JP2003021632A - ウロキナーゼレセプターに対する抗体とその用途 - Google Patents

ウロキナーゼレセプターに対する抗体とその用途

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JP2003021632A
JP2003021632A JP2002108441A JP2002108441A JP2003021632A JP 2003021632 A JP2003021632 A JP 2003021632A JP 2002108441 A JP2002108441 A JP 2002108441A JP 2002108441 A JP2002108441 A JP 2002108441A JP 2003021632 A JP2003021632 A JP 2003021632A
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ケル・ダネー
Ebbe Roenne
エベ・レネ
Niels Behrendt
ニルス・ベーレント
Vincent Ellis
ヴィンセント・エリス
Gunilla Hoeyer-Hansen
グニラ・ヘイア−ハンセン
Charles Pyke
チャールズ・パイク
Nils Brunner
ニルス・ブリュンナー
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ｕ−ＰＡＲの検定試薬の提供。 【解決手段】 ｕ−ＰＡＲ分子のＣ末端部を含んでお
り、そして、完全ｕ−ＰＡＲ分子の第８８位アミノ酸残
基で始まるｕ−ＰＡＲ分子の部分に結合する、モノ特異
性モノクローナル抗体を必須成分として使用する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】発明の分野 本発明は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ９０／００９０
およびアメリカ特許出願第３３４６１３号および第３７
４,８５４号に開示された発明の或る面における更なる
展開、特に特定のタイプの抗体、就中モノクローナル抗
体、ならびにそのような特定のタイプの抗体の用途、就中
ｕ−ＰＡＲを検出、定量したり、治療のために使用した
り、医療のスクリーニングに使用することに関する。
【０００２】
【従来の技術】一般的背景 文献によると、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化
因子(u−ＰＡ)は、これまでに調査されたあらゆる種類
のほ乳類から見出されている。幾つかの発見は、u−Ｐ
Ａが、他の蛋白質分解酵素をプラスミンと一緒に用いた
場合に誘発される、恐らくは細胞外マトリックスの分解
による組織分解および／または細胞移動に関係あること
を示している。この関係は、乳腺や前立腺の泌乳後退縮
および子宮における受精卵着床後の栄養芽層侵入の初期
においてほぼ充分に研究されてきた。組織分解および細
胞移動におけるu−ＰＡの役割に関する仮説は、退縮し
ている乳腺の上皮細胞、乾せんでの組織分解を伴う領
域、精子形成中の精母細胞の放出との関連、および創傷
治癒中の上皮生長のケラチン生成細胞におけるu−ＰＡ
の免疫細胞化学的発見により可能となったより正確な位
置測定によりさらに支持されている(ダノ等(１９８８、
１９９０)、グロンダル-ハンセン等(１９８８)、アンド
レーセン等(１９９０)参照)。
【０００３】また、u−ＰＡが炎症の退化相においてあ
る役割を演じていることが考えられ、また、u−ＰＡが
様々な細胞に対するリンパ球介在細胞毒性を妨害すると
いう報告も存在し、天然キラー細胞の細胞毒性作用にお
けるu−ＰＡの直接的役割が提案されている。u−ＰＡの
役割は、血管形成および上皮細胞移動、すなわち腫よう
増大における重要なプロセスにおいて提案されている。
【０００４】u−ＰＡは、新生物由来の多くの培養細胞
型により産生される。腫よう組織の外植体は、対応する
正常組織よりも多くのu−ＰＡを放出することが見出さ
れた。u−ＰＡは、ヒト肺、結腸、子宮内膜、胸部、前
立腺および腎臓癌腫、ヒト・メラノーマ、ネズミ乳癌、
ネズミ・ルイス肺腫ようからの抽出物およびヒト腹膜癌
腫症からの腹水において同定された。マウスにおいて侵
襲的に増大および転移しているルイス腹癌腫に関する免
疫組織化学試験は、u−ＰＡの存在を一貫して示した
が、また、個々の腫ようの異なる部分におけるu−ＰＡ
の含有量の顕著な不均一性をも示した。高いu−ＰＡ含
有量は周囲の正常組織の侵襲的増大および分解を伴う領
域で見出されたが、他の領域は検出可能なu−ＰＡを欠
いていた。u−ＰＡは、腫よう細胞の細胞質および正常
細胞の周囲に細胞外的に局在していた。
【０００５】周囲正常組織の分解は、悪性腫ようの侵襲
性の中心的特徴である。悪性腫ようにおけるu−ＰＡの
定常的発見およびu−ＰＡが正常な生理学的事象におけ
る組織分解である役割を演じていることを示す発見によ
り、u−ＰＡは癌発生においても似た役割を演じている
ことが仮定される。u−ＰＡが組織破壊においてある役
割を演じているという仮説は、プラスミンが他の蛋白質
分解酵素と一緒になって細胞外マトリックスを分解する
という仮定を含む。この状況では、細胞外マトリックス
の大部分の成分がプラスミンにより分解され得ることに
注目すべきである。これらには、ラミニン、フィブロネ
クチン、プロテオグリカン、および全部ではないが、恐
らくは幾つかのタイプのコラーゲンが含まれる。さら
に、バエスおよび共同研究者により最初に報告された通
り、プラスミンは、一方で他のタイプのコラーゲンを分
解し得る潜在コラゲナーゼを活性化し得る(ダノ等、(１
９８８、１９９０)参照)。
【０００６】処置失敗群における癌患者の大多数は、転
移の直接作用または転移の処置に伴う合併症で死亡す
る。従って、多くの研究は、診断的または治療的ストラ
テジーに関する基礎であり得る特異的な生化学的因子の
同定に集中してきた。細胞外マトリックスは、糖蛋白
質、例えばフィブロネクチンおよびラミニン、コラーゲ
ンおよびプロテオグリカンにより構成される。細胞外マ
トリックスは、組織治癒および改造、炎症および新生組
織形成中のみ細胞の動きに対して集中的に透過性にな
る。リオッタ(１９８６)は三段階仮説を提案した。第一
段階は、細胞表面レセプターによる腫よう細胞の結合で
ある。次に、固定された腫よう細胞は、マトリックスを
局所的に分解し得る(結合成分の分解を含む)加水分解酵
素を分泌する(または宿主細胞を誘導して酵素を分泌さ
せる)。マトリックス溶解は、ほぼ確実に腫よう細胞表
面に近い高局在領域で行なわれると思われる。第三段階
は、蛋白質分解により修飾されたマトリックス領域への
腫よう細胞の移動である。すなわち、マトリックスの侵
襲性は、受動的生長圧に起因するだけでなく、能動的生
化学機構を必要とする。
【０００７】多くの研究グループは、侵襲性腫よう細胞
がマトリックス分解性プロテイナーゼを分泌することを
提案した。セリンプロテアーゼおよびチオールプロテア
ーゼを含むプロテアーゼのカスケードは全て、腫よう侵
襲の容易化の一因となっている。重大なカスケードの一
つは、プラスミノーゲン活性化システムである。蛋白質
分解の調節は、腫よう細胞−宿主細胞相互作用および宿
主または腫よう細胞そのものにより産生されるプロテア
ーゼ阻害物質を含め、多くのレベルで行なわれ得る。マ
トリックス分解酵素の発現は、腫よう細胞特異的ではな
い。活動的侵襲性腫よう細胞は、単にそれらの非侵襲性
対照細胞と比べて異なる調節シグナルに応答し得る(リ
オッタ、１９８６)。
【０００８】プラスミノーゲン活性化システムが、細胞
外マトリックス蛋白質の分解を通して、悪性腫ようの増
大中に正常組織の侵襲および破壊においてある役割を演
じているという仮定は、様々な発見により支持されてい
る。これらの発見には、発癌性ウイルスによる細胞の形
質転換およびu−ＰＡの合成間の密接な関係、u−ＰＡが
多くの非悪性状態における組織破壊に関与するという発
見、および腫ようの侵襲領域におけるu−ＰＡの免疫組
織化学的位置測定が含まれる(概説としてダノ等(１９８
５)、サクセラ(１９８５)参照)。
【０００９】この仮説を支持する別の発見は、侵襲およ
び転移のモデルシステムにおけるu−ＰＡに対する抗触
媒的抗体による試験から生まれている。上記抗体は、チ
キン胚芽のしょう尿膜へ移植されたヒトu−ＰＡ産生腫
よう、ＨＥp−３から肺への転移(オッソブスキーおよび
ライヒ、１９８３、オッソブスキー、１９８８)、Ｂ１
６メラノーマ細胞による羊膜の浸透(ミグナッティ等、
１９８６)、新生物に由来する幾つかのヒトおよびネズ
ミセルラインによる基底膜侵襲(ライヒ等、１９８８)お
よびマウスにおけるＢ１６メラノーマ細胞の静脈内注射
後の肺転移の形成(ヒアリング等、１９８８)を減少させ
ることが見出された。これらの試験の中には(ミグナッ
ティ等、１９８６、ライヒ等、１９８８)、プロコラゲ
ナーゼのプラスミン触媒による活性化(トリグベーソン
等(１９８７)参照)は、プラスミノーゲン活性化作用の
重大な部分であると思われるものがあった。
【００１０】細胞外プロセスにおける蛋白質分解カスケ
ード・システムの調節に関する必要条件は、その開始お
よび進行の正確な位置測定である。例えば、補体および
凝結システムでは、様々な成分に対する細胞レセプター
が公知であり、それらは反応連鎖を促進または終結させ
る反応の位置測定に役立っている(ミューラー-エーベル
ハルト、１９８８、マン等、１９８８)。プラスミノー
ゲン活性化システムでは、組織型プラスミノーゲン活性
化因子(t−ＰＡ)により触媒されたプラスミノーゲン活
性化の位置決定におけるフィブリンの役割がよく知られ
ている(トールセン等、１９７２、ホイラーツ等、１９
８２)。
【００１１】免疫細胞化学試験は、腫ようの侵襲性領域
では、u−ＰＡが腫よう細胞の膜に位置することを示唆
しており(スクリバー等、１９８４)、最近の発見は、細
胞表面において、u−ＰＡが一般的に特異的レセプター
に結合していること、およびこの局在性は、時間および
空間の点でu−ＰＡ触媒プラスミノーゲン活性化の調節
に重大であり得ることを示している(ブラシ等(１９８
７)、ダノー等(１９９０)参照)。予備報告は、t−ＰＡ
もまた、細胞表面レセプターに結合し、その酵素活性を
保持し得ることを示唆している(ベーベ、１９８７、バ
ルナーサン等、１９８８、ハジャーおよびナハマン、１
９８８、クィパー等、１９８８)。しかしながら、この
現象は、結合部位の性質に関するさらに明確な説明を要
する。
【００１２】u−ＰＡに対する表面レセプター u−ＰＡに対する細胞レセプター(u−ＰＡＲ)は、最初、
血液単核白血球および単核白血球様Ｕ９３７セルライン
において同定され(バッサーリ等、１９８５)、その存在
は、幾つかの型の悪性細胞(ストッペーリ等、１９８
５、バッサーリ等、１９８５、プロー等、１９８６、ボ
イド等、１９８８a、ニールセン等、１９８８)、ヒト線
維芽細胞(バジパイおよびベーカー、１９８５)を含む様
々な培養細胞およびヒト胸部癌腫組織(ニードハム等、
１９８７)において立証されている。レセプターは、活
性５４kＤ u−ＰＡ、その一ポリペプチド鎖プロ酵素、
プロ−u−ＰＡ(下記参照)および活性部位試薬ＤＦＰに
より阻害された５４kＤ u−ＰＡに結合するが、活性u−
ＰＡの低分子量(３３kＤ)形態の結合性は全く示さない
(バッサーリ等、１９８５、クベリス等、１９８６)。す
なわち、レセプターへの結合はu−ＰＡの触媒部位を必
要とせず、これらの発見に従って、u−ＰＡの結合決定
基は、一次構造が触媒部位とは大きく異なる領域である
酵素のアミノ末端部分において同定された。レセプター
結合ドメインは、u−ＰＡ分子の１５kＤアミノ末端フラ
グメント(ＡＴＦ、残基１−１３５)、より正確には、表
皮成長因子(ＥＧＦ)レセプターへの結合に関与するＥＧ
Ｆの部分と相同性を示す領域であるため成長因子領域と
呼ばれるシステイン濃厚域内に位置する。結合に非常に
重要であると思われるアミノ酸残基は、配列１２−３２
内に位置する(アッペラ等、１９８７)。非常に低濃度
(１００ナノモル)の結合を阻害する合成ペプチドが構築
された。ネズミおよびヒトペプチド間の交差反応性の欠
如は、u−ＰＡおよびu−ＰＡＲ間の結合が強度に種特異
的であることを示す。
【００１３】u−ＰＡＲへのu−ＰＡの結合は、t−ＰＡ
およびプラスミノーゲンを含むu−ＰＡに構造上関連し
た幾つかの蛋白質について試験されたにせよ(ストッペ
ーリ等、１９８５、バッサーリ等、１９８５、ニールセ
ン等、１９８８)、レセプターへの結合についてきっ抗
する他の蛋白質がまだ全く見出されていないという意味
では特異的である。レセプター結合ドメインのみを含む
u−ＰＡのフラグメント、例えばＡＴＦは、u−ＰＡと結
合し得る他の分子(プロテアーゼ・ネキシンおよびプラ
スミノーゲン活性化因子阻害物質ＰＡＩ−１およびＰＡ
Ｉ−２)が触媒活性領域を認識するため、レセプターへ
の結合特異性を確実にする(ストッペーリ等、１９８
５、ニールセン等、１９８８)。ＰＡＩ−１は、u−ＰＡ
とは共有結合複合体を形成し得るが、プロ−u−ＰＡと
は形成し得ない(アンドレアーゼン等、１９８６)。
【００１４】報告されたレセプターの数は、正常単核白
血球では１細胞当たり数千個の分子(マイルズおよびプ
ロー、１９８７)からある種の結腸癌腫セルラインでは
３×１０５(ボイド等、１９８８a)といった範囲で、試
験された細胞型間で強度に変動し、また、結合親和力に
ついては０.１−１０ナノモルの範囲で見かけ上ある程
度の変動が生じる(概説については、ブラシ(１９８
８)、ダノー等(１９９０)参照)。さらに、ある種のセル
ラインでは、レセプター数は、様々な薬剤、例えばＵ９
３７細胞ではホルボール・ミリステート・アセテート
(ＰＭＡ)(ストッペーリ等、１９８５、ニールセン等、
１９８８)、Ａ４３１細胞(ブラシ等、１９８６)および
ヒーラ細胞(エストレイヒェル等、１９８９)では表皮成
長因子並びに結腸癌腫細胞ではジメチルホルムアミド
(ボイド等、１９８８b)を加えることにより調節され得
る。第一に述べたケースでは、リガンドに対する親和力
が大きく減少すると同時にレセプター数が増加する(ニ
ールセン等、１９８８、ピコン等、１９８９)。
【００１５】ヒトu−ＰＡレセプターは最近、精製、特
性化され(ベーレント等、１９９０)、その全長ｃＤＮＡ
はクローン化された(ロダン等、１９９０)。u−ＰＡＲ
は５５〜６０ＫＤのグリコプロテインであり、その分子
量はジスルフィド結合の開裂後も変化が認められないの
で、一本鎖ポリペプチドから成るものと推定される。同
定された異なった電気泳動的運動性をもった若干の変種
は、グリコシル化の変種と思われる。全長ヒトu−ＰＡ
ＲｃＤＮＡは、１３６３ｂｐの長さを持ち、そのヌクレ
オチド配列を３１３残基長のu−ＰＡＲ分子の推定アミ
ノ酸配列と共に以下に示す。シグナルペプチドにはアン
ダーラインを、精製タンパクについて決定された配列で
ある最初の３０アミノ酸にはオーバーラインを付してあ
る。スター印は潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位を示
す。
【００１６】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【００１７】u−ＰＡＲに対するポリクローナル抗体の
製法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ９０／０００９０
号に記載されているが、レセプターに対する特別のモノ
クローナル抗体は、ここに記載する。
【００１８】u−ＰＡに対するプロ酵素(プロ−u−ＰＡ) 幾つかの試験結果は、u−ＰＡが、プラスミノーゲン活
性化能力をほとんどまたは全くもたない１本鎖プロ酵素
として多くの型の培養細胞から放出されることを示して
いる(ニールセン等、１９８２、スクリバー等、１９８
２、イートン、１９８４、カサイ等、１９８５、パネル
およびギュアウィッチ、１９８７)。触媒量のプラスミ
ンによる制限された蛋白質分解により、このプロ酵素
は、その活性２本鎖対応物質に変換され得る。また、１
本鎖u−ＰＡのプロ酵素の性質は、それが本質的に合成
基質によるアミド分解活性をもたず(ウン等、１９８
２、イートン等、１９８４、リジネン等、１９８６、ス
タンプ等、１９８６a、１９８６b、ネレス等、１９８
７、パネルおよびギュアウィッチ、１９８７)、それが
巨大分子阻害物質(イートン等、１９８４、バッサーリ
等、１９８５、アンドレアセン等、１９８６、ステフェ
ンズ等、１９８７)および合成阻害物質(ニールセン等、
１９８２、スクリバー等、１９８２、ウン等、１９８
２、ギュアウィッチ等、１９８４、カサイ等、１９８
５)との反応性をほとんどまたは全くもたないという発
見において反映されている。
【００１９】本質的不活性プロ酵素としての１本鎖u−
ＰＡのこの概念は、数名の他の研究者(コレン等、１９
８６、リジネン等、１９８６、スタンプ等、１９８６
a、１９８６b)が到達した解釈とは対立する。彼等は、
幾つかの供給源から得られた１本鎖u−ＰＡがかなりの
プラスミノーゲン活性化能力を有し、組換え１本鎖u−
ＰＡが２本鎖u−ＰＡの場合よりも一層高い活性を有す
るという結論に達した。これらの試験を行うため、生成
されたプラスミンの活性を色素原基質により測定する結
合プラスミノーゲン活性化検定を使用した。プロ−u−
ＰＡに関する上記検定は、自己活性的であり、少量の汚
染性または生成された２本鎖u−ＰＡまたはプラスミン
により強く影響される。従って、他の場所で詳細に検討
されている通り(ペーターセン等、１９８８)、これらの
試験で見出される１本鎖u−ＰＡの高い活性は見かけ上
のものであり、１本鎖u−ＰＡの固有の活性によるもの
ではなかったといえる。部位突然変異によりプラスミン
開裂に対する部分的耐性が加えられた組換え１本鎖u−
ＰＡの変異体に関する報告は、この解釈と一致する。１
本鎖u−ＰＡのこの変異体は、結合検定において２本鎖u
−ＰＡの場合よりも２００倍低い活性を有していた(ネ
レス等、１９８７)。
【００２０】プロ−u−ＰＡに関する検定において自己
活性化を阻止する方法を含む最近の動力学試験は、プロ
−u−ＰＡの低い固有活性を確認した(エリス等、１９８
７、ペーターセン等、１９８８、ウラノ等、１９８
８)。ＨＴ−１０８０線維肉腫細胞から得られたプロ−u
−ＰＡの高度精製製品による一試験では、プロ−u−Ｐ
Ａが、２本鎖u−ＰＡの２５０倍低濃度の場合より低い
プラスミノーゲン活性化能力を有することが示された。
この低い活性が固有のものであるのか、汚染によるもの
であるのかを決定することは出来なかった(ペーターセ
ン等、１９８８)。
【００２１】インタクトな生物では、プロ−u−ＰＡ
は、細胞内貯蔵におけるu−ＰＡの主形態であり、ま
た、それは、細胞外流体中でu−ＰＡのかなり大きなフ
ラクションを構成する(スクリバー等、１９８４、キー
ルベルグ等、１９８５)。従って、プロ−u−ＰＡの細胞
外活性化は、プラスミノーゲン活性化のu−ＰＡ経路の
生理学的調節における非常に重要な段階であり得る。プ
ロ−u−ＰＡのプラスミン触媒による活性化によって、
少量のプロ−u−ＰＡの活性化作用を加速および増幅す
る積極的なフィードバック機構が提供される。しかしな
がら、生理学的条件下におけるプラスミノーゲン活性化
のu−ＰＡ経路の開始は、この明細書に記載されている
通りプロ−u−ＰＡを活性化するトリガー因子を必要と
する。リジン１５８が別のアミノ酸(例、ＧluまたはＧl
y)へ改変されたヒト１本鎖プロ−u−ＰＡの突然変異体
は、全くまたは低い程度にしか活性２本鎖u−ＰＡに変
換されない(ネレス等、１９８７)。
【００２２】焦点接触部位におけるu−ＰＡ ＨＴ−１０８０線維肉腫細胞およびヒト線維芽細胞の表
面において、u−ＰＡは、不均一に分布し、明らかに細
胞-細胞接触部位および細胞および培養基盤間の最も近
接した部位である焦点接触部位に位置していることが見
出された(ポーラーネン等、１９８７、１９８８、ヘブ
ールおよびベーカー、１９８８)。u−ＰＡは、他の２タ
イプの細胞-培養基盤接触部位、すなわち近接接触部位
およびフィブロネクサスからは検出されなかったことか
ら、焦点接触部位における固有成分といえる(ポーラー
ネン等、１９８８)。焦点接触部位のu−ＰＡはレセプタ
ー結合している(ヘブールおよびベーカー、１９８８)。
焦点接触部位は、いわゆるストレス線維またはアクチン
・ケーブルである、アクチン含有マイクロフィラメント
管束の末端に位置する(ブリッジ、１９８６)。これらの
部位は、幾つかの構造成分(アクチン、タリン)および調
節因子(チロシンキナーゼ原始腫よう遺伝子生成物Ｐ６
０ｓｒｃ、Ｐ１２０ｇａｇ−ａｂｌ、Ｐ９０
ｇａｇ−ｙｅｓ、Ｐ８０ ｇａｇ−ｙｅｓ)を含み、それ
らは全て細胞質側に位置する(ブリッジ(１９８６)参
照)。
【００２３】細胞表面上のプラスミノーゲン結合部位 プラスミノーゲンおよびプラスミンは、血小板、内皮細
胞および新生物に由来する幾つかの細胞型を含め、多く
の型の培養細胞に結合する(マイルズおよびプロー、１
９８５、ハジャー等、１９８６、プロー等、１９８６、
マイルズおよびプロー１９８７、バーチンおよびフォン
ダネチェ、１９８８)。結合は、プラスミノーゲンに対
するかなり低い親和力(ＫＤ１μＭ)で飽和可能である。
少なくとも細胞タイプによっては、プラスミンの結合は
プラスミノーゲンと同じ部位を利用すると思われるが、
プラスミンに関する結合パラメーターは、プラスミノー
ゲンおよびプラスミンに関する複数タイプの結合部位が
存在し得ることを示している。すなわち、プラスミンお
よびプラスミノーゲンがほぼ等しい親和力で結合する細
胞タイプもあれば(プロー等、１９８６)、明らかにプラ
スミンがプラスミノーゲンよりも高い親和力(ＫＤ５０
ナノモル)で結合する細胞タイプもある(バーチンおよび
フォンダネチェ、１９８８)。この結合は、低量のリジ
ンおよびリジン類縁体により阻止され、プラスミノーゲ
ンおよびプラスミンの重鎖のクリングル構造を含むと思
われる(マイルズ等、１９８８)。
【００２４】結合能力は細胞タイプ間で変動し、多くの
細胞タイプでは非常に高い(１細胞当たり１０５−１０
７結合部位)。結合部位の化学的性質は知られていな
い。膜蛋白質ＧＰIIb／IIIaは、血小板へのプラスミノ
ーゲンの結合に関与すると思われ(マイルズ等、１９８
６)、特にトロンビン刺激血小板では、フィブリンもプ
ラスミノーゲン結合に関与し得る(マイルズ等、１９８
６)。その精製形態において、血小板蛋白質トロンボス
ポンディンは、プラスミノーゲンと複合体を形成する
(ＫＤ３５ナノモル)(シルバースタイン等、１９８４)。
また、固定化ラミニン(サロネン等、１９８４)およびフ
ィブロネクチン(サロネン等、１９８５)もプラスミノー
ゲンと結合する(それぞれＫＤ３ナノモルおよび９０ナ
ノモル)。
【００２５】表面プラスミノーゲン活性化 u−ＰＡおよびプラスミノーゲンの両方に結合する細胞
タイプもある(プロー等、１９８６、マイルズおよびプ
ロー、１９８７、バーチンおよびフォンダネチェ、１９
８８、エリス等、１９８８)。レセプター結合プロ−u−
ＰＡは、プラスミンにより活性化され得(クベリス等、
１９８６)、少なくとも部分的に、レセプター結合２本
鎖u−ＰＡはプラスミノーゲン活性化能力を保持してい
る(バッサーリ等、１９８５)。
【００２６】両分子に対する結合部位をもつ細胞へu−
ＰＡおよびプラスミノーゲンを加えると、細胞結合プラ
スミンが発生する(プロー等、１９８６、バーチンおよ
びフォンダネチェ、１９８８)。これらの試験によっ
て、溶液中で行なわれる活性化プロセス間または表面結
合反応体間の厳密な区別はできなかった。
【００２７】u−ＰＡおよびプラスミノーゲンの結合部
位間の相互作用は、２つのセルラインにおけるu−ＰＡ
結合がプラスミノーゲンに対する高い結合能力を誘導す
るという発見により示唆されている。これらの試験にお
けるプラスミノーゲンの結合は、u−ＰＡに関する結合
能力に全く影響を与えなかった(プロー等、１９８６)。
また、２つの試験で立証されたプラスミノーゲン結合部
位は見たところ同一ではないが(上記参照)、プラスミノ
ーゲンにより誘発されるu−ＰＡ結合性の向上が、新生
物由来のセルラインにおいてバーチンおよびフォンダネ
チェ(１９８８)により見出された。
【００２８】最近、オッソブスキー(１９８８)は、表面
u−ＰＡレセプターを有するが、u−ＰＡを産生しないヒ
ト腫よう細胞の(インビボ検定における修飾ひな胚しょ
う尿膜への)侵入能力が、外因性u−ＰＡでそれらのレセ
プターを飽和させることにより増強され得るという発見
を発表した。しかしながら、この発見は(著者の意見で
は)暗示的なものにすぎず、それはレセプター自体への
結合が必要であることを立証してはいない。
【００２９】エリス等(１９８９)は、プラスミノーゲン
活性化を誘導する反応が、u−ＰＡおよびプラスミノー
ゲンをＵ９３７細胞へ加えた場合に行なわれ得ること、
および、それらの反応が、プラスミノーゲンおよびプロ
−u−ＰＡの両方を表面に結合させた場合にさらに有効
に行なわれることを示す証拠を発表した。この実験は、
血清の非存在下、すなわちエリス等が使用した製品によ
るプラスミノーゲン活性化が同じく溶液中で行なわれる
(エリス等、１９８７)条件下で行なわれた。これらの試
験は、u−ＰＡがレセプター結合していない場合に、関
与するプロセス(例、２本鎖u−ＰＡにより触媒されるプ
ラスミノーゲン活性化)の一つまたはそれ以上が実際に
行なわれる可能性を排除するものではない。ステフアン
等（１９８９）は血清の存在下で培養されたＨＴ１０８
０線維肉腫細胞の表面におけるプラスミン形成が、当該
細胞によって生産されるu−ＰＡが表面のu−ＰＡＲに結
合する場合のみに起こることを証明した。特に興味を惹
くのは、外的に加えられたＤＦＰ−不活性u−ＰＡが内
因性レセプター結合u−ＰＡと置換することが出来、そ
れによってプラスミノーゲン活性化を阻止する事実の発
見であり、これは本研究の治療的応用のための前提要件
である。
【００３０】
【発明が解決しようとする課題】発明の要約 本発明は、u−ＰＡレセプターに対するモノクローナル
抗体とポリクローナル抗体に関する、インタクトな生物
において細胞外的に存在する場合と類似した条件下(す
なわち、プラスミン阻害物質およびプラスミノーゲン活
性化因子を含む血清の存在下)、内在性u−ＰＡにより開
始されるプラスミノーゲン活性化は事実上u−ＰＡがレ
セプター結合している場合にのみ行なわれる。この発見
に基づいて、新規で、潜在的に非常に貴重な治療および
診断方法および生成物が、これらの抗体により提供され
る。
【００３１】
【課題を解決するための手段】u−ＰＡがそのレセプタ
ーへ結合すると、プロ−u−ＰＡとu−ＰＡは細胞表面に
位置するだけでなく、少なくともある種の細胞タイプに
おいてはそれらを細胞-細胞および細胞-基質接触部位で
ある表面の異なった部分へ集中させる。焦点接触部位に
おけるプロ−u−ＰＡとu−ＰＡの存在は、u−ＰＡ触媒
プラスミノーゲン活性化が、例えば細胞移動中における
接触部位の分解に含まれていることを示す。これらの部
位におけるプロ−u−ＰＡの選択的活性化は、指向性細
胞周囲蛋白質分解を達成する手段を提供する。プロ−u
−ＰＡ活性化は、細胞内で開始され、u−ＰＡレセプタ
ーを通って経膜的シグナルにより伝達され得る。
【００３２】ヒト腫よう細胞は、ごく一般的にウロキナ
ーゼ型のプラスミノーゲン活性化因子(u−ＰＡ)を分泌
することが見出されている。この意味によると、それら
は、血清および他の体液中高濃度のプラスミノーゲンに
おいて利用可能な蛋白質分解能を増強させることができ
る。腫よう細胞の侵襲特性は、少なくとも部分的にはプ
ラスミンの広スペクトルの活性により伝達され、他の潜
在プロテアーゼ、例えばコラゲナーゼの活性化における
間接的作用を含むそれらの蛋白質分解能に左右され得
る。腫よう細胞によりプロテアーゼ活性が発現される
と、基底膜、毛管壁および間質結合組織への貫通が容易
になることにより、他の部位へ拡散し、転移が確立され
る。
【００３３】細胞移動に連動した細胞周囲蛋白質分解の
段階的経路は予見され得る。細胞表面へのu−ＰＡおよ
びプラスミノーゲンの結合により、細胞外蛋白質分解お
よび細胞-細胞および細胞-培養基盤結合の局所切断が誘
導される。従って、細胞のこの領域は自由に移動し、こ
れはＰＡＩ-１が存在する領域へu−ＰＡを転移させる。
ＰＡＩ−１はu−ＰＡを不活化し、局所蛋白質分解活性
の非存在下、細胞はマトリックスと新たな結合を形成す
る。これは、さらに移動するのに要求されるプロセスで
ある。
【００３４】u−ＰＡおよびu−ＰＡＲの相互作用につい
てさらに特性確認するため、u−ＰＡＲの精製が必要で
あった。単核白血球様細胞Ｕ９３７により産生されるu
−ＰＡＲの数は、ホルボールエステル、例えばＰＭＡに
より数倍に増加し得る。この事実を用いて、充分な量の
精製用レセプターを製造した。実施例１では、細胞から
のデタージェント抽出物の温度誘導相分離および固定Ｄ
ＦＰ不活化u−ＰＡによるアフィニティー・クロマトグ
ラフィーを含め、u−ＰＡレセプターの完全な精製方法
が記載されている。この結果、負荷がレセプター約１μ
gである、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色後に約５５−
６０kＤで一つのバンドを示す製品が得られた。
【００３５】精製蛋白質は化学的にu−ＰＡと交差結合
し得る。そのアミノ酸組成およびＮ−末端配列が決定さ
れた(３０残基、それらのうちある程度不確かなものも
ある)。それは重度にＮ−グリコシル化されていること
が見出され、脱グリコシル化の結果、約３０−３５kＤ
の見かけ上の分子量を有する蛋白質が生じた。異なるセ
ルラインおよびＰＭＡ−刺激および非刺激Ｕ９３７細胞
由来のu−ＰＡＲの見かけ上の分子量は幾分変化した。
この不均一性は脱グリコシル化後に消失したため、様々
な供給源から得られたu−ＰＡＲのグリコシル化におけ
る差異によるものであった。
【００３６】
【発明の実施の形態】同じレセプターの幾つかの変異体
の存在は、ほ乳類細胞ではむしろ一般的であると思われ
る。実施例１で立証されたu−ＰＡＲ分子の変調は、細
胞移動および侵襲性の中心にあるプロセスである、細胞
外蛋白質分解の調節、すなわち細胞外マトリックスおよ
び基底膜成分の分解における重要な特徴を表し得る。相
異なる細胞タイプが、u−ＰＡＲの蛋白質部分が異なる
方法でグリコシル化されている相異なる種類のレセプタ
ーを有する場合、局在した蛋白質分解活性の阻害に必要
とされる細胞タイプを区別することが可能であり、それ
は、癌細胞が、正常細胞のu−ＰＡＲのグリコシル化と
はかなり異なる方法でグリコシル化されたu−ＰＡＲを
産生するときに特に貴重であり、例えばu−ＰＡＲ抗体
により区別され得る。
【００３７】実施例２では、u−ＰＡＲのリガンド結合
ドメインの単離が同定および特性検定された。これは、
リガンド結合を阻止し得るペプチドに関する潜在的に治
療上貴重な情報を提供する。
【００３８】推定アミノ酸配列は、u−ＰＡＲが、２８
２残基長親水性Ｎ末端部分(恐らくは細胞外)、次いで２
１個のかなり疎水性のアミノ酸(恐らくは経膜的ドメイ
ン)を伴う３１３残基長蛋白質として生成されることを
示した。潜在的細胞外部分は、特にシステインのパター
ンに関して著しい相同性を有する３反復単位で組織され
る。これは、異なるリガンドに結合し得る別個のドメイ
ンの存在を示し得る。
【００３９】精製u−ＰＡＲについての研究により、u−
ＰＡＲが少なくとも場合によっては、末端プロセッシン
グされ、糖脂質アンカーにより細胞表面に固定されるこ
と、および表面位置は、ホスホリピダーゼＡ２およびＤ
によってではなく、ホスホリピダーゼＰＩ−ＰＬＣによ
り調節され得ることが認識され得た(実施例３)。さら
に、処置されなかった細胞からの採取流体もまたある程
度遊離u−ＰＡＲを含むことが見出され、このことは、
内在性ホスホリピダーゼにより仲介され得る細胞からの
放出を示した。これは生理学的機構であり得、例えば血
清中における遊離レセプターの測定結果が何等かの病的
プロセスの診断上貴重な指標であり得る可能性がある。
【００４０】実施例４には、u−ＰＡＲに対するポリク
ローナルマウスとウサギ抗体の産生およびレセプターに
対する４つのモノクローナルマウス抗体の産生が記載さ
れている。
【００４１】ポリクローナル抗体は、１２５Ｉ−標識精
製u−ＰＡＲを、1：7,500に希釈した抗血清により達成
される有意沈殿により、用量依存的に沈殿させた。逆相
ラジオイムノアッセイにおいて、抗血清は放射標識u−
ＰＡＲを免疫補足することが見いだされ、ＥＬＩＳＡに
おいて固定化u−ＰＡＲは１ngの量において1：8,000に
希釈された免疫血清で検出された。ウエスターンブロッ
ティングにより、抗体は精製u−ＰＡＲと、ＰＭＡ処理
Ｕ９３７細胞の抽出物の粗洗剤相中のu−ＰＡＲを検出
した。後者の場合において、u−ＰＡＲとは異なる電気
泳動移動性を持った蛋白質との反応は検出されず、抗体
の特異性が高いことを示した。u−ＰＡＲに対するポリ
クローナル抗体は特異的にリガンド結合を妨げるのに使
用することができる。さらに、ポリクローナルu−ＰＡ
Ｒ抗体はu−ＰＡ触媒細胞表面プラスミノーゲン活性化
を阻止することが認められる。
【００４２】モノクローナル抗体は、固定化精製u−Ｐ
ＡＲによるスクリーニングＥＬＩＳＡ、ホスホリパーゼ
可溶化u−ＰＡＲによるウエスターンブロッティング試
験、元の細胞に対する１２５Ｉ−ＡＴＦ（u−ＰＡのア
ミノ末端断片）の結合の阻止およびu−ＰＡＲｍＲＮＡ
に対して陽性の組織部分における細胞を染色する能力を
含む各種の方法によって選択された。安定してＥＬＩＳ
Ａ陽性を示すハイブリドーマ培養株２４株のうち４株を
クローニングのために選択した。４株の各々から誘導し
た１つのクローン化ハイブリドーマ培養株を選択し、以
後の研究に使用した。
【００４３】これら４つのハイブリドーマからの精製モ
ノクローナル抗体を、元の精製u−ＰＡＲおよびキモト
リプシンにより分解したu−ＰＡＲを免疫沈殿させてＭ
ｒ１６ｋＤu−ＰＡ結合ドメインおよびＭｒ３５−４５
ｋＤnon-u−ＰＡ結合断片を産生する能力によって特徴
づけた。また、細胞抽出物中におけるu−ＰＡＲとその
グリコシル化変種を染色する能力はウエスターンブロッ
ティング試験によって評価された。
【００４４】これらの研究により、前記４つの抗体はu
−ＰＡＲ中の４つの異なったエピトープを認識するもの
と結論された。１つ（３Ｒと称する）はu−ＰＡＲのu−
ＰＡ結合ドメイン中のエピトープに対するものであり、
他の３つ（１Ｒ、２Ｒ、４Ｒと称する）はu−ＰＡＲのn
on-結合部に対するものである。
【００４５】抗体は二重抗体サンドイッチ型ＥＬＩＳＡ
Ｓ、たとえばモノクローナル抗体のうちの１種（４Ｒ）
を捕捉抗体として使用し、ビオチン化されている他の１
種の抗体（２Ｒ）を検出抗体として使用するＥＬＩＳＡ
におけるu−ＰＡＲを定量するのに使用できることが証
明された。他の例においては、u−ＰＡＲに対するポリ
クローナルウサギ抗体が捕捉抗体として用いられ、ビオ
チン化モノクローナル抗体（２Ｒ）が検出抗体として用
いられた。
【００４６】さらに、抗体はu−ＰＡ／u−ＰＡＲ相互反
応、細胞表面プラスミン発生およびヌードマウスのサブ
ストレイン中へ接触されたヒト癌細胞の侵襲と移転を阻
止する物質を同定するための医薬スクリーニング計画に
おいて使用できることが証明された。
【００４７】本発明の抗体は商業的に入手し得る試薬と
共に以下の選択的定量の手段を提供するものである： １）u−ＰＡＲ(それがu−ＰＡとコンプレックス化して
いると否とを問わず) ２）u−ＰＡＲとu−ＰＡのコンプレックス ３）u−ＰＡとコンプレックス化していないu−ＰＡＲ
（遊離u−ＰＡＲ） ４）u−ＰＡＲのグリコシル化変種
【００４８】それぞれu−ＰＡＲ中のu−ＰＡ結合ドメイ
ンとu−ＰＡＲのnon-u−ＰＡ結合部に対して特異的なモ
ノクローナル抗体の製造法を以下に記載する；このよう
な抗体はその異なった状態においてu−ＰＡＲを定量す
るのに有用である。
【００４９】実施例７においてはモノクローナル抗体の
１つ（３Ｒ）が細胞表面プラスミノーゲン活性化を強く
阻止するが、この活性化は他の３つの抗体によっては影
響を受けないかまたは影響を受けても僅かである。モノ
クローナル抗体３ＲはまたＵ９３７細胞表面における放
射標識ＤＦＰ処理u−ＰＡの結合を効果的に阻止する一
方、２Ｒや４Ｒによっては阻止が認められず、１Ｒでは
僅かな阻止が認められるに止まった。さらに、マウスＩ
ｇＧに対するＦＩＴＣ標識抗体を使用するフローサイト
メトリーによる抗体３Ｒ、４Ｒはヒト単球に効果的に結
合することが見いだされた。４Ｒ抗体の結合は単球のu
−ＰＡによる前処理によって影響されないが、３Ｒ抗体
の結合はu−ＰＡによる前処理によって完全に阻止され
る。
【００５０】実施例８においては、免疫組織化学的研究
においてモノクローナル抗体の２つ（２Ｒと４Ｒ）は細
胞の同じサブポピュレーションを染色するものであっ
て、このサブポピュレーションはハイブリダイゼーショ
ンによって証明されるように、u−ＰＡＲに対するｍＲ
ＮＡを含むことによって特性化される。
【００５１】先の発見に基づいて、u−ＰＡのレセプタ
ー結合の阻止は、局在した蛋白質分解活性の治療的阻止
に関したその生理学的機能の幾つか、例えば癌細胞の侵
襲性および転移、炎症性腸疾患、前癌状態の結腸腺腫、
敗血性関節炎、骨関節炎、リューマチ様関節炎(過剰u−
ＰＡ生産の直接関与が立証されている)、オステオポロ
ーシス、コレステリン腫よう並びに過剰のプラスミノー
ゲン活性化が病因であることが示された若干の皮膚およ
び角膜疾患、例えば角膜潰よう、角膜炎、表皮水ほう
症、乾せんおよび天ぼうそうを阻害する手段であると結
論された。u−ＰＡレセプターは幾つかの血液細胞（好
中性顆粒球および単球）や内皮細胞に存在するため、そ
れらの調節はまた、生理学的、病理学的および薬理学的
状態における血管内線維溶解活性に重要な影響を与え得
る。上述の疾患は、細胞表面プラスミノーゲン活性化を
遮断または低減化する物質の投与に基づく治療にとって
第一の明確な標的となる。受精卵の着床におけるu−Ｐ
Ａの役割故に、レセプター結合を阻害する手段から避妊
効果が期待される。治療および予防は、例えば下記で説
明されている、レセプター結合プラスミノーゲン活性化
因子活性を遮断または低減化する薬剤による全身的また
は局所的処置を含む。
【００５２】ほ乳類、特にヒトにおける局在した蛋白質
分解活性の阻止または打ち消し方法であって、ほ乳類に
おいてu−ＰＡレセプター(u−ＰＡＲ)へのu−ＰＡの結
合を妨害し、それによってu−ＰＡによるプラスミノー
ゲンからプラスミンへの変化を阻止することによるプラ
スミノーゲンからプラスミンへの活性化を阻止する方
法。
【００５３】請求の範囲を含む本明細書において、「局
在した蛋白質分解活性」という語は、実質的に体内のあ
らゆる場所で作用する全体的蛋白質分解活性とは反対
に、人体の一つまたは幾つかの別個の領域または別個の
細胞に位置する蛋白質分解活性を指すものとする。局在
した蛋白質分解活性は、ほ乳類、特にヒトでは広範に、
または局所的に阻害され得る。「阻止または打ち消す」と
いう語は、u−ＰＡＲへのu−ＰＡの結合が完全に阻止さ
れている状況、または結合が充分に阻害されていること
によりプラスミノーゲン活性化因子の望ましくない作用
が阻止される状況を指すものとする。
【００５４】「u−ＰＡＲ」という語の使用は、ある種類
におけるu−ＰＡＲのポリペプチド部分が全u−ＰＡＲに
ついて同じであり得ても、例えばu−ＰＡＲの炭水化物
部分または表面結合機構が異なり得るため、複数のu−
ＰＡＲが存在することを示す。非病的細胞のu−ＰＡＲ
ｓへのu−ＰＡの結合に影響を及ぼすことなく癌細胞に
存在するu−ＰＡＲへのu−ＰＡの結合を遮断する（例え
ば癌細胞上のレセプター変種に対して特異的モノクロー
ナル抗体を使用することによる）か、またはu−ＰＡＲ
を発現する癌細胞を特異的に殺す（例えば癌細胞上のレ
セプター変種に特異的なモノクローナル抗体に結合した
毒性物質の投与による）ことは可能であり得るため、あ
る種の細胞、例えば癌細胞が、重要な治療的意義を有し
得る実質的に異なるu−ＰＡＲを有することさえ同様に
あり得る。
【００５５】酵素ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性
化因子(u−ＰＡ)は、唯一の充分に規定された巨大分子
基質、すなわちプラスミノーゲンを有する。Ａrg５６０
での開裂により、プラスミノーゲンは、広スペクトルの
プロテアーゼ・プラスミンに活性化される。従って、「u
−ＰＡがプラスミノーゲンからプラスミンへの変換する
のを阻止する」という語は、u−ＰＡによるこの活性化が
実質的に阻害されること、または活性化が充分に阻害さ
れることによりプラスミンの望ましくない作用を阻止ま
たは低減化し得る状況を意味する。
【００５６】u−ＰＡＲへのu−ＰＡのレセプター結合形
態の結合の阻止は、例えば、好適には本発明の３Ｒ抗体
のようにu−ＰＡＲへ結合するモノクローナル抗体をほ
乳類へ投与することにより、u−ＰＡのレセプター結合
形態が通常結合するレセプターの部位を占領することに
よってu−ＰＡＲを遮断することにより行なわれ、上記
モノクローナル抗体は、レセプターに対するu−ＰＡの
レセプター結合形態の結合を低減化するのに有効な量で
投与される。「u−ＰＡＲへの結合によりu−ＰＡのレセ
プター結合形態が通常結合するレセプターの部位を占領
する」という語は、抗体がu−ＰＡＲへ結合する結果、u
−ＰＡのレセプター結合形態がu−ＰＡＲへ結合され得
ないことを意味するものとする。
【００５７】上記したように、u−ＰＡＲへのu−ＰＡの
レセプター結合形態の結合を阻止することによって細胞
表面プラスミノーゲン活性化を阻止する非常に興味深い
方法は、u−ＰＡＲに対する抗体の使用である。抗体はu
−ＰＡＲの非炭水化物部分と反応するモノクローナル抗
体であり得るか、またはそれはu−ＰＡＲの炭水化物部
分と反応するモノクローナル抗体であり得、後者は、u
−ＰＡＲの独特の変異体を発現する細胞が望ましくない
蛋白質分解に関与する細胞である標的細胞間の貴重な区
別を可能にし得る。抗体は、下記の様々な方法で投与さ
れ得る。
【００５８】疾患の中には、u−ＰＡＲの量減少または
機能障害に関連したものもあると思われる。これらは、
創傷治癒障害の症例および同じく血栓塞栓疾患の症例を
含み得る。ある条件下での血栓溶解におけるu−ＰＡ(従
って、恐らく同じくu−ＰＡＲ)の役割は、急性炎症中お
よび癌においてu−ＰＡが内皮細胞に存在するという本
発明発明者による発見により示唆されている。正常条件
下では、内皮細胞は、u−ＰＡではなくt−ＰＡを含む。
さらに興味深いのは、激発性夜間ヘモグロビン尿症とい
う疾患がグリセリン-ホスホイノシトール・アンカーの
形成能力の障害とu−ＰＡＲのアンカリングの低減に関
連していることである。なお、この疾患は血栓塞栓疾患
を伴うことが多い(セルバラージ等、１９８８およびそ
こに引用された参考文献参照)。
【００５９】u−ＰＡＲの細胞外部分がかなりの相互相
同性を伴う３反復単位により構成されるという発見(実
施例２)から、それが相異なるリガンドに結合し得る、
すなわち、立証されたu−ＰＡの結合に加えて、それが
他のリガンドとも結合し得ることが予想される。強い増
強効果が細胞表面に対するｐｒｏ−u−ＰＡおよびプラ
スミノーゲンの同時結合により得られるため、当然、こ
れらの中にはまだ未知のプラスミノーゲン・レセプター
またはプラスミノーゲン結合部位を含み得るものもある
ことが仮定される。u−ＰＡＲの細胞−細胞および細胞
−基質結合部位への焦点集中およびu−ＰＡＲの幾らか
の移動細胞の導入端への極在化もまた、u−ＰＡＲとu−
ＰＡ以外の分子の間の相互反応を示す。u−ＰＡＲに関
する他の潜在的代替的リガンドは、また種々のインテグ
リンのような細胞-細胞および焦点細胞-培養基質接触部
位に位置する蛋白質であってもよい。上記リガンドの結
合を阻害するu−ＰＡＲに対する抗体は、細胞表面プラ
スミノーゲン活性化の阻害において貴重であり得、上記
代替リガンドへのu−ＰＡＲの結合の阻止は、広範囲の
疾患において機能的に重要かつ治療上貴重であり得る。
【００６０】u−ＰＡＲは、様々な形態、例えば実施例
１記載のグリコシル化変異体、実施例３記載の発見によ
り示唆されているリパーゼＰＩ−ＰＬＣに対して異なる
感受性を示す変異体で存在する。u−ＰＡＲ機能の増加
を伴う幾つかの疾患において、これらの或る種の形態は
優先的に変化する。或る種の明確な形態に選択的に向け
られたモノクローナル抗体は、それ故上記疾患において
特に治療上貴重であり得る。
【００６１】ほ乳類、好ましくはヒトに対する種々の抗
体の投与は、抗体の投与に適した投与方法により遂行さ
れ得る。局所投与は、抗体またはその誘導体を膏薬、軟
膏、ローション、クリーム等に製剤化することにより行
なわれ得る。
【００６２】本発明の医薬組成物は、例えばヒトモノク
ローナル抗体またはその誘導体を含んでよい。
【００６３】上述の状態および疾患の処置に関する別の
ストラテジーは、薬剤により表面上にu−ＰＡＲを含む
細胞を標的とすることであり、ポリクローナルまたはモ
ノクローナル抗体のようなu−ＰＡＲに対する抗体へ結
合させた薬剤の投与を含む。上記抗体の例として、特に
癌細胞タイプに存在するu−ＰＡＲの変異体を特に指向
した抗体が挙げられる。
【００６４】薬剤は、典型的には抗癌剤、例えばアルキ
ル化剤、例えばメルファラン、クロラムブシル、ブスル
ファン、シスプラチン、チオテーパ、代謝きっ抗物質、
例えばメトトレキセート、フルラシル、アザチオプリ
ン、細胞分裂阻止物質、代表的にはビンクリスチン、ビ
ンブラスチン、または抗生物質、例えばドクソルビシ
ン、ダウノルビシンまたはブレオマイシンであり得る。
薬剤はまた細菌性または他の毒素を含み得る。
【００６５】特に興味を惹く抗体は、u−ＰＡＲの種々
の形を区別する抗体である。抗体に基づく診断キット、
材料および方法の詳細な記載は以下に述べるとおりであ
る。
【００６６】本発明の一態様は、純粋なu−ＰＡＲの製
造方法であって、u−ＰＡＲ含有材料をu−ＰＡＲに対す
る固定化された本発明のモノクローナル抗体によるアフ
ィニティー・クロマトグラフィーに付し、例えば酸性条
件下でu−ＰＡＲを溶離することを含む方法に関するも
のである。
【００６７】この明細書で使用されている「類縁体」とい
う語は、類縁体の免疫原性に対して副作用を示さないさ
さいな変形が行なわれ得る、u−ＰＡＲから誘導された
特有のアミノ酸配列と類似したアミノ酸組成または配列
を有する蛋白質またはポリペプチドを示す。類似ポリペ
プチドまたは蛋白質は、ほ乳類から誘導され得るか、ま
たは部分的または完全に合成され得る。
【００６８】本発明のモノクローナル抗体は、また高収
率と純度でu−ＰＡＲ含有フラクションを得るために使
用することができる。その方法は、特異モノクローナル
抗体をマトリックスに固定化させ、当該マトリックスを
遊離u−ＰＡＲ化合物を含む製品と接触させ、洗浄し、
最後にマトリックスに固定化された抗原抗体錯体を処理
して、u−ＰＡＲ化合物を精製形で遊離させるものであ
る。好ましい方法は、カラムマトリックスに固定化させ
た抗体を使用するカラムアフィニティークロマトグラフ
ィーによりu−ＰＡＲを単離させるものである。
【００６９】本明細書に関連して、「抗体」という語は、
本発明ポリペプチドへの暴露に対する応答として脊椎動
物またはより正確には脊椎動物起源の免疫系に属する細
胞により産生される物質を指す。
【００７０】抗体の変異ドメインは可変および定常配列
により構成される。ドメインの変異部分は抗体のイディ
オタイプと呼ばれる。抗体のこの部分は抗原との相互作
用、抗原結合に関与する。
【００７１】イディオタイプ構造は抗原性であるため、
イディオタイプ構造を指向した特異抗体に対して生じ得
る。これはマウスで行なわれた。イディオタイプに対し
て生じた抗体、抗イディオタイプ抗体は、もとの抗原の
構造を模倣し得るため、もとの抗原として機能すること
により、もとの抗原と反応する抗体を生じ得る。この方
法は、問題の蛋白質の重要な免疫原性部分の特性検定お
よび合成と関連した問題をめぐるものであるため、有利
であり得る。これは立体配座エピトープの場合に最も重
要であり、他の方法であれば同定が困難であり得る。そ
れは、防御免疫性がこの方法で誘導され得る若干の生物
について示された(例、トリパノソーマ・デュルゼイ、
トリパノソーマ・ブルセイ、Ｂ型肝炎ウイルスおよびプ
ラスモディウム・ノウレシ)。
【００７２】本発明の抗体は、免疫原形態で本発明ポリ
ペプチドの少なくとも天然または合成部分を投与するこ
とにより、前記ポリペプチドと反応する抗体産生細胞を
得、生物または細胞から抗体含有物質を単離することを
含む方法により製造され得る。本発明抗体の製造方法に
ついては後で詳述する。
【００７３】上記抗体は、好ましくは単一特異的抗体で
ある。単一特異的抗体は、適当な動物へ本発明ポリペプ
チドの実質的に純粋な製品を注射し、初回採血前の４ま
たは５か月まで適当な間隔(例、１または２週間ないし
１箇月)で１回またはそれ以上のブースター注射をする
ことにより生成され得る。確立された免疫化スケジュー
ルを続行し、各ブースター免疫化の約１週間後動物から
採血し、抗体を適当な方法で血清から単離する(例、ハ
ーボーおよびインギルド、Ｓcand．Ｊ．Ｉmmun．２(補
遺１)、１９７３、１６１−１６４頁参照)。
【００７４】高い検定特異性を要求しないのであれば、
抗体はポリクローナル抗体であり得る。ポリクローナル
抗体は、例えばハーボーおよびインギルドの記載(上記
参照)に従い得られる。さらに具体的には、ポリクロー
ナル抗体を得る予定の場合、好ましくは適当なアジュバ
ント、例えばフロインド不完全または完全アジュバント
を加えた後、u−ＰＡＲ化合物製品を動物に注射する。
免疫原がヒトu−ＰＡＲ化合物である場合、動物はウサ
ギであり得る。動物を定期的、例えば１週間間隔で採血
し、得られた血液を抗体含有血清フラクションに分離
し、所望ならば前記フラクションをさらに別の慣用的抗
体精製方法、および／または精製u−ＰＡＲ化合物の使
用を含む方法に付す。
【００７５】別の好ましい態様では、モノクローナル抗
体が得られる。モノクローナル抗体は、u−ＰＡＲ化合
物の必須成分、すなわちエピトープに対してまたは実質
的にそれを指向して産生され得る。モノクローナル抗体
は、慣用的技術(例、ケーラーおよびミルスタインによ
る「ネイチャー」、２５６、１９７５、４９５頁記載)に
より、例えばハイブリドーマ・セルラインの使用によ
り、またはクローンもしくはそのサブクローンまたは前
記モノクローナル抗体コードするハイブリドーマ・セル
ラインからの遺伝情報をもつ細胞により製造され得る。
モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生する
細胞を適当なセルラインの細胞と融合し、生成した前記
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選
抜およびクローニングすることにより製造され得る。別
法として、モノクローナル抗体は、前記モノクローナル
抗体を産生する非融合細胞を不死化し、続いて細胞を適
当な培地で生長させて前記抗体を産生させ、生長培地か
らモノクローナル抗体を採取することにより製造され得
る。
【００７６】本発明の抗体の製造に使用される免疫化動
物は、好ましくはウサギ、サル、ヒツジ、ヤギ、マウ
ス、ラット、ブタ、ウマおよびモルモットから成る群か
ら選択される。本発明の抗体を産生する細胞は、ひ臓細
胞またはリンパ細胞、例えば末梢リンパ球であり得る。
【００７７】本発明の抗体の製造においてハイブリドー
マ細胞を使用する場合、これらはインビトロまたは動物
の体腔で生育され得る。抗体産生細胞を動物、例えばマ
ウスに注射すると、動物の腹水中で高濃度の抗体を放出
する腹水腫ようが形成される。動物は同じく正常抗体を
産生するが、これらは、標準的精製方法、例えば遠心分
離、ろ過、沈澱、クロマトグラフィーまたはそれらの組
み合わせにより腹水から精製され得るモノクローナル抗
体の僅かなパーセンテージに達するにすぎない。
【００７８】モノクローナル抗体が製造され得る適当な
方法の一例は、結果として常套技術(例、Ｒ．ダルチャ
ウ、Ｊ．キルクレイ、Ｊ.Ｗ．ファーブルによる「モノク
ローナル・アンティボディー・トゥ・ア・ヒューマン・
ロイコサイト-スペシフィック・メンブラン・グリコプ
ロテイン・プロバブリイ・ホモロガス・トゥ・ザ・ロイ
コサイト-コモン(Ｌ−Ｃ)アンティゲン・オブ・ザ・ラ
ット」、「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロ
ジー」、１０、１９８０、７３７−７４４頁に記載)を用
いた免疫化マウス(例、Ｂalb／cマウス)からのひ臓細胞
とミエローマ細胞を融合する方法である。得られた融合
体を慣用的技術、例えば上記方法で単離されたu−ＰＡ
Ｒ化合物を用いる結合検定によりスクリーニングする。
【００７９】別の態様において、本発明は、試料中のu
−ＰＡＲまたはその誘導体を検出および／または定量し
得る、本発明の抗体を含む診断剤に関するものである。
【００８０】上記検討によると、本発明の抗体は、癌お
よび組織侵入および組織改造を伴う他の疾患のプロセス
におけるu−ＰＡＲの関与を考慮すると、これらの診断
に貴重であり得る。u−ＰＡＲ mＲＮＡタンパクが結腸
癌、管状乳癌、鱗状皮膚癌を含む種々の異なった癌種に
おいて、侵入正面に位置する細胞中に一貫して見出され
るという発見は、この考えを強く支持している。この考
えをさらに支持するものは、これらのすべての場合にお
いて、u−ＰＡ mＲＮＡおよび／またはタンパクがu−Ｐ
ＡＲ含有細胞またはu−ＰＡＲ含有細胞に隣接する細胞
によって生産されるという発見である。これに関連し
て、胸部癌患者からの血清が正常個体と比べて高濃度の
u−ＰＡを有すること(グレンダール-ハンセン等、１９
８８)、および胸部癌組織におけるu−ＰＡ含有量は、例
えば本出願の優先権年度に公開されたようにこの疾患に
おける貴重な予後マーカーであることが示されたこと
(ヤーニッケ等、１９８９、１９９０)も興味深い。u−
ＰＡＲの存在がu−ＰＡ機能にとって前提条件であると
いう事実により、癌組織におけるu−ＰＡＥ含有量はい
っそう優れた診断的および予後マーカーであると考えら
れる。u−ＰＡＲ測定結果の潜在的な診断および予後用
途の新しい態様は、外来的に加えられるホスホリパーゼ
の非存在下でさえ生ずる培養細胞からのu−ＰＡＲの放
出である(実施例３に記載)。この発見により、u−ＰＡ
Ｒもまた何等かの生理学的および異常生理学的条件下お
よび特に癌において体液中へ放出されるという可能性が
生じる。従って、体液、例えば血清、尿および腹水中に
おけるu−ＰＡＲまたはその分解生成物の濃度の測定
は、診断的および／または予後的に貴重であることが証
明され得る。
【００８１】大部分の検定用途の場合、抗体に結合抗体
検出用の標識を付すのが好ましく、または別法では(例
えば二重抗体検定において)、標識および非標識抗体の
組み合わせが使用され得る。標識として使用される物質
は、それ自体検出可能であるかまたは別の物質と反応し
て検出可能な生成物を生じ得るあらゆる物質から選択さ
れ得る。すなわち、標識は、放射性同位元素、酵素、発
色団、蛍光性または化学発光性物質および複合体形成剤
から選択され得る。
【００８２】標識として有用な酵素の例は、β−ガラク
トシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、炭
酸脱水酵素、ペルオキシダーゼ(例、西洋わさびペルオ
キシダーゼ)、ホスファターゼ(例、アルカリ性または酸
性ホスファターゼ)、グルコース−６−燐酸デヒドロゲ
ナーゼおよびリボヌクレアーゼである。
【００８３】酵素はそれ自体では検出不可能であるが、
検出可能な最終生成物が得られる反応を触媒するために
は基質と組み合わせなければならない。すなわち、基質
を反応混合物に加えることにより、着色した蛍光性また
は化学発光性生成物または色の変化または色、蛍光また
は化学発光の強度の変化が得られる。上述の酵素に対す
る基質として本方法で有用な基質の例は、Ｈ２Ｏ２、p
−ニトロフェニルホスフェート、乳糖、尿素、β−Ｄ−
グルコース、ＣＯ２、ＲＮＡ、澱粉またはマレエートで
ある。基質は、例えば供与体または受容体である発色団
と組み合わされ得る。
【００８４】本発明方法により使用される成分検出用標
識として使用され得る蛍光性物質は、４−メチルアンベ
リフェリル−ホスフェート、４−メチルアンベリフェリ
ル−Ｄ−ガラクトピラノシドおよび３−(p−ヒドロキシ
フェニル)プロピオン酸であり得る。これらの物質は、
蛍光分光光度計により検出され得る。化学発光性物質
は、ペルオキシダーゼ／エオシン／ＥＤＴＡ、イソルミ
ノール／ＥＤＴＡ／Ｈ２Ｏ２およびそれらの基質であり
得る。
【００８５】発光団は、o−フェニレンジアミンまたは
類似化合物であり得る。これらの物質は分光光度計によ
り検出され得る。放射性同位元素は、検出可能かつ研究
室で許容され得る同位元素、例えば１２５Ｉ、
１３１Ｉ、３Ｈ、３５Ｐ、３５Ｓまたは１４Ｃであり得
る。放射能は、γ−計数管もしくはシンチレーション計
数管またはラジオオートグラフィー、次いでデンシトメ
ーター手段により測定され得る。
【００８６】複合体形成剤は、プロテインＡ、プロテイ
ンＧ(免疫グロブリンと複合体を形成する)、ビオチン
(アビジンおよびストレプトアビジンと複合体を形成す
る)およびレクチン(炭水化物決定基、例えばレセプター
と複合体を形成する)であり得る。この場合、複合体は
それ自体直接には検出され得ず、複合体形成剤が複合体
を形成する物質の標識を必要とする。標識付けは、上記
標識性物質のいずれかにより行なわれ得る。
【００８７】本発明の実施態様において、本発明の抗体
は、固体支持体に結合させた架橋性化合物と結合され得
る。固体支持体および抗体を結合させるべく設計された
架橋性化合物は、ヒドラジド、プロテインＡ、グルタル
アルデヒド、カルボジイミドまたはリジンであり得る。
【００８８】使用される固体支持体は例えばポリマーで
あり、それはポリマー被覆されたマトリックスであり得
る。マトリックスは、適当な固体材料、例えばガラス、
紙またはプラスチック製であり得る。ポリマーは、可塑
性セルロース、例えば特殊処理紙、ニトロセルロース紙
または臭化シアン-活性化紙であり得る。適当なプラス
チック製品の例は、ラテックス、ポリスチレン、ポリビ
ニルクロリド、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポ
リビニルアセテートおよびそれらの適当なコポリマーで
ある。シリコーンポリマーの例にはシロキサンがある。
【００８９】固体支持体は、トレイ、プレート、例えば
マイクロタイタープレート、例えば薄層または、好まし
くはストリップ、フィルム、糸、固体粒子、例えばビー
ズ、例えばプロテインＡ被覆細菌または紙の形態であり
得る。
【００９０】本発明の抗体は、試料中に存在するポリペ
プチドの少なくとも一形態および／または一部分の同定
および／または定量を目的とする検定で使用され得る。
本発明用途により遂行される同定および／または定量
は、u−ＰＡＲ化合物またはu−ＰＡＲ化合物の一形態を
伴う同定および／または定量であり得る。すなわち、u
−ＰＡＲ化合物の定性的および定量的測定は、両方とも
本発明の使用により達成され得る。同定および／または
定量は、ともに科学的、臨床的および産業的目的で実施
され得る。下記でさらに詳述されている通り、u−ＰＡ
Ｒ化合物の同定または定量は、臨床的常法において特に
重要である。
【００９１】試料は、生きている生物体、例えばヒトま
たは動物から得られた標本であり得る。標本は、血液、
例えば赤血球濃厚分画、または例えば肝細胞を含む組織
試料であり得る。本発明の非常に興味深い実施態様で
は、標本は尿である。
【００９２】本発明の好ましい一実施態様では、本発明
方法で使用される抗体は、一般に検定のより高い精度お
よび正確さが達成されると同時に恐らくは実施時間も少
なくてすむと考えられることから、モノクローナル抗体
であるのが好ましい。さらに、試験の検出限界および感
度を高め得ることから、２種またはそれ以上のモノクロ
ーナル抗体から成る混合物が使用され得る。モノクロー
ナル抗体は下記方法により得られる。高い総合活性を有
する抗体は、捕獲技術に関して選択され得る。
【００９３】本方法で使用される抗体は、本発明の検定
の精度および／または正確さを改良するために、好まし
くは実質的に純粋な形態(適当な技術または本発明方法
により精製、下記参照)である。
【００９４】本発明の一面は、ここに説明するように、
ｕ−ＰＡＲと反応し、それによってｐｒｏ−ｕ−ＰＡと
活性ｕ−ＰＡの結合及び細胞表面プラスミノーゲン活性
化を阻止するモノクローナル抗体に関する。
【００９５】これらの性質を持ったモノクローナル抗体
は、以下に説明するように、数多くの診断的及び治療的
用途において有用である。
【００９６】ｕ−ＰＡＲと反応し、それによってｐｒｏ
−ｕ−ＰＡと活性ｕ−ＰＡとの結合並びに細胞表面プラ
スミノーゲン活性化を阻止する、モノクロナール抗体３
Ｒを生産するハイブリドーマクローンは、ブダペスト条
約の条件に従って、ヨーロピアン・コレクション・オブ
・アニマル・セル・カルチュアズに仮寄託番号90101009
号として寄託されている。
【００９７】このクローンとそれによって生産されたモ
ノクロナール抗体は本発明のこの面における実施態様を
構成するものであるが、この面は明らかに当該モノクロ
ナール抗体に対する機能的均等物、すなわちｕ−ＰＡＲ
と反応し、それによってｐｒｏ−ｕ−ＰＡと活性ｕ−Ｐ
Ａとの結合並びに細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻
止するいかなるモノクロナール抗体にも及ぶものであ
る。すなわち、本発明のこの面によるモノクロナール抗
体は、クローン90101009号によって生産されたモノクロ
ナール抗体３Ｒの機能的均等物であるモノクロナール抗
体としても特性化され得る。これは、それが抗体３Ｒと
同様、ｕ−ＰＡＲと反応し、それによってｕ−ＰＡＲと
ｐｒｏ−ｕ−ＰＡまたは活性ｕ−ＰＡとの結合並びにプ
ラスミノーゲンのプラスミンへの細胞表面活性化を阻止
するからである。
【００９８】上に説明したように、ｕ−ＰＡＲのｕ−Ｐ
Ａ結合ドメインはｕ−ＰＡＲのＮ末端８７残基を含む領
域に位置するものである。すなわち、本発明のこの面に
よるモノクロナール抗体を他に定義するとすれば、ここ
で第８図にｕ−ＰＡＲ１として示された配列のポリペプ
チドまたはｕ−ＰＡに結合してｕ−ＰＡＲとｕ−ＰＡの
間の結合を阻止することができるいずれかの配列または
その類似体と反応するモノクロナール抗体である。
【００９９】本発明のこの面によるモノクロナール抗体
のｕ−ＰＡＲとの反応はｐｒｏ−ｕ−ＰＡと活性ｕ−Ｐ
Ａのｕ−ＰＡＲに対する結合並びに細胞表面プラスミノ
ーゲン活性化の阻止を結果するものであるが、これはｕ
−ＰＡＲにおけるｕ−ＰＡ結合ドメインとの反応であっ
てもよく、また特別の可能性として、ｕ−ＰＡ結合ドメ
インよりもｕ−ＰＡＲの他の部分に対する結合であっ
て、アロステリック効果により結合ドメインにおける変
化を惹起するものであってもよい。モノクロナール抗体
とｕ−ＰＡＲとの反応がｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメ
インとの反応（モノクロナール抗体３Ｒに対する場合に
認められたように）であるときは、当該反応はｕ−ＰＡ
Ｒの結合部位を直接含む結合であってもよく（これは約
３０またはそれ以下（またはそれ以上）、たとえば１５
〜３０またはときにそれ以下、しかし恐らく３０〜５０
またはそれ以上のアミノ酸配列を含むものと考えられ
る。)、適当な結合部位を含まないが、それにも拘わらず
ｕ−ＰＡ結合を阻止するような結合、たとえばアロステ
リック効果を有し、ｕ−ＰＡ結合を阻止するような抗体
結合であってもよい。上記いずれの場合においてもｕ−
ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインに結合してｐｒｏ−ｕ−
ＰＡまたはｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲへの結合並びに細胞表
面プラスミノーゲン活性化を阻止するモノクロナール抗
体は、治療目的のために同じ全体的な機能性と利用性を
有しており、本発明のこの面における同じ実施態様を構
成するものである。
【０１００】本発明のこの面によるモノクロナール抗体
は、免疫され得る動物をｕ−ＰＡＲまたはそのサブセク
ションまたは免疫原的変異種、たとえばｕ−ＰＡＲのｕ
−ＰＡ結合ドメインによって免疫し、免疫された動物か
らの細胞をミエローマセルラインと融合させ、ｕ−ＰＡ
Ｒと反応してｐｒｏ−ｕ−ＰＡと活性ｕ−ＰＡのｕ−Ｐ
ＡＲへの結合並びに細胞表面プラスミノーゲン活性化を
阻止することができる抗体を生産するクローンをスクリ
ーニングすることによって製造することができる。
【０１０１】以下の説明および実施例から明らかなよう
に、モノクロナール抗体の生産の初期段階において、特
別の選択プランが用いられ、これによってｕ−ＰＡＲと
反応してその結果としての阻止効果を有し、同時にＥＬ
ＩＳＡのようなイムノアッセイにおける有用性を有する
抗体を生産するハイブリドーマクローンが得られた。
【０１０２】このようなモノクロナール抗体が確立され
たことが一旦見いだされると、当業者にとってここに開
示された特定の種とはその微小な特異的作用形式、蛋白
化学組成などにおいて異なっているが、同じ本質的機能
性、すなわちｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインに対し
結合し、それによってｐｒｏ−ｕ−ＰＡまたは活性ｕ−
ＰＡのｕ−ＰＡＲに対する結合並びに細胞表面プラスミ
ノーゲン活性化を阻止することができる性能を示す他の
モノクロナール抗体を生産することが可能となろう。
【０１０３】上記説明により、モノクロナール抗体のこ
の面のサブクラスはｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡＲ結合ドメイ
ンと反応し、それによってｐｒｏ−ｕ−ＰＡと活性ｕ−
ＰＡの結合並びに細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻
止するモノクロナール抗体である。
【０１０４】抗体が上記定義に一致することを評価する
方法は、抗体とｕ−ＰＡＲとの間の反応によって引き起
こされた表面プラスミノーゲン活性化の阻止を測定する
か、抗体とｕ−ＰＡＲとの間の反応によって引き起こさ
れたｕ−ＰＡまたはｐｒｏ−ｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲへの
結合の阻止を測定することからなる。
【０１０５】本発明のこの面における、特別な狭い実施
態様は、競合実験において、ブダペスト条約の条件下に
ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・
カルチュアズに仮寄託番号90101009号として寄託された
ハイブリドーマ・セルラインによって生産されたモノク
ローナル抗体３Ｒと競合することができるモノクローナ
ル抗体である。
【０１０６】この点において、「抗体」なる用語は完全
な抗体分子のみならず、Ｆａｂフラグメントのようにそ
の結合断片をも意味することが意図されている。実施例
の抗体はマウスハイブリドーマによって生産されている
が、治療目的のための抗体は適切にはヒトハイブリドー
マによって生産される。ヒトハイブリドーマの確立と使
用は当業界においてよく知られているところであり、た
とえばＭ．Ｃ.Ｇlassy，Ｈ.Ｈ.Ｈandley，Ｈ.Ｈagiwara
およびＩ.Ｒoyston：ヒト／ヒトハイブリドーマを分泌
する抗体を発生させるのに有用なヒトリンホブラストイ
ドＢ−セルライン、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳ
Ａ，80:6327-6331,1983やＦ.Ｆ.Ｉrie，Ｌ.Ｌ.Ｓzeおよ
びＲ.Ｅ.Ｓaxton：エプシュタイン−バールウイルス形
質転換ヒトＢリンパ球セルラインによるインビトロで生
産された腫瘍抗原ＯＦＡ−１に対するヒト抗体、Ｐro
c．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ79:5666-5670,1982を参
照されたい。
【０１０７】本発明の抗体の最も重要な有用性の一つ
は、診断目的に対するものであり、特にサンプル中にお
けるｕ−ＰＡＲの存在を検出したり定量するための方法
における使用である。以下に、このような方法、特にＥ
ＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着試験法）による方法および
本発明によるモノクローナル抗体についてより詳細に述
べることとする。
【０１０８】また、ある種の特異的ポリクローナル抗体
についても述べる。このような特異的ポリクローナル抗
体を生産する方法は実施例４に記載されており、かかる
抗体はインタクトｕ−ＰＡＲのキモトリプシンによる分
解によって得られたｕ−ＰＡＲの１６ｋＤｕ−ＰＡ結合
フラグメントによる免疫によって展開されるものであ
る。他の興味ある特異的抗体はｕ−ＰＡＲの３５〜４５
ｋＤnon−ｕ−ＰＡ結合フラグメントによる免疫によっ
て得ることができる。
【０１０９】本発明によるかかる用途の一面はサンプル
中におけるｕ−ＰＡＲの検出または定量方法であり、検
出または定量は本質的にｕ−ＰＡＲがｕ−ＰＡを結合し
たか否かとは無関係であり、捕捉または／および検出抗
体としてｕ−ＰＡＲがｕ−ＰＡに結合していると否とを
問わずｕ−ＰＡＲに結合することができる抗体を使用す
ることを含む。
【０１１０】本発明において使用された各抗体は、ｕ−
ＰＡＲと反応するが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反
応しない本発明によるモノクローナル抗体または遊離ｕ
−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とも反応す
る本発明のモノクローナル抗体であってよい。
【０１１１】また、本発明で有用なものは、ｕ−ＰＡＲ
と反応するがそのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応しない
ポリクローナル抗体および遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡ
とｕ−ＰＡＲの複合体とも反応するポリクローナル抗体
である。
【０１１２】この方法の一つの有用な具体例は、ｕ−Ｐ
ＡＲと反応するが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応
しない一つのモノクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲ
ともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とも反応する一つの
モノクローナル抗体を捕捉抗体として使用し、ｕ−ＰＡ
Ｒと反応するが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応し
ない他の一つのモノクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡ
Ｒともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とも反応する他の
一つのモノクローナル抗体であって、このような他のモ
ノクローナル抗体が異なったエピトープに対して向けら
れたものであるようなものを検出抗体として使用する方
法である。
【０１１３】このような方法の他の一つの具体例は、ｕ
−ＰＡＲと反応するが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは
反応しないポリクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲと
もｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とも反応するポリクロ
ーナル抗体を捕捉抗体として使用し、ｕ−ＰＡＲと反応
するが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応しない一つ
のモノクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−Ｐ
Ａとｕ−ＰＡＲの複合体とも反応する一つのモノクロー
ナル抗体を検出抗体として使用する方法である。
【０１１４】他の一つの具体例は、ｕ−ＰＡＲと反応す
るが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応しないモノク
ローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−
ＰＡＲの複合体とも反応する一つのモノクローナル抗体
を捕捉抗体として使用し、ｕ−ＰＡＲと反応するが、そ
のｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応しないポリクローナル
抗体または遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの
複合体とも反応するポリクローナル抗体を検出抗体とし
て使用する方法である。
【０１１５】さらに他の具体例は、ｕ−ＰＡＲと反応す
るが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応しないポリク
ローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−
ＰＡＲの複合体とも反応するポリクローナル抗体を捕捉
抗体として使用し、ｕ−ＰＡＲと反応するが、そのｕ−
ＰＡ結合ドメインとは反応しないポリクローナル抗体ま
たは遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体
とも反応するポリクローナル抗体を検出抗体として使用
する方法である。
【０１１６】本発明による他の方法は、サンプル中のｕ
−ＰＡＲとｕ−ＰＡの複合体を検出するかまたは定量す
る方法であって、ｕ−ＰＡまたはｐｒｏ−ｕ−ＰＡと結
合したｕ−ＰＡＲに結合することができる抗体を捕捉ま
たは検出抗体として使用し、結合したｕ−ＰＡまたはｐ
ｒｏ−ｕ−ＰＡを検出する抗体を検出または捕捉抗体と
して使用するものである。
【０１１７】この方法の具体例は、ｕ−ＰＡＲと反応す
るが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応しないモノク
ローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−
ＰＡＲの複合体とも反応するモノクローナル抗体を捕捉
または検出抗体として使用する方法である。
【０１１８】他の具体例は、ｕ−ＰＡＲと反応するが、
そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応しないポリクローナ
ル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲ
の複合体とも反応するポリクローナル抗体を捕捉または
検出抗体として使用する方法である。
【０１１９】本発明による他の重要な方法は、サンプル
中のｕ−ＰＡとは結合していないｕ−ＰＡＲを検出また
は定量する方法であって、遊離ｕ−ＰＡＲと結合する
が、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲとの複合体とは結合すること
ができない抗体を捕捉または検出抗体として使用するも
のである。
【０１２０】この方法で使用する抗体は、ｕ−ＰＡＲの
ｕ−ＰＡ結合ドメインと反応するモノクローナル抗体ま
たは遊離ｕ−ＰＡＲと反応するが、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡ
Ｒの複合体とは反応しないモノクローナル抗体、もしく
はｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応するが、ｕ
−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しないポリクロー
ナル抗体あるいは遊離ｕ−ＰＡＲと反応するが、ｕ−Ｐ
Ａとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しないポリクローナル
抗体であってよい。
【０１２１】この方法の一つの具体例は、ｕ−ＰＡＲの
ｕ−ＰＡ結合ドメインと反応するモノクローナル抗体ま
たは遊離ｕ−ＰＡＲと反応し、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの
複合体とは反応しないモノクローナル抗体を捕捉抗体と
して使用し、ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応
する他のモノクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲと反
応し、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しない他
のモノクローナル抗体であって、このような他のモノク
ローナル抗体が異なったエピトープに対して向けられて
いるようなものを検出抗体として使用する方法である。
【０１２２】この方法の他の一つの具体例は、ｕ−ＰＡ
Ｒのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応するが、ｕ−ＰＡとｕ
−ＰＡＲの複合体とは反応しないポリクローナル抗体ま
たは遊離ｕ−ＰＡＲと反応し、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの
複合体とは反応しないポリクローナル抗体を捕捉抗体と
して使用し、ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応
するモノクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲと反応
し、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しないモノ
クローナル抗体を検出抗体として使用する方法である。
【０１２３】この方法のさらに他の具体例は、ｕ−ＰＡ
Ｒのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応するモノクローナル抗
体または遊離ｕ−ＰＡＲと反応し、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡ
Ｒの複合体とは反応しないモノクローナル抗体を捕捉抗
体として使用し、ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと
反応し、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しない
ポリクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲと反応し、ｕ
−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しないポリクロー
ナル抗体を検出抗体として使用する方法である。
【０１２４】この方法のさらに他の具体例は、ｕ−ＰＡ
Ｒのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応し、ｕ−ＰＡとｕ−Ｐ
ＡＲの複合体とは反応しないポリクローナル抗体または
遊離ｕ−ＰＡＲと反応し、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合
体とは反応しないポリクローナル抗体を捕捉抗体として
使用し、ｕ−ＰＡＲと反応し、そのｕ−ＰＡ結合ドメイ
ンとは反応しないポリクローナル抗体または遊離ｕ−Ｐ
ＡＲともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とも反応するポ
リクローナル抗体を検出抗体として使用する方法であ
る。
【０１２５】本発明の他の方法は、サンプル中のｕ−Ｐ
Ａと結合していないｕ−ＰＡＲを検出または定量する方
法であって、遊離ｕ−ＰＡＲと結合するが、ｕ−ＰＡ結
合を阻止することができない抗体を捕捉または検出抗体
として使用し、ｕ−ＰＡまたはそのｕ−ＰＡＲ結合変異
種を検出または捕捉試剤として使用するものである。
【０１２６】本発明の他の方法は、組織断片におけるｕ
−ＰＡＲの免疫組織学的検出方法であって、当該方法で
は検出抗体としてｕ−ＰＡＲと反応するモノクローナル
抗体またはｕ−ＰＡＲと反応するポリクローナル抗体、
たとえばｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応する
モノクローナル抗体、遊離ｕ−ＰＡＲと反応するが、ｕ
−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しないモノクロー
ナル抗体、ｕ−ＰＡＲとは反応するが、そのｕ−ＰＡ結
合ドメインとは反応しないモノクローナル抗体、遊離ｕ
−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とも反応す
るモノクローナル抗体、ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメ
インと反応し、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応
しないポリクローナル抗体、ｕ−ＰＡＲと反応するが、
そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応しないポリクローナ
ル抗体、遊離ｕ−ＰＡＲと反応するが、ｕ−ＰＡとｕ−
ＰＡＲの複合体とは反応しないポリクローナル抗体、ま
たは遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体
とも反応するポリクローナル抗体を使用する。
【０１２７】特に、抗体は上記したモノクローナル抗体
の１種である。この方法の一つの具体例、すなわちｕ−
ＰＡＲをそれがｕ−ＰＡと結合しているか否かに関係な
く検出する方法はｕ−ＰＡＲと反応するが、そのｕ−Ｐ
Ａ結合ドメインとは反応しないモノクローナル抗体、遊
離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とも反
応するモノクローナル抗体、ｕ−ＰＡＲと反応するが、
そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応しないポリクローナ
ル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲ
の複合体とも反応するポリクローナル抗体を使用するも
のである。
【０１２８】この方法の他の具体例は、遊離のｕ−ＰＡ
Ｒを検出するものであって、検出抗体として遊離ｕ−Ｐ
ＡＲを検出するが、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体を検
出することができない抗体を使用する。
【０１２９】この具体例において、検出抗体としては、
ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応するモノクロ
ーナル抗体、遊離ｕ−ＰＡＲと反応するが、ｕ−ＰＡと
ｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しないモノクローナル抗
体、ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応するが、
ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しないポリクロ
ーナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲと反応するが、ｕ−Ｐ
Ａとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しないポリクローナル
抗体が使用されてよい。
【０１３０】ｕ−ＰＡと結合していると否とを問わずｕ
−ＰＡＲを検出する本発明によるモノクローナル抗体の
一例は、４Ｒとして参照され、仮寄託番号90101010号と
して寄託されたハイブリドーマセルラインによって生産
される抗体である。この点で有用であると考えられる本
発明の他のモノクローナル抗体としては、１Ｒと２Ｒが
ある。
【０１３１】遊離ｕ−ＰＡＲと反応するが、ｕ−ＰＡと
ｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しない、本発明によるモノ
クローナル抗体の例としては、上に述べた抗体３Ｒが挙
げられる。
【０１３２】抗体３Ｒに関して上記したところと同様、
ここに述べられたモノクローナル抗体の各機能タイプ
は、寄託された具体的なクローンの具体的な生産物に限
定されるものではなく、むしろ実施例および特許請求の
範囲を含め本明細書中に記載した有用性に関して同じ機
能性を示すモノクローナル抗体の集団として理解される
べきである。
【０１３３】本発明の一面は、サンプル中のｕ−ＰＡＲ
のグリコシル化変異種を検出または定量する方法に関
し、当該方法は検出抗体として単独にまたは優先的に該
変異種に結合するモノクローナル抗体を使用するもので
ある。
【０１３４】ｕ−ＰＡＲのグリコシル化変異種は、典型
的には癌細胞の特別のタイプに特徴的な変異種である。
【０１３５】上記した全ての場合において、サンプルと
は典型的には癌患者または癌の疑いがある患者からの血
清、血漿または尿を言うが、勿論特定のケースに適切な
他のサンプルたとえば糞便サンプルであってもよい。サ
ンプルはまた癌組織または癌の疑いがある組織から抽出
されてもよい。
【０１３６】上記した全ての場合において、サンプルは
また組織破壊、たとえばリュウマチ性関節炎、潰瘍性大
腸炎または乾癬症を含む非腫瘍性疾病に罹っている患者
または罹っている疑いのある患者からの血清、血漿また
は尿であってもよい。
【０１３７】上に詳述したように、検出抗体は検出標識
を伴っており、そのような標識の例はここに述べるとお
りである。
【０１３８】本発明によるモノクローナル抗体は、ま
た、診断剤を表面にｕ−ＰＡＲを含む細胞に命中させる
ための方法においても使用することができ、当該方法は
哺乳類特にヒト、特に癌に罹患したまたは罹患した疑い
のある哺乳類に対してｕ−ＰＡＲに対する本発明のモノ
クローナル抗体に結合した診断剤を投与することを含む
ものである。診断剤はテクネチウムのような放射性物質
であってもよい。
【０１３９】この目的のために用いられる本発明の抗体
は、上記した本発明のモノクローナル抗体のいずれであ
ってもよく、ｕ−ＰＡＲの特別なグリコシル化変異種に
単独でまたは優先的に結合するモノクローナル抗体であ
ってもよい。
【０１４０】上記の記述を要約し、かつ図に関する説明
および実施例に記載したモノクローナル抗体の性質を参
照して、本発明によるモノクローナル抗体は、ｕ−ＰＡ
Ｒに対するモノクローナル抗体としての以下に述べる特
性の一つまたはそれ以上によって特徴付けることができ
る： １）サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて捕捉抗体として固
定化されたとき、ｕ−ＰＡＲを捕捉することができる、
または ２）サンドイッチＥＬＩＳＡにおいてビオチン標識検出
抗体として使用されたとき、ｕ−ＰＡＲを検出すること
ができる、または ３）ＥＬＩＳＡにおいて使用されたとき、固定化された
ｕ−ＰＡＲに結合することができる、または ４）ＥＬＩＳＡにおいて捕捉抗体として固定化されたと
き、ｕ−ＰＡＲがそのｕ−ＰＡ結合容を保持するように
ｕ−ＰＡＲを結合することができる、または ５）放射免疫沈殿試験において、精製ｕ−ＰＡＲがイン
タクトの形で沈殿させる、または ６）放射免疫沈殿試験において、キモトリプシン消化に
よって得られるｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合Ｍｒ16,000フ
ラグメントを沈殿させる、または ７）放射免疫沈殿試験において、キモトリプシン消化に
よって得られ、ｕ−ＰＡを結合しないｕ−ＰＡＲのｕ−
ＰＡ結合Ｍｒ16,000フラグメントを沈殿させる、または ８）ｕ−ＰＡＲ含有抽出物の界面活性剤相が６〜１６％
グラジエントゲル上非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離
に付した場合、ウエスタンブロッティングにおいてｕ−
ＰＡＲと反応する、または ９）ウエスタンブロッティングにおいて、Ｕ９３７細胞
によって生産された５０〜６５ｋＤ範囲のｕ−ＰＡＲグ
リコシル化変異種と反応せず、Ｕ９３７ａ細胞によって
生産された約４０〜４５ｋＤのｕ−ＰＡＲグリコシル化
変異種と反応しない、または １０）ウエスタンブロッティングにおいて、Ｕ９３７細
胞によって生産された５０〜６５ｋＤ範囲のｕ−ＰＡＲ
グリコシル化変異種と反応し、Ｕ９３７ａ細胞によって
生産された約４０〜４５ｋＤのｕ−ＰＡＲグリコシル化
変異種と反応する、または １１）ウエスタンブロッティングにおいて、Ｕ９３７細
胞によって生産された５０〜６５ｋＤ範囲のｕ−ＰＡＲ
グリコシル化変異種と弱く反応し、Ｕ９３７ａ細胞によ
って生産された約４０〜４５ｋＤのｕ−ＰＡＲグリコシ
ル化変異種と強く反応する、または １２）ホルマリン固定、パラフィン包埋結腸癌組織塊の
断面において、癌細胞を侵襲前面において免疫染色し、
免疫染色された細胞の所在はイン・シチュ・ハイブリダ
イゼーションによって検出されたｕ−ＰＡＲｍＲＮＡの
分布と実質的に同じである、または １３）ｐｒｏ−ｕ−ＰＡと活性ｕ−ＰＡの結合および細
胞表面プラスミノーゲン活性化を阻止する、または １４）ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応し、そ
のによってｐｒｏ−ｕ−ＰＡと活性ｕ−ＰＡの結合およ
び細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻止する、または １５）図８においてｕ−ＰＡＲ１として示された配列ま
たはｕ−ＰＡＲに結合してｕ−ＰＡＲとｕ−ＰＡの結合
を阻止することができる配列もしくはその類似体と反応
するモノクローナル抗体、または １６）パラフィン包埋組織切片のような組織断片におけ
るｕ−ＰＡＲに結合し、それによってｕ−ＰＡＲの免疫
組織学的検出に有用である、または １７）ｕ−ＰＡＲの特定のグリコシル化変異種に選択的
に結合することができる、または １８）Ｃ末端部を含み、インタクトｕ−ＰＡＲ分子中の
アミノ酸残基８８で出発するｕ−ＰＡＲ分子のnon-ｕ−
ＰＡ結合部と反応する、または １９）マウスＩｇＧに対するフルオルエッセインイソチ
オシアネート−標識抗体によるフローサイトメトリーを
使用した場合、ヒト単核細胞に結合し、この結合は外因
的に加えられたｕ−ＰＡとのプレインキュベーションに
よって影響されない、または ２０）マウスＩｇＧに対するフルオルエッセインイソチ
オシアネート−標識抗体によるフローサイトメトリーを
使用した場合、ヒト単核細胞に結合し、この結合は外因
的に加えられたｕ−ＰＡとのプレインキュベーションに
よって完全に阻止される。
【０１４１】本明細書の記載から、これらの性質は、単
独でまたは結合して、本発明のモノクローナル抗体をｕ
−ＰＡＲおよびｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応の検出、
定量、特性化および機能的分析のために、そしてまたｕ
−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応を含む癌およびその他の疾
病における診断的予後的および治療的用途のために極め
て有用なものとすることは明らかである。
【０１４２】本発明によるモノクローナル抗体の一つの
重要な用途は、ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応の潜在的
阻止、そしてｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応が含まれる
癌や他の疾病における潜在的な抗侵襲および抗転移効果
のための物質をスクリーニングする手段を確立すること
である。かかる用途の一つは、スクリーニング方法であ
って、当該方法においては、物質によるｕ−ＰＡ／ｕ−
ＰＡＲ相互反応の可能な阻止が当該物質を固定化ｕ−Ｐ
ＡＲと可溶化ｕ−ＰＡを含む系に加えることによって決
定され、ｕ−ＰＡＲに結合したｕ−ＰＡは標識すること
によってまたは標識抗ｕ−ＰＡ抗体を使用することによ
って検出される。上記の阻止は、また、物質を固定化ｕ
−ＰＡと可溶化ｕ−ＰＡＲを含む系に添加することによ
って決定され、ｕ−ＰＡに結合したｕ−ＰＡＲは標識す
ることによってまたは標識抗ｕ−ＰＡＲ抗体を使用する
ことによって検出される。
【０１４３】かかる試験法の例としては、ｕ−ＰＡＲを
捕捉するためにｕ−ＰＡＲに対する固定化モノクローナ
ル抗体を使用し、それに続いてｕ−ＰＡＲに結合するｕ
−ＰＡを測定する非常に実際的なスクリーニングＥＬＩ
ＳＡを挙げることができる。その際の候補物質の可能な
干渉、レセプター結合ｕ−ＰＡは標識がたとえばビオチ
ンである、標識抗ｕ−ＰＡ抗体によって検出される。
【０１４４】上記の簡便かつ迅速なスクリーニングにお
いて、物質が陽性であることが見いだされた場合には、
該物質によるｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応の可能な阻
止を、当該物質をｕ−ＰＡＲと放射標識ｕ−ＰＡまたは
その誘導体を含む系に加え、ｕ−ＰＡに結合したｕ−Ｐ
ＡＲを交差結合させ、交差結合生成物をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅとオートラジオグラフィによって検出することにより
測定する、より労力を要する試験法で適切にテストする
ことができる。この試験法における陽性の結果は、当該
物質が事実ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ結合を阻止することを
確認する。
【０１４５】通常、次の工程は、上記試験法においてｕ
−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ結合阻止陽性と認められた物質を、
培養細胞の表面におけるｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲに対する
結合の可能な阻止を判断する試験法で調べることであ
る。この試験法は、放射標識ｕ−ＰＡまたはその誘導体
とｕ−ＰＡを有する細胞を含む系に当該物質を加え、ｕ
−ＰＡＲに結合するｕ−ＰＡまたは誘導体を細胞のガン
マー計数によって検出することからなる。この試験法に
おける陽性の結果は、先の試験法で認められたｕ−ＰＡ
／ｕ−ＰＡＲ結合の阻止が可溶化されたｕ−ＰＡＲの使
用に関連した人為的なものではなく、臨床的状況にある
場合のようにｕ−ＰＡＲが細胞表面に結合した場合に実
際に達成されるものであることを証明する。
【０１４６】ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応を阻止する
目的は、生物学的設定におけるｕ−ＰＡの酵素活性を阻
止することである。これは、細胞表面プラスミノーゲン
活性化のレセプター結合外因性ｐｒｏ−ｕ−ＰＡによる
阻止が、ｕ−ＰＡＲを有する細胞に当該物質を添加し、
そこへｐｒｏ−ｕ−ＰＡを添加し、細胞表面上のプラス
ミン発生を測定することによって決定される検定法で直
接試験することができる。外因的にｕ−ＰＡを加えたこ
の状態はあるタイプの癌、たとえば結腸腺癌における状
況に類似しており、その場合癌細胞はｕ−ＰＡＲを生産
し、かつ含有しているのに対し、ｕ−ＰＡは腫瘍支質中
において隣接した非腫瘍細胞によって生産される。
【０１４７】しかしながら、あるタイプの癌、たとえば
鱗片状皮膚癌の場合には、癌細胞それ自身がｕ−ＰＡＲ
とｕ−ＰＡを生産する。この場合においてはｕ−ＰＡ／
ｕ−ＰＡＲ相互反応の阻止は、２つの成分が異なった細
胞によって生産される場合よりも困難となる。問題の物
質がこれらの状況のもとにｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反
応を阻止することができるか否かを試験するためには、
レセプター結合外因性ｐｒｏ−ｕ−ＰＡによる細胞表面
プラスミノーゲン活性化の可能な阻止がｕ−ＰＡＲ担持
細胞をインキュベートし、ｐｒｏ−ｕ−ＰＡを当該物質
で生産させ、セル表面におけるプラスミン発生の測定に
よって決定される方法を使用する。
【０１４８】動物実験において侵襲と転移についてのｕ
−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応を阻止する物質の効果を研
究する際に固有の問題点は、ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互
反応における種特異性である。それ故、ヒトの系におい
てｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応を阻止する物質が必ず
しもマウスのような実験動物系においてｕ−ＰＡ／ｕ−
ＰＡＲ相互反応を阻止するとは限らない。この問題はモ
ノクローナル抗体がｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応を阻
止する物質として使用される場合に一層深刻なものとな
る。何故なら、ヒトｕ−ＰＡＲに対するマウスモノクロ
ーナル抗体はマウスｕ−ＰＡＲと反応しないからであ
る。それ故、本発明によりヌードマウスに接種されたヒ
ト癌細胞の侵襲および転移を容易に測定できるシステム
が開発された。常套のヌードマウスに接種されたヒトの
癌細胞は規則どおりには侵襲、転移しない。本発明によ
れば、ｎｕ／ｎｕＭＥＴＡ／ｂｏｍと称するヌードマウ
スのサブストレインは、実質上すべての場合において若
干の癌セルラインが侵襲し、転移することが確認され
た。さらに本発明によれば、マウスに接種されたヒトの
癌細胞は、接種に先立って酵素β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼをコードするｌａｃＺ遺伝子によって形質転換され
た。この酵素は基質Ｘ−ガルに適用されたとき、青色染
色を示す。すなわちこの系はヒト癌細胞とマウス自身の
細胞との間で顕著な着色差を得ることを可能にし、これ
によって侵襲細胞と転移の検出および定量を著しく容易
化する。実施例９に記載した実験において、このマウス
モデルにおける侵襲、転移癌細胞はｕ−ＰＡとｕ−ＰＡ
Ｒの両者を生産することが見いだされた。さらにその侵
襲と転移は、ｕ−ＰＡに対するモノクローナル抗体であ
って、細胞表面プラスミン発生を阻止するものの投与に
よって殆ど完全に阻止できることが見いだされた。ｐｒ
ｏ−ｕ−ＰＡのレセプター結合の阻止がプラスミン発生
を阻止すると言う上記の発見と相俟って、これはｕ−Ｐ
Ａとｕ−ＰＡＲを生産する、細胞上のｕ−ＰＡ／ｕ−Ｐ
ＡＲ相互反応を効果的に阻止する物質はヌードマウスモ
デルにおける侵襲と転移を阻止することを示すものであ
る。
【０１４９】マウスがｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲを生産する
ヒト癌細胞により接種されるモデルに加え、他の多数の
モデルもまた興味あるものである。そのような他のモデ
ルとしては、一方がｕ−ＰＡを生産し、他方がｕ−ＰＡ
Ｒを生産する二つのタイプの癌細胞を接種するものであ
って、従って二つの異なったタイプの細胞で生産される
あるタイプの癌で生ずる臨床的条件が刺激されることに
なる。第３の興味ある場合として、ｕ−ＰＡＲを生産す
るヒト癌細胞をｕ−ＰＡを生産するヒト腫瘍−潜入繊維
芽細胞と共に接種する場合である。
【０１５０】これらのヌードマウスモデルにおいて侵襲
と転移を阻止することが見いだされたｕ−ＰＡ／ｕ−Ｐ
ＡＲ相互反応阻止物質は、ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反
応が侵襲と転移に決定的であると信じられているヒト癌
タイプ、たとえば結腸腺癌、乳腺癌、鱗片状皮膚癌にお
いて抗侵襲的かつ抗転移的であると考えられる。従って
このような化合物は有効な抗侵襲、抗転移薬として強力
な候補と考えられるから、動物において適切な毒性試験
を行った後、第１相および第２相の臨床試験でさらに研
究を行うべきである。
【０１５１】すなわち、本発明の一面は、上記の方法に
よって選択された場合に、哺乳類においてｕ−ＰＡのレ
セプター結合系のｕ−ＰＡＲへの結合を阻止することに
よってプラスミノーゲンのプラスミンへの活性化を妨げ
ることによる、哺乳類、特にヒトにおける局所的蛋白分
解活性を阻止し、妨害する物質に関するものである。
【０１５２】他の面において、本発明は、上記した１つ
またはそれ以上の試験法で試験される種々の基準におい
て、特に当該物質がクレーム７５にクレームした試験法
１）〜４）に示された基準に合致する場合において、局
在する蛋白分解活性を阻止し、妨害する物質に関する。
これは当該物質が、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲが異なった細
胞タイプによって生産される臨床的状況において活性が
あると考えられるからである。
【０１５３】さらに当該物質がクレーム７６の５）の基
準にも合致する場合には、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲが同じ
細胞で生産される臨床的状況において活性があるものと
考えられる。
【０１５４】もし物質がマウスモデルにおいても陽性で
あるならば、それは人体においてヒト癌細胞の侵襲と転
移を抑制するであろうことを強く示すものである。
【０１５５】本発明の方法を使用してｕ−ＰＡ／ｕ−Ｐ
ＡＲ結合を阻害することが見いだされた化学物質の一つ
はスラミンである。スラミン自身は一般に抗癌剤として
使用するには毒性が強過ぎるように思われるが、本発明
はスラミンの類似体もしくは誘導体であって毒性が低
く、しかもなおｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応を阻害す
るものは適切な抗癌剤となることを示している。
【０１５６】図についての説明図１、アフィニテイ精製
u−ＰＡＲのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び特異的リガンドへの
化学架橋
【０１５７】Ａ) ＰＭＡ処理u−ＰＡＲ９３７a細胞か
らの膜蛋白含有トリトンＸ−１１４フラクションは固定
化ＤＦＰ処理u−ＰＡを用いるアフィニテイクロマトグ
ラフィに付した。中性化カラム溶出液を０.１％酢酸に
対して透析し、凍結乾燥により濃縮した。精製前２×１
８８細胞を表現する蛋白を還元条件下６−１６公配ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを続けた(レーン１)。ゲルを銀染色した。
マーカー蛋白の分子量(レーン２)を示す。
【０１５８】Ｂ) アフィニテイカラム溶出液を希釈し
て検定の間、１nＭのu−ＰＡＲのほぼ等濃度を得た。試
料をプレインキュベートのみ(レーン２)又は以下の非標
識化試薬の存在下、１００nＭの濃度でインキュベート
した。ウシ血清アルブミン(レーン３)、t−ＰＡ(レーン
４)、プラスミノーゲン(レーン５)、マウス表皮性生成
因子(レーン６)、ＡＴＦ(レーン７)、活性５４ＫＤu−
ＰＡ(レーン８)、ＤＦＰ−不活化５４ＫＤu−ＰＡ(レー
ン９)。室温で１５分間インキュベーション後、Ｉ−標
識化ＡＴＦ(約１nＭ)を加え、次いで４℃で１時間イン
キュベーションした。インキュベーション後、化学架橋
をＤＳＳでなしとげ、その後試料を非還元条件下、６−
１６％公配ゲル上ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグ
ラフィにより分析した。レーン１は、１２５Ｉ−ＡＴＦ
を伴う架橋コントロール及びu−ＰＡＲ又は競合物の不
添加を示す。分子量標準蛋白の電気泳動可動性を示す
(ｋＤ)。
【０１５９】Ｃ) 中性化アフィニテイカラム溶出液を
(Ａ)におけるように濃縮して、約１５μg／mlのu−ＰＡ
Ｒ濃縮物を得、５０μg／mlＤＦＰ−処理u−ＰＡＲ−Ｐ
Ａの存在下、ＤＳＳと(レーン３)、又はそれのみ(レー
ン４)と架橋した。コントロールとも:精製u−ＰＡＲの
み、化学架橋なし(レーン５);ＤＦＰ処理u−ＰＡのみ、
化学架橋なし(レーン１);ＤＦＰ−処理u−ＰＡ、架橋の
み(レーン２)。試料は非還元条件下、Ｐhast−ＳＤＳ−
ＰＡＧＥを続けた。ゲルを銀染色した。化学架橋はＤＦ
Ｐ−処理u−ＰＡのみの移動速度で少しの増加となり、
多分、内側架橋によるものであるが、u−ＰＡＲのみの
ものではない。分子量標準蛋白の電気泳動可動性(レー
ン６)を示す(ｋＤ)。
【０１６０】図２、精製u−ＰＡＲの酵素脱グリコシ
ル。アフィニテイ精製１２５Ｉ−標識化u−ＰＡＲを緩
和な還元条件下(実験方法参照)変性による脱グリコシル
のための前処理し、ペプチド:Ｎ−グリコシダーゼＦで
処理し(レーン２)又は直接分析した(レーン１)。分析は
６−１６％公配ゲル上、還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により行ない、次いでコダックＸＡＲフイルム上オート
ラジオグラフィを行なった。標準蛋白の電気泳動可動性
を示す(ｋＤ)。
【０１６１】図３、架橋１２５Ｉ−ＡＴＦの脱グリコシ
ル:ＰＭＡ−処理及び非処理u９３７細胞からのu−ＰＡ
Ｒコンプレックス。ＰＭＡ−処理(レーン１及び３)及び
非処理(レーン２及び４)細胞を酸処理し、０.５％ＣＨ
ＡＰＳで溶解した。溶解質を １２５Ｉ−ＡＴＦとインキ
ュベートし、ジサクシニミジルスベリン酸塩で架橋し、
緩和な還元条件下変性し、次いでペプチド:Ｎ−グリコ
シダーゼＦの存在下(レーン３及び４)又は不存在下(レ
ーン１及び２)、さらにインキュベートし、還元条件下
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド(６−１６％)ゲル電気泳動
により分析し、次いでオートラジオグラフィに付した。
標準蛋白の電気泳動可動性を示す(ｋＤ)。
【０１６２】図４、化学的交差結合によるリガンド結合
u−ＰＡＲ断片の検出 精製u−ＰＡＲ(３０μg／ml)をキモトリプシン(４０ng
／ml)により３７℃で７時間処理するか(レーン３)、又
は分解することなく直接分析する(レーン２)。コントロ
ール(レーン１)はバッファーを含み、同じ条件下にキモ
トリプシンと共に培養した。分析は、６７倍希釈サンプ
ルを１２５Ｉ−標識ＡＴＦ(１ｎＭ)と共に培養し、ＤＳ
Ｓで交差結合し、還元条件(Ａ)又は非還元条件(Ｂ)で６
〜１６％Ｔグラジエントゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥに付
し、ゲルのオートラジオグラフィーによって行う。分子
状マスマーカータンパクの電気泳動移動性が示されてい
る。
【０１６３】図５、u−ＰＡＲ断片の電気泳動分解 (Ａ)非分解、精製u−ＰＡＲ(０．４μg)(レーン３)、図
４の説明に記載したようにキモトリプシン処理した精製
u−ＰＡＲ(０．４μg)(レーン４)又は同じ条件でキモト
リプシン処理したバッフアー(レーン２)を還元条件下に
トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ(１０％Ｔ、３％Ｃ)で分析し
た。ゲルを銀染色した。マーカータンパクの分子状マス
(レーン１と５)が示されている。
【０１６４】(Ｂ)精製u−ＰＡＲを図４の説明に記載さ
れているようにキモトリプシンで分解した。分解混合物
のサンプルをリガンドの不存在下（レーン２）又はＡＴ
Ｆの存在下（レーン３）ＤＳＳによる化学的交差結合に
付した。レーン４は化学的交差結合後のＡＴＦ製品のみ
を示す。交差結合は、１２μl容で行われ、各サンプル
は０．２７μgのu−ＰＡＲ物質及び／又は０．０５μg
ＡＴＦを含んでいた。ＤＳＳ−処理サンプルと交差結合
に付されなかったu−ＰＡＲ分解混合物のサンプル０．
２７μg(レーン１)を還元条件下トリシンＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ(１０％Ｔ、３％Ｃ)で分析し、銀染色を行った。分
子状マスマーカータンパクの電気泳動移動性が示されて
いる。
【０１６５】図６、u−ＰＡＲとそのリガンド結合断片
の界面活性剤相分離 精製u−ＰＡＲを図４の説明に記載したようにキモトリ
プシンで分解した。サンプルを１００倍に希釈し、１％
トライトンＸ−１１４の存在下、温度誘導相分離に付し
た。得られた水相(レーン３)、界面活性剤相(レーン
２)、相分離を行わなかった分離混合物のサンプル(レー
ン１)及びブラインドサンプル(すなわち相分離を行わな
かったキモトリプシン処理バッファー)(レーン４)を
１２５Ｉ−ＡＴＦ(１nＭ)と共に培養し、ＤＳＳによる
化学的交差結合に付した。すぺてのサンプルは、検定の
間にＣＨＡＰＳ含有バッファーを加えて最終的に同じ希
釈度(１３８倍)に調節した。交差結合サンプルを還元条
件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ゲルのオートラジオグ
ラフィーを行った。分子状マスマーカータンパクの電気
泳動移動性が示されている。
【０１６６】図７、リガンド結合断片のデグリコシレー
ション インタクト、精製u−ＰＡＲ(レーンＡ１とＢ１)又はキ
モトリプシン処理u−ＰＡＲ(レーンＡ２とＢ２)のサン
プルを、キモトリプシン濃度を２００ng／mlとする以外
は図４の説明に記載した方法で調製した。サンプルを６
７倍に希釈し、１ ２５Ｉ−標識ＡＴＦ(１nＭ)と共に培
養し、ＤＳＳによる化学的交差結合に付した。交差結合
サンプルを緩和な変性条件下デグリコシレーションのた
めの前処理に付し(実施例参照)、ペプチド：Ｎ−グリコ
シダーゼＦの不存在(Ａ)又は存在(Ｂ)の下に３７℃、１
８時間インキュベートした。生成物を６〜１６％Ｔグラ
ジエントゲル上、還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
分析し、オートラジオグラフィーに付した。分子状マー
カータンパクの電気泳動移動性が示されている。
【０１６７】図８、u−ＰＡＲの内部アミノ酸配列の繰
返しとこれら繰返しのＴ細胞活性化 タンパク／Ｌy−６抗原およびイカタンパクＳgp−２の
細胞外ドメインとの相同性
【０１６８】システイン基にはアンダーラインが付され
ている。略号は次の意義を有する：u−ＰＡＲ１，２及
び３、u−ＰＡＲの第１，第２及び第３繰返し(ｃＤＮＡ
配列(１８)から導かれたアミノ酸配列の残基１〜９２、
９３〜１９１および１９２〜２８２)；ＣＯ、u−ＰＡＲ
の３つの繰返しに対する一致した配列；Ｌy−６ａ、Ｌy
−６ｃ、Ｌy−６抗原／Ｔ細胞活性化タンパク(残基１〜
７９と１〜７６)(２８〜３１)；Ｓgp−２、イカグリコ
プロテインＳgp−２(残基１〜９２)(３２)；ＣＯ、Ｌy
−６ａ、Ｌy−６ｃおよびＳgp−２に対する一致した配
列。「アンカー」とはグリコホスホリピド尾部に対する
付着部位を示す。疑問符は付着部位がＳgp−２配列との
配列によって提案されたものであることを示す。(３
２)。u−ＰＡＲについて、付着部位は、仮にＳer２８２
(すなわち示された最後の残基)又は残基Ｇly２８３もし
くはＡla２８４のいずれかに対して与えられた（プラウ
グら、提出済)。
【０１６９】示された一致配列において、すべての配列
に存在した基は一致基と定義され、変化し得る位置はｘ
のマークを付し、メンバー配列のいずれかにおいてギャ
ップを含む位置はｇのマークを付した。矢印は、制限化
キモトリプシン消化の間に開裂した結合を示す。u−Ｐ
ＡＲ繰返しに対する一致配列とＬy−６及びＳgp−２配
列に対するそれとの類似性(システインのパターンやギ
ャップ部分の存在)について注目されたい。
【０１７０】図９は、酸加水分解後u−ＰＡＲ−ＰＡＲ
から放れたアミノ酸の陽イオン変換クロマトグラフィか
らの溶出プロフィルを示す。蛋白は、トリトンＸ−１１
４デタージエンド相分離及びアフィニテイクロマトグラ
フィ(ＤＦＰ−u−ＰＡＲ−ＰＡセファロース)により、
ＰＭＡ刺激u−ＰＡＲ９３７細胞(６×１０９細胞)から
始めに精製した。純度を改良し、アミノ酸分析上、低分
子量化合物から干渉を排除するために、このレセプター
調製物は０.１％酢酸に対して徹底的に透析し、凍結乾
燥し、次いでトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、続い
て０.４５μmＰＶＤＦ膜(８cm×８cm)上電気伝導に付し
た。挿入物はクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０
による染色後、固定化u−ＰＡＲ−ＰＡＲを示す。u−Ｐ
ＡＲの可動性の少しの低下がこの実験で見られ、凍結乾
燥調製物中のツイッターイオンデタージエントＣＨＡＰ
Ｓの大過剰による。u−ＰＡＲを表わすＰＶＤＦ膜の染
色域を切除し、３,３'−ジチオジプロピオン酸(ＤＴＤ
ＰＡ)の存在下、１１０°で２０時間、真空で加水分解
した。Ｃys−Ｘは加水分解の間システインとＤＴＤＰＡ
の間で形成される生成物であり、ＧlcＮはグルコサミン
であり、ＥtＮはエタノールアミンである。
【０１７１】図１０は、バシルス・セレウスからのホス
ファチジルイノシトール−特異性ホスホリラーゼＣ(Ｐ
Ｉ−ＰＬＣ)による付着ＰＭＡ−刺激u９３７細胞からの
１２ ５Ｉ−標識化ＤＦＰ処理u−ＰＡの遊離を示す。始
めに内因的に生成したu−ＰＡを酸処理によりＰＭＡ刺
激u９３７細胞(２×１０７細胞／皿)から溶出する。外
因的に加えた１２５Ｉ標識化ＤＦＰ処理u−ＰＡ(１nＭ
及び４.５×１０６cpm)の結合を、２５mＭＨＥＰＥＳ、
pＨ７.４を含む５ml血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培
地中４℃で２時間実施した。細胞をこの緩衝液で３回洗
浄後、１つの皿を５％ＳＤＳで抽出し、１００％細胞結
合放射活性を明らかにし、一方、他をもう一度酸処理し
て、酸抽出化活性を測定した(このレベルは縦座標で矢
で示す)。２つの皿は各々０.６μgＰＩ−ＰＬＣ／mlを
受け(△)、一つは８μg／mlホスホリパーゼＡ２を受け
(○)、一方、最後の皿は緩衝液コントロールを構成した
(●)。培地の２つのアリコット(１００μl)を各皿か
ら、３７℃で撹拌テーブル上でのインキュベーションの
間にとり、放出放射活性を遠心(２０,０００Ｘg５分間)
後、上清中で測定した。試料は図１１に示すようにＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより後で分析した。
【０１７２】図１１は、コンプレックス形成及び１２５
Ｉ−標識化ＤＦＰ処理u−ＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る分子分析及びＰＩ−ＰＬＣによる培地に放出されたu
−ＰＡＲを示す。図１０に記載される実験からの上清の
アリコットは、非還元条件下、直接(Ａ)又は続く１mＭ
ジサクシニミジルスベリン酸塩(ＤＳＳ)と架橋し、サン
プリン後直ちに実施して(Ｂ)、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(１０
％Ｔ、２.５％Ｃ)により分析した。別の実験(Ｃ)で、２
皿のＰＭＡ刺激u９３７細胞を、図１０の説明に記載さ
れるように培養し、酸処理する。中和後、一皿を５mlの
血清のない培地(２５mＭＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６
４０.pＨ７.４)中０.６μgＰＩ−ＰＬＣとインキュベー
トし、一方、他を５mlの培地のみでインキュベートし
た。リパーゼの添加及び直ちに遠心(２０,０００Ｘg、
５分間)後、アリコットを０分、３０分及び６０分に抜
き取った。上清を１２５Ｉ標識化ＤＦＰ不活化u−ＰＡ
(１nＭ)と４℃で１時間プレインキュベートし、次いで
１mＭＤＳＳと架橋した。最も右のレーン(ＤＦＰ−u−
ＰＡ)はu−ＰＡＲの不存在で架橋した１２５Ｉ標識化リ
ガンドを表わす。試料は上のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より分析した。
【０１７３】図１２は、ＰＩ−ＰＬＣで処理による精製
u−ＰＡＲの疎水性性質の変化を示す。ＰＭＡ刺激u９３
７細胞から精製したu−ＰＡＲは処理することなく(ＮＯ
ＮＥ)又は全くホスホリパーゼがない(ＭＯＣＫ)か又は
２０μl／ml／ＰＩ−ＰＬＣの存在下(ＰＩ−ＰＬＣ)、
５０mＭトリエチルアミン／ＨＣl(pＨ７.５)、５mＭＥ
ＤＴＡ及び０.１％トリトンＸ−１００中、３７℃で３
０分間インキュベートした。一つの試料を５０mＭ酢酸
塩(pＨ６.０)、１０mＭＣaＣl２中キャベツから精製し
た２００μg／mlホスホリパーゼＤと共に(ＰＬＤ)、そ
して他は５０mＭＨＥＰＥＳ(pＨ８.０)、１０mＭＣaＣl
２中ハチ毒から精製した１００μg／mlホスホリパーゼ
Ａ２で(ＰＬＡ２)インキュベートした。これらのu−Ｐ
ＡＲ調製品は次いで１％トリトンＸ−１１４中、温度誘
発デタージエント相分離に付した。この相分離を、それ
ぞれ余分のトリトンＸ−１１４及び０.１Ｍトリス(pＨ
８.１)の添加により水及びデタージエント相を得るのに
一度繰り返した。最後に、１nＭ１２５Ｉ標識化ＡＴＦ
との架橋分析を水(Ａ)及びデタージエント(Ｄ)相の同時
のアリコット上で実施し、次いで非還元条件下、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ(１０％Ｔ及び２.５％Ｃ)により行なった。
１２５Ｉ−ＡＴＦ／u−ＰＡＲコンプレックス(Ｍr７０,
０００)に相当する領域をポリアミドゲルから切除し、
放射活性を測定した(各レーンの底にＡ＋Ｄで全放射活
性の％として示す)。
【０１７４】図１３は、ＧＰＩ−膜沈降の間プロセシン
グ部位が既知である蛋白からのＣＯＯＨ末端アミノ酸配
列のu−ＰＡＲに関し予言されたものに対する(アミノ酸
分析を基礎として、表５)比較を示す。グリコリピドへ
の付着に含まれるアミノ酸が目だつ。ＶＳＧ及びＰＡＲ
Ｐは変異体表面グリコプロテイン及びトリパノゾマ・ブ
ルケイからのプロサイクリック酸性反復蛋白を表わす。
ＣＥＡは癌胎児性抗体である。ＰＬＡＰは胎盤アルクリ
ホスファターゼであり、Ｔhy−１はラット胸腺細胞から
分離した表面グリコプロテインを表わす。
【０１７５】図１４、１２５Ｉ標識化精製u−ＰＡＲの
放射免疫沈降。縦座標:％１２５Ｉ−u−ＰＡＲ沈澱。横
座標:免疫／非免疫血清希釈１:７５、１:７５０、１:７
５００及び１:７５０００。
【０１７６】バー１−１１は、１)各試料に加えた
１２５Ｉ−u−ＰＡＲの総量、４４０００cpm:２)試験管
への放射活性の結合のコントロール:３)プロテインＡセ
ファロースへの１２５Ｉ−u−ＰＡＲの結合のコントロ
ール:４−７)非免疫血清への１２ ５Ｉ−u−ＰＡＲの結
合:８−１１)免疫血清への１２５Ｉ−u−ＰＡＲの結合
を表わす。
【０１７７】図１５、方法のところで記載したと同じ逆
固相ラジオイムノアッセイ。免疫／非免疫血清による
１２５Ｉ−u−ＰＡＲのキャッチング。縦座標:cpm結
合、横座標:抗体の２倍系列の希釈、１:５００−１:３
２００、Ｘ−Ｘ免疫:○−○非免疫。各試料に添加した
１２５Ｉ−u−ＰＡＲの総量:３３０００cpm。
【０１７８】図１６、ＥＬＩＳＡ。精製u−ＰＡＲを１n
g／ウェルの濃度で覆った。免疫／非免疫血清(一次抗
体)を１:５００から１:２５６０００の範囲で２倍系列
希釈に添加した。１:５００希釈したペルオキシダーゼ
接合二次抗体を用いた。基質はＯＰＤであった。酵素基
質反応からの色彩発達を４９０nmで読んだ。反応は１０
分後停止した。y軸:ＯＤ４９０nm。x軸:免疫／非免疫血
清の希釈。×−×免疫;○−○非免疫。
【０１７９】図１７、精製u−ＰＡＲに対して作った抗
体による細胞性ＡＴＦ結合の阻害。５×１０５u９３７a
細胞を精製u−ＰＡＲに対して作ったマウス抗血清と共
に(●−●)又は、ブタムチンに対して作ったコントロー
ルマウス抗血清と共に(○−○)４℃で１時間プレインキ
ュベートし、続いて２.２nＭ１２５Ｉ−ＡＴＦを加え
て、同一温度でさらに１時間インキュベートした。次い
で細胞を３回洗浄し、細胞結合放射活性をガンマカウン
ターで測定した。横座標は、１:１５３,６００から１:
３００の範囲の最終希釈の、抗血清の２倍希釈系列を表
わす。縦軸は抗血清が存在しないで得た値のパーセンテ
ージとして細胞結合放射活性を表わす。７００nＭ非標
識化u−ＰＡによる抗血清の置換は、結合の９０％阻害
となった。
【０１８０】挿入:ウエスタンブロットは用いた抗血清
の反応性を示す。５００ngの精製u−ＰＡＲ(レーン２及
び４)又は２.５×１０６ＰＭＡ刺激u９３７細胞から得
たトリトンＸ−１１４デタージエント相(レーン１及び
３)を、６−１６％公配ゲル上還元条件下ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより分析した。そしてウエスタンブロッティング
は、１:２５０に希釈した一次抗血清マウス抗−u−ＰＡ
Ｒ血清(レーン１及び２)又は同一希釈で上記コントロー
ル血清(レーン３及び４)として用いた。
【０１８１】図１８は、u−ＰＡＲに対するポリクロー
ナルウサギ抗体の反応性を証明するウエスタンブロット
を示す。ＰＭＡ刺激u９３７細胞の溶解質からのトリト
ンＸ−１１４デタージエント相の７５μl試料はそれだ
けで(レーン１)、ＤＦＰ処理u−ＰＡと混合後(実施例
１:最終濃度１０μg／ml)(レーン４)又は同一量のＤＦ
Ｐ処理u−ＰＡと混合後、化学架橋し(レーン３)、分析
した。コントロールとして同一量のＤＦＰ処理u−ＰＡ
のみを、架橋実施後(レーン５)又は直接(レーン６)、分
析した。レーン２の試料は、７５μlの細胞溶解質デタ
ージエント相を含んでおり、ＤＦＰ処理u−ＰＡを添加
することなく化学架橋に付した。試料は非還元条件下６
−１６％公配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動し、次いでニト
ロセルロース上エレクトロブロッティングした。シート
は、ウサギ抗−u−ＰＡＲ血清からの精製及び吸収ＩgＧ
(Ａ)と、又は、同一ウサギからの免疫前血清からの精製
及び吸収ＩgＧ(Ｂ)とインキュベートした。インキュベ
ーションの間のＩgＧ濃度は、両場合とも１２μg／mlで
あった。シートをウサギＩgＧに対するアルカリホスフ
ァターゼ結合抗体と共に発達させ、次いでアルカリホス
ファターゼ活性の検出を行なった。
【０１８２】図１９、４つのモノクローナル抗体による
１２５Ｉ−標識u−ＰＡＲ(Ｉ)及びu−ＰＡＲ(Ｄ)の免疫
沈澱。
【０１８３】精製u−ＰＡＲ(３０μg／ml)はキモトリプ
シン(４０ng／ml)により３７℃において７時間処理し
た。非分解インタクトu−ＰＡＲと分解u−ＰＡＲを
１２５Ｉ−ヨードによって放射標識した。３．５×１０
５cpm／mlに相当する１２５Ｉ−u−ＰＡＲ(Ｉ)及び
１２５Ｉ−u−ＰＡＲ(Ｄ)の量を材料(Materials)と方法
(Methods)に記載されたように免疫沈澱に付した。すべ
ての抗体溶液は同一濃度(２０μg／ml)であった。
【０１８４】Ａ．１２５Ｉ−u−ＰＡＲの免疫沈澱。レ
ーン１〜１０は次のサンプルを表す：出発物質、Ｐrot.
Ａ seph．溶液５０μl(コントロール)、アフィニティ精
製ウサギ抗u−ＰＡＲ血清、アフィニティ精製ウサギ前
免疫血清、２Ｒ，３Ｒ，１Ｒ，４Ｒ，モノクローナル抗
体のプール、抗ＴＮＰモノクローナル抗体(neg コント
ロール)。 Ｂ．１２５Ｉ−u−ＰＡＲ(Ｄ)。レーン１〜１０は上記
と同じ抗体を表す。
【０１８５】図２０、u−ＰＡＲに対して高められた４
つのモノクローナル抗体の反応性を示すウエスターンブ
ロット。
【０１８６】３×１０７ＰＭＡ−刺激u９３７とu９３７
a細胞から得られたトライトンＸ−１１４ディタージェ
ントを１つの大きなスロットで適用し、６〜１６％グラ
ジエントゲル上で非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
分析した。分離したタンパクをニトロセルロースに移
し、４つのモノクローナル抗体及びコントロール血清
(マウス抗u−ＰＡＲ血清とマウス非免疫血清)を使用す
るウエスターンブロッティングに付した。
【０１８７】Ａ．u９３７細胞からのサンプル。ニトロ
セルロースシート片を、モノクローナル抗体１Ｒ、２
Ｒ、３Ｒ、４Ｒを分泌するハイブリドーマからの消費メ
ディアの１：１希釈物(レーン１〜４)、1：500希釈マウ
ス抗u−ＰＡＲ血清(レーン５)及び１：500希釈マウス非
免疫血清(レーン６)と反応させた。分子量マーカーが示
されている。 Ｂ．u９３７a細胞からのサンプル。ニトロセルロースシ
ート片を上記のようにインキュベートした。
【０１８８】図２１、精製u−ＰＡＲの定量化を示す２
つの抗体サンドウィッチＥＬＩＳＡ。ＥＬＩＳＡは実施
例６に記載したように実施した。捕捉抗体として次のも
のを使用した：モノクローナル抗体４Ｒ、トリニトロフ
ェノール(ＴＮＰ)に対するモノクローナル抗体、実施例
４に記載されたように調製されたu−ＰＡＲに対するア
フィニティ精製ポリクローナルウサギ抗体及び実施例４
に記載されたように調製された前免疫血清、濃度２０μ
g／ml。精製u−ＰＡＲは、1：500〜１：32000の範囲で
２倍づつ連続的に加えた。検出抗体は濃度５００ng／ml
のビオチン化モノクローナル抗体２Ｒであり、パーオキ
シダーゼ結合アジビンは１：5000に希釈した。７分後酵
素基質反応により発色させ、４９０nmと５４０nmで測定
した。
【０１８９】Ｘ軸：精製u−ＰＡＲの２倍づつの連続希
釈 Ｙ軸：ＯＤ４９０nm／５４０nm。 Ａ：４Ｒ(黒丸)とＴＮＰに対するモノクローナル抗体
(白丸) Ｂ：ポリクローナルウサギ抗u−ＰＡＲ抗体(黒三角)と
ウサギ前免疫血清(白三角) 注意：u−ＰＡＲの希釈度１：500において、ＯＤ値は測
定するには高過ぎた。
【０１９０】図２２は、ｕ９３７細胞上のｕに結合した
ｐによるプラスミノーゲン活性化の動力学を示す。ＤＦ
Ｐ−ｐと抗ｕ抗体との競合によりｕに特異的に結合して
いることが証明された、ｐと共に前培養された９３７細
胞を、Ｇlu−プラスミノーゲン(０．０９〜２．２６μ
Ｍ)と共に培養した。プラスミンの生成速度をプラスミ
ノーゲン濃度に対して二重相反法でプロットした。Ｋm
は０．６７μＭとして決定され、Ｖmaxは０．０４３nＭ
min−１として決定されたが、これは実験的に決定され
た細胞結合ｐ濃度７．７pＭにおいて、Ｋcat ５．６min
−１に相当する。
【０１９１】図２３、酸洗９３７細胞を種々の濃度のモ
ノクローナル抗体３Ｒと培養し、細胞にｐを結合させた
ときの残留ｐ触媒細胞表面プラスミノーゲン活性化。残
留ｐ活性(すなわちプラスミン産生速度)は、抗体と培養
されなかった細胞に比較した％で示される。示されたデ
ータは３回の独立した実験による平均±標準偏差であ
る。
【０１９２】図２４、酸洗９３７a細胞をモノクローナ
ル抗体１(パネルＡ)、２Ｒ(パネルＢ)、３Ｒ(パネルＣ)
および４Ｒ(パネルＤ)の各々２μg／mlの存在又は不存
在下３０分間前培養し、ｐｒｏ−ｐ、プラスミノーゲン
２及び蛍光性プラスミン基質Ｈ−Ｄ−Ｖal−Ｌeu−Ｌys
−７−アミド−４−メチルクマリンと培養した。
【０１９３】(△)細胞不存在下におけるプラスミン産
生、(□)抗体と前培養された９３７aの存在下における
プラスミン産生、(▽)抗体なしの９３７aの存在下にお
けるプラスミン産生。
【０１９４】図２５は、ｃＤＮＡサブクローンpＨＵＲ
０６から生じたアンチセンスＲＮＡを用いるヒト結腸腺
癌のパラフィン部分へのハイブリダイゼーションを示
す。侵襲ホーカス（ａ及びｂ）における分裂腫瘍腺は、
腫瘍細胞のストランドの前縁における細胞へのハイブリ
ッド形成を示す（ｂにおける矢印；ｂはａにおける正方
形領域の拡大である）。密着細胞から成る腫瘍腺におい
て、ハイブリダイゼーション信号は悪性上皮のアルブミ
ン表面における細胞上に位置する（ｃ；矢印）か、腺の
周りの間質組織に存在する細胞上に位置する（ｄ；矢
印）。新血管新生の領域において、間充組織由来と思わ
れる細胞はハイブリッド形成を示す（ｅ）。倍率：２１
６×（ａ）、５４０×（ｂ−ｄ）、８７０×（ｅ）。
【０１９５】図２６、結腸腺癌の一例のモノクローナル
抗ｕ−ＰＡＲ抗体クローンＲ２による免疫染色（Ａ）。
腫瘍−間質界面（点線）に位置する多数の腫瘍細胞（直
線矢印）はｕ−ＰＡＲに対し強陽性である。断面におけ
る僅かな陽性組織球（曲線矢印）についても注目された
い。陰性コントロール（抗ＴＮＰ）抗体（ｂ）について
は染色が認められない。
【０１９６】図２７、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの間の結合
阻止についての化合物スラミンの効果は、２種の抗体サ
ンドイッチＥＬＩＳＡとして構成され、実施例９に説明
されているように実施された物質スクリーニングＥＬＩ
ＳＡで試験された。Ｒ４は２０μｇ／ｍｌの濃度におい
て捕捉抗体として用いられた。精製ｕ−ＰＡＲは２０ｎ
ｇ／ｍｌの濃度で加えられた。ＤＦＰ−ｕ−ＰＡは最終
濃度５ｎｇ／ｍｌとなるようにブロッキングバッファー
と共に又は３倍連続希釈濃度のスマリンとの混合物の状
態で加えられた。検出抗体は、濃度２μｇ／ｍｌのビオ
チン化抗ｕ−ＰＡ抗体クローン５であり、パーオキシダ
ーゼ結合アビジンは１：５０００に希釈された。３分後
酵素−基質反応により発色させ、４９０ｎｍおよび５４
０ｎｍで測定された。コントロールとして、検定の種々
の工程において反応試剤を省略したものを使用した。
【０１９７】Ｘ軸：スマリンの３倍連続希釈 Ｙ軸：４９０ｎｍ／５４０ｎｍにおける吸光度 ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ単独（△）、ＤＦＰ−ｕ−ＰＡとスラ
ミン（□）、ブロッキングバッファー（▽）。
【０１９８】図２８は、１２５Ｉ標識ＡＴＦとｕ−ＰＡ
Ｒの間の交差結合の化合物スラミンによる阻止をスラミ
ンの存在または不存在下、ＨＥｐ−２細胞分解物中の
１２５Ｉ標識ＡＴＦのｕ−ＰＡＲへの化学交差結合の測
定により決定したものを示す。次のスラミン濃度（ｍｇ
／ｍｌ）を使用した：０（レーン２）、０.１（レーン
３）、０.２５（レーン４）、１.０（レーン５）、２.
５（レーン６）、１０.０（レーン７）。レーン１は、
細胞分解物の代わりにバッファーを加え、スマリンを加
えない陰性コントロールを示す。右の方への数はマーカ
ープロテインの分子性マスを示す。スマリンは、図から
明らかなように、ｕ−ＰＡＲとリガンド１２ ５Ｉ標識Ａ
ＴＦの間の結合反応を用量依存的に阻止することが見い
だされた。スマリン１ｍｇ／ｍｌの濃度においては結合
活性は検出されず、０.１ｍｇ／ｍｌのスマリン濃度で
は結合活性５０％以上の阻止率が得られた。結合活性
は、放射標識共有結合の形成として定義された。
【０１９９】図２９は内因的に産生されたｐｒｏ−ｕ−
ＰＡのＰＡＲに対する結合について、モノクローナル抗
体３Ｒの存在下における培養ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞
の効果を示すものであって、これはエリスら（１９８９
年）に記載されたメカニズムによってプラスミノーゲン
活性化を伝達する結合ｐｒｏ−ｕ−ＰＡの活性によって
決定された。抗体３Ｒは、プラスミノーゲン発生速度
を、抗体の不存在下に培養されたコントロール細胞の２
０％まで低下させたが、これは３Ｒが内因的に分泌され
たｐｒｏ−ｕ−ＰＡのＰＡＲへの結合を阻止するのに有
効であり、またその機能的活性を証明するものである。
【０２００】図３０、イン・ビトロおよびイン・ビボで
成長した腫瘍細胞のＸ−ガル染色。細胞と腫瘍は固定
し、Ｘ−ガル染色の処理を行った（実施例９参照）。
Ａ：ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＢＡＧ細胞；Ｂ：通路２０に
おけるＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＢＡＧ細胞；Ｃ：皮下ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１キセノグラフト；Ｄ：ヌードマウスに
おける皮下ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＢＡＧキセノグラフト
通路２。
【０２０１】図３１Ａ：一次元ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｂ
ＡＧ腫瘍の冷凍断片。腫瘍組織は冷凍切断処理に付し、
Ｘ−ガル染色を行った（実施例９参照）。腫瘍細胞のみ
がＸ−ガルにより陽性に染色された。 ＴＴ：腫瘍組織。ＭＴ：マウス組織。 ３Ｂ−Ｄ：二次元ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＢＡＧ腫瘍の巨
視的外観。Ｘ−ガルによる全臓器染色。Ｂ：肝臓；Ｃ：
脾臓と膵臓；Ｄ：腸管。 ３Ｅ−Ｇ：ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＢＡＧ腫瘍細胞のマウ
ス肺への転移性拡がり。Ｅ：肺転移の巨視的外観；Ｆ：
単一肺転移（矢印）；Ｇ：３Ｆに見られる肺転移の組織
学的断片、Ｈ.Ｅ.染色、４０Ｘ。 ３Ｈ：ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＢＡＧ腫瘍細胞で皮下的に
接種されたマウスからの腹水のＸ−ガル染色。
【０２０２】
【実施例】実施例１ ｕ−ＰＡＲの精製および特性決定 物質および方法 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：特に説明しない場合、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥは、Ｕ.Ｋ.ラエムリの方法［「クリーベイジ・オブ
・ストラクチュラル・プロテインズ・デュアリング・ジ
・アセンブリー・オブ・ザ・ヘッド・オブ・バクテリオ
ファージＴ４」、ネーチャー、２２７巻、６８０〜６８
２頁（１９７０年）］により、６−１６％勾配の平板ゲ
ルを使用して実施した。試料の前処理は、非還元条件下
では煮沸せずに実施した。還元条件を使用した場合は、
試料を２０mM ＤＴＴの存在で５分間煮沸した。
【０２０３】ファスト・ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥはファス
ト・ゲル装置（ファーマシア）で既製の１０−１５％勾
配ゲルを使用して実施した。電気泳動は製造業者の指示
にしたがい実施した。銀染色はホイケスホーフェンおよ
びデルニックの方法（１９８８年）により実施した。
【０２０４】アミノ酸分析またはＮＨ２末端アミノ酸配
列決定のため、電気ブロットする試料のトリシン−ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥは、シェーガーおよびフォン・ヤゴフ（１
９８７年）にしたがい、ミニ・プロテアンII装置（バイ
オ・ラド）で、０.７５mmの均質な７.７％Ｔ、３％Ｃゲ
ルで実施した。スカベンジャーとして１２mM ３−メル
カプトプロパン酸を添加したゲル緩衝液中で、ゲルを１
５mAで３時間予備電気泳動した。４０mMジチオトレイト
ールを還元剤として含有する試料緩衝液５０μlへ、凍
結乾燥した試料を直接溶解し、２分間煮沸した。予備電
気泳動に使用したゲル緩衝液を電気泳動用緩衝液と取り
換えたのち、６０Ｖで電気泳動を４時間実施した。
【０２０５】アミノ酸分析またはＮＨ２末端アミノ酸配
列決定のための試料の電気ブロッティング：電気泳動の
のち、半乾燥電気ブロッティング装置（ＪＫＡ・インス
トルメンツ、デンマーク）を使用し、トリシン−ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲルを二フッ化ポリビニリデン
（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア）上へ電気ブロットした。電
気ブロットは、０.４mMジチオエリトリトールおよび１
０％メタノールを含有する１０mM ＣＡＰＳ［３−（シ
クロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸］中
で、ｐＨ１１.０で起こり、０.８mA／cm２で２時間実施
した。タンパク質をクーマシーＲ２５０で２分間染色
し、短時間脱染色し、ついで水洗することにより位置を
突き止めた（マツダイラ、１９８７年）。
【０２０６】電気ブロットしたタンパク質のアルキル化
およびアミノ酸配列決定：クーマシー染色したタンパク
質バンドをＰＶＤＦ膜から切り出し、暗所、室温で、５
０mMホウ酸ナトリウム（ｐＨ８.０）中、２５mMヨード
酢酸アミドで１時間処理した。反応後、水で十分に洗浄
し、アルゴン大気下で乾燥した。乾燥フィルター上のタ
ンパク質をアプライド・バイオシステムズ４７７Ａ型タ
ンパク質配列解析器で配列決定した。ＰＴＨアミノ酸誘
導体のためのオン・ラインＨＰＬＣ同定システムはカル
ボキシメチルシステインの誘導体を含有していた（変換
中にアミドメチル誘導体の脱アミド化によって生成）。
この誘導体の正確な同定は、これと平行して行ったニワ
トリ・リゾチーム（６番目の残基にシステインを有す
る）の調製用電気泳動、電気ブロッティング、およびア
ルキル化したのち、試験的配列決定によって確認した。
【０２０７】アミノ酸組成およびアミノ糖の測定：電気
ブロットしたｕ−ＰＡＲの加水分解のため、クーマシー
染色し、その位置でアルキル化したタンパク質を含有す
るＰＶＤＦ膜の領域を、真空下に０.０５％フェノール
含有６Ｍ塩酸で１１０℃で２０時間処理した。ポストカ
ラム−Ｏ−フタルジアルデヒド同定システムを装備した
ウオーターズ・アミノ酸分析装置でアミノ酸分析を実施
した（バークホルトおよびジェンセン、１９８９年）。
【０２０８】分析研究のための細胞培養：下記のヒト細
胞系を括弧内に示した供給源から得た。組織球性リンパ
腫細胞系Ｕ９３７（Ｕ９３７ａと命名）（Ｅ.Ｋ.Ｏ.ク
リュイトフ、ユニバーシティー・ホスピタル・センタ
ー、ローザンヌ、スイス）、この細胞系の変異株（Ｕ９
３７ｂと命名）（Ａ.ファトロッシ、リサーチ・ラボ・
オブ・アエロナウティカ・ミリターレ、ローマ、イタリ
ア）、前骨髄性白血病細胞系ＨＬ−６０（アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ））、膀
胱癌細胞系５６３７（ＡＴＣＣ）、喉頭表皮癌細胞系Ｈ
Ｅｐ−２（ＡＴＣＣ）、表皮癌細胞系Ａ−４３１（Ｅ.
ヘルセス、ユニバーシティー・オブ・トロンハイム、ノ
ルウェー）、子宮頚癌細胞系ヒーラー（ＡＴＣＣ）、大
腸癌細胞系ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ）、結膜細胞系チャ
ング（ＡＴＣＣ）、絨毛膜癌細胞系ＪＥＧ−３（Ａ.バ
ヘリ、ユニバーシティー・オブ・ヘルシンキ、フィンラ
ンド）、羊膜細胞系ＡＶ３（ＡＴＣＣ）、線維肉腫細胞
系ＨＴ−１０８０（Ａ.バヘリ）。Ｕ９３７およびＵ９
３７ａおよびＨＬ−６０細胞は懸濁で増殖したが、他の
すべての細胞は単層で増殖した。ＨＴ−１０８０および
Ａ−４３１細胞は、加熱失活させた１０％ウシ胎児血清
を含有するダルベッコの修飾したイーグルの培地で増殖
した。他のすべての細胞系は加熱失活させた５％ウシ胎
児血清および２mM Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ
１６４０培地で増殖した。すべての培地はペニシリン２
００単位／ml、ストレプトマイシン２５μg／mlを添加
した。すべての細胞は５％ＣＯ２を加えた加湿大気下で
３７℃で培養した。付着細胞はゴムかき取り器で回収し
た。Ｕ９３７細胞のＰＭＡ誘発は、（０.５〜１）×１
０ ６細胞／mlの密度で１５０nM ＰＭＡで実施した。細
胞がプラスチック表面へ付着する場合は、４日間処理を
行った。ＰＭＡ誘発した付着性Ｕ９３７細胞はゴムかき
取り器で回収した。
【０２０９】Ｕ９３７細胞の大規模生産：１リットルの
スピンナーフラスコ中で、２mM Ｌ−グルタミン、５％
ウシ胎児血清（加熱失活）、ペニシリン２００単位／m
l、ストレプトマイシン２５μg／mlを補給した（または
抗生物質を加えない）ＲＰＭＩ １６４０培地で、Ｕ９
３７ａ細胞を（１.０〜１.５）×１０６細胞／mlの密度
に達するまで増殖した。各フラスコは細胞培養５００ml
を含んでいた。
【０２１０】Ｕ９３７細胞のホルボール−１２−ミリス
テート−１３−アセテート（ＰＭＡ）誘発および回収：
１スピンナーフラスコの５００ml細胞浮遊液を、新たに
調製した無血清培地１リットルへ加えた。ジメチルスル
ホキシドで貯蔵したＰＭＡ貯蔵液（１ml当たりＰＭＡ１
mg）１５０μlを最終濃度１５０nM ＰＭＡに達するまで
添加した。培養を１０層の重層細胞培養装置（ヌンク、
デンマーク）へ移し、この装置で３.５日間増殖させ
た。ＰＭＡ溶液を添加すると、細胞は分裂を停止し、表
面へ付着した。
【０２１１】付着性の少ない多数の細胞をなお含んでい
る１.５リットルの上清を回収した。一層強く付着して
いる細胞は、装置を０.１％ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ
（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含有せず）５００mlで洗浄
し、激しく振とうすることによって回収した。２つの細
胞浮遊液をプールして合計２リットルの回収液を得た。
細胞を遠心によって採取した。
【０２１２】細胞溶解および界面活性剤層分離：ＰＭＡ
刺激したＵ９３７細胞をニールセンらの報告（１９８８
年）のように洗浄し、酸処理した。細胞溶解緩衝液２０
ml［０.１Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８.１）、１％トリト
ンＸ１１４、１０mM ＥＤＴＡ、１０μg／mlアプロチニ
ン］および１００mMフェニルメチルスルホニルフルオリ
ドのジメチルスルホキシド溶液０.２mlを、酸処理細胞
１０９へ０℃で加えた。懸濁液を完全に混合し、氷上で
５分間放置し、再混合してさらに５分間０℃で放置した
のち、４℃、１６０００×ｇで、１０分間遠心により液
を透明にした。
【０２１３】透明にした細胞溶解物を、３７℃で１０分
間インキュベーションして熱誘発による層分離処理（ボ
ージャー、１９８１年）をしたのち、２０℃、１８００
×ｇで１０分間遠心によって、界面活性剤層を採取し
た。上層を棄てた。０.１Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８.
１）１８mlを下層（約２ml）へ０℃で加えることによっ
て洗浄し、ついで完全混合によって透明な単一層の溶液
を回復させ、前記のように加熱・遠心によって層分離を
繰り返した。
【０２１４】新しい上層を除去後、０.１Ｍトリス／Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８.１）の添加により下層を２０mlとした。
その後の操作および精製の間に、新たな層分離を避ける
ため、３−（（３−コールアミドプロピル）ジメチルア
ンモニウム）−１−プロパンスルホン酸塩（ＣＨＡＰ
Ｓ）（１０％ｗ／ｖ）５００μlを添加して、透明単一
な層の界面活性剤画分を得た。微量の不溶性物質を、４
℃で３３００×ｇ、１５分間の遠心によってこの溶液か
ら除去した。
【０２１５】これと同様な方法で、ただし一層少量の細
胞物質を使用して、他の細胞型（前掲）から細胞溶解物
および界面活性剤層を作成した。すべての試薬量を比例
的に減量した。１実験では１％トリトンＸ１１４の代わ
りに０.５％ＣＨＡＰＳを細胞溶解界面活性剤として使
用した。この実験では、層分離は起こらなかった。
【０２１６】アフィニティーマトリックスの作成：ｕ−
Ｐａ（セロノ）２.５×１０６ＩＵ（約２５mg）を０.１
Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８.１）、０.１％ツイーン８０
２５mlに溶解した。新しい５００mMジイソプロピルフ
ルオロホスフェート（ＤＦＰ）のイソプロパノール保存
溶液２５０μlを添加し、３７℃で４時間インキュベー
トし、最初の２時間後、さらに同量のＤＦＰを追加する
ことによって、酵素を失活させた。
【０２１７】０.２５Ｍ ＮａＨＣＯ３、０.５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０.１％トリトンＸ−１００（ｐＨ８.５）に対して
０℃で十分に透析することによって反応を停止させた。
【０２１８】容量合計５０ml中の透析した物質を、０.
２５Ｍ ＮａＨＣＯ３、０.５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８.５）
（カップリング緩衝液）で新たに平衡化したＣＮＢｒ−
活性化セファロース（ファーマシア）１２.５mlへ結合
した。反応を４℃で１夜進行させ、１Ｍエタノールアミ
ン／ＨＣｌ（ｐＨ８.０）でマトリックスを平衡化し、
４℃で２４時間インキュベートすることにより反応を停
止させた。マトリックス（ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ−セファロ
ース）をカップリング緩衝液で洗浄し、使用前、好適な
溶出緩衝液（後出、参照）で予備溶出した。
【０２１９】アフィニティー精製：Ｕ９３７ａ細胞６×
１０９から得られた透明にした界面活性剤画分を洗浄緩
衝液−１［１０mMリン酸ナトリウム、１４０mM塩化ナト
リウム、０.１％ＣＨＡＰＳ（ｐＨ７.４）］１容量で希
釈し、上記と同じ緩衝液で平衡化したＤＦＰ−ｕ−ＰＡ
−セファロース８mlを含有するカラムでクロマトグラフ
ィー精製を行った。試料を適用後、カラムを洗浄緩衝液
−１で洗浄し、ついで洗浄緩衝液−２［１０mMリン酸ナ
トリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、０.１％ＣＨＡＰＳ
（ｐＨ７.４）］で洗浄した。カラムを溶出緩衝液［０.
１Ｍ酢酸、０.５Ｍ塩化ナトリウム、０.１％ＣＨＡＰＳ
（ｐＨ２.５）］で下方から溶出した。溶出後、直ちに
０.１Ｍリン酸ナトリウム、１.０Ｍ炭酸ナトリウム（ｐ
Ｈ９.０）の好適な容量を溶出画分へ添加することによ
りｐＨ７.５に調節した。ウロキナーゼの１２５Ｉ−標
識アミノ末端（ＡＴＦ）断片へ化学的に橋架けし、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって、
ｕ−ＰＡＲ含有画分を同定した。アミノ酸分析またはＮ
Ｈ２末端アミノ酸配列決定のため精製したｕ−ＰＡＲ試
料を、０.１％酢酸に対して透析し、凍結乾燥した。
【０２２０】１２５Ｉによるタンパク質の標識：ＡＴＦ
の１２５Ｉ−標識を、先の報告と同様に（ニールセン
ら、１９８８年）、ただし０.１％トリトンＸ−１００
を０.０１％ツイーン８０で置き換えて実施した。０.１
％酢酸に対して透析後、凍結乾燥によって濃縮した精製
ｕ−ＰＡＲタンパク質１.５μgを、容量２５μl中、１
２５Ｉ ２５０μCiで処理して同様の方法によりヨウ素
化した。
【０２２１】化学的な橋架け検定：複合体混合物または
精製した画分中のｕ−ＰＡＲの１２ ５Ｉ−標識ＡＴＦへ
の橋架け反応を、可溶化した受容体に関して報告した方
法（ニールセンら、１９８８年）と同様に、架橋剤とし
て２mMジスクシンイミジルスベリン酸（ＤＳＳ）を使用
して実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色による分
析のため、精製したｕ−ＰＡＲのＤＦＰ処理したｕ−Ｐ
Ａへの橋架け反応を、これと同じ方法で、ただし非標識
ＤＦＰで処理したｕ−ＰＡをリガンドとして使用して、
実施した。
【０２２２】酵素的脱グリコシル化：細胞溶解物および
界面活性剤画分中のｕ−ＰＡＲに対する脱グリコシル化
研究のため、分解前に、受容体を１２５Ｉ−標識したＡ
ＴＦへの化学的橋架け反応により選択的に標識した。
【０２２３】凍結乾燥し、精製したｕ−ＰＡＲは直接放
射性ヨウ素化された。Ｎ−結合した炭水化物を完全に除
去するため、ＳＤＳおよびジチオトレイトールを、それ
ぞれ最終濃度０.５％および１.６mMまで添加して３分間
煮沸する緩和な還元条件下で、試料を変性させた。変性
させた試料のアリコート（１０μl）を、ペプチド：Ｎ
−グリコシダーゼＦ １単位（Ｎ−グリカナーゼ、ゲン
ザイム）添加または酵素無添加で、容量合計３０μlで、
２００mMリン酸ナトリウム（ｐＨ８.６）、１.５％トリ
トンＸ−１００、１０mM １,１０−フェナントロリン
（メタノール貯蔵液から添加）を含有するように調節し
た。脱グリコシル化を３７℃で２０時間実施した。ＣＨ
ＡＰＳで溶解後、得られた非分画の細胞溶解物の研究で
は、還元のため、ジチオトレイトールの代わりに１００
mM β−メルカプトエタノールを使用し、脱グリコシル
化では、１,１０−フェナントロリンの代わりに１０mM
ＥＤＴＡを含有させた。
【０２２４】脱シアル酸するため、１２５Ｉ−ＡＴＦへ
の橋架け反応によって標識した細胞溶解物７０μlを０.
０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.０）で２００μlへ増量
した。混合物の９０μlアリコートを３３ng／μlノイラ
ミニダーゼ（ベーリンガー−マンハイム）１４μlまた
は無酵素で処理した。脱シアル酸は３７℃で１夜実施し
た。
【０２２５】結果：精製：ＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞
を酸処理して、表面結合したｕ−ＰＡがあれば除去し、
緩衝液を含有するトリトンＸ−１１４で細胞溶解した。
界面活性剤抽出物を温度誘発層分離で処理し、単離した
界面活性剤層をアフィニティークロマトグラフィーの原
料として使用した。酸溶出物を中和して、直接または
０.１％酢酸に対する透析により濃縮し凍結乾燥したの
ち、これを分析した。精製物質の電気泳動の挙動を第１
図に示す。
【０２２６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色のあと（第
１Ａ図）、溶出したタンパク質は１本の幅広いバンドと
して約５５〜６０ｋＤａの範囲を含んで移動した。この
範囲の外側では、タンパク質物質は検出されなかった。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを非還元条件下で実施すると、同一の
見掛けの分子質量を有する単一のバンドが認められた
（第１ｃ図、レーン５）。
【０２２７】ＡＴＦに対するウロキナーゼの結合活性の
分析を、１２５Ｉ−標識したＡＴＦへの化学的橋架け反
応、ついでＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフ
ィーにより実施した。ＡＴＦ結合活性が銀染色可能なタ
ンパク質と一緒に溶出した。ＡＴＦと精製タンパク質と
の間に生成した複合体は、電気泳動の間、７０〜７５ｋ
Ｄａの１成分として移動した（第１Ｂ図、レーン２）。
部分的に精製したｕ−ＰＡＲで以前に示したように（ニ
ールセンら、１９８８年）、生成した複合体は、無傷の
ＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞でＡＴＦによって生成した
橋架け反応生産物（成績は示さない）、およびこれと同
じ細胞からの未精製の界面活性剤抽出物中の橋架け反応
生産物と判別ができなかった。１２５Ｉ−標識したＡＴ
Ｆへの結合および橋架け反応は、特異的であり、かつ可
飽和であった。即ち、この結合は過剰の非標識ＡＴＦ、
活性なｕ−ＰＡ、またはＤＦＰ処理したｕ−ＰＡによっ
て競合できたが、例えばウシ胎児血清アルブミンのよう
な無関係なタンパク質、またはｔ−ＰＡ、プラスミノー
ゲン、または上皮細胞増殖因子のような関連タンパク質
では競合が得られなかった（第１Ｂ図）。
【０２２８】精製したタンパク質の機能的完全性および
純度を研究するため、橋架け実験を非標識成分で実施し
た（第１Ｃ図）。このリガンドが高分子量であるため、
精製したタンパク質自身からＳＤＳ−ＰＡＧＥから明瞭
に分離し得る複合体を生じるはずであるので、この実験
ではＡＴＦの代わりに、ＤＦＰ処理したｕ−ＰＡをｕ−
ＰＡＲ特異的なリガンドとして選んだ。精製した標品中
に存在しているすべてのタンパク質物質が、非標識リガ
ンドへ結合できることが認められ（レーン４および３を
比較）、したがってｕ−ＰＡＲに対する本質性（ニール
センら、１９８８年）、および精製したタンパク質の純
粋性が確かめられた。実際、結合能は標品中で銀染色に
よって検出され得るタンパク質だけの特性であった。
【０２２９】アミノ酸分析による定量化の結果、６×１
０９細胞からの精製収率はポリペプチド６〜９μg（ｕ
−ＰＡＲ糖タンパク質約１０〜１５μgに対応する、後
記）であることが判明した。
【０２３０】アミノ酸組成およびＮＨ２末端アミノ酸配
列：調製用電気泳動、電気ブロッティング、およびヨー
ド酢酸アミドによるアルキル化後の精製タンパク質のア
ミノ酸組成を第１表に示す。この組成は、注目すべき高
含量のシステイン残基を含んでいる。さらにリシン残基
の存在が若干少ないことが注目される。使用した分析系
では、アミノ酸以外にもグルコサミンおよびガラクトサ
ミンの定量ができる。グルコサミンは加水分解中の損失
分を補正すると、タンパク質１モル当たりＮ−アセチル
グルコサミン約３０モルに対応する量で検出された。こ
れに反して、ガラクトサミンは全く同定されなかった。
酸加水分解後、極めて多数のグルコサミン残基が検出
可能であること、およびペプチド：Ｎ−グリコシダーゼ
Ｆ処理（後記）によって見掛けの分子質量の著しい減少
が生じたことは、Ｎ−結合した炭水化物の大きい側鎖が
タンパク質に存在していることを示している。ガラクト
サミンが全く検出できなかったことは、この型のＯ−結
合炭水化物がｕ−ＰＡＲに存在しないことを示してい
る。然し、アミノ酸分析による検出をまぬがれ得るその
他のＯ−結合オリゴ糖の存在を除外することはできな
い。
【０２３１】２種類のアミノ酸配列決定実験を実施し
た。第１の配列決定実験では、透析および凍結乾燥のの
ち、アフィニティー精製したｕ−ＰＡＲの直接的なＮＨ
２末端配列決定を実施した。部分配列（第２Ａ表）が得
られ、このことは１配列だけが精製した物質に存在して
いることを示している。
【０２３２】第２の配列決定実験では、透析し、凍結乾
燥し、精製したｕ−ＰＡＲをトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにかけ、ＰＶＤＦ膜上へ電気ブロットし、クーマシー
染色し、アルキル化して、上記のように切り出して、つ
いでＮＨ２末端配列決定を行った。この配列を第２Ｂ表
に示す。
【０２３３】第２表に示されるように、この２つの配列
を比較すると、同定したすべてのアミノ酸残基が同一で
あることが判る。また第２の実験だけで同定された３
位、６位、１２位は、すべてシステインであることが判
った。即ち、最初の実験でこれら位置の同定が何れもで
きなかったのは、アルキル化が欠けていることに起因し
ていた。標品中で唯一検出可能なＮＨ２末端配列は、ｕ
−ＰＡＲの電気泳動の移動を伴っていた。したがって、
例えばポリペプチド主鎖に伴う低分子量のペプチド成分
の形で隠されている追加的な配列はなかった。
【０２３４】ジョージタウン・ユニバーシティー・タン
パク質データベースによる探索では、ｕ−ＰＡＲ ＮＨ
２末端アミノ酸配列の本質は明らかにならず、また既知
のどのタンパク質との際立った相同性も明らかにならな
かった。
【０２３５】アミノ末端は、タンパク質全体のアミノ酸
組成と同様にシステイン残基に富んでいる。
【０２３６】プローブ組み立てのためのデータ（実施例
２）を第２Ａ表に示した配列から誘導した。この組み立
てのため、アミノ酸配列の６位は試験的にＡｓｎを割り
当てた（第２Ａ表の脚注ａ参照）。
【０２３７】グリコシル化：精製した１２５Ｉ−標識し
たｕ−ＰＡ受容体をペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦで
処理した。この酵素はあらゆる種類のＮ−結合炭水化物
を除去することができ、その切断部位はアスパラギン側
鎖と最も内部のＮ−アセチルグルコサミン残基との間で
ある（タレンチノら、１９８５年）。第２図に脱グリコ
シル化したタンパク質の電気泳動の挙動を示す。１２５
Ｉ−標識したタンパク質のオートラジオグラフィー後に
観察された電気泳動のバンドは、直接タンパク質染色後
に見られるより常に僅かに幅広いバンドを示した。然
し、反応が、不均一な５５〜６０ｋＤａ受容体（レーン
１）を遥かに尖鋭なバンドとして移動する３５ｋＤａだ
けの脱グリコシル化されたタンパク質（レーン２）へ変
えるので、したがって最初の不均一な物質は、すべて同
一のタンパク質の変異体を現していることがさらに確認
された。
【０２３８】細胞系間のグリコシル化の不均一性および
変異：別の実験系で、受容体を含有している細胞溶解物
からの未精製の界面活性剤画分、または未分画の溶解物
を、上記で使用したのと同一の酵素で処理した。これら
の実験では、ウロキナーゼの １２５Ｉ−標識したアミノ
末端断片（ＡＴＦ）への化学的橋架け反応により（ニー
ルセンら、１９８８年）、脱グリコシル化反応の前に、
ｕ−ＰＡＲの選択的な標識を実施した（ニールセンら、
１９８８年）。
【０２３９】第３図から、受容体を精製した細胞溶解物
は、７０〜７５ｋＤａのｕ−ＰＡＲ−ＡＦＴ複合体を生
じ（レーン１）、これは脱グリコシル化されて約５０ｋ
Ｄａの生産物を生じ得ることが判る（レーン３）。ＡＦ
ＴがＮ−結合炭水化物を含有していることは知られてい
ない。即ち、見掛けの分子質量で起こる変化は、前記の
精製したタンパク質で見られた変化と同一であるので、
この実験は、認められた大量のグリコシル化が、事実、
これらの細胞の界面活性剤溶解物中で、唯一有意なＡＦ
Ｔ結合成分の特性であるということの独立した証拠を提
供した。
【０２４０】刺激されていないＵ９３７細胞抽出物で橋
架け反応を実施すると（第３図、レーン２）、生成した
複合体は、ＰＭＡ刺激後に認められるより僅かに高い電
気泳動移動度で再現性をもって移動し、その場合の見掛
けの分子質量は７０ｋＤａであった。然し脱グリコシル
化すると、ＰＭＡ処理した細胞および未処理の細胞から
の複合体は判別できなくなった（レーン３および４を比
較）。したがってＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞から精製
した受容体は、無刺激細胞に存在している受容体のグリ
コシル化変異体であった。
【０２４１】他の細胞系から得られた界面活性剤による
細胞溶解物をＡＦＴへの化学的橋架け反応によって分析
すると、ある場合には、放射能標識した生産物の電気泳
動移動度における変化が観察された。これらの分析で、
比較のため、種々の細胞型間のｕ−ＰＡＲ含量の大きな
変化を補正するには希釈要素の個々の調節が必要であっ
た（ニールセンら、１９８８年）。ただし別々の実験で
は、希釈が個々の複合体の移動に対して影響を与えない
ことが確かめられた。
【０２４２】上記のパタンを含め、合計４種類の区別で
きる電気泳動パタンが判明した。以前報告したように
（ニールセンら、１９８８年）、細胞系の大多数は、例
えばＰＭＡで処理しなかったＵ９３７細胞の場合のよう
に７０ｋＤａの単一の複合体バンドを生じた（第３図、
レーン２）。即ち、このパタンは、例えばＡ−４３１表
皮癌細胞、ヒーラー子宮頚癌細胞、５６３７膀胱癌細
胞、ＨＣＴ１１６大腸癌細胞、ＡＶ３羊膜細胞、ＪＥＧ
−３絨毛膜癌細胞、およびチャング結膜細胞で認められ
た。
【０２４３】線維肉腫細胞系ＨＴ−１０８０は第３のｕ
−ＰＡＲ変異体を含んでおり、僅かに低分子量の単一な
複合バンドを生じた（約６５ｋＤａ、データは示さ
ず）。
【０２４４】第４のパタンは、精製の原料として使用し
た株とは異なったＵ９３７細胞株の研究で見いだされ
た。ＰＭＡで処理しないと、この株（Ｕ９３７ａと命名
する）は、上記のＵ９３７細胞が示したのと同一の複合
体バンドを示した。然しＰＭＡ処理に対する反応は、再
現性を伴って異なっていた。即ち、ＰＭＡ処理したＵ９
３７ａ細胞は２つの複合バンドを生じた。最高のバンド
はＰＭＡ処理したＵ９３７で認められたものと同一であ
るようであった。低い方のバンドは尖鋭に出現し、５５
ｋＤａ成分として移動した（データは示さず）。このバ
ンドは可溶化した物質で橋架け反応後にだけ認められ
た。無傷の細胞で橋架け反応を実施すると（ニールセン
ら、１９８８年）、最高のバンドだけが存在し（データ
は示さず）、したがって低い方のバンドは細胞内前駆
体、または受容体の分解産物を現したものであり得るこ
とを示唆している。
【０２４５】然し上記の４種類のパタンを現す試料を
１２５Ｉ−ＡＴＦへ橋架け反応したのち、酵素的な脱グ
リコシル化で処理すると、分子量の変化は消失した。生
じた複合体バンドは、親細胞系の本質とは無関係に尖鋭
で、５０ｋＤａ成分として移動した（データは示さ
ず）。
【０２４６】即ち、Ｎ−結合グリコシル化は、ＰＭＡ刺
激したＵ９３７系の範囲内、およびＰＭＡ刺激したＵ９
３７系で２つのバンドを生じる分子ｕ−ＰＡＲの不均一
性に起因しているだけでなく、無刺激のまたはＰＭＡ刺
激したＵ９３７細胞からのｕ−ＰＡＲ間の電気泳動上の
差異、および異なった細胞系間の変異にも起因する（即
ち試験した他の細胞系とＨＴ−１０８０線維肉腫細胞を
比較して）。
【０２４７】シアル酸の除去：上述した未精製の界面活
性剤画分中のｕ−ＰＡＲのための橋架け標識方式を、酵
素的な脱シアル酸の研究に使用した（データは示さ
ず）。ＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞からの橋架け界面活
性剤画分のノイラミニダーゼ処理によって、ＡＴＦ−ｕ
−ＰＡＲ複合体の見掛けの分子量で約５ｋＤａの減少が
生じた。即ちグリコシル化は数個のシアル酸残基を含ん
でいた。ＰＭＡ刺激していないＵ９３７細胞を脱シアル
酸実験に使用すると、分子量の変化は疑いもなく存在す
るが、若干小さく出現した。然しながら予備的な比較で
は、シアル酸化はで無刺激のｕ−ＰＡＲとＰＭＡ刺激さ
れた細胞との間の全体的な差異を説明することはできな
いことが示唆された。
【０２４８】［第１表］ トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ、ＰＶＤＦ膜上への電気ブロッティング、およびアル
キル化ののちに測定した アフィニティー精
製したｕ−ＰＡＲのアミノ酸配列 Ａｓｐ／Ａｓｎ 33.2 （第１表つづき） Ｔｈｒａ 21.4 Ｓｅｒｂ 26.3 Ｇｌｕ／Ｇｌｎｃ 43.2 Ｐｒｏ 11.4 Ｇｌｙ 28.2 Ａｌａ 8.4 Ｃｙｓ（Ｃｙｓ(Ｃｍ)として） 28.4 Ｖａｌ 11.9 Ｍｅｔｄ 7.7 Ｉｌｅ 6.7 Ｌｅｕ 26.5 Ｔｙｒ 8.0 Ｐｈｅ 5.7 Ｈｉｓ 12.8 Ｌｙｓ 11.1 Ａｒｇ 20.0 グルコサミンｅ 30.8ａ 加水分解中の５％損失を補正ｂ 加水分解中の１０％損失を補正ｃ アミノ酸標準混合物におけるピロ−グルタミン酸の生
成のため、わずかに過剰刺激の可能性ｄ 電気泳動およびブロッティング（３５）の間に通常観
察される３０％損失を補正ｅ 加水分解中の５０％損失を補正
【０２４９】タンパク質７０ピコモルの加水分解をＰＶ
ＤＦ膜上で、２０時間直接実施した。残基数を計算し、
合計３１０残基と推定した。同一条件下で分析した標準
的なタンパク質で見いだされる補正要素にしたがい、電
気泳動および電気ブロッティング（Ｍｅｔ）および加水
分解中の損失（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、グルコサミン）に対す
る補正を実施した。
【０２５０】［第２表］ ｕ−ＰＡＲのＮ−末端アミノ
酸配列。括弧内は試験的に分類した同定を示す。疑問詞
は同定しなかったことを表す。脚注がある場合は、最良
の推定を示す。 Ａ. ０.１Ｍ酢酸に対して透析し、凍結乾燥後、アフィ
ニティー精製したｕ−ＰＡＲの直接配列決定。最初の収
量は第１段階で７０ピコモルのＰＴＨ−Ｌｅｕであっ
た。直接配列決定でシステイン残基の同定ができなかっ
たことに注意。 研究番号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 アミノ酸残基 Leu ? ? Met Gln ?ａ Lys Thr Asn Gly 研究番号 11 12 13 14 15 16 アミノ酸残基 Asp ? Arg Val (Glu) Glu ａAsn? Ｂ. トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、電気ブロッティング
およびアルキル化後に得られた配列。ＰＶＤＦ膜は、平
行して実施したアミノ酸分析実験から推定してｕ−ＰＡ
Ｒ３５ピコモルを含有している（第１表）。最初の収量
は第１段階でＰＴＨ-Ｌｅｕ１９.５ピコモルであった。
反復した収量はＬｅｕ１、Ｌｅｕ１９、およびＬｅｕ２
３に基づき９６％であった。Ｃｙｓはアルキル化したタ
ンパク質におけるカルボキシメチルシステインのＰＴＨ
誘導体の同定を示す。 研究番号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 アミノ酸残基 Leu ? Cys Met Gln Cys Lys Thr Asn Gly 研究番号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 アミノ酸残基 Asp Cys (Arg) Val Glu Glu (His) Ala Leu Gly 研究番号 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 アミノ酸残基 Gln ?ｂ Leu ?ｃ (Arg) Thr (Thr) Ile Val ? ｄ ｂAsp? ｃArg/Cys? ｄArg/Thr?
【０２５１】実施例２ ｕ−ＰＡＲのリガンド結合するドメインの単離および同
定 実験方法：精製ｕ−ＰＡＲは、上記と同様に、ホルボー
ル−１２−ミリスタート−１３−アセタート処理細胞か
ら得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製操作および銀染色で検出
可能なすべての蛋白質は上記と同様の化学的橋架試験に
おいて非標識ＤＦＰ−処理ｕ−ＰＡまたはＡＴＦへの結
合が可能であった。
【０２５２】酵素分解 キモトリプシン（６７ｕ／ｍｇ）およびトシルフェニル
クロロメチルケトン−処理トリプシン（２５５ｕ／ｍ
ｇ）はワーシントン・バイオケミカル・コーポレーショ
ン、フリーホールド、ニュージャージイからのものであ
る。エンドプロテイナーゼＧｌｕ−ＣおよびＬｙｓ−Ｃ
（配列決定用）およびブロメレインはベーリンガー・マ
ンハイム、ＦＲＧからのものである。分解条件の検討は
精製ｕ−ＰＡＲ（３μｇ／ｍｌ、上記と同様にして得ら
れた中性アフィニティカラム溶出液の形態を直接使用し
た）と、所定のプロテナーゼを希釈列で添加したものを
一夜インキュベートした（８ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍ
ｌ、またはＬｙｓ−Ｃの場合、〜０.２μｇ／ｍｌの範
囲の最終濃度）。キモトリプシンによる分解に関する系
統的な検討のために、精製ｕ−ＰＡＲを、上記と同様に
透析および凍結乾燥により濃縮し、０.０５Ｍトリス／
ＨＣｌ、０.０５％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ８.１中に最終濃度
３０μｇ／ｍｌに再溶解し、ついで（４０ｎｇ／ｍｌ、
または所定の）キモトリプシンを添加した。７時間３７
℃にてインキュベートした後、分解をフェニルメチルス
ルホニルフルオリド（メルク、ＦＲＧ）を添加して終了
させ、新鮮なジメチルスルホキシドの２０ｍＭ保存溶液
に添加した。
【０２５３】ｕ−ＰＡＲおよびｕ−ＰＡＲフラグメント
のリガンド−結合活性についての化学的架橋試験 ＡＴＦ（ひとウロキナーゼのアミノ酸残基番号１〜１３
５）はＧ．ガッサニ、ル・プチト、イタリーからの好意
により贈与された。Ｎ,Ｎ−ジスクシシニミジルスベラ
ート（ＤＳＳ）を用いる、１２５Ｉ−標識ＡＴＦに対す
る、未変化または分解処理ｕ−ＰＡＲの化学的架橋は上
記と同様に行った。精製した架橋コンジュケートの視覚
化は、スラブゲル上レミリ（上掲）によるＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ、ついでオートラジオグラフィーにより行った。
【０２５４】幾つかの実験では、非−標識ＡＴＦをリガ
ンドとして用いた。これらの実験は、蛋白質濃度を所定
のものに、電気泳動分析をトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
および銀染色で行う以外は同じ方法で行った（下記実施
例４参照）。
【０２５５】ＡＴＦ結合成分の疎水性分析のためのトリ
トンＸ−１１４相分離 未変化またキモトリプシン処理ｕ−ＰＡＲを、０℃にて
０.１Ｍトリス／ＨＣｌ、１％トリトンＸ−１１４、ｐ
Ｈ８.１に希釈し、５分間３７℃にてインキュベートし
た。得られたデタージェントおよび水相を遠心分離によ
りそれぞれ分離した。各相を０.１Ｍトリス／ＨＣｌ、
ｐＨ８.１を添加して初期容量にし、その後、ＣＨＡＰ
Ｓ（０.２５％最終濃度）を添加して、あらたな相分離
を避けた。各相におけるＡＴＦ−結合成分の存在は、
１２５Ｉ−ＡＴＦへの化学的架橋により分析した。
【０２５６】脱グリコシル化分析 酵素的脱グリコシル化のために、１２５Ｉ−ＡＴＦに架
橋させた試料を１.５倍に希釈し、０.５％ＳＤＳおよび
１.７ｍＭジチオスレイトール中で３分間煮沸し変性さ
せた。変性試料を脱グリコシル化緩衝液を添加してさら
に６倍の希釈し、最終濃度の０.１２Ｍりん酸ナトリウ
ム、０.９％トリトンＸ−１００、５ｍＭ１,１０フェナ
ンスロリンおよび３３Ｕ／ｍｌペプチド：Ｎ−グリコシ
ダーゼＦ（Ｎ−グリカナーゼ；ゲンザイム、ボストン、
マサチューセッツ）をそれぞれ含み、ｐＨ８.６、１,１
０フェナンスロリンは、２５０ｍＭのメタノール貯蔵溶
液で添加した。脱グリコシル化は試料を３７℃で一夜イ
ンキュベートすることにより行った。
【０２５７】アミノ酸配列決定のための成分のフラグメ
ント分析および分離のための電気泳動技術 アミノ酸配列分析のための分解ｕ−ＰＡＲの試料は、電
気泳動の前に凍結乾燥により濃縮した。銀染色されるゲ
ルの試料は直接分析した。
【０２５８】シェッガーおよびフォン・ジャガウ（アナ
リティカル・バイオケミストリー、１６６、１９８７、
３６８−３７９）によるトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
は、１０％Ｔ、３％ゲルを用いた以外は上記と同様に行
った。銀染色はヒュークショーブンおよびダーニックの
試薬系（エレクトロフォレイシス、９、１９８８）を用
いて行った。
【０２５９】アミノ酸配列決定のためのポリビニリデン
ジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜上の試料の電気ブロッティ
ングは、移動緩衝液のメタノールおよびジチオスレイト
ールの濃度をそれぞれ１５％および０.５ｍＭにし、ブ
ロッティングを９０分間０.４ｍＡ／ｃｍ２の電流密度
にした以外は、プラウグら（アナリティカル・バイオケ
ミストリー、１８１、１９８９、３３−３９）に記載と
同様に行った。アルキル化は行わなかった。
【０２６０】アミノ酸配列決定 ＮＨ２−末端アミノ酸配列決定は、電気ブロッティング
された蛋白質バンド（上記）を含むＰＶＤＦ膜の切り出
し切片上で直接行った。アプライド・バイオシステム・
プロテイン・シークエンサー、タイプ４７７Ａを使用し
た。
【０２６１】配列および相同性分析 ｕ−ＰＡＲ中の内部反復、内部反復の多重配列および共
通配列の検討はＬ．パティ（ジャーナル・オブ・モルキ
ュラー・バイオロジー、１９８、１９８７、５６７−５
７７）に記載の方法により行った。ナショナル・バイオ
メディカル・リサーチ・ファウンデーション／蛋白質同
定用データベースを隔たりのある相同性の検索のための
適当な方法を用いて相同性につき検索した（Ｌ．パテ
ィ、ジャーナル・オブ・モルキュラー・バイオロジー、
２０２、１９８８、６８９−６９６；Ｌ．パティ、セ
ル、６１、１９９０、１３−１４）。この方法では、蛋
白質系統群に特徴的な共通配列の類似性を、被検蛋白質
が当該蛋白質群の典型的な特徴を有するかどうかを決定
するために用いた。
【０２６２】結果 ｕ−ＰＡＲの蛋白質加水分解によるリガンド−結合フラ
グメントの放出 リガンド−結合能力に重要なｕ−ＰＡＲの構造的特徴の
検討のために、精製レセプターの試料を、非変性条件下
の種々のプロテアーゼの希釈列で処理し、ついで、化学
的架橋試験を用いて、１２５Ｉ標識ＡＴＦに対する結合
活性につき分析した（Ｌ.Ｓ.ニールセンら、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６３、１９
８８、２３５８−２３６３）。
【０２６３】５種の被検プロテアーゼのうち、トリプシ
ンおよびキモトリプシンは、レセプターのリガンド−結
合活性を排除し得るが、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｇｌｕ−Ｃおよび
ブロメラインは有効でない。しかし、トリプシンによる
処理により、被検の全濃度にわたって、すべての架橋活
性は完全に消滅したが、低濃度のキモトリプシンは、約
Ｍｒ３２０００のＡＴＦとのコンジュゲートの形成によ
り証明されるように（第４図、レーン３）、異なるｕ−
ＰＡＲのリガンド−結合フラグメントを生成した。この
成分は、上記のＭｒ７０−８００００のコンジュゲート
のみを示す未処理のレセプターが試験された場合の試料
には存在しない（レーン２）。後者のコンジュゲートの
強度はキモトリプシン処理試料中で著しく減少し、活性
レセプターのむしろ効果的な開裂を示す（下記も参照；
より高濃度のキモトリプシンを用いた場合は、このバン
ドは完全に消滅した）。他のＡＴＦ−結合生成物は検出
されなかった。
【０２６４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥが未変化または変化試料
で行われたかにかかわらず、電気泳動パターンは一致し
た（第４Ａ図と４Ｂ図を比較せよ）；特に、ＡＴＦとｕ
−ＰＡＲのキモトリプシン開裂生成物間で形成されたコ
ンジュゲートは同じ見かけＭｒで移動する。
【０２６５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によるキモ
トリプシン処理試料の直接分析は非常に簡単な開裂パタ
ーンを示した（第５Ａ図）。原料から生成された未変化
のｕ−ＰＡＲは不均質性成分として移動し、Ｍｒ５０−
６５０００にまたがり（レーン３）、この不均質性はＮ
−結合炭水化物中の変化形によるものである。キモトリ
プシン処理は、鋭いバンドとして移動するＭｒ１６００
０の１個の主要フラグメントおよびＭｒ３５−５０００
０範囲の不均質性成分の出現をもたらし、これは分子中
の残部を示すものであると思われる（すなわち、Ｍｒ約
１６０００フラグメントの除去によって分解された出発
物質）（レーン４）。さらに、少量の未変化のｕ−ＰＡ
Ｒがこの試料中に見られ、上記で観察された残存してい
るリガンド−結合活性に結び付く。
【０２６６】このパターンは、リガンド−結合ｕ−ＰＡ
Ｒ分解生成物がＭｒ１６０００フラグメントに一致する
ことを示唆し、それゆえ、この分子量はＡＴＦ（見かけ
Ｍｒ１８０００）との−コンジュゲートＭｒ３２０００
の形成と一致する。しかし、別に、架橋活性は銀染色に
よって検出されない痕跡のフラグメントにより得られる
ものかも知れない。この可能性を検討するために、架橋
実験を非標識成分で行い、ついで、生成したコンジュゲ
ートのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色を行った（第５Ｂ
図）。
【０２６７】キモトリプシン処理試料（レーン１）の電
気泳動像は、リガンドが添加されなかったとき、架橋工
程の実施により影響されなかった（レーン２）。一方、
ＡＴＦの存在下で架橋が行われたとき（レーン３）、独
特のＭｒ３２０００生成物が形成されたが、Ｍｒ１６０
００バンドはほとんど消滅した。この試料中にＭｒ２０
０００領域に数個の斑点が観察されたが、これは余剰に
添加されたＡＴＦによるものであり、これは使用した電
気泳動システム中の電気泳動移動度とともに移動した
（レーン４）。
【０２６８】すなわち、Ｍｒ３２０００コンジュゲート
は銀染色によりはっきりと検出され、この形成はＭｒ１
６０００フラグメントの消失を伴うものであるから、こ
の開裂生成物は直接リガンド−結合活性に対応するもの
である。
【０２６９】より高濃度のキモトリプシン（０.２−１
μｇ／ｍｌ）を用いるｕ−ＰＡＲの分解は、還元条件下
でＳＤＳ−ＰＡＧＥ中Ｍｒ１３０００成分だけ移動する
追加の銀−染色フラグメントの出現をもたらす（データ
は示さず）。キモトリプシン希釈列の使用は、この生成
物がリガンド−結合フラグメントのさらなる分解から生
じるものであることを示している。この生成はＭｒ１６
０００成分の消失を伴うものであるが、より大きなフラ
グメントは分解されない。１２５Ｉ−ＡＴＦ架橋試験を
用いて平行分析を行うと、Ｍｒ１３０００フラグメント
を示すコンジュゲートは検出され得なかった。銀−染色
ゲル上のＭｒ１６０００フラグメントの分解的消失は、
架橋試験における、Ｍｒ３２０００放射能標識コンジュ
ゲートの消失を伴う。一方、新規の放射能標識バンドは
出現しない。すなわち、リガンド−結合能力が失われた
ことを示している。Ｍｒ７０−８００００の架橋生成物
もまた次第に消失し、キモトリプシン１μｇ／ｍｌｕ−
ＰＡＲの処理後全く存在しない。従って、この実験はま
た、Ｍｒ７０−８００００架橋ＡＴＦ−コンジュゲート
（第４図）が専ら、より少量のキモトリプシンによる処
理後に残っている、未変化のｕ−ＰＡＲにより形成さ
れ、銀染色ゲル上でまた高濃度キモトリプシンで変化し
なかったＭｒ３５−５００００によって生成したもので
ないことを確認するものである。
【０２７０】リガンド−結合フラグメントの同定 精製ｕ−ＰＡＲ約２０μｇを、上記で用いたＭｒ１６０
００フラグメントの生成条件と同じ条件下でキモトリプ
シン（４０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。試料は凍結乾燥に
より濃縮し、第５図で採用したのと同じシステムを用い
て、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲルは、Ｐ
ＶＤＦ膜上に電気ブロットし、クーマシー染色後、下記
の染色領域を膜から切り出した（第５Ａ図の平行電気泳
動パターンの矢印参照）：Ｉ）Ｍｒ１６０００開裂生成
物；II）Ｍｒ３５−４５０００領域に対応する染色領
域、すなわち、残存する未分解ｕ−ＰＡＲを除き、より
大きな開裂生成物を含む領域。
【０２７１】切り出したポリペプチドをＮＨ２−末端ア
ミノ酸配列決定にかけ、第３表に示す配列を得た。各場
合とも唯一の配列のみであった。Ｍｒ１６０００フラグ
メントは上記の未変化ｕ−ＰＡＲのＮＨ２−末端と同じ
ＮＨ２−末端を有するが、より大きな開裂生成物は、未
変化の蛋白質の残基番号８８にＮＨ２−末端を有し、ｕ
−ＰＡＲの完全なアミノ酸配列と比較することにより同
定され、ｃＤＮＡ配列決定から推定された（ロルダン
ら、１９９０）。
【０２７２】開裂後の親水性度および解離 温度誘発トリトンＸ−１１４相分離（Ｃ.ボーディエ、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２
５６、１９８１、１６０４−１６０７）は、未変化のｕ
−ＰＡＲをデタージェント相に導くことを示した。この
親水性度はＣＯＯＨ−末端グリコシル−ホスファチジル
−イノシトールグリコリピド膜アンカーの存在によるも
のである（実施例３）。リガンド−結合ｕ−ＰＡＲフラ
グメントが共有結合力により、分子の残部に付着したま
まであるかどうか、または非−変性条件下で解離し得る
かどうかを分析するために、キモトリプシン−処理、精
製ｕ−ＰＡＲをデタージェント相分離にかけ、得られた
相を１２５Ｉ−ＡＴＦ架橋試験で分析した（第６図）。
Ｍｒ７０−８００００の放射能標識コンジュゲート（す
なわち、１２５Ｉ−ＡＴＦと消化後の残存未変化ｕ−Ｐ
ＡＲの付加物）はほとんど専ら、デタージェント相中で
形成されたが、一方、Ｍｒ３２０００コンジュゲート
（リガンド−結合ｕ−ＰＡＲフラグメントの活性を示
す）は水相でのみ観察された（レーン２と３を比較せ
よ）。前者の知見は相分離の内部標準を提供するもので
あり、さらに、ＣＯＯＨ−末端の、疎水性特質は、例え
ば、混濁しているホスフォリパーゼや検出されない蛋白
質分解が生じても失われないことを確証するものであ
る。従って、水相中のＮＨ２−末端の、リガンド−結合
フラグメントの独占的出現は、このフラグメントが、変
性剤不存在下でＣＯＯＨ−末端の、グリコリピド含有部
から解離したものであることを示している。
【０２７３】グリコシル化 ｕ−ＰＡＲは、酵素ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦで
処理して除去し得る、多量のＮ−結合炭水化物を含む
（上記参照）。キモトリプシン−処理ｕ−ＰＡＲに架橋
した１２５Ｉ−ＡＴＦを含む試料をこの酵素で処理した
とき（第４図）、Ｍｒ３２０００コンジュゲートを脱グ
リコシル化され、Ｍｒ約２５０００のコンジュゲートを
生成させる（レーンＡ２とＢ２を比較せよ）。未変化の
ｕ−ＰＡＲで形成するコンジュケート（レーンＡ１）は
Ｍｒ５００００生成物（レーンＢ１）に変換する。上記
参照。すなわち、リガンド−結合ｕ−ＰＡＲフラグメン
トが脱グリコシル化される。
【０２７４】すなわち、ｒ１６０００のＵ−ＰＡＲのキ
モトリプシン分解フラグメントが生成し、これは、少な
くとも、定性的に、リガンドに対する結合能力を維持し
ている。定量的結合性の検討は、入手した量では不可能
であったが、１ｎＭで存在する放射能標識リガンドでイ
ンキュベート後、すなわち、未変化レセプターの結合活
性の証明に最適であることがすでに判明しているのと同
じ条件を用いて（上記参照）、化学的架橋により示され
た。
【０２７５】アミノ酸配列決定はリガンド−結合フラグ
メントが、非開裂ｕ−ＰＡＲと同じＮＨ２−末端を有
し、開裂は、未変化蛋白質のＴｙｒ８７とＳｅｒ８８の
間で生じたことを示した。後者のアミノ酸残基は、観察
された唯一の別の分解生成物（すなわち、より大きい、
非−リガンド−結合成分）中の単一の検出可能なＮＨ２
−末端を構成しており、著しい開裂特異性を示す。この
より大きいフラグメント中の分子量の不均質性は親の蛋
白質の分子量不均質性を示しており（第５Ａ図）、これ
は、すでにグリコシル化変形体によるものであることを
示した（上記参照）。
【０２７６】リガンド−結合フラグメントは多分全配列
１〜８７にわたっているが、新規のＣＯＯＨ−末端に近
い別の開裂は排除され得ない（直接確認されなかっ
た）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析されたこのフラグメ
ントのみかけの分子量は、８７個のアミノ酸残基フラグ
メントにつき予想されたものより幾分高いものであった
が、この矛盾はＮ−結合炭水化物の存在により説明され
得た。すなわち、脱グリコシル化後、１２５Ｉ−ＡＴＦ
およびリガンド−結合フラグメントのコンジュケート
は、ＡＴＦと８７個のアミノ酸残基成分間で形成される
付加物の予想される大きさに良く一致するＭｒ２５００
０コンジュケートとして移動する。
【０２７７】今回の検討で観察されたすべての特徴は、
ＮＨ２−末端、Ｍｒ１６０００フラグメントが、ｕ−Ｐ
ＡＲ内のあきらかな構造的および機能的ドメインを構成
することを示唆している。すなわち、それははっきりと
範囲の限定されたリガンド−結合フラグメントであり、
緩和なプロテアーゼ処理により分離される。このフラグ
メントと１２５Ｉ−ＡＴＦにより形成されたＭｒ３２０
００架橋コンジュケートは、非減成試料処理後にＳＤＳ
−ＰＡＧＥ中で観察され得たものであるから（第４Ｂ図
参照）、蛋白質の残部にジスルフィド−結合したもので
はない。さらに、トリトンＸ−１１４相分離にかけたと
き（すなわち、非変成条件下）、それは蛋白質の残部か
ら解離し、デタージェント結合がないことは、それが水
可溶性であることを示唆する。その結合能力は同じ実験
におけるデタージェント相分離後に示され得たものであ
るから、最終的に、リガンドを結合する能力は、少なく
とも定性的には蛋白質の残部とは独立している。
【０２７８】Ｍｒ１６０００フラグメントがはっきりし
た構造的ドメインとしての性質を示すという実験的知見
はｕ−ＰＡＲにおける内部の相同性の分析に一致する。
この分析は、レセプターのアミノ酸配列が、ｃＤＮＡ配
列決定から帰結され（ロルダンら、１９９０年）、シス
テイン残基の特徴的なパターンによって特徴付けられる
３個の繰返し（繰返し１、１−９２残基；繰返し２、９
３−１９１残基；繰返し３、１９２−２８２残基）を含
むことを明らかにした（第８図）。この配列において、
第２および第３の繰返しの配列は２２％の一致を示す；
第２の繰返しの１０個のシステインすべてが第３の繰返
しのすべての１０個のシステインと一致する。第１の繰
返しはより離れた関係にある（第３および第２の繰返し
と、それぞれ１２および１６％の一致）；その８個のシ
ステインのうちの７個は他の２個の繰返しのものと一致
する。これらの知見は、ｕ−ＰＡＲが３個の構造ドメイ
ンで組織されていることを意味する；観察された機能的
活性フラグメントは実験的に第１の繰返しに対応し、繰
返し−間結合の開裂により遊離される（第８図）。この
提案されたドメインの構造はまた、ｕ−ＰＡＲのキモト
リプシン分解の著しい特異性を説明するものである（す
なわち、蛋白質分解に対する、このドメインを接続させ
るヒンジのような流動性ペプチドセグメントの一般的感
受性による）。
【０２７９】ｕ−ＰＡＲ内の３個の繰返しの存在は、レ
セプターが先祖のドメインの内部的３重複写の結果とし
て生じたものであるとを示唆している。実際、蛋白質配
列データベースの検索ではこのシステインリッチ単位の
単一の複写のみを処理する数個の相同性蛋白質を確認し
た。Ｔ−細胞活性化蛋白質の細胞内部分／Ｌｙ６抗体
（Ｋ．Ｐ．ルクレアら、ＥＭＢＯ ジャーナル、５、１
９８６、３２２７−３２３４；パルフリーら、イムノジ
ェネティクス、２６、１９８７、３８９−３９１；パル
フリーら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１４０、
１９８８、３０５−３１０；Ｈ．レイザーら、プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス Ｕ．Ｓ．Ａ．８５、２２５５−２２５９）およ
びＬｙ−６関連いか蛋白質Ｓｇｐ−２（Ａ．Ｆ．ウイリ
アムら、イムノジェネティクス、２７、１９８８、２６
５−２７２）はｕ−ＰＡＲの内部の繰返しに関連する
（第５図）。興味あることに、ｕ−ＰＡＲ同様に、これ
らの蛋白質はグリコシル−ホスファチジル−イノシトー
ルアンカーにより細胞膜に付着している（Ａ．Ｆ．ウイ
リアムら、イムノジェネティクス、２７、１９８８、２
６５−２７２；Ｊ．Ｗ．ハンメルバーガーら、バイオケ
ミカル・アンド・バイオィジカル・リサーチ・コミュニ
ケーション、１４８、１９８７、１３０４−１３１
１）。ｕ−ＰＡＲ見られる繰返し型の単一の複写との相
同性グリコホスホリピド−アンカー蛋白質の存在はこれ
らのドメインの構造的独立性を強調するものである。さ
らに、この新規なドメイン群の各構成員の同数のシステ
インの存在はシステインがドメイン内のジスルフィド結
合と関連するとの推定に一致する。ｕ−ＰＡＲ分子内の
２８個のシステインから８個のみが、推定されたｕ−Ｐ
ＡＲのアミノ酸配列の番号１−８７残基内に存在するの
であるから、ジスルフィドブリッジがｕ−ＰＡＲの結合
ドメインと蛋白質の残部間に存在しないという事実は前
者のジスルフィド構造の検討を著しく容易にする。
【０２８０】Ｍｒドメインのさらなるキモトリプシン分
解開裂はリガンド−結合活性を消失させる。Ｍｒ１３０
００生成物が還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示さ
れるのであるから、この第２の開裂はＭｒ１６０００ポ
リペプチドの一方のより末端近くで生じた。入手し得た
量が非常に少なく、Ｍｒ１３０００生成物のＮＨ２−末
端アミノ酸配列決定が不可能であったので、関連する開
裂部位がＭｒ１６０００フラグメントのＮＨ２−または
ＣＯＯＨ末端内に存在したかどうかはわからない。この
第２の減成段階に含まれる領域はＭｒ１６０００ドメイ
ンの結合活性にとって重要には違いないが、それが、直
線結合決定素を含むかどうか、配座効果が観察された活
性の消失に対応するかどうかの立証は残されている。
【０２８１】ｃＤＮＡ配列決定から帰結されたｕ−ＰＡ
Ｒアミノ酸配列（ロルダンら、１９９０年）はＮ−結合
グリコシル化のための潜在的な５個の部位を含む；しか
し、これらのうちのどれが実際に成熟蛋白質中でグリコ
シル化されるのかは決定されていない。これらの部位の
唯１個、すなわち、Ａｓｎ５２は残基番号１−８７の領
域内に存在するから、ここで報告した脱グリコシル化実
験はこのグリコシル化残基としてこのアスパラギンを確
認するものである。しかし、前記の炭水化物に基づく差
異は、ＰＭＡ刺激後のＵ９３７細胞の２種の異なる株を
比較したときに、ｕ−ＰＡＲの電気泳動パターンで観察
され、リガンド−結合ドメインとは関係しなかった。ｕ
−ＰＡＲ試剤は細胞の２種の株のいずれかから精製さ
れ、いずれの場合もキモトリプシン処理でＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで鋭いバンドとして移動する、Ｍｒ１６０００リガ
ンド−結合フラグメントを生成する。親の蛋白質間電気
泳動的差異はより大きな（すなわち、非−リガンド−結
合）生成物（データは示さず）を生じ、各試剤内の不均
質性は上記で論じた。
【０２８２】プラスミン−仲介細胞表面蛋白質加水分解
（Ｖ．エリスら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー、２６４、１９８９、２１８５−２１８
８；Ｒ．Ｗ．スティーブンスら、ジャーナル・オブ・セ
ル・バイオロジー、１０８、１９８９、１９８７−１９
９５）において、ｕ−ＰＡＲに関係すると思われる機能
的重要性は、この相分離リガンド−結合ドメインを有効
な可溶性ｕ−ＰＡＲ拮抗剤としての価値ある試薬とな
す。すなわち、ｕ−ＰＡの結合に対してｕ−ＰＡＲと競
合する可溶性分子は、細胞侵入における細胞表面プラス
ミノーゲン活性化の検討の重要な手段になり（Ｌ．オソ
ースキー、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、１
０７、１９８８、２４３７−２４５５；Ｖ．Ｊ．ヒヤリ
ングら、キャンサー・リサーチ、４８、１９８８、１２
７０−１２７８）、これらのプロセスの妨害のための治
療的可能性を有し得る。
【０２８３】第３表 キモトリプシン分解ｕ−ＰＡＲフラグメントのＮＨ２−
末端アミノ酸配列および未変化のｕ−ＰＡＲの部分的配
列 Ｍｒ16000フラグメント１）２） ＬＲ？ＭＱ？(Ｋ)Ｔ
ＮＧＤ？ＲＶＥＥ？Ａ？Ｇ ｕ−ＰＡＲ残基１−２０４） ＬＲＣＭＱＣ Ｋ ＴＮ
ＧＤＣＲＶＥＥＣＡＬＧ Ｍｒ35-50000フラグメント１）３） ＳＲＳＲＹＬＥ
？(Ｉ)Ｓ？ ｕ−ＰＡＲ残基８８−９８５） ＳＲＳＲＹＬＥＣ
Ｉ ＳＣ １） ( )は同定が不確かであることを示す。？は同定
が行われなかったことを示す。 ２） 電気ブロッティングされたＭｒ１６０００ｕ−Ｐ
ＡＲフラグメントの自動配列決定による決定（第５Ａ図
のバンドＩ）。初回収率は段階１でＬｅｕ２４pmolであ
った。Ｇｌｙに基づく、反復収率(１０およびは２０段
階)は９６％であった。他の配列は検出されなかった(配
列決定限界２pmol)。 ３） 電気ブロッティングされたＭｒ３５−５００００
ｕ−ＰＡＲフラグメントの自動配列決定による決定（第
５Ａ図のバンドII）。初回収率は段階１でＳｅｒ２９pm
olであった。Ｓｅｒに基づく、反復収率（１、３および
は１０段階）は９０％であった。他の配列は検出されな
かった（配列決定限界２pmol、ＧｌｕおよびＧｌｙにつ
き３pmol）。 ４） 未変化の蛋白質（１７）およびｃＤＮＡ配列決定
（１８）のＮＨ２−末端アミノ酸配列決定から得られた
配列 ５） ｃＤＮＡ配列決定（１８）から帰結される配列。
先行する残基（すなわち、番号８７）はチロシンであ
る。
【０２８４】実施例３ ｕ−ＰＡＲはグリコシル−ホスファチジルイノシトール
・アンカーを有し、Ｃ−末端でプロセスされる 物質および方法：
【０２８５】物質：ＰＶＤＦ膜（イモビロン−Ｐ）はミ
リポアから、ＮＷ，Ｎ'Ｗ−ジメチル−Ａｒｇはシグマ
から、ＮＷ−モノメチル−Ａｒｇはカルビオケムから入
手し、ＮＷ，ＮＷ−ジメチル−ＡｒｇはＴ. オガワ博士
（徳島大学、日本）の好意により贈与された。エタノー
ルアミンはメルクから入手した。Ｎａ１２５Ｉ、［９,
１０（ｎ）−３Ｈ］−ミリスチン酸（５３Ｃｉ／ミリモ
ル）、ミオ−［２−３Ｈ］イノシトール（１８.３Ｃｉ
／ミリモル）、［１−３Ｈ］エタノールアミン塩酸塩
（１９Ｃｉ／ミリモル）はアマーシャムから入手した。
【０２８６】タンパク質：ヒトおよびウシ赤血球からの
アセチルコリンエステラーゼ、ミツバチ毒液からのホス
ホリパーゼＡ２、ウシ脳からのミエリン塩基性タンパク
質はシグマから入手した。キャベツからのホスホリパー
ゼＤおよびバシラス・セレウスからのホスファチジルイ
ノシトール特異的なホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）
はベーリンガー・マンハイムから入手した。ｕ−ＰＡＲ
は実施例１で示したようにＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞
から精製した。活性なヒトｕ−ＰＡはセロノから購入
し、報告したようにＤＦＰで阻害したた（ニールセン
ら、１９８８年）。ｕ−ＰＡのアミノ末端（ＡＴＦ）は
Ｇ. カサニ博士（レペチット、イタリア）から好意的に
贈与された。ＡＴＦ、ｕ−ＰＡＲおよびＤＦＰ失活させ
たｕ−ＰＡは、報告したように放射能標識した（ニール
センら、１９８８年）。ただしｕ−ＰＡＲの場合は、
０.１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００の代わりに０.１
％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳで、またＡＴＦおよびＤＦＰ−
ｕ−ＰＡの場合は、０.０１％（ｖ／ｖ）ツイーン８０
で置き換えた。ヒトｕ−ＰＡＲに対するポリクローナル
家兎抗体の作成は実施例１１で説明したようにして実施
した。
【０２８７】無傷なＵ９３７細胞のホスホリパーゼ処
理：付着性のＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞（約２×１０
７／皿）を、まず２５mMＨＥＰＥＳを含有する無血清Ｒ
ＰＭＵ１６４０培地（ｐＨ７.４、緩衝液Ａ）で洗浄し
た。ついで細胞を、５０mMグリシン／ＨＣｌ、０.１Ｍ
ＮａＣｌ（ｐＨ３.０）で室温で３分間酸処理して、内
因的に生産されたｕ−ＰＡをすべて解離し、その受容体
へ自己分泌のやり方で結合させた。０.５Ｍ ＨＥＰＥ
Ｓ、０.１ＭＮａＣｌ（ｐＨ７.５）の０.２容量で中和
後、直ちに上清を除き、細胞を緩衝液Ａで２回洗浄し
た。幾つかの実験では、外来性に添加した１２５Ｉ−標
識したＤＦＰ−ｕ−ＰＡ（１nM）を未標識のｕ−ＰＡＲ
へ緩衝液Ａ中で４℃で２時間インキュベーションにより
再結合させ、リガンド無添加のこれと同一の緩衝液で３
回洗浄した。これらの付着性Ｕ９３７細胞の種々のホス
ホリパーゼとのインキュベーションを、緩衝液Ａ中、３
７℃で振とうテーブル上で実施した。
【０２８８】生体内標識：実施例１の報告と同様に細胞
培養を実施した。ｕ−ＰＡＲの発現を増大させるため、
ヒトＵ９３７細胞（５×１０７細胞／皿）の代謝的標識
に先立ってＰＭＡ（１５０nM）で５時間刺激した。［３
Ｈ］エタノールアミンおよび［３Ｈ］ミリスチン酸で標
識するため、細胞をＲＰＭＩ １６４０培地で培養し、
ミオ−［３Ｈ］イノシトールによる標識はイーグルの最
少必須培地で実施した。どちらの培地とも、２mM Ｌ−
グルタミン、５mMピルビン酸ナトリウム、２００単位／
mlペニシリン、２５μg／mlストレプトマイシン、２５m
M ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、０.５mg／ml脱脂ＢＳＡ、
４×規定濃度の非必須アミノ酸類を補給した。すべての
トレーサーは、２５mg／ml脱脂ＢＳＡ、０.１Ｍ ＨＥＰ
ＥＳ（ｐＨ７.４）の貯蔵溶液から、最終濃度０.１mCi
／mlで培地１０mlに添加し、代謝標識を３７℃で１５時
間進行させた。ついで付着細胞を酸処理し、１％前濃縮
したトリトンＸ−１１４、０.１Ｍトリス（ｐＨ８.
１）、１０μg／mlトラジロール、１mM ＰＭＳＦ、およ
び０.２mM ＺｎＣｌ２の氷冷溶液５mlで洗浄し、細胞溶
解した。最後に界面活性剤層分離を実施例１で報告した
ように実施した。
【０２８９】生合成的に標識したｕ−ＰＡＲの免疫沈
降：透明な界面活性剤層の２mlアリコートへ免疫前家兎
ＩｇＧ１２μgを添加し、混合物を４℃で２時間インキ
ュベートした。０.１Ｍトリス（ｐＨ８.１）、０.１％
ＣＨＡＰＳ、および０.１％脱脂ＢＳＡへ、プロテイン
Ａセファロース（ファーマシア）を５０％（ｖ／ｖ）で
懸濁した液１００μlを添加したあと、同時混合しなが
ら４℃でインキュベーションを２時間続けた。遠心（５
０００×ｇ、５分間）によって上清を回収し、ポリクロ
ーナル抗ｕ−ＰＡＲ家兎ＩｇＧ １２μgを添加してイン
キュベーションを４℃で１夜進行させ、最後にプロテイ
ンＡセファロースの新しいアリコートで、さらに３時間
インキュベートした。ついで不動化した免疫複合体を、
０.１％（ｗ／ｖ）脱脂ＢＳＡ（１回）、０.１％脱脂Ｂ
ＳＡ／１Ｍ ＮａＣｌ（１回）を含有し、または無添加
（２回）の何れかの０.１Ｍトリス（ｐＨ８.１）／０.
１％ＣＨＡＰＳで十分に洗浄した。このように洗浄した
プロテインＡセファロースを遠心によって採取し、最後
に２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する０.１Ｍトリス（ｐ
Ｈ６.８）５０μlに懸濁し、５分間煮沸したのち、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０２９０】トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびアミノ
酸分析：シェーガーおよびフォン・ヤコフの方法（１９
８７年）に従い、トリシン−ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲルをバイオ・ラド・ミニプロテアンII装置（８cm×
７cm×０.７５cm）で調製した。均質なゲル（７.５％Ｔ
および３％Ｃ）を１日前に流し込み、０.５Ｍトリス、
０.１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、および１２mM ３−メルカプ
トプロピオン酸（スカベンジャーとして添加）（ｐＨ
８.４５）で１５mA／ゲルで４時間予備電気泳動を行っ
た。精製し、凍結乾燥したｕ−ＰＡＲを、４％（ｗ／
ｖ）ＳＤＳ、１２％（ｗ／ｖ）グリセリン、５０mMトリ
ス、および４０mMジチオトレイトール（ｐＨ６.８）で
２分間煮煮沸により還元した。予備電気泳動に使用した
ゲル緩衝液を本来の電気泳動緩衝液（シェーガーおよび
フォン・ヤコフ、１９８７年）と取り換え、ただし１mM
３−メルカプトプロピオン酸をカソード緩衝液へ含有
させた。電気泳動を６０Ｖで４時間実施した。以前報告
されたように（プラグら、１９８９年）、半乾燥方法に
より０.４５μm ＰＶＤＦ膜上で、１０mM ３−（シクロ
ヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸、１０％
（ｖ／ｖ）メタノール、および０.４mMジチオトレイト
ール中（ｐＨ１１）で、電気移動を０.８mA／cm２で２
時間実施した。
【０２９１】アミノ酸分析のために、０.０５％（ｗ／
ｖ）フェノールを含有する再蒸留した６Ｍ ＨＣｌ １０
０μlおよび１％（ｗ／ｖ）ＤＴＤＰＡの２Ｍ ＮａＯＨ
溶液５μl中で、先に報告されたように（プラグら、１
９８９年）、切り出したＰＶＤＦ膜上で１１０℃で、ク
ーマシー染色したｕ−ＰＡＲを作成した。主として報告
された（バークホルトおよびジェンセン、１９８９
年）、Ｏ−フタルジアルデヒド誘導体化を備えたウォー
ターズ・アミノ酸分析器でアミノ酸分析を実施した。た
だしクロマトグラフィー系は、塩基性アミノ酸の分離能
を増大するため若干修飾した。溶出はハロゲン化物を含
まない２種の緩衝液ＡおよびＢ（組成については、バー
クホルトおよびジェンセン、１９８９年参照）の混合液
から得られたｐＨ勾配により実施したが、勾配は下記の
直線状セグメントからなっていた。最初の溶離液１００
％Ａ、１５分で８８％Ａおよび１２％Ｂ、２４分で６０
％Ａおよび４０％Ｂ、２６分で５５％Ａおよび４５％
Ｂ、３６分で５０％Ａおよび５０％Ｂ、４０分で３０％
Ａおよび７０％Ｂ、６４分で２５％Ａおよび７５％Ｂ、
６５分で１００％Ａ、６５〜７０分で１００％Ａであっ
た。
【０２９２】種々の分析：実施例１で報告したように、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ジスクシンイミジルスベリン酸（Ｄ
ＳＳ）による化学的橋架け反応、および分析的界面活性
剤層分離をトリトンＸ−１１４で実施した。
【０２９３】直接オートラジオグラフィー（１２５Ｉ）
および蛍光光度法（３Ｈ）を増感紙（クロネックス）を
使用して−８０℃でＸ線フィルム（コダックＸ−オーマ
ット）で実施した。蛍光光度法の場合は、Ｘ線フィルム
を予備露光し（０.２〜０.３Ａ）、製造業者の指示によ
り、ポリアクリルアミドゲルを増感剤で含浸させた。
【０２９４】結果： 精製したｕ−ＰＡＲのアミノ酸分析：精製したｕ−ＰＡ
Ｒのアミノ酸分析では（実施例１）、酸加水分解物の中
にＯ−フタルジアルデヒトと反応し、カチオン交換クロ
マトグラフィーで、アンモニアのすぐ後に溶出する未確
認の化合物の存在が明らかになった（第９図）。刺激し
ないＵ９３７細胞（２×１０１０細胞）からｕ−ＰＡＲ
を精製すると、類似のピークが観察されたが、その他の
方法で処理すると同一であった（データは示さず）。こ
の未知の化合物は、これを２％ＳＤＳで煮沸し、ついで
トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および０.４５μmポリビ
ニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜上で１０％（ｖ／
ｖ）ＭｅＯＨの存在で電気ブロッティングしても、精製
されたタンパク質内に残存しているので、ｕ−ＰＡＲの
共有結合的な構成成分として挙動した。さらにこの化合
物は、タンパク質が染色された領域のすぐ上下でＰＶＤ
Ｆ膜の好適な切片を切り出し、アミノ酸分析のために同
一の方法で調製すると存在しなくなるので、クーマシー
染色したｕ−ＰＡＲの特殊な構成成分であった（第９
図、挿入）。そのうえ以前にこの手法で、分析した数種
の染色されたタンパク質およびペプチドでは、この特殊
な成分の存在が顕在化されなかった（プラグら、１９８
９年）。
【０２９５】この研究でアミノ酸分析のため、一般的な
ものばかりでなく、さまざまな滅多にない塩基性アミノ
酸を、その保持時間の再現性を損なうことなく、分離を
増大させることができる特殊な勾配をカチオン交換クロ
マトグラフィーのために設計した（物質および方法の
項、参照）。この方法によって、ｕ−ＰＡＲ中の同定で
きなかった化合物を、アンモニア（５３.５分）および
アルギニン（６０.８分）の間で５５.３分後に再現性を
もって溶出した。種々の物理的に生じるアルギニン誘導
体が、ほぼ類似の保持時間を有することが予想されるの
で、ＮＷ，ＮＷ−ジメチルアルギニン（５３.８分）、
ＮＷ，Ｎ'Ｗ−ジメチルアルギニン（５４.４分）、ＮＷ
−モノメチルアルギニン（５８.６分）等を含む数種の
メチル化アルギニン誘導体を試験した。これらの保持時
間は、何れもｕ−ＰＡＲ中の同定できなかった化合物の
値と一致しなかった。然し基準的なエタノールアミンを
試験すると、同定できなかったｕ−ＰＡＲ中の化合物と
まさに同一の保持時間を示した。そのうえヒトおよびウ
シの双方の赤血球のアセチルコリンエステラーゼを加水
分解すると、この保持時間を有する化合物が同様に観察
され、一方、例えばミエリン塩基性タンパク質からの加
水分解物ではこの化合物は存在しなかった。赤血球から
単離されたアセチルコリンエステラーゼは糖脂質膜アン
カーに共有結合成分としてエタノールアミンを含有して
いるが、ミエリン塩基性タンパク質は部分的にメチル化
されたアルギニン残基を有している。したがってｕ−Ｐ
ＡＲは、酸に不安定な結合（例えばエステルまたはアミ
ド結合）によってタンパク質と共有結合的に結合してい
るエタノールアミンを含有していると結論した。第１２
図の定量分析データは、各ｕ−ＰＡＲ分子が２〜３個の
エタノールアミン残基を含んでいることを示している
（第４表参照）。
【０２９６】ＰＩ−ＰＬＣ処理による細胞表面からのｕ
−ＰＡＲの放出：精製したｕ−ＰＡＲにエタノールアミ
ンが存在することは、この細胞受容体がグリコシルホス
ファチジルイノシトール（ＧＰＩ）によって形質膜へ繋
ぎ止められていることことを示唆している。そのような
ＧＰＩ−アンカー型タンパク質の大多数は、細菌性ホス
ファチジルイノシトール特異的なホスホリパーゼＣ（Ｐ
Ｉ−ＰＬＣ）感受性であり、糖脂質のジアセチルグリセ
ロール部分を除去することによって、タンパク質を培地
へ放出する（ロー、１９８９年）。したがって発明者ら
は、最初、ＰＭＡ刺激されたＵ９３７細胞の細胞表面へ
結合した、１２５Ｉ−標識ＤＦＰ処理したｕ−ＰＡをＰ
Ｉ−ＰＬＣが放出できるかどうかを研究した。第１０図
に示したように、細胞に伴っている放射能の約５０％
が、ＰＩ−ＰＬＣによって最初の１５分以内に放出され
た。さらにＰＩ−ＰＬＣ濃度が僅か５０ng／mlまで低下
したときでも、放出速度はごく僅か低下するだけであっ
た（データは示さず）。これとは対照的に、ホスホリパ
ーゼＡ２（第１０図）およびホスホリパーゼＤ（データ
は示さず）は、これらのホスホリパーゼが比較的高濃度
で存在していても（＞５μg／ml、第１０図）、空試料
と比べて、細胞表面からの １２５Ｉ−標識ＤＦＰ−ｕ−
ＰＡ遊離の促進を何ら誘発できなかった。これに反し
て、トリプシンはすべての細胞表面に付随している放射
能を効率的に放出し（データは示さず）、即ち、受容体
へ結合しているｕ−ＰＡの物理的な接近を証明した。
【０２９７】第１１Ａ図に示したように、ＰＩ−ＰＬＣ
によって培地へ放出されたｕ−ＰＡは本質的に分解され
ず、少量のそのアミノ末端断片（ＡＴＦ、Ｍｒ１７００
０）と一緒に、主として無傷な２本鎖ｕ−ＰＡ（Ｍｒ５
００００）からなっていた。ｕ−ＰＡの受容体結合ドメ
インはこれらの両成分にともに備わっている（アペラ
ら、１９８７年）。したがってこれら２つの分子種は
１２５Ｉ−標識ＤＦＰ−ｕ−ＰＡと前インキュベーショ
ンの間に細胞表面へ結合した。対照的に受容体結合ドメ
インを欠いているｕ−ＰＡの低分子量形（Ｍｒ３３００
０）は、洗浄操作によって消失した。これらの成績か
ら、ｕ−ＰＡおよびＡＴＦは、ＰＩ−ＰＬＣによって細
胞表面から放出されるが、これらは特異的にｕ−ＰＡＲ
を伴っていることが判る。
【０２９８】この実験で、サンプリングと同時に、回収
した上清へ１mMジスクシンイミジルスベリン酸（ＤＳ
Ｓ）を添加することによる橋架け分析を実施すると、複
合体を含有している可溶性ｕ−ＰＡはＰＩ−ＰＬＣ処理
した細胞からの培地でだけ検出された（第１１Ｂ図）。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、この複合体の電気泳動による移動
度（Ｍｒ１１００００）は、ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ複合
体の移動度と同じであった（ニールセンら、１９８８
年）。模擬的に処理した試料では培地中に遊離のｕ−Ｐ
Ａだけが認められ、このことはｕ−ＰＡＲからの緩徐な
一過性のｕ−ＰＡの解離を反映していた。この実験は、
ＰＩ−ＰＬＣによって放出されたｕ−ＰＡが、ｕ−ＰＡ
Ｒとの複合体を作るという解釈をさらに支持するもので
ある。
【０２９９】最後にＰＩ−ＰＬＣによるｕ−ＰＡＲタン
パク質の特異的な放出そのものが、観察した１２５Ｉ−
標識リガンドの放出の真の原因であることを直接的に証
明した。この実験では、ＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞
を、まず酸処理して内因性のｕ−ＰＡを除き、ついでＰ
Ｉ−ＰＬＣとインキュベートした。ついで培地へ放出さ
れた何らかのｕ−ＰＡ結合成分の存在を、１２５Ｉ−標
識ＤＦＰ−ｕ−ＰＡへの橋架け反応によって検定した。
この実験で、ＰＩ−ＰＬＣは、遊離形ｕ−ＰＡＲが、膜
結合形から、１２５Ｉ−標識ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ（第１１
Ｃ図）および１２ ５Ｉ−標識ＡＴＦ（データは示さず）
に対する高い親和性をなお発現し得る可溶性タンパク質
（Ｍｒ６００００）へ急速に変換するのを誘導すること
が判った。さらにＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞のＰＩ−
ＰＬＣ処理後、無血清培地で、精製したヒトｕ−ＰＡＲ
に対して生じさせたポリクローナル・マウス抗血清を使
用してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティングによ
り、類似のＭｒを有するタンパク質を検出した（データ
は示さず）。したがってこの可溶性タンパク質は機能性
（結合特異性）および構造関係（Ｍｒおよび抗原性）の
双方の点から細胞結合型ｕ−ＰＡＲに似ている。懸濁液
中の非刺激Ｕ９３７細胞の分析によって、類似したＰＩ
−ＰＬＣ依存性のｕ−ＰＡＲの放出が明らかになった
（データは示さず）。
【０３００】然しＰＩ−ＰＬＣで処理しない無血清培地
で長期間インキュベーションしたのちに、ｕ−ＰＡＲの
緩徐な内因性の放出が検出された（第１１Ｃ図）。この
知見は、細胞が可溶性ｕ−ＰＡＲを産生したのか、ある
いは分泌したのかの何れかであることを示し得るが、一
層可能性があるのは細胞がＧＰＩ特異的なホスホリパー
ゼを産生したことである。
【０３０１】精製したｕ−ＰＡＲのＰＩ−ＰＬＣ処理後
に変化した疎水性：精製したｕ−ＰＡＲをトリトンＸ−
１１４による界面活性剤層分離にかけると、１２５Ｉ−
標識ＡＴＦへの橋架け反応による試験で、ほとんど定量
的に界面活性剤層へ分配され（第１２Ａ図）、即ち、受
容体の極めて疎水性な特性が証明された。ＰＩ−ＰＬＣ
とインキュベーションすると、ＡＴＦ結合活性の５０％
以上は水層で回復され、実質的にタンパク質を結合する
ｕ−ＰＡの疎水性を変化させた（第１２Ｂ図）。ＰＩ−
ＰＬＣの濃度増加によって、精製したｕ−ＰＡＲ標品で
この変換の水準をさらに高めることは不可能であること
が判った。これらの成績は、以前の実験で無傷のＰＭＡ
刺激したＵ９３７細胞のＰＩ−ＰＬＣ処理によって、放
出されたｕ−ＰＡを伴う細胞の分画と一致している（第
１０図）。この知見は、細菌性ＰＩ−ＰＬＣに対する部
分的抵抗性（約５０％）が生体内ｕ−ＰＡＲ集団の真の
特徴であることを示し得る。他のホスホリパーゼ（ＰＬ
ＤおよびＰＬＡ２）は精製したｕ−ＰＡＲの疎水性に何
ら有意な変化を誘発しなかった(第１２Ｃ図)。
【０３０２】１２５Ｉ−標識したｕ−ＰＡＲの試料を種
々のホスホリパーゼで酵素的に処理したあと、電荷シフ
ト電気泳動によって分析すると、類似の挙動が認められ
た。ＰＩ−ＰＬＣだけが、ポリアクリルアミドゲルで界
面活性剤組成と独立して移動する標識ｕ−ＰＡＲ（約５
０％）の意味のある部分を疎水性形へ変えることができ
た（データは示さず）。この実験は、ＰＩ−ＰＬＣが誘
発したＡＴＦ結合活性の層分配の変化が、全体的にｕ−
ＰＡＲタンパク質そのものの疎水性の同一の変化に起因
することを示している。
【０３０３】生体内標識：ＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞
の［３Ｈ］−エタノールアミン、ミオ−［３Ｈ］−イノ
シトール、または［３Ｈ］−ミリスチン酸の何れかとの
インキュベーションのあと、ＤＦＰ−ｕ−ＰＡＲへ結合
可能な成分（Ｍｒ５０〜６００００）の生合成的な標識
が得られた（データは示さず）。ｕ−ＰＡＲに特異的な
ポリクローナル抗体との免疫沈降によって、このタンパ
ク質をＵ９３７細胞の界面活性剤溶解物から単離し、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光光度法によって分析した（物
質および方法の項参照）。
【０３０４】カルボキシル末端の翻訳後プロセッシン
グ：約２モルのエタノールアミン／１モルのｕ−ＰＡＲ
の存在を証明することとは別に（第９図および第４
表）、アミノ酸分析によって、この膜受容体の翻訳後プ
ロセッシングの可能性に関する追加的な情報が明らかに
なった。精製したｕ−ＰＡＲに対して計算したアミノ酸
組成をｃＤＮＡ配列からの発生期タンパク質に対する予
測値と比較すると、幾つかの再現性のある有意な矛盾が
生じた（ロルダンら、１９９０年）。特にＡｌａおよび
Ｌｅｕの実測値はあまりに低く、ＴｙｒおよびＰｈｅの
値はあまりに高かった（第４表）。然し、興味深いこと
に、何か翻訳後の出来事の間に２９〜３１ＣＯＯＨ末端
残基が除去されたと仮定すると、計算した値と予測した
アミノ酸組成とは完全に一致することが可能であった
（第４表）。即ち、測定したアミノ酸組成、および通常
この装置で得られる正確さ／精度に基づけば、ｕ−ＰＡ
ＲにＣＯＯＨプロセッシング部位が存在することが推定
される。このモデルにしたがい、プロセッシングは、第
１３図に示したように、Ｓｅｒ２８２、Ｇｌｙ２８３、
またはＡｌａ２８４残基の１カ所で起こることが予測さ
れる。
【０３０５】［第４表］ 精製ｕ−ＰＡＲのアミノ酸組
成と提案されたＣＯＯＨ末端プロセッシング前後のその
ｃＤＮＡから推定されたアミノ酸組成との比較ａ
【表６】 （Ｂ） プロセッシング後に推測したｕ−ＰＡＲの配列 (Ｌｅｕ１〜Ａｌａ２８４) アミノ酸 ｃＤＮＡからの 酸加水分解後の ＳＤ 予測値 測定値 Ａｓｐ＋Ａｓｎ ２９ ２９．８ ０．４ Ｔｈｒｂ ２０ ２０．０ ０．５ Ｓｅｒｂ ２４ ２３．６ ０．４ Ｇｌｕ＋Ｇｌｎｃ ３６ ３８．１ １．２ Ｐｒｏ ９ １０．２ ０．３ Ｇｌｙ ２６ ２６．８ １．０ Ａｌａ ８ ７．６ ０．１ Ｃｙｓｄ ２８ ２６．３ ０．９ Ｖａｌ １２ １１．０ ０．２ Ｍｅｔ ６ ５．５ ０．５ Ｉｌｅ ７ ６．１ ０．１ Ｌｅｕ ２４ ２４．５ ０．６ Ｔｙｒ ７ ７．１ ０．１ Ｐｈｅ ５ ５．２ ０．１ Ｈｉｓ １２ １１．６ ０．１ Ｌｙｓ １０ ９．９ ０．２ Ａｒｇ １９ １８．６ ０．２ Ｔｒｐ ２ 測定せず 測定せず エタノールアミン − ２．４ ０．４ 第４表の注 ａ. 精製したｕ−ＰＡＲは第９図の解説で説明したアミ
ノ酸分析のために作成した。示した値は３つの独立した
測定の平均値を表す。データはトリプトファンを除いて
すべてのアミノ酸に関して正常化した。発生期ｕ−ＰＡ
Ｒでは合計数３０９残基であり、完全にプロセスされた
タンパク質では２８２と推定した（４および２トリプト
ファン残基をそれぞれ除いた）。アミノ酸数はシグナル
配列を除いてｕ−ＰＡＲのためのｃＤＮＡ配列に基づい
ている(ロルダンら、１９９０年)。 ｂ. これらのヒド
ロキシアミノ酸の値は加水分解中の分解を補正した［Ｓ
ｅｒ（５％）およびＴｈｒ（１０％）］。 ｃ. アミノ酸標準混合物にピログルタミン酸の生成のた
め、僅かな過剰評価が予想される。 ｄ. １試料では、システインを加水分解前にヨード酢酸
アミドを使用してそのままアルキル化して誘導体化し、
その後、酸加水分解してＳ−カルボキシシステインとし
て定量化した。一般にこのアルキル化の収量は９５％で
ある（プラグ、１９８９年）。別法として、加水分解の
間、３，３'−ジチオジプロピオン酸（ＤＴＤ ＰＡ）
の存在でシステインを誘導体化し、システインとＤＴＤ
ＰＡの間に生成した混合ジスルフィド化合物（Ｃｙｓ−
ｘ）として定量化した。 ｅ. ｎｄ＝測定しなかった。 ｆ. ＳＤ＝標準偏差（残基の絶対数）
【０３０６】この実施例の結果から、ｕ−ＰＡＲはグリ
コシル化したホスファチジルイノシトールアンカーを有
し、Ｃ末端をプロセスされていることが明白に証明され
た。
【０３０７】実施例４ ｕ−ＰＡＲに対するマウスおよびウサギポリクローナル
およびモノクローナル抗体の製造 精製ひとｕ−ＰＡ受容体（実施例１）を、６−１６％勾
配ゲルで非還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動の対象とした。蛍光分子量マーカーを隣の列
で泳動せることにより、抗原に対応する電気泳動部位を
切り出した。ゲル片はミクロ−ヂスメンブレーターII装
置で凍結乾燥し、続いて解凍した（ビー・ブラウン・エ
ージー、ドイツ連邦共和国）。ポリアクリルアミドゲル
粉はトリス緩衝化食塩水中で再構成させ、フロインド不
完全アジュバンドと混合し、ニュージーランド白色ウサ
ギへの注射に使用した。１０週間によわたり動物は５回
の注射を受け、それぞれ約３μｇの抗原を含み、その
後、単一の８μｇの注射をさらに７週間後行った。血清
を最後の注射の１週間後取り出し、ＩｇＧをプロテイン
Ａ−セファロースクロマトグラフィーで調製した。注射
抗原内の痕跡の不純物を除去するために、抗体を、固定
化ひとｕ−ＰＡおよびＰＭＡ−刺激 Ｕ９３７細胞（実
施例１参照）由来トリトンＸ−１１４デタージェント蛋
白質混合物をそれぞれ含むカラムを逐次通過させること
により吸着させた。得られた抗体調製物は溶液中でｕ−
ＰＡのアミド加水分解またはプラスミノーゲン活性化活
性を阻害しなかった。
【０３０８】未変化ｕ−ＰＡＲに対する上記と同様の方
法がｕ−ＰＡＲの１６ｋＤ ｕ−ＰＡ結合ドメインおよ
び実施例２に記載同様のキモトリプシン分解で得たｕ−
ＰＡＲのＭｒ３５−４５ｋＤ非−ｕ−ＰＡ結合フラグメ
ントに特異的なポリクローナル抗体の製造に利用でき
る。免疫化のためには、これらの２つの断片を上記と同
様にＳＤＳ−ＰＨＡＧＥゲルから切断して別々に得られ
得る。
【０３０９】ウエスタンブロットティングにより評価し
たｕ−ＰＡＲポリクローナル抗体の特異性 電気泳動法 ＳＤＳ−ＰＡＧＥをラエミリ（上掲）によ
り６〜１６％ポリアクリルアミド直線濃度勾配でスラブ
ゲル中行った。試料を還元条件下移動させた。試料を２
ーメルカプトエタノールを１００℃３分間ジチオトレイ
トールを置き換えること以外ラエミリ緩衝液中電気泳動
する直前に還元した。下記の分子量マーカーを使用し
た：ホスホリラーゼｂ（分子量約９４０００）、ウシ血
清アルブミン（分子量６７０００）、卵白アルブミン
（分子量約４３０００）、炭酸脱水酵素（分子量約３０
０００）、大豆トリプシン阻害剤（分子量約２０１０
０）およびα−ラクトアルブミン（分子量約１４４０
０）。
【０３１０】ウエスタンブロッティング − アフィニ
ティー精製ｕ−ＰＡＲまたはＰＭＡ−刺激Ｕ９３７細胞
のトリトンＸ−１１４抽出物からのデタージェント相を
６〜１６％勾配ゲル上還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥに適
用する。ゲルをニトロセルロースシート上へ電気ブロッ
トした。シートを濯ぎ、トリス緩衝化食塩水、ｐＨ７．
４中３０％ウシ胎仔で不活化した。シートをマウス−抗
−ｕ−ＰＡＲまたは対照血清でインキュベートし（即
ち、豚ムチンに対するマウス抗血清）、トリス−緩衝化
食塩水中胎仔ウシ血清中希釈した。シートを濯ぎ、第２
の抗体（アルカリホスファターゼ−接合ウサギ抗−マウ
スＩｇ（ダコパッツ、コペンハーゲン）でインキュベー
トし、ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリルホスフェート／レバミソールで
染色した。
【０３１１】ウサギｕ−ＰＡＲ抗体のウエスタンブロッ
ティング分析を、以下の変更以外同様の方法で行った：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを非還元条件下行った。新生子ウシ血
清を胎仔ウシ血清の代わりに使用した。最初の抗体イン
キュベーション工程中には１０％血清だけを含んだ。１
００倍希釈のアルカリホスファターゼ接合ブタ抗−ウサ
ギＩｇ（ダッコパ社製商品番号３０６）を第２の抗体と
して使用した。
【０３１２】細胞ＡＴＦ結合の阻害に関する分析 −
Ｕ９３７細胞を、ニールセン等（１９８８年）に記載と
同様に洗浄し、酸処理した。細胞をＰＢＳ１００μｌ、
０．１％ウシ血清アルブミン中再懸濁し、前以て希釈し
た抗−ｕ−ＰＡＲ１００μｌを加えた。対照試料に前以
て希釈した対照血清１００μｌを加えた（即ち、豚ムチ
ンに対して生じたマウス抗血清）。試料を静かに撹拌し
つつ４℃１時間インキュベートした。インキュベート
後、１２５Ｉ−ＡＴＦ１００μｌを加え、インキュベー
ションをもう１時間続けた。３００μｌ反応容積中、
１２５Ｉ−ＡＴＦの最終濃度は、２．２ｎＭであり、抗
−ｕ−ＰＡＲ血清／対照血清の最終希釈は１：３００〜
１：１５３６００の範囲であった。ついで、細胞をＰＢ
Ｓ−ウシ血清アルブミンの１ｍｌで３回洗浄し、結合放
射能をガンマ計数器で測定した。これらの条件下、放射
能の１２％は、抗血清を加えないとき、細胞−結合とな
った。結合放射能の９０％は、細胞が非標識化ｕ−ＰＡ
７００ｎＭで前以てインキュベートしたとき置換され
た。
【０３１３】結果 第１４図が示すように、免疫化マウスから血清は１２５
Ｉ標識化精製ｕ−ＰＡＲを沈降させた。１：７５、１：
７５０、１：７５００、１：７５０００に希釈した抗−
ｕ−ＰＡＲ血清は、それぞれ２５％、１８％、５％およ
び１％沈降させた。同じ希釈で免疫化血清および他方の
対照は０．５〜１％血清の範囲内で沈降し得る。
【０３１４】逆固相放射能免疫測定を使用して、抗血清
を１２５Ｉ標識化精製ｕ−ＰＡＲ（第１５図）を免疫捕
獲に使用した。抗−ｕ−ＰＡＲ血清１：５００〜１：３
２０００の２倍系列希釈は同量の１２５Ｉ−ｕ−ＰＡＲ
（総量の約２％）を１：４０００までの血清希釈で捕獲
し、１：３２０００で半量に低下した。非免疫血清の同
じ系列希釈物および他方の対照は、総量の約０.５％
１２５Ｉ−ｕ−ＰＡＲの捕獲となった。
【０３１５】ＥＬＩＳＡにおける免疫に対する非免疫血
清の反応を第１６図に示す。ウェルに対するコート化精
製ｕ−ＰＡＲの１ｎｇは１：８０００に希釈した免疫血
清で検出されるのに十分であった。すべての希釈非免疫
血清および他の試料について、バックグランド濃度で反
応値が得られる。
【０３１６】ひとｕ−ＰＡＲに対するマウス抗血清を、
Ｕ９３７細胞を、抗血清と前以てインキュベートし、つ
いで１２５Ｉ−ＡＴＦを加えた競合実験において使用し
た。第１７図が示すように、抗−ｕ−ＰＡＲ血清は細胞
に対する１２５Ｉ−ＡＴＦの特異的結合を完全に阻害し
得た。５０％阻害は１：２４００希釈で得た。同じ条件
下、対照血清は僅かに阻害、即ち、使用した最も高い濃
度で約２０％（１：３００希釈）を示した。ウエスタン
ブロッティングにおいて、ＰＭＡ−処理Ｕ９３７細胞か
らのデタージェント相内に含まれるｕ−ＰＡＲおよび精
製ｕ−ＰＡＲは、抗−ｕ−ＰＡＲ血清により検出された
（第１７図、差し込み図、レーン１およびレーン２）。
対照免疫血清は、同じ調製物とは反応しなかった（レー
ン３およびレーン４）。
【０３１７】ウサギポリクローナル抗体をウサギをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを連続して分取したアフィニティー精製ｕ
−ＰＡＲを含むポリアクリルアミドゲル物質でウサギを
免疫化することにより製造した。ＩｇＧ画分を得られた
抗血清から分離し、固定相ヒトｕ−ＰＡおよびＰＭＡ−
刺激Ｕ９３７細胞由来の固定化膜−タンパク質混合物の
それぞれカラムを通して吸収させた。抗体は、ＰＭＡ刺
激Ｕ９３７細胞（図１８）（Ａ）からトリトンＸ−１１
４デタージェント相中ｕ−ＰＡＲを認識した。すなわ
ち、化学的架橋の実施（方法につき実施例１参照）（レ
ーン３）後ＤＦＰ処理ｕ−ＰＡとの１００〜１１０ｋＤ
コンジュゲートを形成する能力によりｕ−ＰＡＲである
ことを決定し得る５０〜６５ｋＤの範囲内のタンパク質
が認められた（レーン１および２）。ＤＦＰ処理ｕ−Ｐ
Ａだけ（レーン５および６）では発色せず、ＤＰＦ処理
ｕ−ＰＡを加えなかったとき、架橋操作は、ｕ−ＰＡＲ
の電気泳動像を変化させなかった（レーン２）。同じ方
法で調製され、同じウサギからの前免疫ＩｇＧで染色さ
れたバンドは試料のいずれにもなかった。
【０３１８】ｕ−ＰＡＲの配位結合能に対するウサギ抗
体の効果を、ｕ−ＰＡＲの精製試料（実施例；約２０ｎ
ｇ／ｍｌ）を、ウサギ抗−ＰＡＲ血清からの精製および
吸収ＩｇＧと前以てインキュベートした別の実験におい
て検討した（プレインキュベーション中最終ＩｇＧ濃度
９０μｇ／ｍｌ）。この処理は、１２５Ｉ−ＡＴＦとの
架橋コンジュゲートの形成を完全に妨害した。前免疫血
清からのＩｇＧは、同じ濃度で架橋分析に影響を与えな
かった。
【０３１９】u−ＰＡＲに対するモノクローナルマウス
抗体の産生 マウスの免疫化 ＢＡＬＢ／c系マウスを、ジイソプロピルフルオライド
・ウロキナーゼ型プラスミ¨ノーゲン活性化物(ＤＦＰ
−u−ＰＡ)リガンド親和性カラム上でu９３７ａ細胞か
ら精製したu−ＰＡＲで免疫した（実施例１参照）。マ
ウスは３週間間隔でu−ＰＡＲ ５μgを３回腹腔内注射
した。最後の注射後８−１０日で、血清を、u−ＰＡＲ
に対する反応性についてＥＬＩＳＡおよびウェスタンブ
ロッティングの両方で試験した。陽性の反応が検出され
たとき、u−ＰＡＲ １０−１５μgを腹腔内に最終的に
ブースター注射した。
【０３２０】ハイブリドーマの融合及びクローニング 融合のための標準的な実験計画に従ったが、簡単な概要
は以下のとおりである: a) 免疫ＢＡＬＢ／cマウスから単離した脾臓及び末梢
リンパ節を機械的に粉砕し、均一な細胞懸濁液を血清不
含溶媒中調製した。 b) 指数増殖期の骨髄腫細胞およびＸ６３−Ａg８.６５
３細胞(ケルニー、ジャーナル・オブ・イムノロジー、
１２３巻、１５４８−１５５０頁、１９７９年)を単離
し、ＢＡＬＢ／c脾臓リンパ球との融合に供した。骨髄
腫細胞は血清不含溶媒に再懸濁した。 c) 脾臓およびリンパ節リンパ球並びに骨髄腫細胞それ
ぞれ１：１.２５及び１：２の比率で混合した。 d) 細胞は３７℃で５０％(重量／容量)ポリエチレング
リコール４０００(ＰＥＧ)を（脾臓及びリンパ節リンパ
球に対し、それぞれ５mlないしn×１０８及び１mlない
し４.５×１０７）滴加することにより融合した e) 血清不含溶媒を穏やかに添加して融合を停止させ
た。 f) 遠心後、上清を除去し、細胞を血清含有溶媒で１回
洗浄した。次いで、細胞をヒポキサンチン・アミノプテ
リン・チミジン(ＨＡＴ)含有溶媒中注意深く再懸濁し
た。 g) 融合した細胞を約７×１０５セル／ウェル（脾臓融
合）及び５×１０５セル／ウェル（リンパ節融合）の濃
度で、１５０μlの選択溶媒中２.５×１０４マクロファ
ージを含有する平底マイクロタイタープレートのウェル
に５０μlずつ分配した。 h) 細胞を加湿恒温培養器中５％ＣＯ２ 雰囲気下３７
℃で恒温培養した。 i) 選択溶媒は１週間後かまたは必要な時に新しくし
た。 j) ハイブリドーマの成長を見るために、ウェルを検査
した。膨大に成長し色が黄色に変化したのが観察された
時、上清を採りＥＬＩＳＡ法によりu−ＰＡＲと反応す
る抗体のふるい分けに供した（以下参照）。 k) 融合後１０−１４日に、ＨＡＴ培地をＨＴ培地に置
き換え、その後、例えば１０日後に普通の培地に置き換
えた。 l) ＥＬＩＳＡ陽性のウェルを２４−ウェルプレートの
カップに移し、次に小さい(２５cm２)培養フラスコに移
した。 m) ＥＬＩＳＡ陽性のハイブリッド細胞を、液体窒素中
できるだけ早く凍結した。 n) ４つのＥＬＩＳＡ陽性ウェルからのハイブリドーマ
を制限希釈によりクローン化した。平均０.５セル／ウ
ェルで３６ウェル、平均１セル／ウェルで３６ウェル及
び平均３セル／ウェルで３６ウェルを各培地から調製し
た。唯一の型のモノクローナル抗体を分泌するハイブリ
ドーマが確立されるまで再びクローン化し再試験した。
【０３２１】融合細胞を含むウェルからの培地をＥＬＩ
ＳＡで試験し、元のハイブリドーマ培養体の各々から平
均０.５セル／ウェルで接種したウェルからのクローン
の強いＥＬＩＳＡ反応を安定に示す一つを次の増殖用に
用いた。
【０３２２】スクリーニング用に用いた固相酵素免疫測
定法（ＥＬＩＳＡ） 材料 １) ９６ウェルプレート(平底高度な結合能力、ヌン
ク)。 ２) u９３７細胞から精製したu−ＰＡＲ(１０μg／m
l)。 ３) 西洋ワサビペルオキシダーゼ・複合ウサギ抗マウ
スＩg(ＨＲＰ−ＲａＭＩg)。 ４) ＰＢＳ緩衝液、pＨ７.４(ＰＢＳ)。 ５) ＰＢＳ＋０.１％トゥイーン２０、pＨ７.４(ＰＢ
Ｓ／トゥイーン２０) ６) 妨害用緩衝液: ＰＢＳ中１％脂肪粉乳（ＳＭ
Ｐ）。 ７) クエン酸塩緩衝液: ０.１Ｍクエン酸塩、pＨ５.
０。 ８) 基質溶液: クエン酸塩緩衝液中１,２−フェニレン
ジアミン−ジヒドロクロライド(ＯＰＤ)錠、たとえばク
エン酸塩緩衝液１５ml＋Ｈ２Ｏ２ ５μl中ＯＰＤ３錠
(３０％)。 ９) 停止用緩衝液: １Ｍ Ｈ２ＳＯ４ 方法 １) ０.１Ｍ Ｎa２ＣＯ３、pＨ９.８で希釈して濃度
を２０ng／mlにした精製u−ＰＡＲ １００μlでウェル
を被覆する。 ２) ４℃で一晩恒温培養する。 ３) 翌日、ウェルをＰＢＳ／トゥイーン２０で４回洗
浄する。 ４) ウェル中に残存する活性部位を１％ＳＭＰ／ＰＢ
Ｓ、２００μl／ウェルで、室温で１／２時間妨害す
る。穏やかに振とうする。 ５) 段階３のように洗浄する。 ６) ＰＢＳ／トゥイーン２０＋１％ＳＭＰ中連続希釈
したハイブリドーマ分泌抗体／免疫／非免疫血清からの
使用溶媒１００μl／ウェルを加え、適切な対照を含め
る。 ７) 穏やかに振とうしながら３７℃で１時間恒温培養
する。 ８) 段階３のように洗浄する。 ９) ＰＢＳ／トゥイーン２０＋１％ＳＭＰで１:５００
に希釈した２次抗体ＨＲＰ−ＲaＭ Ｉg １００μl／
ウェルを添加する。 10) 段階７のように恒温培養する。 11) 段階３のように洗浄する。 12) ２回蒸留水で１回洗浄する。 13) 基質溶液１００μl／ウェルを添加する。 14) 鮮やかな黄色が現れた時、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４１５
０μl／ウェルで１５−３０分間反応を停止させる。 15) ４９０nmフィルターの付いたＥＬＩＳＡ読み取り
機を読む。
【０３２３】モノクローナル抗体の精製 材料 １．ハイブリドーマ分泌モノクローナル抗体からの使用
溶媒。 ２．a．プロテインＧセファロース４ファスト・フロウ
使い捨て可能カラム３ml。 b．結合用緩衝液：２×１００ml、０.２Ｍリン酸ナトリ
ウム（pＨ７.０）。予防剤として０.０５％ナトリウム
アジドを含む１０×濃縮物。 c．溶出溶液：１×１００ml、１.０Ｍグリシン−ＨＣl
（pＨ２.７）。１０×濃縮物。２.７のpＨは防腐剤を使
用することなくすぐれた安定性を与える。 d．中和緩衝液：１×１００ml、１.０Ｍトリス−ＨＣl
（pＨ９）。防腐剤として０.０５％ナトリウムアジドを
含む。 を含むＩgＧの精製用ＭＡbトラップＧ完全キット（ファ
ルマシア）。 ３．フラクションコレクター及びuv−モニター ４．ミニソーブ管 方法 プロテインＧセファロース４ＦＦカラムをまず頂上キャ
ップを除くことにより開けた。これはゲル中に入る気泡
を防ぐ。２０％エタノール保管溶液を注ぎ、プロテイン
Ｇセファロース４ＦＦカラムを結合用緩衝液（〜３０m
l）で頂上まで満たすことにより平衡化し、その後カラ
ムから引き出した。カラムはメニスカスが頂上フリット
に達すると流れを自動的に停止し、カラムを乾燥から防
ぐ。培養上清を１５０×g遠心し、濾過した（０.２０μ
m）。５０−１５０mlの調製した試料を用いゲルに吸収
させた。未結合の蛋白を結合用緩衝液（〜３０ml）で頂
上までカラムを満たすことにより流去し、緩衝液をカラ
ムに通過させて未結合材料を溶出した。結合したＩgＧ
は、溶出緩衝液（〜１５ml）でカラムを満たすことによ
りカラム上に溶出させた。溶出した抗体の１mlフラクシ
ョンを４０−８０μl中性緩衝液を含むミニソーブ管に
集め、溶出フラクションの純度をファストゲルシステム
（ファルマシア）を適用し、次いで銀染色して８−２５
％勾配ゲル上で調べた（実施例１参照）。
【０３２４】モノクローナル抗体のサブイソタイピング 材料 １．９６ウェルプレート（平均高度な結合能力、ヌン
ク）。 ２．精製したu−ＰＡＲ（１０μg／ml）。 ３．マウス・タイパー・サブイソタイピング・キット
（バイオ−ラド）。 ４．西洋ワサビペルオキシダーゼ・複合ブタ抗ウサギＩ
g(ＨＲＰ−ＳaＲ Ｉg) ５．ＰＢＳ緩衝液、pＨ７.４（ＰＢＳ）。 ６．ＰＢＳ＋０.１％トゥイーン２０、pＨ７.４（ＰＢ
Ｓ／トゥイーン２０)。 ７．妨害用緩衝液：ＰＢＳ中１％脱脂粉乳（ＳＭＰ）。 ８．クエン酸塩緩衝液：０.１Ｍクエン酸塩、pＨ５.
０。 ９．基質溶液：クエン酸緩衝液中１,２−フェニレンジ
アミン−ジヒドロクロライド（ＯＰＤ）錠、例えばクエ
ン酸液緩衝液１５ml＋Ｈ２Ｏ２５μl中ＯＰＤ３錠（３
０％）。 10．停止用緩衝液：１ＭＨ２ＳＯ４
【０３２５】方法 ウエルを０.１ＭＮa２ＣＯ２、pＨ９.８中２０ng／mlの
濃度まで希釈した精製u−ＰＡＲ100μlで被覆し、１夜
４℃で恒温培養した。次いでウエルをＰＢＳ／トゥイー
ン２０で４回洗い、ウエルに残っている活性部位を、１
％ＳＭＰ／ＰＢＳ、２００μｌ／ウエルで１／２時間室
温でゆるやかに振とうしながら反応を停止させる。それ
らを再び上記のように洗い、ハイブリドーマ分泌モノク
ローナル抗体からの使用溶媒１００μl／ウエルを加
え、次いで１時間３７℃でゆるやかに振とうしながら恒
温培養した。上記のように洗浄したのち、サブイソタイ
ピング抗体の未希釈溶液１００μl／ウエルを加えた。
１時間３７℃で恒温培養したのち、ウエルを上記のよう
に洗浄した。１：５００に希釈したＨＲＰ−ＳaＲＩg１
００μl／ウエルをＰＢＳ／トゥイーン２０＋１％ＳＭ
Ｐに加え、ウエルを恒温培養し、上記のように洗浄し、
次いで２回蒸留水で洗浄した。基質溶液１００μl／ウ
エルを加え、５−１０分後、鮮やかな黄色が現れたと
き、１５０μl／ウエルの１ＭＨ２ＳＯ４で反応を停止
させた。４９０nmフィルターの付いたＥＲＩＳＡ読み取
り機で吸光度を測定した。各実験で適当な対照を含ん
だ。
【０３２６】結果 融合脾臓細胞を有する１０００ウエルは１９、そして融
合リンパ節細胞を有する９０ウエルは５つの安定なＥＬ
ＩＳＡ陽性ハイブリドーマを得た。一次クローニング用
に異なる特質でハイブリドーマを選択するため、安定な
ＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマからの調整溶媒を、
（１）ウエスタンブロッティング（実施例４参照）でu
−ＰＡＲを可溶化したＰＩ−ＰＬＣを染色する能力（実
施例３参照）、（２）放射標識型でのu−ＰＡのＡＴＦ
部分のu９３７細胞への結合の妨害（実施例１１参
照）。及び（３）結腸アデノアルシノナス（adenoarcin
onas）のパラフィン区分の染色、インサイチュウハイブ
リダイゼーションによりそれらはu−ＰＡＲに対するmＲ
ＮＡの発現を伴う細胞を含むことを示した（実施例８参
照）、について試験した。
【０３２７】これらの基準で、４ハイブリドーマをクロ
ーニング用に選択した（Ｉ ４Ｅ−８、Ｉ ５Ａ−７、Ｉ
１０Ａ−４、II １Ｄ−６）。最初の３つは脾臓細胞融
合から誘導され、最後のものはリンパ節細胞融合から誘
導された。これらの４つのハイブリドーマからの調整溶
媒の特質は以下の通りであった。
【０３２８】
【表７】 ４つのハイブリドーマのクローニング後、平均０.５セ
ル／ウエルで植えたウエルのほぼ半分が生成を示し、そ
れぞれの元のハイブリドーマ用に、一貫して強いＥＬＩ
ＳＡ反応を示すものの一つを繁殖用及び全ての続く研究
用に用いた。クローンを選択したものは１Ｒ（Ｉ４Ｅ−
８から）、２Ｒ（Ｉ ５Ａ−７から）、３Ｒ（Ｉ １０Ａ
−４から）及び４Ｒ（II １Ｄ−６から）と名付けた。
１Ｒは他の３つのクローンよりも弱いＥＬＩＳＡ反応を
一貫して示した。これらのクローンから生成された抗体
のサブイソタイピングは上記したように実施した。１Ｒ
はＩgＧ２b、カッパーであると測定され、他の３つはＩ
gＧ１カッパーイソタイプと測定された。抗体は上記の
ように精製し、ファストゲルシステムでの電気泳動後、
１つの銀染色バンドを示すこれらの精製標品は全ての続
く研究に用いた。
【０３２９】実施例５ 免疫沈降及びウエスタンブロッティングによるモノクロ
ーナル抗体の特性表示モノクローナルこれらのによる免
疫沈降による精製u−ＰＡＲの特異認識 放射免疫沈降検定法（ＲＩＰＡ）。この検定法は、無処
理のu−ＰＡＲ（Ｉ）又はＭr＝１６,０００u−ＰＡ結合
ドメイン及びu−ＰＡと結合しないＭr３５−４５,００
０断片を含むu−ＰＡＲ（Ｄ）のキモトリプシン崩壊型
を特異的に検出する目的で開発された。
【０３３０】材料 １．１２５Ｉ−ヨウ素化u−ＰＡＲ（Ｉ）及びu−ＰＡＲ
（Ｄ）。 ２．反応用緩衝液：０.１Ｍトリス−ＨＣｌ中０.１％ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０.１％ＣＨＡＰＳ＋３
００mＭＮaＣl、pＨ＝８.１。 ３．洗浄用緩衝液０：反応用緩衝液。 洗浄用緩衝液１：０.１％ＢＳＡのない反応用緩衝液。 ４．反応用緩衝液中に膨張し、１：１に希釈したプロテ
インＡセファロースＣＬ４Ｂ（プロテインＡセファロー
ス溶液）。 ５．エッペンドルフプラスチック試験管。
【０３３１】方法 １．反応用緩衝液に希釈した放射性標識化u−ＰＡＲ
（Ｉ）又はu−ＰＡＲ（Ｄ）（約３.５×１０５cpm／m
l）１００μlをエッペンドルフ試験管に加える。 ２．反応用緩衝液に適当な濃度（即ち２０μg／ml）に
希釈した精製モノクローナル抗体を添加し、適切な対照
も含める。 ３．穏やかに振とうしながら４℃で１時間恒温培養す
る。 ４．プロテインＡセファロース溶液５０μlを加える。 ５．エンド・オーバー・エンド撹拌器上、４℃で１時間
恒温培養する。 ６．最後の恒温培養の後、１０,０００rpmで２０秒間試
料を遠心沈殿させる（ミニヒューグ）。 ７．１mlウエスタン緩衝液０にペレットを再び懸濁し、
１０,０００rpmで２０秒間セファロースを遠心沈殿させ
る。上清を除去する。 ８．段階７を繰り返す。 ９．１mlウエスタン緩衝液１にペレットを再び懸濁し、
１０,０００rpmで２０秒間セファロースを遠心沈殿させ
る。上清を除去する。 10．段階９を繰り返す。 11．ゲル電気泳動用二回濃縮試料緩衝液５０μlにペレ
ットを再び懸濁し、試料を５分間煮沸する。 12．１０,０００rpmで２０秒間試料を遠心沈殿させる。 13．上清を試験管に移し、ガンマーカウンターで試料を
数える。 14．計数後、６−１６％公配ゲル及び自動ラジオグラフ
ィーで非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試料を分
析する。
【０３３２】結果 ４つのモノクローナル抗体は、無処理形及び崩壊形で精
製u−ＰＡＲへの結合について放射免疫沈降検定法で試
験した。キモトリプシン分解の結果、Ｍr１６,０００の
u−ＰＡ結合断片及びＭr３０−５０,０００範囲の不均
質成分の遊離となり、これは分子の静止を示す。無処理
のu−ＰＡＲはＭr５０−６５,０００を有する不均質成
分である。u−ＰＡＲ、u−ＰＡＲ（Ｉ）及びu−ＰＡＲ
（Ｄ）の両調製品は、実施例１に記載したように１２５
Ｉ−ヨウ素で放射標識化し、免疫沈降に付した。図１９
Ａは、モノクローナル抗体（それぞれレーン７，５，
６，８における１Ｒ、２Ｒ、３Ｒ、４Ｒ）が異なる効率
を有するＭr５０−６５,０００の範囲のu−ＰＡＲ
（Ｉ）を沈降させることを示す。この違いは精製u−Ｐ
ＡＲに対する異なる親和性を反映しうる。２Ｒ及び４Ｒ
はu−ＰＡＲ（Ｉ）を沈殿させるのに等しく効果的であ
るが、３Ｒは効果がより少ない。１Ｒによって沈殿され
るu−ＰＡＲ（Ｉ）の量は、非常に少ない。これは、こ
の抗体と精製u−ＰＡＲとの比較的弱い反応を示すＥＬ
ＩＳＡ結果と一致する（上記参照）。４つのモノクロー
ナル抗体のプールは個々の抗体の混合効果を反映する。
u−ＰＡＲ（Ｄ）を抗原として用いた場合、免疫沈降の
結果、３ＲによるＭr１６,０００を有するuＰＡＲのu−
ＰＡ結合断片の特異認識となった。２Ｒ及び４Ｒはほぼ
同じ効率を有するＭr３５−５０,０００範囲の不均質成
分を認識した。プールしたモノクローナル抗体は、個々
の抗体の反応から予想されるように両成分を認識した
（図１９Ｂ）。
【０３３３】ウエスタンブロッティングにより測定され
た通りのＰＭＡ処理u９３７細胞からのu−ＰＡＲとモノ
クローナル抗体との反応性 方法 電気泳動。ラエムリに従って、平板ゲル中、直線６−１
６％ポリアクリルアミド濃度勾配でＳＤＳ−ＰＡＧＥを
実施した（上掲）。試料は還元条件下とした。試料は、
２−メルカプトエタノールをジチオトレイトールに置き
換えた以外、３分間１００℃でラエムリ緩衝液中での電
気泳動前直ちに還元した。ウエスタンブロッティング。
ＰＭＡ活性u９３７細胞及びu９３７aのトリトンＸ−１
１４抽出物からの清浄相の試料を、それぞれ非還元条件
下、６−１６％公配ゲル上ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。
分離した蛋白をニトロセルロースフィルターシート上に
エレクトロブロットした。シーツをトリス緩衝・食塩水
pＨ８.０中１％脱脂粉乳で妨害し、５mm片に切った。こ
れらを妨害用溶液に希釈したu−ＰＡＲ又は対照血清
（即ちマウス抗u−ＰＡＲ血清及びマウス非免疫血清）
に対する、実施例１に記載したように調製したマウスモ
ノクローナル抗体１Ｒ、２Ｒ、３Ｒ及び４Ｒと恒温培養
した。片を妨害用溶液（上記参照）中０.０５％トゥイ
ーンに浸漬し、二次抗体［アルカリホスファターゼ複合
ウサギ抗マウスＩg（ダコパッツ、コペンハーゲン）］
と恒温培養し、ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドチルホスファターゼで展開
した。
【０３３４】結果 ＰＭＡ処理u９３７及びu９３７a細胞からの清浄相内に
含まれるu−ＰＡＲに対する４つのモノクローナル抗体
の反応性を、それぞれウエスタンブロッティングにより
分析した。u−９３７細胞は５０−６５ＫＤ範囲にu−Ｐ
ＡＲ蛋白を発現し、u９３７a細胞はさらにu−ＰＡＲ変
異体系４０−４５ＫＤを発現する。図２０Ａに示すよう
に、モノクローナル抗体１Ｒ（レーン１）はウエスタン
ブロッティングで何の反応も示さなかったが、２Ｒ、３
Ｒ及び４Ｒ（それぞれレーン２、３及び４）はu−ＰＡ
Ｒに対して予想された分子量を有する蛋白を認識した。
４Ｒは非常に弱い反応を与えた。図２０Ｂは、u９３７a
細胞からのu−ＰＡＲとの反応性のパターンを示す。１
Ｒ（レーン１）はu−ＰＡＲとの反応を示さなかった。
２Ｒ及び３Ｒ（それぞれレーン２及び３）はu−ＰＡＲ
の高及び低分子量形の両方を認識し、一方４Ｒ（レーン
４）はu−ＰＡＲの低分子量変異体を優勢に強く認識し
た。
【０３３５】結論 これらの実験の結果から、４つのモノクローナル抗体１
Ｒ、２Ｒ、３Ｒ及び４Ｒは全てu−ＰＡＲに向けられ、
これらはu−ＰＡＲ分子上の異なるエピトープを認識す
ると結論される。 １Ｒ：抗体はu−ＰＡＲの非u−ＰＡ結合部分に結合す
る。抗体はＥＬＩＳＡで反応性なだけである。蛋白をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ及びエレクトロブロッティングに付す
と、この抗体により認識されるエピトープは崩壊する。 ２Ｒ：抗体はu−ＰＡＲの非u−ＰＡ結合部分に結合す
る。それが向けられるエピトープはＳＤＳ−ＰＡＧＥ及
びエレクトロブロッティングにより破壊されない。ウエ
スタンブロッティングにおいて、ＰＭＡ活性化u９３７a
細胞からのu−ＰＡＲの高及び低分子量グリコシレーシ
ョン変異体の両方とそれが反応することで４Ｒと異な
る。 ３Ｒ：抗体はu−ＰＡＲのu−ＰＡ結合部分と結合する。
それが向けられるエピトープはＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びエ
レクトロブロッティングにより破壊されない。 ４Ｒ：抗体はu−ＰＡＲの非u−ＰＡ結合部分に結合す
る。それが向けられるエピトープはＳＤＳ−ＰＡＧＥ及
びエレクトロブロッティングにより破壊されない。それ
は、ＤＭＡ活性化u９３７a細胞からのu−ＰＡＲの低分
子量グリコシレーション変異体とほとんど独占的に反応
するので２Ｒと異なる
【０３３６】実施例６ ＥＬＩＳＡによるu−ＰＡＲの定量 生物学的材料：実施例１で記載したように精製したu−
ＰＡＲ親和性。 実施例４に記載したように精製したモノクローナル抗体
１Ｒ、２Ｒ、３Ｒ及び４Ｒ。 モノクローナル抗体のビオチン化（ゲストン、Ｊ−Ｌ
ら、ジャーナル・オブ・ヒストケミカル・シトケミスト
リイ、２７、１９７９、１１３１−１１３９参照）
【０３３７】材料 １．１mg／mlの濃度で精製抗体。 ２．反応用緩衝液：０.１ＭＮaＨＣＯ３、pＨ９.５。 ３．希釈ジメチルホルムアミド中ＢＸＮＨＳ（ビオチン
のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル＋スペーサー
基）の貯蔵溶液：０.１ＭＢＸＮＨＳ。 ４．ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７.４（ＰＢＳ）。 ５．透析管 ６．８７％グリセロール
【０３３８】方法 ２ml（２mg）の精製抗体を５００ml０.１ＭＮaＨＣ
Ｏ３、pＨ９.５で２時間、次いで５００ml０.１ＭＮaＨ
ＣＯ３、pＨ９.５で一夜４℃で透析した。４５.６μl
０.１ＭＢＸＮＨＳを透析した抗体に加え、次いでこれ
を１時間室温で光から保護して、ゆるやかに磁気撹拌し
つつ恒温培養した。恒温培養後、反応溶液を２４時間４
℃で、４回更新で、５００mlＰＢＳ、pＨ７.４に対し透
析した。ビオチン化抗体を８７％グリセロールで１：１
に希釈し、−２０℃で保存した。
【０３３９】u−ＰＡＲの測定 材料 １．９６ウエル・プレート（平底高結合能力、ヌン
ク）。 ２．未標識化精製モノクローナル抗体４Ｒ。 ３．ビオチンで標識した精製モノクローナル抗体２Ｒ。 ４．西洋ワサビペルオキシダーゼ複合（ＨＲＰ）ストレ
プトアビジン（ＤＡＫＯ、コペンハーゲン）。 ５．ＰＢＳ緩衝液、pＨ７.４（ＰＢＳ）。 ６．ＰＢＳ＋０.１％トゥイーン２０、pＨ７.４（ＰＢ
Ｓ／トゥイーン）。 ７．妨害用緩衝液：ＰＢＳ中１％脱脂粉乳（ＳＭＰ）。 ８．クエン酸塩緩衝液：０.１Ｍクエン酸塩、pＨ５.
０。 ９．基質溶質：クエン酸塩緩衝液中１,２−フェニレン
ジアミン−塩酸塩（ＯＰＤ）錠、例えばクエン酸塩緩衝
液１５ml＋Ｈ２Ｏ２（３０％）５μl中４ＯＰＤ錠。1
0．停止用緩衝液：１ＭＨ２ＳＯ４。
【０３４０】方法 １．０.１ＭＮa２ＣＯ３（pＨ９.８）中に希釈した精製
モノクローナル抗体４Ｒ（２０μg／ml）１００μlでウ
エルを被覆する。 ２．４℃で一夜恒温培養する。 ３．ＰＢＳ／トゥイーンで５回ウエルを洗浄する。 ４．ウエル中に残っている活性部位を１％ＳＭＰ／ＰＢ
Ｓ、２５０μl／ウエルで少なくとも１時間３７℃で妨
害する。 ５．段階３のように洗浄する。 ６．未標識化標準抗原溶液の連続希釈１００μlを添加
する。 ７．ゆるやかに振とうしながら、最小１.５時間、室温
で恒温培養する。 ８．段階３のように洗浄する。 ９．ビオチン標識化モノクローナル抗体２Ｒ（濃度５０
０ng／ml）１００μlを添加する。 10．段階７のように恒温培養する。 11．段階３のように洗浄する。 12．ＳＭＰ／ＰＢＳ／トゥイーンに１：５０００に希釈
したＨＲＰ−ストレプアビジン（ＤＡＫＯ、コペンハー
ゲン）１００μlを添加する。 13．段階７のように恒温培養する。 14．段階３のように洗浄する。 15．二回蒸留水で１回洗浄する。 16．基質溶液１００μl／ウエルを添加する。 17．鮮やかな黄色が現れたとき、１ＭＨ２ＳＯ４１００
μl／ウエルで５−１０分、反応を停止する。 18．４９０nmフィルターの付いたＥＬＩＳＡ読み取り機
で読む。
【０３４１】モノクローナル抗体４Ｒをu−ＰＡＲに対
する親和性精製ポリクローナル抗体と置き換え、同様の
実験を実施した。u−ＰＡＲに対するポリクローナル抗
体は上記実施例４に記載されるように得た。
【０３４２】結果 精製したｕ−ＰＡＲを２種の抗体サンドウィッチＥＬＩ
ＳＡにより定量分析した。モノクローナル抗体４Ｒを捕
獲抗体として使用するとき、精製したｕ−ＰＡＲは上記
の条件下１：５００〜１：４０００希釈範囲で測定し得
た。不適切なモノクローナル抗体はｕ−ＰＡＲ（図２
１）を結合しない。ｕ−ＰＡＲに対してアフィニティー
精製ポリクローナルウサギ抗体を使用したとき、ｕ−Ｐ
ＡＲを１：１０００〜１：４０００希釈範囲で測定し得
た。ウサギ免疫前血清はｕ−ＰＡＲＡ（図２１）を結合
していないことを示した。定量的ＥＬＩＳＡの感受性
は、曲線の傾斜に依存する。４Ｒを用いる実施例におい
て、最も急な傾斜を得る；従って、これは最も正確な定
量を与えるものと思われる。
【０３４３】これらの結果およびｕ−ＰＡＲ（実施例
５）のキモトリプン消化の免疫沈降で得られた結果に基
づいて、抗体の下記の組合せは、ｕ−ＰＡと複合してい
ると否とに関係なくｕ−ＰＡＲを測定するのに有用であ
ると思われる。
【０３４４】Ａ．非標識捕捉抗体：１Ｒおよびアフィニ
ティー精製ポリクローナル抗−ｕ−ＰＡＲウサギ抗体。 ビオチン−標識検出抗体：２Ｒまたは４Ｒ、アフィニテ
ィー精製ポリクローナル抗−ｕ−ＰＡＲウサギ抗体。 Ｂ．非標識捕捉抗体：２Ｒ、アフィニティー精製ポリク
ローナル抗−ｕ−ＰＡＲウサギ抗体。 ビオチン−標識検出抗体：１Ｒ、４Ｒ、アフィニティー
精製ポリクローナル抗−ｕ−ＰＡＲウサギ抗体。 Ｃ．非標識捕捉抗体：４Ｒおよびアフィニティー精製ポ
リクローナル抗−ｕ−ＰＡＲウサギ抗体。 ビオチン−標識検出抗体：１Ｒまたは２Ｒ、アフィニテ
ィー精製ポリクローナル抗−ｕ−ＰＡＲウサギ抗体。
【０３４５】抗体の下記の組合せは、ｕ−ＰＡＲおよび
ｕ−ＰＡの複合体の測定に有効であると思われる： Ａ．非標識捕捉抗体：１Ｒ，２Ｒおよび４Ｒ、アフィニ
ティー精製ポリクローナル抗−ｕ−ＰＡＲウサギ抗体。 ビオチン−標識検出抗体：ｕ−ＰＡのＢ−鎖と反応する
モノクローナル抗体（例えば、クローン２および５、ニ
ールセン等、ジャーナル・オブ・イムノアッセイ、７
巻、１９８６年、２０９〜２２８頁）。 Ｂ．非標識捕捉抗体：ｕ−ＰＡのＢ−鎖と反応するモノ
クローナル抗体。 ビオチン−標識検出抗体：１Ｒ、２Ｒまたは３Ｒ、アフ
ィニティー精製ポリクローナル抗−ｕ−ＰＡＲウサギ抗
体。
【０３４６】下記の組合せの試薬は、ｕ−ＰＡＲ単一ま
たはｕ−ＰＡとの複合体の測定に有効であると思われ
る： Ａ．非標識捕捉抗体：モノクローナル抗体１Ｒ，２Ｒま
たは４Ｒ、アフィニティー精製ポリクローナル抗−ｕ−
ＰＡＲウサギ抗体。 検出試薬：ビオチン−標識検出抗体３Ｒ、ビオチニル化
ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ。 Ｂ．非標識捕捉抗体：３Ｒ、ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ。 ビオチン−標識検出抗体：モノクローナル抗体１Ｒ、２
Ｒまたは４Ｒ、アフィニティー精製ポリクローナル抗−
ｕ−ＰＡＲウサギ抗体。
【０３４７】ｕ−ＰＡＲ ＥＬＩＳＡａの上記の種々の
型において、３Ｒモノクローナル抗体は、ｕ−ＰＡＲの
１６ｋＤのｕ−ＰＡ結合断片で免疫化により産生したポ
リクローン抗体により置換し得る。１Ｒ、２Ｒおよび４
Ｒモノクローンル抗体は、実施例４記載と同様にｕ−Ｐ
ＡＲのＭｒ３５〜４５ｋＤの非−ｕ−ＰＡ結合断片で免
疫化により産生したポリクローナル抗体により置換し得
る。
【０３４８】実施例１０ u−ＰＡＲ抗体による細胞表面プラスミノーゲン活性化
の阻害 材料および方法 Ｕ９３７細胞上のu−ＰＡＲ結合u−ＰＡによるプラスミ
ノーゲン活性化を、詳細に上述（エリス等、１９９０
年）されているとおりに決定した。簡単に述べると、種
々濃度のプラスミノーゲン(０.０９μＭおよび２.２６
μＭ)をプラスミン特異性蛍光原性基質Ｖal−Ｌeu−Ｌy
s−ＡＭＣ(バケム、スイス)の存在下、Ｕ９３７細胞(活
性u−ＰＡと共に前もって恒温培養し続いて洗浄した)と
共に恒温培養した。プラスミン発生は基質の加水分解に
よる蛍光の増加の変化率から決定した。蛍光は励起およ
び発光波長を各々３８０nmおよび４８０nmで測定した。
これらのプラスミン発生率は次いで、二重逆数法でプラ
スミノーゲン濃度に対してプロットし、反応に対する個
々の反応速度定数、ＫmおよびＶmaxを決定した。最高反
応速度Ｖmaxは、Ｖmaxをu−ＰＡＲに結合したu−ＰＡの
濃度で割ることにより、触媒反応速度定数Ｋcatに変換
した。
【０３４９】Ｕ９３７細胞上のu−ＰＡＲに結合したu−
ＰＡの濃度は、反応速度実験と平行して１２５Ｉ−u−
ＰＡ(エリス等（１９９０年）により記載のとおり調製)
を細胞と恒温培養し反応速度実験と同じ処理をして決定
した。u−ＰＡＲに結合した １２５Ｉ−u−ＰＡは一般的
なガンマー・カウンティング技法を用いて定量した。
【０３５０】結果 Ｕ９３７細胞上でu−ＰＡＲに結合したu−ＰＡによるプ
ラスミノーゲン活性化の反応速度論 Ｕ９３７細胞上のu−ＰＡＲに結合したu−ＰＡは、u−
ＰＡＲが存在しない場合に示すのとは異なる反応速度特
性を示して天然基質プラスミノーゲンを活性化すること
が認められた。u−ＰＡＲ結合u−ＰＡによるＧlu−プラ
スミノーゲンの活性化は、明らかにミカエリス・メント
ン型反応速度機構に従った。これはＫmが０.６７μＭ、
kcatが５.６／分であることに特徴づけられた(図２
２)。これらの両者の定数は溶液中、すなわちＵ９３７
細胞が不在のときにu−ＰＡで得られたものとは異なっ
ていた。この場合、Ｋmは２５μＭ(細胞関与u−ＰＡＲ
が不在の場合のプラスミノーゲン親和性が約４０倍低い
ことと等価である)と非常に高く、kcatは４４／分(細胞
関与u−ＰＡＲが不在の場合の触媒速度が約８倍高いこ
とと等価である)と高かった。従って、Ｕ９３７細胞上
でu−ＰＡＲに結合したu−ＰＡはプラスミノーゲン活性
化を誘起し、溶液中でよりも低いプラスミノーゲン濃度
で飽和されるが、触媒反応速度の低下を伴う。しかしな
がら、全体的な効果をみると、Ｕ９３７細胞上のu−Ｐ
ＡＲに結合している場合、ｕ−ＰＡの触媒効率(kcat／
Ｋm)が５倍増加する(表５)。プラスミノーゲン(および
プラスミン)はＵ９３７細胞およびその他広範な種類の
細胞(エリスら、１９８９年; プロウら、１９８６年)に
結合することが知られているので、これらの定数はu−
ＰＡＲを有する細胞の表面で起こるプラスミノーゲン活
性化、すなわち細胞表面プラスミノーゲン活性化の程度
を表す。
【０３５１】図５でも、ＰＭＡ刺激Ｕ９３７細胞上でu
−ＰＡＲに結合したu−ＰＡによるプラスミノーゲン活
性化の類似の測定結果を示す。プラスミノーゲン活性化
のＫmは今回は１.４３μＭであり、溶液中の反応の場合
に比べるとまだかなり低い。しかしながら、kcatもまた
５.６／分から１.２３／分に低下するので、非刺激細胞
と比較した場合、全体的にはプラスミノーゲン活性化(k
cat／Ｋm)は約１０倍低下する結果となる。
【０３５２】 表５ u−ＰＡＲ関与Ｕ９３７の存在下、Ｇlu−プラスミノーゲン活性化の反応速度 定数 Ｋm kcat kcat／Ｋm 溶液中のu −ＰＡ 25μＭ 44／分 1.76／μＭ・分 Ｕ９３７細胞上の 0.67 5.6 8.36 u−ＰＡ−u−ＰＡＲ ＰＭＡ−Ｕ９３７上の 1.43 1.23 0.86 u−ＰＡ−u−ＰＡＲ
【０３５３】u−ＰＡＲのポリクローナル抗体による細
胞表面プラスミノーゲン活性化の阻害 精製したu−ＰＡＲに対して上昇したポリクローナルウ
サギ抗体(実施例１１参照)を用いて、前章で実証された
u−ＰＡの細胞表面プラスミノーゲン活性化活性が、確
かにu−ＰＡＲに結合したu−ＰＡによるものであること
を証明し、またこの抗体が溶液中u−ＰＡＲに対するu−
ＰＡの結合を実際に妨害することをも証明した。
【０３５４】最初に、溶液中のu−ＰＡ活性に及ぼすこ
の抗体の効果を決定した。４回の実験で抗u−ＰＡＲ(１
００μg／ml、３０分)により残存u−ＰＡ活性は９０.１
＋９.３％になり、それに対して同じ動物から採った免
疫前ＩgＧでは８８.６＋１２.３％であった。従って、
抗u−ＰＡＲ抗体はu−ＰＡ活性を特異的に阻害すること
はなかった。
【０３５５】２５μg／mlの濃度で３０分間Ｕ９３７細
胞と前もって恒温培養した場合、抗u−ＰＡＲ抗体は結
果的におこるプラスミノーゲン活性化活性を７６％(３
回の実験の平均、６６％−８２％の範囲)に減少させ
た。免疫前ＩgＧが１％未満しか阻害しないのに対し
て、一方ＤＦＰ−u−ＰＡは９０％阻害した(３回の実験
で７４％−１００％の範囲)。従って、抗u−ＰＡＲポリ
クローナル抗体は細胞表面プラスミノーゲン活性化を効
果的に阻害する。
【０３５６】ｕ−ＰＡＲに対するモノクローナル抗体に
よる外来性ｕ−ＰＡにより開始された細胞表面プラスミ
ノーゲン活性の阻害 ４種のモノクローナル抗体１Ｒ、２Ｒ、３Ｒおよび４Ｒ
のうち、３種は、上記の方法により試験した濃度（５０
μｇ／ｍｌまで）で細胞表面プラスミノーゲンの活性化
の阻害に効果がないことが判明した。これらは、１Ｒ、
２Ｒおよび４Ｒであった。しかしながら、モノクローナ
ル抗体３Ｒは、図２３に示したようにプラスミノーゲン
活性化を強く阻害した。この阻害は約０．０７μｇ／ｍ
ｌの抗体濃度で最強の半分であった。
【０３５７】モノクローナル抗体３Ｒは、また、実施例
１に記載と同様に行った架橋実験により試験したとこ
ろ、Ｕ９３７細胞上ｕ−ＰＡＲに対して１２５Ｉ標識化
ＤＦＰ−処理ｕ−ＰＡの結合を十分に阻害した。抗体１
Ｒ、２Ｒおよび４Ｒは、ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ結合を阻害し
なかった。
【０３５８】マウスＩｇＧに対して市販のＦＩＴＣ−
（フルオレセインイソチオシアネート）標識抗体を用い
て標準フローサイトメトリー法の使用により、２種の抗
体３Ｒおよび４Ｒは、新たに製造したヒト単球上でｕ−
ＰＡＲに十分に結合したことが見出された。３Ｒの結合
は、外来性付加ｕ−ＰＡとのプレインキュベーションに
より完全に阻害され、４Ｒの結合はｕ−ＰＡとのプレイ
ンキュベーションにより影響を受けなかった。
【０３５９】従って、３Ｒ抗体は、その特定細胞受容体
に対するｕ−ＰＡの結合を阻害する。この相互反応は細
胞表面上プラスミン蛋白分解活性の発生に必須のもので
ある。
【０３６０】３Ｒを含むモノクローナル抗体はｕ−ＰＡ
が結合した細胞、即ち細胞をｕ−ＰＡとインキュベート
し、ついでモノクローナル抗体とインキュベートした細
胞による細胞表面プラスミノーゲン活性に対して影響を
及ぼさない。
【０３６１】ｕ−ＰＡＲに対するモノクローナル抗体に
よる外来性プロ−ｕ−ＰＡにより開始した細胞表面プラ
スミノーゲン活性化の阻害 方法 Ｕ９３７ａ細胞の存在下プロ−ｕ−ＰＡおよびプラスミ
ノーゲンの混合物からプラスミノの生成を最初に開示し
た方法（エリス Ｖ等、１９８９年）の修飾法により測
定した。Ｕ９３７ａ細胞を洗浄し、酸処理（ベーレンド
等、１９９０年）して、細胞に結合した外来性ｕ−ＰＡ
の微量を除去してから、３０分間３７℃で２ｍｇ／ｍｌ
脂肪酸無含有ＢＳＡを含むＰＢＳ中種々の濃度のモノク
ローナル抗体とインキュベートし、次いで同じ緩衝液で
１回洗浄した。次いで、細胞を、０．０５Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ７．４、プロ−ｕ−ＰＡ（１．２ｎＭ）を含
む０．１Ｍ ＮａＣｌ、プラスミノーゲン２（０．１４
μＭ）およびプラスミン特異性蛍光ペプチド基質である
０．２ｍＭ Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ７−アミ
ド−４−メチルクマリン中２×１０６セル／ｍｌの最終
濃度でインキュベートした。このインキュベーション
を、３７℃に保温した１０ｍｍプラスチック製蛍光光度
計キュベット中行い、微小磁気撹拌機を備えたパーキン
−エルマーＬＳ−５ルミネセンス分光光度計中静かに撹
拌した。プラスミン生成を蛍光強度における変化率から
測定した（エリス等、１９９０年）。対照実験におい
て、抗−ｕ−ＰＡＲ抗体は５０μｇ／ｍｌまでの抗体濃
度で細胞の不在下プラスミノーゲン活性化に対して影響
を及ぼさないことが判明した。
【０３６２】結果 ｐｒｏ−ｕ−ＰＡ依存プラスミノーゲン活性化は、Ｕ９
３７細胞の存在下非常に増強することが証明されたが、
この効果はｐｒｏ−ｕ−ＰＡおよびプラスミノーゲン両
方の細胞結合を必要とする（エリスら、(１９８９
年)）。図２４は、ｐｒｏ−ｕ−ＰＡおよびプラスミノ
ーゲンを酸洗浄Ｕ９３７ａ細胞とインキュベートした系
におけるこの効果を証明するものであって、プラスミン
生成は細胞の存在下タンパク質の添加時間から直接測定
される。図は、ｕ−ＰＡＲに対して生成する４種の抗体
それぞれとの細胞のプレインキュベーションの効果も示
している。抗体３Ｒが、２μｇ/ｍｌの濃度で、Ｕ９３
７ａ細胞の存在下に観察されたプラスミン産生の増強を
完全に打ち消すことが理解される（図２４Ｃ）。これに
対して抗体１Ｒと２Ｒは、同じ抗体濃度において、プラ
スミノーゲン活性化の細胞上昇について、いかなる効果
も示さなかった。これらの二つの抗体は、また、５０μ
ｇ/ｍｌまでの濃度において、この系におけるプラスミ
ンの発生に有意な効果を示さなかった。抗体４Ｒは、プ
ラスミン発生の上昇に対する部分的阻止と共に、中間的
な効果を示し（図２４Ｄ）、この阻止効果は、より高濃
度（５０μｇ/ｍｌまで、データ示さず）においても約
５０％以上となることはなかった。しかしながら、前の
ように４Ｒとプレインキュベートした細胞を、プラスミ
ノーゲンの添加に先立ってｐｒｏ−ｕ−ＰＡと共に更に
１５分間インキュベートした場合には、プラスミン発生
の上昇に対する４Ｒの阻止効果は打ち消された。同じ条
件下で、抗体３Ｒの効果は不変であった。
【０３６３】実施例６ u−ＰＡＲmＲＮＡ用時ハイブリッド形成およびｕ−ＰＡ
Ｒの免疫染色 用時ハイブリッド形成 材料および方法 材料 下記の材料は表記した供給源から得た:Ｔ７およ
びＴ３ポリメラーゼ、pブルースクリプト(Ｂluescript)
ＫＳ(＋)プラスミドベクター(ストラタジン;ＣＡ、ＵＳ
Ａ);ＲＮアシンおよびＤＮアーゼＩ(プロメガ、ＷＩ、
ＵＳＡ);[３５]Ｓ−ＵＴＰ(１３００Ｃi／mmol)(ＮＥＮ
デュポン、ＭＡ、ＵＳＡ)；ジチオスレイトールおよび
制限エンドヌクレアーゼ(ベーリンガーマンハイム、マ
ンハイム、ＦＲＧ);Ｋ５オートラジオグラフィクエマル
ジョン(イルフォード、チェシャー、英国);ホルムアミ
ド(フルカ、ブッチス、スイス);さけ精子ＤＮＡ(タイプ
III、シグマ、ＭＯ、ＵＳＡ)、他のすべての材料は既述
と同様である(クリステンセンら、１９８４年;クリステ
ンセンら、１９９０年)か、十分入手可能な等級のもの
である。
【０３６４】組織調製 手術後、結腸の腺癌を有する１
３人の患者からの組織標本を切取し、４％または１０％
(重量／容量)ホルマリン−０.９％ＮaＣl溶液中に２４
−４８時間放置した後、パラフィンワックスに固定し
た。
【０３６５】ＲＮＡプローブの調製 完全なひとu−Ｐ
ＡＲcＤＮＡ(実施例３参照)は標準的技術を用いてサブ
クローンし(マニアチスら、１９８２年)、２種のサブク
ローンを調製した:pブルースクリプト中pＨＵＲ０４:Ｐ
stＩ(１８４)−ＰstＩ(４５１)フラグメントおよびpＨ
ＵＲ０６:ＢamＨＩ(４９７)−ＢamＨＩ(１０８１)フラ
グメント、塩基対数は実施例３中に表記した配列に対応
している。精製プラスミド調製物はＣsＣｌ勾配中でバ
ンドとし(banding)プラスミドをＳmaＩ制限エンドヌク
レアーゼ（ｐＨＵＲ０４）またはＳpeＩおよびＥcoＲＩ
(pＨＵＲ０６)を用いて転写のために直線状にした。直
線状プラスミド５μgをフェノールおよびクロロホルム
／イソアミルアルコール(２５:１)を用いて抽出し、エ
タノールで沈澱させ、水に再溶解した。各転写反応は直
線状ＤＮＡ鋳型(１μg)、ＲＮアシン(４０Ｕ)、４０mＭ
トリス−Ｃl、pＨ７.６、６mＭ ＭgＣl２、１０mＭ
ＮaＣl、２mＭスペルミジン、１０mＭ ＤＴＴ、１mＭ
ＧＴＰ、１mＭ ＡＴＰ、１mＭＣＴＰ、４μＭ[３５]
ＳＵＴＰおよび関連（relevant）ポリメラーゼ(Ｔ３ま
たはＴ７、４０Ｕ)を含む。pＨＵＲ０４鋳型はＴ３ポリ
メラーゼを用いて転写し、ＥcoＲＩで直線化されたpＨ
ＵＲ０６鋳型はＴ７ポリメラーゼで転写し、アンチセン
ス転写物を生成する。ＳpeＩによる消化により直線化し
たpＨＵＲ０６鋳型はＴ３ポリメラーゼで転写し、セン
ス転写物を生成する。
【０３６６】１２０分３７℃にて転写後、鋳型ＤＮＡ
を、ＲＮアーゼ無含有ＤＮアーゼ(１Ｕ)、酵母t−ＲＮ
Ａ(２０μg)、ＲＮアシン(２０Ｕ)の添加および３７
℃、１５分間のインキュベーションにより除去した。フ
ェノールおよびクロロホルム／イソアミルアルコール
(２５:１)で抽出後、ＲＮＡをエタノールで沈澱させ、
酢酸アンモニウム(最終濃度２Ｍ)添加後、１５０００×
g、４℃、１０分間遠心分離し、１０mＭ ＤＴＴに再度
溶解した。ＲＮＡを１０mＭ ＤＴＴを含む、pＨ１０.
２の０.１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液中で、平均１００bp
に加水分解した。加水分解時間は前記(コックスら、１
９８４年)と同様に計算した。加水分解後、１０mＭ Ｄ
ＴＴを含む、同量のpＨ６.２の０.２Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液を添加して中性とし、ＲＮＡを上記と同様にエタ
ノールで２度沈澱させた。ＲＮＡプローブを１０mＭ
ＤＴＴに再溶解し、放射活性をシンチレーション計数管
を用いて測定した。プローブ調製物は常に４×１０６cp
m／μl以上を含み、ＴＣＡ沈澱可能物の量は通常約９０
％であった。pＨＵＲ０６プラスミド鋳型の向い合って
いる鎖から転写された２種の対応ＲＮＡプローブを１０
mＭ ＤＴＴの添加により、同じ放射活性濃度に調製
し、脱イオンしたホルムアミドを最終濃度５０％になる
ように添加し、プローブを使用時まで−２０℃にて保存
した。
【０３６７】用時（In situ）ハイブリッド形成 用時
ハイブリッド形成を多数の公知方法(コックスら、１９
８４：アングエール等、１９８７年)から採用した方法
を用いて行った。スライドを０.５％ゼラチン、０.５％
クロムミョウバン中に浸し、室温で乾燥、１８０℃にて
３時間焼成し、ほこりのない状態で室温にて保存した。
パラフィン断片を切断し、スライド上に置き、６０℃に
て３０分間加熱し、キシレン中で脱パラフィンし、等級
化アルコール(graded alcohol)を通して、ＰＢＳ(０.
１４Ｍ ＮaＣlを含む０.０１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液
pＨ７.４)に再水和した。ついでスライドをＰＢＳ中で
２回洗浄し、０.２Ｍ ＨＣl中２０分間酸処理し、ＰＢ
Ｓ中で５分間洗浄した。その後、５０mＭトリス−Ｃl、
pＨ８.０中プロテアーゼＫ５μg／mlプロテアーゼＫお
よび５mＭＥＤＴＡ中で７.５分間インキュベーション
し、ＰＢＳ(２分間)中で２回洗浄し、ＰＢＳ中、４(重
量／容量)％パラホルムアルデヒド中２０分間で固定し
た。固定化剤はＰＢＳ中で洗浄して除き、スライドをビ
ーカー中１００mＭトリエタノールアミンに、マグネチ
ックスターラー上で浸漬した。溶液を攪拌しながら、無
水酢酸を添加し(最終濃度０.２(容／容)％)、添加を５
分後くり返す。最後にスライドをＰＢＳ中で洗浄し(５
分)、等級化アルコール中で脱水し、室温にて風乾し
た。プローブを８０℃にて３分間加熱し、放冷し、ハイ
ブリッド形成混合物に添加した。最終ハイブリッド形成
溶液はＲＮＡプローブ(８０pg／μl)、脱イオンホルム
アミド(５０％)、硫酸デキストラン(１０％)、t−ＲＮ
Ａ(１μg／μl)、フィコル４００(０.０２(重量／容量)
％、ポリビニルピロリドン(０.０２(重量／容量)％、Ｂ
ＳＡフラクションＶ(０.０２(重量／容量)％)、１０mＭ
ＤＴＴ、０.３Ｍ ＮaＣl、０.５mＭ ＥＤＴＡ、１
０mＭトリス−Ｃlおよび１０mＭ ＮaＰＯ４(pＨ６.８)
を含む。ハイブリッド形成溶液をスライドに適用し(セ
クション当り、約２０μl)、アルコール洗浄、高圧滅菌
カバースリップ(cover slip)で覆った。セクションを、
プローブ、硫酸デキストラン、ＤＴＴおよびt−ＲＮＡ
を除き、ハイブリッド形成溶液と同じ混合物(洗浄混合
物)１０mlを用いて湿潤化した室内で、４７℃にて一夜
(１６−１８時間)ハイブリッド形成させた。ハイブリッ
ド形成後、セクション上にところどころ形成された気泡
の位置をマークし、洗浄混合物中で１時間５０℃にてイ
ンキュベーションしてカバースリップを除いた。洗浄混
合物をとり替え、１時間５０℃にて洗浄を継続した。セ
クションを０.５Ｍ ＮaＣl、１mＭ ＥＤＴＡ、１０m
Ｍトリス−Ｃl(pＨ７.２、ＮＴＥ)および１０mＭ ＤＴ
Ｔ中で３７℃にて１５分間洗浄し、ＲＮアーゼ(２０μg
／ml)でＮＴＥ中３７℃にて３０分処理した。ついでＮ
ＴＥ中３７℃にて(２×３０分)洗浄し、１５mＭ塩化ナ
トリウム、１.５mＭくえん酸ナトリウム、pＨ７.０およ
び１mＭ ＤＴＴの２リットル中で室温にて攪拌しなが
ら洗浄した。ついで、セクションを、すべて３００mＭ
酢酸アンモニウムを含む９９％エタノールまでの等級化
アルコール溶液中で脱水し、風乾した。最後に、製造業
者の推せんに従って、オートラジオグラフエマルジョン
を適用し、セクションを乾燥剤入り暗密室箱中で１〜２
週間曝露後現像されるまで４℃にて保存する。
【０３６８】結果 組織を２種の非重複クローンpＨＵＲ０４およびpＨＵＲ
０６からのアンチセンス転写物およびpＨＵＲ０６から
のセンス転写物を用いて分析した。
【０３６９】外観が正常な粘膜の領域はすべての場合に
ハイブリッド形成の徴候がなかった(示さず)。
【０３７０】腫瘍の浸潤性病巣には、pＨＵＲ０６アン
チセンス転写物を用いた時はハイブリッド形成シグナル
が常に見られた。特に顕著なハイブリッド形成シグナル
が細胞上の、明瞭な炎症の徴候と周囲の間葉組織の崩壊
の領域内の破裂腫瘍腺の先端に観察された(図２５a−
b)。腫瘍腺がより組織的な構造を示す浸潤腫瘍の他の領
域では、ハイブリッド形成シグナルが腫瘍細胞の付着糸
状体に密接に結合する細胞上(図２５−d)か、または腫
瘍性乳首自体の漿膜表面に集中した細胞上に見られた
(図２５−c)。セクションから問題となっている細胞型
(類)を確実に同定することも、ハイブリッド形成シグナ
ルを示した新生血管形成領域内の細胞の同定も確定的に
確認すること（図２５−ｅ）はできなかった。さらに腫
瘍の当該領域の拡大写真(４００−１０００Ｘ)による検
討の後、臭化銀結晶を過ヨウ素酸に５分間浸漬して除
き、スライドを再検査した。この方法によって、ハイブ
リッド形成を示す細胞をより詳細に検討することがで
き、現在、この方法で細胞型(類)の最終的評価を行って
いる。
【０３７１】pＨＵＲ０６アンチセンス転写物で得られ
たハイブリッド形成シグナルは、pＨＵＲ０４からのア
ンチセンス転写物を用いて、隣接セクション上に確認さ
れた（示さず）。放射活性プローブの非特異的結合はp
ＨＵＲ０６からのセンス転写物を用いて示し、分析した
すべての腫瘍中に、組織セクション上に不均一に分散し
たシグナルが生じており、非ハイブリッド形成領域(例
えば、正常に見える粘膜)でpＨＵＲ０６アンチセンス転
写物で得られたものと比較すると顕著であった(示さ
ず)。
【０３７２】パラフィン包埋、ホルマリン定着ヒト腫瘍
におけるｕ−ＰＡＲの免疫組織学的検出 抗体：ｕ−ＰＡＲ、クロン２Ｒおよび４Ｅ、精製ＩｇＧ
に対するモノクローナル抗体
【０３７３】組織−セクション：結腸腺癌の３症例およ
び肺鱗状癌の１症例からの常用法のホルマリン定着およ
びパラフィン包埋組織ブロックを使用した。薄いセクシ
ョン（３〜５ミクロン）をミクロトーム上で切断した。
【０３７４】方法：セクションを２×５分間キシレン中
脱パラフィン化し、等級化アルコール浴を通してＴＢＳ
−トリトンに脱水し、室温で１０分間０．１％ＣａＣｌ
２を含む５０ｍＭトリス／ＨＣｌ中０．０１％トリプシ
ン溶液で処理した（免疫化による）。ついで、セクショ
ンを脱イオン水を流して５分間洗浄し、ついで室温で１
５分間５％血清−ＴＢＳ−ＢＳＡ中不活し、最初の抗体
はｍ−抗−ｕ−ＰＡＲクローン２Ｒおよび４Ｒであり、
阻害対照として、ｍ−抗−ＴＮＰであった。インキュベ
ーションをセクションの乾燥を防ぐために湿潤させた箱
中一夜４℃または１時間３７℃で行った。ＴＢＳ−トリ
トン中５×５分間セクションを洗浄後、第２のウサギ−
抗−マウス−抗体を室温で３０分間適用し（ダコパッツ
Ｚ２５９、５％ウサギ血清−ＴＢＳ−ＢＳＡ中１：５
に希釈した）、ついでＴＢＳ−トリトン中５×５分で洗
浄した。ついで、アルカリホスファターゼ複合体マウス
−抗−アリカリホスファターゼを室温で３０分間セクシ
ョンに適用した（ダコパッツＤ６５１、５％ウサギ血清
−ＴＢＳ−ＢＳＡ中１：２０に希釈した）。最後の洗浄
をＴＢＳ−トリトン中５×５分間、ついでＡＰ−緩衝液
中２×５分間行った。色素産生基質ＮＶＴ／ＢＣＩＰで
の染色は既に記述のように室温で暗室中３０分間行った
（クリステンセン問う、１９９０年、ヒストケミストリ
ー、９３巻、５５９〜５６２頁）。セクションをユキッ
ト（Eukitt）でカバーガラスする前にケルネクトロット
(Kernechtrot)で対照染色した。
【０３７５】緩衝液：ＴＢＳ：５０ｍＭ トリス／ＨＣ
ｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７.４ＴＢＳ−トリト
ン：１％トリトンＸ−１００を含むＴＢＳ ＴＢＳ−ＢＳＡ：０.２５％ウシ血清アルブミン ５％ウサギ血清−ＴＢＳ−ＢＳＡ：５％正常ウサギ血清
ＴＢＳ−ＢＳＡ ＡＰ−緩衝液：５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣ
ｌを含む１００ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ９.５
【０３７６】結果 同じ免疫グロブリン濃度で比較するとき、抗体２Ｒは４
Ｒより高い考慮すべき染色強度を示したけれども、抗体
２Ｒおよび４Ｒは４種すべてにおいて同じ組織成分と反
応した。免疫活性物質は、侵襲病巣の腫瘍−基質界面で
好中球中、組織球のサブセット中および細胞中一貫して
発見された。対照として使用したｍ−抗−ＴＮＰ抗体と
インキュベートしたセクションには染色は見られなかっ
た。同じ種からの組織セクションを特異的ｕ−ＰＡＲ
ｍＲＮＡの位置付けのために用時ハイブリダイゼーショ
ンによって前もって試験した（上述、参照）。これら腫
瘍中抗体２Ｒおよび４Ｒで見られるようにｕ−ＰＡＲの
免疫組織学的位置付けは、間質細胞中で発見される、ま
たは肉芽組織中存在する侵襲病巣、組織球細胞および好
中球で陽性細胞に関してｕ−ＰＡＲ ｍＲＮＡ（用時ハ
イブリダイゼーション）の分布と実質的に同じであっ
た。血管中に含まれる好中球が関連するかぎり、ｕ−Ｐ
ＡＲ ｍＲＮＡがこれら細胞中発見され得ることを除い
て、強いｕ−ＰＡＲ免疫反応性が発見され得る。
【０３７７】実施例９ 基質スクリーニング概要 様々な連続工程を含む下記の基質スクリーニング概要
は、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの間の界面を阻害するのに使
用し得、侵襲および転移工程を阻害する薬剤として使用
される基質を決定することを確実にした。最初の基質の
スクリーニングは下記の基質スクリーニングＥＬＩＳＡ
を使用して行い、および基質が阻害効果を示すなら、基
質の次のスクリーニングを概要の次ぎの工程を使用して
行った。
【０３７８】１． ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ界面を阻害し
得る基質のスクリーニングにおける使用のための基質ス
クリーニングＥＬＩＳＡ ２種の抗体サンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイを、溶液
中ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲ間の界面を阻害するためにそれ
らの才能に対してスクリーニング基質 １）９６−ウエルプレート（平底高結合容積、ＮＵＮ
Ｃ） ２）非標識化精製Ｒ４ ３）ビオチン標識化精製抗−ｕ−ＰＡクローン５（ニー
ルセン等、１９８６年） ４）西洋ワサビペルオキシダーゼ複合化（ＨＲＰ）アビ
ジン ５）アフィニティー精製ｕ−ＰＡＲ ６）ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ ７）スラミン（ゲルマニン（商標）、バイエル社製） ８）ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４（ＰＢＳ） ９）ＰＢＳ ＋ ０．１％トゥィーン２０、ｐＨ７．４
（ＰＢＳ／トゥィーン） １０）不活緩衝液：ＰＢＳ中１％スキムミルクパウダー
（ＳＭＰ） １１）クエン酸緩衝液：０．１Ｍクエン酸、ｐＨ５．０ １２）基質溶液：クエン酸緩衝液中１，２−フェニレン
ジアミドジヒドロクロリド（ＯＰＤ）錠、例えば、クエ
ン酸１５ｍｌ中ＯＰＤ３錠。 １３）中止緩衝液：１Ｍ Ｈ２ＳＯ４
【０３７９】製造法 １）０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３中希釈された１００μｌＲ
４（２０μｇ／ｍｌ）でウェルをコートする。 ２）４℃で一夜インキュベートする。 ３）ＰＢＳ／トゥィーン中ウェル５Ｘを洗浄する。 ４）ＲＴで少なくとも１時間ウェル中残存活性部位を１
％ ＳＭＰ／ＰＢＳ、２００μｌ／ウェルで不活する。 ５）工程３）と同様に洗浄する。 ６）ｕ−ＰＡＲ（２０ｎｇ／ｍｌ）の１００μｌを加え
る。 ７）ＲＴで１時間静かに撹拌しつつインキュベートす
る。 ８）工程３）と同様に洗浄する。 ９）ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）１００μｌお
よび不活緩衝液の混合物またはＤＦＰ−ｕ−ＰＡ（１０
ｎｇ／ｍｌ）１００μｌおよびスラミンの連続希釈１０
０μｌの混合物を加える。 １０）工程７）と同様にインキュベートする。 １１）工程３）と同様に洗浄する。 １２）バイオチオニル化抗−ｕ−ＰＡクローン５（２μ
ｇ／ｍｌ）１９９μｌを加える。 １３）工程７）と同様にインキュベートする。 １４）工程３）と同様に洗浄する。 １５）ＳＭＰ／ＰＢＳ／トゥィーン中１：５０００に希
釈されたＨＲＰ−アビジン１００μｌを加える。 １６）工程７）と同様にインキュベートする。 １７）工程３）と同様に洗浄する。 １８）希釈水中１Ｘを洗浄する。 １９）基質溶液１００μｌ／ウェルを加える。 ２０）明黄色になるとき、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４１００μｌ
／ウェルとの反応を中止する。 ２１）４９０ｎｍフィルター、バックグラウンド参照と
して５４０ｎｍフィルターでＥＬＩＳＡリーダーで読み
取る。
【０３８０】２．物質のｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応
阻害能力を試験するための、さらなる架橋試験 上記スクリーニングＥＬＩＳＡで行ったｕ−ＰＡとｕ−
ＰＡＲの間の阻害相互作用を阻害することが見出された
物質の更なる試験が、上記ＥＬＩＳＡで示された阻害が
実際にｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの間の結合阻害によるもの
であることを確証するために行われる。本実施例におい
て、上記ｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲへの結合の化合物スラミ
ンによる上記阻止の性質がｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの間の
結合の真の阻害であることが証明される。
【０３８１】材料 ｕ−ＰＡＲ含有ＨＥｐ−２ラリンクス表皮癌セルライン
（ベーレントら、１９９０）はＡＴＣＣから購入した。
ＨＥｐ−２細胞の澄明化分解物は、１％ＣＨＡＰＳを１
％トリトンＸ−１１４の代わりに使用した以外、上記の
Ｕ９３７に対して記載されたと同様の方法で産生され
た。スラミンは種々の濃度で使用した。
【０３８２】方法 ＨＥｐ−２細胞分解物は４０倍に希釈し、１２５Ｉ−標
識ＡＴＦおよび種々の濃度のスラミン存在下インキュベ
ーションし、続いて化学的架橋およびＳＤＳ−ファージ
およびオートラジオグラフィーによる分析を行った。架
橋と分析は実施例１に記載したように行った。
【０３８３】結果 スラミンはｕ−ＰＡＲおよび１２３Ｉ−標識ＡＴＦの結
合反応を、図２８記載のように、用量依存的に阻害する
ことが見出された。１ｍｇ／ｍｌの濃度のスラミン存在
下では結合活性は検出されず、０．１ｍｇ／ｍｌスラミ
ン存在下では５０％以上の結合阻害が観察された。結合
活性は放射能標識共有結合形成として定義された。した
がって、上記物質スクリーニングＥＬＩＳＡはｕ−ＰＡ
とｕ−ＰＡＲの間の結合を阻害することが出来る物質を
同定するために使用しうるものと結論出来る。
【０３８４】３．培養細胞の細胞表面上のｕ−ＰＡのｕ
−ＰＡＲに対する結合の阻害能についての物質スクリー
ニング
【０３８５】化合物または抗体のｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲ
への結合阻害能は、実施例４に記載の方法を含む工程と
して好適に試験される。この実施例では、ポリクローナ
ル抗体の結合阻害の効果を試験する。図１７より、ポリ
クローナル抗体がｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲへの結合を阻害
することが示される。ポリクローナル抗体を種々の濃度
における試験下で化合物または抗体で、またはモノクロ
ーナル抗体で置き換えることにより、化合物または抗体
によるｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲへの結合阻害能を細胞表面
上で評価することが出来る。
【０３８６】４．種々の型の培養癌細胞におけるプラス
ミノーゲン活性化阻害能についての物質スクリーニン
グ。
【０３８７】種々の癌細胞がｕ−ＰＡＲおよびｕ−ＰＡ
発現について差を有することが知られているので、化合
物または抗体のプラスミノーゲン活性化阻害効果は異な
った型の癌細胞で試験する。効果はｕ−ＰＡＲを発現す
るがｕ−ＰＡを発現しない、それゆえ内因性プロ−ｕ−
ＰＡを所有しない癌細胞およびｕ−ＰＡＲおよびｕ−Ｐ
Ａの両方を発現し、それゆえ内因性プロ−ｕ−ＰＡをも
つ細胞で試験する。スクリーニングの目的にしたがっ
て、異なった源からの癌細胞タイプを検定に使用する。
【０３８８】4a．ｕ−ＰＡＲを発現するがｕ−ＰＡを発
現しない培養癌細胞における活性化阻害能に対する物質
スクリーニング
【０３８９】このスクリーニング検定は、本質的に実施
例７に記載したｕ−ＰＡＲを発現するがｕ−ＰＡを発現
しない癌細胞タイプＭＤＡ−ＭＢ−４３５（プライス・
ジェーら、１９８７）を使用して行う。
【０３９０】図２３から、モノクローナル抗体Ｒ３（Ｒ
１、Ｒ２およびＲ４ではない）が活性化を阻害する能力
のあることがわかる。このモノクローナル抗体を種々の
濃度での試験下、物質で、または他のモノクローナル抗
体に置き換えることにより、活性化の阻止に関する化合
物又は抗体の能力を試験することが出来る。
【０３９１】4b．ｕ−ＰＡＲおよびｐｒｏ−ｕ−ＰＡを
発現する癌細胞培養における活性化阻害能に対する物質
スクリーニング。
【０３９２】このスクリーニング検定は、ｕ−ＰＡＲと
ｕ−ＰＡの両方を発現し、それゆえｕ−ＰＡＲおよびｐ
ｒｏ−ｕ−ＰＡをもっている癌細胞で行うべきであり、
以下にモノクローナル抗体Ｒ３の活性化阻害能を示した
実施例を記載する。
【０３９３】アメリカ合衆国メリーランド州在、ＡＴＣ
Ｃから得たＭＤＡ−ＭＤ−２３１細胞を、２４ウェルの
培養プレートに、５％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ
（フロー・ラボラトリーズ、スコットランド）中濃度
０．２５×１０６細胞／ｍｌで、１００μｇ／ｍｌのモ
ノクローナル抗体Ｒ３の存在または非存在下に種付けし
た。細胞を５日間、すなわちコンフルエンスに達するま
で培地を変えずに培養した。この期間後の細胞の計数
は、細胞の増殖が抗体の存在によって影響されないこと
証明した。
【０３９４】ｕ−ＰＡＲ媒介プラスミン産生のそれぞれ
の測定のため、１２ウェルを２５ｍＭヘペス、ｐＨ７．
４で緩衝化したＤＭＥＭ中で３回、０．２％ＢＳＡ添加
ＰＢＳ中で１回洗浄した。続いて、ウェルを１ウェルあ
たり２００μｌの１５μｇ／ｍｌＧｌｕ−プラスミノー
ゲンおよびＣａ＋＋およびＭｇ＋＋を含むＰＢＳ中の
０．２ｍＭのプラスミン特異性蛍光物質Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ
−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＡＭＣと共にインキュベーションし
た。３分毎に１５０μｌの０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ７．４、０．１ＭＮａＣｌをマイクロ蛍光測定キュ
ベットに入れた。産生プラスミン活性による基質の開裂
による蛍光は、パーキン−エルマーＬＳ５蛍光光度測定
器で、励起および発光波長それぞれ３８０および４８０
ｎｍにおいて測定された。産生プラスミンは３分毎の蛍
光の変化速度を測定し、これを活性部位測定プラスミン
を使用して作成した検量線と比較することにより定量し
た（エリスら、１９８９）。
【０３９５】図２４は、モノクローナル抗体３Ｒ存在下
でＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を培養した場合のプラスミ
ン産生についての効果を示す。抗体３Ｒはプラスミン産
生速度を抗体非存在下に培養された対照細胞のそれの２
０％に減少させる。したがって、３Ｒが内因的に分泌さ
れたｐｒｏ−ｕ−ＰＡのＰＡＲへの結合、それによるプ
ラスミノーゲン活性化の阻害に効果的であることが証明
される。
【０３９６】下記の実施例のモノクローナル抗体を種々
の濃度でスクリーニングされるべき化合物または抗体に
より、または他のモノクローナルまたはポリクローナル
抗体により置き換えることにより、化合物または抗体の
活性化阻害効果を評価することが出来る。
【０３９７】５．ヌードマウスにおけるヒト癌細胞の侵
襲および転移過程の阻害能に対する物質スクリーニン
グ。
【０３９８】ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの間の相互反応を阻
止するための物質スクリーニング計画の上記前工程に示
され、それによって侵襲および転移過程を阻止する医薬
として使用するに有力な物質をスクリーニングする最終
の段階は、イン・ビボで侵襲および転移過程を阻止する
物質の効果を評価するためのものである。ひと癌細胞の
侵襲的かつ転移的方が測定されるマウスモデルがこの効
果を評価するために開発された。
【０３９９】方法 ヌード雌マウス６−８週令ヌ／ヌ−ＭＥＴＡ／Ｂｏｍ
（ボンホルトガード、デンマーク）を下記の形質導入ひ
と癌細胞で接種する。下記の型のひと癌細胞を使用し得
る：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、Ｈ
Ｔ１０８０（アンドレアセンら、１９８６）、Ｕ９３７
およびＭＩＩＩ（クラーク・アールら、１９８９）。
【０４００】レトロウイスルトラスダクション 転移腫瘍を可視化するために、測定に使用されるヒト癌
細胞型をＬａｃＺ遺伝子の形質導入で標識し、Ｘガル染
色によって可視化するようにする。この形質転換は先に
リンら（１９９０）がＬａｃＺ遺伝子で形質転換したラ
ス−形質転換マウス３Ｔ３細胞を使用して行っている
が、本明細書の実施例ではヒト癌セルラインを使用して
いる。ＬａｃＺ遺伝子はβ−ガラクトピラノシドをコー
ドし、その活性は暗青反応を与える発色性基質５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシド（Ｘ−ｇａｌ）で染色して検出し得る。これに
よって又、顕微鏡的転移腫瘍を観察することが出来る。
【０４０１】選択されたヒト癌細胞の形質転換は、下記
のように行い得る。 物質の薬物動力学
【０４０２】スクリーニングされる化合物または抗体の
薬物動力学的特性がマウスにおける有効濃度で当該化合
物や抗体を投与し、かつ保持するために明確化されなけ
ればならない。
【０４０３】スクリーニングされる化合物または抗体の
投与はその化学的性質に依存し、腹腔内注射または皮下
注射、経口投与または局所投与によって行われてよい。
以下に、モノクローナル抗体の薬物動力学的特性を試験
した実施例を示す。 マウスおよび形質転換癌細胞の前処理
【０４０４】形質転換癌細胞を注射する前にマウスをス
クリーニングする化合物または抗体で前処理すること
は、化合物または抗体の充分な濃度を得るために有利で
ある。さらに、マウスに注射する形質転換癌細胞は細胞
と化合物または抗体の間の接触を増加させるために、当
該化合物または抗体を含む溶液内でプレインキュベーシ
ョンされてよい。通常、この前処理を変化させたり、ま
たは除外する若干の実験が化合物または抗体の全体の効
果を明確にし、または推測するために行われるべきであ
る。
【０４０５】癌細胞接種 形質転換癌細胞は皮下または腹腔内のいずれにも接種す
ることが出来る。 腫瘍増殖の測定
【０４０６】腫瘍増殖は試験する化合物または抗体が、
侵襲、転移工程に対する可能的効果に加えて、腫瘍増殖
に影響があるかどうかを明確にするために測定されるべ
きである。増殖は下記のように測定する。
【０４０７】スクリーニング測定の期間 測定の期間は化合物または抗体の性質および侵襲、転移
工程に対する効果についての影響に依存する。
【０４０８】侵襲および転移工程の測定 化合物または抗体の侵襲、転移工程および腫瘍の増殖に
対する効果は、ヒト細胞とマウス細胞の間の染色による
顕著な差を利用して、局所的および／または肺、リンパ
節および腹腔内で評価することが出来る。このような測
定の例は下記の６）に記載する。
【０４０９】侵襲および転移工程の試験物質の阻害の結
果は、ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応がこれらの工程で
重要な役割を担っていると考えられる結腸腺癌、乳管癌
および鱗状皮膚癌のようなヒト癌における抗侵襲、抗転
移薬として良好な候補であることを示す。従って、適当
な毒性学的研究の後、これらは第１相および第２相臨床
試験で試験されるべきである。
【０４１０】６）ｕ−ＰＡに対するモノクローナル抗体
を使用する、マウスにおける侵襲および転移工程の阻
止。
【０４１１】癌細胞の侵襲および転移工程におけるｕ−
ＰＡの酵素的活性の有意性は、下記のように試験した。
その結果とスクリーニング計画の前工程で得られた結果
とを併せて、この方法がｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応
を阻害する物質の抗侵襲および抗転移効果を阻害するの
に価値があることを示す。
【０４１２】材料および方法 細胞系 ヒト乳癌セルラインＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ
−ＭＢ−４３５を１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ中で
常法により増殖させた（Ｄ１０）。ヌードマウス実験用
細胞は酵素を使用する代わりに細胞回収機を用いて回収
した。セルラインを試験し、マイコプラズマ汚染のない
ことを確認した。
【０４１３】マウス ヌード雌マウス６−８週令ヌ／ヌ−ＭＥＴＡ／Ｂｏｍ
（ボンホルトガード、デンマーク）を使用した。マウス
は層状流動クリーンベンチで飼育し、使用したすべての
設備はオートクレーブで処理した。
【０４１４】レトロウィルス形質転換 ＬａｃＺ遺伝子を含むＰＡ３１７細胞（ミラー・エー・
ディーら、１９８６）に包まれたＢＡＧベクター（ＬＴ
Ｒ−ＬＡＣＺ−ＳＶ４０ ＰＲＯＭＯＴＥＲ−ＮＥＯ
（商標）ＬＴＲ含有）（プライス・ジェーら、１９８
７）のウィルスストックを細胞の形質転換に使用した。
ネオマイシン耐性遺伝子を形質転換細胞の選択のために
使用した。ヒト癌細胞を感染の１日前に１：１０分割率
でプレート上においた。細胞を感染させるために、培養
培地を４μｇ／ｍｌのポリプロピレン含有５ｍｌのウィ
ルス上清液で置き換え、５％ＣＯ２インキュベーター
中、２時間３７℃インキュベーションした。５ｍｌのＤ
１０を添加し、このように形質転換したヒト癌細胞をイ
ンキュベーターに戻した。培地を次の日に新鮮なＤ１０
で置換した。得られた形質転換セルラインはＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５ ＢＡＧと名付
けた。
【０４１５】選択方法 ＢＧＡベクター含有細胞を増殖させるため、感染細胞集
団を５００μｇ／ｍｌＧ４１８含有培地で増殖させた。
しかしながら、選択細胞は上記のようにＸ−ｇａｌ染色
によって測定した場合、必ずしもすべてがβ−ガラクト
シダーゼを発現しなかった。したがって、細胞はフルオ
レッセイン−ジ−β−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）−
ＦＡＣＳ選択をノーランら（１９８８）が記載したよう
に実施した。この方法では、ｌａｃＺ遺伝子産物である
β−ガラクトシダーゼを発現する細胞による非蛍光基質
からの蛍光の遊離はフローサイトメトリーにおける細胞
の分離を可能にする。コンフルエントな１００ｍｍ皿を
トリプシン処理し、単一細胞懸濁液をＤ１０中１−５×
１０７細胞／ｍｌに調節した。１００μｌの細胞懸濁液
をファルコン２０５８試験管中で３７℃でインキュベー
ションした。基質ＦＤＧの細胞による取り込みは、ｄＨ
２Ｏ中の２ｍＭ ＦＤＧ１００μｌを添加することによ
る低張刺激により行った。３７℃での１分のインキュベ
ーションの後、基質を氷冷１．８ｍｌＤ１０を添加する
ことにより細胞内にトラップした。細胞を氷の上で１時
間インキュベーションし、４８８ｎｍ波長に合わせたベ
クトン・ディッキンソン２層レーザーＦＡＣＳｔａｒプ
ラスフローサイトメーターで分類した。
【０４１６】細胞接種 総数２×１０６腫瘍細胞をそれぞれの横腹の皮下に接種
した。腫瘍細胞は常に胸壁の下に位置した。細胞接種の
１日前、５００μｇの抗体をマウスに注射し、２１日後
に５００μｇを注射した。マウスは接種後６週間で屠殺
した。
【０４１７】抗体 ｕ−ＰＡ抗体クローン５（ニールセンら、１９８６）を
酵素活性阻害に使用し、無関係な対照抗体として大麦蛋
白に対するＩｇＧ１マウスモノクローナル抗体を使用し
た。
【０４１８】形質転換ヒト乳癌細胞系の実験 形質転換細胞はノーザン・ブロッティングでｕ−ＰＡお
よびｕ−ＰＡＲをコードするｍＲＮＡの存在に対して実
験した。
【０４１９】全ＲＮＡはＭＤＡ−ＭＢ−２３１ ＢＡＧ
キセノグラフトから前記のように抽出した（チーグウィ
ンら、１９７９）。２５μｇのＲＮＡを２．２Ｍホルム
アルデヒド含有１．２％アガロースゲルを使用する電気
泳動によりサイズ分画した。ＲＮＡをニトロセルロース
フィルターにブロットし、３２Ｐ−標識ｃＤＮＡプロー
ブで５８℃でにおいて８時間標準ハイブリダイゼーショ
ン緩衝液でハイブリダイズした（チョムチンスキーら、
１９８７）。ｕ−ＰＡのｃＤＮＡはｐＨＵＫ８を含有し
（ランドら、１９８７）、ｕ−ＰＡＲのｃＤＮＡはｐ−
ｕ−ＰＡＲ−１を含有した（ローランドら、１９９
０）。ハイブリダイゼーションに続き、フィルターを、
全１時間、６５℃で０．１×ＳＳＣを３回変えて洗浄し
た。オートラジオグラフィーはクロネックス・クアンタ
・III増強スクリーンで行った。
【０４２０】培養物中の細胞のＸ−ｇａｌ染色 培養物中の細胞をガラススライドにおき、２日間増殖さ
せてからＰＢＳ中５分間の０．５％（容量／容量）グル
タールアルデヒド処理で固定し、ＰＢＳでの３回の洗浄
に続き、３７℃でＸ−ｇａｌ染色溶液（ＰＢＳ中１ｍｇ
Ｘ−ｇａｌ／ｍｌ；３５ｍＭ フェリシアン化カリウ
ム；２ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で一晩インキュベートし
た。この断片はケネクトロットにより逆染色した。
【０４２１】腫瘍増殖 腫瘍増殖は２元的に１週間に３回測定し、腫瘍面積を測
定した。形質転換ゴンペルツ機能（リガード・ケーおよ
びスパン−トームセン・エム、１９８９）を使用し、個
々の腫瘍の増殖速度（形質転換コンペルツ増殖曲線の傾
き）を計算した。局所侵襲の測定
【０４２２】細胞接種後６週間、すべての動物を頸部脱
きゅうにより屠殺した。細胞接種部位の初期腹腔腫瘍を
皮膚に向かって腹腔方向から摘出し、これによって腫瘍
の片側に腹腔筋肉壁を、他の片側に皮膚を残した。それ
ぞれの腫瘍は、腫瘍の最も長い直径に対する垂直切開に
より２つの部位に分けた。他の切開は腫瘍の境界地核で
行った。組織学的切片は切開の部位により作られる。局
所侵襲は腹腔筋肉繊維の間に位置する腫瘍細胞として定
義される。皮膚への侵襲処理は行われなかった。腫瘍細
胞が筋肉繊維に接近して位置しているが、筋肉を分割で
していない場合、侵襲を除外するため、更に切片を作っ
た。
【０４２３】転移の測定 肝臓、横隔膜、脾臓、膵臓、腸および肺の剖見を、それ
ぞれの動物で行った。器官を１×ＰＢＳで処理し、４％
パラホルムアルデヒドおよび０．５％グルタールアルデ
ヒド中、３時間固定した。器官を次に１×ＰＢＳで３回
処理し、Ｘ−ｇａｌ溶液（ＰＢＳ中１ｍｇ Ｘ−ｇａｌ
／ｍｌ；３５ｍＭ フェリシアン化カリウム；２ｍＭ
ＭｇＣｌ２）で４℃で一夜染色した。次の日、器官を１
×ＰＢＳで処理し、ナトリウムアジド中に保存し、ライ
ッツＭＰＳ５２カメラをつけた回転ステレオマイクロス
コープで測定した。ヒト腫瘍細胞の転移の存在を確認す
るため、種々の組織の青い部分を４％ホルマリンで固定
し、常套の組織学的方法で処理した。器官に１個または
それ以上の青い部分が存在するとき、それを転移部位に
陽性であると記録した。
【０４２４】凍結セクション 器官を４℃、２時間０．１ＭＰＢＳ ｐＨ＝４中２％パ
ラホルムアルデヒドに固定し、次に０．１ＭＰＢＳで処
理し、０．１ＭＰＢＳ中、７％シュクロースで２時間、
１５％シュクロースで更に２時間脱水し、寒冷断片作成
処理に付した。寒冷断片を次に細胞系に使用される方法
にしたがってＸ−ｇａｌ染色した。
【０４２５】架橋測定 ｕ−ＰＡＲを発現し続けるこの形質転換を確立するため
に、ｕ−ＰＡＲの存在を上記２）に記載した方法にした
がって、交差結合試験を行った。ｕ−ＰＡＲに結合する
リガンドとして１２５Ｉ−ＡＴＦを使用した。
【０４２６】細胞表面プラスミノーゲン活性化の抗−ｕ
−ＰＡ抗体による阻害 ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のプラスミノーゲン活性化能
力は先に記載した懸濁液−増殖細胞用の方法（エリス
ら、１９９０）を修正した方法により、測定した。簡単
には、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を２４ウェルコスター
トレイ中でコンフルエントに増殖させた。当該トレイは
血清を含まないＤＭＥＭ（フロー・ラボラトリーズ、ス
コットランド）中、プラスミン阻害剤アプロチニン（１
０μｇ／ｍｌ）（バイヤー、ドイツ）存在下に維持され
た。測定の前に、細胞を３回ｉＨＥＰＥＳ−緩衝化ＤＭ
ＥＭで洗浄し、続いて１５分間室温で１０μｇ／ｍｌの
ｕ−ＰＡに対するモノクローナル抗体の存在下および非
存在下インキュベーションした（クローン５）。２回の
洗浄後、細胞は０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（インキュベ
ーション毎に１２ウェルそれぞれに２００μｌ）中、プ
ラスミノーゲン（２０ｕｇ／ｍｌ）と特異的蛍光性プラ
スミン特異性基質Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａ
ＭＣ（０．２ｍＭ）と共に、３７℃でインキュベーショ
ンした。時間的間隔をおいて１５０μｌの細胞懸濁上澄
液を除去し、１５０μｌ０．０５ＭトリスｐＨ７．４、
０．１ＭＮａＣｌで希釈し、蛍光強度をパーキン−エル
マーＬＳ−５蛍光スペクトロメーター中、ミクロクキュ
ベットを使用し、励起および発光波長それぞれ３８０お
よび４８０ｎｍで測定した。プラスミン濃度は各時間的
インターバルをおいて基質の加水分解を計算し（ｄＦ／
ｄｔ）、活性部位力価既知プラスミン（エリスら、１９
９０年）を使用した検量線と比較して決定した。
【０４２７】抗ｕ−ＰＡ−抗体の薬物動力学 それぞれ５匹のヌードマウスからなる７つの群に単一用
量のμｇ抗−ｕ−ＰＡ−抗体クローン５を腹腔内に投与
した。注射後０、１、２、４、８、１６および３２日
後、一群５匹のマウスを採血し、血清を保存した。さら
に、腫瘍担持動物を使用した実験において、血清はすべ
ての抗ｕ−ＰＡ−抗体−処理動物から抗体投与後１４日
に得た。ヌンク・イムノプレート（平底マキシソーブ、
ヌンク・エー／エス、デンマーク）を一晩４℃で０．１
Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ９．８中の１μｇ／ｍｌのｕ−
ＰＡ（ＵＫＩＤＡＮ Ｌｅｏ）で被覆した。過剰のｕ−
ＰＡを洗浄して除き、付加的蛋白結合部位をＰＢＳ中の
１％脱脂粉とともに１時間インキュベートした。洗浄
後、プレートをマウス血清または試験すべきサンプル
中、抗ｕ−ＰＡ抗体クローン５の標準希釈液と共に、３
７℃で１時間インキュベートした。プレートを再び洗浄
し、次にビオチン化ウサギ抗マウスＩｇＧ（ＤａＫｏ）
と共に更に１時間インキュベートした。さらに洗浄後、
プレートをパーオキシダーゼ結合アビジン（ＤａＫｏ）
と共に１時間インキュベートし、パーオキシダーゼ反応
をＯＰＤ−錠剤と過酸化水素を使用し、０．１Ｍクエン
酸−リン酸緩衝液、ｐＨ５．０中で進行させた。反応を
１００μｌ １ＭＨ２ＳＯ４の添加によって停止させ、
吸光度を４９０ｎｍで読み取った。すべてのサンプルに
ついて２回行った。
【０４２８】結果 ＬａｃＺ形質転換および細胞の選択 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞
は、ＢＡＧベクターに感染し、ＬａｃＺ遺伝子を図３０
に示された細胞のようにもたない限り、Ｘ−ｇａｌで染
色されない。低いウィスル価（−５×１０４ｃｆｕ／ｍ
ｌ）のため、各セルラインの約１％のみがＸ−ｇａｌで
陽性に染色されることが最初に見出された。Ｇ４１８選
択に続いて、約６０−７０％のＧ４１８−耐性細胞がＸ
−ｇａｌ染色に基づいてＬａｃＺ遺伝子を発現した。Ｌ
ａｃＺ−発現細胞を増殖させるため、両方の乳癌セルラ
インをＦＤＡ−ＦＡＣＳ選択に付した。ＬａｃＺ形質転
換の安定性を測定するために、形質転換以後２０継代目
の細胞をＸ−ｇａｌで染色した。図３０Ｂに示されるよ
うに、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ ＢＡＧ細胞はＬａｃＺ発
現細胞の相対数において、わずかな損失を示すのみであ
った。同様の結果がＭＤＢ−ＭＢ−２３１細胞でも得ら
れた（データは示していない）。
【０４２９】形質転換ヒト乳癌セルラインの実験の結果 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＢＡＧ腫瘍は、多くのｕ−ＰＡお
よびｕ−ＰＡＲに対するｍＲＮＡを発現し、１２５Ｉ
ＡＴＦは細胞分解物の界面活性剤相にｕ−ＰＡＲの存在
を明らかに証明した。
【０４３０】非形質転換および形質転換腫瘍細胞の比較 ヒト腫瘍細胞をＬａｃＺ遺伝子で形質転換する目的は、
ヌードマウス中に拡散させた後、細胞を位置付けること
ができるからである。形質転換セルラインのいずれも初
期の皮下腫瘍は高度のＸ−ｇａｌ染色特異性を表すが、
一方非形質転換細胞由来の腫瘍は青く染まらなかった。
これは図３０のＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−２３１ＢＡＧ腫瘍に対して示される（それぞＣおよ
びＤ）。同一の結果がＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤ
Ａ−ＭＢ−４３５ＢＡＧの染色に続いて見られた。
【０４３１】イン・ビボにおけるヒト腫瘍細胞の検出 両方のＢＡＧラインをヌードマウス中で連続的に継代
し、少なくとも３つ継代後、ＬａｃＺ発現を保持した。
初期の腫瘍の寒冷断片においてＸ−ｇａｌ染色は、ＢＡ
Ｇ形質転換ヒト癌細胞に制限された（図３１）。
【０４３２】非形質転換および形質転換腫瘍の両方とも
動物の腹腔壁の浸透と共に局所的侵襲が行われた（示し
ていない）。いずれの腫瘍ラインでも形質転換皮下腫瘍
を担持したマウスからの肝臓、脾臓、膵臓、腸および肺
のＸ染色は、腹腔内に位置する器官内の二次的腫瘍形成
の青い染色を示した（図３１（ＢおよびＤ））。二次腫
瘍は種々の腹腔内器官において局所的侵襲を示した（図
３１（ＥおよびＦ））。
【０４３３】肺の青い染色部位の組織学的検討は微小転
移の存在を確認した（図３１(Ｇ)）。未感染腫瘍細胞を
接種したマウスまたは腫瘍転移のない器官におけるＸ−
ｇａｌ染色は、陽性ではなかった。
【０４３４】抗ｕ−ＰＡ抗体を使用するマウスにおける
侵襲および転移の阻止 抗ｕ−ＰＡ抗体を注射しなかったマウス内のＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−２３１ＢＡＧ腫瘍は、マウスの腹腔筋肉層に侵襲し
て成長した。癌細胞は筋肉繊維の中に広がり、しばしば
腫瘍細胞は筋肉の腹腔側に位置し得る。非関連抗体は表
６から明らかなように、局所的腫瘍侵襲に効果を有しな
かった。対照的に、抗ｕ−ＰＡ抗体は腫瘍細胞の局所的
広がりを阻害した。表６に示されるように、８匹のマウ
スのうち５匹は腹腔内器官に癌細胞の転移的広がりがあ
った。最も一般的には、腫瘍細胞は肝臓と膵臓の門管に
見いだされた。非関連抗体は腹腔内への転移的形成に効
果を有しなかった。抗ｕ−ＰＡ抗体による注射は、表６
に示されるように腫瘍細胞の腹腔内器官への広がりを有
意に阻害した。抗ｕ−ＰＡ抗体の注射により、肺に青斑
点のある動物の数もまた有意に減少した。青斑点の部分
に癌細胞が存在することを確認するために、幾つかの斑
点を切除し、組織学的慣用法により処理した。
【０４３５】 表６ 局所的侵襲 腹腔内の広がり 肺転移 対照 １２／１６ ５／８ ８／８ 大麦抗体 １７／２０ ５／１０ ９／１０ 抗ｕ−ＰＡ抗体 ６／１６ ０／８ １／８
【０４３６】抗ｕ−ＰＡ抗体の腫瘍細胞増殖への効果 抗ｕ−ＰＡ抗体の腫瘍細胞増殖への効果の実験におい
て、抗ｕ−ＰＡ抗体および非関連抗体のどちらも腫瘍増
殖の有意な変化の原因とはならないことが示された（示
していない）。
【０４３７】薬物動力学 １００μｇの抗ｕ−ＰＡ抗体の単独腹腔内注射は抗体の
血清濃度を約２５ｎｇ／ｍｌにした。血清濃度は評価Ｔ
１／２約２１日で僅かに低下するのみである。
【０４３８】文献 アンドレアセンＰＡ、ニールセンＬＳ、クリステンセン
Ｐ、グレンダール−ハンセンＪ、スクリバーＬ、ダネＫ
（１９８６年）ヒト線維肉腫細胞からのプラスミノーゲ
ンアクチベーターインヒビターは、ウロキナーゼ型プラ
スミノーゲンアクチベーターを結合するが、そのプロ酵
素とき結合しない。ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー２６１：７６４４−７６５１ アンドレアセンＰＡ等、エンドクリノロジー（１９９０
年）１２６：２５６７−２５７６ アンゲールＬＭ、ストーラＭＨ、アンゲールＲＣ（１９
８７年）注釈き調理法。もとの場所のハイブリダイゼー
ション。神経生理学への応用。オックスフォード・ユニ
バーシティ・プレス、オックスフォー、pp.７１−９６ アペラＥ、ロビンソンＥＡ、ウルリッチＳＪ、ストペリ
ーＭＰ、コルティＡ、カッサーニＧ、ブラーシＦ（１９
８７年）ウロキナーゼのレセプター結合配列。プロテア
ーゼの成長因子モジュールのための生物学的作用。ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２６２：
４４３７−４４４０ アペラＥ、ウェヴールＩＴ、ブラーシＦ（１９８８年）
蛋白中の表皮性成長因子様部分の構造と作用。ＦＥＢＳ
レタース２３１：１−４ バイパイＡ、ベーカーＪＢ（１９８５年）ヒト前皮膚線
維芽細胞上の陰性ウロキナーゼ結合部位。バイオケミカ
ル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ
ーションズ１３３：４７５−４８２ バイパイＡ、バカールＪＢ（１９８５ａ年）バイオケミ
カル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニ
ケーションズ１３３：９９４−１０００ バカールＪＢ、ロウＤＡ、スィマールＲＬ、キュニンガ
ムＤＤ（１９８０年）セル２１：３７−４５ バルクホルトＶ、ジェンセンＡＬ（１９８９年）アミノ
酸分析：付加物としてのジスルフィド化合物との塩酸加
水分解後、蛋白中のシステインプラス半システインの検
定 アナリティカル・バイオケミストリー１７７：３１８−
３２２ バルナザンＥＳ、シネＤＢ、バロネＫ、クオＡ、ラルセ
ンＧＲ（１９８８年）ヒト肉皮細胞に対するリコンビナ
ント型及び変異ｔ−ＰＡの特異結合。フィブリノリスィ
ス２、補遺１：２８ ビーベＤＰ（１９８７年）ヒトへそ静脈付肉皮細胞への
組織プラスミノーゲン活性因子の結合。ソロンボスィス
・リサーチ４６：２４１−２５４ ベルＧＩ、フォンＮＭ、ステンピアンＭＭ、ウルムステ
ドＭＡ、カプュＤ、クＬ、ウーダＭＳ、ラルＳＢ、サン
チェ−ペスカドールＬ（１９８６年）（ヒト表皮性成長
因子プレカーサー：ＣＤＮＡ配列、インヒドロ発現及び
遺伝子体制）ヌクレック・アシド・リサーチ１４：８４
２７−８４４６ ブラーシＦ（１９８８年）フィブリノリスィス２：７３
−８４ ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター用表面レ
セプター ブラーシＦ、ストペリーＭＰ、キュベリＭＶ（１９８６
年）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター用レ
セプター。ジャーナル・オブ・セル・バイオロジカル３
２：１７９−１８６ ブラーシＦ、ヴァサリーＪ−ＤＰ、ダネＫ（１９８７
年）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子：プロ
酵素、レセプター及びインヒビター。ジャーナル・オブ
・セル・バイオロジカル１０４：８０１−８０４ ボルディアＣ（１９８１年）トリトン×−１１４溶液中
完全膜蛋白の相分離。ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー２５６：１６０４−１６０７ ボイドＤ、フロレントＧ、キムＰ、ブラテインＭ（１９
８８ａ年）ウロキナーゼのレベルの検定及びヒト直腸癌
細胞系のそのレセプター。キャンサー・リサーチ４８：
３１１２−３１１６ ボイドＤ、フロレントＧ、ムラノＧ、ブラテインＭ（１
９８８ｂ年）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドによるヒト
直腸細胞系中のウロキナーゼレセプターの変調。 バイオロジカル・アンド・バイオフィジカル・アクタ９
４７：９６−１００ デ・ブラインＰＡＦ、クレイマ−ボウボウスＧ、ウェル
スパゲＨＷ、ヴェルイエンＪＨ、ドウイイエールＧ、エ
タルマンＩＴ、ラマールＣＢＨＷ（１９８８年）ソロン
ボスィス・アンド・ハエモスタスィス６０：２；２６２
−２６６ ブリッジＫ（１９８６年）正常及び形質転換線維芽細
胞：病巣接触での細胞骨格膜及び外細胞マトリックス成
分の体制及び調節 キャンサー・リサーチ４：１８−７８ ブルティンＰ、フォンダネチェＭ−Ｃ（１９８８年）ヒ
ト癌細胞上プラスミンへのレセプター。ジャーナル・オ
ブ・ナショナル・キャンセル・インスティテュート８
０：７６２−７６５ カーペンターＧ、コエンＳ（１９７６年）ジャーナル・
オブ・セル・バイオロジカル７１：１５９−１７１ チャーグインＪＭ等（１９７９年）バイオケミストリー
２４：５２９４−５２９９ コムゾンスキーＰ、サクチ、Ｎ（１９８７年）酸公配チ
オシアナート−フェノール−クロロホルム抽出によるＲ
ＮＡ分離の単一段階方法。アナリティカル・バイオケミ
ストリー１６２：１５６−１５９ クラークＲ等（１９８９年）ＰＮＡＳ８６：３６４９−
３６５３ コレンＤ、ザマロンＣ、リヨネンＨＲ、ホイルアルツＭ
（１９８６年）プロウロキナーゼによるプラスミノーゲ
ンの活性化。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー２６１：１２５９−１２６６ コルサロＣＭ、ペアザンＭＬ（１９８１年）哺乳動物細
胞中ＤＮＡ−仲介遺伝子転移の効率の増強。ソマティッ
ク・セル・アンド・モルキュラー・ジェネティックス
７：６０３−６１６ コクスＫＨ、ディリオンＤＶ、アンゲールＲＣ（１９８
４年）不斉ＲＮＡプローブを用いるそれ自体のハイブリ
ダイゼーションによるシー・ウルチン・エンブイオス中
のｍＲＮＡｓの検免。ディベロプメント・バイオロジカ
ル１０１：４８５−５０２ キュベリＭＶ、ノリＭＬ、カサニＧ、ブラーシＦ（１９
８６年）ヒトのウロキナーゼレセプターへの単一プロウ
ロキナーゼの結合。ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー２６１：１５８１９−１５８２２ キュベリＭＶ、アンドレアセンＰＡ、ラグノＰ、メイエ
ルＭ、ダネＫ、ブラーシＦ（１９８９年）プロスィーデ
ング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
スィズＵＳＡ８６：４８２８−４８３０ ダネＫ、アンドレアセンＰＡ、グレンダール−ハンセン
Ｊ、クリステンセンＰ、ニールセンＬＳ、スクリバーＬ
（１９８５年）プラスミノーゲン活性化因子、組織遅化
及び癌 アドバンスドゥ・キャンサー・リサーチ４４：１３９−
２６６ ダネＫ、ニールセンＬＳ、ピケＣおよびキラルマンＧＭ
（１９８８年）プラスミノーゲン活性化因子及び新形
成。フィジオロジカル・アンド・クリニカル・アスペク
トＣ、クルフト編、ＣＲＣ出版、ボカ・レイトン１９８
８年pp.１９−４６ダネＫ等（１９９０年）モレキュラ
ー・バイオロジー・オブ・ザ・カーディオバスキュラー
・システム１３２巻１７３−１８６ デ・デューブＣ、デュ・バルスィＴ、ポーレＢ、トュル
ーエＡ、トュルケンズＰ、ヴァン・オーフＦ（１９７４
年）バイオロジカル・ファーマコロジー２３：２４９５
−２５３１ イートンＤＬ、スコットＲＷ、ベーカーＪＢ（１９８４
年）ヒト線維芽細胞ウロキナーゼプロ酵素の精製及びプ
ロテアーゼ及びプロテアーゼネキシンによるその調節。
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２５
９：６２４１−６２４７ イリスＶ、スカーリーＭＦ、カキャールＶＶ（１９８７
年）機能分離中単鎖ウロキナーゼによるプラスミノーゲ
ン活性化。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー２６２：１４９９８−１５００３ イリスＶ、スカーリーＭＦ、カキャールＶＶ（１９８８
年） 調節単鎖ウロキナーゼ初発プラスミノーゲン活性化にお
けるヒトＵ９３７単核球の役割。フィブリノリスィス
２：サプルメント１、１１２ イリスＶ、スカーリーＭＦ、カキャールＶＶ（１９８９
年）単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に
より開始したプラスミノーゲン活性化。ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー２６４：２１８５−
８８ イリスＶ、ツェ−チェイン・ウン、ベーレントＮ、レネ
Ｅ、ダネＫ（１９９０年）プラスミノーゲン活性化因子
阻害剤によるレセプター結合ウロキナーゼの阻害ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２６５、９
９０４−９９０８エストリシャールＡ、ウールエンド
Ａ、ベリンＤ、スクリーニングＷ−Ｄ、ヴァサリＪ−Ｄ
（１９８９年）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化
因子に適した細胞結合の特徴づけ。ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー２６４：１１８０−１１
８９ ファグソンおよびウイリアムズ（１９８８年）グリコシ
ル−ホスファチジルイノシトル構造を経る蛋白の細胞表
面沈降。アニューアル・レヴュー・バイオケミカル５
７：２８５−３２０ ゲントンＣ、クリュイトフＥＫＯ、スクリーニングＷ−
Ｄ（１９８７年）ジャーナル・オブ・セル・バイオロジ
カル１０４：７０５−７１２ グレンダール−ハンセンＪ、アゲーリンＮ、ムンクホル
ム−ラーセンＰ、バチＦ、ニールセンＬＳ、ドンベルノ
スキーＰ、ダネＫ（１９８８年）ウロキナーゼ型プラス
ミノーゲン活性化因子に適した、感受性で特異的酵素結
合免疫吸着剤検定及び胸癌を伴う患者からの血奬への応
用。ジャーナル・オブ・ラボラトリー・アンド・クリニ
カル・メディシン１１１：４２−５１ グレンダール−ハンセンＪ、ランドＬＲ、ラルフキア
Ｅ、オッテヴァンゲルＶ、ダネＫ、（１９８８年）イン
ビボで傷いた再上皮形成の間、ケラチノサイト中のウロ
キナーゼ及び組織型プラスミノーゲン活性化因子。ザ・
ジャーナル・オブ・インベスティガティブ・ダマトロジ
ー９０：７９０−７９５ グアウィッチＶ、パネルＲ、ルイＳ、ケリーＰ、サディ
チＲＬ、グリーンリーＲ（１９８４年） ウロキナーゼ（プロウロキナーゼ）のチモーゲンレセプ
ターによる有効かつフィブリン特異的血餅溶解。インビ
トロ及び２動物種での研究。ジャーナル・オブ・クリニ
カル・インベスティガティブ７３：１７３１−１７３９ ヘイグラーＨＴ、マックスフィールドＦＲ、ウィリンガ
ムＭＣ、パスタンＩ（１９８０年）ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー２５５：１２３９−１２
４１ アジャールＫＡ、アーペルＰＣ、ジャフェＥＡ、ナチマ
ンＲＬ（１９８６年）プラスミノーゲンの培養ヒト内皮
細胞への結合。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー２６１：１１６５６−１１６６２ アジャールＫＡ、ナチマンＲＬ（１９８８年）培養ヒト
内皮細胞上の線維溶解系の組み立て。フィブリノリスィ
ス２、補遺１：１１８ ハシモトＦ、ホリゴメＴ、カンバヤシＭ、ヨシダＫ、ス
ガノＨ（１９８３年）ナトリウムドデシルスルファート
ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動による低分子量ポ
リペプチドの分離改良法。アナリティカル・バイオケミ
ストリー１２９：１９２−１９９ アーリンＶＪ、ロウＬＷ、コルティＡ、アペラＥ、ブラ
ーシＦ（１９８８年）ネズミメラノーマ細胞の細胞表面
ウロキナーゼによる転移可能性の変調。キャンサー・リ
サーチ４８：１２７０−１２７８ エベールＣＡ、ベーカーＪＢ（１９８８年）細胞外プラ
スミノーゲン活性化因子の線維芽細胞骨格への結合、ビ
ングリンによる細胞表面ウロキナーゼのコロカリゼーシ
ョン。ジャーナル・オブ・セル・バイオロジカル１０
６：１２４１−１２４７ ユークショーベンＪ、デルニックＲ（１９８８年）ファ
スト系発展単位における着色染色用改良銀染色方法。フ
ァスト・システム・ディベロプメント・ユナイテッド・
エレクトロフォレスィス９：２８−３２ ホップＴＰ、ウッズＫＲ（１９８１年）アミノ酸配列か
らの蛋白抗原決定基のプロディクション。プロスィーデ
ング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
スィズＵＳＡ７８：３８２４−３８２８ ホイルアーツＭ、リーケンＤＣ、リーネンＨＲ、コレン
Ｄ（１９８２年）ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子
によるプラスミノーゲンの活性化の運動性。フィブリン
の役割。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー２５７：２９１２−２９１９ ジョニクＦ、スクミットＭ、アフテルＡ、オールリーダ
ーＡ、バビクＲ、ウルムＫ、ゲスナーＷ、グラフＨ（１
９９０年）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子
（Ｕ−ＰＡ）抗原は胸癌の卑い再発の予言諸である。フ
ィブリノリスィス１−１０ ジョニクＦ、スクミットＭ、ウルムＫ、ゲスナーＷ、グ
ラフＨ（１９８９年）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン
活性化因子及び胸癌での早い再発：ザ・ランセット、１
０４９ カサイＳ、アリムラＨ、ニシムラＭ、スヤマＴ（１９８
５年）単一プロウロキナーゼの蛋白分解切断は、チモー
ゲン及びフィブリンに対するその高親和性の減少の活性
化が起こる形態的変化を含む。ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー２６０：１２３７７−１２３
８１ キールバーグＶ、アンドレアセンＰＡ、グレンダール−
ハンセンＪ、ニールセンＬＳ、スクリバーＬ、ダネＫ
（１９８５年）マウス・インビボのウロキナーゼ型プラ
スミノーゲン活性化因子に対するプロ酵素。ＦＥＢＳレ
タース１８２：４４１−４４５ クリステンセンＰ、ラーソンＬ−Ｉ、ニールセンＬＳ、
グレンダール−ハンセンＪ、アンドレアセンＰＡ、ダネ
Ｋ（１９８４年）ヒト内皮細胞はプラスミノーゲン活性
化因子の一タイプを含む。ＦＥＢＳレタース１６８：３
３−３７ クリステンセンＰ、ピケＣ、ランドＬＲ、アンドレアセ
ンＰＡ、ダネＬ（１９９０年）ルイス肺癌におけるプラ
スミノーゲン活性化因子インヒビター型１。ルイス・ラ
ング・カルシノマ・ヒストケミストリー コザクＭ（１９８７年）６６９脊椎動物メッセンジャー
ＲＮＡからの５'−非コーディング配列の分析。ＲＮＡ
ｓ．ヌクリア・アクタ・リサーチ１５：８１２５−８１
３２クーペルＪ、オッタールＭ、リーケンＤＣ、ヴァン
・バーケルＴＪＣ（１９８８年）ラット腎細胞との組織
型プラスミノーゲン活性化因子のインビボ相互反応。フ
ィブリノリスィス２、補遺１：２８ キテＪ、ドリッテルＲＦ（１９８２年）蛋白の水治療法
特性を展示する簡単な方法。ジャーナル・オブ・モルキ
ュラー・バイオロジー１５７：１０５−１３２ ラミリＵＫ（１９７０年）バクテリオファージＴ４のヘ
ッドの組み立ての間、構造蛋白の切断。ネイチャー２２
７：６８０−６８５ リーネンＨＲ、ザマロンＣ、ブラベルＭ、ウィンクラー
ＭＥ、コレンＤ（１９８６）プロウロキナーゼＩ、メク
ニズムによるプラスミノーゲンの活性化。ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー２６１：１２５３
−１２５８ リンＷ−Ｃ、プレトロ−IIＴＰ、カルプＬＡ（１９９
０）腫瘍進行中の微小転移生成検出の高感度マーカーと
しての細菌ＬａｃＺ遺伝子、カンサー・リサーチ５０：
２８０８−２８１７ リオッタＬＡ(１９８６年)腫瘍侵入及び転移−細胞外マ
トリックスの役割：ロード・メモリアル・アワード・レ
クチャー。キャンサー・リサーチ４６：１−７ ロウＭＧ（１９８９年）膜蛋白のグリコシル−ホスファ
チジルイノシトール沈降。バイオケミカル・バイオフィ
ジカル・アクタ９８８：４２７−４５４ ランドＬＲ、リチオＡ、アンドレアセンＰＡ、ニールセ
ンＬＳ、クリステンセンＰ、レイホーＭ、サクセラＯ、
ブラーシＦ、ダネＫ（１９８７年）形質転換成長因子−
Ｂは、ＷＩ−３８ヒト肺線維芽細胞中、タイプ−１プラ
スミノーゲン活性化因子インヒビターのレベルの強く固
い作用の陽性調整物である。ＷＩ−３８ヒューマン・ラ
ング・フィブロブラストＥＭＢＯ Ｊ６：１２８１−１
２８６ ランドＬＲ、ジョージＢ、ニールセンＬＳ、メイエル
Ｍ、ダネＫ、アンドレアセンＰ（１９８８年）モルキュ
ラー・セル・エンドクリノール６０：４３−５３ マニアティス等（１９８２年）モルキュラー・クローニ
ング：ラボラトリー・マニュアル・コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー マンＫＧ、ジェニーＲＧ、クリシュナトウェミＳ（１９
８８年）組み立てにおけるコフアクター蛋白及び血液凝
固酵素コンプレックスの発現。アニューアル・レヴュー
・バイオケミカル５７：９１５−９５６ マツダイラＰ（１９８７年）ポリビニリデンジフルオリ
ド膜上に電気泳動した蛋白のピコモル量からの配列。ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２６
２：１００３５−１００３８ マツオＯ、タナカＳ、キクチＨ（１９８８）骨関節炎へ
の尿トリプシンインヒビターの効果。トロンボスィス・
リサーチ５２：２３７−２４５ メイエルＭ、ランドＬＲ、リチオＡ、スクーヴＪ、ニー
ルセンＬＳ、スタッシーＳＮ、ダネＫ、アンドレアセン
ＰＡ（１９８８年）プラスミノーゲン活性化因子インヒ
ビター型１蛋白、ｍＲＮＡ及び遺伝子転写は、ヒト横紋
筋肉腫細胞において、ホルボールエルテル類により増加
する。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー２６３：１５６８８−１５６９３ ミグナッティＰ、ロビンズＥ、リフキンＤＢ（１９８６
年）ヒト羊水膜を経る腫瘍侵入：プロティナーゼカスケ
ードの要求。セル４７：４８７−４９８ マイルズＬＡ、ダウルバーグＣＭ、プロウＥＦ（１９８
８年）プラスミノーゲンの細胞結合ドメイン及び血漿中
のそれらの機能。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー２６３：１１９２８−１１９３４ マイルズＬＡ、ギンズバーグＭＨ、ホワイトＪＧ、プロ
ウＥＦ（１９８６年）２つの明白なメカニズムによるヒ
ト血小板とのプラスミノーゲン相互反応。ジャーナル・
オブ・クリニカル・インベスティガティブ７７：２００
１−２００９ マイルズＬＡ、プロウＥＦ（１９８５年）血小板表面で
のプラスミノーゲンの結合及び活性化ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー２６０：４３０３−４
３１１ マイルズＬＡ、プロウＥＦ（１９８６年）特異的抗体プ
ローブで定義されたのと同じ、プラスミノーゲンの高親
和リジン結合部位の地形図。バイオケミストリー２５：
６９２６−６９３３ マイルズＬＡ、プロウＥＦ（１９８７年）末梢血液細胞
に対する線維素溶解成分、プラスミノーゲン及びウロキ
ナーゼのレセプター仲介結合。ソロンボ・ハエモスタ５
８：９３６−９４２ ミラーＡＤ、バティモアＣ（１９８６年）ヘルパーウイ
ルス生成をもたらす組かえを回避するためのレトロウイ
ルスパッケージ細胞再デザイン、モレキュラー・アンド
・バイオロジー６巻２８９５−２９０２ モリスィＪＨ、ファルライＨ、エドギントンＴＳ（１９
８７年）組織因子、凝固プロティナーゼカスケードの開
始のための細胞レセプター用ｃＤＮＡの分子クローニン
グ。セル５０：１２９−１３５ ミューラー−エバーハードＨＪ（１９８８年）補体系の
分子体系及び機能。アニューアル・レヴュー・バイオケ
ミカル５７：３２１−３４７ ニーダムＧＫ、シャーベＧＶ、ファーンドンＪＲ、ハリ
スＡＬ（１９８７年）ヒト胸癌膜上特異的レセプター部
位でのウロキナーゼの結合。ヨーロピアン・ジャーナル
・オブ・キャンセル５５：１３−１６ ネルズＬ、リーネンＨＲ、コレンＤ、ホルムズＷＥ（１
９８７年）リジンの部位特異的変異誘発により生じた組
換型ヒト−本鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化
因子変異体の特徴づけ。ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー２６２：５６８２−５６８９ ニールセンＬＳ、ハンセンＪＧ、スクライバーＬ、ウィ
ルソンＥＬ、カルトフトＫ、ズーサンＪ、ダネＫ（１９
８２年）モノクローナル抗体によるアフニティクロマト
グラフィによるヒトグリア芽腫細胞からのプラスミノー
ゲン活性化因子に対するチモーゲンの精製。バイオケミ
ストリー２４：６４１０−６４１５ ニールセンＬＳ、ケレアマンＧＭ、ベーレントＮ、ピコ
ーネＲ、ダネＫ、ブラーシＦ（１９８８年）ウロキナー
ゼ型プラスミノーゲン活性化因子に適した55,000-60,00
0Ｍｒレセプター蛋白。ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー２６３：２３５８−２３６３ ニールセンＬＳ、アンドレアセンＰＡ、グレンダール−
ハンセンＪ、ファンＪ−Ｙ、クリステンセンＰ、ダネＫ
（１９８６年）ソロンボ・ハエモスト５５：２０６−２
１２ ノランＧＰ、フィーリングＳ、ニコラＪ−Ｆ、ヘルツェ
ンベルクＬＡ（１９８８年）エシエリキア・コリＬａｃ
Ｚ導入後のＢ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性に基づく生存
ほ乳類細胞の蛍光賦活細胞分析および検索、プロシーデ
ィングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・ユーエスエイ８５：２６０３−２６０７ ノリＭＬ、サルビＥ、コルティＡ、ロビアーティＦ、ソ
フィエンティーニＡ、ブラーシＦ、パレンティＦ、カッ
サーニＧ（１９８９年）マウス細胞からのヒト組換型−
本鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の製造
及び特徴づけ。フィブリノリスィス３：１０１−１０６ オカヤマＨ、バーグＰ（１９８３年）哺乳動物細胞中に
ｃＤＮＡ挿入の発現を詳すｃＤＮＡクローニングベクタ
ー。モルキュラー・アンド・セル・バイオロジー３：２
８０−２８９ オッソウスキーＬ（１９８８年）ニワトリ胚中ヒト腫瘍
細胞の播種におけるプラスミノーゲン活性化因子依存通
路。セル５２：３２１−３２８ オッソウスキーＬ、リーヒＥ（１９８３年）プラスミノ
ーゲン活性化因子阻害ヒト腫瘍転移に対する抗体。セル
３５：６１１−６１９ パネルＲ、グレビヒＶ（１９８７年）１本鎖ウロキナー
ゼが低触媒活性（プロウロキナーゼ）を有する１本鎖ウ
ロキナーゼによる、又は２本鎖ウロキナーゼによるプラ
スミノーゲンの活性化。ブロッド６９：２２−２６ ペテルセンＬＣ、ルンＬＲ、ニールセンＬＳ、ダネＫ、
スクリーバーＬ（１９８８年）ヒト肉腫細胞からの１本
鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子は、少し
の又は全く内因性活性のないプロ酵素である。ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２６３：１１
１８９−１１１９５ ピコーネＲ、カンタニアックＥＬ、ニールセンＬＳ、ベ
ーレントＮ、マストロニコラＭＲ、クベリスＭＶ、スト
ッペリＭＰ、ペーダーセンＳ、ダネＫ、ブラーシＦ（１
９８９年）ホルボールエステルＰＭＡによる単核球様Ｕ
９３７細胞中のウロキナーゼレセプターの調節。ジャー
ナル・オブ・セル・バイオロジー１０８：６９３−７０
２ プローグＭ、ジェンセンＡＬ、バークホルトＶ（１９８
９年）トリシン−ナトリウムドデシルサルフェート−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動からのＰＶＤＦ膜上に電
気ブロットしたペプチドのアミノ酸成分及びＮＨ２未端
配列の決定。アニューアル・バイオケミカル１８１：３
３−３９ プロウＥＦ、フレアネＤＥ、プレシアＪ、マイルズＬＡ
（１９８６年）プラスミノーゲン系及び細胞表面：同じ
細胞型上プラスミノーゲン及びウロキナーゼレセプター
に対する証拠。ジャーナル・オブ・バイオロジー１０
３：２４１１−２４２０ ポラネンＪ、ハズマンＫ、ニールセンＬＳ、ダネＫ、ヴ
ァエリＡ（１９８８年）病巣接触での血漿膜結合ウロキ
ナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の超構造局在。ジ
ャーナル・オブ・バイオロジー１０６：８７−９５ ポラネンＪ、サクセラＥ−Ｍ、アンドレアセンＰ、ニー
ルセンＬＳ、ダネＫ、ヴァエリＡ（１９８７年）ウロキ
ナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の明白な局在と培
養ヒト線維芽細胞及び肉腫細胞下のそのタイプ−１イン
ヒビター。ジャーナル・オブ・バイオロジー１０４：１
０８５−１０９６ ポンテＰ、グニンＰ、ブラウＨ、ケデスＬ（１９８３
年）ヒトアクチン遺伝子は、α−心臓アクチンに対する
単一コピーであるが、β−及びα−細胞骨格遺伝子に対
するマルチコピーである：３'−非翻訳部分は同位元素
特異的であるが進化において変換する。モルキュラー・
アンド・セル・バイオロジー３：１７８３−１７９１ ポツァッティＲ、マセルＲ、ウイリアムズＳＪ、パドマ
ナバンＲ、ハワードＢ、リオッタＬ、コウリーＧ（１９
８６年）１又は２オンコジンにより形質転換した一次ラ
ット胎児は異なる転移潜在性を示す。 プライスＪ、ターナーＤ、セプコＣ（１９８７年）レト
ロウイルス仲介遺伝子伝達による脊椎動物系における系
統分析、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ８４：
１５６−１６０ ライヒＲ、トンプソンＥ、イワモトＹ、マーティンＧ
Ｒ、ディーソンＪＲ、フラーＧＣ、ミスキンＲ（１９８
８年）プラスミノーゲン活性化因子、セリンプロテナー
ゼ及びコラゲナーゼルの阻害は、転移細胞による基部膜
の侵入を防ぐ。 ロルダンＡＬ、クベリスＭＶ、マスツィＭＴ、ベーレン
ト、ルンドＬＲ、ダネＫ、アペラＥ、ブラシＦ（１９９
０年）ヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子の
レセプター、細胞表面の中心分子のクローニングと発
現、プラスミン依存蛋白溶解、ジＥＭＢＯジャーナル
９；４６７−４７４ ラッセルＤＷ、シュナイダーＷＪ、ヤマモトＴ、ラスキ
ーＫＬ、ブラウンＭＳ、ゴルト−シュタインＪＬ（１９
８４年）ＬＤＬレセプターのドメインマップ：表皮性成
長因子プレカーサーによる配列類似点。セル３７：５７
７−５８５ サクセラＯ（１９８５年）細胞周囲蛋白分解のプラスミ
ノーゲン活性化と調節。バイオケミカル・アンド・バイ
オフィジカル・アクタ８２３：３５−６５ サロネンＥ−Ｍ、サクセラＯ、ヴァルティオＴ、ヴァエ
リＡ、ニールセンＬＳ、ツォイテンＪ（１９８５年）プ
ラスミノーゲン及び組織型プラスミノーゲン活性化因子
は固定化フィブロネクチンに結合する。ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー２６０：１２３０２
−１２３０７ サロネンＥ−Ｍ、ツィッティングＡ、ヴァエリＡ（１９
８４年）ラミニンはプラスミノーゲン及びその組織型活
性化因子と相互作用する。ＦＥＢＳレタース１７２：２
９−３２ シェガーＨ、フォン・ヤゴーＧ（１９８７年）１−１０
０ｋＤａの範囲の蛋白の分離のためのトリシン−ナトリ
ウムトデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動。アナリティカル・バイオケミストリー１６６：
３６８−３７９ セルヴァライＰ、ロッセＷ、シルバーＲ、スプリンガー
ＴＡ（１９８８年）血液中の主なＦｃレセプターはホス
ファチジルイノシトール沈降を有し、発作用夜間ヘモグ
ロビン尿症に欠損である。ネイチャー３３３：５６５−
５６７ シルバーシュテインＲＬ、ロイングＬＬＫ、ハーペルＰ
Ｃ、ナハマンＰ（１９８４年）プラスミノーゲンとの血
小板トロンボスポンジンのコンプレックス形成。組織活
性化因子による活性化の変調。ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・インベスティガティブ７４：１６２５−１６３
３ スクリーバーＬ、ラーションＬ−Ｉ、キールベリＶ、ニ
ールセンＬＳ、アンドレアセンＰＢ、クリステンセン
Ｐ、ダネＫ（１９８４年）ルイス肺癌中のウロキナーゼ
型プラスミノーゲン活性化因子の免疫細胞化学局在。ジ
ャーナル・オブ・セル・バイオロジー９９：７５３−７
５８ スクリーバーＬ、ニールセンＬＳ、ステフェンＲ、ダネ
Ｋ（１９８２年）肉腫ウイルスにより形質転換したネズ
ミ細胞から不活性プロ酵素として放出されたプラスミノ
ーゲン活性化因子。ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー１２４：４０９−４１４ ステフェンズＲＷ、アリタロＲ、タピオヴァーラＨ、ヴ
ァエリＡ（１９８８年）白血病細胞系による活性ウロキ
ナーゼの製造：固体腫瘍の細胞系からの新規識別。リュ
ケミア・リサーチ１２：４１９−４２２ ステフェンズＲＷ、フォルダムＣＪ、ドウＷＦ（１９８
７年）ヒト直腸癌中のウロキナーゼ型プラスミノーゲン
活性化因子に対するプロ酵素：蛋白分解活性化後、単核
球ミナクチビンによるインビトロ阻害。ヨーロピアン・
ジャーナル・オブ・キャンセル・クリニカル・オンコロ
ジー２３：２１３−２２２ ステフェンズＲＷ、ロイングＫ−Ｃ、ポラネンＪ、サロ
ネンＥ−Ｍ、ヴァエリＡ（１９８７年）プラスミノーゲ
ン活性化因子及びそれらの特異的インヒビターのミクロ
フレート免疫捕獲（immocapture）検定。ジャーナル・
オブ・イムノロジカル・メソッド１０５：２４５−２５
１ ステファンス等（１９８９年）ジャーナル・オブ・セル
ラー・バイオロジー１０８：１９８７−１９９５ ストッペリＭＰ、コルティＡ、ソフィエンティーニＡ、
カッサーニＦ、アソイアンＲＫ（１９８５年）Ｕ９３７
単核球上特異的レセプターへのヒトウロキナーゼプラス
ミノーゲン活性化因子のアミノ末端断片の分別増強結
合。プロスィーディング・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンスィズＵＳＡ８２：４９３９−４９
４３ ストッペリＭＰ、タチェティＣ、クベリスＭＶ、コルテ
ィＡ、ヘアリングＶＪ、カッサーニＧ、アッペラＥ、ブ
ラーシＦ（１９８６年）ヒトＡ４３１細胞上プロウロキ
ナーゼレセプターのオートクリン飽和。 セル４５：６７５−６８４ スタンプＤＣ、レイネンＨＲ、コレンＤ（１９８６ａ
年）ヒト細胞培養からの単鎖ウロキナーゼ型プラスミノ
ーゲン活性化因子の精製及び特徴づけ。ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー２６１：１２７４−
１２７８ スタンプＤＣ、ティアンポンＭ、コレンＤ（１９８６ｂ
年）ヒト尿のウロキナーゼ関連蛋白。ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー２６１：１２６７−１
２７３ タレンティーノＡＬ、ゴメスＣＬ、プラマーＴＨ（１９
８５年）ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼによるアスパラ
ギン結合グリカンの脱グリコシン化。Ｆ・バイオケミス
トリー２４：４６６５−４６７１ トーセンＳ、グラス−グリーンヴァルトＰ、アストロッ
プＴ（１９７２年）ウロキナーゼ及びプラスミノーゲン
活性化因子のフィブリンへの結合における相違。ソロン
ボス・ディアス・ハエモロフ２８：６５−７４ トリュグヴァソンＫ、ホイヒテャＭ、サロＴ（１９８７
年）腫瘍侵入における細胞外マトリックスの蛋白分解退
化。バイオロジカル・アンド・バイオフィジカル・アク
タ９０７：１９１−２１７ ウラノＴ、デ・セラノＶＳ、ジャフニーＰＪ、カステリ
ーノＦＪ（１９８８年）ヒト単鎖ウロキナーゼによるヒ
ト（Ｇlu'）プラスミノーゲンの活性化。アーチブ・オ
ブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス
２６４：２２２−２３０ ヴァサリＪ−Ｄ、ハミルトンＪ、レイチＥ（１９７７
年）マクロファージプラスミノーゲン活性化因子：コン
カナバリンＡ及びホルボールミリステートアセテートに
よる誘導。セル１１：６９５−７０５ ヴァサリＪ−Ｄ、バッチーノＤ、ベリンＤ（１９８５
年）ヒトプラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼの
Ｍｒ55,000形にに対する細胞結合部位。ジャーナル・オ
ブ・セル・バイオロジー１００：８６−９２ ヴァサリＪ−Ｄ、ダイエールＪ−Ｍ、ウールエンドＡ、
ベリンＤ（１９８４年）培養ヒト単核球マクロファージ
によるプロウロキナーゼの及びプラスミノーゲン活性化
因子の隨伴分泌。ジャーナル・オブ・イクスペリメンタ
ル・メディシン１５９：１６５２−１６６８ ウンＴ−Ｃ、オソウスキーＬ、レイチＥ（１９８２年）
ヒトウロキナーゼのプロ酵素形。ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー１５７：７２６２−７２６
８ ウンＴ−Ｃ、レイチＥ（１９８７年）ヒト胎盤からのプ
ラスミノーゲン活性化のインヒビター。ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー２６２：３６４６−
３６５３ ヤーデンＹ、ウルリッチＡ（１９８８年）成長因子によ
る単一トランスダクションの分子分析。バイオケミスト
リー２７：３１１３−３１１９
【０４３９】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 アフィニテイ精製u−ＰＡＲのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ及び特異的リガンドへの化学架橋。
【図２】 精製u−ＰＡＲの酵素脱グリコシル。
【図３】 架橋１２５Ｉ−ＡＴＦの脱グリコシル:ＰＭ
Ａ−処理及び非処理u９３７細胞からのu−ＰＡＲコンプ
レックス。
【図４】 化学的交差結合によるリガンド結合u−ＰＡ
Ｒ断片の検出
【図５】 u−ＰＡＲ断片の電気泳動分解。
【図６】 u−ＰＡＲとそのリガンド結合断片の界面活
性剤相分離。
【図７】 リガンド結合断片のデグリコシレーション。
【図８】 u−ＰＡＲの内部アミノ酸配列の繰返しとこ
れら繰返しのＴ細胞活性化タンパク／Ｌy−６抗原およ
びイカタンパクＳgp−２の細胞外ドメインとの相同性。
【図９】 酸加水分解後u−ＰＡＲ−ＰＡＲから放れた
アミノ酸の陽イオン変換クロマトグラフィからの溶出プ
ロフィルを示す。
【図１０】 バシルス・セレウスからのホスファチジル
イノシトール−特異性ホスホリラーゼＣ(ＰＩ−ＰＬＣ)
による付着ＰＭＡ−刺激u９３７細胞からの １２５Ｉ−
標識化ＤＦＰ処理u−ＰＡの遊離を示す。
【図１１】 コンプレックス形成及び１２５Ｉ−標識化
ＤＦＰ処理u−ＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子分析
及びＰＩ−ＰＬＣによる培地に放出されたu−ＰＡＲを
示す。
【図１２】 ＰＩ−ＰＬＣで処理による精製u−ＰＡＲ
の疎水性性質の変化を示す。
【図１３】 ＧＰＩ−膜沈降の間プロセシング部位が既
知である蛋白からのＣＯＯＨ末端アミノ酸配列のu−Ｐ
ＡＲに関し予言されたものに対する(アミノ酸分析を基
礎として、表５)比較を示す。
【図１４】 １２５Ｉ標識化精製u−ＰＡＲの放射免疫
沈降。
【図１５】 方法のところで記載したと同じ逆固相ラジ
オイムノアッセイ。
【図１６】 ＥＬＩＳＡ。
【図１７】 精製u−ＰＡＲに対して作った抗体による
細胞性ＡＴＦ結合の阻害。
【図１８】 u−ＰＡＲに対するポリクローナルウサギ
抗体の反応性を証明するウエスタンブロットを示す。
【図１９】 ４つのモノクローナル抗体による１２５Ｉ
−標識u−ＰＡＲ(Ｉ)及びu−ＰＡＲ(Ｄ)の免疫沈澱。
【図２０】 u−ＰＡＲに対して高められた４つのモノ
クローナル抗体の反応性を示すウエスターンブロット。
【図２１】 精製u−ＰＡＲの定量化を示す２つの抗体
サンドウィッチＥＬＩＳＡ。
【図２２】 ｕ９３７細胞上のｕに結合したｐによるプ
ラスミノーゲン活性化の動力学を示す。
【図２３】 酸洗９３７細胞を種々の濃度のモノクロー
ナル抗体３Ｒと培養し、細胞にｐを結合させたときの残
留ｐ触媒細胞表面プラスミノーゲン活性化。
【図２４】 酸洗９３７a細胞をモノクローナル抗体１
(パネルＡ)、２Ｒ(パネルＢ)、３Ｒ(パネルＣ)および４
Ｒ(パネルＤ)の各々２μg／mlの存在又は不存在下３０
分間前培養し、ｐｒｏ−ｐ、プラスミノーゲン２及び蛍
光性プラスミン基質Ｈ−Ｄ−Ｖal−Ｌeu−Ｌys−７−ア
ミド−４−メチルクマリンと培養した。
【図２５】 ｃＤＮＡサブクローンpＨＵＲ０６から生
じたアンチセンスＲＮＡを用いるヒト結腸腺癌のパラフ
ィン部分へのハイブリダイゼーションを示す。
【図２６】 結腸腺癌の一例のモノクローナル抗ｕ−Ｐ
ＡＲ抗体クローンＲ２による免疫染色（Ａ）。
【図２７】 ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの間の結合阻止につ
いての化合物スラミンの効果は、２種の抗体サンドイッ
チＥＬＩＳＡとして構成され、実施例９に説明されてい
るように実施された物質スクリーニングＥＬＩＳＡで試
験された。
【図２８】 １２５Ｉ標識ＡＴＦとｕ−ＰＡＲの間の交
差結合の化合物スラミンによる阻止をスラミンの存在ま
たは不存在下、ＨＥｐ−２細胞分解物中の１ ２５Ｉ標識
ＡＴＦのｕ−ＰＡＲへの化学交差結合の測定により決定
したものを示す。
【図２９】 内因的に産生されたｐｒｏ−ｕ−ＰＡのＰ
ＡＲに対する結合について、モノクローナル抗体３Ｒの
存在下における培養ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の効果を
示すものであって、これはエリスら（１９８９年）に記
載されたメカニズムによってプラスミノーゲン活性化を
伝達する結合ｐｒｏ−ｕ−ＰＡの活性によって決定され
た。
【図３０】 イン・ビトロおよびイン・ビボで成長した
腫瘍細胞のＸ−ガル染色。
【図３１】 図３１Ａ：一次元ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｂ
ＡＧ腫瘍の冷凍断片。３Ｂ−Ｄ：二次元ＭＤＡ−ＭＢ−
４３５ＢＡＧ腫瘍の巨視的外観。３Ｅ−Ｇ：ＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−４３５ＢＡＧ腫瘍細胞のマウス肺への転移性拡が
り。３Ｈ：ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＢＡＧ腫瘍細胞で皮下
的に接種されたマウスからの腹水のＸ−ガル染色。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/06 Ａ６１Ｐ 17/06 ４Ｈ０４５ 19/02 19/02 27/02 27/02 35/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/16 Ｃ１２Ｑ 1/16 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 595003015 Ｃａｎｃｅｒｆｏｒｓｋｎｉｎｇｓｆｏｎ ｄｅｎ ａｆ 1989（Ｆｏｎｄｅｎ ｔｉ ｌ ｆｒｅｍｍｅ ａｆ ｅｋｓｐｅｒｉ ｍｅｎｔｅｌ ｃａｎｃｅｒｆｏｒｓｋｎ ｉｎｇ) (72)発明者 ケル・ダネー デンマーク国デー・コー−2920 シャーロ ッテンルン、エル・イー・ブルーンス・ヴ ァイ 20番 (72)発明者 エベ・レネ デンマーク国デー・コー−2300 コペンハ ーゲン・エス、クアランズヴァイ 18番、 フェアスト・チル・ヴェンストレ (72)発明者 ニルス・ベーレント デンマーク国デー・コー−2880 バウスヴ ェアズ、ランゲモーセヴァイ 17番 (72)発明者 ヴィンセント・エリス デンマーク国デー・コー−1051 コペンハ ーゲン・コー、ニューハウン 18番 (72)発明者 グニラ・ヘイア−ハンセン デンマーク国デー・コー−2820 ゲントフ テ、トフテケアスヴァイ 67番 (72)発明者 チャールズ・パイク デンマーク国デー・コー−2860 セボー、 カール・メラース・アレー 18番、フェア スト・チル・ヘイア (72)発明者 ニルス・ブリュンナー デンマーク国デー・コー−2830 ヴィルー ム、ベンヴェズヴェンゲット ９番 Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA40 CB01 FB03 FB07 FB08 4B024 AA01 AA11 BA61 CA02 DA03 EA02 GA11 HA13 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ08 QQ20 QR16 QR48 QR51 QR67 QR77 QS28 QX01 QX02 QX07 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 DA13 4C085 AA14 BB11 CC23 DD63 EE01 GG10 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 DA76 DA86 EA20 EA50 FA74 GA26

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ｕ−ＰＡＲ分子のＣ末端部を含んでお
    り、そして、完全ｕ−ＰＡＲ分子の第８８位アミノ酸残
    基で始まるｕ−ＰＡＲ分子の部分に結合する、モノ特異
    性モノクローナル抗体から成る、ｕ−ＰＡＲの検定試
    薬。
  2. 【請求項２】 次のいずれかの定量のための、請求項１
    記載の検定試薬： （１）ｕ−ＰＡと複合している、複合していないにかか
    わりなくｕ−ＰＡＲを定量する； （２）ｕ−ＰＡＲとｕ−ＰＡの複合体を定量する； （３）ｕ−ＰＡと複合していないｕ−ＰＡＲ（遊離ｕ−
    ＰＡＲ）を定量する；および、 （４）ｕ−ＰＡＲのグリコシル化変種を定量する。
  3. 【請求項３】 検定を血液、血清、血漿、尿、組織片ま
    たは癌もしくはその疑いのある組織の抽出物から選択さ
    れた試料について行う、請求項１または２記載の検定試
    薬。
  4. 【請求項４】 予後評価または診断のために使用する、
    請求項１〜３のいずれか記載の検定試薬。
  5. 【請求項５】 試料中のｕ−ＰＡＲの存在を検出または
    定量するためのＥＬＩＳＡ検定で使用する、請求項１〜
    ４のいずれか記載の検定試薬。
  6. 【請求項６】 組織片中のｕ−ＰＡＲに結合することが
    出来、従ってｕ−ＰＡＲの免疫組織化学的検出に有用で
    ある、モノ特異性モノクローナル抗体であって、当該抗
    体はブダペスト条約に従ってユーロピアン・コレクショ
    ン・オブ・アニマル・セル・カルチャーに寄託された寄
    託番号９０１０１００８のハイブリドーマ・セルライン
    によって産生される抗体２Ｒまたは寄託番号９０１０１
    ０１０のハイブリドーマ・セルラインによって産生され
    る抗体４Ｒに機能的に均等であるもの。
  7. 【請求項７】 捕捉または検出抗体としてＥＬＩＳＡで
    使用するに適した、ｕ−ＰＡＲに有効に結合することが
    出来るモノ特異性モノクローナル抗体であって、当該抗
    体はブダペスト条約に従ってユーロピアン・コレクショ
    ン・オブ・アニマル・セル・カルチャーに寄託された寄
    託番号９０１０１００８のハイブリドーマ・セルライン
    によって産生される抗体２Ｒまたは寄託番号９０１０１
    ０１０のハイブリドーマ・セルラインによって産生され
    る抗体４Ｒに機能的に均等であるもの。
  8. 【請求項８】 ｕ−ＰＡＲの特定のグリコシル化変種に
    選択的に結合することが出来るモノ特異性モノクローナ
    ル抗体であって、当該抗体はブダペスト条約に従ってユ
    ーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カ
    ルチャーに寄託された寄託番号９０１０１０１０のハイ
    ブリドーマ・セルラインによって産生される抗体４Ｒに
    機能的に均等であるもの。
  9. 【請求項９】 遊離のｕ−ＰＡＲおよびｕ−ＰＡとｕ−
    ＰＡＲの間の複合体のいずれにも反応することが出来る
    モノ特異性モノクローナル抗体であって、当該抗体はブ
    ダペスト条約に従ってユーロピアン・コレクション・オ
    ブ・アニマル・セル・カルチャーに寄託された寄託番号
    ９０１０１０１０のハイブリドーマ・セルラインによっ
    て産生される抗体４Ｒに機能的に均等であるもの。
  10. 【請求項１０】 ｕ−ＰＡＲ分子のＣ末端部を含んでお
    り、そして、完全ｕ−ＰＡＲ分子の第８８位アミノ酸残
    基で始まるｕ−ＰＡＲ分子の部分に結合する、モノ特異
    性モノクローナル抗体であって、当該抗体はブダペスト
    条約に従ってユーロピアン・コレクション・オブ・アニ
    マル・セル・カルチャーに寄託された寄託番号９０１０
    １００７のハイブリドーマ・セルラインによって産生さ
    れる抗体１Ｒ、寄託番号９０１０１００８のハイブリド
    ーマ・セルラインによって産生される抗体２Ｒまたは寄
    託番号９０１０１０１０のハイブリドーマ・セルライン
    によって産生される抗体４Ｒに機能的に均等であるも
    の。
  11. 【請求項１１】 ｕ−ＰＡＲとの反応によるｐｒｏ−ｕ
    −ＰＡまたは活性ｕ−ＰＡの結合の阻止と細胞表面プラ
    スミノーゲン活性化の阻止を行う、モノクローナル抗体
    を含むことを特徴とする、哺乳類におけるｕ−ＰＡのレ
    セプタ結合形のｕ−ＰＡＲに対する結合を阻止し、それ
    によってプラスミノーゲンのプラスミンへの活性化を阻
    止することに基づく、哺乳類（ひとを含む）における蛋
    白分解作用を阻止または妨害するための医薬組成物。
  12. 【請求項１２】 モノクローナル抗体がひとモノクロー
    ナル抗体である、請求項１１記載の医薬組成物。
  13. 【請求項１３】 抗体がＦａｂフラグメントである、請
    求項１１または１２記載の医薬組成物。
  14. 【請求項１４】 阻止または妨害された蛋白分解作用が
    癌に関連するものである、請求項１１〜１３のいずれか
    記載の医薬組成物。
  15. 【請求項１５】 慢性関節リュウマチ、潰瘍性大腸炎ま
    たは乾癬症のような組織破壊を伴う非悪性疾病の処置に
    使用する、請求項１１〜１３のいずれか記載の医薬組成
    物。
  16. 【請求項１６】 モノクローナル抗体が癌細胞に存在す
    ることのあるｕ−ＰＡＲのグリコシル化変種に結合する
    ものである、請求項１５記載の医薬組成物。
  17. 【請求項１７】 ｕ−ＰＡＲと反応するモノクローナル
    抗体を含む、患者の単球や顆粒球について減少したｕ−
    ＰＡＲ濃度を検出することによる発作性夜間ヘモグロビ
    ン尿症の診断または予後評価剤。
  18. 【請求項１８】 哺乳類（ひとを含む）におけるｕ−Ｐ
    Ａのレセプタ結合形のｕ−ＰＡＲに対する結合を妨害す
    ることによりプラスミノーゲンのプラスミンへの活性化
    を阻止することによって、哺乳類における局在化した蛋
    白分解作用を阻止または妨害するに適した物質を選択す
    る方法であって、次の少なくとも一つのアッセイを行う
    ことを特徴とする方法： （１）当該物質によるｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応の
    阻止を、当該物質を固定化されたｕ−ＰＡＲと可溶化さ
    れたｕ−ＰＡを含む系に加え、ｕ−ＰＡＲに結合したｕ
    −ＰＡを標識化するか、または標識化抗ｕ−ＰＡ抗体を
    使用することにより検出するか、もしくは当該物質を固
    定化されたｕ−ＰＡと可溶化されたｕ−ＰＡＲを含む系
    に加え、ｕ−ＰＡに結合したｕ−ＰＡＲを標識化する
    か、または標識化抗ｕ−ＰＡＲ抗体を使用することによ
    り検出する； （２）当該物質によるｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応の
    阻止を、当該物質をｕ−ＰＡＲと放射性標識化ｕ−ＰＡ
    またはその誘導体を含む系に加え、ｕ−ＰＡに結合した
    ｕ−ＰＡＲを交差結合させ、交差結合生成物をＳＤＳペ
    ージ及び放射線写真により検出する； （３）培養細胞表面におけるｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲに対
    する結合の阻止を、当該物質を放射性標識化ｕ−ＰＡま
    たはその誘導体とｕ−ＰＡＲを有する細胞含む系に加
    え、ｕ−ＰＡＲに結合したｕ−ＰＡまたはその誘導体を
    当該細胞のガンマ計数により検出する； （４）レセプタ結合外因性ｐｒｏ−ｕ−ＰＡによる細胞
    表面プラスミノーゲン活性化の阻止を、当該物質をｕ−
    ＰＡＲを有する細胞に加え、さらにｐｒｏ−ｕ−ＰＡを
    加えてから、細胞表面におけるプラスミン生成を測定す
    ることにより検出する； （５）レセプタ結合外因性ｐｒｏ−ｕ−ＰＡによる細胞
    表面プラスミノーゲン活性化の阻止を、ｕ−ＰＡＲを有
    する細胞を培養し、当該物質でｐｒｏ−ｕ−ＰＡを産生
    させてから、細胞表面におけるプラスミン生成を測定す
    ることにより検出する；および （６）ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応を阻止するように
    樹立させた物質を、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの存在下に侵
    襲および／または転移することが知られており、かつ、
    マウスにおいて侵襲および／または転移を起こすことが
    知られているところのひと癌細胞を接種させたヌードマ
    ウスに投与し、当該マウスにおけるひと癌細胞の侵襲お
    よび／または転移を阻止する物質を適切な物質として選
    択する。
  19. 【請求項１９】 ひと癌細胞がｕ−ＰＡを産生する細胞
    であり、ｕ−ＰＡＲがマウスに接種される他のひと細胞
    によって供給されるものであるか、 ひと癌細胞がｕ−ＰＡＲを産生する細胞であり、ｕ−Ｐ
    Ａがマウスに接種される他のひと細胞によって供給され
    るものであるか、 ひと癌細胞がｕ−ＰＡもｕ−ＰＡＲも産生しない細胞で
    あり、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲが他の細胞によって供給さ
    れるものであるか、またはひと癌細胞がｕ−ＰＡもｕ−
    ＰＡＲも産生する細胞である、請求項１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 マウスがｎｕ／ｎｕ−ＭＥＴＡ／Ｂｏ
    ｍ系マウスである、請求項１８または１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 ひと癌細胞とマウス細胞の視覚的区別
    を両者の間に顕著な色の差異を設けることによって明ら
    かにする、請求項１８〜２０のいずれか記載の方法。
  22. 【請求項２２】 顕著な色の差異が酵素と当該酵素に対
    する色素基質を用いて設けられる、請求項２１記載の方
    法。
  23. 【請求項２３】 酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼであ
    り、基質がＸ−ｇａｌである、請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 β−Ｄ−ガラクトシダーゼがひと癌細
    胞に導入されたｌａｃＺ遺伝子により産生されるもので
    ある、請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 ｌａｃＺ遺伝子がレトロウイルス性ベ
    クターを使用する形質導入によりひと癌細胞に導入され
    たものである、請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 請求項１８〜２５のいずれか記載の方
    法によって選択された、哺乳類（ひとを含む）における
    ｕ−ＰＡのレセプタ結合形のｕ−ＰＡＲに対する結合を
    妨害することによりプラスミノーゲンのプラスミンへの
    活性化を阻止することによって、哺乳類における局在化
    した蛋白分解作用を阻止または妨害するための物質。
  27. 【請求項２７】 哺乳類（ひとを含む）におけるｕ−Ｐ
    Ａのレセプタ結合形のｕ−ＰＡＲに対する結合を妨害す
    ることによりプラスミノーゲンのプラスミンへの活性化
    を阻止することによって、哺乳類における局在化した蛋
    白分解作用を阻止または妨害するための組成物の調製に
    使用する物質であって、次の性質を有するもの： （１）ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応を阻止する（ただ
    し、当該阻止は、当該物質を固定化されたｕ−ＰＡＲと
    可溶化されたｕ−ＰＡを含む系に加え、ｕ−ＰＡＲに結
    合したｕ−ＰＡを標識化するか、または標識化抗ｕ−Ｐ
    Ａ抗体を使用することにより検出するか、もしくは当該
    物質を固定化されたｕ−ＰＡと可溶化されたｕ−ＰＡＲ
    を含む系に加え、ｕ−ＰＡに結合したｕ−ＰＡＲを標識
    化するか、または標識化抗ｕ−ＰＡＲ抗体を使用するこ
    とにより検出する方法で確認される); （２）ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応を阻止する（ただ
    し、当該阻止は、当該物質をｕ−ＰＡＲと放射性標識化
    ｕ−ＰＡまたはその誘導体を含む系に加え、ｕ−ＰＡに
    結合したｕ−ＰＡＲを交差結合させ、交差結合生成物を
    ＳＤＳページ及び放射線写真により検出する方法で確認
    される）； （３）培養細胞表面におけるｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲに対
    する結合を阻止する（ただし、当該阻止は、当該物質を
    放射性標識化ｕ−ＰＡまたはその誘導体とｕ−ＰＡＲを
    有する細胞含む系に加え、ｕ−ＰＡＲに結合したｕ−Ｐ
    Ａまたはその誘導体を当該細胞のガンマ計数により検出
    する方法で確認される）；および （４）レセプタ結合外因性ｐｒｏ−ｕ−ＰＡによる細胞
    表面プラスミノーゲン活性化を阻止する（ただし、当該
    阻止は、当該物質をｕ−ＰＡＲを有する細胞に加え、さ
    らにｐｒｏ−ｕ−ＰＡを加えてから、細胞表面における
    プラスミン生成を測定することにより検出する方法で確
    認される）。
  28. 【請求項２８】 当該物質がさらに次の性質を有する、
    請求項２７記載の物質： （５）レセプタ結合外因性ｐｒｏ−ｕ−ＰＡによる細胞
    表面プラスミノーゲン活性化を阻止する（ただし、当該
    阻止は、ｕ−ＰＡＲを有する細胞を培養し、当該物質で
    ｐｒｏ−ｕ−ＰＡを産生させてから、細胞表面における
    プラスミン生成を測定することにより検出する方法で確
    認される）。
  29. 【請求項２９】 当該物質がさらに次の性質を有する、
    請求項２７または２８記載の物質： （６）ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの存在下に侵襲および／ま
    たは転移することが知られており、かつ、マウスにおい
    て侵襲および／または転移を起こすことが知られている
    ところのひと癌細胞を接種させたヌードマウスに投与し
    たとき、当該マウスにおけるひと癌細胞の侵襲および／
    または転移を阻止することができる。
  30. 【請求項３０】 マウスがｎｕ／ｎｕ−ＭＥＴＡ／Ｂｏ
    ｍ系マウスである、請求項２９記載の物質。
  31. 【請求項３１】 ひと癌細胞とマウス細胞の視覚的区別
    を、酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを使用し、当
    該酵素に対する色素基質としてＸ−ｇａｌを使用するこ
    とにより、両者の間に顕著な色の差異を設けることによ
    って明確化する、請求項２９記載の物質。
  32. 【請求項３２】 β−Ｄ−ガラクトシダーゼがひと癌細
    胞に導入されたｌａｃＺ遺伝子により産生されるもので
    ある、請求項３１記載の物質。
  33. 【請求項３３】 ｌａｃＺ遺伝子がレトロウイルス性ベ
    クターを使用する形質導入によりひと癌細胞に導入され
    たものである、請求項３２記載の物質。
  34. 【請求項３４】 スラミンまたはその類似体もしくは誘
    導体である、請求項２７〜３３のいずれか記載の物質。
  35. 【請求項３５】 請求項に記載の抗体を捕捉または検出
    抗体あるいはそれら両者として使用することを特徴とす
    る、ｕ−ＰＡＲがｕ−ＰＡに結合しているか否かと本質
    的に関係のない、試料中のｕ−ＰＡＲを検出または定量
    する方法。
  36. 【請求項３６】 請求項に記載の抗体のように、ｕ−Ｐ
    Ａまたはｐｒｏ−ｕ−ＰＡに結合したｕ−ＰＡＲに結合
    することが出来る抗体を捕捉または検出抗体として使用
    し、結合したｕ−ＰＡまたはｐｒｏ−ｕ−ＰＡを検出す
    る抗体を検出または捕捉抗体として使用することを特徴
    とする、試料中のｕ−ＰＡＲとｕ−ＰＡの複合体を検出
    または定量する方法。
  37. 【請求項３７】 請求項に記載の抗体のように、遊離ｕ
    −ＰＡＲと結合することが出来るが、ｕ−ＰＡ結合を阻
    止することが出来ない抗体を捕捉または検出抗体として
    使用し、ｕ−ＰＡまたはそのｕ−ＰＡＲ結合変種を検出
    または捕捉抗体として使用することを特徴とする、試料
    中のｕ−ＰＡと結合していないｕ−ＰＡＲを検出または
    定量する方法。
  38. 【請求項３８】 請求項に記載の抗体のように、ｕ−Ｐ
    Ａに結合していると否とに関係なくｕ−ＰＡＲを検出す
    る抗体を検出抗体として使用することを特徴とする、組
    織片中のｕ−ＰＡＲの免疫組織化学的検出法。
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