JP3428441B2

JP3428441B2 - タイトジャンクション構成膜蛋白質クローディンファミリー

Info

Publication number: JP3428441B2
Application number: JP17984798A
Authority: JP
Inventors: 承一郎月田
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1998-05-15
Filing date: 1998-06-26
Publication date: 2003-07-22
Anticipated expiration: 2018-06-26
Also published as: JP2000032984A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、タイトジャンクシ
ョン（Tight Junction,以下、ＴＪと記載)の新規な構成
膜蛋白質に関するものであり、医学の分野で利用され
る。

【０００２】

【従来の技術】多細胞動物において、隣接する細胞との
接着の情報は、細胞の増殖、分化、炎症、癌転移などの
生命現象の調節、維持に深く関係している。接着に関与
している細胞間接着分子は細胞表面で集合して、接着の
ための特殊に分化した膜領域をつくることが多い。とく
に、上皮細胞において、カドヘリンなどの細胞間接着分
子は、その細胞質ドメインで細胞骨格と強く結合してい
ることが知られている。このような膜領域は、細胞間接
着装置と呼ばれ、主として次の４つに分類されている。
gap junction（ＧＪ）、adherens junction （ＡＪ）、
desmosome およびtight junction（ＴＪ）である。ＴＪ
は、上皮または内皮細胞層における細胞間接着装置の一
つである。それは、溶質および水が細胞外空間を自由に
通過することを妨げる物理的関門の役目を果たし(関門
機能)、細胞を取り巻く連続した周縁シールを構成す
る。またＴＪは、先端および基底外側形質膜領域間の境
界として細胞極性を形成し維持する役目を果たす（防壁
機能）と考えられている。オクルディンは、ＴＪのみに
局在し、４個の膜貫通領域を持つ、現在知られている唯
一の構成膜蛋白質であり（Furuse,M.et al.,J.Cell Bio
l.,123,1777-1788,1993, Ando-Akatsuka,Y.et al.,J.Ce
ll Biol.,133,43-47,1996)、その後の研究により、オク
ルディンは、ＴＪ鎖の生成に直接関与することおよびＴ
Ｊの機能性成分であることが報告されている。ところが
最近、オクルディンがただ１種のＴＪ構成膜蛋白質では
ないことが示唆された。すなわち、Ｃ端部切断オクルデ
ィンをＭＤＣＫ細胞に導入すると、内因性オクルディン
は細胞間境界に沿って点状に再分布されるが、ＴＪ鎖の
連続的網目構造は影響を受けない（Balda,M.S.et al.,
J.Cell Biol.,134,1031-1049,1996）。オクルディンの
第２細胞外ループに対応する合成ペプチドを培地に添加
すると、培養上皮細胞の接着装置領域から内因性オクル
ディンを駆逐するが上皮細胞の形態全体に影響を与えな
い（Wong,V.et al.,J.Cell Biol.,136,399-409,199
7）。さらに、いくつかの種における、非神経組織の内
皮細胞およびセルトリ細胞(Seritoli cell)は、ＴＪを
もつがオクルディンは痕跡量しか発現しないことが報告
された（Hirase,T.et al.,J.Cell Sci.,110,1603-1613,
1997)。ごく最近になって、本発明者らは、幹胚葉（emb
ryonic stem , 以下ＥＳと記載）細胞のオクルディン遺
伝子をノックアウトすることに成功したが、オクルディ
ン欠失ＥＳ細胞が発生過程で上皮細胞に分化した時、Ｔ
Ｊは隣接上皮細胞間によく発達することが見出されたの
である。この知見は、オクルディンが必ずしもＴＪの生
成自体に必要なのではないこと、およびオクルディンが
なくても鎖構造を形成し得る未同定のＴＪ構成膜蛋白質
（類）が存在することを、決定的に示した。オクルディ
ンの機能を理解するため、およびＴＪの分子体系を更に
明確に理解するために、ＴＪの新しい構成膜蛋白質
（類）の同定が待望された。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ＴＪの新しい構成膜蛋
白質を同定することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＴＪを高
密度に含むニワトリ肝臓より調整した接着装置画分を原
料として、オクルディンと行動を共にする蛋白質の同定
を試みた。まず、４Ｍグアニジン処理し不溶性画分を不
連続ショ糖密度勾配遠心分離により分画しSDS-PAGEにて
解析した結果、約22kDの幅広いバンドがオクルディンと
ともに行動する事を確認した。このバンドの上半分、下
半分にわけ、直接アミノ酸配列を解析し２種のペプチド
を確認した。ついで、GenBank/EMBL/DDBJからのホモロ
ジー検索の結果２種のＥＳＴクローンが見出され、この
ＥＳＴ配列を利用して、マウス肝臓cDNAライブラリーよ
り２種の相互に関連するcDNAを単離構造解析した。これ
ら蛋白質とFLAGペプチドとの融合蛋白質をコードするcD
NAをMDCK細胞に導入し、該蛋白質を安定的に発現するMD
CK細胞を用い、これら蛋白質の細胞内分布を顕微鏡観察
により調べたところＴＪ特異的に存在する事が確認さ
れ、それぞれクローディン１および２と命名した。クロ
ーディン１および２の塩基配列をもとに、ホモロジー検
索を行ったところRVP1（Rat androgen withdrawal apot
osis protein,Briehl and Miesfeld,Mol.Endocrinol.5:
1381-1388,1991, Peacock et al.,Gemomics 46:443-44
9,1997）、CPE-R（Clostridium perfringens enterotox
in receptor, Katabira et al.,J.Cell Biol.136:1239-
1247,1997）、TMCVF（Transmembrane potein deleted i
n Vela-cardio-facial syndrome, Sirotkin et al.,Gen
omics.42:245-251,1997）がホモロジーを持つことが見
出されクローディンが遺伝子ファミリーを構成する可能
性が示唆された。そこで、さらなるクローディンファミ
リーの構成員を見出すために、クーディン１とのホモロ
ジーで見出されたマウスESTクローンをもとに、PCRを行
って新規なクローディンをコードするcDNAを見出した。
このうちRVP1のマウスホモログをクローディン３、CPE-
Rをクローディン４（マウスCPE-Rの配列は既知であ
る）、TMCVFのマウスホモログをクローディン５と命名
した。さらにクローディン１〜５とは異なるESTクロー
ンの配列をもとにPCRを行ってクローディン６，７，８
を見出した。クローディン３〜８の構造を決定し、これ
ら蛋白質とFLAGペプチドとの融合蛋白質を発現するDNA
をMDCK細胞に導入したところ、クローディン３〜８全て
がクローディン１，２と同様にＴＪ特異的に存在する事
を見出した。以上の結果より生理学的機能が不明であっ
たRVP1、CPE-R、TMCVF（クローディン３，４，５）を含
め、クローディン１〜８がＴＪを構成する遺伝子ファミ
リー（以下、配列番号１および２あるいは配列番号１８
から２２に記載のアミノ酸配列を有するクローディン
１，２，３，５，６，７，８をまとめてクローディンフ
ァミリーと称す。）を形成すること見出し、本発明を完
成するに至った。すなわち本発明は、配列番号１および
２あるいは配列番号１８から２２に記載の（クローディ
ン４の配列は既知であるので記載していない）アミノ酸
配列を有するＴＪ構成膜蛋白質クローディン１，２，
３，５，６，７，８、それらをコードするＤＮＡ。これ
らＤＮＡを含有するベクター、これらベクターを保持す
る形質転換体、これら形質転換体を培養し発現産物を回
収する事を含む蛋白質の製造方法。クローディンファミ
リーと結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル
抗体。クローディンファミリーをコードするＤＮＡ配列
に由来する、少なくとも１５個の連続する塩基からなる
オリゴヌクレイチドをプライマー又はプローブとして用
いる、生体試料中のクローディンファミリー遺伝子の解
析方法、およびクローディンファミリーの発現に影響を
与える薬物をスクリーニングする方法、に関する。本発
明のＤＮＡは、その一部をプライマーまたはプローブと
して用いることにより、クローディン蛋白質の遺伝子解
析や遺伝子の発現の解析に利用することができる。一部
とは、プライマーまたはプローブとして使用するオリゴ
ヌクレオチドが本発明のＤＮＡ配列をもとに少なくとも
１０個の対応する塩基配列を含むものからなり、好まし
くは少なくとも１５個の塩基配列、さらに好ましくは少
なくとも約２０〜３０個の塩基配列を含むものからなる
対応するポリヌクレオチドを意味する。またプローブと
しては、さらに高分子のもの、全ＤＮＡも使用すること
ができる。本発明のクローディン蛋白質の全部または一
部をエピトープとして用い、抗体の作成、およびその抗
体を用いる研究用、診断用試薬として利用することがで
きる。エピトープとは、ポリペプチドの抗原決定基を意
味し、一般に少なくとも６個のアミノ酸で構成され、６
個のアミノ酸で構成されるポリペプチドが抗体と結合す
ることは公知である（公表特許公報60-500684 号）。本
蛋白質の抗原ペプチドは、本発明のアミノ酸配列に基づ
いて、連続してなる少なくとも６個のアミノ酸、好まし
くは連続してなる少なくとも８個のアミノ酸、より好ま
しくは連続してなる少なくとも約１５個のアミノ酸、さ
らに好ましくは連続してなる少なくとも約２０個のアミ
ノ酸からなるポリペプチドを意味する。

【０００５】

【発明の実施の形態】ニワトリ接着装置の調整法はTsuk
itaらの方法に調整することができる(Tsukita,Sh.et a
l.,J.Cell Biol.,108,31-41,1989, Furuse,M.et al.,J.
Cell Biol.,123,1777-1788,1993）。遺伝子操作法は成
書（Maniatis et al.,Molecular Cloing:A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,1989）に記載
されている方法にしたがった。本発明のモノクローナル
抗体の調製はクローディンを抗原とし、必要に応じてキ
ャリアー蛋白との複合体を作り、これを動物に接種して
免疫する。上記免疫動物の脾臓あるいはリンパ節から得
られた抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合し、クローディ
ンに強い特異性を示す抗体を産生するハイブリドーマを
選択することにより調製される。その操作は従来既知の
方法に準ずればよい。免疫抗原としては天然精製品、遺
伝子組換手法あるいは化学合成手法による生産品などい
ずれも使用できる。遺伝子組換手法によるクローディン
の調製は、クローディンをコードするｃＤＮＡをクロー
ディンの発現に適したベクターのプロモター下流に制限
酵素とＤＮＡリガーゼを用いる公知の方法により再結合
して組換え発現ベクターを作製することでできる。ベク
ターは宿主内で複製、増幅可能であれば特に限定されな
い。プロモーターおよびターミネーターに関してもクロ
ーディンをコードする塩基配列の発現に用いられる宿主
に対応したものであれば特に限定されず、宿主に応じて
適切な組み合わせも可能である。このようにして得られ
た組換え発現ベクターはコンピテント細胞法（J. Mol.
Biol., 53, 154,1970）、リン酸カルシウム法（Scienc
e, 221, 551, 1983 ）、などにより宿主に導入し、形質
転換体が作製される。宿主としては大腸菌および動物細
胞などが用いられ、得られた形質転換体はその宿主に応
じた適切な培地中で培養される。培養は通常20℃〜45
℃、pH５〜８の範囲で行われ、必要に応じて通気、撹拌
が行われる。培養物からのクローディンの分離、精製は
公知の分離、精製法を適宜組み合わせて実施すれば良
い。これらの公知の方法としては塩析、溶媒沈殿法、透
析ゲル炉過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフ
ィ、アフィニティクロマトグラフィー、逆相高速液体ク
ロマトグラフィなどが挙げられる。

【０００６】免疫抗原クローディンは、部分構造を有す
るフラグメントあるいはペプチドであってもよく、クロ
ーディンの全アミノ酸配列から適宜選択することができ
る。クローディンのアミノ酸配列から４箇所の膜貫通部
位を有すると予想されることから、目的に応じて細胞膜
の外部内部など適宜選択し抗原として採用し、目的とす
る抗体を作製することができる。抗原とキャリア蛋白の
複合体の調製は種々の縮合剤を用いることができるが、
グルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性
エステル等が使用できる。キャリア蛋白は牛血清アルブ
ミン、サイログロブリン、ヘモシアニン等の常用されて
いるものでよく、通常１〜５倍量の割合でカップリング
させる方法が用いられる。免疫される動物としてはマウ
ス、ラット、ウサギ、モルモットなどがあげられ、接種
方法は皮下、筋肉あるいは腹腔内に投与される。投与に
際しては完全フロイントアジュバンドや不完全フロイン
トアジュバンドと混和して投与してもよく、投与は通常
２〜５週毎に１回ずつ行われる。免疫された動物の脾臓
あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細
胞と細胞融合させられハイブリドーマとして単離され
る。骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来の
ものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のものである
ことが好ましいが、異種間においても可能な場合もあ
る。細胞融合の操作は既知の方法、たとえばケーラーと
ミルスタインの方法（Nature, 256, 495, 1975）に従い
実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコー
ルやセンダイウイルスなどが挙げられるが、通常20〜50
％程度の濃度のポリエチレングリコール（平均分子量10
00〜4000）を用いて20〜40℃、好ましくは30〜37℃の温
度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常１：１
〜１０：１程度、約１〜10分間程度反応させることによ
り細胞融合を実施することができる。抗クローディン抗
体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の免疫
化学的方法が使用できる。たとえば、クローディンをコ
ートしたマイクロプレートを用いるＥＬＩＳＡ（Enzyme
-linked immunosorbent assay ）法、抗免疫グロブリン
抗体をコートしたマイクロプレートを用いるＥＩＡ（En
zyme immunoassay）法、クローディンを含むサンプルを
電気泳動後ニトロセルロース転写膜を用いるウエスタン
ブロット法などがあげられる。このようなウエルから更
に例えば限界希釈法によってクローニングを行いクロー
ンを得る。ハイブリドーマの選別、育種は通常ＨＡＴ
（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加
して、10〜20％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、
ＲＰＭＩ1640）で行われる。このようにして得られたク
ローンはあらかじめブリスタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃ
マウスの腹腔内へ移植し、10〜14日後にモノクローナル
抗体を高濃度に含む腹水を採取し、抗体精製の原料とす
ることができる。また、該クローンを培養し、その培養
物を抗体精製の原料とすることもできる。モノクローナ
ル抗体の回収は免疫グロブリンの精製法として既知の方
法を用いればよく、たとえば、硫安分画法、ＰＥＧ分画
法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利用、さらに
アフィニティクロマトグラフィなどの手段により容易に
達成することができる。本発明によって得られた抗クロ
ーディンモノクローナル抗体を用いる免疫学的方法によ
り生体試料中のクローディンの定性、定量を行うことが
できる。免疫学的方法としては、生体試料を必要に応じ
て適切に処理、たとえば細胞の分離、抽出操作などした
試料について、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、凝集
法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用する
ことができる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を
用いる直接法、該抗体に対する抗体の標識化されたもの
を用いる間接法などにより行ないえる。標識化剤として
は螢光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の
標識物質はいずれも使用できる。本発明のモノクローナ
ル抗体はＦｃ’あるいはＦｃ領域を除去したＦａｂ’あ
るいはＦａｂ画分、あるいはその重合体を用いてもよ
い。またそのキメラ抗体、ヒト化抗体であってもよい。

【０００７】クローディンの発現に影響を与える薬剤の
スクリーニングは以下のように実施できる。クローディ
ンを発現する細胞株を、ノーザンブロッティング・RT-P
CR等のクローディンmRNAの発現により選択する。また、
上に述べた方法により得られた抗体を用いて蛍光抗体法
・酵素抗体法等により選択しても良い。選択した細胞を
被験薬剤の存在下に培養し、クローディンmRNA発現量を
ノーザンブロッティング・スロットブロットハイブリダ
イゼーション・RT-PCR等により、あるいはクローディン
の発現量を蛍光抗体法・酵素抗体法等により定量し、被
験薬剤のクローディンの発現に対する影響を測定する。
たとえば、実施例３に記載した方法に準ずることができ
る。また、より容易に大量の薬剤をスクリーニングでき
るように以下のような工夫をしても良い。ヒトDNAライ
ブラリーより、クローディンcDNAの5'領域とハイブリダ
イズするクローンを選び出し、適当なプロモータースク
リーニングシステムに挿入してプロモーター活性を持っ
たクローンを選択する。場合によっては、ここでプロモ
ーター活性に必須の領域を絞り込んでも良い。ここで選
択したクローディンのプロモーター領域を持ったDNA
を、活性の測定が容易な酵素、例えばルシフェラーゼ・
アルカリフォスファターゼなどをコードするDNAの上流
に挿入してレポーター遺伝子を構築する。このレポータ
ー遺伝子をNeo^r,hyg^rなどの適当な耐性遺伝子と共に培
養が可能な細胞、例えばHeLa細胞等に導入後、耐性遺伝
子に対応した薬剤で選択し、クローディンを発現させる
プロモーターの活性を測定できる細胞株を確立する。こ
の細胞株に薬剤を作用させて導入した酵素の活性を測定
し、クローディンの発現に影響を与える薬剤のスクリー
ニングを実施する。別のスクリーニング系として、クロ
ーディンファミリーと結合する化合物の選択に利用する
ことができる。結合する化合物はクローディンの機能に
影響を与える可能性を有し、また実施例に示されるよう
にクローディンファミリーの分布に臓器特異性が見られ
ることから、クローディンファミリーに対する結合能に
特異性を有する化合物であれば、臓器特異的な作用を発
現する可能性がある。スクリーニング法の一例として、
クローディンＤＮＡで形質転換した細胞またはその細胞
膜あるいは単離されたクローディン蛋白質またはその部
分ペプチドなどが使用される。適切な条件下で、クロー
ディンと試験化合物とを反応させ両者の結合の有無を測
定すればよい。測定手法は例えば標識物質を適宜利用す
ることにより測定することができる。また、クローディ
ン４がClostridium perfringensのエンテロトキシンの
レセプターであり、クローディン３もエンテロトキシン
と結合する（Kitahara et al.,J.Biol.Chem.272:26652-
26658,1997）ことから、クローディンファミリーとエン
テロトキシンの結合を阻害する化合物は、エンテロトキ
シン阻害剤として期待され、クローディンファミリーの
遺伝子産物はエンテロトキシン阻害剤のスクリーニング
に利用することが可能である。なお、本発明が構造解析
したクローディンファミリーはマウス由来であるが、本
発明のクローディンファミリー遺伝子解析方法およびス
クリーニング方法はヒト由来のクローディンファミリー
を使用した場合も本発明の範囲に含まれるものである。

【０００８】

【実施例】以下の実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施
例に使用する抗体および細胞は下記の通りである。ウサ
ギ抗ニワトリオクルディンポリクロナール抗体(F44)、
ラット抗ニワトリオクルディンモノクロナール抗体(Oc-
1)およびラット抗マウスオクルディンモノクロナール抗
体(MOC37)は常法により作製した。ラット抗マウスE-カ
ドヘリンモノクロナール抗体(ECCD2)は竹内教授(京都大
学)より譲り受けた。マウス抗FLAGモノクロナール抗体
(M2)(イーストマンコダック社製)とウサギ抗GFPポリク
ローナル抗体（クロンテック社製）は試薬を使用した。
MDCK II細胞(Madin-Darby腎タイプII細胞)は10％ウシ胎
児血清を含むDMEM培養液中にて増殖させた。SDSポリア
クリルアミド電気泳動はLaemmli (1970)の方法に準じ一
次元SDS-PAGE (12.5%)を行い、銀染色にて解析した。イ
ムノブロッティングは、ゲルからニトロセルロース膜に
転写後、抗体と反応させ、結合した抗体はビオチン化第
二抗体およびストレプトアビジン化アルカリホスファタ
ーザ（アマシャム社）を用い検出した。酵素基質はニト
ロブルーテトラゾリウムとブロムクロロインドリルリン
酸を使用した。

【０００９】実施例１ニワトリの肝臓から分離した結
合分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるオクルディンおよび
約２２ｋＤバンドの同定オクルディンは最初抗原としてニワトリ肝臓から分離し
た接着装置画分を抗原として作製したモノクローナル抗
体（ｍＡｂ）により同定されたが（Furuse,M.et al.,J.
Cell Biol.,123,1777-1788,1993）、分画中のオクルデ
ィンが銀染色バンドとして検出するに十分なほど大量に
存在するか否かについては検討されていない。そこで、
分離した接着装置画分を０．１％ＳＤＳ含有溶液で可溶
化し、オクルディンを抗ニワトリオクルディンポリクロ
ナール抗体（ｐＡｂ、Ｆ４４）により免疫吸着した。非
処理群と抗体処理群との銀染色パターンと比較すると、
Ｆ４４処理接着装置画分のそれは６０ｋＤ付近のバンド
を特異的に欠失していた。そこで、発明者らは、オクル
ディンは、銀染色ゲルにおいて単一の６０ｋＤバンドと
して検出できると結論した。そこで、発明者らは、分離
した結合分画の数々のバンドから、下記の処理において
６０ｋＤのオクルディンバンドと行動を共にするバンド
またはバンド類を同定することを試みた。ニワトリ肝臓
からの接着装置画分(Junction fraction)の分離は、１
〜２日齢のヒヨコ肝臓粗膜画分および胆細管画分より本
発明者らの方法により調整した。320 羽ヒヨコより約20
mlの接着装置を含むショ糖溶液を得ることができる。オ
クルディンを免疫吸収するために、100μlの接着装置画
分溶液を10mM Tris-HCl溶液(pH 7.5)にて洗浄し、遠心
分離により得られたペレットを100μl SDS溶液(0.1% SD
S, 150mM NaCl, 10mM Tris-HCl, pH 7.5)にて数回洗浄
した。室温で15分放置後、100μlのNP-40溶液(２％ NP-
40, 150mM NaCl, 10mM Tris-HCl, pH 7.5)を添加し、15
000xg, 20分間遠心分離した。25μlのウサギ抗ニワトリ
オクルディン血清(F44)と反応させた40μl容量相当のPr
otein A-Sepharose 4B(ファルマシア製)に前記上清を添
加し、４℃、２時間撹拌した後、その上清をSDS-PAGEに
供した。接着装置画分より、抹消膜蛋白質を完全に除く
ために、400μlの接着装置画分を10mM Tris-HCl溶液(pH
７.5)にて、遠心分離操作(15000xg, 5分)により２回洗
浄した。得られたペレットを800μlのグアニジン溶液(4
M グアニジン-HCl, 10mMTris-HCl, pH 7.5)に懸濁し氷
中30分放置後、700μlの10mM Tris-HCl溶液(pH 7.5)を
添加し希釈する。溶解した抹消膜蛋白質は遠心分離によ
り除去し、得られてペレットをSDS-PAGEに供し抹消膜蛋
白質の有無を確認した。予想通り、６０ｋＤのオクルデ
ィンバンドはグアニジン抽出に抵抗した。オクルディン
バンドに加えて、９個のバンドがグアニジン不溶性分画
中に検出され、その量はオクルディンのそれと同様また
はさらに多かった。これらのバンドは、仮に、上からバ
ンド１−９と称した（図１）。次いで、分離した接着装
置画分の分画は下記のように処理した。1.8 mlの画分を
600μlの10 mM HEPES溶液(pH 7.5)にて２回洗浄した
後、Sonifier 250(ブランソンウルトラソニット社製)を
用い10秒間超音波処理した。次いで、50%(wt/wt)ショ糖
溶液を加え、38％(wt/wt)ショ糖溶液とした。ショ糖濃
度50％、46％、42％、38％(サンプル含有)、34％、30
％、25％、20％、０％の不連続ショ糖溶液中で4000回
転、1.8時間、４℃にて遠心分離した(SW41ローター、ベ
ックマン社製)。それぞれの中間相を分取し、０〜20％
層と20〜25％層を、42〜46％層と46〜50％層を併せそれ
ぞれ0〜25％層、42〜50％層と命名した。それぞれ200
μlに、800μlの10 mM HEPES液(pH 7.5)を添加し、80,0
00回転１時間４℃にて遠心分離した（TLA100.2ロータ
ー、ベックマン社）。得られたそれぞれのペレットはSD
S-PAGE分析に供し、銀染色した後、オクルディンバンド
の分布を他のグアニジン不溶性バンド(バンド１ー９)の
それと比較した。その結果、このショ糖密度勾配条件下
において、オクルディンは２５：３０％、３０：３４％
および３４：３８％の層で大量に回収されたが、０：２
５％、３８：４２％および４２：５０％の層では痕跡量
しか回収されず（抗オクルディンｍＡｂを使用して確
認）、バンド１−９の中で、バンド９のみがオクルディ
ンと同一の分布パターンを示す事が判明した。一方、他
のグアニジン不溶性バンド１−８はオクルディンと異な
る行動を示し、バンド１−６＆８、およびバンド７はそ
れぞれ０：２５％層、および３８：４２％／４２：５０
％層に分画されていた。それ故、発明者らは、分離した
結合分画中の数々のバンドの中で、バンド９のみが、グ
アニジン処理のみならず超音波処理とその後のしょ糖密
度勾配遠心分離でも行動を共にしたと結論した。発明者
らは、バンド９中の２２ｋＤポリペプチド（類）が、オ
クルディンと共にＴＪ鎖を構成する内在性膜蛋白質の良
好な候補（類）であると推測した。

【００１０】実施例２マウスクローディン１および２
をコードしている完全長ｃＤＮＡのクローニンググアニジン不溶性分画中の２２ｋＤ付近の幅広いバンド
９を試験的に下半部と上半部に分け、これを直接ペプチ
ド配列決定に付した。ペプチドの構造解析は接着装置4
Mグアニジン不溶性画分を12.5%のポリアクリルアミドゲ
ルにて電気泳動を行い、22 kDに位置する広いバンド
（図１のNo.9のバンド）の上部半分および下部半分を直
接アミノ酸配列の解析に供した。すなわち下部半分のバ
ンドはポリビニリデンジフルオライド (PVDF) 膜（バイ
オラド社製）に転写後、クマシーブリリアントブルーR-
250にて染色し、HPG1005A蛋白シークエンサー（ヒュー
レット・パッカード社）にて解析した。上部半分のバン
ドは、ゲルをCBB染色後抽出しRosenfeld (1992)に従
い、アミノ酸配列をゲル内分解法 (in-gel digestion m
ethod) 解析した（Rosenfeld,I.et al.,Anal. Biochem.
203,173-197,1992）。その結果、22 kDバンドの上部お
よび下部より二つのペプチドを確認した。ホモロジー検
索により２種のＥＳＴクローンすなわちヒトＥＳＴクロ
ーン（寄託番号ＡＡ３０５４２４）およびマウスＥＳＴ
クローン（寄託番号ＡＡ１１６７０９）が同定された
が、これらはそれぞれペプチド配列１および２に顕著な
ホモロジーを示すアミノ酸配列をコードするものであっ
た。これらのＥＳＴ配列を使用して、マウス肝臓ｃＤＮ
Ａから２種の異なるが相互に関連するｃＤＮＡを分離し
た。cDNAのクローニングは、マウス肝の全RNAをChomzyn
skiの方法 (1987)に従い抽出し、poly A(+) RNAはオリ
ゴdTセルロース（ニューイングランドバイオラボス社
製）を用いて調整した。単鎖cDNAは、このpoly A(+) RN
AをもとにSuperscript ^TMII reversetranscriptase（ギ
ブコ社製）により作成しPCRに供した。マウス肝のλgt1
0 cDNAライブラリーは、Time Saver TM cDNA Symthesis
キット（ファルマシア社製）を用いて作製しcDNAスクリ
ーニングに供した。塩基配列はDye Terminater Cycle S
equence Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用
いて決定した。

【００１１】クローディン１のcDNA Genbank/EMBL/DDBJデータベースによる構造相関検索の
結果ヒトESTクローン(accession No. AA305424)はペプ
チドと高い相同性を有していることがわかった。そこ
で、ヒトEST配列をもとにデザインした配列番号５およ
び配列番号６に記載の二種のプライマーを用い、マウス
肝単鎖cDNAをPCRに供したところ216塩基対を有するDNA
断片の増幅物が得られた。塩基構造解析の結果ヒトEST
のマウス相同体をコードするDNAであることが判明し
た。このcDNA断片を鋳型として、DIG標識プローブをDIG
High Prime標識キット（ベーリンガーマンハイム社
製）を用いて作製し、λgt10 マウス肝cDNAライブラリ
ーのスクリーニングに供した。その結果、0.9 Kbの陽性
クローン(INO1)を得、これをpBluescript SK(-)を用い
サブクローニングを行った。ペプチド１配列はN末端部
分の配列を有していることから、このクローンはORFの
3'-非コード領域を含み、ORFの5'末端部分を含まないこ
とが判明した。そこで、マウスESTクローンのデータベ
ース検索したところAccession No 562761が同定され、
このクローンはINO1の3'末端に5'末端配列が接続しペプ
チド-1配列と高い相同性をもつポリペプチドをコードし
ていることが判明した。すなわちこのクローンは5'側非
コード領域、ORFの5'末端を含有していた。ESTクローン
およびINO1をもとにデザインした二種のプライマー、す
なわち配列番号７および配列番号８記載のDNAをプライ
マーとして用い、マウス肝単鎖cDNAをPCRに供し、全ORF
を含むcDNAの調整を試みた。増幅産物をpGEM-T Easy Ve
ctor（プロメガ社製）を用いサブクローニングを行い、
pGTCL-1と命名した。構造解析の結果、クローディン１
のcDNAは、推定分子量22.9 kdをもつアミノ酸211個のポ
リペプチドをコードしているORFを含んでいた（配列番
号１）。

【００１２】クローディン２のcDNAの決定クローディン１の場合と同様の手法にて行った。すなわ
ち、Genbankデータベースを用いる相同性解析によりマ
ウスESTクローン (accession No. AA116709)を確認。ペ
プチド２配列と高い相同性を有するペプチドをコードす
るこのクローンはORFの3'末端及び3'非コード領域を含
有し、ORFの5'末端は含有していない。マウス肝cDNAラ
イブラリーをMarathon^TM cDNA増幅キット（クローンテ
ック社製）を用し調整し、ESTクローンからデザインし
た配列番号９記載のオリゴヌクレオチドおよびキットに
備えられたAP-1プライマーを用いPCRを実施した。PCR増
幅物の構造解析したところ、5'側の非コード領域および
ORFの5'末端部を含むことが確認された。次いで、EST配
列およびこの増幅物よりデザインされた二種のプライマ
ー、すなわち配列番号１０および配列番号１１記載のプ
ライマーを用いて全ORFを含むcDNAをPCR法により増幅さ
せた。pGEM-T Easy vector（プロメガ社製）を用いサブ
クローニングを行い、これをpGTCL-2と命名した。。さ
らなるプラスミド構築に関して、挿入物はpGTCL-2のEco
RI分解により調整し、pBluescript SK(-)に挿入し、こ
のプラスミドをpSKCL-2と命名する。これらのcDNAは、
推定分子量24.5 kdをもつアミノ酸230個のポリペプチド
をコードしているORFを含んでいた。これらのポリペプ
チドは互いに配列の類似性（アミノ酸配列レベルで３８
％の同一性）を示したが、オクルディンには示さなかっ
た。さらに、親水性プロッティングは、オクルディンと
同様に、クローディン１および２の両者が４個の膜貫通
領域を含むことが推測された。

【００１３】実施例３マウスクローディン１および２の発現と分布マウスクローディン１および２の発現と分布を調べるた
めに、発明者らはC端にFLAGペプチドまたはGFPを結合さ
せたクローディン１および２の発現ベクターを構築し
た。まず、FLAGペプチドを結合させたクローディン１発
現ベクター(pCCL1F)を作製するために、配列番号１２お
よび配列番号１３記載のオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとするPCRによりクローディン-1のストップコドン部
にBamH1認識配列を導入した。このPCR産物のEcoRI-BamH
I断片とpGTCL-1のSacI-EcoRI断片をSacIおよびBamHIに
て分解したpBluescript SK(-)に同時に導入し、pSKCL-1
CBを構築した。FLAGペプチドをコードするアダプターDN
Aは、配列番号１４および配列番号１５に記載の二つの
オリゴヌクレオチドをアニールし、T4 polynucleotide
kinaseを作用させリン酸化することにより作製した。FL
AG標識クローディン１をコードするDNAを含有するプラ
スミドpSKCL-1Fは、FLAGアダプターと、BamHIとEcoRVで
消化したpSKCL-1CBを結合させることにより作製した。p
SKCL-1FをSacI-KpnIで消化したのちT4ポリメラーゼで平
滑末端としたDNAをpCAGGS-neodel EcoRI (Niwa et al 1
991)に導入しFLAG標識クローディン１の発現ベクターを
pCCL-1Fを調整した。FLAG標識クローディン２発現ベク
ターpCCL-2Fは上記クローディン１の場合と基本的に同
手法により調整した。配列番号１６および配列番号１７
記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行
い、クローディン２ cDNAのストップコドンにBamHI認識
配列を導入した。pSKCL-2のSacIとXhoIとの消化断片と
このPCR増幅産物のXhoIとBamHIとの消化断片をSacIとBa
mHIで消化したpSKCL-1Fに導入し、FLAG標識ペプチドを
コードするDNAを含有するプラスミドを調整した。このF
LAG標識クローディン２ cDNAはpCAGG neodel EcoRIに導
入し、発現ベクターpCCL-2Fを調整した。GFP標識クロー
ディン１発現ベクター(pBCL-1G) を作製するために、pQ
BI25（クアンタムバイオテクノロジー社製）から調整し
たGFPのcDNAの上流にXbaI認識配列とグアニン12塩基断
片（グリシン４残基をコード）を導入し、pBluescript
に挿入した(pGGLG4)。クローディン１ cDNAのストップ
コドンにXbaI認識配列をPCRを用いて導入したのち、pGG
LG4のXbaI認識配列に挿入した。クローディン１のGFP融
合タンパク質をコードするDNAを発現ベクターpBATEM2(N
ose, 1988) に導入し、発現ベクターpBCL-1Gを作製し
た。MDCKII細胞は形質転換用細胞として使用した。形質
転換効率を良くするために、50 mM Ca⁺⁺含有DMEM (LCM)
に5% FCS（Ca⁺⁺を除去したもの）を添加した培養液にて
一晩培養(35 mm dish)したのち、血清フリーLCMで２回
洗浄する。1 mgのpCCL-1F, pCCL2FまたはpBCL-1Gを0.1
mgのpSTneoB (Katoh, 1987)と共に、1 mlのLCM培養液中
（Lipofectamine Plus：ギブコ社製）、上記細胞と反応
させた。５時間反応後、2 ml 10% FCS含有DMEMを添加
し、細胞を一日培養する。次いで、10% FCSおよび300 m
g Geneticine（ギブコ社製）を含むDMEM培養液を用い、
２個の9 cm dishにて培養し安定な形質転換細胞を選択
した。10〜14日後Geneticine抵抗性コロニーを選択し、
融合タンパク質を発現するクローンを抗FLAG抗体又はGF
Pフルオレセインを用いて蛍光顕微鏡にてスクリーニン
グした。上記の方法により、発明者らは、FLAGペプチド
またはGFP（緑色蛍光蛋白質）で標識したクローディン
１および２を培養MDCK細胞に導入したところ、予想通り
の分子量をもったFLAG標識クローディン１、FLAG標識ク
ローディン２およびGFP標識クローディン１を安定的に
発現するMDCK細胞が得られた。次いで、これらの標識蛋
白質の細胞下分布を、オクルディンおよびＥカドヘリン
のそれと比較しながら共焦点顕微鏡法で調べた。図２に
示すように、導入したFLAG標識クローディン１およびFL
AG標識クローディン２の両者がＴＪでオクルディンと精
確に並置された。コンピューターで作成した断面像か
ら、FLAG標識クローディン１およびFLAG標識クローディ
ン２が密集して遺伝子導入したMDCK細胞膜頂端部におい
てオクルディンと精確に並置されることを明らかにした
が、Ｅカドヘリンはさらに下側に局在するようであり、
これはクローディン１またはクローディン２の分布と重
ならないことを示すものであった。同様な結果が、GFP
標識クローディン１発現MDKCK細胞でも得られたが、こ
れは標識蛋白質が導入蛋白質の細胞下分布に影響した可
能性を除外するものであった。これらの知見は、クロー
ディン１および２の両者がＴＪに濃縮されていることを
示した。これらの蛋白質がＴＪ鎖自体上に局在するか否
かを調べるために、FLAG標識クローディン１、FLAG標識
クローディン２およびGFP標識クローディン１を発現す
るMDCK細胞を、抗FLAGモノクローナル抗体または抗GFP
ポリクローナル抗体を使用して免疫凍結破砕レプリカ法
により分析した。すべての場合に、ＴＪ鎖は特異的に標
識されたが、これはクローディン１および２の両者がＴ
Ｊ鎖に直接取りこまれたことを示すものであった。最後
に、発明者らは、種々の組織におけるクローディン１お
よび２の発現をノザーンブロッティングにより調べた。
クローディン１および２をコードするDNAを³²PdCTPでラ
ベルし、ExpressHybTM Hybridization Solution (Clont
ech)中で68℃12時間ハイブリダイズ後、2xSSC, 0.1%SDS
中にて室温で30分、0.1xSSC, 0.1%SDS中にて50℃で30分
洗った。その後、Bio-Imageing Analyzer BAS2000（フ
ジ写真フィルム社製）イメージングプレートに12時間露
光し、BAS2000にて解析した。クローディン１のｍＲＮ
Ａは試験したすべての組織において大きな４．０ｋｂバ
ンドおよび小さな１．３ｋｂバンドとして検出され、特
に肝臓および腎臓で大量に検出された。対照的に、クロ
ーディン２の発現（大きな４．０ｋｂおよび小さな２．
０ｋｂのｍＲＮＡ）は肝臓と腎臓（および脳に少量）に
限定されていた。この事は、クローディン類は組織特異
性を有する可能性があると推察される。

【００１４】実施例４マウスクローディン３ないし８
をコードしている完全長ｃＤＮＡのクローニングクローディン１の配列をもとにしてGenBank/EMBL/DDBJ
の検索を行ったところ、15個のマウスESTクローンを見
出した。このうちRVP-1とホモロジーを持つ重複する４
つのEST配列をもとにPCRを行い、RVP-1マウスホモログ
のクローディン３のcDNAを得た（配列番号１８）。ま
た、TMVCFとホモロジーを持つ重複する２つのEST配列を
もとにPCRを行い、TMVCFマウスホモログのクローディン
５のcDNAを得た（配列番号１９）。クローディン３のcD
NAは、推定分子量23.3 kdをもつアミノ酸219個のポリペ
プチドをコードしているORFを含んでいた。また、クロ
ーディン５のcDNAは、推定分子量23.1 kdをもつアミノ
酸218個のポリペプチドをコードしているORFを含んでい
た。残った９個のESTクローンはクローディン１および
２とホモロジーが認められるものの、クローディン１な
いし５とは異なることが見出された。この配列をもとに
プライマーを設定しPCRを行って、クローディン６，
７，８のORFを含む完全長のcDNAを得た。クローディン
６のcDNAは、推定分子量23.4 kdをもつアミノ酸219個の
ポリペプチドをコードしているORFを含んでいた（配列
番号２０）。クローディン７のcDNAは、推定分子量22.6
kdをもつアミノ酸211個のポリペプチドをコードしてい
るORFを含んでいた（配列番号２１）。クローディン８
のcDNAは、推定分子量24.9 kdをもつアミノ酸225個のポ
リペプチドをコードしているORFを含んでいた（配列番
号２２）。また、クローディン１および２と同様にクロ
ーディン３ないし８も４個の膜貫通領域を含むことが推
定された。

【００１５】実施例５マウスクローディン３ないし８
の細胞内および臓器分布マウスクローディン３ないし８の細胞内分布マウスクローディン３ないし８の細胞内分布を調べるた
めに、発明者らはC端にFLAGペプチドを結合させたクロ
ーディン３ないし８の発現ベクターを構築した。クロー
ディン３ないし８のcDNAの3'端にEcoRI認識配列を導入
し、pBluescriptSK(-)-HA-tagに挿入した。その後SalI-
XbaIで切り出し、T4 polymeraseで平滑末端化してpCAGG
SneodelEcoRIに挿入した。構築したFLAG標識クローディ
ン３ないし８発現ベクターを、実施例３と同様にMDCK細
胞にトランスフェクション後Geneticineで選択し、Gene
ticine抵抗性で安定してFLAG標識クローディン３ないし
８を発現するクローンを分離した。FLAGに対するモノク
ローナル抗体を用いクローディン３ないし８の細胞内分
布を共焦点顕微鏡で調べた。コンピューターで作製した
断面像より、クローディン３ないし８は培養したMDCK細
胞の頂端部のＴＪにオクルジンと共に存在し、基底部に
存在するカドヘリンとは異なった分布をすることが見出
された。マウスクローディン３ないし８の臓器分布クローディン３ないし８に特異的なプローブをデザイン
し、ノーザンブロティングを行ってその臓器分布を調べ
た。その結果、クローディン３は肺と肝臓に大量に発現
し、腎臓と精巣に少量発現していた。クローディン４，
７，８は肺と腎臓に発現していた。これに対しクローデ
ィン５は調べた全ての臓器に発現し、特に肺に大量に発
現していた。クローディン６は調べた臓器で発現は認め
られなかったが、RT-PCRで腎臓での発現が認められた。
クローディン６に対応するマウスESTクローンは全てマ
ウス胎児由来であり、クローディン６の発現が発達段階
により制御を受けている可能性が考えられた。また、ク
ローディン３，５には大きさの異なる２つのmRNAが認め
られ、alternative-splicingが起きていることが考えら
れた。

【００１６】実施例６マウスクローディン３，４，８
に対するポリクローナル抗体の作製クローディンに対する家兎ポリクローナル抗体の作製を
試みた。クローディン３，４，８のカルボキシ末端に対
応するペプチド（配列番号２２，２３，２４）をシステ
インを介してKeyhole limpet hemocyaninと結合させ、
家兎に免疫した。その抗血清をクローディン３，４，８
のカルボキシ末端の細胞質領域とGSTとの融合蛋白でア
フィニティ精製し、クローディン３，４，８に対する
ポリクローナル抗体を得た。そして、ウェスタンブロッ
ティングにより、それぞれのポリクローナル抗体がクロ
ーディン３，４，８のカルボキシ末端の細胞質領域とGS
Tとの融合蛋白を特異的に認識することを確認した。肝
臓と腎臓の凍結切片をクローディン３，４，８に対する
ポリクローナル抗体とオクルジンに対するモノクローナ
ル抗体で２重染色した。その結果、肝臓ではクローディ
ン３がオクルディンと一致して細胆管（bile canalicul
i）に沿って存在した。また、腎臓の遠位尿細管ではク
ローディン３，４，８がオクルディンと一致して存在し
ていたが、近位尿細管では少量しか存在していなかっ
た。

【００１７】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：952 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：マウス組織の種類：肝臓配列の特徴特徴を表す記号：CDS 特徴の存在位置：156..791 特徴を決定した方法：P 配列： AGCCAGGAGC CTCGCCCCGC AGCTGCACAG AGAGCAAGGG TATAGGCACT AACTTGTTTG 60 CAGAGACCCC ATCACCTTCG GGAGCTCAGG TGCGCACCTT GCAAACTCCA CTTTCTGCAT 120 CTGCCACTGA GCCCGCGGGA GCCTCGGAAA GAGCC ATG GCC AAC GCG GGG CTG 173 Met Ala Asn Ala Gly Leu 1 5 CAG CTG CTG GGT TTC ATC CTG GCT TCT CTG GGA TGG ATC GGC TCC ATC 221 Gln Leu Leu Gly Phe Ile Leu Ala Ser Leu Gly Trp Ile Gly Ser Ile 10 15 20 GTC AGC ACT GCC CTG CCC CAG TGG AAG ATT TAC TCC TAT GCT GGG GAC 269 Val Ser Thr Ala Leu Pro Gln Trp Lys Ile Tyr Ser Tyr Ala Gly Asp 25 30 35 AAC ATC GTG ACC GCT CAG GCC ATC TAC GAG GGA CTG TGG ATG TCC TGC 317 Asn Ile Val Thr Ala Gln Ala Ile Tyr Glu Gly Leu Trp Met Ser Cys 40 45 50 GTT TCG CAA AGC ACC GGG CAG ATA CAG TGC AAA GTC TTC GAC TCC TTG 365 Val Ser Gln Ser Thr Gly Gln Ile Gln Cys Lys Val Phe Asp Ser Leu 55 60 65 70 CTG AAT CTG AAC AGT ACT TTG CAG GCA ACC CGA GCC TTG ATG GTA ATT 413 Leu Asn Leu Asn Ser Thr Leu Gln Ala Thr Arg Ala Leu Met Val Ile 75 80 85 GGC ATC CTG CTG GGG CTG ATC GCA ATC TTT GTG TCC ACC ATT GGC ATG 461 Gly Ile Leu Leu Gly Leu Ile Ala Ile Phe Val Ser Thr Ile Gly Met 90 95 100 AAG TGC ATG AGG TGC CTG GAA GAT GAT GAG GTG CAG AAG ATG TGG ATG 509 Lys Cys Met Arg Cys Leu Glu Asp Asp Glu Val Gln Lys Met Trp Met 105 110 115 GCT GTC ATT GGG GGC ATA ATA TTT TTA ATT TCA GGT CTG GCG ACA TTA 557 Ala Val Ile Gly Gly Ile Ile Phe Leu Ile Ser Gly Leu Ala Thr Leu 120 125 130 GTG GCC ACA GCA TGG TAT GGA AAC AGA ATT GTT CAA GAA TTC TAT GAC 605 Val Ala Thr Ala Trp Tyr Gly Asn Arg Ile Val Gln Glu Phe Tyr Asp 135 140 145 150 CCC TTG ACC CCC ATC AAT GCC AGG TAT GAA TTT GGC CAG GCC CTC TTT 653 Pro Leu Thr Pro Ile Asn Ala Arg Tyr Glu Phe Gly Gln Ala Leu Phe 155 160 165 ACT GGC TGG GCC GCT GCC TCC CTC TGC CTT CTG GGA GGT GTC CTA CTT 701 Thr Gly Trp Ala Ala Ala Ser Leu Cys Leu Leu Gly Gly Val Leu Leu 170 175 180 TCC TGC TCC TGT CCC CGG AAA ACA ACC TCT TAC CCA ACA CCA CGG CCT 749 Ser Cys Ser Cys Pro Arg Lys Thr Thr Ser Tyr Pro Thr Pro Arg Pro 185 190 195 TAT CCC AAG CCA ACA CCT TCT AGT GGG AAA GAC TAT GTG TGACAGAGGC 798 Tyr Pro Lys Pro Thr Pro Ser Ser Gly Lys Asp Tyr Val 200 205 210 AAAGGAAGAG ATCTTCCTGG AGCAAATACA AAATGGACAT TGAACCTAGG ATTGACATTA 858 ACGCCTTAGA CTGTTGATGA TGGTTATCGG AACTGTGGTA GAACAGAAGG AAGCATATTT 918 TTATACATCC CCATGGCTAT GCAGGCCTTG GCTG 952 配列番号：２配列の長さ：791 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：マウス組織の種類：肝臓配列の特徴特徴を表す記号：CDS 特徴の存在位置：48..740 特徴を決定した方法：P 配列： ACGACAAGCA AACAGGCTCC GAAGATACTT CTACTGAGAG GTCTGCC ATG GCC TCC 56 Met Ala Ser 1 CTT GGC GTT CAA CTG GTG GGC TAC ATC CTA GGC CTT TTG GGG CTG TTA 104 Leu Gly Val Gln Leu Val Gly Tyr Ile Leu Gly Leu Leu Gly Leu Leu 5 10 15 GGC ACA TCC ATT GCC ATG CTG CTT CCC AAC TGG CGA ACG AGT TCC TAT 152 Gly Thr Ser Ile Ala Met Leu Leu Pro Asn Trp Arg Thr Ser Ser Tyr 20 25 30 35 GTT GGT GCC AGC ATT GTG ACG GCG GTT GGC TTT TCC AAG GGC CTC TGG 200 Val Gly Ala Ser Ile Val Thr Ala Val Gly Phe Ser Lys Gly Leu Trp 40 45 50 ATG GAG TGT GCG ACA CAC AGC ACA GGC ATC ACC CAG TGC GAT ATC TAC 248 Met Glu Cys Ala Thr His Ser Thr Gly Ile Thr Gln Cys Asp Ile Tyr 55 60 65 AGT ACC CTT TTA GGA CTT CCT GCT GAC ATC CAG GCT GCC CAG GCC ATG 296 Ser Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Asp Ile Gln Ala Ala Gln Ala Met 70 75 80 ATG GTG ACG TCC AGT GCA ATG TCC TCG CTG GCT TGT ATT ATC TCT GTG 344 Met Val Thr Ser Ser Ala Met Ser Ser Leu Ala Cys Ile Ile Ser Val 85 90 95 GTG GGC ATG AGA TGC ACC GTG TTC TGC CAG GAT TCT CGA GCT AAG GAC 392 Val Gly Met Arg Cys Thr Val Phe Cys Gln Asp Ser Arg Ala Lys Asp 100 105 110 115 AGA GTG GCT GTA GTG GGT GGA GTC TTT TTC ATC CTT GGT GGC ATC CTG 440 Arg Val Ala Val Val Gly Gly Val Phe Phe Ile Leu Gly Gly Ile Leu 120 125 130 GGC TTT ATC CCA GTT GCT TGG AAT CTT CAT GGC ATC CTT CGG GAC TTC 488 Gly Phe Ile Pro Val Ala Trp Asn Leu His Gly Ile Leu Arg Asp Phe 135 140 145 TAC TCG CCG CTG GTT CCT GAC AGC ATG AAA TTT GAG ATT GGA GAG GCT 536 Tyr Ser Pro Leu Val Pro Asp Ser Met Lys Phe Glu Ile Gly Glu Ala 150 155 160 CTG TAC TTG GGC ATC ATC TCA GCC CTG TTT TCT TTG GTA GCC GGA GTC 584 Leu Tyr Leu Gly Ile Ile Ser Ala Leu Phe Ser Leu Val Ala Gly Val 165 170 175 ATC CTT TGC TTT TCC TGC TCG CCC CAG GGC AAT CGT ACC AAC TAC TAT 632 Ile Leu Cys Phe Ser Cys Ser Pro Gln Gly Asn Arg Thr Asn Tyr Tyr 180 185 190 195 GAT GGC TAC CAG GCC CAG CCT CTT GCC ACT AGG AGC TCT CCA AGA TCT 680 Asp Gly Tyr Gln Ala Gln Pro Leu Ala Thr Arg Ser Ser Pro Arg Ser 200 205 210 GCT CAA CAG CCC AAA GCC AAG AGT GAG TTC AAC TCA TAC AGC CTG ACT 728 Ala Gln Gln Pro Lys Ala Lys Ser Glu Phe Asn Ser Tyr Ser Leu Thr 215 220 225 GGG TAT GTG TGAAGAACCA GGGGCCAGAG CTGGGGGTAG GGTGGGGTAG 777 Gly Tyr Val 230 TGGCTGGGAC TATA 791 配列番号：３配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：ニワトリ組織の種類：肝臓オルガネラ名：タイトジャンクション配列： Ala Ser Gly Gly Leu Gln Leu Leu Gly Phe Val Leu Ala Phe Leu Gly 1 5 10 15 Trp Met Gly Ile Ile Ile 20 配列番号：４配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：ニワトリ組織の種類：肝臓オルガネラ名：タイトジャンクション配列： Ser Glu Phe Ser Ser Tyr Asn Leu Thr Gly Tyr Val 1 5 10 配列番号：５配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： ATGGCCAACG CGGGGCTGCA GCTGTTGGG 29 配列番号：６配列の長さ：26 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： CAGATTCAGC AAGGAGTCAA GACTTT 26 配列番号：７配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： AGCCAGGAGC CTCGCCCCGC AGCTGCA 27 配列番号：８配列の長さ：24 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： CAGCCAAGGC CTGCATAGCC ATGG 24 配列番号：９配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： GCTGTTGAGC AGATCTTGGA GAGCTCC 27 配列番号：１０配列の長さ：24 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： ACGACAAGCA AACAGGCTCC GAAG 24 配列番号：１１配列の長さ：18 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： TATAGTCCCA GCCACTAC 18 配列番号：１２配列の長さ：24 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： GGCGACATTA GTGGCCACAF CATG 24 配列番号：１３配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： CGCGGATCCC ACATAGTCTT TCCCACT 27 配列番号：１４配列の長さ：36 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： GATCCGACTA CAAGGACGAC GATGACAAGT AGATCT 36 配列番号：１５配列の長さ：32 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： AGATCTACTT GTCATCGTCG TCCTTGTAGT CG 32 配列番号：１６配列の長さ：24 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： ACGACAAGCA AACAGGCTCC GAAG 24 配列番号：１７配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： GCGGGATCCC ACATACCCAG TCAGG 25 配列番号：１８配列の長さ：660 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：マウス組織の種類：肝臓配列の特徴特徴を表す記号：CDS 特徴の存在位置：1..657 特徴を決定した方法：P 配列： ATG TCC ATG GGC CTG GAG ATC ACC GGC ACG TCG CTG GCC GTG CTG GGC 48 Met Ser Met Gly Leu Glu Ile Thr Gly Thr Ser Leu Ala Val Leu Gly 1 5 10 15 TGG CTG TGC ACC ATC GTG TGC TGC GCC CTT CCC ATG TGG CGC GTT TCG 96 Trp Leu Cys Thr Ile Val Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val Ser 20 25 30 GCC TTC ATC GGC AGC AGC ATC ATC ACG GCG CAG ATC ACC TGG GAG GGC 144 Ala Phe Ile Gly Ser Ser Ile Ile Thr Ala Gln Ile Thr Trp Glu Gly 35 40 45 CTG TGG ATG AAC TGC GTG GTG CAA AGC ACC GGT CAG ATG CAG TGC AAA 192 Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys 50 55 60 ATG TAC GAC TCG CTG CTG GCC CTG CCG CAG GAC CTG CAG GCC GCC CGA 240 Met Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg 65 70 75 80 GCC CTC ATC GTG GTG TCC ATC CTG CTG GCC GCC TTC GGG CTC CTC GTG 288 Ala Leu Ile Val Val Ser Ile Leu Leu Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val 85 90 95 GCG CTC GTG GGC GCC CAG TGT ACC AAC TGC GTA CAA GAC GAG ACG GCC 336 Ala Leu Val Gly Ala Gln Cys Thr Asn Cys Val Gln Asp Glu Thr Ala 100 105 110 AAG GCC AAG ATC ACC ATC GTG GCG GGA GTG CTT TTC CTG TTG GCG GCT 384 Lys Ala Lys Ile Thr Ile Val Ala Gly Val Leu Phe Leu Leu Ala Ala 115 120 125 CTG CTC ACC TTA GTA CCG GTG TCC TGG TCG GCC AAC ACC ATC ATC AGG 432 Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Ser Trp Ser Ala Asn Thr Ile Ile Arg 130 135 140 GAT TTC TAT AAC CCG TTG GTG CCC GAG GCC CAG AAG CGG GAG ATG GGA 480 Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Pro Glu Ala Gln Lys Arg Glu Met Gly 145 150 155 160 GCT GGG TTG TAC GTG GGC TGG GCT GCC GCC GCG CTG CAG TTG CTA GGG 528 Ala Gly Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Gln Leu Leu Gly 165 170 175 GGC GCC TTG CTG TGT TGC TCC TGC CCA CCG CGC GAC AAG TAT GCA CCC 576 Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Pro Arg Asp Lys Tyr Ala Pro 180 185 190 ACC AAG ATC CTC TAT TCT GCG CCG CGA TCC ACC GGC CCT GGC ACC GGT 624 Thr Lys Ile Leu Tyr Ser Ala Pro Arg Ser Thr Gly Pro Gly Thr Gly 195 200 205 ACC GGC ACC GCC TAC GAC CGC AAG GAC TAC GTC TGA 660 Thr Gly Thr Ala Tyr Asp Arg Lys Asp Tyr Val * 210 215 配列番号：１９配列の長さ：657 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：マウス組織の種類：肝臓配列の特徴特徴を表す記号：CDS 特徴の存在位置：1..654 特徴を決定した方法：P 配列： ATG GGG TCT GCA GCG TTG GAA ATT CTG GGT CTG GTG CTG TGT CTG GTA 48 Met Gly Ser Ala Ala Leu Glu Ile Leu Gly Leu Val Leu Cys Leu Val 1 5 10 15 GGA TGG GTG GGC TTG ATC CTG GCG TGT GGG CTG CCC ATG TGG CAG GTG 96 Gly Trp Val Gly Leu Ile Leu Ala Cys Gly Leu Pro Met Trp Gln Val 20 25 30 ACT GCC TTC CTG GAC CAC AAC ATC GTG ACG GCG CAG ACG ACT TGG AAG 144 Thr Ala Phe Leu Asp His Asn Ile Val Thr Ala Gln Thr Thr Trp Lys 35 40 45 GGG CTG TGG ATG TCG TGC GTG GTG CAG AGT ACC GGG CAC ATG CAG TGC 192 Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly His Met Gln Cys 50 55 60 AAG GTG TAT GAA TCT GTG CTG GCG CTG AGT GCG GAG GTG CAG GCA GCT 240 Lys Val Tyr Glu Ser Val Leu Ala Leu Ser Ala Glu Val Gln Ala Ala 65 70 75 80 CGG GCA CTC ACC GTG GGC GCT GTG CTG CTG GCG CTG GTG GCA CTC TTT 288 Arg Ala Leu Thr Val Gly Ala Val Leu Leu Ala Leu Val Ala Leu Phe 85 90 95 GTT ACC TTG ACC GGC GCT CAG TGC ACC ACC TGC GTG GCC CCG GGC CCA 336 Val Thr Leu Thr Gly Ala Gln Cys Thr Thr Cys Val Ala Pro Gly Pro 100 105 110 GTT AAG GCA CGG GTA GCA CTC ACG GGA GGA GCG CTT TAC GCG GTG TGC 384 Val Lys Ala Arg Val Ala Leu Thr Gly Gly Ala Leu Tyr Ala Val Cys 115 120 125 GGG CTG CTG GCA CTC GTG CCG CTC TGC TGG TTC GCC AAC ATC GTT GTC 432 Gly Leu Leu Ala Leu Val Pro Leu Cys Trp Phe Ala Asn Ile Val Val 130 135 140 CGC GAG TTC TAT GAT CCG ACG GTG CCG GTG TCA CAG AAG TAC GAG CTG 480 Arg Glu Phe Tyr Asp Pro Thr Val Pro Val Ser Gln Lys Tyr Glu Leu 145 150 155 160 GGC GCG GCG CTG TAC ATC GGC TGG GCG GCC TCC GCA CTG CTC ATG TGC 528 Gly Ala Ala Leu Tyr Ile Gly Trp Ala Ala Ser Ala Leu Leu Met Cys 165 170 175 GGT GGC GGC CTC GTG TGT TGC GGC GCC TGG GTC TGC ACC GGG CGC CCT 57 6 Gly Gly Gly Leu Val Cys Cys Gly Ala Trp Val Cys Thr Gly Arg Pro 180 185 190 GAG TTC AGC TTC CCG GTC AAG TAC TCT GCG CCG CGG CGG CCC ACG GCC 624 Glu Phe Ser Phe Pro Val Lys Tyr Ser Ala Pro Arg Arg Pro Thr Ala 195 200 205 AAT GGC GAT TAC GAC AAG AAG AAC TAT GTC TAA 657 Asn Gly Asp Tyr Asp Lys Lys Asn Tyr Val * 210 215 配列番号：２０配列の長さ：660 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：マウス組織の種類：肝臓配列の特徴特徴を表す記号：CDS 特徴の存在位置：1..657 特徴を決定した方法：P 配列： ATG GCC TCT ACT GGT CTG CAA ATC TTG GGG ATC GTC CTG ACC CTG CTT 48 Met Ala Ser Thr Gly Leu Gln Ile Leu Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 GGC TGG GTC AAC GCC CTG GTG TCC TGT GCC CTG CCC ATG TGG AAG GTG 96 Gly Trp Val Asn Ala Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val 20 25 30 ACC GCC TTC ATC GGC AAC AGC ATC GTC GTG GCC CAG ATG GTG TGG GAG 144 Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Met Val Trp Glu 35 40 45 GGG CTG TGG ATG TCC TGT GTG GTT CAG AGC ACT GGC CAG ATG CAG TGC 192 Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys 50 55 60 AAG GTG TAT GAC TCA CTG TTG GCG CTG CCC CAG GAC CTG CAG GCT GCC 240 Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala 65 70 75 80 AGA GCC CTC TGT GTT GTC ACC CTC CTC ATT GTC CTG CTT GGC CTG CTC 288 Arg Ala Leu Cys Val Val Thr Leu Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Leu 85 90 95 GTG TAC CTG GCT GGA GCC AAG TGC ACT ACC TGT GTG GAA GAT AGG AAC 336 Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Asp Arg Asn 100 105 110 TCC AAG TCT CGT CTG GTG CTC ATC TCT GGC ATC ATC TTT GTC ATT TCT 384 Ser Lys Ser Arg Leu Val Leu Ile Ser Gly Ile Ile Phe Val Ile Ser 115 120 125 GGG GTC CTG ACG CTC ATT CCT GTC TGC TGG ACT GCC CAC TCT ATC ATC 432 Gly Val Leu Thr Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ser Ile Ile 130 135 140 CAG GAC TTC TAC AAC CCC TTG GTG GCT GAT GCT CAA AAG CGG GAG CTG 480 Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Asp Ala Gln Lys Arg Glu Leu 145 150 155 160 GGG GCC TCC CTC TAC CTG GGC TGG GCA GCC TCA GGC CTT TTG CTG CTG 528 Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu 165 170 175 GGT GGA GGG CTA CTA TGC TGC GCC TGC TCT TCT GGA GGG ACC CAG GGA 576 Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Ala Cys Ser Ser Gly Gly Thr Gln Gly 180 185 190 CCC AGA CAT TAC ATG GCC TGC TAT TCT ACA TCT GTC CCA CAT TCT CGG 624 Pro Arg His Tyr Met Ala Cys Tyr Ser Thr Ser Val Pro His Ser Arg 195 200 205 GGA CCC TCC GAA TAT CCC ACC AAG AAT TAT GTG TGA 660 Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val * 210 215 220 配列番号：２１配列の長さ：636 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：マウス組織の種類：肝臓配列の特徴特徴を表す記号：CDS 特徴の存在位置：1..633 特徴を決定した方法：P 配列： ATG GCC AAC TCG GGC CTG CAA CTG CTG GGC TTT TCA ATG GCC ATG CTT 48 Met Ala Asn Ser Gly Leu Gln Leu Leu Gly Phe Ser Met Ala Met Leu 1 5 10 15 GGC TGG GTG GGC CTG ATA GCG AGC ACT GCC ATC CCT CAG TGG CAG ATG 96 Gly Trp Val Gly Leu Ile Ala Ser Thr Ala Ile Pro Gln Trp Gln Met 20 25 30 AGC TCC TAT GCG GGC GAC AAC ATC ATC ACA GCC CAG GCC ATG TAC AAG 14 4 Ser Ser Tyr Ala Gly Asp Asn Ile Ile Thr Ala Gln Ala Met Tyr Lys 35 40 45 GGG CTC TGG ATG GAG TGC GTC ACG CAG AGC ACC GGC ATG ATG AGC TGC 192 Gly Leu Trp Met Glu Cys Val Thr Gln Ser Thr Gly Met Met Ser Cys 50 55 60 AAA ATG TAC GAC TCG GTG CTC GCC CTG CCG GGA GCC CTG CAG GCC ACT 240 Lys Met Tyr Asp Ser Val Leu Ala Leu Pro Gly Ala Leu Gln Ala Thr 65 70 75 80 CGA GCC TTA ATG GTG GTG TCC CTG GTG TTG GGC TTC TTA GCC ATG TTT 288 Arg Ala Leu Met Val Val Ser Leu Val Leu Gly Phe Leu Ala Met Phe 85 90 95 GTC GCC ACG ATG GGC ATG AAG TGC ACA CGC TGT GGG GGA GAT GAC AAA 336 Val Ala Thr Met Gly Met Lys Cys Thr Arg Cys Gly Gly Asp Asp Lys 100 105 110 GCG AAG AAG GCC CGA ATA GCT ATG ACT GGA GGC ATT GTT TTC ATT GTG 38 4 Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ala Met Thr Gly Gly Ile Val Phe Ile Val 115 120 125 GCA GGT CTT GCT GCC TTG GTA GCA TGT TCC TGG ATT GGT CAT CAG ATT 432 Ala Gly Leu Ala Ala Leu Val Ala Cys Ser Trp Ile Gly His Gln Ile 130 135 140 GTC ACA GAC TTT TAT AAC CCC TTG ACG CCC ATG AAC GTT AAG TAC GAG 480 Val Thr Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Thr Pro Met Asn Val Lys Tyr Glu 145 150 155 160 TTT GGA CCT GCC ATC TTT ATC GGC TGG GCA GGG TCT GCT CTG GTC CTT 528 Phe Gly Pro Ala Ile Phe Ile Gly Trp Ala Gly Ser Ala Leu Val Leu 165 170 175 CTG GGA GGT GCC CTG CTC TCT TGC TCC TGT CCA GGC AGT GAA AGC AAA 576 Leu Gly Gly Ala Leu Leu Ser Cys Ser Cys Pro Gly Ser Glu Ser Lys 180 185 190 GCT GCG TAC CGA GCA CCC CGC TCT TAC CCC AAG TCC AAT TCC TCC AAG 624 Ala Ala Tyr Arg Ala Pro Arg Ser Tyr Pro Lys Ser Asn Ser Ser Lys 195 200 205 GAA TAC GTG TGA 636 Glu Tyr Val * 210 配列番号：２２配列の長さ：678 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：マウス組織の種類：肝臓配列の特徴特徴を表す記号：CDS 特徴の存在位置：1..675 特徴を決定した方法：P 配列： ATG GCA ACC TAC GCT CTT CAA ATG GCT GCA CTG GTG CTT GGT GGT GTT 48 Met Ala Thr Tyr Ala Leu Gln Met Ala Ala Leu Val Leu Gly Gly Val 1 5 10 15 GGC ATG GTG GGC ACG GTG GCT GTG ACT ATC ATG CCT CAG TGG AGA GTG 96 Gly Met Val Gly Thr Val Ala Val Thr Ile Met Pro Gln Trp Arg Val 20 25 30 TCT GCC TTC ATC GAA AGT AAC ATT GTG GTG TTT GAG AAC CGC TGG GAA 144 Ser Ala Phe Ile Glu Ser Asn Ile Val Val Phe Glu Asn Arg Trp Glu 35 40 45 GGC TTG TGG ATG AAT TGT ATG AGG CAT GCC AAC ATC AGA ATG CAG TGC 192 Gly Leu Trp Met Asn Cys Met Arg His Ala Asn Ile Arg Met Gln Cys 50 55 60 AAG GTC TAC GAC TCC CTG CTG GCT CTT AGT CCA GAC CTC CAG GCA TCC 240 Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Ser Pro Asp Leu Gln Ala Ser 65 70 75 80 CGA GGA CTG ATG TGT GCT GCG TCC GTC TTG GCT TTC TTG GCT TTC ATG 288 Arg Gly Leu Met Cys Ala Ala Ser Val Leu Ala Phe Leu Ala Phe Met 85 90 95 ACA GCC ATC CTC GGA ATG AAG TGC ACC AGA TGC ACG GGG GAC GAT GAG 336 Thr Ala Ile Leu Gly Met Lys Cys Thr Arg Cys Thr Gly Asp Asp Glu 100 105 110 AAC GTG AAG AGC CGC ATC TTG CTG ACA GCC GGA ATC ATC TTC TTC ATC 384 Asn Val Lys Ser Arg Ile Leu Leu Thr Ala Gly Ile Ile Phe Phe Ile 115 120 125 ACC GGC TTG GTT GTG CTC ATC CCT GTC AGC TGG GTT GCC AAT TCC ATC 432 Thr Gly Leu Val Val Leu Ile Pro Val Ser Trp Val Ala Asn Ser Ile 130 135 140 ATC AGA GAC TTC TAC AAC CCA CTG GTG GAT GTG GCC CTA AAG CGC GAG 480 Ile Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Asp Val Ala Leu Lys Arg Glu 145 150 155 160 CTG GGA GAA GCC CTC TAC ATA GGC TGG ACC ACA GCG CTG GTG CTG ATC 528 Leu Gly Glu Ala Leu Tyr Ile Gly Trp Thr Thr Ala Leu Val Leu Ile 165 170 175 GCT GGA GGA GCA CTG TTC TGT TGT GTG TTT TGT TGT ACT GAA AGG AGC 576 Ala Gly Gly Ala Leu Phe Cys Cys Val Phe Cys Cys Thr Glu Arg Ser 180 185 190 AAC AGT TAC AGG TAC TCG GTA CCA TCC CAT CGC ACC ACT CAA CGG AGT 624 Asn Ser Tyr Arg Tyr Ser Val Pro Ser His Arg Thr Thr Gln Arg Ser 195 200 205 TTC CAC GCC GAA AAG AGA TCT CCG AGC ATA TAC TCC AAA AGT CAG TAT 672 Phe His Ala Glu Lys Arg Ser Pro Ser Ile Tyr Ser Lys Ser Gln Tyr 210 215 220 GTG TAG 678 Val * 225 配列番号：２３配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：マウス組織の種類：肝臓配列： Cys Pro Arg Ser Thr Gly Pro Gly Thr Gly Thr Gly Thr Ala Tyr Asp 5 10 15 Arg Lys Asp Tyr Val 20 配列番号：２４配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：マウス組織の種類：肝臓配列： Cys Asp Lys Pro Tyr Ser Ala lys Tyr Ser Ala Ala Arg Ser Val Pro 5 10 15 Ala Ser Asn Tyr Val 20 配列番号：２５配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：マウス組織の種類：肝臓配列： Cys Gln Arg Ser Phe His Ala Glu Lys Arg Ser Pro Ser Ile Tyr Ser 5 10 15 Lys Ser Gln Tyr Val 20

【図面の簡単な説明】

【図１】電気泳動を示す図面の代用写真である。グアニ
ディン不溶性画分のSDS-PAGE解析の図である。

【図２】生物の形態を示す図面の代用写真である。FLAG
標識クローディン１及び２、とオクルディンの分布を示
すMDCK細胞染色像の図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 1/68 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 - 15/90 C07K 14/705 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】タイトジャンクション構成膜蛋白質のク
ローディンファミリーをコードするＤＮＡであって、配
列番号１に記載のアミノ酸配列を有するクローディン１
をコードするＤＮＡ。
【請求項２】タイトジャンクション構成膜蛋白質のク
ローディンファミリーをコードするＤＮＡであって、配
列番号２に記載のアミノ酸配列を有するクローディン２
をコードするＤＮＡ。
【請求項３】タイトジャンクション構成膜蛋白質のク
ローディンファミリーをコードするＤＮＡであって、配
列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するクローディン
３をコードするＤＮＡ。
【請求項４】タイトジャンクション構成膜蛋白質のク
ローディンファミリーをコードするＤＮＡであって、配
列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するクローディン
５をコードするＤＮＡ。
【請求項５】タイトジャンクション構成膜蛋白質のク
ローディンファミリーをコードするＤＮＡであって、配
列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するクローディン
６をコードするＤＮＡ。
【請求項６】タイトジャンクション構成膜蛋白質のク
ローディンファミリーをコードするＤＮＡであって、配
列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するクローディン
７をコードするＤＮＡ。
【請求項７】タイトジャンクション構成膜蛋白質のク
ローディンファミリーをコードするＤＮＡであって、配
列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するクローディン
８をコードするＤＮＡ。
【請求項８】請求項１ないし７に記載のＤＮＡを含有
するベクター。
【請求項９】請求項８に記載のベクターを保持する形
質転換体。
【請求項１０】配列番号１に記載のアミノ酸配列を有
するタイトジャンクション構成膜蛋白質クローディン
１。
【請求項１１】配列番号２に記載のアミノ酸配列を有
するタイトジャンクション構成膜蛋白質クローディン
２。
【請求項１２】配列番号１８に記載のアミノ酸配列を
有するタイトジャンクション構成膜蛋白質クローディン
３。
【請求項１３】配列番号１９に記載のアミノ酸配列を
有するタイトジャンクション構成膜蛋白質クローディン
５。
【請求項１４】配列番号２０に記載のアミノ酸配列を
有するタイトジャンクション構成膜蛋白質クローディン
６。
【請求項１５】配列番号２１に記載のアミノ酸配列を
有するタイトジャンクション構成膜蛋白質クローディン
７。
【請求項１６】配列番号２２に記載のアミノ酸配列を
有するタイトジャンクション構成膜蛋白質クローディン
８。
【請求項１７】請求項９に記載の形質転換体を培養す
る工程、及び、発現産物を回収する工程を含む、請求項
１０ないし１６に記載のクローディンファミリーの製造
方法。
【請求項１８】請求項１ないし７に記載のＤＮＡがコ
ードするクローディンファミリーと反応するポリクロー
ナル抗体またはモノクローナル抗体。
【請求項１９】請求項１８に記載のポリクローナル抗
体またはモノクローナル抗体を使用することを特徴とす
る、生体試料中のクローディンファミリーの免疫学的測
定方法。
【請求項２０】請求項１ないし７に記載のクローディ
ンファミリーをコードするＤＮＡに由来する、少なくと
も１５個の連続する塩基からなるオリゴヌクレオチドを
プライマーまたはプローブとして使用することを特徴と
する、生体試料中のクローディンファミリー遺伝子の解
析方法。
【請求項２１】請求項１ないし７に記載のＤＮＡがコ
ードするクローディンファミリーを用いることを特徴と
する該蛋白質と反応性を有する化合物のスクリーニング
法。
【請求項２２】請求項１ないし７に記載のＤＮＡがコ
ードするクローディンファミリーのいずれか１つを発現
している細胞、または請求項１ないし７に記載のクロー
ディンファミリーをコードする遺伝子のプロモーター配
列もしくは請求項１ないし７に記載のクローディンファ
ミリーをコードする遺伝子を導入した細胞を用いること
を特徴とする該クローディンファミリーの発現に影響を
与える化合物をスクリーニングする方法。