JPH05304992A - ハイブリッド・モノクローナル抗体および抗体含有薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】血栓溶解剤としての組織プラスミノーゲンアク
チベーター（ｔＰＡ）の血中半減期を延長及びｔＰＡム
テインの血栓への選択性の低下を改善し、またこれら血
栓溶解剤の副作用を抑える。 【構成】二重特異性の一方が血栓に対し、他方がＦ、Ｅ
およびＫ１ドメインを欠失してなるｔＰＡ、例えばｔＰ
Ａ−６’に対する二重特異性モノクローナル抗体、およ
び該二重特異性モノクローナル抗体に、Ｆ、ＥおよびＫ
１ドメインを欠失してなるｔＰＡムテインを免疫結合さ
せてなる血栓溶解剤。 【効果】血栓溶解能、血栓への選択性が増し、一方、フ
ィブリノーゲンに対する反応性も少ないのでフィブリノ
ーゲン分解能が高まるといった副作用もない血栓溶解剤
が得られた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、二重特異性を有するハ
イブリッド・モノクローナル抗体（以下、ＭｏＡｂと略
記することがある）に関する。さらに詳しくは、二重特
異性の一方が血栓に対するものであり、他方がＦ、Ｅお
よびＫ１ドメインを欠失してなるｔＰＡムテインに対す
るものである二重特異性モノクローナル抗体（以下、ｂ
ｓＭｏＡｂと略記することがある）に関する。本発明は
また、上記のｂｓＭｏＡｂに、Ｆ、ＥおよびＫ１ドメイ
ンを欠失してなるｔＰＡムテインを免疫結合させてなる
血栓溶解剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】心筋梗塞、動脈塞栓症あるいは脳梗塞な
どの血栓性患者には広く血栓溶解療法が用いられ、スト
レプトキナーゼ（以下、ＳＫと略記することがある）や
ウロキナーゼ（以下、ＵＫと略記することがある）など
が臨床応用されている。最近では、血栓への選択性が高
く、従って出血傾向の副作用を軽減すると云われている
ティッシュ・プラスミノーゲン・アクチベータ（以下、
ｔＰＡと略記することがある）やプロウロキナーゼ（以
下、ＰｒｏＵＫと略記することがある）が登場し、上記
のＳＫやＵＫに代わろうとしている。さらに、より効率
の高い、かつ血栓選択性に優れた血栓溶解剤として修飾
型ｔＰＡなども開発されてきた。また一方で、抗体ター
ゲティングを利用した血栓溶解剤も登場し［C.Bodeら：
サイエンス（Science), 229, 765 (1985)；M. S. Runge
ら：プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・サイエンス ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA), 84, 7659 (1987) ；T. Kurokawaら：バイオテ
クノロジー（Bio/Technology), 7, 1163 (1989)：ヨー
ロッパ特許出願第0363712公開公報参照〕、血栓を形成
するフィブリンや活性化血小板に高い親和性を有する抗
体を利用して、血栓溶解作用物質単独に比べて数倍から
数十倍効率の高い血栓溶解剤も作製されるようになっ
た。特に血栓と血栓溶解作用物質との両者に免疫結合で
きるｂｓＭｏＡｂは、抗体活性および血栓溶解活性の低
下を伴わない、きわめて効率的な血栓溶解剤を提供して
いる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、新しい
世代の血栓溶解剤として登場したｔＰＡなどについて
も、半減期が非常に短いためその多量を長時間にわたっ
て投与しなければならないという制約があり、このため
出血傾向の副作用をしばしば伴うことが報告されてい
る。このため半減期を延長させるべく、あるいは血中に
存在するインヒビターによる阻害を受けないタイプのｔ
ＰＡムテインが作製された。しかし、このようなｔＰＡ
ムテインは一般的に元の非修飾型ｔＰＡに比べてフィブ
リン親和能が小さいため血栓への選択性が低下したり、
あるいは酵素活性そのものが低下することが分ってい
る。また抗体ターゲティング化血栓溶解剤については血
栓溶解作用物質の血栓溶解能を増強させるだけでなく、
その血中半減期をも延長させる効果を有しているが、同
時に血栓溶解剤のもつ副作用［フィブリノーゲン分解能
およびα₂−アンチプラスミン（以下、α₂−ＡＰと略記
することがある）消費能］を増大させることはある程度
避けられないことが分かっている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記のｔ
ＰＡムテインで見られた血栓親和能の低下や、あるいは
抗体ターゲティング化血栓溶解剤で見られた副作用の増
大という問題点を解決するため種々の検討を重ね、ｔＰ
ＡムテインをｂｓＭｏＡｂに免疫結合させ、血栓へのタ
ーゲティングを実施することにより、血中半減期の延
長、血栓親和能の増大、さらには副作用の軽減をもたら
し得ることを見出した。すなわち、本発明は二重特異性
の一方が血栓に対するものであり、他方がＦ、Ｅおよび
Ｋ₁ドメインを欠失するｔＰＡムテインに対するもので
あるｂｓＭｏＡｂであり、さらにはこのｂｓＭｏＡｂに
該ｔＰＡムテインを免疫結合させてなる血栓溶解剤を提
供するものである。本発明の二重特異性抗体は、血栓が
フィブリンあるいは活性化血小板であるものに結合でき
るものであり、また該抗体は少なくとも可変領域を含有
し、かつ重鎖定常領域ドメイン２および３を欠失したも
のであることができる。

【０００５】ｔＰＡムテインについて説明すると、ｔＰ
Ａは図１に示すようにＦＩＮＧＥＲ（Ｆ），ＥＧＦ
（Ｅ），ＫＲＩＮＧＬＥ１（Ｋ１），ＫＲＩＮＧＬＥ２
（Ｋ２）およびＰＲＯＴＥＡＳＥ（Ｐ）部分から構成さ
れている。上記ｔＰＡムテインとしてはＥ，Ｆ，Ｋ１部
分が欠失した後述の参考例１６に記載のｔＰＡ−１や、
その内のＰ部分のＲ²⁹⁸’²⁹⁹がＥ²⁹⁸’²⁹⁹に置換された
後述の参考例１９に記載のｔＰＡ−６’等が挙げられ
る。また抗体分子は図２に示すように、抗原との結合に
関わる可変（Ｖ）領域と、抗原結合には関与しないが、
他の生物学的機能、例えば補体との結合あるいは抗体レ
セプターとの結合に関与する定常（Ｃ）領域とがある。
抗原結合に関わる機能のみを必要とする場合には可変領
域のみで構成される分子で十分であり、最近の遺伝子組
換え型抗体の中にはこのような分子も作製されている。
古くから採用されている方法は、抗体分子をパパインあ
るいはペプシンのような消化酵素を用いて限定的な部分
加水分解処理に供し、図２に示した個所でペプチドを切
断し重（Ｈ）鎖定常領域ドメイン２および３（以下それ
ぞれＣＨ₂およびＣＨ₃と略記することがある）を欠失し
たＦａｂあるいはＦａｂ’を作製する方法である。この
ようにして得られた抗体断片は幾つかの抗体機能を失う
が、少なくとも抗原結合能はほぼ１００％保持されてい
るのが通例であり、本発明においてもこのような断片を
用いることができる。

【０００６】本発明で用いられる、ｔＰＡムテインとし
て、Ｆ、Ｅ、Ｋ１の全ドメインを欠失し、Ｋ２、プロテ
アーゼ（Ｐ）の両ドメインからなるｔＰＡムテイン（ア
ミノ酸残基番号174-527、ただし174〜179の一部ないし
は全部のアミノ酸残基を欠失してもよい）、および該ｔ
ＰＡムテインの更なるムテインが挙げられる（以下、両
者をあわせてＦＥＫ１欠失ｔＰＡムテインと略記するこ
とがある）。また、この更なるムテインとしては、本
来、元のペプチドあるいは蛋白質のアミノ酸配列が変異
したものが挙げられ、したがって該変異としては、構成
アミノ酸の欠損、他のアミノ酸への置換が挙げられる。
該構成アミノ酸の欠損としては、ＦＥＫ１欠失ｔＰＡム
テイン構成アミノ酸の少なくとも１個が欠損しているも
のが挙げられる。該他のアミノ酸への置換としては、Ｆ
ＥＫｌ欠失ｔＰＡムテイン構成アミノ酸の少なくとも１
個が別のアミノ酸で置換されているものが挙げられる。
少なくとも１個の構成アミノ酸が欠損しているＦＥＫ１
欠失ｔＰＡムテインにおいて欠損している構成アミノ酸
の数としては、ＦＥＫ１欠失ｔＰＡムテインの有する特
徴を失わない限り何個でもよい。該欠損している構成ア
ミノ酸の例としては、ｔＰＡのアミノ酸残基番号296か
ら302のアミノ酸残基などが挙げられる。

【０００７】少なくとも１個の構成アミノ酸が別のアミ
ノ酸で置換されているＦＥＫ１欠失ｔＰＡムテインにお
いて置換されるアミノ酸の数としては、ＦＥＫ１欠失ｔ
ＰＡムテインの特徴を失わない限り何個でもよい。置換
されるアミノ酸部位としては、アミノ酸残基番号296か
ら304の間のアミノ酸残基の一部ないし全部を別のアミ
ノ酸残基に置換してなるものや、アミノ酸残基番号296
から302の領域の一部ないし全部を欠失させ、かつアミ
ノ酸残基番号296から304の領域の一部のアミノ酸残基を
別のアミノ酸残基に置換してなるものがその例として挙
げられる。置換される前の構成アミノ酸の例としては、
例えばシステイン、アスパラギン酸、アルギニンなどが
挙げられる。置換される前の構成アミノ酸がシステイン
である場合には、置換されたアミノ酸としては、たとえ
ば中性アミノ酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例と
しては、たとえば、グリシン、バリン、アラニン、ロイ
シン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒ
スチジン、トリプトファン、セリン、スレオニン、メチ
オニンなどが挙げられる。特に、セリン、スレオニンが
好ましい。

【０００８】置換される前の構成アミノ酸がシステイン
以外のものである場合には、置換された別のアミノ酸と
しては、たとえば、アミノ酸の親水性、疎水性あるいは
電荷の点で、置換される前のアミノ酸とは異なる性質を
もつものを選ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸が
アスパラギン酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸
としてアスパラギン、スレオニン、バリン、フェニルア
ラニン、アルギニンなどが挙げられるが、特にアスパラ
ギン、アルギニンが好ましい。置換される前のアミノ酸
がアルギニンの場合には置換されたあとのアミノ酸とし
てグルタミン、グルタミン酸、スレオニン、ロイシン、
フェニルアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸が挙
げられるが、特にグルタミン酸あるいはヒスチジンが好
ましい。置換される前のアミノ酸がグルタミン酸の場合
には、置換された後のアミノ酸としてチロシンが好まし
い。本発明のムテインは、上記した欠損、置換が組み合
わさったものでもよい。

【０００９】本発明のムテインを製造するためには、従
来の組換えＤＮＡ技術に加え、特定部位指向性変異誘発
技術（Site-directed mutagenesis）が採用される。該
技術は周知であり、アール・エフ・レイサー（Lather,
R. F.)及びジェイ・ピー・レコック（Lecoq, J. P.)、
ジェネティック・エンジニアリング（Genetic Engineer
ing)、アカデミックプレス社（1983年）第31-50頁、に
示されている。オリゴヌクレオチドに指示された変異誘
発はエム・スミス(Smith, M.)及びエス・ギラム(Gillam,
S.)、ジェネティック・エンジニアリング:原理と方
法、プレナムプレス社(1981年）３巻 1-32頁に示されて
いる。

【００１０】本発明のムテインをコードする構造遺伝子
を製造するためには、たとえば、（１）ｔＰＡの構造遺
伝子の１本鎖からなる１本鎖ＤＮＡを突然変異オリゴヌ
クレオチドプライマーと雑種形成させる、（２）ＤＮＡ
ポリメラーゼによりプライマーを伸長させ、突然変異性
ヘテロ二量体（heteroduplex）を形成させる、及び
（３）この突然変異性ヘテロ二量体を複製する、といっ
た方法がある。

【００１１】本発明で用いられる抗フィブリン抗体産生
ハイブリドーマの作製にあたっては、該ハイブリドーマ
がフィブリンに特異的で実質的にフィブリノーゲンと結
合しないＭoＡbを産生するものであればいずれのもので
もよい。例えばかかるフィブリン特異抗体は、フィブリ
ノーゲンが分解されて生ずるフィブリンの、α鎖Ｎ末端
フラグメントペプチドあるいはβ鎖Ｎ末端フラグメント
ペプチドを免疫原として用いることにより作製される
〔K. Y. Huiら:サイエンス（Science), 222, 1129（198
3);特開昭６３−９３８００号公報〕。また、フィブリ
ンは哺乳動物のものであればいずれでもよいが、好まし
くはヒト・フィブリンが挙げられ、とりわけヒト・フィ
ブリンのβ鎖Ｎ末端部に相当するペプチドが用いられ
る。これにキャリア蛋白を結合させて、動物(例、ウサ
ギ、ラット、マウス、モルモットなど)を免疫し抗体産
生細胞を得る。次いで免疫動物より採取したこれらの抗
体産生細胞、例えば脾臓細胞やリンパ節細胞などを骨髄
腫細胞と融合し、得られるハイブリドーマの中から実質
的にフィブリノーゲンに反応せずフィブリンに特異的に
結合する抗体産生細胞をスクリーニングする。上記のヒ
ト・フィブリンβ鎖Ｎ末端ペプチドとして、次のごとき
アミノ酸配列を有するものが特に好ましく用いられる。 H-Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-R-Cys-OH 〔式中、RはLys-Arg-Glu-Gluで示されるペプチド又はそ
の一部を示す〕〔配列番号１〕。Ｃ末端のＣysはキャリ
ア蛋白との化学結合用のリンカー部に用いられる。すな
わちキャリア蛋白を予め、例えばＮ−（γ−マレイミド
ブチリルオキシサクシニミド）（以下、ＧＭＢＳと略記
することがある）でマレイミド化あるいはＮ−サクシニ
ミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
（以下、ＳＰＤＰと略記することがある）でジチオピリ
ジル化することにより、上記ペプチドのＣ末端ＣysのＳ
Ｈ基を介してキャリア蛋白に化学結合させることが可能
である。

【００１２】さらにフィブリン特異性を確実なものとす
るために、T. Hamaokaらが報告したＤ−グルタミン酸と
Ｄ−リジンの共重合体（以下、Ｄ−ＧＬと略記すること
がある）を用いて、フィブリン抗原免疫動物にフィブリ
ノーゲン寛容状態を惹起させ、フィブリン特異抗体産生
細胞をより高頻度で得る方法も好ましく用いられる。
〔T. Hamaokaら：ジャーナル・オブ・エクスプリメンタ
ル・メディシン（J. Exp. Med.〕,139, 1446（1974）；
K. Tateishi ら：ジャーナル・オブ・イムノロジカル・
メソッズ（J. Immunol. Methods), 47, 249 (1981)〕。
この方法では、免疫原として例えば上記のヒト・フィブ
リンβ鎖Ｎ末端ペプチドにキャリア蛋白を結合させたも
のが、寛容原として例えば次のごときアミノ酸配列を有
するペプチドにＤ−ＧＬを結合させたものが用いられ
る。 Ｈ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−
Ｒ−ＯＨ 〔式中ＲはＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕで示される
ペプチド又はその一部を示す〕〔配列番号２〕。

【００１３】また本発明で用いられる抗活性化血小板Ｍ
oＡb産生ハイブリドーマの作製にあたっては、該ハイブ
リドーマが活性化血小板に特異的でかつ実質的に非刺激
血小板と結合しないＭoＡbを産生するものであれば、い
ずれのものでもよい。例えばかかる活性化血小板特異Ｍ
oＡbはトロンビンで活性化された血小板（好ましくはヒ
ト血小板）を免疫原として用いることにより作製される
〔C. L. Bermanら：ジャーナル・オブ・クリニカル・イ
ンベスティゲーション（J. Clin. Invest.）,78, 130
(1986)；N. Akamatsuら：スロンボーシス・アンド・ヘ
モスターシス（Thromb. Haemostasis), 62, 250 (198
9)〕。また、用いる血小板は哺乳動物のものであればい
ずれでもよいが、好ましくはヒト血小板が挙げられる。
この活性化血小板を動物（例、ウサギ、ラット、マウ
ス、モルモットなど）に免疫し抗体産生細胞を得、次い
で免疫動物より採取したこれらの抗体産生細胞、例えば
脾臓細胞やリンパ節細胞などを骨髄腫細胞と融合する。
得られるハイブリドーマの中から実質的に非刺激血小板
に反応せず活性化血小板に特異的に結合する抗体産生細
胞をスクリーニングすることによって、目的とする抗活
性化血小板ＭoＡb産生ハイブリドーマを取得することが
できる。さらにまた本発明における抗ｔＰＡムテインＭ
oＡb産生ハイブリドーマの作製については、前述したｔ
ＰＡムテイン、あるいは元の非修飾型のｔＰＡそのもの
を常法に従い動物に免疫し、得られる抗体産生細胞を骨
髄腫細胞などと融合させる方法が用いられる。動物を免
疫し、得られる抗体産生細胞を骨髄腫細胞などと融合さ
せ、抗体産生ハイブリドーマを得る方法については、抗
フィブリン抗体産生ハイブリドーマあるいは抗活性化血
小板抗体産生ハイブリドーマを得る方法と同様な操作が
用いられる。

【００１４】免疫動物としては、例えばウサギ、ラッ
ト、マウス、モルモットなどが用いられるが、ＭoＡb製
造の場合にはマウスが特に好ましく用いられる。接種方
法としては、通常実施される方法に従えばよく、例えば
活性化血小板に特異的な抗体を作製する場合にはマウス
に１回１０⁸〜１０¹⁰個、好ましくは０．５〜２×１０⁹
個の洗浄ヒト血小板を生理食塩水、ヘペス緩衝液あるい
はリン酸食塩緩衝液（以下、ＰＢＳと略記することがあ
る）に懸濁して、トロンビンで活性化後腹腔内に１０〜
１４日毎に３〜８回接種する方法がとられる。ヒトフィ
ブリンやｔＰＡムテインに特異的な抗体を作製する場合
には、マウスに１回１〜１００μg、好ましくは１０〜
２５μgの抗原蛋白質を等容量（０.１ml）の生理食塩水
およびフロイントの完全アジュバンドで乳化して、背
部、腹部の皮下あるいは腹腔内に２〜３週毎に３〜６回
接種する方法がとられる。これらの免疫動物、例えばマ
ウスから抗体価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日後
に脾臓およびあるいはリンパ節を採取し、それらに含ま
れる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させる。融合操作
は既知の方法に従い実施でき、融合促進剤としてはポリ
エチレングリコール（以下、ＰＥＧと略記することがあ
る）やセンダイ・ウィルスなどが挙げられるが、好まし
くはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞としてはＮＳ−
１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０など、特にＮＳ−１やＰ３Ｕ
１が好ましく用いられる。例えば脾臓細胞と骨髄腫細胞
との好ましい比率は１：１〜１０：１で、これに分子量
１，０００〜９，０００のＰＥＧが１０〜８０％の濃度
で添加され、２０〜３７℃、好ましくは３０〜３７℃で
３〜１０分インキュベートするのが良い。

【００１５】抗フィブリン抗体産生ハイブリドーマのス
クリーニングには種々の方法が使用できる。例えば、マ
イクロプレートにフィブリノーゲンを吸着させたのち、
トロンビンを作用させフィブリノーゲンをフィブリンに
変換する。次いで過剰のフィブリノーゲン存在下でハイ
ブリドーマ培養上清をフィブリン固定マイクロプレート
に添加し、プレートに結合した抗フィブリン特異抗体を
検出する酵素免疫測定法（以下、ＥＩＡと略記すること
がある）により培養上清中の抗体価を測定する。ＨＡＴ
（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）添加培
地で選別、育種された抗体活性陽性のハイブリドーマは
直ちにクローニングに供されるが、通常これは限界希釈
法などで容易に実施される。クローン化されたハイブリ
ドーマ培養上清の抗体価を上記の方法で測定し、安定的
に力価の高い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、
目的とするモノクローナルな抗フィブリン特異抗体産生
ハイブリドーマを取得することができる。以上のような
製造法に従って、作製した抗フィブリン抗体産生ハイブ
リドーマの例として、後述の参考例８および実施例１に
示したＦＩＢ１−１１，ＦＩＢ２−１１およびＦＴＢ２
−１３３が挙げられる。抗活性化血小板ＭoＡb産生ハイ
ブリドーマのスクリーニングについても種々の方法が使
用できる。例えば、マイクロプレートに非刺激血小板あ
るいはトロンビン活性化血小板を結合させ、１％ホルマ
リンで固定化して固相抗原として使用する。これにハイ
ブリドーマ培養上清を添加し、プレートに結合した抗活
性化血小板抗体を酵素標識第２抗体で検出するＥＩＡに
より培養上清中の抗体価を測定し、非刺激および活性化
血小板との結合の差の大きなものを選択する。例えば、
ＨＡＴ添加培地で選別、育種された抗体活性陽性のハイ
ブリドーマは直ちにクローニングに供されるが、通常こ
れは限界希釈法などで容易に実施される。クローン化さ
れたハイブリドーマ培養上清の抗体価を上記の方法で測
定し、安定的に力価の高い抗体を産生するハイブリドー
マを選択し、目的とするモノクローナルな抗活性化血小
板特異抗体産生ハイブリドーマを取得することができ
る。以上のような製造法に従って作製した抗活性化血小
板ＭoＡb産生ハイブリドーマの例として、後述の参考例
９に示したマウス・ハイブリドーマ２Ｔ６０が挙げられ
る。

【００１６】またｔＰＡムテインに対するＭoＡbを産生
するハイブリドーマのスクリーニングは、ｔＰＡムテイ
ンあるいは非修飾型ｔＰＡを吸着させたマイクロプレー
トを用いるＥＩＡで簡便に実施できる。クローニングも
上記した常法に従って実施し、目的の抗ｔＰＡムテイン
ＭoＡb産生ハイブリドーマを取得できる。以上のような
製造法に従って作製した抗ｔＰＡムテインＭoＡb産生ハ
イブリドーマの例として、後述の参考例１０に示したマ
ウス・ハイブリドーマＴＰＡ１−４１が挙げられる。

【００１７】本発明の二重特異性を有するハイブリッド
ＭoＡbを産生するポリドーマの作製には幾つかの手法が
あり〔例、新本洋士ら：蛋白質・核酸・酵素，33, 217
(1988）など〕、いずれの方法を用いてもよいが例え
ば、上記のＨＡＴ抵抗性の抗ｔＰＡムテイン抗体産生
ハイブリドーマを、５−ブロモデオキシウリジン（以
下、ＢrdＵと略記することがある）添加の培養液に段階
的に馴化させ、チミジンキナーゼ欠損株をクローン化し
ＨＡＴ感受性とする。同様にＨＡＴ抵抗性の抗フィブリ
ンあるいは抗活性化血小板特異抗体産生ハイブリドーマ
を８−アザグアニン（以下、ＡＺＧと略記することがあ
る）耐性とし、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボ
シルトランスフェラーゼ欠損株をクローン化しＨＡＴ感
受性とする。次いで常法に従い両者を融合して得られる
テトラオーマをＨＡＴ添加培地で選別後、血栓およびｔ
ＰＡムテインの両者に結合能を有するハイブリッドＭo
Ａbを分泌するテトラオーマをクローン化する、抗フ
ィブリンあるいは抗活性化血小板特異抗体産生ハイブリ
ドーマをフルオレセイン・イソチオシアネート（以下、
ＦＩＴＣと略記することがある）で標識し、もう一方の
抗ｔＰＡムテイン抗体産生ハイブリドーマをテトラメチ
ル・ロダミン・イソチオシアネート（以下、ＴＲＩＴＣ
と略記することがある）で標識後、常法に従い両者を融
合する。得られた細胞懸濁液をフルオレセイン・アクテ
ィベイティッド・セルソーター（以下、ＦＡＣＳと略記
することがある）に供し、ＦＩＴＣの緑色およびＴＲＩ
ＴＣの赤色の蛍光を同時に有するテトラオーマを選別・
クローン化するなどの方法が挙げられる。また両親株の
マーカーを全く逆にして使用し、テトラオーマを選別・
クローン化することも可能である、ｔＰＡムテインを
免疫したマウスより脾臓細胞を採取し、一方でＨＡＴ感
受性とした抗フィブリンあるいは抗活性化血小板ＭoＡb
産生ハイブリドーマとこの脾臓細胞とを融合させ、ＨＡ
Ｔ添加培地で選別しトリオーマを作成する。次いで血栓
およびｔＰＡムテインの両者に結合能を有するハイブリ
ッドＭoＡbを分泌するトリオーマをクローン化する、な
どの方法がある。

【００１８】これらの操作における細胞融合に当っては
センダイウイルス、ＰＥＧなどの融合促進剤やあるいは
電気刺激などの方法が用いられる。好ましくはＰＥＧが
用いられ、以下にその一例を挙げるが、もちろんこの方
法に限定されるものではない。すなわち、分子量約１，
０００〜９，０００、濃度約１０〜８０％等のＰＥＧが
用いられ、処理時間は約０．５〜３０分であるが、好ま
しい条件の一例として、約３５〜５５％のＰＥＧ６，０
００を約４〜１０分間、３７℃で細胞と接触させ、効率
よく融合させることができる。ポリドーマの選択は、上
記のＨＡＴ添加培地などで実施できるが、このため８−
ＡＺＧ、６−チオグアニン（６−ＴＧ）あるいは５−Ｂ
rdＵなどの薬剤馴化法により、それぞれの薬物耐性株が
取得される。また新しいマーカーの融合細胞への導入に
より、種々の選択培地が用いられる。このような例とし
て、ネオマイシンやハイグロマイシンＢ添加培地などが
挙げられる〔B. Sugdenら:モレキュラー・アンド・セル
ラー・バイオロジー（Mol. Cell. Biol.), 5, 410 (198
5)〕。さらに前記したように、異った蛍光色素で標識し
たハイブリドーマを融合し、ＦＡＣＳで二重標識された
ハイブリッド・ハイブリドーマをソーティングする方法
もある〔L. Karawajewら:ジャーナル・オブ・イムノロ
ジカル・メソッズ（J.Immunol. Methods). 96, 265 (19
87)〕。

【００１９】ハイブリッド抗体産生ポリドーマのスクリ
ーニングには種々の方法が使用できる。例えば、前述
した抗フィブリンあるいは抗活性化血小板特異抗体産生
ハイブリドーマと抗ｔＰＡムテイン抗体産生ハイブリド
ーマのスクリーニングのためのＥＩＡ併用、フィブリ
ン結合あるいは活性化血小板結合マイクロプレートに被
検培養上清を添加し、次にＨＲＰ標識したｔＰＡムテイ
ンもしくは非修飾型ｔＰＡを加えて二重特異性を有する
ハイブリッド抗体検出のためのＥＩＡ；あるいは抗フィ
ブリンあるいは抗活性化血小板特異抗体と異なるサブク
ラスに属するｔＰＡムテインに対する抗体を用いる場合
は、フィブリン結合あるいは活性化血小板結合マイク
ロプレートに被検培養上清を添加し、次にＨＲＰ標識し
た該抗マウスIgGサブクラス特異抗体を加えて二重特異
性抗体を検出するＥＩＡ、およびこれらの変法などを適
宜組み合せて用いることができる。ハイブリッド抗体活
性陽性のポリドーマは直ちにクローニングに供される
が、これは通常限界希釈法などで容易に実施される。ク
ローン化されたポリドーマの培養上清については、上記
の方法でその抗体価を測定し、安定的に力価の高い抗体
を産生するポリドーマを選択することにより、目的とす
るモノクローナルなハイブリッド抗体産生ポリドーマを
取得することができる。

【００２０】上記した本発明のポリドーマの培養は通
常、液体培地中、または動物の腹腔内（例えば、マウス
等哺乳動物の腹腔内）で公知の方法により実施できる。
培養液および腹水中の抗体の精製については公知の生化
学的手法を組み合わせて用いることによりできる。例え
ば、細胞培養液もしくは腹水を遠心分離し、上清を取り
出し、塩析（通常は硫酸アンモニウムもしくは硫酸ナト
リウムを用いる）を実施する。得られたタンパク沈殿物
を適当な溶液に溶解し、透析後カラムクロマトグラフィ
ー（イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、プロテインＡ
カラム、ヒドロキンアパタイトカラム、ＡＢxカラム、
疎水担体カラムあるいは抗原結合カラム等)に付し、目
的とする抗体を分離精製することができる。以上のよう
な分離精製操作により、例えば１リットルの培養上清か
らタンパク重量比で９０％以上の純度のハイブリッドＭ
oＡbを約１〜５mg得ることができる。また、２０mlの腹
水液からは同様の抗体が３〜１０mg得られる。以上のよ
うな製造法に従って作製した抗フィブリン−抗ｔＰＡム
テイン二重特異性抗体産生テトラオーマの例として実施
例３に示したＦＴ２−１４がトリオーマの例として実施
例２に示したＴＡＦ１−４２、ＴＡＦ１−７９およびＴ
ＡＦ１−２２８が挙げられる。本発明の二重特異性抗体
がマウス抗体由来のものである場合には、該蛋白質の超
可変領域以外の領域、例えば定常領域あるいはフレーム
・ワーク領域を、遺伝子操作技術によりヒト抗体由来の
ものに変換し〔Z. Steplewskiら:プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス ユーエスエ
ー（Proc. Natl.Acad. Sci. USA), 85, 4852 (1988);
L. Riechmannら:ネーチャー（Nature), 332,323 (198
8)〕、マウス−ヒト・キメラ型あるいはヒューマナイズ
した抗体を作製することもできる。かかるヒト型化抗体
はヒトへの投与に際し、抗原性が小さいため有利に用い
られる。

【００２１】本発明の二重特異性抗体を作製するには、
上記のハイブリッド・ハイブリドーマ法が望ましいが、
以下のような化学結合法も用いられる。２種のＭoＡbを
化学的に結合させるために、抗体分子中に存在している
置換基、例えばアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ
ル基またはスルフヒドリル基などを利用することができ
る。例えば、（１）一方の抗体の反応性アミノ基と他方
の反応性カルボキシル基とを水溶性カルボジイミド試薬
〔例、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド、１−シクロヘキシル−３−（２
−モルホリノエチル）−カルボジイミド−ｐ−トルエン
スルホネートなど〕を用いて水性溶媒中で脱水縮合させ
る、（２）一方の抗体の反応性アミノ基をＮ−ヒドロキ
シスクシミドの活性エステル〔例、ｐ−マレイミドメチ
ルシクロヘキサン−１−カルボキシル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシミドエステル、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイロ
キシ）スクシミドエステルあるいはＧＭＢＳなど〕と反
応させマレイミド化したのち、ｉ）他方の抗体をジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）で還元した抗体、あるいはii）
他方の抗体にＮ−スクシミジル−３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）でスルフヒドリル基
を導入した抗体、あるいはiii）他方の抗体をペプシン
処理後還元して得られるＦab'画分のスルフヒドリル基
とチオエーテル結合させる、（３）２種の抗体双方の反
応性アミノ基をスクシンジアルデヒドやグルタルアルデ
ヒドなどのジアルデヒド試薬を用いて結合させる、
（４）２種の抗体をＤＴＴで還元あるいはＳＰＤＰでス
ルフヒドリル基を導入し、再酸化によりヘテロダイマー
を作製する、（５）２種の抗体をいずれもペプシン処理
後還元し、Ｆab'としたのち再酸化しＦab'ヘテロダイマ
ーを作製する、などの方法がある。またこれらの方法を
種々組み合わせて、２種の抗体活性をできるだけ損なわ
ずに効率良く目的のヘテロダイメリックな二重特異性抗
体を作製する報告があり〔M. J. Glennieら:ジャーナル
・オブ・イムノロジー（J.Immunol.), 139, 2367 (198
7):北川常広:有機合成化学、42, 283 (1984)〕、本発明
の二重特異性ＭoＡbの作製に利用できる。

【００２２】以上のような結合反応終了後、二重特異性
抗体結合物はセファデックスＧ１００もしくはＧ２０
０、セファロース６Ｂもしくは４Ｂ、ウルトロゲルＡｃ
Ａ４４もしくは３４、セファクリルＳ２００などのゲル
ろ過クロマトグラフィーにより精製・分取できる。ある
いは抗原結合カラムを用いるアフィニティークロマトグ
ラフィーを組み合わせることにより選択的な分取も可能
である。

【００２３】以上のようにして得られた二重特異性を有
するハイブリッドＭoＡbは蛋白質として均一であり、蛋
白分解酵素（ペプシン、パパインなど）処理などによ
り、活性化血小板あるいはフィブリンおよびｔＰＡムテ
インに対する結合能を保持するＦ(ab')₂断片などを得る
ことができる。本発明の二重特異性ＭoＡbあるいはｔＰ
Ａムテインと該二重特異性ＭoＡbとから作製される選択
的な血栓溶解蛋白複合体を用いる血栓溶解治療法におい
ては、幾つかの方法が用いられる。例えば、本発明の
二重特異性ＭoＡbを予め血栓性疾患患者に投与し、患者
体内に形成された血栓に結合させるベく十分な時間経過
後に、ｔＰＡムテインを投与する、該二重特異性Ｍo
ＡbとｔＰＡムテインとを同時に血栓性疾患患者に投与
する。あるいは予め該二重特異性ＭoＡbとｔＰＡムテ
インとを反応させ、たとえば免疫結合させ、未反応のｔ
ＰＡムテインを分離後、得られた選択的血栓溶解蛋白複
合体、好ましくは該ｂＳＭｏＡｂとｔＰＡムテインの比
率が１：１であるような選択的血栓溶解蛋白複合体を、
血栓性疾患患者に投与するなどの方法が挙げられる。

【００２４】本発明の二重特異性ＭoＡbあるいはさらに
ｔＰＡムテインを免疫結合させてなる血栓溶解剤は、必
要により例えばメンブレインフィルター等によるろ過除
菌操作の後に、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容
され得る担体、賦形剤、希釈剤などと混合し、注射剤な
どとして製剤化して、哺乳動物（例、マウス、ラット、
ネコ，イヌ，ブタ，ウシ，サル、ヒトなど）に投与し、
例えば心筋梗塞、末梢動・静脈閉塞症、網膜動・静脈閉
塞症、脳梗塞、肺塞栓症などの血栓・閉塞性疾患の治療
に用いることが可能である。本発明の血栓溶解剤の投与
量は、対象となる疾患、症状あるいは投与ルートなどに
よって異なるが、例えば心筋梗塞の成人患者に静脈内投
与する場合、二重特異性ＭoＡbとして１日当り約０．０
２〜１mg／kg好ましくは約０．０４〜０．４mg／kg、ｔ
ＰＡムテインでは一般的には約０．００１〜０．５mg／
kg、好ましくは約０．００２〜０．１mg／kg、中でも約
０．００４〜０．０４mg／kgが好ましい。

【００２５】

【作用】以上のような方法で、標的血栓部位に対して特
異的に結合可能であり、実質的にフィブリノーゲンや非
刺激血小板と結合しない本発明の二重特異性ＭoＡbとｔ
ＰＡムテインとを用いることにより、副作用を伴うこと
なく選択的かつ効率的に血栓を溶解、除去できる。

【００２６】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commis
ion on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは
当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例
を下記する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありう
る場合は、特に明示しなければＬ−体を示すものとす
る。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 Ｔｄｒ ：チミジン ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ（Ｇ）：グリシン Ａｌａ（Ａ）：アラニン Ｖａｌ（Ｖ）：バリン Ｌｅｕ（Ｌ）：ロイシン Ｉｌｅ（Ｉ）：イソロイシン Ｓｅｒ（Ｓ）：セリン Ｔｈｒ（Ｔ）：スレオニン Ｃｙｓ（Ｃ）：システイン Ｍｅｔ（Ｍ）：メチオニン Ｇｌｕ（Ｅ）：グルタミン酸 Ａｓｐ（Ｄ）：アスパラギン酸 Ｌｙｓ（Ｋ）：リジン Ａｒｇ（Ｒ）：アルギニン Ｈｉｓ（Ｈ）：ヒスチジン Ｐｈｅ（Ｆ）：フェニルアラニン Ｔｙｒ（Ｙ）：チロシン Ｔｒｐ（Ｗ）：トリプトファン Ｐｒｏ（Ｐ）：プロリン Ａｓｎ（Ｎ）：アスパラギン Ｇｌｎ（Ｑ）：グルタミン。

【００２７】

【実施例】以下に参考例および実施例により本発明を具
体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するも
のでないことは言うまでもない。なお、参考例および実
施例で用いられている動物細胞および微生物は、以下の
表に示すように寄託が行なわれている。
(IFO) (FRI) 動物細胞および微生物名 IFO No. FERM No. マウスハイブリドーマ 50174 BP-2081 FIB 1−11 (1988.9.21) (1988.10.4) マウスハイブリドーマ 50175 BP-2082 FIB 2−11 (1988.9.21) (1988.10.4) マウスハイブリドーマ 50178 BP-2085 TPA 1−41 (1988.9.21) (1988.10.4) マウスハイブリドーマ 50211 BP-2623 2T60 (1989.9.27) (1989.10.4) マウスハイブリドーマ 50332 BP-3455 FTB 2−133 (1991.6.7) (1991.6.18) マウスハイブリッド・ハイブリドーマ 50180 BP−2158 （テトラオーマ）FT2−14 (1988.11.8) (1988.11.25) マウスハイブリッド・ハイブリドーマ 50333 BP-3456 （トリオーマ）TAF 1−42 (1991.6.7) (1991.6.18) マウスハイブリッド・ハイブリドーマ 50334 BP-3457 （トリオーマ）TAF 1−79 (1991.6.7) (1991.6.18) マウスハイブリッド・ハイブリドーマ 50335 BP-3458 （トリオーマ）TAF 1−228 (1991.6.7) (1991.6.18) Escherichia coli MM294(DE3)/pLysS, pTB1133 IFO 15031 FERM BP-2882 (1990.4.17) (1990.5.1) Escherichia coli MM294(DE3)/pLysS, pTB1277 IFO 15116 FERM BP-3199 (1990.12.6) (1990.12.1 3) IFO:財団法人発酵研究所（大阪市淀川区十三本町２丁目
１７番８５号） FRI:通商産業省微生物工業技術研究所（茨城県つくば市
東１丁目１番３号）

【００２８】

【参考例１】 抗フィブリン抗体測定用ＥＩＡ ３.３Ｍ尿素、０.０１％ ＥＤＴＡ含有リン酸食塩緩衝
液（ＰＢＳ，pＨ７.３）に溶解したヒト・フィブリン・
モノマー溶液１mg／mlを、９６穴マイクロプレートに５
０μlずつ分注し４℃で一夜放置後、２％カゼイン、
０．０１％チメロサール含有ＰＢＳ１５０μlを添加し
て感作プレートを作製した。次に１００単位／mlヘパリ
ン、３mＭフェニルメチルスルホニルフルオリド含有Ｐ
ＢＳに溶解したヒト・フィブリノーゲン溶液１０mg／ml
を、等量の被検ハイブリドーマ培養上清と混じ、室温で
３０分間反応後、その１００μlを上記のフィブリン感
作プレートに添加し室温で２時間反応させた。０.０５
％ Tween２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔw）でプレートを
十分に洗浄後、ホースラッディッシュ・ペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）標識ウサギ抗マウスIgG抗体を添加し、さ
らに室温で２時間反応させた。洗浄後、酵素基質として
オルソフェニレンジアミンおよびＨ₂Ｏ₂を含有する０．
１Ｍクエン酸緩衝液を各ウェルに加え、室温で酵素反応
を実施した。１Ｎ硫酸で反応停止後、マルチスキャン
（フロー社製）を用いて波長４９２nmで発色色素量を測
定した。

【００２９】

【参考例２】 抗血小板抗体測定用ＥＩＡ 固定化血小板の作製 クエン酸採血したヒト新鮮血から遠心分離法により多血
小板血漿を取得し、ＡＤＰ分解酵素を含むタイロード−
ヘペス緩衝液（pＨ６．５）で洗浄した。この洗浄血小
板を２×１０⁷個／ウエルでマイクロプレートに播き、
トロンビン（０．２ユニット／ml）で活性化したのち遠
心した。次いで２％ホルマリンで固定化後、５％牛血清
アルブミン（以下、ＢＳＡと略記することがある）含有
ＰＢＳでブロッキングして活性化血小板プレートを作製
した。非刺激血小板プレートは上記の操作中、トロンビ
ン活性化操作を省略して作製した。 ＥＩＡ操作法 ハイブリドーマ培養上清１００μlを血小板プレートに
添加し、室温で３時間反応後ＰＢＳ−Ｔwで洗浄、ＨＲ
Ｐ標識ウサギ抗マウスIgG抗体を添加し、さらに室温で
２時間反応させた。洗浄後、固相に結合したＨＲＰ活性
を参考例１に示した方法で測定した。

【００３０】

【参考例３】 抗ｔＰＡ抗体測定用ＥＩＡ 市販の１本鎖ｔＰＡ（中央科学工業Ｋ．Ｋ．販売）５μ
g／ml溶液を９６穴マイクロプレートに１００μlずつ分
注し４℃で一夜放置後、２％カゼイン、０．０１％チメ
ロサール含有ＰＢＳ１５０μlを添加して感作プレート
を作製した。上記の液を除去しＰＢＳ−Ｔwで洗浄後、
被検ハイブリドーマ培養上清１００μlを添加し室温で
２時間反応させた。以下、参考例１に記載の方法で酵素
反応を実施し抗体価を測定した。

【００３１】

【参考例４】 抗ｔＰＡムテイン抗体測定用ＥＩＡ 参考例３に記載のｔＰＡの代りに参考例１９に記載のｔ
ＰＡ−６’を使用し、ｔＰＡ−６’感作プレートを作製
後、同様の方法で抗ｔＰＡムテイン抗体価を測定した。

【００３２】

【参考例５】 抗ヒト・フィブリノーゲン抗体測定用Ｅ
ＩＡ 参考例３に記載のｔＰＡの代りに市販のヒト・フィブリ
ノーゲン（和光純薬販売）を使用し、ヒト・フィブリノ
ーゲン感作プレートを作製後、同様の方法で抗ヒト・フ
ィブリノーゲン抗体活性を測定した。

【００３３】

【参考例６】 抗フィブリン−抗ｔＰＡムテイン・ハイ
ブリッド抗体測定用ＥＩＡ 参考例４で作成したｔＰＡ−６’感作プレートにハイブ
リッド抗体含有検液を添加し、室温で２時間反応させ
た。ＰＢＳ−Ｔwで洗浄後、ビオチン標識した参考例８
−に記載のヒト・フィブリンβ鎖Ｎ末端ペプチド（１
−１１）−ＢＳＡ複合体を添加し、さらに室温で２時間
反応させた。次にアビジン−ＨＲＰ複合体を添加し室温
で１時間反応後、固相に結合したＨＲＰ活性を参考例１
に示した方法で測定した。

【００３４】

【参考例７】 フィブリン溶解反応中和試験 ｔＰＡ溶液（最終濃度２０ng／ml）に被検ハイブリドー
マ培養上清希釈液を添加し、３７℃で１時間反応後反応
混液をフィブリン・アガロース・プレートの１ウェル当
り５μl注入した。３７℃で２〜６時間後にフィブリン
の溶解斑（直径）を測定し、ｔＰＡの酵素活性に対する
ハイブリドーマ培養上清に含まれるＭoAbの中和能を測
定した。

【００３５】

【参考例８】 マウス抗ヒトフィブリン・モノクロナー
ル抗体産生ハイブリドーマの作製 免疫原の調製 公知の固相合成法によりペプチド合成機（アプライド・
システム、モデル４３０Ａ型）を用いて作製された次式
のヒト・フィブリンβ鎖Ｎ末端ペプチド（１−１１）−
Ｃys ３.３mgを、予めＧＭＢＳでマレイミド化したＢＳ
Ａ（ＢＳＡ１モル当り１３モルのマレイミド基を導入）
１２mg／２ml水溶液に加え３０℃で１時間反応させ、ヒ
ト・フィブリンβ鎖Ｎ末端ペプチド（１−１１）−ＢＳ
Ａ複合体を得た。次いで生理食塩水で３回透析後（３リ
ットル×３）、凍結保存し免疫原として用いた。 H-Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Cys-
OH (12-mer, 配列番号1) 免疫 ペプチド−ＢＳＡ複合体１mg／ml生理食塩水溶液に等量
のフロイント完全アジュバンドを加え、マウス（♀，n
＝１０：０．１mg／０．２ml／マウス）の背部および腹
部皮下への免疫を開始した。追加免疫は免疫原に等量の
フロイント不完全アジュバンドを加えて、２−３週毎に
５回接種し実施した。 細胞融合 最終免疫後３日で脾臓を摘出し、脾臓細胞懸濁液を常法
により調製した（約１０⁸個）。次いでマウス骨髄腫細
胞（Ｐ３Ｕ１）２×１０⁷個を添加し、ＰＥＧ６０００
を用いてケーラーとミルスタインの方法〔ネーチャー
（Nature). 256,495 (1975)〕に準じて細胞融合に供し
た。融合終了後、細胞混液をＨＡＴ培地中に懸濁し、１
０日間培養した。以後は、親細胞の選択が終了次第、Ｈ
ＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ培地に代え培
養を続けた。

【００３６】ハイブリドーマの選択およびクローニン
グ 固相にヒト・フィブリノーゲンおよびヒト・フィブリン
・モノマーを吸着させたマイクロプレートを用いる参考
例５および１に記載のＥＩＡでハイブリドーマ培養上清
の抗体価を測定した。融合１０日から２０日後でハイブ
リドーマの出現を認め、かつヒト・フィブリンに特異結
合する抗体がみられた。特に結合活性の強いハイブリド
ーマについて、限界希釈法によるクローニングに供し
た。クローン化したハイブリドーマの培養上清を同様に
ＥＩＡのスクリーニングに供し、ヒト・フィブリン結合
能の強いものを選択した。これらの結果、高濃度ヒト・
フィブリノーゲン存在下でフィブリンに特異結合するＭ
oＡb産生マウスハイブリドーマＦＩＢ１−１１およびＦ
ＩＢ２−１１が得られた。これらから得られたＭｏＡｂ
ＦＩＢ１−１１およびＦＩＢ２−１１の免疫グロブリ
ン・クラス、サブクラスはオークターロニー法による測
定で、いずれもIgG₁（κ鎖）であった。

【００３７】

【参考例９】 マウス抗活性化血小板抗体産生ハイブリ
ドーマの作製 免疫 クエン酸採血で得たヒト新鮮血より遠心分離法で洗浄血
小板を取得した。血小板約１０⁹個にトロンビン０．１
単位／mlを添加し、３７℃で５分間インキュベートした
のち、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に（ｎ＝１０；約１
０⁹ケ／１ｍｌ／マウス）注射した。２週毎に６−８回
免疫した。 細胞融合 参考例８−に記載のマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１の代わ
りにＮＳ−１を用いて、以下全く同様の方法で細胞融合
を実施した。 ハイブリドーマの選択およびクローニング 血小板結合マイクロプレートを用いる参考例２に記載の
ＥＩＡでハイブリドーマをスクリーニングし、以下参考
例８−と同じ要領で抗活性化血小板ＭoＡb産生ハイブ
リドーマを取得した。これらの結果、ヒトおよびウサギ
活性化血小板に特異的に結合するＭoＡb産生ハイブリド
ーマ２Ｔ６０が得られた。抗体２Ｔ６０の免疫グロブリ
ン・クラス、サブクラスはオークターロニー法による測
定で、IgG₁（κ鎖）であった。

【００３８】

【参考例１０】 マウス抗ｔＰＡムテイン・モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマの作製 免疫 ｔＰＡ２００μg／ml生理食塩水溶液に等量のフロイン
ト完全アジュバンドを添加し十分乳濁後、ＢＡＬＢ／ｃ
マウス（♀，２０μg／０．２ml／マウス）に腹腔およ
び背部皮下投与し、２〜３週間隔で追加免疫を実施し
た。３回の追加免疫後、１０日で最大の血清抗体価を示
した個体について、ｔＰＡ抗原液（５０μg／０．１ml
生理食塩水／マウス）を静脈内投与した。 細胞融合 参考例８−に記載の方法に従い、細胞融合を実施し
た。 ハイブリドーマの選択およびクローニング ｔＰＡムテイン結合マイクロプレートを用いる参考例４
に記載のＥＩＡでハイブリドーマをスクリーニングし、
以下参考例８−と同じ方法でｔＰＡムテイン結合活性
を有する抗ｔＰＡ ＭoＡb産生ハイブリドーマを取得し
た。これらの中、参考例７に記載のフィブリン溶解反応
中和試験で中和能を示さず、かつｔＰＡおよびｔＰＡム
テインに特異結合する抗ｔＰＡ ＭoＡbを産生するハイ
ブリドーマとしてマウスハイブリドーマＴＰＡ１−４１
を得た。抗体ＴＰＡ１−４１の免疫グロブリン・クラ
ス、サブクラスはオークターロニー法による測定でIgG₂
b（κ鎖）であった。

【００３９】

【参考例１１】 ヒトｔＰＡをコードする遺伝子を含む
プラスミドの構築 （１）ｃＤＮＡ含有プラスミドの単離： ヒト包皮由来初代培養細胞ｍＲＮＡより合成したｃＤＮ
ＡをｐＣＤベクター〔Okayamaら、モレキュラー・セル
・バイオロジー（Molecular Cel1 Biology), 3,280 (19
83) 参照〕に組み込んで作成した大腸菌ｘ1776を宿主と
したｃＤＮＡライブラリーを大阪大学微生物病研究所の
岡山博士より分与を受けた。このｃＤＮＡライブラリー
よりアルカリ法（Birnboim. H. C. & Doly. J.，ヌクレ
イック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Researc
h), 1, 1513 (1979)〕でプラスミドＤＮＡを抽出し、こ
のＤＮＡを大腸菌ＤＨ１に感染させ、約２×10⁶個のclo
neよりなる大腸菌ＤＨ１を宿主としたｃＤＮＡライブラ
リーを作成した。

【００４０】上記大腸菌ＤＨ１を用いたｃＤＮＡライブ
ラリーをニトロセルロースフィルター（ミリポア社、Ｈ
ＡＴＦフィルター)上に約５×10⁴ clone／フィルターと
なるように10枚まき、このフィルターをマスターフィル
ターとしている各２枚ずつを１組としたレプリカフィル
ター計20枚を作成した。このレプリカフィルター上の大
腸菌を0.5Ｎ ＮａＯＨ溶液で溶かし、露出変性したプラ
スミドＤＮＡをフィルター上に固定した〔Grunstein,
M. & Hogness, D. S.,プロシージングス オブナショナ
ル アカデミー オブ サイエンス（ Proc. Natl. Acad.
Sci. USA）72,3961 (1975)〕。

【００４１】一方、D. Pennicaらにより報告されている
〔ネイチャー（Nature） 301， 214(1983)〕ヒトｔＰＡ
のアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸No.248-260(Asn-A
rg-Arg-Leu-Thr-Trp-Glu-Tyr-Cys-Asp-Val-Pro-Ser)
（配列番号３）, アミノ酸No.489-501(Arg-Met-Thr-Leu
-Val-Gly-Ile-Ile-Ser-Trp-Gly-Leu-Gly)（配列番号
４）およびアミノ酸No.516-527-stop(Asn-Tyr-Leu-Asp-
Trp-Ile-Arg-Asp-Asn-Met-Arg-Pro-Stop）（配列番号
５）をもとにこれらのアミノ酸配列に対応する塩基配列
を有するオリゴヌクレオチド各々 AAC CGC AGG CTG ACG
TGG GAG TAC TGT GATGTG CCC TCC （配列番号６）; CG
C ATG ACT TTG GTG GGC ATC ATC AGC TGG GGCCTG GGC
（配列番号７）; AAC TAC CTA GAC TGG ATT CGT GAC AA
C ATG CGA CCGTGA（配列番号８）を化学合成した。この
オリゴヌクレオチドに対してＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（宝酒造製）を用いて50μｌの反応液〔オリゴヌク
レオチド0.1μg，50mM Tris-HCl pH8.0, 10mM ＭｇＣｌ
₂，10mMメルカプトエタノール、50μＣｉγ−³²Ｐ ＡＴ
Ｐ(＞5000Ci／mmole), ３ユニット Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ〕中で37℃１時間反応させ、オリゴヌクレオ
チドの５’末端を³²Ｐで標識した。上記方法で標識した
オリゴヌクレオチド二種をプローブとして、別々に、Ｄ
ＮＡを固定したレプリカフィルターに会合させた。会合
反応は10μＣｉのプローブを含む５×ＳＳＰＥ〔180mM
NaCl，10mM リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）,
１mM EDTA〕，５×Denhardt's，0.1％ＳＤＳ，100μｇ
／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ溶液10ｍｌ中で、35℃16時間
行い、反応後フィルターを５×ＳＳＣ〔0.15M NaCl，0.
015M クエン酸ナトリウム緩衝液〕0.1％ＳＤＳ溶液で室
温で30分ずつ３回さらに45℃30分ずつ２回洗浄した〔T.
Maniatisら、モレキュラー・クローニング（Molecular
Cloning）Cold Spring Harbor Laboratory，ｐ. 309(1
982)〕。

【００４２】洗浄したフィルターよりラジオオートグラ
ムをとり、三種類のプローブの全部に対して反応する菌
株を一組２枚のレプリカフィルターのラジオオートグラ
ムを重ね合わせることにより探した。この方法により５
×10⁵ 個のコロニーより三種類のプローブに対して反応
する１株〔Escherichia coli K12 DH1/TPA13〕を得た。
この菌株よりプラスミドＤＮＡ(pTPA13)をアルカリ法
〔ヌクレイック アシッズ リサーチ（Nucleic Acids Re
search），1，1513(1979)〕によって抽出精製し、ｃＤ
ＮＡの長さを検討したところ2.3kbであることが明らか
になった。しかし、このｃＤＮＡ鎖長ではＮ末端側まで
コードしていないことがわかった。

【００４３】（２）ヒトｔＰＡ ｃＤＮＡを含むファー
ジの単離 λｇｔ１０をベクターとしたヒトニューロブラストー
マ、ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社）を大腸
菌Ｃ600、ＨｆｌＡを宿主として、軟寒天プレート上
に、約１×10⁵クローンずつ、10枚まき、これを、ニト
ロセルロースフィルター（ミリポア社、ＨＡＴＦフィル
ター）上に移した後、0.5Ｎ ＮａＯＨ溶液でとかし露出
変性したファージＤＮＡをフィルター上に乾燥固定し
た。〔Maniatisら、「モレキュラー・クローニング（Mo
lecular Cloning)」Cold Spring HarborLaboratory, p3
20, 1982〕。一方参考例１1の（１）で得られたプラス
ミドｐＴＰＡ13を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮａｒＩで
切断して得られる0.3ＫｂのＤＮＡ断片をニックトラン
スレーション法（Mainatisら、同上p109）により³²Ｐ標
識し、プローブとした。標識したプローブと、ＤＮＡを
固定したフィルターを、標識プローブを含む、５×ＳＳ
ＰＥ(0.9M NaCl 50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4),
５mM EDTA), 50%ホルムアミド、５×Denhardt's,0.1％
SDS, 100μｇ/ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ溶液10ｍｌ中で
42℃、16時間、会合反応を行い、反応後フィルターを２
×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナ
トリウム), 0.1％ SDS溶液中で室温で30分ずつ２回、１
×ＳＳＣ、0.1％SDS溶液中で68℃で30分ずつ２回洗浄し
た。洗浄したフィルターを乾燥させた後、ラジオオート
グラムをとり、プローブと反応するクローンを検索し
た。この方法により得られたクローンλＴＰＡ７よりDa
visらの方法〔Davisら、「アドバンスト・バクテリアル・
ジェネティクス(Advanced Bacterial Genetics)」, Cold
Spring Harbor Laboratory（ 1980)〕 によりファージ
ＤＮＡを抽出し、数種の制限酵素を用いて検討した結
果、クローンλＴＰＡ７はｐＴＰＡ１３で欠けているヒ
トｔＰＡのＮ末端側をコードするｃＤＮＡを有すること
がわかった。以上の結果、得られたｐＴＰＡ１３および
λＴＰＡ７のｃＤＮＡ部分を組み合わせることにより、
ヒトｔＰＡのコード領域全体をカバーすることができ
た。また得られたｃＤＮＡ部分の塩基配列をジデオキシ
ヌクレチオド合成鎖停止法〔Messingら、「ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research)」9, 30
9, (1981)〕によって決定した。報告されている塩基配
列と比較した結果、アミノ酸No.129(Arg)をコードする
塩基配列(No.552-554)ＣＧＧがＴＧＧにかわっており、
コードされるアミノ酸がＡｒｇ→Ｔｒｐに置き換ってい
ることがわかった（図３)（配列番号９）。

【００４４】（３）動物細胞発現用プラスミドの構築 上記したλＴＰＡ７をＥｃｏＲＩで切断し、0.8kbのＤ
ＮＡ断片を得た。一方プラスミドｐＴＢ652〔サイエン
ス（Science） 236 : 1116-1120,（ 1987）〕をＥｃｏ
ＲＩで切断して得たアンピシリン耐性遺伝子、 ＭｕＬ
Ｖ−ＬＴＲおよびＳＶ40プロモーターを含む断片(約4.2
kb）を調製し、両者をligationしてプラスミドｐλＴＰ
Ａ７Ｅ0.8を構築した。このｐλＴＰＡ７Ｅ0.8をＮａｒ
ＩおよびＣｌａＩで消化して得た2.1kbのＤＮＡ断片と
プラスミドｐＴＰＡ13をＮａｒＩおよびＣｌａＩで消化
して調製したｔＰＡ ｃＤＮＡを含む断片をligateし、
プラスミドｐＴＢ920を構築した（図４)。次にｐＴＢ92
0をＢａｍＨＩで消化して得た2.7kbのＤＮＡ断片を、ｐ
ＴＢ399〔セル ストラクチャー アンド ファンクション
（Cell Structure and Function） 12 : 208-217, 198
7〕のＢａｍＨＩ部位に挿入してｐＴＢ926を構築した。
このプラスミドをＣｌａＩで消化して4.0kbの断片を調
製し、ｐＴＢ348（Cell Structure and Function 12 :
205-217, 1987）のＣｌａＩ部位に組み込んでプラスミ
ドｐＴＢ927を構築した（図５)。

【００４５】

【参考例１２】 ヒトｔＰＡ ｃＤＮＡの動物細胞での
発現 サルＣＯＳ−７細胞〔「セル(Cell)」, 27, 279-288 (198
1)〕を５％胎児牛血清を含むＤＭＥＭ培地で単層培養
（ファルコン径60mmプラスチックディッシュ）した後、
同培地で培地交換した。交換の４時間後に公知の方法
〔Grahamら、「ヴィロロジー(Virology)」, 52, 456 (1
973)〕に従いディシュ１枚当りプラスミドｐＴＢ920ま
たはｐＴＢ927のＤＮＡ10μｇを含むカルシウムホスフ
ェートゲルを調製し細胞に添加し、ｐＴＢ920感染細胞
またはｐＴＢ927感染細胞をそれぞれ得た。さらにその
４時間後グリセロール処理して５％胎児牛血清を含む培
地で上記ｐＴＢ920感染ＣＯＳ−７細胞またはＴＢ927感
染ＣＯＳ−7細胞の培養を続けた。70〜72時間後に培養
上清を集め、上清中のｔＰＡ量を参考例３に記載のＥＩ
Ａ法により測定したところ200μｇ〜400μｇ／ｍｌのｔ
ＰＡが検出され、上記ｃＤＮＡが正しくヒトｔＰＡをコ
ードしていることが確められた。

【００４６】

【参考例１３】 ムテインをコードする塩基配列を有す
る組換えＤＮＡの製造 参考例１１に記載のプラスミドｐＴＢ927をBgl IIで消
化して2.1kbのＤＮＡ断片を得、これをさらにApaLＩお
よびBstYＩで消化して1.3kbの断片を得た。このＤＮＡ
の両端をklenowフラグメントを用いた反応により平滑化
した後、プラスミドpUC118のSmaＩ部位に組み込みプラ
スミドｐＴＢ1127を構築し、合成オリゴヌクレオチドを
使用する特定部位指向性変異誘発の鋳型として用いた。
特定部位指向性変異はOligonucleotide-directed in vi
tro Mutagenesis System (アマシャム社）と合成オリゴ
マーを用いて行った。用いた合成オリゴマーの配列を下
に示す。 5'-ACTGTTTCCCTCAGACATATGAGGGGTGCTGCAGAA-3' (36mer)（配列番号１０） この合成オリゴマーを用いることにより、Ｃ¹⁷³はＭに
置換されると同時にＮｄｅｌの認識部位が導入された、
ヒトｔＰＡ ｃＤＮＡを構築することができた(図６)。
即ち、ｔＰＡのアミノ酸番号１〜１７３までのＦＥＫ１
ドメインの欠失したｔＰＡムテインが得られた。このよ
うにして得られたｔＰＡムテイン、ｔＰＡ−１の塩基配
列およびそれから推測されるアミノ酸配列を図７（配列
番号１１）に示す。このムテインとｔＰＡとの違いを示
すと以下のようである。 上記のようにして得られたプラスミドをｐＴＢ1128とし
た（図８)。

【００４７】

【参考例１４】 ヒトｔＰＡのムテインをコードする遺
伝子による大腸菌の形質転換 （１）ヒトｔＰＡのムテイン発現用プラスミドｐＴＢ11
33の構築 前記参考例１３で得られたｐＴＢ1128をNdeＩおよびBam
HＩで切断し、各々約1.1kbのＤＮＡ断片を得た。この断
片をプラスミドｐＥＴ３ｃ〔Srudier, F. W. (Brookhav
en National Labs. U.S.A.) より分与をうけた〕のＮｄ
ｅＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＴＢ11
33を構築した（図８）。 （２）形質転換 次に大腸菌ＭＭ294株に、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子を組み込んだλファージＤＥ３〔Studier,
F. W. ら、ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジ
ー（J. Mol. Biol.), 189 :113-130 (1986)〕を溶原化
させ、さらにＴ７ファージのリゾチーム遺伝子をもつプ
ラスミドpLysS〔Studier, F. W. ら、ジャーナル オブ
モレキュラー バイオロジー（J. Mol. Biol.),189: 113
-130 (1986)〕を導入し、大腸菌MM294(DE3)/pLysS株を
作製した。この大腸菌株にｐＴＢ1133を導入し、大腸菌
MM294(DE3)/pLysS,ｐＴＢ1133をつくった。この菌株は
ヒトｔＰＡムテインｔＰＡ−１を産出するように作製さ
れていた。

【００４８】

【参考例１５】 ｔＰＡ−１発現大腸菌の培養 参考例１４で得た大腸菌MM294 (DE3)/pLysS, ＰＴＢ113
3を、200ｍｌ容技付き三角フラスコ内の１％バクトトリ
プトン（ディフコラボラトリーズ、アメリカ)、0.5％バ
クトイーストエキス（ディフコラボラトリーズ、アメリ
カ)、0.5％ＮａＣｌ、100μｇ／ｍｌアンピシリンナト
リウムおよび10μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む
液体培地40ｍｌに接種して37℃にて一晩振盪培養した。
この培養液10ｍｌを1,000ｍｌ容三角フラスコ内の１％
バクトトリプトン、0.5％バクトイーストエキス、0.5％
ＮａＣｌ、100μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウムおよ
び10μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む上記液体培
地200ｍｌに添加しては37℃にて4時間、ついでイソプロ
ピル-β-D-チオガラクトピラノシド(和光純薬工業株式
会社）0.1mMを添加してさらに４時間振盪培養して培養
液を得た。この培養液を遠心分離し、菌体を集め−80℃
で凍結して保存した。

【００４９】

【参考例１６】 ｔＰＡ−１蛋白質の抽出、賦活化およ
び精製 抽出、賦活化 参考例１５で得たｔＰＡ−１発現大腸菌凍結菌体を50mM
トリス塩酸緩衝液(ｐＨ8.0)５０ｍｌに懸濁した。懸濁
液を超音波処理（２Ａ×２分間、２回）にかけ、溶菌液
を得た後18,900×ｇで20分間遠心分離して沈澱物を得
た。この沈澱物を10mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0)５０
ｍｌで洗浄して、18,900×ｇで20分間遠心分離して沈澱
物を得た。さらにこの沈澱物を0.25％（v/v）トライト
ンＸ−100を含む10mMトリス塩酸緩衝液(ｐＨ8.0)で洗浄
して、18,900×ｇで20分間遠心分離して沈澱物を得た。
この沈澱物に抽出用緩衝液（７Ｍ塩酸グアニジン−0.1
Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ7.5）−５mM ２−メルカプトエタ
ノール）２５ｍｌを加えて４℃にて一晩撹拌した。この
抽出液を18,900×ｇで20分間遠心分離して抽出上清２５
ｍｌを得た。抽出上清２５ｍｌを７Ｍ塩酸グアニジン−
0.1Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.5）−５mM ２−メ
ルカプトエタノールに対して透析した後、脱気した賦活
化用緩衝液〔2.5Ｍ尿素−50mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
8.75）−10mM ＮａＣｌ−５mM ＥＤＴＡ−10mMリシン−
0.5mM還元型グルタチオン−0.3mM酸化型グルタチオン〕
1,250ｍｌに加えて撹拌した後、15℃において保温し
た。

【００５０】精製 賦活化されたｔＰＡ−１溶液の各々1,250ｍｌを50mMト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0)−0.01％Tween80に対して透
析した。透析内液を18,900×ｇで20分間遠心分離して透
析上清を得た。この透析上清を50mMトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ8.0）で平衡化したＱＡＥトヨパール550Ｃ（東ソ
ー社）カラム（カラム容量70ｍｌ）に負荷して蛋白質を
吸着させ、次に同緩衝液でカラムを洗浄した後０〜1.0
Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配溶出法(溶出緩衝液容量600
ｍｌ）にてｔＰＡ−１を溶出した。活性画分を0.5Ｍ Ｎ
ａＣｌ−50mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）−0.01％ Tw
een80で平衡化したベンザミジンセファロース６Ｂ(ファ
ルマシア社、スウェーデン)カラム（カラム容量20ｍ
ｌ）に負荷して活性型ｔＰＡ−１を吸着させ、次に同緩
衝液でカラムを洗浄した後0.2Ｍアルギニン−0.5Ｍ Ｎ
ａＣｌ−50mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）−0.01％Twe
en80で活性型ｔＰＡ−１を溶出した。以上の精製操作に
より、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを示すｔＰＡ−１
標品を得た。すなわち、分子量は還元条件下で３９，５
００、非還元条件下で３５，０００であった。

【００５１】

【参考例１７】 ムテイン(ｔＰＡ−６')をコードする
塩基配列を有する組換えＤＮＡの製造 参考例１３に記載のプラスミドｐＴＢ1128を合成オリゴ
ヌクレオチドを使用する特定部位指向性変異誘発の鋳型
として用いた。特定部位指向性変異はOligonucleotide-
directed in vitro Mutagenesis System (アマシャム
社）と合成オリゴマーを用いて行った。用いた合成オリ
ゴマーの配列は下に示すとおりである。 5'−ＧＧＧＣＧＡＣＴＣＴＴＣＧＴＧＣＴＴＧＧＣＡＡ
Ａ−3' (24mer)（配列番号１２） この合成オリゴマーを用いることにより、Ｒ²⁹⁸'²⁹⁹は
Ｅ²⁹⁸'²⁹⁹に置換されると同時にＭｂｏIIの認識部位が
導入されたＦＥＫ１ドメイン欠失ヒトｔＰＡ ｃＤＮＡ
を構築することができた(図９)。この合成オリゴマーを
用いて得られたｔＰＡムテイン、ｔＰＡ−６’の塩基配
列およびそれから推測されるアミノ酸配列を図１０（配
列番号１３）に示す。このムテインとｔＰＡとの違いを
示すと以下のようである。 この合成オリゴマーを用いた結果得られたプラスミドを
ｐＴＢ1038とした。

【００５２】

【参考例１８】 ヒトｔＰＡのムテイン(ｔＰＡ−６’)
をコードする遺伝子による大腸菌の形質転換 （１）ヒトｔＰＡのムテイン発現用プラスミドｐＴＢ12
77の構築 前記参考例１７で得られたｐＴＢ1038をNdeＩおよびBam
HＩで切断し、約1.1kbのＤＮＡ断片を得た。この断片を
プラスミドｐＥＴ３ｃ〔Srudier, F. W. (Brookhaven N
ational Labs. U.S.A.) より分与をうけた〕のＮｄｅＩ
−ＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＴＢ1277を
構築した（図９）。 （２）形質転換 次に参考例１４で示した大腸菌MM294(DE3)/pLysS株にｐ
ＴＢ1277を導入し、大腸菌MM294(DE3)/pLysS,ｐＴＢ127
7をつくった。これらの菌株はヒトｔＰＡムテインｔＰ
Ａ−６'を産出するように作製されていた。

【００５３】

【参考例１９】 ｔＰＡ−６’蛋白質の抽出、賦活化お
よび精製 抽出 参考例１８で得た大腸菌MM294(DE3)/plysS，ｐＴＢ１２
７７を参考例１５で示した培養条件下に培養し、ｔＰＡ
−６’発現大腸菌体を得た。このｔＰＡ−６’発現大腸
菌菌体20gを50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)0.2リットル
に懸濁した。懸濁液を超音波処理（２Ａ×２分間，２
回）にかけ、次いで18,900×gで20分間遠心分離して沈
殿物を得た。この沈殿物を0.5％（ｖ／ｖ）トライトンX
-100を含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)0.2リットルで
洗浄して、18,900×gで20分間遠心分離して沈殿物を得
た。さらにこの沈殿物を50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)
0.2リットルで洗浄して、18,900×gで20分間遠心分離し
て沈殿物を得た。この沈殿物に抽出用緩衝液(7M塩酸グ
アニジン−0.1M KH₂PO₄（pH7.5）−0.1M2-メルカプトエ
タノール)0.1リットルを加えて4℃で一晩撹拌した。こ
の抽出液を18,900×gで20分間遠心分離して抽出上清0.1
リットルを得た。 賦活化 賦活化用緩衝液〔2.5M尿素 50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.
75)-10mM ＮａＣｌ 5mM EDTA- 10mMリシン 0.5mM還元型
グルタチオン〕20リットルに、抽出上清0.1リットルを
加えて15℃で1時間撹拌した後、酸化型グルタチオンを
最終濃度0.3mMになるように加えて15℃で保温した。 精製 賦活化されたｔＰＡ−６’溶液を限外濾過法により2リ
ットルに濃縮し、次に50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5) 0.
01％Tween80に対して透析した後、18,900×gで20分間遠
心分離して透析上清２リットルを得た。この透析上清を
50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)で平衡化したＱＡＥトヨ
パール550C(東ソー社)カラム(カラム容量150ml)に負荷
して蛋白質を吸着させ、次に同一緩衝液0.3リットルで
カラムを洗浄した後０〜1.0M ＮａＣｌの直線勾配溶出
法(溶出緩衝液容量1,200ml)を用いてｔＰＡ−６’を溶
出した。活性画分0.2リットルを集め、50mMトリス塩酸
緩衝液(pH8.5)-0.01％Tween80に対して透析した。この
透析内液0.2リットルを同一緩衝液で平衡化したリシン
セファロース4B(ファルマシア社、スウエーデン)カラム
(カラム容量40ml)に負荷してｔＰＡ−６’を吸着させ
た。0.5Ｍ NaCl-50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)-0.01％T
ween80 80mlでカラムを洗浄した後、0.2Ｍアルギニン−
0.5Ｍ NaCl−50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)-0.01％Twee
n80 でｔＰＡ−６’を溶出した。以上の精製操作によ
り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを示すｔＰＡ−６’
標品38mgを得た。すなわち、分子量は還元条件下で39,0
00であり、非還元条件下では33,000であった。この値は
一次構造より推定される理論値(tPA-6'=39,561)によく
一致した。

【００５４】

【参考例２０】 抗活性化血小板−ｔＰＡムテイン・ハ
イブリッド抗体測定用ＥＩＡ 参考例２で作製した抗活性化血小板感作プレートに被検
ハイブリドーマ培養上清を添加し、室温で２時間反応さ
せた。次いでＰＢＳ−Ｔｗで洗浄後ビオチン標識したｔ
ＰＡを添加し、さらに室温で２時間反応させた。次ぎに
アビジン−ＨＲＰ複合体を添加し室温で１時間反応後、
固相に結合したＨＲＰ活性を参考例１に示した方法で測
定した。

【００５５】

【実施例１】 マウス抗ヒトフィブリン特異抗体産生ハ
イブリドーマの作製 免疫原および寛容原の調製 公知の固相合成法によりペプチド合成機（アプライド・
システム社、モデル４３０Ａ型）を用いて次式に示す
Ａ，Ｂ２種のペプチドを合成した。 Ａ： H-Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-
Lys-Cys-OH （８−ｍｅｒ，配列番号１４） Ｂ：H-Phe-Phe-Ser-Ala-Arg-Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-
Lys-OH （１２−ｍｅｒ，配列番号１５） ペプチドＡはヒトフィブリンβ鎖Ｎ末端ペプチド（１−
７）−Ｃｙｓに相当し、ペプチドＢは上記フィブリンβ
鎖Ｎ末端ペプチド（１−７）をＣ端側に含む１２個のア
ミノ酸からなるフィブリノーゲンβ鎖部分ペプチドであ
る。予めメタ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ
・スクシンイミドエステル（以下、ＭＢＳと略記するこ
とがある）を用いてマレイミド化したキーホール・リン
ペット・ヘモシアニン（以下、ＫＬＨと略記することが
ある）にペプチドＡを添加し、ＫＬＨ １モル当りペプ
チドＡ ７分子が結合した（ペプチドＡ）₇−ＫＬＨ複合
体を調製した。ペプチドＢはＭＢＳでマレイミド化した
のち、一方でＳ−アセチル・メルカプト・無水コハク酸
とヒドロキシル・アミンとで連続処理することによりス
ルフヒドリル基を導入したＤ−ＧＬ〔Ｄ−グルタミン酸
とＤ−リジンとの共重合体：分子量３４，３００，Ｄ−
Ｇｌｕ：Ｄ−Ｌｙｓ＝６０：４０（ピアース・ケミカル
ズ社製）〕に添加し、Ｄ−ＧＬ１分子当りペプチドＢ４
分子が結合した（ペプチドＢ）₄−Ｄ−ＧＬ複合体を調
製した。

【００５６】免疫法 免疫原として（ペプチドＡ）₇−ＫＬＨ複合体を、寛容
原として（ペプチドＢ）₄−Ｄ−ＧＬ複合体を用いる免
疫法を採用した。まず初回免疫５日前および３日前にＢ
ＡＬＢ／ｃマウス（♀；ｎ＝１０）に寛容原１ｍｇ／生
理食塩水溶液４００μｌ／マウスを腹腔内投与した。次
いで免疫原の生理食塩水溶液に等量のフロイント不完全
アジュバントを添加し十分乳濁後、４０μｇ／０.２ml
／マウスを腹腔および背部皮下投与した。２〜４回目の
追加免疫は、いずれも免疫原をフロイント不完全アジュ
バントに乳濁し初回と同量を皮下投与したが、それぞれ
の追加免疫５日前および３日前には必らず寛容原５００
μｇ／生理食塩水溶液２００μｌ／マウスを腹腔内投与
した。４回免疫後１０日で最大の血清抗体価を示した個
体について、免疫原（５０μｇ／０.２ml／マウス）を
静脈内投与した。 細胞融合 参考例８−に記載の方法に従い、細胞融合を実施し
た。 ハイブリドーマの選択およびクローニング フィブリノーゲンおよびフィブリン・モノマー結合プレ
ートを用いる参考例５および１に記載のＥＩＡでハイブ
リドーマをスクリーニングし、以下、参考例８−と同
じ要領で抗ヒトフィブリン特異抗体産生ハイブリドーマ
ＦＴＢ２−１３３を取得した。得られた結果は図１１に
示した通りであった。該図においてはフィブリノーゲン
に対する反応性（○：参考例５に記載のＥＩＡ）および
フィブリンに対する反応性（●：参考例１に記載のＥＩ
Ａ）を示している。

【００５７】抗ヒトフィブリン特異抗体産生ハイブリド
ーマＦＴＢ２−１３３はフィブリンにのみ結合能を示
し、フィブリノーゲンにはほとんど反応しなかった。Ｆ
ＴＢ２−１３３抗体の免疫グロブリンクラス、サブクラ
スはオークターロニー法による測定でＩｇＧ₁（κ鎖）
であった。

【００５８】ＨＡＴ感受性株の取得 で得られたＨＡＴ抵抗性のＦＴＢ２−１３３細胞株
を、まず１μＭ濃度の８−ＡＺＧ添加培地で培養し、次
いで順次８−ＡＺＧ濃度を２〜５倍づつ上昇させ、培養
を続けた。１００μＭの８−ＡＺＧに耐性となった細胞
株についてＨＡＴ感受性および抗ヒトフィブリン特異抗
体産生性を測定し、目的の細胞株を選定した。得られた
細胞株は元のＨＡＴ抵抗性株と同等の抗体産生性を有
し、かつＨＡＴ添加培地で１００％死滅した。

【００５９】

【実施例２】 マウス抗フィブリン−抗ｔＰＡムテイン
ｂｓＭｏＡｂの製造（１） 免疫 参考例１６で作製したｔＰＡ−１ １００μｇ／ｍｌ生
理食塩水溶液を用いて、参考例８−と同じ要領でマウ
スを免疫した。 細胞融合 最終免疫後３日で脾臓を摘出し、脾臓細胞懸濁液を常法
により調製した（約１０⁸個）。次いで参考例１−で
取得したＨＡＴ感受性の抗ヒトフィブリン抗体産生ハイ
ブリドーマＦＴＢ２−１３３ ２×１０⁷個を添加し、
参考例８−に示した要領で細胞融合およびＨＡＴ選択
を実施した。 ハイブリッド・ハイブリドーマの選択およびクローニ
ング ｔＰＡ結合マイクロプレートを用いる参考例３に記載の
ＥＩＡおよび抗フィブリン−抗ｔＰＡムテインｂｓＭｏ
Ａｂ活性を測定する参考例６に記載のＥＩＡを用いてハ
イブリッド・ハイブリドーマをスクリーニングし、以下
参考例８−と同じ方法により抗フィブリン−抗ｔＰＡ
ムテインｂｓＭｏＡｂ産生トリオーマＴＡＦ １−４
２，ＴＡＦ １−７９およびＴＡＦ １−２２８を取得し
た。それぞれのトリオーマ培養上清をＥＩＡに供した結
果を表１に示す。

【００６０】

【表１】 トリオーマ 吸光度（４９２ｎｍ） 抗ｔＰＡ抗体活性¹ 二重特異性抗体活性² ＴＡＦ １−４２ １．４７６ １．４６７ ＴＡＦ １−７９ １．４７５ １．４１９ ＴＡＦ １−２２８ １．４５１ ０．６５８ コントロール³ ０．０５１ ０．１９９ １）参考例３参照。 ２）参考例６参照。 ３）ＦＩＢ １−１１抗体産生ハイブリドーマ（参考例
８−参照）の培養上清を使用。 ３種のｂｓＭｏＡｂ ＴＡＦ１−４２，１−７９および
１−２２８はオークターロニー法による測定の結果いず
れもＩｇＧ₁（κ鎖）であった。

【００６１】ハイブリッド抗体の精製 予め０．５ml鉱油を腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウス
１群５匹に５×１０⁶個／マウスのｂｓＭｏＡｂ産生ト
リオーマＴＡＦ １−４２、ＴＡＦ １−７９およびＴＡ
Ｆ １−２２８をそれぞれ腹腔内接種した。約１０〜１
５日後に腹水の貯溜が見られた。抗体の精製は常法によ
り、４５−５０％飽和硫酸アンモニウムで分画後、参考
例８−に記載のヒト・フィブリンβ鎖Ｎ末端ペプチド
（１−１１）−Ｃｙｓを結合したセルロファイン・カラ
ムに供し、アフィニティークロマトグラフィーで抗フィ
ブリン抗体活性を有するＩｇＧ画分を取得した。次いで
ヒドロキシ・アパタイト・カラムを用いる高速液体クロ
マトグラフィーによりｂｓＭｏＡｂを分離、精製した。
こうして腹水各５ｍｌからｂｓＭｏＡｂ ＴＡＦ １−４
２、ＴＡＦ １−７９およびＴＡＦ １−２２８がそれぞ
れ１２ｍｇ、４ｍｇ、３０ｍｇ得られた。得られた結果
を図１２に示す。矢印で示したピークが、参考例６に記
載のＥＩＡでｂｓＭｏＡｂ活性陽性を示したＩｇＧ画分
であった。

【００６２】

【実施例３】 マウス抗フィブリン−抗ｔＰＡムテイン
ｂｓＭｏＡｂの製造（２）細胞融合 参考例８−で取得した抗ヒトフィブリン抗体産生ハイ
ブリドーマＦＩＢ１−１１および参考例１０−で取得
した抗ｔＰＡ抗体産生ハイブリドーマＴＰＡ１−４１
を、それぞれ０．５μｇ／ml ＦＩＴＣおよび１．５μ
g／ml ＴＲＩＴＣ含有イスコフーハムＦ・１２混合培
地で３７℃、３０分間インキュベートし、蛍光染色し
た。次いで、ＬＳＭ溶液（和光純薬工業K.K.販売）を添
加し死細胞を除去したのち、両ハイブリドーマを１：１
の割合で混じ、ＰＥＧ６０００を用いて参考例８−に
記載の方法で細胞融合した。３７℃で２時間インキュベ
ート後、ＦＡＣＳに供することによりフルオレセインお
よびローダミン二重染色された細胞２５，０００個を分
取し、次にフィーダーとしてマウス胸腺細胞を５×１０
⁵個／ウエル播種した９６穴マイクロプレートに、上記
の二重染色細胞を１０個／ウエルの割合で播種し培養し
た。 ハイブリッド・ハイブリドーマの選択およびクローニ
ング 融合後１−２週で細胞増殖のみられたウエルの培養上清
を、それぞれ参考例１、３および６に記載のＥＩＡに供
し抗体活性を測定した。高いハイブリッド抗体活性を示
したウエルについて限界希釈法によるクローニングを実
施し、目的の二重特異性抗体産生マウス・ハイブリッド
・ハイブリドーマ（テトラオーマ）ＦＴ２−１４を取得
した。

【００６３】ハイブリッド抗体の精製 予め０．５ml鉱油を腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウス
６匹に５×１０⁶個／マウスのマウスハイブリッド・ハ
イブリドーマＦＴ２−１４を腹腔内接種した。約１０〜
２０日後に腹水の貯溜が認められたのでそれを採取し、
４５−５０％飽和硫酸アンモニウムで塩析してＩｇＧ画
分を得た。次いで２０mM ＰＢＳで平衡化したフィブリ
ン結合セルロファイン・カラムに供し、０．２Ｍグリシ
ン・塩酸緩衝液（pH ２．９）で溶出した。得られた蛋
白画分を１Ｎ ＮａＯＨで中和後、１０mMリン酸カリウ
ム緩衝液（pH ６．８）で透析し、同じ緩衝液で平衡化
したヒドロキシアパタイト・カラムを用いる高速液体ク
ロマトグラフィーに供した。リン酸カリウム緩衝液（pH
６．８）１０mMから２１０mMの塩濃度勾配溶出法を用
いて二重特異性ハイブリッド抗体ＦＴ２−１４を精製し
た。約５０mlの腹水液から４７mgの精製抗体ＦＴ２−１
４を取得した。得られた精製ｂｓＭｏＡｂ ＦＴ２−１
４を、参考例６に記載の抗フィブリン−抗ｔＰＡムテイ
ン・ハイブリッド抗体測定用ＥＩＡの供した結果を図１
４に示す。ヒトフィブリンおよびｔＰＡ−６’の相方に
強い結合活性を有することが明らかとなった。

【００６４】Ｆ（ａｂ’）₂の精製 得られた精製抗体ＦＴ２−１４を２０mM酢酸緩衝液（pH
３．５）に溶解し、ペプシン不溶化カラム（５mgペプ
シン／２．５mlセルロファイン・ゲル）に供した。３７
℃において３ml／時間の流速でゆっくりと溶出し、ペプ
シン消化物を得た。１Ｎ ＮａＯＨでpH ７．５に調整
後プロテインＡ・カラムに供し、ＰＢＳ（pH ７．５）
で溶出する蛋白画分を分取した。さらにフィブリン結合
カラムに供し、ＰＢＳでカラムを溶出・洗浄後、pH
２．５のグリシン−塩酸緩衝液でフィブリン結合活性を
有するＦ（ａｂ’)₂画分を溶離した。約４０mgのＦＴ２
−１４（全ＩｇＧ分子）から４．３mgのＦＴ２−１４
Ｆ（ａｂ’）₂画分を取得した。 二重特異性抗体活性 で得られたＦ（ａｂ’）₂画分を参考例６に記載のＥ
ＩＡに供し二重特異性抗体活性を測定した。得られた結
果は図１４に示した通りであった。図中、抗フィブリン
・抗ｔＰＡムテインｂｓＭｏＡｂ ＦＴ２−１４（●）
およびそのＦ（ａｂ’）₂画分（○）に関する結果を示
す。ＦＴ２−１４ Ｆ（ａｂ’）₂画分はＩｇＧ全分子
と同様にフィブリンおよびｔＰＡムテインの両者に強い
結合能を示した。

【００６５】

【実施例４】免疫複合体液の調製 一定量のｔＰＡ（最終濃度０．１μｇ／ｍｌ）および参
考例１９に記載のｔＰＡ−６’（最終濃度０．５μｇ／
ｍｌ）に種々の濃度の実施例２で得られたマウス抗フィ
ブリン−抗ｔＰＡムテインｂｓＭｏＡｂを添加し、室温
で２０分間免疫反応させて免疫複合体液を調製した。

【００６６】

【実施例５】 フィブリン溶解能の増強効果 公知の方法〔D. Collenら：スロンボーシス・アンド・
ヘモスターシス（Thromb. Haemostasis). 45, 225 (198
1)〕に従い、血漿凝塊溶解試験（plasma clot lysis as
say）を実施した。すなわち、実施例４で得られた免疫
複合体にヒト血漿を添加し、次いでヒト・トロンビンを
最終濃度１．０単位／ｍｌとなるように加えて凝固させ
た。溶解度分析計（Euglobulin lysis analyzer "ELT-
6" MebanixCo.）を用いて血漿の濁度を経時的に観察
し、溶解に要する時間を測定した。非修飾型ｔＰＡに対
しては３種のｂｓＭｏＡｂ（ＴＡＦ １−４２，ＴＡＦ
１−７９およびＴＡＦ １−２２８）はいずれもフィブ
リン溶解能の増強効果を示さなかった。ｔＰＡ−６’に
対しては２種のｂｓＭｏＡｂ（ＴＡＦ １−４２および
ＴＡＦ １−７９）が増強効果を示さなかったが、ＴＡ
Ｆ １−２２８は図１３に示したようにｔＰＡ−６’の
線溶活性として用量依存的に最大５倍以上の増強効果を
示した。図中、縦軸は非修飾ｔＰＡ単剤（●）もしくは
ｔＰＡムテインｔＰＡ−６’単剤（○）の溶解能を１０
０％とした時の、それぞれｔＰＡ／抗体複合体（●）も
しくはｔＰＡ−６’／抗体複合体（○）の溶解能を表
す。

【００６７】

【実施例６】 マウス抗活性化血小板−ｔＰＡムテイン
・ｂｓＭｏＡｂの製造単特異性抗体の精製 参考例９および１０にそれぞれ記載の抗活性化血小板抗
体産生ハイブリドーマ２Ｔ６０および抗ｔＰＡムテイン
抗体産生ハイブリドーマＴＰＡ１−４１を用いて、実施
例２−に記載の方法に従い腹水化し、さらに精製して
ＩｇＧ抗体画分を得た。Ｆ（ａｂ’）₂の調製 上記で調製した２種の抗体ＩｇＧ画分をそれぞれ公知
の方法［M.Marianiら：モレキュラー・イムノロジー（M
ol.Immunol.），28，69（1991）］に供し、フィシン
（シグマ社販売）を用いてトリス・塩酸緩衝液中（ｐＨ
７．０）で分解した。Ｌ−システイン（和光純薬販売）
を添加し（最終濃度１ｍＭ）反応を活性化したのち、３
７℃で４時間インキュベートした。１００ｍＭ Ｎ−エ
チルマレイミドの添加で反応停止後、得られた抗体フラ
グメント溶液をＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で透析した。そ
れぞれの抗体溶液を同じＰＢＳで平衡化したプロテイン
Ａカラム（２．６×４．７ｃｍ）に供し、素通リ画分を
分取した。さらに、ＴＳＫゲル（東洋ソーダ製造）を用
いるゲル濾過カラム・クロマトグラフィーに供してＦ
（ａｂ’）₂画分を調製した。ヘテロダイメリックＦ（ａｂ’）₂の調製 上記で調製した２Ｔ６０抗体由来のＦ（ａｂ’）₂を
ＤＴＴで還元後、ｏ−フェニレンジマレイミドを用いる
公知の方法［M.J.Glennieら：ジャーナル・オブ・イム
ノロジー（J.Immunol.），139，2367（1987）］に従っ
て２Ｔ６０ Ｆａｂ’画分のスルフヒドリル基をマレイ
ミド化した。一方上記で調製したＴＰＡ１−４１抗体
由来のＦ（ａｂ’）₂を同様にＤＴＴで還元後、セファ
デックスＧ２５ゲル濾過カラム・クロマトグラフィーを
用いて過剰のＤＴＴを分離ないし除去し、上記のマレイ
ミド化２Ｔ６０ Ｆａｂ’にモル比１：１で添加し、チ
オエーテル結合により２種の異なった特異性を有する抗
体Ｆａｂ’をヘテロダイメリックに結合させた。得られ
る反応混合物をウルトロ・ゲルＡｃＡ４４カラム（ＬＫ
Ｂ社販売）を用いるゲル濾過カラム・クロマトグラフィ
ーに供し、ヘテロダイメリックＦ（ａｂ’）₂を精製分
取した。両単特異性抗体精製ＩｇＧ標品１０ｍｇより目
的の二重特異性Ｆ（ａｂ’）₂を抗体約１１ｍｇを得
た。二重特異性抗体活性 で調製したヘテロダイメリックＦ（ａｂ’）₂画分を
参考例２０に記載のＥＩＡに供し抗活性化血小板−抗ｔ
ＰＡムテイン二重特異性抗体活性を測定した。得られた
結果は図１５に示した通りであった。

【００６８】

【発明の効果】本発明のハイブリッドｂｓＭｏＡｂは、
ｔＰＡムテインの血栓溶解能を損なうことなく該ｔＰＡ
ムテインと結合し、かつ血栓への親和性、選択性を大幅
に増大することが可能である。従ってハイブリッドＭｏ
ＡｂとｔＰＡムテインとの１：１免疫複合体を作製する
ことにより、選択的かつ効率的な血栓の溶解、除去が可
能となる。

【００６９】

【００７０】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント

【００７１】配列番号：2 配列の長さ：16 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Phe Phe Ser Ala Arg Gly His Arg Pro Leu Asp Lys Lys Arg Glu Glu 1 5 10 15。

【００７２】配列番号：3 配列の長さ：13 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser 1 5 10。

【００７３】配列番号：4 配列の長さ：13 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Arg-Met-Thr-Leu-Val-Gly-Ile-Ile-Ser-Trp-Gly-Leu-Gly 1 5 10。

【００７４】配列番号：5 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント-stop

【００７５】配列番号：6 配列の長さ：39 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAC CGC AGG CTG ACG TGG GAG TAC TGT GAT GTG CCC TCC 39。

【００７６】配列番号：7 配列の長さ：39 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGC ATG ACT TTG GTG GGC ATC ATC AGC TGG GGC CTG GGC 39。

【００７７】配列番号：8 配列の長さ：39 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAC TAC CTA GAC TGG ATT CGT GAC AAC ATG CGA CCG TGA 39。

【００７８】配列番号：9 配列の長さ：1800 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 ヒト包皮由来初代培養細胞 配列の特徴 存在位置：552..554 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ＡＡＡＡＣＣＴＣＴＧ ＣＧＡＧＧＡＡＡＧＧ ＧＡＡＧＧＡＧＣＡＡ ＧＣＣ
ＧＴＧＡＡＴＴ ＴＡＡＧＧＧＡＣＧＣ ＴＧＴＧＡＡＧＣＡＡ 60 TC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT 107 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys -35 -30 -25 GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC CAG GAA ATC CAT GCC CGA TTC AGA 155 Gly Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg -20 -15 -10 -5 AGA GGA GCC AGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AGA GAT GAA AAA ACG CAG 203 Arg Gly Ala Arg Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln 1 5 10 ATG ATA TAC CAG CAA CAT CAG TCA TGG CTG CGC CCT GTG CTC AGA AGC 251 Met Ile Tyr Gln Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser 15 20 25 AAC CGG GTG GAA TAT TGC TGG TGC AAC AGT GGC AGG GCA CAG TGC CAC 299 Asn Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His 30 35 40 TCA GTG CCT GTC AAA AGT TGC AGC GAG CCA AGG TGT TTC AAC GGG GGC 347 Ser Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly 45 50 55 60 ACC TGC CAG CAG GCC CTG TAC TTC TCA GAT TTC GTG TGC CAG TGC CCC 395 Thr Cys Gln Gln Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro 65 70 75 GAA GGA TTT GCT GGG AAG TGC TGT GAA ATA GAT ACC AGG GCC ACG TGC 443 Glu Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys 80 85 90 TAC GAG GAC CAG GGC ATC AGC TAC AGG GGC ACG TGG AGC ACA GCG GAG 491 Tyr Glu Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu 95 100 105 AGT GGC GCC GAG TGC ACC AAC TGG AAC AGC AGC GCG TTG GCC CAG AAG 539 Ser Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys 110 115 120 CCC TAC AGT GGG TGG AGG CCA GAC GCC ATC AGG CTG GGC CTG GGG AAC 587 Pro Tyr Ser Gly Trp Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn 125 130 135 140 CAC AAC TAC TGC AGA AAC CCA GAT CGA GAC TCA AAG CCC TGG TGC TAC 635 His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr 145 150 155 GTC TTT AAG GCG GGG AAG TAC AGC TCA GAG TTC TGC AGC ACC CCT GCC 683 Val Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala 160 165 170 TGC TCT GAG GGA AAC AGT GAC TGC TAC TTT GGG AAT GGG TCA GCC TAC 731 Cys Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr 175 180 185 CGT GGC ACG CAC AGC CTC ACC GAG TCG GGT GCC TCC TGC CTC CCG TGG 779 Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp 190 195 200 AAT TCC ATG ATC CTG ATA GGC AAG GTT TAC ACA GCA CAG AAC CCC AGT 827 Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser 205 210 215 220 GCC CAG GCA CTG GGC CTG GGC AAA CAT AAT TAC TGC CGG AAT CCT GAT 875 Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp 225 230 235 GGG GAT GCC AAG CCC TGG TGC CAC GTG CTG AAG AAC CGC AGG CTG ACG 923 Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr 240 245 250 TGG GAG TAC TGT GAT GTG CCC TCC TGC TCC ACC TGC GGC CTG AGA CAG 971 Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln 255 260 265 TAC AGC CAG CCT CAG TTT CGC ATC AAA GGA GGG CTC TTC GCC GAC ATC 1019 Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile 270 275 280 GCC TCC CAC CCC TGG CAG GCT GCC ATC TTT GCC AAG CAC AGG AGG TCG 1067 Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser 285 290 295 300 CCC GGA GAG CGG TTC CTG TGC GGG GGC ATA CTC ATC AGC TCC TGC TGG 1115 Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp 305 310 315 ATT CTC TCT GCC GCC CAC TGC TTC CAG GAG AGG TTT CCG CCC CAC CAC 1163 Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His 320 325 330 CTG ACG GTG ATC TTG GGC AGA ACA TAC CGG GTG GTC CCT GGC GAG GAG 1211 Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu 335 340 345 GAG CAG AAA TTT GAA GTC GAA AAA TAC ATT GTC CAT AAG GAA TTC GAT 1259 Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp 350 355 360 GAT GAC ACT TAC GAC AAT GAC ATT GCG CTG CTG CAG CTG AAA TCG GAT 1307 Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp 365 370 375 380 TCG TCC CGC TGT GCC CAG GAG AGC AGC GTG GTC CGC ACT GTG TGC CTT 1355 Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu 385 390 395 CCC CCG GAG GAC CTG CAG CTG CCG GAC TGG ACG GAG TGT GAG CTC TCC 1403 Pro Pro Glu Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser 400 405 410 GGC TAC GGC AAG CAT GAG GCC TTG TCT CCT TTC TAT TCG GAG CGG CTG 1451 Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu 415 420 425 AAG GAG GCT CAT GTC AGA CTG TAC CCA TCC AGC CGC TGC ACA TCA CAA 1499 Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln 430 435 440 CAT TTA CTT AAC AGA ACA GTC ACC GAC AAC ATG CTG TGT GCT GGA GAC 1547 His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp 445 450 455 460 ACT CGG AGC GGC GGG CCC CAG GCA AAC TTG CAC GAC GCC TGC CAG GGC 1595 Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly 465 470 475 GAT TCG GGA GGC CCC CTG GTG TGT CTG AAC GAT GGC CGC ATG ACT TTG 1643 Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu 480 485 490 GTG GGC ATC ATC AGC TGG GGC CTG GGC TGT GGA CAG AAG GAT GTC CCG 1691 Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro 495 500 505 GGT GTG TAC ACC AAG GTT ACC AAC TAC CTA GAC TGG ATT CGT GAC AAC 1739 Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn 510 515 520 ATG CGA CCG TGACCAGGAA CACCCGACTC CTCAAAAGCA AATGAGATCC 1788 Met Arg Pro 525 527 CGCCTCTTCT TC 1800。

【００７９】配列番号：10 配列の長さ：36 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACTGTTTCCC TCAGACATAT GAGGGGTGCT GCAGAA 36。

【００８０】配列番号：11 配列の長さ：1068 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列番号７を修飾 配列の特徴 存在位置：１〜173までのアミノ酸欠損 特徴を決定した方法：P 配列 ATG TCT GAG GGA AAC AGT GAC TGC TAC TTT GGG AAT GGG TCA GCC TAC 48 Met Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr 1 5 10 15 CGT GGC ACG CAC AGC CTC ACC GAG TCG GGT GCC TCC TGC CTC CCG TGG 96 Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp 20 25 30 AAT TCC ATG ATC CTG ATA GGC AAG GTT TAC ACA GCA CAG AAC CCC AGT 144 Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser 35 40 45 GCC CAG GCA CTG GGC CTG GGC AAA CAT AAT TAC TGC CGG AAT CCT GAT 192 Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp 50 55 60 GGG GAT GCC AAG CCC TGG TGC CAC GTG CTG AAG AAC CGC AGG CTG ACG 240 Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr 65 70 75 80 TGG GAG TAC TGT GAT GTG CCC TCC TGC TCC ACC TGC GGC CTG AGA CAG 288 Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln 85 90 95 TAC AGC CAG CCT CAG TTT CGC ATC AAA GGA GGG CTC TTC GCC GAC ATC 336 Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile 100 105 110 GCC TCC CAC CCC TGG CAG GCT GCC ATC TTT GCC AAG CAC AGG AGG TCG 384 Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser 115 120 125 CCC GGA GAG CGG TTC CTG TGC GGG GGC ATA CTC ATC AGC TCC TGC TGG 432 Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp 130 135 140 ATT CTC TCT GCC GCC CAC TGC TTC CAG GAG AGG TTT CCG CCC CAC CAC 480 Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His 145 150 155 160 CTG ACG GTG ATC TTG GGC AGA ACA TAC CGG GTG GTC CCT GGC GAG GAG 528 Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu 165 170 175 GAG CAG AAA TTT GAA GTC GAA AAA TAC ATT GTC CAT AAG GAA TTC GAT 576 Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp 180 185 190 GAT GAC ACT TAC GAC AAT GAC ATT GCG CTG CTG CAG CTG AAA TCG GAT 624 Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp 195 200 205 TCG TCC CGC TGT GCC CAG GAG AGC AGC GTG GTC CGC ACT GTG TGC CTT 672 Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu 210 215 220 CCC CCG GAG GAC CTG CAG CTG CCG GAC TGG ACG GAG TGT GAG CTC TCC 720 Pro Pro Glu Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser 225 230 235 240 GGC TAC GGC AAG CAT GAG GCC TTG TCT CCT TTC TAT TCG GAG CGG CTG 768 Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu 245 250 255 AAG GAG GCT CAT GTC AGA CTG TAC CCA TCC AGC CGC TGC ACA TCA CAA 816 Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln 260 265 270 CAT TTA CTT AAC AGA ACA GTC ACC GAC AAC ATG CTG TGT GCT GGA GAC 864 His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp 275 280 285 ACT CGG AGC GGC GGG CCC CAG GCA AAC TTG CAC GAC GCC TGC CAG GGC 912 Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly 290 295 300 GAT TCG GGA GGC CCC CTG GTG TGT CTG AAC GAT GGC CGC ATG ACT TTG 960 Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu 305 310 315 320 GTG GGC ATC ATC AGC TGG GGC CTG GGC TGT GGA CAG AAG GAT GTC CCG 1008 Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro 325 330 335 GGT GTG TAC ACC AAG GTT ACC AAC TAC CTA GAC TGG ATT CGT GAC AAC 1056 Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn 340 345 350 ATG CGA CCG TGA 1068 Met Arg Pro 355。

【００８１】配列番号：12 配列の長さ：24 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGCGACTCT TCGTGCTTGG CAAA 24。

【００８２】配列番号：13 配列の長さ：1068 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列番号9を修飾 配列の特徴 存在位置：１〜173までのアミノ酸欠損、298及び299位
アミノ酸置換 特徴を決定した方法：P 配列 ATG TCT GAG GGA AAC AGT GAC TGC TAC TTT GGG AAT GGG TCA GCC TAC 48 Met Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr 1 5 10 15 CGT GGC ACG CAC AGC CTC ACC GAG TCG GGT GCC TCC TGC CTC CCG TGG 96 Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp 20 25 30 AAT TCC ATG ATC CTG ATA GGC AAG GTT TAC ACA GCA CAG AAC CCC AGT 144 Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser 35 40 45 GCC CAG GCA CTG GGC CTG GGC AAA CAT AAT TAC TGC CGG AAT CCT GAT 192 Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp 50 55 60 GGG GAT GCC AAG CCC TGG TGC CAC GTG CTG AAG AAC CGC AGG CTG ACG 240 Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr 65 70 75 80 TGG GAG TAC TGT GAT GTG CCC TCC TGC TCC ACC TGC GGC CTG AGA CAG 288 Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln 85 90 95 TAC AGC CAG CCT CAG TTT CGC ATC AAA GGA GGG CTC TTC GCC GAC ATC 336 Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile 100 105 110 GCC TCC CAC CCC TGG CAG GCT GCC ATC TTT GCC AAG CAC GAA GAG TCG 384 Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Glu Glu Ser 115 120 125 CCC GGA GAG CGG TTC CTG TGC GGG GGC ATA CTC ATC AGC TCC TGC TGG 432 Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp 130 135 140 ATT CTC TCT GCC GCC CAC TGC TTC CAG GAG AGG TTT CCG CCC CAC CAC 480 Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His 145 150 155 160 CTG ACG GTG ATC TTG GGC AGA ACA TAC CGG GTG GTC CCT GGC GAG GAG 528 Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu 165 170 175 GAG CAG AAA TTT GAA GTC GAA AAA TAC ATT GTC CAT AAG GAA TTC GAT 576 Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp 180 185 190 GAT GAC ACT TAC GAC AAT GAC ATT GCG CTG CTG CAG CTG AAA TCG GAT 624 Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp 195 200 205 TCG TCC CGC TGT GCC CAG GAG AGC AGC GTG GTC CGC ACT GTG TGC CTT 672 Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu 210 215 220 CCC CCG GAG GAC CTG CAG CTG CCG GAC TGG ACG GAG TGT GAG CTC TCC 720 Pro Pro Glu Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser 225 230 235 240 GGC TAC GGC AAG CAT GAG GCC TTG TCT CCT TTC TAT TCG GAG CGG CTG 768 Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu 245 250 255 AAG GAG GCT CAT GTC AGA CTG TAC CCA TCC AGC CGC TGC ACA TCA CAA 816 Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln 260 265 270 CAT TTA CTT AAC AGA ACA GTC ACC GAC AAC ATG CTG TGT GCT GGA GAC 864 His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp 275 280 285 ACT CGG AGC GGC GGG CCC CAG GCA AAC TTG CAC GAC GCC TGC CAG GGC 912 Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly 290 295 300 GAT TCG GGA GGC CCC CTG GTG TGT CTG AAC GAT GGC CGC ATG ACT TTG 960 Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu 305 310 315 320 GTG GGC ATC ATC AGC TGG GGC CTG GGC TGT GGA CAG AAG GAT GTC CCG 1008 Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro 325 330 335 GGT GTG TAC ACC AAG GTT ACC AAC TAC CTA GAC TGG ATT CGT GAC AAC 1056 Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn 340 345 350 ATG CGA CCG TGA 1068 Met Arg Pro 355。

【００８３】配列番号：14 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント

【００８４】配列番号：15 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント

【図面の簡単な説明】

【図１】ｔＰＡおよびｔＰＡムテインの構造を示す模式
図である。

【図２】ＩｇＧの構造を示す模式図である。

【図３】参考例１で得られたヒトｔＰＡ ｃＤＮＡの塩
基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列である。

【図４】プラスミドｐＴＢ９２０の構築図である。

【図５】プラスミドｐＴＢ９２７の構築図である。

【図６】ヒトｔＰＡムテインｔＰＡ−１を得るに当って
行われた特定部位変異の模式図である。

【図７】ヒトｔＰＡムテインｔＰＡ−１の塩基配列およ
びそれから推定されるアミノ酸配列である。

【図８】プラスミドｐＴＢ１１２８および１１３３の構
築図である。

【図９】プラスミドｐＴＢ１０３８および１２７７の構
築図である。

【図１０】ヒトｔＰＡムテインｔＰＡ−６’の塩基配列
およびそれから推定されるアミノ酸配列である。

【図１１】実施例１で得られた抗ヒト・フィブリン特異
抗体ＦＴＢ２−１３３の抗体希釈曲線を表わす。フィブ
リノーゲンに対する反応性（○：参考例５に記載のＥＩ
Ａ）およびフィブリンに対する反応性（●：参考例１に
記載のＥＩＡ）を示す。

【図１２】実施例２−（４）に記載の抗フィブリン・抗
ｔＰＡムテインｂｓＭｏＡｂ（ＴＡＦ１−４２，ＴＡＦ
１−７９およびＴＡＦ１−２２８）の精製結果を表す。
すなわち、ｂｓＭｏＡｂを含有する腹水液より塩析処理
でＩｇＧ画分を取得し、さらにフィブリンβ鎖Ｎ末端ペ
プチド結合カラムで精製したのち、ヒドロキシ・アパタ
イト・カラムに供した結果を示す。クロマト・パターン
は溶出液の２８０ｎｍでの吸光度で示し、矢印は参考例
６に記載のＥＩＡでｂｓＭｏＡｂ活性陽性のピークを示
す。

【図１３】実施例２−に記載の抗フィブリン・抗ｔＰ
ＡムテインｂｓＭｏＡｂ ＴＡＦ１−２２８をｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ血漿凝塊溶解試験に供した時の結果を表す。縦
軸は非修飾ｔＰＡ単剤（●）もしくはｔＰＡムテインｔ
ＰＡ−６’単剤（○）の溶解能を１００％とした時の、
それぞれｔＰＡ／抗体複合体（●）もしくはｔＰＡ−
６’／抗体複合体（○）の溶解能を表す（実施例５参
照）。

【図１４】実施例３に記載の抗フィブリン・抗ｔＰＡム
テインｂｓＭｏＡｂ ＦＴ２−１４（●）およびそのＦ
（ａｂ’）₂画分（○）を、参考例６に記載のＥＩＡで
測定した結果を表す。

【図１５】実施例６−に記載の抗活性化血小板−抗ｔ
ＰＡムテイン二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）₂の活性を参
考例２０に記載のＥＩＡで測定した結果を表す（実施例
６−参照）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＣＢ Ｐ 9284−4Ｃ // Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】二重特異性の一方が血栓に対するものであ
   り、他方がフィンガー（Ｆ）ドメイン、成長因子（Ｅ）
   ドメインおよびクリングル（Ｋ）１ドメインを欠失して
   なる組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）ム
   テインに対するものである二重特異性抗体。
2. 【請求項２】血栓がフィブリンである請求項１記載の二
   重特異性抗体。
3. 【請求項３】血栓が活性化血小板である請求項１記載の
   二重特異性抗体。
4. 【請求項４】少なくとも可変領域を含有し、かつ重鎖定
   常領域ドメイン２および３を欠失する請求項１記載の二
   重特異性抗体。
5. 【請求項５】二重特異性抗体がＦ（ａｂ’）₂である請
   求項４記載の二重特異性抗体。
6. 【請求項６】請求項１記載の二重特異性抗体に、Ｆ、Ｅ
   およびＫ１ドメインを欠失してなるｔＰＡムテインを、
   免疫結合させてなる血栓溶解剤。
7. 【請求項７】ｔＰＡムテインがアミノ酸残基番号296か
   ら302の領域の一部ないし全部を欠失してなるものであ
   る、請求項６記載の血栓溶解剤。
8. 【請求項８】ｔＰＡムテインがアミノ酸残基番号296か
   ら304の間のアミノ酸残基の一部ないし全部を別のアミ
   ノ酸残基に置換してなるものである、請求項６記載の血
   栓溶解剤。
9. 【請求項９】ｔＰＡムテインがアミノ酸残基番号296か
   ら302の領域の一部ないし全部を欠失させ、かつアミノ
   酸残基番号296から304の領域の一部のアミノ酸残基を別
   のアミノ酸残基に置換してなるものである、請求項７記
   載の血栓溶解剤。