JPH09238683A - ウェルナー症候群の原因遺伝子の存在する領域にある新規ｗｓ−３遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質 - Google Patents
ウェルナー症候群の原因遺伝子の存在する領域にある新規ｗｓ−３遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質Info
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 配列番号２で表されるアミノ酸配列を実
質的に含むポリペプチドをコードし、WS領域に存在する
ヒトWS-3遺伝子、該遺伝子の少なくとも一部とハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドプローブ、該遺伝子を含
む組換え体DNA 、該組換え体DNA によって形質転換され
た形質転換体、配列番号２で表されるアミノ酸配列を実
質的に含むポリペプチド、該ポリペプチドの製造方法、
該ポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体
又はポリクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ、該遺伝子を用いて作られるトラン
スジェニック・ノックアウトマウス、及び前記遺伝子の
用途。 【効果】 本発明により、ウェルナー症の治療・診断に
有用な遺伝子、ポリペプチド、抗体が提供される。
質的に含むポリペプチドをコードし、WS領域に存在する
ヒトWS-3遺伝子、該遺伝子の少なくとも一部とハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドプローブ、該遺伝子を含
む組換え体DNA 、該組換え体DNA によって形質転換され
た形質転換体、配列番号２で表されるアミノ酸配列を実
質的に含むポリペプチド、該ポリペプチドの製造方法、
該ポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体
又はポリクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ、該遺伝子を用いて作られるトラン
スジェニック・ノックアウトマウス、及び前記遺伝子の
用途。 【効果】 本発明により、ウェルナー症の治療・診断に
有用な遺伝子、ポリペプチド、抗体が提供される。
Description
【０００１】近年、ポジショナルクローニングの手法に
より、長大な染色体上の特定遺伝子を明らかにすること
が出来るようになってきている。我々は、このポジショ
ナルクローニング方法を駆使し、ウェルナー症候群の原
因となる遺伝子領域（以下、ウェルナー領域又はWS領域
と記す）のコンティーグマップ（以下、遺伝子物理地図
と記す）を作成し、最終的にこのＷＳ領域内に新規ＷＳ
−３遺伝子を見い出し本発明を完成するに至った。
より、長大な染色体上の特定遺伝子を明らかにすること
が出来るようになってきている。我々は、このポジショ
ナルクローニング方法を駆使し、ウェルナー症候群の原
因となる遺伝子領域（以下、ウェルナー領域又はWS領域
と記す）のコンティーグマップ（以下、遺伝子物理地図
と記す）を作成し、最終的にこのＷＳ領域内に新規ＷＳ
−３遺伝子を見い出し本発明を完成するに至った。
【０００２】すなわち、本発明は、配列番号２で表され
るアミノ酸配列を実質的に含むポリペプチドをコードす
るＷＳ−３遺伝子である。該遺伝子としては、配列番号
１又は３で表される塩基配列のいずれかのものが挙げら
れる。ここで、「実質的に含む」とは、当該ポリペプチ
ドによってコードされる遺伝子がＷＳ−３としての機能
を有する限り、そのポリペプチドに含まれるアミノ酸配
列に欠失、置換、挿入等の変異が生じてもよいことを意
味する。また、「ＷＳ−３遺伝子」とは、ウェルナー領
域に含まれる新規遺伝子を意味する。
るアミノ酸配列を実質的に含むポリペプチドをコードす
るＷＳ−３遺伝子である。該遺伝子としては、配列番号
１又は３で表される塩基配列のいずれかのものが挙げら
れる。ここで、「実質的に含む」とは、当該ポリペプチ
ドによってコードされる遺伝子がＷＳ−３としての機能
を有する限り、そのポリペプチドに含まれるアミノ酸配
列に欠失、置換、挿入等の変異が生じてもよいことを意
味する。また、「ＷＳ−３遺伝子」とは、ウェルナー領
域に含まれる新規遺伝子を意味する。
【０００３】さらに、本発明は、前記ＷＳ−３遺伝子の
少なくとも一部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドプローブである。さらに、本発明は、前記ＷＳ−３遺
伝子を含む組換え体ＤＮＡである。さらに、本発明は、
前記組換え体ＤＮＡによって形質転換された形質転換体
である。さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、
得られる培養物からＷＳ−３遺伝子がコードするポリペ
プチドを採取することを特徴とする前記ポリペプチドの
製造方法である。
少なくとも一部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドプローブである。さらに、本発明は、前記ＷＳ−３遺
伝子を含む組換え体ＤＮＡである。さらに、本発明は、
前記組換え体ＤＮＡによって形質転換された形質転換体
である。さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、
得られる培養物からＷＳ−３遺伝子がコードするポリペ
プチドを採取することを特徴とする前記ポリペプチドの
製造方法である。
【０００４】さらに、本発明は、配列番号２で表される
アミノ酸配列を実質的に含む、ＷＳ−３遺伝子がコード
するポリペプチドである。さらに、本発明は、前記ポリ
ペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体又はポ
リクローナル抗体である。さらに、本発明は、前記ポリ
ペプチドで免疫された抗体産生細胞とミエローマ細胞と
を融合させることにより得られる、前記モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマである。さらに、本発明
は、前記オリゴヌクレオチドプローブを含む遺伝子の検
出用試薬である。
アミノ酸配列を実質的に含む、ＷＳ−３遺伝子がコード
するポリペプチドである。さらに、本発明は、前記ポリ
ペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体又はポ
リクローナル抗体である。さらに、本発明は、前記ポリ
ペプチドで免疫された抗体産生細胞とミエローマ細胞と
を融合させることにより得られる、前記モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマである。さらに、本発明
は、前記オリゴヌクレオチドプローブを含む遺伝子の検
出用試薬である。
【０００５】さらに、本発明は、前記ポリペプチド、並
びに前記モノクローナル抗体及び／又はポリクローナル
抗体を含む診断用キットである。さらに、本発明は、前
記ＷＳ−３遺伝子の機能を失った遺伝子が導入されたノ
ックアウトマウスである。さらに、本発明は、前記ＷＳ
−３遺伝子の発現レベルを上昇又は下降するように修飾
された遺伝子が導入されたマウスである。さらに、本発
明は、前記ＷＳ−３遺伝子が導入されたトランスジェニ
ックマウスである。
びに前記モノクローナル抗体及び／又はポリクローナル
抗体を含む診断用キットである。さらに、本発明は、前
記ＷＳ−３遺伝子の機能を失った遺伝子が導入されたノ
ックアウトマウスである。さらに、本発明は、前記ＷＳ
−３遺伝子の発現レベルを上昇又は下降するように修飾
された遺伝子が導入されたマウスである。さらに、本発
明は、前記ＷＳ−３遺伝子が導入されたトランスジェニ
ックマウスである。
【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。まず、Ｗ
Ｓ遺伝子（ウェルナー症候群の原因となる遺伝子）の存
在位置を探索するにあたり、ＷＳ領域のうち、最もその
存在が高いと推察される領域に関してP1及び PACファー
ジ DNAを用いた遺伝子物理地図を作成する（図１）。
Ｓ遺伝子（ウェルナー症候群の原因となる遺伝子）の存
在位置を探索するにあたり、ＷＳ領域のうち、最もその
存在が高いと推察される領域に関してP1及び PACファー
ジ DNAを用いた遺伝子物理地図を作成する（図１）。
【０００７】遺伝子物理地図は、P1及び PACファージ等
のベクター中に組み込まれた平均鎖長90Kbp の長さを持
つヒトDNA断片を正確につなぎ合わせることにより作成
することができ [下記の(1) 〜(4) ]、以後のクローニ
ング実験を容易にすることができる。即ち、(1) 目的の
マーカーDNA と同一の塩基配列を含む DNA断片（P1/PAC
クローン）をライブラリー中から選択する。(2) 次に、
得られたクローンについて、塩化セシウム（以下、CsCl
と略す）を用いた超遠心分離により精製後、組み込まれ
ているDNA 断片の両末端の塩基配列を決定する。(3) さ
らに、この塩基配列の情報をもとにして、ポリメラーゼ
連鎖反応法（米国特許4683195 号, 1987年７月28日；以
下、ＰＣＲと略す）用のプライマーを少なくとも１対
(即ち２本) 作製し、ＰＣＲ反応を行う。(4) (3) の操
作により得られたＰＣＲ産物をプローブとして用いて、
目的とする塩基配列と同一の塩基配列を含むDNA断片（P
1/PACクローン）をライブラリー中から選択する。(5)
(1)〜(4)の操作を繰り返し、順次 DNA断片をつなげる正
確な操作を行い、数百万塩基対にも及ぶ長大な領域をク
ローン化した数多くのP1/PAC DNAの連鎖からなる遺伝子
物理地図を構築する（図１）。物理地図の確認は、リン
パ球細胞を用いたFluorescence in situ hybridization
( 以下、FISHと記す) により行う。FISHは、P1/PAC DNA
が正しい順序でつなげられているか、また、複数のスタ
ート地点から出発した P1/PAC DNA の、いまだつながっ
ていないギャップの距離はどの程度であるかを知るため
の手法の１つである。
のベクター中に組み込まれた平均鎖長90Kbp の長さを持
つヒトDNA断片を正確につなぎ合わせることにより作成
することができ [下記の(1) 〜(4) ]、以後のクローニ
ング実験を容易にすることができる。即ち、(1) 目的の
マーカーDNA と同一の塩基配列を含む DNA断片（P1/PAC
クローン）をライブラリー中から選択する。(2) 次に、
得られたクローンについて、塩化セシウム（以下、CsCl
と略す）を用いた超遠心分離により精製後、組み込まれ
ているDNA 断片の両末端の塩基配列を決定する。(3) さ
らに、この塩基配列の情報をもとにして、ポリメラーゼ
連鎖反応法（米国特許4683195 号, 1987年７月28日；以
下、ＰＣＲと略す）用のプライマーを少なくとも１対
(即ち２本) 作製し、ＰＣＲ反応を行う。(4) (3) の操
作により得られたＰＣＲ産物をプローブとして用いて、
目的とする塩基配列と同一の塩基配列を含むDNA断片（P
1/PACクローン）をライブラリー中から選択する。(5)
(1)〜(4)の操作を繰り返し、順次 DNA断片をつなげる正
確な操作を行い、数百万塩基対にも及ぶ長大な領域をク
ローン化した数多くのP1/PAC DNAの連鎖からなる遺伝子
物理地図を構築する（図１）。物理地図の確認は、リン
パ球細胞を用いたFluorescence in situ hybridization
( 以下、FISHと記す) により行う。FISHは、P1/PAC DNA
が正しい順序でつなげられているか、また、複数のスタ
ート地点から出発した P1/PAC DNA の、いまだつながっ
ていないギャップの距離はどの程度であるかを知るため
の手法の１つである。
【０００８】このようにして得られた遺伝子物理地図、
及びこれを構成するクローン化 P1/PAC DNA を用いて、
cDNAの検出及び塩基配列の決定を行う。cDNAの検出は、
エキソントラッピング法により得られるcDNAの一部のエ
キソンの塩基配列を決定し、PCR 、ノーザンブロット解
析をすることにより行うことができる。また、塩基配列
の決定は、PCR をベースとした方法により行うことがで
きる。例えば、上記エキソントラッピング法により得ら
れるエキソンの断片を鋳型とし、配列番号４、５、20又
は21で表される配列をプライマーとして、PCR を行う。
及びこれを構成するクローン化 P1/PAC DNA を用いて、
cDNAの検出及び塩基配列の決定を行う。cDNAの検出は、
エキソントラッピング法により得られるcDNAの一部のエ
キソンの塩基配列を決定し、PCR 、ノーザンブロット解
析をすることにより行うことができる。また、塩基配列
の決定は、PCR をベースとした方法により行うことがで
きる。例えば、上記エキソントラッピング法により得ら
れるエキソンの断片を鋳型とし、配列番号４、５、20又
は21で表される配列をプライマーとして、PCR を行う。
【０００９】本発明により明らかになったWS-3遺伝子は
ヒト由来のものであり、配列番号２で表されるアミノ酸
配列を実質的に含む（図２）。本発明により、WS-3遺伝
子は、ヒトゲノム上のWS領域内にあるものの、WS-3遺伝
子の転写方向は不明である。また、図３に示すFISHの結
果から明白なように、当該WS-3遺伝子は、ヒト染色体第
８番の8p11.2-p12.1付近に存在することが確認され、さ
らに、本発明者らは、〔実施例５〕に詳述したサザンブ
ロット解析により、WS-3遺伝子はヒトゲノム上でファミ
リーを形成して存在している可能性を明らかにした (図
４A 及び図４B ) 。なお、ヒトWS-3遺伝子に相当する他
種の遺伝子は、Zoo Blotによる解析結果より、ヒトWS-3
遺伝子の塩基配列とホモロジーを有していたことから
(図４C 及び図４D)、公知技術によりクローニングする
ことが可能である。
ヒト由来のものであり、配列番号２で表されるアミノ酸
配列を実質的に含む（図２）。本発明により、WS-3遺伝
子は、ヒトゲノム上のWS領域内にあるものの、WS-3遺伝
子の転写方向は不明である。また、図３に示すFISHの結
果から明白なように、当該WS-3遺伝子は、ヒト染色体第
８番の8p11.2-p12.1付近に存在することが確認され、さ
らに、本発明者らは、〔実施例５〕に詳述したサザンブ
ロット解析により、WS-3遺伝子はヒトゲノム上でファミ
リーを形成して存在している可能性を明らかにした (図
４A 及び図４B ) 。なお、ヒトWS-3遺伝子に相当する他
種の遺伝子は、Zoo Blotによる解析結果より、ヒトWS-3
遺伝子の塩基配列とホモロジーを有していたことから
(図４C 及び図４D)、公知技術によりクローニングする
ことが可能である。
【００１０】以上の発明を完成するに至った基本的要因
は、WS-3遺伝子が遺伝子物理地図上「ウェルナー原因遺
伝子と最も強い連鎖を示す STSマーカー、D8S1055、D8S
339、GSR を含む領域」にあることを見出した（図１）
ことである。図１において、100kbp単位でスケール表示
された直線（尺度線）の直下に影付ボックスで示したも
のは、そこから転写される代表的な遺伝子の名称とその
大体の転写位置である。これらの遺伝子は、テロメア側
からセントロメア側に向かってWS-3遺伝子（本発明によ
る新規遺伝子）、チューブリン偽遺伝子(Tu-φ) 、WS遺
伝子、TFIIEβ（Transcription factor, TFIIEβサブユ
ニット）遺伝子、GSR(Glutathione S-reductase）遺伝
子、WS-2遺伝子及び PP2Aβ（Protein phosphatase 2A
βサブユニット) 遺伝子である。多数の下向きの矢印
（↓）が示す影付きのバーは、ヒトゲノムDNAを概略図
として示したものである。尺度線と該概略図との間に記
載された記号（例えば D8S1055、D8S339等）は、これま
でに知られているSTS（Sequence Tagged Sequence）マ
ーカーであり、それらのおおよその位置を示している。
ヒトゲノムDNAの概略図の下に記載された多数の短い実
線は、遺伝子物理地図を構築しているP1あるいはPAC由
来のDNAであり、本発明者らの便宜のための番号（例え
ば PAC由来の #6207）が付してある。
は、WS-3遺伝子が遺伝子物理地図上「ウェルナー原因遺
伝子と最も強い連鎖を示す STSマーカー、D8S1055、D8S
339、GSR を含む領域」にあることを見出した（図１）
ことである。図１において、100kbp単位でスケール表示
された直線（尺度線）の直下に影付ボックスで示したも
のは、そこから転写される代表的な遺伝子の名称とその
大体の転写位置である。これらの遺伝子は、テロメア側
からセントロメア側に向かってWS-3遺伝子（本発明によ
る新規遺伝子）、チューブリン偽遺伝子(Tu-φ) 、WS遺
伝子、TFIIEβ（Transcription factor, TFIIEβサブユ
ニット）遺伝子、GSR(Glutathione S-reductase）遺伝
子、WS-2遺伝子及び PP2Aβ（Protein phosphatase 2A
βサブユニット) 遺伝子である。多数の下向きの矢印
（↓）が示す影付きのバーは、ヒトゲノムDNAを概略図
として示したものである。尺度線と該概略図との間に記
載された記号（例えば D8S1055、D8S339等）は、これま
でに知られているSTS（Sequence Tagged Sequence）マ
ーカーであり、それらのおおよその位置を示している。
ヒトゲノムDNAの概略図の下に記載された多数の短い実
線は、遺伝子物理地図を構築しているP1あるいはPAC由
来のDNAであり、本発明者らの便宜のための番号（例え
ば PAC由来の #6207）が付してある。
【００１１】括弧内の数字は、それぞれのDNAのおおよ
その大きさ（例えば、#2587 では65Kb）を示している。
これらのDNAの末端にあるオープンスクエア（□）及び
オープンダイヤモンド（◇）の記号は、DNAの方向を決
めるためにDNA 末端に連結されたプロモーターの存在を
示すものであり、それぞれ、P1/PACファージベクター中
に設置してあったSP6プロモーター及びT7プロモーター
を意味する。また、「●」は各P1/PACクローンにSTS
が、「○」は各P1/PACクローンにT7、SP6 末端の塩基配
列が含まれていることが確認済であることを意味する。
その大きさ（例えば、#2587 では65Kb）を示している。
これらのDNAの末端にあるオープンスクエア（□）及び
オープンダイヤモンド（◇）の記号は、DNAの方向を決
めるためにDNA 末端に連結されたプロモーターの存在を
示すものであり、それぞれ、P1/PACファージベクター中
に設置してあったSP6プロモーター及びT7プロモーター
を意味する。また、「●」は各P1/PACクローンにSTS
が、「○」は各P1/PACクローンにT7、SP6 末端の塩基配
列が含まれていることが確認済であることを意味する。
【００１２】WS-3遺伝子がWSの原因遺伝子そのものであ
るか否かは、ウェルナー症患者及び健常人の線維芽細胞
から得られた全RNA を用いて、WS-3 cDNA クローンをプ
ローブとして行うノーザンブロット解析により判断する
ことができる。ノーザンブロット解析の結果、両者に於
いてmRNAのサイズ・発現量に差が認められなかったが
（図５及び表11）、個体レベルにおいて、この遺伝子が
ウェルナー症候群の原因となっているかどうかを調べる
ことが必要であり、今後の研究が待たれる。
るか否かは、ウェルナー症患者及び健常人の線維芽細胞
から得られた全RNA を用いて、WS-3 cDNA クローンをプ
ローブとして行うノーザンブロット解析により判断する
ことができる。ノーザンブロット解析の結果、両者に於
いてmRNAのサイズ・発現量に差が認められなかったが
（図５及び表11）、個体レベルにおいて、この遺伝子が
ウェルナー症候群の原因となっているかどうかを調べる
ことが必要であり、今後の研究が待たれる。
【００１３】以上に述べた結果は、ＷＳ領域内に存在す
る他の遺伝子由来のmRNA、例えばプロテインフォスファ
ターゼmRNA(PP2A β）、グルタチオン-S- レダクターゼ
(GSR) mRNA、Transcription factor TFIIEβ(TFIIEβ)
mRNAを検出する各種プローブを用いたノーザンブロット
解析でも同様であり、いずれの mRNA の鎖長・発現量に
関してもウェルナー症患と健常人の両者に於いて相異は
なかった。
る他の遺伝子由来のmRNA、例えばプロテインフォスファ
ターゼmRNA(PP2A β）、グルタチオン-S- レダクターゼ
(GSR) mRNA、Transcription factor TFIIEβ(TFIIEβ)
mRNAを検出する各種プローブを用いたノーザンブロット
解析でも同様であり、いずれの mRNA の鎖長・発現量に
関してもウェルナー症患と健常人の両者に於いて相異は
なかった。
【００１４】ヒトWS-3遺伝子が各種臓器に於てどのよう
に発現しているかを調べる多組織ノーザンブロット(mul
ti-Tissue Northern Blot)解析については〔実施例６〕
に示されている（図５Ａ）。この結果から、WS-3遺伝子
は、心臓、骨格筋及び膵臓に於て強く発現し、脳、胎
盤、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵
巣、小腸、大腸において中程度に発現し、末梢リンパ球
に於ては、僅かしか発現していないことがわかった。
に発現しているかを調べる多組織ノーザンブロット(mul
ti-Tissue Northern Blot)解析については〔実施例６〕
に示されている（図５Ａ）。この結果から、WS-3遺伝子
は、心臓、骨格筋及び膵臓に於て強く発現し、脳、胎
盤、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵
巣、小腸、大腸において中程度に発現し、末梢リンパ球
に於ては、僅かしか発現していないことがわかった。
【００１５】以上の結果を総合すると、WS-3遺伝子は、
種を越えて比較的良く保存され（図４C 及び図４D)、か
つ、ヒトのさまざまな組織において高い発現が認められ
たことから（図５Ａ）、生体の基本的な恒常性の維持に
関わる未知の構成成分をコードしている遺伝子の一つで
あることが強く示唆され、この遺伝子の発現制御を解明
することは、生体の恒常性維持を司るメカニズムを解明
するうえで有用であり、また、生命の基本的な恒常性を
維持するための新規医薬品の創製にも有用であると共
に、ウェルナー症候群病発症との関連を解明するための
研究にも有用である本発明のWS-3遺伝子は、例えば以下
のようにして同定し取得することができる。I. ゲノム
DNA及びRNAの調製 (1) 細胞サンプルの収集とゲノム DNA調製 ヒト血液リンパ球からのゲノム DNA調製は、Molecular
Cloning (Sanbrook, Fritschand Maniatis, Cold Sprin
g Harbor 出版) に記載された方法により行うことがで
きる。まず、新鮮な血液を、 Sucrose、Tris-HCl緩衝液
(pH 7.5)、 MgCl2 及び１％ Triton X-100 を含む溶液
と混合して溶血し、氷上に静置後遠心し、リンパ球を含
むペレット画分を得る。このペレットをNaCl及びEDTAを
含む溶液に懸濁し、プロテイナーゼ K、５％ SDS及びTr
is-HCl緩衝液(pH8.0) を加え、37℃で一晩インキュベー
トする。この後、５mlからなる１容のフェノールと１容
のクロロホルム−イソアミルアルコール（24：１）の混
液とを加え、静かに回しながらゲノムDNAの抽出を行
う。遠心後上清画分を分取し、フェノール／クロロホル
ムによる抽出を繰り返す。遠心分離により得られる上清
に、20％容の３M 酢酸ナトリウム液（pH 5.2）を加え、
更に2.5倍容のエタノールを加え、ゲノムDNAを析出させ
る。綿状のDNAをガラスパスツールピペットで巻取り、1
0mM Tris-HCl (pH 8.0)及び0.2mM EDTAを含む1.25mlの
バッファーに溶かす。
種を越えて比較的良く保存され（図４C 及び図４D)、か
つ、ヒトのさまざまな組織において高い発現が認められ
たことから（図５Ａ）、生体の基本的な恒常性の維持に
関わる未知の構成成分をコードしている遺伝子の一つで
あることが強く示唆され、この遺伝子の発現制御を解明
することは、生体の恒常性維持を司るメカニズムを解明
するうえで有用であり、また、生命の基本的な恒常性を
維持するための新規医薬品の創製にも有用であると共
に、ウェルナー症候群病発症との関連を解明するための
研究にも有用である本発明のWS-3遺伝子は、例えば以下
のようにして同定し取得することができる。I. ゲノム
DNA及びRNAの調製 (1) 細胞サンプルの収集とゲノム DNA調製 ヒト血液リンパ球からのゲノム DNA調製は、Molecular
Cloning (Sanbrook, Fritschand Maniatis, Cold Sprin
g Harbor 出版) に記載された方法により行うことがで
きる。まず、新鮮な血液を、 Sucrose、Tris-HCl緩衝液
(pH 7.5)、 MgCl2 及び１％ Triton X-100 を含む溶液
と混合して溶血し、氷上に静置後遠心し、リンパ球を含
むペレット画分を得る。このペレットをNaCl及びEDTAを
含む溶液に懸濁し、プロテイナーゼ K、５％ SDS及びTr
is-HCl緩衝液(pH8.0) を加え、37℃で一晩インキュベー
トする。この後、５mlからなる１容のフェノールと１容
のクロロホルム−イソアミルアルコール（24：１）の混
液とを加え、静かに回しながらゲノムDNAの抽出を行
う。遠心後上清画分を分取し、フェノール／クロロホル
ムによる抽出を繰り返す。遠心分離により得られる上清
に、20％容の３M 酢酸ナトリウム液（pH 5.2）を加え、
更に2.5倍容のエタノールを加え、ゲノムDNAを析出させ
る。綿状のDNAをガラスパスツールピペットで巻取り、1
0mM Tris-HCl (pH 8.0)及び0.2mM EDTAを含む1.25mlの
バッファーに溶かす。
【００１６】ヒト胎盤組織からのゲノムDNAの精製は、
健常人妊婦より得た新鮮な胎盤をドライアイス上で凍結
させ、スライサーを用いて極く薄い切片にするか、又は
細粉したものを材料として用いて行う。細かくした凍結
胎盤破片から、Gross-Bellardらの方法［Eur. J. Bioch
em. 36, 32-38 (1973)］に従ってゲノムDNAを抽出・精
製する。
健常人妊婦より得た新鮮な胎盤をドライアイス上で凍結
させ、スライサーを用いて極く薄い切片にするか、又は
細粉したものを材料として用いて行う。細かくした凍結
胎盤破片から、Gross-Bellardらの方法［Eur. J. Bioch
em. 36, 32-38 (1973)］に従ってゲノムDNAを抽出・精
製する。
【００１７】(2) 細胞株の確立及び全RNAの調製 臨床診断的に認定されたウェルナー症患者 (以下、WS患
者と記す) からバイオプシーにより得られる皮膚組織切
片をもとにＷＳ繊維芽細胞株を確立し、全RNA及びpoly
A+ 含有mRNA（以下 poly A+ mRNA と記す) を精製す
る。同様にして、健常人皮膚組織切片からの健常人繊維
芽細胞株の確立と共にRNAを精製する。
者と記す) からバイオプシーにより得られる皮膚組織切
片をもとにＷＳ繊維芽細胞株を確立し、全RNA及びpoly
A+ 含有mRNA（以下 poly A+ mRNA と記す) を精製す
る。同様にして、健常人皮膚組織切片からの健常人繊維
芽細胞株の確立と共にRNAを精製する。
【００１８】mRNAの調製は、以下の方法で行う。WS患者
又は健常人由来の培養ヒト繊維芽細胞をトリプシンによ
りペトリ皿からはがし、PBS で十分に洗浄後、６M グア
ニジウムチオシアネート溶液中でホモジナイズし、Chir
gwinらの方法［Biochemistry18, 5294-9299 (1979)］に
従い、塩化セシウム平衡密度勾配遠心法により全RNAを
沈殿として分離する。分離後、フェノール抽出、エタノ
ール沈殿等により全RNAを精製する。polyA+ mRNA 群を
得る場合には、全RNAにオリゴ(dT)を共有結合で表層に
もつラテックス粒子、オリゴテックス(dT)-30(宝酒造社
製)を加え、Kuribayashi-Ohtaらの方法［Biochem. Biop
hys. Acata. 1156, 204-112 (1993)］に従い、バッチ法
によるアフィニティクロマトグラフィーにより精製す
る。
又は健常人由来の培養ヒト繊維芽細胞をトリプシンによ
りペトリ皿からはがし、PBS で十分に洗浄後、６M グア
ニジウムチオシアネート溶液中でホモジナイズし、Chir
gwinらの方法［Biochemistry18, 5294-9299 (1979)］に
従い、塩化セシウム平衡密度勾配遠心法により全RNAを
沈殿として分離する。分離後、フェノール抽出、エタノ
ール沈殿等により全RNAを精製する。polyA+ mRNA 群を
得る場合には、全RNAにオリゴ(dT)を共有結合で表層に
もつラテックス粒子、オリゴテックス(dT)-30(宝酒造社
製)を加え、Kuribayashi-Ohtaらの方法［Biochem. Biop
hys. Acata. 1156, 204-112 (1993)］に従い、バッチ法
によるアフィニティクロマトグラフィーにより精製す
る。
【００１９】これらの繊維芽細胞からのmRNAは、逆転写
酵素を用いてcDNAを調製するための試料として用いるの
みならず、ＷＳ患者のある特定のmRNAが質的（サイズ及
びファミリーの存在）及び量的（発現量及びコピー数）
に健常人と比較して変動しているか否かをノーザンブロ
ット解析する際の試料としても用いることができる。 II. 遺伝子物理地図の構築 (1) P1/PACファージライブラリーの構築 P1/PACファージライブラリーの作製及びP1/PACクローン
の遺伝子物理地図作製のため、ヒトDNA断片を含むP1/PA
CファージDNAを、特異的な配列を持つ DNAプライマーを
用いたPCR法によりP1/PACファージライブラリーから選
別する。なお、P1/PACとは、巨大な遺伝子領域を迅速に
かつ精度高く解析するため、λファージ系（10〜20kb)
よりも大きく、YAC(１〜２Mb)とコスミド(20 〜40kb)
の中間サイズのDNA(80〜150kb)をクローン化できる系と
して開発されたファージ・クローニングベクターをい
う。
酵素を用いてcDNAを調製するための試料として用いるの
みならず、ＷＳ患者のある特定のmRNAが質的（サイズ及
びファミリーの存在）及び量的（発現量及びコピー数）
に健常人と比較して変動しているか否かをノーザンブロ
ット解析する際の試料としても用いることができる。 II. 遺伝子物理地図の構築 (1) P1/PACファージライブラリーの構築 P1/PACファージライブラリーの作製及びP1/PACクローン
の遺伝子物理地図作製のため、ヒトDNA断片を含むP1/PA
CファージDNAを、特異的な配列を持つ DNAプライマーを
用いたPCR法によりP1/PACファージライブラリーから選
別する。なお、P1/PACとは、巨大な遺伝子領域を迅速に
かつ精度高く解析するため、λファージ系（10〜20kb)
よりも大きく、YAC(１〜２Mb)とコスミド(20 〜40kb)
の中間サイズのDNA(80〜150kb)をクローン化できる系と
して開発されたファージ・クローニングベクターをい
う。
【００２０】P1/PACファージライブラリーには、Smolle
r ら［Chromosoma 100, 487-494 (1991)］又は田代ら
（実験医学別冊「ゲノムのマッピングとシークエンス解
析法」，バイオマニュアルシリーズ６，1994年、羊土
社）によって作製法が記載されているGenome System 社
製（8620 Pennell Dr. St. Louis, Missouri, USA)のも
のを用いることができる。
r ら［Chromosoma 100, 487-494 (1991)］又は田代ら
（実験医学別冊「ゲノムのマッピングとシークエンス解
析法」，バイオマニュアルシリーズ６，1994年、羊土
社）によって作製法が記載されているGenome System 社
製（8620 Pennell Dr. St. Louis, Missouri, USA)のも
のを用いることができる。
【００２１】本発明者らがWS領域を迅速かつ高精度に解
析するクローニングシステムとしてP1/PACファージを選
択したのは、(a) 大腸菌を宿主とするためクローン化 D
NAの回収が容易であり、また組み込まれたDNAが安定で
あるという利点、(b) Sp6 及びT7プロモーター配列が配
置されている（コンティグ作製やウォーキングの際、イ
ンサートDNAの両末端の塩基配列を読む必要が生じるの
であるが、Sp6及びT7プロモーターは、これを可能とす
る）という利点、(c) 宿主である大腸菌に感染したファ
ージDNAは、以降通常のプラスミドとして取り扱える上
に、通常のコロニーハイブリダイゼーション法が利用で
きるという優れた特徴を持っていることによる。
析するクローニングシステムとしてP1/PACファージを選
択したのは、(a) 大腸菌を宿主とするためクローン化 D
NAの回収が容易であり、また組み込まれたDNAが安定で
あるという利点、(b) Sp6 及びT7プロモーター配列が配
置されている（コンティグ作製やウォーキングの際、イ
ンサートDNAの両末端の塩基配列を読む必要が生じるの
であるが、Sp6及びT7プロモーターは、これを可能とす
る）という利点、(c) 宿主である大腸菌に感染したファ
ージDNAは、以降通常のプラスミドとして取り扱える上
に、通常のコロニーハイブリダイゼーション法が利用で
きるという優れた特徴を持っていることによる。
【００２２】(2) P1/PACファージクローンのスクリーニ
ング P1/PACファージクローンのスクリーニングは、Smoller
ら［Chromosoma 100, 487-494 (1991)］に記載された方
法により行う。すなわち、ナイロン膜上、P1/PACファー
ジが感染した大腸菌を広げ、培養を行い、１mM イソプ
ロピル-1-チオ-b-D-ガラクトプラノシド (以下、IPTGと
記す) 及び25 mg/mlのカナマイシンを含むLBプレート上
で37℃で６時間培養し、P1/PACファージの大腸菌あたり
のコピー数を増幅させる。この後、フィルター上の大腸
菌を常法に従い溶菌させると共に、ファージDNA を含む
２本鎖DNAをアルカリ変性させて１本鎖DNAとし、このDN
AをUV照射又は加熱によりナイロン膜上に固定させる。
目的とするP1/PACファージクローンを得るために、放射
性リン酸[32P]で標試したDNAプローブをランダムヘキサ
マー反応[Feinberg and Vogelstein, Addendum.Anal. B
iochem. 137, 266-267(1984)]やPCR法により調製し、こ
れを用いたハイブリダイゼーションにより目的とするP1
/PACクローンを選別・単離する。
ング P1/PACファージクローンのスクリーニングは、Smoller
ら［Chromosoma 100, 487-494 (1991)］に記載された方
法により行う。すなわち、ナイロン膜上、P1/PACファー
ジが感染した大腸菌を広げ、培養を行い、１mM イソプ
ロピル-1-チオ-b-D-ガラクトプラノシド (以下、IPTGと
記す) 及び25 mg/mlのカナマイシンを含むLBプレート上
で37℃で６時間培養し、P1/PACファージの大腸菌あたり
のコピー数を増幅させる。この後、フィルター上の大腸
菌を常法に従い溶菌させると共に、ファージDNA を含む
２本鎖DNAをアルカリ変性させて１本鎖DNAとし、このDN
AをUV照射又は加熱によりナイロン膜上に固定させる。
目的とするP1/PACファージクローンを得るために、放射
性リン酸[32P]で標試したDNAプローブをランダムヘキサ
マー反応[Feinberg and Vogelstein, Addendum.Anal. B
iochem. 137, 266-267(1984)]やPCR法により調製し、こ
れを用いたハイブリダイゼーションにより目的とするP1
/PACクローンを選別・単離する。
【００２３】(3) P1/PAC DNAの調製 P1/PACファージクローンからのDNAの回収と精製は、Smo
llerら［Chromosoma 100, 487-494 (1991)］によって記
載された方法に少し変法を加えて行った。詳細は〔実施
例１〕に記す。
llerら［Chromosoma 100, 487-494 (1991)］によって記
載された方法に少し変法を加えて行った。詳細は〔実施
例１〕に記す。
【００２４】(4) P1/PAC DNA末端部位の塩基配列の決定 P1/PAC DNAをオーバーラップさせつつ整列させ、遺伝子
物理地図を完成させるため、各P1/PAC DNAクローン中に
挿入されているインサートDNAの両末端部位の塩基配列
を決定する。塩基配列の決定は、Hattori ら［Electrop
horesis 13, 560-565 (1992)］により記載されたPCRを
ベースにした方法により行う。すなわち、P1/PACベクタ
ーに存在するSP6及びT7プロモーターに結合する二種の
プライマー [SP6側プライマー (配列番号５) とT7側プ
ライマー (配列番号６)]を用い、蛍光ダイデオキシター
ミネーターを含有するPRISM Sequenceing Kit (Perkin
Elmer 社製) を使って反応を行い、Applied Biosystem
社製のオートシークエンサー（model ABI 373）を用い
てPCR 反応後の遺伝子断片の塩基配列を読み取り、附属
のMacintosh コンピューターによりデータの解析を行
う。
物理地図を完成させるため、各P1/PAC DNAクローン中に
挿入されているインサートDNAの両末端部位の塩基配列
を決定する。塩基配列の決定は、Hattori ら［Electrop
horesis 13, 560-565 (1992)］により記載されたPCRを
ベースにした方法により行う。すなわち、P1/PACベクタ
ーに存在するSP6及びT7プロモーターに結合する二種の
プライマー [SP6側プライマー (配列番号５) とT7側プ
ライマー (配列番号６)]を用い、蛍光ダイデオキシター
ミネーターを含有するPRISM Sequenceing Kit (Perkin
Elmer 社製) を使って反応を行い、Applied Biosystem
社製のオートシークエンサー（model ABI 373）を用い
てPCR 反応後の遺伝子断片の塩基配列を読み取り、附属
のMacintosh コンピューターによりデータの解析を行
う。
【００２５】(5) Dual-color FISH 分析による各P1/PAC
DNAクローンのWS領域への帰属 FISHとは、細胞核に蛍光標識をしたDNAプローブをハイ
ブリダイズさせ、細胞核上でそのDNAの位置を目に見え
る形で検出する方法である。標本としては、分裂間期又
は染色体がはっきり見える分裂中期の細胞が用いられ
る。
DNAクローンのWS領域への帰属 FISHとは、細胞核に蛍光標識をしたDNAプローブをハイ
ブリダイズさせ、細胞核上でそのDNAの位置を目に見え
る形で検出する方法である。標本としては、分裂間期又
は染色体がはっきり見える分裂中期の細胞が用いられ
る。
【００２６】分裂中期の細胞は次の手順で得ることがで
きる。末梢血細胞をフィトヘムアグルチニン（PHA)で刺
激して細胞分裂を促進し、コルセミドを用いて分裂中期
で分裂を停止させる。細胞は酢酸/メタノール溶液で固
定した後に、スライドグラスの上に広げる。スライドグ
ラス上の標本はホルムアミドと SSC [Standard Saline
Citrate; 0.15M NaCl, 0.015M Sodium Citrate (pH 7.
0)]により変性させる。次に、ジゴキシゲニン又はビオ
チンで標識したDNAプローブを反応させると、この標識D
NAは標本とハイブリダイズする。次に、ロダミン標識し
た抗ジゴキシゲニン抗体又は FITC-標識アビジンなどで
処理して蛍光標識すると、DNAプローブがハイブリダイ
ズした位置をロダミンについては赤色、FITCについては
緑色のシグナルとして見ることができる。
きる。末梢血細胞をフィトヘムアグルチニン（PHA)で刺
激して細胞分裂を促進し、コルセミドを用いて分裂中期
で分裂を停止させる。細胞は酢酸/メタノール溶液で固
定した後に、スライドグラスの上に広げる。スライドグ
ラス上の標本はホルムアミドと SSC [Standard Saline
Citrate; 0.15M NaCl, 0.015M Sodium Citrate (pH 7.
0)]により変性させる。次に、ジゴキシゲニン又はビオ
チンで標識したDNAプローブを反応させると、この標識D
NAは標本とハイブリダイズする。次に、ロダミン標識し
た抗ジゴキシゲニン抗体又は FITC-標識アビジンなどで
処理して蛍光標識すると、DNAプローブがハイブリダイ
ズした位置をロダミンについては赤色、FITCについては
緑色のシグナルとして見ることができる。
【００２７】ビオチンを標識したWS-3遺伝子を含むPAC
クローンDNA（#6207)のプローブを、細胞分裂中期のヒ
ト末梢血リンパ球細胞の標本にハイブリダイズした。そ
の後、蛍光色素（FITC）標識したアビジンでこの標本を
染色した。図３中の番号１に示すように、FITCのシグナ
ルは、第８染色体のセントロメアを特異的に染める標準
DNAプローブ (ロダミン標識；番号２で示す) の近傍の
短腕部分に存在する。従って、WS-3遺伝子を含むPACク
ローンDNAは、第８染色体短腕部分に存在することが分
かった。
クローンDNA（#6207)のプローブを、細胞分裂中期のヒ
ト末梢血リンパ球細胞の標本にハイブリダイズした。そ
の後、蛍光色素（FITC）標識したアビジンでこの標本を
染色した。図３中の番号１に示すように、FITCのシグナ
ルは、第８染色体のセントロメアを特異的に染める標準
DNAプローブ (ロダミン標識；番号２で示す) の近傍の
短腕部分に存在する。従って、WS-3遺伝子を含むPACク
ローンDNAは、第８染色体短腕部分に存在することが分
かった。
【００２８】III. エキソントラッピング法によるcDNA
エキソンの調製 (1) エキソントラッピング法 WS遺伝子領域をカバーする遺伝子物理地図を作成した
後、この遺伝子物理地図を構成するP1/PAC DNAからエキ
ソントラッピング法により直接エキソン部分が単離され
る。詳細については〔実施例２〕に記す。決定された塩
基配列については、既存の遺伝子に該当するものの有
無、又は既存の遺伝子と相同配列を持つものの有無をデ
ータバンクで検索する。
エキソンの調製 (1) エキソントラッピング法 WS遺伝子領域をカバーする遺伝子物理地図を作成した
後、この遺伝子物理地図を構成するP1/PAC DNAからエキ
ソントラッピング法により直接エキソン部分が単離され
る。詳細については〔実施例２〕に記す。決定された塩
基配列については、既存の遺伝子に該当するものの有
無、又は既存の遺伝子と相同配列を持つものの有無をデ
ータバンクで検索する。
【００２９】(2) エキソンジョイニング エキソントラッピング法によって得られたエキソンの断
片の長さは、数十bp〜400bpの範囲であり、平均200bp
前後である。この大きさでは、cDNAのクローニング、サ
ザンブロット、ノーザンブロット法など種々の解析をす
るには短いため、エキソン同士をPCRを用いて連結する
工夫を行う。
片の長さは、数十bp〜400bpの範囲であり、平均200bp
前後である。この大きさでは、cDNAのクローニング、サ
ザンブロット、ノーザンブロット法など種々の解析をす
るには短いため、エキソン同士をPCRを用いて連結する
工夫を行う。
【００３０】エキソンの連結については、エキソントラ
ッピング法によって得られた各エキソンのプライマーを
選んで、RT-PCRによって作製したcDNAをテンプレートと
して、一組のFP（センス配列：フォワードプライマー）
とRP（ノンセンス配列：リバースプライマー) を用いて
PCR を行う。すなわち、それぞれのエキソン部分の配列
に対してセンス鎖及びアンチセンス（ノンセンス）鎖の
配列からなる20塩基程度のプライマーを作製し、連結の
対象となる２種類のエキソンの一方をセンス鎖プライマ
ー、他方をアンチセンス鎖プライマーとして任意に選択
し、PCR を行うことにより連結することができる。
ッピング法によって得られた各エキソンのプライマーを
選んで、RT-PCRによって作製したcDNAをテンプレートと
して、一組のFP（センス配列：フォワードプライマー）
とRP（ノンセンス配列：リバースプライマー) を用いて
PCR を行う。すなわち、それぞれのエキソン部分の配列
に対してセンス鎖及びアンチセンス（ノンセンス）鎖の
配列からなる20塩基程度のプライマーを作製し、連結の
対象となる２種類のエキソンの一方をセンス鎖プライマ
ー、他方をアンチセンス鎖プライマーとして任意に選択
し、PCR を行うことにより連結することができる。
【００３１】例えば、２種類のエキソンの一方をエキソ
ンＡ、他方をエキソンＢとし、エキソンＡとエキソンＢ
とが本来ＡＢの順で整列しているとすると、エキソンＡ
に対応するPCR 産物（センスプライマーを用いて合成さ
れたDNA 断片であるとする)の3'末端に、エキソンＢに
対応するPCR 産物（アンチセンスプライマーを用いて合
成されたDNA 断片であるとする) の5'末端が連結し、本
来のＡＢの順に整列するエキソンが得られる。このよう
にして、二つ以上のエキソンにまたがるPCR産物を得る
ことができる。
ンＡ、他方をエキソンＢとし、エキソンＡとエキソンＢ
とが本来ＡＢの順で整列しているとすると、エキソンＡ
に対応するPCR 産物（センスプライマーを用いて合成さ
れたDNA 断片であるとする)の3'末端に、エキソンＢに
対応するPCR 産物（アンチセンスプライマーを用いて合
成されたDNA 断片であるとする) の5'末端が連結し、本
来のＡＢの順に整列するエキソンが得られる。このよう
にして、二つ以上のエキソンにまたがるPCR産物を得る
ことができる。
【００３２】(3) 塩基配列の決定 塩基配列の決定は、Hattoriら［Electrophoresis 13, 5
60-565 (1992)］により記載されたPCR をベースにした
方法により行うことができる。Perkin Elmer社製の蛍光
ダイデオキシターミネーターを含有する PRISM Sequenc
eing Kitを使って反応を行い、Applied Biosystems社製
のオートシークエンサー (モデル ABI 373) で塩基配列
を読み取り、附属のMacintoshコンピューターによりデ
ータの解析を行う。詳細については〔実施例３〕に記
す。
60-565 (1992)］により記載されたPCR をベースにした
方法により行うことができる。Perkin Elmer社製の蛍光
ダイデオキシターミネーターを含有する PRISM Sequenc
eing Kitを使って反応を行い、Applied Biosystems社製
のオートシークエンサー (モデル ABI 373) で塩基配列
を読み取り、附属のMacintoshコンピューターによりデ
ータの解析を行う。詳細については〔実施例３〕に記
す。
【００３３】IV. TAIL-PCR法によるエキソンの伸長 WS領域の遺伝子物理地図を構成するP1/PAC DNAから、エ
キソントラッピング法により直接エキソン部分を単離す
る事が可能であるが、この方法によって得られた各エキ
ソン断片の長さは、数十bpから400bpの範囲で、平均200
bp前後である。通常、この大きさでは、cDNAのクローニ
ング、サザンブロッティングなど種々の解析には小さす
ぎるため、より長いcDNA断片を得ることが必要となる。
そこで、より長いcDNA断片を得るため、各エキソンのプ
ライマー同士の組み合わせでPCRを行う前記エキソンジ
ョイニング法(III-(2)参照) やTAIL-PCR法を試みる。TA
IL-PCR法は、従来のRACE法と比較し簡便で、種々のcDNA
クローンを 5' 側あるいは3' 側に、より長く、正確に
伸長させることができる方法である。その詳細について
は〔実施例３〕に記す。
キソントラッピング法により直接エキソン部分を単離す
る事が可能であるが、この方法によって得られた各エキ
ソン断片の長さは、数十bpから400bpの範囲で、平均200
bp前後である。通常、この大きさでは、cDNAのクローニ
ング、サザンブロッティングなど種々の解析には小さす
ぎるため、より長いcDNA断片を得ることが必要となる。
そこで、より長いcDNA断片を得るため、各エキソンのプ
ライマー同士の組み合わせでPCRを行う前記エキソンジ
ョイニング法(III-(2)参照) やTAIL-PCR法を試みる。TA
IL-PCR法は、従来のRACE法と比較し簡便で、種々のcDNA
クローンを 5' 側あるいは3' 側に、より長く、正確に
伸長させることができる方法である。その詳細について
は〔実施例３〕に記す。
【００３４】V. MarathonTTM cDNA Amplification Kit
を用いたWS-3 cDNA のクローニング このキットは、Long-distance (LD) PCR法と Suppressi
on PCR法の２つの原理に基づいてRACE (Rapid Amplific
ation of cDNA Ends) を行い、既知の部分配列から、未
知の 5'-, 3'- 両端を含む配列を増幅し、さらに、それ
らの融合によって完全長のcDNAを得ることを可能にす
る。
を用いたWS-3 cDNA のクローニング このキットは、Long-distance (LD) PCR法と Suppressi
on PCR法の２つの原理に基づいてRACE (Rapid Amplific
ation of cDNA Ends) を行い、既知の部分配列から、未
知の 5'-, 3'- 両端を含む配列を増幅し、さらに、それ
らの融合によって完全長のcDNAを得ることを可能にす
る。
【００３５】まず、アダプターを連結したした鋳型二本
鎖cDNAとアダプタープライマー (AP) 、遺伝子特異的プ
ライマー (GSP)を利用してLD PCRを行い、5'- 及び3'-
端をそれぞれ含む断片を増幅する。その際、AP-1は、ア
ダプターの突出末端と同じ配列を持つため、アダプター
にはアニーリングせず、一回目の増幅では、GSP からの
み伸長する(Suppression PCR)。次に、5'- 及び3'- 端
をそれぞれ含む２種類の断片(5'-及び3'- RACE産物) を
熱変性により一旦一本鎖cDNAにした後、オーバーラップ
している構造をアニーリングさせることで、5'- 及び
3'-RACE産物を融合させる。相補鎖を合成した後、これ
を鋳型として今度は、APと poly A -tailの部分にあら
かじめ組み込まれているcDNA合成プライマー (CDS)によ
って、LD PCRを行うことにより、最終的に、5'- 及び3'
- 両端を含む完全長の cDNA を得ることができる。詳細
については〔実施例４〕に記す。
鎖cDNAとアダプタープライマー (AP) 、遺伝子特異的プ
ライマー (GSP)を利用してLD PCRを行い、5'- 及び3'-
端をそれぞれ含む断片を増幅する。その際、AP-1は、ア
ダプターの突出末端と同じ配列を持つため、アダプター
にはアニーリングせず、一回目の増幅では、GSP からの
み伸長する(Suppression PCR)。次に、5'- 及び3'- 端
をそれぞれ含む２種類の断片(5'-及び3'- RACE産物) を
熱変性により一旦一本鎖cDNAにした後、オーバーラップ
している構造をアニーリングさせることで、5'- 及び
3'-RACE産物を融合させる。相補鎖を合成した後、これ
を鋳型として今度は、APと poly A -tailの部分にあら
かじめ組み込まれているcDNA合成プライマー (CDS)によ
って、LD PCRを行うことにより、最終的に、5'- 及び3'
- 両端を含む完全長の cDNA を得ることができる。詳細
については〔実施例４〕に記す。
【００３６】VI. cDNAクローンの解析 (1) サザンブロットによる解析 サザンブロットとは、制限酵素などによって切断したDN
A断片の中から目的とする遺伝子を検出することを目的
とする手法である。まず、DNA断片をアガロース・ゲル
の電気泳動でサイズの違いに従い分離する。次に、アル
カリ及び塩によってDNAを変性させ、ニトロセルロース
・フィルターに移す。このフィルターを [32P]で標識し
たプローブとハイブリダイズさせ、フィルターをオート
ラジオグラフィーにかける。その結果、ハイブリダイズ
したDNA 断片が検出される。この方法を用いることで、
遺伝子数（コピー数）、ファミリーの存在等を知ること
ができる。プローブとしては、TAIL-PCR法で得られたDN
A又はそれをもとにMarathon Kitを用いて得られた完全
長cDNAが用いられる。詳細については [実施例５] に記
す。
A断片の中から目的とする遺伝子を検出することを目的
とする手法である。まず、DNA断片をアガロース・ゲル
の電気泳動でサイズの違いに従い分離する。次に、アル
カリ及び塩によってDNAを変性させ、ニトロセルロース
・フィルターに移す。このフィルターを [32P]で標識し
たプローブとハイブリダイズさせ、フィルターをオート
ラジオグラフィーにかける。その結果、ハイブリダイズ
したDNA 断片が検出される。この方法を用いることで、
遺伝子数（コピー数）、ファミリーの存在等を知ること
ができる。プローブとしては、TAIL-PCR法で得られたDN
A又はそれをもとにMarathon Kitを用いて得られた完全
長cDNAが用いられる。詳細については [実施例５] に記
す。
【００３７】(2) ノーザンブロットによる解析 ノーザンブロットとは、RNAの混合物の中から特定のRNA
を検出するための手法であり、また、目的のRNA のサイ
ズ及び量を検出することを目的として使用される手法で
ある。細胞又は組織からのRNAの抽出は高濃度グアニジ
ンチオシアネートを用いて行い、フェノール/クロロフ
ォルムで除蛋白したのち、アルコール沈殿でRNAを精製
する。アガロースゲル電気泳動でRNAをサイズの違いで
分画し、アルカリ及び塩により変性させる。次に、ニト
ロセルロース・フィルターに移し、[32P]でラベルしたc
DNAプローブとハイブリダイズさせる。オートラジオグ
ラフィーで感光させ、プローブとハイブリダイズした目
的のRNAを検出する。
を検出するための手法であり、また、目的のRNA のサイ
ズ及び量を検出することを目的として使用される手法で
ある。細胞又は組織からのRNAの抽出は高濃度グアニジ
ンチオシアネートを用いて行い、フェノール/クロロフ
ォルムで除蛋白したのち、アルコール沈殿でRNAを精製
する。アガロースゲル電気泳動でRNAをサイズの違いで
分画し、アルカリ及び塩により変性させる。次に、ニト
ロセルロース・フィルターに移し、[32P]でラベルしたc
DNAプローブとハイブリダイズさせる。オートラジオグ
ラフィーで感光させ、プローブとハイブリダイズした目
的のRNAを検出する。
【００３８】この方法により、プローブに用いたcDNAの
配列に対応するmRNAが検出され、かつ目的の遺伝子の完
全長のサイズ、及び相対的な発現量を知ることができ
る。プローブとしては、TAIL-PCR法で得られたcDNA断片
又はそれをもとにMarathon cDNA Kit を用いて得られた
完全長cDNAが用いられる。詳細については〔実施例６〕
に記す。
配列に対応するmRNAが検出され、かつ目的の遺伝子の完
全長のサイズ、及び相対的な発現量を知ることができ
る。プローブとしては、TAIL-PCR法で得られたcDNA断片
又はそれをもとにMarathon cDNA Kit を用いて得られた
完全長cDNAが用いられる。詳細については〔実施例６〕
に記す。
【００３９】VII. 形質転換体の作製 精製された遺伝子を、適当なベクター DNAの制限酵素部
位又はマルチクローニングサイトに挿入して組換え体DN
Aを作成し、当該組換え体DNAを用いて、宿主細胞を形質
転換する。DNA 断片を挿入するためのベクター DNAは、
宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例
えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。宿
主細胞が大腸菌である場合は、プラスミド pUC118 （宝
酒造社製）、pUC119（宝酒造社製）、pBluescript SK+
(Stratagene社製)、pGEM-T(Promega社製) 等が使用でき
る。
位又はマルチクローニングサイトに挿入して組換え体DN
Aを作成し、当該組換え体DNAを用いて、宿主細胞を形質
転換する。DNA 断片を挿入するためのベクター DNAは、
宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例
えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。宿
主細胞が大腸菌である場合は、プラスミド pUC118 （宝
酒造社製）、pUC119（宝酒造社製）、pBluescript SK+
(Stratagene社製)、pGEM-T(Promega社製) 等が使用でき
る。
【００４０】宿主細胞としては、真核細胞及び原核細胞
のいずれをも用いることができる。真核細胞としては動
物、酵母等の細胞が、原核細胞としては大腸菌等が挙げ
られる。例えば、大腸菌XL1-Blue（Stratagene社製）、
JM109（宝酒造社製）等を用いることができる。
のいずれをも用いることができる。真核細胞としては動
物、酵母等の細胞が、原核細胞としては大腸菌等が挙げ
られる。例えば、大腸菌XL1-Blue（Stratagene社製）、
JM109（宝酒造社製）等を用いることができる。
【００４１】ベクターDNA としてプラスミド DNAを用い
る場合、例えばEcoRI DNA断片を挿入する際、プラスミ
ドDNAを制限酵素EcoRI(New England Biolab; NEB 社
製）を用いて消化し、自己連結を防ぐためCIP(calf int
estine phosphatase) 等で処理をしておく。次いで、DN
A断片と切断されたベクターDNAとを混合し、これに、例
えばT4 DNAリガーゼ（宝酒造社製）を作用させて組換え
体DNAを得る。このようにして得られた組換え体DNAを、
宿主細胞、例えば大腸菌XL1-Blue等へ形質転換すること
により、目的の遺伝子を含む遺伝子断片を保有する形質
転換体のコロニーを得ることができる。
る場合、例えばEcoRI DNA断片を挿入する際、プラスミ
ドDNAを制限酵素EcoRI(New England Biolab; NEB 社
製）を用いて消化し、自己連結を防ぐためCIP(calf int
estine phosphatase) 等で処理をしておく。次いで、DN
A断片と切断されたベクターDNAとを混合し、これに、例
えばT4 DNAリガーゼ（宝酒造社製）を作用させて組換え
体DNAを得る。このようにして得られた組換え体DNAを、
宿主細胞、例えば大腸菌XL1-Blue等へ形質転換すること
により、目的の遺伝子を含む遺伝子断片を保有する形質
転換体のコロニーを得ることができる。
【００４２】本発明では、形質転換は、例えばHanahan
の方法 [Techniques for Transformationof E. coli In
DNA Cloning, vol.1, Glover,D.M.(ed.) pp109-136, I
RL Press (1985)] により行うことができる。上記形質
転換株のスクリーニングは、目的遺伝子の一部を含む D
NA 断片をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーシ
ョン、あるいは、目的の遺伝子の塩基配列に基づいた
5' プライマー(FP)を合成し、次いで、相補鎖DNAの塩基
配列に基づいた3'プライマー (RP) を合成し、これらの
プライマーを用いたPCR法により、目的とする遺伝子を
含むコロニーを選択することができる。このようにして
本発明の遺伝子を保有する形質転換株を得ることができ
る。
の方法 [Techniques for Transformationof E. coli In
DNA Cloning, vol.1, Glover,D.M.(ed.) pp109-136, I
RL Press (1985)] により行うことができる。上記形質
転換株のスクリーニングは、目的遺伝子の一部を含む D
NA 断片をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーシ
ョン、あるいは、目的の遺伝子の塩基配列に基づいた
5' プライマー(FP)を合成し、次いで、相補鎖DNAの塩基
配列に基づいた3'プライマー (RP) を合成し、これらの
プライマーを用いたPCR法により、目的とする遺伝子を
含むコロニーを選択することができる。このようにして
本発明の遺伝子を保有する形質転換株を得ることができ
る。
【００４３】VIII. WS-3遺伝子がコードするポリペプ
チドの生産 前記のようにして得られた組換え体ＤＮＡを保有する原
核又は真核細胞を培養すれば、本発明の遺伝子がコード
するポリペプチドを生産することができる。培養方法
は、通常の固体培養法でもよいが、液体培養法を採用す
ることが好ましい。
チドの生産 前記のようにして得られた組換え体ＤＮＡを保有する原
核又は真核細胞を培養すれば、本発明の遺伝子がコード
するポリペプチドを生産することができる。培養方法
は、通常の固体培養法でもよいが、液体培養法を採用す
ることが好ましい。
【００４４】組換え微生物を培養する培地としては、例
えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス等から選ばれる１
種以上の窒素源に、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化第二鉄等の無機塩類の１種以上を添加し、
更に必要により糖質原料、抗生物質、ビタミン等を適宜
添加したものが用いられる。また、必要により培地にIP
TG等を添加して、遺伝子の発現を誘導してもよい。培養
開始時の培地のpHは7.2 〜7.4 に調節し、培養は通常36
〜38℃、好ましくは37℃前後で14〜20時間、通気攪拌培
養、振盪培養等により行う。
えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス等から選ばれる１
種以上の窒素源に、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化第二鉄等の無機塩類の１種以上を添加し、
更に必要により糖質原料、抗生物質、ビタミン等を適宜
添加したものが用いられる。また、必要により培地にIP
TG等を添加して、遺伝子の発現を誘導してもよい。培養
開始時の培地のpHは7.2 〜7.4 に調節し、培養は通常36
〜38℃、好ましくは37℃前後で14〜20時間、通気攪拌培
養、振盪培養等により行う。
【００４５】培養終了後、培養物より本発明のポリペプ
チドを採取するには、通常のタンパク質精製手段を用い
ることができる。すなわち、リゾチーム等の酵素を用い
た溶菌処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により菌体を
破壊し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを菌
体外に排出させる。次いで、濾過又は遠心分離等を用い
て不溶物を除去し、粗ポリペプチド溶液を得る。
チドを採取するには、通常のタンパク質精製手段を用い
ることができる。すなわち、リゾチーム等の酵素を用い
た溶菌処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により菌体を
破壊し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを菌
体外に排出させる。次いで、濾過又は遠心分離等を用い
て不溶物を除去し、粗ポリペプチド溶液を得る。
【００４６】上記粗ポリペプチド溶液から、該ポリペプ
チドをさらに精製するには、通常のタンパク質精製法を
使用することができる。例えば、硫安塩析法、イオン交
換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル
ろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、電気泳動法等を、単独又は適宜組み合わせるこ
とにより行う。
チドをさらに精製するには、通常のタンパク質精製法を
使用することができる。例えば、硫安塩析法、イオン交
換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル
ろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、電気泳動法等を、単独又は適宜組み合わせるこ
とにより行う。
【００４７】IX. モノクローナル抗体の作製 本発明のWS-3遺伝子がコードするポリペプチドに特異的
なモノクローナル抗体は、以下のようにして得ることが
できる。 (1) 抗原の調製 前記の方法 (VIII参照) により得られたポリペプチドを
緩衝液に溶解し、次いでアジュバントを添加する。アジ
ュバントとしては、市販のフロイント完全アジュバン
ト、フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、こ
れらの何れのものを混合してもよい。
なモノクローナル抗体は、以下のようにして得ることが
できる。 (1) 抗原の調製 前記の方法 (VIII参照) により得られたポリペプチドを
緩衝液に溶解し、次いでアジュバントを添加する。アジ
ュバントとしては、市販のフロイント完全アジュバン
ト、フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、こ
れらの何れのものを混合してもよい。
【００４８】(2) 免疫及び抗体産生細胞の採取 上記のようにして得られた免疫原を哺乳動物、例えばラ
ット、マウスなどに投与する。抗原の免疫量は１回に動
物１匹当たり、10〜500μg用いる。免疫部位は、主とし
て静脈内、皮下、腹腔内に注入する。また、免疫の間隔
は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは
１〜３週間間隔で、２〜５回、好ましくは３〜４回免疫
する。最終の免疫日から２〜７日後、好ましくは４〜５
日後に、抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞として
は、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられ
るが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
ット、マウスなどに投与する。抗原の免疫量は１回に動
物１匹当たり、10〜500μg用いる。免疫部位は、主とし
て静脈内、皮下、腹腔内に注入する。また、免疫の間隔
は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは
１〜３週間間隔で、２〜５回、好ましくは３〜４回免疫
する。最終の免疫日から２〜７日後、好ましくは４〜５
日後に、抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞として
は、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられ
るが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
【００４９】(3) 細胞融合 抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウ
スなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用する。
使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の
状態では選択培地(HAT培地：ヒポキサンチン、アミノプ
テリン、チミンを含む) で生存出来ず、抗体産生細胞と
融合した状態でのみ生存出来る性質を有するものが好ま
しい。ミエローマ細胞の具体例としては、P3U-1（大日
本製薬社製）などのマウスミエローマ細胞株が挙げられ
る。
スなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用する。
使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の
状態では選択培地(HAT培地：ヒポキサンチン、アミノプ
テリン、チミンを含む) で生存出来ず、抗体産生細胞と
融合した状態でのみ生存出来る性質を有するものが好ま
しい。ミエローマ細胞の具体例としては、P3U-1（大日
本製薬社製）などのマウスミエローマ細胞株が挙げられ
る。
【００５０】次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞
とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDME
M、RPMI-1640 培地などの動物細胞培養用培地中で108細
胞／mlの抗体産生細胞と２×105細胞／mlのミエローマ
細胞とを等容量混合し、融合促進剤存在のもと融合反応
を行う。細胞融合を促進させるためには、平均分子量1,
500ダルトンのポリエチレングリコール等を使用するこ
とができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレー
ション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産
生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDME
M、RPMI-1640 培地などの動物細胞培養用培地中で108細
胞／mlの抗体産生細胞と２×105細胞／mlのミエローマ
細胞とを等容量混合し、融合促進剤存在のもと融合反応
を行う。細胞融合を促進させるためには、平均分子量1,
500ダルトンのポリエチレングリコール等を使用するこ
とができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレー
ション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産
生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００５１】(4) ハイブリドーマの選択及びクローニン
グ 細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを
選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎
児血清含有 RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイク
ロタイタープレート上に５〜10細胞／ウェル程度まき、
各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換
して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、約
14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして
得ることができる。
グ 細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを
選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎
児血清含有 RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイク
ロタイタープレート上に５〜10細胞／ウェル程度まき、
各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換
して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、約
14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして
得ることができる。
【００５２】増殖してきたハイブリドーマの培養上清中
に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニング
する。ハイブリドーマのスクリーニングは通常の方法に
従い、特に限定はされない。例えば、ハイブリドーマと
して生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集
し、酵素免疫測定法（EIA; enzyme immuno assay）、RI
A(radio immuno assay) 等によって行うことが出来る。
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、
最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリド
ーマを樹立する。
に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニング
する。ハイブリドーマのスクリーニングは通常の方法に
従い、特に限定はされない。例えば、ハイブリドーマと
して生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集
し、酵素免疫測定法（EIA; enzyme immuno assay）、RI
A(radio immuno assay) 等によって行うことが出来る。
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、
最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリド
ーマを樹立する。
【００５３】(5) モノクローナル抗体の採取 樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取
する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等が
採用できる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを
10％ウシ胎児血清含有 RPMI-1640培地、MEM 培地又は無
血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件
（例えば37℃，５％CO2濃度）で10〜14日間培養し、そ
の培養上清から抗体を取得することができる。
する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等が
採用できる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを
10％ウシ胎児血清含有 RPMI-1640培地、MEM 培地又は無
血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件
（例えば37℃，５％CO2濃度）で10〜14日間培養し、そ
の培養上清から抗体を取得することができる。
【００５４】腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来
の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約
５×106個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させ
る。そして、１〜２週間後に腹水または血清を採集す
る。上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要と
される場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマ
トグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又は
これらを組み合わせることにより精製することができ
る。
の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約
５×106個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させ
る。そして、１〜２週間後に腹水または血清を採集す
る。上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要と
される場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマ
トグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又は
これらを組み合わせることにより精製することができ
る。
【００５５】X. ポリクローナル抗体の作製 (1) 抗原の調製 前記の方法 (VIII参照) により得られたポリペプチドを
緩衝液に溶解し、次いでアジュバントを添加する。アジ
ュバントとしては市販のフロイント完全アジュバント、
フロイント不完全アジュバントを用いる。
緩衝液に溶解し、次いでアジュバントを添加する。アジ
ュバントとしては市販のフロイント完全アジュバント、
フロイント不完全アジュバントを用いる。
【００５６】(2) 免疫 免疫する動物は、通常、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒ
ツジなどを用いる。ウサギを例にとると、ウサギの足蹠
に、通常100μgから500μg のポリペプチドをフロイン
ト完全アジュバントとともに皮下注射する。二週間後に
同量の抗原をフロイント不完全アジュバントと混合して
筋肉内注射をする。さらに二週間後に筋肉内注射を繰り
返し、最終免疫の一週間後に耳より部分採血してEIA法
等により抗体価を測定する。抗体価が目的の値に達して
いれば全採血し、抗体価が低ければ筋肉内注射を繰り返
し、抗体価が目的の値に達するまで免疫を繰り返す。血
清から硫安分画による抗体の精製は、モノクローナル抗
体の項 (IX参照) で述べた方法を採用できる。
ツジなどを用いる。ウサギを例にとると、ウサギの足蹠
に、通常100μgから500μg のポリペプチドをフロイン
ト完全アジュバントとともに皮下注射する。二週間後に
同量の抗原をフロイント不完全アジュバントと混合して
筋肉内注射をする。さらに二週間後に筋肉内注射を繰り
返し、最終免疫の一週間後に耳より部分採血してEIA法
等により抗体価を測定する。抗体価が目的の値に達して
いれば全採血し、抗体価が低ければ筋肉内注射を繰り返
し、抗体価が目的の値に達するまで免疫を繰り返す。血
清から硫安分画による抗体の精製は、モノクローナル抗
体の項 (IX参照) で述べた方法を採用できる。
【００５７】XI. WS領域に存在するWS-3遺伝子及びその
遺伝子がコードするポリペプチドの検出用試薬 WS-3遺伝子は、種を越えて比較的良く保存され（図４C
及び図４D ）、かつ、ヒトのさまざまな組織において高
い発現が認められたことから（図５A）、生体の基本的
な恒常性の維持に関わる未知の構成成分をコードしてい
る遺伝子の一つであることが強く示唆され、この遺伝子
の発現制御の理解は、生体の恒常性維持を司るメカニズ
ムを解明するうえで有用であり、また、生体の基本的な
恒常性を維持するための新規医薬品の創製にも有用であ
ると共に、ウェルナー症候群病発症との関連を解明する
ための研究にも有用である。
遺伝子がコードするポリペプチドの検出用試薬 WS-3遺伝子は、種を越えて比較的良く保存され（図４C
及び図４D ）、かつ、ヒトのさまざまな組織において高
い発現が認められたことから（図５A）、生体の基本的
な恒常性の維持に関わる未知の構成成分をコードしてい
る遺伝子の一つであることが強く示唆され、この遺伝子
の発現制御の理解は、生体の恒常性維持を司るメカニズ
ムを解明するうえで有用であり、また、生体の基本的な
恒常性を維持するための新規医薬品の創製にも有用であ
ると共に、ウェルナー症候群病発症との関連を解明する
ための研究にも有用である。
【００５８】本発明の遺伝子を上記に関連する検出用試
薬として使用する場合は、クローニングされたWS-3遺伝
子の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとしてハイブリダイゼーションを行い、サザン又は
ノーザンブロット法により検出することができる。な
お、オリゴヌクレオチドプローブとしては、DNAプロー
ブ、RNAプローブが挙げられる。また、本発明の遺伝子
をコードするポリペプチドに対するポリクローナル抗体
及びモノクローナル抗体を検出用試薬として使用する場
合は、EIA、RIAまたはウエスタンブロット解析により、
検出することができる。 XII. トランスジェニックマウス (1) 導入する遺伝子の構築 マウスに導入する遺伝子については、上流のプロモータ
ーと下流のpoly-Aシグナルを含むゲノムDNAを使用する
か、あるいは両者に挟まれたcDNAを使用するかのいずれ
かである。WS-3遺伝子を過剰発現しうるトランスジェニ
ックマウスを作製すれば、WS-3遺伝子の生物学的な作用
を解析するためのモデル動物（実験動物）に使用できる
可能性が高い。
薬として使用する場合は、クローニングされたWS-3遺伝
子の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとしてハイブリダイゼーションを行い、サザン又は
ノーザンブロット法により検出することができる。な
お、オリゴヌクレオチドプローブとしては、DNAプロー
ブ、RNAプローブが挙げられる。また、本発明の遺伝子
をコードするポリペプチドに対するポリクローナル抗体
及びモノクローナル抗体を検出用試薬として使用する場
合は、EIA、RIAまたはウエスタンブロット解析により、
検出することができる。 XII. トランスジェニックマウス (1) 導入する遺伝子の構築 マウスに導入する遺伝子については、上流のプロモータ
ーと下流のpoly-Aシグナルを含むゲノムDNAを使用する
か、あるいは両者に挟まれたcDNAを使用するかのいずれ
かである。WS-3遺伝子を過剰発現しうるトランスジェニ
ックマウスを作製すれば、WS-3遺伝子の生物学的な作用
を解析するためのモデル動物（実験動物）に使用できる
可能性が高い。
【００５９】トランスジェニックマウスの遺伝子として
は、WS-3遺伝子を過剰発現させるようなベクター、逆に
その発現を抑制するようなアンチセンスのベクターの二
つが考えられる。いずれの場合にも、遺伝子の選択のた
めの、ポジティブ選別用の薬剤 (例えば、ネオマイシン
など) 耐性遺伝子を連結させておく。
は、WS-3遺伝子を過剰発現させるようなベクター、逆に
その発現を抑制するようなアンチセンスのベクターの二
つが考えられる。いずれの場合にも、遺伝子の選択のた
めの、ポジティブ選別用の薬剤 (例えば、ネオマイシン
など) 耐性遺伝子を連結させておく。
【００６０】(2) 細胞への遺伝子の挿入 細胞への遺伝子の挿入は、従来より使用されている受精
卵に、直接DNAを注入する方法も使用し得るが、最近開
発された胚性幹細胞 (embryonic stem cell: ES 細胞)
は、培養が可能で、しかもこの細胞からマウスを発生さ
せることができるという利点を有しているため、各種ES
細胞を用いる方法がより効率的で好ましい。ES細胞とし
ては、例えばTT2細胞が挙げられる（相沢慎一，ジーン
ターゲッティング，1995年，羊土社）。エレクトロポレ
ーションによりWS-3遺伝子を含む上記ベクターDNAをES
細胞へ導入し、ネオマイシンでポジティブ選別し、目的
の変異ES細胞を得る。
卵に、直接DNAを注入する方法も使用し得るが、最近開
発された胚性幹細胞 (embryonic stem cell: ES 細胞)
は、培養が可能で、しかもこの細胞からマウスを発生さ
せることができるという利点を有しているため、各種ES
細胞を用いる方法がより効率的で好ましい。ES細胞とし
ては、例えばTT2細胞が挙げられる（相沢慎一，ジーン
ターゲッティング，1995年，羊土社）。エレクトロポレ
ーションによりWS-3遺伝子を含む上記ベクターDNAをES
細胞へ導入し、ネオマイシンでポジティブ選別し、目的
の変異ES細胞を得る。
【００６１】(3) 胚胎盤胞又は８細胞期胚への注入 上記ES細胞を胚胎盤胞又は８細胞期胚へ、毛細管を用い
て注入する。
て注入する。
【００６２】(4) 仮親への移植 ES細胞を注入した８細胞期胚は直接仮親の卵管に移植す
るか、一日培養して胚盤胞まで発生したものを子宮に移
植する。ES細胞を注入した胚盤胞は直接子宮へ移植す
る。
るか、一日培養して胚盤胞まで発生したものを子宮に移
植する。ES細胞を注入した胚盤胞は直接子宮へ移植す
る。
【００６３】(5) キメラマウスの解析 妊娠したマウスに出産させる。子の毛色によりキメラの
程度を判定し、その程度の高いもの同士を交配させる。
生まれた子マウスの尾を小さく切り、PCR法により変異
アリルの伝達を調べる。ヘテロマウス同士を交配して、
ホモ体をつくり、それを解析する。
程度を判定し、その程度の高いもの同士を交配させる。
生まれた子マウスの尾を小さく切り、PCR法により変異
アリルの伝達を調べる。ヘテロマウス同士を交配して、
ホモ体をつくり、それを解析する。
【００６４】XIII. ノックアウトマウス ヒトWS-3遺伝子に相当するマウスWS-3遺伝子を含むゲノ
ムDNAをPCRまたはゲノムライブラリーから得、そのいず
れかのエキソンの中にneo耐性遺伝子を挿入したベクタ
ーを構築する。この操作によりこのエキソンの機能は破
壊される。これと同時に、このベクターの中にネガティ
ブ選別用のチミジンキナーゼ(tk)遺伝子又はジフテリア
(DT)毒素遺伝子を繋げておく。エレクトロポレーション
により該ベクターDNAをES細胞に導入する。次に、この
細胞をポジティブ選別用のネオマイシン及びネガティブ
選別用の核酸類似体FIAU (fluoroiodoadenosyluraci
l)、又はジフテリア毒素の存在下で培養する。この操作
により非相同組換えを起こしたジフテリア毒素感受性細
胞と、組換えを全く起こさないG418感受性細胞が除去さ
れ、相同組換えを起こした細胞のみが残る。この細胞で
は、破壊されたエキソンを含む遺伝子がノックアウトさ
れる。得られた細胞をマウスの胚胎盤胞又は８細胞期胚
に注入し、その後はトランスジェニックマウスの操作に
準じて操作し、ダブルノックアウトマウスを得ることが
できる。
ムDNAをPCRまたはゲノムライブラリーから得、そのいず
れかのエキソンの中にneo耐性遺伝子を挿入したベクタ
ーを構築する。この操作によりこのエキソンの機能は破
壊される。これと同時に、このベクターの中にネガティ
ブ選別用のチミジンキナーゼ(tk)遺伝子又はジフテリア
(DT)毒素遺伝子を繋げておく。エレクトロポレーション
により該ベクターDNAをES細胞に導入する。次に、この
細胞をポジティブ選別用のネオマイシン及びネガティブ
選別用の核酸類似体FIAU (fluoroiodoadenosyluraci
l)、又はジフテリア毒素の存在下で培養する。この操作
により非相同組換えを起こしたジフテリア毒素感受性細
胞と、組換えを全く起こさないG418感受性細胞が除去さ
れ、相同組換えを起こした細胞のみが残る。この細胞で
は、破壊されたエキソンを含む遺伝子がノックアウトさ
れる。得られた細胞をマウスの胚胎盤胞又は８細胞期胚
に注入し、その後はトランスジェニックマウスの操作に
準じて操作し、ダブルノックアウトマウスを得ることが
できる。
【００６５】XIV. 遺伝子の発現レベルを上昇又は下降
するように修飾された遺伝子が導入されたマウス 本発明においては、遺伝子の発現を正常に調節している
いくつかの重要な部位（エンハンサー、プロモーター、
イントロン等）の一部に変異を導入、除去あるいは新た
に付加することにより、本来の遺伝子の発現レベルと比
較し、人工的に上昇又は下降するように修飾することが
できる。
するように修飾された遺伝子が導入されたマウス 本発明においては、遺伝子の発現を正常に調節している
いくつかの重要な部位（エンハンサー、プロモーター、
イントロン等）の一部に変異を導入、除去あるいは新た
に付加することにより、本来の遺伝子の発現レベルと比
較し、人工的に上昇又は下降するように修飾することが
できる。
【００６６】
【発明の実施の形態】以下、実施例により本発明をさら
に具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限
定されない。 〔実施例１〕ゲノムDNA 及びRNA の調製並びにP1及び P
AC DNAの精製 I. ゲノムDNA及びRNAの調製 (1) 細胞サンプルの収集とゲノム DNA調製 ヒト血液リンパ球からのゲノム DNA調製は、Molecular
Cloning (Sanbrook, Fritschand Maniatis, Cold Sprin
g Harbor 出版) に記載された方法により行った。ま
ず、新鮮な血液（10ml）を、80mlの 0.32M Sucrose、10
mMのTris-HCl緩衝液(pH 7.5)、５mM MgCl2 及び１％ T
riton X-100 を含む溶液と混合して溶血し、氷上に20分
間静置後、遠心し、リンパ球を含むペレット画分を得
た。このペレットを2.25mlの0.075M NaCl 及び0.025M E
DTA を含む溶液に懸濁し、0.25mlの２mg/ml プロテイナ
ーゼ K、５％ SDS及び10mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)
を加え、37℃で一晩インキュベートした。この後、５ml
からなる１容のフェノールと１容のクロロホルム−イソ
アミルアルコール（24：１）の混液とを加え、静かに回
しながらゲノムDNAの抽出を行った。遠心後（3,000rpm,
10分）、上清画分を分取し、フェノール／クロロホル
ムによる抽出を繰り返した。遠心分離により得られる上
清に、20％容の３M 酢酸ナトリウム液（pH 5.2）を加
え、更に2.5倍容のエタノールを加え、ゲノムDNAを析出
させた。綿状のDNAをガラスパスツールピペットで巻取
り、10mM Tris-HCl (pH 8.0)及び0.2mM EDTAを含む1.25
mlのバッファーに溶かした。
に具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限
定されない。 〔実施例１〕ゲノムDNA 及びRNA の調製並びにP1及び P
AC DNAの精製 I. ゲノムDNA及びRNAの調製 (1) 細胞サンプルの収集とゲノム DNA調製 ヒト血液リンパ球からのゲノム DNA調製は、Molecular
Cloning (Sanbrook, Fritschand Maniatis, Cold Sprin
g Harbor 出版) に記載された方法により行った。ま
ず、新鮮な血液（10ml）を、80mlの 0.32M Sucrose、10
mMのTris-HCl緩衝液(pH 7.5)、５mM MgCl2 及び１％ T
riton X-100 を含む溶液と混合して溶血し、氷上に20分
間静置後、遠心し、リンパ球を含むペレット画分を得
た。このペレットを2.25mlの0.075M NaCl 及び0.025M E
DTA を含む溶液に懸濁し、0.25mlの２mg/ml プロテイナ
ーゼ K、５％ SDS及び10mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)
を加え、37℃で一晩インキュベートした。この後、５ml
からなる１容のフェノールと１容のクロロホルム−イソ
アミルアルコール（24：１）の混液とを加え、静かに回
しながらゲノムDNAの抽出を行った。遠心後（3,000rpm,
10分）、上清画分を分取し、フェノール／クロロホル
ムによる抽出を繰り返した。遠心分離により得られる上
清に、20％容の３M 酢酸ナトリウム液（pH 5.2）を加
え、更に2.5倍容のエタノールを加え、ゲノムDNAを析出
させた。綿状のDNAをガラスパスツールピペットで巻取
り、10mM Tris-HCl (pH 8.0)及び0.2mM EDTAを含む1.25
mlのバッファーに溶かした。
【００６７】ヒト胎盤組織からのゲノムDNAの精製は、
健常人妊婦より得た新鮮な胎盤をドライアイス上で凍結
させ、スライサーを用いて極く薄い切片にするか、又は
細粉したものを材料として用いて行った。細かくした凍
結胎盤破片から、Gross-Bellardらの方法［Eur. J. Bio
chem. 36, 32-38 (1973)］に従ってゲノムDNAを抽出・
精製した。
健常人妊婦より得た新鮮な胎盤をドライアイス上で凍結
させ、スライサーを用いて極く薄い切片にするか、又は
細粉したものを材料として用いて行った。細かくした凍
結胎盤破片から、Gross-Bellardらの方法［Eur. J. Bio
chem. 36, 32-38 (1973)］に従ってゲノムDNAを抽出・
精製した。
【００６８】(2) 細胞株の確立及び全RNAの調製 臨床診断的に認定されたウェルナー症患者 (以下、WS患
者と記す) からバイオプシーにより得られる皮膚組織切
片をもとにＷＳ繊維芽細胞株を確立し、全RNA及びpoly
A+ 含有mRNA（以下 poly A+ mRNA と記す) を精製し
た。同様にして、健常人皮膚組織切片からの健常人繊維
芽細胞株の確立と共にRNAを精製した。
者と記す) からバイオプシーにより得られる皮膚組織切
片をもとにＷＳ繊維芽細胞株を確立し、全RNA及びpoly
A+ 含有mRNA（以下 poly A+ mRNA と記す) を精製し
た。同様にして、健常人皮膚組織切片からの健常人繊維
芽細胞株の確立と共にRNAを精製した。
【００６９】mRNAの調製は、以下の方法で行った。WS患
者又は健常人由来の培養ヒト繊維芽細胞をトリプシンに
よりペトリ皿からはがし、PBS で十分に洗浄後、６M グ
アニジウムチオシアネート溶液中でホモジナイズし、Ch
irgwinらの方法［Biochemistry 18, 5294-9299 (197
9)］に従い、塩化セシウム平衡密度勾配遠心法により全
RNAを沈殿として分離した。分離後、フェノール抽出、
エタノール沈殿等により全RNAを精製した。polyA+ mRNA
群を得る場合には、全RNAにオリゴ(dT)を共有結合で表
層にもつラテックス粒子、オリゴテックス(dT)-30(宝酒
造社製)を加え、Kuribayashi-Ohtaらの方法［Biochem.
Biophys. Acata. 1156, 204-112 (1993)］に従い、バッ
チ法によるアフィニティクロマトグラフィーにより精製
した。 これらの繊維芽細胞からのmRNAは、逆転写酵素
を用いてcDNAを調製するための試料として用いるのみな
らず、ＷＳ患者のある特定のmRNAが質的（サイズ及びフ
ァミリーの存在）及び量的（発現量及びコピー数）に健
常人と比較して変動しているか否かをノーザンブロット
解析する際の試料としても用いることができる。
者又は健常人由来の培養ヒト繊維芽細胞をトリプシンに
よりペトリ皿からはがし、PBS で十分に洗浄後、６M グ
アニジウムチオシアネート溶液中でホモジナイズし、Ch
irgwinらの方法［Biochemistry 18, 5294-9299 (197
9)］に従い、塩化セシウム平衡密度勾配遠心法により全
RNAを沈殿として分離した。分離後、フェノール抽出、
エタノール沈殿等により全RNAを精製した。polyA+ mRNA
群を得る場合には、全RNAにオリゴ(dT)を共有結合で表
層にもつラテックス粒子、オリゴテックス(dT)-30(宝酒
造社製)を加え、Kuribayashi-Ohtaらの方法［Biochem.
Biophys. Acata. 1156, 204-112 (1993)］に従い、バッ
チ法によるアフィニティクロマトグラフィーにより精製
した。 これらの繊維芽細胞からのmRNAは、逆転写酵素
を用いてcDNAを調製するための試料として用いるのみな
らず、ＷＳ患者のある特定のmRNAが質的（サイズ及びフ
ァミリーの存在）及び量的（発現量及びコピー数）に健
常人と比較して変動しているか否かをノーザンブロット
解析する際の試料としても用いることができる。
【００７０】II. P1及び PAC DNAの精製 純度の高いP1及びPAC DNA はCsCl密度勾配遠心法で分離
精製し、WS領域の遺伝子物理地図の作成、遺伝子配列の
解読、FISHによる解析及びエキソントラッピング法の材
料に用いた。
精製し、WS領域の遺伝子物理地図の作成、遺伝子配列の
解読、FISHによる解析及びエキソントラッピング法の材
料に用いた。
【００７１】(1) IPTG刺激による大腸菌体内P1/PACコピ
ー数の増大・誘導法 P1/PACファージクローンからの DNAの回収・精製は、Sm
oller ら〔Chromosoma100,487-494 (1991)〕によって報
告された方法に変更を加えて行った。単一P1/PACファー
ジクローンを含む大腸菌 (E. coli NS3529) コロニーを
最終濃度25μg/mlのカナマイシンを含む33mlのLB培養液
中に懸濁し、37℃で一晩振盪培養した。翌日、同濃度の
カナマイシンを含む１LのLB培養液中へ移し、1.5 時間
振盪培養後、最終濃度0.5 mMとなるようにIPTGを加え、
引き続き５時間振盪培養した。
ー数の増大・誘導法 P1/PACファージクローンからの DNAの回収・精製は、Sm
oller ら〔Chromosoma100,487-494 (1991)〕によって報
告された方法に変更を加えて行った。単一P1/PACファー
ジクローンを含む大腸菌 (E. coli NS3529) コロニーを
最終濃度25μg/mlのカナマイシンを含む33mlのLB培養液
中に懸濁し、37℃で一晩振盪培養した。翌日、同濃度の
カナマイシンを含む１LのLB培養液中へ移し、1.5 時間
振盪培養後、最終濃度0.5 mMとなるようにIPTGを加え、
引き続き５時間振盪培養した。
【００７２】(2) CsCl密度勾配遠心法によるP1/PAC DNA
の精製 P1/PAC DNAは、上記(1) に記載した方法により得られた
菌体から、通常のアルカリ-SDS法［Birnboim and Doly,
Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 (1979)］により調
製し、CsCl密度勾配遠心法により精製した。
の精製 P1/PAC DNAは、上記(1) に記載した方法により得られた
菌体から、通常のアルカリ-SDS法［Birnboim and Doly,
Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 (1979)］により調
製し、CsCl密度勾配遠心法により精製した。
【００７３】冷却遠心分離 (3,500rpm×15分) により回
収した菌体に、50mlの50mM Sucrose-10mM EDTA-25mM Tr
is-HCl(pH 8.0)と、50mg/ml のlysozyme溶液を1.5 ml加
え穏やかに室温で５分インキュベートした。引き続き、
100ml の0.2M NaOH-1% SDS溶液を加え穏やかに氷上で５
分インキュベートした。さらに、75mlの3M KAc-11.5%氷
酢酸を加え穏やかに氷上で５分インキュベートした。冷
却遠心分離(4,000 rpm×15分）により上清を回収し、そ
こに最終濃度50μg/mlとなるようにRNase溶液を加え、3
7℃で１時間インキュベート後同量の2-propanolを加
え、-20 ℃で１時間放置した。冷却遠心分離 (6,000rpm
×15分) 後、デカンテーションにより上清を除去し、P1
/PAC DNAを含む沈殿を70％EtOHで洗浄後完全に風乾させ
た。６mlの10mM Tris-HCl-1mM EDTA (pH 8.0) を加えて
沈殿を溶解させ、そこに６gのCsClを加えて十分に溶解
させ、さらに10mg/ml エチジウムブロミドを100μl 加
え、-20℃で20分放置した。冷却遠心分離 (6,000rpm×1
0分) 後、上清を回収し、22℃で 100,000rpm ×４時間
以上の超高速遠心により P1/PAC DNA をバクテリアゲノ
ムと分離した。UV照射下P1/PAC DNAを含むバンドを回収
後、イソアミルアルコールでエチジウムブロミドを除
き、また、２度の透析によりCsClを除き P1/PACDNA を
精製した。透析バッファーとして10mM Tris-HCl-1.25mM
EDTA (pH 8.0)を用いた。これらのP1/PAC DNAは、コン
ティグ作成（図１）に使われるとともに〔実施例２〕に
示すエキソントラッピング法に使われた。
収した菌体に、50mlの50mM Sucrose-10mM EDTA-25mM Tr
is-HCl(pH 8.0)と、50mg/ml のlysozyme溶液を1.5 ml加
え穏やかに室温で５分インキュベートした。引き続き、
100ml の0.2M NaOH-1% SDS溶液を加え穏やかに氷上で５
分インキュベートした。さらに、75mlの3M KAc-11.5%氷
酢酸を加え穏やかに氷上で５分インキュベートした。冷
却遠心分離(4,000 rpm×15分）により上清を回収し、そ
こに最終濃度50μg/mlとなるようにRNase溶液を加え、3
7℃で１時間インキュベート後同量の2-propanolを加
え、-20 ℃で１時間放置した。冷却遠心分離 (6,000rpm
×15分) 後、デカンテーションにより上清を除去し、P1
/PAC DNAを含む沈殿を70％EtOHで洗浄後完全に風乾させ
た。６mlの10mM Tris-HCl-1mM EDTA (pH 8.0) を加えて
沈殿を溶解させ、そこに６gのCsClを加えて十分に溶解
させ、さらに10mg/ml エチジウムブロミドを100μl 加
え、-20℃で20分放置した。冷却遠心分離 (6,000rpm×1
0分) 後、上清を回収し、22℃で 100,000rpm ×４時間
以上の超高速遠心により P1/PAC DNA をバクテリアゲノ
ムと分離した。UV照射下P1/PAC DNAを含むバンドを回収
後、イソアミルアルコールでエチジウムブロミドを除
き、また、２度の透析によりCsClを除き P1/PACDNA を
精製した。透析バッファーとして10mM Tris-HCl-1.25mM
EDTA (pH 8.0)を用いた。これらのP1/PAC DNAは、コン
ティグ作成（図１）に使われるとともに〔実施例２〕に
示すエキソントラッピング法に使われた。
【００７４】〔実施例２〕エキソントラッピング法 (1) DNA 断片の調製 以下、一連の操作によりP1/PAC DNA断片からエキソンを
回収した。まず、1 μg のP1/PAC DNA断片を、それぞれ
100 unitの制限酵素BamHI 及びBgl IIと所定の宝酒造社
製のバッファー中で、37℃で３時間インキュベートする
ことにより切断した。反応液はフェノール/クロロフォ
ルムで処理してDNAを抽出した後、エタノールで沈殿さ
せた。
回収した。まず、1 μg のP1/PAC DNA断片を、それぞれ
100 unitの制限酵素BamHI 及びBgl IIと所定の宝酒造社
製のバッファー中で、37℃で３時間インキュベートする
ことにより切断した。反応液はフェノール/クロロフォ
ルムで処理してDNAを抽出した後、エタノールで沈殿さ
せた。
【００７５】(2) エキソントラッピング用の ベクター
pSPL3への DNA 断片の挿入 制限酵素Bam HIで切断後、フォスファターゼ（Boehring
er Mannhaim社製）処理で脱リン酸化された40ngのエキ
ソントラッピング用のベクター pSPL3 (GibcoBRL 社製)
と、合計100ng の制限酵素Bam HI及びBgl IIにより切断
されたP1/PACDNA断片とを、T4 DNAリガーゼとともに所
定のバッファーを用いて15℃で16時間反応させ、pSPL3
ベクターへP1 DNA断片を挿入した。
pSPL3への DNA 断片の挿入 制限酵素Bam HIで切断後、フォスファターゼ（Boehring
er Mannhaim社製）処理で脱リン酸化された40ngのエキ
ソントラッピング用のベクター pSPL3 (GibcoBRL 社製)
と、合計100ng の制限酵素Bam HI及びBgl IIにより切断
されたP1/PACDNA断片とを、T4 DNAリガーゼとともに所
定のバッファーを用いて15℃で16時間反応させ、pSPL3
ベクターへP1 DNA断片を挿入した。
【００７６】72℃で10分間処理して反応を停止させた
後、大腸菌HB101へトランスフォームした。増殖させた
大腸菌を回収し、プラスミドをQiagenカラム（Qiagen社
製）を用いて調製した。なお、pSPL3 ベクターには、HI
V のtat遺伝子のスプライシングのためのドナー及びア
クセプターの構造が組み込まれており、これを利用して
挿入された遺伝子からエキソンがスプライシングされる
ように設計されている。後述する各種プライマー（配列
番号６、７、８）はこのベクター上に設定されたもので
ある。
後、大腸菌HB101へトランスフォームした。増殖させた
大腸菌を回収し、プラスミドをQiagenカラム（Qiagen社
製）を用いて調製した。なお、pSPL3 ベクターには、HI
V のtat遺伝子のスプライシングのためのドナー及びア
クセプターの構造が組み込まれており、これを利用して
挿入された遺伝子からエキソンがスプライシングされる
ように設計されている。後述する各種プライマー（配列
番号６、７、８）はこのベクター上に設定されたもので
ある。
【００７７】(3) Cos-7 細胞へのエレクトロポレーショ
ンによるトランスフェクション Cos-7細胞を直径10cmのシャーレで10％ウシ胎児血清を
含むDMEM培地を用いて培養した。0.5％トリプシン溶液
を使用して細胞を剥がし、細胞懸濁液にしたのち細胞を
冷PBS (Phosphate buffer-Saline, pH 7.2)で洗浄し
た。0.5×106/mlの濃度に細胞数を調整した後、0.4 cm
のチェンバーに0.8mlの細胞浮遊液と５μgプラスミドDN
Aを加え、10分間氷冷した。Gene Pulser II (BioRAD社
製)を用い、電圧1.2 kV、静電容量25μFDの条件でエレ
クトロポレーションを行った。再び10分間氷冷したの
ち、予め37℃に温めた培地へ懸濁しなおし、その後60-7
2時間培養した。
ンによるトランスフェクション Cos-7細胞を直径10cmのシャーレで10％ウシ胎児血清を
含むDMEM培地を用いて培養した。0.5％トリプシン溶液
を使用して細胞を剥がし、細胞懸濁液にしたのち細胞を
冷PBS (Phosphate buffer-Saline, pH 7.2)で洗浄し
た。0.5×106/mlの濃度に細胞数を調整した後、0.4 cm
のチェンバーに0.8mlの細胞浮遊液と５μgプラスミドDN
Aを加え、10分間氷冷した。Gene Pulser II (BioRAD社
製)を用い、電圧1.2 kV、静電容量25μFDの条件でエレ
クトロポレーションを行った。再び10分間氷冷したの
ち、予め37℃に温めた培地へ懸濁しなおし、その後60-7
2時間培養した。
【００７８】(4) 全RNAの抽出 トランスフェクションした細胞は、37℃に温めたPBSで
洗浄した後に、0.1％トリプシン溶液で処理し細胞をは
がし、懸濁液とした。10％のウシ胎児血清を含むDMEM培
地に細胞を懸濁してトリプシンを失活させた後に、いず
れもRNaseを含まない、300μlのTKM溶液(10mM Tris-HCl
pH7.5, 10mM KCl, 1mM MgCl2)及び15μlの10％Triton
X-100溶液を５分毎に氷冷下で順次加え、４℃で1,500 r
pm ×５分間遠心して核を除いた。上清を除去し、RNase
を含まない５％SDSを20μl加えた後に、フェノール/ク
ロロフォルムでRNAを抽出した。通常、これら一連の操
作により30〜50μｇの全RNA を回収することができた。
RNAをエタノールで沈殿させた後、ジエチルピロカーボ
ネートで処理し、RNaseフリーとしたMilliQ水50μlに溶
かした。
洗浄した後に、0.1％トリプシン溶液で処理し細胞をは
がし、懸濁液とした。10％のウシ胎児血清を含むDMEM培
地に細胞を懸濁してトリプシンを失活させた後に、いず
れもRNaseを含まない、300μlのTKM溶液(10mM Tris-HCl
pH7.5, 10mM KCl, 1mM MgCl2)及び15μlの10％Triton
X-100溶液を５分毎に氷冷下で順次加え、４℃で1,500 r
pm ×５分間遠心して核を除いた。上清を除去し、RNase
を含まない５％SDSを20μl加えた後に、フェノール/ク
ロロフォルムでRNAを抽出した。通常、これら一連の操
作により30〜50μｇの全RNA を回収することができた。
RNAをエタノールで沈殿させた後、ジエチルピロカーボ
ネートで処理し、RNaseフリーとしたMilliQ水50μlに溶
かした。
【００７９】(5) RT-PCR 上述した手順で調製した細胞質RNA約３μg、pSPL3 ベク
ターに設定されたプライマーSA2(配列番号６ )、ジチオ
スレイトール、dNTP (dATP, dCTP, dGTP及びdTTP) 、逆
転写酵素用バッファー及び逆転写酵素Super Sucript II
を含む反応液を42℃で30分反応させ、その後RNase 処理
をしてcDNAを調製した。このcDNAをテンプレートとし
て、pSPL3 ベクターに設定された二つのプライマーSD2
(配列番号７) 及びSA4(配列番号８) で、Taq DNA ポリ
メラーゼを用い、PCR 反応を行った。反応は、94℃で１
分、60℃で１分、72℃で１分を１サイクルとしてこれを
30サイクル行った。
ターに設定されたプライマーSA2(配列番号６ )、ジチオ
スレイトール、dNTP (dATP, dCTP, dGTP及びdTTP) 、逆
転写酵素用バッファー及び逆転写酵素Super Sucript II
を含む反応液を42℃で30分反応させ、その後RNase 処理
をしてcDNAを調製した。このcDNAをテンプレートとし
て、pSPL3 ベクターに設定された二つのプライマーSD2
(配列番号７) 及びSA4(配列番号８) で、Taq DNA ポリ
メラーゼを用い、PCR 反応を行った。反応は、94℃で１
分、60℃で１分、72℃で１分を１サイクルとしてこれを
30サイクル行った。
【００８０】反応生成物であるDNAをエタノール沈殿さ
せた後に、４％の低融点アガロース電気泳動で高分子と
低分子の二分画に分離した。それぞれの画分のゲルを切
り出し、70℃で溶解後、Resin column (Promega社製)
でDNAを精製した。通常、これら一連の操作により50〜2
00ng のDNAを回収することができた。
せた後に、４％の低融点アガロース電気泳動で高分子と
低分子の二分画に分離した。それぞれの画分のゲルを切
り出し、70℃で溶解後、Resin column (Promega社製)
でDNAを精製した。通常、これら一連の操作により50〜2
00ng のDNAを回収することができた。
【００８１】(6) 塩基配列決定のためのエキソンDNA の
調整 上記DNA溶液、T4 DNAリガーゼ（宝酒造社製）、バッフ
ァー（宝酒造社製）、及びpGEM-Tベクター（Promega 社
製）を含む溶液を15℃で３時間反応させて、エキソンDN
A断片をpGEM-Tベクターに組み込んだ。このベクターで
大腸菌JM109をトランスフォームさせ、X-gal、IPTG及び
アンピシリン (最終濃度50μg/ml) を含むLBバクトアガ
ープレートに播いた。白色の大腸菌コロニーについて、
pSPL3 ベクターに設定されたSA4(配列番号８）とSD2(配
列番号７）の二つのプライマーを用いて PCRを行った。
目的のDNA 断片の得られたコロニーについて、アンピシ
リン (最終濃度50μg/ml) を含むLB培地で、37℃で16時
間以上振盪培養し、Kurabo社製のロボット(PI-100Σ)
を用いてプラスミド DNAを回収・精製した。
調整 上記DNA溶液、T4 DNAリガーゼ（宝酒造社製）、バッフ
ァー（宝酒造社製）、及びpGEM-Tベクター（Promega 社
製）を含む溶液を15℃で３時間反応させて、エキソンDN
A断片をpGEM-Tベクターに組み込んだ。このベクターで
大腸菌JM109をトランスフォームさせ、X-gal、IPTG及び
アンピシリン (最終濃度50μg/ml) を含むLBバクトアガ
ープレートに播いた。白色の大腸菌コロニーについて、
pSPL3 ベクターに設定されたSA4(配列番号８）とSD2(配
列番号７）の二つのプライマーを用いて PCRを行った。
目的のDNA 断片の得られたコロニーについて、アンピシ
リン (最終濃度50μg/ml) を含むLB培地で、37℃で16時
間以上振盪培養し、Kurabo社製のロボット(PI-100Σ)
を用いてプラスミド DNAを回収・精製した。
【００８２】RNase 処理によりRNAを分解した後、20％
ポリエチレングリコール/2.5M NaCl溶液で小分子化合物
を除き、エタノール沈殿を行いDNAシークエンス用の試
料とした。最終的に塩基配列の確定したエキソンをデー
タバンクで検索し、既知と未知の遺伝子に大別した。未
知のエキソンは、実施例３又は実施例４に記したよう
に、TAIL-PCR又はMarathonTM cDNA Amplification Kit
の材料に供した。
ポリエチレングリコール/2.5M NaCl溶液で小分子化合物
を除き、エタノール沈殿を行いDNAシークエンス用の試
料とした。最終的に塩基配列の確定したエキソンをデー
タバンクで検索し、既知と未知の遺伝子に大別した。未
知のエキソンは、実施例３又は実施例４に記したよう
に、TAIL-PCR又はMarathonTM cDNA Amplification Kit
の材料に供した。
【００８３】〔実施例３〕TAIL-PCR法によるエキソンの
伸長 TAIL-PCR法は、既存配列に隣接する未知の塩基配列を効
率良く増幅できる温度非対称交互PCR 法であり［Liu,
Y.-G. and Whittier, R.L. Genomics 25, pp674-681(19
95)］、既知配列に特異的な長いプライマーとそれより
短い任意のプライマーを用いて、高温と中温アニーリン
グを交互に行う。さらにこのサイクルをプライマー部位
に変化させ、３回繰り返すことにより、目的配列の優先
的かつ特異的な増幅を可能にする。具体的には、以下の
ようなサイクルで、テンプレート cDNAとしては、ヒトH
eLa細胞cDNAライブラリー及びヒト唇細胞cDNAライブラ
リーを用いてPCR反応を行い、cDNA断片の検出と単離を
行った。
伸長 TAIL-PCR法は、既存配列に隣接する未知の塩基配列を効
率良く増幅できる温度非対称交互PCR 法であり［Liu,
Y.-G. and Whittier, R.L. Genomics 25, pp674-681(19
95)］、既知配列に特異的な長いプライマーとそれより
短い任意のプライマーを用いて、高温と中温アニーリン
グを交互に行う。さらにこのサイクルをプライマー部位
に変化させ、３回繰り返すことにより、目的配列の優先
的かつ特異的な増幅を可能にする。具体的には、以下の
ようなサイクルで、テンプレート cDNAとしては、ヒトH
eLa細胞cDNAライブラリー及びヒト唇細胞cDNAライブラ
リーを用いてPCR反応を行い、cDNA断片の検出と単離を
行った。
【００８４】 (1) 一次PCR反応; 16.5 μl pre-mixture-1* 2.5 μl テンプレート 1.0 μl AD 1-4 プライマー (100pmol/μl) 全量 20μl *pre-mixture-1 (165μl, 10 samples) 20.0 μl 10 x バッファー 16.0 μl dNTPs 30.0 μl SP-1 プライマー (1pmol/μl) 1.6 μl Taq (5 U/μl) 97.4 μl dH2O 1 サイクル 92℃ 2分, 95 ℃ 1 分, 1 サイクル 94℃ 15秒, 65 ℃ 1 分, 72 ℃ 2 分, 5 サイクル 94℃ 15秒, 30 ℃ 3 分, (3 分かけて)72 ℃ 2 分, 1 サイクル 94℃ 15秒, 44 ℃ 1 分, 72 ℃ 2 分, 10 サイクル 12 サイクル 94℃ 5秒, 65 ℃ 1 分, 72 ℃ 2 分, 2 サイクル 94℃ 5秒, 44 ℃ 1 分, 72 ℃ 2 分, 1 サイクル 1 サイクル 72℃ 5分, 1 サイクル 4 ℃に保持する。
【００８５】 (2) 二次PCR 反応; 17.4 μl pre-mixture-2* 2.0 μl 一次PCR 産物(100倍希釈) 0.6 μl AD 1-4 プライマー (100pmol/ml) 全量 20μl *pre-mixture-2 (174μl, 10 samples) 20.0 μl 10 x バッファー 2.0 μl dNTPs 40.0 μl SP-2 プライマー (1pmol/μl) １．６ μl Taq (5 U/μl) 110.4 μl dH2O 1サイクル 95℃ 5分, 1 サイクル 10サイクル 94℃ 5秒, 65 ℃ 1 分, 72 ℃ 2 分, 2 サイクル 94℃ 5秒, 44 ℃ 1 分, 72 ℃ 2 分, 1 サイクル 1サイクル 72℃ 5分 4 ℃に保持する。
【００８６】 (3) 三次PCR 反応; 42.0 μl pre-mixture-3* 5.0 μl 二次PCR 産物(100倍希釈) 3.0 μl AD 1-4 プライマー(10pmol/μl) 全量 50μl *pre-mixture-3 (420μl, 10 samples) 50.0 μl 10 x バッファー 5.0 μl dNTPs 20.0 μl SP-3 プライマー (1pmol/μl) 3.0 μl Taq (5 U/μl) 342.0 μl dH2O
【００８７】(4) 使用したプライマー AD1 配列番号９ AD2 配列番号１０ AD3 配列番号１１ AD4 配列番号１２ 3'側への伸長 3' SP-1 配列番号１３ 3' SP-2 配列番号１４ 3' SP-3 配列番号１５
【００８８】通常、7mlを1.5 ％アガロースゲルにより
解析し、特異的な増幅が認められた場合、5mlを直接、
塩基配列の解析に用いた。このようにして得られたDNA
配列が、真にWS領域由来の遺伝子断片であることを確認
するため、pGEM-Tベクター（Promega社製）を用いてク
ローニングし、以下に記した方法により、塩基配列の決
定を行った。
解析し、特異的な増幅が認められた場合、5mlを直接、
塩基配列の解析に用いた。このようにして得られたDNA
配列が、真にWS領域由来の遺伝子断片であることを確認
するため、pGEM-Tベクター（Promega社製）を用いてク
ローニングし、以下に記した方法により、塩基配列の決
定を行った。
【００８９】塩基配列の決定 目的とする DNA断片をpGEM-Tベクター (Promega 社製）
に挿入し、大腸菌で増殖させた後、プラスミドをロボッ
ト(Kurabo 社製 PI-100Σ) を用いたアルカリ法により
精製する。得られた精製プラスミドを RNaseで処理した
後、ポリエチレングリコール/食塩水の溶液で処理して
小分子を除き、DNA を精製する。
に挿入し、大腸菌で増殖させた後、プラスミドをロボッ
ト(Kurabo 社製 PI-100Σ) を用いたアルカリ法により
精製する。得られた精製プラスミドを RNaseで処理した
後、ポリエチレングリコール/食塩水の溶液で処理して
小分子を除き、DNA を精製する。
【００９０】精製されたDNA を鋳型DNA として、非標識
プライマー、４種類の蛍光標識ヌクレオチド-5'-トリフ
ォスフェイト、及び Taqポリメラーゼを加えた反応系で
PCRを行う。この反応では、無作為に蛍光色素の入った
DNA断片が合成され、それをシークエンサーで解析する
ことで、最終的には連続した塩基配列を決定することが
できる。DNA の塩基配列は、Applied Biosystem 社製の
自動DNAシークエンサー (モデルABI 373)を用いて行う
ことができる。
プライマー、４種類の蛍光標識ヌクレオチド-5'-トリフ
ォスフェイト、及び Taqポリメラーゼを加えた反応系で
PCRを行う。この反応では、無作為に蛍光色素の入った
DNA断片が合成され、それをシークエンサーで解析する
ことで、最終的には連続した塩基配列を決定することが
できる。DNA の塩基配列は、Applied Biosystem 社製の
自動DNAシークエンサー (モデルABI 373)を用いて行う
ことができる。
【００９１】得られたcDNAクローンは、最終的にPCR 及
びFISHにより正確にその位置を確認すると共に下記のプ
ライマーを用いて塩基配列を決定した。 M13F側 配列番号２０ M13R側 配列番号２１ SP6 側 配列番号４ T7側 配列番号５
びFISHにより正確にその位置を確認すると共に下記のプ
ライマーを用いて塩基配列を決定した。 M13F側 配列番号２０ M13R側 配列番号２１ SP6 側 配列番号４ T7側 配列番号５
【００９２】〔実施例４〕MarathonTM cDNA Amplifica
tion Kitを用いた WS-3 cDNAのクローニング 株式会社エイジーン研究所が所有するWS領域内の構成PA
C クローン(#6207) からエキソントラッピング法で単離
されたWS-3遺伝子の部分断片をTAIL-PCR法により伸長さ
せ、引き続き、MarathonTM cDNA Amplification Kitを
用いて、5'-, 3'-両端を含む完全長のWS-3 cDNA クロー
ンを得た。具体的には、以下のようなサイクルで、テン
プレートとして、ヒト Heart cDNA ライブラリーを用い
てPCR 反応を行い、WS-3 cDNA断片の検出と単離を行っ
た。
tion Kitを用いた WS-3 cDNAのクローニング 株式会社エイジーン研究所が所有するWS領域内の構成PA
C クローン(#6207) からエキソントラッピング法で単離
されたWS-3遺伝子の部分断片をTAIL-PCR法により伸長さ
せ、引き続き、MarathonTM cDNA Amplification Kitを
用いて、5'-, 3'-両端を含む完全長のWS-3 cDNA クロー
ンを得た。具体的には、以下のようなサイクルで、テン
プレートとして、ヒト Heart cDNA ライブラリーを用い
てPCR 反応を行い、WS-3 cDNA断片の検出と単離を行っ
た。
【００９３】まず、TAIL-PCR法により得られたWS-3 cDN
A の部分DNA 断片配列の一方の鎖上にAG1284（配列番号
18）、AG1285 (配列番号19) 及びAG1286 (配列番号20)
、相補鎖の cDNA 上に AG1288(配列番号21) 及びAG128
9 (配列番号22) の計５個のnested gene specificプラ
イマー (GSP)を作製した。Marathon ReadyTM cDNA Ampl
ification kit によって、5'-RACE および 3'-RACEのそ
れぞれの産物が得られた場合、互いに向き合う最も内側
のプライマー [AG1286 (配列番号20) とAG1289 (配列番
号22)]同士の間に54bpのオーバーラップができるように
デザインしてあり、この部分を互いにアニーリングさせ
る (Fusion) ことで完全長のcDNAが得られるようになっ
ている。以下に、ヒト心臓cDNA ReadyTMをテンプレート
として、(1)5'-RACE、(2)3'-RACEおよび (3)5'-RACE 産
物と 3'-RACE 産物の融合について順に説明する。 (1) 5'-RACE 産物の増幅 [1st LD PCR] アダプタープライマー 1 (配列番号23)とAG1288 (配列
番号21)を使って、以下の組成及びサイクルプログラム
でヒト心臓cDNA ReadyTMをテンプレートにして PCR反応
を行った。PCR の反応条件（試薬組成及びサイクル）を
表１及び２に示す。
A の部分DNA 断片配列の一方の鎖上にAG1284（配列番号
18）、AG1285 (配列番号19) 及びAG1286 (配列番号20)
、相補鎖の cDNA 上に AG1288(配列番号21) 及びAG128
9 (配列番号22) の計５個のnested gene specificプラ
イマー (GSP)を作製した。Marathon ReadyTM cDNA Ampl
ification kit によって、5'-RACE および 3'-RACEのそ
れぞれの産物が得られた場合、互いに向き合う最も内側
のプライマー [AG1286 (配列番号20) とAG1289 (配列番
号22)]同士の間に54bpのオーバーラップができるように
デザインしてあり、この部分を互いにアニーリングさせ
る (Fusion) ことで完全長のcDNAが得られるようになっ
ている。以下に、ヒト心臓cDNA ReadyTMをテンプレート
として、(1)5'-RACE、(2)3'-RACEおよび (3)5'-RACE 産
物と 3'-RACE 産物の融合について順に説明する。 (1) 5'-RACE 産物の増幅 [1st LD PCR] アダプタープライマー 1 (配列番号23)とAG1288 (配列
番号21)を使って、以下の組成及びサイクルプログラム
でヒト心臓cDNA ReadyTMをテンプレートにして PCR反応
を行った。PCR の反応条件（試薬組成及びサイクル）を
表１及び２に示す。
【００９４】
【表１】
【００９５】
【表２】
【００９６】[2nd LD PCR] 1st PCR 産物を、１×TE (pH8.0)で50倍希釈したもの５
μlをテンプレートにして、nestedプライマー [AP2(配
列番号24), AG1289(配列番号22)]でPCR 反応を行った。
PCR の反応条件（試薬組成及びサイクル）を表３及び４
に示す。
μlをテンプレートにして、nestedプライマー [AP2(配
列番号24), AG1289(配列番号22)]でPCR 反応を行った。
PCR の反応条件（試薬組成及びサイクル）を表３及び４
に示す。
【００９７】
【表３】
【００９８】
【表４】
【００９９】2nd PCR 産物10μlを1.2%アガロースゲル
電気泳動後、EtBr染色した。その結果、アダプターを含
めてWS-3 cDNA の5'端部分（約400 bpの断片）の増幅を
確認した。
電気泳動後、EtBr染色した。その結果、アダプターを含
めてWS-3 cDNA の5'端部分（約400 bpの断片）の増幅を
確認した。
【０１００】(2) 3'-RACE 産物の増幅 [1st LD PCR]：アダプタープライマー 1 (配列番号23)
とAG1284（配列番号18)を使って 5'-RACE同様、ヒト心
臓cDNA ReadyTMをテンプレートにしてPCR 反応を行っ
た。PCR の反応条件（試薬組成及びサイクル）を表５及
び６に示す。
とAG1284（配列番号18)を使って 5'-RACE同様、ヒト心
臓cDNA ReadyTMをテンプレートにしてPCR 反応を行っ
た。PCR の反応条件（試薬組成及びサイクル）を表５及
び６に示す。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
【表６】
【０１０３】[2nd LD PCR]：1st PCR 産物を、１×TE
(pH8.0)で50倍希釈もの 5μlをテンプレートにして、ne
stedプライマー [AP2 ( 配列番号24), AG1285(配列番号
19)]でPCR反応を行った。GSP に AG1285(配列番号19)
を使う以外は、(1)5'-RACE, [2nd LD PCR] の項に記載
の方法と同様にしてPCR を行った。
(pH8.0)で50倍希釈もの 5μlをテンプレートにして、ne
stedプライマー [AP2 ( 配列番号24), AG1285(配列番号
19)]でPCR反応を行った。GSP に AG1285(配列番号19)
を使う以外は、(1)5'-RACE, [2nd LD PCR] の項に記載
の方法と同様にしてPCR を行った。
【０１０４】[3rd PCR] ：2nd PCR 産物をさらに50倍希
釈し、5μlをテンプレートにnestedプライマー[AP2（配
列番号24），AG1286（配列番号20）] でPCR反応を行っ
た。GSP にAG1286（配列番号20）を使う以外は、[2nd L
D PCR]に記載の方法と同様にPCR を行った。3rd PCR 産
物 15μlを 1.2％アガロースゲル電気泳動にかけた後、
EtBr染色した結果、アダプターを含め、約 800 bpのWS-
3 cDNA 3'-端部分の特異的増幅を確認した。
釈し、5μlをテンプレートにnestedプライマー[AP2（配
列番号24），AG1286（配列番号20）] でPCR反応を行っ
た。GSP にAG1286（配列番号20）を使う以外は、[2nd L
D PCR]に記載の方法と同様にPCR を行った。3rd PCR 産
物 15μlを 1.2％アガロースゲル電気泳動にかけた後、
EtBr染色した結果、アダプターを含め、約 800 bpのWS-
3 cDNA 3'-端部分の特異的増幅を確認した。
【０１０５】(3) 融合による完全長WS-3 cDNA の増幅 (1) と (2)の各 5'-、3'- 端を含む２種類の断片(5'-,
3'- RACE産物) を熱変性により一旦一本鎖 cDNA にした
後、オーバーラップしている構造をアニーリングさせる
ことで、5'- 及び 3'-RACE産物を融合させた。相補鎖を
合成した後、これを鋳型として今度は、APと poly A -t
ail の部分にあらかじめ組み込まれている cDNA synthe
sis プライマー[CDS、(配列番号25)]によって、Long-Di
stance PCR を行うことにより、最終的に、5'-, 3'- 両
端を含む完全長の WS-3 cDNAクローンを得ることができ
た。PCR の反応条件（試薬組成及びサイクル）を表７及
び８に示す。
3'- RACE産物) を熱変性により一旦一本鎖 cDNA にした
後、オーバーラップしている構造をアニーリングさせる
ことで、5'- 及び 3'-RACE産物を融合させた。相補鎖を
合成した後、これを鋳型として今度は、APと poly A -t
ail の部分にあらかじめ組み込まれている cDNA synthe
sis プライマー[CDS、(配列番号25)]によって、Long-Di
stance PCR を行うことにより、最終的に、5'-, 3'- 両
端を含む完全長の WS-3 cDNAクローンを得ることができ
た。PCR の反応条件（試薬組成及びサイクル）を表７及
び８に示す。
【０１０６】
【表７】
【０１０７】
【表８】
【０１０８】[PCRによる完全長cDNAの生成]:サイクル反
応後、反応液を 1×TEで 100倍希釈して、この 5μlを
テンプレートとする。完全長の cDNA を増幅するため、
AP2 (配列番号24) およびCDS(配列番号25) プライマー
によって以下の反応を行った。PCR の反応条件（試薬組
成及びサイクル）を表９及び10に示す。
応後、反応液を 1×TEで 100倍希釈して、この 5μlを
テンプレートとする。完全長の cDNA を増幅するため、
AP2 (配列番号24) およびCDS(配列番号25) プライマー
によって以下の反応を行った。PCR の反応条件（試薬組
成及びサイクル）を表９及び10に示す。
【０１０９】
【表９】
【０１１０】
【表10】
【０１１１】最後に、この反応産物15μlを1.2%アガロ
ースゲル電気泳動して、アダプターとCDS を含む、全長
約 1.1 kbpの全WS-3 cDNA が増幅できたのを確認した。
この完全長のcDNAは、アダプターおよび CDSプライマー
内部にあらかじめ用意されているNotI制限酵素部位で消
化した後、pBluescriptII KS(+)ベクター(Stratagene社
製) にサブクローニングし、完全長のcDNA配列を決定し
た。
ースゲル電気泳動して、アダプターとCDS を含む、全長
約 1.1 kbpの全WS-3 cDNA が増幅できたのを確認した。
この完全長のcDNAは、アダプターおよび CDSプライマー
内部にあらかじめ用意されているNotI制限酵素部位で消
化した後、pBluescriptII KS(+)ベクター(Stratagene社
製) にサブクローニングし、完全長のcDNA配列を決定し
た。
【０１１２】〔実施例５〕WS-3遺伝子のサザンブロット
による解析 標識された核酸プローブと相補的な塩基配列を持つWS-3
遺伝子DNAの領域を同定するために、次のようにサザン
ハイブリダイゼーションを行った。 (1) ヒト胎盤及びマウス肝臓由来のゲノムDNA 制限酵素（BamHI, BglII, EcoRI, HindIII及び PstI）
で消化したヒト胎盤及びマウス肝臓由来のゲノムDNA 10
μgを0.8%アガロースゲル電気泳動により分離した。ゲ
ルを0.5N NaOH-1.5M NaCl溶液150 mlに浸し、30分間ゆ
っくり振盪し、アルカリ変性させた。ゲルを脱イオン水
で軽く洗い、0.5M Tris-HCl(pH 7.5）、1.5M NaCl溶液1
50 mlに浸し、30分間ゆっくりと振盪し、中和反応させ
た。
による解析 標識された核酸プローブと相補的な塩基配列を持つWS-3
遺伝子DNAの領域を同定するために、次のようにサザン
ハイブリダイゼーションを行った。 (1) ヒト胎盤及びマウス肝臓由来のゲノムDNA 制限酵素（BamHI, BglII, EcoRI, HindIII及び PstI）
で消化したヒト胎盤及びマウス肝臓由来のゲノムDNA 10
μgを0.8%アガロースゲル電気泳動により分離した。ゲ
ルを0.5N NaOH-1.5M NaCl溶液150 mlに浸し、30分間ゆ
っくり振盪し、アルカリ変性させた。ゲルを脱イオン水
で軽く洗い、0.5M Tris-HCl(pH 7.5）、1.5M NaCl溶液1
50 mlに浸し、30分間ゆっくりと振盪し、中和反応させ
た。
【０１１３】一方、ゲルと同じ大きさに切ったニトロセ
ルロース膜（Amersham社製）を蒸留水にて湿らせた後、
２×SSC（0.3M NaCl、0.03M クエン酸ナトリウム（pH
7.0）に浸した。トレイに20×SSC 溶液を200 ml入れ、
スポンジを浸し、ついで適当な大きさの濾紙（Whatmann
3 MM)を２×SSCに浸した後、スポンジの上に載せた。
ルロース膜（Amersham社製）を蒸留水にて湿らせた後、
２×SSC（0.3M NaCl、0.03M クエン酸ナトリウム（pH
7.0）に浸した。トレイに20×SSC 溶液を200 ml入れ、
スポンジを浸し、ついで適当な大きさの濾紙（Whatmann
3 MM)を２×SSCに浸した後、スポンジの上に載せた。
【０１１４】つぎにこの濾紙上に、前記のように処理し
たアガロースゲル、その上にニトロセルロース膜を載
せ、さらに同じ大きさの濾紙、ペーパータオルの束、重
しを載せ、一晩トランスファーさせた。トランスファー
終了後、紫外線照射（波長260 nm、120 mJ/cm2）により
ゲノムDNAをニトロセルロース膜へ固定し、株式会社エ
イジーン研究所が所有するヒト染色体8p11.2-p12.1コン
ティグの構成 PACクローン（#6207）よりMarathonTM cD
NA Amplification Kit 法で単離された完全長WS-3 cDNA
断片を後述の方法に従い放射性ラベルしてWS-3遺伝子
の検出プローブとし、最終的にKodack社製の X線フィル
ムによるオートラジオグラフィーにより検出した（図４
A 及び図４B）。なお、WS-3プレハイブリダイゼーショ
ンバッファーには 5×SSPE、10×Denhardt's溶液、2%SD
S、100μg/mlの変性サケ精子DNA 断片を含むものを用い
た。
たアガロースゲル、その上にニトロセルロース膜を載
せ、さらに同じ大きさの濾紙、ペーパータオルの束、重
しを載せ、一晩トランスファーさせた。トランスファー
終了後、紫外線照射（波長260 nm、120 mJ/cm2）により
ゲノムDNAをニトロセルロース膜へ固定し、株式会社エ
イジーン研究所が所有するヒト染色体8p11.2-p12.1コン
ティグの構成 PACクローン（#6207）よりMarathonTM cD
NA Amplification Kit 法で単離された完全長WS-3 cDNA
断片を後述の方法に従い放射性ラベルしてWS-3遺伝子
の検出プローブとし、最終的にKodack社製の X線フィル
ムによるオートラジオグラフィーにより検出した（図４
A 及び図４B）。なお、WS-3プレハイブリダイゼーショ
ンバッファーには 5×SSPE、10×Denhardt's溶液、2%SD
S、100μg/mlの変性サケ精子DNA 断片を含むものを用い
た。
【０１１５】ヒト胎盤（レーン１〜５）及びマウス肝臓
（レーン６〜10）由来のゲノムＤＮＡを下記の制限酵素
で消化し（レーン１及び６はＢａｍＨＩ で消化したも
の、レーン２及び７はBglII で消化したもの、レーン３
及び８はEcoRIで消化したもの、レーン４及び９はHindI
II で消化したもの、レーン５及び10はPstIで消化した
ものである）、アガロース電気泳動で分離後、ニトロセ
ルロース膜にブロットした。これに、[32P] で標識した
完全長WS-3 cDNA をプローブとしてハイブリダイズし、
検出した。その結果を図４A及び図４Bに示す。この結果
より、WS-3遺伝子は、ヒトゲノム上でファミリーを形成
して存在している可能性が示唆される。
（レーン６〜10）由来のゲノムＤＮＡを下記の制限酵素
で消化し（レーン１及び６はＢａｍＨＩ で消化したも
の、レーン２及び７はBglII で消化したもの、レーン３
及び８はEcoRIで消化したもの、レーン４及び９はHindI
II で消化したもの、レーン５及び10はPstIで消化した
ものである）、アガロース電気泳動で分離後、ニトロセ
ルロース膜にブロットした。これに、[32P] で標識した
完全長WS-3 cDNA をプローブとしてハイブリダイズし、
検出した。その結果を図４A及び図４Bに示す。この結果
より、WS-3遺伝子は、ヒトゲノム上でファミリーを形成
して存在している可能性が示唆される。
【０１１６】(2) Zoo Blot ９種類のゲノム DNA各４μgをアガロース電気泳動し
て、ナイロン膜にブロットしたプリメイドフィルター
（Clontech社製）を使用した（図４C及び図４D）。WS-3
遺伝子の検出プローブは、前述と同様で、ハイブリダイ
ゼイション及び洗浄条件は、Clontechのプロトコールに
従った。
て、ナイロン膜にブロットしたプリメイドフィルター
（Clontech社製）を使用した（図４C及び図４D）。WS-3
遺伝子の検出プローブは、前述と同様で、ハイブリダイ
ゼイション及び洗浄条件は、Clontechのプロトコールに
従った。
【０１１７】図４C及び図４Dより、WS-3遺伝子は、種を
越えて良く保存されていることがうかがえる。なお、ゲ
ノムDNAの起源は、ａがヒト、ｂがサル、ｃがラット、
ｄがマウス、ｅがイヌ、ｆがウシ、ｇがウサギ、ｈがニ
ワトリ、ｉが酵母である。
越えて良く保存されていることがうかがえる。なお、ゲ
ノムDNAの起源は、ａがヒト、ｂがサル、ｃがラット、
ｄがマウス、ｅがイヌ、ｆがウシ、ｇがウサギ、ｈがニ
ワトリ、ｉが酵母である。
【０１１８】なお、図４A及び図４B、また、図４C及び
図４Dは、それぞれ同一のサンプルをＸ線フィルムで１
日（図４A及び図４C）、及び７日間（図４B及び図４D）
感光後、現像した写真である。
図４Dは、それぞれ同一のサンプルをＸ線フィルムで１
日（図４A及び図４C）、及び７日間（図４B及び図４D）
感光後、現像した写真である。
【０１１９】〔実施例６〕WS-3遺伝子のノーザンブロッ
トによる解析 (1) WS-3遺伝子のノーザンブロットによる解析 本発明に於いては、グリオキサール法により全RNAをア
ガロース電気泳動し、ナイロン膜にトランスファーした
後、cDNAプローブを[32P]-dCTPでラベルして、これをハ
イブリダイズさせた。ここでは実際に以下のRNAサンプ
ルを使ったWS-3cDNA プローブによる解析を示す（図５B
及び５C）。
トによる解析 (1) WS-3遺伝子のノーザンブロットによる解析 本発明に於いては、グリオキサール法により全RNAをア
ガロース電気泳動し、ナイロン膜にトランスファーした
後、cDNAプローブを[32P]-dCTPでラベルして、これをハ
イブリダイズさせた。ここでは実際に以下のRNAサンプ
ルを使ったWS-3cDNA プローブによる解析を示す（図５B
及び５C）。
【０１２０】(i) 全RNAサンプル 健常人繊維芽細胞由来 ・CS-3F0-250（大日本製薬社より市販されている新生児
皮膚） ・Y.H.（男性、35歳、皮膚） ・H.N.（男性、20歳、皮膚） WS患者繊維芽細胞由来 ・WS6201（女性、皮膚） ・WS11901（男性、皮膚） ・WS12301（男性、42歳、皮膚）
皮膚） ・Y.H.（男性、35歳、皮膚） ・H.N.（男性、20歳、皮膚） WS患者繊維芽細胞由来 ・WS6201（女性、皮膚） ・WS11901（男性、皮膚） ・WS12301（男性、42歳、皮膚）
【０１２１】(ii) ヒト多組織ノーザン(MTN) ブロット MTN ブロットＩ及びII 16種類のヒトの組織・臓器より抽出した polyA+ RNA 各
２μgをアガロース電気泳動して、ナイロン膜にブロッ
トしたプリメイドフィルター（Clontech社製）を使用し
た（図５A）。
２μgをアガロース電気泳動して、ナイロン膜にブロッ
トしたプリメイドフィルター（Clontech社製）を使用し
た（図５A）。
【０１２２】(iii) WS-3 cDNA プローブ 株式会社エイジーン研究所が所有するヒト染色体 8p11.
2-p12.1 コンティグの構成 PACクローン(#6207) からMarathonTM cDNA Amplificat
ion Kit法で単離された完全長WS-3 cDNA の3'-UT 部分
を、後述の方法に従い放射性ラベルしてWS-3遺伝子の検
出プローブとして用いた。
2-p12.1 コンティグの構成 PACクローン(#6207) からMarathonTM cDNA Amplificat
ion Kit法で単離された完全長WS-3 cDNA の3'-UT 部分
を、後述の方法に従い放射性ラベルしてWS-3遺伝子の検
出プローブとして用いた。
【０１２３】(iv) ヒトβアクチンcDNAプローブ ヒトβアクチンcDNA（206〜1109ヌクレオチド、904 b
p）部分を、配列番号26及び配列番号27で表されるプラ
イマーを用いたRT-PCRによって増幅、精製し、これをpG
EM-Tベクター（Promega社製）へサブクローニングし
た。このcDNAクローンをマルチクローニングサイトのNc
oIとNotI部位で消化して得られる935 bp断片をプローブ
とした。
p）部分を、配列番号26及び配列番号27で表されるプラ
イマーを用いたRT-PCRによって増幅、精製し、これをpG
EM-Tベクター（Promega社製）へサブクローニングし
た。このcDNAクローンをマルチクローニングサイトのNc
oIとNotI部位で消化して得られる935 bp断片をプローブ
とした。
【０１２４】(2) 全RNAブロッティングフィルターの作
製 (i) 器具および試薬 電気泳動槽、コーム、スターラーバー等の器具はRNase
除去のため、2% Absorb（Dupont社製）に１日浸し、ジ
エチルピロカーボネート（DEPC）処理したミリＱ水でリ
ンスして用いた。試薬については、すべてDEPC-ミリＱ
水で調製し、オートクレーブ滅菌して用いた。
製 (i) 器具および試薬 電気泳動槽、コーム、スターラーバー等の器具はRNase
除去のため、2% Absorb（Dupont社製）に１日浸し、ジ
エチルピロカーボネート（DEPC）処理したミリＱ水でリ
ンスして用いた。試薬については、すべてDEPC-ミリＱ
水で調製し、オートクレーブ滅菌して用いた。
【０１２５】(ii) グリオキサール、ジメチルスルホキ
シド（DMSO）の脱イオン化処理 飽和グリオキサール（ナカライ社製）、DMSO（ナカライ
社製）のそれぞれ20mlに対し、イオン交換樹脂AG501-X8
（BioRad）20 gを加え30分攪拌する。濾過した濾液に再
度、同量の樹脂を加え、pHが6.0以下になるまでこの操
作を繰り返す。最後に1mlずつエッペンドルフチューブ
に分注して-20℃で保存した。
シド（DMSO）の脱イオン化処理 飽和グリオキサール（ナカライ社製）、DMSO（ナカライ
社製）のそれぞれ20mlに対し、イオン交換樹脂AG501-X8
（BioRad）20 gを加え30分攪拌する。濾過した濾液に再
度、同量の樹脂を加え、pHが6.0以下になるまでこの操
作を繰り返す。最後に1mlずつエッペンドルフチューブ
に分注して-20℃で保存した。
【０１２６】(iii) アガロースゲルの作製 １g アガロースME（和光純薬社製）を10mMリン酸ナトリ
ウム（pH 6.5）100mlに溶解して１％アガロースゲルを
作製した。ゲルのサイズは7cm(W)×10cm(L)である。
ウム（pH 6.5）100mlに溶解して１％アガロースゲルを
作製した。ゲルのサイズは7cm(W)×10cm(L)である。
【０１２７】(iv) RNAのグリオキサール処理 RNAとグリオキサールの水素結合による変性状態ではRNa
seによる分解を受けないことから以下の前処理をおこな
った。上述の全RNAサンプル20μgをエタノール沈殿し、
ペレットを風乾した。これを５μlのDEPC-ミリＱ水で溶
解し、これに11μlのグリオキサールミックス[ 58μl脱
イオン化グリオキサール、200μl 脱イオン化DMSO、８
μl 10％SDS、８μl 0.5 Mリン酸ナトリウム(pH 6.5)、
用時調製] を加え50℃で20分間インキュベーションし
た。このときサイズマーカーとしてRNAラダー（GibcoBR
L社製）５μgも同様に前処理した。
seによる分解を受けないことから以下の前処理をおこな
った。上述の全RNAサンプル20μgをエタノール沈殿し、
ペレットを風乾した。これを５μlのDEPC-ミリＱ水で溶
解し、これに11μlのグリオキサールミックス[ 58μl脱
イオン化グリオキサール、200μl 脱イオン化DMSO、８
μl 10％SDS、８μl 0.5 Mリン酸ナトリウム(pH 6.5)、
用時調製] を加え50℃で20分間インキュベーションし
た。このときサイズマーカーとしてRNAラダー（GibcoBR
L社製）５μgも同様に前処理した。
【０１２８】(v) 電気泳動 グリオキサール処理した全RNAサンプルに３μlのゲル・
ローディングバッファー[50％グリセロール、10mMリン
酸ナトリウム(pH7.0)、0.25％ブロモフェノールブル
ー、0.25％キシレンシアノールFF] を加え軽く遠心し
た。これを１％アガロースゲルにローディングして10mM
リン酸ナトリウムバッファー（pH 6.5）中で、80 Vで約
２時間、ブロモフェノールブルーがゲルから流れ出る直
前まで泳動した。泳動中、pH上昇によりRNAからグリオ
キサールが解離するのを防ぐために、泳動バッファーを
マグネティックスターラーで攪拌し、さらに＋、−極の
バッファーをペリスタティックポンプによって循環させ
るようにした。
ローディングバッファー[50％グリセロール、10mMリン
酸ナトリウム(pH7.0)、0.25％ブロモフェノールブル
ー、0.25％キシレンシアノールFF] を加え軽く遠心し
た。これを１％アガロースゲルにローディングして10mM
リン酸ナトリウムバッファー（pH 6.5）中で、80 Vで約
２時間、ブロモフェノールブルーがゲルから流れ出る直
前まで泳動した。泳動中、pH上昇によりRNAからグリオ
キサールが解離するのを防ぐために、泳動バッファーを
マグネティックスターラーで攪拌し、さらに＋、−極の
バッファーをペリスタティックポンプによって循環させ
るようにした。
【０１２９】泳動後、ゲルを50mM水酸化ナトリウム溶液
に20分間浸してグリオキサールを解離させた（この操作
をしないと次の染色がうまくいかない）。50mMリン酸ナ
トリウム（pH 6.5）で20分中和しつつ、１μg/mlのエチ
ジウムブロマイドを添加してRNAの染色をおこなった。
染色したサイズマーカーおよびリボゾームRNAはスケー
ルとともに写真撮影しておいた。
に20分間浸してグリオキサールを解離させた（この操作
をしないと次の染色がうまくいかない）。50mMリン酸ナ
トリウム（pH 6.5）で20分中和しつつ、１μg/mlのエチ
ジウムブロマイドを添加してRNAの染色をおこなった。
染色したサイズマーカーおよびリボゾームRNAはスケー
ルとともに写真撮影しておいた。
【０１３０】(vi) ナイロン膜へのブロッティング 20×SSCバッファーで１晩、キャピラリー法によりナイ
ロン膜、Hybond N+(Amersham社製）へRNAをトランスフ
ァーした。ゲルからナイロン膜（以後、フィルターと呼
ぶ）をはがすときにコームの位置にマーカーをつけ、裏
・表がわかるようにRNAの転写された面の左上の角を切
り落としておいた。２×SSCバッファーでフィルターを1
0分間リンスし、風乾した。フィルターが乾いた後、312
nmのUV光で15秒間暴露し、RNAをフィルターに固定し
た。
ロン膜、Hybond N+(Amersham社製）へRNAをトランスフ
ァーした。ゲルからナイロン膜（以後、フィルターと呼
ぶ）をはがすときにコームの位置にマーカーをつけ、裏
・表がわかるようにRNAの転写された面の左上の角を切
り落としておいた。２×SSCバッファーでフィルターを1
0分間リンスし、風乾した。フィルターが乾いた後、312
nmのUV光で15秒間暴露し、RNAをフィルターに固定し
た。
【０１３１】(3) ハイブリダイゼーション (i) プレハイブリダイゼーション フィルターを弁当箱型ポリスチレン製容器の中で、100
mlのプレハイブリダイゼーションバッファー（WS-3又は
βアクチン・プレハイブリダイゼーションバッファー)
に浸して42℃で４時間インキュベーションした。なお、
WS-3プレハイブリダイゼーションバッファーには50％ホ
ルムアミド、５×SSPE、10×Denhardt's溶液、２％ SDS
及び100μg/ml変性サケ精子DNA断片を含むものを、βア
クチン・プレハイブリダイゼーションバッファーには40
％ホルムアミド、６×SSC、５×Denhardt's溶液、0.5％
SDS及び100μg/ml変性サケ精子DNA断片を含むものを用
いた。
mlのプレハイブリダイゼーションバッファー（WS-3又は
βアクチン・プレハイブリダイゼーションバッファー)
に浸して42℃で４時間インキュベーションした。なお、
WS-3プレハイブリダイゼーションバッファーには50％ホ
ルムアミド、５×SSPE、10×Denhardt's溶液、２％ SDS
及び100μg/ml変性サケ精子DNA断片を含むものを、βア
クチン・プレハイブリダイゼーションバッファーには40
％ホルムアミド、６×SSC、５×Denhardt's溶液、0.5％
SDS及び100μg/ml変性サケ精子DNA断片を含むものを用
いた。
【０１３２】(ii) WS-3 及びβアクチンcDNAプローブの
放射性ラベリング テンプレートとして前述のWS-3 cDNA 断片50ng、プライ
マーとしてランダムヘキサマー50pmolを用い、ランダム
プライマーDNAラベリングキットVer.2（宝酒造社製）に
より[α-32P]-dCTP（NEN社製、第一化学薬品社製）で放
射性ラベルした。βアクチンプローブも同じ方法でラベ
ルした。
放射性ラベリング テンプレートとして前述のWS-3 cDNA 断片50ng、プライ
マーとしてランダムヘキサマー50pmolを用い、ランダム
プライマーDNAラベリングキットVer.2（宝酒造社製）に
より[α-32P]-dCTP（NEN社製、第一化学薬品社製）で放
射性ラベルした。βアクチンプローブも同じ方法でラベ
ルした。
【０１３３】(iii) ハイブリダイゼーション プレハイブリダイゼーションバッファーを棄て、新たに
50mlのプレハイブリダイゼーションバッファーを加え、
気泡がフィルターの下に入りこまないように穏やかに振
盪する。これに[32P]-dCTPで放射性ラベルしたWS-3 cDN
A プローブを比活性が約１×106cpm/mlとなるように加
え、42℃で16時間ハイブリダイズした。
50mlのプレハイブリダイゼーションバッファーを加え、
気泡がフィルターの下に入りこまないように穏やかに振
盪する。これに[32P]-dCTPで放射性ラベルしたWS-3 cDN
A プローブを比活性が約１×106cpm/mlとなるように加
え、42℃で16時間ハイブリダイズした。
【０１３４】ハイブリダイゼーションの後、フィルター
を100ml の２×SSC、0.1％ SDS溶液で室温、15分のリン
スを２回繰り返し、次に100 mlの0.2×SSC、0.1％ SDS
溶液で室温、15分のリンスを２回おこなった。フィルタ
ーはやや湿った状態まで水分を除き、サランラップ（登
録商標；旭化成社製）にはさんでBAS1500システム（富
士フィルム社製）によるオートラジオグラフィー解析を
おこなった。
を100ml の２×SSC、0.1％ SDS溶液で室温、15分のリン
スを２回繰り返し、次に100 mlの0.2×SSC、0.1％ SDS
溶液で室温、15分のリンスを２回おこなった。フィルタ
ーはやや湿った状態まで水分を除き、サランラップ（登
録商標；旭化成社製）にはさんでBAS1500システム（富
士フィルム社製）によるオートラジオグラフィー解析を
おこなった。
【０１３５】(iv) フィルターからのプローブ除去 フィルターを完全に乾燥させないように注意しながら、
0.1×SSC、５％ SDS溶液で20分間煮沸した。煮沸後、室
温に戻るまで静置し、次いでフィルターを濾紙の上に取
り出して風乾した。この濾紙について、次のプローブを
ハイブリダイズする前にオートラジオグラフィーを行う
か、又はFuji BAS1500システム（富士フィルム社製）に
露光してシグナルが消失したことを確認した。
0.1×SSC、５％ SDS溶液で20分間煮沸した。煮沸後、室
温に戻るまで静置し、次いでフィルターを濾紙の上に取
り出して風乾した。この濾紙について、次のプローブを
ハイブリダイズする前にオートラジオグラフィーを行う
か、又はFuji BAS1500システム（富士フィルム社製）に
露光してシグナルが消失したことを確認した。
【０１３６】(4) Fuji BAS1500システムによる解析 BAS1500 システムは輝尽性蛍光体を用いた放射線エネル
ギーメモリ型２次元センサー（イメージングプレート；
IP）にＸ線フィルム同様にサンプルを密着露光させ、こ
のIPをHe-Neレーザー光で励起させ露光量に応じて放出
される蛍光をPSL(Photo Stimulated Luminescence) と
いうデジタル量に変換して定量した。定量値の直線性は
良好でバックグラウンドの減算、指定領域内の放射線強
度の計測、比較が行える。
ギーメモリ型２次元センサー（イメージングプレート；
IP）にＸ線フィルム同様にサンプルを密着露光させ、こ
のIPをHe-Neレーザー光で励起させ露光量に応じて放出
される蛍光をPSL(Photo Stimulated Luminescence) と
いうデジタル量に変換して定量した。定量値の直線性は
良好でバックグラウンドの減算、指定領域内の放射線強
度の計測、比較が行える。
【０１３７】(i) WS-3 mRNA発現の定量 IPの感度をＸ線フィルムの約20倍として、WS-3 cDNA プ
ローブをハイブリダイズさせたフィルターをIPに暗黒下
で３時間、密着露光させた。その結果、約1.0kbpの明瞭
なバンドが検出できた。健常人及びWS患者において、WS
-3 mRNAは、サイズ・発現量とも有意差は認められなか
った。定量は次のようにおこなった。まず、健常人及び
WS患者の各バンドの領域と任意のバックグランド領域を
指定し、各バンドの放射線強度の定量値からバックグラ
ウンドを減算したもので比較をおこなった (表１１)。
ローブをハイブリダイズさせたフィルターをIPに暗黒下
で３時間、密着露光させた。その結果、約1.0kbpの明瞭
なバンドが検出できた。健常人及びWS患者において、WS
-3 mRNAは、サイズ・発現量とも有意差は認められなか
った。定量は次のようにおこなった。まず、健常人及び
WS患者の各バンドの領域と任意のバックグランド領域を
指定し、各バンドの放射線強度の定量値からバックグラ
ウンドを減算したもので比較をおこなった (表１１)。
【０１３８】(ii) サンプル間の標準化 前述の方法に従いWS-3プローブをフィルターから除去し
た。次に、βアクチンプローブを用いて同様のハイブリ
ダイゼーションと定量をおこない、各サンプルのシグナ
ル強度を測定した。すべてのサンプルは線維芽細胞由来
でβアクチンの発現量は同じであるという仮定に基づ
き、WS-3 mRNA の発現量とβアクチンｍＲＮＡの発現量
との比を算出した （表１１)。
た。次に、βアクチンプローブを用いて同様のハイブリ
ダイゼーションと定量をおこない、各サンプルのシグナ
ル強度を測定した。すべてのサンプルは線維芽細胞由来
でβアクチンの発現量は同じであるという仮定に基づ
き、WS-3 mRNA の発現量とβアクチンｍＲＮＡの発現量
との比を算出した （表１１)。
【０１３９】(5) 結果 (i) WS-3 mRNA の組織特異的発現 ヒト各組織・臓器由来の２mg poly(A)+RNAを含むMTN ブ
ロットＩ及びII(CLONTECH社製）に、[32P] 標識した WS
-3 cDNAの 3'-UTをプローブとしてハイブリダイズさせ
た。
ロットＩ及びII(CLONTECH社製）に、[32P] 標識した WS
-3 cDNAの 3'-UTをプローブとしてハイブリダイズさせ
た。
【０１４０】WS-3 mRNAの発現は、各種の臓器で幅広く
認められ、図５A のようなパターンを示した。すなわ
ち、WS-3遺伝子は、心臓、骨格筋及び膵臓に於て強く発
現し、脳、胎盤、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、前立
腺、精巣、卵巣、小腸、大腸において中程度に発現し、
末梢リンパ球に於ては、僅かしか発現していないことが
わかった。Poly(A)+ RNAの起源（図５Ａの各レーン）
は、ａが心臓、ｂが脳、ｃが胎盤、ｄが肺、ｅが肝臓、
ｆが骨格筋、ｇが腎臓、ｈが膵臓、ｉが脾臓、ｊが胸
腺、ｋが前立腺、ｌが精巣、ｍが卵巣、ｎが小腸、ｏが
大腸、ｐが末梢リンパ球のものである。
認められ、図５A のようなパターンを示した。すなわ
ち、WS-3遺伝子は、心臓、骨格筋及び膵臓に於て強く発
現し、脳、胎盤、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、前立
腺、精巣、卵巣、小腸、大腸において中程度に発現し、
末梢リンパ球に於ては、僅かしか発現していないことが
わかった。Poly(A)+ RNAの起源（図５Ａの各レーン）
は、ａが心臓、ｂが脳、ｃが胎盤、ｄが肺、ｅが肝臓、
ｆが骨格筋、ｇが腎臓、ｈが膵臓、ｉが脾臓、ｊが胸
腺、ｋが前立腺、ｌが精巣、ｍが卵巣、ｎが小腸、ｏが
大腸、ｐが末梢リンパ球のものである。
【０１４１】(ii) WS-3 mRNA発現の健常人とWS患者との
比較（図５B及び図５C、表11） 図５B 及び５C に示すノーザンブロット解析の結果を F
uji BAS 1500システムによって定量化した。WS-3 mRNA
の発現をβ−アクチンmRNAで標準化した後、健常人とWS
患者を％表示により比較した。本データでは、３名のWS
患者、３名の健常人の値を比較している。
比較（図５B及び図５C、表11） 図５B 及び５C に示すノーザンブロット解析の結果を F
uji BAS 1500システムによって定量化した。WS-3 mRNA
の発現をβ−アクチンmRNAで標準化した後、健常人とWS
患者を％表示により比較した。本データでは、３名のWS
患者、３名の健常人の値を比較している。
【０１４２】
【表11】
【０１４３】表11中のレーン１〜６は、図５B 中のレー
ン１〜６に対応する。レーン１〜３は健常人の値を示
し、レーン４〜６はWS患者の値を示す。健常人及びWS患
者の約1.0kb WS-3 mRNA の発現については、サイズ及び
発現量ともに両者において差は認められなかった。図５
Cに示したポジティブコントロールであるβ−アクチンm
RNAの発現は、WS患者（レーン４〜６）においても健常
人（レーン１〜３）と同程度の発現が認められた。
ン１〜６に対応する。レーン１〜３は健常人の値を示
し、レーン４〜６はWS患者の値を示す。健常人及びWS患
者の約1.0kb WS-3 mRNA の発現については、サイズ及び
発現量ともに両者において差は認められなかった。図５
Cに示したポジティブコントロールであるβ−アクチンm
RNAの発現は、WS患者（レーン４〜６）においても健常
人（レーン１〜３）と同程度の発現が認められた。
【０１４４】全RNAの由来は、レーン１がCS-3FO-250細
胞由来全RNA 、レーン２が健常人（Y.H.）細胞由来全RN
A 、レーン３が健常人（H.N.）細胞由来全RNA 、レーン
４が患者（WS6201）細胞由来全RNA 、レーン５が患者
（WS11901 ）細胞由来全RNA 、レーン６が患者（WS1230
1 ）細胞由来全RNAである。また、28S及び18S はリボソ
ームRNAサブユニットのサイズの位置を示す。
胞由来全RNA 、レーン２が健常人（Y.H.）細胞由来全RN
A 、レーン３が健常人（H.N.）細胞由来全RNA 、レーン
４が患者（WS6201）細胞由来全RNA 、レーン５が患者
（WS11901 ）細胞由来全RNA 、レーン６が患者（WS1230
1 ）細胞由来全RNAである。また、28S及び18S はリボソ
ームRNAサブユニットのサイズの位置を示す。
【０１４５】以上より、WS-3遺伝子は、種を越えて比較
的良く保存され（図４Ｂ）、かつ、ヒトのさまざまな組
織において高い発現が認められたことから（図５A）、
生体の基本的な恒常性の維持に関わる未知の構成成分を
コードしている遺伝子の一つであることが強く示唆さ
れ、この遺伝子の発現制御の解明は、生体の恒常性維持
を司るメカニズムを解明するうえで有用であり、また、
生命の基本的な恒常性を維持するための新規医薬品の創
製にも有用であると共に、ウェルナー症候群病発症との
関連を解明するための研究にも有用である。
的良く保存され（図４Ｂ）、かつ、ヒトのさまざまな組
織において高い発現が認められたことから（図５A）、
生体の基本的な恒常性の維持に関わる未知の構成成分を
コードしている遺伝子の一つであることが強く示唆さ
れ、この遺伝子の発現制御の解明は、生体の恒常性維持
を司るメカニズムを解明するうえで有用であり、また、
生命の基本的な恒常性を維持するための新規医薬品の創
製にも有用であると共に、ウェルナー症候群病発症との
関連を解明するための研究にも有用である。
【０１４６】また、本発明の遺伝子（WS-3遺伝子）は、
ウェルナー症候群病発症との関連性のある病気の検査・
予防のための診断プローブとして有用である。また、ヒ
ト個体の発生に関する医科学的、あるいはまた、細胞生
物学的、免疫学的、生化学的及び分子生物学的研究のた
めの試薬として、WS-3遺伝子及びそれがコードするタン
パク質、さらにそのタンパク質に対する抗体は有用であ
る。加えて、WS-3遺伝子はトランスジェニック・ノック
アウトマウスを作成し、モデル動物をつくる際に極めて
有用であることは明白である。
ウェルナー症候群病発症との関連性のある病気の検査・
予防のための診断プローブとして有用である。また、ヒ
ト個体の発生に関する医科学的、あるいはまた、細胞生
物学的、免疫学的、生化学的及び分子生物学的研究のた
めの試薬として、WS-3遺伝子及びそれがコードするタン
パク質、さらにそのタンパク質に対する抗体は有用であ
る。加えて、WS-3遺伝子はトランスジェニック・ノック
アウトマウスを作成し、モデル動物をつくる際に極めて
有用であることは明白である。
【０１４７】
配列番号：１ 配列の長さ：９７７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列：
【０１４８】配列番号：２ 配列の長さ：１９０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：
【０１４９】配列番号：３ 配列の長さ：９７７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列：
【０１５０】配列番号：４ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAT TTA GGT GAC ACT ATA G
【０１５１】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG
【０１５２】配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATC TCA GTG GTA TTT GTG AGC
【０１５３】配列番号：７ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTG AAC TGC ACT GTG ACA AGC TGC
【０１５４】配列番号：８ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CAC CTG AGG AGT GAA TTG GTC G
【０１５５】配列番号：９ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGW GNA GWA NCA SAG A
【０１５６】配列番号：１０ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ＡＧＷ ＧＮＡ ＧＷＡ ＮＣＡ ＷＡＧ Ｇ
【０１５７】配列番号：１１ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴： 特徴を表す記号：modified base 存在位置:6 特徴を決定した方法：E 他の情報：Inosine 特徴を表す記号：modified base 存在位置:11 特徴を決定した方法：E 他の情報：Inosine 配列： CAW CGI CNG AIA SGA A
【０１５８】配列番号：１２ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴： 特徴を表す記号：modified base 存在位置:5 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：Ｉｎｏｓｉｎｅ 特徴を表す記号：modified base 存在位置:11 特徴を決定した方法：E 他の情報：Inosine 配列： TCS TIC GNA CIT WGG A
【０１５９】配列番号：１３ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTG ACA AGT GGT TGC ATC ATT GG
【０１６０】配列番号：１４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGA AGT CAT CCC TGA GAA TAC G
【０１６１】配列番号：１５ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCT TCG TCG GGT GCA GAC TGA G
【０１６２】配列番号：１６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC
【０１６３】配列番号：１７ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C
【０１６４】配列番号：１８ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TAT CGG ACC TCG GAC AGT GAT CCA CC
【０１６５】配列番号：１９ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGG CCA ATA GTG ATT GGC GAA GGG AAC C
【０１６６】配列番号：２０ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGG CAC CAA TAA TGT GTT TGA AGT TGG C
【０１６７】配列番号：２１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCC CAA TGA TGC AGC CAC TTG TCA
【０１６８】配列番号：２２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCC ATC TTC ATG GCT TGG GAA TAA CAG C
【０１６９】配列番号：２３ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC
【０１７０】配列番号：２４ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＡＴ ＡＧＧ ＧＣＴ ＣＧＡ Ｇ
ＣＧ ＧＣ
ＣＧ ＧＣ
【０１７１】配列番号：２５ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ＴＴＣ ＴＡＧ ＡＡＴ ＴＣＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＴＴＴ ＴＴＴ
ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＶ Ｎ
ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＶ Ｎ
【０１７２】配列番号：２６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGA CGA GGC CCA GAG CAA GAG AGG
【０１７３】配列番号：２７ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ＣＣＡ ＣＡＴ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＧＧＴ Ｇ
ＧＡ ＣＡＧ
ＧＡ ＣＡＧ
【図１】ＷＳ遺伝子領域のP1/PACクローンの遺伝子物理
地図とWS-3遺伝子及び既知遺伝子の位置を示す図であ
る。
地図とWS-3遺伝子及び既知遺伝子の位置を示す図であ
る。
【図２】WS-3遺伝子がコードするタンパク質を示す模式
図である。
図である。
【図３】WS-3遺伝子を含むPAC クローンを用いたFISHに
よる解析結果を示す写真である（生物の形態）。
よる解析結果を示す写真である（生物の形態）。
【図４】WS-3遺伝子のサザンブロットによる解析結果を
示す電気泳動の写真である。
示す電気泳動の写真である。
【図５】WS-3遺伝子のノーザンブロットによる解析結果
を示す電気泳動の写真である。
を示す電気泳動の写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Claims (15)
- 【請求項１】 配列番号２で表されるアミノ酸配列を実
質的に含むポリペプチドをコードするＷＳ−３遺伝子。 - 【請求項２】 上記遺伝子が、配列番号１又は３で表さ
れる塩基配列のいずれかのものである請求項１記載のＷ
Ｓ−３遺伝子。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載の遺伝子の少なくと
も一部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプロー
ブ。 - 【請求項４】請求項１又は２記載のＷＳ−３遺伝子を含
む組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項４記載の組換え体ＤＮＡによって
形質転換された形質転換体。 - 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培養し、得
られる培養物からＷＳ−３遺伝子がコードするポリペプ
チドを採取することを特徴とする前記ポリペプチドの製
造方法。 - 【請求項７】 配列番号２で表されるアミノ酸配列を実
質的に含む、ＷＳ−３遺伝子がコードするポリペプチ
ド。 - 【請求項８】 請求項７記載のポリペプチドと特異的に
反応するモノクローナル抗体。 - 【請求項９】 請求項７記載のポリペプチドと特異的に
反応するポリクローナル抗体。 - 【請求項１０】 請求項７記載のポリペプチドで免疫さ
れた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させること
により得られる、請求項８記載のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ。 - 【請求項１１】 請求項３記載のオリゴヌクレオチドプ
ローブを含む遺伝子の検出用試薬。 - 【請求項１２】 請求項７記載のポリペプチド、並びに
請求項８記載のモノクローナル抗体及び／又は請求項９
記載のポリクローナル抗体を含む診断用キット。 - 【請求項１３】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の
遺伝子の機能を失った遺伝子が導入されたノックアウト
マウス。 - 【請求項１４】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の
遺伝子の発現レベルを上昇又は下降するように修飾され
た遺伝子が導入されたマウス。 - 【請求項１５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の
遺伝子が導入されたトランスジェニックマウス。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8055144A JPH09238683A (ja) | 1996-03-12 | 1996-03-12 | ウェルナー症候群の原因遺伝子の存在する領域にある新規ｗｓ−３遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8055144A JPH09238683A (ja) | 1996-03-12 | 1996-03-12 | ウェルナー症候群の原因遺伝子の存在する領域にある新規ｗｓ−３遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09238683A true JPH09238683A (ja) | 1997-09-16 |
Family
ID=12990584
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8055144A Pending JPH09238683A (ja) | 1996-03-12 | 1996-03-12 | ウェルナー症候群の原因遺伝子の存在する領域にある新規ｗｓ−３遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09238683A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000011161A1 (fr) * | 1998-08-24 | 2000-03-02 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Nouvelle collectine |
| US7189809B2 (en) | 2000-02-14 | 2007-03-13 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Scavenger receptors |
-
1996
- 1996-03-12 JP JP8055144A patent/JPH09238683A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000011161A1 (fr) * | 1998-08-24 | 2000-03-02 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Nouvelle collectine |
| US7189809B2 (en) | 2000-02-14 | 2007-03-13 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Scavenger receptors |
| US7612174B2 (en) | 2000-02-14 | 2009-11-03 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Scavenger receptor |
| US7612175B2 (en) | 2000-02-14 | 2009-11-03 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Scavenger receptor |
| US8084578B2 (en) | 2000-02-14 | 2011-12-27 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Monoclonal antibody against human scavenger receptor SRCL-P1 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060117 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060704 |