JPH11346775A - アクチン結合蛋白質フラビン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なアクチン結合蛋白質フラビンと、この
フラビンを産業上利用するための遺伝子材料を提供す
る。 【解決手段】 ラット蛋白質であって、配列番号１のア
ミノ酸配列を有するアクチン結合蛋白質フラビン、この
蛋白質をコードするラット遺伝子、この遺伝子のｃＤＮ
Ａであって、配列番号２の塩基配列を有するｃＤＮＡ、
このｃＤＮＡの一部連続配列からなるＤＮＡ断片、この
ｃＤＮＡまたはＤＮＡ断片がハイブリダイズする動物ゲ
ノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡを保有する組換えベクター、
および前記アクチン結合蛋白質フラビンを免疫原として
作成された抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、新規なアクチン
結合蛋白質フラビン（Ｆrabin）に関するものである。
さらに詳しくは、この発明は、動物の個体形成等に重要
な役割を果たす新規動物性蛋白質フラビンと、このフラ
ビンをコードする遺伝子材料に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】動物個体における様々な細胞現象、例え
ば、細胞接着、細胞運動および細胞の形状決定等におい
ては、細胞接着分子、受容体およびチャンネル等の膜貫
通蛋白質によって形成される接着装置が重要な役割を果
たしており、これらの接着装置は、しばしばアクチン性
細胞骨格と結合することが知られている（Biochem. Bio
phys. Acta 737:305-341, 1983; Curr. Opin. Cell Bio
l. 1:103-109, 1989; Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1
-6, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 3:849-853,1991; S
cience. 258:955-964, 1992; Curr. Opin. Cell Biol.
4:834-839, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 5:653-660,
1993; Trends Biochem. Sci. 22:53-58,1997 ）。従っ
て、アクチン性細胞骨格と細胞質膜とは前記細胞現象に
おいて重要な役割を果たしており、それ故アクチン性細
胞骨格を膜貫通蛋白質に結合させる生体分子の特定に多
大な努力が払われてきた。しかしながら、アクチン性細
胞骨格と細胞質膜との結合に関する分子的基礎について
は、今だ充分に理解されてはいない。

【０００３】このような細胞結合に係わる分子的基礎を
理解するため、これまでに細胞接着部位が最も広範に研
究された（Biochem. Biophys. Acta 737:305-341, 198
3; Curr. Opin. Cell Biol. 1:103-109, 1989; Cell Mo
til. Cytoskeleton. 20:1-6,1991; Curr. Opin. Cell B
iol. 3:849-853, 1991; Science. 258:955-964, 1992;
Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992; Curr. Opi
n. Cell Biol. 5:653-660, 1993; Trends Biochem. Sc
i. 22:53-58, 1997 ）。その結果、アクチン線維（Ｆ−
アクチン）に関連する細胞接着部位が２つのタイプ、す
なわち、細胞−細胞接着帯（adherens junctions: Ａ
Ｊ）と、細胞−マトリックスＡＪとに分類されている。
細胞−細胞ＡＪにおいては、その細胞外表面でカドヘリ
ン（cadherin）が互いに相互作用しており、多くの結合
蛋白質が同定されている（Development 102:639-655, 1
988; Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Scien
ce 251:1451-1455,1991; Curr. Opin. Cell Biol. 4:83
4-839, 1992; EMBO J. 8:1711-1717, 1989; Cell 65:84
9-857, 1991; Science 251:1451-1455, 1991; Curr. Op
in. Cell Biol. 4:834-839, 1992）。これらの結合タン
パク質のうち、α−カテニンは、Ｆ−アクチンと直接相
互作用する（Pro.Natl. Acad. Sci. USA. 92:8813-881
7, 1995）と共に、α−アクチニンおよび／またはＺＯ
−１を介してＦ−アクチンに間接的に相互作用している
（J. Cell.Biol. 130:67-77, 1995;J. CellBiol. 138:1
81-192, 1997 ）。また、別のＦ−アクチン結合蛋白質
であるビンキュリン（vinculin）は、細胞−細胞ＡＪに
集中していることが知られているが、細胞−細胞ＡＪに
おけるその相互作用分子は未だ特定されていない（Cell
Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Curr. Opin. Ce
ll Biol. 4:834-839, 1992）。さらに、細胞外表面にお
いてインテグリン（integrin）がマトリックス蛋白質と
相互作用する細胞−マトリックスＡＪでは、その細胞質
ドメインは、α−アクチニン、ビンキュリン、タリン
（talin ）等のＦ−アクチン結合蛋白質と、直接または
関節的に相互作用している（Ann. Rev. Cell Dev. Bio
l. 11:379-416, 1995）。

【０００４】以上のとおり、多くのＦ−アクチン結合蛋
白質が、アクチン性細胞骨格と細胞質膜のカドヘリンお
よびインテグリンとの結合因子（linker）として作用し
ていると考えられている。一方、アクチン性細胞骨格と
細胞質膜との結合は、神経細胞に特異的な現象（例え
ば、成長円錐の伸長やその後のシナプス結合の形成およ
び維持等）にとっても重要である（Neuron 1:761-772,
1988; Science 242:708-715, 1988; Curr. Opin. Neuro
biol. 4:43-48, 1994; Curr. Opin. Neurobiol. 4:640-
647, 1994; Cell 83:171-176, 1995）。しかしながら、
これらの神経細胞に特異的な現象において、どのような
分子がアクチン性細胞骨格を細胞質膜に結合させている
かは明らかではない。

【０００５】この点を明らかにするため、この出願の発
明者等は、ラットの脳から幾つかの新規なＦ−アクチン
結合蛋白質を単離し、特に神経細胞に特異的で、シナプ
スに多く存在する蛋白質の構造を解析し、既に特許出願
している（特願平９−９２６１５号）。この先願発明の
蛋白質（以下、発明者等の命名に従って「ニューラビ
ン」（neurabin) と記載する）は、１つのＦ−アクチン
結合ドメインと、１つのＰＤＺドメインを有している。
ＰＤＺドメインは様々な蛋白質に見出されており、その
うちの幾つかは細胞間結合に局在している。例えば、シ
ナプス結合におけるＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０（Neuro
n. 9:929-942, 1992; J. Biol. Chem. 268:4580-4583,
1993 ）、隔膜結合におけるＤlg（Cell. 66:451-464, 1
991）、密着結合におけるＺＯ−１およびＺＯ−２（J.
Cell Biol. 193:755-766, 1986; Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA. 88:3460-3464, 1991; J. Cell Biol. 121:491-
502,1993; J. Cell Biol. 123:1049-1053, 1993; Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 90:7834-7838, 1993; J. Cell
Biol. 124:949-961, 1994）等である。また、最近の研
究から、ＰＤＺドメインは標的蛋白質のユニークなＣ−
末端モチーフに結合することが明らかにされたが（Tren
ds Biochem. Sci. 21:455-458, 1996 ）、このモチーフ
は、N-methyl-D-aspartate受容体やＳhaker-type K⁺ チ
ャネル等の多くの膜貫通蛋白質に見出されている（Natu
re 378:85-88, 1995; Science 269:1737-1740, 1995;
J. Neurosci. 16:2157-2163, 1996）。これらの知見か
ら、蛋白質ニューラビンは、シナプスにおけるアクチン
性細胞骨格と膜貫通蛋白質との接着因子として機能して
いるものと考えられる。

【０００６】さらにこの出願の発明者等は、ラット脳か
らニューラビンとは別の新規なアクチン結合蛋白質（l-
アファディン）を単離し、その構造を解析して特許出願
している（特願平９−２５７０４３合）。このl-アファ
ディンは、分子量が約２０５ＫＤａで、Ｃ−端にＦ−ア
クチン結合ドメインを有し、動物の全ての組織において
アクチン性細胞骨格と細胞−細胞ＡＪとを連結する新規
な蛋白質であることが確認されている。

【０００７】

【発明が解決使用とする課題】この出願の発明者等によ
る以上のとおりの精力的な研究により、アクチン性細胞
骨格と結合する接着装置としての新規蛋白質が同定さ
れ、様々な細胞現象の一端が徐々に解明されつつある。
しかしながら、細胞間接着に関与する分子的基礎の全容
は未だ解明されておらず、そのためには、アクチン結合
蛋白質のさらなる同定が必須である。また、このような
蛋白質は、例えば癌腫の浸潤、転移のメカニズム、ある
いは細胞の形状決定の異常を原因とする様々な器官形成
不全の解明につながる可能性もあり、これらのヒト疾患
の診断やその治療法、治療薬等の開発への応用も期待さ
れる。

【０００８】この出願は、以上のとおりの事情に鑑みて
なされたものであって、新規なアクチン結合蛋白質を、
その構造（アミノ酸配列）および性状を明らかにして提
供することを課題としている。また、この出願は、この
アクチン結合蛋白質の遺伝子工学的操作のための材料を
提供することも目的としている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決するものとして、以下の発明を提供する。 （１）ラット蛋白質であって、配列番号１のアミノ酸配
列を有するアクチン結合蛋白質フラビン。 （２）配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列を有す
る動物性蛋白質。 （３）前記（１）のアクチン結合蛋白質フラビンをコー
ドするラット遺伝子。 （４）前記（３）の遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番
号２の塩基配列を有するｃＤＮＡ。 （５）配列番号２の塩基配列における一部連続配列から
なるＤＮＡ断片。 （６）前記（４）のｃＤＮＡまたは（５）のＤＮＡ断片
がハイブリダイズする動物ゲノムＤＮＡ配列。 （７）前記（４）のｃＤＮＡを保有する組換えベクタ
ー。 （８）前記（１）のアクチン結合蛋白質フラビンを免疫
原として作成された抗体。

【００１０】

【発明の実施の形態】この発明のアクチン結合蛋白質
は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）電気泳動による
分子量約１０５ＫＤａの蛋白質である。このアクチン結
合蛋白質は、Ｎ−端領域にＦ−アクチン結合ドメイン、
中央領域にＤb1ホモロジーおよびプレックストリン（pl
eckstrin）ホモロジードメイン、そしてＣ−端領域にシ
ステイン−リッチドメインを有している。これらのドメ
イン構成は、顔面性器形成不全（faciogenital dysplas
ia）またはAarskog-Scott syndrom の原因遺伝子ＦＧＤ
−１と高い相同性を示すことから、この蛋白質をフラビ
ン（frabin: FGD1-related F-actin-binding protein）
と命名した。

【００１１】この発明の蛋白質フラビンは、配列番号１
の全アミノ酸配列からなる蛋白質の他、配列番号１のア
ミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチド
断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。これらのペプ
チド断片は抗体を作製するための抗原として用いること
ができる。さらに、この発明の蛋白質には、他の任意の
蛋白質（例えば、蛍光蛋白質など）との融合蛋白質も含
まれる。

【００１２】この発明の蛋白質フラビンは、公知の方法
によってラットの臓器、細胞株などから単離することが
できる。また、ペプチドとして使用する場合には、この
発明によって提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成
によって調製することもできる。あるいはこの発明によ
って提供されるｃＤＮＡ断片を用いて組換えＤＮＡ技術
によりインビトロで生産することにより取得することも
できる。例えば、組換えＤＮＡ技術によって蛋白質を取
得する場合には、この発明のｃＤＮＡ断片を適当な発現
ベクターに組換え、この組換えベクターによる形質転換
体細胞（大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等）からこの
発明の蛋白質を大量に発現させることができる。具体的
には、例えば、大腸菌などの微生物で発現させる場合に
は、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リ
ボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミ
ネーター等を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮ
Ａを挿入結合して発現ベクターを作成し、この発現ベク
ターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換
体を培養してやれば、ｃＤＮＡがコードしている蛋白質
を微生物内で大量生産することができる。あるいは、他
の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもでき
る。得られた融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断す
ることによって、ｃＤＮＡがコードする蛋白質部分のみ
を取得することもできる。

【００１３】一方、この発明の蛋白質を動物細胞で分泌
発現させる場合には、ｃＤＮＡ断片を、動物細胞用プロ
モーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等
を有する動物細胞用発現ベクターに組換え、動物細胞内
に導入してやれば、この発明の蛋白質を動物細胞内で発
現させることができる。この発明の動物蛋白質は、前記
蛋白質フラビンと実質的に同一のアミノ酸配列を有する
ヒトおよび他の哺乳動物の蛋白質である。これらの蛋白
質は、例えばヒト蛋白質の場合には、この発明のラット
ｃＤＮＡまたはその一部配列をプローブとしてヒトｃＤ
ＮＡライブラリーから得たヒトｃＤＮＡを用い、前記と
同様のインビトロ生産または組換えＤＮＡ技術によって
取得することができる。

【００１４】この発明の遺伝子は、前記蛋白質フラビン
をコードしているラット遺伝子であって、この発明のｃ
ＤＮＡまたはその一部配列からなるＤＮＡ断片をプロー
ブとして既存のラットゲノムライブラリーから単離する
ことができる。また、この発明のゲノムＤＮＡ配列は、
前記蛋白質フラビンと実質的に同一のアミノ酸配列を有
する蛋白質をコードするヒトおよび他の哺乳動物の遺伝
子であって、例えば、この発明のｃＤＮＡまたはその一
部配列をプローブとして既存のゲノムライブラリーから
単離することができる。

【００１５】この発明のｃＤＮＡは、配列番号２の塩基
配列からなるＤＮＡ断片であって、たとえば、その塩基
配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを
用いて、ラット細胞から作製したｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングすることにより、この発明のｃＤＮＡ
のクローンを容易に得ることができる。あるいは、これ
らのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的ｃＤＮＡを合
成することもできる。一般に動物遺伝子は個体差による
多型が頻繁に認められる。従って１または複数個のヌク
レオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチド
による置換がなされているｃＤＮＡもこの発明に含まれ
るものである。同様に、これらの変更によって生じる１
または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他
のアミノ酸による置換がなされている蛋白質も、配列番
号１のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する限
り、この発明の範疇に含まれるものである。

【００１６】また、この発明のｃＤＮＡの部分配列は、
10bp以上の連続配列であり、この連続配列からなるＤＮ
Ａ断片（センス鎖およびアンチセンス鎖）もこの発明の
範囲に含まれる。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用の
プローブとして用いることができる。さらに、この発明
の抗体は、前記の蛋白質それ自体、またはその部分ペプ
チドを抗原として、公知の方法により、ポリクローナル
抗体またはモノクローナル抗体として得ることができ
る。

【００１７】以下、実施例を示してこの発明をさらに詳
細かつ具体的に説明するが、この発明は、以下の例によ
って限定されるものではない。

【００１８】

【実施例】実施例１：アクチン結合蛋白質フラビンの同
定と精製 胎児ラット脳より成長円錐を単離し、¹²⁵Iで標識したＦ
−アクチンによるブロット・オーバーレイ(blot overla
y)法（Cell Motil. Cytoskeleton. 18:164-179, 1991）
を行い、分子量約１０５ＫＤａ（ｐ１０５）のバンドを
確認した。

【００１９】次に、胎児ラット脳の可溶画分をＳＤＳ−
ＰＡＧＥで処理し、分子量約１０５ＫＤａの蛋白質バン
ドを、複数のカラムクロマトグラフィー（Q-Sepharose,
Mono Q, phenyl-5PW, phenyl-5PW PW）で精製した。最
終的なphenyl-5PW PW カラムクロマトグラフィーの結果
を図１に示す。図１（Ａ）は２８０ｎｍでの吸光度、
（Ｂ）は銀染色した蛋白質バンド、（Ｃ）は ¹²⁵Ｉ標識
Ｆ−アクチンによるブロット・オーバーレイである。 実施例２：アクチン結合蛋白質フラビン遺伝子のクロー
ニング 実施例１で得た１０５ＫＤａ精製蛋白質をポリアクリル
アミドゲルから切り出し、その１４カ所の部分アミノ酸
配列を決定した。これらのアミノ酸配列を既存の蛋白質
データベースで検索したが、該当する蛋白質は存在せ
ず、新規な蛋白質であることが確認された。

【００２０】次いで、この部分アミノ酸配列に基づいて
作成したオリゴヌクレオチドプローブを用いてラットの
脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ｐ１０５
をコードするｃＤＮＡを単離した。配列解析の結果、こ
のｃＤＮＡは、配列番号１に示した７６６アミノ酸残基
からなる蛋白質をコードしていることが確認された。ま
た、このアミノ酸配列から算出された分子量は86,449で
あり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量１０５ＫＤａより
少なかった。 実施例３：アクチン結合蛋白質フラビンの動物細胞での
発現とその構造解析 実施例２で構築したｐ１０５のｃＤＮＡを動物細胞発現
ベクターに組み込み、このベクターをＣＯＳ７細胞に導
入して、細胞の発現産物について ¹²⁵Ｉ標識Ｆ−アクチ
ンを用いたブロット・オーバーレイ法による分析を行っ
た。

【００２１】結果は図２に示したとおりである。この図
２において、レーン１は精製蛋白質フラビン、レーン２
は組換え蛋白質（ｐＣＶＭ−フラビン）、レーン３はコ
ントロールである。また、矢印はフラビンを示し、星印
は ¹²⁵Ｉ標識Ｆ−アクチンに対する結合活性を有するＣ
ＯＳ７細胞由来の蛋白質を示している。この図２に示し
たように、得られた組換え蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上でネイティブなｐ１０５と類似の泳動を示し、 ¹²⁵Ｉ
標識Ｆ−アクチンに対する結合活性を有してもいた。以
上の結果から、実施例２で得たｃＤＮＡクローンはｐ１
０５の全長をコードしていることが確認された。

【００２２】また、様々なフラビン断片とＧＳＴ（グル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）との融合蛋白質を
大腸菌で発現させ、それぞれの ¹²⁵Ｉ標識Ｆ−アクチン
結合活性を調べた。結果は図３に示したとおりである。
この図３において、レーン１はＧＳＴ−フラビン１（１
−１５０アミノ酸）、レーン２はＧＳＴ−フラビン２
（１−２０８アミノ酸）、レーン３はＧＳＴ−フラビン
３（２０９−５２０アミノ酸）、レーン４はＧＳＴ−フ
ラビン４（５２１−７６６アミノ酸）を示している。こ
の図３から明らかなように、蛋白質フラビンはそのＮ−
端１５０アミノ酸残基にＦ−アクチン結合ドメインを有
している。既存の蛋白質データベースで検索した結果、
この１−１５０アミノ酸配列は如何なる既知蛋白質とも
有意な相同性を示さないことが確認された。

【００２３】ただし、図４に示したように、蛋白質フラ
ビンのドメイン構成は、ＦＧＤ１のそれと高い相同性を
示した。フラビンのＤb1ホモロジードメイン（ＤＨ）お
よびプレックストリンホモロジードメイン（ＰＨ）は各
々、ＦＧＤ１のそれと７１％および５７％の相同性を示
した。また、フラビンとＦＧＤ１のそれぞれのシステイ
ン−リッチドメイン（ＣＲＤ）の相同性は６５％であっ
た。 実施例４：フラビンの生化学的特性 ＧＳＴ−全長フラビン融合蛋白質をＦ−アクチンと共に
インキュベートした後に超高速遠心し、Ｆ−アクチンを
結合した融合蛋白質を回収した。この融合蛋白質のスト
イキオメトリー（stoichiometry ）を計算した結果、ア
クチン約１４分子当たりＧＳＴ−フラビン１分子の割合
で結合すると計算され、そのＫｄ値は９×１０^-7オーダ
ーと計算された（図５）。なお、図５中の泳動図は、Ｇ
ＳＴ−全長フラビン融合蛋白質をＦ−アクチンとの結合
性を示しており、レーン１および２はＦ−アクチン不在
時の上清画分およびペレット画分、レーン３および４は
Ｆ−アクチン存在時の上清画分およびペレット画分のゲ
ル電気泳動の結果である。矢印はアクチンを、くさび印
はＧＳＴ−全長フラビン融合蛋白質を示す。

【００２４】また、フラビンのアクチン結合様式をブロ
ット・オーバーレイ法を用いて検討した結果、フラビン
とアクチンとの結合はミオシンＳ１によって特異的に阻
害されたが（図６）、この阻害はＭｇＡＴＰの添加によ
って消失した。ミオシンＳ１はＦ−アクチンの側面に結
合することが確認されている蛋白質であり（Science26
1:58-65, 1993; Nature 364:171-174, 1993 ）、ＭｇＡ
ＴＰはアクチン−ミオシン複合体を分離することが知ら
れているため（Biochemistry 14:2207-2214, 1975 ）、
フラビンはＦ−アクチンの側面に結合することが確認さ
れた。

【００２５】次に、ＧＳＴ−全長フラビンおよびＧＳＴ
−フラビン１（１−１５０アミノ酸）について、Ｆ−ア
クチン架橋（crosslinking）活性を透過電子顕微鏡を用
いて調べた。結果は図７に示したとおりであり、ＧＳＴ
−全長フラビンはＦ−アクチンを束化するのに対し、Ｇ
ＳＴ−フラビン１およびＧＳＴ単独ではそのような現象
は観察されなかった。この結果は、フラビンが他の公知
のアクチン結合蛋白質と同様に複数のＦ−アクチン結合
部位を有するオリゴマーとして存在していることを示唆
する。またフラビンがオリゴマーとして存在すること
が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量（１０５ＫＤａ）と
ゲル濾過の推定分子量（８６ＫＤａ）とが異なることの
原因であると考えられる。

【００２６】さらにまた、フラビンがＦ−アクチン結合
蛋白質であることを実証するため、myc で標識化した全
長フラビンまたはその変異体（Ｆ−アクチン結合領域を
欠損したフラビン）をＣＯＳ７細胞で発現させ、発現蛋
白質と内在性Ｆ−アクチンのそれぞれの局在を比較し
た。結果は図８に示したとおりであり、Ｆ−アクチン結
合領域を有するフラビンはＦ−アクチンと同一位置に発
現したのに対し、変異体蛋白質ではそのような発現は観
察されなかった。

【００２７】以上の結果から、フラビンは正常細胞にお
いてＦ−アクチン結合蛋白質として機能しており、Ｆ−
アクチン結合領域はそのＮ−端側（１−１５０アミノ酸
残基）に位置していることが確認された。 実施例５：フラビンの細胞形状に対する効果の確認 フラビンが細胞形状の変化させるか否かについて検討し
た。すなわち、全長フラビンまたはＣdc４２の変異体
（Ｖ１２Ｃdc４２）をスイス３Ｔ３細胞で発現させ、そ
の細胞形状の変化を調べた。結果は図９に示したとおり
であり、フラビンおよびＶ１２Ｃdc４２は全細胞の９０
％以上に対して同程度の細胞変化を生じさせた。

【００２８】次に、フラビンまたはＶ１２Ｃdc４２をＨ
Ａ標識化ＪＮＫとともにＣＯＳ７細胞で発現させた。Ｊ
ＮＫは免疫沈降され、ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎに対するカイ
ネース活性を調べた。その結果、図１０に示したとお
り、フラビンおよびＶ１２Ｃdc４２はＪＮＫを活性化さ
せることが確認された。以上の結果は、フラビンとＦＧ
Ｄ１とが各々のＤＨ領域およびＰＨ領域の相同性が極め
て高いことと考え合わせると、蛋白質フラビンが、ＦＧ
Ｄ１と同様に、Ｃdc４２に対するＧＥＰとして機能し、
そしてＣdc４２の賦活化を通して細胞形状の変化および
ＪＮＫ活性化を生じさせていることを示唆する。 実施例６：抗フラビン抗体の作成 公知の方法に従い、全長フラビンおよびフラビン１（１
−２０８アミノ酸残基）を免疫原として、フラビンを特
異的に認識するウサギ・ポリクローナル抗体を作成し
た。

【００２９】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、細胞間接着に関与する新規なアクチン結合蛋白
質フラビンと、このフラビンを産業上利用するための遺
伝子材料が提供される。

【００３０】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：７６６ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 起源 生物名：ラット 組織：胎児脳 配列 Met Glu Glu Ser Asn Pro Ala Pro Thr Ser Cys Ala Ser Lys Gly Lys 1 5 10 15 His Ser Lys Val Ser Asp Leu Ile Ser His Phe Glu Gly Gly Ser Val 20 25 30 Leu Ser Ser Tyr Thr Asp Val Gln Lys Asp Ser Thr Met Asn Leu Asn 35 40 45 Ile Pro Gln Thr Pro Arg Gln His Gly Leu Thr Ser Thr Thr Pro Gln 50 55 60 Lys Leu Pro Ser His Lys Ser Pro Gln Lys Gln Glu Lys Asp Ser Asp 65 70 75 80 Gln Asn Gln Gly Gln His Gly Cys Leu Ala Asn Gly Val Ala Ala Ala 85 90 95 Gln Ser Gln Met Glu Cys Glu Thr Glu Lys Glu Ala Ala Leu Ser Pro 100 105 110 Glu Thr Asp Thr Gln Thr Ala Ala Ala Ser Pro Asp Ala His Val Leu 115 120 125 Asn Gly Val Arg Asn Glu Thr Thr Thr Asp Ser Ala Ser Ser Val Thr 130 135 140 Asn Ser His Asp Glu Asn Ala Cys Asp Ser Ser Cys Arg Thr Gln Gly 145 150 155 160 Thr Asp Leu Gly Leu Pro Ser Lys Glu Gly Glu Pro Val Ile Glu Ala 165 170 175 Glu Leu Gln Glu Arg Glu Asn Gly Leu Ser Thr Glu Gly Leu Asn Pro 180 185 190 Leu Asp Gln His His Glu Val Lys Glu Thr Asn Glu Gln Lys Leu His 195 200 205 Lys Ile Ala Thr Glu Leu Leu Leu Thr Glu Arg Ala Tyr Val Ser Arg 210 215 220 Leu Asn Leu Leu Asp Gln Val Phe Tyr Cys Lys Leu Leu Glu Glu Ala 225 230 235 240 Asn Arg Gly Ser Phe Pro Ala Glu Met Val Asn Lys Ile Phe Ser Asn 245 250 255 Ile Ser Ser Ile Asn Ala Phe His Ser Lys Phe Leu Leu Pro Glu Leu 260 265 270 Glu Lys Arg Met Gln Glu Trp Glu Thr Thr Pro Arg Ile Gly Asp Ile 275 280 285 Leu Gln Lys Leu Ala Pro Phe Leu Lys Met Tyr Gly Glu Tyr Val Lys 290 295 300 Gly Phe Asp Asn Ala Val Glu Leu Val Lys Asn Met Thr Glu Arg Val 305 310 315 320 Pro Gln Phe Lys Ser Val Thr Glu Glu Ile Gln Lys Gln Lys Ile Cys 325 330 335 Gly Ser Leu Thr Leu Gln His His Met Leu Glu Pro Ile Gln Arg Ile 340 345 350 Pro Arg Tyr Glu Met Leu Leu Lys Asp Tyr Leu Lys Lys Leu Ser Pro 355 360 365 Asp Ala Pro Asp Trp Asn Asp Ala Lys Lys Ser Leu Glu Ile Ile Ser 370 375 380 Thr Ala Ala Ser His Ser Asn Ser Ala Ile Arg Lys Met Glu Asn Leu 385 390 395 400 Lys Lys Leu Leu Glu Ile Tyr Glu Met Leu Gly Glu Glu Glu Asp Ile 405 410 415 Val Asn Pro Ser Asn Glu Leu Ile Lys Glu Gly Gln Ile Leu Lys Leu 420 425 430 Ala Ala Arg Asn Thr Ser Ala Gln Glu Arg Tyr Leu Phe Leu Phe Asn 435 440 445 Asn Met Leu Leu Tyr Cys Val Pro Arg Phe Ser Leu Val Gly Ser Lys 450 455 460 Phe Thr Val Arg Thr Arg Val Gly Ile Asp Gly Met Lys Ile Val Glu 465 470 475 480 Thr His Asn Glu Glu Tyr Pro His Thr Phe Gln Val Ser Gly Lys Glu 485 490 495 Arg Thr Leu Glu Leu Gln Ala Ser Ser Glu Gln Asp Lys Glu Glu Trp 500 505 510 Ile Lys Ala Leu Gln Glu Ser Ile Asp Ala Phe His Gln Arg His Glu 515 520 525 Thr Phe Arg Asn Ala Ile Ala Lys Glu Asn Asp Ile Pro Leu Glu Val 530 535 540 Ser Thr Ala Glu Leu Gly Lys Arg Ala Pro Arg Trp Ile Arg Asp Asn 545 550 555 560 Glu Val Thr Met Cys Met Lys Cys Lys Glu Ser Phe Asn Ala Leu Thr 565 570 575 Arg Arg Arg His His Cys Arg Ala Cys Gly His Val Val Cys Trp Lys 580 585 590 Cys Ser Asp Tyr Lys Ala Gln Leu Glu Tyr Asp Gly Gly Arg Leu Asn 595 600 605 Lys Val Cys Lys Asp Cys Tyr Gln Ile Met Ser Gly Phe Ala Glu Ser 610 615 620 Glu Glu Lys Lys Arg Arg Gly Ile Leu Glu Ile Glu Ser Ala Glu Val 625 630 635 640 Ser Gly Asn Ser Glu Val Cys Ser Phe Leu Gln Tyr Met Glu Lys Ser 645 650 655 Lys Pro Trp Gln Lys Ile Trp Cys Val Ile Pro Lys Gln Asp Pro Leu 660 665 670 Val Leu Tyr Met Tyr Gly Ala Pro Gln Asp Val Arg Ala Gln Ala Thr 675 680 685 Ile Pro Leu Leu Gly Tyr Ile Val Asp Asp Met Pro Lys Ser Ala Asp 690 695 700 Leu Pro His Ser Phe Lys Leu Thr Gln Ser Lys Ser Val His Ser Phe 705 710 715 720 Ala Ala Asp Ser Glu Glu Leu Lys Gln Lys Trp Leu Lys Ile Ile Leu 725 730 735 Leu Ala Val Thr Gly Glu Thr Pro Asp Gly Pro Ser Glu His Leu Asp 740 745 750 Thr Leu Asp Asn Leu Pro Gly Pro Lys Glu Lys Ser Glu Cys * 755 760 765 配列番号：２ 配列の長さ：2301 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ラット 組織：胎児脳 配列 ATGGAGGAGT CTAATCCAGC CCCTACTTCA TGTGCCTCAA AAGGGAAACA TAGTAAGGTG 60 TCGGATCTCA TCAGTCACTT TGAAGGAGGC AGTGTCCTGT CAAGTTACAC TGATGTGCAA 120 AAAGATTCTA CTATGAACCT AAATATTCCT CAAACTCCAA GACAGCATGG GCTAACCTCC 180 ACAACTCCAC AAAAGCTTCC ATCCCACAAG TCTCCACAGA AGCAGGAAAA GGATTCAGAT 240 CAGAATCAGG GCCAACACGG TTGTTTGGCC AATGGTGTGG CGGCTGCACA AAGCCAGATG 300 GAGTGTGAAA CCGAGAAGGA GGCTGCCCTT AGTCCAGAGA CAGACACTCA GACTGCTGCT 360 GCCTCTCCTG ATGCACATGT GCTGAATGGA GTAAGAAACG AAACCACCAC AGATTCTGCA 420 TCCTCTGTAA CCAACAGCCA TGATGAAAAC GCTTGTGACA GCAGCTGCAG GACTCAAGGG 480 ACTGACTTAG GGCTTCCCTC AAAAGAAGGA GAGCCAGTGA TAGAAGCTGA ACTCCAGGAG 540 AGGGAAAATG GACTGAGCAC CGAGGGACTG AATCCGCTGG ACCAGCACCA TGAAGTGAAG 600 GAGACTAATG AGCAGAAACT TCACAAAATA GCCACAGAAC TTTTGCTTAC AGAAAGAGCT 660 TATGTCAGCC GGCTCAACCT CCTAGATCAG GTATTTTATT GCAAACTATT AGAAGAAGCA 720 AACCGAGGCT CATTTCCTGC AGAGATGGTG AATAAAATCT TTTCTAACAT TTCATCAATA 780 AATGCCTTCC ATAGTAAATT CCTATTACCT GAGCTGGAGA AGCGAATGCA AGAATGGGAA 840 ACTACACCCA GAATTGGAGA TATCCTGCAA AAGTTGGCAC CATTCCTTAA GATGTATGGA 900 GAATACGTAA AGGGATTTGA TAATGCGGTG GAACTGGTTA AAAACATGAC AGAGCGTGTT 960 CCCCAGTTTA AATCAGTGAC TGAAGAGATT CAGAAACAGA AGATCTGTGG AAGCTTAACC 1020 CTACAGCATC ACATGCTGGA GCCTATCCAG CGGATCCCTC GCTACGAGAT GCTCCTTAAG 1080 GACTACCTGA AGAAGCTGTC TCCTGACGCC CCAGACTGGA ATGATGCAAA GAAGTCACTT 1140 GAAATTATAT CTACAGCAGC AAGCCATTCT AATAGTGCAA TAAGAAAAAT GGAGAACCTG 1200 AAGAAACTTT TAGAAATTTA TGAGATGTTG GGAGAAGAAG AGGATATTGT AAATCCCTCA 1260 AATGAACTAA TAAAAGAAGG ACAAATCCTC AAACTAGCAG CTCGGAACAC ATCAGCACAA 1320 GAGCGCTACC TCTTCTTATT CAACAACATG TTGCTATATT GTGTGCCCAG ATTCAGTTTG 1380 GTGGGCTCAA AATTCACAGT TCGAACCAGG GTTGGCATTG ATGGAATGAA AATTGTGGAG 1440 ACTCACAATG AAGAGTATCC ACACACTTTC CAGGTGTCTG GGAAAGAAAG AACCCTGGAG 1500 CTGCAGGCCA GTTCTGAGCA AGACAAAGAA GAATGGATCA AGGCACTTCA AGAGAGTATT 1560 GATGCTTTTC ATCAAAGGCA TGAAACCTTC AGAAATGCAA TTGCAAAGGA AAATGACATT 1620 CCCCTAGAGG TTTCTACTGC TGAACTAGGA AAACGAGCCC CAAGATGGAT ACGTGATAAC 1680 GAAGTGACCA TGTGCATGAA GTGCAAAGAG TCTTTCAATG CACTGACCAG GAGGCGGCAT 1740 CACTGCCGGG CGTGTGGACA TGTGGTTTGT TGGAAATGTT CTGACTACAA AGCTCAACTT 1800 GAGTATGACG GTGGAAGGTT GAACAAGGTC TGTAAAGACT GCTACCAGAT AATGAGTGGA 1860 TTCGCAGAGA GTGAAGAAAA GAAAAGAAGG GGCATTTTAG AGATTGAATC AGCAGAAGTA 1920 TCAGGAAATA GTGAAGTATG CAGTTTTCTC CAGTACATGG AAAAGTCAAA ACCCTGGCAG 1980 AAAATATGGT GTGTGATCCC CAAGCAAGAC CCCCTTGTGC TGTACATGTA TGGCGCTCCT 2040 CAGGATGTCA GAGCCCAAGC AACCATACCC CTCCTGGGCT ACATTGTGGA TGACATGCCT 2100 AAGAGTGCAG ATCTGCCGCA CAGTTTCAAG CTGACCCAGT CCAAGTCTGT GCACAGTTTT 2160 GCTGCAGACA GTGAGGAACT GAAACAGAAG TGGCTGAAAA TTATCCTTCT GGCTGTCACG 2220 GGTGAGACAC CAGACGGCCC GAGTGAGCAT CTAGACACCT TAGACAACCT CCCTGGACCC 2280 AAGGAAAAGT CAGAATGCTA A 2301

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明の蛋白質フラビンに対するphenyl-5PW
PW カラムクロマトグラフィーの結果である。（Ａ）は
２８０ｎｍでの吸光度、（Ｂ）は銀染色した蛋白質バン
ド、（Ｃ）は ¹²⁵Ｉ標識Ｆ−アクチンによるブロット・
オーバーレイである。

【図２】組換えフラビンのＦ−アクチン結合活性を示す
電気泳動図である。レーン１は精製蛋白質フラビン、レ
ーン２は組換え蛋白質（ｐＣＶＭ−フラビン）、レーン
３はコントロールである。また、矢印はフラビンを示
し、星印は ¹²⁵Ｉ標識Ｆ−アクチンに対する結合活性を
有するＣＯＳ７細胞由来の蛋白質を示している。

【図３】様々なフラビン断片のＦ−アクチン結合活性を
示す電気泳動図である。レーン１はＧＳＴ−フラビン１
（１−１５０アミノ酸）、レーン２はＧＳＴ−フラビン
２（１−２０８アミノ酸）、レーン３はＧＳＴ−フラビ
ン３（２０９−５２０アミノ酸）、レーン４はＧＳＴ−
フラビン４（５２１−７６６アミノ酸）を示している。

【図４】フラビンとＦＧＤ１とのドメイン構成を示した
模式図である。

【図５】ＧＳＴ−全長フラビン融合蛋白質とＦ−アクチ
ンとの結合の程度を示したグラフ図である。図中は、Ｇ
ＳＴ−全長フラビン融合蛋白質とＦ−アクチンとの結合
性を示す電気泳動図である。

【図６】フラビンとアクチンとの結合に対するミオシン
Ｓ１の効果を示す電気泳動図である。レーン１はコント
ロール、レーン２はＡＴＰ不在時のミオシンＳ１の効
果、レーン３はＡＴＰ存在下でのミオシンＳ１の効果を
示す。

【図７】フラビンとＦ−アクチンとの交叉結合活性を示
す電子顕微鏡写真図である。（ａ）はＧＳＴ−全長フラ
ビン；（ｂ）はＧＳＴ−フラビン１（１−１５０）；
（ｃ）はＧＳＴ単独である。

【図８】ＣＯＳ７細胞におけるフラビンおよびＦ−アク
チンの局在を示す顕微鏡写真図である。（ａ−ｃ）はmy
c 標識化蛋白質、（ｄ−ｆ）はＦ−アクチンである。ま
た、（ａ，ｄ）は myc−全長フラビン；（ｂ，ｅ）は m
yc−フラビン１；（ｃ、ｆ）は myc−フラビン２であ
る。

【図９】フラビンによるスイス３Ｔ３細胞の形状変化を
示す顕微鏡写真図である。（Ａ−Ｃ）はＦ−アクチン、
（Ｄ−Ｆ）はmyc 標識化蛋白質である。（Ａ，Ｄ）はコ
ントロール；（Ｂ、Ｅ）はmyc-V12Cdc42；（Ｃ、Ｆ）は
myc−全長フラビンである。

【図１０】ＣＯＳ７細胞におけるフラビンのＪＮＫ活性
化に関する試験結果である。（Ａ）はＪＮＫ活性であ
る。（Ｂ）はウエスタンブロット分析の結果であり、
（１）はコントロール；（２）はV12Cdc42；（３）はＤ
ｂ１；（４）はフラビンを示す。くさび印はＧＳＴ−ｃ
−Ｊｕｎを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高井 義美 兵庫県神戸市西区学園東町２丁目５番地の 73 (72)発明者 中西 宏之 兵庫県神戸市西区学園西町２丁目５番地の 110

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラット蛋白質であって、配列番号１のア
   ミノ酸配列を有するアクチン結合蛋白質フラビン。
2. 【請求項２】 配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配
   列を有する動物性蛋白質。
3. 【請求項３】 請求項１のアクチン結合蛋白質フラビン
   をコードするラット遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項３の遺伝子のｃＤＮＡであって、
   配列番号２の塩基配列を有するｃＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列番号２の塩基配列における一部連続
   配列からなるＤＮＡ断片。
6. 【請求項６】 請求項４のｃＤＮＡまたは請求項５のＤ
   ＮＡ断片がハイブリダイズする動物ゲノムＤＮＡ配列。
7. 【請求項７】 請求項４のｃＤＮＡを保有する組換えベ
   クター。
8. 【請求項８】 請求項１のアクチン結合蛋白質フラビン
   を免疫原として作成された抗体。