KR100633221B1 - 신규 콜렉틴 - Google Patents

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KR100633221B1
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후소 야쿠힝 고교 가부시끼가이샤
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Abstract

특히 체내에서 항균성, 항바이러스 활성등을 발현할 것으로 기대되는 신규 콜렉틴 관련 분자들, 즉, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 신규 콜렉틴 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 신규 콜렉틴, 및 이 분자들을 사용하는 방법을 제공한다.
신규 콜렉틴*항균성*항바이러스성

Description

신규 콜렉틴{Novel collectin}
본 발명은 생물학적 방어 시스템의 메카니즘을 연구하기에 유용하고, 항-바이러스 활성 등을 함유한 생리학적 활성을 가지고 있어 의약품용도로서 응용이 가능할 것으로 기대되는 신규 콜렉틴(collectin)에 관한 것이다.
콜렉틴은 Ca2+ 요구성의 당인식영역(Carbohydrate Region Domain; CRD) 및 콜라겐형 영역을 갖는 단백질의 일반 명칭이다. 상당수의 이러한 단백질은 세균 및 바이러스와 같은 광범위한 미생물에 대한 기초 면역 시스템에 관여하는 것으로 알려져 있다.
이전에 확인된 콜렉틴은 만난(mannan)-결합 단백질(MBP), 표면활성제 (surfactant) 단백질 A (SP-A), 표면활성제 단백질 D (SP-D) 및 교착소(conglutinin) 등을 포함한다. 이들 콜렉틴은 (1) Ca2+-요구성 당인식영역(CRD)과 (2) 콜라겐형 영역의 특징적인 영역을 함유하는 기본 구조(도 1)로 구성된 것이 공지되어 있고[Malhortra et al., Eur.J.Immunol. Vol.22, 1437-1445, 1992], 서브유닛은 콜라겐형 영역내의 3중 헬릭스를 이루는 3개의 기본 구조로부터 형성될 수 있고, 더구나, 이러한 서브유닛은 올리고머, 예를 들면, 3중체, 4중체, 및 6중체를 형성할 수 있다.
척추동물에서, 세포를 매개로 하는 면역반응 및 특이적 항체 반응을 포함하는 매커니즘은 병원성 세균 및 바이러스 등의 침입에 대한 주된 숙주-방어 시스템으로 여겨지고 있다. 최근, 교착소등의 렉틴(lectin)이 비특이적 면역 반응에 관여하는 것이 제시되었는데, 예를 들어, 렉틴이 모성 항체가 불충분하고 특이적인 방어 시스템이 미숙한 유아에 대해 다양한 미생물의 중화작용과 제거에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다[Super et al., Lancet, Vol.2, 1236-1239, 1989].
더욱이, 생물학적 숙주-방어 시스템에서 렉틴의 역할에 관하여, 숙주는 예를 들어 MBP 유전자상의 유전적 돌연변이로 인한 혈중 MBP 농도의 저하에 의해 감염되기가 쉽다고 보고되었다[Sumiya et al., Lancet, Vol.337, 1567-1570, 1991].
본 발명자들은 교착소 및 만난-결합 단백질이 H1 및 H3 타입 인플루엔자 A 바이러스의 감염 및 적혈구응집 활성을 억제할 수 있다는 것을 이전에 발견하였다[Wakamiya et al., Glycoconjugate J., Vol. 8, 235, 1991; Wakamiya et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., Vol.187, 1270-1278, 1992].
이후, 본 발명자들은 교착소를 코딩하는 cDNA 클론을 분리하고, 교착소 유전자 및 다양한 표면활성제 단백질 D 유전자간에 밀접한 관련성이 있음을 발견하였다[Suzuki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., Vol.191, 335-342, 1993].
따라서, 콜렉틴은 생물학적 방어 매커니즘을 연구하기에 유용하고, 생리학적 활성 의약물질로서 유용한 것으로 기대되고 있다. 그러므로, 이 계열(family)에 속하는 신규한 분자종의 발견은 감염성 질병의 치료를 포함하는 다양한 의료분야 및 생물학적 분야에 크게 기여하는 것일 것이다.
<발명의 개시>
본 발명은 관련된 분야 기술을 고려하여 이루어진 것으로, 본 발명의 목적은 특히 인체에서 항균성, 항바이러스 활성과 같은 생리학적 활성을 나타낼 수 있는 것으로 기대되는 신규 콜렉틴을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 신규 콜렉틴 유전자 및 콜렉틴의 특징적인 구조를 갖는 단백질을 제공하고, 이는 하기와 같은 점에서 선행기술과 구별된다:
[1] 서열번호:2의 제 206-547 위치에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
[2] 서열번호:2의 제 229-547 위치에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
[3] 서열번호:1의 제 670-1695 위치에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
[4] 서열번호:1의 제 739-1695 위치에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
[5] 콜렉틴 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서, 서열번호:4 및 서열번호:5의 염기서열를 갖는 프라이머를 사용하여 수행되는 PCR 반응의 증폭 생성물 인 프로브와 스트린전트(stringent) 조건하에서 하이브리드를 형성할 수 있는 폴리뉴클레오타이드;
[6] [1] 내지 [5]에 기재된 폴리뉴클레오타이드와 스트린전트 조건하에서 하이브리드를 형성할 수 있는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 단백질이 (1) Ca2+ 요구성의 당인식영역(CRD) 및 (2) 콜라젠형 영역을 함유하고, 인간 콜렉틴인 폴리뉴클레오타이드;
[7] [3] 내지 [6]에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 신규 콜렉틴;
[8] 서열번호:2의 제 206-547 위치의 아미노산 서열을 포함하는 신규 콜렉틴;
[9] 서열번호: 2의 제 229-547 위치의 아미노산 서열을 포함하는 신규 콜렉틴;
[10] [7] 내지 [9]에 기재된 신규 콜렉틴의 아미노산 서열에 있어서 한개 이상의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 이아미노산 서열이 1) Ca2+ 요구성의 탄소화물 인식 영역(CRD) 및 (2) 콜라겐형 영역에 상응하는 서열을 포함하는 신규 콜렉틴.
도 1은 종래 보고된 주요한 콜렉틴의 기본 구조 및 단백질의 개략도이다.
도 2는 종래 보고된 3종류의 콜렉틴의 아미노산 서열의 얼라인먼트(alignment) 전반부를 도시한 것이다.
도 3은 도 2와 동일하게 얼라인먼트의 후반부를 도시한 것이다.
도 4(b)는 본 발명의 신규 콜렉틴의 염기서열을 결정하기 위하여 사용한 각 프라이머의 명칭 및 서열기(sequencer)에 의해 해독되는 염기서열을 도시한 것이고, 도 4(a)는 수득된 신규 콜렉틴의 ORF를 도시한 것이다.
도 5는 종래 보고된 3종류의 콜렉틴 및 본 발명의 신규 콜렉틴의 아미노산 서열의 얼라인먼트의 전반부를 도시한 것이다.
도 6은 도 5와 동일하게 얼라인먼트의 후반부를 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 신규 콜렉틴의 게놈 서던 분석의 결과를 도시한 것으로, 각 라인에서 사용된 제한 효소는 (1)EcoR I, (2)Xba I, (3)Hind Ⅲ, (4)Pst I, (5)Bg1 Ⅱ 및 (6)Bam HI이다.
도 8은 본 발명의 신규 콜렉틴의 장기분포를 도시한 것으로, 인간의 조직, 즉 (1)뇌, (2)심장, (3)신장, (4)지라, (5)간, (6)소장, (7)근육조직, (8)정관, (9)태반 또는 (10)대장에서의 mRNA의 발현분포의 분석결과를 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 신규 콜렉틴의 종간 보존성을 도시한 것으로, 각종의 척추동물, 즉 (1)사람, (2)원숭이, (3)래트, (4)마우스, (5)개, (6)소, (7)토끼 및 (8)닭에서의 게놈 서든 분석의 결과를 도시한 것이다.
도 10은 다양한 콜렉틴의 유전적 계통도(phylogenetic tree)이다.
도 11은 본 발명의 신규 콜렉틴을 발현하는 벡터의 구조를 도시한 모식도이다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 [1] 내지 [6]의 상술한 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 cDNA이다.
상기 [2]의 폴리뉴클레오타이드는 적어도 서열번호:2의 제 229-547 위치에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하지만, 제1 메티오닌 잔기의 상류에, 추가의 염기서열, 예를 들면, 서열번호: 2의 제 226-228위치 또는 제 211-228 위치, 또는 서열번호: 2의 제 102-228 위치, 제 91-228 위치, 제 9-228 위치, 제 1-228 위치 등의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 염기서열을 함유할 수 있다.
또한, 상기 [4]의 폴리뉴클레오타이드는 염기서열 5' 상류에 추가로 서열번호: 1의 제 730-738 위치 또는 제 685-738 위치, 또는 제 358-738 위치, 제 325-738 위치, 제 79-738 위치, 제 55-738 위치 또는 제 1-738위치에 나타낸 염기서열을 더 포함할 수 있다.
추가로, 상기 [3] 또는 [4]의 폴리뉴클레오타이드는 이의 3' 하류에 서열번호:1의 제 1696-204 위치에 나타낸 염기서열을 포함한다.
또한, 본 발명의 단백질 [7] 내지 [10]은 인체에서 항균, 항바이러스 활성 등을 나타낼 수 있는 것으로 기대되기 때문에, 생리학적으로 활성을 갖는 의약물질로서의 유용성을 고려할 때 사람으로 부터 유래된 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 사람유래의 신규 콜렉틴을 예상하고, 다양한 인간 조직을 검사한 바, 유용한 것으로 여겨지는 신규 콜렉틴이 인간태반 등에서 발현되어 있는 것이 나타났다.
또한, 상기 [9]의 신규한 콜렉틴은 적어도 서열번호: 2의 제 229-547 위치에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하고, 서열번호: 2의 제 226-228 위치 또는 제 211-228 위치의 아미노산 서열 또는 서열번호: 2의 제 102-228위치, 제 91-228 위치, 제 9-228 위치, 제 1-228 위치의 아미노산 서열이 제 1 메티오닌 잔기의 상류에 추가로 포함될 수 있다.
상기 [5] 및 [6]의 발명에서 스트린전트 하이브리드 형성 조건은 예를 들어 5×SSC(20×SSC(3M NaCl, 0.3M 시트르산나트륨)를 4배 희석하여 제조), 1% 블로킹제(Boehringer Mannheim), 0.1% N-라우로일 살코신, 및 0.02% SDS의 용액에서, 68℃로 1시간동안 예비하이브리드 형성(prehybridization); cDNA 프로브(10ng/㎖)를 함유하는 5×SSC, 1% 블로킹제(Boehringer Mannheim), 0.1% N-라우로일 살코신, 및 0.02% SDS의 용액에서 55℃로 16시간동안 하이브리드 형성; 2×SSC/0.1% SDS용액으로 5분간 2회 세척; 및 55℃에서 0.5×SSC/0.1% SDS용액으로 15분간 2회 세척을 행하는 일련의 하이브리드 형성을 위한 단계가 포함된다. 그러나, 용액의 농도, 온도 및 시간과 같은 상기 조건은 당분야의 지식에 기초하여 적의하게 변경할 수 있다.
또한 상기 [10]에서 하나이상의 아미노산의 결실, 치환 및/또는 부가는 신규 콜렉틴의 아미노산 잔기의 친수성/소수성, 또는 산성/염기성에 크게 변화를 일으키지 아니하고, (1) Ca2+ 요구성 당인식영역(CRD) 및 (2) 콜라젠형 영역이 갖는 각각 의 특성을 크게 변화시키지 아니하는 범위내에서 가능하다.
이전에 보고된 콜렉틴계에 속하는 단백질의 아미노산 서열 및 구조를 근거로하여, 예를 들어, (1) Ca2+ 요구성의 당인식영역 (CRD) 중 1-10개의 아미노산 잔기 및 (2) 콜라젠형 영역 중 1-100, 바람직하게는 1-15개의 아미노산 잔기를 결실, 치환 및/또는 부가하는 것이 가능하다.
본 발명은 또한 신규 콜렉틴을 발현시킬 수 있는 방식으로 상술된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
폴리뉴클레오타이드가 삽입되는 벡터는 플라즈미드, λ-파아지 및 코스미드(cosmid)와 같은 레플리콘(replicon)에 상기 신규 콜렉틴을 도입하여, 신규 콜렉틴이 복제되고 발현될 수 있도록 한 것을 의미한다. 예를 들어, 코스미드보다 긴 DNA 단편을 클로닝할 수 있는 벡터로는 P1 파아지, F 인자 및 효모의 인공 염색체 YAC 등을 포함할 수 있다. 또한, λ-파아지는 치환형벡터 및 삽입형 벡터를 포함하고, 삽입되는 유전자의 길이에 따라 적의하게 선택될 수 있다. 더욱이, 동물 세포에서 발현가능한 공지의 벡터로는 예를 들어, SV40계 벡터, 소 파필로마 바이러스 벡터(bovine papiloma virus vector), 허피스 바이러스 벡터(herpes virus vector), 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터(poxvirus vector) 및 레트로바이러스 벡터(retrovirus vector) 등을 포함한다. 시판되는 벡터에는 pUC19, pTV118N (Takara Shuzo Co., Ltd.), pUEX2(Amersham), pGEX-4T, pKK233-2(Pharmacia), pMAM-neo (Clontech), pGL2 (Promega) 및 pDNA3.1+ (Invitrogen)등 이 포함될 수 있다. 상기 벡터는 특별한 제한없이 제한효소, 리가아제(ligase) 등을 사용하여 통상적인 방법으로 제작할 수 있다.
세균, 특히 대장균이 상술한 벡터로 형질전환 또는 형질감염되는 숙주로서 사용되는 경우, 벡터는 통상적으로 프로모터 영역(프로모터, 오퍼레이터 및 샤인-달카르노 서열(Shine-Dalgarno sequence)포함), 개시 코돈, 신규 콜렉틴을 코딩하는 염기서열, 종결 코돈, 종결 부위 등을 포함할 수 있다. 숙주로서 효모 또는 동물세포가 사용되는 경우, 벡터는 적어도 프로모터, 개시 코돈, 시그날 펩티드 및 신규 콜렉틴를 코딩하는 염기서열 및 종결 코돈을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 인헨서(enhancer) 서열, 신규 콜렉틴의 5'- 및 3'-비번역 부위, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐화 부위 및 선택표지가 벡터내로 또한 삽입될 수 있다.
본 발명의 벡터내로 삽입되는 프로모터로서, 종래 공지된 SV40(Simian Virus 40), SRα, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 엑틴 프로모터, 바이러스성 LTR(Long Terminal Repeat)(예: HTLV-1 LTR, HIV-LTR, 라우스 사르코마 바이러스(Rous sarcoma virus ) LTR), 및 허피스 심플렉스 타이로신 키나아제 바이러스 프로모터(herpes simplex tyrosine kinase virus promoter )등이 강한 프로모터인지 약한 프로모터인지와 무관하게 사용될 수 있다.
섬유아세포, 신경세포, 혈액세포, 실질(實質)세포 등의 정상세포로부터 암세포에 이르는 다양한 세포종의 진핵 세포에서 발현을 기재하는 경우, 일반적으로 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 티미딘 키나아제(TK), β-엑틴 및 SV40 초기 유전자 프로모터 등이 프로모터로서 사용될 수 있다. 인헨서는 통상적으로 프 로모터 서열과 결합되어 있기 때문에 그대로 사용할 수 있다.
더욱이 유전자가 삽입되고 발현되는 세포 및 조직이 특정되는 경우, 세포에 대해 특이적인 프로모터가 선택될 수 있다. 추가로, 동종 또는 이종 방식으로 상기 프로모터를 조합함으로써, 고 발현이 기대될 수 있고, 신규 콜렉틴이 안정적으로 수득될 수 있는 효과를 발휘한다.
반면, 원핵세포에서 사용되는 프로모터에는 PBAD, PL, trc, T7, SP6, T3, lac 등이 포함될 수 있다.
원칙적으로, 원핵세포 중에서 선택된 세포에서 신규한 콜렉틴을 고 발현시킬 수 있는 프로모터를 적의하게 선택할 수 있고, 프로모터가 숙주에 적합하다면 본 발명의 프로모터로서 사용할 수 있다. 더욱이, 유전자가 삽입되고 발현되는 세포 및 조직이 특정되는 경우, 세포에 특이적인 프로모터가 선택될 수 있다. 추가로, 동종 또는 이종 방식으로 상기 프로모터를 조합함으로써, 고 발현이 기대될 수 있고, 신규 콜렉틴이 안정적으로 수득될 수 있는 효과를 발휘한다.
반면, 효모에서 사용되는 프로모터에는 GAL1, AOX1, CUP1, 및 PGK 등이 포함될 수 있다.
목적하는 벡터만을 회수하기 위해 상술한 벡터에 삽입된 선택표지로는 디하이드로포레이트 환원효소(dihydrofolate reductase , 이후, DHFR로 약칭) 유전자, 메토트렉세이트 내성 유전자(methotrexate resistant gene) 및 neo 유전자(G18 내성 유전자)가 포함될 수 있고, 예를 들어, DHFR 유전자가 결실된 CHO 세포를 사용하여 DHFR 유전자를 선별 표지로서 사용하는 경우, 티미딘이 없는 배지로 선별작업 을 수행할 수 있다. 추가로, 메토트렉세이트 농도가 높은 배지에서 세포를 배양하고 내성 세포를 선별함으로써 유전자를 세포에서 발현시키는 경우에, 고 발현되는 세포주를 수득할 수 있다.
본 발명은 또한 구축된 벡터로 형질감염 또는 형질전환되어 본 발명의 신규콜렉틴을 발현할 수 있는 동물 세포, 곤충 세포 및 미생물 세포(대장균, 바실러스 서브틸리스, 효모 등) 등의 숙주세포를 계획한다.
본 발명의 숙주 세포로서 사용된 동물 세포는 그 종류가 특별히 한정되지는 않지만, 인간으로부터 유래된 세포들을 포함할 수 있다. 예를 들어, CHO 세포, COS 세포, BHK 세포, Vero 세포, 골수종 세포(myeloma cell), HEK293 세포, HeLa 세포, Jurkat 세포, 마우스 L 세포, 마우스 C127 세포, 마우스 FM3A 세포, 마우스 섬유아세포, 조골세포(osteoblast), 연골 세포(cartilage cell ) 등이 포함될 수 있다. 또한, 미생물 세포로서, 예를 들어 대장균, 바실러스 서브틸리스 등의 세균, 및 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 맥주 효모 등의 효모균이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명에 의해, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편을 포함하는 신규 콜렉틴 관련 분자종을 스크리닝하기 위한 프로브가 제공된다. 신규 콜렉틴 관련 분자종은 도 10에 도시된 공지된 콜렉틴에 포함되지 않으며, 도 1에 도시된 바와 같은 특징적인 구조를 갖는 신규 콜렉틴의 분자종을 의미한다. 본 발명의 프로브를 사용하여, 다양한 생물종의 조직 세포등에서 얻은 유전자와 프로브간의 하이브리드 형성능을 조사하고, 비교적 스트린전트 조건하에서 프로브와 하이브리드를 형성할 수 있는 유전자를 탐색하여 목적하는 신규 콜렉틴 관련 분자종을 코딩하는 유전자를 스크리닝하는 것에 의해 목적하는 신규 콜렉틴 관련 분자종을 획득할 수 있다. 상술한 폴리펩티드 단편 중에서, 탄수화물 인식 구조 영역을 포함하는 서열번호: 1의 제 1291-1698 위치중의 적어도 연속 10개 염기이상의, 바람직하게는, 연속 20개 염기이상의 염기서열을 포함하는 단편, 또는 콜라겐형 영역을 포함하는 서열번호: 1의 제 796-1236 위치의 서열 중 연속 10개 염기이상의, 바람직하게는, 연속 20개 염기 이상의 서열을 포함하는 단편이 특이성(specificity) 면에서 볼 때 프로브를 구성하기 위한 폴리뉴클레오타이드로서 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따라 수득된 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자를 인식하는 항체를 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "유래분자"는 신규 콜렉틴과 동일한 특성을 갖는 단편(예를 들어, 당인식영역 및/또는 콜라겐형 영역을 포함하는 단편), 신규 콜렉틴의 전구체, 및 스트린전트 조건하에서 단편, 전구체, 및/또는 이에 상보적인 핵산서열을 코딩하는 염기서열과 하이브리드를 형성할 수 있는 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드들 포함할 수 있다.
신규 콜렉틴 및/또는 유래분자에 대한 항체(예: 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 펩티드 항체) 또는 항-혈청은 본 발명의 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자, 또는 이를 함유하는 단백질을 항원으로 사용하여 공지된 항체 또는 항-혈청 생성 방법에 따라 제조할 수 있다. 즉, 본 발명의 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자 또는 이를 함유하는 융합 단백질을 항원으로 하여, 투여를 통해 항체생산이 가능한 부위에 단독으로 또는 희석제 또는 담체와 조합하여 온혈 동물에 투여할 수 있다. 투여시, 항체의 생산을 증가시키기 위해서 플로인트(Freund)의 완전 아쥬번트(Freund's complete adjuvant) 또는 플로인트의 불완전 아쥬번트가 투여될 수 있으며, 통상적으로 1-6주당 1회, 총 2-10회 투여될 수 있다. 적용되는 온혈동물에는 예를 들어 원숭이, 토끼, 개, 기니아 피그, 마우스, 래트, 양, 염소, 닭 등이 포함될 수 있고, 마우스 및 래트가 바람직하다. 래트 중에서, 위스타 및 SD 종 래트 등이 바람직하고, 마우스 중에는 BALB/c, C57BL/6 및 ICR 종 등이 바람직하게 사용될 수 있다.
세포를 생산하는 모노클로날 항체가 제조될 경우, 항체가(antibody titer)가 밝혀진 개체가 온혈동물(예: 마우스)로부터 선택되고, 이후 지라 또는 림프절의 최종 면역화이후 2-5일에 회수한다. 이후 골수종 세포와 이에 포함된 항체 생성 세포간의 융합에 의해 모노클로날 항체 생성 하이브리도마를 수득한다. 항혈청내의 항체가는 항혈청과 후술하는 표지화된 신규 콜렉틴과 항혈청과의 반응 또는 신규 콜렉틴을 반응시킨 후 항체에 결합된 표지화제의 활성을 측정함으로써 결정할 수 있다. 융합조작은 공지의 방법, 예를 들면, Kohler and Milstein's method(Nature, 256:495, 1975) 및 이의 변형된 방법(J.Immunol. Method. 39: 285, 1980; Eur. J. Biochem., 118; Nature, 285:446, 1980)에 따라 수행한다. 융합촉진제로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 센다이 바이러스(Sendai virus) 등, 바람직하게는 PEG가 사용될 수 있다. 융합효율을 더 증진시키기 위해, 렉틴, 폴리-L-라이신 또는 DMSO가 임의양(ad libitum)으로 첨가될 수 있다.
골수종 세포는 예를 들어 X-63Ag8, NS-1, P3U1, SP2/0, AP-1 세포 등을 포함할 수 있으나, SP2/0이 바람직하게 사용될 수 있다. 항체 생성 세포(비장세포; (splenocyte))의 수와 골수종 세포의 수간의 적합한 비율은 1:20-20:1일 수 있고 세포 융합은 대략 10-80%의 농도에서 PEG(바람직하게 PEG 1000-PEG 6000)를 첨가하고, 20-24℃, 바람직하게 30-37℃에서 1-10분동안 배양함으로써 효과적으로 수행할 수 있다. 비록 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자에 대한 항체를 생성하는 하이브리도마를 스크리닝하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있지만, 예를 들어, 신규 콜렉틴 항원을 직접 또는 담체와 같이 흡착시킨 고체상(예를 들면, 마이크로플레이트)에 하이브리도마 배양 상청액을 첨가한 다음, 여기에 방사성 물질, 효소 등으로 표지화된 항-면역글로블린 항체를 또는 단백질 A를 첨가하여, 고체상에 결합된 항-신규 콜렉틴 항체를 검출하는 방법; 및 항-면역글로블린 항체 또는 단백질 A가 흡착된 고체상에 하이브리도마 배양 상청액을 첨가하고, 방사성 물질, 효소 등으로 표지화된 신규 콜렉틴을 첨가한 다음, 고체상에 결합된 항-신규 콜렉틴 모노클로날 항체를 검출하는 방법을 적용할 수 있다.
신규 콜렉틴 및/또는 유래분자에 대한 모노클로날 항체의 선별 및 클로닝은 당분야에 공지된 방법 또는 거기에 준하는 방법에 따라 수행할 수 있다. 일반적으로 HAT(하이포잔틴(hypoxantine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine))를 첨가한 동물세포용 선별배지에서 수행될 수 있다. 선별, 클로닝 및 성장을 위한 배지로서, 하이브리도마가 그속에서 성장할 수 있다면 어떤 배지도 사용가능하다. 예를 들어, 우태아혈청을 1-20%, 바람직하게는 10-20% 함유 하는 RPMI 배지, 우태아혈청을 1-10% 함유하는 GIT 배지, 및 하이브리도마 배양용 무혈청 배지등이 사용될 수 있다. 배양온도는 약 37℃가 바람직하다. 배양기간은 통상적으로 5일에서 3주, 바람직하게는 1주일 내지 2주일이다. 일반적으로 배양은 5% 이산화탄소 기체 존재하에서 수행한다. 하이브리도마 배양 상청액의 항체가는 상술한 항혈청중의 항-신규 콜렉틴 항체가의 측정에 사용된 방식과 유사한 방식으로 측정할 수 있다. 구체적으로, 측정 방법으로는 방사선면역측정법(radioimmunoassay method; RIA법), 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay method; ELISA법), 형광면역측정법(Flurescene immunoassay method; FIA법), 플라크측정법(plque assay method) 및 응집반응법 등이 사용될 수 있으나, 후술하는 ELISA법이 바람직하게 사용될 수 있다.
면역 항원에 대한 경우와 유사한 방식으로 제조된 단백질을 ELISA 플레이트의 각 웰의 표면에 고정시킨다. 그 다음, 비특이적 흡착을 방지하기 위해, 소혈청 알부민(BSA), 마우스 혈청 알부민(MSA), 오보알부민(ovoalbumin: OVA), 젤라틴 및 탈지유 등을 고정시킨다. 하이브리도마 배양 상청액을 각 웰에 첨가하고, 일정시간 방치하여 면역반응이 행해지도록한다. 세척액으로 인상완충액생리식염수(PBS) 등을 사용하여 각 웰을 세척한다. 세척액에 계면활성제를 첨가하는 것이 바람직하다. 효소-표지화 된 이차항원을 첨가하고, 일정시간 방치한다. 표지효소로서는 β-갈락톡시다아제, 알카리 포스파타아제, 퍼옥시다아제 등이 사용될 수 있다. 각 웰을 동일한 세척액으로 세척한 후, 사용된 표지화 효소에 대한 기질 용액을 첨가하고, 효소반응시킨다. 목적하는 항체가 첨가된 하이브리도마 배양 상청액에 존재하는 경우, 효소반응이 진행되면 기질 용액의 색이 변화한다.
클로닝은 일반적으로 반-고체 아가법(semi-solid agar method), 제한 희석 배양법등 당분야에서 공지된 방법으로 행한다. 구체적으로 상기한 방법으로 목적하는 항체를 생성되는 웰을 확인한 후, 클로닝하여 단일 클론을 수득한다. 클로닝법으로는 하이브라도마 세포가 희석되고 배양되어 배양 플레이트의 웰당 하나의 콜로니를 형성하는 제한 희석 배양법이 사용될 수 있다. 제한 희석 배양법에 의한 클로닝에서는 콜로니 형성능을 향상시키기 위해서 지지세포(feeder cells)를 사용하거나, 인터루킨 6과 같은 세포성장인자를 첨가할 수 있다. 선택적으로, FACS(fluorescence activated cell sorter: 형광표지세포분리기) 및 단일 세포 조작법을 사용하여 클로닝할 수 있다. 클론된 하이브리도마는 무혈청 배지에서 배양하는 것이 바람직하고, 최적의 양의 항체를 상청액에 첨가한다. 그러므로 수득된 단일 하이브리도마를 플라스크 또는 세포 배양 장치를 사용하여 대규모로 배양하거나, 그러하지 않은 경우 동물에서 복강내 배양을 수행하여[J. Immunol. Meth., 53: 313, 1982] 모노클로날 항체를 수득할 수 있다. 플라스크내에서의 세포 배양은 태아 카프 혈청(Fetal calf serum; FCS) 0-20%를 포함하는 세포배양용 배지(IMDM, DMEM, RPMI 1640, MEM 등)를 사용하여 수행할 수 있다. 동물의 복강내에서 배양이 수행되는 경우, 세포 융합에 사용되는 골수종 세포에서 유래된 동물과 동일한 종, 동일한 계통의 동물, 흉선없는 마우스 등을 사용하는 것이 바람직하고, 프리스탄(pristan)과 같은 미네랄 오일을 사전 투여한 후 하이브리도마를 이식한다. 1-2주후, 골수종 세포가 복강내에서 증식되고, 모노클로날 항체를 포함하는 복수(腹水)를 회수할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체는 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자에 특이적인 에피토프를 인식하는 것을 선별함으로써 기타 단백질과의 가교 반응을 일으키지 않는 것이 수득될 수 있다. 일반적으로, 단백질을 구성하는 아미노산 서열중에 연속한 적어도 3개 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 7~20아미노산의 아미노산 서열에 단백질의 고유의 에피토프를 나타내는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체는 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자중에 제시된 아미노산 서열로부터 선택된 펩타이드로부터 구성되고, 본 발명에 의한 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자에 특이적인 모노클로날 항체를 나타내는 적어도 세 개 연속의 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열을 갖는다. 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자에 기재된 아미노산 서열을 통해 보존된 아미노산 서열이 선택되는 경우, 신규 콜렉틴계에 대한 공통의 에피토프가 선택될 수 있다. 또한, 각각의 서열에 대해 특이적인 아미노산 서열을 포함하는 영역이 선택되는 경우, 각각의 단백질을 식별할 수 있는 모노클로날 항체가 선택될 수 있다.
신규 콜렉틴 및/또는 유래분자에 대한 모노클로날 항체의 분리 및 정제는 일반적인 폴리클로날 항체의 경우와 유사하게 면역글로블린의 분리 및 정제법에 따라 수행될 수 이다. 공지된 정제방법, 예를 들면 염석(salting-out)법, 알콜 침전법, 등전점 침전법, 전기영동법, 암모니움 설페이트 침전법, 이온교환(예: DEAE(디에틸아미노에틸) 세파로즈 등)에 의한 흡탈착법, 초원심분리법, 겔여과법, 항체 결합 고체상, 단백질 A, 단백질 G 등과 같은 활성 흡착제로 항체만을 수집하고 결합 을 해리시켜 항체를 수득하는 특이적정제법으로 수행될 수 있다. 정제 공정 동안 항체가의 감소 및 응집물 형성을 억제하기 위하여, 예를 들어 사람 혈청 알부민을 0.05-2%의 농도로 첨가한다. 추가로, 글리신, α-알라닌 등의 아미노산류, 특히 라이신, 아르기닌, 히스티딘 등의 염기성 아미노산, 글루코즈, 만니톨 등의 당류 또는 염화나트륨 등의 염류를 첨가하는 것이 바람직하다. IgM 항체의 경우, 특히 응집하기 쉬운 것으로 공지되어 있으므로, β-프로피오노락톤(b-propionolacton ) 및 아세트산 무수물로 처리하는 것이 바람직하다.
본 발명의 폴리클로날 항체는 당업계에서 공지된 방법 또는 이에 준하는 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어 면역 항원(단백질 항원) 자체, 또는 제조된 담체 단백질과의 복합체를 모노클로날 항체를 생산하는 상술된 방법과 유사하게 온혈 동물을 면역화시키는데 사용될 수 있고, 따라서, 모노클로날 항체가 각 면역동물로부터 본 발명의 단백질 또는 이의 단편에 대한 항체를 함유하는 물질을 수집하고, 분리 및 정제함으로써 생성될 수 있다. 온혈동물의 면역화에 사용되는 면역 항원과 담체 단백질의 복합체에 있어서, 담체 단백질의 종류 및 담체와 합텐(hapten)의 혼합비율은 담체에 가교시키고 면역화하여 합텐에 대한 항체를 효과적으로 생성할 수 있으면 어떤 종류를 어떤 비율로 가교시켜도 좋지만, 예를 들어, 소혈청 알부민, 소 티로글로블린(bovine thyroglobulin), 헤모시아닌(hemocyanin) 등을 중량비로 합텐 1에 대해 약 0.1-20, 바람직하게는 약 1-5의 비율로 합텐과 결합시키는 방법이 적용될 수 있다. 또한, 다양한 축합제를 합텐과 담체의 결합에 사용할 수 있지만, 글루타알데히드 또는 카보디이미드, 말레이미드 활성 에스테르, 티올기 또는 디티오피리딜기을 포함하는 활성 에스테르 시약 등을 사용할 수 있다. 축합 생성물을 온혈동물에 대해서 항체 생산이 가능한 부위에 단독으로 또는 담체 또는 희석제와 조합하여 투여할 수 있다. 투여시, 항체의 생산을 증가시키기 위해서 플로인트의 완전 아쥬번트 또는 플로인트의 불완전 아쥬번트가 투여될 수 있다. 통상적으로 매 2-6주마다 한번씩, 총 약 3-10회 투여할 수 있다. 폴리클로날 항체는 혈액, 복수(腹水) 등으로부터 수집될 수 있고, 바람직하게는 상술한 방법으로 면역화시킨 온혈동물의 혈액으로 부터 수집될 수 있다. 항혈청중 폴리클로날 항체가는 상술한 혈청의 항체가의 측정방식과 유사한 방식으로 측정할 수 있다. 폴리클로날 항체의 분리 및 정제는 상술한 모노클로날 항체의 분리 및 정제 방법과 유사한 방법으로 면역글로블린의 분리 및 정제 방법에 따라 수행될 수 있다.
또한, 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자 및 다른 단백질 또는 폴리펩티드 단편을 포함하는 융합 단백질을 면역원으로 사용함으로써 항체를 생성할 수 있다. 융합 단백질을 구성하는 다른 단백질 또는 폴리펩티드로는 특히 GST(글루타티온-S-트랜스퍼라제)가 바람직하고, 이외에도, 폴리히스티딘(바람직하게는 6개의 히스티딘잔기), 칼모듈린 결합 펩티드(calmodulin binding peptide ; CBP), 단백질 A 등을 사용할 수 있다.
폴리히스티딘이 사용되는 경우, 유전자 재조합 공정에 의해 발현되는 융합 단백질의 단리 및 정제를 위해 니켈-킬레이팅 수지에 대한 흡착이 사용될 수 있고, 이 경우 수지로부터 단백질을 해리하기 위해 EDTA 또는 이미다졸 물질을 첨가하거나 pH를 변화시킬 수 있다. CBP가 사용되는 경우, 발현된 융합 단백질을 칼모듈린 친화성 수지를 사용하여 친화성 크로마토그래피하고, EGTA를 첨가함으로써 수지로부터 해리시킬 수 있다. 추가로, 단백질 A를 사용하는 경우, 발현된 융합 단백질을 IgG 세파로즈(예: IgG 세파로즈 6FF)를 사용하여 친화성 크로마토그래피하고 이후 pH를 변화시킴으로써 수지로 부터 해리시킬 수 있다.
또한, 상기 융합 단백질을 구성하는 단백질 또는 폴리펩티드 단편의 예로는 Xpress, Thioredoxin, c-myc, V5, HA/c-myc 등을 포함할 수 있고, 에피토프로 다른 단백질을 인식할 수 있는 항체를 이용하여 목적하는 신규 콜렉틴과의 융합 단백질을 발현시킨 후, 항원-항체 친화 컬럼으로 분리 및 정제할 수 있다.
그런 융합 단백질을 면역원으로 사용하여 모노클로날 항체를 수득하는 경우, 신규 콜렉틴이 항체를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있으나, 선별성 측면에서 면역원으로서 사용되는 융합단백질로 스크리닝하는 것이 바람직하다.
전술된 바람직한 면역원, 즉 GST 및 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자를 포함하는 융합 단백질은 GST 유전자의 코딩 영역 및 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자의 코딩 영역을 포함하는 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염시킨 대장균 또는 동물 세포를 배양하고; 배양액 및/또는 세포로부터 융합단백질을 분리함으로써 생산될 수 있다. 수득된 융합 단백질은 글루타티온을 함유하는 담체, 예를 들면, 글루타티온 세파로즈 비드에 대한 친화성에 기초하여 더 정제하는 것이 바람직하고, 글루타티온 세파로즈 비드로부터 융합 단백질을 용출하는 방법은 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 이에 따라, 목적하는 면역원으로서 바람직한 정제된 융합 단백질을 얻을 수 있다.
그런 융합단백질을 면역원으로 사용하여 모노클로날 항체를 제조하는 방법에 있어서, 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자를 항체를 스크리닝 하기 위해 사용할 수 있으나, 특이성면에서 면역원으로 융합 단백질을 사용하여 스크리닝하는 것이 바람직하다.
신규 콜렉틴 및/또는 유래분자에 대한 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 신규 콜렉틴과 관련된 질환의 진단 및 치료에 이용할 수 있다. 항체를 특히 인체에 투여하는 경우, 인간에 대해 면역원성을 갖지 않거나 가능한한 면역원성이 약화된 인간화된 항체 또는 키메라 항체와 같은 항체가 바람직하게 사용된다. 마우스 모노클로날 항체가 인체에 투여되는 경우, 인간에 이종성 단백질이기 때문에 여러 부작용이 일어날 수 있는 위험성이 있다. 그러므로 인간 모노클로날 항체가 바람직하지만, 융합 효율이 떨어지고 항체를 안정적으로 생성하는 하이브리도마를 수득하는 것이 어렵다. 그러나, 현재 기술이 발달하여, 인간 모노클로날 항체 또는 키메라 항체의 생성이 가능하다.
"키메라 항체"라는 용어는 마우스 항체와 인간 항체의 키메라 분자로 정의된다. 인간에게 임의의 항체를 면역화시킴으로써 항체를 제조하는 것은 윤리적으로 불가능하다. 그러므로, 마우스를 면역화시킨 후, 항원에 결합할 수 있는 항체의 가변영역(V 영역)을 마우스 모노클로날 항체의 유전자로 부터 절단하고, 키메라 유전자를 인간 골수종 세포로부터 유래한 항원 유전자의 불변 영역(C 영역)에 결합하므로써 제조한다. 이 키메라 유전자가 숙주 세포에서 발현되는 경우, 인간/마우스 모노클로날 항체가 생성될 수 있다. 키메라 항체는 인간에 대해 항원성이 낮기 때문에, 치료 또는 영상진단등을 위해 인체에 투여될 모노클로날 항체로서 사용될 수 있다. 키메라 항체와 관련된 공지 기술로는 일본국공개공보 제 05-304989호(1993), 제 04-330295(1992)호, WO9106649호, 일본국 공개공보 제 63-036786호(1988) 및 일본국 공고공보 제 06-98021호(1994) 등이 있다.
그러나, 키메라 항체보다 더 유용한 것으로 보고된 인간화 항체가 최근 개발되었다. "인간화 항체"라는 용어는 항체분자의 항원결합부위치(CDR: Complementary determing region; 상보성결정영역)의 유전자서열만을 인간항체유전자에 이식(CDR 이식(grafting))하여 항체 분자의 CDR을 제외한 전분자(entire molecure)를 인간화시킨 항체를 의미한다. 이 항체는 인간/마우스 키메라 항체보다 마우스 항체의 부분을 덜 갖기때문에, 항원성이 낮고 더 안전하다고 여겨진다. 일본국에서, 성인 T 세포 백혈병에 대한 인간화항체의 임상시험이 최근에 실행되었다. 인간화 항체를 제조하기 위한 방법 및 이의 관련된 기술에는 Genentech(USA)(WO9222653, WO9845332, WO9404679, WO9837200 및 WO9404679) 및 Celltech (UK)(WO9429451, WO9429351, WO9413805, WO9306231, WO9201059, WO9116927, WO9116928, WO9109967, WO8901974 및 WO8901783) 등이 있다.
인간 모노클로날 항체를 생성하는 방법으로는 세포융합법이외에, 엡스테인-바 바이러스(Epstein-Barr virus ; EBV)로 형질전환하는 방법, 이 형질전화된 세포를 모세포와 융합하는 방법; 유전공학을 이용하여 인간화 항체 또는 키메라 항체를 제조하는 방법 등을 포함할 수 있다. 키메라 항체란 이종 동물의 면역글로블린 유전자 단편을 연결(join)하여 제조된 항체를 의미하며, 인간화 항체란 인간에 대한 이종 항체, 예를 들어 마우스 등의 항체를 변형하여 H쇄와 L쇄의 상보성결정부위(CDR)이외의 일차구조를 인간의 항체에 대응하는 일차 구조로 치환하여 제조된 항체를 의미한다. 인간 모노클로날 항체제조용 모세포로는, 인간/마우스 이종골수종인 SHM-D 33 균주(ATCC CRL 1668) 또는 RF-S1 균주를 이용하여 마우스의 모세포의 것과 견줄만큼 높은 융합 효율을 얻을 수 있다, 상기 모세포를 사용하여 수득된 하이브리도마를 지지세포(支持細胞)없이 클로닝할 수 있고, IgG 타입 항체를 비교적 안정하게 대량 생산할 수 있다. 15% FCS를 첨가한 ERDF 배지를 모세포의 배양을 위해 사용할 수 있고, 다른 과정은 마우스에서와 유사하게 실행할 수 있다. 또한, 인간 모노클로날 IgG 타입 항체를 생산하기 위해서, 항원에 충분히 감작하는 인간 임파구를 말초혈액으로 부터 수집하는 것이 바람직하다.
항원에 충분히 감작되는 임파구를 수득하는 것이 어려울 경우, 시험관내 항원 감작화를 수행할 수도 있다. 본 발명의 항체는 상술된 방법 등을 사용하여 인간화할 수 있고, 항체를 인체에 투여하는데 매우 유용하다.
본 발명은 추가적인 면으로 신규 콜렉틴 관련 분자종, 또는 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자를 수득하는 방법에 있어서, 상기 항체를 이용하여 단백질을 스크리닝하여 신규 콜렉틴 관련된 분자종 또는 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 이 방법에서, 여러생물의 체액, 조직세포등을 함유하는 신규 콜렉틴 관련 분자종, 또는 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자를 분리, 수득하기 위해서 상기 항체를 이용하여 면역반응성을 갖는 단백질을 스크리닝한다. 스크리닝 단계에서, cDNA 라이브러리의 발현 스크리닝이 바람 직하게 사용될 수 있다.
또 다른 면으로 본 발명은 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자의 정량적 측정법에 있어서, 피검시료중에 함유되어 있는 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자의 면역학적 결합 특성에 기초하여 이것의 양의 측정을 행하는 것을 특징으로 하는 정량적 측정법을 제공한다.
이 방법에서, 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자의 양을 측정하기 위해, 상술한 항체의 경우 면역블럿팅, 면역침전법, ELISA법등이 사용될 수 있고, 특히 ELISA법을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 예를 들어, 불용성 담체에 결합된 항체 및 표지화항체와 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자를 반응시킴으로써 생성되는 샌드위치 복합체를 측정하는 단계를 포함하는 샌드위치법, 또는 표지된 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자와 피검시료중의 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자를 항체와 경쟁적으로 반응시키고, 항체와 반응한 표지항원의 양에 따라 피검 시료중의 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자를 측정하는 단계를 포함하는 경합법(Competitive method)을 이용하여 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자의 양을 측정할 수 있다.
샌드위치 방법으로 신규콜렉틴 및/또는 유래분자의 양을 측정하는 방법은 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자에 면역화된 항체의 면역반응을 먼저 수행한 다음, 세척에 의해 반응하지 않은 물질을 완전히 제거하고, 표지화된 항체를 부가하는 2단계 방법 또는 면역화된 항체, 라벨화된 항체 및 신규콜렉틴 및/또는 유래분자를 동시에 혼합하는 1단계 방법으로 수행될 수 있다.
이와 같은 측정을 위해 사용되는 불용성 담체로는 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리염화비닐, 폴리에스테르, 폴리아크릴레이트 에스테르, 나일론, 폴리아세탈, 불소수지 등의 합성 수지, 셀룰로오스, 아가로스 등의 폴리사카라이드, 유리, 금속 등이 포함될 수 있다.
불용성 담체는 예를 들면, 트레이형(tray-like), 구형, 섬유형, 실린더형, 원반형, 용기형, 셀형, 시험관형 등 여러형상일 수 있다. 항체를 흡착시킨 담체는 아지드화나트륨과 같은 방부제의 존재시 냉소(冷所)에서 보관할 수 있다.
항체의 고정화를 위해, 공지의 화학결합방법 또는 물리적 흡착 방법이 이용될 수 있다. 화학결합방법은 예를 들면, 글루타알데히드를 이용하는 방법, N-숙신이미딜-4-(N-말레이미드메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트, N-숙신이미딜-2-말레이미드아세테이트 등을 사용하는 말레이미드법, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드를 사용하는 카보이미드법이 포함될 수 있다. 또한, 말레이미드벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르법, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜티오)프로피온산법, 비스디아조화벤지딘법, 디팔미틸라이신법 등이 포함될 수 있다. 또한, 상기 항체에 대한 제 3의 항체를 상기의 방법으로 고정화한 후, 미리 피검시험물질과 에피토프가 다른 2종류의 항체를 반응시켜 형성시킨 복합체를 포착할 수 있다.
항체를 표지화하는되 사용되는 물질로는 효소, 형광물질, 발광물질, 방사성 물질, 금속킬레이트 등이 있다. 효소는 예를 들면, 퍼옥시다아제, 알카리 포스파타아제, β-D-갈락톡시다아제, 말레이드 디하이드로게네이즈, 스타필로코커스(staphylococcus) 뉴클레아제, δ-5-스테로이드 아이소머라제, α- 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제, 트리오스 포르페이트 아이소머라아제(triose phosphate isomerase), 호오스라디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 아스파라기나아제, 글루코스 옥시다아제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나아제, 글루코아밀라아제, 아세틸콜린 에스테라아제 등이 포함될 수 있고, 형광물질로는 예를 들면, 플루오레스세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 피코빌린 단백질(phycobilin protein), 로다민(rhodamine), 피코에리쓰린(phycoerythrin), 피코시아닌, 알로피코시아닌(allophycocyanin), 오르쏘프탈산 알데하이드(orthophthalic aldehyde) 등을 포함될 수 있으며, 발광물질로는 이소루미놀, 루시제닌(lucigenin), 루미놀, 아로마틱 아크리디니움에스테르(aromatic acridiniumester), 이미다졸, 아크디니움염 및 이것의 변형 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제, 이퀴오린(aequorin) 등이 포함될 수 있고, 방사성 물질로는 125I, 127I, 131I, 14C, 3H, 32P, 35S 등이 포함될 수 있으며, 여기에 한정되지 않고, 면역학적측정방법에서 사용될 수 있는 물질들이 사용될 수 있다. 또한 비오틴, 디나이트로페닐, 피리녹살(pyridoxal) 또는 플루오로에스카민(fluroescamine) 등의 저분자 합텐을 항체에 콘쥬게이트시킬 수 있다. 표지화 효소로 호오스라디쉬 퍼옥시다아제를 사용하는 것이 바람직하다. 이 효소는 다량의 기질과 반응하여 과요오드산법에 의해 항체에 쉽게 콘쥬게이트될 수 있다.
효소를 표지화제로 사용하는 경우, 그것의 활성을 측정하기 위한 기질과 발색제가 사용된다. 퍼옥시다아제가 효소로 사용되는 경우, 과산화수소가 기질용액으로, 2,2'-아지노-디-[3-에틸벤즈티아졸린 술포네이트]암모니움[ABTS], 5-아미노살리실산, 오르쏘페닐렌디아민, 4-아미노안티피린, 3,3',5,5'-테르라메틸벤지딘 등이 발색제로서 사용될 수 있다, 알카리 포스파타아제를 효소로 사용하는 경우 기질은 오르쏘페닐포스페이트, 파라니트로페닐포스페이트등이 사용될 수 있다. β-D-갈락톡시다아제를 효소로 사용하는 경우 기질은 플루오르세인-디-(β-D-갈락토피라노사이드), 4-메틸-엄벨리페릴(umbellifery)-β-D-갈락토피라노사이드 등이 사용될 수 있다.
가교제로는 N,N'-오르쏘페닐렌디말레이미드, 4-(N-말레이미드메틸)사이클로헥사노일 N-숙신이미드 에스테르, 6-말레이미드헥사노일 N-tnrtlsdlalem dptmxpfm, 4,4'-디티오피리딘 또는 다른 공지의 가교제가 이용될 수 있다. 가교제와 효소 및 항체와의 반응은 사용된 가교제의 성질에 따라 이미 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 또한 사용되는 항체로는 조건에 따라 항체들의 임의의 단편, 예를 들면, Fab', Fab, F(ab')2 등이 있을 수 있다. 또한, 효소vywl항체는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 중 어느 하나에서와 동일한 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
상기 가교제를 이용하여 얻은 효소표지항체를 친화성 크로마토그래피등의 공지의 방법으로 정제하는 경우는 더 감도가 높은 면역 측정 시스템이 가능하다. 그와 같은 방식으로 정제된 효소표지항체는 티메로살, 글리세롤 등의 안정화제와 혼 합할 수 있고, 또한 동결건조할 수 있으며, 그런 다음, 냉암소(冷暗所)에서 보관할 수 있다.
상기 정량방법에서 측정대상시료는 혈장, 혈청, 혈액, 뇨, 조직액, 뇌척수액 등의 체액 등, 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자를 함유하는 시료 또는 이들의 전구체를 함유하는 시료이면 특별히 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자를 정량하기 위한 키트로서, 상기 항체를 함유하고, 이 항체를 사용한 ELISA법으로 피검시료중에 함유된 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자의 양을 측정하는 것을 특징으로 하는 키트를 제공한다. 이 키트는 항체이외에 상기 정량에 필요한 시약류를 더 포함한다.
본 발명은 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자를 생산하기 위한 방법으로서 상기 항체를 사용하여 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자를 분리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이외같은 방법으로 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자를 분리하기 위해서, 상기 항체를 결합시킨 담체에 시료를 접촉시켜 항원과 항체사이에 특이적 상호작용을 허용하고, 이어서 담체를 세척한 후, 결합된 목적 단백질을 용출시키는 단계를 포함하고, 컬럼범, 배치법 등으로 친화성 크로마토그래피법 및/또는 면역침전법을 수행할 수 있다.
이 방법에서 시료는 예를 들면, 인간유래의 태반, 지라 등으로부터 조제하여 얻어진 것이나, 상기 본 발명의 신규 콜렉틴을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 발현되어 조제된 것일 수 있지만, 발현산물을 사용하는 것이 바람직하다. 이는 시료를 안정하게 공급할 수 있시 때문이며, 따라서, 그와 같은 발현단계를 포함하는 방 법이 본 발명에서 시도될 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 시도되는 다른 것은 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자의 조직내에서의 존재를 확인하는 방법으로서, 상기 항체를 사용하여 면역조직학적 검사를 수행한다. 면역조직학적 검사는 예를 들면, 표지항체를 사용한 in situ 면역조직학적염색과 같은 기술을 채용하여 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 제조합 유전자가 염색체에 안정하게 도입되어 신규 콜렉틴을 발현하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간 동물(transgenic non-human animals)이 제공된다. 또한, 본 발명에 따른 신규 콜렉틴의 상동체를 함유하는 비인간 동물에 있어서, 상기 상동체를 코딩하는 유전자의 발현을 수정하는 방식으로(예를 들면, 발현을 억제, 촉진 또는 소정의 한정된 조건하에서 발현되도록 함) 유전자의 도입을 유효하게 하는 트랜스제닉 비인간 동물이 본 발명에 의해 제공된다. 이 비인간 동물에서 유전자의 발현을 정상적으로 조절하는 여러 중요한 부위(인헨서, 프로모터, 인트론 등)의 일부에서 결실, 치환, 부가 및/또는 삽입과 같은 변이를 일으키는 것에 의해 본래의 유전자의 발현수준과 비교하여 상승 또는 하강되도록 관련된 유전자의 발현수준을 인공적으로 수정할 수 있다. 변이의 도입은 공지의 방법으로 행해질 수 있다(예를 들면, Lesley, S.A. et al., Promega Notes Magazine, 46, 6-10, 1994; Kunkel, T.A. et al., Methods Enzymol., 154, 367-382, 1987; Sayers, J.R. et al., Biotechniques, 13, 592-596, 1992; Ito W., et al., Gene, 102, 67-70, 1991; Cormack, B., Current Protocols in Molecular Biology, 8.5.1-8.5.9, 1987). 이 방법에서, 유전자는 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA를 포함할 수 있다. 또한, 유전자의 발현은 전사와 번역의 단계를 모두 포함한다.
본 발명에 따른 트랜스제닉 비인간 동물은 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자의 기능 또는 발현 조절에 대한 연구, 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자가 관여하는 것으로 예상되는 질환의 메카니즘의 규명 및 의약품의 스크리닝 및 안전성 시험에의 이용을 위한 질환 모델 동물의 개발에 유용하다.
"트랜스제닉 동물"의 협의는 외래 유전자가 유전자의 재조합에 의해 생식세포(germ cells)에 인위적으로 도입되는 동물을 의미하고, 광의는 안티센스 RNA를 사용하여 특정의 유전자의 기능을 억제하는 안티센스 트랜스제닉 동물, 배성간세포(embryonic strm cells; ES 세포)를 사용하여 특정의 유전자를 넉아웃시킨 동물 및 점돌연변이(point mutated) DNA가 도입된 동물을 포함하고, 개체 발생의 초기에 외래 유전자가 염색체에 안정하게 도입되어 자손에 유전형질로서 전달되어 얻어진 동물을 의미한다.
본 명세서 중에서 "트랜스제닉 동물"은 인간 이외의 모든 척추동물을 포함하는 광의의 의미로 해석된다. 본 발명의 트랜스제닉 동물은 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자의 기능 또는 발현 조절에 대한 연구, 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자를 인간에서 발현하는 세포에 관련된 질환의 메카니즘의 규명 및 의약품의 스크리닝 및 안전성 시험에의 이용을 위한 질환 모델 동물의 개발에 유용하다
트랜스제닉 동물의 제조방법은 위상차현미경(phase-contrast microscope)하 에서 전핵단계의 난자 세포의 핵에 마이크로피펫을 사용하여 유전자를 직접 도입하는 방법(마이크로-인젝션법, 미국특허 제 4,873,191호 참조), 배성간세포를 사용하는 방법 등이 포함할 수 있다. 이외에, 유전자를 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터에 삽입하고, 난자 세포에 감염시키는 방법, 정자 세포를 매개로 하여 유전자를 난자 세포에 도입하는 정자벡터법 등이 개발되었다. 정자벡터법은 외래 유전자를 정자세포에 부착시키거나 외래 유전자를 일렉트로포레이션법(electroporation method)등으로 정자세포에 도입한 후, 난자세포에서 수정하여 외래 유전자를 도입시키는 유전자 재조합법이다(M. Lavitroanoet et al, Cell, 57, 717, 1989). 또한, 박테리오파아지 P1의 cre/lox P 리컴비나아제 시스템, 샤카로마이세스 세르비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 FLP 리컴비나아제 시스템등에 의해 생체내에서 부위특이적 유전자 재조합이 적용될 수 있다. 또한, 레트로바이러스를 사용하여 비인간 동물에 목적 단백질의 트랜스젠(transgene)을 도입하는 방법이 보고되었다.
마이크로-인젝션법으로 트랜스제닉 동물을 제조하는 방법은 예를 들면 하기에 나타낸바와 같이 수행된다.
먼저 기본적으로 발현조절에 관여하는 프로모터, 신규 콜렉틴을 코딩하는 염기서열 및 poly A 시그널로부터 구성된 트랜스젠을 준비해야 한다. 특정분자의 발현패턴 및 발현양은 프로모터의 활성에 따라 영향을 받을 수 있고, 제조된 트랜스제닉 동물들이 도입된 트랜스젠의 복제수 및 염색체에 도입된 부위에 따라 계통(系統)들 사이에 다르므로, 각계통들 사이의 발현 패턴과 발현양이 확인되어야 한다.
비번역영역과 스프라이싱(splicing)에서 발현량이 변화되는 것으로 판명되었기 때문에, poly A 시그널의 앞에 먼저 스플라이스될 수 있는 인트론 서열을 도입할 수 있다. 수정란에 도입되는 유전자는 가능한 한 순도가 높은 유전자를 사용하여야 한다는 것이 중요하다. 사용하는 동물로는 수정란 수집용 마우스(5~6주), 교배용 웅성(雄性)마우스, 가임신(pseudopregnant) 자성(雌性)마우스, 정관 수술을 받은 웅성 마우스(male mouse received vasoligation) 등이 포함될 수 있다.
수정란을 효과적으로 얻기 위해서 가나도트로핀(gonadotropin)등으로 배란을 유도할 수 있다. 수정란을 회수한 후, 마이크로인젝션법으로 인젝션 피펫중의 유전자를 난자의 웅성전핵에 주입한다. 주입한 난자를 자궁관으로 되돌리기 위한 동물관(가임신 자성 마우스 등)을 준비하고, 동물하나당 약 10~15개의 난자를 이식(transplant)한다. 그 다음, 탄생시 트랜스젠이 마우스에 도입되는지를, 꼬리의 선단부로부터 게놈 DNA를 추출하고, 서턴 블롯팅 방법 또는 PCR법으로 트랜스젠을 검출하거나, 상동체의 재조합이 일어났을 경우에만 활성화되는 표지 유전자를 삽입하는 양성 클로닝법으로 확인할 수 있다. 또한, 트랜스젠의 발현을 확인하기 위해서, 트랜스젠 유래 전사산물을 노턴 블롯팅법 또는 RT-PCR법으로 검출한다. 또한 단백질 또는 그것의 단편에 대한 특이 항체에 대해서는 웨스턴 블롯팅법을 행할 수 있다.
또한 본 발명에 따르면, 상기 본 발명의 신규 콜렉틴의 상동체를 포함하는 비인간동물에 있어서, 상기 상동체의 발현을 억제하는 방식으로 상기 신규 콜렉틴의 상동체를 코딩하는 유전자를 변형시켜 수득됨을 특징으로 하는 넉아웃(knockout) 비인간 동물이 제공된다.
본 발명에서 넉아웃 마우스는 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자의 유전자의 기능이 저하되도록 처리될 수 있다. "넉아웃 마우스"라는 것은 상동체 재조합 기술에 의해 임의의 유전자가 파괴되고 따라서 유전자의 기능이 저하된 트랜스제닉 마우스를 의미한다.
넉아웃 마우스는 ES 세포들을 사용하여 상동체 재조합을 수행하고, 하나의 대립형질의 유전자를 변형/파괴시켜 배성간세포를 선별하여 제조할 수 있다.
예를 들면, 수정란의 미분화배아세포(blastcyst) 또는 상실배(morula)에 유전자를 조작하여 배성간세포를 주입하여 배성간세포유래의 세포와 배유래의 세포가 혼합된 키메라 마우스(chimera mouse)를 얻을 수 있다.
이 키메라 마우스(키메라는 두개이상의 수정란에 기초한 체세포(stomatic cells)에서 형성된 단일개체를 의미한다)를 정상마우스와 교차교배시키는 경우에, 하나의 대립형질 유전자의 전체가 변형/파괴된 헤테로접합체(heterozygote)가 생산될 수 있다. 또한, 헤테로접합체 마우스끼리 교차교배하여 호모접합체가 생산될 수 있다.
"상동체 재조합"이란 유전자 재조합 메카니즘에서 염기서열이 동일하거나 매우 유사한 두개의 유전자 사이에서 발생하는 재조합을 의미한다. PCR법은 동족체 재조합이 발생된 세포들을 선별하는데 사용할 수 있다. 폴리머라아제 체인 반응(PCR)은 삽입된 유전자의 일부와 삽입이 기대되는 영역의 일부를 프라이머로서 이용하여 수행되고, 그 결과, 증폭산물이 나타난 세포에서 상동체 재조합의 발생이 나타난 것으로 판명할 수 있다. 또한, 배의 간세포에서 발현되는 유전자에서 상동체 재조합이 발생된 경우에, 도입되는 유전자에 네오마이신 내성유전자를 결합시키고, 유전자 도입후에 예를 들면, 네오마이신 저항체가 되는 세포를 도출하는 것에 의해 선별하거나, 공지의 방법 또는 그것의 변형된 방법을 사용하여 용이하게 선별할 수 있다(Capecchi, Science, Vil. 244, pp. 1288~1299(1989) 등).
본 발명은 다음의 본 발명을 실시예들을 통해 더욱 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본원 발명은 본원 명세서에 개시된 발명들, 특히 청구범위 및 그의 권리, 및 가장 폭넓게 해석한 실시예들을 고려하여 당업자들이 통상적으로 행할 수 있는 모든 변형 및 응용들을 모두 포함한다.
본원 발명은 다음의 실시예들을 포함한다: EST 데이베이스에 의한 검색(실시예 1); 스크리닝을 통한 프로브의 제작(실시예 2); 인간 태반으로부터 제작된 cDNA 라이브러리의 스크리닝(실시예 3); 신규 콜렉틴의 염기서열 작성(실시예 4); 신규 콜렉틴의 게놈 서던 블랏(실시예 5); 다양한 인간 조직들에서의 신규 콜렉틴에 대한 노던 분석(실시예 6); 각종 동물로부터 분리한 조직에서의 신규 콜렉틴에 대한 게놈 서던 분석(실시예 7); 신규 콜렉틴의 유전학 연구(실시예 8); 신규 콜렉틴에 특이적인 모노클로날 항체의 생성(실시예 9); 항-마우스 항-인간 신규 콜렉틴 항체를 사용한 ELISA 방법(실시예 10); 인간에 대한 낮은 면역원성을 갖는 항체의 생성(실시예 11); 신규 콜렉틴의 발현벡터 pNOW1-hCL-P1의 제작(실시예 12); 신규 콜렉틴을 발현하는 클론의 선별(실시예 13); 트랜스지닉 마우스(transgenic mouse)의 제작(실시예 14); 및 녹아웃 마우스(knockout mouse)의 제작(실시예 15).
실시예 1: EST 데이터 베이스 검색
인간 MBP, 인간 SP-A 및 인간 SP-D 등의 공지의 콜렉틴 분자들의 아미노산 서열들을 비교함으로써 보존성이 높은 영역(highly conserved regions)들을 검색하였다(도 2 및 3 참조, 여기에서 이들 단백질들 사이에 상동성이 존재하는 아미노산 잔기들은 박스(box)로 표시함). 그 결과로, 인간 MBP 서열(도 3에서 윤곽문자들) 중 아미노산 번호 220에서 246까지의 27개의 아미노산들로 이루어진 영역에서 높은 상동성이 있음을 확인하였다. 따라서, 이들 영역에 대응하는 일부 컨센서스 서열들을 작성하고, 이 서열에 대한 EST(Expressed Sequence Tags) 데이터베이스 검색을 수행하였다. 검색은 1996년 10월 11일자로 발표되고, 676,750개의 서열을 포함하는 EST 데이터베이스를 사용하였다.
그 결과로, 상기 27개의 아미노산으로 이루어진 서열과 상동성이 높은 아미노산 서열을 포함하는 데이터를 몇 개 얻었다. 상기에서 얻어진 아미노산 서열 데이터로 GenBank/EST 데이터베이스 검색을 더 수행하여, 이들 데이터의 아미노산 서열이 공지되었는지, 아니면 공지되지 않은 유전자로부터 유래된 것인지를 판단하였다. 컨센서스 서열로서 다음의 아미노산 서열을 사용하였을 때, 상동성이 높으면서 공지되지 않은 두 개의 서열(등록번호: W72977 및 R74387) 데이터를 얻었다.
Glu-Lys-Cys-Val-Glu-Met-Tyr-Thr-Asp-Gly-Lys-Trp-Asn-Asp-Arg-Asn-Cys-Leu-Gln-Ser-Arg-Leu-Ala-Ile-Cys-Glu-Phe(서열번호:3). 이들은 각각 태반 및 태 아 심장으로부터 유래한 것이며, 신규 콜렉틴의 염기서열을 나타내는 부위에 대한 클론들이었다.
그런 다음, 태아 심장으로부터 제작된 클론(I.M.A.G.E. Consortium Clone ID: 34472)을 ATCC(American Type Culture Collection)으로부터 분양받았고, 이를 신규 콜렉틴을 얻기위한 스크리닝 프로브로서 이용하였다.
실시예 2: 스크리닝을 위한 프로브의 제작
상기 클론의 삽입 DNA의 염기서열은 프라이머(Pharmacia, M13 Universal Primer(서열번호:7: 5'-플루오레세인(fluorescein)-cgacgttgtaaaacgacggccagt-3') 및 M13 Reverse Primer(서열번호:8: 5'-플루오레세인-caggaaacagctatgac-3'))를 사용하여 결정하였다.
상기 얻어진 염기서열로부터 ORF(open reading frame)를 콜렉틴 아미노산 서열에 대응시킴으로써, ORF로부터 판독한 아미노산 서열에 해당하는 염기서열을 유추하였다. 그런 다음, 상기 염기서열의 일부분에 대응하는 디옥시게닌(digoxigenin; DIG) 표지된 cDNA 프로브에 대한 프라이머(Reverse Primer: caatctgatgagaaggtgatg(서열번호:4) 및 Forward Primer: acgaggggctggatgggacat(서열번호:5))를 DNA/RNA 합성기(Applied Biosystems, 392A)를 사용하여 제작하였다. DIG 표지는 PCR DIG 프로브 합성 키트(Boehringer Mannheim)를 사용하여 수행하였다. 반응혼합물은 다음을 포함하였다: 플라스미드 DNA(클론 W72977, 50ng/㎕) 2㎕(100ng); 10× 완충액 5㎕; 25mM MgCl2 5㎕; dNTP (PCR Labeling Mix) 5㎕; 20μM Reverse Primer 2.5㎕; 20μM Forward Primer 5㎕; H2O 28㎕; Taq 중합효소 0.5㎕. PCR 반응은 Zymoreactor(ATTO Corp.)를 사용하여, 92℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분, 35사이클의 조건으로 수행하였다.
실시예 3: 인간 태반으로부터 유래한 cDNA 라이브러리의 스크리닝
우선, 다음과 같이 인간 태반으로부터 유래한 파지(phage) cDNA 라이브러리를 역가측정(titration)하였다. mLB 배지(10mM MgSO4 및 0.2% 말토오스를 함유한 LB 배지(1g의 트립톤, 0.5g의 효모 추출물 및 0.5g의 NaCl, 총 부피 100㎖))로 37℃에서 16시간동안 배양한 E.Coli Y109r- 2㎖와, SM 완충액(5.8g의 NaCl, 2g의 MgSO4ㆍ7H2O, 2M 트리스-HCl (pH7.5) 25㎖ 및 2% 젤라틴 5㎖, 최종 부피 1ℓ)로 순차적으로 희석한 cDNA 라이브러리 0.1㎖를 37℃에서 15분 동안 배양한 후, 상기 혼합물에 2.5㎖의 LB-TOP 아가로스(0.75% 아가로스/LB 배지)를 부가하여 균질 용액(homogenous solution)을 만들고, 90㎜φ LB 배지 플레이트(Iwaki Glass),(1.5% 아가/LB 배지)에 치상하였다. 15분동안 상온에서 부가된 용액을 고화(固化)시킨 다음, 42℃에서 5시간동안 배양하였다. 각각의 플레이트에서 플라크(plaque)의 수를 측정하고, 파지의 역가를 계산하였다. 그 결과로, 역가는 2.1×1010pfu/㎖이었다. 그런 다음, 실시예 2에서 제작된 프로브를 사용하여, 다음과 같이 스크리닝을 수행하였다.
mLB 배지로 37℃에서 16시간동안 배양한 E.Coli Y109r- 0.6㎖와 1×105pfu가 되도록 SM 완충액으로 희석한 cDNA 라이브러리를 37℃에서 15분동안 배양한 후, 상기 혼합물에 7.5㎖의 LB-TOP 아가로스(0.75%의 아가로스)를 부가하여 균일한 용액을 만들었다. 상기 용액을 10㎠의 LB 사각 플레이트(Nissui Seiyaku) 10개에 치상한 후, 상온에서 15분동안 고화시킨 다음, 42℃에서 15분동안 상기 플레이트를 배양하였다. 각 플레이트에서 플라크의 형성을 확인한 후, 나이론막으로의 트랜스퍼(transfer)를 수행하였다. 상기 트랜스퍼는 Nytran 13N(Schleicher and Schuell Co.)을 사용하여 수행하였다. 증류수에 10분동안 12.5㎝×9.0㎝ 크기의 필터들을 침지시켜 적신 다음, 왓트만 3MM 용지로 잔여수분을 제거하고, 플라크가 형성된 플레이트에 필터를 위치시켰다. 2분동안 방치한 후, 필터들을 회수하고, 10분동안 공기건조시켰다. 필터 위의 파지 DNA를 0.2M의 NaOH/1.5M의 NaCl로 2분동안 변성시킨 다음, 0.4M의 트리스-HCl(pH 7.6)/2×SSC로 2분동안 중화시킨 후, 2×SSC로 2분동안 세척하였다. 그런 다음, GS GENE LINKER(BioRad)로 UV 조사(irradiation)하여, 막에 파지 DNA를 고정시켰다.
다음과 같이 하이브리드형성 및 신호 검출을 수행하였다. 2×SSC에 필터를 침지시키고, 잔여수분을 왓트만 3MM 용지로 제거하였다. 그런 다음, 필터들을 하이브리드형성 백(hybridization bag)에 집어넣고, 하이브리드 형성용액(5×SSC, 1% 블로킹제, 0.1% N-라우로일 사코신(N-lauroyl sarcosine) 및 0.02% SDS)으로 68℃에서 10분동안 사전 하이브리드형성(prehybridization)을 수행하였다. 그런 다음, 상기 백으로부터 하이브리드형성 용액을 제거하고, 상기 백에 10ng/㎖ 농도의 DIG 표지된 cDNA 프로브를 함유한 하이브리드형성 용액을 집어넣은 다음, 55℃에서 16시간동안 하이브리드형성을 진행시켰다. 상기 하이브리드형성이 완료된 후, 2×SSC/0.1%SDS 용액으로 5분씩 2회 필터를 세척한 후, 0.5×SSC/0.1%SDS 용액으로 15분씩 2회 더 세척하였다. 그런 다음, DIG 완충액 Ⅰ(100mM 트리스-HCl, 150mM NaCl(pH 7.5))를 1분동안 처리하여 SDS를 제거한 후, DIG 완충액 Ⅱ(1% 블로킹제를 함유한 DIG 완충액 Ⅰ)으로 30분동안 처리하여, 필터를 블로킹하였다. 필터를 DIG 완충액Ⅰ으로 1분동안 세척한 다음, DIG 완충액 Ⅱ로 5,000배 희석시킨 알칼린성 포스파타아제 표지된 항-DIG 항체(Boehringer Mannheim) 용액을 첨가하여, 상온에서 30분동안 항원항체반응을 수행하였다. 그런 다음, DIG 완충액Ⅰ으로 상온에서 15분씩 2회 필터를 세척하고, DIG 완충액 Ⅲ(100mM 트리스-HCl, 100mM NaCl(pH 9.5), 50mM MgCl2)으로 3분동안 필터를 처리하여, Mg2+의 농도를 증가시켰다. NBT/BCIP(WAKO Chem., Co.)이 함유된 DIG 완충액 Ⅲ 용액를 첨가하여, 색깔변화를 유도하였고, 10개의 양성 클론이 동정되었다.
이들 클론에 해당하는 플라크를 플레이트로부터 분리한 후, 1㎖의 SM 완충액을 함유하는 튜브로 옮겼다. 10분동안 교반한 후, SM 완충액으로 순차적으로 각 완충액을 희석하고, 희석용액 0.1㎖과, mLB 배지로 37℃에서 16시간동안 배양한 E. Coli Y1090r- 배양액 0.2㎖를 혼합하였다. 상기 혼합물을 37℃에서 15분동안 배양한 다음, 2.5㎖의 LB-TOP 아가로스를 부가하여 균일한 용액을 만들었다. 상기 용액을 90㎜φ LB 플레이트 10개에 치상하고, 상온에서 15분동안 고화시킨 다음, 42℃에서 5시간동안 플레이트를 배양하였다. 몇 개의 플라크가 얻어졌고, 일차 스 크리닝 방법에 따라, 이차 스크리닝을 수행하였다.
실시예 4: 신규 콜렉틴 염기서열의 스크리닝
이차 스크리닝을 통해 얻어진 양성 클론들 중 적당한 클론의 플라크를 플레이트로부터 분리하고, 200㎕의 증류수가 들어있는 튜브에 첨가한 후, 상온에서 30분동안 교반한 다음, 상기 튜브를 15,000rpm으로 5분동안 원심분리하고, 상청액을 얻었다.
얻어진 상청액을 주형(template)으로서 이용하여, TaKaRa LA PCR Kit Ver.2(TaKaRa Syuzo, Co.)로 삽입 DNA를 PCR 증폭하였다. PCR 반응액의 조성은 다음과 같다: 상청액 27㎕, Mg2+을 함유하지 않는 10×LA PCR 완충액 Ⅱ 5㎕; 25mM MgCl2 5㎕; dNTP Mix 8㎕; 20μM λgt11 Reverse Primer(서열번호:9; 5'-ttgacaccagaccaactggtaatg-3') 2.5㎕; 20μM λgt11 Forward Primer(서열번호:10; 5'-ggtggcgacgactcctggagcccg-3') 1㎕; LA Taq 중합효소 0.5㎕; 및 H2O, 최종부피 50㎕. Applied Biosystems Gene Amp PCR System 9600을 사용하여, 98℃에서 20초, 68℃에서 5분, 30사이클의 조건으로 PCR 반응을 수행하였다. 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 PCR 생성물을 확인한 후, 겔로부터 절출(切出; excision)하여 정제하였다. 이 정제단계에서, Sephaglas BandPrep Kit(Pharmacia)를 사용하였다.
절출된 DNA 단편을 pCR2.1 벡터(Invitrogen, TA Cloning Kit)에 도입하였다. 재조합벡터를 Invitro사의 TA Cloning Kit에 포함된 TOP10F'세포에 형질전환시켰다. 형질전환체를 LB 배지(100㎍/㎖ 암피실린 함유)에서 배양하고, 알칼린 SDS 방 법에 의해 각 클론마다 3종류의 플라스미드 DNA를 추출하였다.
얻어진 DNA를 적당한 제한효소로 절단하고, 각 DNA 단편들을 pUS18 벡터에 도입한 후, XL1-Blue 세포에 형질전환시켰다. 형질전환체를 LB 배지(100㎍/㎖ 암피실린 함유)에서 배양하고, 알칼린 SDS 방법에 의해 플라스미드를 추출하였다. CL-P1-2-1에서는 EcoRⅠ-HindⅢ 및 HindⅢ-EcoRⅠ 단편을 포함하는 플라스미드가 얻어졌고, CL-P1-3-4에서는 EcoRⅠ-BamHⅠ단편, BamHⅠ-SmaⅠ단편, SmaⅠ-HindⅢ 단편, KpnⅠ-Sau3AⅠ 단편, Sau3AⅠ-EcoRⅠ단편, EcoRⅠ-KpnⅠ단편 및 EcoRⅠ-SmaⅠ단편을 포함한 플라스미드가 얻어졌으며; CL-P1-3-7에서는 EcoRⅠ-BamHⅠ 단편, BamHⅠ-SmaⅠ 단편, SmaⅠ-HindⅢ단편, KpnⅠ-Sau3AⅠ 단편, Sau3AⅠ-EcoRⅠ 단편, EcoRⅠ-KpnⅠ 단편 및 KpnⅠ-EcoRⅠ 단편을 포함하는 플라스미드가 얻어졌다. 제작된 프라이머는 다음과 같다: Autoread Sequencing Kit에 포함된 M13 Universal Primer(서열번호:5), M13 Reverse Primer(서열번호:6) 및 FITC(Pharmacia, Fluore Prime)-표지된 다음의 프라이머을 사용하여 DNA/RNA 합성기에 의해 프라미머를 작성하고, Autorea Sequencing Kit(Pharmacia) 및 A.L.F. Autosequencer를 사용하여 전체영역에 대한 염기서열을 결정하였다.
HPP 1: 5'-플루오레세인-cgtgaaaatgaatggaagtgg-3' (서열번호:11)
HPP 2: 5'-플루오레세인-ttttatccattgctgttcctc-3' (서열번호:12)
HPP 3: 5'-플루오레세인-ctggcagtccccgaggtccag-3' (서열번호:13)
HPP 5: 5'-플루오레세인-gctggtccccccggagagcgt-3' (서열번호:14).
다음에서 실시한 염기서열 결정의 대략적인 방법은 도 4에 나타내었다. 얻 어진 신규 콜렉틴의 ORF는 도 4(a)에 나타내었고, 여기에서 G-X-Y는 콜라겐형 영역을 나타낸다. 또한, 도 4(b)에서, 상기 각 플라이머의 명칭, 서열판독기(sequencer)로 판독한 염기서열의 위치(화살표로 나타냄), M13 Universal Primer(U로 나타냄) 및 M13 Reverse Primer(R로 나타냄)를 표시하였다.
또한, 캡(Cap) 영역 cDNA를 사용하여, 전사개시점(transcription initiation site)을 포함하는 5'-말단 영역의 염기서열을 결정하였다.
우선, 인간의 간(NIPPON GENE) 유래의 캡 영역 cDNA, 키트에 부착된 1RC2 프라이머(5'-aaggtacgccacagcgtatg-3'(서열번호:15)) 및 392A DNA/RAN 합성기(applied Biosystem)를 사용하여 합성된 TGP1 프라이머(5'-tcttcagtttccctaatccc-3'(서열번호:16))를 이용하여 1차 PCR을 수행하였다. 반응 혼합용액은 최종부피 50㎕에 대하여 Mg2+를 함유하지 않는 LA PCR 완충액 Ⅱ, 2.5mM MgCl2, 각각 200μM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP(모두 TAKARA Syuzo, Co.에서 제조) 1㎕; 인간 간 유래의 캡 영역 cDNA; 0.5μM의 1RC2 프라이머(이상 NIPPON GENE사 제조) 및 0.5μM의 TGP1 프라이머를 함유한다. PCR 반응은, 95℃에서 20초간 열변성, 60℃에서 20초간 어닐링, 72℃에서 20초간 중합반응을 35사이클 반복하고, 반응전에 95℃에서 5분동안 열변성 및 반응후 72℃에서 10분간 중합반응을 포함하는 프로그램을 사용하여 PCR을 수행하였다. 1차 PCR을 완료한 후, nested PCR을 수행하였다. 1차 PCR 산물 1㎕를 주형으로하고, 프라이머로는 키트에 포함된 프라이머 2RC2 프라이머(5'-gtacgccacagcgtatgatgc-3'(서열번호:17)) 및 합성된 TGP2 프라이 머(5'-cattcttgacaaacttcatag-3'(서열번호:18))(TGP1 프라이머와 유사한 방법으로 합성됨)를 사용하여, 1차 PCR과 동일한 반응조성 및 프로그램에 의해(사이클 수는 25인 것만 제외) 반응을 수행하였다. PCR 반응은 TaKaRa사의 PCR Thermal Cycler 480으로 수행하였다. 얻어진 PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 확인한 후, 겔로부터 밴드를 절출한 다음, -80℃에서 10분동안 동결시키고, 이를 15,000rpm에서 10분동안 원심분리한 후, 그 상청액을 에탄올 침전시켜 정제하였다.
정제된 DNA 단편은 pT7Blue 벡터(Novagen)에 도입하고, 이 벡터를 컴피턴트(competent) XL1-Blue 세포에 형질전환시켰다. 형질전환체를 LB 배지(100㎍/㎖의 암피실린 함유)에서 배양하고, 알칼린 SDS 방법에 의해서 플라스미드를 추출한 다음, Autoread Sequecing Kit(Pharmacia) 및 A.L.F. DNA Sequencer에 의해 그의 염기서열을 결정하였다.
그 결과로, 실시예 3에서 얻어진 신규 콜렉틴의 cDNA 클론은 1026개 염기의 OFR(open reading frame)을 포함하는 2024개의 염기들로 이루어지고, 서열 번호 2에 나타낸 342개의 아미노산을 코딩하는 것으로 확인되었다.
다음으로, GenBank 데이터베이스에서 DNA 및 아미노산 서열들에 대한 상동성검색을 수행한 결과, 얻어진 단백질의 아미노산 서열은 종래에 동정된 콜렉틴과는 확른 신규한 단백질임을 확인하였다.
또한, 종래에 보고된 3종의 콜렉틴의 아미노산 서열과 본 발명의 신규 콜렉틴 아미노산 서열을 비교하였다. 이들의 얼라인먼트(alignment)를 도 5 및 6에 나타내었다. 도 2 및 3과 유사하게, 상동적을 갖는 아미노산 잔기 부분들은 박스로 표시하였다. 이들 서열의 얼라인먼트를 통해, 얻어진 신규 단백질과 공지의 콜렉틴은 상동성이 있고, 콜렉틴 계열에 속함을 확인하였다.
실시예 5: 신규 콜렉틴의 게놈 서던 블랏
실시예 4에서 결정된 cDNA 서열을 갖는 신규 콜렉틴 유전자가 단일본 유전자(a single copy gene)인지 복수본 유전자(multi copy gene)인지를 확인하기 위해서, 게놈 서던 분석을 수행하였다.
인간혈액으로부터 유래한 4㎍의 인간게놈 DNA(Promega)를 (1) EcoRⅠ, (2) XbaⅠ, (3) HindⅢ, (4) PstⅠ, (5) BglⅡ 또는 (6) BamHⅠ의 제한효소들 중 임의의 하나로 절단하고, 0.8% 아가로스 겔에서 100㎃로 3시간동안 전기영동하였다. 전기영동을 완료한 후, 나이론막(Nytran 13N)으로 DNA를 트랜스퍼하여 분석용 막을 제조하였다.
트랜스퍼는, 우선 전기영동한 겔을 0.25N HCl 용액 100㎖에 침지시키고, 증류수로 세 번 세척한 후, 변성 용액(1.5M NaCl, 0.5M NaOH) 100㎖에 15분씩 두 번 침지시킨 다음, 중화용액(0.5M 트리스-HCl, 3M NaCl(pH 6.)) 100㎖에 301분동안 침지시킴으로써, 탈퓨린화(depurination), 변성 및 중화처리를 수행하였다. 그런 다음, DNA를 Vacuum Blotting System(Toyobo Engineering, VB-30)을 이용하여 트랜스퍼하였다. 이때, 막은 2×SSC로 5분, 20×SSC로 5분동안 침지시켜 전처리한 것을 사용하였고, 패드(pad)는 20×SSC로 침지시킨 것을 이용하였다. 트랜스퍼를 완료한 후, UV 조사에 의해 DNA를 고정(fixation)하였다.
서던 분석에 사용한 하이브리드형성용 프로브는, 실시예 4에서 얻은 신규 콜 렉틴의 cDNA 서열 중 ORF의 일부분을, 다음의 프라이머:
5'-gaagacaagtcttcaactcttg-3'(서열번호:19) 및 5'-ctctgagtctgtgaggccgatc-3'(서열번호:20))로 상기 언급한 PCR DIG 프로브 합성 키트를 이용하여 DIG 표지한 다음의 DNA 프로브를 이용하였다:
gaagacaagt cttcacatct tgttttcata aacactagag aggaacagca atggataaaa aaacagatgg tagggagaga gagccactgg atcggcctca cagactcaga g(서열번호:21). 하이브리드형성 전에, 프로브를 10분동안 끓이고, 5분동안 건조된 얼음/에탄올 용액으로 급속 동결처리하였다.
우선, 트랜스퍼 단계를 거친 막을 2×SSC 용액에 5분동안 침지시키고, ExpressHyb 하이브리드형성 용액(Clonetech) 10㎖로 65℃에서 30분동안 사전하이브리드형성을 수행하였다. 그런 다음, 상기 동결처리한 프로브를 10ng/㎖이 되도록 ExpressHyb 하이브리드형성 용액으로 희석한 후, 희석용액 2㎖를 사용하여 65℃에서 1시간동안 하이브리드형성을 수행하였다.
하이브리드형성을 수행한 막의 세척은, 20㎖의 2×SSC/0.1%SDS 용액으로 상온에서 5분씩 2회 교반하고, 20㎖의 0.2×SSC/0.1%SDS 용액으로 65℃에서 15분씩 2회 교반하여 수행하였다. 그런 다음, 막을 50㎖의 DIG 완충액 Ⅰ(100mM 트리스-HCl, 150mM NaCl(pH7.5))로 상온에서 1분동안 2회 세척하여 SDS를 제거한 다음, 50㎖의 DIG 완충액 Ⅱ'(1.5% 블로킹제가 함유된 DIG 완충액 Ⅰ)로 상온에서 1시간동안 처리하여 블로킹을 수행하였다. 그런 다음, 0.2%의 Tween20을 함유하는 DIG 완충액 Ⅰ으로 5,000배 희석한 알칼린성 포스파타아제 표지된 항-DIG 항체 10㎖로 막을 30분동안 처리한 후, 0.2%의 Tween20을 함유하는 50㎖의 DIG 완충액 Ⅰ로 상온에서 3분동안 교반하면서 2회 세척하였다. 10㎖의 DIG 완충액 Ⅲ로 상온에서 3분동안 막을 2회 침지시킨 후, 막을 하이브리드형성 봉지에 집어넣고, DIG 완충액 Ⅲ로 100배 희석한 CSPD(등록상표명, Boehringer Mannheim; 화학발광 기질) 용액을 첨가하여, 용액이 막 전체적으로 퍼지도록 한 다음, 상기 막을 Instant Film T612(Polaroid)위에서 감광시켰다.
그 결과로, 도 7에서 보는 바와 같이, 각 제한 효소들로 처리된 게놈 DNA에서 각각 단지 하나 또는 두 개의 신호만이 검출되었다. 따라서, 얻어진 신규 콜렉틴 유전자는 단일본 유전자이라는 것을 확인하였다.
실시예 6: 신규 콜렉틴의 인간조직에서의 발현분포분석
본 발명의 신규 콜렉틴 mRNA의 다양한 조직에서의 발현을 검사하기 위해서, RT-PCR 분석을 수행하였다.
여러 인간조직((1)뇌, (2) 심장, (3) 신장, (4) 비장, (5) 간, (6) 소장, (7) 근육, (8) 고환, (9) 태반 또는 (10) 결장)으로부터 유래한 각 RNA를 주형으로 하고, RNA LA PCR Kit(AMV) Ver. 1.1(TAKARA Syuzo, Co.)을 사용하여, RT-PCR을 수행하였다. 우선, 다음의 반응조성으로 역전사 반응을 수행하였다. 상기 반응조성물은 5mM MgCl2, 1×RNA PCR 완충액, 1mM dNTP 혼합물, 1U/㎕ RNase 저해제, 0.25U/㎕의 역전사효소, 0.125μM 올리고 dT-어댑터 프라이머, 1㎍의 RNA을 함유하고, 최종부피가 20㎕가 되도록 RNase가 없는 증류수를 첨가하였다. 동시에, 음성대조군으로서 역전사효소를 함유하지 않는 반응조성물도 제조하였다. 상기 반응액을 0.2㎖의 튜브로 넣고, TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL(TAKARA Syuzo, Co.)를 사용하여, 42℃에서 30분, 99℃에서 5분, 5℃에서 5분을 1 사이클로 하여 PCR반응을 수행하였다. 얻어진 PCR 생성물을 이용하여, 다음의 반응조성으로 LA PCR를 수행하였다. 2.5mM MgCl2, 1× LA PCR 완충액 Ⅱ(Mg2+ 없음), 2U TaKaRa LA Taq, 및 얻어진 신규 콜렉틴의 cDNA서열 중 넥 영역(neck region)으로부터 당인식구조영역(carbohydrate recognition domain)을 증폭하기 위한 두 종류의 0.2μM의 프라이머들(RT-PCR 프라이머 U: 5'-gtgcccctggccctgcagaatg-3'(서열번호:22) 및 RT-PCR 프라이머 R: 5'-gcatatcaccctggggaacattttag-3'(서열번호:23))를 첨가하고, 최종 부피가 80㎕이 되도록 무균증류수로 조정하였다. PCR은 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초를 1사이클로하여, 50사이클을 수행하였다. PCR반응 생성물은 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 분리하고, 에티디움 브로마이드(0.1㎍/㎖)로 염색한 후, 투광기(transilluminator)로 전기영동 패턴을 확인하여, 발현조직을 동정하였다.
또한, 각 조직에서 발현된 양을 비교하기 위해서, 각 조직의 β-액틴 유전자 일부분을 RT-PCR로 증폭하고, RNA의 양을 보정하였다. 상기와 동일한 방법으로, 역전사 효소반응 및 PCR 반응을 수행하고, 상기한 바와 같이 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 동정하였다. 역전사반응 조성물은 5mM MgCl2, 1×RNA PCR 완충액, 1mM dNTP 혼합물, 1U/㎕의 RNase 저해제, 0.25U/㎕의 역전사 효소, 2.5μM의 랜덤 9-mer(random 9-mer), RNA 10ng을 함유하고, RNase가 없는 증류수로 최종 부피를 60㎕로 조정하였다. 30℃에서 10분, 42℃에서 15분, 99℃에서 5분, 5℃에서 5분을 1 사이클로 하여 PCR을 수행하였다. 얻어진 PCR 생성물을 이용하여, 계속하여 다음의 반응조성으로 PCR 반응을 수행하였다: 2.5mM MgCl2, 1× LA PCR 완충액 Ⅱ(Mg2+ 없음), 2U TaKaRa LA TAQ, 0.25μM의 인간 β-액틴 안티센스 프라이머 5'-caagagatggccacggctgct-3'(서열번호:24), 0.25μM의 인간 β-액틴 안티센스 프라이머 5'-tccttctgcatcctgtcggca-3'(서열번호:25)를 첨가하고, 최종부피가 40㎕이 되도록 무균의 증류수로 조정하였다. PCR은 94℃에서 15초 및 68℃에서 30초를 1사이클로 하여 30사이클을 수행하였다.
그 결과를 도 8에 나타내었고, 이는 본 발명의 신규 콜렉틴의 mRNA가 태반(레인 9), 비장(레인 4) 및 신장(lane)에서 발현된다는 것을 나타낸다. 특히 태반에서 매우 높게 발현된다는 것을 확인하였다.
실시예 7: 신규 콜렉틴의 다양한 동물에서의 게놈 서던 블랏 분석
본 발명의 신규 콜렉틴 유전자가 다른 동물종에서도 보존되었는지를 알아보기 위해서, 게놈 서던 하이브리드형성을 수행하였다.
하이브리드형성용 프로브로는 상기 신규 콜렉틴의 cDNA 서열 중 OFR에 해당하는 부분을 PCR DIG 프로브 합성 키트(Boehringer Mannheim)를 사용하여 DIG 표지한 DNA 프로브를 사용하고, 막은 (1) 인간(Promega), (2) 원숭이(Clonetech), (3) 쥐(Promega), (4) 마우스(Promega), (5) 개(Clonetech), (6) 소(Promega), (7) 토 끼(Clonetech) 및 (8) 닭(Promega)의 각각의 게놈 DNA 5㎍을 제한효소 EcoRⅠ으로 처리하고, 아가로스 겔에서 전기영동한 다음, Nytran 13N막으로 트랜스퍼한 후, UV 조사로 고정처리하여, 제조하였다.
상기 프로브 및 막을 사용하여, 다음의 단계에 따라 하이브리드형성을 수행하였다. 우선, 2×SSC로 5분동안 막을 침지시키고, 10㎖의 ExpressHyb 하이브리드형성 용액으로 65℃에서 30분동안 사전하이브리드형성을 수행하였다. 그런 다음, 상기에서 언급한 바와 같이 동결처리된 프로브를 10ng/㎖의 농도가 되도록 ExpressHyb 하이브리드형성 용액으로 희석하고, 희석 프로브 용액 2㎖를 이용하여, 65℃에서 1시간동안 하이브리드형성을 수행하였다.
하이브리드형성 후, 막을 다음과 같이 세척하였다. 20㎖의 2×SSC/0.1%SDS 용액으로 상온에서 5분동안 2회 교반한 후, 20㎖의 0.2×SSC/0.1% SDS 용액으로 65℃에서 15분동안 2회 교반한다. 그런 다음, 막을 50㎖의 DIG 완충액 Ⅰ(100mM 트리스-HCl, 150mM NaCl(pH7.5))으로 상온에서 1분동안 2회 세척하여 SDS를 제거한 다음, 50㎖의 DIG 완충액 Ⅱ'(1.5% 블로킹제가 함유된 DIG 완충액 Ⅰ)으로 상온에서 1시간동안 처리하여 블로킹을 수행하였다. 그런 다음, 0.2%의 Tween20을 함유하는 DIG 완충액 Ⅰ으로 5,000배 희석한 알칼린성 포스파타아제 표지된 항-DIG 항체 10㎖로 30분동안 막을 처리한 후, 0.2%의 Tween20을 함유하는 DIG 완충액 Ⅰ을 50㎖로 이용하여 상온에서 20분동안 2회 교반하면서 세척하였다. 10㎖의 DIG 완충액 Ⅲ로 상온에서 3분동안 2회 침지시킨 후, 막을 하이브리드형성 봉지에 집어넣고, DIG 완충액 Ⅲ로 100배 희석한 CSPD를 첨가하여, 전체적으로 퍼지도록 한 후, 상기 막을 Instant Film T612(Polaroid)위에서 감광시켰다.
그 결과를 도 9에 나타내었고, 닭의 DNA를 로딩한 레인 8을 제외한 모든 레인에서 DNA 신호가 검출되었다. 이는 본 발명의 신규 콜렉틴 유전자가 포유동물종에서 보존되어 있다는 것을 나타낸다.
실시예 8: 신규 콜렉틴의 유전학적 분석
얻어진 신규 콜렉틴의 DNA 서열에 기초하여, 공지 콜렉틴들과의 유전학적 위치 관련성을 알아보기 위해 분석을 행하여, 유전학적 계통발생도(phylogentic tree)를 작성하였다.
분석 대상의 콜렉틴은 도 10에 나타낸 각종 콜렉틴 계열의 단백질들이다(도 10에서, CL-L1은 본 발명자에 의해 최근 분리된 인간의 간 유래의 콜렉틴을 나타냄(일본국 특허출원 제 10-11281 참조)). GenBank 데이터베이스로부터 각각의 아미노산서열을 검색하여 얻은 데이터를 토대로, 렉틴 도메인(lectin domain)을 포함한 영역을 이용하는 clustalw방법으로 다중 얼라인먼트(multiple alignment)를 작성하고, N-J(이웃-관련성; neighbor-joning) 방법을 사용하는 Phylip Version 3.57c package 프로그램을 통해 유전학적 계통발생도를 작성하였다.
그 결과로, 도 10에서 보는 바와 같이, SP-D, 소 콜렉틴-43 및 소 콘글루티닌(conglutinine)이 단일 클러스터(cluster)를 형성하고, 또한 MBP 및 SP-A가 각각 분리된 클러스터를 형성하지만, 본 발명의 신규 콜렉틴 유전자는 CL-L1과 함께 어떤 클러스터에도 속하지 않는다는 것을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 신규 콜렉틴은 CL-L1과도 다르고, 종래 보고된 콜렉틴들과는 유전학적으로 다른 클러스터를 형성한다는 것을 알 수 있다.
실시예 9: 신규 콜렉틴에 대한 모노클로날 항체의 생산
100㎍의 신규 콜렉틴을 용해시킨 PBS(-)(PBS, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온이 없음) 용액 100㎕과 플로인트의 완전 아쥬번트 100㎕를 혼합하여 에멀젼을 제조하고, 이 에멀전을 두 마리의 BALB/C 마우스(숫컷, 8주령)에 복막내 주사한다. 3주일후, 유사한 방법으로 이차면역을 수행한다. 이때에, 플로인트의 완전 아주번트 대신에 플로인트의 불완전 아쥬번트를 사용한다. 2주일이 더 지난 후, 혈청을 회수하고, 그의 항체역가를 측정한다. 항체역가가 가장 높은 마우스를 선발하고, 1주일 지난 후, 이차면역과 동일한 방법으로 최종면역을 수행한다. 최종면역 5일 후에, 비장을 분리해 내어, 세포현탁액을 제조한다. 2×107의 NS-1 골수종세포와, 제작된 1×108의 비장세포를 혼합하여 세포융합을 수행한다. 혼합액을 1,600rpm으로 6분동안 상온에서 원심분리한 후, 상청액을 제거하고 남은 세포들을 현탁한 다음, 여기에 1㎖의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 1분동안 첨가한 후, 상온에서 1분동안 교반한다. 그런 다음, 37℃에서 사전배양된 1㎖의 배양배지(15% FCS, 2mM L-글루타민 용액, 0.05mM 2-머캅토에탄올을 함유한 이소코프의 배지(Isocove's medium))를 온화하게 교반하면서 1분동안 적가한다. 이 과정을 한번 더 반복한 후, 이번에는 8㎖에 대하여 동일한 방법으로 3분동안 수행한다. 그런 다음, 1,000rpm으로 5분동안 상온에서 원심분리하여 PEG를 제거한다. 펠렛을 풀고, 여기에 5×105세포/㎖ 농도가 되도록 100㎖의 흉선세포 현탁액(HAT를 포함하는 하이브리도마 성장 배지에 현탁되는 하이브리도마 생성률을 높이기 위한 사육세포(feeder cell))을 첨가하여, 현탁액을 제조한다. 이 현탁액을 96웰-플레이트에 웰당 0.1㎖씩 치상하고, 37℃, 5% CO2 조건의 CO2 배양기에서 배양한다.
하이브리도마의 선별은 다음과 같이 수행한다. 배양을 시작한지 1일 후에, 각 웰에 150㎕의 HAT 배지(HAT를 함유한 하이브리도마 성장 배지)를 부가하고, 2일동안 더 배양한다. 2일 후에, 150㎕의 배지를 제거하고, 여기에 새로운 150㎕의 HAT 배지를 부가함으로써 배지를 교체하고, 3일 및 7일 배양한 후 동일한 방법으로 배지를 교체한다. 4일 후에, 100㎕의 배양 상청액을 수집한 다음, 신규 콜렉틴에 대한 항체 역가를 측정하여 스크리닝을 수행한다. 그런 다음, 파스테르 파이펫(Pasteur pupet)을 사용하여, 항체양성 세포들을 96웰 플레이트로부터 24-웰 플레이트로 옮긴다. 이때에, 각각의 웰에 0.5㎖의 HT 배지(하이포크산틴 및 티미딘을 함유한 하이브리도마 성장배지)를 사전 부가한다. 배양 3일 후에, 배지 일부를 수집하고, 그의 항체 역가를 다시 측정한 결과에 따라, 항체-양성으로서 결정될 수 있는 세포들을 클로닝하고, 동결보관한다. 클로닝시, 양성세포들을 1세포/㎖이 되도록 흉선세포 현탁액으로 제한희석하고, 96웰-복수 플레이트에 웰당 0.2㎖씩 치상한다. 10일 배양한 후에, 단일 웰마다 단일 콜로니를 형성한 웰의 항체역가를 측정하고, 가장 높은 항체 역가를 나타내는 두 개의 콜로니들을 선별한다. 이들 두 클론들을 재클로닝한다. 클로닝 방법은 1차 클로닝 방법과 유사한 방법으로 수행한다. 항체-양성 세포는 계속하여 대량배양을 수행한다. 우선, 세포를 24웰-멀티 플레이트로 옮긴 후, 3일동안 배양한 다음, 25㎠ 플라스크에 옮기고, 3일동안 더 배양하고, 다시 225㎠로 옮겨 3일동안 더 배양한 후, 배양 상청액을 회수하여 모노클로날 항체를 제조한다.
또한, 복수(腹水)로부터 모노클로날 항체를 생산하기 위해서, 클로닝된 하이브리도마를 1×107세포/㎖로 조정한 다음, 마우스 1마리당 1㎖를 복막내 주사한다. 1주일 후, 팽대된 복부를 갖는 마우스를 에테르로 마취시키고, 복수를 수집한다. 혈청분리제가 첨가된 응집촉진형 원심분리 튜브에 수집한 복수를 집어넣고, 상온에서 30분동안 방치시킨 후, 3,000rpm으로 5분동안 원심분리한다. 상부의 복수를 회수한 후, 알모늄 설페이트 분별화(ammonium sulfate fractionation)에 의해 유체를 더 정제하여, 항체를 생산한다.
실시예 10: 항-마우스 항-인간 신규 콜렉틴 항체를 사용한 ELISA법
항-마우스 항-인간 신규 콜렉틴 항체를 코팅 완충액(50mM 탄산염-이탄산염 완충액, pH 9.6)으로 10㎍/㎖이 되도록 희석하고, 항체용액을 96-웰 ELISA 플레이트에 각 웰당 100㎕씩 분주(分注)한다. 그런 다음, 플레이트를 4℃에서 하룻밤동안 배양하고, 웰들을 100㎕의 세척용액[TBS/T 용액(25mM 트리스-HCl, 0.14M NaCl, 5mM KCl, 0.05% Tween20, pH 7.4)]으로 세 번 세척한다. 이후부터, 세척은 동일한 방법으로 수행한다. 5% 탈지유/TBS/T 용액 300㎕를 각 웰에 분주하고, 37℃에서 1시간동안 배양한다. 세척 후, 피검시료 및 신규 콜렉틴 표준물질을 100㎕씩 분주하고, 37℃에서 1시간동안 배양한다. 이때에, 피검시료는 적당히 희석하고, 표준물질은 최고 농도가 0.02㎍/㎖ 이하가 되도록, 순차적으로 두 번 희석한 물질이 사용된다. 세척한 후, 1㎍/㎖의 비오틴(biotin)화된 항-토끼 항-인간 신규 콜렉틴 항체 100㎕를 분주하고, 37℃에서 1시간동안 배양한다. 세척한 후, 100㎕의 비오틴 스트렙타비딘 용액을 분주하고, 플레이트를 37℃에서 30분동안 배양한다. 세척 후, 100㎕의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 용액을 분주한 후, 상온에서 30분동안 방치한 후, 1N 인산 용액 100㎕를 첨가하고, 반응을 종료시킨 다음, 450㎚의 파장으로 흡광도를 측정한다.
상기한 방법을 사용하여 표준물질로 검량선을 작성하고, 신규 콜렉틴을 정량한다.
실시예 11: 인간에 대해 낮은 면역원성을 갖는 항체의 생산
우선, 실시예 9에서 언급한 방법으로 얻어진 마우스 하이브리도마로부터 mRNA를 제작하고, 파지 벡터를 이용한 cDNA 라이브러리를 제작하여 cDNA 클로닝을 수행한다. 보존영역의 cDNA를 프로브로서 사용하여 마우스 항체 cDNA를 클로닝하고, 제한 효소에 의해 삽입된 cDNA를 분석한 후, 항체 cDNA의 염기서열을 결정한다.
그런 다음, 키메라 항체(chimeric antibody)를 발현시켜, 클로닝된 항체 유전자의 돌연변이 유무를 항체 결합활성검사를 통해 확인하고, 발현된 인간화 항체의 결합활성을 연구할 때, 양성 대조군으로써 사용한다. 키메라 항체를 발현시킬 때, 인간항체의 H쇄 및 L쇄의 보존영역 유전자가 단일벡터에 클로닝된 카세트형 발현벡터가 사용된다. 키메라 항체의 결합활성을 확인한 결과, 클로닝된 마우스 항 체 유전자에 문제가 없이 판단되면, 인간화 항체 유전자를 구축한다. 키메라 항체 생산방법과는 달리, 인간화 항체의 경우는 구축할 유전자의 설계를 행하지 않으면 안된다. 결정된 마우스 항체의 가변영역(variable region) 유전자의 염기서열에 기초하여, 데이터베이스를 이용하여 상동성이 높은 인간 항체의 가변영역의 아미노산서열을 검색한다. CDR 서열을 제외하고 70∼80%의 상동성을 갖는 서열들이 검색되고, 이렇게 선택된 인간 항체 가변영역으로부터 CDR 서열을 제거한 영역(구조물 영역(framework region))에 마우스 항체의 CDR 서열을 이식하고, 단백질 구조분석 소프트웨어에 의해 분자 모델링(molecular modeling)을 수행한다. 모델링을 통해, 항원에 결합하는 H쇄 및 L쇄 중 총 6개의 CDR들의 모양이 삼차원적으로 마우스 모노클로날 항체의 본래의 것과 유사하도록 만들기 위해서, 인간 구조물영역 서열들의 H쇄 및 L쇄 중 몇 개의 아미노산을 마우스형의 것으로 바꾼다. 이때에, 인간 항체에 더 가까운 항체를 생산하기 위해서, 마우스형 아미노산의 수를 적게하는 것이 바람직하다. 이러한 분자 모델링에 따르면, 하나의 모델로부터 출발된 인간화 항체가 마우스 모노클로날 항체와 동일한 100%의 활성을 나타낼 확률이 낮기 때문에, 인간화 항체의 변형체를 10가지 이상 제작, 발현시켜서, 그들의 활성을 비교해야만 한다.
유전자 설계를 완료한 후, 유전자의 제작을 실질적으로 수행한다. 인간화 항체의 H쇄, L쇄의 보존영역을 포함하는 카세트형 발현벡터를 클로닝하고, COS세포 등에서 일시적인 발현을 수행한 다음, 배양 상청액의 항체활성을 ELISA법으로 측정하여 확인한다. 활성이 높은 몇 개의 종류를 선택하고, 안정적인 발현을 위한 각 각의 발현벡터들과 COS세포 등의 숙주세포를 사용하여 안정적인 발현을 하는 세포들을 제조하고, 배양 상청액으로부터 정제된 항체를 생산한다.
실시예 12: 신규 콜렉틴의 발현벡터 pNOW1-hCL-P1의 제작
우선, 서열번호:1에 나타낸 신규콜렉틴의 개시코돈에서 종료코돈까지를 aaggaaaaaa gcggccgcat gcaacaagat ttgatgagg(서열번호:26)의 염기서열로 이루어진 프라이머와 gctctagatt ataatgcaga tgacagtac(서열번호:27)의 염기서열로 이루어진 프라이머를 이용하여 Zymoreactor(ATTO Corp.)으로 증폭시킨다.
얻어진 신규 콜렉틴의 cDNA를 제한효소 NotⅠ 및 XbaⅠ으로 절단하고, 신규 콜렉틴의 cDNA 중 670∼1698bp에 대응하는 cDNA 영역을 얻고, 이를 삽입체 DNA로 한다.
다음으로, 발현벡터 pNOW/CMV-A(일본국 특허공개공보 10-179169(1998) 참조)를 제한효소 NotⅠ 및 XbaⅠ으로 절단하고, 사이토메갈로바이러스 프로모터(cytomegalovirus promoter; pCMV)의 하류, 즉 PCMV(사이토메갈로바이러스 초기 주요항원 프로모터)와 BGP 폴리-A(소 성장호르몬 폴리아데노신화 신호) 사이에, 상기 삽입체 DNA를 DNA 라이게이션 키트(ligation kit; TaKara Shuzo Co., Ltd.)를 이용하여 삽입한다. 상기에서 얻어진 발현벡터를 플라스미드 pNOW1-hCL1-P1(hCL-P1: 신규 콜렉틴을 코딩하는 염기서열)로서 명명하고, 그 구조의 모식도를 도 11에 나타내었다.
실시예 13: 신규 콜렉틴을 발현하는 클론의 선별
(1) 디하이드로폴레이트 리덕타아제 결핍 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(dhfr - )로의 발현벡터 pNOW1-hCL-P1의 도입
10% 태아 카프 혈청(fetal calf serum; FSC, GIBCO)(히포크산틴 및 티미딘이 없는)을 첨가한 이스코프의 변형된 둘베코의 배지(IMDM, GIBCO)를 제조하고, 여기에 DHFR 유전자 결핍 DG44 CHO 세포주(dhfr-)를 1×105세포/㎖의 농도가 되도록 혼합한 다음, 직경이 60㎜인 디쉬에 접종하고, 37℃, 5%의 이산화탄소(CO2)의 조건으로 24시간동안 배양한다. 배양 상청액을 제거한 다음, 사전에 개별적으로 준비한 5㎍의 DNA(발현벡터 pNOW-hCL-P1) 및 리포펙틴 용액(DOTAP: 리포좀 형질감염 작용제; Boeringer Mannheim)을 혼합하여 얻은 용액 100㎕를 함유한 10% FCS 첨가 IMDM를 첨가하여 6㎖의 용액을 만들고, 여기에 히포크산틴(최종 농도 10nM)(GIBCO) 및 티미딘(최종농도 10nM)(GIBCO)을 더 첨가한 다음, 16시간동안 배양하여, 숙주세포 dhfr- CHO에 발현벡터 pNOW1-hCL-P1을 도입한다. 배양 상청액을 제거한 다음, 10% FCS, 히포크산틴 및 티미딘을 첨가한 6㎖의 IMDM을 부가하고, 24시간 더 배양한다.
(2) 네오마이신(G418) 저항성 CHO 세포들의 수득
발현벡터 pNOW1-hCL1-P1로 형질전환시킨 세포들을 24시간 배양한 후, 이들을 트립신 처리하여 디쉬로부터 회수하고, 세포수를 측정한다. 그런 다음, 1×105세포/㎖이 되도록 400㎍/㎖ 농도의 네오마이신(G418)을 함유하는 10% FCS 첨가 IMDM으로 세포를 현탁한 것을, 0.1㎖/웰의 양으로 96-웰 마이크로플레이트 10개 에 접종(분주)한다. 37℃, 5%의 이산화탄소(CO2)의 조건하에서 배양하고, 2주일 후, 생존세포를 G418 저항성 세포(클론)으로서 수득한다.
이들 G418 저항성 클론들에 대해 hCL-P1 생산성을 확인한다. hCL-P1의 생산을 확인한 클론들 중 일부 클론들을 선별하고, 선별된 각 클론들을 25㎠의 배양 플라스크에 접종한다. 세포들이 밀집될 때까지(액 3×106세포/25㎠ 배양 플라스크), 배양을 수행한다. 각각의 배양 플라스크로부터 배양 상청액을 제거한 다음, 상기 언급한 조성과 동일한 10% FCS 첨가 IMDM을 2㎖ 부가한 후, 4일동안 배양하고, 배양 상청액을 회수한다. 회수된 배양 상청액 중 hCL-P1(rhCL-P1: 재조합 인간 신규 콜렉틴)의 생산량을 측정한다. hCL-P1의 생산량은, 대조군으로서 하기의 Suzuku, et al., supra의 방법을 사용하여 E.Coli에서 발현시킨 hCL-P1, 콜렉틴의 당인식영역(CRD) 및 넥(neck) 영역(동일한 방법을 사용하여, E.Coli에서 발현시킨 것)에 대한 항-토끼 폴리클로날 항체 및 hCL-P1(측정 대상)을 사용하여, Suzuku et al.의 방법(Y. Suzuki et al., "Characterization of Recombinant Bovine Conglutinin Expressed in a Mammalian Cell", Biochem. Biophys. Commun., 238: 856-863 (1997))에 따라 정량한다.
(3) 메토트렉세이트(methotrexate) 저항성 CHO 세포의 수득
단대배양(passage culture) 및 상기한 실시예 13(2)에서 얻은 클론을 생산하는 hCL-P1의 안정화 후에, 낮은 농도의 메토트레세이트(MTX)를 배지에 첨가하고, 유전자 증폭을 수행한다.
우선, 5nM MTX, 400㎍/㎖의 G418을 첨가한 10% 투석제FCS(JRH Bioscience) 첨가 IMDM에, 각각의 선별된 세포 클론을 혼합하고, 96-웰 마이크로 플레이트 10개에 0.1㎖/웰의 양으로 접종(분주)하였다. 세포들을 37℃, 5% 이산화탄소(CO2)의 조건하에서 배양하고, 2주일 후, 생존 세포들을 5nM MTX 저항성 세포(클론)으로서 수득한다.
이들 5nM MTX 저항성 클론들에 대해 hCL-P1 생산성을 확인한다. hCL-P1의 생산물임이 확인된 클론들 중에서 몇 개의 클론들을 임의로 선별하고, 선별된 클론들 각각을 25㎠의 배양 플라스크에 접종한 후, 세포들이 밀집될 때까지 2주일간 배양한다. 세포배양 상청액을 제거한 다음, 상기 언급한 조성과 동일한 10% FCS 첨가 IMDM을 2㎖ 부가한 후, 4일동안 배양하고, 배양 상청액을 회수한 다음, hCL-P1의 생산량을 확인한다. hCL-P1 생산량의 정량은 실시예 10에서 언급한 ELISA법에 따라 수행한다.
실시예 14: 트랜스지닉 마우스의 생산
콜렉틴은 기초면역에 중요한 역할을 수행하는 것을 생각된다. 또한, 본 발명의 신규 콜렉틴은 종래 콜렉틴과는 유전학적으로 독립적인 클러스터를 형성하는 것으로 여겨지기 때문에, 면역에 대한 새로운 지식을 얻고, 신규 콜렉틴의 작용 메커니즘을 이해하기 위한 중요한 도구를 제공하기 위해서, 이 신규콜렉틴의 트랜스지닉 비인간 동물을 제작한다.
본 발명의 인간으로부터 유래한 신규 콜렉틴을 마우스에서 발현시킬 수 있는 플라스미드를 제작한다. 우선, 닭 β-액틴 프로모터 및 β-액틴 프로모터 상류의 사이토메갈로바이러스 전사강화자(enhancer)를 포함하는 포유동물 발현 벡터(Niwa, H., et al., Gene, 193-200, 1991)로부터 2.3kb의 단편을 SalⅠ/PstⅠ으로 절단하여 얻고, 이를 클로닝 벡터 pBluescript(Stragene)의 SalⅠ/PstⅠ 부위에 삽입하여 pBsCAG-2 벡터를 제작한다. 이 2.3kb의 단편은 상기 언급한 전사강화자/프로모터 및 토끼 β-글로빈 유전자의 일부(두번째 인트론, 세 번째 액손, 및 3'-말단 비코딩 영역)를 포함한다. hLC-P1의 cDNA(서열번호:1의 제 670-1698 위치)를 상기한 세 번째 액손의 EcoRⅠ 부위에 삽입하여, 트랜스지닉 마우스에서 발현시키기 위한 플라스미드 pβA/hCL-P1을 제작한다.
그런 다음, 알칼린-SDS법에 의해서 많은 양의 플라스미드 pβA/hCL-P1를 준비하고, 플라스미드를 CsCl 평형밀도-균배 초원심분리법(CsCl equilibrium density gradient ultracentrifugation method)에 의해 정제한다. SalⅠ/BamHⅠ으로 pβA/hCL-P1을 절단하여 얻은 유전자를 분리하고, 벡터의 일부분도 절단한다. 그런 다음, 아가로스 겔 전기영동에 의해 벡터 DNA 단편 및 분리, 도입된 DNA 단편을 겔로부터 분출시킨 다음, GeneClean Ⅱ 키트를 사용하여 DNA 정제한다. 에탄올 침전 후, DNA 단편을 주사용 DNA 용액(10mM 트리스-HCl(pH7.5), 0.25mM EDTA)에 용해시킨 다음, 15,000rpm(20,000×g)으로 5분동안 원심분리한 후, 상청액을 회수한다. 분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정함으로써 DNA 농도를 계산하고, 500 DNA 분자/p1이 되도록 농도를 조절하고, DNA가 마우스의 제 1세포기의 배(first phase embryo)에 도입할 때까지, 50㎖로 분주하여 -20℃에서 보관한다.
다음으로, DNA를 주입하기 위한 마우스 수정란을 제작한다. 우선, 수정란의 수집을 위해 사용될 자성 마우스에서 과잉배란(superovulation)을 유도하기 위하여, 수태마 혈청성 생식선자극호르몬(pregnant horse serum gonadotropin; PMSG) 및 인간 융모막성 생식선자극호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG) 5 IU/개체를 48시간 간격으로 복막내 투여하고, 자성 마우스와 웅성 마우스를 동거시켰다(cohabitation). 질 막힘(vaginal plug)이 형성된 암컷 마우스의 복강을 절개한 다음, 자궁을 꺼내어, BWW-Hepes 배지(NaCl 102.2mM, KCl 4.78mM, KH2PO4 1.19mM, CaCl2 1.17mM, MgSO4 1.19mM, NaHCO3 4.76mM, Hepes 15mM, 락트산 나트륨 25mM, 피브루산 나트륨 0.25mM, 글루코오스 5.56mM, BSA 4㎎/㎖, EDTA 0.1mM 및 페놀레드 0.00025% 함유)로 세척한 후, 300㎎/㎖의 하이알루론니다아제(hyaluronidase)를 함유한 BWW-Hepes 배지로 옮긴다. 입체 현미경하에서 자궁관의 팽대부를 시계용 핀셋(watch marker's tweezer)으로 절개하고, 수정란을 배지로부터 꺼낸 다음, 수정란을 글래스 피펫으로 집어서, BWW-Hepes 배양액으로 5번 세척한다. 그런 다음, 수정란을 미네랄 오일이 덮힌 BWW 배지의 드롭(drop)에 유입하고, 37℃, 5%의 CO2 조건의 배양기로 배양한다.
계속하여, 수정란 전핵(pronucleus)에 DNA를 주입한다. 60㎜의 페트리 디쉬에, HWW-Hepes 배지 및 DNA 용액(500 DNA분자/p1)의 드롭을 만들고, 그 위에 미네랄 오일로 덮었다. 인젝션(injection) 및 홀딩 피펫이 갖추어진 주입기(injector)를 사용하여, BWW-Hepes 배양액 드롭 속으로 수정란을 들인다. 인젝션 피펫으로 DNA 용액을 흡입하고, 주입기에 약간의 압력을 주어, DNA 용액이 팁(tip)으로부터 계속 흘러가도록 한다. 인젝션 피펫측으로 웅성 전핵을 위치되도록 홀딩 피펫으로 수정란을 흡인하고, 그런 다음 대상 렌즈의 배율을 40배로 변화시켜 전핵에 초점을 맞춘 다음, 인제션 피펫의 팁 위치를 전핵과 동일한 평면상에 위치되도록 조절한다.
그런 다음, 인젝션 피펫의 팁을 전핵에 찔러, DNA 용액을 주입한다. 핵의 팽대을 확인한 후, 피펫을 빠르게 당기고, 주입된 난자를 아래쪽으로 이동시켜, 처리되지 않은 난자들과 혼합되지 않도록 한다. 한번에 약 30개의 난자들을 주입하고, BWW 배양액 드롭으로 이동시켜, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기로 배양한다.
배양 후, 수정란을 자궁관에 이식한다. 펜토바르비탈 주입 용액(Nembutal injection liquid)을 희석제로서 10배 희석하고(최종 농도 5㎎/㎖), 체중 1㎏당 0.01㎖의 용액을 복막내 투여하여, 가임신한(pseudopregnant) 마우스를 마취시켰다. 가능한한 배양액을 적게 함유하게 하면서(0.5-1㎖), 30개의 난자들을 미리 흡입시킨 트랜스퍼 피펫을 사용하여, 자궁관의 내부로 주입한다. 난소(ovary) 및 자궁관을 체내로 다시 집어 넣고, 입구를 봉합한다. 그런 다음, 생식을 진행시키고, 약 19일 후에 새끼를 얻는다.
트랜스지닉 마우스의 스크리닝은 도트 블랏 하이브리드형성(dot blot hybridization)으로 다음과 같이 수행한다. 얻어진 새끼에게 태생후 4주일동안 젓을 먹이고, 마취상태에서 약 1㎝의 꼬리끝을 자르고, 자른 꼬리를 1.5㎖의 Eppendorf 튜브에 옮긴다. 0.5㎎/㎖의 프로테인나아제 K를 함유한 STE 완충액(50mM 트리스-HCl, 100mM EDTA(pH 7.5), 0.5%(w/v) SDS)를 상기 튜브에 부가하고, 55℃의 배양기에서 교반하며 하룻밤동안 배양한다. 꼬리부위 용해액 100㎕를 새로운 튜브로 옮기고, 여기에 200㎕의 TE 포화된 페놀 용액 및 110㎕의 TE 완충액을 부가한 다음, 볼텍스(vortex) 혼합기로 5분간 교반혼합하고, 혼합물을 15,000rpm(20,000×g)으로 5분동안 상온에서 원심분리한다. 형성된 수용액층 200㎕를 새로운 튜브로 옮기고, 여기에 200㎕의 페놀/클로로포름을 부가하고, 5분동안 볼텍스 혼합기로 교반혼합한 다음, 혼합물을 15,000rpm(20,000×g)으로 5분동안 상온에서 원심분리하였다. 그 상청액을 새로운 튜브로 옮기고, 여기에 3M 아세트산 나트륨 20㎕ 및 에탄올 500㎕를 첨가한 후, 혼합물을 필라멘트형의 DNA 침전물이 관찰될 때까지 충분히 교반혼합하였다. 그런 다음, 15,000rpm(20,000×g)로 4℃에서 5분동안 원심분리하였다. 상청액을 제거한 후, 70% 에탄올로 세척하고, 5분동안 공기건조한 후, 2M NaCl, 0.1M NaOH 용액에 DNA 침전물을 용해시킨다. 끓는 물 수조에서 5분동안 가열한 후, DNA를 얼음 냉각한 물로 빠르게 냉각하여, DNA 변성을 수행하였다. 96-웰 다면체(manifold)를 셋팅(setting)한 후, DNA를 나이론막에 스팟팅(spotting)한 다음, 나이론 막을 공기건조하고, 80℃에서 2시간동안 가열한다. 도입된 DNA 중 마우스로부터 유래한 서열이 아닌 부위를 프로브로 하여, 종래의 방법에 따라 하이브리드형성을 수행한다. 그 결과로, 트랜스지닉 마우스를 동정할 수 있는 신호를 확인할 수 있다.
수정란에 유전자 주입을 수행할 때, 수정란의 약 90%가 생존한다. 이들 생 존란 모두는 동물 한 마리당 약 25 난자로 하여 리시피언트(recipient)에 주입하여, 리시피언트를 수태시키고, 수태 후 약 19일이 되었을 때에, 새끼를 얻을 수 있다. 이들 새끼 마우스의 유전학적 분석을 수행하고, 도입된 유전자의 존재를 확인한다. 또한, F1 마우스를 이들 트랜스지닉 마우스로부터 얻어내고, 이식 유전자의 전달률을 검사한다.
실시예 15: 녹아웃 마우스의 생산
우선, C57BL/6J 마우스로부터 유래한 ES 세포에서 본 발명의 신규 콜렉틴의 마우스 상동체(homologue)를 코딩하는 목적 유전자 부위의 액손 부분에, 선별표지 유전자로서 네오마이신 저항성 유전자를 도입하여, 표적 DNA를 제작한다. 그런 다음, ES 세포로의 DNA의 전기천공(electrophoration)은 다음과 같이 수행한다. 대수 성장기의 ES 세포 배양액(90㎜의 페트리 디쉬)을 깨끗한 ES 배지(20%의 FCS, 1mM 피브루산 용액, 0.1mM 비필수 아미노산 용액 및 1mM 2-머캅토에탄올을 함유한 80%의 DMEM 배양액)으로 교체한 다음, 4시간동안 더 배양하고, 배양액을 제거한 후 PBS(-)로 충분히 세척한 후, 세포들을 0.1% 트립신으로 3분간 처리한다. 세포들에 1㎖의 배양액을 부가한 다음, 상청액을 제거한 후, 세포들을 5㎖의 PBS(-)로 현탁하고, 세포수를 측정한다. 다시 세포들을 600rpm으로 4℃에서 5분동안 원심분리하고, 상청액을 제거한 다음, 세포들을 1.1×107세포/㎖의 농도가 되도록 PBS(-)로 현탁하고, 0.9㎖은 큐벳(cuvette)으로 옮긴 후, 여기에 1㎍/㎖의 DNA 용액(표적용) 25㎕(25㎍)를 부가하고, 상온에서 5분동안 배양한다. 500㎌, 230V의 조건으로 유 전자 펄서(gene pulser)를 사용하여 천기천공을 수행한 다음, 5분동안 방치하고, 세포들을 ES 배양액으로 현탁한 다음, 지지세포(feeder cell)가 치상된 네 개의 페트리 디쉬에 1/4씩 접종한다. 천기천공을 완료한 후, 24시간동안 배양한 후, 배양액을 150㎍/㎖ G418(활성 형태)을 함유한 ES 배양액으로 교체하고, 이후 배양액을 매일 교체한다. 7일이 지난 후, 다음과 같이 클로닝을 수행한다.
콜로니가 형성된 90㎜의 페트리 디쉬로부터 배양액을 제거하고, 10㎖의 PBS(-)를 부가한다. 입체 현미경으로 관찰하였을 때 양호한 모양을 나타낸 콜로니를 팁으로 스크랩핑하고, 이를 흡입하여, 0.1% 트립신 용액 70㎕가 미리 부가된 96-웰 플레이트로 각각의 콜로니들을 옮긴다. 플레이트를 37℃에서 4-5분간 배양하고, 트립신 처리한 다음, 8 Channel Pipetman을 사용하여 피펫팅을 충분하게 수행한 후, 75㎍/㎖의 G418이 함유된 ES 배양액 0.8㎖가 사전에 부가된 24-웰 플레이트(지지세포 함유)의 4개의 웰에 세포들을 접종한다. 24시간 배양한 후, 배양액을 0.75㎍/㎖의 G418이 함유된 ES배양액으로 교체한다. 3일 후에, 대수 성장기의 클론에 0.1% 트립신 100㎕를 부가하고, 여기에 ES 배양액 100㎕를 부가한 후, 페펫팅에 의해 클론을 둥근 바닥 96-웰 플레이트로 옮긴다. 48개의 클론들 모두를 처리할 때, 배양액 20㎕는 보존하고, 잔사 180㎕는 PCR용으로 사용한다.
96-웰 플레이트에서 PCR용 클론을 1,200rpm으로 4℃에서 5분간 원심분리한 후, 배양액을 제거하고, 세포들을 PBS(-)로 세 번 세척한다. 100㎕의 용해용액(100mM 트리스-HCl(pH8.0), 10mM EDTA, 0.2%(w/v) SDS, 100mM NaCl, 100㎍/㎖ 프로테인나아제 K)을 8 Channel Pipetman을 사용하여 클론에 부가하고, 프로테인나아제 K-처리를 55℃에서 1시간동안 수행한다. 플레이트 부근을 접착테이프로 봉합하고, 프로테인나아제 K가 완전히 불활성 되도록 95℃에서 15분동안 더 배양한다. 플레이트를 4℃에서 5분동안 냉각하고, 용액 2-3㎕를 PCR용 시료로서 수집하여, 일차 스크리닝(남은 용액은 -20℃에서 보관함)에 사용한다. 시료는 4개의 클론들로 이루어진 그룹일 수 있고, PCR은 센스 프라이머(atgcaacaagatttgatgagg(서열번호:28)) 및 안티센스 프라이머(cctacccggtagaattgacc(서열번호:29)를 사용하여 수행한 다음, 전기영동법에 의해 목적 유전자의 측정을 통해 양성 그룹을 동정한다. -20℃에서 보관한 남은 시료들 중에서, 유사한 방식으로 양성 그룹에 속하는 각각의 클론을 PCR하여 양성 클론을 확인한다. 그런 다음, 배양용 클론에 대해 스크리닝을 수행한다. 배양용 클론 20㎕를 24웰 플레이트(지지세포 함유)의 4웰/열로 접종하고, 모든 웰이 채워졌을 때, 플레이트를 CO2 배양기로 옮겨 배양한 다음, 마지막 단계로 하나의 클론을 3개의 웰로 나누고, 그런 다음 6-웰 플레이트에 접종한다(지지세포 함유).
유전자를 도입한 ES세포 덩어리를 다음의 방법에 의해서 제조된 마우스의 2.5일생 배(8세포기 배)의 두 개 사이에 끼우는 샌드위치법에 의해서 배세포 키메라 마우스의 발생을 수행한다.
2.5일생 배의 제조는 다음과 같이 수행한다. 2.5일생 배가 ES세포에 착생되기 6일 전에, 5 IU의 PMSG(pregnant mare serum gonadotropin)를 난자 수집용 C57BL6J 자성 마우스에 복막내 투여하여 수행한다. 그런 다음, 4일째에, 5IU의 hCG(human chorionic gonadotropin)를 추가로 복막내 투여하고, 웅성 마우스과 교배시킨다. 3일 전에, 질막힘 형성을 통해 교배를 확인하고, 정관제거수술을 시킨 웅성 마우스와 교배시킴으로써, 자연발정기 상태의 가임신한 자성 마우스를 만들었다. 착생 일에, 난자를 수집하기 위한 자성 마우스를 경부척추골 탈골(cervical vertrae dislocation)에 의해 안락사시킨 다음, 자궁관 및 자궁을 적출하였다. 자궁관 및 자궁을 BWW-Hepes 배양액으로 역류시켜, 2.5일생 배아세포(8세포기 배, 또는 상실배)를 수집하고, BWW 배양액 드롭으로 옮긴 후, CO2 배양기(5% CO2, 37℃)에서 배양한다. 난자들을 수집하고, 2.5일생 배를 산성 Tyrode's 용액(200㎕)한 드롭으로 옮긴 후, 1∼2분동안 방치하고 나서, 클리어 존(clear zone)이 용해되었을 때, BWW-Hepes 배양액으로 빠르게 난자들을 6번 세척하고, 이를 ES세포와의 착색용으로 사용한다.
ES세포의 제조는 다음과 같이 수행한다. 착생 날에, 지지세포로 배양된 ES세포들을 PBS(-)로 두 번 세척하고, 0.05% 트립신 용액으로 2분동안 트립신 처리한 후, 페트리 디쉬로부터 스크랩핑하여 약 10개의 세포 덩어리를 생산하였다. ES 배양액(-G418)을 세포에 부과하여 트립신을 불활성화 시키고, 원심분리후, 세포들을 ES 배양액으로 현탁한다. 이들을 0.1% 젤라틴이 덮힌 페트리 디쉬에 접종하고, 15분동안 CO2 배양기에 방치시킨다. 디쉬에 흡작되지 않은 세포들을 수집하고, 이들 세포들을 응집된 키메라를 제조하기 위해 사용한다.
2.5일생 배와 ES 세포들 사이의 착생은 다음과 같이 수행한다. 우선, 바늘을 사용하여 박테리아 배양용 페트리 디쉬 바닥에 웰을 만든다. 웰을 20㎕의 BWW 배양액으로 덮고, 미네랄 오일을 추가로 덮는다. 그런 다음 디쉬를 CO2 배양기로 옮기고, 배양액은 동일한 조건으로 한다. 양호한 형태를 갖는 10∼20 ES 세포들로 이루어진 덩어리들을 입체 현미경으로 선택한다. 이러한 ES 세포의 덩어리들을 상기한 순서대로 제조된 웰에 치상한다. 클리어존이 제거된 2.5일생 배는 ES 세포에 착생하기 위해서, 웰마다 2개의 배(embryos)로 웰에 치상한다. 디쉬를 CO2 배양기에서 하룻밤 배양하고, 거의 2배의 크기를 갖는 아세포종이 생산된다.
그런 다음, 3.5일생 배를 자궁에 이식한다. 펜토바르비탈의 비경구 용액(Nembutal parenteral solution)을 마취된 상상임신한 마우스(교배 후 2.5일)에 복막내 투여한다(체중 1g 당 50㎍). 마취된 마우스의 배면을 절개하고, 클러칭 팻 매스(clutching pat mass)를 통해 자궁을 추출한다. 하룻밤 배양하여 제조된 아세포종 또는 상실배를 적은 양의 배양액(0.5∼1㎕)으로, 피펫당 10∼15개를 빨아들인 후, 주사기 바늘로 자궁관에 가까운 부분의 가궁벽을 주사하는 것에 의해서 이들 배아를 자궁으로 이식한다. 자궁을 체내로 집어놓고, 입구를 봉합한 후, 약 18일 후에 새끼가 태어난다.
생식계열 세포(germ line)의 전달을 확인한 후, 서로 다른 이종의 마우스를 교배하여 동족화(homogenization)시키고, 본 발명의 신규 콜렉틴의 동족체를 발현하지 않는 목적의 녹아웃 마우스를 제작한다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 항균성, 항바이러스 활성을 확인할 수 있는 콜렉틴의 특징적 구조를 갖고, 지금까지 보고된 콜렉틴과는 다른 신규 콜렉틴 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명에서 제공하는 서열정보는 생물학적 방어 시스템의 메카니즘을 규명하는데 유용하며, 신규 콜렉틴의 생물학적 활성을 이용한 의약, 실험실 용도의 수단(tool)을 제공하는데 유용하다. 예를 들면, 신규 콜렉틴을 발현할 수 있는 벡터, 이 콜렉틴의 발현을 가능하게 하는 벡터를 함유하는 숙주세포, 신규 콜렉틴에 대한 항체, 신규의 콜렌틴 관련 분자종을 스크리닝하기 위한 프로브를 제공할 수 있다. 더욱이, 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자의 기능 또는 발현 조절에 대한 연구, 신규 콜렉틴 및/또는 유래분자가 관여하는 것으로 예상되는 질환의 메카니즘의 규명 및 의약품의 스크리닝 및 안전성 시험에의 이용을 위한 질환 모델 동물로 유용한 트랜스제닉 비인간 동물 및 넉아웃 비인간 동물을 제공할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES, LTD. <120> Novel Collectin <130> 99P147WO <150> JP 10-237611 <151> 1998-08-24 <160> 29 <210> 1 <211> 2024 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <221> CDS <222> (670)..(1695) <400> 1 gtcacgaatc tgcagcaaga taccagcgtg ctccagggca atctgcagaa ccaaatgtat 60 tctcataatg tggtcatcat gaacctcaac aacctgaacc tgacccaggt gcagcagagg 120 aacctcatca cgaatctgca gcggtctgtg gatgacacaa gccaggctat ccagcgaatc 180 aagaacgact ttcaaaatct gcagcaggtt tttcttcaag ccaagaagga cacggattgg 240 ctgaaggaga aagtgcagag cttgcagacg ctggctgcca acaactctgc gttggccaaa 300 gccaacaacg acaccctgga ggatatgaac agccagctca actcattcac aggtcagatg 360 gagaacatca ccactatctc tcaagccaac gagcagaacc tgaaagacct gcaggactta 420 cacaaagatg cagagaatag aacagccatc aagttcaacc aactggagga acgcttccag 480 ctctttgaga cggatattgt gaacatcatt agcaatatca gttacacagc ccaccacctg 540 cggacgctga ccagcaatct aaatgaagtc aggaccactt gcacagatac ccttaccaaa 600 cacacagatg atctgacctc cttgaataat accctggcca acatccgttt ggattctgtt 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80 Ala Lys Ala Asn Asn Asp Thr Leu Glu Asp Met Asn Ser Gln Leu Asn 85 90 95 Ser Phe Thr Gly Gln Met Glu Asn Ile Thr Thr Ile Ser Gln Ala Asn 100 105 110 Glu Gln Asn Leu Lys Asp Leu Gln Asp Leu His Lys Asp Ala Glu Asn 115 120 125 Arg Thr Ala Ile Lys Phe Asn Gln Leu Glu Glu Arg Phe Gln Leu Phe 130 135 140 Glu Thr Asp Ile Val Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Tyr Thr Ala His 145 150 155 160 His Leu Arg Thr Leu Thr Ser Asn Leu Asn Glu Val Arg Thr Thr Cys 165 170 175 Thr Asp Thr Leu Thr Lys His Thr Asp Asp Leu Thr Ser Leu Asn Asn 180 185 190 Thr Leu Ala Asn Ile Arg Leu Asp Ser Val Ser Leu Arg Met Gln Gln 195 200 205 Asp Leu Met Arg Ser Arg Leu Asp Thr Glu Val Ala Asn Leu Ser Val 210 215 220 Ile Met Glu Glu Met Lys Leu Val Asp Ser Lys His Gly Gln Leu Ile 225 230 235 240 Lys Asn Phe Thr Ile Leu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Pro Arg 245 250 255 Gly Asp Arg Gly Ser Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Asn Lys Gly 260 265 270 Gln Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu 275 280 285 Arg Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Gly Lys 290 295 300 Gly Ser Lys Gly Ser Gln Gly Pro Lys Gly Ser Arg Gly Ser Pro Gly 305 310 315 320 Lys Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ser Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Pro 325 330 335 Pro Gly Lys Glu Gly Leu Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Phe Gln 340 345 350 Gly Leu Gln Gly Thr Val Gly Glu Pro Gly Val Pro Gly Pro Arg Gly 355 360 365 Leu Pro Gly Leu Pro Gly Val Pro Gly Met Pro Gly Pro Lys Gly Pro 370 375 380 Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ala Val Val Pro Leu Ala Leu Gln 385 390 395 400 Asn Glu Pro Thr Pro Ala Pro Glu Asp Asn Gly Cys Pro Pro His Trp 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Asp Lys Cys Tyr Tyr Phe Ser Val Glu Lys Glu Ile 420 425 430 Phe Glu Asp Ala Lys Leu Phe Cys Glu Asp Lys Ser Ser His Leu Val 435 440 445 Phe Ile Asn Thr Arg Glu Glu Gln Gln Trp Ile Lys Lys Gln Met Val 450 455 460 Gly Arg Glu Ser His Trp Ile Gly Leu Thr Asp Ser Glu Arg Glu Asn 465 470 475 480 Glu Trp Lys Trp Leu Asp Gly Thr Ser Pro Asp Tyr Lys Asn Trp Lys 485 490 495 Ala Gly Gln Pro Asp Asn Trp Gly His Gly His Gly Pro Gly Glu Asp 500 505 510 Cys Ala Gly Leu Ile Tyr Ala Gly Gln Trp Asn Asp Phe Gln Cys Glu 515 520 525 Asp Val Asn Asn Phe Ile Cys Glu Lys Asp Arg Glu Thr Val Leu Ser 530 535 540 Ser Ala Leu 545 <210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Consensus Sequence of collectins Hybridizable with Novel Collectin. <400> 3 Glu Lys Cys Val Glu Met Tyr Thr Asp Gly Lys Trp Asn Asp Arg Asn 1 5 10 15 Cys Leu Gln Ser Arg Leu Ala Ile Cys Glu Phe 20 25 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Reverse Primer for Screening a Novel Collectin. <400> 4 caatctgatg agaaggtgat g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Forward Primer for Screening a Novel Collectin. <400> 5 acgaggggct ggatgggaca t 21 <210> 6 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of three collectins which were reported heretofore. <400> 6 Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro 1 5 10 15 Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys Glu Phe 20 25 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 Universal Primer Sequence for Sequencing. <400> 7 cgacgttgta aaacgacggc cagt 24 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 Reverse Primer Sequence for Sequencing. <400> 8 caggaaaca gctatgac 17 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a lambda gt11 Reverse Primer for Sequencing. <400> 9 ttgacaccag accaactggt aatg 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a lamda gt11 Forward Primer for Sequencing. <400> 10 ggtggcgacg actcctggag cccg 24 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Primer for Screening a Novel Collectin. <400> 11 cgtgaaaatg aatggaagtg g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Primer for Screening a Novel Collectin. <400> 12 ttttatccat tgctgttcct c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Primer for Sequencing a Novel Collectin. <400> 13 ctggcagtcc ccgaggtcca g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Primer for Sequencing a Novel Collectin. <400> 14 gctggtcccc ccggagagcg t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a 1RC2 Primer for Cap Site Sequencing. <400> 15 caaggtacgc cacagcgtat g 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Synthetic TGP1 Primer for Cap Site Sequencing. <400> 16 tcttcagttt ccctaatccc 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a 2RC2 Primer for Cap Site Sequencing. <400> 17 gtacgccaca gcgtatgatg c 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Synthetic TGP2 Primer for Cap Site Sequencing. <400> 18 cattcttgac aaacttcata g 21 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Primer for Screening a Novel Collectin. <400> 19 gaagacaagt cttcaactct tg 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Primer for Screening a Novel Collectin. <400> 20 ctctgagtct gtgaggccga tc 22 <210> 21 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Probe for Screening a Novel Collectin. <400> 21 gaagacaagt cttcacatct tgttttcata aacactagag aggaacagca atggataaaa 60 aaacagatgg tagggagaga gagccactgg atcggcctca cagactcaga g 111 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Forward Primer for Screening a Novel Collectin. <400> 22 gtgcccctgg ccctgcagaa tg 22 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Reverse Primer for Screening a Novel Collectin. <400> 23 gcatatcacc ctggggaaca ttttag 26 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Sense Primer for Screening beta-Actin. <400> 24 caagagatgg ccacggctgc t 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of an Antisense Primer for Screening beta-Actin. <400> 25 tccttctgca tcctgtcggc a 21 <210> 26 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Sense Primer for Amplifying the Novel Collectin. <400> 26 aaggaaaaaa gcggccgcat gcaacaagat ttgatgagg 39 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Reverse Primer for Amplifying the Novel Collectin. <400> 27 gctctagatt ataatgcaga tgacagtac 29 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Sense Primer for Amplifying the Nockout Gene. <400> 28 atgcaacaag atttgatgag g 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a Sense Primer for Amplifying the Nockout Gene. <400> 29 cctacccggt agaattgacc 20

Claims (63)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열 중 제 226~547 위치의 아미노산으로 구성되는 분리된(isolated) 인간 신규 콜렉틴 폴리펩타이드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 중 제 730~1695 위치의 뉴클레오타이드로 구성된 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  5. 삭제
  6. 서열번호 2의 아미노산 서열 중 제 229~547 위치의 아미노산으로 구성된 분리된 인간 콜렉틴 폴리펩타이드.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 중 제 739~1695 위치의 뉴클레오타이드로 구성된 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  10. 삭제
  11. 서열번호 2의 아미노산 서열 중 제 206~547 위치의 아미노산으로 구성된 분리된 인간 콜렉틴 폴리펩타이드.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 중 제 670~1695 위치의 뉴클레오타이드로 구성된 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  15. 삭제
  16. 서열번호 2의 아미노산 서열 중 제 211~547 위치의 아미노산으로 구성된 분리된 인간 콜렉틴 폴리펩타이드.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 중 제 685~1695 위치의 뉴클레오타이드로 구성된 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  20. 삭제
  21. 서열번호 2의 아미노산 서열 중 제 102~547 위치의 아미노산으로 구성된 분리된 인간 콜렉틴 폴리펩타이드.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 중 제 358~1695 위치의 뉴클레오타이드로 구성된 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  25. 삭제
  26. 서열번호 2의 아미노산 서열 중 제 91~547 위치의 아미노산으로 구성된 분리된 인간 콜렉틴 폴리펩타이드.
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 중 제 325~1695 위치의 뉴클레오타이드로 구성된 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  30. 삭제
  31. 서열번호 2의 아미노산 서열 중 제 9~547 위치의 아미노산으로 구성된 분리된 인간 콜렉틴 폴리펩타이드.
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 중 제 79~1695 위치의 뉴클레오타이드로 구성된 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  35. 삭제
  36. 서열번호 2의 아미노산 서열 중 제 1~547 위치의 아미노산으로 구성된 분리된 인간 콜렉틴 폴리펩타이드.
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 중 제 55~1695 위치의 뉴클레오타이드로 구성된 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  40. 삭제
  41. 제 4항에 의한 폴리뉴클레오타이드가 도입된 것을 특징으로 하는 벡터.
  42. 제 9항에 의한 폴리뉴클레오타이드가 도입된 것을 특징으로 하는 벡터.
  43. 제 14항에 의한 폴리뉴클레오타이드가 도입된 것을 특징으로 하는 벡터.
  44. 제 19항에 의한 폴리뉴클레오타이드가 도입된 것을 특징으로 하는 벡터.
  45. 제 24항에 의한 폴리뉴클레오타이드가 도입된 것을 특징으로 하는 벡터.
  46. 제 29항에 의한 폴리뉴클레오타이드가 도입된 것을 특징으로 하는 벡터.
  47. 제 34항에 의한 폴리뉴클레오타이드가 도입된 것을 특징으로 하는 벡터.
  48. 제 39항에 의한 폴리뉴클레오타이드가 도입된 것을 특징으로 하는 벡터.
  49. 제 41항에 의한 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  50. 제 42항에 의한 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  51. 제 43항에 의한 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  52. 제 44항에 의한 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  53. 제 45항에 의한 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  54. 제 46항에 의한 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  55. 제 47항에 의한 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  56. 제 48항에 의한 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  57. 제 9항에 의한 폴리뉴클레오타이드로 구성되는 프로브.
  58. 제57항에 있어서, 상기 프로브는 제9항에 의한 폴리뉴클레오타이드를 주형으로 하고 caatctgatgagaaggtgatg(서열번호 4) 및 acgaggggctggatgggacat(서열번호 5)의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 프라이머를 사용하여 수행되는 PCR 반응의 증폭 산물에 상보적인 것임을 특징으로 하는 프로브.
  59. 제6항에 의한 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 트랜스제닉 비-인간 동물로서, 제9항에 의한 폴리뉴클레오타이드가 상기 비-인간 동물의 크로모좀(chromosome) 내로 도입된 트랜스제닉 비-인간 동물.
  60. 삭제
  61. 제59항에 있어서, 상기 트랜스제닉 비-인간 동물이 트랜스제닉 마우스임을 특징으로 하는 트랜스제닉 비-인간 동물.
  62. 제6항에 의한 폴리펩타이드를 발현할 수 없도록 제작한 넉아웃(knockout) 비-인간 동물.
  63. 제 62항에 있어서, 상기 넉아웃(knockout) 비-인간 동물은 넉아웃 마우스임을 특징으로 하는 넉아웃 비-인간 동물.
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