JP4441118B2 - 新規コレクチン - Google Patents

Description

〔技術分野〕
本発明は、生体防御機構の解明に有用であり、また抗ウイルス活性などを含む生理活性を有することが期待され、医薬品用途への応用が可能であると考えられる、新規コレクチンに関する。
〔背景技術〕
コレクチンは、Ｃａ^２＋要求性の糖認識構造様領域（ＣＲＤ）及びコラーゲン様領域を有するタンパク質の総称であり、細菌、ウイルスを始め様々な微生物に対する基礎免疫に関与していると考えられている。
これまでに見出されているコレクチンとして、マンナン結合タンパク質（ＭＢＰ）、サーファクタントタンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）およびサーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）、コングルチニンなどを挙げることができる。これらのコレクチンは、図１（ａ）に示すような、（１）Ｃａ^２＋要求性の糖認識構造様領域（ＣＲＤ）、及び（２）コラーゲン様領域の特徴的な領域を含む基本構造から構成されていることが知られており〔Ｍａｌｈｏｒｔｒａら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジ−（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、２２巻、１４３７〜１４４５頁、１９９２年〕、この基本構造３個がコラーゲン様領域においてトリプルヘリックスを構成することによりサブユニットを形成し、さらにこのサブユニットが３量体、４量体、６量体等のオリゴマー構造を形成している。
脊椎動物では、細胞を介する免疫応答および特異的抗体反応によるメカニズムが、病原菌、ウイルスなどの侵入に対する最大の生体防御システムと考えられている。最近になって、コングルチニン等のレクチンによる非特異的な免疫応答への関与が示唆され、例えば、母親の移行抗体や特異的防御システムが充分に発達していない小児に対し、種々の微生物の中和作用や排除に重要な役割を果たしているとの報告がなされている〔Ｓｕｐｅｒら、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、２巻、１２３６〜１２３９頁、１９８９年〕。さらに、宿主の生体防御におけるこれらレクチンの役割について、例えば、ＭＢＰの遺伝子上の変異に起因したＭＢＰの血中濃度の低下によって、宿主が感染を受けやすくなるという研究結果が報告されている〔Ｓｕｍｉｙａら、ランセット、３３７巻、１５６９〜１５７０頁、１９９１年〕。
本発明者らのグループは、以前に、コングルチニンおよびマンナン結合タンパク質が、Ｈ１およびＨ３タイプのインフルエンザＡウイルスの感染や赤血球凝集活性を阻害することを見出した〔Ｗａｋａｍｉｙａら、グライココンジュゲイト・ジャーナル（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．）、８巻、２３５頁、１９９１年；Ｗａｋａｍｉｙａら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケイションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）、１８７巻、１２７０〜１２７８頁、１９９２年〕。
その後さらに、コングルチニンをコードするｃＤＮＡクローンを取得し、コングルチニンと種々のサーファクタントタンパク質Ｄ遺伝子との間の強い関連性も見出されている〔Ｓｕｚｕｋｉら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケイションズ、１９１巻、３３５〜３４２頁、１９９３年〕。
このように、コレクチンは、生体防御機構の解明における有用性及び生理活性医薬物質としての有用性などが期待される物質であり、このファミリーに属する新規分子種の発見は、感染症の治療の他種２々の医療分野、そして生物学の分野にも寄与するところ大である。
〔発明の開示〕
本発明は、かかる現状に鑑みてなされたものであり、特にヒトの体内で抗細菌、抗ウイルス活性などの生理活性を発揮することが期待される新規コレクチンを得ることを目的とするものである。
すなわち、本発明は、
［１］配列番号：２の第２０６〜５４７位で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
［２］配列番号：２の第２２９〜５４７位で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
［３］配列番号：１の第６７０〜１６９５位で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
［４］配列番号：１の第７３９〜１６９５位で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
［５］配列番号：４及び配列番号：５で示される塩基配列を有するプライマーを用いて行ったＰＣＲ反応の増幅産物であるプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、且つコレクチンをコードするポリヌクレオチド、
［６］［１］乃至［５］に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、該ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、（１）Ｃａ^２＋要求性の糖認識構造様領域（ＣＲＤ）、及び（２）コラーゲン様領域を含む、ヒトコレクチンであるポリヌクレオチド、
［７］［３］乃至［６］に記載のポリヌクレオチドによってコードされる新規コレクチン、
［８］配列番号：２の第２０６〜５４７位で示されるアミノ酸配列を含む新規コレクチン、
「９］配列番号：２の第２２９〜５４７位で示されるアミノ酸配列を含む新規コレクチン、
［１０］［７］乃至［９］のいずれかに記載の新規コレクチンのアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、（１）Ｃａ^２＋要求性の糖認識構造様領域（ＣＲＤ）、及び（２）コラーゲン様領域を含む、新規コレクチンをその要旨とし、
コレクチンに特徴的な構造を有し、従来報告されているものとは異なる新規のコレクチン遺伝子及びタンパク質を提供するものである。
〔発明を実施するための最良の形態〕
如上の本発明において、前記ポリヌクレオチド［１］〜［６］は、好ましくはｃＤＮＡである。
上記［２］に示されるポリヌクレオチドは、少なくとも配列番号：２の第２２９〜５４７位で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むが、第一メチオニン残基の上流に、さらなる塩基配列、例えば、配列番号：２の第２２６〜２２８位もしくは第２１１〜２２８位、または配列番号：２の第１０２〜２２８位、第９１〜２２８位、第９〜２２８位、第１〜２２８位などのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含みうるものである。
また、上記［４］に示されるポリヌクレオチドは、塩基配列の５’上流に配列番号：１の第７３０〜７３８位もしくは第６８５〜７３８位、または第３５８〜７３８位、第３２５〜７３８位、第７９〜７３８位、第５５〜７３８位もしくは第１〜７３８位で示される塩基配列をさらに含みうる。
さらに、上記［３］または［４］に示されるポリヌクレオチドはの３’下流には、配列番号：１の第１６９６〜２０２４位で示される塩基配列をさらに含みうる。
なお、本発明の上記タンパク質［７］〜［１０］はヒト由来であることが、ヒトの体内で抗細菌、ウイルス活性などを発揮できることが期待され、生理活性医薬物質としての有用性に鑑みて好ましい。従って、本発明のタンパク質は、ヒト由来の新規コレクチンを企図するものであり、様々なヒト生体組織を検討したところ、有用と考えられる新規コレクチンがヒト胎盤等に発現されていることが示された。
そして、上記［９］に示される新規コレクチンは、少なくとも配列番号：２の第２２９〜５４７位で示されるアミノ酸配列を含むものであるが、その第一メチオニン残基の上流に、例えば、配列番号：２の第２２６〜２２８位もしくは第２１１〜２２８位、または配列番号：２の第１０２〜２２８位、第９１〜２２８位、第９〜２２８位、第１〜２２８位などのアミノ酸配列をさらに含みうるものである。
上記［５］または［６］におけるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５ｘＳＳＣ（２０ｘＳＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）を４倍希釈することにより５ｘＳＳＣを調製）、１％ブロッキング剤（ベーリンガー・マンハイム社製）、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％ＳＤＳの溶液中で、６８℃にて１時間プレハイブリダイゼーション；ｃＤＮＡブローブ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含む５ｘＳＳＣ、１％ブロッキング剤、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％ＳＤＳの溶液中で、５５℃にて１６時間ハイブリダイゼーション：２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で５分間２回洗浄；５５℃にて、０．５ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で１５分間２回洗浄を行う一連の処理工程を含むハイブリダイゼーションが含まれるが、当該技術分野における知識に基づき、溶液濃度や温度、時間等の条件を適宜に変更することができる。
そして、上記［１０］における、１または複数のアミノ酸の欠失、置換及び／または付加とは、新規コレクチンの親水性・疎水性、酸性・塩基性、含有基などに大幅な変化をきたさず、（１）Ｃａ^２＋要求性の糖認識構造様領域（ＣＲＤ）及び（２）コラーゲン様領域の有する各々の特徴を変えることが少ない範囲でのアミノ酸の欠失、置換及び／または付加を称する。これまでに報告されているコレクチンファミリーのタンパク質のアミノ酸配列とその構造に基づき、例えば（１）Ｃａ^２＋要求性の糖認識構造様領域（ＣＲＤ）において１〜１０程度、（２）コラーゲン様領域において１〜１００程度、好ましくは１〜１５のアミノ酸の欠失、置換及び／または付加が許容されると考えられる。
本発明はまた、上記のポリヌクレオチドを、新規コレクチンの発現を許容するように含むベクターを提供する。
このポリヌクレオチドが挿入されるベクターは、プラスミド、λファージ、コスミド等のようなレプリコンに、上記新規コレクチンにかかるポリヌクレオチドを組み込んで、新規コレクチンが複製・発現されるようにしたものを言う。例えば、コスミドよりもさらに長いＤＮＡ断片をクローニングできるベクターとして、Ｐ１ファージ、Ｆ因子および酵母の人工染色体ＹＡＣ等がある。また、λファージには置換型ベクターおよび挿入型ベクターが含まれ、これらは導入する遺伝子の長さに応じて適宜選択することができる。また、例えば動物細胞発現可能なベクターとして公知のものに、ＳＶ４０系ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、ヘルペスウィルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レトロウイルスベクター等がある。市販されているものとしては、ｐＵＣ１９、ｐＴＶ１１８Ｎ（寳酒造社製）、ｐＵＥＸ２（アマシャム製）、ｐＧＥＸ−４Ｔ、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ（クロンテック社製）、ｐＧＬ２（プロメガ社製）、ｐＤＮＡ３．１＋（インビトロジェン社製）等が挙げられる。かかるベクターの構築方法は、特に限定されるものではなく常法により制限酵素、リガーゼ等を利用して行うことができる。
上記ベクターが形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞として細菌、特に大腸菌を使用する場合には、ベクターは普通少なくともプロモーター領域（プロモーター、オペレーター及びシャインダルガーノ配列を含む）、開始コドン、新規コレクチンをコードする塩基配列、終始コドン、ターミネーター領域等から構成される。酵母または動物細胞を宿主として用いる場合、ベクターは、少なくともプロモーター、開始コドン、シグナルペプチド、新規コレクチンをコードする塩基配列及び終始コドンを含むことが好ましい。また、エンハンサー配列、新規コレクチンの５’−及び３’−非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位及び選択マーカーをベクターに挿入することもできる。
本発明のベクターに組み込まれるプロモーターとしては、従来よりよく知られているＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０）、ＳＲα、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、アクチンプロモーター、ウイルス性ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ）、例えばＨＴＬＶ−１ ＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ラウス肉芽種ウイルスＬＴＲ、単純ヘルペスチロシンキナーゼウイルスプロモーター等の強力なプロモーター、弱いプロモーターに関わらず使用できる。
真核細胞において、線維芽細胞、神経細胞、血液細胞および実質細胞等の正常細胞から、癌細胞に至る多くの細胞種に発現を期待する場合、一般的なプロモーターとしては、サイトメガロウィルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、β−アクチンおよびＳＶ４０初期遺伝子プロモーター等が挙げられる。エンハンサーは通常、プロモーター配列とセットになっているのでそのまま利用することができる。
また、遺伝子を導入し発現させる細胞および組織が特定されている場合には、細胞に特異的なプロモーターを選択することができる。さらに、これらプロモーターをホモあるいはヘテロに組合せることにより、高発現が期待でき、安定に新規コレクチンが得られるという効果が奏される場合がある。
一方、原核細胞において使用されるプロモーターとして、ＰＢＡＤ、ＰＬ、ｔｒｃ、Ｔ７、ＳＰ６、Ｔ３、ｌａｃ等がある。
主として、これらの原核細胞由来の細胞内で新規コレクチンを高発現させることができるプロモーターは宿主に適合する限り、本発明のプロモーターとして適宜選択して用いることができる。また、遺伝子を導入し発現させる細胞および組織が特定されている場合には細胞に特異的なプロモーターを選択することができる。さらに、これらプロモーターをホモあるいはヘテロに組合せることにより、さらに高発現が期待でき、安定に新規コレクチンが得られるという効果が奏される場合がある。
一方、酵母において使用されるプロモーターとしては、ＧＡＬ１、ＡＯＸ１、ＣＵＰＩ、ＰＧＫ等がある。
上記ベクターに組み込み、目的とするベクターのみを回収するための選択マーカーとしては、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下ＤＨＦＲと略す）遺伝子（メトトレキサート耐性遺伝子）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８耐性遺伝子）等が挙げられ、例えば、ＤＨＦＲ遺伝子が欠損しているＣＨＯ細胞を用いて、ＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。また、メトトレキサートの濃度を上げて培養し、耐性細胞を選択することにより遺伝子を細胞内で発現させ、さらに高発現の細胞株を得ることもできる。
本発明は、この様に構築されたベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞、例えば、動物細胞、昆虫細胞および微生物細胞（大腸菌、枯草菌、酵母等）で、新規コレクチンを発現することができる宿主細胞も企図するものである。
本発明の宿主細胞たる動物細胞としては、ヒト由来の細胞が挙げられるが特に限定されるものでない。例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ミエローマ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウスＦＭ３Ａ細胞、マウス繊維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞等がある。また、微生物細胞としては、例えば大腸菌および枯草菌等の細菌類ならびにサッカロマイセス・セレビシエおよび麦酒酵母等の酵母類等が含まれる。
また本発明によって、上記ポリヌクレオチドまたはその断片を含む、新規コレクチン関連分子種をスクリーニングするためのプローブが提供される。新規コレクチン関連分子種とは、図１に示したような特徴的な構造を有し、図１０に示す既知コレクチンに包含されない新規コレクチンの分子種を言う。本発明のプローブを用いて、種々の生物の組織細胞等から得た遺伝子との間のハイブリッド形成能を調べ、比較的ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子を探索することによって目的とする新規コレクチン関連分子種をコードする遺伝子をスクリーニングし、これを発現することにより新規コレクチン関連分子種を取得することが可能となる。上記ポリペプチドの断片のうち、糖認識構造様領域を含む配列番号：１の第１２９１〜１６９８位の配列のうち少なくとも連続１０塩基以上、好ましくは連続２０塩基以上の塩基配列からなるもの、またはコラーゲン様領城を含む配列番号：１の第７９６〜１２３６位の配列のうち少なくとも連続１０塩基以上、好ましくは連続２０塩基以上の塩基配列からなるものが、特異性の点からプローブを構成するポリヌクレオチドとして有用である。
本発明はまた、本発明によって得られた新規コレクチン及び／または由来分子を認識する抗体を提供する。本明細書で言う由来分子とは、新規コレクチンと同様の特徴を有する断片（例えば、糖鎖認識部位及び／またはコラーゲン領域を含む断片）、新規コレクチンの前駆体及びそれらをコードする核酸配列及び／またはその相補的な核酸配列とストリジェントな条件下にてハイブリダイズすることができる核酸によってコードされるアミノ酸配列からなるポリペブチド等が含有される。
新規コレクチン及び／または由来分子に対する抗体（例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ペプチド抗体）または抗血清は、本発明の新規コレクチン及び／または由来分子あるいはそれらを含む融合タンパク質等を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。すなわち、本発明の新規コレクチン及び／もしくは由来分子またはそれらを含む融合タンパク質を抗原として、投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体または希釈剤、担体と共に温血動物に対して投与される。投与に際して抗体産生を高めるために、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与しても良い。投与は通常１〜６週毎に１回づつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ等が挙げられるが、マウス及びラットが好ましくは用いられる。ラットにはＷｉｓｔａｒ及びＳＤ系ラット等が好ましく、マウスにはＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６及びＩＣＲ系マウス等が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められる個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば後記の標識化新規コレクチンまたは新規コレクチンと抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）やその変法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ，３９，２８５，１９８０．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８，４３７，１９８１、Ｎａｔｕｒｅ，２８５，４４６，１９８０）に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルス等が挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。さらに融合効率を高めるために、適宜レクチン、ポリーＬ−リジンもしくはＤＭＳＯを添加することもできる。
骨髄腫細胞としては例えばＸ−６３Ａｇ８、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１細胞等が挙げられるが、好ましくはＳＰ２／０細胞が用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：２０〜２０：１であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）を１０〜８０％程度の濃度で添加し、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。新規コレクチン及び／または由来分子に対する抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、新規コレクチン抗原を直接または担体と共に吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した抗新規コレクチン抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素等で標識した新規コレクチンを加え、固相に結合した抗新規コレクチンモノクローナル抗体を検出する方法等が挙げられる。
新規コレクチン及び／または由来分子に対するモノクローナル抗体の選別及びクローニングは、自体公知またはそれに準じる方法に従って行うことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）を添加した動物細胞用選択培地で行われる。選別、クローニング及び育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地、またはハイブリドーマ培養用無血清培地等を用いることができる。培養温度は、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガスを含む空気の存在下で行われる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗新規コレクチン抗体価の測定と同様にして測定できる。すなわち、測定方法としてはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）法、ＦＩＡ（蛍光イムノアッセイ）法、プラーク測定法、凝集反応法等を用いることができるが、以下に示すようなＥＬＩＳＡ法が好ましい。
免疫抗原と同様の操作で調製したタンパク質をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルの表面に固定化する。次に、非特異的吸着を防止する目的で、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＭＳＡ（マウス血清アルブミン）、ＯＶＡ（オボアルブミン）、ゼラチンもしくはスキムミルク等を各ウェルに固定化する。この各ウェルにハイブリドーマ培養上清液を添加し、一定時間放置し免疫反応を行わせる。ＰＢＳ（リン酸緩衝性生理食塩水）等を洗浄液として各ウェルを洗浄する。この洗浄液中には界面活性剤を添加することが好ましい。酵素標識二次抗体を添加し一定時間放置する。標識酵素としては、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等を用いることができる。同じ洗浄液で各ウェルを洗浄後、使用した標識酵素の基質溶液を添加し酵素反応を行わせる。添加したハイブリドーマ培養上清液中に目的とする抗体が存在する場合は酵素反応が進行し基質溶液の色が変化する。
クローニングは、通常半固体アガー法や限界希釈法等のそれ自体公知の方法で行うことができ、具体的には前記の方法で目的とする抗体を産生するウェルを確認した後、クローニングを行いシングルクローンを得る。クローニング法としては、培養プレート１ウェル当たりに１個のコロニーが形成するようにハイブリドーマ細胞を希釈して培養する限界希釈法等を用いると良い。限界希釈法によるクローニングには、コロニー形成能を高めるために支持細胞を用いるか、インターロイキン６などの細胞増殖因子を添加しても良い。その他、ＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取器）及びシングルセルマニプレーション法を用いてクローニングすることができる。クローン化されたハイブリドーマを、好ましくは無血清培地中で培養し、至適量の抗体をその上清に加える。この様にして得られた単一のハイブリドーマは、フラスコや細胞培養装置を用いて大量培養を行うか、動物の腹腔内で培養する（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｍｅｔｈ．，５３，３１３，１９８２）ことにより、モノクローナル抗体を得ることができる。フラスコ内で培養を行う場合は、０〜２０％のＦＣＳ（胎児ウシ血清）を含む細胞培養用培地（ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０及びＭＥＭ等）を用いて行うことができる。動物の腹腔内で培養する場合は、細胞融合に使用した骨髄腫細胞の由来となった動物と同種、同系統の動物または胸腺欠損ヌードマウス等を使用することが好ましく、予めプリスタン等の鉱物油を投与してからハイブリドーマを移植する。１〜２週間後腹腔内に骨髄腫細胞が増殖し、モノクローナル抗体を含む腹水を得ることができる。
本発明によるモノクローナル抗体は、新規コレクチン及び／または由来分子に特異的なエピトープを認識するものを選択することによって、他のタンパク質と交差しないものとすることができる。一般的にそのタンパク質を構成するアミノ酸配列の中から、連続する少なくとも３以上のアミノ酸残基、望ましくは７〜２０アミノ酸のアミノ酸配列によって提示されるエピトープは、そのタンパク質に固有のエピトープを示すと言われている。従って、新規コレクチン及び／または由来分子のいずれかに記載されたアミノ酸から選択され、かつ連続する少なくとも３アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を持つペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体は、本発明における新規コレクチン及び／または由来分子特異的なモノクローナル抗体といえる。新規コレクチン及び／または由来分子に記載されたアミノ酸配列の間で保存されたアミノ酸配列を選べば、新規コレクチンファミリーに共通のエピトープを選択することができる。あるいは各配列に特異的なアミノ酸配列を含む領域であれば、それぞれのタンパク質の識別が可能なモノクローナル抗体を選択することができる。
新規コレクチン及び／または由来分子に対するモノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。公知の精製法としては、例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、硫安沈殿法、イオン交換体（例えばＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）セファロース等）による吸脱着法、超遠心法、ゲル濾過法、抗原結合固相またはプロテインＡもしくはプロテインＧ等の活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法のような手法を施すことができる。精製過程において凝集物の形成や抗体価の低下を防止する目的で、例えばヒト血清アルブミンを０．０５〜２％の濃度で添加する。その他、グリシン、α−アラニン等のアミノ酸類、特にリジン、アルギニン及びヒスチジン等の塩基性アミノ酸、グルコースやマンニトール等の糖類または塩化ナトリウム等の塩類を添加しても良い。ＩｇＭ抗体の場合、特に凝集しやすいことが知られているため、β−プロピオニラクトン及び無水酢酸で処理しても良い。
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体を作り、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質またはその断片に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類及びキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免役したハプテンに対して抗体が効率よくできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させても良いが、例えばウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５０割合でカップリングさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカップリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオピリジル基を含有する活性エステル試薬などが用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバンドを投与しても良い。投与は、通常２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行われる。ポリクローナル抗体は上記の方法で免役された温血動物の血液、腹水等、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
また、新規コレクチン及び／または由来分子とその他のタンパク質またはポリペプチド断片とを含む融合タンパク質を免疫原として用いることによって抗体を調製することができる。係る融合タンパク質を構成する、その他のタンパク質またはポリペプチド断片として、特にＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）が好適であるが、他にも、ポリヒスチジン（好ましくは６個のヒスチジン）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、プロテインＡ等を用いてもよい。
尚、ポリヒスチジンを用いた場合、遺伝子組換え法にて発現させた融合タンパク質を単離精製するためには、ニッケルキレーティング樹脂への吸着を利用することができ、ｐＨ変動の他、ＥＤＴＡまたはイミダゾール物質を添加することによって当該樹脂から解離することができる。ＣＢＰを用いた場合、発現させた融合タンパク質はカルモジュリンアフィニティー樹脂を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行い、その後ＥＧＴＡを加えることにより当該樹脂から解離することができる。また、プロテインＡを用いた場合、発現させた融合タンパク質はＩｇＧセファロース（例えば、ＩｇＧセファロース６ＦＦ）カラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーを行い、その後ｐＨ変動によって当該樹脂から解離することができる。
さらに前記融合タンパク質を構成するタンパク質またはポリペプチド断片の別の例として、Ｘｐｒｅｓｓ、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ、ｃ−ｍｙｃ、Ｖ５及びＨＡ／ｃ−ｍｙｃ等を挙げることができ、これらをエピトープとして認識することができる抗体を用いて、目的とする新規コレクチンとの融合タンパク質を発現した後に抗原−抗体アフィニティーカラムにより単離・精製することができる。
このような融合タンパク質を免疫原として用いてモノクローナル抗体を取得する場合、抗体のスクリーニングには新規コレクチンを用いてもよいが、免疫原として用いた融合タンパク質でスクリーニングを実施することが選択性の点で好ましい。
好ましい免疫原であるＧＳＴと新規コレクチン及び／または由来分子を含む融合タンパク質は、ＧＳＴ遺伝子のコード領域ならびに新規コレクチン及び／または由来分子のコード領域を含む発現ベクターを形質転換またはトランスフェクトした大腸菌または動物細胞を培養し、その培養液及び／または菌体から融合タンパク質を単離することによって好適に製造することができる。さらにこうして得られた融合タンパク質は、グルタチオンを有する担体、例えば、グルタチオンセファロースビーズへのアフィニティーによって精製されたものであるとよく、当該グルタチオンセファロースビーズからの融合タンパク質の溶出方法は公知の方法によって行うことができる。こうして、目的の免疫原として好ましい精製された融合タンパク質を、得ることができる。
このような融合タンパク質を免疫原として用いてモノクローナル抗体を調製する方法において、抗体のスクリーニングには新規コレクチン及び／または由来分子を用いてもよいが、免疫原として用いた融合タンパク質でスクリーニングを実施することが選択性の点で好ましい。
新規コレクチン及び／または由来分子に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は、新規コレクチンに関連する疾病の診断や治療に利用することが可能である。なお、抗体を特にヒトに投与することが意図される場合、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体等のヒトに対して免疫原性を有さないあるいは極力抑えた抗体を用いるのが好ましい。マウスモノクローナル抗体をヒトの体内に投与すると、ヒトにとっては異種タンパクであるので種々の副作用が起こる危険性がある。そこで、ヒトモノクローナル抗体が望ましいが、融合効率が悪くまた抗体産生が安定なハイブリドーマを得ることは難しかった。しかし、現在技術は進歩しヒトモノクローナル抗体またはキメラ抗体を作製することが可能となっている。
キメラ抗体とはマウス抗体とヒト抗体のキメラ分子をいう。ヒトに任意の抗原を免疫して抗体を製造することは倫理上不可能である。ゆえに、マウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（Ｖ領域）を切り出し、ヒト骨髄腫由来の抗体定常部（Ｃ領域）遺伝子と結合してキメラ遺伝子を作製する。このキメラ遺伝子を宿主細胞で発現させれば、ヒト・マウス・モノクローナル抗体が産生できる。キメラ抗体はヒトに対する抗原性が少ないため、ヒト体内に投与する治療用や画像診断用モノクローナル抗体等として利用できる。公知のキメラ抗体の関連技術として、特開平０５−３０４９８９号、特開平０４−３３０２９５号、ＷＯ９１０６６４９、特開昭６３−０３６７８６号、特公平０６−９８０２１号に記載の発明等がある。
しかし、最近キメラ抗体よりも有用であるといわれるヒト化抗体が開発された。ヒト化抗体とは抗体分子の抗原結合部位（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、相補性決定領域）の遺伝子配列のみをヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）し、抗体分子のＣＤＲを除いた全分子をヒト化した抗体である。本抗体はヒト・マウス・キメラ抗体より、マウスの抗体部分が少ないため、抗原性が少なく安全性が高いと言われている。我が国では現在、成人性Ｔ細胞白血病に対するヒト化抗体の臨床試験が行われている。ヒト化抗体の製造方法及びその関連技術については、米国Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社（ＷＯ９２２２６５３、ＷＯ９８４５３３２、ＷＯ９４０４６７９、ＷＯ９８３７２００、ＷＯ９４０４６７９）及び英国Ｃｅｌｌｔｅｃｈ社（ＷＯ９４２９４５１、ＷＯ９４２９３５１、ＷＯ９４１３８０５、ＷＯ９３０６２３１、ＷＯ９２０１０５９、ＷＯ９１１６９２７、ＷＯ９１１６９２８、ＷＯ９１０９９６７、ＷＯ８９０１９７４、ＷＯ８９０１７８３）等の特許出願がある。
ヒトモノクローナル抗体の作製方法には細胞融合法以外にも、エプスタイン・バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウィルス（ＥＢＶ）で形質転換する方法、さらにはその形質転換した細胞を親細胞と融合させる方法、遺伝子工学を利用しキメラ抗体、ヒト化抗体を作製する方法などがある。キメラ抗体とは異種の動物の免疫グロブリン遺伝子断片をつなげて作製された抗体であり、ヒト化抗体とはマウスなどにヒトにとって異種の抗体を改変して、Ｈ鎖とＬ鎖の相補性決定部（ＣＤＲ）以外の一次構造をヒトの抗体の対応する一次構造に置換した抗体をいう。ヒトモノクローナル抗体作製用の親細胞は、ヒト／マウスのヘテロミエローマであるＳＨＭ−Ｄ ３３株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６８）またはＲＦ−Ｓ１株を用いるとマウスの親細胞と同等の高い融合効率が得られる。これらの親細胞を用いて得られたハイブリドーマはフィーダー細胞なしでクローニングが可能であり、ＩｇＧタイプの抗体を比較的安定にしかも大量に産生することができる。親細胞の培養には、１５％ＦＣＳを加えたＥＲＤＦ培地を用い、その他の操作はマウスの場合と同様である。また、ＩｇＧタイプのヒトモノクローナル抗体を作製するには抗原で充分に感作されたヒトリンパ球を末梢血から採取して用いるのが好ましい。
充分に抗原で感作されたリンパ球の取得が困難な場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原感作を行うこともできる。上記示した方法等を用いることにより、本発明の抗体をヒト化することができ、ヒトに投与する場合には非常に有用である。
さらに本発明によって提供されるのは、新規コレクチン関連分子種または新規コレクチン及び／もしくは由来分子を取得するための方法であって、上記の抗体を使用してタンパク質のスクリーニングを行い、新規コレクチン関連分子種、または新規コレクチン及び／もしくは由来分子をスクリーニングを得る工程を含むことを特徴とする方法である。この方法では、種々の生物の体液、組織細胞等に含まれる新規コレクチン関連分子種、または新規コレクチン及び／もしくは由来分子を単離・取得すべく、上記の抗体を使用して免疫反応性を有するタンパク質をスクリーニングする。かかるスクリーニングにおいて、ｃＤＮＡライブラリーの発現スクリーニングが好適に利用される。
本発明のさらなる特徴において、新規コレクチン及び／または由来分子の定量方法であって、上記抗体を使用して、被検試料中に含まれる新規コレクチン及び／または由来分子の免疫学的な結合性に基づき、測定を行うことを特徴とする定量方法が提供される。
この方法において新規コレクチン及び／または由来分子の量を測定するために、前記抗体をイムノブロッティング、免疫沈降またはＥＬＩＳＡ等において使用するとよく、特にＥＬＩＳＡ法を行うことが至便であり好ましい。そして、例えば不溶性担体に結合させた抗体と標識化抗体とにより新規コレクチン及び／または由来分子を反応させて生成したサンドイッチ錯体を検出するサンドイッチ法、また、標識化新規コレクチン及び／または由来分子と検体中の新規コレクチン及び／または由来分子を抗体と競合的に反応させ、抗体と反応した標識抗原量から検体中の新規コレクチン及び／または由来分子を測定する競合法を利用して検体中の新規コレクチン及び／または由来分子を測定するとよい。
サンドイッチ法による新規コレクチン及び／または由来分子の測定においては、まず、試料中の固定化抗体と新規コレクチン及び／または由来分子とを反応させた後、未反応物を洗浄によって完全に除去し、標識化抗体を添加する２ステップ法もしくは固定化抗体、標識化抗体及び新規コレクチン及び／または由来分子を同時に混合する１ステップ法などを用いることができる。
測定に使用される不溶性担体は、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂等の合成樹脂、セルロース、アガロース等の多糖類、ガラス、金属等が挙げられる。不溶性担体の形状としては、例えばトレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等の種々の形状を用いることができる。抗体を吸着した担体は、適宜アジ化ナトリウム等の防腐剤の存在下、冷所に保存する。
抗体の固層化には、公知の化学的結合法または物理的吸着法を用いることができる。化学的結合法としては例えばグルタルアルデヒドを用いる方法、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート及びＮ−スクシンイミジル−２−マレイミドアセテートなどを用いるマレイミド法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸などを用いるカルボジイミド法が挙げられる。その他、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル法、Ｎ−スクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法、ビスジアゾ化ベンジジン法、ジパルミチルリジン法が挙げられる。あるいは、先に被検出物質とエピトープの異なる２種類の抗体を反応させて形成させた複合体を、抗体に対する第３の抗体を上記の方法で固層化させておいて捕捉することも可能である。
標識物質としては、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質及び金属キレート等を使用するのが好ましい。酵素としては、例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、α−グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等が挙げられ、蛍光物質としては、例えばフルオレセインインチアネート、フィコビリプロテイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オルトフタルアルデヒド等が挙げられ、発光物質としてはイソルミノール、ルシゲニン、ルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びその修飾エステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリン等が挙げられ、放射性物質としては^１２５Ｉ、^１２７Ｉ、^１３１Ｉ、^１４Ｃ、^３Ｈ、^３２Ｐ、^３５Ｓ等が挙げられるが、これらに限らず免疫学的測定法に使用することができるものであれば特に限定されない。さらに、抗体にビオチン、ジニトロフェニル、ピリドキサールまたはフルオレサミンの様な低分子ハプテンを結合させても良い。好ましくは西洋わさびペルオキシダーゼを標識化酵素として用いる。本酵素は多くの基質と反応することができ、過ヨウ素酸法によって容易に抗体に結合させることができる。
標識化剤が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤を用いる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質溶液としてＨ_２Ｏ_２を用い、発色剤として２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸、オルトフェニレンジアミン、４−アミノアンチピリン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン等を使用することができ、酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は基質としてオルトニトロフェニルフォスフェート、パラニトロフェニルリン酸等を使用することができ、酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は基質としてフルオレセイン−ジ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、４−メチルウンベリフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等を使用することができる。
架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’−オルトフェニレンジマレイミド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、６−マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、４，４’−ジチオピリジン、その他公知の架橋剤が利用可能である。これらの架橋剤と酵素及び抗体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に応じて既知の方法に従って行えばよい。また、抗体としては、場合によっては、そのフラグメント、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２を用いる。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体にかかわらず同様の処理により酵素標識体を得ることができる。上記架橋剤を用いて得られる酵素標識体をアフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法にて精製すれば、更に感度の高い免疫測定系が可能となる。精製した酵素標識化抗体は、安定剤としてチメロサールもしくはグリセリン等を加えて、あるいは凍結乾燥して冷暗所に保存する。
上記定量方法における測定対象試料は、血漿、血清、血液、尿、組織液、脳脊髄液等の体液等、新規コレクチン及び／または由来分子を含む試料あるいはその前駆体を含む試料であれば限定されない。
さらに本発明は、新規コレクチン及び／または由来分子を定量するためのキットであって、上記抗体を含み、この抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によって被検試料中に含まれる新規コレクチン及び／または由来分子の量が測定されることを特徴とするキットを提供する。このキットには抗体のほか、上記のような定量に必要な試薬類が含まれる。
本発明はまた、新規コレクチン及び／または由来分子を生産するための方法であって、上記抗体を用いて新規コレクチン及び／または由来分子を単離する工程を含む方法を提供する。かかる方法において新規コレクチン及び／または由来分子を単離するために、前記抗体を結合させた担体に試料を接触させて抗原−抗体間の特異的な相互作用を許容し、次いで担体を洗浄した後、結合された目的タンパク質を溶出する工程を含む、カラム法、バッチ法等によるアフィニティークロマトグラフィー及び／または免疫沈降が実施されるとよい。
この方法における試料は、例えば、ヒト由来の胎盤、脾臓等より調製して得られたものでも、また、前記した本発明の新規コレクチンをコードするポリヌクレオチドから発現させることによって調製したものでもよいが、安定に試料を供給可能であるので、発現産物が好適に用いられ、かかる発現工程を含む方法が本発明において企図される。
また、本発明でさらに企図されるのは、新規コレクチン及び／または由来分子の組織内における存在を確認するための方法であり、この方法において、如上の抗体を用いて免疫組織学的検査が行われる。免疫組織学的検査とは、例えば、標識抗体を用いたｉｎ ｓｉｔｕ免疫組織染色などの技術が採用され、新規コレクチン及び／または由来分子を検出するものである。
さらには、本発明により、上記本発明のポリヌクレオチドを含む組換え遺伝子が安定して染色体に導入され、且つ新規コレクチンを発現することができることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物が提供される。さらに提供されるのは、本発明の新規コレクチンの相同体を含む非ヒト動物において、該相同体をコードする遺伝子の発現を修飾するように（例えば、発現を阻止、促進、あるいは所定条件のみで発現するように）遺伝子導入がなされたことを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物である。この非ヒト動物において遺伝子の発現を正常に調節しているいくつかの重要な部位（エンハンサー、プロモーター、イントロン等）の一部に欠失、置換、付加及び／または挿入などの変異を起こさせることにより、本来の遺伝子の発現レベルと比較して上昇または下降するように人工的に修飾することができる。この変異の導入は、公知の方法により行うことができる（例えば、Ｌｅｓｌｅｙ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ Ｍａｇａｚｉｎｅ，４６，６−１０，１９９４；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ，，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７−３８２，１９８７；Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３，５９２−５９６，１９９２；Ｉｔｏ Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０２，６７−７０，１９９１；Ｃｏｒｍａｃｋ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｙ，８．５．１−８．５．９，１９８７）。ここで遺伝子としては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡあるいは合成ＤＮＡを含む。また、遺伝子の発現には転写と翻訳のいずれのステップも含まれる。
これら本発明によるトランスジェニック非ヒト動物は、新規コレクチン及び／または由来分子の機能あるいは発現調節の研究、新規コレクチン及び／または由来分子が関与すると予想される疾患のメカニズム解明、医薬品のスクリーニング・安全性試験に用いる疾患モデル動物の開発に有用である。
トランスジェニック動物とは狭義には遺伝子組換えにより、外来遺伝子が生殖細胞に人為的に導入された動物のことをいい、広義にはアンチセンスＲＮＡを用いて特定の遺伝子の機能を抑えたアンチセンス・トランスジェニック動物や、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いて特定の遺伝子をノックアウトした動物、点突然変異ＤＮＡを導入した動物を含み、個体発生の初期に外来遺伝子が安定して染色体に導入され、その子孫に遺伝形質として伝達され得る動物のことをいう。
本明細書中でいうトランスジェニック動物とはヒト以外のすべての脊椎動物を含む広義の意味に解する。本発明におけるトランスジェニック動物は、新規コレクチン及び／または由来分子の機能あるいは発現調節の研究、ヒトにおいて発現している細胞に関連する疾患のメカニズムの解明、医薬品のスクリーニング・安全性試験に用いる疾患モデル動物の開発に有用である。
トランスジェニック動物の作製方法は、位相差顕微鏡下で前核期卵子の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）、胚性幹細胞を使用する方法などがある。その他、レトロウィルスベクターまたはアデノウイルスベクターに遺伝子を挿入し、卵子に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵子に導入する精子ベクター法等が開発されている。
精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（Ｍ，Ｌａｖｉｔｒ−ａｎｏｅｔら、Ｃｅｌｌ，５７，７１７，１９８９）。あるいはバクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系やサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦＬＰリコンビナーゼ系等によるｉｎ ｖｉｖｏにおける部位特異的遺伝子組換えを用いることもできる。また、レトロウィルスを使用して、非ヒト動物へ目的タンパク質のトランスジーンを導入する方法も報告されている。
マイクロインジェクション法によるトランスジェニック動物作製方法は、例えば、以下に示すようにして行われる。
まず、発現制御に関わるプロモニター、新規コレクチンをコードする塩基配列、ポリＡシグナルから基本的に構成されるトランスジーンが必要である。プロモーター活性により特定分子の発現様式や発現量が左右され、また、導入トランスジーンのコピー数や染色体上の導入部位により作製されたトランスジェニック動物が系統間で異なるため、各系統間で発現様式・発現量を確認する。非翻訳領域やスプライシングにより発現量が変化することが判明しているため、予めポリＡシグナルの前にスプライシングされるイントロン配列を導入してもよい。受精卵に導入する遺伝子はできるだけ純度の高いものを使用することが重要である。使用する動物としては、受精卵採取用マウス（５〜６週齢）、交配用雄マウス、偽妊娠雌マウス、輸精管結紮雄マウス等が用いられる。
効率よく受精卵を得るために、ゴナドトロピン等により排卵を誘発してもよい。受精卵を回収し、マイクロインジェクション法にて卵子の雄性前核にインジェクションピペット中の遺伝子を注入する。注入した卵子を輸卵管に戻すための動物（偽妊娠雌マウス等）を用意し、一匹に対して約１０〜１５個を移植する。その後、誕生したマウスにトランスジーンが導入されているか否かを、尾の先端部からゲノムＤＮＡを抽出し、サザン法あるいはＰＣＲ法によりトランスジーンを検出するか、あるいは相同組み換えが起こったときのみに活性化するマーカー遺伝子を挿入したポジティブクローニング法により確認することができる。さらに、トランスジーンの発現を確認するため、ノザン法もしくはＲＴ−ＰＣＲ法によりトランスジーン由来転写産物を検出する。または、タンパク質またはその断片に対する特異的抗体によって、ウェスタンブロッティングを行ってもよい。
さらに本発明によって、上記本発明の新規コレクチンの相同体を含む非ヒト動物において、該相同体の発現を阻止するように該相同体をコードする遺伝子が改変されて得られることを特徴とするノックアウト非ヒト動物を提供する。
本発明のノックアウトマウスは、新規コレクチン及び／または由来分子遺伝子の機能が失われるように処理されたものである。ノックアウトマウスとは相同組換え技術により任意の遺伝子を破壊し、機能を欠損させたトランスジェニックマウスをいう。ＥＳ細胞を用いて相同組換えを行い、一方の対立遺伝子を改変・破壊した胚性幹細胞を選別し、ノックアウトマウスを作製することができる。例えば、受精卵の胚盤胞や桑実胚期に遺伝子を操作した胚性幹細胞を注入して、胚性幹細胞由来の細胞と胚由来の細胞が混ざったキメラマウスを得る。このキメラマウス（キメラとは、２個以上の受精卵に基づいた体細胞で形成される単一個体をいう）と正常マウスを交配すると、一方の対立遺伝子の全てが改変・破壊されたヘテロ接合体マウスを作製することができる。さらに、ヘテロ接合体マウス同士を交配することで、ホモ接合体マウスが作製できる。
相同組換えとは、遺伝子組換え機構で塩基配列が同じ、または非常に類似している２つの遺伝子間で起こる組換えのことをいう。相同組換えを起こした細胞の選別にはＰＣＲを使用することができる。挿入遺伝子の一部と挿入が期待される領域の一部をプライマーとして用いるＰＣＲ反応を行い、増幅産物ができた細胞で相同組換えを起こしていることが判明できる。また、胚幹細胞で発現している遺伝子に相同組み換えを起こさせる場合には、導入遺伝子にネオマイシン耐性遺伝子を結合させておき、導入後に細胞をネオマイシン耐性にさせることにより選択することができる等、公知の方法及びそれらの変法を用いて容易に選択することができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻、１２８８〜１２９２頁（１９８９）等を参照されたい）
以下に、本発明の新規コレクチンに関して、実施例に沿って詳細に説明するが、これら実施例の開示によって、本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。
すなわち、ＥＳＴデータベースの検索（実施例１）、スクリーニング用プローブの作製（実施例２）、ヒト胎盤由来ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング（実施例３）、新規コレクチンの塩基配列の決定（実施例４）、新規コレクチンのゲノミックサザン分析（実施例５）、新規コレクチンのヒトの種々の組織に対するノーザン分析（実施例６）、新規コレクチンの種々の動物種の組織についてのゲノミックサザン分析（実施例７）ならびに新規コレクチンの遺伝学的解析（実施例８）、新規コレクチンに対するモノクローナル抗体の調製（実施例９）、抗マウス抗ヒト新規コレクチン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（実施例１０）、ヒトに対する免疫原性を低下させた抗体の調製（実施例１１）、新規コレクチンの発現ベクターｐＮＯＷ１−ｈＣＬ−Ｐ１の構築（実施例１２）、新規コレクチンを発現するクローンの選択（実施例１３）、トランスジェニックマウスの作製（実施例１４）及びノックアウトマウスの作製（実施例１５）について以下に説明する。
実施例１：ＥＳＴデータベースの検索
既知のコレクチンすなわち、ヒトＭＢＰ、ヒトＳＰ−Ａ及びヒトＳＰ−Ｄのアミノ酸配列（図２及び３参照、図中、相同と認められるアミノ酸残基部分に囲みを付した）を比較することにより、分子間に保存性の高い領域の検索を行った。この結果、ヒトＭＢＰのアミノ酸配列における第２２０番目から２４６番目までの２７アミノ酸（図３、白抜文字部分、配列番号：６）に保存性が高いことが明かとなったので、この領域に相当するコンセンサス配列をいくつか作成し、ＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｓ）データベースの検索を行った。ＥＳＴデータベースは、１９９６年１０月１１に、６７６７５０件の配列を含むものを使用した。
その結果、上記２７アミノ酸の配列と相同性の高いアミノ酸配列を含むデータがいくつか得られた。得られたデータのアミノ酸配列についてＧｅｎＢａｎｋ／ＥＳＴデータベースの検索を行い、既知または未知物質のいずれであるかを判定した結果、コンセンサス配列として、
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ（配列番号：３）で示されるアミノ酸配列を用いて検索したときに得られたデータの中に、相同性は高いが未知の塩基配列を含む２種のデータ（登録番号：Ｗ７２９７７及びＲ７４３８７）を得ることができた。これらは、それぞれ、胎盤由来及び胎児心臓由来であり、新規コレクチンの塩基配列の一部を示すクローンであった。
そこで、このうち、胎児心臓由来のクローン（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｃｌｏｎｅ ＩＤ ３４４７２）をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より購入して、以下の新規コレクチン取得のためのスクリーニング用プローブ作製に利用した。
実施例２：スクリーニング用プローブの作製
上記クローンのインサートＤＮＡの塩基配列を、プライマー（ファルマシア社製、Ｍ１３ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：７、５’−フルオレセイン−ｃｇａｃｇｔｔｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔ−３’）及びＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：８、５’−フルオレセイン−ｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃ−３’））で決定した。
この塩基配列から読取枠をコレクチンのアミノ酸配列に合わせて、そこから読み取ることができるアミノ酸配列に相当する塩基配列を抽出し、この一部分に相当するジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルｃＤＮＡプローブ用プライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー、ｃａａｔｃｔｇａｔｇａｇａａｇｇｔｇａｔｇ（配列番号：４）及びＦｏｒｗａｒｄプライマー、ａｃｇａｇｇｇｇｃｔｇｇａｔｇｇｇａｃａｔ（配列番号：５）を、アプライドバイオシステムズ社製３９２Ａ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて作製した。ＤＩＧラベルは、ＰＣＲ ＤＩＧプローブ合成キット（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。反応組成は以下のとおりである（プラスミドＤＮＡ（クローンＷ７２９７７、５０ｎｇ／μｌ） ：２μｌ（１００ｎｇ）、１０ｘ緩衝液：５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２：５μｌ、ｄＮＴＰ（ＰＣＲラベリングミックス）：５μｌ、２０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：２．５μｌ、２０μＭＦｏｒｗａｒｄプライマー：５μｌ、Ｈ_２Ｏ：２８μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ：０．５μｌ）。ＰＣＲ反応は、アトー社製ザイモリアクターを用いて、９２℃１分、５５℃１分、７２℃２分のサイクルを３５回行った．。
実施例３：ヒト胎盤由来ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
先ず、以下のようにヒト胎盤由来ファージｃＤＮＡライブラリーのタイトレーションを行った。ｍＬＢ培地（１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４及び０．２％マルトースを含むＬＢ培地（１ｇトリプトン、０．５ｇイーストエキストラクト、０．５ｇＮａＣｌ／１００ｍｌ）で３７℃にて１６時間培養したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０９０ｒ⁻０．２ｍｌと、ＳＭ緩衝液（５．８ｇＮａＣｌ、２ｇＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２５ｍｌ、５ｍｌ ２％ゼラチン／Ｌ）で段階希釈したｃＤＮＡライブラリー０．１ｍｌを３７℃１５分インキュベートし、その後２．５ｍｌのＬＢ−ＴＯＰアガロース（０．７５％アガロース／ＬＢ培地）に加え均一とし、９０ｍｍφＬＢ培地プレート（岩城硝子社製）（１．５％アガー／ＬＢ培地）にまいた。１５分間室温で固化させ、４２℃にて５時間インキュベーションした。各プレートのプラークを計数後、ファージのタイターを計算により求めた。その結果、タイターは２．１ｘ１０^１０ｐｆｕ／ｍｌであった。このようにタイトレーションを行ったｃＤＮＡライブラリーにつき、実施例２で作製したプローブを用いて以下の通りにスクリーニングを行った。
ｍＬＢ培地で３７℃にて１６時間培養したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０９０ｒ⁻０．６ｍｌとＳＭ緩衝液で希釈したｃＤＮＡライブラリー１ｘ１０^５ｐｆｕを、３７℃にて１５分間インキュベートし、その後７．５ｍｌ ＬＢ−ＴＯＰ アガロース（０．７５％アガロース）に加えて均一とした。これを１４０ｍｍ^２のＬＢ培地角プレート（日水製薬社製）にまいたものを１０枚作製し、１５分間室温で固化させ、４２℃にて５時間インキュベーションした。プラーク形成を確認後、次に、ナイロンメンブレンへの転写を行った。転写は、ナイトラン（Ｎｙｔｒａｎ）１３Ｎ（シュライヒャーアンドシュウェル社製（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｃｏ．））を用いて行った。１２．５０ｃｍｘ９．０ｃｍのフィルターを蒸留水に浸けて１０分間湿らせた後、ワットマン３ＭＭ紙上において余分な水分を除去し、プラークを形成したプレート上にフィルターを置いた。２分間放置した後、フィルターを剥がし、１０分間風乾させた。０．２Ｍ ＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣｌにより２分間ファージＤＮＡを変性させ、０．４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）／２ｘＳＳＣで２分間中和し、２ｘＳＳＣで２分間洗浄を行った。その後、ＧＳ ＧＥＮＥ ＬＩＮＫＥＲ（バイオラッド社製）で紫外線照射することによりファージＤＮＡをメンブレンに固定した。ハイブリダイゼーション及びシグナルの検出は以下の様に行った。フィルターを２ｘＳＳＣで湿らせ、余分な水分をワットマン３ＭＭ紙で除去し、ハイブリダイゼーションバックに移しハイブリダイゼーション溶液（５ｘＳＳＣ、１％ブロッキング剤、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％ＳＤＳ）と６８℃にて１時間プレハイブリダイゼーションを行った。続いて、バックからハイブリダイゼーション溶液を除き、そこへＤＩＧでラベルしたｃＤＮＡプローブを１０ｎｇ／ｍｌになるように調製したハイブリダイゼーション溶液を加え、５５℃にて１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、フィルターは室温にて２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で５分間、２回洗浄し、５５℃にて、０．５ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で１５分間２回洗浄した。次にＤＩＧ緩衝液Ｉ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５））で１分間、ＳＤＳを除去し、ＤＩＧ緩衝液ＩＩ（１％ブロッキング剤、ＤＩＧ緩衝液Ｉ）で３０分間、フィルターのブロッキングを行った。ＤＩＧ緩衝液Ｉで１分間洗浄し、次いでＤＩＧ緩衝液ＩＩで抗ＤＩＧアルカリフォスファターゼ標識抗体（ベーリンガー・マンハイム社製）を５０００倍希釈した溶液を加えて、３０分間抗体反応を室温で行った後、室温でＤＩＧ緩衝液Ｉで１５分間２回洗浄した。ＤＩＧ緩衝液ＩＩＩ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ９．５）、５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）で３分間処理することによりＭｇ^２＋の濃度を高め、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（和光純薬社製）をＤＩＧ緩衝液ＩＩＩに加えた溶液で発色させたところ、１０個の陽性クローンが得られた。これらのクローンに相当するプラークをプレートから切り出し、ＳＭ緩衝液１ｍｌを入れたチューブに加え、１０分間撹拌した後ＳＭ緩衝液で段階希釈し、この希釈液０．１ｍｌとｍＬＢ培地で３７℃１６時間培養したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０９０ｒ⁻０．２ｍｌを混ぜ、３７℃にて１５分間インキュベートした。その後、混合液を２．５ｍｌ ＬＢ−ＴＯＰアガロースに加えて均一とし、９０ｍｍφＬＢ培地プレートにまいたものを１０枚作製し、１５分間室温で固化させ、４２℃にて５時間インキュベーションし、いくつかのプラークを得、一次スクリーニングと同様にして二次スクリーニングを行った。
実施例４：新規ヒトコレクチンの塩基配列の決定
二次スクリーニングで得られた陽性クローンのうち適切と考えられるクローンのプラークをプレートから切り出し、蒸留水２００μｌを入れたチューブに加えて３０分間室温で撹拌した後、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を得た。
得られた上清を鋳型とし、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用い、ＰＣＲによりインサートＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲの反応組成は以下のとおりである（上清：２７μｌ、１０ｘＬＡ ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ｍｇ^２＋不含）：５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２：５μｌ、ｄＮＴＰミックス：８μｌ、２０μＭ λｇｔｌｌ Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号：９、５’−ｔｔｇａｃａｃｃａｇａｃｃａａｃｔｇｇｔａａｔｇ−３’）：２．５μｌ、２０μＭ λｇｔｌｌ Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号：１０、５’−ｇｇｔｇｇｃｇａｃｇａｃｔｃｃｔｇｇａｇｃｃｃｇ−３’）：２．５μｌ、ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ：０．５μｌ、Ｈ_２Ｏ：全容量５０μｌになるように添加）。ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社製ジーンＡｍｐ ＰＣＲシステム９６００を用いて、９８℃２０秒、６８℃５分のサイクルを３０回行った。ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル電気泳動にて確認後、ゲルからの切り出しにより精製した。精製には、ファルマシア社製Ｓｅｐｈａｇｌａｓ ＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔを用いた。
切り出したＤＮＡ断片は、インビトロジェン社製ＴＡクローニングキットのｐＣＲ２．１ベクターに組み込んだ。組換えたベクターは、インビトロジェン社製ＴＡクローニングキットに含まれるＴＯＰ１０Ｆ’細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）で培養し、アルカリＳＤＳ法により各クローンにつき３種類のプラスミドＤＮＡを抽出した。
得られたＤＮＡを適当と考えられる制限酵素で切断し、各ＤＮＡ断片をｐＵＣ１８ベクターに組込み、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ｃｅｌｌに形質転換した。形質転換体をＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）で培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。ＣＬ−Ｐ１−２−１からは、ＥｃｏＲ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメント、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−ＥｃｏＲ Ｉフラグメントを含むプラスミド、ＣＬ−Ｐ１−３−４からは、ＥｃｏＲ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉフラグメント、ＢａｍＨ Ｉ−Ｓｍａ Ｉフラグメント、Ｓｍａ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメント、Ｋｐｎ Ｉ−Ｓａｕ３Ａ Ｉフラグメント、Ｓａｕ３Ａ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉフラグメント、ＥｃｏＲ Ｉ−Ｋｐｎ Ｉフラグメント、ＥｃｏＲ Ｉ−Ｓｍａ Ｉフラグメントを含むプラスミド、ＣＬ−Ｐ１−３−７からは、Ｅ ｃｏＲ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉフラグメント、ＢａｍＨ Ｉ−Ｓｍａ Ｉフラグメント、Ｓｍａ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメント、Ｋｐｎ Ｉ−Ｓａｕ３Ａ Ｉフラグメント、Ｓａｕ３Ａ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉフラグメント、ＥｃｏＲ Ｉ−Ｋｐｎ Ｉフラグメント、Ｋｐｎ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉフラグメントを含むプラスミドを得た。プライマーはＡｕｔｏＲｅａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）添付のＭ１３Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：７）、Ｍ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：８）及びＦＩＴＣ（ファルマシア社製ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ）にてラベルした以下のプライマーをＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて作成し、ファルマシア社製オートリード・シークエンシング・キット及びＡ．Ｌ．Ｆ．オートシーケンサーで全領域の塩基配列を決定した。
ＨＰＰ １：５’−フルオレセイン−ｃｇｔｇａａａａｔｇａａｔｇｇａａｇｔｇｇ−３’（配列番号：１１）、
ＨＰＰ ２：５’−フルオレセイン−ｔｔｔｔａｔｃｃａｔｔｇｃｔｇｔｔｃｃｔｃ−３’（配列番号：１２）、
ＨＰＰ３：５’−フルオレセイン−ｃｔｇｇｃａｇｔｃｃｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇ−３’（配列番号：１３）、
ＨＰＰ ５：５’−フルオレセイン−ｇｃｔｇｇｔｃｃｃｃｃｃｇｇａｇａｇｃｇｔ−３’（配列番号：１４）
以上実施した塩基配列決定における概略は、図４に示す通りである。
図４（ａ）に、得られた新規コレクチンのＯＲＦが示され、この中のＧ−Ｘ−Ｙはコラーゲン様領域を表すものである。また、図４（ｂ）に、上記各プライマー名、シーケンサーにより読み取られた塩基配列（矢印により表される）ならびにＭ１３ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｕで表される）及びＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｒで表される）を示す。
さらにＣａｐ ｓｉｔｅ ｃＤＮＡを用いて、この配列の転写開始点を含む５’末端領域の塩基配列を決定した。
Ｃａｐ Ｓｉｔｅ ｃＤＮＡ，Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製）により、添付の１ＲＣ２ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ｃａａｇｇｔａｃｇｃｃａｃａｇｃｇｔａｔｇ−３’（配列番号：１５））及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製３９２Ａ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーにより合成したＴＧＰ１ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ｔｃｔｔｃａｇｔｔｔｃｃｃｔａａｔｃｃｃ−３’（配列番号：１６））を用いて第１回ＰＣＲを行った。反応混液は、総液量５０μｌにて、ＬＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｍｇ^２＋不含）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（以上宝酒造社製）を１μｌ：Ｃａｐ Ｓｉｔｅ ｃＤＮＡ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ，０．５μＭ １ＲＣ２ Ｐｒｉｍｅｒ（以上ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製）、ならびに０．５μＭ ＴＧＰ１ Ｐｒｉｍｅｒを含むものとした。ＰＣＲは、熱変性９５℃にて２０秒、アニーリング６０℃にて２０秒、伸長反応７２℃にて２０秒を３５サイクル、また繰り返し反応前に熱変性９５℃にて５分、最後に伸長反応７２℃にて１０分を含むプログラムで行った。第１回ＰＣＲ終了後、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。第１回ＰＣＲ産物１μｌを鋳型とし、プライマーは添付の２ＲＣ２ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ｇｔａｃｇｃｃａｃａｇｃｇｔａｔｇａｔｇｃ−３’（配列番号：１７））及び合成ＴＧＰ２ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ｃａｔｔｃｔｔｇａｃａａａｃｔｔｃａｔａｇ−３’（配列番号：１８））（ＴＧＰ１ Ｐｒｉｍｅｒと同様にして合成したもの）を用い、第１回ＰＣＲと同様の反応組成、プログラム（但し、サイクル数は２５サイクル）で行った。以上のＰＣＲ反応は宝酒造社製ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０により行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により確認後、バンドをゲルより切り出し、−８０℃，１０ｍｉｎ．凍結し、１５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ．遠心分離後、上清をエタノール沈澱することにより精製した。
精製したＤＮＡ断片は、Ｎｏｖａｇｅｎ社製ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｖｅｃｔｏｒに組み込み、このベクターをコンピテントセルＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）で培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製ＡｕｔｏＲｅａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ及びＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで塩基配列の決定を行った。プライマーはＡｕｔｏＲｅａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ添付のＭ１３ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：７）及びＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：８）を用いた。
この結果、実施例３で取得された新規コレクチンのｃＤＮＡクローンは、２０２４塩基を含み、１０２６塩基のＯＲＦ（転写解読枠）を有し（配列番号：１参照）、配列番号：２に示される３４２のアミノ酸をコードしていることが確認できた。
次いで、ＧｅｎＢａｎｋデータベースでＤＮＡ及びアミノ酸についての相同性の検索を行った結果、得られたアミノ酸配列は、従来見出されているコレクチンのいずれとも異なる新規タンパク質の配列であることが明らかとなった。
また、従来報告されている３種のコレクチンのアミノ酸配列と、本発明の新規コレクチンのアミノ酸配列を比較した。そのアラインメントを図５及び６に示す。図２及び３と同様に、相同性を有するアミノ酸残基部分に囲みを付した。このアラインメントにより、得られた新規タンパク質は既知コレクチンと相同性を有し、コレクチンファミリーに属していることが示される。
実施例５：新規コレクチンのゲノミックサザン分析
実施例４において明らかにされたｃＤＮＡ配列を有する新規コレクチンの遺伝子が、シングルコピー遺伝子であるかまたはマルチコピー遺伝子であるかを明らかにするために、ゲノミックサザン分析を行った。
ヒト血液由来のヒトゲノムＤＮＡ（プロメガ社製）の４μｇ相当量を、制限酵素の（１）ＥｃｏＲ Ｉ、（２）Ｘｂａ Ｉ、（３）Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、（４）Ｐｓｔ Ｉ、（５）Ｂｇｌ ＩＩまたは（６）ＢａｍＨ Ｉで消化し、０．８％アガロースゲルにて、１００ｍＡで３時間電気泳動した。泳動終了後、ナイロンメンブレン（ナイトラン１３Ｎ）に転写して、分析用のメンブレンを作製した。転写は、先ず、電気泳動後のゲルを１００ｍｌの０．２５Ｎ ＨＣｌに１０分間浸し、蒸留水で３回洗浄した後、１００ｍｌの変性液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨ）に１５分間２回浸し、１００ｍｌの中和液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ６．８））に３０分間浸すことによって脱プリン化、変性及び中和の処理を施し、次いでバキュームブロッティングシステム（東洋紡エンジニアリング社製、ＶＢ−３０）を用いて転写した。この際、メンブレンは、２ｘＳＳＣに５分間、次に２０ｘＳＳＣに５分間浸漬して前処理したものを用い、パッドは、２０ｘＳＳＣをしみこませておいたものを用いた。転写終了後、ＵＶ照射により固定処理を施した。
サザン分析のためのハイブリダイゼーション用プローブとしては、実施例４で得られた新規コレクチンのｃＤＮＡ配列のＯＲＦの一部分を、プライマー：
５’−ｇａａｇａｃａａｇｔｃｔｔｃａａｃｔｃｔｔｇ−３’（配列番号：１９）及び
５’−ｃｔｃｔｇａｇｔｃｔｇｔｇａｇｇｃｃｇａｔｃ−３’（配列番号：２０）と、前記のＰＣＲ ＤＩＧプローブ合成キットを用いてＤＩＧラベルしたＤＮＡプローブ：
ｇａａｇａｃａａｇｔ ｃｔｔｃａｃａｔｃｔ ｔｇｔｔｔｔｃａｔａ ａａｃａｃｔａｇａｇ ａｇｇａａｃａｇｃａ ａｔｇｇａｔａａａａ ａａａｃａｇａｔｇｇ ｔａｇｇｇａｇａｇａ ｇａｇｃｃａｃｔｇｇ ａｔｃｇｇｃｃｔｃａ ｃａｇａｃｔｃａｇａ ｇ（配列番号：２１）を用いた。ハイブリダイゼーションの前に、プローブは１０分間煮沸し、５分間ドライアイス／エタノールで急速凍結処理しておいた。
先ず、転写後のメンブレンを２ｘＳＳＣに５分間浸し、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クローンテック社製）１０ｍｌ中で６５℃にて３０分間プレハイブリダイゼーションを行った。次いで、前記凍結処理後のプローブをＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで１０ｎｇ／ｍｌとなるように希釈し、この溶液２ｍｌを用いて、６５℃にて１時間ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄は、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液２０ｍｌで室温にて５分間ずつ２回振盪し、続いて０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液２０ｍｌで６５℃にて１５分間ずつ２回振盪しながら行った。ＳＤＳを除去するために、ＤＩＧ緩衝液Ｉ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５））５０ｍｌで室温にて１分間２回洗浄し、次にＤＩＧ緩衝液ＩＩ’（１．５％ブロッキング剤、ＤＩＧ緩衝液Ｉ）５０ｍｌで室温にて１時間ブロッキングを行った。次いで、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤＩＧ緩衝液Ｉで５０００倍に希釈しておいた抗ＤＩＧアルカリホスファターゼ標識抗体１０ｍｌで３０分間処理し、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤＩＧ緩衝液Ｉを５０ｍｌ用い室温にて２０分間、振盪しながら洗浄を２回行った。１０ｍｌのＤＩＧ緩衝液ＩＩＩに室温にて３分間２回浸した後、メンブレンをハイブリバックに移し、ＤＩＧ緩衝液ＩＩＩで１００倍に希釈しておいたＣＳＰＤ（登録商標、ベーリンガー・マンハイム社製、化学発光基質）を全体にゆきわたるように延ばし、インスタントフィルムＴ６１２（ポラロイド社製）上で感光させた。
この結果、図７の各レーンに示されるように、各制限酵素で処理したゲノムＤＮＡより、それぞれ１〜２個のシグナルしか検出されないので、得られた新規コレクチン遺伝子がシングルコピー遺伝子であることが推測された。
実施例６：新規コレクチンのヒトの組織における発現分布解析
本発明の新規コレクチンのｍＲＮＡの種々の組織における発現を調べるため、ＲＴ−ＰＣＲにより解析を行った。
種々の組織由来のＲＮＡ（（１）脳、（２）心臓、（３）腎臓、（４）脾臓、（５）肝臓、（６）小腸、（７）筋組織、（８）精巣、（９）胎盤、または（１０）大腸（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製））を鋳型とし、ＲＮＡ ＬＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．１．１（宝酒造社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。まず以下の反応組成で逆転写反応を行った。５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｘ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、１ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、１Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅインヒビター、０．２５Ｕ／μｌ逆転写酵素、０．１２５μＭ Ｏｌｉｇｏ ｄＴ−Ａｄａｐｔｏｒ Ｐｒｉｍｅｒ、ＲＮＡ ｌμｇを含み、全量２０μｌになるようにＲＮａｓｅ不含の蒸留水で調節した。同時に逆転写酵素を含まない反応組成も調製して、ネガティブコントロールとした。上記反応液を０．２ｍｌチューブに入れ、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造社製）で４２℃で３０分間、９９℃で５分間、５℃で５分間の１サイクルでＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を用いて、続いて以下の反応組成でＬＡ ＰＣＲを行った。２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｘ ＬＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｍｇ^２＋不含）、２Ｕ ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ，得られた新規コレクチンのｃＤＮＡ配列のネック領域から糖認識構造様領域を増幅できるようなプライマー２種類（ＲＴ−ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｕ：５’−ｇｔｇｃｃｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｃａｇａａｔｇ−３’（配列番号：２２）、ＲＴ−ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｒ：５’−ｇｃａｔａｔｃａｃｃｃｔｇｇｇｇａａｃａｔｔｔｔａｇ−３’（配列番号：２３）を０．２μＭ加え、全量８０μｌになるように滅菌蒸留水で調節した。ＰＣＲは、９４℃で２分間を１サイクル、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分３０秒間を５０サイクル行った。反応生成物を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド溶液（０．１μｇ／ｍｌ）で染色を行い、トランスイルミネーターで泳動パターンを確認し、発現組織を同定した。
また各組織での発現量を比較するために、各組織でβ−アクチン遺伝子の一部分を増幅させるＲＴ−ＰＣＲを行い、ＲＮＡの補正を行った。方法は上記同様、逆転写反応、ＰＣＲ反応を行い、上記と同様に１％アガロースゲル電気泳動を用いて判定を行った。逆転写反応の組成は、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｘ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ，１ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ，１Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅインヒビター、０．２５Ｕ／μｌ逆転写酵素、２．５μＭランダム９ ｍｅｒ、ＲＮＡ １０ｎｇを含み、全量６０μｌになるようにＲＮａｓｅ不含の蒸留水で調節した。ＰＣＲは３０℃で１０分間、４２℃で１５分間、９９℃で５分間、５℃で５分間の１サイクルを行った。得られたＰＣＲ産物を用いて、続いて以下の反応組成でＰＣＲ反応を行った。２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｘ ＬＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｍｇ^２＋不含）、２Ｕ ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ，０．２５μＭ ヒトβ−アクチン・センスプライマー５’−ｃａａｇａｇａｔｇｇｃｃａｃｇｇｃｔｇｃｔ−３’（配列番号：２４）、０．２５μＭヒトβ−アクチン・アンチセンスプライマー５’−ｔｃｃｔｔｃｔｇｃａｔｃｃｔｇｔｃｇｇｃａ−３’（配列番号：２５））を加え、全量４０μｌになるように滅菌蒸留水で調節した。ＰＣＲは９４℃で１５秒間、６８℃で３０秒間を３０サイクル行った。
この結果を図８に示すが、本発明の新規コレクチンのｍＲＮＡが、胎盤（レーン９）、脾臓（レーン４）、腎臓（レーン３）で発現していることが明らかとなった。特に胎盤での発現が高いことが明らかである。
実施例７：新規コレクチンの種々の動物についてのゲノミックサザン分析
本発明の新規コレクチンの遺伝子が、他の動物種において保存されているか否かを明らかにするために、ゲノミックサザン分析を実施した。
ハイブリダイゼーション用プローブとしては、前記の新規コレクチンのｃＤＮＡ配列のＯＲＦに相当する部分を、ＰＣＲ ＤＩＧプローブ合成キット（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いてＤＩＧラベルしたＤＮＡプローブを用い、メンブレンは、（１）ヒト（プロメガ社製）、（２）サル（クローンテック社製）、（３）ラット（プロメガ社製）、（４）マウス（プロメガ社製）、（５）イヌ（クローンテック社製）、（６）ウシ（プロメガ社製）、（７）ウサギ（クローンテック社製）及び（８）ニワトリ（プロメガ社製）のゲノムＤＮＡをそれぞれ５μｇずつ、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉで処理し、アガロースゲルで電気泳動した後に、ナイトラン１３Ｎメンブレンに転写し、ＵＶ照射により固定処理を施したものを用いた。
以上のプローブとメンブレンを用いて、下記の工程に従ってハイブリダイゼーションを行った。先ず、２ｘＳＳＣにメンブレンを５分間浸し、１０ｍｌのＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中で６５℃にて３０分間プレハイブリダイゼーションを行った。次いで、前記と同様に凍結処理されたプローブをＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで１０ｎｇ／ｍｌとなるように希釈し、この溶液２ｍｌを用いて、６５℃にて１時間ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄は、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液２０ｍｌで室温にて５分間２回振盪し、続いて０．２ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液２０ｍｌで６８℃にて１５分間ずつ２回振盪しながら行った。ＳＤＳを除去するために、ＤＩＧ緩衝液Ｉで室温にて１分間２回洗浄し、次に５０ｍｌのＤＩＧ緩衝液ＩＩ’で、室温にて１時間ブロッキングを行った。次いで、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤＩＧ緩衝液Ｉで５０００倍に希釈しておいた抗ＤＩＧアルカリホスファターゼ標識抗体を１０ｍｌ用いて３０分間処理し、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤＩＧ緩衝液Ｉを５０ｍｌ用い室温にて２０分間、振盪しながら洗浄を２回行った。１０ｍｌのＤＩＧ緩衝液ＩＩＩに室温にて３分間２回浸した後、メンブレンをハイブリバックに移し、ＤＩＧ緩衝液ＩＩＩで１００倍に希釈しておいたＣＳＰＤを全体にゆきわたるように延ばし、インスタントフィルムＴ６１２上で感光させた。
この結果を図９に示すが、ニワトリ（レーン８）を除くすべての動物種において明瞭なシグナルが認められることから、本発明の新規コレクチン遺伝子は、哺乳類において保存されていることが明らかとなった。
実施例８：新規コレクチンの遺伝学的解析
得られた新規コレクチンのＤＮＡ配列に基づき、既知のコレクチンとの遺伝的位置付けを明らかにするために解析を行い、遺伝的系統樹を作成した。
解析の対象としたコレクチンは、図１０に示す各種コレクチンファミリーのタンパク質（図中、ＣＬ−Ｌ１は本発明者らが最近単離したヒト肝臓由来のコレクチンを示す（特願平１０−１１２８１号明細書参照））であり、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからそれぞれのアミノ酸配列を検索して得られたデータをもとにレクチンドメインを含む領域を用いてｃｌｕｓｔａｌｗ法でマルチプル・アラインメントを作成し、それらをもとにＮ−Ｊ法（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ法）を用い、Ｐｈｙｌｉｐ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．５７ｃ ｐａｃｋａｇｅプログラムを用いて遺伝的系統樹を作成した。
その結果を図１０に示すが、ＳＰ−Ｄ、ウシＣＬ−４３及びウシコングルチニンで１つのクラスターを形成し、さらにＭＢＰ及びＳＰ−Ａでそれぞれ別々にクラスターを形成していたが、本発明の新規コレクチン遺伝子はＣＬ−Ｌ１と同様これらのいずれのクラスターにも属していないことが示された。また、本発明の新規コレクチンはＣＬ−Ｌ１とも異なる、従来報告されているコレクチンとは遺伝的に別のクラスターを形成するものと推測された。
実施例９：新規コレクチンに対するモノクローナル抗体の調製
新規コレクチン１００μｇをＰＢＳ（−）（カルシウムイオン及びマグネシウムイオン不含のＰＢＳ）１００μｌに溶解したものと完全フロイントアジュバンド１００μｌを混合し、エマルジョンを作成し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌性、８週齢）２匹の腹腔内に注射する。３週間後、同様にして２回目の免疫を行う。但し、完全フロイントアジュバンドのかわりに不完全フロイントアジュバンドを用いる。さらに２週間後、血清を採取し抗体価を測定する。一番抗体価の高いマウスを選び、一週間後、２回目と同様にして最終免疫を行う。最終免疫の５日後、脾臓を採取し、細胞浮遊液を調製する。細胞融合は、骨髄腫細胞ＮＳ−１細胞２×１０^７個と調製した脾細胞１×１０^８個を混合して行う。混液を１，６００ｒｐｍ、６分間室温で遠心後、上清を除去し、残った細胞をほぐしたところにポリエチレングリコニル（ＰＥＧ）を１ｍｌ、１分間をかけて添加し、室温で１分間攪拌する。その後、あらかじめ３７℃で保温しておいた基本培地（イスコフ培地、１５％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）１ｍｌを１分間かけて滴下しながら軽く混ぜる。この操作をもう一度繰り返した後、今度は８ｍｌを３分間かけて同様の操作を行う。その後、１，０００ｒｐｍ、５分間、室温で遠心することによりＰＥＧを除去する。ペレットをほぐし、そこへ５×１０^６個／ｍｌの胸腺細胞浮遊液（ハイブリドーマ形成率を高めるフィーダー細胞として使用、ＨＡＴを含むハイブリドーマ増殖培地に浮遊させたもの）１００ｍｌを加えて浮遊液を作製する。この浮遊液を９６穴プレートに０．１ｍｌずつまきこみ、ＣＯ_２インキュベーターにて、３７℃、５％ＣＯ_２で培養を行う。
ハイブリドーマの選択は以下のようにして行う。培養開始１日後、各ウェルにＨＡＴ培地（ＨＡＴを含むハイブリドーマ増殖培地）１５０μｌを添加した後、引き続き、２日間培養する。２日後培地の１５０μｌを除去し、そこへＨＡＴ培地１５０μｌを添加して培地交換を行い、さらに３日および７日培養後も、同様に培地交換を行う。その４日後、培養上清１００μｌを採取し新規コレクチンに対する抗体価を測定してスクリーニングを行う。次に、抗体陽性細胞をパスツールピペットを用いて、９６穴プレートから２４穴マルチプレートに移す。この時、各ウェルにあらかじめＨＴ培地（ヒポキサンチン及びチミジンを含むハイブリドーマ増殖用培地）０．５ｍｌを添加しておく。３日間培養後、培地を一部採取し、抗体価を再測定した結果、抗体陽性と判断できる細胞をクローニングおよび凍結保存する。クローニングは陽性細胞を胸腺細胞浮遊液で限界希釈して１個／ｍｌに調製し、９６穴マルチプレートに０．２ｍｌずつまきこむ。１０日間培養後、１ウェルに１個だけコロニーを形成しているものの抗体価を測定し、高い抗体価が示されたもの２個を選択する。この２コロニーについて再クローニングを行う。方法は１回目のクローニングと同様の方法で行う。抗体陽性細胞は続いて培養拡大を行う。まず、２４穴マルチプレートに移した後、３日間培養後、２５ｃｍ^２フラスコに移し、さらに３日後、２２５ｃｍ^２フラスコに移して培養をさらに３日間続け、培養上清を回収することによってモノクローナル抗体を調製する。
また、腹水からのモノクローナル抗体の製造は、クローニング済みのハイブリドーマを１×１０^７個／ｍｌに調製し、マウス１匹当たり１ｍｌを腹腔内に注射することにより行う。１週間後、腹部の肥大したマウスをエーテルで麻酔し、腹水を採取する。血清分離剤入り凝固促進型遠心管に移し、室温３０分間放置後、３，０００ｒｐｍ、５分間遠心する。上部の腹水を回収、さらに硫安塩析で精製して抗体を得る。
実施例１０：抗マウス抗ヒト新規コレクチン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法
抗マウス抗ヒト新規コレクチン抗体をコーティングバッファー（５０ｍＭ炭酸−炭酸水素バッファー、ｐＨ９．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、この抗体液を９６穴ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌずつ分注する。その後、４℃で一晩インキュベートする。洗浄液（ＴＢＳ／Ｔ液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１４Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４））３００μｌで３回洗浄する。以下の洗浄は同様にして行う。５％スキムミルク／ＴＢＳ／Ｔ液３００μｌを分注し、３７℃、１時間静置する。洗浄後、被験試料および新規コレクチン標準品を１００μｌ分注し、３７℃にて１時間静置する。このとき被験試料は適当に希釈を行い、標準品は０．０２μｇ／ｍｌを最高濃度とし２倍連続希釈列を用いる。洗浄後、１μｇ／ｍｌビオチン化抗ウサギ抗ヒト新規コレクチン抗体１００μｌを分注し、３７℃、１時間静置する。洗浄後、ビオチンストレプトアビジン液１００μｌを分注し、３７℃、３０分間静置する。さらに洗浄後、３，３，５，５’−テトラメチルベンチジン溶液１００μｌを分注し、３０分間室温にて放置後、１Ｎリン酸１００μｌを添加することにより、反応を停止し、波長４５０ｎｍで吸光度を測定を行う。
この方法を用いて標準品により検量線を作成し、新規コレクチンを定量する。
実施例１１：ヒトに対する免疫原性を低下させた抗体の調製
まず、実施例９に記載の方法で得られたマウスハイブリドーマからｍＲＮＡを調製し、ファージベクターを用いたｃＤＮＡライブラリーを作製、ｃＤＮＡクローニングを行う。定常領域ｃＤＮＡをプローブとしたマウス抗体ｃＤＮＡクローニングし、制限酵素を用いて挿入されたｃＤＮＡの解析を行い、抗体ｃＤＮＡの塩基配列の決定する。
次に、キメラ抗体を発現させ、クローニングした抗体遺伝子における変異の有無などを抗体結合活性から確認し、また、発現させたヒト化抗体の結合活性を検討するときのポジティブコントロールとして使用する。キメラ抗体を発現する際には、ヒト抗体Ｈ鎖、Ｌ鎖の定常領域遺伝子が一つのベクター上にクローニングされているカセットタイプの発現ベクターを用いる。キメラ抗体の結合活性を確認し、クローニングしたマウス抗体遺伝子に間違いがないと判断できたところで、ヒト化抗体遺伝子の構築を行う。キメラ抗体作製法とは異なり、ヒト化抗体の場合は構築する遺伝子の設計を行わなければいけない。決定されたマウスの抗体可変領域遺伝子の塩基配列をもとに、データベースを利用して相同性の高いヒト抗体可変領域のアミノ酸配列を検索する。ＣＤＲ配列を除いて７０〜８０％の相同性を有するものを見いだし、このように選択したヒト抗体可変領域からＣＤＲ配列を除いた領域（フレームワーク領域）にマウス抗体ＣＤＲ配列を移植して、蛋白構造解析ソフトにより分子モデリングを行う。モデリングにより抗原と結合するＨ鎖、Ｌ鎖上の合計６個のＣＤＲが三次元構造上最もオリジナルのマウスモノクローナル抗体のものに近くなるように、ヒトフレームワーク領域の配列をＨ鎖、Ｌ鎖それぞれ数アミノ酸ずつをマウス型に戻す。この場合、マウス型に戻す数が少なければ少ないほど、よりヒト抗体に近い抗体が得られるので理想的である。このような分子モデリングでは、一つのモデルから出発したヒト化抗体がマウスモノクローナル抗体に等しい活性を１００％再現できる確立は低いため１０種類以上のバージョンのヒト化抗体遺伝子を設計、発現して活性を比べる。
遺伝子設計終了後、実際に遺伝子の構築を行う。ヒト化抗体Ｈ、Ｌ鎖の定常領域遺伝子を含むカセットタイプの発現ベクターにクローニングし、ＣＯＳ細胞などを用いて一過性発現を行い培養上清の抗体活性をＥＬＩＳＡ法を用いて確認する。活性の強かった数種類を選択して、それぞれ恒常発現用の発現ベクターとＣＯＳ細胞などの宿主細胞を用いて恒常発現する細胞を確立し、培養上清から精製抗体を調製する。
実施例１２：新規コレクチンの発現ベクターｐＮＯＷ１−ｈＣＬ−Ｐ１の構築
まず、配列番号：１に示す新規コレクチンの開始コドンから終止コドンまでを、ａａｇｇａａａａａａ ｇｃｇｇｃｃｇｃａｔ ｇｃａａｃａａｇａｔ ｔｔｇａｔｇａｇｇの塩基配列（配列番号：２６）からなるプライマーと、ｇｃｔｃｔａｇａｔｔ ａｔａａｔｇｃａｇａ ｔｇａｃａｇｔａｃの塩基配列（配列番号：２７）からなるプライマーを用いて、ザイモリアクター（アトー社製）で増幅させる。
得られた新規コレクチンのｃＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩとＸｂａＩで消化して、新規コレクチンのｃＤＮＡの６７０〜１６９８ｂｐに対応するｃＤＮＡ部分（配列番号：１参照）を得、これを挿入体とする。
次に、発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａ（特開平１０−１７９１６９号明細書参照）を、制限酵素ＮｏｔＩとＸｂａＩで消化して、サイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）の下流、すなわち、Ｐ_ＣＭＶ（サイトメガロウイルス初期主要抗原プロモーター）とＢＧＰポリＡ（ウシ成長ホルモンポリアデニレーションシグナル）の間に、前述の挿入体をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造製）を用いて挿入する。このようにして得られた発現ベクターをプラスミドｐＮＯＷ１−ｈＣＬ−Ｐ１（ｈＣＬ−Ｐ１：新規コレクチンをコードする塩基配列）と命名し、その構造の模式図を第１１図に示す。
実施例１３：新規コレクチンを発現するクローンの選択
（１）ジヒドロ葉酸還元酵素欠損（ｄｈｆｒ ⁻ ）のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞への発現ベクターｐＮＯＷ１−ｈＣＬ−Ｐ１の導入
ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＧＩＢＣＯ社）を１０％添加した（ヒポキサンチン、チミジンを含まない）Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ、ＧＩＢＣＯ社）を調製し、これにＤＨＦＲ遺伝子が欠損した（ｄｈｆｒ⁻）ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞株を、１×１０^５細胞／ｍｌになるように混合し、これを直径６０ｍｍのディッシュに播種し、３７℃で、５％炭酸ガス（ＣＯ_２）の条件下で、２４時間培養する。培養上清を廃棄し、その代わりに別途予め、５μｇのＤＮＡ（発現ベクターｐＮＯＷ１−ｈＣＬ−Ｐ１）をリポフェクチン溶液（ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔ−ｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；ベーリンガーマンハイム社製）に混合して得た溶液１００μｌを含む１０％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭを加えて６ｍｌとし、さらにヒポキサンチン（終濃度１０ｎＭ）（ＧＩＢＣＯ社製）とチミジン（終濃度１００ｎＭ）（ＧＩＢＣＯ社製）を加え、１６時間培養し、ｄｈｆｒ⁻の宿主ＣＨＯ細胞への発現ベクターｐＮＯＷ１−ｈＣＬ−Ｐ１の導入を行う。その後、培養上清を廃棄し、１０％ＦＣＳ、ヒポキサンチン、チミジン添加ＩＭＤＭの６ｍｌを加え、さらに２４時間培養を行う。
（２）ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性ＣＨＯ細胞の取得
発現ベクターｐＮＯＷ１−ｈＣＬ−Ｐ１が導入された細胞を２４時間培養した後、これをトリプシン処理してディッシュより回収し、細胞数を計測した後、１×１０^５細胞／ｍｌになるように４００μｇ／ｍｌの濃度のネオマイシン（Ｇ４１８）を含む１０％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭで細胞を懸濁したものを、０．１ｍｌ／ウェルの量で９６ウェルのマイクロプレート１０枚に播種（分注）する。３７℃で、５％炭酸ガス（ＣＯ_２）の条件下培養し、２週間後の生存細胞をＧ４１８耐性細胞（クローン）として取得する。
これらＧ４１８耐性クローンを、ｈＣＬ−Ｐ１の産生性について確認する。ｈＣＬ−Ｐ１の産生が確認されたクローンの中からいくつかを選択し、各クローンを、２５ｃｍ^２のカルチャーフラスコに播種する。細胞が密集するまで（およそ３×１０^６細胞／２５ｃｍ^２カルチャーフラスコ）培養を行う。それぞれのカルチャーフラスコの培養上清を廃棄し、前出のものと同じ組成の１０％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭを２ｍｌ加え、４日間培養し、その培養上清を回収する。回収した培養上清中のｈＣＬ−Ｐ１（ｒｈＣＬ−Ｐ１：組換えヒト新規コレクチン）の産生量を測定する。なお、ｈＣＬ−Ｐ１の産生量は、対照として下記鈴木らの方法を用いて大腸菌で発現させたｈＣＬ−Ｐ１、コレクチンの糖認識領域（ＣＲＤ）とネック領域（同様の方法を用いて大腸菌で発現させたもの）に対する抗ウサギポリクローナル抗体およびｈＣＬ−Ｐ１（定量対象）を用いて、鈴木らの方法（Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ，ｅｔ ａｌ．，″Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂｏｖｉｎｅ Ｃｏｎｇｌｕｔｉｎｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ａ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ″，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３８，ｐｐ．８５６−８６３（１９９７））に準じて定量する。
（３）メトトレキセート耐性のＣＨＯ細胞の取得
上記実施例１３（２）で得られるｈＣＬ−Ｐ１産生クローンをさらに継代培養して安定化させた後、低濃度のメトトレキセート（ＭＴＸ）を培地に加えて遺伝子増幅を行う。
まず、５ｎＭ ＭＴＸ、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を加えた１０％透析済ＦＣＳ（ＪＲＨバイオサイエンス社製）添加ＩＭＤＭに、選択した各細胞クローンを混合し、０．１ｍｌ／ウェルの量を９６ウェルのマイクロプレート１０枚に播種（分注）する。３７℃で、５％炭酸ガス（ＣＯ_２）の条件下で培養を行い、２週間後の生存細胞を５ｎＭ ＭＴＸ耐性細胞（クローン）として取得する。
これら５ｎＭ ＭＴＸ耐性のクローンを、ｈＣＬ−Ｐ１産生性について確認する。ｈＣＬ−Ｐ１の産生が確認されたクローンの中からいくつかのクローンを任意に選択し、それぞれを２５ｃｍ^２のカルチャーフラスコに播種し、細胞が密集するまで２週間培養する。培養上清を廃棄し、前出のものと同じ組成の１０％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭ（５ｎＭ ＭＴＸ、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を加えたもの）を２ｍｌ加え、４日間培養し、その培養上清を回収し、ｈＣＬ−Ｐ１の産生レベルを確認する。なお、ｈＣＬ−Ｐ１の産生量の定量は、実施例１０に記載のＥＬＩＳＡ法に準じて行う。
実施例１４：トランスジェニックマウスの作製
コレクチンは基礎免疫に重要な役割を担っていると考えられている。また、本発明の新規コレクチンは従来のコレクチンとは遺伝的に別のクラスターを形成するものと考えられるので、免疫に関する新たな知見を得、また当該新規コレクチンの作用機序を解明する上で重要なツールを提供するために、この新規コレクチンのトランスジェニック非ヒト動物を作製する。
本発明のヒト由来の新規コレクチンをマウスで発現させることのできるプラスミドを構築する。まず、ニワトリ−β−アクチンプロモーターとその上流にサイトメガロウィルスエンハンサーを有する哺乳動物発現ベクター（Ｎｉｗａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ，；Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２００，１９９１）より２．３ｋｂ断片をＳａｌ Ｉ／ｐｓｔ Ｉ消化により切り出し、これをクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＳａｌ Ｉ／Ｐｓｔ Ｉ部位へ挿入し、ｐＢｓＣＡＧ−２ベクターを構築する。この２．３ｋｂ断片中には、上記エンハンサー／プロモーターおよびウサギ−β−グロビン遺伝子の一部（第２イントロン、第３エクソン、３’非翻訳領域）が含まれている。ｈＣＬ−Ｐ１のｃＤＮＡ（配列番号：１の第６７０〜１６９８位）を上記第３エクソンのＥｃｏ ＲＩ部位に挿入し、トランスジェニックマウス発現用プラスミドｐβＡ／ｈＣＬ−Ｐ１を構築する。
次に、アルカリ−ＳＤＳ法により大量のプラスミドｐβＡ／ｈＣＬ−Ｐ１を準備し、ＣｓＣｌ平衡密度勾配超遠心法により精製を行う。ｐβＡ／ｈＣＬ−Ｐ１をＳａｌ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩ消化した遺伝子を単離し、ベクター部分を切り離す。その後、アガロースゲル電気泳動によりベクターＤＮＡ断片と分離し、導入ＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ ＩＩ Ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製する。エタノール沈殿の後、インジェクション用ＤＮＡ溶解液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、１５，０００ｒｐｍ（２０，０００ｘｇ）、５分間の遠心後、上清を回収する。分光光度計で吸光度を測定してＤＮＡ濃度を計算し、５００ＤＮＡ分子／ｐ１になるように調製し、マウス第一細胞期胚へのＤＮＡ導入まで、５０ｍｌずつ分注して−２０℃に保存する。
次にＤＮＡを注入するためのマウス受精卵を調製する。まず、受精卵採取用雌性マウスを過排卵誘起を施すため、妊馬血清性性腺刺激ホルモンおよびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを４８時間間隔で５ＩＵ／ｂｏｄｙを腹腔内に投与し、雄性マウスと同居させる。膣栓が形成されているマウスの腹腔を開き、卵管を取り出しＢＷＷ−Ｈｅｐｅｓ培地（ＮａＣｌ １０２．２ｍＭ、ＫＣｌ ４．７８ｍＭ、ＫＨ_２ＰＯ_４１．１９ｍＭ、ＣａＣｌ_２１．１７ｍＭ、ＭｇＳＯ_４１．１９ｍＭ、ＮａＨＣＯ_３４．７６ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ１５ｍＭ、乳酸ナトリウム２５ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム０．２５ｍＭ、グルコース５．５６ｍＭ、ＢＳＡ４ｍｇ／ｍＬ、ＥＤＴＡ０．１ｍＭ及びフェノールレッド０．０００２５％含有）で洗浄した後、３００ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼを含むＢＷＷ−Ｈｅｐｅｓ培地に入れる。実体顕微鏡下に卵管膨大部を時計用ピンセットで引き裂き、受精卵を培地中に取り出した後、受精卵をガラスピペットで拾い上げ、ＢＷＷ−Ｈｅｐｅｓ培地で５回洗浄する。その後、受精卵をミネラルオイルで覆われたＢＷＷ培地のドロップの中に入れ、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養する。
引き続き、受精卵前核へのＤＮＡ注入を行う。６０ｍｍのシャーレにＢＷＷ−Ｈｅｐｅｓ培地とＤＮＡ溶液（５００ＤＮＡ分子／ｐ１）のドロップを作り、その上をミネラルオイルで覆った後、インジェクションピペットとホールディングピペットをそれぞれのインジェクターに取りつけ、ＢＷＷ−Ｈｅｐｅｓ培地の上のドロップに受精卵を入れる。インジェクションピペットにＤＮＡ溶液を吸引し、ごくわずか陽圧になるようにインジェクターを調節し、先端から持続的にＤＮＡ溶液を流出させておく。インジェクションピペット側に雄性前核がくるようにホールディングピペットで卵を吸引し、対物レンズの倍率を４０倍にして前核に焦点を合わせた後、インジェクションピペットの先端が前核と同じ平面にくるように調節する。
その後、インジェクションピペットの先端を前核の中に突き刺し、ＤＮＡ溶液を注入する。核の膨化を確認した後、ピペットをすばやく抜き取り、インジェクションした卵は下のドロップに移動させ、未処理の卵と混ざらないように操作する。一度に約３０個の卵をインジェクションし、その後ＢＷＷ培地のドロップに移して、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養する。
培養後、受精卵の卵管への移植を行う。ネンブタール注射液を希釈液で１０倍に希釈し（終濃度５ｍｇ／ｍｌ）、体重１ｇあたり０．０１ｍｌ腹腔内に投与して偽妊娠マウスに麻酔をかける。約３０個の卵をできるだけ少量の培地（０．５〜１．０ｍｌ）とともに吸い上げておいたトランスファーピペットを用いて、卵管開口部に注入する。卵巣と卵管を体内に戻して切り口を縫合する。その後飼育を続けて、およそ１９日後に出産する仔を得る。
トランスジェニックマウスのスクリーニングはドットブロットハイプリダイゼーションにより以下のようにして行う。得られた仔は生後４週間で離乳させ、尾部の先端部分約１ｃｍを麻酔下で切断し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れる。０．５ｍｇ／ｍｌのプロティナーゼＫを含むＳＴＥｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５），０．５％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ）を０．５ｍｌ加え、５５℃のインキュベーター中で一晩振盪する。尾部溶解液のうち１００ｍｌを新しいチューブに取り、ＴＥ飽和フェノール２００ｍｌとＴＥ ｂｕｆｆｅｒ１１０ｍｌを加え、ボルテックスミキサーに５分間かけた後、１５，０００ｒｐｍ（２０，０００ｘｇ）、５分間、室温で遠心する。得られた水層２００ｍｌを新しいチューブに取り、フェノール／クロロホルムを２００ｍｌ加えて５分間ボルテックスミキサーにかけた後、１５，０００ｒｐｍ（２０，０００ｘｇ）、５分間、室温で遠心する。上清を新しいチューブに取り、３Ｍ酢酸ナトリウム２０ｍｌとエタノール５００ｍｌを加え、ＤＮＡの糸状沈殿物が目視可能となるまで十分混合するように振り、１５，０００ｒｐｍ（２０，０００ｘｇ）、５分問、４℃で遠心する。上清を除いて７０％エタノールで洗浄の後、５分問乾燥させ、ＤＮＡ沈殿を１００ｍｌの２Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液に溶解する。沸騰水浴中で５分間加温後、氷水中で急冷し、ＤＮＡを変性させる。９６穴マニホールドをセットし、ＤＮＡをナイロンメンブレン上にスポットし、メンブレンを風乾した後、８０℃、２時間加熱する。導入したＤＮＡのうちマウス由来の配列を含まない部分をプローブに用いて、通常の方法でハイブリダイゼーションを行う。この結果、シグナルが確認できたものの個体をトランスジェニックマウスとして同定する。
このようにして受精卵に遺伝子注入操作を行うと、受精卵のうち約９割が生存し続ける。この生存卵全てを１匹当たり２５個程度となるようレシピエントに移植してレシピエントが妊娠するようにし、妊娠およそ１９日目生まれる仔を得る。これらの仔の遺伝子解析を行って導入遺伝子の存在を確認する。さらに、これらのトランスジェニックマウスよりＦ１マウスを得、トランスジーンの伝達性を調べる。
実施例１５：ノックアウトマウスの作製
まず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウス由来のＥＳ細胞において本発明の新規コレクチンマウス相同体をコードする目的遺伝子の一部のエクソン部分に、選択マーカー遺伝子であるネオマイシン耐性遺伝子を組み込んで、ターゲッティング用ＤＮＡの構築を行う。次にこのＤＮＡのＥＳ細胞へのエレクトロポレーションを以下のように実施する。対数増殖期のＥＳ細胞（９０ｍｍシャーレ１枚）を新鮮なＥＳ培地（２０％ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸溶液、０．１ｍＭ非必須アミノ酸溶液及び１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む８０％ＤＭＥＭ培地）に交換して４時間さらに培養し、培地を除去後、ＰＢＳ（−）でよく洗浄した後、０．１％トリプシン溶液０．５ｍｌで３分間処理する。培地を１ｍｌ加えて単一細胞に分散させ、６００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上澄みを捨て、ＰＢＳ（−）５ｍｌに懸濁し、細胞数を測定する。再度、６００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上澄みを捨て、１．１×１０^７細胞／ｍｌになるようにＰＢＳ（−）に懸濁する。１．１×１０^７細胞／ｍｌの懸濁液うち０．９ｍｌをキュベットへ移し、１μｇ／μｌのＤＮＡ溶液（ターゲッティング用）２５μｌ（２５μｇ）をキュベットに加えて、室温で、５分間静置する。ジーンパルサーを用いて、５００μＦ、２３０Ｖの条件で、エレクトロポレーションを行い、５分間放直後、ＥＳ培地（−Ｇ４１８）に懸濁し、フィーダー細胞が敷かれているシャーレ（９０ｍｍ）４枚に１／４ずつ播く。ニレクトロポレーション後、２４時間培養したら、１５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（活性型）含有ＥＳ培地に交換し、その後毎日、培地交換を行う。７日後に以下のとおりにクローニングを行う。
コロニーの出現した９０ｍｍシャーレより培地を除去し、ＰＢＳ（−）を１０ｍｌ分注する。実体顕微鏡の下で形態が良好なコロニーをチップで１つずつ掻取し、吸い上げ、それぞれのコロニーは、あらかじめ０．１％トリプシン溶液７０μｌが入れられた９６穴プレートへ移す。そのまま３７℃に４〜５分間放置し、トリプシン処理を行い、８連ピペットマンを用いて充分にピペッティング後、あらかじめ７５μｇ／ｍｌ Ｇ４１８含有ＥＳ培地を０．８ｍｌ入れた２４穴プレート（フィーダー細胞付き）の４穴へ播く。２４時間培養後、７５μｇ／ｍｌ Ｇ４１８含有ＥＳ培地と交換する。３日後、対数増殖期になったクローンに、０．１％トリプシン１００μｌを加え、ＥＳ培地を１００μｌ加えてピペッティング後、丸底９６穴プレートへ移す。４８クローンのすべてを処理したら、培養用に２０μｌとり、残り１８０μｌはＰＣＲ用に用いる。
ＰＣＲ用のクローンを９６穴プレートごと１２００ｒｐｍ，４℃、５分間遠心した後、培地を除去し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄する。８連ピペットマンを用いて溶解用溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１００μｇ／ｍＬプロティナーゼＫ）１００μｌを加え、５５℃、１時間プロティナーゼＫ処理を行う。テープでプレートの回りに封をして、さらに９５℃、１５分間保温してプロティナーゼＫを完全に失活させる。４℃にて５分間冷却し、２〜３μｌをＰＣＲ用サンプルとして採取し、第１回目のスクリーニングに用いる（残りは−２０℃で保存する）。サンプルは４クローンを１グループとしてセンスプライマー：ａｔｇｃａａｃａａｇａｔｔｔｇａｔｇａｇｇ（配列番号：２８）及びアンチセンスプライマー：ｃｃｔａｃｃｃｇｇｔａｇａａｔｔｇａｃｃ（配列番号：２９）を用いたＰＣＲを行い、電気泳動法によって目的遺伝子を確認することにより陽性グループの同定を行う。−２０℃で保存しておいた残りのサシプルのうち、陽性グループに属する各クローンについて、同様にＰＣＲを行い、陽性クローンを同定する。次に培養用クローンのスクリーニングを行う。培養用のクローン２０μｌを、２４穴プレート（フィーダー細胞付き）の４穴／列へ播き、全部が埋まったらＣＯ_２インキュベーターへ入れて培養し、最終的に１クローンを３穴に分けて６穴プレート（フィーダー細胞付き）に植え継ぐ。
遺伝子を導入したＥＳ細胞塊を下記のとおりに調製したマウスの２．５日胚（８細胞期胚）２個で挟み込むサンドイッチ法により生殖系列キメラマウスの作成を行う。
２．５日胚の調製は、以下の様に行う。２．５日胚ＥＳ細胞の接着の６日前に５ＩＵのＰＭＳＧ（妊馬血清性腺刺激ホルモン）を採卵用のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌性マウスの腹腔内に投与する。４日前さらに５ＩＵのｈＣＧ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）を腹腔内に投与し、雄と交配させる。３日前、膣栓により交尾を確認し、自然発情している偽妊娠用雌マウスを精管結紮雄マウスと交配させる。膣栓により交尾を確認し、偽妊娠マウスとする。接着当日採卵用雌マウスを頚椎脱臼により安楽死させ、卵管および子宮を摘出する。卵管と子宮をＢＷＷ−Ｈｅｐｅｓ培地で環流し、２．５日胚（８細胞期胚および桑実胚）を採取し、胚をＢＷＷ培地のドロップに移し、ＣＯ_２インキュベーター（５％ＣＯ_２，３７℃）中で培養する。採卵し２．５日胚を酸性タイロード液のドロップ（２００μｌ）に移し、１〜２分間静置し、透明帯が溶解したらすぐにＢＷＷ−Ｈｅｐｅｓ培地で６回洗浄してＥＳ細胞との接着に使用する。
ＥＳ細胞の調製は以下のようにして行う。接着当日、フィーダー細胞上に培養しているＥＳ細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄し、０．０５％トリプシン液を２分間作用させ、数十細胞の塊となるようにシャーレから剥取する。ＥＳ培地（−Ｇ４１８）を加え、トリプシンを不活化し、遠心後、ＥＳ培地に懸濁する。０．１％ゼラチンを被覆したシャーレに播き、１５分間ＣＯ_２インキュベーター中に静置する。シャーレに接着しなかった細胞を集め、これを集合キメラ作製に使用する。
２．５日胚とＥＳ細胞の接着は、以下のようにして行う。先ず、細菌培養用のシャーレの底にニードルで小さな穴を開ける。穴を２０μｌのＢＷＷ培地のドロップで覆い、さらにミネラルオイルでカバーする。ＣＯ_２インキュベーターに入れ、培地をこの条件に平衡化しておき、実体顕微鏡下に良好な形状を有する、１０〜２０個からなるＥＳ細胞塊を選別する。先に作製した穴の中に、ＥＳ細胞塊を１つずつ入れる。透明帯を除去しておいた２．５日胚を２個ずつ穴の中に入れ、ＥＳ細胞塊と接着させる。ＣＯ_２インキュベーターで一晩培養し、２個分の大きさからなる１つの胚盤胞を得る。
次に、３．５日胚を子宮へ移植する。偽妊娠マウス（交尾後２．５日）の腹腔内にネンブタール注射液を投与し（体重１ｇ当たり５０μｇ）、麻酔をかける。麻酔のかかったマウスの後背部を開き、脂肪塊を摘んで子宮を引き出す。一晩培養してできた胚盤胞もしくは桑実胚を、１０〜１５個ずつ少量の培地（０．５〜１．０μｌ）とともにピペットで吸いあげ、実体顕微鏡下で、注射針で子宮壁の卵管に近い部分に穴を開け、その穴にピペットを挿入して、胚を子宮内に移植する。子宮を体内に戻して切り口を縫合し、およそ１８日後に出産する仔を得る。
生殖系列への伝達を確認後、ヘテロ同士のマウスをかけ合わせることによりホモ化し、目的とする本発明の新規コレクチンの相同体を発現しないノックアウトマウスを得る。
〔産業上の利用可能性〕
以上説明したように本発明によって、抗菌性、抗ウイルス活性が確認されているコレクチンに特徴的な構造を有し、従来報告されているものとは異なる新規コレクチン及びそれをコードする遺伝子が提供される。
本発明によって得られる配列情報は、生体防御機構の解明に有用であり、また新規コレクチンが有する生物学的活性を利用した医薬、実験用途のツールを提供することができる。例えば、この新規コレクチンを発現できるベクター、このベクターを発現可能に含む宿主細胞、新規コレクチンに対する抗体の他、新規コレクチン関連分子種をスクリーニングするためのプローブが提供される。
さらに、新規コレクチン及び／または由来分子の機能あるいは発現調節の研究、ヒトにおいて発現している細胞に関連する疾患のメカニズムの解明、医薬品のスクリーニング・安全性試験に用いる疾患モデル動物として有用なトランスジェニック非ヒト動物、ノックアウト非ヒト動物が本発明によって提供される。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図は、従来報告されている主なコレクチンの基本構造及びタンパク質の概観を示す図である。
第２図は、従来報告されている３種のコレクチンのアミノ酸配列のアラインメントの前半部分を示す図である。
第３図は、第２図と同様のアラインメントの後半部分を示す図である。
第４図（ｂ）は、本発明の新規コレクチンの塩基配列を決定するために使用した各プライマーの名称と、シーケンサーにより読み取られた塩基配列を示す図であり、第４図（ａ）は、得られた新規コレクチンのＯＲＦを示す図である。
第５図は、従来報告されている３種のコレクチンと、本発明の新規コレクチンのアミノ酸配列のアラインメントの前半部分を示す図である。
第６図は、第５図と同様のアラインメントの後半部分を示す図である。
第７図は、本発明の新規コレクチンのゲノミックサザン分析の結果を示す図である。各レーンで使用された制限酵素は、（１）ＥｃｏＲ Ｉ、（２）Ｘｂａ Ｉ、（３）Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、（４）Ｐｓｔ Ｉ、（５）Ｂｇｌ ＩＩ及び（６）Ｂａｍ ＨＩである。
第８図は、本発明の新規コレクチンの臓器分布を示す、ヒトの種々の組織、すなわち、１）脳、（２）心臓、（３）腎臓、（４）脾臓、（５）肝臓、（６）小腸、（７）筋組織、（８）精巣、（９）胎盤、または（１０）大腸におけるｍＲＮＡの発現分布の分析結果を示す図である。
第９図は、本発明の新規コレクチンの種間での保存性を示す、種々の脊椎動物、すなわち、（１）ヒト、（２）サル、（３）ラット、（４）マウス、（５）イヌ、（６）ウシ、（７）ウサギ及び（８）ニワトリにおけるゲノミックサザン分析の結果を示す図である。
第１０図は、種々のコレクチンの遺伝的系統樹を示す図である。
第１１図は、本発明の新規コレクチンを発現するベクターの構造を示す模式図である。

Claims (19)

1. 配列番号：２に記載のアミノ酸配列の第229位〜第547位のアミノ酸からなり、かつ糖鎖に対してカルシウムイオン(Ca ²⁺ )特異的に結合する、ことを特徴とするポリペプチド。
2. 配列番号：１に記載の塩基配列の第739位〜第1695位のヌクレオチドからなり、かつ請求項１に記載のポリペプチドをコードする、ことを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
3. 配列番号：２に記載のアミノ酸配列の第226位〜第547位のアミノ酸からなり、かつ糖鎖に対してカルシウムイオン(Ca ²⁺ )特異的に結合する、ことを特徴とするポリペプチド。
4. 配列番号：１に記載の塩基配列の第730位〜第1695位のヌクレオチドからなり、かつ請求項３に記載のポリペプチドをコードする、ことを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
5. 配列番号：２に記載のアミノ酸配列の第211位〜第547位のアミノ酸からなり、かつ糖鎖に対してカルシウムイオン(Ca ²⁺ )特異的に結合する、ことを特徴とするポリペプチド。
6. 配列番号：１に記載の塩基配列の第685位〜第1695位のヌクレオチドからなり、かつ請求項５に記載のポリペプチドをコードする、ことを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
7. 配列番号：２に記載のアミノ酸配列の第206位〜第547位のアミノ酸からなり、かつ糖鎖に対してカルシウムイオン(Ca ²⁺ )特異的に結合する、ことを特徴とするポリペプチド。
8. 配列番号：１に記載の塩基配列の第670位〜第1695位のヌクレオチドからなり、かつ請求項７に記載のポリペプチドをコードする、ことを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
9. 配列番号：２に記載のアミノ酸配列の第102位〜第547位のアミノ酸からなり、かつ糖鎖に対してカルシウムイオン(Ca ²⁺ )特異的に結合する、ことを特徴とするポリペプチド。
10. 配列番号：１に記載の塩基配列の第358位〜第1695位のヌクレオチドからなり、かつ請求項９に記載のポリペプチドをコードする、ことを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
11. 配列番号：２に記載のアミノ酸配列の第91位〜第547位のアミノ酸からなり、かつ糖鎖に対してカルシウムイオン(Ca ²⁺ )特異的に結合する、ことを特徴とするポリペプチド。
12. 配列番号：１に記載の塩基配列の第325位〜第1695位のヌクレオチドからなり、かつ請求項１１に記載のポリペプチドをコードする、ことを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
13. 配列番号：２に記載のアミノ酸配列の第９位〜第547位のアミノ酸からなり、かつ糖鎖に対してカルシウムイオン(Ca ²⁺ )特異的に結合する、ことを特徴とするポリペプチド。
14. 配列番号：１に記載の塩基配列の第79位〜第1695位のヌクレオチドからなり、かつ請求項１３に記載のポリペプチドをコードする、ことを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
15. 配列番号：２に記載のアミノ酸配列の第１位〜第547位のアミノ酸からなり、かつ糖鎖に対してカルシウムイオン(Ca ²⁺ )特異的に結合する、ことを特徴とするポリペプチド。
16. 配列番号：１に記載の塩基配列の第55位〜第1695位のヌクレオチドからなり、かつ請求項１５に記載のポリペプチドをコードする、ことを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
17. 請求項２、４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
18. 請求項１７に記載のベクターを発現可能に含む宿主細胞。
19. 請求項２に記載のポリヌクレオチドからなり、かつコレクチン関連分子種をスクリーニングするためのプローブ。

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