JP4231778B2 - 精巣型カルニチントランスポーターとその遺伝子 - Google Patents
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Description
本発明は精巣及び精巣上体におけるカルニチン及びその類似物質のナトリウム依存的な輸送に関与する遺伝子と、その遺伝子がコードするポリペプチドに関する。
背景技術
カルニチンは、生体のあらゆる臓器における脂肪酸のベータ酸化において重要な役割を果たしている。あらゆる臓器の細胞はそのエネルギー源であるATP(アデノシン三リン酸)を脂肪酸のベータ酸化によりミトコンドリア内で産生している。脂肪酸のアシル基はカルニチンの作用によりミトコンドリア内に輸送され、アシルCo−Aに変換された後、ベータ酸化を受け、ATPを産生する。カルニチンは多くは食物由来であり、一部は肝臓、脳で生合成されるが、多くの細胞はカルニチンを細胞外より取り込む必要があり、カルニチン特異的な輸送体が細胞膜に存在することがこれまでの生理学的な研究から予測されてきた。
各種細胞のカルニチンの取り込みについては、これまで摘出臓器灌流法や単離細胞膜小胞系などを用いた実験系により研究されてきた。しかし従来の手法では、細胞膜を介したカルニチン輸送系について詳細に解析することは困難であり、トランスポーターそのものを単離して解析することが望まれてきた。
カルニチントランスポーターとして、ラットCT1(Sekine,T et al.,Biochem.Biophis.Res.Commun.,第251巻、586−591頁、1998年)が単離されている。CT1のヒトにおける相同遺伝子としてhOCTN2(Tamai,I.et al.,J.Biol.Chem.,第273巻、20378−20382頁、1998年)が報告されている。これらは全身の臓器に広く分布し、各種細胞のカルニチン取り込みに寄与している。また腎臓にも発現し、カルニチンを尿細管腔より再吸収する機能をはたしている。
これまでの研究で、精巣及び精巣上体のカルニチンの濃度は生体内で最も高く、種によっては血中濃度の2000倍にも達することが明らかにされた。精巣上体管腔は精子の栄養及び成熟を司る器官であることから、カルニチンと精子機能の関連が注目されてきた。
精巣で産生された精子は、その段階では未成熟であり、運動性もきわめて低く、そのままでは受精能力を有さないことが明らかになっている。精巣を離れた精子は精巣上体に移行し、様々な修飾をうけ、成熟する。また精子の受精能にはその鞭毛運動が不可欠であり、そのために膨大なエネルギーを要する。このエネルギー源となるATP産生のためにカルニチンが大量に要求されると考えるのは合目的的である。
実際にヒトの精液中カルニチン濃度と精子の数及び運動能の正の相関を示す研究も報告されている。また臨床医学において、特発性不妊症患者にカルニチンを投与したところ、妊娠の確率が上昇したとの報告もされている。
このように、精巣及び精巣上体に特異的なカルニチン輸送は、精子の成熟及び受精能力に関して重要な役割を担っていると考えられ、摘出臓器灌流法や単離細胞膜小胞系などを用いた実験系により研究されてきた。これらの研究により能動的カルニチン輸送系が存在することは示されていたが、その分子的実体は不明であった。
本発明者の一部らは、以前に腎臓、肝臓、脳、胎盤などにおける薬物輸送において中心的な役割を果たしている有機アニオントランスポーターOAT1(organic anion transporter1)(Sekine,T.et al.,J.Biol.Chem.,第272巻,18526−18529頁、1997年)、OAT2(Sekine,T.,FEBS letter,第429巻、179−182頁、1998年)、OAT3(Kusuhara,H.et al.,J.Biol.Chem.,第274巻、13675−13680頁、1999年)、及びOAT4(Cha,S.H.et al.,J.Biol.Chem.,第275巻、4507−4512頁、2000年)を単離し報告してきた。OATファミリーに属するこれらのトランスポーターは化学構造の異なる多くの有機アニオンを輸送することの出来るトランスポーターであり、種々のアニオン性薬物の輸送も行っている。
更に近年、有機カチオンを認識するOCT(organic cation transporter)ファミリーも同定されている。カルニチンは正電荷及び負電荷の両者を併せ持つ有機イオンであり、カルニチントランスポーターは分子進化の観点からOATファミリーとOCTファミリーの中間に位置することが予想される。
これらの事実から、本発明者らは、精巣及び精巣上体に特異的なカルニチントランスポーターが有機イオントランスポーターファミリーに属するものであることを予測した。
発明の開示
本発明の目的は、精巣及び精巣上体におけるカルニチン輸送に関与する新規なカルニチントランスポーター遺伝子及びその遺伝子がコードするポリペプチドであるカルニチントランスポーターを同定し、提供することにある。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、(1)配列番号:1に記載されたアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、カルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質に関する。
また、本発明は、(2)上記タンパク質をコードする遺伝子に関する。
更に、本発明は、(3)配列番号:1に記載された塩基配列からなるDNA、又は該DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードするDNA、からなる遺伝子に関する。
更にまた、本発明は、(4)上記遺伝子若しくは該遺伝子の中のタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターに関する。
また、本発明は、(5)上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
更に、本発明は、(6)配列番号:1に記載された塩基配列の中の連続する14塩基以上の部分配列若しくはその相補的な配列を含むヌクレオチドに関する。
更にまた、本発明は、(7)上記ヌクレオチドを含んでなる、ナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブに関する。
また、本発明は、(8)上記ヌクレオチドを用いて、ナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させる方法に関する。
更に、本発明は、(9)上記(1)に記載のタンパク質に対する抗体に関する。
更にまた、本発明は、(10)上記(1)に記載のタンパク質を用いて、該タンパク質の有するナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用を検出する方法に関する。
また、本発明は、(11)上記(1)に記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質或いは機能抑制物質を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精巣及び精巣上体での動態を調整する方法に関する。
更に、本発明は、(12)上記(1)に記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質或いは機能抑制物質を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞に与える影響を調整する方法に関する。
更にまた、本発明は、(13)上記(1)に記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質或いは機能抑制物質を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞の受精能力に与える影響を調整する方法に関する。
また、本発明は、(14)上記(1)に記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質或いは機能抑制物質を用いて、該タンパク質を特定の細胞に過剰発現させるか、或いはすでに細胞に存在する該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞の受精能力、或いは個体の受精能力に与える影響を検出及び調整する方法に関する。
即ち、本発明者らは既に述べたように、4つの有機アニオントランスポーターOAT1、OAT2、OAT3及びOAT4を先に単離した。これらは相互に40%前後のアミノ酸配列の相同性を有している。これらの配列をもとに、EST(expressed sequence tag)データベースを検索し、OAT1,2,3及び4と相同性を有する新規cDNA断片を同定し、このcDNA断片を用いて、ヒト精巣cDNAライブラリーよりこれまでに報告のない新規クローン(CT2)を同定し本発明を完成するに到った。
本発明のカルニチントランスポーターCT2は、L−カルニチン及びその類似物質を細胞膜を介して一方より他方に輸送する能力を有し、他のOATやOCTファミリーに属する薬物トランスポーターと比較して、狭い範囲の基質選択性を有するトランスポーターである。
本発明のタンパク質としては、配列番号:1に記載されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば、配列番号:1に記載されたアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられるが、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、有機アニオン輸送活性が失われない程度であればよく、その数としては、通常1〜約110個、好ましくは1〜約55個である。このようなタンパク質は、配列番号1で示されたアミノ酸配列と通常、〜75%、好ましくは〜90%のアミノ酸配列の相同性を有する。
本発明の遺伝子としては、配列番号:1に記載された塩基配列を有するDNAからなるもののほか、例えば、配列番号:1に記載された塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子が挙げられる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイゼーションを、5×SSC(standard saline citrate)又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、37〜42℃の温度条件下、約12時間行い、5×SSCまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で予備洗浄を行った後に、1×SSC又はこれと同等の塩濃度で洗浄を行うことにより実施できる。また、より高いストリンジェンシーを得るためには、洗浄を0.1×SSC又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
本発明のカルニチントランスポーター遺伝子、並びに本発明のタンパク質は、適当な哺乳動物の臓器、組織、若しくは培養細胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。哺乳動物としては、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット、マウスなどの非ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。
遺伝子のスクリーニング及び単離は、ホモロジースクリーニング及びPCRスクリーニングなどにより好適に実施できる。
得られたcDNAについては、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質、即ちCT2のアミノ酸配列を決定することができる。
得られたcDNAがカルニチントランスポーターのcDNAであること、即ちcDNAにコードされた遺伝子産物がカルニチントランスポーターであることは、例えば次のようにして検証することができる。
得られたCT2cDNAから調製したcRNAを卵母細胞に導入して発現させ、カルニチンを細胞内に輸送する(取り込む)能力を、カルニチンを基質とする通常の取り込み実験(Sekine,T et al.,Biochem.Biophis.Res.Commun.,第251巻、586−591頁、1998年)により、細胞内への基質取り込みを測定することにより確認できる。
また、発現細胞に同様の取り込み実験を応用して、CT2の輸送特性や基質特異性などを調べることができる。
また、発現細胞について、同様の取り込み実験を応用して、CT2の特性、例えば、CT2が時間依存性の輸送を行っているという特性や、CT2のナトリウム依存性、基質選択性、pH依存性などを調べることができる。
得られたCT2遺伝子のcDNAを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なcDNAライブラリー又はゲノミックDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。
また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列(配列番号:1)に示された塩基配列、若しくはその一部)の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常のPCR法によりcDNAライブラリーから遺伝子を単離することが出来る。
cDNAライブラリー及びゲノミックDNAライブラリー等のDNAライブラリーは、例えば、「Molecular Cloning;Sambrook,J.,Fritsh,E.F.及びManiatis,T.著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊」に記載の方法により調製することができる。或いは、市販のライブラリーがある場合にはこれを用いてもよい。
CT2遺伝子のヒトゲノム上における構造を得るには、得られたCT2遺伝子のcDNAを用いて、ゲノミックDNAライブラリーをスクリーニングし、得られたクローンを解析する。或いは公開されているヒトゲノム解析結果の情報をもとにホモロジー検索プログラムを用いてこれを探索してもよい。
本発明のカルニチントランスポーター(CT2)は、例えば、カルニチントランスポーターをコードするcDNAを用い、遺伝子組み換え技術により生産することができる。例えば、カルニチントランスポーターをコードするDNA(cDNA等)を適当な発現ベクター、例えばプラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等に組み込み、得られた組み換えDNAを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチドを生産するための発現系(宿主ベクター系)としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳動物細胞の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を用いることが望ましい。
例えば、ポリペプチドを哺乳動物で発現させる場合には、カルニチントランスポーターをコードするDNAを、適当な発現ベクター(例えば、プラスミドベクター、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクチニアウイルスベクター、SV40系ベクター等)中の適当なプロモーター(例えばSV40プロモーター、LTRプロモーター、エロンゲーション1αプロモーター等)の下流に挿入して発現ベクターを構築する。次に、得られた発現ベクターで適当な動物細胞を形質転換して、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とするポリペプチドが生産される。宿主とする哺乳動物細胞としては、サルCOS−7細胞、チャイニーズハムスターCHO細胞、ヒトHela細胞または、腎臓組織由来の初代培養細胞やブタ腎由来LLC−PK1細胞、フクロネズミ腎由来OK細胞、マウス由来近位尿細管S1、同S2、同S3細胞等の細胞株が挙げられる。
カルニチントランスポーターCT2をコードするcDNAとしては、例えば、配列番号:1に記載された塩基配列を有するcDNAを用いることが出来るほか、前記のcDNAに限定されることなく、アミノ酸配列に対応するDNAを設計し、ポリペプチドをコードするDNAを用いることもできる。この場合、一つのアミノ酸をコードするコドンは各々1〜6種類知られており、用いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現の高い配列を設計することが望ましい。設計した塩基配列をもつDNAはDNAの化学合成、前記cDNAの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位変異導入法(site specific mutagenesis)「Mark,D.F.ら、Proc Natl Acad Sci USA第18巻、5662−5666頁、1984年」等により実施できる。
本発明のカルニチントランスポーター遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド(オリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド)は、カルニチントランスポーター遺伝子を検出するためのプローブとして使用できるほか、カルニチントランスポーターの発現を変調させるために、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、やリボザイム、デコイとして使用することもできる。このようなヌクレオチドとしては、例えば、配列番号:1に記載された塩基配列の中の通常、連続する14塩基以上の部分配列若しくはその相補的な配列を含むヌクレオチドを用いることができ、ハイブリダイズをより特異的とするためには、部分配列としてより長い配列、例えば20塩基以上或いは30塩基以上の配列を用いても良い。
また、本発明のカルニチントランスポーターまたは、これと免疫学的同等性を有するポリペプチドを用いて、その抗体を取得することが出来、抗体は、カルニチントランスポーター検出や精製などに利用できる。抗体は、本発明のカルニチントランスポーター、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチド等を抗原として用いて製造できる。ポリクロナール抗体は、宿主動物(たとえば、ラットやウサギ)に抗原を接種し、免疫血清を回収する通常の方法により製造することができ、モノクロナール抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。
本発明のタンパク質を用いることにより、該タンパク質の有するナトリウム依存的にカルニチン及びその類似物質を輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用を検出することが出来る。
また、本発明のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質(例えば、アンドロゲン等のホルモン)或いは機能抑制物質(例えば、アンチセンスヌクレオチド等)を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精巣及び精巣上体での動態を調整することが出来る。
更に、本発明のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質(例えば、アンドロゲン等のホルモン等)或いは機能抑制物質(例えば、アンチセンスヌクレオチド等)を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞に与える影響を調整することが出来る。
更にまた、本発明のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質(例えば、アンドロゲン等のホルモン等)或いは機能抑制物質(例えば、アンチセンスヌクレオチド等)を用いて、該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞の受精能力に与える影響を調整することが出来る。
また、本発明のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質(例えば、アンドロゲン等のホルモン等)或いは機能抑制物質(例えば、アンチセンスヌクレオチド等)を用いて、該タンパク質を特定の細胞に過剰発現させるか、或いは既に細胞に存在する該タンパク質の有するカルニチン及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送されるカルニチン及びその類似物質の精子細胞の受精能力、或いは個体の受精能力に与える影響を検出又は調整することが出来る。
実施例
以下、実施例により本説明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
なお、下記実施例において、各操作は特に断りがない限り、「Molecular Cloning:Sambrook,J.,Fritsh,E.F.及びManiatis,T.著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊」に記載の方法により行うか、又は市販のキットを用いる場合には市販品の指示書に従ってこれを使用した。
実施例1 精巣及び精巣上体特異的カルニチントランスポーター(CT2)cDNAの単離とその解析
先に本発明者の一部らが単離したOAT1、OAT2、OAT3、OAT4、及びCT1の塩基配列情報をもとに、公開されているESTデータベースを探索した。この結果、OAT1、OAT2、OAT3、OAT4、及びCT1と相同性を有する新規cDNA断片AA778598を得た。
AA778598を32Pでラベルしたプローブを用いて、既に構築してあったヒト精巣cDNAライブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、50℃のハイブリダイゼーション用溶液中で一昼夜行い、その後フィルター膜は、50℃で0.1×SSC(standard saline citrate)/0.1%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)で洗浄した。ハイブリダイゼーション溶液としては、50%ホルムアミド、5×SSC、3×デンハード液、0.2%SDS、10%硫酸デキストラン、0.2mg/ml変性サーモン精子DNA、2.5mMピロリン酸ナトリウム、25mM MES、0.01%Antifoam B(シグマ社製、発泡防止剤)を含むpH6.5の緩衝液を用いた。λZipLox中に単離されたクローンはin vitro excision法によりプラスミドベクターpZL1に更にサブクローン化した。この結果、カルニチン輸送活性を持つ新規cDNA(CT2cDNA)が得られた。
上記により得られたcDNA(CT2cDNA)の塩基配列の決定は、特異的プライマーを用いて、自動シークエンサー(アプライドバイオシステム社製)によりおこなった(配列番号:1に記載)。
次いで、CT2cDNAを含むプラスミドから、T7RNAポリメラーゼを用いて、in vitroでcRNA(cDNAに相補的なRNA)を調製した(Sekine,T.,et al.,J.Biol.Chem.,第272巻、18526−18529頁、1997年参照)。
得られたcRNAを、既に報告されている方法(Sekine,T.,et al.,J.Biol.Chem.,第272巻、18526−18529頁、1997年)に従い、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、この卵母細胞について放射能標識されたL−カルニチンによる取り込み実験を行った。この結果、第1図Aに示すようにCT2を発現させた卵母細胞は3H−L−カルニチンの取り込みを示すことが判明した。これに対して代表的な有機アニオンである14C−PAH(パラアミノ馬尿酸)及び有機カチオンである14C−TEA(テトラエチルアンモニウム)の取り込みは認められなかった。
以下に、本発明のCT2について、輸送機能解析、基質選択性の検討、遺伝子発現の解析、遺伝子がコードするタンパク質の精巣及び精巣上体における免疫組織学的検討、並びにCT2遺伝子のヒトゲノムにおける構造解析を行った結果を順を追って記す。
(1)CT2のカルニチン輸送の時間依存性試験をおこなった。
この結果、第1図Bに示すようにCT2を発現させた卵母細胞は3H−L−カルニチンの取り込みの時間依存性を示した。このことから、CT2は単にカルニチンと結合するだけではなく、細胞内に輸送するトランスポーターであることが示された。
(2)CT2のカルニチン輸送のミカエリス−メンテン動力学試験をおこなった。
種々の濃度のカルニチンのCT2による取り込み量の変化を調べることにより、カルニチンのCT2による輸送の濃度依存性を検討した。放射能標識されたカルニチンの取り込み実験は、CT2cRNAを注入した卵母細胞を用い、前記記載方法に準じて実施した。この結果(第2図A)、L−カルニチンの取り込みのKm値は約20.3μMであった。
(3)L−カルニチンの異性体であるD−カルニチンがCT2によるL−カルニチン輸送に与える影響を検討した。
第2図Bに示すように、D−カルニチンは濃度依存的にCT2によるL−カルニチン輸送を阻害した。Ki値は約30.1μMであった。
(4)CT2のカルニチン輸送におけるナトリウム依存性を検討した。
細胞外ナトリウムをリチウム及びN−メチル−D−グルカミンに置換した場合、CT2を介したカルニチンの輸送は減少し、CT2が細胞外ナトリウム依存性のカルニチントランスポーターであることが明らかになった(第3図A)。ただし細胞外ナトリウムをリチウム及びN−メチル−D−グルカミンに置換した場合でも取り込みは完全には減少せず、部分的細胞外ナトリウムに依存することが明らかになった。
(5)CT2のカルニチン輸送におけるpH依存性を検討した。
第3図Bに示すように、細胞外のpHをより酸性にしたところ、CT2のカルニチン輸送は減少した。
(6)CT2の基質選択性をさらに検討するために、CT2cRNAを注入した卵母細胞による3H−カルニチンの取り込み実験系において、系へ各種カルニチン類似物質を添加し、その影響を調べた(阻害実験)。
3H−カルニチンの取り込み実験は、CT2cRNAを注入した卵母細胞を用い、前記記載方法に準じて実施した。5μM、及び50μMの各種化合物(非標識)の存在下及び非存在下で、50nM 3H−カルニチンの取り込みを測定した。その結果、種々のカルニチン類似物質(D−カルニチン、アセチルL−カルニチン、アセチルDL−カルニチン、オクタノイルL−カルニチン、ベタインなど)はCT2による3H−カルニチンの輸送を有意に阻害した(第4図)。一方、パラアミノ馬尿酸やテトラエチルアンモニウムのようなアニオン性物質及びカチオン性物質は阻害作用を示さなかった(第4図)。以上の結果から、CT2はカルニチン及びカルニチン類似物質の特異的なトランスポーターであることが判明した。
(7)ヒトの各組織におけるCT2遺伝子の発現(ノーザンブロッティング)の解析を行った。
CT2cDNAの全長を32P−dCTPでラベルし、これをプローブとして用いて、ヒトの種々の組織から抽出したRNAをブロッティングしたフィルター(クロンテック社製)のハイブリダイゼーションをおこなった。CT2cDNA全長を含んだハイブリダイゼーション液で一晩ハイブリダイセーションを行い、フィルターを65℃にて、0.1%SDSを含む0.1×SSCで洗浄した。ノーザンブロットの結果(第5図)、精巣のみにおいて、強いバンドが検出された。
(8)CT2の遺伝子がコードするタンパク質の精巣及び精巣上体における免疫組織学的検討を行った。
CT2タンパク質のカルボキシル末端の14アミノ酸残基からなるポリペプチドを合成し、これをウサギに免疫することにより、抗血清を得た。ヒト精巣のパラフィン切片を脱パラフィン化したのち、3%過酸化水素水で処理することにより内因性のペルオキシダーゼを不活性化した。切片をアフィニティー精製したポリクローナル抗CT2抗体(1次抗体)で24時間インキュベートし、次にペルオキシダーゼで標識した抗ウサギIgG抗体で反応させた。最後にペルオキシダーゼの基質であるジアミノベンジジンを加えることにより、茶褐色の沈殿の得られた場所を光学顕微鏡で観察した。第6図に示す通り、精巣ではセルトリ細胞の細胞質内に、精巣上体では上皮細胞の管腔側に有意な染色がみられた(第6図中、矢頭はCT2発現部位を示す。)。従って、CT2は精巣においてセルトリ細胞内にカルニチンを供給し、また精巣上体管腔内に血中よりカルニチンを輸送するトランスポーターである。
(9)CT2遺伝子のヒトゲノムにおける構造を解析した。
ホモロジー検索プログラムを利用して公開されているヒトゲノム解析結果の情報を探索したところ、CT2遺伝子のエクソン・イントロン構造が明らかになった。第7図に示すように、CT2遺伝子は10のエクソンからなり、開始コドンは第2エクソンに存在した。
産業上の利用可能性
本発明のカルニチンを選択的に輸送する精巣及び精巣上体特異的カルニチントランスポーター及びその遺伝子は当該トランスポーターの発現箇所でのカルニチン及びカルニチン類似物質の輸送のインビトロでの検討や、それを基にしたそれら化合物の生殖器官内の動態の予測を可能とする。カルニチンは精子の運動能及び受精能に必須なエネルギー産生に必須の因子であり、当該トランスポーターの発明は将来特発性男性不妊症の病因解明に寄与するものと考えられる。さらに、当該トランスポーターの発現を変調する制御因子を解明することにより、カルニチン輸送能を変調させる方法、精子受精能を変調させる方法の開発に利用できる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第1図は、ヒトCT2遺伝子のcRNAを注入した卵母細胞によるカルニチン取り込み実験の結果(A)と時間依存性(B)を示す図である。
第2図は、ヒトCT2遺伝子のcRNAを注入した卵母細胞によるカルニチン取り込みのミカエリス−メンテン動力学試験の結果(A)とCT2によるL−カルニチン輸送においてD−カルニチンの阻害効果を調べた結果(B)を示す図である。
第3図は、ヒトCT2遺伝子のcRNAを注入した卵母細胞によるカルニチン取り込み実験において、添加する塩の影響を調べた結果(A)とpHの影響を調べた結果(B)を示す図である。
第4図は、ヒトCT2遺伝子のcRNAを注入した卵母細胞によるカルニチン取り込み実験において、系へのカルニチン類似物質添加の影響を調べた結果を示す図である。
第5図は、ヒトの各臓器組織におけるCT2遺伝子mRNAの発現をノーザンブロッティングにより解析した結果を示す図面に代わる写真である。
第6図は、精巣及び精巣上体におけるCT2タンパク質の発現を免疫組織学的に解析した結果を示す図面に代わる写真である。
第7図は、CT2遺伝子のヒトゲノムにおける構造を解析した結果を示す図である。
Claims (2)
- 配列番号1に記載されたアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、カルニチンを輸送する能力を有するタンパク質を用いて、該タンパク質の有するナトリウム依存的にカルニチンを輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用を検出する方法。
- 配列番号1に記載されたアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、カルニチンを輸送する能力を有するタンパク質を用いたカルニチンの取り込み実験系に物質を添加することを特徴とする、前記タンパク質のカルニチン輸送能を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
a)前記タンパク質を発現している細胞を調製する工程、
b)前記細胞を用いたカルニチンの取り込み実験系に前記物質を添加する工程、及び
c)前記細胞へのカルニチンの取込量を測定する工程
を含む、前記方法。
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