JPH06508508A - 肝細胞成長因子（ｈｇｆ）レセプターの部分切除形態 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 、ＨＧＦ　レセプターの。　７、多態 本発明は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）レセプターの部分切除形態、その調製及び それを含む薬学的組成物に関する。

址旦ユガン原遺伝子（Ｃｏｏｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１１． ２９−３３゜＋９８４；　Ｄｅａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１ｇ、 　３８５−３８８．１９８５；　Ｐａｒｋ　ｅｔ　ａｌ、。

ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８４．６３７９−６３８３．１９８７）は、２つのジスルフ ィド結合された鎖、５０ｋＤａ（ｐ　５０　ａ）と１４５ｋＤａ　（ｐ１４５β ）から成るヘテロダイマーであり、独自の特徴を有する膜貫通糖タンパク質（ｐ １９０″ｌ：Ｔ又は性且ルセブター）をコードする（Ｇｉｏｒｄａｎ。

ｅｔ　ａｔ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８．３５１０−３５１７ ．１９８８；　Ｇｉｏｒｄａｎ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３３９．１５５−１５６．１９８９）　。両方 の鎖は、共に細胞表面に露出している。β鎖は、疎水性アミノ酸ストレッチを伴 って原形質膜に広がり、細胞内チロシンキナーゼドメインを有する（Ｄｅａｎ　 ｅｔ　ａｌ、、　１９８５；　Ｇｏｎｚａｔｔｉ−Ｈａｃｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、 　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８５．２１−２５、１９８８：　Ｔｅｍｐｅｓｔ　ｅｔ　 ａｌ、、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２０９．３５７−３６１．１９８６）。

レセプターは、１７０　ｋＤａの前駆体として合成され、それがグリコジル化さ れ、酵素で開裂されて、成熟ヘテロダイマーとなる（Ｇｉｏｒｄａｎｏ　ｅｔ　 ａｔ、、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、　４．１３８３−１３８８．１９８９；　Ｔｅｍ ｐｅｓｔｅｔ　ａｌ、、　Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　５８．３−７．１９８ ８）。

最近、Ｕ旦ユレセプクーに対するリガンドとして、肝細胞成長因子（ＨＧ　Ｆ　 ）が提案されてきた（Ｂｏｔｔａｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５ １゜８０３−８０４．＋９９１；　Ｎａ１ｄｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｏｎｃｏ ｇｅｎｅ　Ｆ２．５０１−５０４．１９９１；Ｎａ１ｄｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、 　＋９９１．　ＥＭＢＯＪ、、　１０．２８６７−２８７８）。ヘパトボエチン ーＡ　（Ｍｉｙａｚａｗａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１６３゜９６７−９７３　（１９８９）；　 Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３４２．４４０−４４３． １９８９；Ｚａｒｎｅｇａｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４９ ．３３１４．１９８９）としても知られているＨＧＦは、−次培養中のラット及 びヒト肝細胞にとって最も効力のあるマイトジェン（分裂促進剤）として、及び ヒト及びげっ歯頚の両方における肝臓のインビボ再生に関与するヘパトトロフィ ック（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｈｉｃ　；肝栄養性）因子として記載されてきた（ 総説として、Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ、　ＦＡＳＥＢ　Ｊ、　４．１７６− １８７．１９９０を参照のこと）。ラット及びウサギにおいては、ＨＧＦは、す い臓、だ液腺、十二指腸、甲状腺及び中枢神経系の選択された領域においても検 出されている（Ｔａｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８７、３２００−３２０４．１９９０；　Ｚａｒｎ ｅｇａｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　鉦、　１２５２−１２５６．１９９０）。

姓旦ユガン遺伝子は、当初、化学的発ガン物質で処理されたヒトのセルラインか らのＤＮＡを用いてトランスフェクションによって同定された（Ｃｏｏｐｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１１．２９−３３．１９８４）　、このセル ラインにおいて、ＭＥＴ遺伝子は染色体再配置（リアレンジメント）によって活 性化された［Ｐａｒｋ咀凪、、　Ｃｅ１ｌ卦、８９５（１９８５１］　、　Ｍミ ニは、ヒトの胃ガンセルライン（Ｇｉｏｒｄａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、　。

Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　８−、３５１０．１９８８）及び自然発 生的に形質転換されたマウスの線維芽細胞（Ｃｏｏｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅ ＭＢＯＪ、、　５．２６２３゜１９８６　）において増幅され、活性化されるこ ともわかっている。

ここで我々は、細胞外ドメインに特異的なモノクローナル抗体を開発し、？！数 のヒトセルラインをスクリーニングするのにこれらの抗体を用いた。既知のｐｌ 　９０　ＮＥＴに加えて、これらの抗体は一貫してその他の２つの牲旦１ヘテロ ダイマー、すなわち細胞表面に局在する１４０ｋＤａの複合体及び培地中に放出 された１３０ｋＤａの複合体を認識した。両方の複合体は、ｐ５０ａと区別でき ないα鎖と、Ｃ末端が部分切除されたβ鎖（それぞれｐ８５β及びｐ７５β）と から成り、細胞質キナーゼドメインを欠いている。これらの部分切除形態１形態 は、翻訳後のタンパク分解的プロセシングによってインビボで生成される。タン パク質キナーゼＣ活性化は、培地中へのｐｌ　３　Ｑ　ＩＩＥＴの放出を上向き 調節する（上昇させる）。

成長因子レセプターの部分切除形態は、い（つかの細胞、組織培養上清及び生物 学的流体において記載されてきた（Ｂｅｇｕｉｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｏ５ｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｃｅ１ｌ　５９．３３５−３４８ ；　Ｚａｂｒｅｓｃｋｙ　ｅｔ　ａｌ、。

１９９１、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６６、１７１６−１７２０　 ）　、最近になって、Ｃ末端部分切除レセプターの可溶性形態が、リガンド結合 に関して無傷の（インタクト）レセプターと競合でき、不活性ヘテロダイマーを 形成することによってリガンド誘発によるチロシンキナーゼ活性の刺激に干渉す ることができるということが報告された（　Ｂａ５ｕ従って、本発明は、それぞ れ５０ｋＤａ、及び７５又は８５ｋＤａの２つのジスルフィド結合された鎖で構 成され、この５０ｋＤａの鎖が性旦ユガン原遺伝子によりコードされるチロシン キナーゼのα鎖であり、７５又は８５ｋＤａの鎖が該チロシンキナーゼのβ鎖の Ｃ末端部分切除形態であるタンパク質を提供する。

本発明に基づく２つのＣ末端部分切除挾旦ユタンパク質は、１４０　ｋＤａの膜 貫通形態（ｐ　ｌ　４０””）及び培地中に放出される１３０ｋＤａの可溶性タ ンパク質（ｐ　ｌ　３０”’）である。これらの部分切除形態は、琶ミニ遺伝子 が増幅され、過剰発現されるＧＴＬ−１６ヒト胃ガンセルライン（Ｇｉｏｒｄａ ｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８）、ならびに正常レベルのＭＥ工発現を伴うそ の他のガン腫セルラインにおいて検出可能である。

部分切除形態１タンパク質は、２つのジスルフィド結合された鎖から成り、無傷 のｐ１９ＱＭＥＴと同じヘテロダイマー構造を有する。部分切除形態のα鎖は、 ｐｌ　ｇ　Ｑ　ＭＥＴのα鎖と区別不可能であり、一方、そのβ鎖はより低い分 子量を有する。ｐ１４ＱＭＩ！？のβ鎖は約８５　ｋＤａ（ｐ　８５β）であル カ、一方ｐ　１３　ｏ■１ノβ鎖ハ約７５　ｋＤａ（ｐ　７５β）である。

β ｐ８５　及びｐ７５βは、両方共そのＣ末端が一部切り取られている。これらは 、Ｋｌ１配列から予想されるＣ末端ノナデカペプチドに対して向けられた抗体に より認識されない。これらは、インビボ又はインビトロでチロシン上でリン酸化 されないという事実によって示されるように、主要なインビトロリン酸化部位で あるＴｙｒ＋２１％を含む細胞質チロシンキナーゼドメインが欠如している。ｐ ８５β及びｐ７５βは、それら全てが４つの異なるエピトープを規定するモノク ローナル抗体により認識され、同じ細胞外トリプシンペプチドを有することから 、ｐ１４５βとＮ末端ドメインを共有している。

ｐ８５′３ｊｉｌは、その細胛質ドメインの大部分を喪失した膜貫通糖タンパク 質であると考えられている。予想されるアミノ酸配列に基づくと、Ｃ末端の最後 の４３５アミノ酸の切断は、分子量を約５０ｋＤａだけ減少させることになる。

この値は、無傷β鎖対部分切除β鎖の電気泳動による移動の観察上の差異と一致 している。ｐ７５βは、培養土清中に放出され、細胞膜と結びつかないことから 、細胞質ドメイン及び膜貫通セグメントが欠如している。その上、これは、膜に またがるｐ８５β鎖と比較して１０ｋＤａの減少を示す。このサイズ減少は、膜 貫通ドメインを含むセグメントの喪失と相容性がある。

本発明のタンパク質は、性ミニ遺伝子を発現するセルラインの培養から得ること ができる。標準的には、そのセルラインはガンセルラインである。従って、本発 明は、β鎖のＣ末端部分切除形態が７５　ｋＤａの鎖である本発明のタンパク質 の調製方法において、（１）社ミニ遺伝子を発現する細胞を、その細胞用の培地 中で培養する工程； （１１）結果として得られたコンディションド培地（馴化培地）を、旦ミニ遺伝 子によってコードされるチロシンキナーゼのβ鎖の細路外ドメインに特異的な抗 体と接触させる工程；及び（ｉ）結果として得られた免疫複合体から、前記タン パク質を放出させる工程、 を含む方法を提供する。

姓ミニ遺伝子を発現する細胞は、適切なあらゆるセルラインの細胞であってよい 。好適な細胞は、胃ガン腫、肺腺ガン、ロ腔ガン腫及び結腸ガン腫のセルライン である。好ましくは、性ミニ遺伝子を過剰発現する細胞が使用される。培地は、 同化可能な炭素源、同化可能な窒素源、及び望ましい場合には無機塩を含むあら ゆる培地であってよい。ＲＰＭＩ　１６４０培地（場合によりウシ胎児血清を添 加したもの）は、有用な培地である。

ＭＥ工遺伝子によりコードされるチロシンキナーゼのβ鎖の細胞外ドメインに特 異的な抗体は、従来の方法で産生させることができる。抗体は、標準的にはモノ クローナル抗体である（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　 ２５６．４９５−４９７．１９７５　）　、モノクローナル抗体を産生ずるハイ ブリドーマ細胞は、腫瘍細胞と免疫された動物からの牌細胞とを融合させること によって調製できる。免疫される哺乳動物は、ラット又はマウスであってよい。

哺乳動物は、秤ミニ遺伝子を発現する全細胞又は細胞の抽出物を用いて免疫し得 る。好ましくは、細胞はＭＥユ遺伝子を過剰発現する。ハイブリドーマによって 産生された抗体を、秩且１タンパク質産生セルラインから抽出した性旦１タンパ ク質を免疫沈降させるその能力を評価することによってスクリーニングする。ハ イブリドーマは、培養にて成育させてもよいし、あるいは同種（異型）宿主又は 免疫互譲性（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）宿主の血流中へ又は腹水形 成させるため腹腔内に注入してもよい。

免疫沈降物は、馴化培地中に存在するｐｌ　３　ＱＭＥＴと抗体との間で形成さ れる。免疫沈降物は、例えば特異的抗Ｍｅｔ抗体を結合・架橋させたプロティン Ａ−セファロース（商標）カラムのようなカラムで収集する。ｐｌ　３　Ｑ　Ｍ ＥＴは、低ｐＨ又は高塩濃度での処理により免疫複合体から放出させる。

β鎖のＣ末端部分切除形態が８５ｋＤａの形態である本発明のタンパク質は、次 の工程を含む本発明の方法によって調製される＝（１）牲ミニ遺伝子を発現する 細胞を、界面活性剤を用いて抽出する工程； （ＩＩ）該抽出物を、ＭＥ工遺伝子によってコードされるチロシンキナーゼのβ 鎖の細胞外ドメインに特異的な抗体と接触させる工程；及び （ｉ）結果として得られた免疫複合体から、前記タンパク質を放出させる工程。

牲旦ユ遺伝子を発現する細胞及びそれらを成長させた培地は、上述のとおりであ る。細胞は、界面活性剤、標準的にはトリトンＸ１００又はＣＨＡＰＳ　（３− ［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート］ ）のような非イオン性界面活性剤を用いて抽出する。ＣＨＡＰＳはＦｌｕｋａか ら市販されており、Ｎａ１ｄｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　 Ｂｏｉｌ、、　Ｖｏｌ、１１．　Ｎｏ、４　（Ａｐｒ。

１９９１）、　ｐ、＋７９３−１８０３に記載されているようにＨＥＰＳ緩衝液 中の１％溶液として用いられる。標準的には、細胞は、緩衝液中で抽出する。ペ ブスクチン、ロイペプチン、アプロチニン、及びトリプシン阻害剤のようなプロ テアーゼ阻害剤を、付加的に存在させてもよい。結果として得られた抽出物を、 ＭＥ工遺伝子によりコードされるチロシンキナーゼのβ鎖に特異的な抗体と接触 させ、上述のとおり、結果として得られた免疫沈降物からｐ１４０ＭＥＴを放出 させる。

本発明のタンパク質は、単離し、精製することが可能である。このタンパク質は 、姓ミニ遺伝子によりコードされる完全なチロシンキナーゼを実質的に含まない 状態で、そして事実姓ミニ遺伝子を発現する細胞のその他の成分を実質的に含ま ない状態で提供されつる。本タンパク質は、ＨＧＦのアンタゴニスト（拮抗薬） として利用することができる。本タンパク質はＨＧＦに結合する能力を維持して いるが、チロシンキナーゼドメインが欠如していることから、細胞内マイトジェ ンシグナルを伝達することができない。従って、このタンパク質は、胃腸管、肝 臓、甲状腺及び脳の腫瘍を含む新生物性疾病の治療において用いることができる 。実際に、これらの腫瘍のうち高い割合のものがＨＧＦレセプターを発現し、成 長するためにＨＧＦを必要とする。これは、肝臓の過形成又は腺腫症の治療のた めの肝再生抑制剤としても使用できる。

本発明のタンパク質は、あらゆる適切な非経口経路によって患者に投与すること ができる。皮下、静脈内又は筋向のいずれの投与を採用するか、用量、及び投与 頻度の選択は、さまざまな要因によって左右される。これらの要因には、投与の 目的、治療を受ける患者の年齢及び体重、そして患者の状態などが含まれる。治 療学的に有効な量が与えられる。しかしながら、標準的には、本タンパク質は、 各投与経路について１０〜１．ＯＯＯｕｇ／用量、より好ましくは５０〜５００ ｕｇ／用量の量で投与される。

本タンパク質は、薬学的組成物の形に処方してもよい。この薬学的組成物は、薬 学的に許容可能な担体又は希釈剤をも含んでいる。

投与経路に応じて、適当なあらゆる担体又は希釈剤を利用することができる。

以下の例により、本発明を説明する。添付図面中：図１は、姓旦１タンパク質の 部分切除形態が、細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体によって同定され ることを示している。

パネルＡ及びＢ：ラクトペルオキシダーゼの存在下で１２５Ｉで表面標識された ＧＴＬ−１６細胞。細胞タンパク質を、トリトンＸ−１００で可溶化し、性立１ タンパク質の細胞外ドメイン（ＤＯ−２４、ＤＮ−３０、ＤＮ−３１、レーン２ ．３．４）又はＣ末端ペプチド（ＤＲ−６、レーン１）のいずれかに対して向け られた異なるＭＡｂｓで免疫沈降させた。免疫沈降されたタンパク質を、非還元 条件下で（パネルＡ）又は２β−メルカプトエタノールでの還元処理の後（パネ ルＢ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ− ＰＡＧＥ）により分離した。パネルＣ：　Ｄｏ−２４ＭＡｂｓでの免疫沈降の後 に得られたｐ１４０”７（レーンｌ）及びｐ１９０′ｌＥＴ？！合体（レーン２ ）を、５ＤＳ−ＰＡＧＥから切り出し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中に溶出して、２ β−メルカプトエタノールにより還元し、還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析 した。ゲルを※２燥し、オートラジオグラフィのため３日間露出した。

図２は、無傷の又は部分切除のＵ旦ルセブターから単離されたβ鎖の細胞外ドメ インの２次元トリプシンペプチド地図を示している。ｐ１４５β（パネルＡ）、 ｐ８５β（パネルＢ）及びｐ７５β（パネルＣ）は、抗細胞外ドメインＭＡｂｓ による、　＋ｘｓ■で表面標識されたＧＴＬ−１６細胞又は１１ｓｉ標識された ＧＴＬ−１６細胞の上清のいずれかからの免疫沈降に続いて、Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ 　Ａ　Ｇ’Ｅで分離した。タンパク質を、電気泳動によりＩｍｍｏｂｉｌｏｎ　 Ｐ膜にトランスファーし、消耗性（ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ）　トリプシン消化に 付した。約３．０００ｃｐｍの各消化物を、陽極に対応する右下隅にスポットし 、ｐＨ１，９での電気泳動、及びピリジン−酢酸−ブタノール−水中の上昇クロ マトグラフィに付した。区立１タンパク質のα鎖から得られた主要トリプシンペ プチド（矢印）を、比較のために示す（パネルＤ）。地図を、増感スクリーンを 用いて、−７０℃で２週間露出した。原点は丸で囲まれている。

図３は、ｐｌ　４０１４！Ｔがインビトロでリン酸化されないことを示している 。非イオン性界面活性剤中でＧＴＬ−１６細胞から可溶化されたタンパク質を、 抗Ｍｅｔタンパク質細胞外ドメインＭＡｂｓを用いて（ＤＬ−２１、Ｄｏ−２４ 、ＤＮ−３０、ＤＮ−３１、レーン１．２．３．４）、又は非関連タンパク質に 対するＭＡｂｓを用いて（レーン１５）、免疫沈降させた。洗浄した免疫複合体 を［γ−３２Ｐ］　ＡＴＰの存在下でリン酸化し、標識されたタンパク質を、非 還元条件下（パネルＡ）又は還元条件下（２β−メルカプトエタノールの存在下 、パネルＢ）で、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ゲルをＭｔＱし、オートラ ジオグラフィのため２日間露出させた。無傷のｐｌ　９０　ＮＥＴ、又は無傷の ｐ１４５β鎖及び牲旦１前駆体Ｐｒ　１７０のみが標識されている。

図４は、ヒト牲旦ＩＣＤＮＡでのトランスフェクションを受けたマウスの線維芽 細胞が、無傷のｐｌ　ｇ　□　ＮＥＴならびに部分切除形態を発現することを示 している。９ｋｂの主要ｍＲＮＡから誘導された全長ＭＥＴｃＤＮＡでのトラン スフェクションを受けたＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーンｌ、２）又はその馴化培地（ レーン３及び４）からのタンパク質を、沸とうＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で可溶化 し、還元条件下でウェスタンプロット法により分析した。レーン＝１及び４、性 二二タンパク質のＣ末端ペプチドに対するＭＡｂｓ；２及び３、社主１細胞外ド メインに対して向けられたＭＡｂ　（ＤＯ−２４）。強化されたケミルミネッセ ンスシステム（ＥＣＬＴＭ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）により、特異的結合を検出した 。バンドＡ〜Ｄは、切除ｐ８５β（Ｃ）及び可溶性ｐ７５β（Ｄ）と一致するサ イズを有する。

図５は、ｐｌ　９　Ｑ　ＭＥＴ及びｐｌ　４　Ｑ　１１！Ｔの不均等な細胞局在 を示している。ＧＴＬ−１６細胞を、［３Ｈ］グルコサミンで１８時間標識した 。生きた細胞を、ＭＡｂｓと共に氷上で２時間インキュベートし、その後界面活 性剤で溶解させた（レーンｌ、３．５）。そうでない場合には、細胞をまず最初 に溶解させ、次にＭＡｂｓと共にインキュベートした（レーン２．４．６）。両 方の場合において、免疫複合体をプロティンＡ−セファロースで回収し、放射能 標識されたタンパク質を還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。以下の抗体 を使用した：区立１タンパク質の細胞外ドメイン（ＤＯ−２４、レーン１及び２ ）に対して又はＣ末端ペプチド（ＤＲ−６、レーン５及び６）に対して向けられ たＭＡｂｓ、及びＥＧＦに対するレセプターの細胞外ドメインに対するＭＡｂｓ （レーン３及び４）。ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィのために４日間露出 した。

図６は、生理学的条件下での異なるヒトセルラインにおけるｐ１４０”１の発現 を示す（ウェスタンプロット）。細胞タンパク質を、沸とうＬａｅｍｍｌｉ緩衝 液中で可溶化し、非還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離して、ニトロセルロ ースシートにトランスファージ、ＤＬ−２１ＭＡｂｓ及び［”’　Ｉ　］−］ヒ ツジα−マウスＩを順次用いて装飾した。各レーンに、３００μｇの細胞タンパ ク質をロードした。ＧＴＬ−１６レーンには、ｌＯＯμｇをロードした。セルラ インは以下のとおりである；レーンｌ：Ａ３４９、肺ガン腫、レーン２：ＧＴＬ −１６、胃ガン腫；レーン３　：　５Ｋ−ＢＨ３、乳ガン腫；レーン４：ＨＴ− ２９、結腸ガン腫；レーン５：ＫＢ、ロ腔ガン腫。

図７は、区立１タンパク質の可溶性部分切除形態が、細胞外ドメインに対するモ ノクローナル抗体によって同定されることを示している。ＧＴＬ−１６（パネル Ａ、Ｃ）又はＡ３４９細胞（パネルＢ）を、［”ＳＦメチオニンで一晩橿識しく １０　ｏｐｃｉ　／ｄ）　、洗浄して、非イオン性界面活性剤で抽出した。清澄 にした細胞抽出物（レーン１）及び馴化培地（レーン２．３）を、牲旦エタンバ ク質の細胞外ドメイン（Ｄｏ−２４、レーンｌ及び３）に対して又はＣ末端ペプ チド（ＤＲ−６、レーン２）に対して向けられたＭＡｂｓを用いて沈降させた。

免疫沈降されたタンパク質を、非還元条件下で（パネルＡ、Ｂ）又は２β−メル カプトエタノールでの還元処理の後（パネルＣ）、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離した 。ゲルをフルオログラフィに付し、乾燥して、オートグラフィのため３日間露出 した。

図８は、可溶性ｐ１３０１１１！ｔが、細胞表面に露出された牲旦１タンパク質 のクンバク分解により生成されることを示している。

ＧＴＬ−１６細胞を、ラクトペルオキシダーゼの存在下で１２５Ｉで表面ｔｔ＋ 識した。４時間インキュベートした後、標識されたタンパク質を、培養上清（レ ーン１．２）又は細胞抽出物（レーン３．４）から単離し、細胞外ドメイン（Ｄ ｏ−２４、レーン２及び３）に対して又は区立１タンパク質のＣ末端ペプチド（ ＤＲ−６、レーン１及び４）に対して向けられたＭＡｂｓを用いて免疫沈降させ た。免疫沈降させたタンパク質を、還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した 。ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィのために１８時間露出した。

図９は、タンパク質キナーゼＣ活性化による、細胞表面からのｐ１３０”１の放 出の上向きの調節を示す。ＧＴＬ−１６細胞を、−晩［”Ｓ］メチオニン（１０ ０１１ｃｉ　／＋Ｊ）で標識し、ジメチルスルホキシド中に溶解した１６０ｎＭ ＴＰＡ（レーンＴ）又はジメチルスルホキシド単独（レーンＣ）で２時間処理し 、非イオン性界面活性剤で抽出した。馴化培地（Ａ）及び清澄にした細胞抽出物 （Ｂ）を、性且１細胞外ドメインに対して向けられたＭＡｂｓ　（Ｄｏ−２４） で沈降させた。プロティンＡ−セファロースで収集した免疫複合体を、還元条件 下での５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ゲルをフルオログラフィに付し、乾燥して 、オートラジオグラフィのため６時間露出した。パネルＣ：ＧＴＬ−１６細胞を 、上述のとおりＴＰＡ　（レーンＴ）又はジメチルスルホキシド（レーンＣ）で 処理し、ラクトペルオキシダーゼにより　１２６エで標識し、非イオン性界面活 性剤で抽出した。ＭＡｂｓＤＯ−２４での免疫沈降のため清澄にした細胞抽出物 を処理し、上述のとおり免疫複合体を分析した。

図１０は、可溶性ｐ　ｌ　３０””　４：Ｊ：６　”’Ｉ−ＨＧＦＯ）結合１に 示す。琶旦１タンパク質の細胞外ドメインに対して向けられたＭＡｂＤＮ−３０ を、ＰＶＣマイクロタイターウェル上にコーティングし、異なる濃度のｐ１３Ｑ １１ＥＴ又はｐ１３ＱＭｔＴを除いた馴化培地（−）のためのキャッチャ−とし て用いた。次に、例２の「材料と方法」の下に記載されているように、　”’Ｉ −ＨＧＦを添加した。４℃で一晩プレートをインキュベートし、３回洗浄し、結 合した放射能を１％のＳＤＳで溶出させてγ−カウンターで測定した。

図１１は、可溶性ｐ１３０１″ｔＴによるＨＧＦレセプター（ｐ　ｌ　４５βサ ブユニツト）のインビボチロシンリン酸化の阻害を示している。例２の「材料と 方法」の下に記載されているように、レンチル（レンズ豆）レクチン上のアフィ ニティクロマトグラフィにより部分的に精製したｐｌ　３　Ｑ　ＭＥＴと共に、 ＧＴＬ−１６細胞をインキュベートした。ｐ１４５βに存在するホスホチロシン の相対量は、Ｐ　−Ｔ　ｙ　ｒ抗体をプローブとしたウェスタンプロットのラジ オグラムで観察される相当するバンドの光学密度を測定することによって見積っ た。示した値は、代表的実験からのものである。Ａ：ｐ１３０″ＥＴを枯渇させ た馴化培地を用いてインキュベートした細胞、Ｂ：レンチルレクチンで精製した ｐ１３ＱＭ！Ｔを用いてインキュベートした細胞。

図１２は、可溶性ｐｔ　３０　ｔｌＥＴによる区立ｔ／ＨＧＦレセプター（ｐ１ ４５βサブユニット）のインビトロチロシンキナーゼ活性の阻害を示す。レセプ ターを、ポリクローナル抗−性且１血清を用いて沈降させ、ｐ１３０”１を枯渇 させた馴化培地（Ａ）又は部分的に精製したｐ１３０””（Ｂ）の異なる希釈の 溶液６０ｐ−１を用いて、室温で５分間インキュベートした。キナーゼ反応を、 １１００Ｊ７の［γ−”ＰＩ　ＡＴＰ及び５ｍＭのＭ　ｇ　Ｃ４２ｇの存在下で 氷上で２分間行なった。５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィの後、３２ ｐで標識されたバンドの光学密度をレーザーデンシトメーターで測定することに よって、キナーゼ活性を定量した。示した値は、代表的実験からのものである。

図１３は、組織培養培地中のＧＴＬ−１６細胞から放出された可溶性ｐ１３０Ｍ ｅｔの放射能標識免疫測定による検出を例示している。白丸：　ＧＴＬ−１６上 清；黒丸：ＲＰＭＩ培地（陰性対照）。

阿１ 扛社旦方羞 織胞 使用した全てのセルラインはヒト由来のものである。ＧＴＬ−１６細胞は、分化 程度の低い胃ガン腫から誘導されたクローン株である（Ｇｉｏｒｄａｎｏ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８−、３５１０−３５１７゜ １９８８）。Ａ３４９肺腺ガン細胞、ＫＢロ腔ガン腫細胞、ＨＴ−２９結腸ガン 腫細胞及び５Ｋ−ＢＲ−３乳ガン腫細胞は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎから購入した。細胞は、５％ＣＯ，を含む水飽 和大気中で、１０％ウシ胎児血清（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｉｎｃ、　ＭｃＬｅａｎ、　Ｖａ）を加えたＲＰＭＩ　１６４０培地中で成長さ せた。

底体 Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ　ｆＮａｔｕｒｅ　２５６．４９５−４９７ ．１９７５）の手順に従って、区立１タンパク質を過剰に発現する生きたＧＴＬ −１６細胞全体を用いて免疫した後、旦旦１タンパク質の細胞外ドメインに対す るＭＡｂｓを得た。免疫された牌細胞をＡｇ８．６５３骨髄腫細胞と融合させ、 ハイブリッド上清を、ＧＴＬ−１６細胞に対するその示差結合について免疫酵素 検定においてスクリーニングした（Ｐｒａｔｅｔ　ａｔ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄ ｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、　１０．２９３−３０１゜ １９８７）　、固相免疫酵素検定（Ｐｒａｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５　）に おいて社主１タンパク質を過剰発現する細胞に対し選択的に結合する能力につい て、ハイブリッド上清をスクリーニングした。免疫沈降試験については、細胞を ３５３−メチオニンで１８時間標識し、充分に洗浄して、前述のとおり非イオン 性界面活性剤トリトンＸ１００を用いて溶解させた（Ｐｒａｔ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４５．５７９９−５８０７゜１９８５） 。試料を８％の５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析し、Ａｍｅｒｓｈａｍ）１ｙｐｅｒｆ ｉ１ｍを用いて、−７０℃で１日、オートラジオグラフィに付した。

これらの研究のためには、４つの異なるＭＡｂｓ　（ＤＬ−２１、ＤＮ−３０、 ＤＮ−３１、ＤＯ−２４）を選択した。ＭＡｂｓは、相互交叉競合に基づくと、 β−鎖の異なるエピトープと反応する。

異なるＭＡｂｓで同一の結果が得られたため、単純化を期してこのパネルを抗細 胞外ドメインＭＡｂｓと呼ぶ。姓ミニ配列（ＥＭＢ　Ｌデータバンク照会番号Ｘ ５４５５９）の１９個のＣ末端アミノ酸（Ｓ　ｅｒ　ｌ　２　？　２〜５ｅｒｌ 　３９０）に相当するペプチドに対するモノクローナル抗体（ＤＲ−６）も、作 成した。上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）レセプターの細胞外ドメインに対するモノ クローナル抗体は、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ　ｅｔ　＋す、、　ＥＭＢＯＪ、　７　（ １０１，３０５３−３０６０，１９８８により記載されたものである。陰性対照 として、非関連ＭＡｂｓを使用した。

細　ヨウ、　、　！　・ラベリング　、パ　び　ゞラクトペルオキシダー上−Ｈ ２０□で触媒された細胞表面１２８■憚識は、前述のとおりに行なった（Ｇｉｏ ｒｄａｎｏ健」■、、　１９８８　）。パルスヂエイス実験のためには、細胞を 、メチオニンを含まない培地を用いて３０分間前処理し、４００ｐＣｉ／−の［ ”Ｓ］−メチオニンを用いて１５分間パルスし、完全培地で２回洗浄し、次いで 異なる時間だけチェイスした。細胞を、１００ｐＣｉ／−の［３Ｈ］−グルコサ ミン又は［”Ｓ］−メチオニンのいずれかを用いて、１８時間標識した。放射性 同位元素は、全てＡｍｅｒｓｈａｍ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、。

ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　１１１）から購入した。標識した後、 １０ｍＭＰ　Ｉ　ＰＥＳ、ｐＨ７，６，１００ｍＭＮａＣρ、５　ｍＭＭ　ｇ　 Ｃ９ｚ、３００ｍＭシュクロース、５ｍＭＥＧＴＡ　（ＤＩＭ緩衝液）、１％ト リトンＸ−１００及びプロテアーゼ阻害剤（ペプスタチン、５０ｐｇ／−；ロイ ペプチン、５００νｇ／Ｍｌ；アプロチニン、ＩＬ１ｇ／ｌｎｌ；２　ｍＭＰ　 Ｍ　Ｓ　Ｆ　、　Ｓｉｇｍａ；大豆トリプシン阻害剤、５００ｕｇ／＋ａ／、Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を含む氷冷した緩衝液を用いて、細胞を抽出した。超遠心 分離した組織培養上清又は細胞抽出物を、プロティンＡ−セファロース上で予備 清浄化し、異なる抗体で免疫沈降させた。細胞表面に露出された分子の免疫沈降 を、界面活性剤での溶解に先立って、ＭＡｂｓと共に無傷ＧＴＬ−１６細胞をイ ンキュベートすることによって行なった。アフィニティ精製されたヤギ抗マウス Ｉｇ抗体（ＧαＭ１ｇ）と予め反応させたプロティンＡ−セファロース上で、免 疫複合体を、収集し、洗浄し、２β−メルカプトエタノールを含む又は含まない Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｎａｔｕｒｅ　２３０．６８０−６８５．１９７０）中 に溶出させた。［”Ｓ］メチオニンで１８時間標識したＧＴＬ−１６細駒に関し て、テトラデカノイルホルボールアセテート（ＴＰＡ）処理を行なった。細胞を 、新鮮なＲＰＭＩ培地で洗浄し、さらに１６０ｎＭのＴ　Ｐ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ ）を含む又は含まない（対照）ジメチルスルホキシドと共に２時間インキュベー トした。細胞表面に露出された旦旦１タンパク質に対するＴＰＡの影響を分析す るため、ＧＴＬ−１６細胞を、上述のとおりＴＰＡで処理し、次にラクトペルオ キシダーゼにより　ｌ！ｌｌｉで標識した。両方の場合において、界面活性剤で 可溶化された細胞タンパク質又は上清を、上述のとおりに沈降させた。タンパク 質を、５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、固定し、必要ならばフルオログラフィに付し、 乾燥し、オートラジオグラフィのためＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍに 露出した。

Ａ　キナーゼ １％トリトンＸ１００を含むＤＩＭ緩衝液中でＧＴＬ−１６細胞からタンパク質 を抽出し、上述のとおり沈降させた。プロティンＡ−セファロース−６０Ｍ１ｇ で収集した免疫複合体を、２．５μＣＬの［ｙ−”ＰＩ　ＡＴＰ　（比活性、７ 　、０００　Ｃｉ／　Ｍｍ　；　Ａｍｅｒｓｈａｍ）の存在下で、同じ緩衝液２ Ｏｕｌ中で、３０℃で５分間リン酸化した。反応は、５ｍＭＥＤＴＡを含む氷冷 したリン酸緩衝生理食塩溶液、ｐＨ７，２を１−添加することによって停止させ た。試料を遠心分離し、２β−メルカプトエタノールを含む又は含まない沸とう Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液によって溶出させた。５ＤＳ−ＰＡＧＥの後、ゲルを乾燥 し、オートラジオグラフィのため増感用スクリーンを用いてＡｍｅｒｓｈａｍ　 Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍに露出した。

鎖を、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、電気泳動によりＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰ膜 にトランスファージた（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　Ｔｏｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｔ、、 　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ７６、４３５０−４３５３．１９７９）。放射性β鎖を含む 膜フラグメントを、３７℃で３０分間、１００ｍＭ酢酸中、０．５％ポリビニル ピロリドンの中に浸漬し、水で簡単に洗浄し、次いで新たに調整した０、０５Ｍ 　ＮＨ４８ＣＯ，で洗浄した。固定化したタンパク質のトリプシン消化を、１０ ＭｇのＴＲＣＫ処理されたトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて３７ ℃で１６時間行ない、次にさらに３７℃で２時間、新鮮な酵素ＬＯｕｇを追加し て行なった（Ｈｕｎｔｅｒｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　７７、１３１１ −１３１５．１９８０　）　、消化物を、セルロース薄層プレート（１３２５５ セルロース、コダック）上の陽極に対応するコーナーにロードし、ｐＨ１，９で １，２００ボルトアワー。

電気泳動（２，５％蟻酸、７％氷酢酸）に付した。次に、プレートを上昇クロマ トグラフィに付した（ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸；水、２０　：　３０　 ：　６　：　２４ｖ／ｖ）。増感用スクリーンを用いたＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｈｙ ｐｅｒｆｉｌｍ上でのオートラジオグラフィにより、ペプチドを視覚化した。

ウェスタンプロットゝ 還元剤２β−メルカプトエタノールを含む又は含まない沸とうＬａｅｍｍｌｉ緩 衝液中で、細胞を可溶化した。等量のタンパク質（３００ｕｇ）を各レーンにロ ードした。Ｔｏｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７９により記載されているとお りに、ウェスタンプロット法により試料を分析した。プロットを、ＤＬ−２１Ｍ ａｂを含むハイブリドーマ上清、次に１２１１１−標識したヒツジａ　−Ｍ　１ 　ｇ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で、プローブ（探査）した。２〜３日間、増感用ス クリーンを用いてオートラジオグラムを露出した。タンパク質のサイズは、マー カーとして、［”Ｃ］メチル化により予め標識された、ミオシン（２００ｋＤａ ）、ホスホリラーゼｂ　（９２，５ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６９ｋＤａ ）、卵アルブミン（４３ｋＤａ）及び炭酸脱水酵素（３０ｋＤａ）を用いて（Ａ ｍｅｒｓｈａｍ）　、見積った。

Ｎ　Ｉ　Ｈ３Ｔ３　におＬるＭＥＴｃＤＮＡのトランスフエクシヨこれらの研究 に用いた発現ベクターは、主要後期アデノウィルスプロモーターを含む、プラス ミドｐＭＴ２に基づくものであった。

この発現プラスミドは、Ｋ旦エコーディング配列全体を包含する４、３ｋｂのｃ ＤＮＡを用いて構築された（Ｇｉｏｒｄａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９゜Ｎ ａｔｕｒｅ世１５５−１５６　）。このプラスミドは、選択可能なマーカーを全 く含んでいないため、細胞を、ネオマイシン耐性遺伝子を担持するｐＳＶ２ｎｅ ｏと同時トランスフェクションした。リボフエクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏ ｎ）手順により、プラスミドを、ＮＩＨ３Ｔ３細胞へと同時トランスフェクショ ンした。トランスフェクションの２日後、耐性クローンを選択するため、ネオマ イシン類縁体Ｇ４１８を培地に添加した。ウェスタンプロット分析によりＭｅ± レセプターを合成する能力について検定を行なうことによって、区立ルセブター を発現する安定なトランスフェクシント（形質転換体）を同定した。

■ 。′　７、１４０”１は　に　１９０１″ＥＴと　するＧＴＬ−１６細月包の表 面に露出されたタンパク質を、ラクトペルオキシダーゼにより　ｌｔ＠■で標識 した。１％トリトンで細胞を抽出し、可溶化された分子をＫ１１タンパク質のＣ 末端ペプチドに対するＭＡｂ、又は細胞外ドメインの異なるエピトープを認識す るＭＡｂｓを用いて沈降させた。免疫沈降物を、非還元条件又は還元条件下の５ ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｃ末端ペプチドに対する抗体はｐｌ　９　Ｑ　ＭＥ Ｔヘテロダイマーを沈降させ（図ＩＡ、レーン１）、このヘテロダイマーは還元 条件下でｐ５０ａ及びｐ１４５β鎖に解離した（図ＩＢ、レーン１）。細胞外ド メインに対して作成されたＭＡｂｓは、ｐ１９Ｑ１１ＥＴと共に、１４０ｋＤａ の見かけの分子量で移動するもう１つの分子を沈降させた（ｐ１４０”７漬図Ｉ Ａ、レーン２．３．４）。これらの免疫沈降物は、還元条件下で、それぞれ１４ ５．８５及び５０ｋＤａ（図ＩＢ、レーン２．３．４）の３つの鎖へと解離し、 このことはｐ１４０”７がｐ８５及びｐ５０のヘテロダイマーであることを示唆 している。図ＩＣに示す実験は、ｐ１４０′″′：Ｔのヘテロダイマー構造のこ の解釈を正式に立証している。パネルＡから切り出された１４０ｋＤａのバンド を、還元条件下で再度泳動したところ、ｐ８５及びｐ５０が生じた（図ＩＣ、レ ーンｌ）。後者は、ｐ１９０”７αβ複合体から解離されたｐ５０ａと共に同時 移動した（図ＩＣ、レーン２）。ｐ１９０“ＥＴ対ｐ１４０”１の比率は、１： ｌ〜２；ｌの間で変化した。その他のセルラインからの表面ヨウ素化されたタン パク質を検査すると、同一の結果が得られた。

表面ヨウ素化されたｐ１４５β鎖及びｐ８５β鎖の二次元トリプシン地図は、性 立１タンパク質の無傷の及び部分切除β鎖の細胞外ドメインが、同じペプチドを 含んでいることを示している（図２Ａ、２Ｂ）。結論として、ｐ１４０１′ＥＴ は、ｐ５０ａと、ｐ１４５βのＣ末端部分切除に由来する８５ｋＤａのβ鎖（ｐ ８０β）とのヘテロダイマーである。

ｏ−ｒ７、１４０”１はチロシン　でリンフ　されないｐ１９ＱＭＥＴのＣ末端 ペプチドに特異的な抗体を用いて、このタンパク質がそのβサブユニツト上でイ ンビトロでリン酸化されつるということが、以前に示されている（Ｇｉｏｒｄａ ｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８−、３５１０−３５１７．１９８８）。［γ−”Ｐ ］　ＡＴＰの存在下での、立見１細胞外ドメインに対して向けられた４つのＭＡ ｂｓを用いて得られた免疫沈降物のインキュベーションは、ｐ１９ＱｉｌｔＴの 標識化という結果をもたらすが、ｐ１４ＱＭ！Ｔの標識化はもたらさない（図３ Ａ）。還元条件下で、ｐ１４５βのみが標識された（図３Ｂ）。その上、ＧＴＬ −１６タンパク質のウェスタンプロットにおいて、ｐ１４ＱＩＪＥＴは、抗ホス ホチロシン抗体により決して装飾されなかったが、一方、ｐｌ　９　Ｑ　１ｌＥ Ｔは一貫して視覚化された（Ｇｉｏｒｄａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８　） 　、これらのデータは、姓旦１タンパク質の部分切除形態には、インビトロ又は インビボでリン酸化されうるチロシン残基が欠如していることを示唆する。

ａ　、　１４０１′ＥＴ　び　１３０””は　１９０１′Ｅ丁（７）ブローｔ＝ シングによって　しる ｐ１４０”１は、区立１タンパク質の細胞外及び膜貫通ドメインのみをコードす る交互にスプライシングされたｍＲＮＡの翻訳から生じる可能性もあるし、又は 無傷分子の翻訳後プロセシングの結果として生じる可能性もある。実際、４つの 異なる姓旦ニドランスクリプトがＧＴＬ−１６細胞に検出されるが（Ｇｉｏｒｄ ａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ　３３９．　１５５−１５６．　１９８９；　Ｐａｒｋ　ｅｔ　ａ ｌ、、Ｃｅ１ｌ　４５．　８９５−９０４゜１９８６）、そのいずれにも、細胞 質ドメインをコードする領域は欠如していない。

Ｃ末端部分切除区立エタンバク質の起源を調査するため、全長ヒト姓旦ＩＣＤＮ ＡとｐＳＶ２ｎｅｏを用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を同時トランスフェクションし た。６４１８を用いて安定した形質転換体を選択し、牲立１発現について分析し た。陽性細胞のノーザン（ＲＮＡ）プロット分析では、予想されたサイズ（約４ ．３ｋｂ）の単−ｍＲＮＡが検出された。沸とうＬａｅｎ＋ｍｌｉ緩衝液中で細 胞を可溶化し、ウェスタンプロットにより還元条件下でタンパク質を検査した。

Ｍ　ｅ　ｔ　Ｃ末端ペプチドに対する抗体により、１７０　ｋＤａのヒ前駆体及 びｐ１４５β鎖が検出された（図４、レーン１）。

さらに、区立１細胞外ドメインに対して向けられた抗体により、部分切除ｐ８５ ′３のものと一致する抗原特性及び分子量を有する分子が検出された。さらに、 トランスフェクションを受けた細胞の上清中に、これらの抗体により、可溶性ｐ ７５βに匹敵する分子が検出された（図４、レーン３）。トランスフェクション を受けたＮＩＨ３７３細胞においては、部分切除形態１β鎖対無傷姓旦１β鎖の 比率は、ヒトの細胞におけるよりも高いものであった。これらのデータは、牲立 １部分切除形態が全長トランスクリプトに由来することを示している。

１９０””　び　１４０＆ｌｔ’の１）　な全細胞及び細胞表面におけるｐｌ　 ９　ＱＭ！？及びｐ１４ｏｌ″ＥＴの相対量を定量するため、ＧＴＬ−１６細胞 を［３Ｈ］−グルコサミンで標識した。グリコジル化には共通の細胞外ドメイン のみが関与することから、この同位元素を用いると、２つの分子種は同様の効率 で標識されるはずである。細胞表面に露出された分子の選択的免疫沈降を行なっ た（「方法」の項参照）。回収されたタンパク質の量を、全細胞抽出物から免疫 沈降されたものと比較した。図５は、ることを示している（図５、レーン１）。

逆に、全細胞抽出物においては、ｐ８５βはｐ１４５βの１／１０以下であった （図５、レーン２）。抗Ｃ末端Ｍ　Ａ　ｂ　ｓによって、細胞抽出物からのみｐ １４５βが沈降された（図５、レーン５．６）。従って、部分切除形態１形態は 細胞表面に優先的に局在しているという結論を下すことができる。

表面から又は全細胞抽出物から姓旦１タンパク質を沈降させるのに同じ溶解手順 を用いたことから、この実験は、さらに、界面活性剤により誘発される潜在的タ ンパク分解活性は、ｐ８５βの生成において重要な役割を果たしていないことを 表わしている。

１４０”７は　白・に！　されたタンパク　の１　ではない ｐ１９０１″ＥＴのタンパク分解的切断は、細胞抽出の間の内在性プロテアーゼ の活性化により誘発される可能性がある。溶解後のタンパク分解についての内部 対照として、我々は、細胞外ドメインに対して特異的な抗体を用いて、上皮細胞 成長因子レセプターを免疫沈降させた。このレセプターは、ＧＴＬ−１６細胞に おいて発現されており（Ｇｉｌｏｒｄａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８）　、 タンパク分解を受けつるということがわかっている（Ｂａｓｕ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｎａｔｕｒｅ　３１１．４７７−４８０゜１９８４）。図５は、部分切除ｐ１ ４０１″ＥＴが観察された条件下で、表面及び全細胞ライセードの両方から、無 傷の１７５ｋＤａＥＧＦレセプタ一分子のみが沈降されたことを示している。

さらに、区立１タンパク質の部分切除形態が、抽出又は免疫沈降手順の間に導入 されたタンパク分解的崩壊の結果であったということを除外するため、その存在 を、異なるヒトセルラインのウェスタンプロットにおいて直接分析した。これら の実験においては、プロテアーゼ活性を遮断するため、生きた細胞を沸とうＬａ ｅｍｍｌｉ緩衝液で可溶化した。総タンパク質を、非還元条件下の５ＤＳ−ＰＡ ＧＥで分離し、細胞外ドメインに対して向けられたＭＡｂｓで装飾した。ＭＥ工 遺伝子を発現する４つのガン腫セルラインにおいて、ｐ１９０””及びｐ１４０ ＆ＩｔＴの両方の形態が観察された（図６）。

これらのデータは、姓旦１タンパク質の部分切除形態が、生きた細胞において生 理学的条件下で存在することを示唆している。

口　７、口″　１３０”７はｔ立　に　されるＧＴＬ−１６細胞を、５ｓ３−メ チオニンで代謝的に標識し、超遠心分離により清澄にした馴化培地を抗細胞外ド メインＭＡｂｓを用いて沈降させ、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。非還元条件下 で、１３０ｋＤａの見かけの分子量をもつ分子（ｐ　１３０１′Ｅ’）が観察さ れた（図７Ａ、レーン３）。還元されると、この分子はそれぞれ５０ｋＤａ（ｐ 　５０　ａ）と７５ｋＤａ（ｐ　７５　ａ）の２つのサブユニットに解離した（ 図７０、レーン３）。姓！±Ｃ−末端ペプチドに対するＭＡｂｓによっては、同 じ培地からいかなるタンパク質も沈降されなかった（図７Ａ及び７Ｃ、レーン２ ）。肺ガン腫セルラインＡ３４９から集めた上清を用いて、類似の結果が得られ た（図７Ｂ、レーン３）。

ｐ７５β鎮に関して、トリプシンペプチド地図も作製した。これらの実験のため の出発物質としては、　＋ｔｓ■で表面標識された細胞から培地中に放出された ｐｌ　３　Ｑ　ＭＩＴの免疫沈降物を用いた。

還元条件下で実施した５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルから、ｐ７５βを溶出した。図３０ は、標識されたトリプシンペプチドが、ｐ１４５β及びｐ８５βから得られたも のと区別不可能であったことを示している。

可溶性ｐｔ　３０　ＮＥＴには、インビトロで免疫複合体キナーゼ検定によって 評価されるようなキナーゼ活性が欠如している。これらのデータは、培地中に放 出されたＭｅｔ形態がｐ１４５βの細胞質及び膜貫通ドメインを欠いたαβ複合 体であること、及びこの分子の生成はＧＴＬ−１６細胞に制限されないことを示 している。

１３０””はタンパク　プロセスによって　される可溶性ｐ１３０Ｉ′ＥＴが膜 結合性立１タンパク質から由来することを立証するため、以下の実験を行なった 。組織培養プレートに付着するＧＴＬ−１６細胞を、ラクトペルオキシダーゼ法 により　＋２Ｊで表面標識し、さらに４時間培養した。培地を集め、抗細胞外ド メインＭＡｂｓを用いて免疫沈降させた。還元条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析 された免疫沈降物は、可溶性ｐ１３ＱＭＥＴの予想されるサブユニットであるｐ ７５β及びｐ５０ａを生じた（図８、レーン２）。同じＭＡｂｓで処理した対応 する細胞抽出物は、ｐ１４５β、ｐ８５β及びｐ５０ａを生じた（図８、レ−： ／３）。

使用した。これらの抗体は、培地からはいかなるタンパク質も沈降させず（図８ 、レーン１）、細胞抽出物からは無傷のｐ１４５β鎖及びｐ５０ａ鎖のみを沈降 させた（図８、レーン４）。これらの路中に可溶性社立１タンパク質が放出され ることを実証している。

１３０”１の　はＴＰＡ　によ　口き・　されるｐ１３０ｔｉｔｔの放出が生き た細胞内で調整されつるか否かを調査するため、タンパク質キナーゼＣをＴＰＡ 処理によって活性化した。［３ＳＳ］メチオニンで代謝的に標識したＧＴＬ−１ ６細胞を、１６０ｎＭＴＰＡにより２時間刺激した。次に、細胞抽出物及び上清 を採取し、超遠心分離し、社主１細飽外ドメインに対するＭＡｂｓを用いて沈降 させた。還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥにより免疫沈降物を分析した。ＴＰＡ 処理の後、組織培養土清中に検出されたｐ７５βの量は、対照レベルと比較して 著しく増加した（図９Ａ）。総細胞ｐ１４５β及びｐ８５βの量は、見かけ上影 響を受けなかった（図９Ｂ）。細胞表面に露出された区立１タンパク質に対する ＴＰＡの効果を分析するため、ＧＴＬ−１６細胞をＴＰＡで処理し、次に、免疫 沈降に先立ってラクトペルオキシダーゼにより１２５Ｉで標識した。表面標識さ れた性立１タンパク質のみを考慮した場合、ｐ８５βの量は、ＴＰＡ処理の後に 著しく減少した。

ｐ１４５βは、ｐ８５βはど影響を受けなかった（図９Ｃ）。従って、タンパク 質キナーゼＣ活性化が、膜に結合したｐｌ　４　Ｑ　ＭＥＴ及びｐ１９０”７形 態のタンパク分解的プロセシングを刺激することにより、細胞外ｐｌ　３　ＱＭ ＥＴの放出を上向き調節するという結論が下される。

凱ｌ 佳社旦方伝 区系 ［ｙ−”Ｐ］　ＡＴＰ　（比活性：　７　、　ＯＯＯＣＬ　ｍｍｏＩ−’　）及 び［＋１−　Ｉ　］プロティンＡは、Ａｍｅｒｓｈａｍから入手した。　”’Ｉ −ＨＧＦは、Ｎａ１ｄｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１，ＥＭＢＯＪ、、　１ ０．２８６７−２８７８）により記載されているように調製した。簡単に言うと 、担体無しのＮａ１２１′■（２ｍＣ１）及びヨードゲン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用 いて、純ＨＧＦ（ｔｕｇ）を放射能標識した。クロロホルム中、１００μｇ　／ 　ｗｄ！のヨードゲン２００μｌを、窒素流の下で、ポリプロピレンのバイアル 中で乾燥した。次に、０．２５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．４中のＨＧＦ及び１ ２Ｊを添加した。４℃で１５分間反応を進行させ、その後、別のバイアルへ混合 物を移し、１０分間氷上に置いた。担体ＢＳＡを、ｐＨ７，４に緩衝された０、 ４Ｍ　ＮａＣｆｆ、Ｏ，１％ＣＨＡＰＳ、２０ｍＭＰＯ４中、０．１％の最終濃 度まで添加し、同じ緩衝液で予め平衡化したＩＷｄ！のヘパリン−セファロース カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）上でのアフィニティクロマトグラフィにより、標識され たリガンドを、遊離Ｎａ１２！ｌｉから分画した。充分に洗浄した後、同じ緩衝 液中の１．３ＭＮａＣρを用いてカラムを溶出し、０．５−の画分を収集した。

ＴＣＡで沈降可能な放射能を含む画分をプールして、２０ｋｄの膜カットオフの Ｃｅｎｔｒｉｓａｒｔ　（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓｌダイアフィルトレージョン装置 を用いて濃縮し、４℃で保存した。トレーサーの比活性は約８　ｘ　１０　’Ｃ ＰＭ／ｐｇ　（５、７００Ｃｉ／ｍｍｏｉ’ｅｌであり、これは工／ＨＧＦモル 比が約３／ｌであることに相当する。従って、この調製物は、有意な量の標識さ れていない分子を含んでいなかった。

レンチルレクチンセファロース及びセファロースプロティンＡは、Ｐｈａｒｍａ ｃｉａからのものであった。トリトンＸ−１ｏｏはＦｌｕｋａからのものであっ た。

縄胞 使用したセルラインは、例１に記されているとおりＧＴＬ−１６セルラインであ った。細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｆｌｏｗ）を含むＲＰＭ１１６４０培地（ Ｆｌｏｗ）中で培養し、５％ＣＯ，を含む加湿された大気中、３７℃で維持した 。

■体 ホスホチロシン抗体は、ｐ−アミノ−ベンゼン−ホスホネートに対して産生させ 、前述のとおりアフィニティ精製した（Ｃｏｍｏｇｌｉ。

蛙ａ１．．１９８４．　ＥＭＢＯＪ、、旦、　４８３−４８９）。ポリクローナ ル抗区立１血清は、予測された区立ユ遺伝子産物のＣ末端におけるアミノ酸配列 に相当する合成ペプチドＶＤＴＲＰＡＳＦＷＥＴＳに対して免疫したウサギにお いて産生させた。琶旦１タンパク質の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗 体ＤＮ−３０、ＤＮ−３１及びＤＯ−２４は、生きたＧＴＬ−１６細胞全体で免 疫した後のマウスにおいて得られた。

モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈降及びプロティンへ−セファロース ４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）上でのアフ ィニティクロマトグラフィにより、腹水から精製した。精製したＤｏ−２４ＭＡ ｂを、クロラミンＴ手順により２〜４ｍＣ１／ｍｇりンパク質の比活性でｌ！Ｊ 標識した。

１３０”７の。　・　１ ＧＴＬ−１６集密的（コンフルエント）培養から血清を含まない馴化培地を回収 し、５０，０００Ｋｇで超遠心分離し、Ａｍ１ｃｏｎフイルター（１００Ｋ）で １０倍濃縮した（原液）。精製は、レンチルレクチンセファロースカラム上での アフィニティクロマトグラフィにより行なった。４℃で２時間後、カラムをＲＰ ＭＩ培地で数回洗浄し、糖タンパク質を、０．２Ｍα−メチル−Ｄ−マンノシド （Ｆｌｕｋａｌを含むＲＰＭＩで溶出した。ＲＰＭＩに対し一晩透析した後、ア フィニティクロマトグラフィで精製した材料の一部分から、セファロ−スーブロ チインＡ上に不溶化されたＭＡｂＤＮ−３１上での完全吸着により、ｐｌ　３　 Ｑ　ＭＥＴを枯渇させた。この材料を、陰性対照として用いた。部分的に精製さ れたｐｌ　３　Ｑ　ＩＩＥＴを、０．４０、Ｄ、単位（２８０ｎｍ）を含むタン パク質濃度で標準化した。糖タンパク質を、−２０℃で保存した。

二　ｉ’　ＤＤＩＡ Ｄ　Ｎ　−３０Ｍ　ａ　ｂでコーティングし、ＢＳＡで飽和させた９６ウエルＥ ＬＩＳＡプレート（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓ５ａｙ−Ｐｌａｔｅ 、　ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オランダ）を、異なる濃度の部分的に 精製されたｐ１３０”７及び放射能標識されたＨＧＦを用いて４℃で一晩インキ ユベートした。ｐ１３ＱＭＥＴの量を評価するよう開発されたＤＤＩＡにおいて は、Ｕ旦１タンパク質の細胞外ドメインの異なるエピトープに対して向けられた ２つのＭａｂｓを使用した。精製されたＤＮ−３０Ｍａｂｓを、９６ウエルＥＬ ＩＳＡプレート上に吸着させ、次にプレートを飽和させ、ＧＴＬ−１６細胞培養 から回収した異なる濃度の粗上清を添加した。トレーサーとして利用した放射能 標識されたＤｏ−２４ＭＡｂにより、結合を明らかにした。次に、プレートを充 分に洗浄し、結合した放射能を沸とうさせた１％ＳＤＳで溶出して、ガンマカウ ンター（Ａｕｔｏ−ｇａｍｍａ、　Ｐａｃｋａｒｄ）でカウントした。

ゝ　びインビトロ　リン ＧＴＬ−１６細胞を氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、ＤＩＭ緩衝液（１０ｍＭ　Ｐ ｉｐｅｓ、　ｐＨ６、８，１００ｍＭＮａｃ１２．５　ｍＭＭ　ｇ　ＣＥｌ　ｔ 、３００ｍＭショ糖、５ｍＭＥＧＴＡ）に１％トリトンＸ−１００及びプロテア ーゼ阻害剤の混合物を加えたものの中で溶解させた。細胞ライセードを、４℃で ３０分間、１０．ＯＯＯｒｐｍで遠心分離し、セファロ−スープロチインＡにカ ップリングさせた抗−Ｕミニ血清を用いてインキュベートした。結合したタンパ ク質を、ＤＩＭ緩衝液で数回洗浄し、ｐ１３ＱＭＥＴを枯渇させた又は枯渇させ ていないＧＴＬ−１６上清のレンチルレクチン溶出物の異なる希釈溶液６０μノ を用いて、室温で５分間インキュベートした。キナーゼ反応は、氷上で２分間行 なった。１試料当りｌＯμＣＬの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを、最終濃度１００μＭ の標識されていないＡＴＰで希釈した。１０ｍＭＥＤＴＡ及び１００　ｇＭ　Ｎ 　ａｓ　ＶＯ４を含むトリス緩衝生理食塩溶液１　ｄを用いて、キナーゼ反応を 停止した。短い遠心分離の後、タンパク質な、沸とうＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中に 溶出させ、８％の５ＤＳ−ＰＡＧＥに付し、続いて増感用スクリーンを用いて一 ８０℃で１２時間オートラジオグラフィに付した。ｐ１４５”７β−サブユニッ トに取り込まれたリン酸の相対量は、レーザーデンシトメーター（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ　ＬＫＢ　２２０２　Ｕｌｔｒｏｓｃａｎ）を用いて相当するオートラジ オグラフィバンドの光学密度を測定することによって見ＧＴＬ−１６細胞の細胞 単層を、氷冷したリン酸緩衝生理食塩溶液で２回洗浄し、細胞を沸とうＬａｅｍ ｍｌｉ緩衝？？！（Ｌａｅｍ＋ｎｌｉ、　Ｕ、に、。

１９７０、　Ｎａｔｕｒｅ　２３０．６８０−６８５）中で可溶化した。３００ μｇ／ウェルのタンパク質濃度に試料を調整し、８％の５ＤＳ−ＰＡＧＥを実施 し、ニトロセルロースシート上にトランスファーした。別途に詳しく記されてい るように（Ｄｉ　Ｒｅｎｚｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５８．３８３−３９１）、プロットを、まず１０ｕｇＷ ｄ！−’の精製されたＰ−Ｔｙｒ抗体、次に［＋２１　ｒ　］で標識されたプロ ティンＡで探査した。フィルターを、増感用スクリーンを用いて一７０℃で２４ 時間オートラジオグラフィに付した。レーザーデンシトメーターで相当するオー トラジオグラフィバンドの光学密度を測定することにより、ｐ１４５”１βサブ ユニツトに取り込まれたホスホチロシンの相対量を見積った。

■ ＨＧＦは　１３０１′ＥＴに１人する 図１０は、特異的抗体でコーティングされたマイクロタイターウェル上に不溶化 された増大する量の可溶性部分切除ｐ１３０”７が、放射能標識されたＨＧＦに 結合することを示している。この結合は、可鮨和性で、かつ用量依存性である。

１３０ＭＩ！ＴによるＭＥＴ　ＨＧＦレセプターのインビボチロシＺ匹ｚ奴北五 皿Ｉ ＧＴＬ−１６細胞は、インビボで構成的にチロシン上でリン酸化されるβサブユ ニット（ｐ１４５）をもつＨＧＦレセプターを大量に発現する。このことは、イ オン性界面活性剤で可溶化され、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析され、Ｐ−Ｔｙｒ抗体 で探査された総細胞タンパク質のウェスタンプロットによって評価することがで きる（図１１、Ａ）。レンチル−レクチンで精製されたｐｌ　３　Ｑ　ＭＥＴで １０分間これらの細胞を処理することにより、ＨＧ　Ｆ／Ｓ　Ｆレセプターのチ ロシンリン酸化の３０％減少が誘発された（図１１、Ｂ）。

１３ＱＭｔＴによるＭｅｔ　ＨＧＦレセブ　−のインビトロでのチロシンキナー ゼ２　の１ ＨＧＦレセプターを、該タンパク質のＣ末端配列から誘導された合成ペプチドに 対して向けられた抗血清を用いて、ＧＴＬ−１６細胞から免疫沈降させた。キナ ーゼ検定に先立って免疫複合体を用いてインキュベートされたｐ１３ＱＩｌｌＥ Ｔは、無傷のレセプターβサブユニットの自己リン酸化を、用量依存的に阻害し た（ｐ１４５”０；図１２、Ｂ）。ｐｌ　３　Ｑ　ＩＩＥＴを枯渇させた同濃度 のレンチル−レクチン溶出物では、わずかな阻害効果しか測定されなかった（図 １２、Ａ）。

ＤＤＩＡによるｐ′″’＋　１３ＯＮＥＴの異なるエピトープを認識するＭＡｂ ｓのタンデムを用いる固相二重抗原決定基免疫検定により、ｐｌ　３　Ｑ　１１ ｔＴを定量的に評価することができる。図１３は、ＧＴＬ−１６細胞から組織培 養培地中に放出されたｐ１３０１″ＥＴを用いて得られた標準的な結合曲線を示 す。

この結合は、可飽和性、用量依存性であり、特異的である。

１２３４　１２３４　ＭＷ　１２ 八　Ｂ　Ｃ ＣＴ　ＣＴ　ＣＴ ［−コ　「−−］「−コ 希　釈−１ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成５年１１月１０日

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．それぞれ５０ｋＤａと７５又は８５ｋＤａの２つのジスルフィド結合された 鎖で構成されるタンパク質であって、該５０ｋＤａの鎖がＭＥＴガン原遺伝子に よってコードされるチロシンキナーゼのα鎖であり、該７５又は８５ｋＤａ鎖が 該チロシンキナーゼのβ鎖のＣ末端部分切除形態であるタンパク質。
2. ２．β鎖のＣ末端部分切除形態が７５ｋＤａの鎖である、請求の範囲第１項に記 載のタンパク質の調製方法において、（ｉ）ＭＥＴ遺伝子を発現する細胞を、そ の細胞用の培地中で培養する工程； （ｉｉ）結果として得られた馴化培地を、ＭＥＴ遺伝子によってコードされるチ ロシンキナーゼのβ鎖の細胞外ドメインに特異的な抗体と接触させる工程；及び （ｉｉｉ）結果として得られた免疫複合体から、前記タンパク質を放出させる工 程、 を含む方法。
3. ３．β鎖のＣ末端部分切除形態が８５ｋＤａの鎖である、請求の範囲第１項に記 載のタンパク質の調製方法において、（ｉ）ＭＥＴ遺伝子を発現する細胞を、界 面活性剤を用いて抽出する工程、 （ｉｉ）該抽出物を、ＭＥＴ遺伝子によってコードされるチロシンキナーゼのβ 鎖の細胞外ドメインに特異的な抗体と接触させる工程；及び （ｉｉｉ）結果として得られた免疫複合体から、前記タンパク質を放出させる工 程、 を含む方法。
4. ４．有効成分として請求の範囲第１項に記載のタンパク質を、薬学的に許容可能 な担体又は希釈剤と共に含む薬学的組成物。