JPH09505985A

JPH09505985A - メロシンをコードする核酸、メロシン断片およびその使用

Info

Publication number: JPH09505985A
Application number: JP7509932A
Authority: JP
Inventors: エングバル，エバ; レイボ，イルモ
Original assignee: ラホヤキャンサーリサーチファウンデイション
Priority date: 1993-09-22
Filing date: 1994-09-21
Publication date: 1997-06-17
Also published as: WO1995008628A2; AU7877094A; CA2172385A1; US5837496A; US5872231A; WO1995008628A3; EP0720651A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、タンパク質のサブユニットをコードする単離された核酸分子を提供し、このタンパク質は約８００ｋＤの見掛けの分子量を有し、メロシンと称される。また、メロシン断片をコードする単離された核酸分子も提供する。抗メロシン抗体、メロシンの組換体産生のためのベクター、および宿主ベクター系の使用による組換えタンパク質の発現もまた提供する。さらに、本発明は、軸索成長を促進するための、および特定診断用途のためのメロシンの使用を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】メロシンをコードする核酸、メロシン断片およびその使用本発明は、国立衛生研究所からの補助金DK30051、CA45546、CA28896および癌センター補助金許可番号CA30199を受けた。合衆国政府は本発明において特定の権利を有し得る。発明の背景本発明は一般に基底膜、特に新規な組織特異的基底膜関連タンパク質に関する。基底膜は、下層組織支質から上皮細胞を分ける細胞外マトリックスの薄いシート(sheet)である。基底膜は上皮器官および内皮器官を区画化し、そして組織構造を維持する。特定の組織では、基底膜はいくつかの細胞型の相互作用の産物である；例えば、糸球体基底膜は上皮細胞および内皮細胞双方から作られる。骨格筋では、筋内膜由来の繊維芽細胞が、基底膜のアセンブリに対してＩＶ型コラーゲンを与える。神経基底板の形成には、シュワン細胞およびニューロンの相互作用を要する。さらに、基底膜は、細胞の付着、移動および増殖を促進することによって、また組織相互作用のためのシグナルを媒介することによって、発育および組織修復で機能する。全ての基底膜はラミニン、ＩＶ型コラーゲン、エンタクチンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカンを含有する。ラミニンは３つのポリペプチド鎖、４００ｋＤのＡ鎖および各々２００ｋＤの２つのＢ鎖よりなる大きな糖タンパク質である。Ａ鎖のアミノ末端の２／３はＢ１およびＢ２鎖に相同であり、その一方、カルボキシ末端の１／３は区別される構造を有する。最近の研究では、いくつかの遺伝学的に区別されるサブユニット鎖およびその結果としてのいくつかのラミニンのイソ形態が存在することを明らかにした。ＥＨＳラミニン鎖Ａ、Ｂ１およびＢ２の他に、メロシン（ラミニンＭ鎖としても知られている）（Ａ鎖の相同体）(Leivoら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:1544 -1548(1988); Ehrigら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:3264-3268(1990))、ｓ −ラミニン（Ｓ鎖）（Ｂ１鎖の相同体）（Hunterら、Nature 338：229-234(19 89)）およびＢ２ｔ（Ｂ２鎖の短縮形相同体）（Kallunkiら、J．Cell Biol. 119 :679-693(1992))が特徴付けられている。最近、鳥類の眼におけるもう１つのＢ１鎖変異体の部分配列が報告された(O'Rearら、J．Biol．Chem. 267:20555-2055 7(1992))。Ｋ−ラミニンおよびカリニンは、上皮細胞基底膜に存在するラミニンのイソ形態である。Ｋ−ラミニンはＢ１およびＢ２鎖を含有し、Ａ鎖とは免疫学的に区別される第３の１９０ｋＤ鎖を有する(Marinkovichら、J．Cell Biol. 11 9:695-703(1992))。カリニンは３つのサブユニットを有し、そのうち最大のサブユニットはＫ−ラミニンの１つの鎖に免疫学的に関連している(Rouselleら、J． Cell Biol. 114:567-576(1991); Marinkovichら、J．Biol．Chem. 267:17900-17 906(1992))。ラミニンの用語については、本明細書に参考として援用されるEngv all，1993，Kidney International 43:2-6、および図１３を参照されたい。ラミニンは種々の細胞型の付着、拡散、移動および増殖を促進する。ラミニンの最も顕著な特徴の１つは、培養ニューロン細胞からの軸索の外殖（outgrowth ）を促進するその能力である。細胞接着の主要部位および軸索−促進活性はこの分子の長いアームの末端における球状ドメインに存在するようである。特定の腫瘍細胞の転移性性質もラミニンによって影響され得る。例えば、ラミニンは悪性癌腫細胞のＩＶ型コラーゲンへの付着を媒介し、そしてネズミ黒色腫細胞の転移能を増大させることが示されている。血管および他の上皮細胞組織の基底膜への転移性腫瘍細胞の接着には他の基底膜タンパク質およびそれらのレセプターが関与し得る。発生、組織修復、軸索成長および癌における基底膜の重要な役割のため、新しい基底膜成分を同定する必要性が存在する。本発明はこの要求を満足させる。発明の要旨本発明は、タンパク質メロシンの３８０〜４００ＫＤａサブユニットをコードする単離された核酸分子を提供する。また、メロシン断片をコードする単離された核酸分子を提供する。本発明は、さらに、抗体、ベクター、および宿主／ベクター系の使用による組換えタンパク質の発現を提供する。また、本発明は、軸索成長を促進するためのメロシンの使用を提供する。図面の簡単な説明図１は、部分的なメロシンポリペプチドｃＤＮＡのＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。可能なＮ−グリコシル化部位を（▲）によって示し、そしてシステインは丸で囲む。アミノ酸配列決定によって得られた配列には下線を施す。アミノ酸配列の保存されたモチーフは長方形で囲む。図２は、ドットマトリックスブロッティングによる、メロシン断片およびマウス・ラミニンＡ鎖のＣＯＯＨ末端部分のアミノ酸配列の比較を示す。配列は、Mi cro Genieマトリックス比較プログラムを用いて比較した。フレームは、４０％の最小照合（minimal match）にて、８アミノ酸に設定した。図３は、抗血清を用いた胎盤抽出物のイムノブロッティングを示す。胎盤のNa DodSO₄抽出物（レーン１）および胎盤のペプシン消化物由来のメロシンポリペプチドの精製断片（レーン２）をNaDodSO₄の存在下、２〜１６％グラジエントのアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そしてニトロセルロースに移した。（ａ）におけるブロットは、図１におけるメロシンポリペプチドの残基４７６−４８８に対応する１３アミノ酸ペプチドに対して惹起されたペプチド抗血清で染色した。（ｂ）におけるブロットは、メロシンポリペプチドのＣＯＯＨ末端断片を認識するモノクローナル抗体で染色した。比較のため、マウス・ラミニンのブロットを抗−ラミニンで染色した（ｃ）。矢の先は分離ゲルの先端部分を示し、数字（ＫＤａ）は分子量マーカーの位置を示す。図４Ａ〜Ｃは、胎盤からの無傷（intact）メロシンの分析を示す。図４Ａ：ラット・ラミニンのNaDodSO₄−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（レーン１）およびヒト胎盤からのメロシン含有画分（レーン２）。分子量マーカーの部分は左側に示す。図４Ｂ：メロシン含有調製物のロータリーシャドウイング後の電子顕微鏡写真。図４Ｃ：メロシン含有調製物で被覆したマイクロタイターウェルにおける、およびラミニンの大きなペプシン断片で被覆したウェルにおけるＥＬＩＳＡ。抗体は３Ｅ５（■；抗−Ｂ１）、２Ｅ８（●；抗−Ｂ２）、１１Ｄ５（△；抗 −Ａ）、および２Ｇ９（▲；抗−メロシン）であった。図５は、ヒト・メロシンポリペプチド（「ラミニンＭ鎖］）についてのｃＤＮＡクローンの配列の相対的位置、部分的制限地図およびメロシンサブユニットタンパク質のドメイン構造を示す。上部においては、５つの重複するｃＤＮＡクローンの配置およびメロシンｃＤＮＡの部分的制限地図を示す。ＡＴＧは翻訳開始シグナルを示し、そしてＴＧＡは３’末端翻訳終始コドンを示す。制限酵素部位ＥｃｏＲＩ（Ｅ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）およびＰｓｔＩ（ｐ）が示される。中央では、本明細書に参考として援用されるSasakiら、Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 84: 935-939(1987); Sasakiら、J．Biol．Chem．263:16536-16544(1988); Sa sakiら、J．Biol．Chem．262:17111-17117(1987)に準じてナンバリングしたドメインを有するタンパク質構造を示す。ドメインＧにおける５つの内部反復をハッチングを施した長方形によって示す。システインが豊富なＥＧＦモジュールよりなるドメインＩＩＩａ、ＩＩＩｂおよびＶは影を付した長方形によって示す。底部には、アミノ酸（ａａ）のスケールを示す。図６は、ヒト・メロシンｃＤＮＡクローンの完全ヌクレオチド配列および全長タンパク質の推定の完全アミノ酸配列を示す。第１行目、本実験で特徴付けしたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列。第２行目、先に決定されたカルボキシル末端アミノ酸配列（本明細書に参考として援用されるEhrigら、Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 87:3264-3268(1990)）と共に上記ｃＤＮＡクローンからの推定アミノ酸配列。推定のシグナルペプチダーゼ切断部位は三角で示し、システイン残基は丸で囲み、そしてアスパラギン連結オリゴ糖についての可能な付着部位は長方形で囲む。図７は、ヒト・ラミニン型タンパク質のＭ（メロシン）およびＡ鎖のアミノ酸配列を並べたものである。上側の行はメロシンのアミノ酸配列を示し、そして第２行はラミニンＡ鎖のアミノ酸配列を示す。両方のアミノ酸配列はイニシエーターのメチオニンから番号付けられている。全てのシステインは丸で囲み、そしてＮ−グリコシル化部位には下線を施す。構造ドメインは長方形で囲み、右側にローマ数字で示す。ＳＰ＝シグナルペプチドである。図８は、メロシンをコードする配列の染色体位置を示す。染色体６のイディオグラムはその染色体上におけるシグナルの分布およびメロシン遺伝子の６ｑ２２ →２３への割当を示す。図９は、１７週齢ヒト胎児組織におけるメロシンおよびラミニンＡ鎖ｍＲＮＡの発現を示す。全ＲＮＡ（〜１０μｇ）を含有するGene Screen Plusフィルターを調製し、後記実施例Ｖに記載したようにハイブリダイズさせた。フィルターの臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）染色（底部）は各レーンにおけるＲＮＡの相対的量を示す。図１０Ａ〜図１０Ｈは、１７週齢胎児組織におけるメロシンｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションを示す。腎臓において（図１０ＡおよびＢ）、シグナルは、外部皮質における凝縮（condensing）前尿細管細胞および尿管由来細管（ｔ）に隣接する間葉細胞で観察される。ネフロンにおける分泌細管および血管は陰性である。心筋において（図１０ＣおよびＤ）、シグナルは、筋肉全体の心筋細胞で観察され得る。皮膚のセクションにおいては（図１０ＥおよびＦ）、表皮（ｅ）の上皮細胞で細粒子は観察されず、他方、凝縮乳頭状間葉細胞（ｐ）および発育する毛小包（ｆ）で強いシグナルが観察され得る。肺においては（図１０ＧおよびＨ）、気管支周囲動脈壁の平滑筋細胞にシグナルが存在するが、肺胞および気管支細胞は陰性である。棒線Ａ〜Ｄは２００μｍ、およびＥ〜Ｈは１００μｍである。図１１は、既知のヒトＡおよびＢ型ラミニン鎖、ラットＳ鎖、マウスＡ鎖およびショウジョウバエＡ鎖のドメインＶＩの並べたものである。鎖の半分において同一であるアミノ酸には影を付し、そして濃い影は保存された変化Ｐｈｅ（Ｆ）＜−＞Ｔｙｒ（Ｙ）を示す。略号：Ｂ１、ヒトＢ１鎖；Ｓ、ラットＳ鎖；Ａ、ヒトＡ鎖；ｍＡ、マウスＡ鎖；Ｍ、ヒトＭ鎖：Ｂ２、ヒトＢ２鎖；ｄＡ、ショウジョウバエＡ鎖。図１２は、既知のヒトＡおよびＢ型鎖、ラットＳ鎖、マウスＡ鎖およびショウジョウバエＡ鎖のドメインＶを並べたものである。鎖の半分において同一であるアミノ酸には影を付し、そして濃い影は保存された変化Ｐｈｅ（Ｆ）＜−＞Ｔｙｒ（Ｙ）を示す。略号：Ｂ１、ヒトＢ１鎖；Ｓ、ラットＳ鎖；Ａ、ヒトＡ鎖；ｍＡ、マウスＡ鎖；Ｍ、ヒトＭ鎖；Ｂ２、ヒトＢ２鎖；ｄＡ、ショウジョウバエＡ鎖。図１３は、ラミニンの構造の模式図である。発明の詳細な説明本発明は、構造的にラミニンに関連するヒトのメロシンタンパク質の主要サブユニットをコードするｃＤＮＡ分子を提供する。メロシンタンパク質は約８００ｋｄの見掛けの分子量を有し、３００、２００、２００および８０ｋＤの見掛けの分子量を有する４つのポリペプチドよりなり、上記３００ｋＤポリペプチドはジスルフィド結合によって該２００ｋＤポリペプチドに結合しており、そして上記３００ｋＤポリペプチドおよび上記８０ｋＤポリペプチドは図６に示したアミノ酸配列を実質的に有する３８０〜４００ｋＤａのメロシンサブユニットを含む。メロシンは、他の組織のうちとりわけ、胎盤、横紋筋、末梢神経、栄養膜およびヒト・シュワン細胞新生物に見い出される。本明細書に参考として援用されるLeivoら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:1 544-1548(1988)は、基底膜関連ポリペプチドメロシンの６５ＫＤａおよび８０ＫＤａセグメントの単離を記載している。これらの２つの前駆体セグメント、完全長メロシンポリペプチド、メロシンポリペプチドの断片、およびこれらのセグメント、ポリペプチドまたは断片の任意を含むタンパク質もメロシンと呼ばれる。６５ＫＤａおよび８０ＫＤａタンパク質は、８００ＫＤａタンパク質複合体内に含有される３８０〜４００ＫＤａメロシンポリペプチドのセグメントであるようなので、メロシンなる用語は本明細書に記載される上記８００ＫＤａタンパク質にも適用される。３８０〜４００ＫＤａサブユニットは、メロシンポリペプチド、メロシンサブユニット、Ｍ鎖、またはラミニンＭ鎖と称される。その生物学的機能を破壊することなく、メロシンサブユニットの一次配列に、限定的な改変がなされ得、また、全一次構造の一部分のみが活性を実現するために必要であり得ることが理解される。１つのそのような生物学的に活性な断片は、図１に示される配列を実質的に有する分子である。本発明の別の実施態様において、メロシンサブユニットは、図６に示された配列と実質的に同様のアミノ酸配列を有する。タンパク質の活性を破壊しないこれらの配列のマイナーな改変は、メロシンの定義内、およびそのように特許請求の範囲に記載されるタンパク質の定義内に入る。さらに、以下の実施例ＩＩに記載されるメロシン活性アッセイによって測定されたとき、またメロシン−特異的抗体を惹起するタンパク質の能力によって定義されるように、完全なタンパク質の機能を保持する、図１または６の配列の断片がこの定義内に含まれ、先に記載した８０Ｋｄ断片のみからなる断片は含まれない。一次アミノ酸配列のマイナーな改変の修飾の結果、図１または６に記載した配列と比較して、実質的に同等または増強された機能を有するタンパク質が得られ得ることが理解される。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発、またはメロシンアナログの合成により行われるように意図的であり得るか、あるいは、メロシンの産生者である宿主における突然変異によるごとく偶然であり得る。全てのこれらの改変、メロシンの生物学的機能が保持される限り含まれる。図１および６に示された核酸配列は、組換えメロシンおよびメロシン断片の産生に有用である。少なくとも１０のヌクレオチドの核酸断片はハイブリダイゼーションプローブとしても有用である。このプローブは、染色体６ｑ２２−＞２３に位置決めされたメロシンをコードするゲノム遺伝子を単離ために（以下により詳細に記載されるように）組織を同定するのに、あるいはメロシン様タンパク質をコードする核酸を同定するために有用である。単離された核酸断片もまた、新規ペプチドを生成するために有用である。これらのペプチドはまた、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生成のための免疫原として有用である。上記プローブおよび免疫原を調製し使用する方法は当該分野でよく知られており、そして以下に要約して記載される。また、本発明の範囲内には、核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子が含まれる。その配列は図１および６に示される。そのようなハイブリダイズする核酸分子またはプローブは、例えば、図１または６の核酸分子のニックトランスレーションによって調製し得、その場合、ハイブリダイズする核酸分子は、その分子のランダム断片であり得、その配列は図１および６に示される。このような断片の調製方法については、本明細書に参考として援用されるSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y．(1989)を参照されたい。本明細書で用いる用語「核酸」は、一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを意味する。さらに、種々の分子、例えば、他のタンパク質、炭水化物、または脂質を、メロシンサブユニットに結合させ得る。このような改変はメロシンの定義内に含まれる。メロシンの状態を記載するために使用する場合、用語「精製された」は、そのネイティブな環境においてメロシンに通常会合した、あるいはメロシンと共に存在する他のタンパク質および分子の部分を含まないタンパク質を示す。本明細書で用いる用語「ネイティブ」は、天然から単離されている、または意図したアミノ酸置換の無い、タンパク質、ポリペプチド、抗体またはその断片形態をいう。本明細書で用いられる用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、抗原を用いた免疫化に応答して産生され、そしてこの抗原と特異的に反応するタンパク質をいう。これには、ポリクローナルならびにモノクローナル抗体が含まれる。ヒトおよび哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギおよびヤギがこの定義に含ませる意図である。産生される最も優勢なヒト抗体はＩｇＧイソタイプであり、ジスルフィド結合によって連結された２つの軽鎖および２つの重鎖を有し、全血清抗体の約８０％を構成する。また、本明細書で用いる用語「抗体」は、抗体の断片を含む。抗体の断片は、その抗原と選択的に結合する少なくともいくらかの能力を保持している。また、本発明は、対応するネイティブ抗体の抗原に結合する能力を保持する、組換えによりまたは化学的に合成された抗体断片が含まれる。抗原またはハプテンと結合する能力は、抗体捕獲アッセイ(例えば、HarlowおよびLane、Antibodies，A Lab oratory Manual 、Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.( 1988)参照)のような当該分野で公知の抗原−結合アッセイによって測定される。いくらかの結合親和性を保持する抗体断片は、限定されるものではないが、Ｆａｂ（酵素パパインを用いた消化によってインタクトの軽鎖および１つの重鎖の一部分を生ずることにより産生された抗体分子の一価の抗原結合性断片を含有する断片）；Ｆａｂ’（ペプシンを用いて処理し、続いて還元して、インタクトの軽鎖および重鎖の一部分を生ずることによって得られた抗体分子の断片；抗体１分子当たり２つのＦａｂ’断片が得られる）；（Ｆａｂ’）₂、引き続いて還元することなく酵素ペプシンを用いて処理することによって得られた抗体の断片；Ｆ (ａｂ’)₂は２つのジスルフィド結合によって一緒に保持された２つのＦａｂ’ 断片のダイマーである；Ｆｖおよび一本鎖抗体（ＳＣＡ）を含む。メロシンをコードする核酸の状態を記載するために用いる場合、用語「単離された」は、ネイティブな環境にある核酸に会合した、または核酸と共に存在する分子の少なくとも一部分を含まない核酸を示す。「組換え発現ベクター」は、そこに含まれるＤＮＡ配列を発現し得るベクターを含み、ここでこのような配列は、それらの発現を行い得る他の配列に作動可能に連結している。常に明示的には記載されないが、これらの発現ベクターは、エピソームとして、あるいは染色体ＤＮＡの組み込まれた一部として宿主生物中で複製可能でなければならないことを意味する。要するに、「発現ベクター」には機能的定義が与えられ、そしてその中に配置された特定のＤＮＡ配列の発現を行い得る任意のＤＮＡ配列が、それが特定の配列に適用される場合、この用語に含まれる。一般に、組換えＤＮＡ技術で利用される発現ベクターは、しばしば、そのベクター形態では染色体に結合しない環状二本鎖ＤＮＡループをいう「プラスミド」の形態である。本明細書においては、プラスミドがベクターの最も通常に使用される形態であるので、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に使用される。しかしながら、本発明は、同等の機能を発揮し、引き続いて当該分野で公知となるような発現ベクターの他の形態を含むことが意図される。「宿主−ベクター系」とは、組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターでトランスフェクトされた細胞をいう。本明細書で開示されるベクターおよび方法は、広範囲の真核生物および原核生物にわたる宿主細胞中における使用に適する。本発明に含まれる、基本的技術を実施するための定義、方法および手段を含む分子生物学の標準的テキストを参考として援用する。例えば、Maniatisら、Mole cular Cloning: A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory，New Y ork(1982)およびSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1989)およびそこで引用されている種々の参照文献を参照されたい。この参照文献および引用された出版物は、特に、本明細書に参考として援用される。さらに、当業者によって現在使用されている組換えＤＮＡ法は、ＤＮＡ配列の容易な再生を可能とする、オリゴヌクレオチドの合成と組み合わせたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。ＰＣＲの手段により、単一の遺伝子コピーのような少量から出発して、長さが約６０００塩基対までのＤＮＡセグメントを指数関数的に増幅し得る。この技術では、新しい相補鎖のＤＮＡポリメラーゼに依存した合成を指令する２つのオリゴヌクレオチドプライマーと共に、変性したＤＮＡ試料をインキュベートする。複数サイクルの合成は、それぞれ、標的配列量のほぼ２倍化を与える。各サイクルは、温度を変化させて制御され、ＤＮＡ鎖の変性を行い、プライマーをアニールし、そして新しいＤＮＡ鎖を合成する。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用すると、各サイクルで新しい酵素を添加する必要がなく、従って、完全に自動化されたＤＮＡ増幅が可能となる。２５回の増幅サイクルで、標的配列の量を約１０⁶倍に増加させる。このＰＣＲ技術は、全てが本明細書に参考として援用される米国特許第４,６８３,１９５号、第４,８００,１５９号、第４,７５４,０６５号、および第４,６８３,２０２号の主題である。本出願に関し、図１または６に示されたｃＤＮＡ、またはそれらの任意の部分は、所望の配列をＰＣＲを用いて増幅し、それを当該分野で周知の適切なベクター中にクローン化することによってクローニングおよび発現目的のために再生され得る。細胞における核酸またはタンパク質の存在の検出方法は、細胞の核酸との核酸プローブのハイブリダイゼーション、およびポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いた細胞染色を含む。このような技術は、当業者に周知の方法によって達成される。例えば、本明細書に参考として援用されるHarlowおよびLane，An tibodies: A Laboratory Manual 、Cold Spring Harbor，1988，参照のこと。メロシンに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を、当該分野で周知の手法によって調製した。抗体の特異性を、胎盤抽出物の酵素イムノアッセイおよびイムノブロッティングを行うことによって調べる。例えば、モノクローナル抗体は、ヒト胎盤組織抽出物のようなタンパク質を含有する物質で動物を免疫化し、続いて当該分野で周知のように抗体産生ハイブリドーマ細胞を単離することによって調製される（例えば、すべてが本明細書に参考として援用される、HarlowおよびLane，Antibodies: A Laboratory Manual、前掲、およびそこに引用された文献を参照のこと）。抗メロシン抗体は、メロシンが栄養膜、横紋筋およびシュワン細胞の基底膜、および他の部位の膜に位置する組織セクションの免疫蛍光分析を行うことによって選択される。抗体の同定はイムノブロッティングおよび免疫沈降によって確認され、１つまたはそれ以上の上記のポリペプチドが示される。適切なハイブリドーマは、精製されたメロシンサブユニットまたはメロシン断片と反応性である。メロシン断片は、図１に示されるメロシンｃＤＮＡを発現させることによって、あるいは、ｃＤＮＡ分子（その配列は図１および６に示される）の制限酵素消化および引き続く制限酵素断片の精製により調製され得る。これらの方法は当業者に周知である（本明細書に参考として援用されるSambrookら、前掲）。次いで、核酸断片は、上記のような原核生物または真核生物発現ベクターで発現される。あるいは、抗メロシン抗体は、図１または６に示された配列を有する分子、または上記の制限酵素断片から調製された合成ペプチドまたは組換えタンパク質断片で動物を免疫化することによって調製され得る。抗体産生に適切であることが示されている１つの分子は図１に示された配列を有する分子である。抗体産生に適する合成ペプチドは実施例Ｉに記載される。抗メロシン抗体の選択は、上記のように行われる。メロシンのＣＯＯＨ末端部分は、ラミニンＡ鎖のＣＯＯＨ末端に構造的に関連する。しかしながら、メロシンのアミノ酸配列は、マウスおよびヒト・ラミニンＡ鎖の相同部分とは、各々、６１％および６２％異なる。アフィニティー精製された抗体は２つのバンドを染色し、メロシンポリペプチドが、それぞれ、約３００ＫＤａおよび８０ＫＤａの２つの断片にプロセッシングされることを示す。メロシンＡ鎖に対するｃＤＮＡクローンは、アフィニティー精製されたメロシンに特異的な抗体を用い、ヒト胎盤ラムダｇｔ１１ｃＤＮＡ発現ライブラリーから単離した。それぞれ、３.６および１.７ｋｂの挿入物を持つ２７１および２２５と命名した２つのｃＤＮＡクローンを配列決定のために選択した。ｃＤＮＡの核酸配列は、１５５ｂｐの非翻訳３’領域を有する３.４ｋｂのオープンリーディングフレームを示した。ｃＤＮＡおよび推定のアミノ酸配列を図１に示す。胎盤のペプシンまたはキモトリプシン消化物から単離した断片のＮＨ₂−末端アミノ酸配列、およびトロンビンで生成された１６ｋＤ断片のＮＨ₂−末端アミノ酸配列が推定配列内に含まれ、それ故、このクローンをメロシンｃＤＮＡとして規定する。ＲＮＡブロット分析は、ヒト胎盤ＲＮＡ中に約１０ｋｂの単一の転写物を示した。メロシンの推定の部分配列は、１１３０個のアミノ酸を含み、そしてＮ−グリコシル化の１３の可能な部位を含有する。この配列は、約１９０アミノ酸の５つの反復を含む。これらの反復は、保存された７アミノ酸長さの配列、ＬＦＶＧＧＬＰまたはその改変体を含む。これには、１７〜２１および４０〜４３残基後にあるシステインが続き、ほとんどのシステインにはグリシンが先行する。５つの反復の間の平均の同一性は約２５％である。メロシンのアミノ酸配列の公知のタンパク質との比較分析は、マウスおよびヒト・ラミニンＡ鎖に対する顕著な類似性を示した。データバンクのサーチに際し、他の有意な類似性は見い出されなかった。また、メロシンの５つの反復がラミニンＡ鎖のＣＯＯＨ末端部分に存在する。図１におけるメロシン配列とマウス・ラミニンＡ鎖の対応する部分との間の全体の同一性は３９％である。その配列が図１に提供される部分的ｃＤＮＡクローンを用いて、メロシンポリペプチドをコードする全長の配列を単離した。いくつかのライブラリーを、ヒト胎盤ポリ（Ａ）ＲＮＡから作製し、そしてメロシンをコードする配列を用いてプローブした。５つの重複するｃＤＮＡ挿入物を継ぎ合わせて全長配列を生成し、これを図６に示す。ヒトＭ鎖は、３０５８残基を含有するヒトＡ鎖よりも３０残基より長い。２つの配列の比較は、Ｍ鎖のドメイン構造はＡ鎖のそれと同様であり、そしてこれらの２つのラミニン重鎖はかなりの相同性を有することを示す。全体の配列類似性は４６.６％であり、保存的変化が含まれる場合は５８.６％である。ＭおよびＡ鎖遺伝子の発現は、ノーザンハイブリダイゼーションによって比較し；また、インサイチュハイブリダイゼーションをヒト胎児組織中のＭ鎖について行った。両手法により、これらのポリペプチドの異なる組織発現パターンが確認された。悪性腫瘍は、非悪性腫瘍と比較して、実質的な量のメロシンを有さないことをさらに発見した。メロシンの正確な量は、特定の腫瘍に依存し、そして本発明の教示が与えられれば、当業者により測定され得る。以下の実施例は例示が目的であり、本発明を限定するものではない。実施例Ｉメロシンの精製ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングラムダｇｔ１１中のヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを、LeivoおよびEngvall（前掲）に記載されているように、メロシンの変性６５ｋＤキモトリプシン断片に対するアフィニティー精製された抗体を用いてスクリーニングした。Argravesら、J．Cell Biol．105，1183-1190(1987)（本明細書に参考として援用される）によって記載されている手法に従って、単離したｃＤＮＡクローンの同一性を免疫学的に確認した。ｃＤＮＡ配列の決定および分析２７１および２２５と命名したそれぞれ、３.６および１.７キロベースの挿入物を持つ２つのｃＤＮＡクローンを配列決定のために選択した。複数の重複する断片を配列決定した。重複しない断片は両方向を配列決定した。クローン化および配列決定した断片の配列を図１に要約する。ｃＤＮＡ挿入物を種々の制限酵素で切断し、そして断片をM13mp19(+)(Bethesda Research Laboratories，Gaithes burg，MD)またはBluescript SK M13(+)(Stratagene Cloning Systems，La Jolla ，CA)中にサブクローン化した。核酸の配列決定は、デオキシアデノシン５’− α−［³⁵Ｓ］チオホスフェート（New England Nuclear，Boston，MA）およびＵＳＢからのキット(Cleveland，OH)を用いて、Sangerらのジデオキシ鎖停止法によって行った。ＤＮＡ合成機（Applied Biosystems，Foster City，CA）を用いて合成した１５塩基のオリゴヌクレオチドプライマーを用いていくつかの領域を配列決定した。配列分析は、MicroGenieプログラム(Beckman)を用いて行った。相同性のサーチはEMBL、Genbank、NBRF/PIRおよびSwiss-Protデータベースと共にBionetを用いて行った。ｃＤＮＡの核酸配列は、3.4-キロベースのオープン・リーディング・フレーム、それに続く１５５塩基対の３’非翻訳領域を示した。推定のアミノ酸配列を図１に示す。胎盤のペプシンまたはキモトリプシン消化物から単離された断片のＮＨ₂ 末端アミノ酸配列およびトロンビンを用いて生成された１６ｋＤａ断片のＮＨ₂ 末端アミノ酸配列が推定の配列内に含まれ、かくして、このクローンがメロシンｃＤＮＡとして定義された。メロシンの推定部分配列は１１３０個のアミノ酸を含み、そして１３のＮ−グリコシル化可能な部位を含む。この配列は約１９０アミノ酸の５つの反復を含む。これらの反復は保存された７アミノ酸配列、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ −Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏまたはその改変体を含む（図１）。この１７〜２１および４０〜４３残基後にシステインが続き、そのほとんどにはグリシンが先行する。５つの反復の間の同一性の平均百分率は約２５％である。タンパク質配列決定 LeivoおよびEngvall（前掲）に記載されるように、モノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィーを用い、ヒト胎盤のペプシン消化物から５５ｋＤメロシン断片を単離した。このメロシンのペプシン断片をトロンビンでさらに消化し、そして１６ｋＤ断片を配列分析のために選択した。このメロシン断片を、Na DodSO₄の存在下で１０〜２０％グラジエントのポリアクリルアミドゲル上で電気泳動的に分離し、二フッ化ポリビニリデン膜(Millipore，Boston，MA)上にブロットし、本明細書に参考として援用されるMatsudaira，J．Biol．Chem.，262 10 035-10038(1987)によって記載されるように、Applied Biosystemsの配列決定機で配列決定した。合成ペプチド、抗体産生、およびイムノブロッティングメロシンｃＤＮＡのオープン・リーディング・フレームの長さは、成熟メロシンポリペプチドが、胎盤抽出物中で当初同定された８０ｋＤ断片よりもかなり大きいことを示した。推定のアミノ酸配列は、６５ｋＤ断片および８０ｋＤ組織ポリペプチドがメロシンのＣＯＯＨ末端断片であることを示唆した。８０ｋＤ断片のＮＨ₂末端であると推定される推定アミノ酸の部分（図１中、残基４７５−４８８および４５７−４６９）からの２つの１３アミノ酸長ペプチドを合成した後、インタクトのメロシンポリペプチドの失われた部分を同定した。ｃＤＮＡ配列から推定されたアミノ酸配列に基づいて、２つの１３アミノ酸長さのペプチドＣＮＮＦＧＬＤＬＫＡＤＤＫＩおよびＣＳＩＶＤＩＤＴＮＱＥＥＮＩを合成した。これらのペプチドのＮＨ₂末端にシステインを付加して、キャリアタンパク質へのカップリングを容易にした。本明細書に参考として援用されるO'Sullivianら、( Anal．Biochem．100，100-108(1979))に従い、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ− ヒドロキシスクシンイミドエステル(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)を用い、このペプチドをkeyhole limpetヘモシアニンにカップリングさせた。得られた結合体をフロイントの完全アジュバント中に乳化し、ウサギに注入した。フロイントの不完全アジュバント中の結合体のブースター免疫化を１および２カ月後に行った。各注入の用量はペプチド０.６ｍｇ相当した。第３回目の注入の１０日後に血液を収集した。得られた抗血清を、ＥＬＩＳＡにおいて、グルタルアルデヒド架橋させたペプチドに対して試験し、そしてLeivoおよびEngvall（前掲）に記載されているように、組織のNaDodSO₄抽出物およびイムノブロッティングで単離されたタンパク質に対して試験した。これらのペプチドでウサギを免疫化して抗血清が得られ、これはイムノブロッティングにおいて、胎盤のNaDodSO₄抽出物中の約３００ｋＤのポリペプチドを染色した。この抗ペプチド抗血清は、メロシンの８０ｋＤまたは６５ｋＤのＣＯＯＨ末端断片とは反応しなかった。同抽出物中における８０ｋＤ断片の存在は、モノクローナル抗体によって明らかとされた（図３Ｂ、レーン１）。また、固定化ペプチドにて抗ペプチド抗血清からアフィニティー精製した抗体は３００ｋＤのバンドを染色した。その他のペプチド抗血清およびプレ免疫血清はイムノブロッティングにおいて任意の染色を与えなかった。これらの結果は、メロシンポリペプチドが、それぞれ、約３００ｋＤおよび８０ｋＤの２つの断片にプロセッシングされることを示唆する。胎盤からのインタクトのメロシンの単離次いで、マウス組織からのラミニンの単離において先に使用された方法を用い、メロシンを単離した（本明細書に援用として援用されるPaulssonら、Eur．J． Biochem.，166:11-19(1987)）。これらの方法は、ＥＤＴＡ含有緩衝液を用いた基底膜からのラミニンの選択的可溶化に基づく。ヒト胎盤を中性緩衝液およびＥＤＴＡを含有する同じ緩衝液で連続的に抽出した場合、メロシン抗原活性は主としてＥＤＴＡ抽出物中に見い出された。メロシンは４ＭＮａＣｌまたは４０％飽和硫酸アンモニウムを用いて抽出物から沈殿させることができた。セフアロース６Ｂでのゲル濾過に際し、メロシン抗原活性はボイド容量ピークに溶出した。それはＤＥＡＥセルロースに結合し、約０.２ＭＮａＣｌで溶出された。図４はＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーからのピークメロシンを含有する画分のNaDodSO₄−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ロータリーシャドウイング後の電子顕微鏡写真、およびＥＬＩＳＡ分析を示す。この画分中の主要成分は、ゲル電気泳動によって測定した場合、８００ｋＤラット・ラミニンよりもわずかに小さい約７００ｋＤの分子量を有していた（図４Ａ）。メルカプトエタノールで還元後、メロシン画分は、６０〜９０ｋＤのいくつかの少量成分に加え、約６００ｋＤ、３００ｋＤ、および１８０〜２００ｋＤのポリペプチドを含有していた（図４Ａ）。合成ペプチドの抗血清は、イムノブロッティングにおいて、５００〜６００ｋＤおよび３００ｋＤのバンドに結合した。メロシンのＣＯＯＨ末端断片に対する抗体は８０ｋＤバンドに結合した。ロータリーシャドウイング後の電子顕微鏡写真を用いて、メロシン画分をさらに特徴付けた。マウスおよびラット・ラミニンによく似た十字架形状の像が観察された主要な構造であった（図４Ｂ）。メロシン特異的およびラミニンサブユニット特異的なモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによる画分の分析は、調製物がメロシンポリペプチドおよびラミニンＢ１およびＢ２軽鎖を含有することを示した。ラミニン重鎖特異的抗体では反応性は認められなかった（図４Ｃ）。ラミニン重鎖に特異的なモノクローナル抗体を用いて単離した短縮形ペプシン断片は、重鎖に特異的な抗体、ならびにＢ１およびＢ２鎖に特異的な抗体と反応した。このラミニン調製物はメロシン抗体と反応しなかった（図４Ｃ）。これらの結果は、胎盤のＥＤＴＡ抽出物から単離された高分子量のラミニン様分子が検出可能なラミニン重鎖を含有しないが、メロシン重鎖と会合したラミニン軽鎖を含んでいたことを示す。実施例ＩＩメロシン活性メロシンは細胞付着を促進するメロシンによって促進される細胞の付着は、当該分野で周知の、そして本明細書に参考として援用されるEngvallおよびRuoslahti(Collagen Rel．Res.，3:359 -369(1983))に記載されている方法によって測定した。要約すれば、ポリスチレン製マイクロタイタープレート(Flow Laboratories，Irvine，CA)を、ＰＢＳ中の異なる濃度のタンパク質１００μｌと共にウェルを室温で３〜１６時間インキュベートすることによって、種々のタンパク質で被覆した。非結合タンパク質を、ＰＢＳで３回洗浄して除去した。いくつかの実験では、タンパク質溶液を含むウェルを３７℃で風乾し、次いで洗浄した。細胞をトリプシン処理し、そしてＥＭＥＭ中の０.５ｍｇ／ｍｌの大豆トリプシンインヒビターで２回洗浄した。１０ｍＭＨＥＰＥＳを含むＥＭＥＭ１ｍｌ当たり約２５０,０００細胞の懸濁液を調製し、そして既に０.１ｍｌのＥＭＥＭを含有する各ウェルに０.１ｍｌを添加した。次いで、空気中１０％ＣＯ₂の雰囲気中で、このプレートを３７℃で３０〜９０分インキュベートした。細胞付着は、以下の方法：１）非付着細胞を除去し、計数する；２）付着細胞を固定し、トルイジンブルーで染色し、そしてAr tek細胞計数器(Dynatech Corporation，Alexandria，VA)を用いて計数する：または３）固定し染色した細胞によって吸収された光を自動ＥＬＩＳＡリーダー(M ultiscan，Flow Laboratories)を用いて測定する；の１つまたはそれ以上によって評価した。ラミニンを溶液中で試験する場合、細胞に添加する前に、１０ｍＭＨＥＰＥＳを含有するＥＭＥＭ中の１ｍｇ／ｍｌＢＳＡの溶液を用い、プレート中で系列的に希釈した。すべてのアッセイは三連の試料で行った。表１の細胞株をメロシンに対する細胞付着について試験した。成功した付着は「＋」で示す。付着が良好なほど「＋」が多い。結果は、メロシンが、全てではないが多くの細胞型による付着を促進することを示す。メロシンは軸索の外殖を促進するメロシンによる軸索促進活性は、本明細書に参考として援用されるEngvallら、J．Cell Biol.，103:2457-2465(1986)およびManthorpeら，A Dissection and Tissue Culture，Manual of the Nervous System，322-326(1989)，Alan R．Lis s，Inc.に記載されたような公知の方法によって測定された。要約すれば、胚８日齢のニワトリ毛様体神経節ニューロン培養を用いた。ポリオルニチン被覆組織培養プラスチック製ウェル（６ｍｍ直径、９６ウェルマイクロプレート）を、３７℃にて、ＰＢＳ中のヒトラミニンまたはメロシンの５μｇ／ｍｌで２〜３時間処理した。このウェルを、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ１００μｌで１回洗浄した。１０００個のニューロンを含有する１００μｌの培養培地（０.５％ＢＳＡ、８×１０^-7Ｍインスリン、３.３×１０^-2Ｍグルコース、２.６×１０^-2 ＭＮａＨＣＯ₃、２×１０^-3ＭＬ−グルタミン、１００μｍ／ｍｌペニシリン、および１００栄養単位／ｍｌの毛様体（神経栄養因子）を補足したダルベッコの改変イーグル基礎培地）を添加した。２００μｌの２％グルタルアルデヒドを２０分間添加することによって３時間後に培養を固定し、水で洗浄し、水中の０.１％トルイジンブルーで染色した。顕微鏡により、約１５０個のニューロンが、各培養条件で観察された。ニューロンは、それらが少なくとも５０μｍの軸索全長を有すれば、軸索担持と記録した。さらに、付着のために、表面を１００μｇ／ｍｌのポリオルイチン（polyorui thine）（ＰＯＲＮ）で被覆した。次いで、軸索外殖のために、２５μｇ／ｍｌラミニンまたはメロシンを添加した。細胞を７２時間軸索延長させた。促進の程度を表２に記載する。軸索成長の促進は「＋」として示す。促進が大きいほど、「＋」が多い。この結果は、メロシンが軸索外殖の促進剤であり、それ自体、ラミニンと同様に効果的であることを示す。このことは、特定の用途（臨床的）には、メロシンが神経再生ではラミニンよりも良好であることを示唆する。何故ならば、例えば、それは、脈管形成活性を有し得ないからである。実施例ＩＩＩヒト・シュワン細胞新生物におけるメロシンの分布基底膜タンパク質メロシンおよびラミニンの発現を、一連の良性および悪性の神経線維腫および叢状神経線維腫で免疫組織学的に実験した。新鮮な組織試料を液体窒素中で凍結した。メロシンおよびラミニンに対するモノクローナル抗体を凍結切片に適用し、そして間接的イムノペルオキシダーゼまたは間接的免疫蛍光技術を用いて、組織中の２つのタンパク質を検出した。結果は、Leivoら、Labor atory Investigation，61:426-432(1989)に記載されている。この文献およびそこに引用されている文献は、本明細書に参考として援用される。組織材料ヒト神経原性腫瘍を、ヘルシンキ大学の病理学部にて、固定することなく新鮮なものを得た。１つの例においては、組織は、頬悪性神経線維腫で死亡したレックリングハウゼン病を持つ患者の剖検から得られた。この組織試料を液体窒素中で凍結し、そして組織−Tek OCT(Miles，Naperville，Illinois)に包埋した。凍結切片を１〜２時間風乾し、アセトン中で固定した。各組織試料の一部をホルマリン中で固定し、ヘマトキシリン−エオシンを用いる常法の組織学的評価のためにパラフィンに包埋した。抗体還元しそしてアルキル化したメロシンの６５ｋＤのポリペプチド断片に対して惹起されたモノクローナル抗体を用いた。これらの抗体は変性ヒト・メロシンを検出し、そしてそれらはヒト胎盤のドデシル硫酸ナトリウム抽出物中の８０−ｋＤポリペプチドバンドをブロットした。同一の染色結果を与えるこれらの抗体の以下のクローンを用いた：５Ｈ２、４Ｅ１０、２Ｇ９、４Ｈ２、１Ｆ６、２Ｅ１０、および２Ｄ１０。モノクローナル抗体を用いて得られた結果と同一の染色結果がまた、メロシンに対するポリクローナル抗血清を用いて正常組織で得られた。ほぼインタクトなヒト・ラミニンに対するモノクローナル抗体が記載されている（Engvallら、前掲）。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルからトランスファーされたラミニンの２００ｋＤＢ１鎖をブロットするモノクローナル抗体２Ｅ８を用いた。シュワン細胞腫瘍の免疫組織学的特徴付けにおいて、本発明者らは、１：３００希釈でウシＳ−１００タンパク質に対するポリクローナルなウサギ抗体(Dakop atts，Glostrup，デンマーク)およびグリア原線維酸性タンパク質に対するモノクローナル抗体(Labsystems，ヘルシンキ、フィンランド)を用いた。免疫組織化学凍結切片を１：２〜１：５希釈のハイブリドーマ培養培地で処理した。マウス一次抗体を切片に３０分間または一晩適用し、続いて、１：５００希釈でビオチン化ウサギ抗マウスＩｇＧ抗血清（Dako，コペンハーゲン、デンマーク）と共に３０分間インキュベーションした。最後に、結合したビオチンを、ビオチン化ペルオキシダーゼ(ABC omplex，Dakopatts)とインビトロで組み合わせたアビジンを用いて（共に１：１６０希釈）検出した。０.０２％過酸化水素を補足した３ −アミノ−９−エチルカルバゾール(Sigma，St．Louis，Missouri)で発色させた。いくつかの場合では、フルオレセインイソシアナート結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Bio-Rad，Richmond，California）を用いて、間接免疫蛍光法にて結合した一次抗体を検出した。メロシンの染色についての特異性のコントロールとして、通常のマウス血清（１：１０）またはリン酸緩衝化生理食塩水をハイブリドーマ媒体の代わりに使用した。モノクローナル抗体によるラミニンの染色に対する特異性のコントロールは、文献に記載されている。コントロール実験では有意な染色は観察されなかった。イムノペルオキシダーゼ技術を用いて染色した調製物は、核を示すためのマイヤーのヘマラム(Merck，Darmstadt，西独)を用いて明るく対比染色された。イムノペルオキシダーゼ染色および免疫蛍光調製物が観察され、上方照明を装備したZeiss Axiophot顕微鏡で写真を取った。４つのヒト神経鞘腫、２つの叢状神経線維腫および４つの悪性神経鞘腫を調べた。２つの神経鞘腫は腹膜後にあり；１つは縦隔にあって、そして１つは胃神経鞘腫の組織学的特徴を呈する胃壁由来であった。組織学的には、全ての神経鞘腫は、巣状柵状配列の核を持つ比較的均一な紡錘状細胞形態を示した。２つの場合では、細胞およびルーズな領域が交互するパターンを示し、各々、いわゆるアントニＡおよびアントニＢ領域を示した。３つの場合で行った電子顕微鏡による観察は、基底膜物質の隆起した沈積物によって覆われた多数の細い細胞突起を示す粗面小胞体に富む紡錘細胞を明らかにした。これらの知見は、神経鞘腫の超微細構造特徴と適合した。免疫組織学的実験において、全ての神経鞘腫はＳ−１００タンパク質に対して強く陽性であった。グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）が３つの場合において巣状に観察された。ラミニンの顕著な染色が、基底膜の平行層において、細胞領域において、および全ての血管壁の全厚さにおいて観察された。血管壁の回りの腫瘍のゆるい細胞の少ない領域および結合性組織鞘は免疫反応性ラミニンを含有しなかった。ヴェロツァイ小体を含む細胞領域は、メロシンを含有しないか、あるいはほとんど無視できる量のメロシンしか含有しなかった。しかし、メロシンに対する明瞭な染色が、細胞領域がゆるい支質領域と境界を接する、または細胞領域が血管隔壁と境界を接する界面で規則的に観察された。叢状神経線維腫２つの叢状神経線維腫は、レックリングハウゼン病を持つ患者の背中の皮下組織の神経幹および縦隔由来であった。これらの腫瘍は、シュワン細胞および繊維芽細胞に適合する波状コラーゲンおよび紡錘細胞を含有する膨大した蛇行性神経幹を表した。両腫瘍において、メロシンおよびラミニンは、蛇行性神経束の輪郭を描く基底膜に沿って、直線状の免疫反応性の形態で同時に局在していた。ラミニンはまた、血管壁にも見い出された。しかし、この位置でメロシンは観察されなかった。悪性神経鞘腫これらの腫瘍は、レックリングハウゼン病を持つ患者における大腿、腹膜後、および頬組織の深神経幹に由来した。組織学的には、それらは、顕著な有糸分裂活性および壊死の病巣領域を持つ悪性の高グレードの紡錘肉腫を表した。悪性神経鞘腫は、Ｓ−１００タンパク質については、最小の巣状免疫染色を示したに過ぎなかった。ＧＦＡＰに対する抗体を用いては染色は検出されなかった。いくつかの血管周囲腫瘍細胞において、ラミニンについての少量の巣状染色のみがあった。しかし、全ての血管壁はラミニンについては強く陽性であった。４つの悪性神経鞘腫のうち３つは、腫瘍細胞において、メロシンに対して免疫染色を示さなかった。ラミニンとは対照的に、血管壁の外部縁のみがいくらかの染色を示した。元の神経幹の残余物が顕微鏡で同定された切片では、メロシンに対する染色は、メロシン陰性腫瘍細胞領域中にブレンドされる残存正常軸索のシュワン細胞基底膜の輪郭を描いた。悪性の神経鞘腫を囲む繊維状皮膜はメロシンに対して陰性であった。しかし、隣接する横紋筋組織においては、基底膜はメロシンに対して陽性であった。１つの場合において、小さいが明確な量のメロシンが腫瘍細胞の間の斑点状沈積物として観察された。この場合、ラミニンについての免疫染色の同様のパターンが観察された。要約すれば、神経鞘腫におけるメロシンの分布はラミニンのそれよりも制限されていたが、叢状神経線維腫においては、両タンパク質が同じ位置に存在していた。悪性神経鞘腫では、いずれのタンパク質も有意な量で観察されなかった。神経鞘腫においては、細胞のアントニＡ領域の基底膜でラミニンに対する強い染色が観察された。対照的に、これらの領域はメロシンを欠いていた。免疫反応性のメロシンは腫瘍細胞と血管壁との間の境界ゾーンで観察された。神経鞘腫における２つの基底膜タンパク質の一致しない分布は、メロシンおよびラミニン双方がシュワン細胞基底膜で観察される正常末梢神経における状況とは異なる。この差異に対する理由は知られていないが、この結果は、２つの基底膜タンパク質について異なる生物学的役割を反映し得る。超微細構造的には、神経鞘腫の腫瘍性の基底膜とシュワン細胞を囲む正常基底膜との間には明らかな差異は存在しないようである。神経鞘腫細胞および非シュワン細胞間葉成分の境界のみにメロシンが存在することは、メロシンの発現が、神経鞘腫細胞と間葉組織または細胞外マトリックスとの接触または相互作用によって誘導され、また、比較的十分に分化した腫瘍においてさえ単離された神経鞘腫細胞によって発現は起こらないことを示す。同様に、末梢神経におけるシュワン細胞は、メロシンの合成および／または沈積のために、ニューロン、神経内膜繊維芽細胞、または神経周囲細胞のごとき神経束の他の細胞型との相互作用を必要とし得る。インビトロで発育する神経におけるシュワン細胞基底膜の髄鞘形成およびアセンブリは、シュワン細胞とニューロンとの間の相互作用に依存することが示されている。同様に、培養シュワン細胞によるＩＶ型コラーゲンの分泌はニューロンとの接触によって調整される。叢状神経線維腫においては、大量のメロシンおよびラミニン双方が同じ位置で観察された。これらの新生物は、増大した数のシュワン細胞および神経周囲細胞、ならびにインタクトの神経周囲鞘および膨大した神経束内に含有されるいくらかの残存軸索を含む。従って、恐らくは、メロシンの発現に必須の比較的よく組織された組織構造が維持される。これらの神経束内の種々の細胞要素の存在は、多くの細胞接触および相互作用を可能とし、そして明らかに、これらのいくつかは、メロシンの分泌に必須である。本実験の悪性神経鞘腫においては、メロシンおよびラミニンは存在しないか、あるいは最小限で発現されるに過ぎなかった。Ｓ−１００タンパク質およびＧＦＡＰのようなシュワン細胞分化に対する免疫組織学的マーカーの付随する欠如は、これらの腫瘍が低レベルのシュワン細胞分化において神経原性肉腫であることを示唆する。ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチンの生合成は、シュワン細胞および神経鞘腫細胞培養において繰り返し示されてきた。さらに、固形絨毛癌において、メロシンは中間栄養細胞タイプの細胞によって発現された。培養した絨毛癌細胞株はラミニンを合成したが、メロシンはそれらの細胞系では検出できなかった。明らかに、培養および腫瘍性シュワン細胞ならびに他の細胞はメロシンを分泌する能力を喪失するが、対応する成熟細胞に特徴的ないくつかの他のマトリックスタンパク質は保持している。実施例ＩＶ全長ヒト・メロシンをコードするｃＤＮＡの単離ｃＤＮＡクローンの生成および特徴付けｃＤＮＡライブラリーをヒト胎盤ポリ（Ａ）ＲＮＡから作製した。まず、図１における、および本明細書に参考として援用されるEhrigら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 87:3264-3268(1990)におけるＭ鎖（メロシン）配列に従って作製したプライマーＭＬ−１（ヌクレオチド残基６９１７−６９４２、図６）を用いてＲＮＡをプライムした。ｃＤＮＡを製造業者の指示(Amersham International)に従ってｃＤＮＡ合成キットを用いて調製し、精製し、そしてＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプター(Pharmacia)を用いてλｇｔ１０ベクター(Promega)にクローン化し、Packagene抽出システム(Promega)を用いてパッケージ化した。プライマーＭ− １０（ヌクレオチド残基４１５３−４１６７、図６）およびＭＬ−５（ヌクレオチド残基１０２８−１０５０、図６）を用いて、２つの他のプライマー伸長ライブラリーを同様に調製した。先に特徴付けられたメロシンｃＤＮＡ(実施例Ｉおよび本明細書に参考として援用されるEhrigら、前掲)をプローブとして用い、第１のライブラリーをスクリーニングした。クローンＭ１−１の５’末端１.４ｋｂＥｃｏＲＩ断片を用いて、第２の伸長ライブラリーをスクリーニングし、そしてクローンＭ１０−２２の１.３ｋｂＮｏｔＩ／ＡｃｃＩ断片を用いて第３のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。メロシンの５’末端に対するクローンを得るために、ＭＬ−６（ヌクレオチド７０６−７３１、図６）でプライムしたｃＤＮＡを合成し、そしてＥｃｏＲＩアダプター(Promega)をこのｃＤＮＡに連結した。ＥｃｏＲＩアダプタープライマーおよび特異的プライマーを用いて、ＰＣＲによってこのｃＤＮＡの５’末端を増幅した。精製されたｃＤＮＡクローンおよびＰＣＲ産物をBluescript ＩＩ(Stratagene)にサブクローン化し、そしてジデオキシ配列決定法(本明細書に参考として援用される、Sangerら、Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 84:935-939(1977))を用い、両鎖から配列決定した。ノーザン分析１８〜１９週齢のヒト胎児組織からの全ＲＮＡを単離し、そして各ＲＮＡを１０μｇ含有する試料を電気泳動し、GeneScreen Plusフィルターにトランスファーし、そしてヒト・ラミニンＡ鎖およびメロシンｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。インサイチュハイブリダイゼーションインサイチュハイブリダイゼーション用のセンスおよびアンチセンスプローブを得るために、ラミニンＡ鎖ｃＤＮＡクローンＣ２−１２由来の２６０ｂｐＮｏｔＩ−ＳａｌＩ断片およびメロシンｃＤＮＡクローンＭ１−１由来の３５０ｂｐＸｈｏＩ−ＣｌａＩ断片をBluescriptＩＩベクターにクローン化した。Ｔ３およびＴ７ポリメラーゼを用い、プローブを³⁵Ｓ−ＵＴＰ（Amersham）で標識した。妊娠第１７週からのヒト胎児組織を用いた。インサイチュハイブリダイゼーションは、それぞれ、本明細書に参考として援用されるCoxら、Devl．Biol.，10 1:485-502(1984)およびWikinsonら、Postimplantation mammalian embryos: a p ractical approach（A．J．CoppおよびD.L．Cockrof編） IRL Press，オックスフォード155-171(1990)に従って行った。ｃＤＮＡクローンの特徴付けおよびメロシン鎖のアミノ酸配列ヒト・メロシンのカルボキシル末端から１１３０個のアミノ酸残基を提供するｃＤＮＡクローンは、実施例１、およびEhrigら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:3264-3268(1990)に記載されている。このｃＤＮＡクローン（ＭＥＲ３’）およびその配列を、第１のプライマー伸長ライブラリーのプライミングおよびスクリーニングに用いた。最長の陽性２.９ｋｂクローンＭ１−１（図５）をさらに特徴付け、そしてその５’末端配列を用いてプライムとし、そして第２のプライマー伸長ライブラリーをスクリーニングし、クローンＭ１０−２２（３.２ｋｂ）を得た。同様に、クローンＭ１０−２２の５’末端を用いて、第３のプライマー伸長ライブラリーをスクリーニングし、クローンＭ５−１（０.８ｋｂ）を単離した。完全な５’末端配列にまたがるクローンを得るために、いくつかのライブラリーを作製した。しかし、これらの努力を通じて得られた全てのクローンはＭ５−１と同様の長さであるか、あるいはＭ５−１よりも短かった。特徴付けた（データは示さず）ゲノムクローンは推定のエクソン２を含有していたが、シグナルペプチドおよび５％非翻訳領域のコーディング領域を含有していなかった。最終的には、ＰＣＲ増幅によって５’末端配列を得た。プライマーＭＬ−６を用いてｃＤＮＡを作製し、それにＥｃｏＲＩアダプターを連結した。次いで、ＥｃｏＲＩアダプタープライマーおよび２つの特異的プライマーをＰＣＲで用いて、ｍＲＮＡの５’末端非翻訳領域、およびシグナルペプチドおよびメロシンのアミノ末端に対する配列を含有する、３００ｂｐの５’末端断片Ｍｇ−１６（図５）を増幅した。重複するｃＤＮＡクローンおよび推定のアミノ酸配列のヌクレオチド配列を図６に示す。実施例ＩおよびEhrigら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:3264-3268 (1990)に記載されたＣ−末端アミノ酸配列をその配列に含まれていた。本実験で生成され特徴付けたクローンは、全部で６９４２ｂｐをカバーし、このクローンは、４９ｂｐの５’末端非翻訳領域および６８９３ｂｐのオープンリーディングフレームよりなる。５’末端配列は、オープンリーディングフレームを有するが、イニシエーターのメチオニンの付近の配列ＡＣＵＡＣＧＡＵＧＣは、翻訳開始のためのKozakコンセンサス配列に一致する(Kozak，M.，J．Cell．Biol. 115:88 7-903(1991)、本明細書に参考として援用する)。推定のシグナルペプチドは、イニシエーターのメチオニンで開始し、疎水性のロイシンが豊富な配列が続く２２アミノ酸を含有する。本明細書に参考として援用されるvon Heijne(1986)の方法に基づくシグナルペプチダーゼ切断部位を予測するコンピュータープログラム分析はＡｌａ２２の後の切断部位を示唆し、それにより、ほとんどのラミニン鎖がそうするように成熟メロシンはグルタミン残基で開始し得る。全部で、メロシンは仮の２２残基のシグナルペプチドの切断後に３０８８のアミノ酸残基を含有する。ラミニンＡ鎖と比較したメロシンのドメイン構造成熟ヒト・メロシンは、３０５８残基を含有するヒト・ラミニンＡ鎖（Nissin enら、Biochem．J. 276:369-379(1991); Haaparantaら、Matrix 11:151-160(199 1)）よりも３０残基より長い。両鎖のアミノ酸配列は図７に並べられる。全てのラミニン鎖と同様に、メロシンタンパク質は球状領域、システインが豊富な棒状の領域およびらせん構造を有すると予測される明瞭なドメインを有する。さらに、ラミニンＡ鎖と同様に、メロシンはカルボキシ末端に大きな球状ドメインを有する（Egrigら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:3264-3268(1990)）。２つの配列の比較は、メロシンのドメイン構造がラミニンＡ鎖の構造と同様であり、そしてこれらの２つのラミニン重鎖がかなりの相同性を有することを示す。メロシンのアミノ末端ドメインＶＩ（残基２３〜２８６）、ＩＶｂ（残基５２８−７２３）およびＩＶａ（残基１１７６−１３７９）は球状構造を形成すると予測される。ドメインＶ（残基２８７−５２７）、ＩＩＩｂ（残基７２４−１１７５）およびＩＩＩａ（残基１３８０−１５７３）はシステインが豊富なＥＧＦ様反復を含有し、そして剛直な棒状構造を有すると予測される。ＥＧＦ様反復の数はメロシンとラミニンＡ鎖中で同一である。ドメインＶは４・１／２の反復を有し、ドメインＩＩＩｂは１０・１／２の反復を有し、そしてドメインＩＩＩａは４つの反復を有する。Beckら、FASEB J. 4:148-160(1990)およびBeckら、W．T aylorおよびP．Argos（編）Springer series in biophysics ，Springer-Verlag, ベルリン7:231-256(1992)は、半分の反復を１と数え、それに従うと両鎖は１７のシステインが豊富な反復を含有する。ドメインＩ＋ＩＩ（残基１５７４−２１５３）は、その一部は先に報告されている（Ehrigら、Proc．Natl．Acad．Sci． U.S.A. 87:3264-3268(1990)）が、２つのＢ型鎖と一緒に、ラミニン分子の長いアームを形成する三重の超らせん（coiled-coil）構造の形成に関与する。さらに、メロシンは、この領域において１つのシステイン残基を含み、この領域はラミニンＡ鎖またはこれまでに特徴付けされている任意のＢ型鎖において対応物を有しない。大きなカルボキシ末端Ｇドメイン（残基２１５４−３１１０）は、ラミニン分子の長いアームの末端に大きな球を形成する。Ｍ鎖におけるアミノ末端ドメインＶＩは１２、ドメインＩＶａは２つ、ドメインＩＩＩｂは１つを有し、ドメインＩ＋ＩＩは１０、そしてドメインＧは７、Ａ鎖よりも多い７アミノ酸残基を有する。Ａ鎖におけるドメインＶは、Ｍ鎖における対応するドメインよりも多い２残基を有する。ヒト・メロシンおよびラミニンＡ鎖のアミノ配列の比較は、総じての配列類似性は４６.６％（表３）であり、保存的変化が含まれる場合は５８.６％（図７）であることを示す。配列類似性は球状ドメインＶＩで最も高く７３.９％であるが、メロシンにおけるこのドメインはアミノ末端でラミニンＡ鎖より多く１２残基を含有する。もし、さらにグルタミンが豊富なアミノ末端配列を排除すると、相同性は７７.４％である。このドメインにおける全ての６つのシステイン部位は保存されている。メロシンおよびラミニンＡ鎖間のシステインが豊富なドメインＶ、ＩＩＩｂおよびＩＩＩａのアミノ酸配列同一性は、各々、６０.１％、５４.９％および５０.２％である。これらのドメインにおける全てのシステイン残基は保存されており、そしてドメインの長さはほぼ同一である。また、２つの鎖の球状ドメインＩＶｂおよびＩＶａはほぼ同数のアミノ酸を有するが、配列類似性はより低く４２％である。配列類似性はドメインＩ＋ＩＩ間で最も低く、そこではそれは３２.３％に過ぎない。また、ラミニンＡ鎖において対応物を有しないメロシンにおけるドメインＩ＋ＩＩには余分なシステイン残基（残基１９７０）がある。ドメインＧ間の配列同一性は４１.８％である。メロシンには２８の推定のＮ−グリコシル化部位があり、そしてラミニンＡ鎖には３４あり、これらの部位のうち１０は２つの鎖の間で保存されている。ほとんどの推定のグリコシル化部位はドメインＧおよびＩ＋ＩＩ内にある。ヒト・メロシン遺伝子の染色体への割当３９の体細胞ハイブリッドのパネル由来のＤＮＡに対する標識ｃＤＮＡクローンＭ１０−２２のハイブリダイゼーションによって、ヒト・メロシン遺伝子を第６染色体にマップした。メロシンｃＤＮＡクローンのハイブリダイゼーションは、第６染色体の分布に相関していた。ｃＤＮＡの中期染色体へのインサイチュハイブリダイゼーションにより、メロシン遺伝子の第６染色体に対する、そしてより正確にはバンド６ｑ２２−＞ｑ２３（図８）に対する位置付けが確認された。ヒト組織におけるメロシンおよびラミニンＡ鎖遺伝子の発現いくつかの１８〜１９週齢のヒト胎児組織からのＲＮＡを用い、メロシンおよびラミニンＡ鎖遺伝子の発現をノーザンハイブリダイゼーションによって比較した（図９）。先に報告されているように(Nissinenら、Biochem．J. 276:369-379 (1991))、ラミニンＡ鎖遺伝子はヒト成人組織では非常に制限された発現を有する。ラミニンＡ鎖についてのシグナルは、脳、神経網膜、腎臓および精巣でのみ観察され、その一方、長期暴露の後であっても、皮膚、結腸、膵臓、副腎、心筋、肺、胸腺、脾臓、肝臓または頭蓋冠骨からのＲＮＡではシグナルは得られていなかった。これまでで、シグナルは神経網膜および脳組織で最も強く、ラミニンＡ鎖遺伝子は、髄膜、中間ゾーン、小脳、嗅球で発現され、そして弱い発現がまた脈絡膜叢および上衣ゾーンで観察された。メロシンタンパク質は異なる発現パターンを有し、シグナルは、胸腺、肝臓、頭蓋冠骨および脳の上衣および中間ゾーンを除く実験したほとんどの組織からのＲＮＡで観察されている。メロシン遺伝子の最も強い発現は心筋、膵臓、脈絡叢および髄膜で観察された。インサイチュハイブリダイゼーションメロシンｍＲＮＡの位置は、１７週齢のヒト胎児組織におけるインサイチュハイブリダイゼーションによって分析した。メロシンｍＲＮＡについての細胞型特異的発現パターンは、腎臓、心臓、皮膚および肺で明らかであった。胚性腎臓において、メロシンに対する転写物は、最も外層の皮質の未分化腎形成間葉で顕著に見いだされ（図１０Ａおよび１０Ｂ）、その一方、腎細管および腎臓血管は陰性のままであった。心筋においては、発現は組織全体の筋細胞で観察された（図１０Ｃおよび１０Ｄ）。皮膚の表皮細胞はメロシンｍＲＮＡを発現しなかったが、それは発育する毛包の先端当たりの凝縮間葉で豊富であった（図１０Ｅおよび１０Ｆ）。肺においては（図１０Ｇおよび１０Ｈ）、肺動脈の平滑筋細胞で標識が見い出され、その一方、肺胞および細気管支細胞は陰性であった。従って、上皮および内皮細胞はメロシンｍＲＮＡについて陰性であり、そして転写物は種々の間葉細胞のみで見い出された。実験した組織では、ラミニンＡ鎖特異的ハイブリダイゼーションを用いて細胞特異的シグナルは観察されなかった。実施例Ｉおよび本明細書に参考として援用されるEhrigら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 87:3264-3268(1990)に記載されている３’末端配列と共に、本結果は、ヒト・メロシンについて完全な一次構造を提供する。メロシンおよびラミニンＡ鎖は非常に似ていることが示された。２つのヒト鎖間の全体の配列類似性（４６.６％）は、相同なＢ１およびＳ鎖の間のそれとほぼ同一である。ヒト・メロシンおよびラミニン鎖遺伝子は、第１染色体のｑ２５−＞ｑ３１領域に位置する密接に関連するＢ２およびＢ２ｔの遺伝子を除き、異なる染色体に位置付けされた(Fukushimaら、Cytogen．Cell Genet. 48:137-141(1988))。この実験においては、メロシン遺伝子は６ｑ２２−＞ｑ２３に割り当てられ、その一方、関連するラミニンＡ鎖遺伝子は染色体１８ｐ１１.３に位置付けされた(Nagayoshiら、G enomics 5:932-935(1989))。ドメイン構造メロシンのドメイン構造は、他のラミニン鎖と同様のいくつかの特徴を含有し、そしてそれは、現実にはラミニンＡ鎖のそれに同一である。メロシンはアミノ末端にさらに１２アミノ酸を有するけれども、アミノ末端球状ドメインＶＩは最も高い相同性を共有する。事実、全ての既知のヒト・ラミニン鎖、マウスＡ鎖、ラットＳ鎖およびショウジョウバエＡ鎖のドメインＶＩは、システイン残基、いくつかのグリシン、セリン、プロリンおよびアルギニン残基、ならびに短いアミノ酸配列ＲＰ、ＴＣＧおよびＷＷＱＳが全ての鎖で一致するように配列し得る（図１１）。ドメインＶＩのカルボキシル末端における、保存された配列Ｙ（Ｙ／Ｆ）Ｙｘｈｘｄｈｘｈ（Ｇ／Ｒ）Ｇ（ｈ：疎水性残基、ｄ：Ｄ、ＥまたはＮ）（本明細書に参考として援用されるBeckら、W．TaylorおよびP．Argos（編）Sprin ger series in Biophysics ，Springer-verlag，ベルリン 7:231-256(1992)に従う）がまた、メロシンで見い出されている。これらの保存された配列の機能は未知である；しかし、任意の理論に拘束されるつもりもないが、保存された領域は、アミノ末端球状ドメインによって明らかに媒介されるラミニン自己アセンブリにおけるこのドメインの役割に重要性を有し得る。ドメインＶ、ＩＩＩｂおよびＩＩＩａは、ＥＧＦ様反復を含有し、規則的な位置に８つのシステイン残基を持つ。第８〜第２と、第５〜第７システインとの間の残基数は全てのラミニン反復において同一であり、そして反復の順序は特異的である。メロシンにおける反復の数は、本明細書に参考として援用されるSasaki ら、J．Biol．Chem. 263:16536-16544(1988)によると２０であり、あるいは共に本明細書に参考として援用されるBeckら、FASEB J. 4:148-160(1990); Beckら、W．TaylorおよびP.Argos（編），Springer series in Biophysics ，Springer-Ve rlag，ベルリン 7:231-256(1992)によると１７である。反復の順序はヒト・メロシンにおいて保存されており、一般に、反復は、ヒトおよびマウス・ラミニンＡ鎖に存在する反復と非常に似ている。ヒトＡ、Ｍ（メロシン）、Ｂ１、Ｂ２およびＢ２ｔ鎖、ラットＳ鎖、ネズミＡ鎖およびショウジョウバエＡ鎖のドメインＶにおける反復は、順番に並べることができる（図１２参照）。ヒトＢ２ｔ鎖は第１のＥＧＦ様反復を欠くが、反復の残りは、第２反復の後に、他の鎖におけるよりも長い第８〜第２システイン間の距離をなす挿入があることを除き、他の鎖の反復とマッチする。ドメインＶの配列は、システインおよびグリシン残基に加え、システイン５および６の間の第１反復においてＨＮＴのような他の保存された配列を含む。他のラミニン鎖とは対照的に、ショウジョウバエＡ鎖は、ドメインＶに１０・１／２のＥＧＦ様反復を含有する。ショウジョウバエＡ鎖における反復３、４、５および６と他の鎖における反復３、４および５との間にはいくつかの類似性が見い出されるが、ショウジョウバエＡ鎖における２つの最初のシステインが豊富な反復は、他の鎖における反復と配列し得るが、ドメインＶの残りはより異なる。既知のＡ型鎖のＥＧＦ様反復は配列し得るが、この配列は主として保存されたシステインおよびグリシンならびにそれらの間の残基数に基づく。ＡおよびＢ２型鎖の球状ドメインＩＶは、１つのＥＧＦ様反復における第３と第４システインとの間の挿入により進化し、そしてＡ鎖において複製されてドメインＩＶｂおよびＩＶａを形成することが示唆された。これらのドメインはメロシンに存在し、そしてそれ故、１つのドメインＩＶのみを含有するショウジョウバエ・ラミニンＡ鎖を除き、ラミニンＡ型鎖でよく保存されている。また、それは、ショウジョウバエＢ１鎖ドメインＩＶにより似ている複製された配列よりなるもう１つのドメインＩＶ”を有する。ドメインＩ＋ＩＩは長いアームのらせん領域を形成する。ＥＨＳラミニン鎖は、七つの基の反復を含有することが示されており、そして同様の反復がまたヒト・ラミニンＡ鎖およびメロシンにも見い出すことができる。プロリン残基はらせんを妨げることが知られている。マウス・ラミニンＡ鎖ならびにヒト・ラミニンＡ鎖およびメロシンには、ドメインＩ＋ＩＩに、４つの保存されたプロリン残基がある。鎖間ジスルフィド結合を形成することが示唆されているシステインのペアはメロシンで保存されている。メロシンのドメインＧは、１０７〜１７８アミノ酸残基を含有する５つの内部反復よりなる（本明細書に参考として援用されるEhrigら、Proc．Natl．Acad．S ci．USA 87:3264-3268(1990)）。これらの反復は、ヒトまたはマウス・ラミニンＡ鎖と比較すると、３０〜５０％の相同性を共有する。また、ショウジョウバエ・ラミニンＡ鎖はＧドメインに５つの反復を有するが、サブドメインＧ３とＧ４との間に、トレオニンに富んだ大きなスペーサー配列がある(Kusche-Gullbergら、EMBO J. 11:4519-4527(1992))。いくつかのタンパク質がラミニンＡ鎖およびメロシンにおけるＧドメインに相同であることが知られている。例えば、ＨＳＰＧ（ヘパリン硫酸プロテオグリカン）コアタンパク質の１つのドメイン、ペルレカン(perlecan)は、ヒト・ラミニンＡ鎖およびメロシンのドメインＧと３３％の相同性を有する。他の相同タンパク質は性ホルモン結合性グロブリン、Beckら、W．TaylorおよびP.Argos（編）Springer series in Biophysics ，Springer-Verl ag，ベルリン 7:231-256(1992)）、アンドロゲン結合性タンパク質(Josephら、F ASEB J. 6:2477-2481(1992))およびニューレキシン（Ushkaryov et al．Science 257:50-56(1992)）である(各々、本明細書に参考として援用される)。また、ショウジョウバエタンパク質fat、slitおよびcrumbsはメロシンおよびラミニンＡ鎖のドメインＧと類似性を共有する(Patthy，L.，FEBS Lett. 298:182-184(1992 ))。ヒト胎児組織におけるメロシンおよびラミニンＡ鎖の発現メロシン遺伝子の発現は、免疫組織学的実験からの各タンパク質を含有することが知られている多くの組織で観察された。しかし、初期胚段階における強いレベルの発現は、マウス胚でメロシンが検出されなかった従前の免疫染色実験(Lei voら、Proc．Natl．Acad．Sci USA 85:1544-1548(1988))とは対照的である。この不一致の理由は明らかではないが；任意の理論にも拘束されるつもりはないが、それは抗体におけるいくつかの未知の制限によるか、あるいは転写物がタンパク質に効率的に翻訳されないのであろう。メロシンは、マウス筋肉組織ではまず誕生後に(Leivoら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:1544-1548(1988))、およびいくつかの哺乳動物種ではいくつかの他の組織においてはまた成体段階において (Sanesら、J．Cell Biol. 111:1685-1699(1990))出現することが報告されている。１７週齢のヒト胎児組織について本明細書で示されたデータは、心筋、膵臓、脈絡膜叢および髄膜におけるメロシン遺伝子の強い発現を明らかにしており、また、有意な発現が精巣、皮膚、副腎、腎臓、肺、脾臓、神経網膜、嗅覚球および小脳で観察されている。胸腺、肝臓、骨、あるいは中間および上衣ゾーンのようないくつかの脳組織または皮質板では実質的にシグナルは観察されていない。インサイチュハイブリダイゼーション分析は、メロシン遺伝子の発現を心筋の筋細胞に位置付け、これは、いくつかの従前の実験(Leivoら、Proc．Natl．Acad．Sc i．USA 85:1544-1548(1988)；Paulssonら、J．Biol．Chem. 264:18726-18732(19 89); Kleinら、Development 110:823-837 (1990); Engvallら、Cell Regul. 1:7 31-740(1990); Paulssonら、J．Biol．Chem. 266:17545-17551(1991))と合致する。しかし、腎臓および皮膚における凝縮間葉近くの支質細胞で発現が観察された。メロシンはモノクローナル抗体によって外部皮質における支質細胞とプレ管状凝縮体との間に位置する狭領域に対して位置付けされた。また、メロシンｍＲＮＡとタンパク質発現との間の良好な一致もまた、他の胚性組織で観察される。発育する毛包の先端および皮脂腺における細胞の直ぐ下に位置する間葉細胞で観察される強い発現は、外分泌腺の発育におけるメロシンの可能な役割を示す。メロシンの発現は、分析したいずれの組織の上皮または内皮細胞においては見い出されなかった。結局、胚形成の間では、メロシンの発現は、それだけではないにせよ、主には間葉起源の細胞の特性であると結論され得る。ラミニンＡ鎖遺伝子の発現は、メロシン遺伝子のそれよりも、ヒト胎児組織ではより制限されていることが示された。新生児ヒト組織について従前に報告されているように(Nissinenら、Biochem．J. 276:369-379(1991))、ノーザン分析は腎臓におけるラミニンＡ鎖遺伝子の発現を明らかにした。本実験は、この段階の腎臓発育の発現をインサイチュハイダリブイゼーションによって特定の細胞に位置付けなかった。ラミニンＡ鎖は、腎臓において、成体組織の管状および糸球体基底膜に(Sanesら、J．Cell Biol. 111:1685-1699(1990))および極性（polarize d）腎臓上皮細胞（Holmら、Cell Differ. 24:223-238(1988)；Klelnら、Cell 55 :331-341(1988); Ekblomら、Cell 60:337-346(1990)）に位置付けられている。K leinら、Development 110:823-837(1990)は、胚性心臓、肝臓、肺および腸におけるラミニンＡ鎖ｍＲＮＡの検出を報告し、そしてこのＡ鎖を含有するラミニンが骨格筋および心筋、肺、肝臓、腎臓および腸から単離されている(Paulssonら、J．Biol．Chem. 264:18726-18732(1989))。しかし、１７週齢ヒト胎児からの組織に関する本実験においては、長い暴露の後でさえ、肺、心臓または肝臓でこのＡ鎖ｍＲＮＡに対するシグナルは観察されなかった。この不一致は、発育の間の時間的発現の差異に起因し得る。神経網膜、嗅覚球および小脳におけるラミニンＡ鎖遺伝子の強い発現は興味深く、そして脳および神経の発育におけるその役割を示す。脳の発育の間における時間的および空間的発現をさらに分析するために、発育する脳組織についての詳細な免疫組織学的およびインサイチュハイブリダイゼーション分析が開始されている。本実験を含むいくつかの研究は、インビボにおけるラミニンサブユニット鎖の空間的および時間的発現双方における変動を示した。これは、部分的には、異なるラミニンのイソ形態の組織特異的機能を意味する。メロシンおよびラミニンＡ鎖に関し、各々、本明細書に参考として援用されるEngvallら、Cell Regul. 1:7 31-740(1990)およびSanesら、J．Cell Biol. 111:1685-1699（1990）は、それらが、しばしば、基底膜の異なる型において相互に排他的であることを示し、これは、ラミニン分子が重鎖としてＭ（メロシン）またはＡ鎖のいずれかを含有することを示す。ヒト胎児組織由来のＲＮＡについて行った本明細書におけるノーザンブロットおよびインサイチュハイブリダイゼーション分析は、Ｍ（メロシン）およびＡ鎖の異なる組織分布を支持する。特に、これらの結果は、メロシン遺伝子は胚発生の間にいくつかの組織において、そして恐らくは間葉細胞によってのみ発現されることを示した。しかし、また、これらの結果は、皮膚および肺上皮細胞ならびに血管内皮細胞のようないくつかのラミニン産生細胞および組織はこれらの組織において、いずれの遺伝子をも発現しない、またはその発現が非常に弱いことを示した。これは、いくつかの、いまだに同定されていないＡ型重鎖を含有するラミニンのイソ形態が存在することを示唆する。このようなイソ形態はカリニンまたはＫ−ラミニンを包含し得る。現在好ましい実施態様を参照して本発明を記載してきたが、本発明の精神を逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 9453−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＧ０１Ｎ 33/53 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/574 0276−2Ｊ 33/574 Ａ 33/577 0276−2Ｊ 33/577 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者レイボ，イルモアメリカ合衆国マサチューセッツ 02148，マルデン，ケネディードライブ 167，アパートメント 808

Claims

【特許請求の範囲】１．図１のヌクレオチド９６３〜３５５４を伴う図６のヌクレオチド１〜６９４３として示される配列を実質的に有する単離された核酸分子。２．前記核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の核酸分子。３．前記核酸がｃＤＮＡである、請求項１に記載の核酸分子。４．前記核酸がｍＲＮＡである、請求項１に記載の核酸分子。５．図６に示されるアミノ酸配列を実質的に有するヒトメロシンをコードする、単離された核酸分子。６．図６に示されるアミノ酸配列を実質的に有する、生物学的に活性なポリペプチド。７．図１に示されるポリペプチドと反応性の抗体を除く、請求項６に記載のポリペプチドと反応性の抗体。８．前記抗体がポリクローナルである、請求項７に記載の抗体。９．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項７記載の抗体。１０．請求項１に記載の核酸分子を含む組換え発現ベクター。１１．請求項５記載の核酸を含む組換え発現ベクター。１２．請求項１０および１１に記載の組換え発現ベクターを含む宿主−ベクター系。１３．前記宿主が原核生物細胞である、請求項１２に記載の宿主−ベクター系。１４．前記原核生物細胞が大腸菌(Escherichia coli)細胞である、請求項１３に記載の宿主−ベクター系。１５．前記宿主が真核生物細胞である請求項１２に記載の宿主−ベクター系。１６．請求項１３に記載の細胞および適切な培地を含む細胞培養。１７．図６に示される配列を有する核酸分子の部分に、緊縮条件下でハイブリダイズするが、図１に示される核酸の部分または図１に示される配列に相補的な配列にはハイブリダイズしない、少なくとも１０ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む核酸プローブ。１８．試料中のメロシンをコードする核酸の存在を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：ａ）請求項１７に記載のプローブを、相補的核酸に該プローブがハイブリダイズする条件下で、該試料に接触させる工程；ｂ）インビトロおよびインサイチュまたは伸長した核酸にハイブリダイズした任意のプローブの存在を検出し、ハイブリダイズしたプローブの存在が該試料中のメロシンをコードする核酸の存在を示す工程。１９．前記プローブが放射性ヌクレオチド、酵素、ビオチンおよび蛍光マーカーから選択される検出可能なマーカーで標識される、請求項１８記載の方法。２０．試料中のメロシンの存在を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：ａ）抗体−メロシン複合体が形成される条件下で、請求項７に記載の抗体と該試料を接触させる工程；ｂ）形成された任意の複合体の存在を検出し、該複合体の存在が該試料中のメロシンの存在を示す工程。２１．前記抗体が検出可能なマーカーで標識される、請求項２０に記載の方法。２２．メロシンの断片をコードする核酸分子であって、該断片が図６に示されるヌクレオチド１〜５９９２を含む核酸配列の制限酵素消化により産生される、核酸分子。２３．腫瘍の悪性度を測定する方法であって、請求項７に記載の抗体を用いて、腫瘍により産生されるメロシンを検出する工程を包含し、該メロシンの実質的な不存在が悪性腫瘍を示す、方法。２４．軸索成長を促進する方法であって、ニューロンを、請求項５に記載の核酸分子により産生されたタンパク質と接触させる工程を包含する、方法。２５．軸索成長を阻害する方法であって、メロシンを、軸索促進活性を阻害する請求項７に記載の抗体と接触させる工程を包含する、方法。２６．基質にメロシンを結合させる細胞の細胞付着を促進する方法であって、図６においてアミノ酸１〜１９８２として示されるアミノ酸配列またはその細胞付着促進部分を実質的に有するポリペプチドを含む基質と該細胞を接触させる工程を包含する、方法。