JPH07138296A - Ｃｓｖｔｃｇ特異的腫瘍細胞の接着受容体の精製及び特性付け - Google Patents
Ｃｓｖｔｃｇ特異的腫瘍細胞の接着受容体の精製及び特性付けInfo
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 トロンボスポンジンのＣＳＶＴＣＧ領域に特
異的な細胞マトリックス受容体、並びにその精製、クロ
ーニング及び発現方法。 【効果】 該受容体蛋白に対する抗体は、多数の診断、
予防及び治療領域で有用である。
異的な細胞マトリックス受容体、並びにその精製、クロ
ーニング及び発現方法。 【効果】 該受容体蛋白に対する抗体は、多数の診断、
予防及び治療領域で有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】腫瘍細胞の表面に発現されるトロ
ンボスポンジン（thrombospondin）のＣＳＶＴＣＧ（配
列番号：１）領域に特異的な細胞間マトリックス受容体
が、ＣＳＶＴＣＧ−特異的受容体の精製法と共に提供さ
れる。該ＣＳＶＴＣＧ−特異的受容体及び該受容体に対
する抗体は、癌診断のための結合アツセイ及び癌管理に
おける配位子（ligand）としての利用の如く、多数の診
断及び治療状況において有用である。
ンボスポンジン（thrombospondin）のＣＳＶＴＣＧ（配
列番号：１）領域に特異的な細胞間マトリックス受容体
が、ＣＳＶＴＣＧ−特異的受容体の精製法と共に提供さ
れる。該ＣＳＶＴＣＧ−特異的受容体及び該受容体に対
する抗体は、癌診断のための結合アツセイ及び癌管理に
おける配位子（ligand）としての利用の如く、多数の診
断及び治療状況において有用である。
【０００２】
【従来の技術】基底膜（basement membrane）は、器官
実質細胞を間隙性膠原支質と分離している、遍在性の特
殊化された細胞外マトリックスである。このマトリック
スと細胞との相互作用は正常及び腫瘍性の両方の細胞過
程の重要な側面である。正常細胞は生存、増殖及び分化
のために細胞外マトリックスが必要であるようであり、
一方移動性細胞は正常及び腫瘍性のいずれも、１の組織
から他への移動において基底膜を横切らねばならない。
特に鱗状の（squamous）又は腺性（glandular）上皮に
起きる転移性癌細胞は、循環系及びリンパ系に入る（血
管内異物侵入）ために基底膜を横切らねばらなず；該循
環腫瘍（circulating neoplastic）細胞は典型的には
器官の毛細血管床内に拘留され、血管壁に侵入し、そし
て基底膜から血管外組織へ貫通し（血管外遊出）、そこ
で第２の新生物（neoplasm）が確立される。このように
基底膜と細胞の相互作用の機構は非常に興味深いもので
ある。
実質細胞を間隙性膠原支質と分離している、遍在性の特
殊化された細胞外マトリックスである。このマトリック
スと細胞との相互作用は正常及び腫瘍性の両方の細胞過
程の重要な側面である。正常細胞は生存、増殖及び分化
のために細胞外マトリックスが必要であるようであり、
一方移動性細胞は正常及び腫瘍性のいずれも、１の組織
から他への移動において基底膜を横切らねばならない。
特に鱗状の（squamous）又は腺性（glandular）上皮に
起きる転移性癌細胞は、循環系及びリンパ系に入る（血
管内異物侵入）ために基底膜を横切らねばらなず；該循
環腫瘍（circulating neoplastic）細胞は典型的には
器官の毛細血管床内に拘留され、血管壁に侵入し、そし
て基底膜から血管外組織へ貫通し（血管外遊出）、そこ
で第２の新生物（neoplasm）が確立される。このように
基底膜と細胞の相互作用の機構は非常に興味深いもので
ある。
【０００３】細胞の細胞外マトリックスとの相互作用
は、細胞が該マトリックスに自身を付着させる能力に依
存している。この付着は、典型的には該マトリックス中
に存在する不連続なコラーゲン種（type）に細胞を結合
させる特定の糖蛋白により媒介され得ることが知られて
いる。線維芽細胞、筋芽細胞及び平滑筋細胞の間隙性Ｉ
型及びＩＩＩ型コラーゲンへのフィブロネクチン媒介付
着、及び軟骨細胞のＩＩ型軟骨コラーゲンへのコンドロ
ネクチン媒介付着が代表例である。
は、細胞が該マトリックスに自身を付着させる能力に依
存している。この付着は、典型的には該マトリックス中
に存在する不連続なコラーゲン種（type）に細胞を結合
させる特定の糖蛋白により媒介され得ることが知られて
いる。線維芽細胞、筋芽細胞及び平滑筋細胞の間隙性Ｉ
型及びＩＩＩ型コラーゲンへのフィブロネクチン媒介付
着、及び軟骨細胞のＩＩ型軟骨コラーゲンへのコンドロ
ネクチン媒介付着が代表例である。
【０００４】正常及び腫瘍性（neoplastic）の両細胞の
基底膜への付着が同様に媒介されていることが見出され
た。基底膜の主要な構成成分はＩＶ型コラーゲン、糖蛋
白（glycoprotein）及びプロテオグリカンである。糖蛋
白ラミニンは上皮及び腫瘍両細胞の基底膜への付着を媒
介し、細胞をＩＶ型コラーゲンに結合させる。前に記し
た如く転移しつつある腫瘍細胞は転移過程において複数
の段階で基底膜を横切らねばならず、且つこの過程の最
初の工程は腫瘍細胞の基底膜への付着であるから、この
機構の明瞭化及びこの膜への腫瘍細胞の付着を促進し又
は阻害する特異的付着因子の特性を導き出すことは、癌
の診断及び処置のために重要な意味をもつ。
基底膜への付着が同様に媒介されていることが見出され
た。基底膜の主要な構成成分はＩＶ型コラーゲン、糖蛋
白（glycoprotein）及びプロテオグリカンである。糖蛋
白ラミニンは上皮及び腫瘍両細胞の基底膜への付着を媒
介し、細胞をＩＶ型コラーゲンに結合させる。前に記し
た如く転移しつつある腫瘍細胞は転移過程において複数
の段階で基底膜を横切らねばならず、且つこの過程の最
初の工程は腫瘍細胞の基底膜への付着であるから、この
機構の明瞭化及びこの膜への腫瘍細胞の付着を促進し又
は阻害する特異的付着因子の特性を導き出すことは、癌
の診断及び処置のために重要な意味をもつ。
【０００５】多くの研究が、ＴＳＰが同一細胞上の複数
の細胞表面受容体に結合でき、又は異なる細胞上の異な
る受容体に結合できることを示している。例えば、血小
板はＧＰＩＩb−ＩＩＩa、ＧＰＩa−ＩＩa（Ｋａｒｃｚ
ｅｗｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）
２６４：２１３３２−２１３２６及びＴｕｓｚｙｎｓｋ
ｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９１）８
７：１３８７−１３９４）、及びヒドロネクチレン受容
体（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉら、Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．
（１９８９）１８２：４８１）によってＴＳＰに結合で
きる。平滑筋細胞、上皮細胞、Ｕ９３７単球様細胞及び
黒色腫細胞はビトロネクチン様受容体を介してＴＳＰに
結合できる。鱗状細胞癌はインテグリン（integrin）又
はＧＰＩＶではないＭｒ ８０，０００／１０５，００
０を介してＴＳＰに結合する（Ｙａｂｋｏｗｉｔｚら、
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９１）ＳＩ：３６４８−
３６５６）。
の細胞表面受容体に結合でき、又は異なる細胞上の異な
る受容体に結合できることを示している。例えば、血小
板はＧＰＩＩb−ＩＩＩa、ＧＰＩa−ＩＩa（Ｋａｒｃｚ
ｅｗｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）
２６４：２１３３２−２１３２６及びＴｕｓｚｙｎｓｋ
ｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９１）８
７：１３８７−１３９４）、及びヒドロネクチレン受容
体（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉら、Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．
（１９８９）１８２：４８１）によってＴＳＰに結合で
きる。平滑筋細胞、上皮細胞、Ｕ９３７単球様細胞及び
黒色腫細胞はビトロネクチン様受容体を介してＴＳＰに
結合できる。鱗状細胞癌はインテグリン（integrin）又
はＧＰＩＶではないＭｒ ８０，０００／１０５，００
０を介してＴＳＰに結合する（Ｙａｂｋｏｗｉｔｚら、
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９１）ＳＩ：３６４８−
３６５６）。
【０００６】他の細胞外マトリックス蛋白に対する受容
体が単離された。Ｌｉｏｔｔａら（米国特許第４，５６
５，７８９号）はラミニン受容体の単離を記載してい
る。Ｍｅｃｈａｍら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９
８９）２６４：１６６５２−７）は６７ｋｄラミニン受
容体と構造的及び機能的類似性を示すエラスチン受容体
を記載している。ＣＤ３６はトロンボスポンジンのＣＳ
ＶＴＣＧ配列に結合すると示唆された（Ａｓｃｈら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．
（１９９２）１８２：１２０８−１２１７）。しかしな
がらＣＤ３６は８８ｋｄ蛋白である。本発明のＣＳＶＴ
ＣＧ特異的受容体は、これらの過去に単離された細胞外
マトリックス蛋白受容体とは異なる。
体が単離された。Ｌｉｏｔｔａら（米国特許第４，５６
５，７８９号）はラミニン受容体の単離を記載してい
る。Ｍｅｃｈａｍら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９
８９）２６４：１６６５２−７）は６７ｋｄラミニン受
容体と構造的及び機能的類似性を示すエラスチン受容体
を記載している。ＣＤ３６はトロンボスポンジンのＣＳ
ＶＴＣＧ配列に結合すると示唆された（Ａｓｃｈら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．
（１９９２）１８２：１２０８−１２１７）。しかしな
がらＣＤ３６は８８ｋｄ蛋白である。本発明のＣＳＶＴ
ＣＧ特異的受容体は、これらの過去に単離された細胞外
マトリックス蛋白受容体とは異なる。
【０００７】
【発明の要約】本発明の目的は、トロンボスポンジン
（ＴＳＰ）のＣＳＶＴＣＧ特異的領域に対して特異的結
合親和性を有する、単離された受容体を提供することに
ある。該受容体は細胞表面に露出している。該受容体は
非還元条件下ＳＤＳ−ゲルで分析して約５０ｋｄの分子
量であり、還元条件下で分子量約５０ｋｄと約６０ｋｄ
の２つの蛋白バンドとしての分子量を有する。該受容体
は内部ジスルフィド結合で連結された２つのサブユニッ
トからなる糖蛋白であり、等電焦点（isoelectricfocus
ing point）は約ｐＨ７．１〜７．５である。
（ＴＳＰ）のＣＳＶＴＣＧ特異的領域に対して特異的結
合親和性を有する、単離された受容体を提供することに
ある。該受容体は細胞表面に露出している。該受容体は
非還元条件下ＳＤＳ−ゲルで分析して約５０ｋｄの分子
量であり、還元条件下で分子量約５０ｋｄと約６０ｋｄ
の２つの蛋白バンドとしての分子量を有する。該受容体
は内部ジスルフィド結合で連結された２つのサブユニッ
トからなる糖蛋白であり、等電焦点（isoelectricfocus
ing point）は約ｐＨ７．１〜７．５である。
【０００８】本発明の他の目的は、ＣＳＶＴＣＧ特異的
受容体（CSVTCG−specific receptor）の精製法を提供
することである。ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を精製
する方法は： ａ）ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体を有する腫瘍細胞株（tu
mor cell line）からの細胞抽出液を調製し； ｂ）該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白が固定化ＣＳＶＴ
ＣＧ（配列番号：１）ペプチドに結合する条件下に、固
定化ＣＳＶＴＣＧペプチドを含有するクロマトグラフカ
ラムに該細胞抽出液を通し；そして ｃ）結合した受容体蛋白を該カラムから溶出して、精製
されたＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を得る；ことから
なる。
受容体（CSVTCG−specific receptor）の精製法を提供
することである。ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を精製
する方法は： ａ）ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体を有する腫瘍細胞株（tu
mor cell line）からの細胞抽出液を調製し； ｂ）該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白が固定化ＣＳＶＴ
ＣＧ（配列番号：１）ペプチドに結合する条件下に、固
定化ＣＳＶＴＣＧペプチドを含有するクロマトグラフカ
ラムに該細胞抽出液を通し；そして ｃ）結合した受容体蛋白を該カラムから溶出して、精製
されたＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を得る；ことから
なる。
【０００９】本発明の更なる他の目的は、ＣＳＶＴＣＧ
特異的受容体上のエピトープに結合する抗体、及びかか
る抗体を産生する細胞株を提供することにある。
特異的受容体上のエピトープに結合する抗体、及びかか
る抗体を産生する細胞株を提供することにある。
【００１０】本発明の更なる目的は、癌を持つ疑いのあ
る組織の試料をＣＳＶＴＣＧ特異的受容体に対して特異
的な抗体と反応させ、そして該組織と該抗体との結合を
測定することによる、癌の診断方法を提供する。
る組織の試料をＣＳＶＴＣＧ特異的受容体に対して特異
的な抗体と反応させ、そして該組織と該抗体との結合を
測定することによる、癌の診断方法を提供する。
【００１１】更なる目的は、薬学的に許容される液体、
ゲル又は固体担体と一緒にＣＳＶＴＣＧ特異的受容体抗
体を含有する、薬学的組成物を提供することにある。該
組成物の治療上有効薬量の投与は、動物特に哺乳類及び
鳥類宿主の如き脊椎動物にトロンボスポンジン様活性の
効果的増大又は阻害を与えることができる。
ゲル又は固体担体と一緒にＣＳＶＴＣＧ特異的受容体抗
体を含有する、薬学的組成物を提供することにある。該
組成物の治療上有効薬量の投与は、動物特に哺乳類及び
鳥類宿主の如き脊椎動物にトロンボスポンジン様活性の
効果的増大又は阻害を与えることができる。
【００１２】本発明の他の目的は、ＣＳＶＴＣＧ特異的
受容体蛋白をコードするＤＮＡ分子及び組換えＤＮＡ法
によりＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を製造する方法を
提供することにある。
受容体蛋白をコードするＤＮＡ分子及び組換えＤＮＡ法
によりＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を製造する方法を
提供することにある。
【００１３】
【発明の詳細】本発明は精製されたトロンボスポンジン
（thrombospondin：ＴＳＰ）受容体蛋白を使用可能な形
態で提供する。該受容体はトロンボスポンジンのＣＳＶ
ＴＣＧ（配列番号：１）領域に対し特異的である。該受
容体蛋白は、例えば癌の診断や処置を含む多くの治療領
域において有用である抗体を製造するために用いること
ができる。該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体の結合部位（bi
nding site）のコンピューター・モデル化は、ＣＳＶ
ＴＣＧ特異的受容体部位にin vivoで結合又は阻止する
新規化合物の設計においても助けとなるであろう。
（thrombospondin：ＴＳＰ）受容体蛋白を使用可能な形
態で提供する。該受容体はトロンボスポンジンのＣＳＶ
ＴＣＧ（配列番号：１）領域に対し特異的である。該受
容体蛋白は、例えば癌の診断や処置を含む多くの治療領
域において有用である抗体を製造するために用いること
ができる。該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体の結合部位（bi
nding site）のコンピューター・モデル化は、ＣＳＶ
ＴＣＧ特異的受容体部位にin vivoで結合又は阻止する
新規化合物の設計においても助けとなるであろう。
【００１４】Ａ．定義 “ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白” “トロンボスポンジン受容体蛋白”又は“ＴＳＰ受容
体”又は“受容体”は、ヒト及びマウスを含むがこれに
限定されない、哺乳動物すべてからの、ペプチドＣＳＶ
ＴＣＧ（配列番号：１）に特異的な結合親和性を有す
る、天然のトロンボスポンジン受容体蛋白を意味する。
該用語は合成ＴＳＰ受容体蛋白、即ち組換え法又は直接
的化学合成法で製造された蛋白をも包含する。ＴＳＰ受
容体蛋白は、血小板、内皮細胞、上皮（肺）細胞；平滑
筋細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト（keratinocyt
e）、単球マクロファージ、グリア細胞及び、最も特別
な、黒色腫細胞及び肺癌細胞を包含し、これに限定され
ない、癌組織に見出される蛋白である。
体”又は“受容体”は、ヒト及びマウスを含むがこれに
限定されない、哺乳動物すべてからの、ペプチドＣＳＶ
ＴＣＧ（配列番号：１）に特異的な結合親和性を有す
る、天然のトロンボスポンジン受容体蛋白を意味する。
該用語は合成ＴＳＰ受容体蛋白、即ち組換え法又は直接
的化学合成法で製造された蛋白をも包含する。ＴＳＰ受
容体蛋白は、血小板、内皮細胞、上皮（肺）細胞；平滑
筋細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト（keratinocyt
e）、単球マクロファージ、グリア細胞及び、最も特別
な、黒色腫細胞及び肺癌細胞を包含し、これに限定され
ない、癌組織に見出される蛋白である。
【００１５】“トロンボスポンジン様活性”は、ここで
はトロンボスポンジンの公知の生理的活性のいずれかに
類似の活性として定義される。これらの活性には、細胞
付着増進活性、細胞分裂促進（mitogenic）活性、細胞
走化性活性、及び止血活性並びに腫瘍細胞、微生物又は
寄生虫の転移活性、血小板凝集活性、フィブリン溶解活
性及び免疫転形（immune modulation）の如き活性から
誘導された活性が含まれる。
はトロンボスポンジンの公知の生理的活性のいずれかに
類似の活性として定義される。これらの活性には、細胞
付着増進活性、細胞分裂促進（mitogenic）活性、細胞
走化性活性、及び止血活性並びに腫瘍細胞、微生物又は
寄生虫の転移活性、血小板凝集活性、フィブリン溶解活
性及び免疫転形（immune modulation）の如き活性から
誘導された活性が含まれる。
【００１６】“抗転移活性”は、ここでは腫瘍細胞の転
移の程度又は大きさを防止又は著るしく減退させる、或
いは始原固形腫瘍の退行を起こしたり阻止する能力と定
義される。
移の程度又は大きさを防止又は著るしく減退させる、或
いは始原固形腫瘍の退行を起こしたり阻止する能力と定
義される。
【００１７】“アテローム硬化活性（Atherosclerosis
activity）”は、ここではアテローム硬化病巣の形成
を促進又は阻止するトロンボスポンジンの能力（capaci
ty）と定義される。該アテローム硬化病巣とは、特に動
脈壁における、脂質含有素材（lipid-containing mate
rial）の劣化蓄積（degenerative accumulation）とし
て定義される。
activity）”は、ここではアテローム硬化病巣の形成
を促進又は阻止するトロンボスポンジンの能力（capaci
ty）と定義される。該アテローム硬化病巣とは、特に動
脈壁における、脂質含有素材（lipid-containing mate
rial）の劣化蓄積（degenerative accumulation）とし
て定義される。
【００１８】“抗マラリヤ活性”は、ここではマラリヤ
感染赤血球の内皮細胞への細胞接着、マラリヤスポロゾ
イト（種虫）の肝細胞の認識及びそれへの侵入、又はマ
ラリヤメロゾイト（分裂小体）の赤血球の認識及びそれ
への侵入を阻害する能力として定義される。抗マラリヤ
活性は細胞接着を阻止するワクチン又は治療剤の形態で
証明することができる。
感染赤血球の内皮細胞への細胞接着、マラリヤスポロゾ
イト（種虫）の肝細胞の認識及びそれへの侵入、又はマ
ラリヤメロゾイト（分裂小体）の赤血球の認識及びそれ
への侵入を阻害する能力として定義される。抗マラリヤ
活性は細胞接着を阻止するワクチン又は治療剤の形態で
証明することができる。
【００１９】“抗血栓活性”は、ここでは血小板の凝集
を阻害する、又は血栓の形成に拮抗する能力として定義
される。
を阻害する、又は血栓の形成に拮抗する能力として定義
される。
【００２０】“血栓溶解活性”は、ここでは血栓の構造
を崩壊させる能力として定義される。
を崩壊させる能力として定義される。
【００２１】“脈管形成活性”は、ここでは血管やリン
パ管の形成を増進又は阻害する能力として定義される。
パ管の形成を増進又は阻害する能力として定義される。
【００２２】“成長因子活性”は、ここでは細胞増殖を
増進又は阻害する能力として定義される。
増進又は阻害する能力として定義される。
【００２３】“細胞接着活性”は、ここでは細胞、好ま
しくは哺乳動物細胞の基質への付着を増進又は阻害する
能力として定義される。
しくは哺乳動物細胞の基質への付着を増進又は阻害する
能力として定義される。
【００２４】Ｂ．好ましい態様 本発明の好ましい受容体蛋白は、黒色腫細胞又は肺癌細
胞の如き癌組織から取り出される。ドデシル硫酸ナトリ
ウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）によるＣＳＶＴＣＧ特異的受容体の分析で、該受
容体は非還元条件下で５０ｋｄの見掛けの分子量を有す
ることがわかる。いくつかの調製では、１００ｋｄより
大なる分子量の二量体が少量観測されるであろう。還元
条件下では、該蛋白は見掛けの分子量５０及び６０ｋｄ
の、近接離間した（spaced closely）２つの主要ポリ
ペプチドバンドとして一緒に移動する。これは、該蛋白
が、ジスルフィド結合されているときはより緻密な形態
であることを予想させる、２つの鎖間ジスルフィド結合
されたポリペプチド鎖から成る、という解釈と一致す
る。
胞の如き癌組織から取り出される。ドデシル硫酸ナトリ
ウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）によるＣＳＶＴＣＧ特異的受容体の分析で、該受
容体は非還元条件下で５０ｋｄの見掛けの分子量を有す
ることがわかる。いくつかの調製では、１００ｋｄより
大なる分子量の二量体が少量観測されるであろう。還元
条件下では、該蛋白は見掛けの分子量５０及び６０ｋｄ
の、近接離間した（spaced closely）２つの主要ポリ
ペプチドバンドとして一緒に移動する。これは、該蛋白
が、ジスルフィド結合されているときはより緻密な形態
であることを予想させる、２つの鎖間ジスルフィド結合
されたポリペプチド鎖から成る、という解釈と一致す
る。
【００２５】該蛋白は、インテグリンス・ラミニン（in
tegrins laminin）、別名ＧＰＩＶに対する抗体と交叉
結合しない。
tegrins laminin）、別名ＧＰＩＶに対する抗体と交叉
結合しない。
【００２６】該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白は、ガラ
クトース、マンノース及びグルコサミン特異的レクチン
に結合するので、糖蛋白である。精製した受容体蛋白の
２６０ｎｍでの高い吸収は、炭水化物（糖質）の存在と
一致する。
クトース、マンノース及びグルコサミン特異的レクチン
に結合するので、糖蛋白である。精製した受容体蛋白の
２６０ｎｍでの高い吸収は、炭水化物（糖質）の存在と
一致する。
【００２７】該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白は、約ｐ
Ｈ７．１〜７．５の等電焦点を有する。
Ｈ７．１〜７．５の等電焦点を有する。
【００２８】該精製された天然ＣＳＶＴＣＧ特異的受容
体を特性付けするために、更にそのin vitroでの受容
体活性を調べた。該受容体はトロンボスポンジンとイオ
ン依存的型式で相互作用するが、フィブロネクチン又は
牛血清アルブミンとは相互作用しない。
体を特性付けするために、更にそのin vitroでの受容
体活性を調べた。該受容体はトロンボスポンジンとイオ
ン依存的型式で相互作用するが、フィブロネクチン又は
牛血清アルブミンとは相互作用しない。
【００２９】当業者なら標準的手法を用いて単離された
ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体のアミノ酸組成及び蛋白配列
を決定することができる。例えば該受容体のアミノ酸配
列は、エドマン分解及びＨＰＬＣによるアミノ酸分析を
繰返し行うことにより、精製蛋白から定めることができ
る。他のアミノ酸配列決定法も当技術分野では公知であ
る。
ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体のアミノ酸組成及び蛋白配列
を決定することができる。例えば該受容体のアミノ酸配
列は、エドマン分解及びＨＰＬＣによるアミノ酸分析を
繰返し行うことにより、精製蛋白から定めることができ
る。他のアミノ酸配列決定法も当技術分野では公知であ
る。
【００３０】細胞からＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を
精製する方法は、２つの基本的工程、細胞の調製及びア
フィニティークロマトグラフィーによる受容体の精製、
からなる。好ましい細胞源には、一般的に容易に入手可
能なマウス・ミエローマ細胞及びヒト肺癌細胞が含まれ
る。培養細胞は大概の組織源に比べて比較的にプロテア
ーゼ不在であるという利点を有する。これは活性な受容
体蛋白の安定化及び精製を容易とする。
精製する方法は、２つの基本的工程、細胞の調製及びア
フィニティークロマトグラフィーによる受容体の精製、
からなる。好ましい細胞源には、一般的に容易に入手可
能なマウス・ミエローマ細胞及びヒト肺癌細胞が含まれ
る。培養細胞は大概の組織源に比べて比較的にプロテア
ーゼ不在であるという利点を有する。これは活性な受容
体蛋白の安定化及び精製を容易とする。
【００３１】細胞抽出液を調製し、受容体がＣＳＶＴＣ
Ｇペプチドに結合する条件下、固定化ＣＳＶＴＣＧ（配
列番号：１）ペプチドを含有するクロマトグラフィーカ
ラムに通す。そして該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体をカラ
ムから精製状態で溶離する。当業者ならＣＳＶＴＣＧ特
異的受容体蛋白に対するｃＤＮＡ及び遺伝子をクローン
化し、配列決定することができる。クローン化はＣＳＶ
ＴＣＧ特異的受容体蛋白に対する抗体及び発現ライブラ
リーを用いることにより、或いは一旦アミノ酸配列が決
定されると、決定されたアミノ酸配列の一部についての
コドンを含有するオリゴヌクレオチドを製造し、該受容
体蛋白をコードする遺伝子についてＤＮＡライブラリー
をスクリーニングのために用いることにより、行うこと
ができる。抗体又はオリゴヌクレオチドプローブ及びＤ
ＮＡライブラリーを調製するための基本的ストラテジー
は、抗体又は核酸ハイブリダイゼーションによるそれら
のスクリーニングと同じように、当業者には周知であ
る。例えば、ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ：ＶＯＬＵＭＥ
Ｉ （Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）：ＮＵ
ＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ
（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ
ｅｄｓ．１９８５）：ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤ
Ｅ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｔｅ ｅｄ．１
９８４）：Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃ
ｈ ＆ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵ
ＡＬ（１９８２）参照。
Ｇペプチドに結合する条件下、固定化ＣＳＶＴＣＧ（配
列番号：１）ペプチドを含有するクロマトグラフィーカ
ラムに通す。そして該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体をカラ
ムから精製状態で溶離する。当業者ならＣＳＶＴＣＧ特
異的受容体蛋白に対するｃＤＮＡ及び遺伝子をクローン
化し、配列決定することができる。クローン化はＣＳＶ
ＴＣＧ特異的受容体蛋白に対する抗体及び発現ライブラ
リーを用いることにより、或いは一旦アミノ酸配列が決
定されると、決定されたアミノ酸配列の一部についての
コドンを含有するオリゴヌクレオチドを製造し、該受容
体蛋白をコードする遺伝子についてＤＮＡライブラリー
をスクリーニングのために用いることにより、行うこと
ができる。抗体又はオリゴヌクレオチドプローブ及びＤ
ＮＡライブラリーを調製するための基本的ストラテジー
は、抗体又は核酸ハイブリダイゼーションによるそれら
のスクリーニングと同じように、当業者には周知であ
る。例えば、ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ：ＶＯＬＵＭＥ
Ｉ （Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）：ＮＵ
ＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ
（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ
ｅｄｓ．１９８５）：ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤ
Ｅ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｔｅ ｅｄ．１
９８４）：Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃ
ｈ ＆ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵ
ＡＬ（１９８２）参照。
【００３２】先ず、ＤＮＡライブラリーを調製する。該
ライブラリーは、ヒトの如き選ばれた哺乳類からのゲノ
ムＤＮＡライブラリーから成ることができる。ヒトゲノ
ムライブラリーは当技術分野で公知である。例えばＬａ
ｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ｃｅｌｌ １５：１
１５７−１１７４参照。ＤＮＡライブラリーは、逆転写
によりポリ−Ａ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）画分から製造され
たｃＤＮＡから構築することもできる。例えば、米国特
許第４，４４６，２３５；４，４４０，８５９；４，４
３３，１４０；４，４３１，７４０；４，３７０，４１
７；４，３６３，８７７参照。該ｍＲＮＡは該受容体蛋
白を発現することが知られている細胞株又は組織から単
離する。ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を発現する細胞
株又は組織はここに記載されている。ｃＤＮＡ（又はゲ
ノムＤＮＡ）はライブラリー構築のために適したベクタ
ー中にクローン化する。好ましくベクターはバクテリオ
ファージ・ベクター、例えばファージλである。適当な
ライブラリーの構築は当業者の技術範囲内である。
ライブラリーは、ヒトの如き選ばれた哺乳類からのゲノ
ムＤＮＡライブラリーから成ることができる。ヒトゲノ
ムライブラリーは当技術分野で公知である。例えばＬａ
ｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ｃｅｌｌ １５：１
１５７−１１７４参照。ＤＮＡライブラリーは、逆転写
によりポリ−Ａ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）画分から製造され
たｃＤＮＡから構築することもできる。例えば、米国特
許第４，４４６，２３５；４，４４０，８５９；４，４
３３，１４０；４，４３１，７４０；４，３７０，４１
７；４，３６３，８７７参照。該ｍＲＮＡは該受容体蛋
白を発現することが知られている細胞株又は組織から単
離する。ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を発現する細胞
株又は組織はここに記載されている。ｃＤＮＡ（又はゲ
ノムＤＮＡ）はライブラリー構築のために適したベクタ
ー中にクローン化する。好ましくベクターはバクテリオ
ファージ・ベクター、例えばファージλである。適当な
ライブラリーの構築は当業者の技術範囲内である。
【００３３】一旦ライブラリーを構築したら、抗体又は
ライブラリーをプローブするためのオリゴヌクレオチド
を調製し、所望のＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白遺伝子
を単離するために用いる。該抗体又はオリゴヌクレオチ
ドは適当な方法で合成する。オリゴヌクレオチド調製の
ために、特別に選択された塩基配列が、該受容体蛋白か
らの知られたアミノ酸配列をコードするコドンに対応す
るように、選ばれる。遺伝コードは重複しているので、
しばしば該蛋白の特別の領域をコードする全ての、又は
合理的な数の可能な塩基配列を包含するいくつかのオリ
ゴヌクレオチドを合成することが必要となる。このよう
に、プローブの基礎となる領域を選ぶ際には、該領域は
コドンが高度に縮重したアミノ酸を含有しないことが一
般的に好ましい。しかし、該ライブラリーを調製した哺
乳類において希である（rare）コドンを含有するプロー
ブを製造する必要性はない。ある状況では、かなり長
い、及び／又は対応する核酸配列に関して高度に多様性
（redundancy）を有するであろうアミノ酸配列の領域を
包含するプローブを調製することが望ましいことを、特
にもしこの長い及び／又は多様性の領域が該受容体蛋白
の高い特徴である場合に、当業者は見出すかも知れな
い。１つのハイブリダイゼーション実験において、各々
遺伝子の異なる領域に対応する２つのプローブ（又はプ
ローブの組（sets））を用いることも望ましい。自動化
されたオリゴヌクレオチド合成法がプローブの大きな群
（family）の調製を比較的手近なものとした。用いられ
るべきプローブの正確な長さは臨界的ではないが、一般
的に当技術分野では約１４〜約２０ベースペアーのプロ
ーブが通常効果的であると認識されている。約２５〜約
６０ベースペアーのより長いプローブも用いられる。
ライブラリーをプローブするためのオリゴヌクレオチド
を調製し、所望のＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白遺伝子
を単離するために用いる。該抗体又はオリゴヌクレオチ
ドは適当な方法で合成する。オリゴヌクレオチド調製の
ために、特別に選択された塩基配列が、該受容体蛋白か
らの知られたアミノ酸配列をコードするコドンに対応す
るように、選ばれる。遺伝コードは重複しているので、
しばしば該蛋白の特別の領域をコードする全ての、又は
合理的な数の可能な塩基配列を包含するいくつかのオリ
ゴヌクレオチドを合成することが必要となる。このよう
に、プローブの基礎となる領域を選ぶ際には、該領域は
コドンが高度に縮重したアミノ酸を含有しないことが一
般的に好ましい。しかし、該ライブラリーを調製した哺
乳類において希である（rare）コドンを含有するプロー
ブを製造する必要性はない。ある状況では、かなり長
い、及び／又は対応する核酸配列に関して高度に多様性
（redundancy）を有するであろうアミノ酸配列の領域を
包含するプローブを調製することが望ましいことを、特
にもしこの長い及び／又は多様性の領域が該受容体蛋白
の高い特徴である場合に、当業者は見出すかも知れな
い。１つのハイブリダイゼーション実験において、各々
遺伝子の異なる領域に対応する２つのプローブ（又はプ
ローブの組（sets））を用いることも望ましい。自動化
されたオリゴヌクレオチド合成法がプローブの大きな群
（family）の調製を比較的手近なものとした。用いられ
るべきプローブの正確な長さは臨界的ではないが、一般
的に当技術分野では約１４〜約２０ベースペアーのプロ
ーブが通常効果的であると認識されている。約２５〜約
６０ベースペアーのより長いプローブも用いられる。
【００３４】選ばれたオリゴヌクレオチドプローブは標
準的手法を用いて放射性ヌクレオチド又はビオチンの如
きマーカーで標識される。そして該標識されたプローブ
の組を、標準的技術に従い該ライブラリーから単離され
たｓｓＤＮＡに一本鎖プローブをハイブリダイズさせる
ことからなるスクリーニング工程において用いる。プロ
ーブの長さ、及びプローブがライブラリーと同じ種、又
は進化論的に近接した又は離れた種からのものであるか
どうかの如きいくつかの要因に依り、厳格な又は寛大な
ハイブリダイゼーション条件のいずれかが適切であろ
う。適切な条件の選択は当業者の技術範囲内である。一
般的には、前出のＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢＲ
ＩＤＩＺＡＴＩＯＮ参照。基本的要件は、ハイブリダイ
ゼーション条件は選択的ハイブリダイゼーションが起る
ように十分厳格であることであり、即ち、非特異的結合
に対抗して、十分な程度のハイブリダイゼーションが核
酸ホモロジー（例えば少くとも約７０〜７５％）による
ものであることである。一旦、ポジティブ・ハイブリダ
イゼーションによってスクリーニングにかけたライブラ
リーからクローンが同定されると、それは制限酵素分析
並びにＤＮＡ配列決定により、特定のライブラリー挿入
物に該受容体蛋白の遺伝子が含有されていることを確認
することができる。
準的手法を用いて放射性ヌクレオチド又はビオチンの如
きマーカーで標識される。そして該標識されたプローブ
の組を、標準的技術に従い該ライブラリーから単離され
たｓｓＤＮＡに一本鎖プローブをハイブリダイズさせる
ことからなるスクリーニング工程において用いる。プロ
ーブの長さ、及びプローブがライブラリーと同じ種、又
は進化論的に近接した又は離れた種からのものであるか
どうかの如きいくつかの要因に依り、厳格な又は寛大な
ハイブリダイゼーション条件のいずれかが適切であろ
う。適切な条件の選択は当業者の技術範囲内である。一
般的には、前出のＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢＲ
ＩＤＩＺＡＴＩＯＮ参照。基本的要件は、ハイブリダイ
ゼーション条件は選択的ハイブリダイゼーションが起る
ように十分厳格であることであり、即ち、非特異的結合
に対抗して、十分な程度のハイブリダイゼーションが核
酸ホモロジー（例えば少くとも約７０〜７５％）による
ものであることである。一旦、ポジティブ・ハイブリダ
イゼーションによってスクリーニングにかけたライブラ
リーからクローンが同定されると、それは制限酵素分析
並びにＤＮＡ配列決定により、特定のライブラリー挿入
物に該受容体蛋白の遺伝子が含有されていることを確認
することができる。
【００３５】別法として、ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体サ
ブユニットについての配列をコードするＤＮＡを、該受
容体蛋白のアミノ酸配列についてのコドンを含有する配
列である重畳（overlapping）オリゴヌクレオチドから
合成的に調製することができる。このようなオリゴヌク
レオチドは標準的方法で調製され、そして完全なコーデ
ィング配列に組立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ，（１９
８１）Ｎａｔｕｒｅ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ
ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２３：１
２９９；Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１参照。
ブユニットについての配列をコードするＤＮＡを、該受
容体蛋白のアミノ酸配列についてのコドンを含有する配
列である重畳（overlapping）オリゴヌクレオチドから
合成的に調製することができる。このようなオリゴヌク
レオチドは標準的方法で調製され、そして完全なコーデ
ィング配列に組立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ，（１９
８１）Ｎａｔｕｒｅ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ
ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２３：１
２９９；Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１参照。
【００３６】ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白のためのコ
ーディング配列を含有するＤＮＡ分子は、いかなる適切
なベクター中にでもクローン化でき、そしてそれにより
ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体遺伝子のコーディング配列を
含有しないベクター（例えば他のライブラリークローン
類）を実質的に含有しない組成物として維持することが
できる。多くのクローニングベクターが当業者には知ら
れており、適当なクローニングベクターの選択は自由に
できる。クローニングのための組換えＤＮＡベクター及
びそれが形質転換する宿主細胞の具体例には、バクテリ
オファージλ（イー・コリ：Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＢＲ３
２２（イー・コリ）、ｐＡＣＹＣ１７７（イー・コ
リ）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性菌）、ｐＧＶ１１０６
（グラム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（非イー・コリ グラ
ム陰性菌）、ｐＨＶ１４（イー・コリ及びバチルス・ス
ブチリス：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ｐ
ＢＤ９（バチルス）、ｐＩＪ６１（ストレプトマイセ
ス：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ｐＵＣ６（ストレプ
トマイセス）、アクチノファージ（ａｃｔｉｎｏｐｈａ
ｇｅ）ψＣ３１（ストレプトマイセス）、ＹＩｐ５（酵
母：ｙｅａｓｔ）、ＹＣｐ１９（酵母）、及び牛パピロ
ーマウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉ
ｒｕｓ）（哺乳動物細胞）が含まれる。一般的には、前
記ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ：ＶＯＬＵＭＥＳ Ｉ＆Ｉ
Ｉ；ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢ
ＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ参照。
ーディング配列を含有するＤＮＡ分子は、いかなる適切
なベクター中にでもクローン化でき、そしてそれにより
ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体遺伝子のコーディング配列を
含有しないベクター（例えば他のライブラリークローン
類）を実質的に含有しない組成物として維持することが
できる。多くのクローニングベクターが当業者には知ら
れており、適当なクローニングベクターの選択は自由に
できる。クローニングのための組換えＤＮＡベクター及
びそれが形質転換する宿主細胞の具体例には、バクテリ
オファージλ（イー・コリ：Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＢＲ３
２２（イー・コリ）、ｐＡＣＹＣ１７７（イー・コ
リ）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性菌）、ｐＧＶ１１０６
（グラム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（非イー・コリ グラ
ム陰性菌）、ｐＨＶ１４（イー・コリ及びバチルス・ス
ブチリス：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ｐ
ＢＤ９（バチルス）、ｐＩＪ６１（ストレプトマイセ
ス：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ｐＵＣ６（ストレプ
トマイセス）、アクチノファージ（ａｃｔｉｎｏｐｈａ
ｇｅ）ψＣ３１（ストレプトマイセス）、ＹＩｐ５（酵
母：ｙｅａｓｔ）、ＹＣｐ１９（酵母）、及び牛パピロ
ーマウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉ
ｒｕｓ）（哺乳動物細胞）が含まれる。一般的には、前
記ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ：ＶＯＬＵＭＥＳ Ｉ＆Ｉ
Ｉ；ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢ
ＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ参照。
【００３７】本発明の１態様においては、ＣＳＶＴＣＧ
特異的受容体蛋白遺伝子からのコーディング配列は、プ
ロモーター、（バクテリア発現のための）リボソーム結
合部位及び、任意に、オペレーター（これらを合わせて
“制御”配列とここでは称する）の制御下に配置され、
該受容体蛋白をコードするＤＮＡ配列（ここでは“コー
ディング”配列と称する）が該ベクターにより形質転換
された宿主細胞中でＲＮＡに転写されるようにする。該
コーディング配列は、シグナルペプチド又はリーダーシ
ークエンスを含有しても、しなくてもよい。
特異的受容体蛋白遺伝子からのコーディング配列は、プ
ロモーター、（バクテリア発現のための）リボソーム結
合部位及び、任意に、オペレーター（これらを合わせて
“制御”配列とここでは称する）の制御下に配置され、
該受容体蛋白をコードするＤＮＡ配列（ここでは“コー
ディング”配列と称する）が該ベクターにより形質転換
された宿主細胞中でＲＮＡに転写されるようにする。該
コーディング配列は、シグナルペプチド又はリーダーシ
ークエンスを含有しても、しなくてもよい。
【００３８】該組換えベクターは、該受容体蛋白コーデ
ィング配列がベクター中において適当な制御配列と一緒
に位置するように構築され、該制御配列との関係で該受
容体コーディング配列の位置及び方向は、該コーディン
グ配列が該制御配列の制御下に（即ち、制御配列におい
てＤＮＡ分子に着くＲＮＡポリメラーゼにより）転写さ
れるようなものである。該制御配列は、例えば上記クロ
ーニングベクターの如きベクター中に挿入される前に、
該コーディング配列に結紮（ligate）することができ
る。別法として、既に制御配列を含有し、その制御配列
の下流に適当な制御部位を含有する発現ベクター中に、
直接該コーディング配列をクローン化することができ
る。原核生物及び酵母中での該受容体蛋白コーディング
配列の発現のためには、該制御配列は該コーディング配
列に対し異質（heterologous）となるであろう。もし宿
主が原核生物ならば、該コーディング配列はイントロン
不在：例えばｃＤＮＡであることも必要である。もし選
ばれた宿主細胞が哺乳動物細胞であるなら、制御配列は
受容体蛋白コーディング配列に対し異質（heterologou
s）又は同質（homologous）であることができる。そし
て該コーディング配列はイントロンを含むゲノムＤＮＡ
又はｃＤＮＡでありうる。ゲノム又はｃＤＮＡコーディ
ング配列のいずれでも酵母中で発現させることができ
る。多くの原核生物性発現ベクターが当該技術分野で知
られている。
ィング配列がベクター中において適当な制御配列と一緒
に位置するように構築され、該制御配列との関係で該受
容体コーディング配列の位置及び方向は、該コーディン
グ配列が該制御配列の制御下に（即ち、制御配列におい
てＤＮＡ分子に着くＲＮＡポリメラーゼにより）転写さ
れるようなものである。該制御配列は、例えば上記クロ
ーニングベクターの如きベクター中に挿入される前に、
該コーディング配列に結紮（ligate）することができ
る。別法として、既に制御配列を含有し、その制御配列
の下流に適当な制御部位を含有する発現ベクター中に、
直接該コーディング配列をクローン化することができ
る。原核生物及び酵母中での該受容体蛋白コーディング
配列の発現のためには、該制御配列は該コーディング配
列に対し異質（heterologous）となるであろう。もし宿
主が原核生物ならば、該コーディング配列はイントロン
不在：例えばｃＤＮＡであることも必要である。もし選
ばれた宿主細胞が哺乳動物細胞であるなら、制御配列は
受容体蛋白コーディング配列に対し異質（heterologou
s）又は同質（homologous）であることができる。そし
て該コーディング配列はイントロンを含むゲノムＤＮＡ
又はｃＤＮＡでありうる。ゲノム又はｃＤＮＡコーディ
ング配列のいずれでも酵母中で発現させることができ
る。多くの原核生物性発現ベクターが当該技術分野で知
られている。
【００３９】組換えＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を、
ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白が製造されるような条件
下、上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を生育
させることにより製造することができる。そしてＣＳＶ
ＴＣＧ特異的受容体蛋白を宿主細胞から単離し、精製す
る。もし発現系が受容体蛋白を生育培地中に分泌するな
ら、受容体蛋白は細胞不含の培地から直接精製できる。
もし受容体蛋白が分泌されないなら、それは細胞溶解物
から単離される。適した生育条件及び回収方法の選定は
当業者の技術範囲内である。
ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白が製造されるような条件
下、上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を生育
させることにより製造することができる。そしてＣＳＶ
ＴＣＧ特異的受容体蛋白を宿主細胞から単離し、精製す
る。もし発現系が受容体蛋白を生育培地中に分泌するな
ら、受容体蛋白は細胞不含の培地から直接精製できる。
もし受容体蛋白が分泌されないなら、それは細胞溶解物
から単離される。適した生育条件及び回収方法の選定は
当業者の技術範囲内である。
【００４０】天然又は合成のＣＳＶＴＣＧ特異的受容体
蛋白のいずれも、ポリクローナル及びモノクローナル双
方の抗体を製造するために用いることができる。もしポ
リクローナル抗体が所望なら、精製された受容体蛋白を
選定された哺乳動物（例えば、マウス、ラビット、山
羊、馬、その他）を免疫するために用い、そして後で該
免疫された動物から血清を集め、公知手順により処理す
る。該受容体蛋白以外の種々の抗原に対するポリクロー
ナル抗体を含有する組成物は、その組成物を受容体が結
合したカラムに通すことにより、抗受容体蛋白抗体でな
い抗体が実質的に存在しないものとすることができる。
洗浄した後、該受容体に対するポリクローナル抗体を該
カラムから溶離する。モノクローナル抗受容体蛋白抗体
も当業者なら容易に製造することができる。ハイブリド
ーマからモノクローナル抗体を製造するための一般的方
法論は周知である。不死化抗体産生細胞株は、融合以外
の技術例えば腫瘍形成性ＤＮＡを用いてのＢリンパ球の
直接的形質転換、又はエプスタイン・バー・ウイルスを
用いたトランスフェクションにより、創出することもで
きる。（例えばＭ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，
“ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（１９８
０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−
Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”（１９８１）；Ｋｅ
ｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”（１９８０）参照）。
蛋白のいずれも、ポリクローナル及びモノクローナル双
方の抗体を製造するために用いることができる。もしポ
リクローナル抗体が所望なら、精製された受容体蛋白を
選定された哺乳動物（例えば、マウス、ラビット、山
羊、馬、その他）を免疫するために用い、そして後で該
免疫された動物から血清を集め、公知手順により処理す
る。該受容体蛋白以外の種々の抗原に対するポリクロー
ナル抗体を含有する組成物は、その組成物を受容体が結
合したカラムに通すことにより、抗受容体蛋白抗体でな
い抗体が実質的に存在しないものとすることができる。
洗浄した後、該受容体に対するポリクローナル抗体を該
カラムから溶離する。モノクローナル抗受容体蛋白抗体
も当業者なら容易に製造することができる。ハイブリド
ーマからモノクローナル抗体を製造するための一般的方
法論は周知である。不死化抗体産生細胞株は、融合以外
の技術例えば腫瘍形成性ＤＮＡを用いてのＢリンパ球の
直接的形質転換、又はエプスタイン・バー・ウイルスを
用いたトランスフェクションにより、創出することもで
きる。（例えばＭ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，
“ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（１９８
０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−
Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”（１９８１）；Ｋｅ
ｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”（１９８０）参照）。
【００４１】モノクローナル抗体の製造のために不死化
されるＢ細胞の供給源の免疫化において、抗原としてＴ
ＳＰ受容体蛋白（天然又は合成）を採用することによ
り、該受容体蛋白分子上の異なる部位のエピトープを認
識する１群のモノクローナル抗体を得ることができる。
該受容体蛋白の結合領域にあるエピトープを認識する抗
体は、抗体とＴＳＰとの間で競合アツセイにおいて容易
に同定することができる。このような抗体は、もしそれ
らがＴＳＰペプチドが結合したとき随伴しておこる生理
学的応答を刺激することなく、in vivoにおいてその受
容体に対するＴＳＰの結合を阻止することができるな
ら、治療薬の可能性を有するであろう。
されるＢ細胞の供給源の免疫化において、抗原としてＴ
ＳＰ受容体蛋白（天然又は合成）を採用することによ
り、該受容体蛋白分子上の異なる部位のエピトープを認
識する１群のモノクローナル抗体を得ることができる。
該受容体蛋白の結合領域にあるエピトープを認識する抗
体は、抗体とＴＳＰとの間で競合アツセイにおいて容易
に同定することができる。このような抗体は、もしそれ
らがＴＳＰペプチドが結合したとき随伴しておこる生理
学的応答を刺激することなく、in vivoにおいてその受
容体に対するＴＳＰの結合を阻止することができるな
ら、治療薬の可能性を有するであろう。
【００４２】Ｃ．投与 本発明の抗体は、生来の（intact）動物においてトロン
ボスポンジン様活性を媒介することができる。生来のト
ロンボスポンジンの効果を阻害又は凝態（mimic）する
生理学的効果を有することが示された。本発明の抗体又
はそれらを含有する組成物は、癌治療、アテローム硬
化、マラリヤ処置又は予防、血栓又は血栓溶解状態、脈
管形成、又は細胞接着の如き多くの治療的及び予防的用
途における有用性が見出される。
ボスポンジン様活性を媒介することができる。生来のト
ロンボスポンジンの効果を阻害又は凝態（mimic）する
生理学的効果を有することが示された。本発明の抗体又
はそれらを含有する組成物は、癌治療、アテローム硬
化、マラリヤ処置又は予防、血栓又は血栓溶解状態、脈
管形成、又は細胞接着の如き多くの治療的及び予防的用
途における有用性が見出される。
【００４３】このように本発明は、それ自身で上記治療
上の有益性を提供するのに役立つ可能性のある非毒性の
付加塩、アミド類及びそのエステル類を含んだ、本発明
の抗体の有効量を含有する組成物も提供する。かかる組
成物は生理学的に許容される液状、ゲル状又は固体状希
釈剤、助剤及び賦形剤と一緒に提供することもできる。
上の有益性を提供するのに役立つ可能性のある非毒性の
付加塩、アミド類及びそのエステル類を含んだ、本発明
の抗体の有効量を含有する組成物も提供する。かかる組
成物は生理学的に許容される液状、ゲル状又は固体状希
釈剤、助剤及び賦形剤と一緒に提供することもできる。
【００４４】これらの抗体及び組成物は、家畜における
如き獣医学的用途及びヒトにおける臨床用途のために、
他の治療用抗体試剤と同様の方法で動物に投与すること
ができる。
如き獣医学的用途及びヒトにおける臨床用途のために、
他の治療用抗体試剤と同様の方法で動物に投与すること
ができる。
【００４５】該組成物は例えば皮下又は静脈への注射に
より、簡便に非経口的に投与される。他の投与方式のた
めに適した別の調合剤には、坐剤、経鼻エアロゾル、及
びある場合には経口調合剤が含まれる。
より、簡便に非経口的に投与される。他の投与方式のた
めに適した別の調合剤には、坐剤、経鼻エアロゾル、及
びある場合には経口調合剤が含まれる。
【００４６】何らの理論にも拘束されることは望まない
が、本発明の組成物は天然のトロンボスポンジンに対し
作用薬（agonist）又は拮抗薬（antagonist）として働
くと信じられる。これらの抗体はスポロゾイト（種虫）
周囲蛋白（circumsporozoiteprotein）、トロンボスポ
ンジン関連の無名の蛋白、及びプロパージン補体蛋白に
対する作用薬又は拮抗薬として働くとも信じられる。
が、本発明の組成物は天然のトロンボスポンジンに対し
作用薬（agonist）又は拮抗薬（antagonist）として働
くと信じられる。これらの抗体はスポロゾイト（種虫）
周囲蛋白（circumsporozoiteprotein）、トロンボスポ
ンジン関連の無名の蛋白、及びプロパージン補体蛋白に
対する作用薬又は拮抗薬として働くとも信じられる。
【００４７】Ｄ．用途 前記した如く、本発明のＣＳＶＴＣＧ特異的受容体に対
する抗体は種々の診断的、生物学的、予防的又は治療的
領域において用いることができる。これらの抗体は、ト
ロンボスポンジン様活性が役割を演じる全ての病気の状
態又は状況の予防又は処置に有用であると期待される。
これらの病気状態又は状況には、転移、アテローム硬
化、マラリヤ、血栓状況、及び脈管形成が含まれるが、
これに限定されない。抗体は診断薬、治療薬又は他の化
合物の担体としても有用である。該抗体は生物医学装置
（biomedical device）においても用いることができ
る。
する抗体は種々の診断的、生物学的、予防的又は治療的
領域において用いることができる。これらの抗体は、ト
ロンボスポンジン様活性が役割を演じる全ての病気の状
態又は状況の予防又は処置に有用であると期待される。
これらの病気状態又は状況には、転移、アテローム硬
化、マラリヤ、血栓状況、及び脈管形成が含まれるが、
これに限定されない。抗体は診断薬、治療薬又は他の化
合物の担体としても有用である。該抗体は生物医学装置
（biomedical device）においても用いることができ
る。
【００４８】多数のin vitro 及びin vivoアツセイ
を、該抗体がトロンボスポンジン様活性をもたらすこと
を証明するために、用いることができる。これらのアツ
セイには、細胞接着分析、血小板凝集分析及び細胞増殖
分析が含まれるが、それに限定されない。
を、該抗体がトロンボスポンジン様活性をもたらすこと
を証明するために、用いることができる。これらのアツ
セイには、細胞接着分析、血小板凝集分析及び細胞増殖
分析が含まれるが、それに限定されない。
【００４９】転移 転移とは、血流又はリンパにより悪性腫瘍の細胞が移動
することにより、病気が体の一部からそれと関係のない
他所へ広がることである。転移は、腫瘍細胞の内皮への
付着、内皮の退縮、基底膜のマトリックス崩壊及び血流
への腫瘍細胞の侵入を含むカスケード機構により達成さ
れると信じられている。このカスケードのどの相におけ
る干渉（intervention）も、転移性癌の予防又は処置に
有益であろう。
することにより、病気が体の一部からそれと関係のない
他所へ広がることである。転移は、腫瘍細胞の内皮への
付着、内皮の退縮、基底膜のマトリックス崩壊及び血流
への腫瘍細胞の侵入を含むカスケード機構により達成さ
れると信じられている。このカスケードのどの相におけ
る干渉（intervention）も、転移性癌の予防又は処置に
有益であろう。
【００５０】天然のトロンボスポンジン分子は腫瘍細胞
の転移を増強することが示された（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１
９８７）４７：４１３０−４１３３）。トロンボスポン
ジン増強がおこる機構は現在良く理解されていない。
の転移を増強することが示された（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１
９８７）４７：４１３０−４１３３）。トロンボスポン
ジン増強がおこる機構は現在良く理解されていない。
【００５１】抗転移活性は、in vitroで化合物が黒色
腫細胞に結合する能力（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏ．（１９９０）１８４：１８９
−９１）、及びin vivoで腫瘍コロニーの数及び大きさ
を減少させる能力（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８７）４
７：４１３０−４１３３）で識別される。
腫細胞に結合する能力（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏ．（１９９０）１８４：１８９
−９１）、及びin vivoで腫瘍コロニーの数及び大きさ
を減少させる能力（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８７）４
７：４１３０−４１３３）で識別される。
【００５２】本発明の抗体は抗転移（antimetastatic）
剤として有用であり、特に抗肺転移剤として有用であ
る。これらの抗体は転移性腫瘍細胞、特にトロンボスポ
ンジンに応答するものの付着を阻害する。該抗体は腫瘍
コロニーの大きさと同様に腫瘍コロニーの数も減少させ
る。該抗体の特に有利な点は、長い（体内）循環半減期
である。
剤として有用であり、特に抗肺転移剤として有用であ
る。これらの抗体は転移性腫瘍細胞、特にトロンボスポ
ンジンに応答するものの付着を阻害する。該抗体は腫瘍
コロニーの大きさと同様に腫瘍コロニーの数も減少させ
る。該抗体の特に有利な点は、長い（体内）循環半減期
である。
【００５３】このような抗転移活性を生起することがで
きる機構は数多く存在する。該抗体は細胞毒性である、
又は細胞増殖を阻害することができる。細胞増殖の阻害
剤としては、該抗体は１）有糸分裂を阻害し、２）脈管
形成を阻害し、又は３）補体経路及び関連キラー細胞を
活性化する、ように作用することができる。
きる機構は数多く存在する。該抗体は細胞毒性である、
又は細胞増殖を阻害することができる。細胞増殖の阻害
剤としては、該抗体は１）有糸分裂を阻害し、２）脈管
形成を阻害し、又は３）補体経路及び関連キラー細胞を
活性化する、ように作用することができる。
【００５４】本発明の抗体は生物医学的装置における用
途も見出すことができる。該抗体は転移性腫瘍細胞の付
着を促進する能力があるので、生物医学的装置を該抗体
で被覆し、血液又はリンパから循環腫瘍細胞を除去する
ことも可能である。該生物医学的装置は肝癌をトラップ
するのにも有用である。
途も見出すことができる。該抗体は転移性腫瘍細胞の付
着を促進する能力があるので、生物医学的装置を該抗体
で被覆し、血液又はリンパから循環腫瘍細胞を除去する
ことも可能である。該生物医学的装置は肝癌をトラップ
するのにも有用である。
【００５５】該抗体の他の用途は、診断又は治療目的で
毒素、薬剤、ホルモン又はイメージング剤を転移性腫瘍
細胞へもたらすための担体としてである。これらの担体
は肝癌にも結合するであろう。
毒素、薬剤、ホルモン又はイメージング剤を転移性腫瘍
細胞へもたらすための担体としてである。これらの担体
は肝癌にも結合するであろう。
【００５６】アテローム硬化 アテローム硬化は、動脈内壁上の脂質小結節（small f
atty nodule）の沈着によって識別される病状であり、
しばしば疾患領域の変性を伴なう。
atty nodule）の沈着によって識別される病状であり、
しばしば疾患領域の変性を伴なう。
【００５７】アテローム硬化活性は、高コレステロール
食を与えられたラビットにおける大動脈病変の進展を阻
害する抗体の能力（capacity）によって識別される。
食を与えられたラビットにおける大動脈病変の進展を阻
害する抗体の能力（capacity）によって識別される。
【００５８】マラリヤ マラリヤは、赤血球に寄生し、感染した蚊に刺されるこ
とにより哺乳動物に伝達される種々の原生動物により引
き起される感染性の病気である。本発明の抗体は細胞接
着を阻止する治療剤として用いることができる。
とにより哺乳動物に伝達される種々の原生動物により引
き起される感染性の病気である。本発明の抗体は細胞接
着を阻止する治療剤として用いることができる。
【００５９】抗マラリヤ活性は、マラリヤに感染した赤
血球の内皮細胞への細胞接着、マラリヤ・スポロゾイト
（種虫）の肝細胞の認識と侵入、又はマラリヤ・メロゾ
イト（分裂小体）の赤血球認識と侵入を阻害する能力に
より識別される。
血球の内皮細胞への細胞接着、マラリヤ・スポロゾイト
（種虫）の肝細胞の認識と侵入、又はマラリヤ・メロゾ
イト（分裂小体）の赤血球認識と侵入を阻害する能力に
より識別される。
【００６０】血栓状態 本発明の抗体に伴う血栓活性は、血小板凝集及び血小板
血栓形成を阻害するように作用する。血小板は、フィブ
リノーゲンとの結合、血小板凝集及び血栓形成を介して
血液凝固に参与する。これらのペプチドは抗血栓剤とし
て以下の状態：心筋梗塞、血栓塞栓症（thromboembolic
disease）及び癌や心臓血管病に起因する血栓合併症
において有用でありうる。
血栓形成を阻害するように作用する。血小板は、フィブ
リノーゲンとの結合、血小板凝集及び血栓形成を介して
血液凝固に参与する。これらのペプチドは抗血栓剤とし
て以下の状態：心筋梗塞、血栓塞栓症（thromboembolic
disease）及び癌や心臓血管病に起因する血栓合併症
において有用でありうる。
【００６１】血小板凝集は損傷した組織の出血を停止さ
せる正常且つ有益なプロセスである。しかしながら血小
板凝集は血管形成術、血栓溶解治療又は血管移植の如き
心臓血管の処置につづいて問題を引き起こす可能性があ
る。血小板は全α顆粒血小板分泌蛋白（alpha granula
r platelet secreted-protein）中に２５％ものＴＳ
Ｐ蛋白を含有する。それ故、血小板の表面の受容体に結
合する抗体を導入することにより、血小板が凝集した
り、凝塊を形成するのを防ぐことができる。
せる正常且つ有益なプロセスである。しかしながら血小
板凝集は血管形成術、血栓溶解治療又は血管移植の如き
心臓血管の処置につづいて問題を引き起こす可能性があ
る。血小板は全α顆粒血小板分泌蛋白（alpha granula
r platelet secreted-protein）中に２５％ものＴＳ
Ｐ蛋白を含有する。それ故、血小板の表面の受容体に結
合する抗体を導入することにより、血小板が凝集した
り、凝塊を形成するのを防ぐことができる。
【００６２】該抗体は末梢動脈の手術の間、心臓血管の
手術において、又は血管形成術の後の如き、多数の治療
適用において有用であることができる。該抗体は、血小
板凝集に伴う心臓血管及び虚血性の障害や病気の処置及
び予防のために、予防的に用いることもできる。本発明
の抗体を基本とする薬品は、現在市販されている他の凝
固溶解剤（例えば、ｔＰＡ、ストレプトキナン（strept
okinan））と一緒に用いるための、血管形成術や血栓溶
解治療の補助剤として用いることができる。かかる薬剤
は、出血も悪化させず、又は合成の抗血小板薬に一般的
にみられる副作用の危険性がない。更にかかる抗体は
（心臓バイパス手術において用いられるものの如き）小
径の移植血管を開通（open）状態に維持するのを助ける
ことができる。同様の適用が発作の危険性がある患者の
ために考えられる。
手術において、又は血管形成術の後の如き、多数の治療
適用において有用であることができる。該抗体は、血小
板凝集に伴う心臓血管及び虚血性の障害や病気の処置及
び予防のために、予防的に用いることもできる。本発明
の抗体を基本とする薬品は、現在市販されている他の凝
固溶解剤（例えば、ｔＰＡ、ストレプトキナン（strept
okinan））と一緒に用いるための、血管形成術や血栓溶
解治療の補助剤として用いることができる。かかる薬剤
は、出血も悪化させず、又は合成の抗血小板薬に一般的
にみられる副作用の危険性がない。更にかかる抗体は
（心臓バイパス手術において用いられるものの如き）小
径の移植血管を開通（open）状態に維持するのを助ける
ことができる。同様の適用が発作の危険性がある患者の
ために考えられる。
【００６３】該抗体は透析適用においても有用である。
該抗体は透析膜上の血小板凝集の除去に努力している透
析患者に投与することができるであろう。別法として
は、該透析膜を該抗体で被膜し、医学装置を流体試料が
通過する際の血小板凝集を防ぐことができるであろう。
該抗体は透析膜上の血小板凝集の除去に努力している透
析患者に投与することができるであろう。別法として
は、該透析膜を該抗体で被膜し、医学装置を流体試料が
通過する際の血小板凝集を防ぐことができるであろう。
【００６４】本発明の抗体は血小板凝集の第２段階（即
ち、血小板凝集のトロンボスポンジン依存段階）を特異
的に阻害する能力を有する。この活性は病状（即ち、灰
色血小板症候群（Gray Platelet Syndrome）、本態性
血小板血症、骨髄増殖性症候群）の結果として生じる、
又は治療（即ち、癌治療）又は自己免疫病により誘導さ
れる、血小板減少症を防止するのにこの抗体を有用なら
しめる。この抗体はバルーンカテーテル法に付随する冠
動脈再閉塞を防止するための作用もある。
ち、血小板凝集のトロンボスポンジン依存段階）を特異
的に阻害する能力を有する。この活性は病状（即ち、灰
色血小板症候群（Gray Platelet Syndrome）、本態性
血小板血症、骨髄増殖性症候群）の結果として生じる、
又は治療（即ち、癌治療）又は自己免疫病により誘導さ
れる、血小板減少症を防止するのにこの抗体を有用なら
しめる。この抗体はバルーンカテーテル法に付随する冠
動脈再閉塞を防止するための作用もある。
【００６５】本発明の抗体は血餅の形成又は構造（stru
cture）を調節する。トロンボスポンジンは線維素塊（f
ibrin clot）中にとり込まれ、血液凝固因子ＸＩＩＩ
ａのための基質として働く。トロンボスポンジン中のＩ
ＱＱ配列モチーフ（motif）がＸＩＩＩａ因子への架橋
に関係している。ＩＱＱを含有するペプチドは血餅の形
成及び構造を調節する。公知の線溶in vitro分析がこ
の能力を証明する。
cture）を調節する。トロンボスポンジンは線維素塊（f
ibrin clot）中にとり込まれ、血液凝固因子ＸＩＩＩ
ａのための基質として働く。トロンボスポンジン中のＩ
ＱＱ配列モチーフ（motif）がＸＩＩＩａ因子への架橋
に関係している。ＩＱＱを含有するペプチドは血餅の形
成及び構造を調節する。公知の線溶in vitro分析がこ
の能力を証明する。
【００６６】抗血栓活性は、１）洗浄した血小板中のＡ
ＤＰ又はトロンビン誘起血小板凝集の阻害；２）富血小
板プラズマ中の血小板凝集の阻害；３）in vivoで測定
されたコラーゲン誘起血小板凝集の阻害；及び頸動脈に
おいて誘起された血栓形成の阻害、を包含する多数の分
析により識別され、この分析において該抗体は血栓誘起
につづく動脈の閉塞を遅延又は防止するであろう。
ＤＰ又はトロンビン誘起血小板凝集の阻害；２）富血小
板プラズマ中の血小板凝集の阻害；３）in vivoで測定
されたコラーゲン誘起血小板凝集の阻害；及び頸動脈に
おいて誘起された血栓形成の阻害、を包含する多数の分
析により識別され、この分析において該抗体は血栓誘起
につづく動脈の閉塞を遅延又は防止するであろう。
【００６７】血栓溶解状態 本発明の抗体に随伴する血栓溶解活性は、形成された血
栓の構造を変える、即ち血餅を溶解する作用がある。血
栓溶解活性はプラスミンの存在下にフィブリンの溶解を
増進する能力として識別される（即ち、標準の凝固溶解
分析）。
栓の構造を変える、即ち血餅を溶解する作用がある。血
栓溶解活性はプラスミンの存在下にフィブリンの溶解を
増進する能力として識別される（即ち、標準の凝固溶解
分析）。
【００６８】脈管形成 脈管形成とは血管及びリンパ管の形成である。本発明の
抗体は脈管形成の調節、特に損傷治癒の増大、腫瘍成
長、糖尿病性網膜症及びリウマチ関節炎の防止又は阻止
に有用である。標準的脈管形成分析は当技術分野で周知
である。これらの分析には、種々の細胞株を用いた増殖
及び移動研究、コラゲナーゼ阻害及びヒヨコ漿尿膜上で
のin vivo新生血管形成（ＣＡＭ分析）が含まれるが、
これに限定されない。
抗体は脈管形成の調節、特に損傷治癒の増大、腫瘍成
長、糖尿病性網膜症及びリウマチ関節炎の防止又は阻止
に有用である。標準的脈管形成分析は当技術分野で周知
である。これらの分析には、種々の細胞株を用いた増殖
及び移動研究、コラゲナーゼ阻害及びヒヨコ漿尿膜上で
のin vivo新生血管形成（ＣＡＭ分析）が含まれるが、
これに限定されない。
【００６９】接着調整 該抗体は細胞接着を調整することができ、ＴＳＰ及び他
の蛋白がＴＳＰ受容体部位を含有する血液血小板の如き
細胞へ結合するのを阻害する。
の蛋白がＴＳＰ受容体部位を含有する血液血小板の如き
細胞へ結合するのを阻害する。
【００７０】診断 本発明の抗体は、胃腸管（胃の、結腸の、及び直腸の）
癌、胸の癌及び肝癌を含む（これに限定されない）種々
の型の癌の診断／予後分析における試剤として有用であ
りうる。
癌、胸の癌及び肝癌を含む（これに限定されない）種々
の型の癌の診断／予後分析における試剤として有用であ
りうる。
【００７１】担体 細胞毒薬、ホルモン又はイメージング剤を、癌その他の
治療における利用のために抗体に結合させることができ
る。
治療における利用のために抗体に結合させることができ
る。
【００７２】生物医学装置 血小板の如く、細胞表面にトロンボスポンジンに対する
受容体を有する細胞を除くために、生物医学装置を該抗
体で被覆することができる。
受容体を有する細胞を除くために、生物医学装置を該抗
体で被覆することができる。
【００７３】以下の略号を本発明の説明において、一貫
して用いた。
して用いた。
【００７４】 ＴＳＰ − トロンボスポンジン ｋｄ − キロダルトン ％ − パーセント ｍＭ − ミリモラー μＭ − マイクロモラー ｍｌ − ミリリットル Ｍ − モラー μｌ − マイクロリットル ＦＮ − フィブロネクチン ＢＳＡ − 牛血清アルブミン μｇ − マイクログラム ｇ − グラム
【００７５】
【実施例】以下の実施例は説明の目的の為に提示するの
であり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定す
る意図はない。
であり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定す
る意図はない。
【００７６】実施例１ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体：精製及び特性付け ５ｍｌの結合バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．５、０．５％ ＮＰ−４０洗浄剤、１ｍＭ
ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００μＭリユーペ
プチン（leupeptin）、１ｍＭ フェニルメチル スル
ホニル フルオライド（ＰＭＳＦ）、１０μｇ／ｍｌア
プロチニン含有）中で細胞ペレットを溶解することによ
り、約４．０×１０7のＢ16−Ｆ10マウス黒色腫細胞又
はＡ５４９ヒト肺癌細胞から細胞抽出液を調製した。４
℃で２０分間４，０００×ｇで遠心分離することによ
り、未溶解物質を試料から除いた。
ｌ、ｐＨ７．５、０．５％ ＮＰ−４０洗浄剤、１ｍＭ
ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００μＭリユーペ
プチン（leupeptin）、１ｍＭ フェニルメチル スル
ホニル フルオライド（ＰＭＳＦ）、１０μｇ／ｍｌア
プロチニン含有）中で細胞ペレットを溶解することによ
り、約４．０×１０7のＢ16−Ｆ10マウス黒色腫細胞又
はＡ５４９ヒト肺癌細胞から細胞抽出液を調製した。４
℃で２０分間４，０００×ｇで遠心分離することによ
り、未溶解物質を試料から除いた。
【００７７】ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水、ｐＨ７．３５
中で平衡化したＣＮ−活性化セファロース１ｍｌに結合
させたＣＳＶＴＣＧ ４ｍｇを５ｍｌのカラムに充填す
ることにより、ＣＳＶＴＣＧ（配列番号：１）アフィニ
ィティーカラムを組み立てた。５０ｍｌの結合バッファ
ーで洗浄した該ＣＳＶＴＣＧカラムに該抽出液を適用し
た。非特異的に吸着した蛋白を、５０ｍｌの結合バッフ
ァーで該カラムを洗浄することによりカラムから除去し
た。特異的に吸着した蛋白は、０．０５％ ＮＰ−４０
洗浄剤、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０
０μＭリユーペプチン（leupeptin）、１ｍＭフェニル
メチル スルホニル フルオライド（ＰＭＳＦ）、及び
１０μｇ／ｍｌアプロチニンを含有する０．１０Ｍ Ｔ
ｒｉｓ、ｐＨ１０．２で溶出した。１０ｍｌの画分は、
Ｔｒｉｓを中和するために７００μｌの１Ｎ ＨＣｌを
含有するチューブに収集した。チューブ中のピーク画分
は、陰イオン交換カラムバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭオクチルグルコシド含
有）中で平衡化した陰イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ、
ファルマシア）に適用した。結合した物質は、ＮａＣｌ
（１００％ １ＭＮａＣｌ）の２０ｍｌ直線勾配で溶出
し、該カラムは２８０及び２６０ｎｍでモニターした。
結合した物質は手順通りに０．３Ｍ ＮａＣｌで溶出し
はじめ、そして勾配は、該蛋白が２６０ｎｍで高吸収を
有する単一均質ピークを平坦に形成して溶出するように
維持した。
中で平衡化したＣＮ−活性化セファロース１ｍｌに結合
させたＣＳＶＴＣＧ ４ｍｇを５ｍｌのカラムに充填す
ることにより、ＣＳＶＴＣＧ（配列番号：１）アフィニ
ィティーカラムを組み立てた。５０ｍｌの結合バッファ
ーで洗浄した該ＣＳＶＴＣＧカラムに該抽出液を適用し
た。非特異的に吸着した蛋白を、５０ｍｌの結合バッフ
ァーで該カラムを洗浄することによりカラムから除去し
た。特異的に吸着した蛋白は、０．０５％ ＮＰ−４０
洗浄剤、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０
０μＭリユーペプチン（leupeptin）、１ｍＭフェニル
メチル スルホニル フルオライド（ＰＭＳＦ）、及び
１０μｇ／ｍｌアプロチニンを含有する０．１０Ｍ Ｔ
ｒｉｓ、ｐＨ１０．２で溶出した。１０ｍｌの画分は、
Ｔｒｉｓを中和するために７００μｌの１Ｎ ＨＣｌを
含有するチューブに収集した。チューブ中のピーク画分
は、陰イオン交換カラムバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭオクチルグルコシド含
有）中で平衡化した陰イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ、
ファルマシア）に適用した。結合した物質は、ＮａＣｌ
（１００％ １ＭＮａＣｌ）の２０ｍｌ直線勾配で溶出
し、該カラムは２８０及び２６０ｎｍでモニターした。
結合した物質は手順通りに０．３Ｍ ＮａＣｌで溶出し
はじめ、そして勾配は、該蛋白が２６０ｎｍで高吸収を
有する単一均質ピークを平坦に形成して溶出するように
維持した。
【００７８】該溶出画分と非結合画分は濃縮し、濃縮物
質を８％ポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ゲルで分
析し、標準の技術を用いてコマシー・ブルー（comassie
blue）染色で可視化した。図１（レーン１及び２）に
示した如く、非還元条件下のＳＤＳ−ゲル電気泳動で分
析したピーク画分は５０ｋｄの見掛けの分子量を有する
主要バンドを、また還元条件（５％β−メルカプトエタ
ノール）下で５０及び６０ｋｄの２本のポリペプチドバ
ンドを示した。１×１０7細胞から約１００μｇの蛋白
が回収された。
質を８％ポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ゲルで分
析し、標準の技術を用いてコマシー・ブルー（comassie
blue）染色で可視化した。図１（レーン１及び２）に
示した如く、非還元条件下のＳＤＳ−ゲル電気泳動で分
析したピーク画分は５０ｋｄの見掛けの分子量を有する
主要バンドを、また還元条件（５％β−メルカプトエタ
ノール）下で５０及び６０ｋｄの２本のポリペプチドバ
ンドを示した。１×１０7細胞から約１００μｇの蛋白
が回収された。
【００７９】該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体を、Ｋａｒｃ
ｚｅｗｓｋｉら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８
９）２６４：２１３２２−６）の標準的手順により125
Ｉ−沃素で標識した。簡単に言えば、１００μｌのオク
チルグルコシド・バッファーに溶解した１２μｇの精製
蛋白を、５分間１つの沃素ビース（Iodo bead）と一緒
にインキュベートした。未反応の沃化物は、Ｔｕｓｚｙ
ｎｓｋｉら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８０）
１０６：１１８−１２２）により既述されているように
して、オクチルグルコシド・バッファー中で平衡化した
セファーデックスＧ−２５の小さいカラムで除去した。
代表的実験によって得られた蛋白の比活性は１０4ｃｐ
ｍ／μｇであった。ＳＤＳ−ゲル電気泳動及びオートラ
ジオグラフィーによる標識物質の分析は、還元条件下で
は６０ｋｄ分子量のポリペプチドバンドが主であること
を示した。この標識物質のオートラジオグラムを図１、
レーン３及び４に示す。
ｚｅｗｓｋｉら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８
９）２６４：２１３２２−６）の標準的手順により125
Ｉ−沃素で標識した。簡単に言えば、１００μｌのオク
チルグルコシド・バッファーに溶解した１２μｇの精製
蛋白を、５分間１つの沃素ビース（Iodo bead）と一緒
にインキュベートした。未反応の沃化物は、Ｔｕｓｚｙ
ｎｓｋｉら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８０）
１０６：１１８−１２２）により既述されているように
して、オクチルグルコシド・バッファー中で平衡化した
セファーデックスＧ−２５の小さいカラムで除去した。
代表的実験によって得られた蛋白の比活性は１０4ｃｐ
ｍ／μｇであった。ＳＤＳ−ゲル電気泳動及びオートラ
ジオグラフィーによる標識物質の分析は、還元条件下で
は６０ｋｄ分子量のポリペプチドバンドが主であること
を示した。この標識物質のオートラジオグラムを図１、
レーン３及び４に示す。
【００８０】該標識された125Ｉ−ＣＳＶＴＣＧ特異的
受容体蛋白（１００，０００ｃｐｍ）を標準の手順を用
いてｐＨ３〜９等電焦点ゲルで分析した。この手順によ
り、該精製された物質は図２に示した如く約７．１〜
７．５の範囲内にｐＩを有する単一バンドとして分解
（resolve）された。
受容体蛋白（１００，０００ｃｐｍ）を標準の手順を用
いてｐＨ３〜９等電焦点ゲルで分析した。この手順によ
り、該精製された物質は図２に示した如く約７．１〜
７．５の範囲内にｐＩを有する単一バンドとして分解
（resolve）された。
【００８１】実施例２結合調査 結合調査は以下のように実施した。
【００８２】取りはずし可能なマイクロタイター・ウェ
ル（Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ）を、
４０μｇ／ｍｌのＴＳＰ、フィブロネクチン、ＢＳＡ又
はペプチド溶液（２０ｍＭビス−トリス−プロパン・バ
ッファー、ｐＨ６．５中）の５０μｌを用いて、４℃で
一晩被覆し、２００μｌの１％ＢＳＡを用いて１時間ブ
ロックした。〔125Ｉ〕標識ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体
の少量を、最終濃度が約１００，０００ｃｐｍ／５０μ
ｌ溶液（３０ｎｍ）になるように結合バッファー（２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ バッファー生理食塩水、ｐＨ７．３
５、１ｍＭ ＣａＣｌ2、０．０５％ ＮＰ４０含有）
に添加した。そして小分割５０μｌを該蛋白被覆ウェル
中で１時間インキュベートした。そしてウェルを２００
μｌの結合バッファーを用いてアスピレーションにより
３回洗浄し、各々のウェルを結合した放射能がガンマー
・カウンターでカウントして測定した。フィブロネクチ
ン、ＢＳＡ及びＶＣＴＧＳＣ（ＣＳＶＴＣＧに対する対
照ペプチド）はＴＳＰについて観測された値の４６％、
３７％及び２７％の結合であったので、ＣＳＶＴＣＧ特
異的受容体蛋白はＴＳＰ及びＣＳＶＴＣＧについて最大
の結合親和性を有した。これらの結果は、該ＣＳＶＴＣ
Ｇ特異的受容体蛋白はin vitroでＴＳＰと特異的に相
互作用しうることを示す。概略、１μｇの標識受容体が
１μｇの固定化ＴＳＰに結合する。ＴＳＰはＦＮ又はＢ
ＳＡに対するより３倍多く標識受容体に結合する。
ル（Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ）を、
４０μｇ／ｍｌのＴＳＰ、フィブロネクチン、ＢＳＡ又
はペプチド溶液（２０ｍＭビス−トリス−プロパン・バ
ッファー、ｐＨ６．５中）の５０μｌを用いて、４℃で
一晩被覆し、２００μｌの１％ＢＳＡを用いて１時間ブ
ロックした。〔125Ｉ〕標識ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体
の少量を、最終濃度が約１００，０００ｃｐｍ／５０μ
ｌ溶液（３０ｎｍ）になるように結合バッファー（２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ バッファー生理食塩水、ｐＨ７．３
５、１ｍＭ ＣａＣｌ2、０．０５％ ＮＰ４０含有）
に添加した。そして小分割５０μｌを該蛋白被覆ウェル
中で１時間インキュベートした。そしてウェルを２００
μｌの結合バッファーを用いてアスピレーションにより
３回洗浄し、各々のウェルを結合した放射能がガンマー
・カウンターでカウントして測定した。フィブロネクチ
ン、ＢＳＡ及びＶＣＴＧＳＣ（ＣＳＶＴＣＧに対する対
照ペプチド）はＴＳＰについて観測された値の４６％、
３７％及び２７％の結合であったので、ＣＳＶＴＣＧ特
異的受容体蛋白はＴＳＰ及びＣＳＶＴＣＧについて最大
の結合親和性を有した。これらの結果は、該ＣＳＶＴＣ
Ｇ特異的受容体蛋白はin vitroでＴＳＰと特異的に相
互作用しうることを示す。概略、１μｇの標識受容体が
１μｇの固定化ＴＳＰに結合する。ＴＳＰはＦＮ又はＢ
ＳＡに対するより３倍多く標識受容体に結合する。
【００８３】実施例３受容体の表面標識 生来の、生育しているＡ５４９細胞を、Ｔｕｓｚｙｎｓ
ｋｉら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８０）１０
６：１１８−１２２）により記載されたようにラクトペ
ルオキシダーゼを用いて〔１２５〕−沃素で表面標識し
た。簡単に言えば、接触単層（confluent monolayer）
に近い細胞を含有する７５ｍｍフラスコを１０ｍｌのＤ
ＭＥＭで３回リンスした。そして該細胞層を０．２単位
／ｍｌのラクトペルオキシダーゼと５００μＣｉの〔１
２５〕−沃素とを含有するＤＭＥＭ ５ｍｌで覆った。
３０％Ｈ2Ｏ：の１μｌ小分割を５回、１分間隔で静か
に混ぜながら添加した。そして１ｍＭ ＮａＮ3 ５μ
ｌを添加することにより反応を停止させ、該単層をＤＭ
ＥＭで３回洗浄し、そしてＣＳＶＴＣＧ結合蛋白の精製
のために細胞を採取した。
ｋｉら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８０）１０
６：１１８−１２２）により記載されたようにラクトペ
ルオキシダーゼを用いて〔１２５〕−沃素で表面標識し
た。簡単に言えば、接触単層（confluent monolayer）
に近い細胞を含有する７５ｍｍフラスコを１０ｍｌのＤ
ＭＥＭで３回リンスした。そして該細胞層を０．２単位
／ｍｌのラクトペルオキシダーゼと５００μＣｉの〔１
２５〕−沃素とを含有するＤＭＥＭ ５ｍｌで覆った。
３０％Ｈ2Ｏ：の１μｌ小分割を５回、１分間隔で静か
に混ぜながら添加した。そして１ｍＭ ＮａＮ3 ５μ
ｌを添加することにより反応を停止させ、該単層をＤＭ
ＥＭで３回洗浄し、そしてＣＳＶＴＣＧ結合蛋白の精製
のために細胞を採取した。
【００８４】ＳＤＳ−ゲル電気泳動及びオートラジオグ
ラフィーによる標識物質の分析により、in vitro沃素
化により標識された、非還元条件下でＭｒ＝５０，００
０のポリペプチドが標識されたことが分かった（図１、
レーン５）。
ラフィーによる標識物質の分析により、in vitro沃素
化により標識された、非還元条件下でＭｒ＝５０，００
０のポリペプチドが標識されたことが分かった（図１、
レーン５）。
【００８５】該受容体は時間依存的様相でＴＳＰに結合
し、６０分後は時間非依存的になった。該結合は１ｍＭ
ＣａＣｌ2及び１ｍＭ ＭｇＣｌ2の双方の存在で最大
となり、一方小量ではあるが相当量の結合が１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡの存在下で発生した。 実施例４受容体抗体 ウサギに３〜４週毎に５０μｇの注射を４回行った後、
標準的手順によりポリクローナルＣＳＶＴＣＧ特異的受
容体抗血清を形成させた。第１回目の注射は、完全フロ
インド・アジュバントと一緒に与え、あとの注射は不完
全フロインド・アジュバントと一緒に投与した。抗体の
力価と特異性はＥＬＩＳＡで定めた。
し、６０分後は時間非依存的になった。該結合は１ｍＭ
ＣａＣｌ2及び１ｍＭ ＭｇＣｌ2の双方の存在で最大
となり、一方小量ではあるが相当量の結合が１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡの存在下で発生した。 実施例４受容体抗体 ウサギに３〜４週毎に５０μｇの注射を４回行った後、
標準的手順によりポリクローナルＣＳＶＴＣＧ特異的受
容体抗血清を形成させた。第１回目の注射は、完全フロ
インド・アジュバントと一緒に与え、あとの注射は不完
全フロインド・アジュバントと一緒に投与した。抗体の
力価と特異性はＥＬＩＳＡで定めた。
【００８６】ＥＬＩＳＡ分析は以下の標準的手順で実施
した。簡単に言えば、マイクロタイタープレートを２μ
ｇのＣＳＶＴＣＧ特異的受容体、フィブロネクチン又は
ＢＳＡで被覆し、１％ＢＳＡを用いて１時間ブロックし
た。１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−
２０を含有する１０ｍＭリン酸塩バッファー、ｐＨ７．
４（ＰＢＳ−Ｔ）中の種々の希釈率の第１抗体５０μｌ
を用いて、ウエルを１時間インキュベートした。そして
ウエルをＰＢＳ−Ｔ中で３回洗浄し、アルカリホスファ
ターゼ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧのＰＢＳ−Ｔ中１：８０
０希釈液５０μｌを用いて、１時間インキュベートし
た。ウエルをＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄し、次いでＴ
ｗｅｅｎ−２０を含有しないＰＢＳ−Ｔバッファーで３
回洗い、そしてアルカリホスファターゼ基質溶液（１ｍ
Ｍ ＺｎＣｌ2及び１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有する０．１
０Ｍグリシン、ｐＨ１０．４中の１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニ
トロフェニルホスフェート）の５０μｌで処理した。３
０分後、１Ｎ ＮａＯＨ５μｌを添加して発色を停止
し、４０５ｎｍで吸収を測定した。
した。簡単に言えば、マイクロタイタープレートを２μ
ｇのＣＳＶＴＣＧ特異的受容体、フィブロネクチン又は
ＢＳＡで被覆し、１％ＢＳＡを用いて１時間ブロックし
た。１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−
２０を含有する１０ｍＭリン酸塩バッファー、ｐＨ７．
４（ＰＢＳ−Ｔ）中の種々の希釈率の第１抗体５０μｌ
を用いて、ウエルを１時間インキュベートした。そして
ウエルをＰＢＳ−Ｔ中で３回洗浄し、アルカリホスファ
ターゼ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧのＰＢＳ−Ｔ中１：８０
０希釈液５０μｌを用いて、１時間インキュベートし
た。ウエルをＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄し、次いでＴ
ｗｅｅｎ−２０を含有しないＰＢＳ−Ｔバッファーで３
回洗い、そしてアルカリホスファターゼ基質溶液（１ｍ
Ｍ ＺｎＣｌ2及び１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有する０．１
０Ｍグリシン、ｐＨ１０．４中の１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニ
トロフェニルホスフェート）の５０μｌで処理した。３
０分後、１Ｎ ＮａＯＨ５μｌを添加して発色を停止
し、４０５ｎｍで吸収を測定した。
【００８７】該抗体は表Ｉに示すように直接的ＥＬＩＳ
Ａで測定して単一特異性（monospecific）であった。
Ａで測定して単一特異性（monospecific）であった。
【００８８】
【表１】
【００８９】実施例５レクチン調査 炭水化物（糖質）が該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体上に依
存することを測定するために、下記のレクチン調査（st
udy）を実施した。ＰＢＳ中のレクチン４０μｇ／ｍｌ
溶液の１００μｌを用いて各々のウェルをインキュベー
トすることにより、マイクロタイターウエルにレクチン
を被覆した。ウェルをＰＢＳ中で２回洗浄し、ＢＳＡで
ブロックし、結合バッファー中の〔125Ｉ〕−ＣＳＶＴ
ＣＧ特異的受容体蛋白５０μｌを用いてインキュベート
した。ウエルをＰＢＳ中で２回洗浄し、結合した放射能
をカウントした。表ＩＩに結果を示す。それは該受容体
がガラクトース、マンノース及びグルコサミン特異的レ
クチンに結合することを示している。
存することを測定するために、下記のレクチン調査（st
udy）を実施した。ＰＢＳ中のレクチン４０μｇ／ｍｌ
溶液の１００μｌを用いて各々のウェルをインキュベー
トすることにより、マイクロタイターウエルにレクチン
を被覆した。ウェルをＰＢＳ中で２回洗浄し、ＢＳＡで
ブロックし、結合バッファー中の〔125Ｉ〕−ＣＳＶＴ
ＣＧ特異的受容体蛋白５０μｌを用いてインキュベート
した。ウエルをＰＢＳ中で２回洗浄し、結合した放射能
をカウントした。表ＩＩに結果を示す。それは該受容体
がガラクトース、マンノース及びグルコサミン特異的レ
クチンに結合することを示している。
【００９０】
【表２】
【００９１】実施例６抗体による接着阻害 抗ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体抗体の、癌細胞のＴＳＰへ
の接着を阻害する能力を測定するために、以下の実験を
実施した。取りはずし可能なマイクロタイターウェル
（Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ）を、２
０ｍＭビス−トリス−プロパンバッファー、ｐＨ６．５
中の４０μｇ／ｍｌ ＴＳＰ、フィブロネクチン、又は
ラミニン溶液の５０μｌを用いて、４℃一晩被覆し、１
％ＢＳＡ２００μｌを用いて１時間ブロックした。Ａ５
４９細胞及び２００μｇ／ｍｌの抗ＣＳＶＴＣＧ特異的
受容体に対するＩｇＧ又は非免疫抗血清を３０分間イン
キュベートし、そして遠心分離して未結合抗体を除去し
た。ペレットをＤＭＥＭ中に再分散し、その細胞を該蛋
白被覆ウェル中で３７℃で６０分インキュベートした。
マイクロタイターウエルの表面に付着した細胞の数をカ
ウントした。表ＩＩＩの結果を非免疫ＩｇＧ−処理の接
着細胞に対する％として示してある。表ＩＩＩは、抗Ｃ
ＳＶＴＣＧ特異的受容体抗体はＡ５４９細胞のＴＳＰ被
覆表面への接着を阻害するが、フィブロネクチン又はラ
ミニンへの細胞接着には影響ないことを示している。該
抗体は組織培養プラスチック（tissue culture plast
ic）へのＴＳＰの付着も阻害した。
の接着を阻害する能力を測定するために、以下の実験を
実施した。取りはずし可能なマイクロタイターウェル
（Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ）を、２
０ｍＭビス−トリス−プロパンバッファー、ｐＨ６．５
中の４０μｇ／ｍｌ ＴＳＰ、フィブロネクチン、又は
ラミニン溶液の５０μｌを用いて、４℃一晩被覆し、１
％ＢＳＡ２００μｌを用いて１時間ブロックした。Ａ５
４９細胞及び２００μｇ／ｍｌの抗ＣＳＶＴＣＧ特異的
受容体に対するＩｇＧ又は非免疫抗血清を３０分間イン
キュベートし、そして遠心分離して未結合抗体を除去し
た。ペレットをＤＭＥＭ中に再分散し、その細胞を該蛋
白被覆ウェル中で３７℃で６０分インキュベートした。
マイクロタイターウエルの表面に付着した細胞の数をカ
ウントした。表ＩＩＩの結果を非免疫ＩｇＧ−処理の接
着細胞に対する％として示してある。表ＩＩＩは、抗Ｃ
ＳＶＴＣＧ特異的受容体抗体はＡ５４９細胞のＴＳＰ被
覆表面への接着を阻害するが、フィブロネクチン又はラ
ミニンへの細胞接着には影響ないことを示している。該
抗体は組織培養プラスチック（tissue culture plast
ic）へのＴＳＰの付着も阻害した。
【００９２】
【表３】
【００９３】実施例７腫瘍細胞の転移に対する抗体の影響 実施例ＩＩに記載したＣＳＶＴＣＧ特異的受容体抗体
を、腫瘍細胞の転移を阻害する能力をin vivoで証明す
るために用いた。
を、腫瘍細胞の転移を阻害する能力をin vivoで証明す
るために用いた。
【００９４】本発明のペプチド化合物の抗転移活性を証
明するために用いたin vivoモデルは、Ｔｕｓｚｙｎｓ
ｋｉら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９８７）４７：４
１３０−４１３３）により記載されている。簡単に言え
ば、１００μｇのＩｇＧ又は１００μｇの本発明の抗Ｃ
ＳＶＴＣＧ特異的受容体抗体の存在下、１×１０5Ｂ16
Ｆ10マウス黒色腫細胞をＣ５７黒マウスに静脈注射す
る。各々の化合物について５〜６の動物を用いる。該分
析で試験された抗体は、トリパンブルー染色排除法で測
定して、細胞生存性に何の影響も持たない。更に、該抗
体は２４時間共培養しても細胞増殖に何の影響もない。
１４日後マウスを殺し、肺腫瘍の数をカウントする。
明するために用いたin vivoモデルは、Ｔｕｓｚｙｎｓ
ｋｉら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９８７）４７：４
１３０−４１３３）により記載されている。簡単に言え
ば、１００μｇのＩｇＧ又は１００μｇの本発明の抗Ｃ
ＳＶＴＣＧ特異的受容体抗体の存在下、１×１０5Ｂ16
Ｆ10マウス黒色腫細胞をＣ５７黒マウスに静脈注射す
る。各々の化合物について５〜６の動物を用いる。該分
析で試験された抗体は、トリパンブルー染色排除法で測
定して、細胞生存性に何の影響も持たない。更に、該抗
体は２４時間共培養しても細胞増殖に何の影響もない。
１４日後マウスを殺し、肺腫瘍の数をカウントする。
【００９５】本発明の抗体は転移活性を阻害するのに効
果的である。
果的である。
【００９６】実施例８血小板凝集に対する抗体の影響 血小板凝集を、蛍光を測定するために取りつけた単一チ
ャネル式血小板凝集計（Chromo−Log，Havertown，Penn
sylvania）で監視する。富血小板ブラズマ（platelet-r
ich-plasma：ＰＲＰ）を、０．３８クエン酸ナトリウム
で抗凝固化した全血から２０分間１５０×ｇで遠心する
ことにより得る。富血小板プラズマの０．５ｍｌ小分割
を、種々の濃度の対照ＩｇＧ又は抗ＣＳＶＴＣＧ特異的
受容体抗体の存在下に２μＭ ＡＤＰと一緒に撹拌する
ことにより、凝集させる。凝集反応はクロノログ（chro
no-log）血小板凝集計中で光学吸収対時間における減少
として３７℃で測定する。本発明の抗体は血小板凝集を
阻害するのに効果がある。
ャネル式血小板凝集計（Chromo−Log，Havertown，Penn
sylvania）で監視する。富血小板ブラズマ（platelet-r
ich-plasma：ＰＲＰ）を、０．３８クエン酸ナトリウム
で抗凝固化した全血から２０分間１５０×ｇで遠心する
ことにより得る。富血小板プラズマの０．５ｍｌ小分割
を、種々の濃度の対照ＩｇＧ又は抗ＣＳＶＴＣＧ特異的
受容体抗体の存在下に２μＭ ＡＤＰと一緒に撹拌する
ことにより、凝集させる。凝集反応はクロノログ（chro
no-log）血小板凝集計中で光学吸収対時間における減少
として３７℃で測定する。本発明の抗体は血小板凝集を
阻害するのに効果がある。
【図１】図１はＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白のＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲルである。レーン１は非還元蛋白（染
色）。レーン２は還元蛋白（染色）。レーン３は非還元
蛋白（標識）。レーン４は還元蛋白（標識）。レーン５
は非還元表面標識蛋白。
−ＰＡＧＥゲルである。レーン１は非還元蛋白（染
色）。レーン２は還元蛋白（染色）。レーン３は非還元
蛋白（標識）。レーン４は還元蛋白（標識）。レーン５
は非還元表面標識蛋白。
【図２】図２はレーン２にＣＳＶＴＣＧ特異的受容体の
等電点を示している、等電焦点ゲルである。
等電点を示している、等電焦点ゲルである。
【配列表】 (１) 一般的情報 (i) 出願人：ツジンスキー、ジョージ ポール（Tuszy
nski, George Paul） アイアル、ジャコブ（Eyal, Jacob） ハミルトン、ブルース キング（Hamilton, bruce Kin
g） (ii) 発明の名称：ＣＳＶＴＣＧ特異的腫瘍細胞接着受
容体の精製及び特性付け (iii) 配列の数：１ (iv) 連絡先： (Ａ) 住所：ダブリユー・アール・グレイス・アンド・
コー・コン（W. R. Grace & Co. -Conn.） (Ｂ) 通り：７３７９ ルート（Route）３２ (Ｃ) 市 ：コロンビア（Columbia） (Ｄ) 州 ：メリランド（Maryland） (Ｅ) 国 ：米国 (Ｆ) ＺＩＰ：２１０４４ (v) コンピューター・リーダブル・フォーム (Ａ) 媒体の型：フロッピーディスク (Ｂ) コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル (Ｃ) 操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ (Ｄ) ソフトウエアー：ワードパーフェクト５・１ (vi) 現行出願日 (Ａ) 出願番号：ＵＳ (Ｂ) 出願日： (Ｃ) 分 類：５３０ (viii) 代理人／事務所情報 (Ａ) 氏名：アプルビー・バネッサ・エル（Appleby, V
anessa L） (Ｂ) 登録番号：３３２２３ (Ｃ) 参照／事件番号：０１−８１１０ (ix) 電話連絡情報 (Ａ) 電話：（４１０）５３１−４５１５ (２) 配列番号：１についての情報 (i) 配列の特性 (Ａ) 長さ：６アミノ酸 (Ｂ) 型 ：アミノ酸 (Ｃ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列：配列番号：１： Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ １ ５
nski, George Paul） アイアル、ジャコブ（Eyal, Jacob） ハミルトン、ブルース キング（Hamilton, bruce Kin
g） (ii) 発明の名称：ＣＳＶＴＣＧ特異的腫瘍細胞接着受
容体の精製及び特性付け (iii) 配列の数：１ (iv) 連絡先： (Ａ) 住所：ダブリユー・アール・グレイス・アンド・
コー・コン（W. R. Grace & Co. -Conn.） (Ｂ) 通り：７３７９ ルート（Route）３２ (Ｃ) 市 ：コロンビア（Columbia） (Ｄ) 州 ：メリランド（Maryland） (Ｅ) 国 ：米国 (Ｆ) ＺＩＰ：２１０４４ (v) コンピューター・リーダブル・フォーム (Ａ) 媒体の型：フロッピーディスク (Ｂ) コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル (Ｃ) 操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ (Ｄ) ソフトウエアー：ワードパーフェクト５・１ (vi) 現行出願日 (Ａ) 出願番号：ＵＳ (Ｂ) 出願日： (Ｃ) 分 類：５３０ (viii) 代理人／事務所情報 (Ａ) 氏名：アプルビー・バネッサ・エル（Appleby, V
anessa L） (Ｂ) 登録番号：３３２２３ (Ｃ) 参照／事件番号：０１−８１１０ (ix) 電話連絡情報 (Ａ) 電話：（４１０）５３１−４５１５ (２) 配列番号：１についての情報 (i) 配列の特性 (Ａ) 長さ：６アミノ酸 (Ｂ) 型 ：アミノ酸 (Ｃ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列：配列番号：１： Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ １ ５
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年５月１７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】図２はレーン２にＣＳＶＴＣＧ特異的受容体の
等電点を示している、等電焦点ゲル出ある。
等電点を示している、等電焦点ゲル出ある。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】腫瘍細胞の表面に発現されるトロ
ンボスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）のＣ
ＳＶＴＣＧ（配列番号：１）領域に特異的な細胞間マト
リックス受容体が、ＣＳＶＴＣＧ−特異的受容体の精製
法と共に提供される。該ＣＳＶＴＣＧ−特異的受容体及
び該受容体に対する抗体は、癌診断のための結合アツセ
イ及び癌管理における配位子（ｌｉｇａｎｄ）としての
利用の如く、多数の診断及び治療状況において有用であ
る。
ンボスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）のＣ
ＳＶＴＣＧ（配列番号：１）領域に特異的な細胞間マト
リックス受容体が、ＣＳＶＴＣＧ−特異的受容体の精製
法と共に提供される。該ＣＳＶＴＣＧ−特異的受容体及
び該受容体に対する抗体は、癌診断のための結合アツセ
イ及び癌管理における配位子（ｌｉｇａｎｄ）としての
利用の如く、多数の診断及び治療状況において有用であ
る。
【０００２】
【従来の技術】基底膜（ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒ
ａｎｅ）は、器官実質細胞を間隙性膠原支質と分離して
いる、遍在性の特殊化された細胞外マトリックスであ
る。このマトリックスと細胞との相互作用は正常及び腫
瘍性の両方の細胞過程の重要な側面である。正常細胞は
生存、増殖及び分化のために細胞外マトリックスが必要
であるようであり、一方移動性細胞は正常及び腫瘍性の
いずれも、１の組織から他への移動において基底膜を横
切らねばならない。特に鱗状の（ｓｑｕａｍｏｕｓ）又
は腺性（ｇｌａｎｄｕｌａｒ）上皮に起きる転移性癌細
胞は、循環系及びリンパ系に入る（血管内異物侵入）た
めに基底膜を横切らねばらなず；該循環腫瘍（ｃｉｒｃ
ｕｌａｔｉｎｇ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）細胞は典型的
には器官の毛細血管床内に拘留され、血管壁に侵入し、
そして基底膜から血管外組織へ貫通し（血管外遊出）、
そこで第２の新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）が確立され
る。このように基底膜と細胞の相互作用の機構は非常に
興味深いものである。
ａｎｅ）は、器官実質細胞を間隙性膠原支質と分離して
いる、遍在性の特殊化された細胞外マトリックスであ
る。このマトリックスと細胞との相互作用は正常及び腫
瘍性の両方の細胞過程の重要な側面である。正常細胞は
生存、増殖及び分化のために細胞外マトリックスが必要
であるようであり、一方移動性細胞は正常及び腫瘍性の
いずれも、１の組織から他への移動において基底膜を横
切らねばならない。特に鱗状の（ｓｑｕａｍｏｕｓ）又
は腺性（ｇｌａｎｄｕｌａｒ）上皮に起きる転移性癌細
胞は、循環系及びリンパ系に入る（血管内異物侵入）た
めに基底膜を横切らねばらなず；該循環腫瘍（ｃｉｒｃ
ｕｌａｔｉｎｇ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）細胞は典型的
には器官の毛細血管床内に拘留され、血管壁に侵入し、
そして基底膜から血管外組織へ貫通し（血管外遊出）、
そこで第２の新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）が確立され
る。このように基底膜と細胞の相互作用の機構は非常に
興味深いものである。
【０００３】細胞の細胞外マトリックスとの相互作用
は、細胞が該マトリックスに自身を付着させる能力に依
存している。この付着は、典型的には該マトリックス中
に存在する不連続なコラーゲン種（ｔｙｐｅ）に細胞を
結合させる特定の糖蛋白により媒介され得ることが知ら
れている。線維芽細胞、筋芽細胞及び平滑筋細胞の間隙
性Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンへのフィブロネクチン媒
介付着、及び軟骨細胞のＩＩ型軟骨コラーゲンへのコン
ドロネクチン媒介付着が代表例である。
は、細胞が該マトリックスに自身を付着させる能力に依
存している。この付着は、典型的には該マトリックス中
に存在する不連続なコラーゲン種（ｔｙｐｅ）に細胞を
結合させる特定の糖蛋白により媒介され得ることが知ら
れている。線維芽細胞、筋芽細胞及び平滑筋細胞の間隙
性Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンへのフィブロネクチン媒
介付着、及び軟骨細胞のＩＩ型軟骨コラーゲンへのコン
ドロネクチン媒介付着が代表例である。
【０００４】正常及び腫瘍性（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）
の両細胞の基底膜への付着が同様に媒介されていること
が見出された。基底膜の主要な構成成分はＩＶ型コラー
ゲン、糖蛋白（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）及びプロテ
オグリカンである。糖蛋白ラミニンは上皮及び腫瘍両細
胞の基底膜への付着を媒介し、細胞をＩＶ型コラーゲン
に結合させる。前に記した如く転移しつつある腫瘍細胞
は転移過程において複数の段階で基底膜を横切らねばな
らず、且つこの過程の最初の工程は腫瘍細胞の基底膜へ
の付着であるから、この機構の明瞭化及びこの膜への腫
瘍細胞の付着を促進し又は阻害する特異的付着因子の特
性を導き出すことは、癌の診断及び処置のために重要な
意味をもつ。
の両細胞の基底膜への付着が同様に媒介されていること
が見出された。基底膜の主要な構成成分はＩＶ型コラー
ゲン、糖蛋白（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）及びプロテ
オグリカンである。糖蛋白ラミニンは上皮及び腫瘍両細
胞の基底膜への付着を媒介し、細胞をＩＶ型コラーゲン
に結合させる。前に記した如く転移しつつある腫瘍細胞
は転移過程において複数の段階で基底膜を横切らねばな
らず、且つこの過程の最初の工程は腫瘍細胞の基底膜へ
の付着であるから、この機構の明瞭化及びこの膜への腫
瘍細胞の付着を促進し又は阻害する特異的付着因子の特
性を導き出すことは、癌の診断及び処置のために重要な
意味をもつ。
【０００５】多くの研究が、ＴＳＰが同一細胞上の複数
の細胞表面受容体に結合でき、又は異なる細胞上の異な
る受容体に結合できることを示している。例えば、血小
板はＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ、ＧＰＩａ−ＩＩａ（Ｋａｒ
ｃｚｅｗｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８
９）２６４：２１３３２−２１３２６及びＴｕｓｚｙｎ
ｓｋｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９１）
８７：１３８７−１３９４）、及びヒドロネクチレン受
容体（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅ
ｓ．（１９８９）１８２：４８１）によってＴＳＰに結
合できる。平滑筋細胞、上皮細胞、Ｕ９３７単球様細胞
及び黒色腫細胞はビトロネクチン様受容体を介してＴＳ
Ｐに結合できる。鱗状細胞癌はインテグリン（ｉｎｔｅ
ｇｒｉｎ）又はＧＰＩＶではないＭｒ ８０，０００／
１０５，０００を介してＴＳＰに結合する（Ｙａｂｋｏ
ｎｉｔｚら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９１）Ｓ
Ｉ：３６４８−３６５６）。
の細胞表面受容体に結合でき、又は異なる細胞上の異な
る受容体に結合できることを示している。例えば、血小
板はＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ、ＧＰＩａ−ＩＩａ（Ｋａｒ
ｃｚｅｗｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８
９）２６４：２１３３２−２１３２６及びＴｕｓｚｙｎ
ｓｋｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９１）
８７：１３８７−１３９４）、及びヒドロネクチレン受
容体（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅ
ｓ．（１９８９）１８２：４８１）によってＴＳＰに結
合できる。平滑筋細胞、上皮細胞、Ｕ９３７単球様細胞
及び黒色腫細胞はビトロネクチン様受容体を介してＴＳ
Ｐに結合できる。鱗状細胞癌はインテグリン（ｉｎｔｅ
ｇｒｉｎ）又はＧＰＩＶではないＭｒ ８０，０００／
１０５，０００を介してＴＳＰに結合する（Ｙａｂｋｏ
ｎｉｔｚら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９１）Ｓ
Ｉ：３６４８−３６５６）。
【０００６】他の細胞外マトリックス蛋白に対する受容
体が単離された。Ｌｉｏｔｔａら（米国特許第４，５６
５，７８９号）はラミニン受容体の単離を記載してい
る。Ｍｅｃｈａｍら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９
８９）２６４：１６６５２−７）は６７ｋｄラミニン受
容体と構造的及び機能的類似性を示すエラスチン受容体
を記載している。ＣＤ３６はトロンボスポンジンのＣＳ
ＶＴＣＧ配列に結合すると示唆された（Ａｓｃｈら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｒｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．
（１９９２）１８２：１２０８−１２１７）。しかしな
がらＣＤ３６は８８ｋｄ蛋白である。本発明のＣＳＶＴ
ＣＧ特異的受容体は、これらの過去に単離された細胞外
マトリックス蛋白受容体とは異なる。
体が単離された。Ｌｉｏｔｔａら（米国特許第４，５６
５，７８９号）はラミニン受容体の単離を記載してい
る。Ｍｅｃｈａｍら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９
８９）２６４：１６６５２−７）は６７ｋｄラミニン受
容体と構造的及び機能的類似性を示すエラスチン受容体
を記載している。ＣＤ３６はトロンボスポンジンのＣＳ
ＶＴＣＧ配列に結合すると示唆された（Ａｓｃｈら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｒｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．
（１９９２）１８２：１２０８−１２１７）。しかしな
がらＣＤ３６は８８ｋｄ蛋白である。本発明のＣＳＶＴ
ＣＧ特異的受容体は、これらの過去に単離された細胞外
マトリックス蛋白受容体とは異なる。
【０００７】
【発明の要約】本発明の目的は、トロンボスポンジン
（ＴＳＰ）のＣＳＶＴＣＧ特異的領域に対して特異的結
合親和性を有する、単離された受容体を提供することに
ある。該受容体は細胞表面に露出している。該受容体は
非還元条件下ＳＤＳ−ゲルで分析して約５０ｋｄの分子
量であり、還元条件下で分子量約５０ｋｄと約６０ｋｄ
の２つの蛋白バンドとしての分子量を有する。該受容体
は内部ジスルフィド結合で連結された２つのサブユニッ
トからなる糖蛋白であり、等電焦点（ｉｓｏｅｌｅｃｔ
ｒｉｃｆｏｃｕｓｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）は約ｐＨ７．１
〜７．５である。
（ＴＳＰ）のＣＳＶＴＣＧ特異的領域に対して特異的結
合親和性を有する、単離された受容体を提供することに
ある。該受容体は細胞表面に露出している。該受容体は
非還元条件下ＳＤＳ−ゲルで分析して約５０ｋｄの分子
量であり、還元条件下で分子量約５０ｋｄと約６０ｋｄ
の２つの蛋白バンドとしての分子量を有する。該受容体
は内部ジスルフィド結合で連結された２つのサブユニッ
トからなる糖蛋白であり、等電焦点（ｉｓｏｅｌｅｃｔ
ｒｉｃｆｏｃｕｓｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）は約ｐＨ７．１
〜７．５である。
【０００８】本発明の他の目的は、ＣＳＶＴＣＧ特異的
受容体（ＣＳＶＴＣＧ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ）の精製法を提供することである。ＣＳＶＴＣＧ
特異的受容体蛋白を精製する方法は： ａ）ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体を有する腫瘍細胞株（ｔ
ｕｍｏｒ ｃｅｌｌｌｉｎｅ）からの細胞抽出液を調製
し； ｂ）該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白が固定化ＣＳＶＴ
ＣＧ（配列番号：１）ペプチドに結合する条件下に、固
定化ＣＳＶＴＣＧペプチドを含有するクロマトグラフカ
ラムに該細胞抽出液を通し；そして ｃ）結合した受容体蛋白を該カラムから溶出して、精製
されたＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を得る；ことから
なる。
受容体（ＣＳＶＴＣＧ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ）の精製法を提供することである。ＣＳＶＴＣＧ
特異的受容体蛋白を精製する方法は： ａ）ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体を有する腫瘍細胞株（ｔ
ｕｍｏｒ ｃｅｌｌｌｉｎｅ）からの細胞抽出液を調製
し； ｂ）該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白が固定化ＣＳＶＴ
ＣＧ（配列番号：１）ペプチドに結合する条件下に、固
定化ＣＳＶＴＣＧペプチドを含有するクロマトグラフカ
ラムに該細胞抽出液を通し；そして ｃ）結合した受容体蛋白を該カラムから溶出して、精製
されたＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を得る；ことから
なる。
【０００９】本発明の更なる他の目的は、ＣＳＶＴＣＧ
特異的受容体上のエピトープに結合する抗体、及びかか
る抗体を産生する細胞株を提供することにある。
特異的受容体上のエピトープに結合する抗体、及びかか
る抗体を産生する細胞株を提供することにある。
【００１０】本発明の更なる目的は、癌を持つ疑いのあ
る組織の試料をＣＳＶＴＣＧ特異的受容体に対して特異
的な抗体と反応させ、そして該組織と該抗体との結合を
測定することによる、癌の診断方法を提供する。
る組織の試料をＣＳＶＴＣＧ特異的受容体に対して特異
的な抗体と反応させ、そして該組織と該抗体との結合を
測定することによる、癌の診断方法を提供する。
【００１１】更なる目的は、薬学的に許容される液体、
ゲル又は固体担体と一緒にＣＳＶＴＣＧ特異的受容体抗
体を含有する、薬学的組成物を提供することにある。該
組成物の治療上有効薬量の投与は、動物特に哺乳類及び
鳥類宿主の如き脊椎動物にトロンボスポンジン様活性の
効果的増大又は阻害を与えることができる。
ゲル又は固体担体と一緒にＣＳＶＴＣＧ特異的受容体抗
体を含有する、薬学的組成物を提供することにある。該
組成物の治療上有効薬量の投与は、動物特に哺乳類及び
鳥類宿主の如き脊椎動物にトロンボスポンジン様活性の
効果的増大又は阻害を与えることができる。
【００１２】本発明の他の目的は、ＣＳＶＴＣＧ特異的
受容体蛋白をコードするＤＮＡ分子及び組換えＤＮＡ法
によりＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を製造する方法を
提供することにある。
受容体蛋白をコードするＤＮＡ分子及び組換えＤＮＡ法
によりＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を製造する方法を
提供することにある。
【００１３】
【発明の詳細】本発明は精製されたトロンボスポンジン
（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ：ＴＳＰ）受容体蛋白
を使用可能な形態で提供する。該受容体はトロンボスポ
ンジンのＣＳＶＴＣＧ（配列番号：１）領域に対し特異
的である。該受容体蛋白は、例えば癌の診断や処置を含
む多くの治療領域において有用である抗体を製造するた
めに用いることができる。該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体
の結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ） のコンピュ
ーター・モデル化は、ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体部位に
ｉｎ ｖｉｖｏで結合又は阻止する新規化合物の設計に
おいても助けとなるであろう。
（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ：ＴＳＰ）受容体蛋白
を使用可能な形態で提供する。該受容体はトロンボスポ
ンジンのＣＳＶＴＣＧ（配列番号：１）領域に対し特異
的である。該受容体蛋白は、例えば癌の診断や処置を含
む多くの治療領域において有用である抗体を製造するた
めに用いることができる。該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体
の結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ） のコンピュ
ーター・モデル化は、ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体部位に
ｉｎ ｖｉｖｏで結合又は阻止する新規化合物の設計に
おいても助けとなるであろう。
【００１４】Ａ．定義 “ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白” “トロンボスポンジン受容体蛋白”又は“ＴＳＰ受容
体”又は“受容体”は、ヒト及びマウスを含むがこれに
限定されない、噛乳動物すべてからの、ペプチドＣＳＶ
ＴＣＧ（配列番号：１）に特異的な結合親和性を有す
る、天然のトロンボスポンジン受容体蛋白を意味する。
該用語は合成ＴＳＰ受容体蛋白、即ち組換え法又は直接
的化学合成法で製造された蛋白をも包含する。ＴＳＰ受
容体蛋白は、血小板、内皮細胞、上皮（肺）細胞；平滑
筋細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎ
ｏｃｙｔｅ）、単球マクロファージ、グリア細胞及び、
最も特別な、黒色腫細胞及び肺癌細胞を包含し、これに
限定されない、癌組織に見出される蛋白である。
体”又は“受容体”は、ヒト及びマウスを含むがこれに
限定されない、噛乳動物すべてからの、ペプチドＣＳＶ
ＴＣＧ（配列番号：１）に特異的な結合親和性を有す
る、天然のトロンボスポンジン受容体蛋白を意味する。
該用語は合成ＴＳＰ受容体蛋白、即ち組換え法又は直接
的化学合成法で製造された蛋白をも包含する。ＴＳＰ受
容体蛋白は、血小板、内皮細胞、上皮（肺）細胞；平滑
筋細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎ
ｏｃｙｔｅ）、単球マクロファージ、グリア細胞及び、
最も特別な、黒色腫細胞及び肺癌細胞を包含し、これに
限定されない、癌組織に見出される蛋白である。
【００１５】“トロンボスポンジン様活性”は、ここで
はトロンボスポンジンの公知の生理的活性のいずれかに
類似の活性として定義される。これらの活性には、細胞
付着増進活性、細胞分裂促進 （ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）
活性、細胞走化性活性、及び止血活性並びに腫瘍細胞、
微生物又は寄生虫の転移活性、血小板凝集活性、フィブ
リン溶解活性及び免疫転形（ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌ
ａｔｉｏｎ）の如き活性から誘導された活性が含まれ
る。
はトロンボスポンジンの公知の生理的活性のいずれかに
類似の活性として定義される。これらの活性には、細胞
付着増進活性、細胞分裂促進 （ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）
活性、細胞走化性活性、及び止血活性並びに腫瘍細胞、
微生物又は寄生虫の転移活性、血小板凝集活性、フィブ
リン溶解活性及び免疫転形（ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌ
ａｔｉｏｎ）の如き活性から誘導された活性が含まれ
る。
【００１６】“抗転移活性”は、ここでは腫瘍細胞の転
移の程度又は大きさを防止又は著るしく減退させる、或
いは始原固形腫瘍の退行を起こしたり阻止する能力と定
義される。
移の程度又は大きさを防止又は著るしく減退させる、或
いは始原固形腫瘍の退行を起こしたり阻止する能力と定
義される。
【００１７】“アテローム硬化活性（Ａｔｈｅｒｏｓｃ
ｌｅｒｏｓｉｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ）”は、ここではア
テローム硬化病巣の形成を促進又は阻止するトロンボス
ポンジンの能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）と定義される。該
アテローム硬化病巣とは、特に動脈壁における、脂質含
有素材（ｌｉｐｉｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍａｔｅ
ｒｉａｌ）の劣化蓄積（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ａ
ｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）として定義される。
ｌｅｒｏｓｉｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ）”は、ここではア
テローム硬化病巣の形成を促進又は阻止するトロンボス
ポンジンの能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）と定義される。該
アテローム硬化病巣とは、特に動脈壁における、脂質含
有素材（ｌｉｐｉｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍａｔｅ
ｒｉａｌ）の劣化蓄積（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ａ
ｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）として定義される。
【００１８】“抗マラリヤ活性”は、ここではマラリヤ
感染赤血球の内皮細胞への細胞接着、マラリヤスポロゾ
イト（種虫）の肝細胞の認識及びそれへの侵入、又はマ
ラリヤメロゾイト（分裂小体）の赤血球の認識及びそれ
への侵入を阻害する能力として定義される。抗マラリヤ
活性は細胞接着を阻止するワクチン又は治療剤の形態で
証明することができる。
感染赤血球の内皮細胞への細胞接着、マラリヤスポロゾ
イト（種虫）の肝細胞の認識及びそれへの侵入、又はマ
ラリヤメロゾイト（分裂小体）の赤血球の認識及びそれ
への侵入を阻害する能力として定義される。抗マラリヤ
活性は細胞接着を阻止するワクチン又は治療剤の形態で
証明することができる。
【００１９】“抗血栓活性”は、ここでは血小板の凝集
を阻害する、又は血栓の形成に拮抗する能力として定義
される。
を阻害する、又は血栓の形成に拮抗する能力として定義
される。
【００２０】“血栓溶解活性”は、ここでは血栓の構造
を崩壊させる能力として定義される。
を崩壊させる能力として定義される。
【００２１】“脈管形成活性”は、ここでは血管やリン
パ管の形成を増進又は阻害する能力として定義される。
パ管の形成を増進又は阻害する能力として定義される。
【００２２】“成長因子活性”は、ここでは細胞増殖を
増進又は阻害する能力として定義される。
増進又は阻害する能力として定義される。
【００２３】“細胞接着活性”は、ここでは細胞、好ま
しくは哺乳動物細胞の基質への付着を増進又は阻害する
能力として定義される。
しくは哺乳動物細胞の基質への付着を増進又は阻害する
能力として定義される。
【００２４】Ｂ．好ましい態様 本発明の好ましい受容体蛋白は、黒色腫細胞又は肺癌細
胞の如き癌組織から取り出される。ドデシル硫酸ナトリ
ウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）によるＣＳＶＴＣＧ特異的受容体の分析で、該受
容体は非還元条件下で５０ｋｄの見掛けの分子量を有す
ることがわかる。いくつかの調製では、１００ｋｄより
大なる分子量の二量体が少量観測されるであろう。還元
条件下では、該蛋白は見掛けの分子量５０及び６０ｋｄ
の、近接離間した（ｓｐａｃｅｄｃｌｏｓｅｌｙ）２つ
の主要ポリペプチドバンドとして一緒に移動する。これ
は、該蛋白が、ジスルフィド結合されているときはより
緻密な形態であることを予想させる、２つの鎖間ジスル
フィド結合されたポリペプチド鎖から成る、という解釈
と一致する。
胞の如き癌組織から取り出される。ドデシル硫酸ナトリ
ウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）によるＣＳＶＴＣＧ特異的受容体の分析で、該受
容体は非還元条件下で５０ｋｄの見掛けの分子量を有す
ることがわかる。いくつかの調製では、１００ｋｄより
大なる分子量の二量体が少量観測されるであろう。還元
条件下では、該蛋白は見掛けの分子量５０及び６０ｋｄ
の、近接離間した（ｓｐａｃｅｄｃｌｏｓｅｌｙ）２つ
の主要ポリペプチドバンドとして一緒に移動する。これ
は、該蛋白が、ジスルフィド結合されているときはより
緻密な形態であることを予想させる、２つの鎖間ジスル
フィド結合されたポリペプチド鎖から成る、という解釈
と一致する。
【００２５】該蛋白は、インテグリンス・ラミニン（ｉ
ｎｔｅｇｒｉｎｓ ｌａｍｉｎｉｎ）、別名ＧＰＩＶに
対する抗体と交叉結合しない。
ｎｔｅｇｒｉｎｓ ｌａｍｉｎｉｎ）、別名ＧＰＩＶに
対する抗体と交叉結合しない。
【００２６】該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白は、ガラ
クトース、マンノース及びグルコサミン特異的レクチン
に結合するので、糖蛋白である。精製した受容体蛋白の
２６０ｎｍでの高い吸収は、炭水化物（糖質）の存在と
一致する。
クトース、マンノース及びグルコサミン特異的レクチン
に結合するので、糖蛋白である。精製した受容体蛋白の
２６０ｎｍでの高い吸収は、炭水化物（糖質）の存在と
一致する。
【００２７】該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白は、約ｐ
Ｈ７．１〜７．５の等電焦点を有する。
Ｈ７．１〜７．５の等電焦点を有する。
【００２８】該精製された天然ＣＳＶＴＣＧ特異的受容
体を特性付けするために、更にそのｉｎ ｖｉｔｒｏで
の受容体活性を調べた。該受容体はトロンボスポンジン
とイオン依存的型式で相互作用するが、フィブロネクチ
ン又は牛血清アルブミンとは相互作用しない。
体を特性付けするために、更にそのｉｎ ｖｉｔｒｏで
の受容体活性を調べた。該受容体はトロンボスポンジン
とイオン依存的型式で相互作用するが、フィブロネクチ
ン又は牛血清アルブミンとは相互作用しない。
【００２９】当業者なら標準的手法を用いて単離された
ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体のアミノ酸組成及び蛋白配列
を決定することができる。例えば該受容体のアミノ酸配
列は、エドマン分解及びＨＰＬＣによるアミノ酸分析を
繰返し行うことにより、精製蛋白から定めることができ
る。他のアミノ酸配列決定法も当技術分野では公知であ
る。
ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体のアミノ酸組成及び蛋白配列
を決定することができる。例えば該受容体のアミノ酸配
列は、エドマン分解及びＨＰＬＣによるアミノ酸分析を
繰返し行うことにより、精製蛋白から定めることができ
る。他のアミノ酸配列決定法も当技術分野では公知であ
る。
【００３０】細胞からＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を
精製する方法は、２つの基本的工程、細胞の調製及びア
フィニティークロマトグラフィーによる受容体の精製、
からなる。好ましい細胞源には、一般的に容易に入手可
能なマウス・ミエローマ細胞及びヒト肺癌細胞が含まれ
る。培養細胞は大概の組織源に比べて比較的にプロテア
ーゼ不在であるという利点を有する。これは活性な受容
体蛋白の安定化及び精製を容易とする。
精製する方法は、２つの基本的工程、細胞の調製及びア
フィニティークロマトグラフィーによる受容体の精製、
からなる。好ましい細胞源には、一般的に容易に入手可
能なマウス・ミエローマ細胞及びヒト肺癌細胞が含まれ
る。培養細胞は大概の組織源に比べて比較的にプロテア
ーゼ不在であるという利点を有する。これは活性な受容
体蛋白の安定化及び精製を容易とする。
【００３１】細胞抽出液を調製し、受容体がＣＳＶＴＣ
Ｇペプチドに結合する条件下、固定化ＣＳＶＴＣＧ（配
列番号：１）ペプチドを含有するクロマトグラフィーカ
ラムに通す。そして該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体をカラ
ムから精製状態で溶離する。当業者ならＣＳＶＴＣＧ特
異的受容体蛋白に対するｃＤＮＡ及び遺伝子をクローン
化し、配列決定することができる。クローン化はＣＳＶ
ＴＣＧ特異的受容体蛋白に対する抗体及び発現ライブラ
リーを用いることにより、或いは一旦アミノ酸配列が決
定されると、決定されたアミノ酸配列の一部についての
コドンを含有するオリゴヌクレオチドを製造し、該受容
体蛋白をコードする遺伝子についてＤＮＡライブラリー
をスクリーニングのために用いることにより、行うこと
ができる。抗体又はオリゴヌクレオチドプローブ及びＤ
ＮＡライブラリーを調製するための基本的ストラテジー
は、抗体又は核酸ハイブリダイゼーションによるそれら
のスクリーニングと同じように、当業者には周知であ
る。例えば、ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ：ＶＯＬＵＭＥ
Ｉ （Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）：ＮＵ
ＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ
（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ
ｅｄｓ．１９８５）：ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤ
Ｅ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｔｅ ｅｄ．１
９８４）：Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃ
ｈ ＆ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵ
ＡＬ（１９８２）参照。
Ｇペプチドに結合する条件下、固定化ＣＳＶＴＣＧ（配
列番号：１）ペプチドを含有するクロマトグラフィーカ
ラムに通す。そして該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体をカラ
ムから精製状態で溶離する。当業者ならＣＳＶＴＣＧ特
異的受容体蛋白に対するｃＤＮＡ及び遺伝子をクローン
化し、配列決定することができる。クローン化はＣＳＶ
ＴＣＧ特異的受容体蛋白に対する抗体及び発現ライブラ
リーを用いることにより、或いは一旦アミノ酸配列が決
定されると、決定されたアミノ酸配列の一部についての
コドンを含有するオリゴヌクレオチドを製造し、該受容
体蛋白をコードする遺伝子についてＤＮＡライブラリー
をスクリーニングのために用いることにより、行うこと
ができる。抗体又はオリゴヌクレオチドプローブ及びＤ
ＮＡライブラリーを調製するための基本的ストラテジー
は、抗体又は核酸ハイブリダイゼーションによるそれら
のスクリーニングと同じように、当業者には周知であ
る。例えば、ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ：ＶＯＬＵＭＥ
Ｉ （Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）：ＮＵ
ＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ
（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ
ｅｄｓ．１９８５）：ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤ
Ｅ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｔｅ ｅｄ．１
９８４）：Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃ
ｈ ＆ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵ
ＡＬ（１９８２）参照。
【００３２】先ず、ＤＮＡライブラリーを調製する。該
ライブラリーは、ヒトの如き選ばれた哺乳類からのゲノ
ムＤＮＡライブラリーから成ることができる。ヒトゲノ
ムライブラリーは当技術分野で公知である。例えばＬａ
Ｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ｃｅｌｌ １５：１
１５７−１１７４参照。ＤＮＡライブラリーは、逆転写
によりポリーＡ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）画分から製造され
たｃＤＮＡから構築することもできる。例えば、米国特
許第４，４４６，２３５；４，４４０，８５９；４，４
３３，１４０；４，４３１，７４０；４，３７０，４１
７；４，３６３，８７７参照。該ｍＲＮＡは該受容体蛋
白を発現することが知られている細胞株又は組織から単
離する。ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を発現する細胞
株又は組織はここに記載されている。ｃＤＮＡ（又はゲ
ノムＤＮＡ）はライブラリー構築のために適したベクタ
ー中にクローン化する。好ましくべクターはバクテリオ
ファージ・ベクター、例えばファージλである。適当な
ライブラリーの構築は当業者の技術範囲内である。
ライブラリーは、ヒトの如き選ばれた哺乳類からのゲノ
ムＤＮＡライブラリーから成ることができる。ヒトゲノ
ムライブラリーは当技術分野で公知である。例えばＬａ
Ｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ｃｅｌｌ １５：１
１５７−１１７４参照。ＤＮＡライブラリーは、逆転写
によりポリーＡ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）画分から製造され
たｃＤＮＡから構築することもできる。例えば、米国特
許第４，４４６，２３５；４，４４０，８５９；４，４
３３，１４０；４，４３１，７４０；４，３７０，４１
７；４，３６３，８７７参照。該ｍＲＮＡは該受容体蛋
白を発現することが知られている細胞株又は組織から単
離する。ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を発現する細胞
株又は組織はここに記載されている。ｃＤＮＡ（又はゲ
ノムＤＮＡ）はライブラリー構築のために適したベクタ
ー中にクローン化する。好ましくべクターはバクテリオ
ファージ・ベクター、例えばファージλである。適当な
ライブラリーの構築は当業者の技術範囲内である。
【００３３】一旦ライブラリーを構築したら、抗体又は
ライブラリーをプローブするためのオリゴヌクレオチド
を調製し、所望のＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白遺伝子
を単離するために用いる。該抗体又はオリゴヌクレオチ
ドは適当な方法で合成する。オリゴヌクレオチド調製の
ために、特別に選択された塩基配列が、該受容体蛋白か
らの知られたアミノ酸配列をコードするコドンに対応す
るように、選ばれる。遺伝コードは重複しているので、
しばしば該蛋白の特別の領域をコードする全ての、又は
合理的な数の可能な塩基配列を包含するいくつかのオリ
ゴヌクレオチドを合成することが必要となる。このよう
に、プローブの基礎となる領域を選ぶ際には、該領域は
コドンが高度に縮重したアミノ酸を含有しないことが一
般的に好ましい。しかし、該ライブラリーを調製した哺
乳類において希である（ｒａｒｅ）コドンを含有するプ
ローブを製造する必要性はない。ある状況では、かなり
長い、及び／又は対応する核酸配列に関して高度に多様
性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）を有するであろうアミノ酸
配列の領域を包含するプローブを調製することが望まし
いことを、特にもしこの長い及び／又は多様性の領域が
該受容体蛋白の高い特徴である場合に、当業者は見出す
かも知れない。１つのハイブリダイゼーション実験にお
いて、各々遺伝子の異なる領域に対応する２つのプロー
ブ（又はプローブの組（ｓｅｔｓ））を用いることも望
ましい。自動化されたオリゴヌクレオチド合成法がプロ
ーブの大きな群（ｆａｍｉｌｙ）の調製を比較的手近な
ものとした。用いられるべきプローブの正確な長さは臨
界的ではないが、一般的に当技術分野では約１４〜約２
０ベースペアーのプローブが通常効果的であると認識さ
れている。約２５〜約６０ベースペアーのより長いプロ
ーブも用いられる。
ライブラリーをプローブするためのオリゴヌクレオチド
を調製し、所望のＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白遺伝子
を単離するために用いる。該抗体又はオリゴヌクレオチ
ドは適当な方法で合成する。オリゴヌクレオチド調製の
ために、特別に選択された塩基配列が、該受容体蛋白か
らの知られたアミノ酸配列をコードするコドンに対応す
るように、選ばれる。遺伝コードは重複しているので、
しばしば該蛋白の特別の領域をコードする全ての、又は
合理的な数の可能な塩基配列を包含するいくつかのオリ
ゴヌクレオチドを合成することが必要となる。このよう
に、プローブの基礎となる領域を選ぶ際には、該領域は
コドンが高度に縮重したアミノ酸を含有しないことが一
般的に好ましい。しかし、該ライブラリーを調製した哺
乳類において希である（ｒａｒｅ）コドンを含有するプ
ローブを製造する必要性はない。ある状況では、かなり
長い、及び／又は対応する核酸配列に関して高度に多様
性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）を有するであろうアミノ酸
配列の領域を包含するプローブを調製することが望まし
いことを、特にもしこの長い及び／又は多様性の領域が
該受容体蛋白の高い特徴である場合に、当業者は見出す
かも知れない。１つのハイブリダイゼーション実験にお
いて、各々遺伝子の異なる領域に対応する２つのプロー
ブ（又はプローブの組（ｓｅｔｓ））を用いることも望
ましい。自動化されたオリゴヌクレオチド合成法がプロ
ーブの大きな群（ｆａｍｉｌｙ）の調製を比較的手近な
ものとした。用いられるべきプローブの正確な長さは臨
界的ではないが、一般的に当技術分野では約１４〜約２
０ベースペアーのプローブが通常効果的であると認識さ
れている。約２５〜約６０ベースペアーのより長いプロ
ーブも用いられる。
【００３４】選ばれたオリゴヌクレオチドプローブは標
準的手法を用いて放射性ヌクレオチド又はビオチンの如
きマーカーで標識される。そして該標識されたプローブ
の組を、標準的技術に従い該ライブラリーから単離され
たｓｓＤＮＡに一本鎖プローブをハイブリダイズさせる
ことからなるスクリーニング工程において用いる。プロ
ーブの長さ、及びプローブがライブラリーと同じ種、又
は進化論的に近接した又は離れた種からのものであるか
どうかの如きいくつかの要因に依り、厳格な又は寛大な
ハイブリダイゼーション条件のいずれかが適切であろ
う。適切な条件の選択は当業者の技術範囲内である。一
般的には、前出のＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢＲ
ＩＤＩＺＡＴＩＯＮ参照。基本的要件は、ハイブリダイ
ゼーション条件は選択的ハイブリダイゼーションが起る
ように十分厳格であることであり、即ち、非特異的結合
に対抗して、十分な程度のハイブリダイゼーションが核
酸ホモロジー（例えば少くとも約７０〜７５％）による
ものであることである。一旦、ポジティブ・ハイブリダ
イゼーションによってスクリーニングにかけたライブラ
リーからクローンが同定されると、それは制限酵素分析
並びにＤＮＡ配列決定により、特定のライブラリー挿入
物に該受容体蛋白の遺伝子が含有されていることを確認
することができる。
準的手法を用いて放射性ヌクレオチド又はビオチンの如
きマーカーで標識される。そして該標識されたプローブ
の組を、標準的技術に従い該ライブラリーから単離され
たｓｓＤＮＡに一本鎖プローブをハイブリダイズさせる
ことからなるスクリーニング工程において用いる。プロ
ーブの長さ、及びプローブがライブラリーと同じ種、又
は進化論的に近接した又は離れた種からのものであるか
どうかの如きいくつかの要因に依り、厳格な又は寛大な
ハイブリダイゼーション条件のいずれかが適切であろ
う。適切な条件の選択は当業者の技術範囲内である。一
般的には、前出のＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢＲ
ＩＤＩＺＡＴＩＯＮ参照。基本的要件は、ハイブリダイ
ゼーション条件は選択的ハイブリダイゼーションが起る
ように十分厳格であることであり、即ち、非特異的結合
に対抗して、十分な程度のハイブリダイゼーションが核
酸ホモロジー（例えば少くとも約７０〜７５％）による
ものであることである。一旦、ポジティブ・ハイブリダ
イゼーションによってスクリーニングにかけたライブラ
リーからクローンが同定されると、それは制限酵素分析
並びにＤＮＡ配列決定により、特定のライブラリー挿入
物に該受容体蛋白の遺伝子が含有されていることを確認
することができる。
【００３５】別法として、ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体サ
ブユニットについての配列をコードするＤＮＡを、該受
容体蛋白のアミノ酸配列についてのコドンを含有する配
列である重畳（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）オリゴヌクレ
オチドから合成的に調製することができる。このような
オリゴヌクレオチドは標準的方法で調製され、そして完
全なコーディング配列に組立てられる。例えば、Ｅｄｇ
ｅ，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ２９２ ：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ ｅｔ ａｌ．，（１
９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２３ ：１２９９；Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８
４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１参照。
ブユニットについての配列をコードするＤＮＡを、該受
容体蛋白のアミノ酸配列についてのコドンを含有する配
列である重畳（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）オリゴヌクレ
オチドから合成的に調製することができる。このような
オリゴヌクレオチドは標準的方法で調製され、そして完
全なコーディング配列に組立てられる。例えば、Ｅｄｇ
ｅ，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ２９２ ：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ ｅｔ ａｌ．，（１
９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２３ ：１２９９；Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８
４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１参照。
【００３６】ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白のためのコ
ーディング配列を含有するＤＮＡ分子は、いかなる適切
なベクター中にでもクローン化でき、そしてそれにより
ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体遺伝子のコーディング配列を
含有しないベクター（例えば他のライブラリークローン
類）を実質的に含有しない組成物として維持することが
できる。多くのクローニングベクターが当業者には知ら
れており、適当なクローニングベクターの選択は自由に
できる。クローニングのための組換えＤＮＡベクター及
びそれが形質転換する宿主細胞の具体例には、バクテリ
オファージλ（イー・コリ：Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＢＲ３
２２（イー・コリ）、ｐＡＣＹＣ１７７（イー・コ
リ）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性菌）、ｐＧＶ１１０６
（グラム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（非イー・コリ グラ
ム陰性菌）、ｐＨＶ１４（イー・コリ及びバチルス・ス
ブチリス：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ｐ
ＢＤ９（バチルス）、ｐＩＪ６１（ストレプトマイセ
ス：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ｐＵＣ６（ストレプ
トマイセス）、アクチノファージ（ａｃｔｉｎｏｐｈａ
ｇｅ）ψＣ３１（ストレプトマイセス）、ＹＩｐ５（酵
母：ｙｅａｓｔ）、ＹＣｐ１９（酵母）、及び牛パピロ
ーマウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉ
ｒｕｓ）（哺乳動物細胞）が含まれる。一般的には、前
記ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ：ＶＯＬＵＭＥＳ Ｉ＆Ｉ
Ｉ；ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢ
ＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ参照。
ーディング配列を含有するＤＮＡ分子は、いかなる適切
なベクター中にでもクローン化でき、そしてそれにより
ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体遺伝子のコーディング配列を
含有しないベクター（例えば他のライブラリークローン
類）を実質的に含有しない組成物として維持することが
できる。多くのクローニングベクターが当業者には知ら
れており、適当なクローニングベクターの選択は自由に
できる。クローニングのための組換えＤＮＡベクター及
びそれが形質転換する宿主細胞の具体例には、バクテリ
オファージλ（イー・コリ：Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＢＲ３
２２（イー・コリ）、ｐＡＣＹＣ１７７（イー・コ
リ）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性菌）、ｐＧＶ１１０６
（グラム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（非イー・コリ グラ
ム陰性菌）、ｐＨＶ１４（イー・コリ及びバチルス・ス
ブチリス：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ｐ
ＢＤ９（バチルス）、ｐＩＪ６１（ストレプトマイセ
ス：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ｐＵＣ６（ストレプ
トマイセス）、アクチノファージ（ａｃｔｉｎｏｐｈａ
ｇｅ）ψＣ３１（ストレプトマイセス）、ＹＩｐ５（酵
母：ｙｅａｓｔ）、ＹＣｐ１９（酵母）、及び牛パピロ
ーマウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉ
ｒｕｓ）（哺乳動物細胞）が含まれる。一般的には、前
記ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ：ＶＯＬＵＭＥＳ Ｉ＆Ｉ
Ｉ；ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢ
ＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ参照。
【００３７】本発明の１態様においては、ＣＳＶＴＣＧ
特異的受容体蛋白遺伝子からのコーディング配列は、プ
ロモーター、（バクテリア発現のための）リボソーム結
合部位及び、任意に、オペレーター（これらを合わせて
“制御”配列とここでは称する）の制御下に配置され、
該受容体蛋白をコードするＤＮＡ配列（ここでは“コー
ディング”配列と称する）が該ベクターにより形質転換
された宿主細胞中でＲＮＡに転写されるようにする。該
コーディング配列は、シグナルペプチド又はリーダーシ
ークエンスを含有しても、しなくてもよい。
特異的受容体蛋白遺伝子からのコーディング配列は、プ
ロモーター、（バクテリア発現のための）リボソーム結
合部位及び、任意に、オペレーター（これらを合わせて
“制御”配列とここでは称する）の制御下に配置され、
該受容体蛋白をコードするＤＮＡ配列（ここでは“コー
ディング”配列と称する）が該ベクターにより形質転換
された宿主細胞中でＲＮＡに転写されるようにする。該
コーディング配列は、シグナルペプチド又はリーダーシ
ークエンスを含有しても、しなくてもよい。
【００３８】該組換えベクターは、該受容体蛋白コーデ
ィング配列がベクター中において適当な制御配列と一緒
に位置するように構築され、該制御配列との関係で該受
容体コーディング配列の位置及び方向は、該コーディン
グ配列が該制御配列の制御下に（即ち、制御配列におい
てＤＮＡ分子に着くＲＮＡポリメラーゼにより）転写さ
れるようなものである。該制御配列は、例えば上記クロ
ーニングベクターの如きベクター中に挿入される前に、
該コーディング配列に結紮（ｌｉｇａｔｅ）することが
できる。別法として、既に制御配列を含有し、その制御
配列の下流に適当な制御部位を含有する発現ベクター中
に、直接該コーディング配列をクローン化することがで
きる。原核生物及び酵母中での該受容体蛋白コーディン
グ配列の発現のためには、該制御配列は該コーディング
配列に対し異質（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）となるで
あろう。もし宿主が原核生物ならば、該コーディング配
列はイントロン不在：例えばｃＤＮＡであることも必要
である。もし選ばれた宿主細胞が哺乳動物細胞であるな
ら、制御配列は受容体蛋白コーディング配列に対し異質
（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）又は同質（ｈｏｍｏｌｏ
ｇｏｕｓ）であることができる。そして該コーディング
配列はイントロンを含むゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡであ
りうる。ゲノム又はｃＤＮＡコーディング配列のいずれ
でも酵母中で発現させることができる。多くの原核生物
性発現ベクターが当該技術分野で知られている。
ィング配列がベクター中において適当な制御配列と一緒
に位置するように構築され、該制御配列との関係で該受
容体コーディング配列の位置及び方向は、該コーディン
グ配列が該制御配列の制御下に（即ち、制御配列におい
てＤＮＡ分子に着くＲＮＡポリメラーゼにより）転写さ
れるようなものである。該制御配列は、例えば上記クロ
ーニングベクターの如きベクター中に挿入される前に、
該コーディング配列に結紮（ｌｉｇａｔｅ）することが
できる。別法として、既に制御配列を含有し、その制御
配列の下流に適当な制御部位を含有する発現ベクター中
に、直接該コーディング配列をクローン化することがで
きる。原核生物及び酵母中での該受容体蛋白コーディン
グ配列の発現のためには、該制御配列は該コーディング
配列に対し異質（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）となるで
あろう。もし宿主が原核生物ならば、該コーディング配
列はイントロン不在：例えばｃＤＮＡであることも必要
である。もし選ばれた宿主細胞が哺乳動物細胞であるな
ら、制御配列は受容体蛋白コーディング配列に対し異質
（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）又は同質（ｈｏｍｏｌｏ
ｇｏｕｓ）であることができる。そして該コーディング
配列はイントロンを含むゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡであ
りうる。ゲノム又はｃＤＮＡコーディング配列のいずれ
でも酵母中で発現させることができる。多くの原核生物
性発現ベクターが当該技術分野で知られている。
【００３９】組換えＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白を、
ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白が製造されるような条件
下、上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を生育
させることにより製造することができる。そしてＣＳＶ
ＴＣＧ特異的受容体蛋白を宿主細胞から単離し、精製す
る。もし発現系が受容体蛋白を生育培地中に分泌するな
ら、受容体蛋白は細胞不含の培地から直接精製できる。
もし受容体蛋白が分泌されないなら、それは細胞溶解物
から単離される。適した生育条件及び回収方法の選定は
当業者の技術範囲内である。
ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白が製造されるような条件
下、上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を生育
させることにより製造することができる。そしてＣＳＶ
ＴＣＧ特異的受容体蛋白を宿主細胞から単離し、精製す
る。もし発現系が受容体蛋白を生育培地中に分泌するな
ら、受容体蛋白は細胞不含の培地から直接精製できる。
もし受容体蛋白が分泌されないなら、それは細胞溶解物
から単離される。適した生育条件及び回収方法の選定は
当業者の技術範囲内である。
【００４０】天然又は合成のＣＳＶＴＣＧ特異的受容体
蛋白のいずれも、ポリクローナル及びモノクローナル双
方の抗体を製造するために用いることができる。もしポ
リクローナル抗体が所望なら、精製された受容体蛋白を
選定された哺乳動物（例えば、マウス、ラビット、山
羊、馬、その他）を免疫するために用い、そして後で該
免疫された動物から血清を集め、公知手順により処理す
る。該受容体蛋白以外の種々の抗原に対するポリクロー
ナル抗体を含有する組成物は、その組成物を受容体が結
合したカラムに通すことにより、抗受容体蛋白抗体でな
い抗体が実質的に存在しないものとすることができる。
洗浄した後、該受容体に対するポリクローナル抗体を該
カラムから溶離する。モノクローナル抗受容体蛋白抗体
も当業者なら容易に製造することができる。ハイブリド
ーマからモノクローナル抗体を製造するための一般的方
法論は周知である。不死化抗体産生細胞株は、融合以外
の技術例えば腫瘍形成性ＤＮＡを用いてのＢリンパ球の
直接的形質転換、又はエプスタイン・バー・ウイルスを
用いたトランスフェクションにより、創出することもで
きる。（例えばＭ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，
“ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（１９８
０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−
Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”（１９８１）；Ｋｅ
ｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”（１９８０）参照）。
蛋白のいずれも、ポリクローナル及びモノクローナル双
方の抗体を製造するために用いることができる。もしポ
リクローナル抗体が所望なら、精製された受容体蛋白を
選定された哺乳動物（例えば、マウス、ラビット、山
羊、馬、その他）を免疫するために用い、そして後で該
免疫された動物から血清を集め、公知手順により処理す
る。該受容体蛋白以外の種々の抗原に対するポリクロー
ナル抗体を含有する組成物は、その組成物を受容体が結
合したカラムに通すことにより、抗受容体蛋白抗体でな
い抗体が実質的に存在しないものとすることができる。
洗浄した後、該受容体に対するポリクローナル抗体を該
カラムから溶離する。モノクローナル抗受容体蛋白抗体
も当業者なら容易に製造することができる。ハイブリド
ーマからモノクローナル抗体を製造するための一般的方
法論は周知である。不死化抗体産生細胞株は、融合以外
の技術例えば腫瘍形成性ＤＮＡを用いてのＢリンパ球の
直接的形質転換、又はエプスタイン・バー・ウイルスを
用いたトランスフェクションにより、創出することもで
きる。（例えばＭ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，
“ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（１９８
０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−
Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”（１９８１）；Ｋｅ
ｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”（１９８０）参照）。
【００４１】モノクローナル抗体の製造のために不死化
されるＢ細胞の供給源の免疫化において、抗原としてＴ
ＳＰ受容体蛋白（天然又は合成）を採用することによ
り、該受容体蛋白分子上の異なる部位のエピトープを認
識する１群のモノクローナル抗体を得ることができる。
該受容体蛋白の結合領域にあるエピトープを認識する抗
体は、抗体とＴＳＰとの間で競合アツセイにおいて容易
に同定することができる。このような抗体は、もしそれ
らがＴＳＰペプチドが結合したとき随伴しておこる生理
学的応答を刺激することなく、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて
その受容体に対するＴＳＰの結合を阻止することができ
るなら、治療薬の可能性を有するであろう。
されるＢ細胞の供給源の免疫化において、抗原としてＴ
ＳＰ受容体蛋白（天然又は合成）を採用することによ
り、該受容体蛋白分子上の異なる部位のエピトープを認
識する１群のモノクローナル抗体を得ることができる。
該受容体蛋白の結合領域にあるエピトープを認識する抗
体は、抗体とＴＳＰとの間で競合アツセイにおいて容易
に同定することができる。このような抗体は、もしそれ
らがＴＳＰペプチドが結合したとき随伴しておこる生理
学的応答を刺激することなく、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて
その受容体に対するＴＳＰの結合を阻止することができ
るなら、治療薬の可能性を有するであろう。
【００４２】Ｃ．投与 本発明の抗体は、生来の（ｉｎｔａｃｔ）動物において
トロンボスポンジン様活性を媒介することができる。生
来のトロンボスポンジンの効果を阻害又は凝態（ｍｉｍ
ｉｃ）する生理学的効果を有することが示された。本発
明の抗体又はそれらを含有する組成物は、癌治療、アテ
ローム硬化、マラリヤ処置又は予防、血栓又は血栓溶解
状態、脈管形成、又は細胞接着の如き多くの治療的及び
予防的用途における有用性が見出される。
トロンボスポンジン様活性を媒介することができる。生
来のトロンボスポンジンの効果を阻害又は凝態（ｍｉｍ
ｉｃ）する生理学的効果を有することが示された。本発
明の抗体又はそれらを含有する組成物は、癌治療、アテ
ローム硬化、マラリヤ処置又は予防、血栓又は血栓溶解
状態、脈管形成、又は細胞接着の如き多くの治療的及び
予防的用途における有用性が見出される。
【００４３】このように本発明は、それ自身で上記治療
上の有益性を提供するのに役立つ可能性のある非毒性の
付加塩、アミド類及びそのエステル類を含んだ、本発明
の抗体の有効量を含有する組成物も提供する。かかる組
成物は生理学的に許容される液状、ゲル状又は固体状希
釈剤、助剤及び賦形剤と一緒に提供することもできる。
上の有益性を提供するのに役立つ可能性のある非毒性の
付加塩、アミド類及びそのエステル類を含んだ、本発明
の抗体の有効量を含有する組成物も提供する。かかる組
成物は生理学的に許容される液状、ゲル状又は固体状希
釈剤、助剤及び賦形剤と一緒に提供することもできる。
【００４４】これらの抗体及び組成物は、家畜における
如き獣医学的用途及びヒトにおける臨床用途のために、
他の治療用抗体試剤と同様の方法で動物に投与すること
ができる。
如き獣医学的用途及びヒトにおける臨床用途のために、
他の治療用抗体試剤と同様の方法で動物に投与すること
ができる。
【００４５】該組成物は例えば皮下又は静脈への注射に
より、簡便に非経口的に投与される。他の投与方式のた
めに適した別の調合剤には、坐剤、経鼻エアロゾル、及
びある場合には経口調合剤が含まれる。
より、簡便に非経口的に投与される。他の投与方式のた
めに適した別の調合剤には、坐剤、経鼻エアロゾル、及
びある場合には経口調合剤が含まれる。
【００４６】何らの理論にも拘束されることは望まない
が、本発明の組成物は天然のトロンボスポンジンに対し
作用薬（ａｇｏｎｉｓｔ）又は拮抗薬（ａｎｔａｇｏｎ
ｉｓｔ）として働くと信じられる。これらの抗体はスポ
ロゾイト（種虫）周囲蛋白（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚ
ｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、トロンボスポンジン関連
の無名の蛋白、及びプロパージン補体蛋白に対する作用
薬又は拮抗薬として働くとも信じられる。
が、本発明の組成物は天然のトロンボスポンジンに対し
作用薬（ａｇｏｎｉｓｔ）又は拮抗薬（ａｎｔａｇｏｎ
ｉｓｔ）として働くと信じられる。これらの抗体はスポ
ロゾイト（種虫）周囲蛋白（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚ
ｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、トロンボスポンジン関連
の無名の蛋白、及びプロパージン補体蛋白に対する作用
薬又は拮抗薬として働くとも信じられる。
【００４７】Ｄ．用途 前記した如く、本発明のＣＳＶＴＣＧ特異的受容体に対
する抗体は種々の診断的、生物学的、予防的又は治療的
領域において用いることができる。これらの抗体は、ト
ロンボスポンジン様活性が役割を演じる全ての病気の状
態又は状況の予防又は処置に有用であると期待される。
これらの病気状態又は状況には、転移、アテローム硬
化、マラリヤ、血栓状況、及び脈管形成が含まれるが、
これに限定されない。抗体は診断薬、治療薬又は他の化
合物の担体としても有用である。該抗体は生物医学装置
（ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｄｅｖｉｃｅ）においても用
いることができる。
する抗体は種々の診断的、生物学的、予防的又は治療的
領域において用いることができる。これらの抗体は、ト
ロンボスポンジン様活性が役割を演じる全ての病気の状
態又は状況の予防又は処置に有用であると期待される。
これらの病気状態又は状況には、転移、アテローム硬
化、マラリヤ、血栓状況、及び脈管形成が含まれるが、
これに限定されない。抗体は診断薬、治療薬又は他の化
合物の担体としても有用である。該抗体は生物医学装置
（ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｄｅｖｉｃｅ）においても用
いることができる。
【００４８】多数のｉｎ ｖｉｔｒｏ 及びｉｎ ｖｉ
ｖｏアツセイを、該抗体がトロンボスポンジン様活性を
もたらすことを証明するために、用いることができる。
これらのアツセイには、細胞接着分析、血小板凝集分析
及び細胞増殖分析が含まれるが、それに限定されない。
ｖｏアツセイを、該抗体がトロンボスポンジン様活性を
もたらすことを証明するために、用いることができる。
これらのアツセイには、細胞接着分析、血小板凝集分析
及び細胞増殖分析が含まれるが、それに限定されない。
【００４９】転移 転移とは、血流又はリンパにより悪性腫瘍の細胞が移動
することにより、病気が体の一部からそれと関係のない
他所へ広がることである。転移は、腫瘍細胞の内皮への
付着、内皮の退縮、基底膜のマトリックス崩壊及び血流
への腫瘍細胞の侵入を含むカスケード機構により達成さ
れると信じられている。このカスケードのどの相におけ
る干渉（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）も、転移性癌の予
防又は処置に有益であろう。
することにより、病気が体の一部からそれと関係のない
他所へ広がることである。転移は、腫瘍細胞の内皮への
付着、内皮の退縮、基底膜のマトリックス崩壊及び血流
への腫瘍細胞の侵入を含むカスケード機構により達成さ
れると信じられている。このカスケードのどの相におけ
る干渉（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）も、転移性癌の予
防又は処置に有益であろう。
【００５０】天然のトロンボスポンジン分子は腫瘍細胞
の転移を増強することが示された（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１
９８７）４７：４１３０−４１３３）。トロンボスポン
ジン増強がおこる機構は現在良く理解されていない。
の転移を増強することが示された（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１
９８７）４７：４１３０−４１３３）。トロンボスポン
ジン増強がおこる機構は現在良く理解されていない。
【００５１】抗転移活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで化合物
が黒色腫細胞に結合する能力（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏ．（１９９０）１８４：
１８９−９１）、及びｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍コロニーの
数及び大きさを減少させる能力（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９
８７）４７：４１３０−４１３３）で識別される。
が黒色腫細胞に結合する能力（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏ．（１９９０）１８４：
１８９−９１）、及びｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍コロニーの
数及び大きさを減少させる能力（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９
８７）４７：４１３０−４１３３）で識別される。
【００５２】本発明の抗体は抗転移（ａｎｔｉｍｅｔａ
ｓｔａｔｉｃ）剤として有用であり、特に抗肺転移剤と
して有用である。これらの抗体は転移性腫瘍細胞、特に
トロンボスポンジンに応答するものの付着を阻害する。
該抗体は腫瘍コロニーの大きさと同様に腫瘍コロニーの
数も減少させる。該抗体の特に有利な点は、長い（体
内）循環半減期である。
ｓｔａｔｉｃ）剤として有用であり、特に抗肺転移剤と
して有用である。これらの抗体は転移性腫瘍細胞、特に
トロンボスポンジンに応答するものの付着を阻害する。
該抗体は腫瘍コロニーの大きさと同様に腫瘍コロニーの
数も減少させる。該抗体の特に有利な点は、長い（体
内）循環半減期である。
【００５３】このような抗転移活性を生起することがで
きる機構は数多く存在する。該抗体は細胞毒性である、
又は細胞増殖を阻害することができる。細胞増殖の阻害
剤としては、該抗体は１）有糸分裂を阻害し、２）脈管
形成を阻害し、又は３）補体経路及び関連キラー細胞を
活性化する、ように作用することができる。
きる機構は数多く存在する。該抗体は細胞毒性である、
又は細胞増殖を阻害することができる。細胞増殖の阻害
剤としては、該抗体は１）有糸分裂を阻害し、２）脈管
形成を阻害し、又は３）補体経路及び関連キラー細胞を
活性化する、ように作用することができる。
【００５４】本発明の抗体は生物医学的装置における用
途も見出すことができる。該抗体は転移性腫瘍細胞の付
着を促進する能力があるので、生物医学的装置を該抗体
で被覆し、血液又はリンパから循環腫瘍細胞を除去する
ことも可能である。該生物医学的装置は肝癌をトラップ
するのにも有用である。
途も見出すことができる。該抗体は転移性腫瘍細胞の付
着を促進する能力があるので、生物医学的装置を該抗体
で被覆し、血液又はリンパから循環腫瘍細胞を除去する
ことも可能である。該生物医学的装置は肝癌をトラップ
するのにも有用である。
【００５５】該抗体の他の用途は、診断又は治療目的で
毒素、薬剤、ホルモン又はイメージング剤を転移性腫瘍
細胞へもたらすための担体としてである。これらの担体
は肝癌にも結合するであろう。
毒素、薬剤、ホルモン又はイメージング剤を転移性腫瘍
細胞へもたらすための担体としてである。これらの担体
は肝癌にも結合するであろう。
【００５６】アテローム硬化 アテローム硬化は、動脈内壁上の脂質小結節（Ｓｍａｌ
ｌ ｆａｔｔｙ ｎｏｄｕｌｅ）の沈着によって識別さ
れる病状であり、しばしば疾患領域の変性を伴なう。
ｌ ｆａｔｔｙ ｎｏｄｕｌｅ）の沈着によって識別さ
れる病状であり、しばしば疾患領域の変性を伴なう。
【００５７】アテローム硬化活性は、高コレステロール
食を与えられたラビットにおける大動脈病変の進展を阻
害する抗体の能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）によって識別さ
れる。
食を与えられたラビットにおける大動脈病変の進展を阻
害する抗体の能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）によって識別さ
れる。
【００５８】マラリヤ マラリヤは、赤血球に寄生し、感染した蚊に刺されるこ
とにより哺乳動物に伝達される種々の原生動物により引
き起される感染性の病気である。本発明の抗体は細胞接
着を阻止する治療剤として用いることができる。
とにより哺乳動物に伝達される種々の原生動物により引
き起される感染性の病気である。本発明の抗体は細胞接
着を阻止する治療剤として用いることができる。
【００５９】抗マラリヤ活性は、マラリヤに感染した赤
血球の内皮細胞への細胞接着、マラリヤ・スポロゾイト
（種虫）の肝細胞の認識と侵入、又はマラリヤ・メロゾ
イト（分裂小体）の赤血球認識と侵入を阻害する能力に
より識別される。
血球の内皮細胞への細胞接着、マラリヤ・スポロゾイト
（種虫）の肝細胞の認識と侵入、又はマラリヤ・メロゾ
イト（分裂小体）の赤血球認識と侵入を阻害する能力に
より識別される。
【００６０】血栓状態 本発明の抗体に伴う血栓活性は、血小板凝集及び血小板
血栓形成を阻害するように作用する。血小板は、フィブ
リノーゲンとの結合、血小板凝集及び血栓形成を介して
血液凝固に参与する。これらのペプチドは抗血栓剤とし
て以下の状態：心筋梗塞、血栓塞栓症（ｔｈｒｏｍｂｏ
ｅｍｂｏｌｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）及び癌や心臓血管病
に起因する血栓合併症において有用でありうる。
血栓形成を阻害するように作用する。血小板は、フィブ
リノーゲンとの結合、血小板凝集及び血栓形成を介して
血液凝固に参与する。これらのペプチドは抗血栓剤とし
て以下の状態：心筋梗塞、血栓塞栓症（ｔｈｒｏｍｂｏ
ｅｍｂｏｌｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）及び癌や心臓血管病
に起因する血栓合併症において有用でありうる。
【００６１】血小板凝集は損傷した組織の出血を停止さ
せる正常且つ有益なプロセスである。しかしながら血小
板凝集は血管形成術、血栓溶解治療又は血管移植の如き
心臓血管の処置につづいて問題を引き起こす可能性があ
る。血小板は全α顆粒血小板分泌蛋白（ａｌｐｈａ ｇ
ｒａｎｕｌａｒ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｅｃｒｅｔｅｄ
−ｐｒｏｔｅｉｎ）中に２５％ものＴＳＰ蛋白を含有す
る。それ故、血小板の表面の受容体に結合する抗体を導
入することにより、血小板が凝集したり、凝塊を形成す
るのを防ぐことができる。
せる正常且つ有益なプロセスである。しかしながら血小
板凝集は血管形成術、血栓溶解治療又は血管移植の如き
心臓血管の処置につづいて問題を引き起こす可能性があ
る。血小板は全α顆粒血小板分泌蛋白（ａｌｐｈａ ｇ
ｒａｎｕｌａｒ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｅｃｒｅｔｅｄ
−ｐｒｏｔｅｉｎ）中に２５％ものＴＳＰ蛋白を含有す
る。それ故、血小板の表面の受容体に結合する抗体を導
入することにより、血小板が凝集したり、凝塊を形成す
るのを防ぐことができる。
【００６２】該抗体は末梢動脈の手術の間、心臓血管の
手術において、又は血管形成術の後の如き、多数の治療
適用において有用であることができる。該抗体は、血小
板凝集に伴う心臓血管及び虚血性の障害や病気の処置及
び予防のために、予防的に用いることもできる。本発明
の抗体を基本とする薬品は、現在市販されている他の凝
固溶解剤（例えば、ｔＰＡ、ストレプトキナン（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｋｉｎａｎ））と一緒に用いるための、血管形
成術や血栓溶解治療の補助剤として用いることができ
る。かかる薬剤は、出血も悪化させず、又は合成の抗血
小板薬に一般的にみられる副作用の危険性がない。更に
かかる抗体は（心臓バイパス手術において用いられるも
のの如き）小径の移植血管を開通（ｏｐｅｎ）状態に維
持するのを助けることができる。同様の適用が発作の危
険性がある患者のために考えられる。
手術において、又は血管形成術の後の如き、多数の治療
適用において有用であることができる。該抗体は、血小
板凝集に伴う心臓血管及び虚血性の障害や病気の処置及
び予防のために、予防的に用いることもできる。本発明
の抗体を基本とする薬品は、現在市販されている他の凝
固溶解剤（例えば、ｔＰＡ、ストレプトキナン（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｋｉｎａｎ））と一緒に用いるための、血管形
成術や血栓溶解治療の補助剤として用いることができ
る。かかる薬剤は、出血も悪化させず、又は合成の抗血
小板薬に一般的にみられる副作用の危険性がない。更に
かかる抗体は（心臓バイパス手術において用いられるも
のの如き）小径の移植血管を開通（ｏｐｅｎ）状態に維
持するのを助けることができる。同様の適用が発作の危
険性がある患者のために考えられる。
【００６３】該抗体は透析適用においても有用である。
該抗体は透析膜上の血小板凝集の除去に努力している透
析患者に投与することができるであろう。別法として
は、該透析膜を該抗体で被膜し、医学装置を流体試料が
通過する際の血小板凝集を防ぐことができるであろう。
該抗体は透析膜上の血小板凝集の除去に努力している透
析患者に投与することができるであろう。別法として
は、該透析膜を該抗体で被膜し、医学装置を流体試料が
通過する際の血小板凝集を防ぐことができるであろう。
【００６４】本発明の抗体は血小板凝集の第２段階（即
ち、血小板凝集のトロンボスポンジン依存段階）を特異
的に阻害する能力を有する。この活性は病状（即ち、灰
色血小板症候群（Ｇｒａｙ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｓｙｎ
ｄｒｏｍｅ）、本態性血小板血症、骨髄増殖性症候群）
の結果として生じる、又は治療（即ち、癌治療）又は自
己免疫病により誘導される、血小板減少症を防止するの
にこの抗体を有用ならしめる。この抗体はバルーンカテ
ーテル法に付随する冠動脈再閉塞を防止するための作用
もある。
ち、血小板凝集のトロンボスポンジン依存段階）を特異
的に阻害する能力を有する。この活性は病状（即ち、灰
色血小板症候群（Ｇｒａｙ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｓｙｎ
ｄｒｏｍｅ）、本態性血小板血症、骨髄増殖性症候群）
の結果として生じる、又は治療（即ち、癌治療）又は自
己免疫病により誘導される、血小板減少症を防止するの
にこの抗体を有用ならしめる。この抗体はバルーンカテ
ーテル法に付随する冠動脈再閉塞を防止するための作用
もある。
【００６５】本発明の抗体は血餅の形成又は構造（ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ）を調節する。 トロンボスポンジンは
線維素塊（ｆｉｂｒｉｎ ｃｌｏｔ）中にとり込まれ、
血液凝固因子ＸＩＩＩａのための基質として働く。トロ
ンボスポンジン中のＩＱＱ配列モチーフ（ｍｏｔｉｆ）
がＸＩＩＩａ因子への架橋に関係している。ＩＱＱを含
有するペプチドは血餅の形成及び構造を調節する。公知
の線溶ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析がこの能力を証明する。
ｒｕｃｔｕｒｅ）を調節する。 トロンボスポンジンは
線維素塊（ｆｉｂｒｉｎ ｃｌｏｔ）中にとり込まれ、
血液凝固因子ＸＩＩＩａのための基質として働く。トロ
ンボスポンジン中のＩＱＱ配列モチーフ（ｍｏｔｉｆ）
がＸＩＩＩａ因子への架橋に関係している。ＩＱＱを含
有するペプチドは血餅の形成及び構造を調節する。公知
の線溶ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析がこの能力を証明する。
【００６６】抗血栓活性は、１）洗浄した血小板中のＡ
ＤＰ又はトロンビン誘起血小板凝集の阻害；２）富血小
板プラズマ中の血小板凝集の阻害；３）ｉｎ ｖｉｖｏ
で測定されたコラーゲン誘起血小板凝集の阻害；及び頸
動脈において誘起された血栓形成の阻害、を包含する多
数の分析により識別され、この分析において該抗体は血
栓誘起につづく動脈の閉塞を遅延又は防止するであろ
う。
ＤＰ又はトロンビン誘起血小板凝集の阻害；２）富血小
板プラズマ中の血小板凝集の阻害；３）ｉｎ ｖｉｖｏ
で測定されたコラーゲン誘起血小板凝集の阻害；及び頸
動脈において誘起された血栓形成の阻害、を包含する多
数の分析により識別され、この分析において該抗体は血
栓誘起につづく動脈の閉塞を遅延又は防止するであろ
う。
【００６７】血栓溶解状態 本発明の抗体に随伴する血栓溶解活性は、形成された血
栓の構造を変える、即ち血餅を溶解する作用がある。血
栓溶解活性はプラスミンの存在下にフィブリンの溶解を
増進する能力として識別される（即ち、標準の凝固溶解
分析）。
栓の構造を変える、即ち血餅を溶解する作用がある。血
栓溶解活性はプラスミンの存在下にフィブリンの溶解を
増進する能力として識別される（即ち、標準の凝固溶解
分析）。
【００６８】脈管形成 脈管形成とは血管及びリンパ管の形成である。本発明の
抗体は脈管形成の調節、特に損傷治癒の増大、腫瘍成
長、糖尿病性網膜症及びリウマチ関節炎の防止又は阻止
に有用である。標準的脈管形成分析は当技術分野で周知
である。これらの分析には、種々の細胞株を用いた増殖
及び移動研究、コラゲナーゼ阻害及びヒヨコ漿尿膜上で
のｉｎ ｖｉｖｏ新生血管形成（ＣＡＭ分析）が含まれ
るが、これに限定されない。
抗体は脈管形成の調節、特に損傷治癒の増大、腫瘍成
長、糖尿病性網膜症及びリウマチ関節炎の防止又は阻止
に有用である。標準的脈管形成分析は当技術分野で周知
である。これらの分析には、種々の細胞株を用いた増殖
及び移動研究、コラゲナーゼ阻害及びヒヨコ漿尿膜上で
のｉｎ ｖｉｖｏ新生血管形成（ＣＡＭ分析）が含まれ
るが、これに限定されない。
【００６９】接着調整 該抗体は細胞接着を調整することができ、ＴＳＰ及び他
の蛋白がＴＳＰ受容体部位を含有する血液血小板の如き
細胞へ結合するのを阻害する。
の蛋白がＴＳＰ受容体部位を含有する血液血小板の如き
細胞へ結合するのを阻害する。
【００７０】診断 本発明の抗体は、胃腸管（胃の、結腸の、及び直腸の）
癌、胸の癌及び肝癌を含む（これに限定されない）種々
の型の癌の診断／予後分析における試剤として有用であ
りうる。
癌、胸の癌及び肝癌を含む（これに限定されない）種々
の型の癌の診断／予後分析における試剤として有用であ
りうる。
【００７１】担体 細胞毒薬、ホルモン又はイメージング剤を、癌その他の
治療における利用のために抗体に結合させることができ
る。
治療における利用のために抗体に結合させることができ
る。
【００７２】生物医学装置 血小板の如く、細胞表面にトロンボスポンジンに対する
受容体を有する細胞を除くために、生物医学装置を該抗
体で被覆することができる。
受容体を有する細胞を除くために、生物医学装置を該抗
体で被覆することができる。
【００７３】以下の略号を本発明の説明において、一貫
して用いた。
して用いた。
【００７４】 ＴＳＰ − トロンボスポンジン ｋｄ − キロダルトン ％ − パーセント ｍＭ − ミリモラー μＭ − マイクロモラー ｍｌ − ミリリットル Ｍ − モラー μｌ − マイクロリットル ＦＮ − フィブロネクチン ＢＳＡ − 牛血清アルブミン μｇ − マイクログラム ｇ − グラム
【００７５】
【実施例】以下の実施例は説明の目的の為に提示するの
であり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定す
る意図はない。
であり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定す
る意図はない。
【００７６】実施例１ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体：精製及び特性付け ５ｍｌの結合バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．５、０．５％ ＮＰ−４０洗浄剤、１ｍＭ
ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭリユー
ペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、１ｍＭ フェニルメ
チル スルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、１０μｇ
／ｍｌアプロチニン含有）中で細胞ペレットを溶解する
ことにより、約４．０×１０７のＢ１６−Ｆ１０マウス
黒色腫細胞又はＡ５４９ヒト肺癌細胞から細胞抽出液を
調製した。４℃で２０分間４，０００×ｇで遠心分離す
ることにより、未溶解物質を試料から除いた。
ｌ、ｐＨ７．５、０．５％ ＮＰ−４０洗浄剤、１ｍＭ
ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭリユー
ペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、１ｍＭ フェニルメ
チル スルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、１０μｇ
／ｍｌアプロチニン含有）中で細胞ペレットを溶解する
ことにより、約４．０×１０７のＢ１６−Ｆ１０マウス
黒色腫細胞又はＡ５４９ヒト肺癌細胞から細胞抽出液を
調製した。４℃で２０分間４，０００×ｇで遠心分離す
ることにより、未溶解物質を試料から除いた。
【００７７】ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水、ｐＨ７．３５
中で平衡化したＣＮ−活性化セファロース１ｍｌに結合
させたＣＳＶＴＣＧ ４ｍｇを５ｍｌのカラムに充填す
ることにより、ＣＳＶＴＣＧ（配列番号：１）アフィニ
ィティーカラムを組み立てた。５０ｍｌの結合バッファ
ーで洗浄した該ＣＳＶＴＣＧカラムに該抽出液を適用し
た。非特異的に吸着した蛋白を、５０ｍｌの結合バッフ
ァーで該カラムを洗浄することによりカラムから除去し
た。特異的に吸着した蛋白は、０．０５％ ＮＰ−４０
洗浄剤、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１
００μＭリユーペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、１ｍ
Ｍフェニルメチル スルホニル フルオライド（ＰＭＳ
Ｆ）、及び１０μｇ／ｍｌアプロチニンを含有する０．
１０ＭＴｒｉｓ、ｐＨ１０．２で溶出した。１０ｍｌの
画分は、Ｔｒｉｓを中和するために７００μｌの１Ｎ
ＨＣｌを含有するチューブに収集した。チューブ中のピ
ーク画分は、陰イオン交換カラムバッファー（２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭオクチルグル
コシド含有）中で平衡化した陰イオン交換カラム（Ｍｏ
ｎｏ Ｑ、ファルマシア）に適用した。結合した物質
は、ＮａＣｌ（１００％ １Ｍ ＮａＣｌ）の２０ｍｌ
直線勾配で溶出し、該カラムは２８０及び２６０ｎｍで
モニターした。結合した物質は手順通りに０．３Ｍ Ｎ
ａＣｌで溶出しはじめ、そして勾配は、該蛋白が２６０
ｎｍで高吸収を有する単一均質ピークを平坦に形成して
溶出するように維持した。
中で平衡化したＣＮ−活性化セファロース１ｍｌに結合
させたＣＳＶＴＣＧ ４ｍｇを５ｍｌのカラムに充填す
ることにより、ＣＳＶＴＣＧ（配列番号：１）アフィニ
ィティーカラムを組み立てた。５０ｍｌの結合バッファ
ーで洗浄した該ＣＳＶＴＣＧカラムに該抽出液を適用し
た。非特異的に吸着した蛋白を、５０ｍｌの結合バッフ
ァーで該カラムを洗浄することによりカラムから除去し
た。特異的に吸着した蛋白は、０．０５％ ＮＰ−４０
洗浄剤、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１
００μＭリユーペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、１ｍ
Ｍフェニルメチル スルホニル フルオライド（ＰＭＳ
Ｆ）、及び１０μｇ／ｍｌアプロチニンを含有する０．
１０ＭＴｒｉｓ、ｐＨ１０．２で溶出した。１０ｍｌの
画分は、Ｔｒｉｓを中和するために７００μｌの１Ｎ
ＨＣｌを含有するチューブに収集した。チューブ中のピ
ーク画分は、陰イオン交換カラムバッファー（２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭオクチルグル
コシド含有）中で平衡化した陰イオン交換カラム（Ｍｏ
ｎｏ Ｑ、ファルマシア）に適用した。結合した物質
は、ＮａＣｌ（１００％ １Ｍ ＮａＣｌ）の２０ｍｌ
直線勾配で溶出し、該カラムは２８０及び２６０ｎｍで
モニターした。結合した物質は手順通りに０．３Ｍ Ｎ
ａＣｌで溶出しはじめ、そして勾配は、該蛋白が２６０
ｎｍで高吸収を有する単一均質ピークを平坦に形成して
溶出するように維持した。
【００７８】該溶出画分と非結合画分は濃縮し、濃縮物
質を８％ポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ゲルで分
析し、標準の技術を用いてコマシー・ブルー（ｃｏｍａ
ｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）染色で可視化した。図１（レーン
１及び２）に示した如く、非還元条件下のＳＤＳ−ゲル
電気泳動で分析したピーク画分は５０ｋｄの見掛けの分
子量を有する主要バンドを、また還元条件（５％β−メ
ルカプトエタノール）下で５０及び６０ｋｄの２本のポ
リペプチドバンドを示した。１×１０７細胞から約１０
０μｇの蛋白が回収された。
質を８％ポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ゲルで分
析し、標準の技術を用いてコマシー・ブルー（ｃｏｍａ
ｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）染色で可視化した。図１（レーン
１及び２）に示した如く、非還元条件下のＳＤＳ−ゲル
電気泳動で分析したピーク画分は５０ｋｄの見掛けの分
子量を有する主要バンドを、また還元条件（５％β−メ
ルカプトエタノール）下で５０及び６０ｋｄの２本のポ
リペプチドバンドを示した。１×１０７細胞から約１０
０μｇの蛋白が回収された。
【００７９】該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体を、Ｋａｒｃ
ｚｅｗｓｋｉら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８
９）２６４：２１３２２−６）の標準的手順により
１２５Ｉ−沃素で標識した。簡単に言えば、１００μｌ
のオクチルグルコシド・バッファーに溶解した１２μｇ
の精製蛋白を、５分間１つの沃素ビース（Ｉｏｄｏ ｂ
ｅａｄ）と一緒にインキュベートした。未反応の沃化物
は、Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉら（Ａｎａｌ．ＢｉｏｃＣｈｅ
ｍ．（１９８０）１０６：１１８−１２２）により既述
されているようにして、オクチルグルコシド・バッファ
ー中で平衡化したセファーデックスＧ−２５の小さいカ
ラムで除去した。代表的実験によって得られた蛋白の比
活性は１０４ｃｐｍ／μｇであった。ＳＤＳ−ゲル電気
泳動及びオートラジオグラフィーによる標識物質の分析
は、還元条件下では６０ｋｄ分子量のポリペプチドバン
ドが主であることを示した。この標識物質のオートラジ
オグラムを図１、レーン３及び４に示す。
ｚｅｗｓｋｉら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８
９）２６４：２１３２２−６）の標準的手順により
１２５Ｉ−沃素で標識した。簡単に言えば、１００μｌ
のオクチルグルコシド・バッファーに溶解した１２μｇ
の精製蛋白を、５分間１つの沃素ビース（Ｉｏｄｏ ｂ
ｅａｄ）と一緒にインキュベートした。未反応の沃化物
は、Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉら（Ａｎａｌ．ＢｉｏｃＣｈｅ
ｍ．（１９８０）１０６：１１８−１２２）により既述
されているようにして、オクチルグルコシド・バッファ
ー中で平衡化したセファーデックスＧ−２５の小さいカ
ラムで除去した。代表的実験によって得られた蛋白の比
活性は１０４ｃｐｍ／μｇであった。ＳＤＳ−ゲル電気
泳動及びオートラジオグラフィーによる標識物質の分析
は、還元条件下では６０ｋｄ分子量のポリペプチドバン
ドが主であることを示した。この標識物質のオートラジ
オグラムを図１、レーン３及び４に示す。
【００８０】該標識された１２５Ｉ−ＣＳＶＴＣＧ特異
的受容体蛋白（１００，０００ｃｐｍ）を標準の手順を
用いてｐＨ３〜９等電焦点ゲルで分析した。この手順に
より、該精製された物質は図２に示した如く約７．１〜
７．５の範囲内にｐＩを有する単一バンドとして分解
（ｒｅｓｏｌｖｅ）された。
的受容体蛋白（１００，０００ｃｐｍ）を標準の手順を
用いてｐＨ３〜９等電焦点ゲルで分析した。この手順に
より、該精製された物質は図２に示した如く約７．１〜
７．５の範囲内にｐＩを有する単一バンドとして分解
（ｒｅｓｏｌｖｅ）された。
【００８１】実施例２結合調査 結合調査は以下のように実施した。
【００８２】取りはずし可能なマイクロタイター・ウェ
ル（Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ Ｒｅｍｏ ｖａｗｅｌｌ）
を、４０μｇ／ｍｌのＴＳＰ、フィブロネクチン、ＢＳ
Ａ又はペプチド溶液（２０ｍＭビス−トリス−プロパン
・バッファー、ｐＨ６．５中）の５０μｌを用いて、４
℃で一晩被覆し、２００μｌの１％ＢＳＡを用いて１時
間ブロックした。〔１２５Ｉ〕標識ＣＳＶＴＣＧ特異的
受容体の少量を、最終濃度が約１００，０００ｃｐｍ／
５０μｌ溶液（３０ｎｍ）になるように結合バッファー
（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ バッファー生理食塩水、ｐＨ
７．３５、ｌｍＭＣａ Ｃｌ２、０．０５％ ＮＰ４０
含有）に添加した。そして小分割５０μｌを該蛋白被覆
ウェル中で１時間インキュベートした。そしてウェルを
２００μｌの結合バッファーを用いてアスピレーション
により３回洗浄し、各々のウェルを結合した放射能がガ
ンマー・カウンターでカウントして測定した。フィブロ
ネクチン、ＢＳＡ及びＶＣＴＧＳＣ（ＣＳＶＴＣＧに対
する対照ペプチド）はＴＳＰについて観測された値の４
６％、３７％及び２７％の結合であったので、ＣＳＶＴ
ＣＧ特異的受容体蛋白はＴＳＰ及びＣＳＶＴＣＧについ
て最大の結合親和性を有した。これらの結果は、該ＣＳ
ＶＴＣＧ特異的受容体蛋白はｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＳＰ
と特異的に相互作用しうることを示す。概略、１μｇの
標識受容体が１μｇの固定化ＴＳＰに結合する。ＴＳＰ
はＦＮ又はＢＳＡに対するより３倍多く標識受容体に結
合する。
ル（Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ Ｒｅｍｏ ｖａｗｅｌｌ）
を、４０μｇ／ｍｌのＴＳＰ、フィブロネクチン、ＢＳ
Ａ又はペプチド溶液（２０ｍＭビス−トリス−プロパン
・バッファー、ｐＨ６．５中）の５０μｌを用いて、４
℃で一晩被覆し、２００μｌの１％ＢＳＡを用いて１時
間ブロックした。〔１２５Ｉ〕標識ＣＳＶＴＣＧ特異的
受容体の少量を、最終濃度が約１００，０００ｃｐｍ／
５０μｌ溶液（３０ｎｍ）になるように結合バッファー
（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ バッファー生理食塩水、ｐＨ
７．３５、ｌｍＭＣａ Ｃｌ２、０．０５％ ＮＰ４０
含有）に添加した。そして小分割５０μｌを該蛋白被覆
ウェル中で１時間インキュベートした。そしてウェルを
２００μｌの結合バッファーを用いてアスピレーション
により３回洗浄し、各々のウェルを結合した放射能がガ
ンマー・カウンターでカウントして測定した。フィブロ
ネクチン、ＢＳＡ及びＶＣＴＧＳＣ（ＣＳＶＴＣＧに対
する対照ペプチド）はＴＳＰについて観測された値の４
６％、３７％及び２７％の結合であったので、ＣＳＶＴ
ＣＧ特異的受容体蛋白はＴＳＰ及びＣＳＶＴＣＧについ
て最大の結合親和性を有した。これらの結果は、該ＣＳ
ＶＴＣＧ特異的受容体蛋白はｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＳＰ
と特異的に相互作用しうることを示す。概略、１μｇの
標識受容体が１μｇの固定化ＴＳＰに結合する。ＴＳＰ
はＦＮ又はＢＳＡに対するより３倍多く標識受容体に結
合する。
【００８３】実施例３受容体の表面標識 生来の、生育しているＡ５４９細胞を、Ｔｕｓｚｙｎｓ
ｋｉら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８０）１０
６：１１８−１２２）により記載されたようにラクトペ
ルオキシダーゼを用いて〔１２５〕−沃素で表面標識し
た。簡単に言えば、接触単層（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｍ
ｏｎｏｌａｙｅｒ）に近い細胞を含有する７５ｍｍフラ
スコを１０ｍｌのＤＭＥＭで３回リンスした。そして該
細胞層を０．２単位／ｍｌのラクトペルオキシダーゼと
５００μＣｉの〔１２５〕−沃素とを含有するＤＭＥＭ
５ｍｌで覆った。３０％Ｈ２Ｏ：の１μｌ小分割を５
回、１分間隔で静かに混ぜながら添加した。そして１ｍ
Ｍ ＮａＮ３ ５μｌを添加することにより反応を停止
させ、該単層をＤＭＥＭで３回洗浄し、そしてＣＳＶＴ
ＣＧ結合蛋白の精製のために細胞を採取した。
ｋｉら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８０）１０
６：１１８−１２２）により記載されたようにラクトペ
ルオキシダーゼを用いて〔１２５〕−沃素で表面標識し
た。簡単に言えば、接触単層（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｍ
ｏｎｏｌａｙｅｒ）に近い細胞を含有する７５ｍｍフラ
スコを１０ｍｌのＤＭＥＭで３回リンスした。そして該
細胞層を０．２単位／ｍｌのラクトペルオキシダーゼと
５００μＣｉの〔１２５〕−沃素とを含有するＤＭＥＭ
５ｍｌで覆った。３０％Ｈ２Ｏ：の１μｌ小分割を５
回、１分間隔で静かに混ぜながら添加した。そして１ｍ
Ｍ ＮａＮ３ ５μｌを添加することにより反応を停止
させ、該単層をＤＭＥＭで３回洗浄し、そしてＣＳＶＴ
ＣＧ結合蛋白の精製のために細胞を採取した。
【００８４】ＳＤＳ−ゲル電気泳動及びオートラジオグ
ラフィーによる標識物質の分析により、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ沃素化により標識された、非還元条件下でＭｒ＝５
０，０００のポリペプチドが標識されたことが分かった
（図１、レーン５）。
ラフィーによる標識物質の分析により、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ沃素化により標識された、非還元条件下でＭｒ＝５
０，０００のポリペプチドが標識されたことが分かった
（図１、レーン５）。
【００８５】該受容体は時間依存的様相でＴＳＰに結合
し、６０分後は時間非依存的になった。該結合は１ｍＭ
ＣａＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２の双方の存在で最
大となり、一方小量ではあるが相当量の結合が１ｍＭ
ＥＤＴＡの存在下で発生した。 実施例４受容体抗体 ウサギに３〜４週毎に５０μｇの注射を４回行った後、
標準的手順によりポリクローナルＣＳＶＴＣＧ特異的受
容体抗血清を形成させた。第１回目の注射は、完全フロ
インド・アジュバントと一緒に与え、あとの注射は不完
全フロインド・アジュバントと一緒に投与した。抗体の
力価と特異性はＥＬＩＳＡで定めた。
し、６０分後は時間非依存的になった。該結合は１ｍＭ
ＣａＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２の双方の存在で最
大となり、一方小量ではあるが相当量の結合が１ｍＭ
ＥＤＴＡの存在下で発生した。 実施例４受容体抗体 ウサギに３〜４週毎に５０μｇの注射を４回行った後、
標準的手順によりポリクローナルＣＳＶＴＣＧ特異的受
容体抗血清を形成させた。第１回目の注射は、完全フロ
インド・アジュバントと一緒に与え、あとの注射は不完
全フロインド・アジュバントと一緒に投与した。抗体の
力価と特異性はＥＬＩＳＡで定めた。
【００８６】ＥＬＩＳＡ分析は以下の標準的手順で実施
した。簡単に言えば、マイクロタイタープレートを２μ
ｇのＣＳＶＴＣＧ特異的受容体、フィブロネクチン又は
ＢＳＡで被覆し、１％ＢＳＡを用いて１時間ブロックし
た。１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−
２０を含有する１０ｍＭリン酸塩バッファー、ｐＨ７．
４（ＰＢＳ−Ｔ）中の種々の希釈率の第１抗体５０μｌ
を用いて、ウエルを１時間インキュベートした。そして
ウエルをＰＢＳ−Ｔ中で３回洗浄し、アルカリホスファ
ターゼ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧのＰＢＳ−Ｔ中１：８０
０希釈液５０μｌを用いて、１時間インキュベートし
た。ウエルをＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄し、次いでＴ
ｗｅｅｎ−２０を含有しないＰＢＳ−Ｔバッファーで３
回洗い、そしてアルカリホスファターゼ基質溶液（１ｍ
Ｍ ＺｎＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する０．
１０Ｍグリシン、ｐＨ１０．４中の１ｍｇ／ｍｌのｐ−
ニトロフェニルホスフェート）の５０μｌで処理した。
３０分後、１Ｎ ＮａＯＨ５μｌを添加して発色を停止
し、４０５ｎｍで吸収を測定した。
した。簡単に言えば、マイクロタイタープレートを２μ
ｇのＣＳＶＴＣＧ特異的受容体、フィブロネクチン又は
ＢＳＡで被覆し、１％ＢＳＡを用いて１時間ブロックし
た。１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−
２０を含有する１０ｍＭリン酸塩バッファー、ｐＨ７．
４（ＰＢＳ−Ｔ）中の種々の希釈率の第１抗体５０μｌ
を用いて、ウエルを１時間インキュベートした。そして
ウエルをＰＢＳ−Ｔ中で３回洗浄し、アルカリホスファ
ターゼ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧのＰＢＳ−Ｔ中１：８０
０希釈液５０μｌを用いて、１時間インキュベートし
た。ウエルをＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄し、次いでＴ
ｗｅｅｎ−２０を含有しないＰＢＳ−Ｔバッファーで３
回洗い、そしてアルカリホスファターゼ基質溶液（１ｍ
Ｍ ＺｎＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する０．
１０Ｍグリシン、ｐＨ１０．４中の１ｍｇ／ｍｌのｐ−
ニトロフェニルホスフェート）の５０μｌで処理した。
３０分後、１Ｎ ＮａＯＨ５μｌを添加して発色を停止
し、４０５ｎｍで吸収を測定した。
【００８７】該抗体は表Ｉに示すように直接的ＥＬＩＳ
Ａで測定して単一特異性（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）
であった。
Ａで測定して単一特異性（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）
であった。
【００８８】
【表１】
【００８９】実施例５レクチン調査 炭水化物（糖質）が該ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体上に依
存することを測定するために、下記のレクチン調査（ｓ
ｔｕｄｙ）を実施した。ＰＢＳ中のレクチン４０μｇ／
ｍｌ溶液の１００μｌを用いて各々のウェルをインキュ
ベートすることにより、マイクロタイターウエルにレク
チンを被覆した。ウェルをＰＢＳ中で２回洗浄し、ＢＳ
Ａでブロックし、結合バッファー中の〔１２５Ｉ）−Ｃ
ＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白５０μｌを用いてインキュ
ベートした。ウエルをＰＢＳ中で２回洗浄し、結合した
放射能をカウントした。表ＩＩに結果を示す。それは該
受容体がガラクトース、マンノース及びグルコサミン特
異的レクチンに結合することを示している。
存することを測定するために、下記のレクチン調査（ｓ
ｔｕｄｙ）を実施した。ＰＢＳ中のレクチン４０μｇ／
ｍｌ溶液の１００μｌを用いて各々のウェルをインキュ
ベートすることにより、マイクロタイターウエルにレク
チンを被覆した。ウェルをＰＢＳ中で２回洗浄し、ＢＳ
Ａでブロックし、結合バッファー中の〔１２５Ｉ）−Ｃ
ＳＶＴＣＧ特異的受容体蛋白５０μｌを用いてインキュ
ベートした。ウエルをＰＢＳ中で２回洗浄し、結合した
放射能をカウントした。表ＩＩに結果を示す。それは該
受容体がガラクトース、マンノース及びグルコサミン特
異的レクチンに結合することを示している。
【００９０】
【表２】
【００９１】実施例６抗体による接着阻害 抗ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体抗体の、癌細胞のＴＳＰへ
の接着を阻害する能力を測定するために、以下の実験を
実施した。取りはずし可能なマイクロタイターウェル
（Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ）を、２
０ｍＭビス−トリス−プロパンバッファー、ｐＨ６．５
中の４０μｇ／ｍｌ ＴＳＰ、フィブロネクチン、又は
ラミニン溶液の５０μｌを用いて、４℃一晩被覆し、１
％ＢＳＡ２００μｌを用いて１時間ブロックした。Ａ５
４９細胞及び２００μｇ／ｍｌの抗ＣＳＶＴＣＧ特異的
受容体に対するＩｇＧ又は非免疫抗血清を３０分間イン
キュベートし、そして遠心分離して未結合抗体を除去し
た。ペレットをＤＭＥＭ中に再分散し、その細胞を該蛋
白被覆ウェル中で３７℃で６０分インキュベートした。
マイクロタイターウエルの表面に付着した細胞の数をカ
ウントした。表ＩＩＩの結果を非免疫ＩｇＧ−処理の接
着細胞に対する％として示してある。表ＩＩＩは、抗Ｃ
ＳＶＴＣＧ特異的受容体抗体はＡ５４９細胞のＴＳＰ被
覆表面への接着を阻害するが、フィブロネクチン又はラ
ミニンへの細胞接着には影響ないことを示している。該
抗体は組織培養プラスチック（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔ
ｕｒｅｐｌａｓｔｉｃ）へのＴＳＰの付着も阻害した。
の接着を阻害する能力を測定するために、以下の実験を
実施した。取りはずし可能なマイクロタイターウェル
（Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ）を、２
０ｍＭビス−トリス−プロパンバッファー、ｐＨ６．５
中の４０μｇ／ｍｌ ＴＳＰ、フィブロネクチン、又は
ラミニン溶液の５０μｌを用いて、４℃一晩被覆し、１
％ＢＳＡ２００μｌを用いて１時間ブロックした。Ａ５
４９細胞及び２００μｇ／ｍｌの抗ＣＳＶＴＣＧ特異的
受容体に対するＩｇＧ又は非免疫抗血清を３０分間イン
キュベートし、そして遠心分離して未結合抗体を除去し
た。ペレットをＤＭＥＭ中に再分散し、その細胞を該蛋
白被覆ウェル中で３７℃で６０分インキュベートした。
マイクロタイターウエルの表面に付着した細胞の数をカ
ウントした。表ＩＩＩの結果を非免疫ＩｇＧ−処理の接
着細胞に対する％として示してある。表ＩＩＩは、抗Ｃ
ＳＶＴＣＧ特異的受容体抗体はＡ５４９細胞のＴＳＰ被
覆表面への接着を阻害するが、フィブロネクチン又はラ
ミニンへの細胞接着には影響ないことを示している。該
抗体は組織培養プラスチック（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔ
ｕｒｅｐｌａｓｔｉｃ）へのＴＳＰの付着も阻害した。
【００９２】
【表３】
【００９３】実施例７腫瘍細胞の転移に対する抗体の影響 実施例ＩＩに記載したＣＳＶＴＣＧ特異的受容体抗体
を、腫瘍細胞の転移を阻害する能力をｉｎ ｖｉｖｏで
証明するために用いた。
を、腫瘍細胞の転移を阻害する能力をｉｎ ｖｉｖｏで
証明するために用いた。
【００９４】本発明のペプチド化合物の抗転移活性を証
明するために用いたｉｎ ｖｉｖｏモデルは、Ｔｕｓｚ
ｙｎｓｋｉら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９８７）４
７：４１３０−４１３３）により記載されている。簡単
に言えば、１００μｇのＩｇＧ又は１００μｇの本発明
の抗ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体抗体の存在下、１×１０
５Ｂ１Ｆ１０マウス黒色腫細胞をＣ５７黒マウスに静脈
注射する。各々の化合物について５〜６の動物を用い
る。該分析で試験された抗体は、トリパンブルー染色排
除法で測定して、細胞生存性に何の影響も持たない。更
に、該抗体は２４時間共培養しても細胞増殖に何の影響
もない。１４日後マウスを殺し、肺腫瘍の数をカウント
する。
明するために用いたｉｎ ｖｉｖｏモデルは、Ｔｕｓｚ
ｙｎｓｋｉら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９８７）４
７：４１３０−４１３３）により記載されている。簡単
に言えば、１００μｇのＩｇＧ又は１００μｇの本発明
の抗ＣＳＶＴＣＧ特異的受容体抗体の存在下、１×１０
５Ｂ１Ｆ１０マウス黒色腫細胞をＣ５７黒マウスに静脈
注射する。各々の化合物について５〜６の動物を用い
る。該分析で試験された抗体は、トリパンブルー染色排
除法で測定して、細胞生存性に何の影響も持たない。更
に、該抗体は２４時間共培養しても細胞増殖に何の影響
もない。１４日後マウスを殺し、肺腫瘍の数をカウント
する。
【００９５】本発明の抗体は転移活性を阻害するのに効
果的である。
果的である。
【００９６】実施例８血小板凝集に対する抗体の影響 血小板凝集を、蛍光を測定するために取りつけた単一チ
ャネル式血小板凝集計（Ｃｈｒｏｍｏ−Ｌｏｇ，Ｈａｖ
ｅｒｔｏｗｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）で監視す
る。富血小板ブラズマ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ−
ｐｌａｓｍａ：ＰＲＰ）を、０．３８クエン酸ナトリウ
ムで抗凝固化した全血から２０分間１５０×ｇで遠心す
ることにより得る。富血小板プラズマの０．５ｍｌ小分
割を、種々の濃度の対照ＩｇＧ又は抗ＣＳＶＴＣＧ特異
的受容体抗体の存在下に２μＭ ＡＤＰと一緒に撹拌す
ることにより、凝集させる。凝集反応はクロノログ（ｃ
ｈｒｏｎｏ−ｌｏｇ）血小板凝集計中で光学吸収対時間
における減少として３７℃で測定する。本発明の抗体は
血小板凝集を阻害するのに効果がある。
ャネル式血小板凝集計（Ｃｈｒｏｍｏ−Ｌｏｇ，Ｈａｖ
ｅｒｔｏｗｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）で監視す
る。富血小板ブラズマ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ−
ｐｌａｓｍａ：ＰＲＰ）を、０．３８クエン酸ナトリウ
ムで抗凝固化した全血から２０分間１５０×ｇで遠心す
ることにより得る。富血小板プラズマの０．５ｍｌ小分
割を、種々の濃度の対照ＩｇＧ又は抗ＣＳＶＴＣＧ特異
的受容体抗体の存在下に２μＭ ＡＤＰと一緒に撹拌す
ることにより、凝集させる。凝集反応はクロノログ（ｃ
ｈｒｏｎｏ−ｌｏｇ）血小板凝集計中で光学吸収対時間
における減少として３７℃で測定する。本発明の抗体は
血小板凝集を阻害するのに効果がある。
【００９７】
【配列表】 （１） 一般的情報 （ｉ） 出願人：ツジンスキー、ジョージ ポール（Ｔ
ｕｓｚｙｎｓｋｉ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｐａｕｌ） アイアル、ジャコブ（Ｅｙａｌ，Ｊａｃｏｂ） ハミルトン、ブルース キング（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ｂ
ｒｕｃｅ Ｋｉｎｇ） （ｉｉ） 発明の名称：ＣＳＶＴＣＧ特異的腫瘍細胞接
着受容体の精製及び特性付け （ｉｉｉ） 配列の数：１ （ｉｖ） 連絡先： （Ａ） 住所：ダブリユー・アール・グレイス・アンド
・コー・コン（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ＆Ｃｏ．−Ｃｏｎ
ｎ．） （Ｂ） 通り：７３７９ ルート（Ｒｏｕｔｅ）３２ （Ｃ） 市 ：コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ） （Ｄ） 州 ：メリランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ） （Ｅ） 国 ：米国 （Ｆ） ＺＩＰ：２１０４４ （ｖ） コンピューター・リーダブル・フォーム （Ａ） 媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ） コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル （Ｃ） 操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ） ソフトウエアー：ワードパーフェクト５・１ （ｖｉ） 現行出願日 （Ａ） 出願番号：ＵＳ （Ｂ） 出願日： （Ｃ） 分 類：５３０ （ｖｉｉｉ） 代理人／事務所情報 （Ａ） 氏名：アプルビー・バネッサ・エル（Ａｐｐｌ
ｅｂｙ，Ｖａｎｅｓｓａ Ｌ） （Ｂ） 登録番号：３３２２３ （Ｃ） 参照／事件番号：０１−８１１０ （ｉｘ） 電話連絡情報 （Ａ） 電話：（４１０）５３１−４５１５ （２） 配列番号：１についての情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ） 長さ：６アミノ酸 （Ｂ） 型 ：アミノ酸 （Ｃ） トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 配列の種類：ペプチド （ｘｉ） 配列：配列番号：１：
ｕｓｚｙｎｓｋｉ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｐａｕｌ） アイアル、ジャコブ（Ｅｙａｌ，Ｊａｃｏｂ） ハミルトン、ブルース キング（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ｂ
ｒｕｃｅ Ｋｉｎｇ） （ｉｉ） 発明の名称：ＣＳＶＴＣＧ特異的腫瘍細胞接
着受容体の精製及び特性付け （ｉｉｉ） 配列の数：１ （ｉｖ） 連絡先： （Ａ） 住所：ダブリユー・アール・グレイス・アンド
・コー・コン（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ＆Ｃｏ．−Ｃｏｎ
ｎ．） （Ｂ） 通り：７３７９ ルート（Ｒｏｕｔｅ）３２ （Ｃ） 市 ：コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ） （Ｄ） 州 ：メリランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ） （Ｅ） 国 ：米国 （Ｆ） ＺＩＰ：２１０４４ （ｖ） コンピューター・リーダブル・フォーム （Ａ） 媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ） コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル （Ｃ） 操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ） ソフトウエアー：ワードパーフェクト５・１ （ｖｉ） 現行出願日 （Ａ） 出願番号：ＵＳ （Ｂ） 出願日： （Ｃ） 分 類：５３０ （ｖｉｉｉ） 代理人／事務所情報 （Ａ） 氏名：アプルビー・バネッサ・エル（Ａｐｐｌ
ｅｂｙ，Ｖａｎｅｓｓａ Ｌ） （Ｂ） 登録番号：３３２２３ （Ｃ） 参照／事件番号：０１−８１１０ （ｉｘ） 電話連絡情報 （Ａ） 電話：（４１０）５３１−４５１５ （２） 配列番号：１についての情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ） 長さ：６アミノ酸 （Ｂ） 型 ：アミノ酸 （Ｃ） トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 配列の種類：ペプチド （ｘｉ） 配列：配列番号：１：
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＥＢ Ｃ０７Ｋ 1/22 16/30 8318−4Ｈ // Ｃ１２Ｎ 15/09 (71)出願人 591048335 ザ・メデイカル・カレツジ・オブ・ペンシ ルベニア ＴＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＰＥＮＮＳＹＬＶＡＮＩＡ アメリカ合衆国ペンシルベニア州19129フ イラデルフイア・ヘンリイアベニュー3300 (72)発明者 ジヨージ・ポール・タスツインスキ アメリカ合衆国ニユージヤージイ州08094 ウイリアムズタウン・ソローレイン824 (72)発明者 ジヤコブ・イヤル アメリカ合衆国メリーランド州21209ボル チモア・エメラルドリツジコート23 (72)発明者 ブルース・キング・ハミルトン アメリカ合衆国メリーランド州20905シル バースプリング・ウオーターゲイトロード 15229
Claims (23)
- 【請求項１】 ペプチドＣＳＶＴＣＧ（配列番号：１）
に対して特異的結合親和性を有する単離された受容体蛋
白。 - 【請求項２】 非還元状態で約５０ｋｄの分子量を有す
る、精製された請求項１の受容体。 - 【請求項３】 還元状態で分子量約５０ｋｄ及び６０ｋ
ｄの２種の蛋白である、請求項１の受容体。 - 【請求項４】 約７．１〜約７．５の等電焦点（isoele
ctric focus point）を有する、請求項１の受容体。 - 【請求項５】 （ａ）ＣＳＶＴＣＧ−特異的受容体を有
する腫瘍細胞からの細胞抽出液を調製し； （ｂ）該ＣＳＶＴＣＧ−特異的受容体蛋白が固定化ＣＳ
ＶＴＣＧペプチド（配列番号：１）に結合する条件下
に、固定化ＣＳＶＴＣＧペプチドを含有するクロマトグ
ラフカラムに該細胞抽出液を通し；そして （ｃ）結合した受容体蛋白を該カラムから溶出して、精
製されたＣＳＶＴＣＧ−特異的受容体蛋白を得る；こと
からなるＣＳＶＴＣＧ−特異的受容体蛋白の精製方法。 - 【請求項６】 該腫瘍細胞株が、黒色腫（melanoma）及
び肺癌（lung carcinoma）細胞株からなる群から選ば
れる請求項５の方法。 - 【請求項７】 該精製されたＣＳＶＴＣＧ−特異的受容
体蛋白を陰イオン交換クロマトグラフカラムに通すこと
から更になる、請求項５の方法。 - 【請求項８】 該ペプチドＣＳＶＴＣＧ（配列番号：
１）に特異的に結合する親和性を有する受容体蛋白に特
異的に反応する抗体又は抗血清。 - 【請求項９】 癌を持つ疑いのある組織の試料を請求項
８の抗体又は抗血清と反応させ、そして該組織と該抗体
との結合を測定することを特徴とする癌の診断方法。 - 【請求項１０】 請求項８の抗体又は抗血清の有効量を
投与することを特徴とする腫瘍転移活性を阻害する方
法。 - 【請求項１１】 腫瘍細胞の付着（adhesion）を防止又
は阻害する請求項１０の方法。 - 【請求項１２】 腫瘍サイズを減少させる請求項１０の
方法。 - 【請求項１３】 腫瘍コロニーの数を減少させる請求項
１０の方法。 - 【請求項１４】 請求項８の抗体又は抗血清の有効量を
投与することを特徴とする血栓活性（thrombotic acti
vity）を阻害する方法。 - 【請求項１５】 血小板凝集を阻害する請求項１４の方
法。 - 【請求項１６】 請求項８の抗体又は抗血清の有効量を
投与することを特徴とするアテローム硬化活性を阻害す
る方法。 - 【請求項１７】 請求項８の抗体又は抗血清の有効量を
投与することを特徴とするマラリア活性を阻害する方
法。 - 【請求項１８】 請求項８の抗体又は抗血清の有効量を
投与することを特徴とする脈管形成を阻害する方法。 - 【請求項１９】 請求項８の抗体又は抗血清を含有する
担体分子。 - 【請求項２０】 毒素、薬物、ホルモン又は画像化剤
（imaging agent）をさらに含有する請求項１９の担
体。 - 【請求項２１】 請求項８の抗体又は抗血清を含有する
診断又は治療のために腫瘍細胞へ化合物を分配するのを
促進する方法。 - 【請求項２２】 請求項８の抗体又は抗血清を組み入れ
た、生物医薬デバイス。 - 【請求項２３】 請求項８の抗体又は抗血清を含有する
ＣＳＶＴＣＧ−特異的受容体を有する細胞の付着を阻害
する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US883659 | 1992-05-14 | ||
| US07/883,659 US5367059A (en) | 1992-05-14 | 1992-05-14 | Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly specific tumor cell adhesion receptor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07138296A true JPH07138296A (ja) | 1995-05-30 |
Family
ID=25383057
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5132353A Pending JPH07138296A (ja) | 1992-05-14 | 1993-05-12 | Ｃｓｖｔｃｇ特異的腫瘍細胞の接着受容体の精製及び特性付け |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5367059A (ja) |
| EP (1) | EP0578342A3 (ja) |
| JP (1) | JPH07138296A (ja) |
| CA (1) | CA2095404A1 (ja) |
| MX (1) | MX9302549A (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5627265A (en) * | 1993-03-05 | 1997-05-06 | Washington University | Receptor for cell-binding domain of thrombospondins |
| EP0730466A4 (en) * | 1993-09-10 | 1999-04-14 | Univ New York | COMPOSITIONS AND METHOD FOR INHIBITING THE INVASION OF HEPATOCYTES BY MALARIASPOROZOITES |
| GB9509957D0 (en) * | 1995-05-17 | 1995-07-12 | Khalil Nasreen | Post-translational activation of tgf-1 involving the tsp-1 receptor cd36 |
| US6716963B1 (en) | 1998-05-22 | 2004-04-06 | Abbott Laboratories | Peptide antiangiogenic drugs |
| WO2000078359A2 (en) * | 1999-06-21 | 2000-12-28 | George Tuszynski | Compositions for treating chemotherapy-resistant tumor cells |
| CN1335887A (zh) * | 1999-06-21 | 2002-02-13 | 印坎药物股份有限公司 | 血管抑制素∶一种Cys－Ser－Val－Thr－Cys－Gly特异性肿瘤细胞粘附受体 |
| US6380161B1 (en) | 1999-06-21 | 2002-04-30 | Inkine Pharmaceutical Company, Inc. | Compositions for treating chemotherapy-resistant tumor cells and targeted chemotherapy compositions |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5192744A (en) * | 1990-01-12 | 1993-03-09 | Northwestern University | Method of inhibiting angiogenesis of tumors |
| US5190920A (en) * | 1990-09-24 | 1993-03-02 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Method for using synthetic analogs of thrombospondin for inhibiting metastasis activity |
| WO1993006848A1 (en) * | 1991-10-03 | 1993-04-15 | The Center For Blood Research | Cd36 immunoadhesins and their use in selectively killing plasmodium falciparum infected erythrocytes |
| CA2134655A1 (en) * | 1992-04-30 | 1993-11-11 | Russell J. Howard | Modulation of thrombospondin-cd36 interactions |
-
1992
- 1992-05-14 US US07/883,659 patent/US5367059A/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-04-30 MX MX9302549A patent/MX9302549A/es unknown
- 1993-05-03 CA CA002095404A patent/CA2095404A1/en not_active Abandoned
- 1993-05-11 EP EP19930250135 patent/EP0578342A3/en not_active Withdrawn
- 1993-05-12 JP JP5132353A patent/JPH07138296A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5367059A (en) | 1994-11-22 |
| EP0578342A3 (en) | 1994-06-29 |
| MX9302549A (es) | 1994-07-29 |
| CA2095404A1 (en) | 1993-11-15 |
| EP0578342A2 (en) | 1994-01-12 |
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