). Zawsze klonowano 2 niezależnie zamplifikowane produkty PCR każdego z regionów VH i VL, stosując startery FR1 lub liderowe, do wektora pGEMT-Vector System II (Promega) zgodnie z zaleceniami producenta (1999, wersja 6).
Po transformacji do E. coli JM109, pojedyncze kolonie badano za pomocą PCR z kolonii, stosując startery T7 i SP6, 30 cykli przyłączania startera w temperaturze 55°C. Plazmidowy DNA z kolonii oczyszczano stosując zestaw Qiaprep Spin miniprep kit (Qiagen). W celu dalszej analizy regionów VH i VL wykonano trawienie stosując Ncol/Notl (NE Biolabs, Westburg, Leusden, Holandia) i analizę w żelu agarozowym.
Cztery wybrane linie komórkowe hybrydom wyrażały następujące sekwencje aminokwasowe:
AB1: ludzkie monoklonalne przeciwciało IgGl, κ z sekwencjami aminokwasowymi: SEKW. NR ID.: 2 i 4,
AB7: ludzkie monoklonalne przeciwciało IgGl,K z sekwencjami aminokwasowymi: SEKW. NR ID.: 6 i 8,
AB11: ludzkie monoklonalne przeciwciało IgGl, κ z sekwencjami aminokwasowymi: SEKW. MR ID.: 10 i 12 i
AB12: ludzkie monoklonalne przeciwciało IgGl,K z sekwencjami aminokwasowymi: SEKW. NR ID.: 14 i 16.
Otrzymane sekwencje przedstawiono na fig. 1-10.
P r z y k ł a d 3. Charakterystyka wiązania ludzkich przeciwciał przeciw CD25
Wiązanie supernatantów ludzkich przeciwciał monoklonalnych wobec CD25 z CD25, konstytutywnie wyrażanymi na komórkach CHO: zarówno AB1, AB7, AB11, jak i AB12 wiązały się z CD25 wyrażanym na transfekowanych komórkach CHO, co ustalono stosując cytometrię przepływową (patrz tabela 3).
Wiązanie supernatantów ludzkich przeciwciał monoklonalnych wobec CD25 z hrCD25 w teście ELISA: zarówno AB1, AB7, AB11, jak i AB12 wiązały się z CD25, co badano w teście ELISA stosując jako antygen opłaszczający hrCD25. Płytki z 96 studzienkami (Greiner) opłaszczano rhCD25 (100 ng/ml, R & D) przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie nieswoiste wiązanie blokowano przez opłaszczanie płytek PBSTC przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Po płukaniu (3 x) płytek PBST, dodawano 100 μl próbki przeciwciała. Po trzykrotnym płukaniu płytek (PBST), płytki inkubowano ze streptawidyną-poli-HRP (1:10000) w PBS po dodaniu do każdej studzienki 100 μl (1 godz., temperatura pokojowa). Po płukaniu płytek (3 x w PBST), przygotowywano 10 mg ABTS (Roche) w 10 ml buforu ABTS (Roche) i do każdej studzienki dodawano 100 pi. Po 20 min. odczytywano absorpcję przy długości fali 405 nm stosując czytnik do ELISA (EL 808, Bio-Tek Instruments).
PL 217 296 B1
T a b e l a 3
Nazwy klonów, izotypy i wiązanie z CD25
Kion Podkiasa Wiązanie CD251 CHO-CD252
AB1 IgGi + +
AB7 IgGi + +
AB11 IgGi + +
AB12 IgGi + +
1 Wiązanie supernatantów hodowli klonu określone przy użyciu rhCD25 ELISA 2 Wiązanie CD25 wyrażanych na transfekowanych komórkach CHO określone przy użyciu cytometrii przepływowej
Hamowanie wiązania biotynylowanego IL-2 ze swym receptorem przez supernatanty ludzkich przeciwciał monoklonalnych wobec CD25: Aby zbadać zakres, w jakim ludzkie przeciwciała monoklonalne blokują lub hamują wiązanie IL-2 z CD25, płytki z 96 studzienkami (Greiner) opłaszczano rhCD25 (100 ng/ml, R & D systems, MN, USA) przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie nieswoiste wiązanie blokowano przez opłaszczanie płytek PBSTC przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Po płukaniu (3 x) płytek PBST, dodawano 100 μΐ próbki przeciwciała (zakres stężeń: 10, 33 i 100 ® ng/ml). Dla porównania dodawano również Zenapax®. Po 10 min. dodawano rIL-2-biotynę (50 ng/ml) (1,5 godz., temperatura pokojowa). Po trzykrotnym płukaniu płytek (w PBST), płytki inkubowano ze streptawidyną-poli-HRP (rozcieńczoną 1:10000 z roztworu wyjściowego) w PBS, po dodaniu do każdej studzienki 100 μΐ (1 godz., temperatura pokojowa). Po płukaniu płytek (3 x w PBST), przygotowywano 10 mg ABTS (Roche) w 10 ml buforu ABTS (Roche) i do każdej studzienki dodawano 100 pi. Po 20 min. odczytywano absorpcję przy długości fali 405 nm stosując czytnik do ELISA (EL 303, Bio-Tek Instruments). Dane pokazują jedno z dwóch reprezentatywnych doświadczeń. Jak pokazano na fig. 11, supernatanty ludzkich przeciwciał monoklonainych wobec CD25 A31, A37, AB11 i AB12 były zdolne ® do hamowania wiązania biotynylowanego IL-2 z CD25 skuteczniej niż Zenapax®.
®
Hamowanie wiązania Zenapax z CD25 przez supernatanty ludzkich przeciwciał monoklonainych wobec CD25: aby zbadać zasięg, do którego ludzkie monoklonalne przeciwciała blokują lub inhibitują wiązanie Zenapax z CD25, płytki z 96 studzienkami (Greiner) opłaszczano rhCD25 (100 ng/mi, R & D systems, MN, USA) na noc w temperaturze pokojowej, a następnie nieswoiste wiązanie blokowano przez opłaszczanie płytek PBSTC przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Po płukaniu (3 x) płytek PBST, dodawano 100 pi próbki (zakres stężeń: 10, 33 i 100 ng/mi). Po 10 min. dodawano bio® tynyiowany Zenapax® (5 ng/mi) (1,5 godz., temperatura pokojowa). Po trzykrotnym płukaniu płytek (w PBST), płytki inkubowano ze streptawidyną-poii-HRP (rozcieńczoną 1:10000 z roztworu wyjściowego) w PBS, po dodaniu do każdej studzienki 100 pi (1 godz., temperatura pokojowa). Po płukaniu płytek (3 x w PBST), przygotowywano 10 mg ABTS (Roche) w 10 mi buforu ABTS (Roche) i do każdej studzienki dodawano 100 pi. Po 20 min. odczytywano absorpcję przy długości fali 405 nm stosując czytnik do ELISA (EL 303, Bio-Tek Instruments). Dane pokazują jedno z dwóch reprezentatywnych doświadczeń. Jak pokazano na fig. 12, supernatanty ludzkich przeciwciał monoklonalnych wobec CC25 AB1, AB7, AB11 i AB12 blokowały wiązanie Zenapax® z CD25.
P r z y k ł a d 4. Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciw CD25 hamują proliferację komórek T indukowaną przeciwciałami anty-CD3
Ludzkie przeciwciała były badane pod kątem ich zdolności do hamowania proliferacji komórek T ® przy zastosowaniu testu proliferacji komórek T. Dla porównania badano zarówno Zenapax®, jak i izotypowe przeciwciało kontrolne (higG1/K).
Izoiacja PBMC: iudzkie komórki krwi (otrzymane w górnej jaśniejszej warstwie skrzepu zawierającej osocze i krwinki białe, z Holenderskiego Banku Krwi Czerwonego Krzyża, Utrecht, Hoiandia) umieszczano w gradiencie fikoiowym (Pharmacia, 2500 rpm, 25 min.). Za pomocą pipety zbierano PBMC do RPMI 1640 (z dodatkiem 10% PCS (Wisent Muiticeii optimum C241), 2 mM L-giutaminy, 50 IU/mi penicyiiny, 50 pg/mi streptomycyny, 25 mM HEPES (wszystkie pochodziły z Bio Whittaker, Europe)).
Test proliferacji komórek T: iudzkie PBMC rozcieńczano w RPMI 1640 (z dodatkiem 10% FCS (Wisent Muiticeii optimum C241), 2 mM L-giutaminy, 50 IU/mi penicyiiny, 50 pg/mi streptomycyny, 3 mM HEPES (wszystkie pochodziły z Bio Whittaker, Europe)) do gęstości 1,5 x 103 komórek/studzienkę (w trzech powtórzeniach) w płytkach z 96 studzienkami z płaskim dnem Greiner). Ko44
PL 217 296 B1 mórki pobudzano przeciwciałami anty-CD3 (CLB- T3/4.E, nr kat. M1654, 10 ng/ml). Następnie, do komórek dodawano 50 pl coraz bardziej rozcieńczonych przeciwciał doświadczalnych (w zakresie od 500 ng/ml do 7,8 ng/ml, w szeregu dwukrotnych rozcieńczeń). Proliferację szacowano ilościowo po pięciu dniach (37°C, 5% CO2) stosując BrdU (stężenie końcowe: 10 μΜ, Rcche) zgodnie z metodą opisaną poniżej.
Test znakowania BrdU (Roche zestaw barwienia BrdU-staining kit, nt kat. 1 647 229): roztwór znakujący BrdU (100 μΜ) dodawano do studzienek i komórki inkubowano przez noc (37°C, 5% CO2). Komórki zawieszano w studzienkach i wirowano (10 min., 300 x g). Odrzucano supernatant, a osad komórek suszono (1 godz., 60°C). Następnie, osad inkubowano z FixDenat (200 pl/studzienkę, 30 min., temperatura pokojowa). Po inkubacji, odrzucano FixDenat i do osadu dodawano (1 godz., temperatura pokojowa) 100 μΙ/studzienkę anty-BrdU-POD (dodano 100 pl roztworu wyjściowego anty-BrdU do 10 ml roztworu do rozcieńczeń przeciwciał). Po odrzuceniu supernatantu, płytki płukano (3 x) stosując roztwór płuczący (200 pl/studzienkę). Ostatecznie, do osadu dodawano (5 min., temperatura pokojowa) 100 pl/studzienkę roztworu substratu. Reakcję barwienia zatrzymywano przy użyciu H2SO4 (25 pl/studzienkę, 1M) i odczytywano gęstość optyczną stosując czytnik do ELISA przy długości fali 450 nm (Bio-Tek Instruments).
Jak pokazano na fig. 13, ludzkie przeciwciała monoklonalne AB1, AB7 i AB12 hamowały proliferację komórek T indukowaną przeciwciałami anty-CD3 w sposób zależny od dawki. Hamowanie przez ®
Iudzkie przeciwciała było wydajniejsze niż przez Zenapax®. Dane pokazują jedno z trzech reprezentatywnych doświadczeń.
P r z y k ł a d 5. Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciw CD25 hamują MLR
Ludzkie przeciwciała badano pod kątem ich zdolności do inhibowania MLR stosując test MLR.
®
Dla porównania badano również Zenapax i izotypowe przeciwciała kontrolne (hlgG1/K). Ludzkie PBMC (otrzymane w górnej jaśniejszej warstwie skrzepu zawierającej osocze i krwinki białe, z Holenderskiego Banku Krwi Czerwonego Krzyża, Utrecht, Holandia) pochodzące od dwóch dawców, nie odpowiadających sobie pod względem MHC, rozcieńczano w RPMI 1640 (z dodatkiem 10% FCS (Wisent Multicell optimum C241), 2 mM L-glutaminy, 50 IU/ml penicyliny, 50 pg/ml streptomycyny (wszystkie pochodziły z Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Szkocja)) do gęstości 2,0 x 106 komó5 rek/ml. PBMC od pierwszego dawcy naświetlano (2000 radów) i mieszano (1,0 x 105 komó5 rek/studzienkę) z PBMC od drugiego dawcy (1,0 x 105 komórek/studzienkę) w płytkach z 96 studzienkami z płaskim dnem (Greiner), w trzech powtórzeniach. Następnie, do komórek dodawano 50 pl coraz bardziej rozcieńczonych przeciwciał doświadczalnych (w zakresie od 50 ng/ml do 0,8 ng/ml, w szeregu dwukrotnych rozcieńczeń). Proliferację szacowano ilościowo po sześciu dniach (37°C, 5% CO2) stosując BrdU (stężenie końcowe: 10 μΜ, Roche) zgodnie z metodą opisaną powyżej.
Jak pokazano na fig. 14, ludzkie przeciwciała monoklonalne AB1, AB7 i AB12 hamowały MLR w sposób zależny od dawki. Inhibicja MLR przez AB1, AB7 i AB12 (w dawkach pomiędzy 1 i 3 ng/ml) ® była bardziej wydajna niż inhibicja przez Zenapax®. Dane pokazują jedno z trzech reprezentatywnych doświadczeń.
P r z y k ł a d 6. Kinetyczna analiza AB12 w aparacie Biacore 3000
Analizy powinowactwa oceniano przez monitorowanie zmian w rezonansie plazmonów powierzchniowych stosując aparat BIA-core 3000. Zastosowano BIAcore 3000 i oprogramowanie kontrolne BIAcore 3000 (BIAcore, Uppsala, Szwecja, seria BR-1100- 43). Ludzkie CD25 (R & D Systems, seria 223-2A/CFO) unieruchomiono na chipie sensorowym CM-5 przy niskiej gęstości (BIAcore, seria BR-1000-14) stosując chemię sprzęgania amin, zgodnie z zaleceniami producenta. Po zablokowaniu pozostałych miejsc wiązania na aktywowanym chipie sensorowym przy użyciu etanolu-aminy-HCl, przeprowadzono analizę kinetyczną w temperaturze 25°C (zgodnie z zaleceniami producenta), stosu® jąc ludzkie monoklonalne przeciwciała AB12 i dla porównania Zenapax . Próbki zawierające odpo® wiednio AB12 i Zenapax® przepływały nad powierzchnią opłaszczonego chipa sensorowego, co po® zwalało na przyłączanie AB12 i Zenapaxu® do rhCD25. Przyłączanie i dysocjację odpowiednio AB12 ® i Zenapaxu®, monitorowano przy użyciu rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) na chipie sensorowym. Wyniki uwidaczniano przy użyciu BIAcore 3000 (Bio-tek Instruments) i analizowano stosując oprogramowanie BIAevaluation Software 3.1 (BIAcore, Uppsala, Szwecja), a wiązanie Languir 1:1 zastosowano jako model wstępny.
KD dla wiązania AB12 z rhCD25 określono stosując analizę BIAcore: 4,74 x 10-11 ± 0,43 x 10-11.
KD dla wiązania Zenapaxu® z rnCD25 określono stosując analizę BIAcore: 1,52 κ 10-10 ± 0,27 x 10-10.
PL 217 296 B1
P r z y k ł a d 7. Traktowanie komórek blastycznych T za pomocą AB12 powoduje internalizację CD25
AB12 badano pod kątem ich zdolności do indukowania internalizacji CD25. Jako izotypowe przeciwciało kontrolne włączono Anty-KLH (ludzkie przeciwciało izotypowe IgGl/κ, swoiste wobec hemocjaniny czareczki skałoczepu).
Indukcja komórek blastycznych T: po izolacji jednojądrowych komórek krwi obwodowej (PBMC) z próbek heparyna-krew, przy użyciu gradientowego podłoża do rozdziału limfocytów, PBMC stymulowano przez trzy do czterech dni 5 μg/ml fitohemaglutyniny (PHA, Difco, nr kat. 211796) w podłożu hodowlanym (37°C, 5% CO2).
Stymulacja komórek blastycznych T w celu badania internalizacji: po zebraniu i płukaniu komórek w PBS, komórki liczono z błękitem trypanowym.
Jedną część komórek blastycznych T (1 x 106 komórek/ml) preinkubowano (4°C, przez 15 min.) z AB12 znakowanym FITC (2 μg/ml AB12-FITC) lub z anty-KLH znakowanym FITC (2 μg/ml) jako izotypem kontrolnym lub bez dodatku przeciwciał.
Po preinkubacji, komórki płukano w PBS i 1 x 106 komórek (w 1 ml podłoża hodowlanego) dodawano do płytki z 24 studzienkami i inkubowano przez 18 godz. (37°C, 5% CO2).
Pozostałe komórki blastyczne T inkubowano bez lub w obecności AB12 znakowanego FITC (2 μg/ml) lub anty-KLH znakowanego FITC (2 μg/ml) przez 18 godz. (37°C, 5% CO2).
Po inkubacji, komórki zbierano i znakowano agiutyniną z zarodków pszenicy wyznakowaną rodaminą (1 μg/ml, znakowanie błony, Molecular Probes, nr kat. W-849), w temperaturze 4°C przez 15 min. Następnie, komórki płukano PBS i zawieszano je w 25 μl Vectashieid DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).
Następnie, 10 μl zawiesiny komórek nakrapiano pipetą na skrawki tkanki, przykrywano i analizowano stosując mikroskopię fluorescencyjną (Carl Zeiss) i zdjęcia zrobione z filtrem TRITC przeznaczonym do barwienia rodaminą (filtr 15, Zeiss) lub filtrem FITC przeznaczonym do barwienia FITC (filtr 09, Zeiss). Nie pokazano barwienia błony, uzyskanego za pomocą aglutyniny z zarodków pszenicy wyznakowanej rodaminą.
Jak przedstawiono na fig. 15A i 15B, po 18 godz. hodowli, wewnątrz komórek można znaleźć sygnał AB12-FITC.
Figura 15A przedstawia wynik po hodowli komórek trwającej 18 godz., po uprzedniej preinkubacji (15 min.) z AB12-FITC i płukaniu, a fig. 15B przedstawia wynik po hodowli komórek trwającej 18 godz. w obecności AB12-FITC.
Doświadczenie kontrolne z nieodpowiednim przeciwciałem anty-KLH koniugowanym z FITC (fig. 15C) nie pokazuje internalizacji przeciwciała znakowanego FITC.
P r z y k ł a d 8. Traktowanie komórek blastycznych T za pomocą AB12 powoduje internalizację CD25, jeśli pomiaru dokonuje się przy użyciu cytometrii przepływowej
W innym doświadczeniu do określenia internalizacji AB12 znakowanych FITC w komórkach blastycznych T w różnych przedziałach czasowych, zastosowano cytometrię przepływową.
Po izolacji jednojądrowych komórek krwi obwodowej (PBMC) z próbek heparyna-krew, przy użyciu gradientowego podłoża do rozdziału limfocytów (Ficoil), PBMC przez trzy do czterech dni stymulowano 5 μg/ml fitonemaglutyniny IPHA, Difco, nr kat. 211796) w podłożu hodowlanym (37°C, 5% CO2). Po trzech dniach hodowli komórki blastyczne T zbierano, płukano PBS i liczono stosując błękit trypanowy.
Do komórek blastycznych T (2,5 x 106 komórek w 2 ml podłoża hodowlanego) dodano 2 μg/ml AB12 znakowanego FITC lub anty-KLH znakowanego FITC (izotypowe przeciwciało kontrolne). Po preinkubacji (4°C, 1 godz.) komórki dzielono na dwie porcje.
Jedną porcję płukano w podłożu hodowlanym, podczas gdy drugiej porcji nie płukano. Po płukaniu, preinkubowane próbki zawieszano w podłożu hodowlanym. Obie porcje inkubowano w temperaturze 4°C lub 37°C.
Po 0, 0,5, 1 lub 4,5 godz. inkubacji (albo w temperaturze 4°C lub 370C), do komórek dodawano 3 ml buforu FACS (PBS z dodatkiem 0,05% BSA i 0,01 μg/ml azydku sodu) i komórki wirowano przy 300 x g (4°C).
Komórki z jednej porcji zawieszano w 200 μl buforu FACS, podczas gdy komórki z drugiej porcji zawieszano w 200 μl buforu FACS z 1 mg/ml bromku etydyny (Sigma, nr kat. E8751). Bromek etydyny dodawano tuż przed poddaniem komórek cytometrii przepływowej.
PL 217 296 B1
Bromek etydyny zastosowano do stłumienia sygnału fluorescencji na powierzchni komórki. Jak pokazano na fig. 16, współczynnik fluorescencji próbek inkubowanych w temperaturze 4°C mierzony z lub bez bromku etydyny wynosił w przybliżeniu jeden. Wskazuje to na brak internalizacji.
Komórki hodowane w temperaturze 37°C wykazały wzrost tego współczynnika fluorescencji w czasie. Wskazuje to na wystąpienie internalizacji AB12-FITC. Jak oczekiwano, inkubacja komórek w ciągłej obecności AB12 znakowanych FITC dała w wyniku wyższe poziomy internalizacji (fig. 16B) w porównaniu z komórkami tylko preinkubowanymi z ABI2 znakowanymi FITC (fig. 16A).
Figura 16A przedstawia współczynnik średniej intensywności fluorescencji (MFI) dla komórek preinkubowanych przez 1 godz. i odpłukanych z nadmiaru AB12 znakowanych FITC.
Figura 16B przedstawia wynik po hodowli komórek w obecności AB12 znakowanych FITC. Współczynnik MFI określa się dzieląc MFI badanych próbek przez MFI próbki w czasie 0 godz.
Nie obserwowano barwienia z izotypowym przeciwciałem kontrolnym (anty-KLH-FITC, wyników nie pokazano).
Ta charakterystyka internalizacji przeciwciał według wynalazku czyni je odpowiednimi do koniugowania z toksynami do leczenia przykładowo białaczki/chłoniaka komórek T dojrzałych, chłoniaka z anaplastycznymi komórkami dużymi, chłoniaka skórnego z limfocytów T (w tym ziarniniaka grzybiastego i zespołu Sezaryego), chłoniaka z obwodowych komórek T, chłoniaka Hodgkina, białaczki kosmatokomórkowej i przewlekłej białaczki limfoblastycznej (CLL)/białaczki Iimfoblastycznej z komórkami małymi (SLL).
W innym układzie, przeciwciała według wynalazku są podmiotem reakcji znakowania z odpowiednim radioizotopem do leczenia przykładowo białaczki/chłoniaka komórek T dojrzałych, chłoniaka z anaplastycznymi komórkami dużymi, chłoniaka skórnego z limfocytów T (w tym ziarniniaka grzybiastego i zespołu Sezaryego), chłoniaka z obwodowych komórek T, chłoniaka Hodgkina, białaczki kosmatokomórko/ej i przewlekłej białaczki limfoblastycznej (CLL) /białaczki iimfoblastycznej z komórkami małymi (SLL).
Ponadto, przeciwciała można znakować stosując 111In do określania masy guza i dzięki czemu można dostosować dawkowanie przeciwciała znakowanego radioaktywnie, które należy podać.
Równoważniki
Specjaliści w dziedzinie są w stanie określić bez prowadzenia jakichkolwiek innych niż rutynowe badania ekwiwalenty konkretnych wykonań opisanych niniejszym wynalazków. Takie ekwiwalenty są objęte załączonymi niniejszym zastrzeżeniami. Za objętą zakresem niniejszego wynalazku uznaje się również dowolną kombinację wykonań.
Jest również oczywistym, że wszystkie cytowane w niniejszym opisie opisy patentowe, rozpatrywane zgłoszenia patentowe oraz inne publikacje włącza się jako odnośniki literaturowe.
PL 217 296 B1
LISTA SEKWENCJI <110> Genmab A/S <120> LUDZKIE PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNE PRZECIW CD25 <130> GMI-059PC <140> PCT/US2003/036126 <141> 2003-11-14 <150> 60/426690 <151> 2002-11-15 <160> 74 <170> FastSEQ dla Windows wersja 4.0 <210> 1 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 caggttcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaagtc 60 ' ’ tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc cgttatccta tcaactgggt gcgacaggcc 120 ' cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcagactac 180 ~ gcacagaggt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgaa cacagcctac 240 ' ~ atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attattgtgc gaggagggac 300 J J tggggagact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc 360 ccatcggtct tccccctggc a
381
<210> 2
<211> 127
<212> PRT
<213> Homo
<400> 2
Gin 1 Val Gin Leu Val 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ser
Ser Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Gly Thr Phe Ser 30 Arg Tyr
Pro Ile Asn 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Met
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Gin Arg Phe
PL 217 296 B1
50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Trp Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
<210> 3 <211> 420 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggaagccc gaaattgtgt
120 ctctcctgca
180 cctggccagg 240 ' gacaggttca
300 ' cctgaagatt
360 ggagggacca
420 cagcacagct tgacgcagtc gggccagtca ctcccaggct gtggcagtgg ttgcagtgta aggtggagat tctcttcctc tccaggcacc gagtgttagc cctcatctat gtctgggaca ttactgtcag caaacgaact ctgctactct ctgtctttgt agcagcttct ggtgcatcca gacttcactc cagtatagta gtggctgcac ggctcccaga ctccagggga tagcctggta gcagggccac tcaccatcag gctcaccgct catctgtctt taccaccgga aagagccacc ccagcagaaa tggcatccca cagactggag cactttcggc catcttcccg <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
PL 217 296 B1
<210> 5 <211> 381 <212> DNA <213> Homo <400> 5 caggttcagc tcctgcaagg
120 cctggacaag
180 gcacagaagt 240 ' atggagctga
300 tggttcgacc
360 ccatcggtct
381
<210> 6
<211> 127
<212> PRT
<213> Homo
<400> 6
sapiens tggtgcagtc cttctggagg gacttgagtg tccaggacag gcagcctgag cctggggcca tccccctggc sapiens tggggctgag caccttcagc gatgggaagg agtcacgatt atctgaggac gggaaccctg a
gtgaagaagc agatatgcta atcatcccta accgcggaca acggccgtgt gtcaccgtct ctgggtcctc tcaactgggt tccttgatat agtccacgaa attactgtgc cctcagcctc ggtgaaggtc gcgacaggcc agcagactac cacagcctac gagaaaggac caccaagggc
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Asp Ile Ala Asp Tyr Ala Gin Lys Phe
50 55 60
Gin Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
<210> 7 <211> 421
PL 217 296 B1 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atggaagccc cagcacagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga tatcaccgga 60 gaaaatgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctctgt ctccagggga aagagccacc 120 - ctctcctgca gggccagtca gagtggtagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gtagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactqqaq 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gttcaccgat caccttcaac 360 caagggacac gactggagat taaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccc
420 g 421
<210> 8
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo
<400> 8
Glu 1 Asn Val Leu Thr 5 Gin Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Gly Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
115 120
<210> 9 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaagtc
PL 217 296 B1 _
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc cgttatccta 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta 180 gcacagaggt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca 240 ’ ” atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt 300 tggggagact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct 360 ' ccatcggtct tccccctggc a 381 ' ' <210> 10 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 tcaactgggt gcgacaggcc tccttggtat agcagactac aattcacgaa cacagcctac attattgtgc gaggagggac cctcagcctc caccaagggc
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Pro Ile Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Gin Arg Phe
50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Phe Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
Ala Arg Arg Asp Trp Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr ' 100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125 <210> 11 <211> 421 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 atggaagccc cagcacagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 ’ ~ gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ' ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagcttct tagcctggta ccagcagaaa 180 ' cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca
PL 217 296 B1
240 .
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300 .....
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatagta gctcaccgct cactttcggc 360 - ggagggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccc
420
g
421
<210> 12
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo
<400> 12
sapiens
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro
115 120
<210> 13
<211> 381
<212> DNA
<213> Homo
<400> 13
caggtgcagc
.
tcctgcaagg
120 cctggacaag
180 gcacagaagt 240 atggagctga
300 ' tggtttgatt
360 sapiens tggtgcagtc cttctggagg ggcttgagtg tccagggcag gcagcctgag actggggcca tggggctgag caccttcagc gatgggaagg agtcacgatt atctgaggac gggaaccctg gtgaagaagc aggtatatta atcatcccta accgcggaca acggccgtgt gtcaccgtct ctgggtcctc tcaactgggt tccttggtgt aatccacgag attactgtgc cctcagcctc ggtgaaggtc gcgacaggcc agaaaactac cacagcctac gagaaaggac caccaagggc
PL 217 296 B1 ccatcggtct tccccctggc a
381
<210> 14
<211> 127
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Gin 1 Val Gin Leu Val 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ser
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ile Ile Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Val Glu Asn Tyr Ala Gin Lys Phe
50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Asp Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
<210> 15
<211> 418
<212> DNA
<213> Homo
<400> 15
atggaagccc
gaaattgtgt
120 ctctcctgca
180 ggccaggctc
240 aggttcagtg
300 gaagattttg
360 gggaccaagg
418
<210> 16
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo
sapiens cagcacagct tgacgcagtc gggccagtca ccaggctcct gcagtgggtc cagtgtatta tggagatcaa sapiens tctcttcctc tccaggcacc gagtgttagc catctatggt tgggacagac ctgtcagcag acgaactgtg ctgctactct ctgtctttgt agctacttag gcatccagca ttcactctca tatggtagct gctgcaccat ggctcccaga ctccagggga cctggtacca gggccactgg ccatcagcag caccgctcac ctgtcttcat taccaccgga aagagccacc gcagaaacct catcccagac actggagcct tttcggcgga cttccccg
PL 217 296 B1
<40( D> 16
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
115
<210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17
Arg Tyr Pro Ile Asn 1 5 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18
Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Gin Arg Phe Gin 15 10 15
Gly <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19
Arg Asp Trp Gly Asp Tyr 1 5
PL 217 296 B1 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Q0> 20
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala 15 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22
Gin Gin Tyr Ser Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23
Arg Tyr Ala Ile Asn 1 5 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24
Arg Ile Ile Pro Ile Leu Asp Ile Ala Asp Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 15 10 15
Asp
PL 217 296 B1 <210> 25 <211> 6' <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25
Lys Asp Trp Phe Asp Pro 1 5 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26
Arg Ala Ser Gin Ser Gly Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28
Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Ile Thr 1 5 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29
Arg Tyr Pro Ile Asn 1 5 <210> 30 <211> 17
PL 217 296 B1 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30
Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Gin Arg Phe Gin 15 10 15
Gly <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31
Arg Asp Trp Gly Asp Tyr 1 5 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala 15 10 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34
Gin Gin Tyr Ser Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 35
PL 217 296 B1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35
Arg Tyr Ile Ile Asn 1 5 <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36
Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Val Glu Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 15 10 15
Gly <210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37
Lys Asp Trp Phe Asp Tyr 1 5 J <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 40
PL 217 296 B1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40
Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 41 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41
Cys Ala Gly Gly Thr Lys Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys 15 10 15
Ala Gly Thr Cys 20 <210> 42 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42
Ser Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Lys Thr Gly Gly 15 10 15
Ala Gly Thr Cys 20 <210> 43 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43
Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys 15 10 15
Ala Gly Thr Cys 20 <210> 44 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44
Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala
PL 217 296 B1
10 15
Gly Cys Ala Thr Cys <210> 45 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Thr Thr Gly Gly Gly Gly Cys Thr Gly Ala 15 10 15
Gly Cys Thr Gly J 20 <210> 46 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46
Ala Thr Gly Gly Ala Gly Thr Thr Thr Gly Gly Arg Cys Thr Gly Ala 15 10 15
Gly Cys Thr Gly 20 <210> 47 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47
Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Ala Cys Cys Thr Gly Thr Gly Gly Thr 15 10 15
Thr Cys Thr Thr Cys 20 <210> 48 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48
Ala Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys Ala Ala Cys Cys Gly Cys Cys Ala 15 10 15
Thr Cys Cys Thr 20
PL 217 296 B1 <210> 49 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49
Thr Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Cys Cys 1 5 10 15
Gly Ala Thr Gly Gly ‘ 20 <210> 50 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50
Arg Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Tyr Cys Cys 15 10 15
Ala Gly Thr Cys 20 <210> 51 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51
Gly Tyr Cys Ala Thr Cys Tyr Arg Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys 15 10 15
Ala Gly Thr Cys 20 <210> 52 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52
Gly Ala Thr Ala Thr Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys 15 10 15
Ala Gly Ala Cys “ 20 <210> 53 <211> 20 <212> PRT
PL 217 296 B1 <213> Homo sapiens <400> 53
Gly Ala Ala Ala Thr Thr Gly Thr Gly Thr Thr Gly Ala Cys Arg Cys 15 10 15
Ala Gly Thr Cys 20 <210> 54 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54
Gly Ala Ala Ala Thr Trp Gly Thr Arg Ala Thr Gly Ala Cys Ala Cys 1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys 20 <210> 55 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55
Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Ala Cys 15 10 15
Ala Gly Thr Cys 20 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56
Gly Ala Ala Ala Thr Thr Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Thr Cys 1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys 20 <210> 57 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57
Cys Cys Cys Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly
PL 217 296 B1
10 15
Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly <210> 58 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58
Cys Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly 15 10 15
Gly Gly Gly Cys Thr Gly Cys J 20 <210> 59 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59
Cys 1 Cys Cys Ala Gly Cys Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Cys
5 10 15
Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Gly Cys
20 25
<210> 60 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys 15 10 15
Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys ' 20 25 <210> 61 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61
Cys Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Cys Ala 15 10 15
Gly Ala Thr Gly 20
PL 217 296 B1
<210> 62
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Xaa=Arg, His,
<220>
<221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Tyr, Trp, or Phe <220>
<221> VARIANT <222> 6
<223> Xaa=Pro, Tyr, Phe, or Trp
<400> 62 Xaa Asp Trp Xaa Asp Xaa
5
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Xaa=Arg or Lys
<220>
<221> VARIANT
<222> 4
<223> Xaa=Gly or Phe
<220>
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa=Pro or Tyr
<400> 63
Xaa Asp Trp Xaa Asp Xaa
1 5
<210> 64
<211> 5
PL 217 296 B1 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly,His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Thr, Val, Trp, or Tyr <220>
<221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=Cys, Asp, Glu, Phe, Gly,His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220>
<221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly,His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr <400> 64
Xaa Tyr Xaa Ile Xaa 1 5 <210> 65 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Arg, Lys, or His <220>
<221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=Ala, Gly, Val, Leu, Ile, or Pro <220>
<221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=Asn or Gin <400> 65
Xaa Tyr Xaa Ile Xaa 1 5
PL 217 296 B1 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=Ala, Ile, or Pro <400> 66
Arg Tyr Xaa Ile Asn 1 5 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa=Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, or Tyr <220>
<221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa=Cys, Asp, Glu, Phe, Gly,His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, or Tyr <220>
<221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa=Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, or Tyr <220>
<221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa=Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly,His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, or Tyr <220>
<221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa=Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu,
PL 217 296 B1
Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <400> 67
Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Gin Xaa Phe Gin 15 10 15
Xaa <210> 68 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa=Ile, Val, Gly, Ala, or Leu <220>
<221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa=Ala, Ile, Val, Gly, Leu, Glu, or Asp <220>
<221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa=Asp, Glu, Asn, or Gin <220>
<221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa=Lys, Arg, or His <220>
<221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa=Gly, Ile, Val, Ala, Leu, Asp, or Glu <400> 68
Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Gin Xaa Phe Gin 15 10 15
Xaa
<210> 69 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220>
PL 217 296 B1
<221> <222> <223> VARIANT 8 Xaa=Ile or Val
<220> <221> VARIANT
<222> 9
<223> Xaa=Ala or Glu
<220> <221> VARIANT
<222> 10
<223> Xaa=Asp or Asn
<220> <221> VARIANT
<222> 17
<223> Xaa=Gly or Asp
<400> 69
Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Gin Xaa Phe Gin 15 10 15
Xaa <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANT <222> 6
<223> Xaa=Ala, Leu, Met, Tyr Cys, Asn, Asp, Pro, Glu, Gin, Phe, Arg, Gly, Ser, His, Thr, Ile, Trp Lys, , or
<220>
<221> VARIANT
<222> 9
<223> Xaa=Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys,
Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, or
Trp <400> 70
Arg Ala Ser Gin Ser Xaa Ser Ser Xaa Leu Ala 1 5 10 <210> 71 <211> 11
PL 217 296 B1 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=Val, Ala, Leu, Ile, or Gly <220>
<221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa=Phe, Trp, or Tyr <400> 71
Arg Ala Ser Gin Ser Xaa Ser Ser Xaa Leu Ala 1 5 10 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=Val or Gly <220>
<221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa=Phe or Tyr <400> 72
Arg Ala Ser Gin Ser Xaa Ser Ser Xaa Leu Ala 15 10 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, or Thr <220>
<221> VARIANT
PL 217 296 B1
<222> 8 <223> Xaa=Leu, Gly, Ala, Val, or Ile
<220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa=Thr or Ser <400> 73 Gin Gin Tyr Xaa Ser Ser Pro Xaa Xaa
5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=Gly or Ser <220>
<221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa=Leu or Ile <400> 74
Gin Gin Tyr Xaa Ser Ser Pro Xaa Thr

Claims (32)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Wyizolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, które wiąże ludzkie CD25 i hamuje wiązanie IL-2 z CD25, które to przeciwciało obejmuje regiony CDR1, CDR2 i CDR3 domeny VH i regiony CDR1, CDR2 i CDR3 domeny VL mające sekwencje aminokwasowe jak określono poniżej:
    (i) SEKW. NR ID.: 23, 24, 25, 26, 27 i 28;
    (ii) SEKW. NR ID.: 29, 30, 31, 32, 33 i 34;
    (ii) SEKW. NR ID.: 35, 36, 37, 38, 39 i 40;
    (iv) SEKW. NR ID.: 17, 18, 19, 20, 21 i 22.
  2. 2. Przeciwciało według zastrz. 1, które wiąże ludzkie CD25 i hamuje wiązanie IL-2 z CD25, które to przeciwciało obejmuje regiony zmienne ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa obejmujące sekwencje aminokwasowe przedstawione, odpowiednio, w SEKW. NR ID.: 10 i 8, SEKW. NR ID.: 14 i 16, SEKW. NR ID.: 2 i 4, SEKW. NR ID.: 10 i 12.
  3. 3. Przeciwciało według dowolnego spośród zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że jest kodowane przez kwasy nukleinowe ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa obejmujące sekwencje nukleotydowe ich regionów zmiennych przedstawione, odpowiednio, w SEKW. NR ID.: 5 i 7, SEKW. NR ID.: 13 i 15, SEKW. NR ID.: 1 i 3 lub SEKW. NR ID.: 9 i 11.
    PL 217 296 B1
  4. 4. Przeciwciało według dowolnego spośród zastrz. 1-3, znamienne tym, że obejmuje:
    (i) sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego pochodzącą z ludzkiej sekwencji zarodkowej VHl-69/JH4b lub VHl-69/JH5b i sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha lekkiego pochodzącą z ludzkiej sekwencji zarodkowej A27/JK4 lub A27/JK5; lub (ii) sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego pochodzącą z ludzkiej sekwencji zarodkowej VH1-69/D7-27/JH4b lub VH1-69/D7-27/JH5b i sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha lekkiego pochodzącą z ludzkiej sekwencji zarodkowej A27/JK4 lub A27/JK5.
  5. 5. Przeciwciało według dowolnego spośród zastrz. 1-4, znamienne tym, że wybrane jest z grupy składającej się z: przeciwciała IgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA1, lgA2, wydzielniczego IgA, IgD i IgE.
  6. 6. Przeciwciało według dowolnego spośród zastrz. 1-5, znamienne tym, że oddysocjowuje od ludzkiego CD25 ze stałą równowagi reakcji dysocjacji (KD) około 10-8 M lub mniej, korzystnie -9 -10 -11 około 10-9 M lub mniej, a najkorzystniej około 10-10 M lub mniej lub 10-11 M lub jeszcze mniej, na podstawie badania rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) w urządzeniu BIAcore 3000, przy użyciu ludzkich zrekombinowanych CD25 jako liganda i przeciwciała jako analitu.
  7. 7. Przeciwciało według dowolnego spośród zastrz. 1-6, znamienne tym, że posiada jedną lub więcej następujących cech:
    (a) swoistość wobec ludzkiego CD25, (b) hamuje wiązanie IL-2 z CD25, (c) eliminuje komórki T wytwarzające CD25, (d) przekształca komórki T w tolerancyjne, (e) hamuje proliferację komórek T wytwarzających CD25, (f) hamuje proliferację komórek T indukowaną przeciwciałem anty-CD3 z jednojądrowych komórek krwi obwodowej (PBMC), (g) hamuje reakcję mieszanych limfocytów (MLR), (h) zdolność internalizacji CD25 wytwarzanego na komórkach T.
  8. 8. Przeciwciało według dowolnego spośród zastrz. 1-7, które jest niezmienionym przeciwciałem wybranym z grupy składającej się z: niezmienionego przeciwciała IgG1, korzystnie niezmienionego przeciwciała IgG1,K niezmienionego przeciwciała IgG1A niezmienionego przeciwciała lgG2, korzystnie niezmienionego przeciwciała lgG2,K niezmienionego przeciwciała lgG2A, niezmienionego przeciwciała IgM, niezmienionego przeciwciała IgA1, niezmienionego przeciwciała lgA2, niezmienionego przeciwciała wydzielniczego IgA, niezmienionego przeciwciała IgD i niezmienionego przeciwciała IgE, znamienne tym, że przeciwciało jest glikozylowane w komórce eukariotycznej.
  9. 9. Przeciwciało według dowolnego spośród zastrz. 1 do 7, znamienne tym, że jest fragmentem przeciwciała lub przeciwciałem o pojedynczym łańcuchu.
  10. 10. Przeciwciało według dowolnego spośród zastrz. 1-9, znamienne tym, że jest immunoglobulinową fuzją białkową domeny wiążącej obejmującą:
    (i) region zmienny łańcucha ciężkiego lub region zmienny łańcucha lekkiego, jak określono w zastrz. I, który jest w fuzji z polipeptydowym regionem zawiasowym immunoglobuliny, (ii) immunoglobulinowy region stały CH2 łańcucha ciężkiego w fuzji z regionem zawiasowym i (iii) immunoglobulinowy region stały CH3 łańcucha ciężkiego w fuzji z regionem stałym CH2.
  11. 11. Hybrydoma, znamienna tym, że wytwarza ludzkie przeciwciało monoklonalne określone w dowolnym spośród zastrz. 1 do 8.
  12. 12. Hybrydoma według zastrz. 11, obejmująca komórkę B uzyskaną ze zwierzęcia transgenicznego nie będącego człowiekiem, w której w wyniku rearanżacji segmentów genów V-(D)-J uzyskano funkcjonalny transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i funkcjonalny transgen ludzkiego łańcucha lekkiego, w fuzji z unieśmiertelnioną komórką, znamienna tym, że wytwarza w wykrywalnej ilości przeciwciało monoklonalne określone w dowolnym spośród zastrz. 1 do 10.
  13. 13. Transfektoma obejmująca kwasy nukleinowe kodujące ludzki łańcuch ciężki i ludzki łańcuch lekki, znamienna tym, że wytwarza wykrywalne ilości przeciwciał określonych w dowolnym spośród zastrz. 1 do 9.
  14. 14. Ex vivo eukariotyczna lub prokariotyczna komórka gospodarza obejmująca kwasy nukleinowe kodujące ludzki łańcuch ciężki i ludzki łańcuch lekki, znamienna tym, że wytwarza wykrywalne ilości przeciwciał określonych w dowolnym spośród zastrz. 1 do 9.
    PL 217 296 B1
  15. 15. Transgeniczne zwierzę nie będące człowiekiem lub roślina obejmujące kwasy nukleinowe kodujące ludzki łańcuch ciężki i ludzki łańcuch lekki, znamienne tym, że wytwarzają w wykrywalnej ilości przeciwciało określone w dowolnym spośród zastrz. 1 do 9.
  16. 16. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że koduje ludzkie przeciwciało monoklonalne określone w dowolnym spośród zastrz. 1 do 9.
  17. 17. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało określone w dowolnym spośród zastrz. 1 do 9 lub wektor ekspresyjny określony w zastrz 16 i farmaceutycznie dopuszczany nośnik oraz, ewentualnie, zawierająca dodatkowy składnik terapeutyczny.
  18. 18. Przeciwciało według dowolnego spośród zastrz. 1 do 9 zawierające dodatkowo linker chelatorowy do przyłączania radioizotopu.
  19. 19. Immunokoniugat obejmujący przeciwciało określone w dowolnym z zastrz. 1 do 9 i 18 połączone z czynnikiem cytotoksycznym, radioizotopem lub lekiem.
  20. 20. Bispecyficzna lub multispecyficzna cząsteczka obejmująca przeciwciało określone w dowolnym spośród zastrz. 1 do 9 oraz specyficzność wiązania dla CD3, CD4, IL-15R, TNF-α związanego z błoną lub związanego z receptorem, lub IL-15 związanej z błoną, lub związanej z receptorem.
  21. 21. Sposób in vitro hamowania wzrostu i/lub proliferacji komórek wyrażających CD25 lub eliminowania komórek wyrażających CD25 obejmujący stosowanie przeciwciała, kompozycji, immunokoniugatu, bispecyficznej lub multispecyficznej cząsteczki jak określone w dowolnym spośród zastrz. 1 do 10 albo 17 do 20, w którym wzrost i/lub proliferacja komórek jest hamowana lub gdzie zachodzi zastopowanie wyrażania CD25 i w którym komórką wyrażającą CD25 jest opcjonalnie aktywowana komórka T.
  22. 22. Przeciwciało, kompozycja, immunokoniugat, bispecyficzna lub multispecyficzna cząsteczka lub wektor ekspresyjny jak określone w dowolnym spośród zastrz. 1 do 10 albo 16 do 20 do stosowania jako lek.
  23. 23. Przeciwciało, kompozycja, immunokoniugat, bispecyficzna lub multispecyficzna cząsteczka lub wektor ekspresyjny jak określone w dowolnym spośród zastrz. 1 do 10 albo 16 do 20 do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu odrzuceniu przeszczepu, reakcji przeszczep przeciw gospodarzowi, chorobie immunologicznej, autoimmunologicznej lub zapalnej, zapaleniu lub zaburzeniu nadmiernej proliferacji komórek skóry, zaburzenia hematologicznego, nowotworu, w którym jest korzystne zahamowanie naciekających regulatorowych komórek T CD25+ i nowotworu limfoidalnego, gdzie:
    (i) odrzucenie przeszczepu jest odrzuceniem aloprzeszczepu lub heteroprzeszczepu, u pacjentów przechodzących przeszczepienie narządu lub tkanki, jak przeszczep serca, płuca, łącznie sercapłuca, tchawicy, nerki, wątroby, trzustki, przełyku, jelita, skóry, kończyny, pępowiny, komórki macierzystej układu krwiotwórczego, komórki wyspy trzustkowej;
    (ii) reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi jest wybrana z grupy składającej się z: reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi przy transfuzji krwi i reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi przy przeszczepie szpiku;
    (iii) choroba immunologiczna, autoimmunologiczna lub zapalna jest wybrana z grupy składającej się z: reumatoidalnego zapalenia stawów, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, artropatii łuszczycowej, cukrzycy typu 1, cukrzycy typu 2 wymagającej insuliny, stwardnienia rozsianego, układowego tocznia rumieniowatego, miastenii ciężkiej, choroby zapalnej jelita, choroby Crohna, zapalenia okrężnicy wrzodziejącego, akrodynii, zespołu Sjogrena, zapaleń tętnicy, w tym zapalenia tętnicy skroniowej olbrzymiokomórkowego, niedokrwistości aplastycznej, astmy, twardzicy skóry i zapalenia błony naczyniowej oka;
    (iv) zapalenie lub zaburzenie nadmiernej proliferacji komórek skóry jest wybrane z grupy składającej się z: łuszczycy, w tym łuszczycy płytkowej, dłoniowo-stopowej łuszczycy krostkowej (PPP), liszaja płaskiego z nadżerkami, pęcherzycy pęcherzowej, pęcherzycy z oddzieleniem naskórka, kontaktowego zapalenia skóry i atopowego zapalenia skóry;
    (v) zaburzenie hematologiczne jest wybrane z grupy składającej się z: białaczki/chłoniaka dojrzałych komórek T, chłoniaka z anaplastycznymi komórkami dużymi, białaczki Iimfoblastycznej przewlekłej (CLL)/białaczki Iimfoblastycznej z komórkami małymi (SLL), chłoniaka z obwodowych komórek T i wtórnej skrobiawicy.
    (vi) nowotwór Iimfoidalny jest wybrany z grupy składającej się z: białaczki komórek T, choroby Hodgkina, białaczki kosmatokomórkowej lub chłoniaka skóry z limfocytów T, w tym ziarniniaka grzybiastego i zespołu Sezaryego;
    PL 217 296 B1 (vii) nowotwór, w którym jest korzystne zahamowanie naciekających regulatorowych komórek T CD25+ jest wybrany z grupy składającej się z: raka żołądka, raków przełyku, czerniaka złośliwego, raka jelita grubego, raka trzustki, raka piersi, raka płuca małokomórkowego, raka płuca niemałokomórkowego, raka szyjki macicy, raka jajnika i raka komórek nerkowych.
  24. 24. Przeciwciało, kompozycja, immunokoniugat, bispecyficzna iub muitispecyficzna cząsteczka lub wektor ekspresyjny według zastrz. 22 aibo 23, gdzie ieczenie obejmuje oddzieine stososowanie u osobnika innego czynnika terapeutycznego i/iub terapii.
  25. 25. Kompozycja według zastrz. 17, przeciwciało, kompozycja, immunokoniugat, bispecyficzna iub muitispecyficzna cząsteczka lub wektor ekspresyjny według zastrz. 25, gdzie czynnik terapeutyczny jest:
    (i) czynnikiem immunosupresyjnym wybranym z grupy składającej się z: cyklosporyny, azatiopryny, kwasu mykofenolowego, mykofenolanu mofetylu, kortykosteroidów, takich jak prednizon, metotreksat, soli złota, sulfasalazyny, czynników przeciwmalarycznych , brekwinaru, iefiunomido, mizorybiny, 15-deoksyspergaiiny, 6-merkaptopuryny, cykiofosfamidu, rapamycyny, takroiimusa (FK-506), OKT3 i giobuiiny przeciwtymocytowej (ii) czynnikiem przeciwzapalnym wybranym z grupy składającej się z: leku steroidowego, NSAID (niesteroidowy iek przeciwzapainy), i DMARD, takie jak metotreksat, hydroksychiorochina, suifasaiazyna, leflunomid, czynników blokujących receptory dla IL-1, np. anakinra i czynników blokujących TNF-α, np. etanerceptu, infliksimabu i adalimumabu, przeciwciał anty-IL-6R, CTLA41g i przeciwciał anty-IL-15.
    (iii) czynnikiem lub terapią do leczenia stanów zapalnych lub zaburzeń nadmiernej proliferacji skóry, wybranym z grupy składającej się z: smoły pogazowej, witaminy A, antraliny, kalcipotrienu, tarazotenu, kortykosteroidów, metotreksatu, retinoidów, np. acitretyny, cyklosporyny, etanerceptu, aiefaceptu, efaiuzimabu, 6-tioguaninu, mykofenoianu mofetyiu, takroiimusu (FK-506), hydroksymocznika i fototerapii takiej jak UVB (promieniowanie uitrafioietowe typu B szerokopasmowe i wąskopasmowe), UVA (promieniowanie uitrafioietowe typu A) i PUVA (metoksaien psoraienu z promieniowaniem uitrafioietowym typu A).
    (iv) wybrany z grupy składającej się z: doksorubicyny, cisplatyny, bleomycyny, karmustyny, chiorambucyiu i cyciofosfamidu.
  26. 26. Przeciwciało, kompozycja, immunokoniugat, bispecyficzna iub muitispecyficzna cząsteczka lub wektor ekspresyjny jak określone w dowolnym spośród zastrz. 1 do 10 aibo 16 do 20 do stosowania w ieczeniu iub zapobieganiu:
    (a) odrzuceniu przeszczepu, reakcji przeszczep przeciw gospodarzowi, chorobie immunoiogicznej, autoimmunologicznej lub zapalnej, zapaleniu lub zaburzeniu nadmiernej proliferacji komórek skóry i nowotworu iimfoidainego, gdzie:
    (i) odrzucenie przeszczepu jest odrzuceniem aioprzeszczepu iub heteroprzeszczepu, u pacjentów przechodzących przeszczepienie narządu lub tkanki, jak przeszczep serca, płuca, łącznie sercapłuca, tchawicy, nerki, wątroby, trzustki, przełyku, jelita, skóry, kończyny, pępowiny, komórki macierzystej układu krwiotwórczego, komórki wyspy trzustkowej;
    (ii) reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi jest wybrana z grupy składającej się z: reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi przy transfuzji krwi i reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi przy przeszczepie szpiku;
    (iii) choroba immunologiczna, autoimmunologiczna lub zapalna jest wybrana z grupy składającej się z: reumatoidalnego zapalenia stawów, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, artropatii łuszczycowej, cukrzycy typu 1, cukrzycy typu 2 wymagającej insuliny, stwardnienia rozsianego, układowego tocznia rumieniowatego, miastenii ciężkiej, choroby zapalnej jelita, choroby Crohna, zapalenia okrężnicy wrzodziejącego, akrodynii, zespołu Sjogrena, zapaleń tętnicy, w tym zapalenia tętnicy skroniowej olbrzymiokomórkowego, niedokrwistości aplastycznej, astmy, twardzicy skóry i zapalenia błony naczyniowej oka;
    (iv) zapalenie lub zaburzenie nadmiernej proliferacji komórek skóry jest wybrane z grupy składającej się z: łuszczycy, w tym łuszczycy płytkowej, dłoniowo-stopowej łuszczycy krostkowej (PPP), liszaja płaskiego z nadżerkami, pęcherzycy pęcherzowej, pęcherzycy z oddzieleniem naskórka, kontaktowego zapalenia skóry i atopowego zapalenia skóry;
    (v) nowotwór Iimfoidainy jest wybrany z grupy składającej się z: białaczki komórek Ti choroby Hodgkina, białaczki kosmatokomórkowej lub chłoniaka skóry z limfocytów T, w tym ziarniniaka grzybiastego i zespołu Sezaryego;
    PL 217 296 B1 (vi) nowotworowi, w którym jest korzystne zahamowanie naciekających regulatorowych komórek T CD25+ i który jest wybrany z grupy składającej się z: raka żołądka, raków przełyku, czerniaka złośliwego, raka jelita grubego, raka trzustki, raka piersi, raka płuca małokomórkowego, raka płuca nie małokomórkowego, raka szyjki macicy, raka jajnika i raka komórek nerkowych, lub (vii) zaburzeniu hematologicznemu wybranemu z grupy składającej się z: białaczki/chłoniaka dojrzałych komórek T, chłoniaka z anaplastycznymi komórkami dużymi, białaczki Iimfoblastycznej przewlekłej (CLL)/białaczki Iimfoblastycznej z komórkami małymi (SLL), chłoniaka z obwodowych komórek T i wtórnej skrobiawicy.
  27. 27. Sposób wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25, znamienny tym, że obejmuje:
    - kontaktowanie próbki z przeciwciałem określonym w dowolnym spośród zastrz. 1-10 w warunkach pozwalających na tworzenie kompleksu pomiędzy przeciwciałem i CD25 i
    - wykrywanie tworzenia kompleksu.
  28. 28. Zestaw diagnostyczny do wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25, znamienny tym, że obejmuje przeciwciało określone w dowolnym spośród zastrz. 1 do 10, przy czym przeciwciało jest ewentualnie połączone z wykrywalnym znacznikiem oraz instrukcje jego stosowania.
  29. 29. Przeciwciało anty-idiotypowe wiążące przeciwciało określone w dowolnym spośród zastrz. 1 do 10.
  30. 30. Przeciwciało według zastrz. 29, wiążące się do przeciwciała, które ma regiony zmienne ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa obejmujące sekwencje aminokwasowe przedstawione, odpowiednio, w SEKW. NR ID.: 2 i 4, SEKW. NR ID.: 6 i 8, SEKW. NR ID.: 10 i 12, SEKW. NR ID.: 14 i 16.
  31. 31. Zastosowanie przeciwciała anty-idiotypowego określonego w zastrz. 29 albo 30 do wykrywania w próbce poziomu ludzkiego przeciwciała monoklonalnego wobec CD25.
  32. 32. Wyizolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem na ludzkim CD25, jak przeciwciało zdefiniowane przez regiony zmienne ludzkiego ciężkiego łańcucha i ludzkiego lekkiego łańcucha kappa obejmujące sekwencje aminokwasowe przedstawione odpowiednio w SEKW. NR ID.: 6 i 8, SEKW. NR ID.: 14, SEKW. NR ID.: 2 i 4, SEKW. NR ID.: 10, 12 i 16.
PL377794A 2002-11-15 2003-11-14 Wyizolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, wytwarzająca je hybrydoma, kodujący to przeciwciało wektor ekspresyjny i zawierająca je kompozycja farmaceutyczna, immunokoniugat, bispecyficzna lub multispecyficzna cząsteczka obejmująca kwasy nukleinowe kodujące ciężki i lekki łańcuch transfektoma, ich zastosowania, zwłaszcza w medycynie, obejmująca te kwasy ex vivo eukariotyczna lub prokariotyczna komórka gospodarza oraz nie będące człowiekiem zwierzę transgeniczne lub roślina, sposób in vitro hamowania wzrostu i/lub proliferacji komórek wyrażających CD25 lub eliminowania komórek wyrażających CD25, sposób wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25, zestaw diagnostyczny do wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25 PL217296B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42669002P 2002-11-15 2002-11-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL377794A1 PL377794A1 (pl) 2006-02-20
PL217296B1 true PL217296B1 (pl) 2014-07-31

Family

ID=32326400

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL377794A PL217296B1 (pl) 2002-11-15 2003-11-14 Wyizolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, wytwarzająca je hybrydoma, kodujący to przeciwciało wektor ekspresyjny i zawierająca je kompozycja farmaceutyczna, immunokoniugat, bispecyficzna lub multispecyficzna cząsteczka obejmująca kwasy nukleinowe kodujące ciężki i lekki łańcuch transfektoma, ich zastosowania, zwłaszcza w medycynie, obejmująca te kwasy ex vivo eukariotyczna lub prokariotyczna komórka gospodarza oraz nie będące człowiekiem zwierzę transgeniczne lub roślina, sposób in vitro hamowania wzrostu i/lub proliferacji komórek wyrażających CD25 lub eliminowania komórek wyrażających CD25, sposób wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25, zestaw diagnostyczny do wykrywania w próbce obecności antygenu CD25 lub komórki wyrażającej CD25

Country Status (18)

Country Link
US (6) US7438907B2 (pl)
EP (1) EP1578397B1 (pl)
JP (1) JP4966497B2 (pl)
KR (2) KR20050086628A (pl)
CN (1) CN101124244B (pl)
AU (1) AU2003295471B2 (pl)
BR (1) BRPI0316282B8 (pl)
CA (1) CA2505991C (pl)
DK (1) DK1578397T3 (pl)
EA (1) EA013677B1 (pl)
ES (1) ES2401136T3 (pl)
IL (1) IL168304A (pl)
MX (1) MXPA05005160A (pl)
NO (1) NO20052889L (pl)
NZ (1) NZ540555A (pl)
PL (1) PL217296B1 (pl)
UA (1) UA90082C2 (pl)
WO (1) WO2004045512A2 (pl)

Families Citing this family (163)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002252456A1 (en) 2001-03-23 2002-10-08 Aphton Corporation Combination treatment of pancreatic cancer
US20090191232A1 (en) 2001-05-04 2009-07-30 Gevas Philip C Combination therapy for the treatment of tumors
US20040009172A1 (en) * 2002-04-26 2004-01-15 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
BR0312785A (pt) * 2002-07-19 2005-08-30 Abbott Biotech Ltd Tratamento de desordens relacionadas a tnf(alfa)
US20090280065A1 (en) * 2006-04-10 2009-11-12 Willian Mary K Uses and Compositions for Treatment of Psoriasis
ES2401136T3 (es) 2002-11-15 2013-04-17 Genmab A/S Anticuerpos monoclonales humanos contra CD25
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
EP1675615A1 (en) * 2003-09-23 2006-07-05 PDL BioPharma, Inc. Treatment of respiratory diseases with anti-il-2 receptor antibodies
DK1794586T3 (da) 2004-09-22 2013-05-13 Cancer Advances Inc Monoklonale antistoffer til progastrin
KR20070083809A (ko) * 2004-10-07 2007-08-24 유니베르시태트 취리히 건선 예방 및 치료용 ⅰ형 인터페론 차단제
US20060165687A1 (en) * 2004-10-19 2006-07-27 Duke University Vaccine adjuvant
WO2006063150A2 (en) * 2004-12-08 2006-06-15 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for immunotherapy and detection of inflammatory and immune-dysregulatory disease, infectious disease, pathologic angiogenesis and cancer
RU2007133561A (ru) * 2005-02-08 2009-04-20 Новартис АГ (CH) Индукция антилимфоцитарного антитела комбинацией агониста/модулятора рецептора s1p и иммуносупрессивных лекарственных средств
MX2007009466A (es) * 2005-02-10 2007-12-07 Baylor Res Inst Anticuerpos monoclonales de anti-interferon alfa y metodos para su uso.
JP5225069B2 (ja) 2005-03-23 2013-07-03 ゲンマブ エー／エス 多発性骨髄腫の治療のためのｃｄ３８に対する抗体
GB0507696D0 (en) * 2005-04-15 2005-05-25 Novartis Ag Organic compounds
EP1874821B1 (de) 2005-04-26 2013-04-17 Trion Pharma Gmbh Kombination von antikörpern mit glukokortikoiden zur behandlung von krebs
MX2007014440A (es) 2005-05-16 2008-02-11 Abbott Biotech Ltd Uso de inhibidor de tnf para tratamiento de poliartritis erosiva.
CN101189265B (zh) * 2005-06-01 2012-07-04 米克罗麦特股份公司 抗il2抗体
US8470316B2 (en) * 2005-10-14 2013-06-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agents for suppressing damage to transplanted islets after islet transplantation
CA2626688C (en) * 2005-10-21 2017-10-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agents for treating cardiopathy
AR057582A1 (es) * 2005-11-15 2007-12-05 Nat Hospital Organization Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos
JPWO2007061029A1 (ja) * 2005-11-25 2009-05-07 学校法人慶應義塾 前立腺癌治療剤
WO2007059782A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
CN101370521A (zh) 2006-01-27 2009-02-18 学校法人庆应义塾 伴有脉络膜血管生成的疾病的治疗药
US9260516B2 (en) * 2006-04-07 2016-02-16 Osaka University Method for promoting muscle regeneration by administering an antibody to the IL-6 receptor
EP2010214A4 (en) 2006-04-10 2010-06-16 Abbott Biotech Ltd USES AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF RHEUMATOID ARTHRITIS
US9605064B2 (en) * 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
EP2007426A4 (en) * 2006-04-10 2010-06-16 Abbott Biotech Ltd COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF PSORIASTIC POLYARTHRITIS AND THEIR APPLICATIONS
US20080131374A1 (en) * 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
JP5605895B2 (ja) 2006-07-04 2014-10-15 ゲンマブ エー／エス Ｃｏｐｄを処置するためのｃｄ２０結合分子
PT2081595T (pt) 2006-09-26 2019-07-16 Genmab As Anti-cd38 mais corticosteroides mais um quimioterápico não corticosteroide para tratar tumores
PL2104682T3 (pl) * 2007-01-11 2017-03-31 Michael Bacher Diagnostyka i leczenie choroby Alzheimera i innych chorób neurodegeneracyjnych
WO2008088902A2 (en) * 2007-01-17 2008-07-24 Yale University Attenuation of the adaptive immune response
WO2008090901A1 (ja) 2007-01-23 2008-07-31 Shinshu University 慢性拒絶反応抑制剤
AU2008211807B2 (en) * 2007-01-29 2013-09-19 Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus Method for producing novel IgE based reagents
EP2615175B1 (en) * 2007-05-31 2018-08-08 Genmab A/S Monovalent human antibodies
WO2009081395A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-02 Ben Gurion University Of The Negev Research And Development Authority A method of treating neurodegenerative diseases
US9669057B2 (en) 2008-04-25 2017-06-06 Duke University Regulatory B cells and their uses
EP2279207B1 (en) 2008-05-07 2015-09-09 Argos Therapeutics, Inc. Humanized antibodies against human interferon-alpha
CN104906581A (zh) * 2008-06-05 2015-09-16 国立研究开发法人国立癌症研究中心 神经浸润抑制剂
UA109633C2 (uk) 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
US8389689B2 (en) 2009-10-28 2013-03-05 Janssen Biotech, Inc. Anti-GLP-1R antibodies and their uses
US8906374B2 (en) 2010-04-20 2014-12-09 Cedars-Sinai Medical Center Combination therapy with CD4 lymphocyte depletion and mTOR inhibitors
US9539322B2 (en) 2010-05-28 2017-01-10 National University Corporation Hokkaido University Method of enhancing an antitumor T cell response by administering an anti-IL-6 receptor antibody
SI2580243T1 (sl) 2010-06-09 2020-02-28 Genmab A/S Protitelesa proti humanemu CD38
CA2802782C (en) 2010-06-15 2018-03-13 Genmab A/S Human antibody drug conjugates against tissue factor
AU2011283694B2 (en) 2010-07-29 2017-04-13 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
WO2012019041A2 (en) 2010-08-04 2012-02-09 Duke University Regulatory b cells and their uses
WO2012088272A1 (en) * 2010-12-21 2012-06-28 Duke University Methods and compositions combining immunotherapy with monocyte activation
EP2714738B1 (en) 2011-05-24 2018-10-10 Zyngenia, Inc. Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
CN103374074A (zh) * 2012-04-28 2013-10-30 中国科学院上海生命科学研究院 一种抗cd25单链抗体
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
BR112015000167B1 (pt) 2012-07-06 2021-11-23 Genmab B.V. Proteína dimérica, proteína, composição, kit de partes e seus usos, bem como método para aumentar a oligomerização em solução de uma proteína dimérica compreendendo um primeiro e segundo polipeptídeo, cada um compreendendo pelo menos as regiões ch2 e ch3 de uma cadeia pesada de igg1 humana e proteína dimérica variante
KR102193080B1 (ko) 2012-08-13 2020-12-18 제넨테크, 인크. 항-jagged 항체 및 사용 방법
US10017739B2 (en) 2012-09-06 2018-07-10 Duke University Methods of expanding and assessing B cells and using expanded B cells to treat disease
EP2906296B1 (en) * 2012-10-12 2018-03-21 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EA201500741A1 (ru) 2013-01-10 2016-01-29 Генмаб Б.В. ВАРИАНТЫ Fc-ОБЛАСТИ IGG1 ЧЕЛОВЕКА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10738132B2 (en) 2013-01-14 2020-08-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9738722B2 (en) 2013-01-15 2017-08-22 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP3421495A3 (en) * 2013-03-15 2019-05-15 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
US20140302037A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
CA2907181C (en) 2013-03-15 2023-10-17 Viktor Roschke Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10519242B2 (en) * 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
EP3097420A4 (en) * 2014-01-24 2018-01-17 Ntercept, LLC Methods and compositions for immune dis-inhibition
JP2017507931A (ja) 2014-02-05 2017-03-23 シーダーズ−サイナイ メディカル センター がん及び感染症の治療方法並びに治療用組成物
LT3122781T (lt) 2014-03-28 2020-03-25 Xencor, Inc. Bispecifiniai antikūnai, kurie jungiasi prie cd38 ir cd3
WO2015199534A1 (en) * 2014-06-26 2015-12-30 Erasmus University Medical Center Rotterdam Determining encapsulating peritoneal sclerosis
BR112017006552A2 (pt) 2014-10-03 2017-12-19 Ntercept Llc composições e métodos para inibir a atividade biológica de biomoléculas solúveis
BR112017011111A2 (pt) 2014-11-25 2017-12-26 Adc Therapeutics Sa conjugados de pirrolobenzodiazepina-anticorpo
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
IL252467B (en) 2014-11-26 2022-06-01 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd38
TN2017000223A1 (en) 2014-11-26 2018-10-19 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens
US10428155B2 (en) 2014-12-22 2019-10-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
CN104483493B (zh) * 2014-12-30 2016-09-28 青岛市市立医院 一种筛选咪唑立宾于免疫t细胞中药物作用靶位的方法
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
GB201507827D0 (en) * 2015-05-07 2015-06-17 Adc Therapeutics Sarl Diagnostic test
WO2017011592A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Modular Genetics, Inc. Generation of acyl alcohols
KR20180034619A (ko) 2015-07-29 2018-04-04 나노틱스 엘엘씨 가용성 생체분자를 소거하기 위한 모듈 조성물 및 이와 관련된 방법
EP3359194A4 (en) 2015-10-06 2019-04-24 Merck Sharp & Dohme Corp. ANTIBODY-ACTIVE CONJUGATE FOR ANTI-INFLAMMATORY APPLICATIONS
WO2017096262A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Jomoco, Corp. Compositions and methods to mitigate or prevent an immune response to an immunogenic therapeutic molecule in non-human primates
KR20180085800A (ko) 2015-12-07 2018-07-27 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 psma에 결합하는 이종이합체성 항체
EP3407916B1 (en) 2016-01-29 2023-12-20 Merck Sharp & Dohme LLC Phosphonate linkers and their use to facilitate cellular retention of compounds
US20190135925A1 (en) * 2016-04-07 2019-05-09 Cancer Research Technology Limited Anti cd25 fc gamma receptor bispecific antibodies for tumor specific cell depletion
MA45255A (fr) 2016-06-14 2019-04-17 Xencor Inc Anticorps inhibiteurs de points de contrôle bispécifiques
CA3029328A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
JP7142630B2 (ja) 2016-10-14 2022-09-27 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαヘテロ二量体ＦＣ－融合タンパク質
EP4252629A3 (en) 2016-12-07 2023-12-27 Biora Therapeutics, Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
WO2018112407A1 (en) 2016-12-15 2018-06-21 Duke University Antibodies and methods for depleting regulatory b10 cells and use in combination with immune checkpoint inhibitors
EP3565604A4 (en) 2017-01-04 2020-09-09 Nanotics, LLC ELIMINATING PARTICLE ASSEMBLY PROCESSES
US11879014B2 (en) 2017-03-17 2024-01-23 Tusk Therapeutics Ltd. Method of treating cancer or depleting regulatory T cells in a subject by administering a human IGG1 anti-CD25 antibody
EP3600416B1 (en) 2017-03-30 2023-06-07 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
WO2018193104A1 (en) 2017-04-20 2018-10-25 Adc Therapeutics Sa Combination therapy with an anti-cd25 antibody-drug conjugate
CN108795858A (zh) * 2017-04-28 2018-11-13 深圳宾德生物技术有限公司 高抗癌活性t细胞的筛选方法和应用
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
KR102099593B1 (ko) * 2017-05-25 2020-04-13 기초과학연구원 항-인간 인터루킨-2 항체 및 이의 용도
AU2018285455A1 (en) 2017-06-14 2019-12-12 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-CD25 ADC
JP7469225B2 (ja) 2017-06-15 2024-04-16 キャンサー アドヴァンシーズ インク． 腫瘍及び癌に対する体液性及び細胞性免疫を誘発するための組成物及び方法
US12150978B2 (en) 2017-06-15 2024-11-26 Cancer Advances Inc. Compositions and methods for preventing tumors and cancer
AU2018291497A1 (en) 2017-06-30 2020-01-16 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric Fc fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra and antigen binding domains
CN111094346A (zh) * 2017-07-06 2020-05-01 塔斯克疗法有限公司 用于肿瘤特异性细胞消耗的化合物和方法
EP3698808B1 (en) 2017-10-20 2025-01-01 Hyogo College Of Medicine Anti-il-6 receptor antibody-containing medicinal composition for preventing post-surgical adhesion
US11312770B2 (en) 2017-11-08 2022-04-26 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-PD-1 sequences
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
JP7765181B2 (ja) 2017-12-19 2025-11-06 ゼンコア インコーポレイテッド 改変されたｉｌ－２ ｆｃ融合タンパク質
KR102083884B1 (ko) * 2018-02-19 2020-03-03 가톨릭대학교 산학협력단 이식 거부 질환 치료용 미니서클 벡터
US10745485B2 (en) 2018-03-13 2020-08-18 Tusk Therapeutics Ltd. Anti-CD25 antibody agents
US10982006B2 (en) 2018-04-04 2021-04-20 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
CA3097741A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
CN112867734A (zh) 2018-04-18 2021-05-28 Xencor股份有限公司 包含IL-15/IL-15Ra Fc融合蛋白和PD-1抗原结合结构域的靶向PD-1的异源二聚体融合蛋白及其用途
WO2019224275A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
WO2019246317A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm
US20230041197A1 (en) 2018-06-20 2023-02-09 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
GB201811364D0 (en) 2018-07-11 2018-08-29 Adc Therapeutics Sa Combination therapy
AU2019355971B2 (en) 2018-10-03 2025-05-08 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
CN113677359A (zh) 2018-11-14 2021-11-19 鲁比克治疗股份有限公司 Cd25抗体
EP3880698A4 (en) 2018-11-14 2022-11-30 RubrYc Therapeutics, Inc. MANIPULATED CD25 POLYPEPTIDES AND USES THEREOF
US20220249814A1 (en) 2018-11-19 2022-08-11 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
BR112021016955A2 (pt) 2019-03-01 2021-11-23 Xencor Inc Composição, composição de ácido nucleico, composição de vetor de expressão, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de produção de um domínio de ligação de membro de família 3 de pirofosfatase/fosfodiesterase de ectonucleotídeo e de tratamento de um câncer, anticorpo anti-enpp3, e, anticorpo heterodimérico
BR112021022682A2 (pt) 2019-05-14 2022-02-22 Provention Bio Inc Métodos e composições para prevenir diabetes do tipo 1
AU2020293160B2 (en) * 2019-06-10 2024-07-25 Shandong Boan Biotechnology Co., Ltd. Anti-CD25 antibody and application thereof
AU2020289961A1 (en) 2019-06-10 2022-01-27 Adc Therapeutics Sa Combination therapy comprising an anti-CD25 antibody drug conjugate and a further agent
US12214216B1 (en) 2019-10-16 2025-02-04 Helen Feng Photon enhanced bone growth system and method
GB201917254D0 (en) 2019-11-27 2020-01-08 Adc Therapeutics Sa Combination therapy
EP4309722A3 (en) 2019-12-13 2024-08-07 Biora Therapeutics, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
TW202144429A (zh) 2020-05-14 2021-12-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 抗ｃｄ２５抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
CA3182445A1 (en) 2020-06-11 2021-12-16 Francisco Leon Methods and compositions for preventing type 1 diabetes
US11124568B1 (en) * 2020-08-19 2021-09-21 Vitruviae LLC CD3/CD25 antibodies for neuro-immune diseases
GB202015916D0 (en) 2020-10-07 2020-11-18 Adc Therapeutics Sa Combination therapy
BR112023016241A2 (pt) * 2021-02-12 2023-11-14 Merck Sharp & Dohme Llc Anticorpos que se ligam ao metapneumovírus, proteínas antigênicas de metapneumovírus e usos dos mesmos
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
US11739144B2 (en) 2021-03-09 2023-08-29 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CLDN6
KR20230154311A (ko) 2021-03-10 2023-11-07 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체
KR102604849B1 (ko) * 2021-05-11 2023-11-22 가톨릭대학교 산학협력단 항-cd25 항체, il-10 및 cxcr3를 발현하는 미니서클 벡터
IL309257A (en) 2021-06-29 2024-02-01 Adc Therapeutics Sa Combined treatment using antibody-drug conjugates
WO2023014863A1 (en) 2021-08-05 2023-02-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses
EP4392455A4 (en) * 2021-08-25 2025-08-20 Ibio Inc ANTI-CD-25 ANTIBODIES
JP2024536722A (ja) 2021-09-03 2024-10-08 ジーオー セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗グリコｃｍｅｔ抗体およびその使用
WO2023034571A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-lamp1 antibodies and their uses
CN115197321B (zh) * 2022-06-02 2023-08-18 四川大学 靶向cd25的抗体及其用途
AU2023298151A1 (en) 2022-07-01 2025-01-02 Neurogene Inc. Neo-2/15 variants and uses thereof for preferentially stimulating t-regulatory cells
EP4572772A1 (en) 2022-08-17 2025-06-25 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
WO2024213046A1 (en) * 2023-04-11 2024-10-17 Suzhou Transcenta Therapeutics Co., Ltd. Anti-cd25 antibody and uses thereof
US12311033B2 (en) 2023-05-31 2025-05-27 Capstan Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations and compositions
WO2025076113A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids with conserved spacing and lipid nanoparticles
WO2025076127A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
AR134267A1 (es) * 2023-11-08 2025-12-17 Sanofi Sa Degradador lisosómico basado en cd25 y usos del mismo
WO2025158376A1 (en) * 2024-01-26 2025-07-31 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods for designing, use and manufacture of improved biologic molecules
WO2025179294A2 (en) 2024-02-22 2025-08-28 Capstan Therapeutics, Inc. Immune engineering amplification
WO2025217452A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025217454A2 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE272471C (pl)
US4578335A (en) 1984-05-21 1986-03-25 Immunex Corporation Interleukin 2 receptor
US4845198A (en) 1984-05-21 1989-07-04 Immunex Corporation Hybridoma antibody which binds IL-2 receptor
US5356795A (en) 1984-07-25 1994-10-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Cloning cDNAs for the human interleukin-2 receptor (55 RD protein)
US5317087A (en) 1984-11-13 1994-05-31 Immunex Corporation Purification of the IL-2 receptor
US4816565A (en) 1985-08-13 1989-03-28 Tasuku Honjo Interleukin 2 receptor and a method for production thereof
US5336489A (en) 1985-09-05 1994-08-09 The Beth Israel Hospital Association Treatment of allograft rejection with IL-2 receptor-specific cytotoxins
US5011684A (en) 1985-09-05 1991-04-30 Beth Israel Hospital Association Lysing or blocking unwanted cells with IL-2 receptor-specific binding substance
FR2616330B1 (fr) 1987-06-12 1990-12-21 Immunotech Sa Agent actif et medicament en contenant destines a prevenir ou a combattre le rejet de greffe d'organe chez l'homme
ATE137119T1 (de) 1987-08-17 1996-05-15 Us Commerce Verfahren zur behandlung der bösartigen und autoimmunen krankheiten beim menschen
US5152980A (en) 1988-05-19 1992-10-06 The Beth Israel Hospital Association Induction of tolerance to a foreign antigen IL-2 receptor-binding substances
EP0414816B1 (en) 1988-05-19 1994-07-27 The Beth Israel Hospital Association Induction of tolerance to a foreign antigen
DD272471A1 (de) 1988-06-13 1989-10-11 Univ Leipzig Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen den il-2-rezeptor humaner t-lymphozyten
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) * 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
FR2649488A1 (fr) 1989-07-07 1991-01-11 Inst Nat Sante Rech Med Fragments d'anticorps monoclonaux specifiques de la presence de leucocytes actives - leur procede d'obtention et leur application dans le cas de rejet de greffe
FR2652746A1 (fr) 1989-10-06 1991-04-12 Merieux Inst Application d'agents actifs pour la preparation d'un medicament destine au traitement de lymphomes ou assimiles.
HUT60768A (en) 1990-03-16 1992-10-28 Sandoz Ag Process for producing cd25 fixing molecules
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
JP2938569B2 (ja) 1990-08-29 1999-08-23 ジェンファーム インターナショナル，インコーポレイティド 異種免疫グロブリンを作る方法及びトランスジェニックマウス
DE4028955A1 (de) 1990-09-12 1992-03-19 Boehringer Mannheim Gmbh Monoklonale antikoerper gegen den interleukin 2-rezeptor
FR2672291A1 (fr) 1991-01-31 1992-08-07 Inst Nat Sante Rech Med Composition d'anticorps diriges contre le recepteur de l'interleukine-2 humaine ou animale.
CA2104958A1 (en) 1991-03-07 1992-09-08 Jean C. Nichols Use of cell surface receptor targeted molecules for the treatment of viral diseases
JP3105629B2 (ja) 1991-04-23 2000-11-06 サングスタット メディカル コーポレイション 特異的結合ペアのメンバーの細胞活性調節接合体
US5326559A (en) 1991-05-16 1994-07-05 Miller D Douglas Treatment of accelerated atheosclerosis with interleukin-2 receptor targeted molecules
EP0584251A4 (en) 1991-05-17 1995-08-02 Seragen Inc MOLECULES AGAINST THE CYTOKIN RECEPTOR TO TREAT NEOPLASMATIC CELL GROWTH.
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JPH08140528A (ja) * 1993-12-03 1996-06-04 Genpharm Internatl Inc 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
AU2226799A (en) 1998-01-15 1999-08-02 Center For Molecular Medicine And Immunology Antibody/receptor targeting moiety for enhanced delivery of armed ligand
WO1999043798A1 (en) 1998-02-27 1999-09-02 Cli Oncology, Inc. Methods and compositions using tumor specific soluble interleukin-2 receptor alpha molecules
JP2000022337A (ja) * 1998-06-30 2000-01-21 Matsushita Electric Works Ltd 多層配線板及びその製造方法
US6620189B1 (en) 2000-02-28 2003-09-16 Radiant Medical, Inc. Method and system for control of a patient's body temperature by way of a transluminally insertable heat exchange catheter
US6472179B2 (en) 1998-09-25 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
WO2000025816A1 (en) 1998-10-30 2000-05-11 The University Of Miami Treatment of hepatitis c by administration of anti-il-2 receptor monoclonal antibody and an antiviral compound
GB9825632D0 (en) 1998-11-23 1999-01-13 Novartis Ag Organic compounds
FR2793691B1 (fr) 1999-05-21 2003-10-03 Hippocampe Utilisation d'anticorps reconnaissant le recepteur de l'interleukine-2 dans la prevention et/ou le traitement des infections par les virus du sida
AU2001276018A1 (en) 2000-07-20 2002-02-05 Regents Of The University Of Minnesota Radiolabeled immunotoxins
ES2309167T3 (es) * 2001-02-19 2008-12-16 Merck Patent Gmbh Metodo para identificar epitotes de celulas t y metodo para preparar moleculas con inmunogenicidad reducida.
JP4406206B2 (ja) * 2001-04-24 2010-01-27 バイエル コーポレーション ヒトｔｉｍｐ−１抗体
EP1600459A3 (en) * 2002-06-28 2005-12-07 Domantis Limited Ligand
ES2401136T3 (es) 2002-11-15 2013-04-17 Genmab A/S Anticuerpos monoclonales humanos contra CD25
WO2007000169A2 (en) * 2005-06-29 2007-01-04 Genmab A/S Non-human mammalian arthritis model featuring human antibodies against citrullinated proteins
US9580506B2 (en) * 2005-07-21 2017-02-28 Genmab A/S Potency assays for antibody drug substance binding to an Fc receptor
JP4316600B2 (ja) 2006-11-06 2009-08-19 本田技研工業株式会社 吸気装置のレゾネータ
US8168185B2 (en) * 2007-01-17 2012-05-01 Merck Serono Sa Process for the purification of anti CD-25 antibodies
US8802089B2 (en) * 2008-01-03 2014-08-12 Genmab A/S Monoclonal antibodies against CD32B
UA109633C2 (uk) * 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
CA2802782C (en) * 2010-06-15 2018-03-13 Genmab A/S Human antibody drug conjugates against tissue factor
PH12013500974A1 (en) * 2010-11-17 2013-07-08 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii
US9540433B2 (en) * 2011-02-01 2017-01-10 Genmab A/S Human antibodies and antibody-drug conjugates against CD74
US8790651B2 (en) * 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
SG10201603411WA (en) * 2011-10-28 2016-07-28 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
US9783589B2 (en) * 2012-08-13 2017-10-10 Immungene Inc Engineered antibody-interferon fusion molecules for treatment of autoimmune diseases
EP2906296B1 (en) * 2012-10-12 2018-03-21 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
BR112017011111A2 (pt) * 2014-11-25 2017-12-26 Adc Therapeutics Sa conjugados de pirrolobenzodiazepina-anticorpo
GB201507827D0 (en) * 2015-05-07 2015-06-17 Adc Therapeutics Sarl Diagnostic test
GB201513607D0 (en) * 2015-07-31 2015-09-16 Feingold Jay M Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
JP4966497B2 (ja) 2012-07-04
MXPA05005160A (es) 2005-07-22
HK1077226A1 (en) 2006-02-10
CA2505991A1 (en) 2004-06-03
ES2401136T3 (es) 2013-04-17
US8961968B2 (en) 2015-02-24
NO20052889D0 (no) 2005-06-14
US20170240640A1 (en) 2017-08-24
US9598493B2 (en) 2017-03-21
US20210107985A1 (en) 2021-04-15
DK1578397T3 (da) 2013-03-11
US10703818B2 (en) 2020-07-07
NO20052889L (no) 2005-07-18
CA2505991C (en) 2018-02-27
US20040170626A1 (en) 2004-09-02
EP1578397A4 (en) 2007-05-09
KR101329843B1 (ko) 2013-11-14
UA90082C2 (ru) 2010-04-12
JP2006523433A (ja) 2006-10-19
AU2003295471B2 (en) 2011-08-25
EP1578397A2 (en) 2005-09-28
AU2003295471A1 (en) 2004-06-15
CN101124244B (zh) 2012-10-10
KR20120056863A (ko) 2012-06-04
US8182812B2 (en) 2012-05-22
EP1578397B1 (en) 2012-12-26
NZ540555A (en) 2008-04-30
WO2004045512A2 (en) 2004-06-03
EA200500835A1 (ru) 2006-02-24
PL377794A1 (pl) 2006-02-20
US20150259424A1 (en) 2015-09-17
US20090081219A1 (en) 2009-03-26
US20120244069A1 (en) 2012-09-27
IL168304A (en) 2010-11-30
BRPI0316282B8 (pt) 2021-05-25
KR20050086628A (ko) 2005-08-30
US7438907B2 (en) 2008-10-21
BR0316282A (pt) 2005-10-11
BRPI0316282B1 (pt) 2019-04-30
EA013677B1 (ru) 2010-06-30
WO2004045512A3 (en) 2005-11-24
CN101124244A (zh) 2008-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210107985A1 (en) Human monoclonal antibodies against cd25
KR101348472B1 (ko) Ｃｄ20에 대한 인간 모노클로날 항체
JP5848861B2 (ja) Ｃｄ２０に対するヒトモノクローナル抗体
HK1077226B (en) Human monoclonal antibodies against cd25
EA043675B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против cd20