JP3969849B2 - アクチン結合蛋白質フラビン - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、新規なアクチン結合蛋白質フラビン（Ｆrabin）に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、動物の個体形成等に重要な役割を果たす新規動物性蛋白質フラビンと、このフラビンをコードする遺伝子材料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動物個体における様々な細胞現象、例えば、細胞接着、細胞運動および細胞の形状決定等においては、細胞接着分子、受容体およびチャンネル等の膜貫通蛋白質によって形成される接着装置が重要な役割を果たしており、これらの接着装置は、しばしばアクチン性細胞骨格と結合することが知られている（Biochem. Biophys. Acta 737:305-341, 1983; Curr. Opin. Cell Biol. 1:103-109, 1989; Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 3:849-853, 1991; Science. 258:955-964, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 5:653-660, 1993; Trends Biochem. Sci. 22:53-58, 1997 ）。従って、アクチン性細胞骨格と細胞質膜とは前記細胞現象において重要な役割を果たしており、それ故アクチン性細胞骨格を膜貫通蛋白質に結合させる生体分子の特定に多大な努力が払われてきた。しかしながら、アクチン性細胞骨格と細胞質膜との結合に関する分子的基礎については、今だ充分に理解されてはいない。
【０００３】
このような細胞結合に係わる分子的基礎を理解するため、これまでに細胞接着部位が最も広範に研究された（Biochem. Biophys. Acta 737:305-341, 1983; Curr. Opin. Cell Biol. 1:103-109, 1989; Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 3:849-853, 1991; Science. 258:955-964, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 5:653-660, 1993; Trends Biochem. Sci. 22:53-58, 1997 ）。その結果、アクチン線維（Ｆ−アクチン）に関連する細胞接着部位が２つのタイプ、すなわち、細胞−細胞接着帯（adherens junctions: ＡＪ）と、細胞−マトリックスＡＪとに分類されている。細胞−細胞ＡＪにおいては、その細胞外表面でカドヘリン（cadherin）が互いに相互作用しており、多くの結合蛋白質が同定されている（Development 102:639-655, 1988; Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Science 251:1451-1455,1991; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992; EMBO J. 8:1711-1717, 1989; Cell 65:849-857, 1991; Science 251:1451-1455, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992）。これらの結合タンパク質のうち、α−カテニンは、Ｆ−アクチンと直接相互作用する（Pro.Natl. Acad. Sci. USA. 92:8813-8817, 1995）と共に、α−アクチニンおよび／またはＺＯ−１を介してＦ−アクチンに間接的に相互作用している（J. Cell.Biol. 130:67-77, 1995;J. Cell Biol. 138:181-192, 1997 ）。また、別のＦ−アクチン結合蛋白質であるビンキュリン（vinculin）は、細胞−細胞ＡＪに集中していることが知られているが、細胞−細胞ＡＪにおけるその相互作用分子は未だ特定されていない（Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992）。さらに、細胞外表面においてインテグリン（integrin）がマトリックス蛋白質と相互作用する細胞−マトリックスＡＪでは、その細胞質ドメインは、α−アクチニン、ビンキュリン、タリン（talin ）等のＦ−アクチン結合蛋白質と、直接または関節的に相互作用している（Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 11:379-416, 1995）。
【０００４】
以上のとおり、多くのＦ−アクチン結合蛋白質が、アクチン性細胞骨格と細胞質膜のカドヘリンおよびインテグリンとの結合因子（linker）として作用していると考えられている。
一方、アクチン性細胞骨格と細胞質膜との結合は、神経細胞に特異的な現象（例えば、成長円錐の伸長やその後のシナプス結合の形成および維持等）にとっても重要である（Neuron 1:761-772, 1988; Science 242:708-715, 1988; Curr. Opin. Neurobiol. 4:43-48, 1994; Curr. Opin. Neurobiol. 4:640-647, 1994; Cell 83:171-176, 1995）。しかしながら、これらの神経細胞に特異的な現象において、どのような分子がアクチン性細胞骨格を細胞質膜に結合させているかは明らかではない。
【０００５】
この点を明らかにするため、この出願の発明者等は、ラットの脳から幾つかの新規なＦ−アクチン結合蛋白質を単離し、特に神経細胞に特異的で、シナプスに多く存在する蛋白質の構造を解析し、既に特許出願している（特願平９−９２６１５号）。この先願発明の蛋白質（以下、発明者等の命名に従って「ニューラビン」（neurabin) と記載する）は、１つのＦ−アクチン結合ドメインと、１つのＰＤＺドメインを有している。ＰＤＺドメインは様々な蛋白質に見出されており、そのうちの幾つかは細胞間結合に局在している。例えば、シナプス結合におけるＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０（Neuron. 9:929-942, 1992; J. Biol. Chem. 268:4580-4583, 1993 ）、隔膜結合におけるＤlg（Cell. 66:451-464, 1991）、密着結合におけるＺＯ−１およびＺＯ−２（J. Cell Biol. 193:755-766, 1986; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:3460-3464, 1991; J. Cell Biol. 121:491-502, 1993; J. Cell Biol. 123:1049-1053, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:7834-7838, 1993; J. Cell Biol. 124:949-961, 1994）等である。また、最近の研究から、ＰＤＺドメインは標的蛋白質のユニークなＣ−末端モチーフに結合することが明らかにされたが（Trends Biochem. Sci. 21:455-458, 1996 ）、このモチーフは、N-methyl-D-aspartate受容体やＳhaker-type K+ チャネル等の多くの膜貫通蛋白質に見出されている（Nature 378:85-88, 1995; Science 269:1737-1740, 1995; J. Neurosci. 16:2157-2163, 1996）。これらの知見から、蛋白質ニューラビンは、シナプスにおけるアクチン性細胞骨格と膜貫通蛋白質との接着因子として機能しているものと考えられる。
【０００６】
さらにこの出願の発明者等は、ラット脳からニューラビンとは別の新規なアクチン結合蛋白質（l-アファディン）を単離し、その構造を解析して特許出願している（特願平９−２５７０４３合）。このl-アファディンは、分子量が約２０５ＫＤａで、Ｃ−端にＦ−アクチン結合ドメインを有し、動物の全ての組織においてアクチン性細胞骨格と細胞−細胞ＡＪとを連結する新規な蛋白質であることが確認されている。
【０００７】
【発明が解決使用とする課題】
この出願の発明者等による以上のとおりの精力的な研究により、アクチン性細胞骨格と結合する接着装置としての新規蛋白質が同定され、様々な細胞現象の一端が徐々に解明されつつある。
しかしながら、細胞間接着に関与する分子的基礎の全容は未だ解明されておらず、そのためには、アクチン結合蛋白質のさらなる同定が必須である。また、このような蛋白質は、例えば癌腫の浸潤、転移のメカニズム、あるいは細胞の形状決定の異常を原因とする様々な器官形成不全の解明につながる可能性もあり、これらのヒト疾患の診断やその治療法、治療薬等の開発への応用も期待される。
【０００８】
この出願は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、新規なアクチン結合蛋白質を、その構造（アミノ酸配列）および性状を明らかにして提供することを課題としている。
また、この出願は、このアクチン結合蛋白質の遺伝子工学的操作のための材料を提供することも目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の発明を提供する。
（１）ラット蛋白質であって、配列番号１のアミノ酸配列を有するアクチン結合蛋白質フラビン。
（２）配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列を有する動物性蛋白質。
（３）前記（１）のアクチン結合蛋白質フラビンをコードするラット遺伝子。
（４）前記（３）の遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列を有するｃＤＮＡ。
（５）配列番号２の塩基配列における一部連続配列からなるＤＮＡ断片。
（６）前記（４）のｃＤＮＡまたは（５）のＤＮＡ断片がハイブリダイズする動物ゲノムＤＮＡ配列。
（７）前記（４）のｃＤＮＡを保有する組換えベクター。
（８）前記（１）のアクチン結合蛋白質フラビンを免疫原として作成された抗体。
【００１０】
【発明の実施の形態】
この発明のアクチン結合蛋白質は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）電気泳動による分子量約１０５ＫＤａの蛋白質である。このアクチン結合蛋白質は、Ｎ−端領域にＦ−アクチン結合ドメイン、中央領域にＤb1ホモロジーおよびプレックストリン（pleckstrin）ホモロジードメイン、そしてＣ−端領域にシステイン−リッチドメインを有している。これらのドメイン構成は、顔面性器形成不全（faciogenital dysplasia）またはAarskog-Scott syndrom の原因遺伝子ＦＧＤ−１と高い相同性を示すことから、この蛋白質をフラビン（frabin: FGD1-related F-actin-binding protein）と命名した。
【００１１】
この発明の蛋白質フラビンは、配列番号１の全アミノ酸配列からなる蛋白質の他、配列番号１のアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。これらのペプチド断片は抗体を作製するための抗原として用いることができる。さらに、この発明の蛋白質には、他の任意の蛋白質（例えば、蛍光蛋白質など）との融合蛋白質も含まれる。
【００１２】
この発明の蛋白質フラビンは、公知の方法によってラットの臓器、細胞株などから単離することができる。また、ペプチドとして使用する場合には、この発明によって提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成によって調製することもできる。あるいはこの発明によって提供されるｃＤＮＡ断片を用いて組換えＤＮＡ技術によりインビトロで生産することにより取得することもできる。例えば、組換えＤＮＡ技術によって蛋白質を取得する場合には、この発明のｃＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに組換え、この組換えベクターによる形質転換体細胞（大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等）からこの発明の蛋白質を大量に発現させることができる。具体的には、例えば、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡを挿入結合して発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養してやれば、ｃＤＮＡがコードしている蛋白質を微生物内で大量生産することができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。得られた融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって、ｃＤＮＡがコードする蛋白質部分のみを取得することもできる。
【００１３】
一方、この発明の蛋白質を動物細胞で分泌発現させる場合には、ｃＤＮＡ断片を、動物細胞用プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する動物細胞用発現ベクターに組換え、動物細胞内に導入してやれば、この発明の蛋白質を動物細胞内で発現させることができる。
この発明の動物蛋白質は、前記蛋白質フラビンと実質的に同一のアミノ酸配列を有するヒトおよび他の哺乳動物の蛋白質である。これらの蛋白質は、例えばヒト蛋白質の場合には、この発明のラットｃＤＮＡまたはその一部配列をプローブとしてヒトｃＤＮＡライブラリーから得たヒトｃＤＮＡを用い、前記と同様のインビトロ生産または組換えＤＮＡ技術によって取得することができる。
【００１４】
この発明の遺伝子は、前記蛋白質フラビンをコードしているラット遺伝子であって、この発明のｃＤＮＡまたはその一部配列からなるＤＮＡ断片をプローブとして既存のラットゲノムライブラリーから単離することができる。
また、この発明のゲノムＤＮＡ配列は、前記蛋白質フラビンと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするヒトおよび他の哺乳動物の遺伝子であって、例えば、この発明のｃＤＮＡまたはその一部配列をプローブとして既存のゲノムライブラリーから単離することができる。
【００１５】
この発明のｃＤＮＡは、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ断片であって、たとえば、その塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ラット細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、この発明のｃＤＮＡのクローンを容易に得ることができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。一般に動物遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡもこの発明に含まれるものである。同様に、これらの変更によって生じる１または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換がなされている蛋白質も、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する限り、この発明の範疇に含まれるものである。
【００１６】
また、この発明のｃＤＮＡの部分配列は、10bp以上の連続配列であり、この連続配列からなるＤＮＡ断片（センス鎖およびアンチセンス鎖）もこの発明の範囲に含まれる。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプローブとして用いることができる。
さらに、この発明の抗体は、前記の蛋白質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法により、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
【００１７】
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は、以下の例によって限定されるものではない。
【００１８】
【実施例】
実施例１：アクチン結合蛋白質フラビンの同定と精製
胎児ラット脳より成長円錐を単離し、125Iで標識したＦ−アクチンによるブロット・オーバーレイ(blot overlay)法（Cell Motil. Cytoskeleton. 18:164-179, 1991）を行い、分子量約１０５ＫＤａ（ｐ１０５）のバンドを確認した。
【００１９】
次に、胎児ラット脳の可溶画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理し、分子量約１０５ＫＤａの蛋白質バンドを、複数のカラムクロマトグラフィー（Q-Sepharose, Mono Q, phenyl-5PW, phenyl-5PW PW）で精製した。最終的なphenyl-5PW PW カラムクロマトグラフィーの結果を図１に示す。図１（Ａ）は２８０ｎｍでの吸光度、（Ｂ）は銀染色した蛋白質バンド、（Ｃ）は 125Ｉ標識Ｆ−アクチンによるブロット・オーバーレイである。
実施例２：アクチン結合蛋白質フラビン遺伝子のクローニング
実施例１で得た１０５ＫＤａ精製蛋白質をポリアクリルアミドゲルから切り出し、その１４カ所の部分アミノ酸配列を決定した。これらのアミノ酸配列を既存の蛋白質データベースで検索したが、該当する蛋白質は存在せず、新規な蛋白質であることが確認された。
【００２０】
次いで、この部分アミノ酸配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプローブを用いてラットの脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ｐ１０５をコードするｃＤＮＡを単離した。
配列解析の結果、このｃＤＮＡは、配列番号１に示した７６６アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることが確認された。また、このアミノ酸配列から算出された分子量は86,449であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量１０５ＫＤａより少なかった。
実施例３：アクチン結合蛋白質フラビンの動物細胞での発現とその構造解析
実施例２で構築したｐ１０５のｃＤＮＡを動物細胞発現ベクターに組み込み、このベクターをＣＯＳ７細胞に導入して、細胞の発現産物について 125Ｉ標識Ｆ−アクチンを用いたブロット・オーバーレイ法による分析を行った。
【００２１】
結果は図２に示したとおりである。この図２において、レーン１は精製蛋白質フラビン、レーン２は組換え蛋白質（ｐＣＶＭ−フラビン）、レーン３はコントロールである。また、矢印はフラビンを示し、星印は 125Ｉ標識Ｆ−アクチンに対する結合活性を有するＣＯＳ７細胞由来の蛋白質を示している。この図２に示したように、得られた組換え蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でネイティブなｐ１０５と類似の泳動を示し、 125Ｉ標識Ｆ−アクチンに対する結合活性を有してもいた。以上の結果から、実施例２で得たｃＤＮＡクローンはｐ１０５の全長をコードしていることが確認された。
【００２２】
また、様々なフラビン断片とＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）との融合蛋白質を大腸菌で発現させ、それぞれの 125Ｉ標識Ｆ−アクチン結合活性を調べた。
結果は図３に示したとおりである。この図３において、レーン１はＧＳＴ−フラビン１（１−１５０アミノ酸）、レーン２はＧＳＴ−フラビン２（１−２０８アミノ酸）、レーン３はＧＳＴ−フラビン３（２０９−５２０アミノ酸）、レーン４はＧＳＴ−フラビン４（５２１−７６６アミノ酸）を示している。この図３から明らかなように、蛋白質フラビンはそのＮ−端１５０アミノ酸残基にＦ−アクチン結合ドメインを有している。既存の蛋白質データベースで検索した結果、この１−１５０アミノ酸配列は如何なる既知蛋白質とも有意な相同性を示さないことが確認された。
【００２３】
ただし、図４に示したように、蛋白質フラビンのドメイン構成は、ＦＧＤ１のそれと高い相同性を示した。フラビンのＤb1ホモロジードメイン（ＤＨ）およびプレックストリンホモロジードメイン（ＰＨ）は各々、ＦＧＤ１のそれと７１％および５７％の相同性を示した。また、フラビンとＦＧＤ１のそれぞれのシステイン−リッチドメイン（ＣＲＤ）の相同性は６５％であった。
実施例４：フラビンの生化学的特性
ＧＳＴ−全長フラビン融合蛋白質をＦ−アクチンと共にインキュベートした後に超高速遠心し、Ｆ−アクチンを結合した融合蛋白質を回収した。この融合蛋白質のストイキオメトリー（stoichiometry ）を計算した結果、アクチン約１４分子当たりＧＳＴ−フラビン１分子の割合で結合すると計算され、そのＫｄ値は９×１０-7オーダーと計算された（図５）。なお、図５中の泳動図は、ＧＳＴ−全長フラビン融合蛋白質をＦ−アクチンとの結合性を示しており、レーン１および２はＦ−アクチン不在時の上清画分およびペレット画分、レーン３および４はＦ−アクチン存在時の上清画分およびペレット画分のゲル電気泳動の結果である。矢印はアクチンを、くさび印はＧＳＴ−全長フラビン融合蛋白質を示す。
【００２４】
また、フラビンのアクチン結合様式をブロット・オーバーレイ法を用いて検討した結果、フラビンとアクチンとの結合はミオシンＳ１によって特異的に阻害されたが（図６）、この阻害はＭｇＡＴＰの添加によって消失した。ミオシンＳ１はＦ−アクチンの側面に結合することが確認されている蛋白質であり（Science 261:58-65, 1993; Nature 364:171-174, 1993 ）、ＭｇＡＴＰはアクチン−ミオシン複合体を分離することが知られているため（Biochemistry 14:2207-2214, 1975 ）、フラビンはＦ−アクチンの側面に結合することが確認された。
【００２５】
次に、ＧＳＴ−全長フラビンおよびＧＳＴ−フラビン１（１−１５０アミノ酸）について、Ｆ−アクチン架橋（crosslinking）活性を透過電子顕微鏡を用いて調べた。結果は図７に示したとおりであり、ＧＳＴ−全長フラビンはＦ−アクチンを束化するのに対し、ＧＳＴ−フラビン１およびＧＳＴ単独ではそのような現象は観察されなかった。この結果は、フラビンが他の公知のアクチン結合蛋白質と同様に複数のＦ−アクチン結合部位を有するオリゴマーとして存在していることを示唆する。またフラビンがオリゴマーとして存在することが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量（１０５ＫＤａ）とゲル濾過の推定分子量（８６ＫＤａ）とが異なることの原因であると考えられる。
【００２６】
さらにまた、フラビンがＦ−アクチン結合蛋白質であることを実証するため、myc で標識化した全長フラビンまたはその変異体（Ｆ−アクチン結合領域を欠損したフラビン）をＣＯＳ７細胞で発現させ、発現蛋白質と内在性Ｆ−アクチンのそれぞれの局在を比較した。結果は図８に示したとおりであり、Ｆ−アクチン結合領域を有するフラビンはＦ−アクチンと同一位置に発現したのに対し、変異体蛋白質ではそのような発現は観察されなかった。
【００２７】
以上の結果から、フラビンは正常細胞においてＦ−アクチン結合蛋白質として機能しており、Ｆ−アクチン結合領域はそのＮ−端側（１−１５０アミノ酸残基）に位置していることが確認された。
実施例５：フラビンの細胞形状に対する効果の確認
フラビンが細胞形状の変化させるか否かについて検討した。すなわち、全長フラビンまたはＣdc４２の変異体（Ｖ１２Ｃdc４２）をスイス３Ｔ３細胞で発現させ、その細胞形状の変化を調べた。結果は図９に示したとおりであり、フラビンおよびＶ１２Ｃdc４２は全細胞の９０％以上に対して同程度の細胞変化を生じさせた。
【００２８】
次に、フラビンまたはＶ１２Ｃdc４２をＨＡ標識化ＪＮＫとともにＣＯＳ７細胞で発現させた。ＪＮＫは免疫沈降され、ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎに対するカイネース活性を調べた。その結果、図１０に示したとおり、フラビンおよびＶ１２Ｃdc４２はＪＮＫを活性化させることが確認された。
以上の結果は、フラビンとＦＧＤ１とが各々のＤＨ領域およびＰＨ領域の相同性が極めて高いことと考え合わせると、蛋白質フラビンが、ＦＧＤ１と同様に、Ｃdc４２に対するＧＥＰとして機能し、そしてＣdc４２の賦活化を通して細胞形状の変化およびＪＮＫ活性化を生じさせていることを示唆する。
実施例６：抗フラビン抗体の作成
公知の方法に従い、全長フラビンおよびフラビン１（１−２０８アミノ酸残基）を免疫原として、フラビンを特異的に認識するウサギ・ポリクローナル抗体を作成した。
【００２９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、細胞間接着に関与する新規なアクチン結合蛋白質フラビンと、このフラビンを産業上利用するための遺伝子材料が提供される。
【００３０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の蛋白質フラビンに対するphenyl-5PW PW カラムクロマトグラフィーの結果である。（Ａ）は２８０ｎｍでの吸光度、（Ｂ）は銀染色した蛋白質バンド、（Ｃ）は 125Ｉ標識Ｆ−アクチンによるブロット・オーバーレイである。
【図２】組換えフラビンのＦ−アクチン結合活性を示す電気泳動図である。レーン１は精製蛋白質フラビン、レーン２は組換え蛋白質（ｐＣＶＭ−フラビン）、レーン３はコントロールである。また、矢印はフラビンを示し、星印は 125Ｉ標識Ｆ−アクチンに対する結合活性を有するＣＯＳ７細胞由来の蛋白質を示している。
【図３】様々なフラビン断片のＦ−アクチン結合活性を示す電気泳動図である。レーン１はＧＳＴ−フラビン１（１−１５０アミノ酸）、レーン２はＧＳＴ−フラビン２（１−２０８アミノ酸）、レーン３はＧＳＴ−フラビン３（２０９−５２０アミノ酸）、レーン４はＧＳＴ−フラビン４（５２１−７６６アミノ酸）を示している。
【図４】フラビンとＦＧＤ１とのドメイン構成を示した模式図である。
【図５】ＧＳＴ−全長フラビン融合蛋白質とＦ−アクチンとの結合の程度を示したグラフ図である。図中は、ＧＳＴ−全長フラビン融合蛋白質とＦ−アクチンとの結合性を示す電気泳動図である。
【図６】フラビンとアクチンとの結合に対するミオシンＳ１の効果を示す電気泳動図である。レーン１はコントロール、レーン２はＡＴＰ不在時のミオシンＳ１の効果、レーン３はＡＴＰ存在下でのミオシンＳ１の効果を示す。
【図７】フラビンとＦ−アクチンとの交叉結合活性を示す電子顕微鏡写真図である。（ａ）はＧＳＴ−全長フラビン；（ｂ）はＧＳＴ−フラビン１（１−１５０）；（ｃ）はＧＳＴ単独である。
【図８】ＣＯＳ７細胞におけるフラビンおよびＦ−アクチンの局在を示す顕微鏡写真図である。（ａ−ｃ）はmyc 標識化蛋白質、（ｄ−ｆ）はＦ−アクチンである。また、（ａ，ｄ）は myc−全長フラビン；（ｂ，ｅ）は myc−フラビン１；（ｃ、ｆ）は myc−フラビン２である。
【図９】フラビンによるスイス３Ｔ３細胞の形状変化を示す顕微鏡写真図である。（Ａ−Ｃ）はＦ−アクチン、（Ｄ−Ｆ）はmyc 標識化蛋白質である。（Ａ，Ｄ）はコントロール；（Ｂ、Ｅ）はmyc-V12Cdc42；（Ｃ、Ｆ）は myc−全長フラビンである。
【図１０】ＣＯＳ７細胞におけるフラビンのＪＮＫ活性化に関する試験結果である。（Ａ）はＪＮＫ活性である。（Ｂ）はウエスタンブロット分析の結果であり、（１）はコントロール；（２）はV12Cdc42；（３）はＤｂ１；（４）はフラビンを示す。くさび印はＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎを示す。
【発明の属する技術分野】
この発明は、新規なアクチン結合蛋白質フラビン（Ｆrabin）に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、動物の個体形成等に重要な役割を果たす新規動物性蛋白質フラビンと、このフラビンをコードする遺伝子材料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動物個体における様々な細胞現象、例えば、細胞接着、細胞運動および細胞の形状決定等においては、細胞接着分子、受容体およびチャンネル等の膜貫通蛋白質によって形成される接着装置が重要な役割を果たしており、これらの接着装置は、しばしばアクチン性細胞骨格と結合することが知られている（Biochem. Biophys. Acta 737:305-341, 1983; Curr. Opin. Cell Biol. 1:103-109, 1989; Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 3:849-853, 1991; Science. 258:955-964, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 5:653-660, 1993; Trends Biochem. Sci. 22:53-58, 1997 ）。従って、アクチン性細胞骨格と細胞質膜とは前記細胞現象において重要な役割を果たしており、それ故アクチン性細胞骨格を膜貫通蛋白質に結合させる生体分子の特定に多大な努力が払われてきた。しかしながら、アクチン性細胞骨格と細胞質膜との結合に関する分子的基礎については、今だ充分に理解されてはいない。
【０００３】
このような細胞結合に係わる分子的基礎を理解するため、これまでに細胞接着部位が最も広範に研究された（Biochem. Biophys. Acta 737:305-341, 1983; Curr. Opin. Cell Biol. 1:103-109, 1989; Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 3:849-853, 1991; Science. 258:955-964, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 5:653-660, 1993; Trends Biochem. Sci. 22:53-58, 1997 ）。その結果、アクチン線維（Ｆ−アクチン）に関連する細胞接着部位が２つのタイプ、すなわち、細胞−細胞接着帯（adherens junctions: ＡＪ）と、細胞−マトリックスＡＪとに分類されている。細胞−細胞ＡＪにおいては、その細胞外表面でカドヘリン（cadherin）が互いに相互作用しており、多くの結合蛋白質が同定されている（Development 102:639-655, 1988; Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Science 251:1451-1455,1991; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992; EMBO J. 8:1711-1717, 1989; Cell 65:849-857, 1991; Science 251:1451-1455, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992）。これらの結合タンパク質のうち、α−カテニンは、Ｆ−アクチンと直接相互作用する（Pro.Natl. Acad. Sci. USA. 92:8813-8817, 1995）と共に、α−アクチニンおよび／またはＺＯ−１を介してＦ−アクチンに間接的に相互作用している（J. Cell.Biol. 130:67-77, 1995;J. Cell Biol. 138:181-192, 1997 ）。また、別のＦ−アクチン結合蛋白質であるビンキュリン（vinculin）は、細胞−細胞ＡＪに集中していることが知られているが、細胞−細胞ＡＪにおけるその相互作用分子は未だ特定されていない（Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992）。さらに、細胞外表面においてインテグリン（integrin）がマトリックス蛋白質と相互作用する細胞−マトリックスＡＪでは、その細胞質ドメインは、α−アクチニン、ビンキュリン、タリン（talin ）等のＦ−アクチン結合蛋白質と、直接または関節的に相互作用している（Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 11:379-416, 1995）。
【０００４】
以上のとおり、多くのＦ−アクチン結合蛋白質が、アクチン性細胞骨格と細胞質膜のカドヘリンおよびインテグリンとの結合因子（linker）として作用していると考えられている。
一方、アクチン性細胞骨格と細胞質膜との結合は、神経細胞に特異的な現象（例えば、成長円錐の伸長やその後のシナプス結合の形成および維持等）にとっても重要である（Neuron 1:761-772, 1988; Science 242:708-715, 1988; Curr. Opin. Neurobiol. 4:43-48, 1994; Curr. Opin. Neurobiol. 4:640-647, 1994; Cell 83:171-176, 1995）。しかしながら、これらの神経細胞に特異的な現象において、どのような分子がアクチン性細胞骨格を細胞質膜に結合させているかは明らかではない。
【０００５】
この点を明らかにするため、この出願の発明者等は、ラットの脳から幾つかの新規なＦ−アクチン結合蛋白質を単離し、特に神経細胞に特異的で、シナプスに多く存在する蛋白質の構造を解析し、既に特許出願している（特願平９−９２６１５号）。この先願発明の蛋白質（以下、発明者等の命名に従って「ニューラビン」（neurabin) と記載する）は、１つのＦ−アクチン結合ドメインと、１つのＰＤＺドメインを有している。ＰＤＺドメインは様々な蛋白質に見出されており、そのうちの幾つかは細胞間結合に局在している。例えば、シナプス結合におけるＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０（Neuron. 9:929-942, 1992; J. Biol. Chem. 268:4580-4583, 1993 ）、隔膜結合におけるＤlg（Cell. 66:451-464, 1991）、密着結合におけるＺＯ−１およびＺＯ−２（J. Cell Biol. 193:755-766, 1986; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:3460-3464, 1991; J. Cell Biol. 121:491-502, 1993; J. Cell Biol. 123:1049-1053, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:7834-7838, 1993; J. Cell Biol. 124:949-961, 1994）等である。また、最近の研究から、ＰＤＺドメインは標的蛋白質のユニークなＣ−末端モチーフに結合することが明らかにされたが（Trends Biochem. Sci. 21:455-458, 1996 ）、このモチーフは、N-methyl-D-aspartate受容体やＳhaker-type K+ チャネル等の多くの膜貫通蛋白質に見出されている（Nature 378:85-88, 1995; Science 269:1737-1740, 1995; J. Neurosci. 16:2157-2163, 1996）。これらの知見から、蛋白質ニューラビンは、シナプスにおけるアクチン性細胞骨格と膜貫通蛋白質との接着因子として機能しているものと考えられる。
【０００６】
さらにこの出願の発明者等は、ラット脳からニューラビンとは別の新規なアクチン結合蛋白質（l-アファディン）を単離し、その構造を解析して特許出願している（特願平９−２５７０４３合）。このl-アファディンは、分子量が約２０５ＫＤａで、Ｃ−端にＦ−アクチン結合ドメインを有し、動物の全ての組織においてアクチン性細胞骨格と細胞−細胞ＡＪとを連結する新規な蛋白質であることが確認されている。
【０００７】
【発明が解決使用とする課題】
この出願の発明者等による以上のとおりの精力的な研究により、アクチン性細胞骨格と結合する接着装置としての新規蛋白質が同定され、様々な細胞現象の一端が徐々に解明されつつある。
しかしながら、細胞間接着に関与する分子的基礎の全容は未だ解明されておらず、そのためには、アクチン結合蛋白質のさらなる同定が必須である。また、このような蛋白質は、例えば癌腫の浸潤、転移のメカニズム、あるいは細胞の形状決定の異常を原因とする様々な器官形成不全の解明につながる可能性もあり、これらのヒト疾患の診断やその治療法、治療薬等の開発への応用も期待される。
【０００８】
この出願は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、新規なアクチン結合蛋白質を、その構造（アミノ酸配列）および性状を明らかにして提供することを課題としている。
また、この出願は、このアクチン結合蛋白質の遺伝子工学的操作のための材料を提供することも目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の発明を提供する。
（１）ラット蛋白質であって、配列番号１のアミノ酸配列を有するアクチン結合蛋白質フラビン。
（２）配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列を有する動物性蛋白質。
（３）前記（１）のアクチン結合蛋白質フラビンをコードするラット遺伝子。
（４）前記（３）の遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列を有するｃＤＮＡ。
（５）配列番号２の塩基配列における一部連続配列からなるＤＮＡ断片。
（６）前記（４）のｃＤＮＡまたは（５）のＤＮＡ断片がハイブリダイズする動物ゲノムＤＮＡ配列。
（７）前記（４）のｃＤＮＡを保有する組換えベクター。
（８）前記（１）のアクチン結合蛋白質フラビンを免疫原として作成された抗体。
【００１０】
【発明の実施の形態】
この発明のアクチン結合蛋白質は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）電気泳動による分子量約１０５ＫＤａの蛋白質である。このアクチン結合蛋白質は、Ｎ−端領域にＦ−アクチン結合ドメイン、中央領域にＤb1ホモロジーおよびプレックストリン（pleckstrin）ホモロジードメイン、そしてＣ−端領域にシステイン−リッチドメインを有している。これらのドメイン構成は、顔面性器形成不全（faciogenital dysplasia）またはAarskog-Scott syndrom の原因遺伝子ＦＧＤ−１と高い相同性を示すことから、この蛋白質をフラビン（frabin: FGD1-related F-actin-binding protein）と命名した。
【００１１】
この発明の蛋白質フラビンは、配列番号１の全アミノ酸配列からなる蛋白質の他、配列番号１のアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。これらのペプチド断片は抗体を作製するための抗原として用いることができる。さらに、この発明の蛋白質には、他の任意の蛋白質（例えば、蛍光蛋白質など）との融合蛋白質も含まれる。
【００１２】
この発明の蛋白質フラビンは、公知の方法によってラットの臓器、細胞株などから単離することができる。また、ペプチドとして使用する場合には、この発明によって提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成によって調製することもできる。あるいはこの発明によって提供されるｃＤＮＡ断片を用いて組換えＤＮＡ技術によりインビトロで生産することにより取得することもできる。例えば、組換えＤＮＡ技術によって蛋白質を取得する場合には、この発明のｃＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに組換え、この組換えベクターによる形質転換体細胞（大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等）からこの発明の蛋白質を大量に発現させることができる。具体的には、例えば、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡを挿入結合して発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養してやれば、ｃＤＮＡがコードしている蛋白質を微生物内で大量生産することができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。得られた融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって、ｃＤＮＡがコードする蛋白質部分のみを取得することもできる。
【００１３】
一方、この発明の蛋白質を動物細胞で分泌発現させる場合には、ｃＤＮＡ断片を、動物細胞用プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する動物細胞用発現ベクターに組換え、動物細胞内に導入してやれば、この発明の蛋白質を動物細胞内で発現させることができる。
この発明の動物蛋白質は、前記蛋白質フラビンと実質的に同一のアミノ酸配列を有するヒトおよび他の哺乳動物の蛋白質である。これらの蛋白質は、例えばヒト蛋白質の場合には、この発明のラットｃＤＮＡまたはその一部配列をプローブとしてヒトｃＤＮＡライブラリーから得たヒトｃＤＮＡを用い、前記と同様のインビトロ生産または組換えＤＮＡ技術によって取得することができる。
【００１４】
この発明の遺伝子は、前記蛋白質フラビンをコードしているラット遺伝子であって、この発明のｃＤＮＡまたはその一部配列からなるＤＮＡ断片をプローブとして既存のラットゲノムライブラリーから単離することができる。
また、この発明のゲノムＤＮＡ配列は、前記蛋白質フラビンと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするヒトおよび他の哺乳動物の遺伝子であって、例えば、この発明のｃＤＮＡまたはその一部配列をプローブとして既存のゲノムライブラリーから単離することができる。
【００１５】
この発明のｃＤＮＡは、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ断片であって、たとえば、その塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ラット細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、この発明のｃＤＮＡのクローンを容易に得ることができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。一般に動物遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡもこの発明に含まれるものである。同様に、これらの変更によって生じる１または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換がなされている蛋白質も、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する限り、この発明の範疇に含まれるものである。
【００１６】
また、この発明のｃＤＮＡの部分配列は、10bp以上の連続配列であり、この連続配列からなるＤＮＡ断片（センス鎖およびアンチセンス鎖）もこの発明の範囲に含まれる。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプローブとして用いることができる。
さらに、この発明の抗体は、前記の蛋白質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法により、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
【００１７】
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は、以下の例によって限定されるものではない。
【００１８】
【実施例】
実施例１：アクチン結合蛋白質フラビンの同定と精製
胎児ラット脳より成長円錐を単離し、125Iで標識したＦ−アクチンによるブロット・オーバーレイ(blot overlay)法（Cell Motil. Cytoskeleton. 18:164-179, 1991）を行い、分子量約１０５ＫＤａ（ｐ１０５）のバンドを確認した。
【００１９】
次に、胎児ラット脳の可溶画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理し、分子量約１０５ＫＤａの蛋白質バンドを、複数のカラムクロマトグラフィー（Q-Sepharose, Mono Q, phenyl-5PW, phenyl-5PW PW）で精製した。最終的なphenyl-5PW PW カラムクロマトグラフィーの結果を図１に示す。図１（Ａ）は２８０ｎｍでの吸光度、（Ｂ）は銀染色した蛋白質バンド、（Ｃ）は 125Ｉ標識Ｆ−アクチンによるブロット・オーバーレイである。
実施例２：アクチン結合蛋白質フラビン遺伝子のクローニング
実施例１で得た１０５ＫＤａ精製蛋白質をポリアクリルアミドゲルから切り出し、その１４カ所の部分アミノ酸配列を決定した。これらのアミノ酸配列を既存の蛋白質データベースで検索したが、該当する蛋白質は存在せず、新規な蛋白質であることが確認された。
【００２０】
次いで、この部分アミノ酸配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプローブを用いてラットの脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ｐ１０５をコードするｃＤＮＡを単離した。
配列解析の結果、このｃＤＮＡは、配列番号１に示した７６６アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることが確認された。また、このアミノ酸配列から算出された分子量は86,449であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量１０５ＫＤａより少なかった。
実施例３：アクチン結合蛋白質フラビンの動物細胞での発現とその構造解析
実施例２で構築したｐ１０５のｃＤＮＡを動物細胞発現ベクターに組み込み、このベクターをＣＯＳ７細胞に導入して、細胞の発現産物について 125Ｉ標識Ｆ−アクチンを用いたブロット・オーバーレイ法による分析を行った。
【００２１】
結果は図２に示したとおりである。この図２において、レーン１は精製蛋白質フラビン、レーン２は組換え蛋白質（ｐＣＶＭ−フラビン）、レーン３はコントロールである。また、矢印はフラビンを示し、星印は 125Ｉ標識Ｆ−アクチンに対する結合活性を有するＣＯＳ７細胞由来の蛋白質を示している。この図２に示したように、得られた組換え蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でネイティブなｐ１０５と類似の泳動を示し、 125Ｉ標識Ｆ−アクチンに対する結合活性を有してもいた。以上の結果から、実施例２で得たｃＤＮＡクローンはｐ１０５の全長をコードしていることが確認された。
【００２２】
また、様々なフラビン断片とＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）との融合蛋白質を大腸菌で発現させ、それぞれの 125Ｉ標識Ｆ−アクチン結合活性を調べた。
結果は図３に示したとおりである。この図３において、レーン１はＧＳＴ−フラビン１（１−１５０アミノ酸）、レーン２はＧＳＴ−フラビン２（１−２０８アミノ酸）、レーン３はＧＳＴ−フラビン３（２０９−５２０アミノ酸）、レーン４はＧＳＴ−フラビン４（５２１−７６６アミノ酸）を示している。この図３から明らかなように、蛋白質フラビンはそのＮ−端１５０アミノ酸残基にＦ−アクチン結合ドメインを有している。既存の蛋白質データベースで検索した結果、この１−１５０アミノ酸配列は如何なる既知蛋白質とも有意な相同性を示さないことが確認された。
【００２３】
ただし、図４に示したように、蛋白質フラビンのドメイン構成は、ＦＧＤ１のそれと高い相同性を示した。フラビンのＤb1ホモロジードメイン（ＤＨ）およびプレックストリンホモロジードメイン（ＰＨ）は各々、ＦＧＤ１のそれと７１％および５７％の相同性を示した。また、フラビンとＦＧＤ１のそれぞれのシステイン−リッチドメイン（ＣＲＤ）の相同性は６５％であった。
実施例４：フラビンの生化学的特性
ＧＳＴ−全長フラビン融合蛋白質をＦ−アクチンと共にインキュベートした後に超高速遠心し、Ｆ−アクチンを結合した融合蛋白質を回収した。この融合蛋白質のストイキオメトリー（stoichiometry ）を計算した結果、アクチン約１４分子当たりＧＳＴ−フラビン１分子の割合で結合すると計算され、そのＫｄ値は９×１０-7オーダーと計算された（図５）。なお、図５中の泳動図は、ＧＳＴ−全長フラビン融合蛋白質をＦ−アクチンとの結合性を示しており、レーン１および２はＦ−アクチン不在時の上清画分およびペレット画分、レーン３および４はＦ−アクチン存在時の上清画分およびペレット画分のゲル電気泳動の結果である。矢印はアクチンを、くさび印はＧＳＴ−全長フラビン融合蛋白質を示す。
【００２４】
また、フラビンのアクチン結合様式をブロット・オーバーレイ法を用いて検討した結果、フラビンとアクチンとの結合はミオシンＳ１によって特異的に阻害されたが（図６）、この阻害はＭｇＡＴＰの添加によって消失した。ミオシンＳ１はＦ−アクチンの側面に結合することが確認されている蛋白質であり（Science 261:58-65, 1993; Nature 364:171-174, 1993 ）、ＭｇＡＴＰはアクチン−ミオシン複合体を分離することが知られているため（Biochemistry 14:2207-2214, 1975 ）、フラビンはＦ−アクチンの側面に結合することが確認された。
【００２５】
次に、ＧＳＴ−全長フラビンおよびＧＳＴ−フラビン１（１−１５０アミノ酸）について、Ｆ−アクチン架橋（crosslinking）活性を透過電子顕微鏡を用いて調べた。結果は図７に示したとおりであり、ＧＳＴ−全長フラビンはＦ−アクチンを束化するのに対し、ＧＳＴ−フラビン１およびＧＳＴ単独ではそのような現象は観察されなかった。この結果は、フラビンが他の公知のアクチン結合蛋白質と同様に複数のＦ−アクチン結合部位を有するオリゴマーとして存在していることを示唆する。またフラビンがオリゴマーとして存在することが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量（１０５ＫＤａ）とゲル濾過の推定分子量（８６ＫＤａ）とが異なることの原因であると考えられる。
【００２６】
さらにまた、フラビンがＦ−アクチン結合蛋白質であることを実証するため、myc で標識化した全長フラビンまたはその変異体（Ｆ−アクチン結合領域を欠損したフラビン）をＣＯＳ７細胞で発現させ、発現蛋白質と内在性Ｆ−アクチンのそれぞれの局在を比較した。結果は図８に示したとおりであり、Ｆ−アクチン結合領域を有するフラビンはＦ−アクチンと同一位置に発現したのに対し、変異体蛋白質ではそのような発現は観察されなかった。
【００２７】
以上の結果から、フラビンは正常細胞においてＦ−アクチン結合蛋白質として機能しており、Ｆ−アクチン結合領域はそのＮ−端側（１−１５０アミノ酸残基）に位置していることが確認された。
実施例５：フラビンの細胞形状に対する効果の確認
フラビンが細胞形状の変化させるか否かについて検討した。すなわち、全長フラビンまたはＣdc４２の変異体（Ｖ１２Ｃdc４２）をスイス３Ｔ３細胞で発現させ、その細胞形状の変化を調べた。結果は図９に示したとおりであり、フラビンおよびＶ１２Ｃdc４２は全細胞の９０％以上に対して同程度の細胞変化を生じさせた。
【００２８】
次に、フラビンまたはＶ１２Ｃdc４２をＨＡ標識化ＪＮＫとともにＣＯＳ７細胞で発現させた。ＪＮＫは免疫沈降され、ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎに対するカイネース活性を調べた。その結果、図１０に示したとおり、フラビンおよびＶ１２Ｃdc４２はＪＮＫを活性化させることが確認された。
以上の結果は、フラビンとＦＧＤ１とが各々のＤＨ領域およびＰＨ領域の相同性が極めて高いことと考え合わせると、蛋白質フラビンが、ＦＧＤ１と同様に、Ｃdc４２に対するＧＥＰとして機能し、そしてＣdc４２の賦活化を通して細胞形状の変化およびＪＮＫ活性化を生じさせていることを示唆する。
実施例６：抗フラビン抗体の作成
公知の方法に従い、全長フラビンおよびフラビン１（１−２０８アミノ酸残基）を免疫原として、フラビンを特異的に認識するウサギ・ポリクローナル抗体を作成した。
【００２９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、細胞間接着に関与する新規なアクチン結合蛋白質フラビンと、このフラビンを産業上利用するための遺伝子材料が提供される。
【００３０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の蛋白質フラビンに対するphenyl-5PW PW カラムクロマトグラフィーの結果である。（Ａ）は２８０ｎｍでの吸光度、（Ｂ）は銀染色した蛋白質バンド、（Ｃ）は 125Ｉ標識Ｆ−アクチンによるブロット・オーバーレイである。
【図２】組換えフラビンのＦ−アクチン結合活性を示す電気泳動図である。レーン１は精製蛋白質フラビン、レーン２は組換え蛋白質（ｐＣＶＭ−フラビン）、レーン３はコントロールである。また、矢印はフラビンを示し、星印は 125Ｉ標識Ｆ−アクチンに対する結合活性を有するＣＯＳ７細胞由来の蛋白質を示している。
【図３】様々なフラビン断片のＦ−アクチン結合活性を示す電気泳動図である。レーン１はＧＳＴ−フラビン１（１−１５０アミノ酸）、レーン２はＧＳＴ−フラビン２（１−２０８アミノ酸）、レーン３はＧＳＴ−フラビン３（２０９−５２０アミノ酸）、レーン４はＧＳＴ−フラビン４（５２１−７６６アミノ酸）を示している。
【図４】フラビンとＦＧＤ１とのドメイン構成を示した模式図である。
【図５】ＧＳＴ−全長フラビン融合蛋白質とＦ−アクチンとの結合の程度を示したグラフ図である。図中は、ＧＳＴ−全長フラビン融合蛋白質とＦ−アクチンとの結合性を示す電気泳動図である。
【図６】フラビンとアクチンとの結合に対するミオシンＳ１の効果を示す電気泳動図である。レーン１はコントロール、レーン２はＡＴＰ不在時のミオシンＳ１の効果、レーン３はＡＴＰ存在下でのミオシンＳ１の効果を示す。
【図７】フラビンとＦ−アクチンとの交叉結合活性を示す電子顕微鏡写真図である。（ａ）はＧＳＴ−全長フラビン；（ｂ）はＧＳＴ−フラビン１（１−１５０）；（ｃ）はＧＳＴ単独である。
【図８】ＣＯＳ７細胞におけるフラビンおよびＦ−アクチンの局在を示す顕微鏡写真図である。（ａ−ｃ）はmyc 標識化蛋白質、（ｄ−ｆ）はＦ−アクチンである。また、（ａ，ｄ）は myc−全長フラビン；（ｂ，ｅ）は myc−フラビン１；（ｃ、ｆ）は myc−フラビン２である。
【図９】フラビンによるスイス３Ｔ３細胞の形状変化を示す顕微鏡写真図である。（Ａ−Ｃ）はＦ−アクチン、（Ｄ−Ｆ）はmyc 標識化蛋白質である。（Ａ，Ｄ）はコントロール；（Ｂ、Ｅ）はmyc-V12Cdc42；（Ｃ、Ｆ）は myc−全長フラビンである。
【図１０】ＣＯＳ７細胞におけるフラビンのＪＮＫ活性化に関する試験結果である。（Ａ）はＪＮＫ活性である。（Ｂ）はウエスタンブロット分析の結果であり、（１）はコントロール；（２）はV12Cdc42；（３）はＤｂ１；（４）はフラビンを示す。くさび印はＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎを示す。
Claims (7)
- ラット蛋白質であって、配列番号１のアミノ酸配列を有するアクチン結合蛋白質フラビン。
- 配列番号１のアミノ酸配列における１または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または置換されたアミノ酸配列を有し、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質と同一のアクチン結合活性を有し、かつ、 JNK を活性化する蛋白質。
- 請求項１のアクチン結合蛋白質フラビンをコードするラット遺伝子。
- 請求項３の遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列を有するｃＤＮＡ。
- 請求項２の蛋白質をコードするＤＮＡ。
- 請求項４のｃＤＮＡを有する組換えベクター。
- 請求項１のアクチン結合蛋白質フラビンを免疫原として作成され、該アクチン結合蛋白質フラビンを特異的に認識する抗体。
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| US20020142464A1 (en) * | 2000-09-08 | 2002-10-03 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 38646, a novel guanine nucleotide exchange factor and uses therefor |
-
1998
- 1998-06-11 JP JP16401698A patent/JP3969849B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JPH11346775A (ja) | 1999-12-21 |
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