KR101398290B1

KR101398290B1 - 혈액응고 제viii 인자의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자

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Publication number: KR101398290B1
Application number: KR1020137018788A
Authority: KR
Inventors: 도모유키 이가와; 젠지로 삼페이; 데츠오 고지마; 데츠히로 소에다; 아츠시 무토; 다케히사 기타자와; 유키코 니시다; 치후미 이마이; 츠카사 스즈키; 가즈타카 요시하시
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2010-11-17
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2014-05-22
Also published as: JPWO2012067176A1; CN105859889A; US20220267470A1; TR201802772T4; HRP20180421T1; KR101398363B1; US20140037632A1; MX2013005394A; JP6823677B2; CN103298937A; TW201414836A; AU2011330184B2; AU2016203564B2; LUC00076I2; JP6710131B2; EP2644698A1; RU2534564C3; JP6013915B2; NO2023034I1; BR112013012213A2

Abstract

혈액응고 제IX 인자/활성화 혈액응고 제IX 인자 및 혈액응고 제X 인자의 쌍방에 특이적으로 결합하여, 혈액응고 제VIII 인자의 보조인자 기능, 즉 활성화 혈액응고 제IX 인자에 의한 혈액응고 제X 인자 활성화를 촉진하는 기능을 대체하는 기능을 갖는 각종의 이중특이성 항체를 제작하였다. 이들 항체 중에서, 혈액응고 제VIII 인자의 기능을 대체하는 활성이 높은 다중특이성 항원 결합 분자를 찾아내는데 성공하였다.

Description

혈액응고 제VIII 인자의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자{Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor VIII}

본 발명은 효소반응을 증강하는 보조인자인 혈액응고 제VIII 인자의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자 및 그 분자를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다.

혈우병 A는 선천성의 혈액응고 제VIII 인자(F.VIII)의 기능 저하 또는 결손에 의한 출혈 이상증이다. 혈우병 A 환자의 출혈에 대해서는, F.VIII 제제가 통상 투여된다(on-demand 투여). 또한, 최근 들어서는, 출혈을 방지하기 위해, 예방적으로 F.VIII 제제가 투여된다(예방 투여, 비특허문헌 1 및 2). F.VIII 제제의 혈중 반감기는 약 12~16시간 정도이다. 그 때문에, 계속적인 예방을 위해서는, 주에 3회 F.VIII 제제가 환자에게 투여된다(비특허문헌 3 및 4). 또한, on-demand투여에 있어서는, 재출혈을 방지하기 위해, F.VIII 제제를 필요에 따라 일정 간격으로 추가 투여한다. 또한, F.VIII 제제의 투여는 정맥내에 실시된다. 따라서, F.VIII 제제와 비교하여 투여의 부담이 적은 약제가, 강하게 요구되고 있었다.

가끔, F.VIII에 대한 항체(인히비터)가 혈우병 환자에게 발생한다. 인히비터는 F.VIII 제제의 효과를 없앤다. 인히비터가 발생한 환자(인히비터 환자)의 출혈에 대해서는 바이패스 제제가 투여된다. 그들의 작용 메커니즘은, F.VIII의 기능, 즉 활성화 혈액응고 제IX 인자(F.IXa)에 의한 혈액응고 제X 인자(F.X)의 활성화를 촉매하는 기능에 비의존적이다. 그 때문에, 바이패스 제제가 출혈을 충분히 멈출 수 없는 케이스가 있다. 따라서, 인히비터의 존재에 좌우되지 않으며, 또한 F.VIII의 기능을 대체하는 약제가, 강하게 요구되고 있었다.

최근, 그 해결수단으로서, F.VIII의 기능을 대체하는 항체 및 그으 사용이 개시되었다(특허문헌 1, 2 및 3). 그 항체는, 항F.VIII 자기 항체를 갖는 후천성 혈우병, 및 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 기능 이상 또는 결손에 기인하는 폰 빌레브란트병에도 유효하다고 생각되나, 반드시 F.VIII의 기능을 대체하는 활성이 충분한 것은 아니었다. 이에 보다 높은 지혈효과를 나타내는 약제로서, 그 항체보다도 더욱 F.VIII의 기능을 대체하는 활성이 높은 항체가 요망되고 있었다.

WO 2005/035754 WO 2005/035756 WO 2006/109592

Blood 58, 1-13 (1981) Nature 312, 330-337(1984) Nature 312, 337-342(1984) Biochim.Biophys.Acta 871, 268-278(1986)

본 발명은 효소반응을 증강하는 보조인자인 F.VIII의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자의 제공을 과제로 한다.

본 발명자들은 예의 연구를 행한 결과, F.IX/F.IXa 및 F.X 양쪽에 특이적으로 결합하여, F.VIII의 보조인자 기능, 즉 F.IXa에 의한 F.X 활성화를 촉진하는 기능을 대체하는 기능(F.Xa 생산 촉진 기능)을 갖는 각종의 이중특이성 항체 중에서, 공지의 것보다도 우수한 F.Xa 생산 촉진 활성을 갖는 이중특이성 항체를 발견하는 것에 성공하였다.

또한, F.VIII의 기능을 대체하는 활성을 갖는 이중특이성 항체의 F.Xa 생산 촉진 활성의 향상에 중요한 당해 항체의 아미노산 서열의 위치를 발견하는 것에 성공하여, 당해 아미노산을 치환함으로써, F.VIII 기능을 대체하는 활성이 더욱 상승한 이중특이성 항체를 취득하는 것에 성공하였다. 또한, F.VIII의 기능을 대체하는 활성이 높을뿐 아니라, F.Xase 저해작용이 낮다고 하는, 양쪽의 성질을 충족시키는 것이 매우 곤란한 이중특이성 항체를 취득하는 것에 성공하였다.

즉 본 발명은 효소반응을 증강하는 보조인자인 F.VIII의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자 및 그 분자를 유효성분으로서 포함하는 의약 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 이하에 관한 것이다.

〔1〕혈액응고 제IX 인자 및/또는 활성화 혈액응고 제IX 인자를 인식하는 제1 항원 결합 부위, 및 혈액응고 제X 인자를 인식하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 혈액응고 제VIII 인자의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자로서, 그 혈액응고 제VIII 인자의 기능을 대체하는 기능이, 서열번호：165와 166으로 이루어지는 H쇄 및 서열번호：167로 이루어지는 공통 L쇄를 갖는 이중특이성 항체(hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ)와 비교하여 높은 활성화 혈액응고 제X 인자(F.Xa) 생산 촉진 활성에 기인하는 기능인, 다중특이성 항원 결합 분자.

〔2〕혈액응고 제IX 인자 및/또는 활성화 혈액응고 제IX 인자를 인식하는 제1 항원 결합 부위를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 혈액응고 제IX 인자 및/또는 활성화 혈액응고 제IX 인자를 인식하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 제3 폴리펩티드, 및 혈액응고 제X 인자를 인식하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 폴리펩티드 및 혈액응고 제X 인자를 인식하는 제4 항원 결합 부위를 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하는, 〔1〕에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자.

〔3〕제1 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드가 각각 혈액응고 제IX 인자 또는 활성화 혈액응고 제IX 인자에 대한 항체의 H쇄 또는 L쇄의 항원 결합 부위를 포함하고, 제2 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 각각 혈액응고 제X 인자에 대한 항체의 H쇄 또는 L쇄의 항원 결합 부위를 포함하는, 〔2〕에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자.

〔4〕제1 폴리펩티드의 항원 결합 부위가 하기 (a1)~(a11)로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 부위 또는 이것과 기능적으로 동등한 항원 결합 부위를 포함하고, 제2 폴리펩티드의 항원 결합 부위가 하기 (b1)~(b11)로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 부위 또는 이것과 기능적으로 동등한 항원 결합 부위를 갖는 〔3〕에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자：

(a1) 서열번호：75, 76, 77(Q1의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a2) 서열번호：78, 79, 80(Q31의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a3) 서열번호：81, 82, 83(Q64의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a4) 서열번호：84, 85, 86(Q85의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a5) 서열번호：87, 88, 89(Q153의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a6) 서열번호：90, 91, 92(Q354의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a7) 서열번호：93, 94, 95(Q360의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a8) 서열번호：96, 97, 98(Q405의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a9) 서열번호：99, 100, 101(Q458의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a10) 서열번호：102, 103, 104(Q460의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a11) 서열번호：105, 106, 107(Q499의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b1) 서열번호：108, 109, 110(J232의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b2) 서열번호：111, 112, 113(J259의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b3) 서열번호：114, 115, 116(J268의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b4) 서열번호：117, 118, 119(J300의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b5) 서열번호：120, 121, 122(J321의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b6) 서열번호：123, 124, 125(J326의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b7) 서열번호：126, 127, 128(J327의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b8) 서열번호：129, 130, 131(J339의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b9) 서열번호：132, 133, 134(J344의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b10) 서열번호：135, 136, 137(J346의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b11) 서열번호：174, 175, 176(J142의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위.

〔5〕제1 폴리펩티드의 항원 결합 부위가 하기 (a1)~(a11)로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 가변영역을 포함하는 항원 결합 부위 또는 이것과 기능적으로 동등한 항원 결합 부위를 포함하고, 제2 폴리펩티드의 항원 결합 부위가 하기 (b1)~(b11)로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 가변영역을 포함하는 항원 결합 부위 또는 이것과 기능적으로 동등한 항원 결합 부위를 갖는 〔3〕에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자：

(a1) 서열번호：35(Q1의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a2) 서열번호：36(Q31의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a3) 서열번호：37(Q1의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a4) 서열번호：38(Q85의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a5) 서열번호：39(Q153의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a6) 서열번호：40(Q354의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a7) 서열번호：41(Q360의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a8) 서열번호：42(Q405의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a9) 서열번호：43(Q458의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a10) 서열번호：44(Q460의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(a11) 서열번호：45(Q499의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b1) 서열번호：46(J232의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b2) 서열번호：47(J259의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b3) 서열번호：48(J268의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b4) 서열번호：49(J300의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b5) 서열번호：50(J321의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b6) 서열번호：51(J326의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b7) 서열번호：52(J327의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b8) 서열번호：53(J339의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b9) 서열번호：54(J344의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b10) 서열번호：55(J346의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(b11) 서열번호：172(J142의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위.

〔6〕제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드에 포함되는 항원 결합 부위가 하기 (c1)~(c10)으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 L쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 부위 또는 이것과 기능적으로 동등한 항원 결합 부위를 포함하는, 〔3〕에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자：

(c1) 서열번호：138, 139, 140(L2의 L쇄 CDR)에 기재된 L쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c2) 서열번호：141, 142, 143(L45의 L쇄 CDR)에 기재된 L쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c3) 서열번호：144, 145, 146(L248의 L쇄 CDR)에 기재된 L쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c4) 서열번호：147, 148, 149(L324의 L쇄 CDR)에 기재된 L쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c5) 서열번호：150, 151, 152(L334의 L쇄 CDR)에 기재된 L쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c6) 서열번호：153, 154, 155(L377의 L쇄 CDR)에 기재된 L쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c7) 서열번호：156, 157, 158(L404의 L쇄 CDR)에 기재된 L쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c8) 서열번호：159, 160, 161(L406의 L쇄 CDR)에 기재된 L쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c9) 서열번호：137, 138, 139(L408의 L쇄 CDR)에 기재된 L쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c10) 서열번호：177, 178, 179(L180의 L쇄 CDR)에 기재된 L쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위.

〔7〕제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드에 포함되는 항원 결합 부위가 하기 (c1)~(c10)으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 L쇄 가변영역을 포함하는 항원 결합 부위 또는 이것과 기능적으로 동등한 항원 결합 부위를 포함하는, 〔3〕에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자：

(c1) 서열번호：56(L2의 L쇄 가변영역)에 기재된 L쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c2) 서열번호：57(L45의 L쇄 가변영역)에 기재된 L쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c3) 서열번호：58(L248의 L쇄 가변영역)에 기재된 L쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c4) 서열번호：59(L324의 L쇄 가변영역)에 기재된 L쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c5) 서열번호：60(L334의 L쇄 가변영역)에 기재된 L쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c6) 서열번호：61(L377의 L쇄 가변영역)에 기재된 L쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c7) 서열번호：62(L404의 L쇄 가변영역)에 기재된 L쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c8) 서열번호：63(L406의 L쇄 가변영역)에 기재된 L쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c9) 서열번호：64(L408의 L쇄 가변영역)에 기재된 L쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위,

(c10) 서열번호：173(L180의 L쇄 가변영역)에 기재된 L쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위.

〔8〕추가로 제1 및 제2 폴리펩티드가 항체의 H쇄 정상영역을 포함하고, 제3 및 제4 폴리펩티드가 항체의 L쇄 정상영역을 포함하는, 〔3〕에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자.

〔9〕제1 및 제2 폴리펩티드가 항체의 H쇄 정상영역을 포함하고, 제3 및 제4 폴리펩티드가 항체의 L쇄 정상영역을 포함하는 〔3〕에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자로서, 또한 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 공통 L쇄인, 〔3〕에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자.

〔10〕제1 폴리펩티드가 하기 (d1)~(d6)의 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열 또는 하기 (d7)~(d9)의 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 항체의 H쇄 정상영역을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 상기 제1 폴리펩티드와는 상이한 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 항체의 H쇄 정상영역을 포함하는, 〔8〕 또는 〔9〕에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자：

(d1) 서열번호：65(G4k)에 기재된 H쇄 정상영역,

(d2) 서열번호：66(z7)에 기재된 H쇄 정상영역,

(d3) 서열번호：67(z55)에 기재된 H쇄 정상영역,

(d4) 서열번호：68(z106)에 기재된 H쇄 정상영역,

(d5) 서열번호：69(z118)에 기재된 H쇄 정상영역,

(d6) 서열번호：70(z121)에 기재된 H쇄 정상영역,

(d7) 서열번호：71(G4h)에 기재된 H쇄 정상영역,

(d8) 서열번호：72(z107)에 기재된 H쇄 정상영역,

(d9) 서열번호：73(z119)에 기재된 H쇄 정상영역.

〔11〕제3과 제4 폴리펩티드가 하기 (e)의 아미노산 서열로 이루어지는 항체의 L쇄 정상영역을 포함하는, 〔8〕 또는 〔9〕에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자：

(e) 서열번호：74(k)에 기재된 L쇄 정상영역.

〔12〕제1 폴리펩티드가 하기 (a1)~(a14)로부터 선택되는 어느 하나의 항체 H쇄를 포함하고, 제2 폴리펩티드가 하기 (b1)~(b12)로부터 선택되는 어느 하나의 항체 H쇄를 포함하며, 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 하기 (c1)~(c10)으로부터 선택되는 어느 하나의 항체 L쇄를 포함하는, 〔8〕 또는 〔9〕에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자：

(a1) 서열번호：1(Q1-G4k)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(a2) 서열번호：2(Q31-z7)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(a3) 서열번호：3(Q64-z55)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(a4) 서열번호：10(Q64-z7)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(a5) 서열번호：11(Q85-G4k)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(a6) 서열번호：12(Q153-G4k)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(a7) 서열번호：13(Q354-z106)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(a8) 서열번호：14(Q360-G4k)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(a9) 서열번호：15(Q360-z118)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(a10) 서열번호：16(Q405-G4k)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(a11) 서열번호：17(Q458-z106)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(a12) 서열번호：18(Q460-z121)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(a13) 서열번호：19(Q499-z118)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(a14) 서열번호：20(Q499-z121)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(b1) 서열번호：4(J268-G4h)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(b2) 서열번호：5(J321-G4h)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(b3) 서열번호：6(J326-z107)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(b4) 서열번호：7(J344-z107)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(b5) 서열번호：21(J232-G4h)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(b6) 서열번호：22(J259-z107)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(b7) 서열번호：23(J300-z107)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(b8) 서열번호：24(J327-z107)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(b9) 서열번호：25(J327-z119)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(b10) 서열번호：26(J339-z119)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(b11) 서열번호：27(J346-z107)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(b12) 서열번호：170(J142-G4h)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄,

(c1) 서열번호：8(L2-k)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 L쇄,

(c2) 서열번호：9(L45-k)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 L쇄,

(c3) 서열번호：28(L248-k)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 L쇄,

(c4) 서열번호：29(L324-k)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 L쇄,

(c5) 서열번호：30(L334-k)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 L쇄,

(c6) 서열번호：31(L377-k)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 L쇄,

(c7) 서열번호：32(L404-k)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 L쇄,

(c8) 서열번호：33(L406-k)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 L쇄,

(c9) 서열번호：34(L408-k)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 L쇄,

(c10) 서열번호：171(L180-k)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 L쇄.

〔13〕제1 폴리펩티드가, 〔12〕의 (a1)~(a14) 중 어느 하나에 기재된 항체의 H쇄와 (c1)~(c10) 중 어느 하나에 기재된 항체의 L쇄로 이루어지는 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고, 제2 폴리펩티드가, 〔12〕의 (b1)~(b12) 중 어느 하나에 기재된 항체의 H쇄와 (c1)~(c10) 중 어느 하나에 기재된 항체의 L쇄로 이루어지는 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는, 〔1〕에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자.

〔14〕제1 폴리펩티드가, 하기 (e1)~(e3)으로부터 선택되는 어느 하나의 항체의 H쇄를 포함하고, 제2 폴리펩티드가 하기 (f1)~(f3)으로부터 선택되는 어느 하나의 항체의 H쇄를 포함하며, 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 하기 (g1)~(g4)로부터 선택되는 어느 하나의 항체의 L쇄를 포함하는, 〔8〕 또는 〔9〕에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자：

(e1) 〔12〕의 (a1)~(a14) 중 어느 하나의 항체의 H쇄와 (c1)~(c10) 중 어느 하나에 기재된 항체의 L쇄로 이루어지는 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하는 항체의 H쇄,

(e2) (e1)로부터 선택되는 어느 하나의 항체의 H쇄에 있어서의 Kabat 넘버링에 의한 34번 위치, 35번 위치, 49번 위치, 61번 위치, 62번 위치, 96번 위치, 98번 위치, 100번 위치, 100b번 위치 및 102번 위치의 아미노산 잔기로부터 선택되는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 있는 항체의 H쇄,

(e3) (e1)로부터 선택되는 어느 하나의 항체의 H쇄에 있어서의 Kabat 넘버링에 의한 34번 위치의 아미노산 잔기가 이소류신, 35번 위치의 아미노산 잔기가 아스파라긴, 글루타민 또는 세린, 49번 위치의 아미노산 잔기가 세린, 61번 위치의 아미노산 잔기가 아르기닌, 62번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산, 96번 위치의 아미노산 잔기가 세린 또는 트레오닌, 98번 위치의 아미노산 잔기가 리신 또는 아르기닌, 100번 위치의 아미노산 잔기가 페닐알라닌 또는 티로신, 100b번 위치의 아미노산 잔기가 글리신, 또는, 102번 위치의 아미노산 잔기가 티로신인 항체의 H쇄,

(f1) 〔12〕의 (b1)~(b12) 중 어느 하나의 항체의 H쇄와 (c1)~(c10) 중 어느 하나의 항체의 L쇄로 이루어지는 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하는 항체의 H쇄,

(f2) (f1) 중 어느 하나의 항체 H쇄에 있어서의 Kabat 넘버링에 의한 35번 위치, 53번 위치, 73번 위치, 76번 위치, 96번 위치, 98번 위치, 100번 위치 및 100a번 위치의 아미노산 잔기로부터 선택되는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 있는 항체의 H쇄,

(f3) (f1) 중 어느 하나의 항체 H쇄로서, Kabat 넘버링에 의한 35번 위치의 아미노산 잔기가 아스파라긴산, 53번 위치의 아미노산 잔기가 아르기닌, 73번 위치의 아미노산 잔기가 리신, 76번 위치의 아미노산 잔기가 글리신, 96번 위치의 아미노산 잔기가 리신 또는 아르기닌, 98번 위치의 아미노산 잔기가 티로신, 100번 위치의 아미노산 잔기가 티로신, 또는, 100a번 위치의 아미노산 잔기가 히스티딘인 항체의 H쇄,

(g1) 〔12〕의 (a1)~(a14) 중 어느 하나의 항체의 H쇄와 (c1)~(c10) 중 어느 하나의 항체의 L쇄로 이루어지는 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하는 항체의 L쇄,

(g2) 〔12〕의 (b1)~(b12) 중 어느 하나의 항체의 H쇄와 (c1)~(c10) 중 어느 하나의 항체의 L쇄로 이루어지는 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하는 항체의 L쇄,

(g3) (g1) 및 (g2) 중 어느 하나의 항체의 L쇄에 있어서의 Kabat 넘버링에 의한 27번 위치, 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치, 52번 위치, 53번 위치, 54번 위치, 55번 위치, 92번 위치, 93번 위치, 94번 위치 및 95번 위치의 아미노산 잔기로부터 선택되는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 있는 항체의 L쇄,

(g4) (g1) 및 (g2) 중 어느 하나의 항체의 L쇄로서, Kabat 넘버링에 의한 27번 위치의 아미노산 잔기가 리신 또는 아르기닌, 30번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산, 31번 위치의 아미노산 잔기가 아르기닌, 32번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민, 50번 위치의 아미노산 잔기가 아르기닌 또는 글루타민, 52번 위치의 아미노산 잔기가 세린, 53번 위치의 아미노산 잔기가 아르기닌, 54번 위치의 아미노산 잔기가 리신, 55번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산, 92번 위치의 아미노산 잔기가 세린, 93번 위치의 아미노산 잔기가 세린, 94번 위치의 아미노산 잔기가 프롤린, 또는, 95번 위치의 아미노산 잔기가 프롤린인 항체의 L쇄.

〔15〕다중특이성 항원 결합 분자가 다중특이성 항체인, 〔1〕~〔14〕 중 어느 하나에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자.

〔16〕이하의 (a)~(u) 중 어느 하나에 기재된 이중특이성 항체：

(a) 제1 폴리펩티드가 서열번호：1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：4에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：9에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q1-G4k/J268-G4h/L45-k),

(b) 제1 폴리펩티드가 서열번호：1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：5에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：9에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q1-G4k/J321-G4h/L45-k),

(c) 제1 폴리펩티드가 서열번호：2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：6에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：8에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q31-z7/J326-z107/L2-k),

(d) 제1 폴리펩티드가 서열번호：3에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：9에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q64-z55/J344-z107/L45-k),

(e) 제1 폴리펩티드가 서열번호：10에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：6에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：30에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q64-z7/J326-z107/L334-k),

(f) 제1 폴리펩티드가 서열번호：10에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：33에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q64-z7/J344-z107/L406-k),

(g) 제1 폴리펩티드가 서열번호：11에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：4에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：33에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q85-G4k/J268-G4h/L406-k),

(h) 제1 폴리펩티드가 서열번호：11에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：5에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：30에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q85-G4k/J321-G4h/L334-k),

(i) 제1 폴리펩티드가 서열번호：12에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：21에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：33에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q153-G4k/J232-G4h/L406-k),

(j) 제1 폴리펩티드가 서열번호：13에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：22에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：29에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q354-z106/J259-z107/L324-k),

(k) 제1 폴리펩티드가 서열번호：14에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：21에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：33에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q360-G4k/J232-G4h/L406-k),

(l) 제1 폴리펩티드가 서열번호：15에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：23에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：30에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q360-z118/J300-z107/L334-k),

(m) 제1 폴리펩티드가 서열번호：16에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：21에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：28에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q405-G4k/J232-G4h/L248-k),

(n) 제1 폴리펩티드가 서열번호：17에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：27에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：34에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q458-z106/J346-z107/L408-k),

(o) 제1 폴리펩티드가 서열번호：18에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：25에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：30에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q460-z121/J327-z119/L334-k),

(p) 제1 폴리펩티드가 서열번호：19에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：24에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：30에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q499-z118/J327-z107/L334-k),

(q) 제1 폴리펩티드가 서열번호：19에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：24에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：31에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q499-z118/J327-z107/L377-k),

(r) 제1 폴리펩티드가 서열번호：19에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：27에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：28에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q499-z118/J346-z107/L248-k),

(s) 제1 폴리펩티드가 서열번호：20에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：25에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：32에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q499-z121/J327-z119/L404-k),

(t) 제1 폴리펩티드가 서열번호：20에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：26에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：31에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q499-z121/J339-z119/L377-k),

(u) 제1 폴리펩티드가 서열번호：12에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：170에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：171에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q153-G4k/J142-G4h/L180-k).

〔17〕〔1〕~〔15〕 중 어느 한 항에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자 또는 〔16〕에 기재된 이중특이성 항체를 코드하는 핵산.

〔18〕〔17〕에 기재된 핵산이 삽입된 벡터.

〔19〕〔17〕에 기재된 핵산 또는 〔18〕에 기재된 벡터를 포함하는 세포.

〔20〕〔19〕에 기재된 세포를 배양함으로써, 〔1〕~〔15〕 중 어느 한 항에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자 또는 〔16〕에 기재된 이중특이성 항체를 제조하는 방법.

〔21〕〔1〕~〔15〕 중 어느 한 항에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자 또는 〔16〕에 기재된 이중특이성 항체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.

〔22〕출혈, 출혈을 수반하는 질환, 또는 출혈에 기인하는 질환의 예방 및/또는 치료에 사용되는 의약 조성물인, 〔21〕에 기재된 조성물.

〔23〕출혈, 출혈을 수반하는 질환, 또는 출혈에 기인하는 질환이, 혈액응고 제VIII 인자 및/또는 활성화 혈액응고 제VIII 인자의 활성의 저하 내지 결손에 의해 발증 및/또는 진전되는 질환인, 〔22〕에 기재된 조성물.

〔24〕혈액응고 제VIII 인자 및/또는 활성화 혈액응고 제VIII 인자의 활성의 저하 내지 결손에 의해 발증 및/또는 진전되는 질환이 혈우병 A인, 〔23〕에 기재된 조성물.

〔25〕혈액응고 제VIII 인자 및/또는 활성화 혈액응고 제VIII 인자의 활성의 저하 내지 결손에 의해 발증 및/또는 진전되는 질환이, 혈액응고 제VIII 인자 및/또는 활성화 혈액응고 제VIII 인자에 대한 인히비터가 출현하고 있는 질환인, 〔23〕에 기재된 조성물.

〔26〕혈액응고 제VIII 인자 및/또는 활성화 혈액응고 제VIII 인자의 활성의 저하 내지 결손에 의해 발증 및/또는 진전되는 질환이 후천성 혈우병인, 〔23〕에 기재된 조성물.

〔27〕혈액응고 제VIII 인자 및/또는 활성화 혈액응고 제VIII 인자의 활성의 저하에 의해 발증 및/또는 진전되는 질환이 폰 빌레브란트병인, 〔23〕에 기재된 조성물.

〔28〕〔1〕~〔15〕 중 어느 한 항에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자 또는 〔16〕에 기재된 이중특이성 항체, 또는, 〔21〕~〔27〕 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 투여하는 공정을 포함하는, 출혈, 출혈을 수반하는 질환 또는 출혈에 기인하는 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법.

〔29〕적어도〔1〕~〔15〕 중 어느 한 항에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자 또는 〔16〕에 기재된 이중특이성 항체, 또는 〔21〕~〔27〕 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는, 〔28〕에 기재된 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 키트.

또한 본 발명은 이하에 관한 것이다.

〔30〕〔1〕~〔15〕 중 어느 한 항에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자 또는 〔16〕에 기재된 이중특이성 항체, 또는, 〔21〕~〔27〕 중 어느 한 항에 기재된 조성물의, 출혈, 출혈을 수반하는 질환 또는 출혈에 기인하는 질환의 예방 및/또는 치료제의 제조에 있어서의 사용.

〔31〕출혈, 출혈을 수반하는 질환 또는 출혈에 기인하는 질환의 예방 및/또는 치료용의, 〔1〕~〔15〕 중 어느 한 항에 기재된 다중특이성 항원 결합 분자 또는 〔16〕에 기재된 이중특이성 항체, 또는, 〔21〕~〔27〕 중 어느 한 항에 기재된 조성물.

또한 본 발명은 효소반응을 증강하는 보조인자인 F.VIII의 기능을 대체하는 기능을 갖는 이중특이성 항체 및 그 항체를 유효성분으로서 포함하는 의약 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 이하에 관한 것이다.

〔32〕혈액응고 제IX 인자 및/또는 활성화 혈액응고 제IX 인자를 인식하는 제1 항원 결합 부위, 및 혈액응고 제X 인자를 인식하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 혈액응고 제VIII 인자의 기능을 대체하는 기능을 갖는 이중특이성 항체로서, 이하의 (a)~(u) 중 어느 하나에 기재된 이중특이성 항체；

〔33〕〔32〕에 기재된 이중특이성 항체를 코드하는 핵산.

〔34〕〔33〕에 기재된 핵산이 삽입된 벡터.

〔35〕〔33〕에 기재된 핵산 또는 〔34〕에 기재된 벡터를 포함하는 세포.

〔36〕〔35〕에 기재된 세포를 배양함으로써, 〔32〕에 기재된 이중특이성 항체를 제조하는 방법.

〔37〕〔32〕에 기재된 이중특이성 항체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.

〔38〕출혈, 출혈을 수반하는 질환, 또는 출혈에 기인하는 질환의 예방 및/또는 치료에 사용되는 의약 조성물인, 〔37〕에 기재된 조성물.

〔39〕출혈, 출혈을 수반하는 질환, 또는 출혈에 기인하는 질환이, 혈액응고 제VIII 인자 및/또는 활성화 혈액응고 제VIII 인자의 활성의 저하 내지 결손에 의해 발증 및/또는 진전되는 질환인, 〔38〕에 기재된 조성물.

〔40〕혈액응고 제VIII 인자 및/또는 활성화 혈액응고 제VIII 인자의 활성의 저하 내지 결손에 의해 발증 및/또는 진전되는 질환이 혈우병 A인, 〔39〕에 기재된 조성물.

〔41〕혈액응고 제VIII 인자 및/또는 활성화 혈액응고 제VIII 인자의 활성의 저하 내지 결손에 의해 발증 및/또는 진전되는 질환이, 혈액응고 제VIII 인자 및/또는 활성화 혈액응고 제VIII 인자에 대한 인히비터가 출현하고 있는 질환인, 〔39〕에 기재된 조성물.

〔42〕혈액응고 제VIII 인자 및/또는 활성화 혈액응고 제VIII 인자의 활성의 저하 내지 결손에 의해 발증 및/또는 진전되는 질환이 후천성 혈우병인, 〔39〕에 기재된 조성물.

〔43〕혈액응고 제VIII 인자 및/또는 활성화 혈액응고 제VIII 인자의 활성 저하에 의해 발증 및/또는 진전되는 질환이 폰 빌레브란트병인, 〔39〕에 기재된 조성물.

〔44〕〔32〕에 기재된 이중특이성 항체, 또는 〔37〕~〔43〕 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 투여하는 공정을 포함하는, 출혈, 출혈을 수반하는 질환 또는 출혈에 기인하는 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법.

〔45〕〔32〕에 기재된 이중특이성 항체, 또는 〔37〕~〔43〕 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는, 〔44〕에 기재된 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 키트.

〔46〕〔32〕에 기재된 이중특이성 항체, 또는 〔37〕~〔43〕 중 어느 한 항에 기재된 조성물의, 출혈, 출혈을 수반하는 질환 또는 출혈에 기인하는 질환의 예방/ 또는 치료제의 제조에 있어서의 사용.

〔47〕출혈, 출혈을 수반하는 질환 또는 출혈에 기인하는 질환의 예방 및/또는 치료용의, 〔32〕에 기재된 이중특이성 항체, 또는 〔37〕~〔43〕 중 어느 한 항에 기재된 조성물.

본 발명에 의해 효소 및 그 효소의 기질 양쪽을 인식하는 항체로서, F.VIII의 기능을 대체하는 활성이 높은 다중특이성 항원 결합 분자가 제공되었다. 또한, 효소 및 그 효소의 기질 양쪽을 인식하는 항체로서, F.VIII의 기능을 대체하는 활성이 높고, 또한 F.Xase 저해작용이 낮은 다중특이성 항원 결합 분자가 제공되었다. 인간화 항체는 일반적으로, 혈중에서의 안정성이 높고 면역원성도 낮은 것으로 생각되는 것으로부터, 본 발명의 다중특이성 항체는 의약품으로서 매우 유망할 것으로 생각된다.

도 1은 F.Xase 저해작용을 설명한 도면이다. (a) F.VIIIa는 F.IXa와 복합체(F.Xase)를 형성하여, F.X를 활성화한다. (b) 이중특이성 항체는, F.IXa 및 F.X에 결합하여, F.X를 활성화한다. (c) F.VIIIa 및 이중특이성 항체의 양자가, 경합하지 않고 F.X를 활성화한다. (d) 이중특이성 항체가 F.IXa 및/또는 F.X에 결합함으로써, F.Xase와 F.X의 복합체의 형성을 저해한다. (e) 이중특이성 항체가 F.IXa 및/또는 F.X에 결합함으로써, F.Xase의 활성을 저해한다.
도 2는 스크리닝을 설명한 도면이다. 인간 F.IXa 및 인간 F.X에 대한 항체 유전자를 약 200종류씩 제작하여, 동물세포 발현 벡터에 삽입하였다. 항F.IXa 항체와 항F.X 항체의 조합으로서 4만 이상의 이중특이성 항체를 일과성 발현하였다. F.Xa 생산 촉진 활성 및 F.Xase 저해작용을 평가하여, F.Xa 생산 촉진 활성이 높고 F.Xase 저해작용이 낮은 이중특이성 항체를 스크리닝하였다. 추가로 필요에 따라 아미노산 치환을 행함으로써, 프로토타입 항체를 제작하였다.
도 3은 hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ, Q1-G4k/J268-G4h/L45-k, Q1-G4k/J321-G4h/L45-k, Q31-z7/J326-z107/L2-k, Q64-z55/J344-z107/L45-k의 F.Xa 생산 촉진 활성을 나타내는 도면이다. 항체 용액의 농도는 300, 30, 3 ㎍/mL(Human Factor IXa, Novact(등록상표) M, Human Factor X와 항체 용액을 혼합한 후의 농도는 100, 10, 1 ㎍/mL), 효소반응 시간은 10분간, 발색시간은 50분간이다. 결과, 이들 항체는, WO 2006/109592에 기재된 hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ와 비교하여, 높은 F.Xa 생산 촉진 활성을 나타내었다.
도 4는 hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ, 프로토타입 항체, 및 아미노산 치환을 도입한 개변 항체의 F.Xa 생산 촉진 활성을 나타내는 도면이다. 항체 용액의 농도는 300, 30, 3 ㎍/mL(Human Factor IXa, Novact(등록상표) M, Human Factor X와 항체 용액을 혼합한 후의 농도는 100, 10, 1 ㎍/mL), 효소반응 시간은 2분간, 발색시간은 20분간이다. 결과, 이들 개변 항체는 프로토타입 항체보다도 높은 F.Xa 생산 촉진 활성을 나타내었다.
도 5는 hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ, 프로토타입 항체, 및 아미노산 치환을 도입한 개변 항체의 F.Xase 저해작용을 나타내는 도면이다. hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ, Q1-G4k/J268-G4h/L45-k, Q31-z7/J326-z107/L2-k, Q1-G4k/J321-G4h/L45-k, Q64-z55/J344-z107/L45-k, Q85-G4k/J268-G4h/L406-k, Q85-G4k/J321-G4h/L334-k, Q64-z7/J344-z107/L406-k, Q64-z7/J326-z107/L334-k, Q153-G4k/J142-G4h/L180-k, Q405-G4k/J232-G4h/L248-k, Q360-G4k/J232-G4h/L406-k, Q153-G4k/J232-G4h/L406-k, Q458-z106/J346-z107/L408-k, Q360-z118/J300-z107/L334-k, Q499-z118/J327-z107/L377-k, Q499-z121/J327-z119/L404-k, Q499-z121/J339-z119/L377-k, Q499-z118/J346-z107/L248-k, Q354-z106/J259-z107/L324-k, Q460-z121/J327-z119/L334-k, 및 Q499-z118/J327-z107/L334-k의 F.VIIIa 존재하에 있어서의 F.IXa에 의한 F.X 활성화에 대한 영향을 나타내는 도면이다. 항체의 F.Xase 저해작용은, 항체 첨가 반응액의 흡광도로부터 항체 무첨가 반응액의 흡광도를 뺀 값으로 나타내었다. 항체 용액의 농도는 300, 30 ㎍/mL(Human Factor IXa, F.VIIIa, Human Factor X와 항체 용액을 혼합한 후의 농도는 100, 10 ㎍/mL), 효소반응 시간은 6분간, 발색시간은 14분간이다. 가로축의 F.Xase 저해작용의 값이 플러스로 갈수록, F.Xase 저해작용이 약하다. 결과, WO 2006/109592에 기재된 hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ는 강한 F.Xase 저해작용을 나타내었다. 본 발명의 항체 모두, hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ와 비교하여, 약한 F.Xase 저해작용을 나타내거나, 또는 저해작용을 나타내지 않았다.
도 6a는 프로토타입 항체, 및 아미노산 치환을 도입한 개변 항체의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. Ref열에 서열명이 기재되어 있지 않은 경우는 Name열의 가변영역 서열을 기재하였다. Kabat 넘버링으로 해당하는 번호에 아미노산이 없는 개소는 「-(하이푼)」을 표시하였다. Name열과 Ref열의 가변영역을 비교하여, 동일한 아미노산의 개소를 「.(도트)」로서 표시하고, 상이한 개소는 Name열의 가변영역의 아미노산을 표시하였다. F.Xa 생산 촉진 활성 향상에 중요한 것이 명백해진 아미노산은 테두리를 둘러서 표시하였다.
도 6b는 도 6a의 계속되는 도면이다.
도 6c는 도 6b의 계속되는 도면이다.
도 6d는 도 6c의 계속되는 도면이다.

본 명세서 중에 기재되는 다중특이성 항원 결합 분자란, 적어도 2종류의 상이한 항원에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원 결합 부위와 제2 항원 결합 부위를 포함한다. 제1 항원 결합 부위와 제2 항원 결합 부위는, 각각, F.IX 및/또는 F.IXa와 F.X에 대해 결합 활성을 가지고 있으면 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 항체, Scaffold 분자(항체 유사 분자), 펩티드 등의 항원과의 결합에 필요한 부위, 또는 당해 부위를 포함하는 단편을 들 수 있다. Scaffold 분자란, 타겟 분자에 결합함으로써 기능을 발휘하는 분자로, 하나 이상의 표적 항원에 결합할 수 있는 입체 구조적으로 안정한 폴리펩티드라면, 어떠한 폴리펩티드이더라도 사용할 수 있다. 그러한 폴리펩티드의 예로서는, 예를 들면, 항체 가변영역, 피브로넥틴(WO 2002/032925), Protein A 도메인(WO 1995/001937), LDL 수용체 A 도메인(WO 2004/044011, WO 2005/040229), 안키린(WO 2002/020565) 등 외에, Nygren등(Current Opinion in Structural Biology, 7:463-469(1997), Journal of Immunol Methods, 290:3-28(2004)), Binz등(Nature Biotech 23:1257-1266(2005)), Hosse등(Protein Science 15:14-27(2006))에 기재된 분자를 들 수 있다. 또한, Curr Opin Mol Ther. 2010 Aug;12(4):487-95.나 Drugs. 2008;68(7):901-12.에 기재되어 있는 표적 항원에 결합할 수 있는 펩티드 분자를 사용하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서, 다중특이성 항원 결합 분자로서는, 적어도 2종류의 상이한 항원과 결합할 수 있는 분자라면 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 항체나 Scaffold 분자 및 이들의 단편 등의 상기 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드, 핵산분자나 펩티드로 이루어지는 앱타머 등을 들 수 있고, 단일 분자여도 되고 이들의 다량체여도 된다. 바람직한 다중특이성 항원 결합 분자로서는, 적어도 2개의 상이한 항원에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다중특이성 항체를 들 수 있다. 본 발명의 F.VIII의 기능을 대체하는 활성을 갖는 항체에 있어서는, 특히 바람직한 항체로서, 2개의 상이한 항원에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이성 항체(bispecific antibody; BsAb)(이중특이성 항체라 불리는 경우도 있다)를 들 수 있다.

본 발명에 있어서 「공통 L쇄」란, 상이한 2종 이상의 H쇄와 회합하여, 각각의 항원에 대해 결합능을 나타낼 수 있는 L쇄이다. 여기서, 「상이한 H쇄」란, 바람직하게는 상이한 항원에 대한 항체의 H쇄를 가리키나, 그것에 한정되지 않고, 아미노산 서열이 서로 상이한 H쇄를 의미한다. 공통 L쇄는, 예를 들면 WO 2006/109592에 기재된 방법에 따라 취득할 수 있다.

본 발명에 있어서의 다중특이성 항원 결합 분자(바람직하게는 이중특이성 항체)는, 2종 이상의 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 항체 또는 항체 단편으로 이루어지는 분자이다. 본 발명의 항체는 특별히 제한되지 않으나, 단일클론 항체인 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 단일클론 항체로서는, 인간, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 양, 낙타, 원숭이 등의 동물 유래의 단일클론 항체 뿐 아니라, 키메라 항체, 인간화 항체, bispecific 항체 등 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체도 포함된다.

또한, 본 발명의 다중특이성 항원 결합 분자가 되는 항체의 L쇄는, 상이한 것이어도 되나, 공통의 L쇄를 가지고 있는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서의 다중특이성 항원 결합 분자는, 유전자 재조합 기술을 사용하여 생산시킨 재조합형 항체인 것이 바람직하다.(예를 들면, Borrebaeck CAK and Larrick JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조). 재조합형 항체는, 그것을 코드하는 DNA를 하이브리도마, 또는 항체를 생산하는 감작 림프구 등의 항체 생산 세포로부터 클로닝하여, 적당한 벡터에 삽입하고, 이것을 숙주(숙주세포)에 도입하여 생산시킴으로써 얻을 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 항체에는, 전체 항체 뿐 아니라 항체 단편이나 저분자화 항체, 및 항체 수식물이 포함되어도 된다.

예를 들면 항체 단편이나 저분자화 항체로서는, 디아바디(diabody；Db), 선형 항체, 단일 사슬 항체(이하, scFv라고도 기재한다) 분자 등이 포함된다. 여기서, 「Fv」 단편은 최소의 항체 단편으로, 완전한 항원 인식 부위와 결합 부위를 포함한다.

「Fv」 단편은 하나의 H쇄 가변영역(VH) 및 L쇄 가변영역(VL)이 비공유 결합에 의해 강하게 연결된 다이머(VH-VL 다이머)이다. 각 가변영역의 3개의 상보가닥 결정영역(complementarity determining region; CDR)이 상호작용하여, VH-VL 다이머의 표면에 항원 결합 부위를 형성한다. 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 부위를 부여하고 있다. 그러나, 하나의 가변영역(또는, 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)이더라도, 전체 결합 부위보다도 친화성은 낮으나, 항원을 인식하여, 결합하는 능력을 갖는다.

또한, Fab 단편(F(ab)라고도 불린다)은 추가로, L쇄의 정상영역 및 H쇄의 정상영역(CH1)을 포함한다. Fab' 단편은, 항체의 힌지영역으로부터의 1 또는 그 이상의 시스테인을 포함하는 H쇄 CH1영역의 카르복시 말단 유래의 수 잔기를 부가적으로 갖는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH란, 정상영역의 1 또는 그 이상의 시스테인 잔기가 유리(遊離) 티올기를 갖는 Fab'를 나타내는 것이다. F(ab') 단편은, F(ab')₂ 펩신 소화물의 힌지부의 시스테인에 있어서의 디설피드 결합의 절단에 의해 제조된다. 화학적으로 결합된 그 밖의 항체 단편도 당업자에게는 알려져 있다.

디아바디는, 유전자 융합에 의해 구축된 2가(bivalent)의 저분자화 항체를 가리킨다(Holliger P et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993), EP404,097호, WO 93/11161호 등). 디아바디는, 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성되는 다이머로, 폴리펩티드 사슬은 각각, 동일한 사슬 중에서 L쇄 가변영역(VL) 및 H쇄 가변영역(VH)이, 서로 결합할 수 없을 정도로 짧은, 예를 들면, 2~12 잔기가 바람직하고, 더욱이 3~10 잔기가 바람직하며, 특히 5 잔기 정도의 링커에 의해 결합되어 있다. 동일 폴리펩티드 사슬 상에 코드되는 VL과 VH는, 그 사이의 링커가 짧기 때문에 단쇄 가변영역 프래그먼트를 형성할 수 없어 이량체를 형성하기 때문에, 디아바디는 2개의 항원 결합 부위를 갖게 된다.

단일 사슬 항체 또는 scFv 항체 단편에는, 항체의 VH 및 VL영역이 포함되고, 이들 영역은 단일 폴리펩티드 사슬 중에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 추가로 VH 및 VL영역 사이에 폴리펩티드 링커를 포함하고 있고, 이것에 의해 scFv는, 항원 결합을 위해 필요한 구조를 형성할 수 있다(scFv의 총설에 대해서는, Pluckthun 『The Pharmacology of Monoclonal Antibodies』Vol.113(Rosenburg and Moore ed(Springer Verlag, New York) pp.269-315, 1994)을 참조). 본 발명에 있어서의 링커는, 그 양단에 연결된 항체 가변영역의 발현을 저해하는 것이 아니라면 특별히 한정되지 않는다.

IgG 타입 이중특이성 항체는 IgG 항체를 생산하는 하이브리도마 2종을 융합함으로써 생성되는 hybrid hybridoma(quadroma)에 의해 분비시킬 수 있다(Milstein C et al. Nature 1983, 305: 537-540). 또한 목적의 2종의 IgG를 구성하는 L쇄 및 H쇄의 유전자, 합계 4종의 유전자를 세포에 도입함으로써 공발현시킴으로써 분비시킬 수 있다.

이때 H쇄의 CH3영역에 적당한 아미노산 치환을 행함으로써 H쇄에 대해서 헤테로 조합의 IgG를 우선적으로 분비시키는 것도 가능하다(Ridgway JB et al. Protein Engineering 1996, 9: 617-621, Merchant AM et al. Nature Biotechnology 1998, 16: 677-681, WO 2006/106905, Davis JH et al. Protein Eng Des Sel. 2010, 4: 195-202.).

또한, L쇄에 관해서는, H쇄 가변영역에 비해 L쇄 가변영역의 다양성이 낮은 것으로부터, 양 H쇄에 결합능을 부여할 수 있는 공통의 L쇄가 얻어지는 것이 기대되어, 본 발명의 항체는, 공통의 L쇄를 갖는 것을 특징으로 하는 것이다. 이 공통 L쇄와 양 H쇄 유전자를 세포에 도입함으로써 IgG를 발현시킴으로써 효율이 좋은 이중특이성 IgG의 발현이 가능해진다.

또한, Fab'를 화학적으로 가교함으로써도 이중특이성 항체를 제작할 수 있다. 예를 들면 한쪽 항체로부터 조제한 Fab'를 o-PDM(ortho-phenylenedi-maleimide)로 말레이미드화하고, 이것과 다른 한쪽의 항체로부터 조제한 Fab'를 반응시킴으로써, 상이한 항체 유래 Fab'끼리를 가교시켜 이중특이성 F(ab')₂를 제작할 수 있다(Keler T et al. Cancer Research 1997, 57: 4008-4014). 또한 Fab'-티오니트로안식향산(TNB) 유도체와 Fab'-티올(SH) 등의 항체 단편을 화학적으로 결합하는 방법도 알려져 있다(Brennan M et al. Science 1985, 229: 81-83).

화학가교 대신에 Fos, Jun 등에 유래하는 류신 지퍼(leucine zipper)를 사용하는 것도 가능하다. Fos, Jun은 호모다이머도 형성하는데, 헤테로다이머를 우선적으로 형성하는 것을 이용한다. Fos 류신 지퍼를 부가한 Fab'와 Jun의 그것을 부가한 다른 한쪽의 Fab'를 발현 조제한다. 온화한 조건으로 환원한 단량체 Fab'-Fos, Fab'-Jun을 혼합하여 반응시킴으로써 이중특이성 F(ab')₂를 형성할 수 있다(Kostelny SA et al. J of Immunology, 1992, 148: 1547-53). 이 방법은 Fab'에는 한정되지 않고, scFv, Fv 등에 있어서도 응용 가능하다.

또한, IgG-scFv(Protein Eng Des Sel. 2010 Apr;23(4):221-8)나 BiTE 등의 sc(Fv)₂(Drug Discov Today. 2005 Sep 15;10(18):1237-44.), DVD-Ig(Nat Biotechnol. 2007 Nov;25(11):1290-7. Epub 2007 Oct 14., MAbs. 2009 Jul;1(4):339-47. Epub 2009 Jul 10.) 등 외(IDrugs 2010, 13:698-700), two-in-one 항체(Science. 2009 Mar 20;323(5921):1610-4., Immunotherapy. 2009 Sep;1(5):749-51.), Tri-Fab나 탠덤 scFv, 디아바디 등의 이중특이성 항체도 알려져 있다(MAbs. 2009 November ; 1(6): 539-547.). 또한 scFv-Fc, scaffold-Fc 등의 분자형을 사용해도, 헤테로 조합의 Fc를 우선적으로 분비시킴으로써(Ridgway JB et al. Protein Engineering 1996, 9: 617-621, Merchant AM et al. Nature Biotechnology 1998, 16: 677-681, WO 2006/106905, Davis JH et al. Protein Eng Des Sel. 2010, 4: 195-202.), 이중특이성 항체를 효율적으로 제작할 수 있다.

디아바디에 있어서도 이중특이성 항체를 제작할 수 있다. 이중특이성 디아바디는 2개의 cross-over scFv 단편의 헤테로 다이머이다. 즉 2종의 항체 A, B 유래의 VH와 VL을 5 잔기 전후의 비교적 짧은 링커로 연결함으로써 제작된 VH (A)-VL (B), VH (B)-VL (A)를 사용하여 헤테로 다이머를 구성함으로써 생성된다(Holliger P et al. Proc of the National Academy of Sciences of the USA 1993, 90: 6444-6448).

이때, 2종의 scFv를 15 잔기 정도의 유연한 비교적 긴 링커로 연결한다(단일 사슬 디아바디：Kipriyanov SM et al. J of Molecular Biology. 1999, 293: 41-56), 적당한 아미노산 치환(knobs-into-holes: Zhu Z et al. Protein Science. 1997, 6: 781-788, VH/VL interface engineering: Igawa T et al. Protein Eng Des Sel. 2010, 8:667-77.)을 행함으로써 목적의 구성을 촉진시키는 것도 가능하다.

2종의 scFv를 15 잔기 정도의 유연한 비교적 긴 링커로 연결함으로써 제작할 수 있는 sc(Fv)₂도 이중특이성 항체가 될 수 있다(Mallender WD et al. J of Biological Chemistry, 1994, 269: 199-206).

항체 수식물로서는, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 들 수 있다. 본 발명의 항체에는, 이들 항체 수식물도 포함된다. 본 발명의 항체 수식물에 있어서는, 결합되는 물질은 한정되지 않는다. 이러한 항체 수식물을 얻는 데는, 얻어진 항체에 화학적인 수식을 행함으로써 얻을 수 있다. 이들 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.

본 발명의 항체는, 인간 항체, 마우스 항체, 랫트 항체 등을 포함하고, 그 유래는 한정되지 않는다. 또한 키메라 항체나 인간화 항체 등의 유전자 개변 항체여도 된다.

인간 항체의 취득방법은 이미 알려져 있고, 예를 들면, 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물(transgenic animal)을 목적의 항원으로 면역함으로써 목적의 인간 항체를 취득할 수 있다(국제특허출원 공개번호 WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735 참조).

유전자 개변 항체는, 기지의 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 키메라 항체는, 면역 동물의 항체의 H쇄, 및 L쇄의 가변영역과, 인간 항체의 H쇄 및 L쇄의 정상영역으로 이루어지는 항체이다. 면역 동물 유래의 항체의 가변영역을 코드하는 DNA를, 인간 항체의 정상영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 삽입하고 숙주에 도입하여 생산시킴으로써, 키메라 항체를 얻을 수 있다.

인간화 항체는, 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해지는 개변 항체이다. 인간화 항체는, 면역 동물 유래의 항체의 CDR을, 인간 항체의 상보성 결정영역으로 이식함으로써 구축된다. 그 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다(유럽특허출원 공개번호 EP 239400, 국제특허출원 공개번호 WO 96/02576, Sato K et al, Cancer Research 1993, 53: 851-856, 국제특허출원 공개번호 WO 99/51743 참조).

본 발명의 다중특이성 항원 결합 분자는, F.IX 및/또는 F.IXa, 및 F.X를 인식하고, 보조인자의 F.VIII의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자로서, 지금까지 F.VIII의 기능을 대체하는 기능을 갖는 이중특이성 항체로서 공지로 되어 있는 hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ(WO 2006/109592에 기재)와 비교하여, 높은 F.Xa 생산 촉진 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 항체는, 통상, 항F.IXa 항체에 있어서의 가변영역과, 항F.X 항체에 있어서의 가변영역을 포함하는 구조를 갖는다.

즉 본 발명은 F.IX 및/또는 F.IXa를 인식하는 제1 항원 결합 부위, 및 F.X를 인식하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, F.VIII의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자로서, 그 F.VIII의 기능을 대체하는 기능이, 서열번호：165와 166으로 이루어지는 H쇄 및 서열번호：167로 이루어지는 공통 L쇄를 갖는 이중특이성 항체(hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ)와 비교하여 높은 F.Xa 생산 촉진 활성에 기인하는 기능인, 다중특이성 항원 결합 분자를 제공한다.

본 발명에 있어서의 다중특이성 항원 결합 분자는, F.IX 및/또는 F.IXa를 인식하는 항원 결합 부위를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드, 및 F.X를 인식하는 항원 결합 부위를 포함하는 제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드를 포함한다. 제1 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드, 및 제2 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드에는, 항체의 H쇄의 항원 결합 부위와 항체의 L쇄의 항원 결합 부위가 포함된다.

예를 들면 본 발명에 있어서의 다중특이성 항원 결합 분자는, 제1 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드가 각각 F.IX 또는 F.IXa에 대한 항체의 H쇄 또는 L쇄의 항원 결합 부위를 포함하고, 제2 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 각각 F.X에 대한 항체의 H쇄 또는 L쇄의 항원 결합 부위를 포함한다.

이때, 제1 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드, 및 제2 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드에 포함되는 항체의 L쇄의 항원 결합 부위는, 공통의 L쇄여도 된다.

본 발명에 있어서의 항체의 L쇄의 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드는, 바람직하게는, F.IX, F.IXa 및/또는 F.X에 결합하는 항체의 L쇄의 전부 또는 일부의 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 항체의 제1 폴리펩티드의 항원 결합 부위의 바람직한 태양으로서 구체적으로는, 후술하는 실시예에 기재된

Q1의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：75, 76, 77),

Q31의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：78, 79, 80),

Q64의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：81, 82, 83),

Q85의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：84, 85, 86),

Q153의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：87, 88, 89),

Q354의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：90, 91, 92),

Q360의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：93, 94, 95),

Q405의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：96, 97, 98),

Q458의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：99, 100, 101),

Q460의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：102, 103, 104),

Q499의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：105, 106, 107),

의 아미노산 서열로 이루어지는 항원 결합 부위, 또는 이들과 기능적으로 동등한 항원 결합 부위를 들 수 있다.

또한, 제2 폴리펩티드의 항원 결합 부위는, 바람직한 태양으로서 구체적으로는, 후술하는 실시예에 기재된

J232의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：108, 109, 110),

J259의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：111, 112, 113),

J268의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：114, 115, 116),

J300의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：117, 118, 119),

J321의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：120, 121, 122),

J326의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：123, 124, 125),

J327의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：126, 127, 128),

J339의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：129, 130, 131),

J344의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：132, 133, 134),

J346의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：135, 136, 137),

J142의 H쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：174, 175, 176),

에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항원 결합 부위, 또는 이들과 기능적으로 동등한 항원 결합 부위를 들 수 있다.

즉 본 발명은 제1 폴리펩티드의 항원 결합 부위가 하기 (a1)~(a11)로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 부위 또는 이것과 기능적으로 동등한 항원 결합 부위를 포함하고, 제2 폴리펩티드의 항원 결합 부위가 하기 (b1)~(b11)로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 부위 또는 이것과 기능적으로 동등한 항원 결합 부위를 갖는 다중특이성 항원 결합 분자를 제공한다：

또한, 제3과 제4 폴리펩티드의 항원 결합 부위의 바람직한 태양으로서 구체적으로는, 후술하는 실시예에 기재된

L2의 L쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：138, 139, 140),

L45의 L쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：141, 142, 143),

L248의 L쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：144, 145, 146),

L324의 L쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：147, 148, 149),

L334의 L쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：150, 151, 152),

L377의 L쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：153, 154, 155),

L404의 L쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：156, 157, 158),

L406의 L쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：159, 160, 161),

L408의 L쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：162, 163, 164),

L180의 L쇄 CDR1, 2, 3의 각 서열(서열번호：177, 178, 179)

즉 본 발명은 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드에 포함되는 항원 결합 부위가 하기 (c1)~(c10)으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 L쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 부위 또는 이것과 기능적으로 동등한 항원 결합 부위를 포함하는, 다중특이성 항원 결합 분자를 제공한다：

본 발명에 기재된 Q1, Q31, Q64, Q85, Q153, Q354, Q360, Q405, Q458, Q460, Q499의 H쇄 가변영역의 아미노산 서열은 각각, 이하의 서열번호로 나타내어진다.

Q1：서열번호：35

Q31：서열번호：36

Q64：서열번호：37

Q85：서열번호：38

Q153：서열번호：39

Q354：서열번호：40

Q360：서열번호：41

Q405：서열번호：42

Q458：서열번호：43

Q460：서열번호：44

Q499：서열번호：45

본 발명에 기재된 J232, J259, J268, J300, J321, J326, J327, J339, J344, J346, J142의 H쇄 가변영역의 아미노산 서열은 각각, 이하의 서열번호로 나타내어진다.

J232：서열번호：46

J259：서열번호：47

J268：서열번호：48

J300：서열번호：49

J321：서열번호：50

J326：서열번호：51

J327：서열번호：52

J339：서열번호：53

J344：서열번호：54

J346：서열번호：55

J142：서열번호：172

즉 본 발명은 제1 폴리펩티드의 항원 결합 부위가 하기 (a1)~(a11)로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 가변영역을 포함하는 항원 결합 부위 또는 이것과 기능적으로 동등한 항원 결합 부위를 포함하고, 제2 폴리펩티드의 항원 결합 부위가 하기 (b1)~(b11)로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 가변영역을 포함하는 항원 결합 부위 또는 이것과 기능적으로 동등한 항원 결합 부위를 갖는 다중특이성 항원 결합 분자를 제공한다：

또한, 본 발명에 기재된 L2, L45, L248, L324, L334, L377, L404, L406, L408, L180의 L쇄 가변영역의 아미노산 서열은 각각, 이하의 서열번호로 나타내어진다.

L2 ：서열번호：56

L45 ：서열번호：57

L248：서열번호：58

L324：서열번호：59

L334：서열번호：60

L377：서열번호：61

L404：서열번호：62

L406：서열번호：63

L408：서열번호：64

L180：서열번호：173

즉 본 발명은 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드에 포함되는 항원 결합 부위가 하기 (c1)~(c10)으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 L쇄 가변영역을 포함하는 항원 결합 부위 또는 이것과 기능적으로 동등한 항원 결합 부위를 포함하는, 다중특이성 항원 결합 분자를 제공한다：

또한, 각 서열의 CDR1~3 및 FR1~4의 아미노산 서열은 도 6a~d에 기재된 바와 같다.

본 발명에서 개시되어 있는 가변영역을 사용하여 전장 항체를 제작하는 경우, 정상영역은 특별히 한정되지 않고, 당업자에게 공지의 정상영역을 사용하는 것이 가능하며, 예를 들면, Sequences of proteins of immunological interest, (1991), U.S. Department of Health and Human Services. Public Health Service National Institutes of Health나, An efficient route to human bispecific IgG, (1998). Nature Biotechnology vol. 16, 677-681, 등에 기재되어 있는 정상영역을 사용할 수 있다. 본 발명의 항체 정상영역의 바람직한 예로서, IgG 항체의 정상영역을 들 수 있다. IgG 항체의 정상영역을 사용하는 경우, 그 종류는 한정되지 않고, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등의 서브클래스의 IgG 정상영역을 사용하는 것이 가능하다. 또한, 이들 서브클래스의 IgG의 정상영역에 대해, 정상영역 부분에 아미노산 변이를 도입해도 된다. 도입하는 아미노산 변이는, 예를 들면, Fcγ 수용체로의 결합을 증대 또는 저감시킨 것(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14;103(11):4005-10., MAbs. 2009 Nov;1(6):572-9.), FcRn으로의 결합을 증대 또는 저감시킨 것(J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6591-604, Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69., J Biol Chem. 2006 Aug 18;281(33):23514-24.) 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이중특이성 항체를 제작하기 위해 2종류의 H쇄를 헤테로 회합화시킬 필요가 있다. CH3 도메인을 매개로 2종류의 H쇄를 헤테로 회합화시키기 위해, knobs-into-hole 기술(J Immunol Methods. 2001 Feb 1;248(1-2):7-15, J Biol Chem. 2010 Jul 2;285(27):20850-9.), 정전반발 기술(WO 2006/106905), SEEDbody 기술(Protein Eng Des Sel. 2010 Apr;23(4):195-202.) 등을 사용하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 항체는 당쇄가 개변 또는 결손되어 있어도 된다. 당쇄가 개변된 항체의 예로서는, 예를 들면, 글리코실화가 수식된 항체(WO 99/54342 등), 당쇄에 부가하는 푸코오스가 결손된 항체(WO 00/61739, WO 02/31140, WO 2006/067847, WO 2006/067913 등), 2등분(bisecting) GlcNAc를 갖는 당쇄를 갖는 항체(WO 02/79255 등) 등을 들 수 있다. 당쇄가 결손된 IgG 항체를 제작하는 방법으로서, EU 넘버링 297번째의 아스파라긴에 변이를 도입하는 방법(J Clin Pharmacol. 2010 May;50(5):494-506.), IgG를 대장균으로 생산시키는 방법(J Immunol Methods. 2002 May 1;263(1-2):133-47., J Biol Chem. 2010 Jul 2;285(27):20850-9.) 등이 알려져 있다. 또한, IgG의 C 말단의 리신 결손에 수반되는 이질성(heterogeneity)이나 IgG2의 힌지영역의 디설피드 결합의 엇갈림에 수반되는 이질성을 아미노산의 결손·치환을 도입함으로써 저감시키는 것도 가능하다(WO 2009/041613)).

예를 들면 본 발명은 제1 및 제2 폴리펩티드가 항체의 H쇄 정상영역을 포함하고, 제3 및 제4 폴리펩티드가 항체의 L쇄 정상영역을 포함하는, 다중특이성 항원 결합 분자를 제공한다.

또한 본 발명은 제1 폴리펩티드가 하기 (d1)~(d6)의 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열 또는 하기 (d7)~(d9)의 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 항체의 H쇄 정상영역을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 상기 제1 폴리펩티드와는 상이한 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 항체의 H쇄 정상영역을 포함하는, 다중특이성 항원 결합 분자를 제공한다：

(d1) 서열번호：65(G4k)에 기재된 H쇄 정상영역,

(d2) 서열번호：66(z7)에 기재된 H쇄 정상영역,

(d3) 서열번호：67(z55)에 기재된 H쇄 정상영역,

(d4) 서열번호：68(z106)에 기재된 H쇄 정상영역,

(d5) 서열번호：69(z118)에 기재된 H쇄 정상영역,

(d6) 서열번호：70(z121)에 기재된 H쇄 정상영역,

(d7) 서열번호：71(G4h)에 기재된 H쇄 정상영역,

(d8) 서열번호：72(z107)에 기재된 H쇄 정상영역,

(d9) 서열번호：73(z119)에 기재된 H쇄 정상영역.

또한 본 발명은 제3과 제4 폴리펩티드가 하기 (e)의 아미노산 서열로 이루어지는 항체의 L쇄 정상영역을 포함하는, 다중특이성 항원 결합 분자를 제공한다：

(e) 서열번호：74(k)에 기재된 L쇄 정상영역.

본 발명에 있어서 「F.VIII의 기능을 대체하는」이란, F.IX 및/또는 F.IXa, 및 F.X를 인식하고, F.X의 활성화를 촉진하는(F.Xa 생산을 촉진하는) 것을 의미한다.

본 발명에 있어서의 「F.Xa 생산 촉진 활성」은, 본 발명의 다중특이성 항원 결합 분자가, 예를 들면, F.XIa(F.IX 활성화 효소), F.IX, F.X, F 합성 기질 S-2222(F.Xa의 합성 기질), 인지질로 이루어지는 측정계에서 평가함으로써 확인할 수 있다. 본 측정계는 혈우병 A 증례에 있어서의 질환의 중증도 및 임상증상과 상관성을 나타낸다(Rosen S, Andersson M, Blomba¨ck M et al. Clinical applications of a chromogenic substrate method for determination of FVIII activity. Thromb Haemost 1985; 54: 811-23). 즉, 본 측정계에서, 보다 높은 F.Xa 생산 촉진 활성을 나타내는 피검물질은, 혈우병 A에 있어서의 출혈증상에 대해, 보다 우수한 지혈효과를 나타내는 것이 기대된다. 그 결과로써, F.VIII의 기능을 대체하는 활성을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자로서, hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ 보다 높은 활성을 갖는 분자라면, 우수한 혈액응고 촉진 활성을 얻는 것이 가능하여, 출혈, 출혈을 수반하는 질환, 또는 출혈에 기인하는 질환의 예방 및/또는 치료용 의약 성분으로서 우수한 효과를 얻을 수 있다. 당해 의약 성분으로서의 우수한 효과를 얻기 위해서는, 예를 들면〔실시예 2〕에 기재된 조건으로 측정한 경우의 F.Xa 생산 촉진 활성이, hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ 이상인 것이 바람직하고, 특히, Q153-G4k/J142-G4h/L180-k와 동등 또는 그 이상인 것이 보다 바람직하다. 또한, 여기에서 말하는 F.Xa 생산 촉진 활성이란, 항체 용액의 20분간의 흡광도 변화치로부터, 용매 20분간의 흡광도 변화치를 뺀 값이다.

본 발명의 바람직한 태양으로서는, F.IX 및/또는 F.IXa, 및 F.X를 인식하고, F.VIII의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항체이다.

본 발명의 상기 다중특이성 항체는, 바람직하게는, 항F.IX/F.IXa 항체의 H쇄 CDR 또는 이것과 기능적으로 동등한 CDR과, 항F.X 항체의 H쇄 CDR 또는 이것과 기능적으로 동등한 CDR을 포함하는 항체이다.

또한 본 발명의 항체는, 항F.IX/IXa 항체에 있어서의,

서열번호：75, 76, 77(Q1의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：78, 79, 80(Q31의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：81, 82, 83(Q64의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：84, 85, 86(Q85의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：87, 88, 89(Q153의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：90, 91, 92(Q354의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：93, 94, 95(Q360의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：96, 97, 98(Q405의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：99, 100, 101(Q458의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：102, 103, 104(Q460의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：105, 106, 107(Q499의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

으로 이루어지는 항원 결합 부위 또는 이것과 기능적으로 동등한 항원 결합 부위와, 항F.X 항체에 있어서의

서열번호：108, 109, 110(J232의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：111, 112, 113(J259의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：114, 115, 116(J268의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：117, 118, 119(J300의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：120, 121, 122(J321의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：123, 124, 125(J326의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：126, 127, 128(J327의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：129, 130, 131(J339의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：132, 133, 134(J344의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：135, 136, 137(J346의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열,

또는 서열번호：174, 175, 176(J142의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열

로 이루어지는 항원 결합 부위 또는 이것과 기능적으로 동등한 항원 결합 부위를 포함하는 항체인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 있어서, 항원 결합 부위가 기능적으로 동등하다는 것은, 당해 항원 결합 부위를 포함하는 다중특이성 항원 결합 분자가 갖는 F.VIII의 기능을 대체하는 활성이 동등한 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 「동등」이란, 반드시 같은 정도의 활성일 필요는 없고, 활성이 증강되어 있어도 되고, 또한, 상기 측정계에서 hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ 보다도 높은 활성 또는, 바람직하게는 〔실시예 2〕에 기재된 조건으로 측정한 경우의 F.Xa 생산 촉진 활성이 Q153-G4k/J142-G4h/L180-k와 동등 또는 그 이상의 활성을 갖는 한, 활성이 감소되어 있어도 된다.

전술한 항체는, 전술한 단락번호 <0413>의 측정계에서 hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ 보다도 높은 활성, 바람직하게는 〔실시예 2〕에 기재된 조건으로 측정한 경우의 F.Xa 생산 촉진 활성이 Q153-G4k/J142-G4h/L180-k와 동등 또는 그 이상의 활성을 갖는 한, 가변영역(CDR서열 및/또는 FR서열)의 아미노산 서열에 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어도 된다. 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입하기 위한, 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는, 단백질에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 당업자라면, 부위 특이적 변이 유발법(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492) 등을 사용하여 아미노산 서열에 적당히 변이를 도입함으로써, 목적의 F.VIII의 기능을 대체하는 활성을 갖는 다중특이성 폴리펩티드 다량체와 기능적으로 동등한 변이체를 조제할 수 있다.

이와 같이, 가변영역에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 변이되어 있어, 전술 단락번호 <0413>의 측정계에서 hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ 보다도 높은 활성, 바람직하게는 〔실시예 2〕에 기재된 조건으로 측정한 경우의 F.Xa 생산 촉진 활성이 Q153-G4k/J142-G4h/L180-k와 동등 또는 그 이상의 활성을 갖는 항체도 또한 본 발명의 항체에 포함된다.

아미노산 잔기를 개변하는 경우에는, 아미노산 측쇄의 성질이 보존되어 있는 다른 아미노산으로 변이되는 것이 바람직하다. 예를 들면 아미노산 측쇄의 성질로서는, 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 지방족 측쇄를 갖는 아미노산(G, A, V, L, I, P), 수산기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(S, T, Y), 황원자 함유 측쇄를 갖는 아미노산(C, M), 카르복실산 및 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산(D, N, E, Q), 잔기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(R, K, H), 및 방향족 함유 측쇄를 갖는 아미노산(H, F, Y, W)을 들 수 있다(괄호 안은 모두 아미노산의 일문자 표기를 나타낸다). 이들의 각 그룹의 아미노산의 치환을 보존적 치환이라 칭한다. 어느 아미노산 서열에 대한 1 또는 복수 개의 아미노산 잔기의 결실, 부가 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의해 수식된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성을 유지하는 것은 이미 알려져 있다(Mark, D. F. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1984)81:5662-6； Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res.(1982)10:6487-500; Wang, A. et al., Science(1984)224:1431-3; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1982)79:6409-13). 이러한 변이체는, 본 발명의 가변영역(예를 들면 CDR 서열, FR 서열, 가변영역 전체)의 아미노산 서열과 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱이 보다 바람직하게는 적어도 90%, 그리고, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 아미노산 서열의 동일성을 갖는다. 본 명세서에 있어서 서열의 동일성은, 서열 동일성이 최대가 되도록 필요에 따라 서열을 정렬화하고, 적당히 갭을 도입한 후, 기초가 된 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열의 잔기와 동일 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열의 동일성은, 후술하는 방법에 의해 결정할 수 있다.

또한, 가변영역(CDR 서열 및/또는 FR 서열)의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있고, 전술한 단락번호 <0413>의 측정계에서 hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ 보다도 높은 활성, 바람직하게는 〔실시예 2〕에 기재된 조건으로 측정한 경우의 F.Xa 생산 촉진 활성이 Q153-G4k/J142-G4h/L180-k와 동등 또는 그 이상의 활성을 갖는 가변영역의 아미노산 서열은, 그 가변영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열로 이루어지는 핵산에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로부터 얻는 것도 가능하다. 가변영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열로 이루어지는 핵산에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산을 단리(isolation)하기 위한, 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건으로서는, 6 M 요소, 0.4% SDS, 0.5×SSC, 37℃의 조건 또는 이것과 동등한 스트린젠시의 하이브리다이제이션 조건을 예시할 수 있다. 보다 스트린젠시가 높은 조건, 예를 들면, 6 M 요소, 0.4% SDS, 0.1×SSC, 42℃의 조건을 사용하면, 보다 상동성이 높은 핵산의 단리를 기대할 수 있다. 단리된 핵산의 서열의 결정은, 후술하는 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 단리된 핵산의 상동성은, 염기서열 전체에서, 적어도 50% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 서열의 동일성을 갖는다.

상기 하이브리다이제이션 기술을 이용하는 방법 대신에, 가변영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열 정보를 토대로 합성한 프라이머를 사용하는 유전자 증폭법, 예를 들면, 폴리머라아제 연쇄반응(PCR)법을 이용하여, 가변영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열로 이루어지는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산을 단리하는 것도 가능하다.

염기서열 및 아미노산 서열의 동일성은, Karlin and Altschul에 의한 알고리즘 BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:5873-7)에 의해 결정할 수 있다. 이 알고리즘을 토대로, BLASTN이나 BLASTX라 불리는 프로그램이 개발되어 있다(Altschul et al.,J.Mol.Biol.(1990)215:403-10). BLAST에 기초하여 BLASTN에 의해 염기서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들면 score=100, wordlength=12로 한다. 또한, BLAST에 기초하여 BLASTX에 의해 아미노산 서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들면 score=50, wordlength=3으로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다. 이들의 해석방법의 구체적인 수법은 공지이다(NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)의 웹사이트를 참조；http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

또한 본 발명은 상기 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하는 항체도 제공한다.

어느 항체가 다른 항체와 중복되는 에피토프를 인식하는지 여부는, 양자의 에피토프에 대한 경합에 의해 확인할 수 있다. 항체 간의 경합은, 경합 결합 어세이에 의해 평가할 수 있고, 그 수단으로서 효소결합 면역흡착 검정법(ELISA), 형광 에너지 전이 측정법(FRET)이나 형광 미량 측정기술(FMAT(등록상표)) 등을 들 수 있다. 항원에 결합한 그 항체의 양은, 중복되는 에피토프로의 결합에 대해 경합하는 후보 경합 항체(피검항체)의 결합능에 간접적으로 상관하고 있다. 즉, 중복되는 에피토프에 대한 피검항체의 양이나 친화성이 커질수록, 그 항체의 항원으로의 결합량은 저하되고, 항원으로의 피검항체의 결합량은 증가한다. 구체적으로는, 항원에 대해, 적당한 표지를 한 그 항체와 평가 대상 항체를 동시에 첨가하고, 표지를 이용하여 결합하고 있는 그 항체를 검출한다. 항원에 결합한 그 항체량은, 그 항체를 사전에 표지해 둠으로써, 용이하게 측정할 수 있다. 이 표지는 특별히 제한되지는 않으나, 수법에 따른 표지방법을 선택한다. 표지방법은, 구체적으로는 형광 표지, 방사 표지, 효소 표지 등을 들 수 있다.

예를 들면, F.IX, F.IXa 또는 F.X를 고상화한 비드에 형광 표지한 그 항체와, 비표지의 그 항체 또는 피검항체를 동시에 첨가하고, 표지된 그 항체를 형광 미량 측정기술에 의해 검출한다.

여기서 말하는 「중복되는 에피토프에 결합하는 항체」란, 표지 그 항체에 대해, 비표지의 그 항체의 결합에 의해 결합량을 50% 저하시키는 농도(IC₅₀)에 대해, 피검항체가 비표지 그 항체의 IC₅₀의 통상, 100배, 바람직하게는 80배, 더욱 바람직하게는 50배, 더욱 바람직하게는 30배, 보다 바람직하게는 10배 높은 농도로 적어도 50%, 표지 그 항체의 결합량을 저하시킬 수 있는 항체이다.

전술한 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하는 항체의 항원 결합 부위를 갖는 다중특이성 항원 결합 분자는, 우수한 F.VIII 기능을 대체하는 활성을 얻는 것이 가능하다. 또한, 전술한 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하는 항체의 항원 결합 부위는, 보다 우수한 F.VIII 기능을 대체하는 활성을 얻기 위해 1 또는 복수의 아미노산을 개변하는 것이 가능하다. 항원 결합 부위의 아미노산을 개변 후, 전술한 측정계에서 hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ 보다도 높은 활성, 바람직하게는 〔실시예 2〕에 기재된 조건으로 측정한 경우의 F.Xa 생산 촉진 활성이 Q153-G4k/J142-G4h/L180-k 동등 또는 그 이상의 활성을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자를 선택함으로써, 보다 우수한 F.VIII 기능을 대체하는 활성을 얻을 수 있다. 본 발명의 우수한 F.VIII 기능을 대체하는 활성을 얻기 위해서는, 특히, 이하의 아미노산 개변이 바람직하다.

(1)　F.IX 및/또는 F.IXa를 인식하는 항체 H쇄에 있어서의 Kabat 넘버링에 의한 34번 위치, 35번 위치, 49번 위치, 61번 위치, 62번 위치, 96번 위치, 98번 위치, 100번 위치, 100b번 위치 및 102번 위치의 아미노산 잔기로부터 선택되는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된다.

(2)　F.X를 인식하는 항체 H쇄에 있어서의 Kabat 넘버링에 의한 35번 위치, 53번 위치, 73번 위치, 76번 위치, 96번 위치, 98번 위치, 100번 위치 및 100a번 위치의 아미노산 잔기로부터 선택되는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된다.

(3) 항체 L쇄에 있어서의 Kabat 넘버링에 의한 27번 위치, 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치, 52번 위치, 53번 위치, 54번 위치, 55번 위치, 92번 위치, 93번 위치, 94번 위치 및 95번 위치의 아미노산 잔기로부터 선택되는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된다.

또한, 본 발명에 있어서, 보다 우수한 F.VIII 기능을 대체하는 활성을 얻기 위한 바람직한 항체의 아미노산으로서는, 이하의 (4)~(6)을 들 수 있다. 이들의 아미노산은, 항체 H쇄가 사전에 그러한 아미노산을 가지고 있어도 되고, 아미노산을 개변함으로써 그러한 서열을 갖는 항체 H쇄로 해도 된다.

(4)　F.IX 및/또는 F.IXa를 인식하는 항체 H쇄가, Kabat 넘버링에 의한 34번 위치의 아미노산 잔기가 이소류신, 35번 위치의 아미노산 잔기가 아스파라긴, 글루타민 또는 세린, 49번 위치의 아미노산 잔기가 세린, 61번 위치의 아미노산 잔기가 아르기닌, 62번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산, 96번 위치의 아미노산 잔기가 세린 또는 트레오닌, 98번 위치의 아미노산 잔기가 리신 또는 아르기닌, 100번 위치의 아미노산 잔기가 페닐알라닌 또는 티로신, 100b번 위치의 아미노산 잔기가 글리신, 또는, 102번 위치의 아미노산 잔기가 티로신인 항체의 H쇄,

(5)　F.X를 인식하는 항체 H쇄에 있어서의 Kabat 넘버링에 의한 35번 위치의 아미노산 잔기가 아스파라긴산, 53번 위치의 아미노산 잔기가 아르기닌, 73번 위치의 아미노산 잔기가 리신, 76번 위치의 아미노산 잔기가 글리신, 96번 위치의 아미노산 잔기가 리신 또는 아르기닌, 98번 위치의 아미노산 잔기가 티로신, 100번 위치의 아미노산 잔기가 티로신, 또는, 100a번 위치의 아미노산 잔기가 히스티딘인 항체의 H쇄,

(6) 항체 L쇄에 있어서의 Kabat 넘버링에 의한 27번 위치의 아미노산 잔기가 리신 또는 아르기닌, 30번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산, 31번 위치의 아미노산 잔기가 아르기닌, 32번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민, 50번 위치의 아미노산 잔기가 아르기닌 또는 글루타민, 52번 위치의 아미노산 잔기가 세린, 53번 위치의 아미노산 잔기가 아르기닌, 54번 위치의 아미노산 잔기가 리신, 55번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산, 92번 위치의 아미노산 잔기가 세린, 93번 위치의 아미노산 잔기가 세린, 94번 위치의 아미노산 잔기가 프롤린, 또는, 95번 위치의 아미노산 잔기가 프롤린인 항체의 L쇄.

상기의 (1)~(6)의 항체의 아미노산 잔기 중, 특히 우수한 F.VIII 유사 활성을 얻기 위한 바람직한 위치의 아미노산 잔기로서는, 이하의 (1)~(3)을 들 수 있다.

(1) F.IX 및/또는 F.IXa를 인식하는 항체 H쇄에 있어서의 Kabat 넘버링에 의한 34번 위치, 35번 위치, 61번 위치, 98번 위치, 100번 위치 및 100b번 위치의 아미노산 잔기, 그 중에서도 61번 위치 및 100번 위치의 아미노산 잔기

(2) F.X를 인식하는 항체 H쇄에 있어서의 Kabat 넘버링에 의한 35번 위치, 53번 위치, 73번 위치, 96번 위치, 98번 위치, 100번 위치 및 100a번 위치의 아미노산 잔기

(3) 항체 L쇄에 있어서의 Kabat 넘버링에 의한 27번 위치, 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치, 52번 위치, 53번 위치, 93번 위치, 94번 위치 및 95번 위치의 아미노산 잔기, 그 중에서도 27번 위치, 30번 위치, 31번 위치, 50번 위치, 53번 위치, 94번 위치 및 95번 위치의 아미노산 잔기

즉 본 발명은 제1 폴리펩티드가 하기 (a1)~(a14)로부터 선택되는 어느 하나의 항체 H쇄와 하기 (c1)~(c10)으로부터 선택되는 어느 하나의 항체 L쇄로 이루어지고, 제2 폴리펩티드가 하기 (b1)~(b12)로부터 선택되는 어느 하나의 항체 H쇄와 하기 (c1)~(c10)으로부터 선택되는 어느 하나의 항체 L쇄로 이루어지는, 다중특이성 항원 결합 분자를 제공한다：

또한 본 발명은 제1 폴리펩티드가, 상기 (a1)~(a14) 중 어느 하나에 기재된 항체의 H쇄와 상기 (c1)~(c10) 중 어느 하나에 기재된 항체의 L쇄로 이루어지는 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고, 제2 폴리펩티드가, 상기 (b1)~(b12) 중 어느 하나에 기재된 항체의 H쇄와 상기 (c1)~(c10) 중 어느 하나에 기재된 항체의 L쇄로 이루어지는 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는, 다중특이성 항원 결합 분자를 제공한다.

또한 본 발명은 제1 폴리펩티드가, 하기 (e1)~(e3)으로부터 선택되는 어느 하나의 항체의 H쇄를 포함하고, 제2 폴리펩티드가 하기 (f1)~(f3)으로부터 선택되는 어느 하나의 항체의 H쇄를 포함하며, 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 하기 (g1)~(g4)로부터 선택되는 어느 하나의 항체의 L쇄를 포함하는, 다중특이성 항원 결합 분자를 제공한다：

(e1)　상기 (a1)~(a14) 중 어느 하나의 항체의 H쇄와 상기 (c1)~(c10) 중 어느 하나에 기재된 항체의 L쇄로 이루어지는 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하는 항체의 H쇄,

(e2)　상기 (e1)로부터 선택되는 어느 하나의 항체의 H쇄에 있어서의 Kabat 넘버링에 의한 34번 위치, 35번 위치, 49번 위치, 61번 위치, 62번 위치, 96번 위치, 98번 위치, 100번 위치, 100b번 위치 및 102번 위치의 아미노산 잔기로부터 선택되는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 있는 항체의 H쇄,

(e3)　상기 (e1)로부터 선택되는 어느 하나의 항체의 H쇄에 있어서의 Kabat 넘버링에 의한 34번 위치의 아미노산 잔기가 이소류신, 35번 위치의 아미노산 잔기가 아스파라긴, 글루타민 또는 세린, 49번 위치의 아미노산 잔기가 세린, 61번 위치의 아미노산 잔기가 아르기닌, 62번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산, 96번 위치의 아미노산 잔기가 세린 또는 트레오닌, 98번 위치의 아미노산 잔기가 리신 또는 아르기닌, 100번 위치의 아미노산 잔기가 페닐알라닌 또는 티로신, 100b번 위치의 아미노산 잔기가 글리신, 또는, 102번 위치의 아미노산 잔기가 티로신인 항체의 H쇄,

(f1)　상기 (b1)~(b12) 중 어느 하나의 항체의 H쇄와 상기 (c1)~(c10) 중 어느 하나의 항체의 L쇄로 이루어지는 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하는 항체의 H쇄,

(f2)　상기 (f1) 중 어느 하나의 항체 H쇄에 있어서의 Kabat 넘버링에 의한 35번 위치, 53번 위치, 73번 위치, 76번 위치, 96번 위치, 98번 위치, 100번 위치 및 100a번 위치의 아미노산 잔기로부터 선택되는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 있는 항체의 H쇄,

(f3)　상기 (f1) 중 어느 하나의 항체 H쇄로서, Kabat 넘버링에 의한 35번 위치의 아미노산 잔기가 아스파라긴산, 53번 위치의 아미노산 잔기가 아르기닌, 73번 위치의 아미노산 잔기가 리신, 76번 위치의 아미노산 잔기가 글리신, 96번 위치의 아미노산 잔기가 리신 또는 아르기닌, 98번 위치의 아미노산 잔기가 티로신, 100번 위치의 아미노산 잔기가 티로신, 또는, 100a번 위치의 아미노산 잔기가 히스티딘인 항체의 H쇄,

(g1)　상기 (a1)~(a14) 중 어느 하나의 항체의 H쇄와 상기 (c1)~(c10) 중 어느 하나의 항체의 L쇄로 이루어지는 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하는 항체의 L쇄,

(g2)　상기 (b1)~(b12) 중 어느 하나의 항체의 H쇄와 상기 (c1)~(c10) 중 어느 하나의 항체의 L쇄로 이루어지는 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하는 항체의 L쇄,

(g3)　상기 (g1) 및 (g2) 중 어느 하나의 항체의 L쇄에 있어서의 Kabat 넘버링에 의한 27번 위치, 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치, 52번 위치, 53번 위치, 54번 위치, 55번 위치, 92번 위치, 93번 위치, 94번 위치 및 95번 위치의 아미노산 잔기로부터 선택되는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 있는 항체의 L쇄,

(g4)　상기 (g1) 및 (g2) 중 어느 하나의 항체의 L쇄로서, Kabat 넘버링에 의한 27번 위치의 아미노산 잔기가 리신 또는 아르기닌, 30번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산, 31번 위치의 아미노산 잔기가 아르기닌, 32번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민, 50번 위치의 아미노산 잔기가 아르기닌 또는 글루타민, 52번 위치의 아미노산 잔기가 세린, 53번 위치의 아미노산 잔기가 아르기닌, 54번 위치의 아미노산 잔기가 리신, 55번 위치의 아미노산 잔기가 글루타민산, 92번 위치의 아미노산 잔기가 세린, 93번 위치의 아미노산 잔기가 세린, 94번 위치의 아미노산 잔기가 프롤린, 또는, 95번 위치의 아미노산 잔기가 프롤린인 항체의 L쇄.

또한, 본 발명의 항체(클론)에 대해서는, 탈아미드화, 메티오닌산화 등의 회피나 항체의 구조 안정화를 목적으로 아미노산 잔기를 치환해도 된다.

본 발명의 다중특이성 항원 결합 분자를 얻는 방법은 특별히 제한되지 않고, 어떠한 방법으로 취득되어도 된다. 예를 들면, 이중특이성 항체의 제조방법의 일례로서는, WO 2006/109592나 WO 2005/035756, WO 2006/106905, WO 2007/114325에 기재된 방법에 따라 이중특이성 항체를 제작 후, 목적의 보조인자 기능 대체 활성을 갖는 항체를 선택해서 취득할 수 있다.

예를 들면 본 발명에 있어서는, 이하의 (a)~(u) 중 어느 하나에 기재된 이중특이성 항체가 제공된다：

본 발명의 항체는, 후술하는 항체를 생산하는 세포나 숙주 또는 정제방법에 의해, 아미노산 서열, 분자량, 등전점 또는 당쇄의 유무나 형태 등이 상이할 수 있다. 그러나, 얻어진 항체가, 본 발명의 항체와 동등한 기능을 가지고 있는 한, 본 발명에 포함된다. 예를 들면, 본 발명의 항체를 원핵세포, 예를 들면 대장균에서 발현시킨 경우, 본래의 항체의 아미노산 서열의 N 말단에 메티오닌 잔기가 부가된다. 본 발명의 항체는 이러한 항체도 포함한다.

본 발명의 이중특이성 항체는 당업자에게 공지의 방법에 의해 제조하는 것이 가능하다.

예를 들면, 얻어진 항F.IX/F.IXa 항체 또는 항F.X 항체의 서열을 토대로, 당업자에게 공지의 유전자 재조합기술을 사용하여 항체를 제작하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 항F.IX/F.IXa 항체 또는 항F.X 항체의 서열을 토대로 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 구축하고, 이것을 발현 벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시키면 된다(예를 들면, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137 참조).

벡터의 예로서는, M13계 벡터, pUC계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또한, cDNA의 서브클로닝, 잘라내기를 목적으로 한 경우, 상기 벡터 외에, 예를 들면, pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 들 수 있다. 본 발명의 항체를 생산하는 목적에 있어서 벡터를 사용하는 경우에는, 특히, 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는, 예를 들면, 대장균에서의 발현을 목적으로 한 경우는, 벡터가 대장균에서 증폭되는 바와 같은 특징을 갖는 것 외에, 숙주를 JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 한 경우에 있어서는, 대장균에서 효율적으로 발현할 수 있는 프로모터, 예를 들면, lacZ 프로모터(Ward등, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터(Better등, Science (1988) 240, 1041-1043), 또는 T7 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하다. 이러한 벡터로서는, 상기 벡터 외에 pGEX-5X-1(파마시아 제조), 「QIAexpress system」(퀴아겐 제조), pEGFP, 또는 pET(이 경우, 숙주는 T7 RNA 폴리머라아제를 발현하고 있는 BL21이 바람직하다) 등을 들 수 있다.

또한, 발현 플라스미드의 벡터에는, 항체 분비를 위한 시그날 서열이 포함되어 있어도 된다. 항체 분비를 위한 시그날 서열로서는, 대장균의 페리플라즘으로 생산시키는 경우, pelB 시그날 서열(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)을 사용하면 된다. 숙주세포로의 벡터의 도입은, 예를 들면 염화칼슘법, 전기천공법을 사용해서 행할 수 있다.

대장균 이외에도, 예를 들면, 본 발명의 항체를 제조하기 위한 벡터로서는, 포유동물 유래의 발현 벡터(예를 들면, pcDNA3(인비트로겐사 제조)나, pEF-BOS(Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322), pEF, pCDM8), 곤충세포 유래의 발현 벡터(예를 들면「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(기브코 BRL 제조), pBacPAK8), 식물 유래의 발현 벡터(예를 들면 pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면, pZIPneo), 효모 유래의 발현 벡터(예를 들면, 「Pichia Expression Kit」(인비트로겐 제조), pNV11, SP-Q01), 고초균 유래의 발현 벡터(예를 들면, pPL608, pKTH50)를 들 수 있다.

CHO 세포, COS 세포, NIH3T3 세포 등의 동물세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 발현 플라스미드의 벡터가 세포 내에서 발현시키기 위해 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터(Mulligan등, Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터(Mizushima등, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하여, 세포로의 형질전환을 선발하기 위한 유전자(예를 들면, 약제(네오마이신, G418 등)에 의해 판별할 수 있는 약제 내성 유전자)를 가지면 더욱 바람직하다. 이러한 특성을 갖는 벡터로서는, 예를 들면, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수 있다.

또한, 유전자를 안정적으로 발현시키며, 또한, 세포 내에서의 유전자의 카피 수의 증폭을 목적으로 하는 경우에는, 핵산 합성 경로를 결손한 CHO 세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터(예를 들면, pSV2-dhfr(「Molecular Cloning 2nd edition」 Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) 등)를 도입하고, 메토트렉세이트(MTX)에 의해 증폭시키는 방법을 들 수 있고, 또한, 유전자의 일과성 발현을 목적으로 하는 경우에는, SV40 T 항원을 발현하는 유전자를 염색체 상에 갖는 COS 세포를 사용하여 SV40의 복제 기점을 갖는 벡터(pcD 등)로 형질전환하는 방법을 들 수 있다. 복제 개시점으로서는, 또한, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 소유두종 바이러스(BPV) 등의 유래의 것을 사용하는 것도 가능하다. 또한, 숙주세포계에서 유전자 카피 수의 증폭을 위해, 발현 벡터는 선택 마커로서, 아미노글리코시드트랜스페라아제(APH) 유전자, 티미딘키나아제(TK) 유전자, 대장균 크산틴구아닌포스포리보실트랜스페라아제(Ecogpt) 유전자, 디히드로엽산환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.

이것에 의해 얻어진 본 발명의 항체는, 숙주세포내 또는 세포외(배지 등)로부터 단리하여, 실질적으로 순수하고 균일한 항체로서 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는, 통상의 항체의 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되고, 조금도 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적당히 선택, 조합하면 항체를 분리, 정제할 수 있다.

크로마토그래피로서는, 예를 들면 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 이들 크로마토그래피는, 액상 크로마토그래피, 예를 들면 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피 등을 사용해서 행할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로서는, Protein A 칼럼, Protein G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들면, Protein A를 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose FF(GE Amersham Biosciences) 등을 들 수 있다. 본 발명은 이들 정제방법을 사용하여, 고도로 정제된 항체도 포함한다.

얻어진 항체는, 균일하게까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 된다. 예를 들면 친화성 크로마토그래피 등의 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동, 등전점 전기영동 등을 적당히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있으나(Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), 이들에 한정되는 것은 아니다. 친화성 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로서는, Protein A 칼럼, Protein G 칼럼 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 항체의 하나의 태양으로서는, 보조인자 F.VIII를 대체하는 기능을 갖는 것으로부터, 본 발명의 항체는, 그 보조인자의 활성(기능) 저하에 기인하는 질병에 대해서, 유효한 약제로 되는 것이 기대된다. 상기 질병으로서, 예를 들면, 출혈, 출혈을 수반하는 질환, 또는 출혈에 기인하는 질환 등을 들 수 있다. 특히, F.VIII/F.VIIIa의 기능 저하나 결손에 의해 출혈 이상증을 일으키는, 혈우병에 대한 우수한 치료효과가 생각된다. 그 중에서도, 혈우병 중, 선천성의 F.VIII/F.VIIIa 기능 저하 또는 결손에 의한 출혈 이상증을 일으키는, 혈우병 A에 대한 우수한 치료제로 되는 것이 기대된다.

본 발명에서는, 본 발명에 기재된 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 (의약) 조성물을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 항체가 F.IX 또는 F.IXa, 및 F.X 양쪽을 인식하고, F.VIII의 기능을 대체하는 항체는, 예를 들면, 출혈, 출혈을 수반하는 질환, 또는 출혈에 기인하는 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약품(의약 조성물) 또는 약제로 되는 것이 기대된다.

본 발명에 있어서, 출혈, 출혈을 수반하는 질환, 또는 출혈에 기인하는 질환이란, 바람직하게는 F.VIII 및/또는 활성화 혈액응고 제VIII 인자(F.VIIIa)의 활성의 저하 내지 결손에 의해 발증 및/또는 진전되는 질환이다. 이러한 질환으로서는, 예를 들면 상기 혈우병 A, F.VIII/F.VIIIa에 대한 인히비터가 출현하고 있는 질환, 후천성 혈우병, 폰 빌레브란트병 등을 들 수 있지만, 이들 질환에 특별히 제한되지 않는다.

치료 또는 예방 목적으로 사용되는 본 발명의 항체를 유효성분으로서 포함하는 의약 조성물은, 필요에 따라, 그들에 대해 불활성인 적당한 약학적으로 허용되는 담체, 매체 등과 혼화하여 제제화할 수 있다. 예를 들면, 멸균수나 생리식염수, 안정제, 부형제, 산화방지제(아스코르브산 등), 완충제(인산, 구연산, 히스티딘, 다른 유기산 등), 방부제, 계면활성제(PEG, Tween 등), 킬레이트제(EDTA 등), 결합제 등을 들 수 있다. 또한, 기타 저분자량의 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴이나 면역 글로불린 등의 단백질, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 글루타민산, 아스파라긴산, 메티오닌, 아르기닌 및 리신 등의 아미노산, 다당 및 단당 등의 당류나 탄수화물, 만니톨이나 소르비톨 등의 당알코올을 포함하고 있어도 된다. 주사용 수용액으로 하는 경우에는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조제를 포함하는 등장액, 예를 들면, D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수 있고, 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, PEG 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 188, HCO-50) 등과 병용해도 된다. 또한, 제제 중에 히알루로니다아제(hyaluronidase)를 혼합함으로써, 보다 커다란 액량을 피하 투여하는 것도 가능하다(Expert Opin Drug Deliv. 2007 Jul;4(4):427-40.).

또한, 필요에 따라 본 발명의 항체를 마이크로캡슐(히드록시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 폴리[메틸메타크릴산] 등의 마이크로캡슐)에 봉입하거나, 콜로이도 드러그 딜리버리 시스템(리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐 등)으로 하는 것도 가능하다("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980) 등 참조). 또한, 약제를 서방성 약제로 하는 방법도 공지로, 본 발명의 항체에 적용 가능하다(Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 15: 267-277 (1981); Langer, Chemtech. 12: 98-105 (1982); 미국특허 제3,773,919호;유럽특허 출원공개(EP) 제58,481호; Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983);EP 제133,988호).

본 발명의 의약 조성물의 투여량은, 제형의 종류, 투여방법, 환자의 연령이나 체중, 환자의 증상, 질환의 종류나 진행의 정도 등을 고려하여, 최종적으로는 의사의 판단에 따라 적당히 결정되는 것이나, 일반적으로 성인의 경우는, 1일당 0.1~2000 ㎎을 1~수 회에 나눠서 투여할 수 있다. 보다 바람직하게는 0.2~1000 ㎎/일, 더욱이 보다 바람직하게는 0.5~500 ㎎/일, 더욱이 보다 바람직하게는 1~300 ㎎/일, 더욱이 보다 바람직하게는 3~100 ㎎/일, 가장 바람직하게는 5~50 ㎎/일이다. 이들 투여량은 환자의 체중이나 연령, 투여방법 등에 따라 변동되나, 당업자라면 적당한 투여량을 적절히 선택하는 것이 가능하다. 투여기간도 환자의 치유경과 등에 따라 적절히 결정하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 본 발명의 항체를 코드하는 유전자 또는 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명의 항체를 코드하는 유전자 또는 핵산을 유전자 치료용 벡터에 삽입하여, 유전자 치료를 행하는 것도 생각할 수 있다. 투여방법으로서는, naked 플라스미드에 의한 직접 투여 외에, 리포솜 등에 팩키징하거나, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 아데노바이러스 관련 벡터, HVJ 벡터 등의 각종 바이러스 벡터로서 형성하거나(Adolph『바이러스 게놈법』, CRC Press, Florid (1996) 참조), 또는, 콜로이드금입자 등의 비드 담체에 피복(WO 93/17706 등)하여 투여할 수 있다. 그러나, 생체내에 있어서 항체가 발현되어, 그 작용을 발휘할 수 있는 한 어떠한 방법에 의해 투여해도 된다. 바람직하게는, 적당한 비경구 경로(정맥내, 복강내, 피하, 피내, 지방조직내, 유선조직내, 흡입 또는 근육내의 경로를 매개로 주사, 주입, 또는 가스 유도성 입자 충격법(전자총 등에 의함), 점비약 등 점막 경로를 매개로 하는 방법 등)에 의해 충분한 양이 투여된다. ex vivo에 있어서 리포솜 트랜스펙션, 입자 충격법(미국특허 제4,945,050호), 또는 바이러스 감염을 이용하여 혈액세포 및 골수 유래 세포 등에 투여하여, 그 세포를 환자에게 재도입함으로써 본 발명의 항체를 코드하는 유전자를 투여해도 된다. 유전자 치료에서는, 본 발명의 항체를 코드하는 임의의 유전자를 사용하는 것이 가능하고, 예를 들면, 전술한 Q1, Q31, Q64, Q85, Q153, Q354, Q360, Q405, Q458, Q460, Q499, J232, J259, J268, J300, J321, J326, J327, J339, J344, J346, J142, L2, L45, L248, L324, L334, L377, L404, L406, L408, L180의 CDR을 코드하는 염기서열을 포함하는 유전자를 들 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 항체 또는 조성물을 투여하는 공정을 포함하는, 출혈, 출혈을 수반하는 질환, 또는 출혈에 기인하는 질환의 예방 및/또는 치료하기 위한 방법을 제공한다. 항체 또는 조성물의 투여는, 예를 들면, 상기 방법에 의해 실시할 수 있다.

또한 본 발명은 적어도 본 발명의 항체 또는 조성물을 포함하는, 상기 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 그 키트에는, 그 밖에, 주사통, 주사바늘, 약학적으로 허용되는 매체, 알코올 면포, 반창고, 또는 사용방법을 기재한 지시서 등을 팩키지해 두는 것도 가능하다.

또한 본 발명은 본 발명의 다중특이성 항원 결합 분자 또는 이중특이성 항체, 또는 조성물의, 출혈, 출혈을 수반하는 질환 또는 출혈에 기인하는 질환의 예방 및/또는 치료제의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다.

또한 본 발명은 출혈, 출혈을 수반하는 질환 또는 출혈에 기인하는 질환의 예방 및/또는 치료용의, 본 발명의 다중특이성 항원 결합 분자 또는 이중특이성 항체, 또는 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로써 본 명세서에 포함된다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.

〔실시예 1〕 F.Xa 생산 촉진 활성을 갖는 이중특이성 항체의 제작

WO 2006/109592에서는, F.VIII의 기능을 대체하는 활성을 갖는 이중특이성 항체로서, hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ를 취득하였다. 그러나, 본 항체는, F.IXa가 F.VIIIa를 보조인자로서 F.X를 활성화하는 반응을 저해하는 작용이 있을 가능성이 생각되었다.

도 1에 기재된 바와 같이, F.IX/F.IXa 또는 F.X에 결합하는 항체는, F.IXa와 F.VIIIa의 복합체(Factor Xase(F.Xase)) 형성을 저해, 또는, F.Xase 활성(F.X의 활성화)을 저해할 가능성이 있다. 이하, F.Xase 형성 저해 및/또는 F.Xase 활성 저해작용을, F.Xase 저해작용으로 기재한다. F.Xase 저해작용은, F.VIIIa를 보조인자로 하는 응고반응의 저해로, 환자에게 남아 있는 F.VIII의 기능, 또는, 투여한 F.VIII 제제의 기능을 억제할 가능성이 있다. 그 때문에, 이중특이성 항체의 목적인 F.Xa 생산 촉진 활성이 높은 것이 바람직하나, 또한 F.Xase 저해작용도 낮은 것이 바람직하다. 특히, F.VIII의 기능을 유지하고 있는 환자나 F.VIII 제제에 의한 치료를 받고 있는 환자의 경우는, F.Xa 생산 촉진 활성과 F.Xase 저해작용은, 가능한 한 분리되어 있는 것이 바람직하다.

그러나, F.Xase 저해작용은, 항원(F.IXa 및/또는 F.X)에 결합한다고 하는 항체의 기본적인 성질에 의한 것으로, 한편, F.Xa 생산 촉진 활성을 갖는(F.VIII의 기능을 대체하는) 이중특이성 항체에 있어서도, 항원(F.IXa 및 F.X)에 결합할 필요가 있다. 그 때문에, F.Xase 저해작용을 갖지 않고 F.Xa 생산 촉진 활성을 갖는(F.VIII의 기능을 대체하는) 이중특이성 항체의 취득은, 매우 곤란할 것으로 예상된다. 마찬가지로, 이중특이성 항체에 아미노산 치환을 도입함으로써, F.Xase 저해작용을 저감시키면서, 목적인 F.Xa 생산 촉진 활성을 상승시키는 것은, 매우 곤란할 것으로 예상된다.

본 발명자들은, 당업자 공지의 방법, 즉 항원(인간 F.IXa 또는 인간 F.X)을 면역한 동물의 항체 생산 세포로부터 항체 유전자를 취득하고, 필요에 따라 아미노산 치환을 도입함으로써, 인간 F.IXa 및 인간 F.X에 대한 항체 유전자를 약 200 종류씩 제작하였다. 각 항체 유전자를 동물세포 발현 벡터에 삽입하였다.

항인간 F.IXa 항체 H쇄 발현 벡터, 항인간 F.X 항체 H쇄 발현 벡터 및 공통 항체 L쇄 발현 벡터가 HEK293H 세포 등 포유류세포로 동시에 트랜스펙션됨으로써, 항F.IXa 항체와 항F.X 항체의 조합으로서 4만 이상의 이중특이성 항체를 일과성 발현하였다. 또한, 비교 참조로서, WO 2006/109592에 기재된 이중특이성 항체인 hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ(서열번호：165/166/167)를 조제하였다.

WO 2006/106905 또는 WO 1996/027011에 기재된 변이가 각 H쇄의 CH3 도메인에 도입되어 있기 때문에, 이중특이성 항체가 주로 발현하고 있다고 생각되었다. 세포의 배양상청 중의 항체를, Protein A를 사용하여 당업자 공지의 방법에 의해 정제하였다.

본 발명자들은, 이들 항체의 F.Xa 생산 촉진 활성을 이하의 방법으로 측정하였다. 반응은 모두 실온에서 행해졌다.

0.1% 소혈청 알부민을 포함하는 트리스 완충 생리식염수(이하, TBSB라 칭한다)로 희석한 항체 용액 5 μL를, 27 ng/mL의 Human Factor IXa beta(Enzyme Research Laboratories) 2.5 μL 및 6 IU/mL의 Novact(등록상표) M(화학급 혈청요법 연구소) 2.5 μL와 혼합한 후, 384 웰 플레이트 중에서 실온에서 30분 인큐베이션하였다.

이 혼합액 중의 효소반응은, 24.7 ㎍/mL의 Human Factor X(Enzyme Research Laboratories) 5 μL를 첨가하여 개시시키고, 10분 후, 0.5 M EDTA 5 μL를 첨가하여 정지시켰다. 발색반응은 발색기질 용액 5 μL를 첨가함으로써 개시시켰다. 50분간의 발색반응 후, 405 nm의 흡광도 변화를 SpectraMax 340PC³⁸⁴(Molecular Devices)를 사용해서 측정하였다. F.Xa 생산 촉진 활성은, 항체 첨가 반응액의 흡광도로부터 항체 무첨가 반응액의 흡광도를 뺀 값으로 나타내었다.

Human Factor IXa, Novact(등록상표) M 및 Human Factor X의 용매는 TBCP(93.75 μM 인지질 용액(SYSMEX CO.), 7.5 mM CaCl₂, 1.5 mM MgCl₂를 포함하는 TBSB)였다. 발색기질 용액인 S-2222^TM(CHROMOGENIX)은, 정제수로 1.47 ㎎/mL에 용해하여, 본 어세이에 사용하였다.

본 발명자들은, 항체의 F.Xase 저해작용을 평가하기 위해, F.VIIIa 존재하에 있어서의 F.IXa에 의한 F.X 활성화에 대한 영향을 이하의 방법으로 측정하였다. 반응은 모두 실온에서 행해졌다.

0.1% 소혈청 알부민을 포함하는 트리스 완충 생리식염수(이하, TBSB라 칭한다)로 희석한 항체 용액 5 μL를, 80.9 ng/mL의 Human Factor IXa beta(Enzyme Research Laboratories) 2.5 μL와 혼합한 후, 384 웰 플레이트 중에서 실온에서 30분 인큐베이션하였다.

추가로 1.8 IU/mL의 F.VIIIa(제작방법은 후술) 2.5 μL를 첨가하고, 30초 후, 이 혼합액 중의 효소반응은, 24.7 ㎍/mL의 Human Factor X(Enzyme Research Laboratories) 5 μL를 첨가하여 개시시켰다. 6분 후, 0.5 M EDTA 5 μL를 첨가하여 정지시켰다. 발색반응은 발색기질 용액 5 μL를 첨가함으로써 개시시켰다. 14분간의 발색반응 후, 405 nm의 흡광도 변화를 SpectraMax 340PC³⁸⁴(Molecular Devices)를 사용해서 측정하였다. 항체의 F.Xase 저해작용은, 항체 첨가 반응액의 흡광도로부터 항체 무첨가 반응액의 흡광도를 뺀 값으로 나타내었다.

또한, F.VIIIa는 5.4 IU/mL의 코지네이트(등록상표) FS(바이엘 약품 주식회사)와 1.11 ㎍/mL의 Human alpha Thrombin(Enzyme Research Laboratories)을 1:1의 용량비로 혼합하고, 실온에서 1분간 인큐베이션 후, 혼합액의 반용량인 7.5 U/mL의 Hirudin(Merck KgaA)을 첨가함으로써 조제하였다. 조제한 용액을 1.8 IU/mL의 FVIIIa로 하고, Hirudin을 첨가로부터 1분 후에 어세이에 사용하였다.

Human Factor IXa, Human Factor X, 코지네이트(등록상표) FS, Human alpha Thrombin, Hirudin의 용매는 TBCP(93.75 μM 인지질 용액(SYSMEX CO.), 7.5 mM CaCl₂, 1.5 mM MgCl₂를 포함하는 TBSB)였다. 발색기질 용액인 S-2222^TM(CHROMOGENIX)은, 정제수로 1.47 ㎎/mL에 용해하여, 본 어세이에 사용하였다.

각 이중특이성 항체의 F.Xa 생산 촉진 활성을 도 3, 도 4에, 각 이중특이성 항체의 F.Xase 저해작용을 도 5에 나타내었다. F.Xa 생산 촉진 활성을 상승시키는 다양한 아미노산 치환을 발견하였으나, 예상된 바와 같이 F.Xa 생산 촉진 활성을 상승시키는 아미노산 치환의 대부분이, F.Xase 저해작용도 상승시켜 버려, F.Xase 저해작용을 억제하는 동시에 F.Xa 생산 촉진 활성을 상승시키는 것은 매우 곤란하였다.

그러한 상황하에서, 본원 발명자들은 F.Xa 생산 촉진 활성이 높고 F.Xase 저해작용이 낮은 이중특이성 항체로서, Q1-G4k/J268-G4h/L45-k, Q1-G4k/J321-G4h/L45-k, Q31-z7/J326-z107/L2-k, Q64-z55/J344-z107/L45-k를 얻었다. 또한, 항인간 F.IXa 항체 H쇄로서, Q1-G4k(서열번호：1), Q31-z7(서열번호：2), Q64-z55(서열번호：3), 프로토타입 항인간 F.X 항체 H쇄로서, J268-G4h(서열번호：4), J321-G4h(서열번호：5), J326-z107(서열번호：6), J344-z107(서열번호：7), 프로토타입 공통 항체 L쇄로서, L2-k(서열번호：8), L45-k(서열번호：9)를 취득하였다. 서열명의 하이푼 앞은 가변영역을 나타내고 있고, 하이푼 뒤는 정상영역을 나타내고 있다. 각 이중특이성 항체명은, 트랜스펙션하는 각 사슬의 서열명을 나열함으로써 나타내어진다.

hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ에 가까운 F.Xa 생산 촉진 활성을 가지고 있었던 이중특이성 항체의 대부분은, 예상된 바와 같이 높은 F.Xase 저해작용을 가지고 있었으나, 이들 이중특이성 항체(Q1-G4k/J268-G4h/L45-k, Q1-G4k/J321-G4h/L45-k, Q31-z7/J326-z107/L2-k, Q64-z55/J344-z107/L45-k)는, WO 2006/109592에 기재된 hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ 보다도 높은 F.Xa 생산 촉진 활성을 갖고, 낮은 F.Xase 저해작용을 가지고 있는 것이 발견되었다. 본 발명자들은, 이들 4개의 항체를 프로토타입 항체로 하여, 추가로 F.Xa 생산 촉진 활성을 상승시키고, F.Xase 저해작용을 감약시키는 검토를 행하였다. F.Xa 생산 촉진 활성을 상승시키고, F.Xase 저해작용을 감약시키는 이중특이성 항체의 스크리닝에 대해서 도 2에 나타내었다.

〔실시예 2〕 개변 항체의 제작

본 발명자들은, 변이 도입을 위한 PCR 등의 당업자 공지의 방법에 의해, 프토로 타입 항체의 각 사슬에 대해 실시예 1에서 발견된 F.Xa 생산 촉진 활성 및 F.Xase 저해작용에 영향을 미치는 다양한 아미노산 변이를 조합해서 도입하고, 개변된 사슬의 조합을 대규모로 평가함으로써, 4개의 프로토타입 항체의 F.Xa 생산 촉진 활성을 추가로 상승시키고, F.Xase 저해작용을 감약시키는 아미노산 치환의 스크리닝을 행하였다.

아미노산 치환이 도입된 각 개변 이중특이성 항체는, 프로토타입 항체와 동일한 방법으로 일과성으로 발현되어, 정제되었다. 이들 항체의 F.Xa 생산 촉진 활성을 이하의 방법으로 측정하였다. 반응은 모두 실온에서 행해졌다.

이 혼합액 중의 효소반응은, 24.7 ㎍/mL의 Human Factor X(Enzyme Research Laboratories) 5 μL를 첨가하여 개시시키고, 2분 후, 0.5 M EDTA 5 μL를 첨가하여 정지시켰다. 발색반응은 발색기질 용액 5 μL를 첨가함으로써 개시시켰다. 20분간의 발색반응 후, 405 nm의 흡광도 변화는 SpectraMax 340PC³⁸⁴(Molecular Devices)를 사용해서 측정하였다. F.Xa 생산 촉진 활성은, 항체 첨가 반응액의 흡광도로부터 항체 무첨가 반응액의 흡광도를 뺀 값으로 나타내었다.

Human Factor IXa, Novact(등록상표) M 및 Human Factor X의 용매는 TBCP(93.75 μM 인지질 용액(SYSMEX CO.)), 7.5 mM CaCl₂, 1.5 mM MgCl₂를 포함하는 TBSB)였다. 발색기질 용액인 S-2222^TM(CHROMOGENIX)은, 정제수로 1.47 ㎎/mL에 용해해서 사용하였다.

이미 기재한 방법으로, 항체의 F.Xase 저해작용도 평가하였다.

각 개변 이중특이성 항체의 F.Xa 생산 촉진 활성을 도 4에, 각 이중특이성 항체의 F.Xase 저해작용을 도 5에 기재하였다.

본원 발명자들은 F.Xa 생산 촉진 활성이 높고 F.Xase 저해작용이 낮은 이중특이성 항체로서, Q85-G4k/J268-G4h/L406-k, Q85-G4k/J321-G4h/L334-k, Q64-z7/J344-z107/L406-k, Q64-z7/J326-z107/L334-k를 얻었다. 또한, 항인간 F.IXa 항체 H쇄로서, Q64-z7(서열번호：10), Q85-G4k(서열번호：11), F.Xa 생산 촉진 활성이 상승된 공통 항체 L쇄로서, L334-k(서열번호：30), L406-k(서열번호：33)를 발견하였다. Q85-G4k/J268-G4h/L406-k, Q85-G4k/J321-G4h/L334-k, Q64-z7/J344-z107/L406-k, Q64-z7/J326-z107/L334-k는, F.Xase 저해작용이 약간 상승하고 있지만, F.Xa 생산 촉진 활성은 크게 상승하였다. 이들 개변 항체는, F.Xase 저해작용의 상승에 비해 F.Xa 생산 촉진 활성이 매우 큰 것으로부터, 프로토타입 항체 보다도 F.Xa 생산 촉진 활성과 F.Xase 저해작용을 추가로 분리할 수 있었다. 이와 같이, F.Xase 저해작용을 억제하는 동시에 F.Xa 생산 촉진 활성을 상승시키는 조합을 발견하였다.

이중특이성 항체에 의해 F.VIII의 기능을 대체하기 위해서는, 발견된 프로토타입 항체의 F.Xa 생산 촉진 활성은 보다 높은 것이 바람직한 한편으로, F.VIII의 기능을 유지하고 있는 환자나 F.VIII 제제에 의한 치료를 받고 있는 환자에 대해서도 임상에서 사용하기 위해서는, F.Xase 저해작용은 보다 낮은 것이 바람직할 것으로 생각되었다. 그 때문에, 추가로 개변을 행하여, F.Xase 저해작용을 상승시키지 않고, F.Xa 생산 촉진 활성을 추가로 상승시킨 이중특이성 항체의 제작을 행하였다.

그 결과, F.Xa 생산 촉진 활성이 높고 F.Xase 저해작용이 낮은 이중특이성 항체로서, Q153-G4k/J232-G4h/L406-k, Q354-z106/J259-z107/L324-k, Q360-G4k/J232-G4h/L406-k, Q360-z118/J300-z107/L334-k, Q405-G4k/J232-G4h/L248-k, Q458-z106/J346-z107/L408-k, Q460-z121/J327-z119/L334-k, Q499-z118/J327-z107/L334-k, Q499-z118/J327-z107/L377-k, Q499-z118/J346-z107/L248-k, Q499-z121/J327-z119/L404-k, Q499-z121/J339-z119/L377-k, Q153-G4k/J142-G4h/L180-k를 얻었다. 또한 항인간 F.IXa 항체 H쇄로서, Q153-G4k(서열번호：12), Q354-z106(서열번호：13), Q360-G4k(서열번호：14), Q360-z118(서열번호：15), Q405-G4k(서열번호：16), Q458-z106(서열번호：17), Q460-z121(서열번호：18), Q499-z118(서열번호：19), Q499-z121(서열번호：20), F.Xa 생산 촉진 활성이 상승한 항인간 F.X 항체 H쇄로서, J232-G4h(서열번호：21), J259-z107(서열번호：22), J300-z107(서열번호：23), J327-z107(서열번호：24), J327-z119(서열번호：25), J339-z119(서열번호：26), J346-z107(서열번호：27), J142-G4h(서열번호：170), 공통 항체 L쇄로서 L248-k(서열번호：28), L324-k(서열번호：29), L377-k(서열번호：31), L404-k(서열번호：32), L408-k(서열번호：34), L180-k(서열번호：171)를 발견하였다.

이들 항체는, F.Xa 생산 촉진 활성이 매우 높은 한편으로, F.Xase 저해작용은 억제되어 있는 것으로부터, F.VIII의 기능을 유지하고 있는 환자나 F.VIII 제제에 의한 치료를 받고 있는 환자에 대해서도 매우 유용한 성질을 가지고 있는 것으로 생각된다. 항체는 일반적으로 반감기가 길고, 피하투여가 가능한 것으로부터, 이들 이중특이성 항체는, 혈우병 A에 있어서의 기존의 FVIII 제제의 정맥내 투여에 의한 정기 보충 요법과 비교하여, 높은 가치를 혈우병 A 환자에게 부여하는 것이 가능할 것으로 생각된다.

실시예 1 및 실시예 2에서 사용한 각 사슬의 가변영역의 서열 비교를 도 6a~6d에 나타내었다. 이중특이성 항체의 F.Xa 생산 촉진 활성을 향상시키기 위해서는, 예를 들면 이하의 아미노산이 중요한 것이 명확해졌다. 항인간 F.IXa 항체 H쇄에 있어서의 34번 위치의 이소류신, 35번 위치의 아스파라긴 또는 글루타민 또는 세린, 49번 위치의 세린, 61번 위치의 아르기닌, 62번 위치의 글루타민산, 96번 위치의 세린 또는 트레오닌, 98번 위치의 리신 또는 아르기닌, 99번 위치의 세린 또는 글루타민산, 100번 위치의 페닐알라닌 또는 티로신, 100b번 위치의 글리신, 102번 위치의 티로신 등. 항인간 F.X 항체 H쇄에 있어서의 35번 위치의 아스파라긴산, 53번 위치의 아르기닌, 73번 위치의 리신, 76번 위치의 글리신, 96번 위치의 리신 또는 아르기닌, 98번 위치의 티로신, 100번 위치의 티로신, 100a번 위치의 히스티딘 등. 공통 항체 L쇄에 있어서의 27번 위치의 리신 또는 아르기닌, 30번 위치의 글루타민산, 31번 위치의 아르기닌, 32번 위치의 글루타민, 50번 위치의 아르기닌 또는 글루타민, 52번 위치의 세린, 53번 위치의 아르기닌, 54번 위치의 리신, 55번 위치의 글루타민산, 92번 위치의 세린, 93번 위치의 세린, 94번 위치의 프롤린, 95번 위치의 프롤린 등(가변영역의 아미노산 번호는 Kabat 넘버링(Kabat EA et al． 1991． Sequences of Proteins of Immunological Interest．NIH)에 따른다).

서열목록 전자파일 첨부

Claims

제1 항체 H쇄가 하기 (a10)의 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 부위를 포함하고, 제2 항체 H쇄가 하기 (b7)의 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 부위를 포함하며, 제1 및 제2 항체 L쇄가 각각 하기 (c5)의 아미노산 서열로 이루어지는 L쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 부위를 포함하고,
혈액응고 제IX 인자, 활성화 혈액응고 제IX 인자, 및 혈액응고 제IX 인자 및 활성화 혈액응고 제IX 인자; 및 혈액응고 제X 인자를 인식하는 이중특이성 항체로서,
제1 및 제2 항체 L쇄는 제1 항체 H쇄 및 제2 항체 H쇄와 각각 짝이 되는 이중특이성 항체:
(a10) 서열번호 : 102, 103, 104(Q460의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위;
(b7) 서열번호：126, 127, 128(J327의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위; 및
(c5) 서열번호：150, 151, 152(L334의 L쇄 CDR)에 기재된 L쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위.
제1항에 있어서,
제1 항체 H쇄가 하기 (a10)의 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 가변영역을 포함하는 항원 결합 부위를 포함하고, 제2 항체 H쇄가 하기 (b7)의 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 가변영역을 포함하는 항원 결합 부위를 포함하며, 제1 및 제2 항체 L쇄가 각각 하기 (c5)의 아미노산 서열로 이루어지는 L쇄 가변영역을 포함하는 항원 결합 부위를 포함하는, 이중특이성 항체:
(a10) 서열번호：44(Q460의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위;
(b7) 서열번호：52(J327의 H쇄 가변영역)에 기재된 H쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위; 및
(c5) 서열번호：60(L334의 L쇄 가변영역)에 기재된 L쇄 가변영역의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 부위.
제2항에 있어서,
제1 항체 H쇄가 하기 (d6) 또는 (d9)의 아미노산 서열로 이루어지는 항체의 H쇄 정상영역을 포함하고, 제2 항체 H쇄가 하기 (d6) 또는 (d9)의 아미노산 서열로서, 상기 제1 항체 H쇄와는 상이한 아미노산 서열로 이루어지는 항체의 H쇄 정상영역을 포함하며, 제1 및 제2 항체 L쇄가 각각 하기 (e)의 아미노산 서열로 이루어지는 항체 L쇄 정상영역을 포함하는, 이중특이성 항체:
(d6) 서열번호：70(z121)에 기재된 H쇄 정상영역;
(d9) 서열번호：73(z119)에 기재된 H쇄 정상영역; 및
(e) 서열번호：74(k)에 기재된 L쇄 정상영역.
제3항에 있어서,
제1 항체 H쇄가 하기 (a12)의 항체 H쇄를 포함하고, 제2 항체 H쇄가 하기 (b9)의 항체 H쇄를 포함하며, 제1 및 제2 항체 L쇄가 각각 하기 (c5)의 항체 L쇄를 포함하는, 이중특이성 항체:
(a12) 서열번호：18(Q460-z121)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄;
(b9) 서열번호：25(J327-z119)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 H쇄; 및
(c5) 서열번호：30(L334-k)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 항체 L쇄.
제1항에 있어서,
제1 및 제2 항체 L쇄가 공통 L쇄인, 이중특이성 항체.
제2항에 있어서,
제1 및 제2 항체 L쇄가 공통 L쇄인, 이중특이성 항체.
제3항에 있어서,
제1 및 제2 항체 L쇄가 공통 L쇄인, 이중특이성 항체.
제4항에 있어서,
제1 및 제2 항체 L쇄가 공통 L쇄인, 이중특이성 항체.
이하의 (o)에 기재된 이중특이성 항체로서, 제1 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드가 회합하고, 제2 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 회합하는 이중특이성 항체：
(o) 제1 폴리펩티드가 서열번호：18에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제2 폴리펩티드가 서열번호：25에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄 및 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 서열번호：30에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중특이성 항체(Q460-z121/J327-z119/L334-k).
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 이중특이성 항체를 코드하는 핵산.
제10항에 기재된 핵산이 삽입된 벡터.
제10항에 기재된 핵산, 또는 상기 핵산이 삽입된 벡터를 포함하는 세포.
제12항에 기재된 세포를 배양함으로써, 이중특이성 항체를 제조하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 이중특이성 항체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 혈우병 A, 후천성 혈우병, 또는 폰 빌레브란트병의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 의약 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 이중특이성 항체를 포함하는, 혈우병 A, 후천성 혈우병, 또는 폰 빌레브란트병의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료하는 방법에 사용하기 위한 키트.
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