CN1549857A

CN1549857A - 睾丸肉碱转运蛋白及其基因

Info

Publication number: CN1549857A
Application number: CNA028109384A
Authority: CN
Inventors: Զ��; 远藤仁; 金井好克; 榎本笃
Original assignee: Human Cell Systems Inc
Current assignee: Human Cell Systems Inc
Priority date: 2001-05-29
Filing date: 2002-05-27
Publication date: 2004-11-24
Anticipated expiration: 2022-05-27
Also published as: US20050054035A1; CN100463967C; US7244556B2; US7582447B2; DE60237518D1; EP1403368A4; EP1403368A1; US20080050811A1; WO2002097088A1; JPWO2002097088A1; ATE479748T1; EP1403368B1; JP4231778B2

Abstract

本发明的目的就是鉴定和提供一种新的肉碱转运蛋白基因，所述基因参与睾丸和附睾中的肉碱转运，以及作为由所述基因编码的蛋白的肉碱转运蛋白。本发明还提供了一种蛋白包括由SEQ ID NO.1所表示的氨基酸序列或者通过上述序列缺失，取代，添加一个到多个氨基酸从所述氨基酸序列衍生的氨基酸序列，并且能够转运肉碱或者其类似物；以及编码该蛋白的基因。

Description

睾丸肉碱转运蛋白及其基因

技术领域

本发明涉及睾丸和附睾中参与肉碱和其类似物的钠依赖性转运的基因以及由所述基因编码的多肽。

背景技术

肉碱对生物体内每个器官中脂肪酸的β-氧化具有重要的功能。每个器官的细胞由于脂肪酸β-氧化而在线粒体中产生ATP(腺苷三磷酸)，它是细胞的能量来源。脂肪酸的酰基通过肉碱的作用在线粒体中转化形成酰基Co-A，然后酰基Co-A进行β-氧化产生ATP。很多肉碱是食物由来的，并且虽然一部分是在肝脏和大脑中生物合成的，但是几乎所有细胞都需要从外界摄取肉碱；因此，根据从前的生理研究，人们猜测肉碱特异性转运蛋白存在于细胞膜中。

通过使用采取摘除的器官的灌注法的试验系统或者分离细胞膜泡囊系统已经对多种细胞进行了肉碱摄取研究。但是，通过传统方法，很难详细分析穿过细胞膜的肉碱转运系统，因此需要分离和分析转运蛋白本身。

大鼠CT1(Sekine，T.等人，Biochem.Biophis.Res.Commun.，251卷，586-591页，1998)已经作为肉碱转运蛋白被分离出来。hOCTN2(Tamai，I.等人，J.Biol.Chem.，Vol.273，pp.20378-20382，1998)已被报道为CT1的人同源基因。肉碱转运蛋白广泛分布于全身的各个器官，参与多种细胞的肉碱摄取。它们也存在于肾脏中用于发挥从肾小管重新吸收肉碱的功能。

根据从前的研究，已经证明在生物体内的睾丸和附睾中肉碱浓度是最高的，根据肉碱的种类达到血清水平的2,000倍。因为，附睾的管是控制精子营养和成熟的器官，肉碱和精子功能的关系受到了广泛的关注。

已经证明在睾丸中产生的精子在该阶段是不成熟的并且运动活性低，而且缺乏受精能力。离开睾丸的精子移动到附睾中并在其中进行多种修饰并成熟。另外，精子鞭毛运动对于精子的受精是必须的，而且需要大量能量。因此有理由认为大量肉碱对于ATP的产生是必须的，ATP是精子鞭毛运动的能量来源。

实际上，已经报道过揭示人精液中肉碱浓度和精子数量以及运动活性之间正相关的研究。而且，在临床医学上，也已经报道了肉碱给药引起特发性男性不育患者受精能力的提高。

因此，特异于睾丸和附睾的肉碱转运被认为在精子成熟和受精中有重要的功能，并且通过使用采取摘除的器官的灌注法的试验系统或者分离细胞膜泡囊系统进行了研究。虽然从研究中已经证实了活性肉碱转运系统的存在，但是其分子物质尚未明确。

在肾脏，肝脏，大脑和胎盘的药物运输中有重要作用的有机阴离子转运蛋白OAT1(有机阴离子转运蛋白1)(Sekine，T等人，J.Bio.Chem.，Vol.272，pp.18526-18529，1997)，OAT1(Sekine，T.，FEBSLetter，.，Vol.429，pp.179-182，1998)，OTA3(Kusuhara，H.等人，J.Bio.Chem.，Vol.274，pp.13675-13680，1999)，和OTA4(Cha，S.H.等人，J.Bio.Chem.，Vol.275，pp.4507-4512，2000)，已经被本发明的一些发明者分离并报道。这些属于OAT家族的转运蛋白为能够转运化学结构不同的多种有机阴离子也转运不同阴离子药物的转运蛋白。

近来，识别有机阳离子的OCT(有机阳离子转运蛋白)家族已经被鉴定。因为肉碱为既具有正电荷也具有负电荷的有机离子，所以有人认为从分子进化的角度肉碱转运蛋白为介于OAT家族和OCT家族之间的蛋白。

鉴于这些事实，本发明的发明者推测特异于睾丸和附睾的肉碱转运蛋白属于有机离子转运蛋白家族。

本发明的公开

本发明的一个目的就是鉴定和提供一种新的参与睾丸和附睾中肉碱转运的肉碱转运蛋白基因，以及一种肉碱转运蛋白，所述肉碱转运蛋白为由所述基因编码的多肽。

附图说明

图1显示了通过注射了人CT2基因的cRNA的卵母细胞的肉碱摄取试验的结果(A)和时间依赖性(B)。

图2显示了通过注射了人CT2基因的cRNA的卵母细胞的肉碱摄取的Michaelis-Menten动态试验的结果(A)和由CT2转运L-肉碱的D-肉碱抑制试验的结果(B)。

图3显示了对于通过注射了人CT2基因的cRNA的卵母细胞的肉碱摄取试验，添加盐的影响结果(A)，以及pH的影响结果(B)。

图4显示了添加肉碱类似物对通过注射了人CT2基因的cRNA的卵母细胞的肉碱摄取试验系统的影响。

图5是代替图片的照片，显示了通过northern印迹方法在人器官中的CT2基因mRNA表达的分析结果。

图6是代替图片的照片，显示了在睾丸和附睾中CT2蛋白表达的免疫组化分析结果。

图7显示了CT2基因的人基因组的结构分析结果。

实施本发明的最佳方式

本发明涉及(1)一种能够转运肉碱或者其类似物的蛋白，包括由SEQ ID NO.1表示的氨基酸序列或者通过所述氨基酸序列中一个或多个氨基酸的缺失，取代或者添加而得到的氨基酸序列。

而且本发明涉及(2)一种编码上述蛋白的基因。

另外本发明涉及(3)一种基因，包括具有由SEQ ID NO.1表示的碱基序列的DNA或者编码与上述DNA在严格条件下杂交，并且能够以钠依赖方式转运肉碱及其类似物的蛋白的DNA。

另外，本发明还涉及(4)一种表达载体，具有上述基因或者编码所述基因的蛋白的基因。

而且，本发明涉及(5)一种由上述表达载体转化的宿主细胞。

另外，本发明涉及(6)一种核苷酸，包括由SEQ ID NO.1代表的碱基序列的连续14个或者更多个碱基的部分序列或者其互补序列。

另外，本发明涉及(7)一种探针，包括上述核苷酸并检测编码能够以钠依赖方式转运肉碱及其类似物的蛋白的基因。

另外，本发明涉及(8)一种通过利用上述核苷酸调节基因表达的方法，所述基因编码能够以钠依赖方式转运肉碱及其类似物的蛋白。

此外，本发明涉及(9)一种针对(1)中所定义蛋白的抗体。

此外，本发明涉及(10)一种通过利用(1)中所定义的蛋白检测受试材料作为底物对所述蛋白的以钠依赖方式转运肉碱及其类似物的能力的作用。

此外，本发明涉及(11)一种通过利用所述蛋白、其特异性抗体、其启动子或者抑制剂调节所述蛋白转运肉碱及其类似物的能力，来调节由(1)所定义的蛋白在睾丸和附睾中转运肉碱及其类似物的动态的方法。

另外，本发明涉及(12)一种通过利用所述蛋白、其特异性抗体、其启动子或者抑制剂调节所述蛋白转运肉碱及其类似物的能力，来调节由(1)所定义的蛋白转运的肉碱及其类似物对于精子细胞的影响的方法。

另外，本发明涉及(13)一种通过利用所述蛋白、其特异性抗体、其启动子或者抑制剂调节所述蛋白转运肉碱及其类似物的能力，来调节由(1)所定义的蛋白转运的肉碱及其类似物对于精子受精能力的影响的方法。

本发明还涉及(14)一种通过利用所述蛋白、其特异性抗体、其启动子或者抑制剂，使蛋白在特定细胞中过量表达、或者调节细胞中现存的所述蛋白转运肉碱及其类似物的能力，来检测或者调节由(1)所定义的蛋白转运的肉碱及其类似物对于精子细胞受精或者个体受精能力的影响的方法。

换言之，本发明的发明者分离了4种如上所述的有机阴离子转运蛋白OAT1，OAT2，OAT3和OAT4。这些有机阴离子转运蛋白的氨基酸序列彼此同源性为大约40％。本发明的发明者基于这些序列调查了EST(表达的序列标记)数据库，鉴定了一种新的cDNA片段，所述片段和OAT1，OAT2，OAT3和OTA4同源。利用所述cDNA片段，本发明的发明者已经鉴定了一种新克隆(CT2)，所述克隆根据人睾丸cDNA文库还未报道，从而完成了本发明。

本发明的肉碱转运蛋白CT2具有通过细胞膜从一个细胞到另一个细胞转运L-肉碱及其类似物的能力，以及与属于OAT家族或者OCT家族的其他药物转运蛋白比较，具有窄的底物选择性。

本发明的蛋白包括具有SEQ ID NO.1表示的氨基酸序列的蛋白或者具有通过缺失，取代或者添加一个到多个氨基酸从所述氨基酸序列衍生的氨基酸序列的蛋白。缺失，取代或者添加氨基酸的量可以是使得有机阴离子转运活性不失去的程度，氨基酸的量通常从大约1到大约110，优选从1到大约55。每种这些蛋白的氨基酸序列和由SEQ IDNO.1表示的氨基酸序列的同源性通常为75％，优选90％。

本发明的基因包括含有具有由SEQ ID NO.1表示的碱基序列的DNA的基因，以及包括含有编码一种蛋白的DNA的基因，所述蛋白与具有由SEQ ID NO.1表示的碱基序列的DNA在严格条件下杂交，并且能够以钠依赖的方式转运肉碱及其类似物。

在本发明的严格条件下杂交可以是在5×SSC(标准柠檬酸盐)杂交液或者在盐浓度等同于5×SSC的杂交液中在从37℃到42℃的温度条件下，进行约12个小时，然后用5×SSC溶液或者盐浓度等同于5×SSC的溶液进行预洗涤，然后用0.1×SSC溶液或者盐浓度等同于0.1×SSC的溶液进行洗涤。通过用1×SSC溶液或者盐浓度为1×SSC的溶液进行洗涤可以达到较高的严格性。

本发明的肉碱转运蛋白基因和蛋白可利用合适哺乳动物的器官，组织，或者培养细胞作为基因来源通过筛选得以分离和获得。哺乳动物包括非人类的动物；诸如狗，牛，马，山羊，羊，猴子，猪，兔子，大鼠，和小鼠；以及人。

基因的筛选和分离优选通过同源筛选，PCR筛选等进行。

获得的cDNA的碱基序列可以通过常用方法进行确定以分析翻译区，从而确定由碱基序列编码的蛋白，CT2的氨基酸序列。

例如利用下列方法，可以证实，获得的cDNA为肉碱转运蛋白的cDNA，换言之，在cDNA中编码的基因产物为肉碱转运蛋白。

通过将从CT2cDNA制备而来的cRNAcRNA导入卵母细胞并表达以及利用常规的摄取试验测定摄取到细胞中的底物(Sekine，T等人，Biochem.Biophis.Res.Commun.，Vol.251，pp.586-591，1998)，可以证明将肉碱转运(摄取)到细胞中的能力，其中肉碱用作底物。

而且也可以通过将类似摄取试验应用于表达细胞来研究CT2的转运特性以及底物选择性。

另外，也可以通过将类似摄取试验应用于表达细胞来研究CT2的特性，诸如时间依赖性转运，钠依赖性，底物选择性，以及pH依赖性。

通过利用获得的CT2基因的cDNA筛选合适的从不同基因来源制备的cDNA文库或者基因组DNA文库，有可能分离来自不同组织或者不同器官的同源基因，染色体基因等等。

而且，通过利用基于本发明公开的基因碱基序列(由SEQ ID NO.1所代表的或者其部分)信息设计的合成引物，有可能根据常规PCR的方法从cDNA文库分离基因。

诸如cDNA文库和基因组DNA文库的DNA文库可以通过所述方法进行制备。例如，方法描述于分子克隆(Molecular Cloning)：由Sambrook.J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.所著T：由冷泉港实验室出版社在1989年出版发行。或者，如果能买到，可以使用市售文库。

为了获得CT2基因的人基因组结构，利用获得的CT2基因的cDNA筛选基因组DNA文库以分析通过筛选获得的克隆。或者，可以利用基于公开发表的人基因组分析结果信息的同源性搜索程序进行检索。

本发明的肉碱转运蛋白(CT2)可以通过利用例如编码肉碱转运蛋白的cDNA的基因重组技术制备。例如，编码肉碱转运蛋白的DNA(诸如cDNA)整合到合适的表达载体，诸如质粒载体，噬菌体载体，以及病毒载体，以将获得的重组DNA导入合适的宿主细胞。产生多肽的表达系统(宿主载体系统)包括细菌，真菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞的表达系统。在上述表达系统中，优选利用昆虫细胞和哺乳动物细胞用于获得功能蛋白。

例如，当在哺乳动物中表达多肽时，编码肉碱转运蛋白的DNA插入到合适表达载体(诸如，质粒载体，逆转录病毒为基础的载体，乳头瘤病毒载体，痘苗病毒载体，以及SV40为基础的载体)中合适启动子(诸如SV40启动子，LTR启动子，以及延长1α启动子)的下游，以构建表达载体。因此，合适的动物细胞通过获得的表达载体进行转化，转化子培养在合适的培养基中产生目的多肽。宿主哺乳动物细胞包括猴COS-7细胞，中国仓鼠CHO细胞，人Hela细胞或者来自肾脏组织的原代培养细胞的细胞株，猪肾脏来源的LLC-PK1细胞，负鼠肾脏来源的OK细胞，小鼠来源的近曲小管S1，S2和S3细胞等。

编码肉碱转运蛋白CT2的cDNA的例子包括但不限于，具有由SEQ ID NO.1代表的碱基序列的cDNA，而且相应于氨基酸序列以及编码多肽的DNA也可以用作cDNA。在这种情况下，已知一种氨基酸由1到6种密码子编码，以及所使用的密码子可以随意选择，但是优选设计的序列根据宿主利用密码子表达的频率能够高水平表达。具有所设计碱基序列的DNA通过DNA的化学合成获得，连同上述cDNA的片段，碱基序列的部分改变等等。碱基序列的人工部分变化以及突变的引入可以通过公开于Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.18，pp.5662-5666，1984的位点特异性突变，利用由编码目的变异的合成寡核苷酸组成的引物进行。

在严格条件下可以和本发明肉碱转运蛋白基因杂交的核苷酸(寡核苷酸或者多核苷酸)可以用作检测肉碱转运蛋白基因的探针，也可作为反义寡核苷酸，核酶，或者诱导调节肉碱转运蛋白的表达。核苷酸包括含有由SEQ ID NO.1代表的碱基序列的连续14个或者更多碱基的部分序列，或者其互补序列，以及为了增强杂交特异性，诸如包括20或者更多个碱基以及30或者更多个碱基的较长序列也可以用作部分序列。

另外，通过使用本发明的肉碱转运蛋白或者免疫学上等效的多肽，可以获得其抗体，抗体可用于肉碱转运蛋白的检测和纯化。可以利用本发明的肉碱转运蛋白，具有肉碱转运蛋白片段或者部分序列的合成肽作为抗原生产抗体。可以通过将抗体接种给宿主动物(诸如大鼠和兔子)并回收抗血清的常规方法产生多克隆抗体，并且可以通过常规杂交瘤等方法产生单克隆抗体。

通过利用本发明的蛋白，可以检测受试材料作为底物对所述蛋白的以钠依赖方式转运肉碱及其类似物的能力的作用。

另外，通过利用所述蛋白、其特异性抗体、其启动子(例如激素，诸如雄激素)，或者其抑制剂(诸如反义核苷酸)调节本发明蛋白转运肉碱及其类似物的能力，可以调节睾丸和附睾中由所述蛋白转运的肉碱及其类似物的动态。

另外，通过利用所述蛋白、其特异性抗体、其启动子(例如激素诸如雄激素)，或者其抑制剂(诸如反义核苷酸)调节本发明蛋白转运肉碱及其类似物的能力，可以调节由所述蛋白转运的肉碱及其类似物对精子受精能力的影响。

通过利用所述蛋白、其特异性抗体、其启动子(例如激素，诸如雄激素)，或者其抑制剂(诸如反义核苷酸)调节本发明蛋白转运肉碱及其类似物的能力，可以调节由所述蛋白转运的肉碱及其类似物对精子或者个体受精能力的影响。

此外，通过使本发明的蛋白在特定细胞过量表达，或者通过利用所述蛋白、其特异性抗体、其启动子(例如激素，诸如雄激素)，或者其抑制剂(诸如反义核苷酸)调节在一个细胞中现存的所述蛋白转运肉碱及其类似物的能力，可以检测或者调节由所述蛋白转运的肉碱及其类似物对精子或者个体受精能力的影响。

实施例

本发明随后将通过实施例进行详细描述，但是并不限于这些实施例。

注意：在下列实施例中的操作将根据描述于分子克隆(MolecularCloning)：Sambrook.J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T著：冷泉港实验室出版社在1989年出版发行的方法进行，除非另有说明，当利用市售试剂盒时，根据其说明书进行操作。

实施例1分离和分析特异于睾丸和附睾的肉碱转运蛋白(CT2)的cDNA

基于由本发明的部分发明者分离的OAT1，OAT2，OAT3，OAT4以及CT1的碱基序列信息，搜索公开发表的EST数据库。搜索结果显示，获得与OAT1，OAT2，OAT3，OAT4以及CT1同源的一新的cDNA片段AA778598。

通过使用³²P标记的AA778598探针，筛选提前制备的人睾丸cDNA文库。在杂交液中50℃杂交一整天，然后用0.1×SSC(标准柠檬酸盐)/0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)在50℃清洗滤膜。作为杂交液的缓冲溶液pH为6.5，含有50％甲酰胺，5×SSC，3×Denhard液，0.2％SDS，10％葡聚糖硫酸酯，0.2mg/ml的变性鲑精DNA，2.5mM的焦磷酸钠，25mM的MES，以及0.01％的消泡剂B(泡沫抑制剂，由Sigma-Aldrich，Co生产)。在λZipLox中分离的克隆通过体外剪切方法亚克隆到质粒载体pZL1中。结果获得具有肉碱转运活性的一新cDNA(CT2cDNA)。

通过上述操作获得的cDNA(CT2cDNA)碱基序列的测定由自动测序仪(Applied Biosystem的产品)利用特定引物(参见SEQ ID NO.1)进行。

随后，从含有CT2cDNA的质粒通过使用T7RNA聚合酶(参见(Sekine，T等人，J.Bio.Chem.，Vol.272，PP.18526-18529，1997)体外制备cRNA(互补于cDNA的RNA)。

这样获得的cRNA根据报道的方法注入恒河豚卵母细胞(参见(Sekine，T等人，J.Bio.Chem.，Vol.272，pp.18526-18529，1997))，在卵母细胞中进行放射性标记的L-肉碱摄取试验。结果，证实表达CT2的卵母细胞表现出图1A所示的³H-L-肉碱摄取。相比之下，代表有机阴离子的¹⁴C-PAH(对氨基马尿酸)和代表有机阳离子的¹⁴C-TEA(四乙铵)的摄取没有被观察到。

下文，转运功能分析，底物选择性研究，基因表达分析，对由该基因编码的蛋白在睾丸和附睾中的免疫研究，以及人基因组中CT2基因的结构分析的结果将按顺序进行描述，所有这些分析和研究都利用本发明的CT2进行。

(1)CT2的时间依赖性肉碱转运试验

作为试验结果，表达CT2的卵母细胞表现出如图1B所示的时间依赖性³H-L-肉碱摄取。从这个结果证实，CT2不仅和肉碱结合而且作为细胞转运肉碱的转运蛋白。

(2)CT2的肉碱转运的米-曼(Michaelis-Menten)动态试验。

由CT2进行的肉碱转运的浓度依赖性根据调查多种浓度肉碱被CT2摄取量的变化进行研究。通过利用注入了CT2cRNA的卵母细胞和根据上述方法进行放射性标记肉碱的摄取试验。结果(图2A)，L-肉碱摄取的Km值为大约20.3μM。

(3)作为L-肉碱异构体的D-肉碱对于CT2的L-肉碱转运的影响研究。

如图2B所示，D-肉碱以浓度依赖的方式抑制CT2的L-肉碱转运。Ki值为大约30.1μM。

(4)肉碱转运中CT2的钠依赖性的研究。

当细胞外钠用锂和N-甲基-D-葡糖胺取代时，CT2的肉碱转运降低显示CT2是细胞外钠依赖的肉碱转运蛋白(图3A)。但是当细胞外钠用锂和N-甲基-D-葡糖胺取代时，摄取并未完全降低，因此反映出CT2依赖于部分细胞外钠。

(5)肉碱转运中CT2的pH依赖性的研究。

如图3B所示，当细胞外pH降到酸性时，CT2的肉碱转运降低。

(6)为了进一步研究CT2的底物选择性，在由注入了CT2cRNA的卵母细胞的³H-肉碱摄取试验系统中，多种肉碱类似物加入到系统中，并研究其影响(抑制试验)。

根据上述方法，利用注入了CT2cRNA卵母细胞进行³H-肉碱摄取试验。在存在或者不存在5μM或者50μM多种化合物(未标记)的条件下测定50nM的³H-肉碱的摄取。结果，多种肉碱类似物(D-肉碱，乙酰L-肉碱，乙酰DL-肉碱，辛酰L-肉碱，甜菜碱等)显著抑制CT2的³H-肉碱的转运(图4)。另外，阴离子物质和阳离子物质诸如对氨基马尿酸和四乙铵没有表现抑制效果(图4)。从上述结果可以发现，CT2是肉碱及其类似物的特异性转运蛋白。

(7)人组织中CT2基因的表达(Northern印迹)的分析。

全长CT2cDNA用³²P-dCTP标记，并用作探针，对提取自多种人组织的滤膜(Clontech产品)印迹RNA进行杂交。在含有全长CT2cDNA的杂交液中过夜杂交，并用含有0.1％SDS的0.1×SSC在65℃清洗滤膜。Northern印迹结果显示，仅仅在睾丸中检测到明显的条带(图5)。

(8)睾丸和附睾中由CT2基因编码的蛋白的免疫学研究。

合成含有CT2蛋白C端的14个氨基酸残基的多肽，免疫兔子获得抗血清。将人睾丸石蜡切片去石蜡并用3％过氧化氢溶液处理以使内源性过氧化物酶失活。该切片和亲和纯化的多克隆抗-CT2抗体(初级抗体)一起温育24小时，然后与用过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体反应。最终，通过加入过氧化物酶的底物二氨基联苯胺，获得的棕色沉淀点利用光学显微镜被观察到。如图6所示，在睾丸支持细胞的细胞质中，以及附睾上皮细胞的腔侧观察到明显的染色(图6中的箭头显示CT2表达位点)。因此，CT2就是在睾丸的支持细胞中提供肉碱的转运蛋白，并从血液向附睾的腔内转运肉碱。

(9)人基因组中CT2基因结构的分析。

利用同源性搜索程序搜索公开发表的人基因组分析结果信息找到CT2基因的外显子结构。如图7所述，CT2基因由10个外显子构成，起始密码子位于第二个外显子中。

工业实用性

本发明特异于睾丸和附睾选择性转运肉碱的肉碱转运蛋白及其基因能够在体外研究肉碱及其类似物在所述转运蛋白表达部位的转运，同时基于本研究预测在生殖器官中所述化合物的动态。肉碱是用于产生精子运动性和受精能力所必需能量的重要因素，而且认为所述转运蛋白的发明将有助于未来阐明先天性男性不育的原因。另外，通过解释调节所述转运蛋白表达的控制因子，本发明可用于发展调节转运肉碱能力的方法，以及发展调节精子受精能力的方法。

序列表

<110>人体细胞组织有限公司(Human Cell Systems，Inc.)

<120>睾丸肉碱转运蛋白及其基因(Testicular carnitine transporter and gene thereof)

<130>SCT032830-25

<150>JP 2001-161212

<151>2001-05-29

<160>2

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>2048

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(285)..(1916)

<400>1

tcgaggggcc agatctcact cgtagggggt gcctgtgcct ggccgcccgt ttctctaatc 60

cgccgccact tccctagacg gctgctgccc agttctgccc tgcgcctccg tagggcctcc 120

ctctgtgcct ggcaggtgtt ccccagggac aaccgttagt cagagttggt tgccgtttat 180

taaaacctaa tacctgccag gtacactgta cctggcgctt acacatagtt cttcatttga 240

tgttcaccgg gaccctgcaa aggaggagta gtgaaaatgt gtat atg agg act ctg 296

Met Arg Thr Leu

1

cat gca gtt tct cat cct tac agt aac tca atg aga ttc cag aga gtc 344

His Ala Val Ser His Pro Tyr Ser Asn Ser Met Arg Phe Gln Arg Val

5 10 15 20

ctc tat ttc ata tgt gcc ttc cag aac atc tct tgt ggt att cac tac 392

Leu Tyr Phe Ile Cys Ala Phe Gln Asn Ile Ser Cys Gly Ile His Tyr

25 30 35

ttg gct tct gtg ttc atg gga gtc acc cct cat cat gtc tgc agg ccc 440

Leu Ala Ser Val Phe Met Gly Val Thr Pro His His Val Cys Arg Pro

40 45 50

cca ggc aat ttg cag aat ggt gag atc tgg gag ctc tca agg tgt agc 488

Pro Gly Asn Leu Gln Asn Gly Glu Ile Trp Glu Leu Ser Arg Cys Ser

55 60 65

agg aat aag agg gag aac aca tcg agt ttg ggc tat gaa tac act ggc 536

Arg Asn Lys Arg Glu Asn Thr Ser Ser Leu Gly Tyr Glu Tyr Thr Gly

70 75 80

agt aag aaa gag ttt cct tgt gtg gat ggc tac ata tat gac cag aac 584

Ser Lys Lys Glu Phe Pro Cys Val Asp Gly Tyr Ile Tyr Asp Gln Asn

85 90 95 100

aca tgg aaa agc act gcg gtg acc cag tgg aac ctg gtc tgt gac cga 632

Thr Trp Lys Ser Thr Ala Val Thr Gln Trp Asn Leu Val Cys Asp Arg

105 110 115

aaa tgg ctt gca atg ctg atc cag ccc cta ttt atg ttt gga gtc cta 680

Lys Trp Leu Ala Met Leu Ile Gln Pro Leu Phe Met Phe Gly Val Leu

120 125 l30

ctg gga tcg gtg act ttt ggc tac ttt tct gac agg cta gga cgc cgg 728

Leu Gly Ser Val Thr Phe Gly Tyr Phe Ser Asp Arg Leu Gly Arg Arg

135 140 145

gtg gtc ttg tgg gcc aca agc agt agc atg ttt ttg ttt gga ata gca 776

Val Val Leu Trp Ala Thr Ser Ser Ser Met Phe Leu Phe Gly Ile Ala

150 155 160

gcg gcg ttt gca gtt gat tat tac acc ttc atg gct gct cgc ttt ttt 824

Ala Ala Phe Ala Val Asp Tyr Tyr Thr Phe Met Ala Ala Arg Phe Phe

165 170 175 180

ctt gcc atg gtt gca agt ggc tat ctt gtg gtg ggg ttt gtc tat gtg 872

Leu Ala Met Val Ala Ser Gly Tyr Leu Val Val Gly Phe Val Tyr Val

185 190 195

atg gaa ttc att ggc atg aag tct cgg aca tgg gcg tct gtc cat ttg 920

Met Glu Phe Ile Gly Met Lys Ser Arg Thr Trp Ala Ser Val His Leu

200 205 210

cat tcc ttt ttt gca gtt gga acc ctg ctg gtg gct ttg aca gga tac 968

His Ser Phe Phe Ala Val Gly Thr Leu Leu Val Ala Leu Thr Gly Tyr

215 220 225

ttg gtc agg acc tgg tgg ctt tac cag atg atc ctc tcc aca gtg act 1016

Leu Val Arg Thr Trp Trp Leu Tyr Gln Met Ile Leu Ser Thr Val Thr

230 235 240

gtc ccc ttt atc ctg tgc tgt tgg gtg ctc cca gag aca cct ttt tgg 1064

Val Pro Phe Ile Leu Cys Cys Trp Val Leu Pro Glu Thr Pro Phe Trp

245 250 255 260

ctt ctc tca gag gga cga tat gaa gaa gca caa aaa ata gtt gac atc 1112

Leu Leu Ser Glu Gly Arg Tyr Glu Glu Ala Gln Lys Ile Val Asp Ile

265 270 275

atg gcc aag tgg aac agg gca agc tcc tgt aaa ctg tca gaa ctt tta 1160

Met Ala Lys Trp Asn Arg Ala Ser Ser Cys Lys Leu Ser Glu Leu Leu

280 285 290

tca ctg gac cta caa ggt cct gtt agt aat agc ccc act gaa gtt cag 1208

Ser Leu Asp Leu Gln Gly Pro Val Ser Asn Ser Pro Thr Glu Val Gln

295 300 305

aag cac aac cta tca tat ctg ttt tat aac tgg agc att acg aaa agg 1256

Lys His Asn Leu Ser Tyr Leu Phe Tyr Asn Trp Ser Ile Thr Lys Arg

310 315 320

aca ctt acc gtt tgg cta atc tgg ttc act gga agt ttg gga ttc tac 1304

Thr Leu Thr Val Trp Leu Ile Trp Phe Thr Gly Ser Leu Gly Phe Tyr

325 330 335 340

tcg ttt tcc ttg aat tct gtt aac tta gga ggc aat gaa tac tta aac 1352

Ser Phe Ser Leu Asn Ser Val Asn Leu Gly Gly Asn Glu Tyr Leu Asn

345 350 355

ctc ttc ctc ctg ggt gta gtg gaa att ccc gcc tac acc ttc gtg tgc 1400

Leu Phe Leu Leu Gly Val Val Glu Ile Pro Ala Tyr Thr Phe Val Cys

360 365 370

atc gcc atg gac aag gtc ggg agg aga aca gtc ctg gcc tac tct ctt 1448

Ile Ala Met Asp Lys Val Gly Arg Arg Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu

375 380 385

ttc tgc agt gca ctg gcc tgt ggt gtc gtt atg gtg atc ccc cag aaa 1496

Phe Cys Ser Ala Leu Ala Cys Gly Val Val Met Val Ile Pro Gln Lys

390 395 400

cat tat att ttg ggt gtg gtg aca gct atg gtt gga aaa ttt gcc atc 1544

His Tyr Ile Leu Gly Val Val Thr Ala Met Val Gly Lys Phe Ala Ile

405 410 415 420

ggg gca gca ttt ggc ctc att tat ctt tat aca gct gag ctg tat cca 1592

Gly Ala Ala Phe Gly Leu Ile Tyr Leu Tyr Thr Ala Glu Leu Tyr Pro

425 430 435

acc att gta aga tcg ctg gct gtg gga agc ggc agc atg gtg tgt cgc 1640

Thr Ile Val Arg Ser Leu Ala Val Gly Ser Gly Ser Met Val Cys Arg

440 445 450

ctg gcc agc atc ctg gcg ccg ttc tct gtg gac ctc agc agc att tgg 1688

Leu Ala Ser Ile Leu Ala Pro Phe Ser Val Asp Leu Ser Ser Ile Trp

455 460 465

atc ttc ata cca cag ttg ttt gtt ggg act atg gcc ctc ctg agt gga 1736

Ile Phe Ile Pro Gln Leu Phe Val Gly Thr Met Ala Leu Leu Ser Gly

470 475 480

gtg tta aca cta aag ctt cca gaa acc ctt ggg aaa cgg cta gca act l784

Val Leu Thr Leu Lys Leu Pro Glu Thr Leu Gly Lys Arg Leu Ala Thr

485 490 495 500

act tgg gag gag gct gca aaa ctg gag tca gag aat gaa agc aag tca 1832

Thr Trp Glu Glu Ala Ala Lys Leu Glu Ser Glu Asn Glu Ser Lys Ser

505 510 515

agc aaa tta ctt ctc aca act aat aat agt ggg ctg gaa aaa acg gaa 1880

Ser Lys Leu Leu Leu Thr Thr Asn Asn Ser Gly Leu Glu Lys Thr Glu

520 525 530

gcg att acc ccc agg gat tct ggt ctt ggt gaa taa atgtgccatg 1926

Ala Ile Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Gly Glu

535 540

cctgctgtct agcacctgaa atattattta ccctaatgcc tttgtattag aggaatctta 1986

ttctcatctc ccatatgttg tttgtatgtc tttttaataa attttgtaag aaaaaaaaaa 2046

aa 2048

<210>2

<211>543

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Arg Thr Leu His Ala Val Ser His Pro Tyr Ser Asn Ser Met Arg

1 5 10 15

Phe Gln Arg Val Leu Tyr Phe Ile Cys Ala Phe Gln Asn Ile Ser Cys

20 25 30

Gly Ile His Tyr Leu Ala Ser Val Phe Met Gly Val Thr Pro His His

35 40 45

Val Cys Arg Pro Pro Gly Asn Leu Gln Asn Gly Glu Ile Trp Glu Leu

50 55 60

Ser Arg Cys Ser Arg Asn Lys Arg Glu Asn Thr Ser Ser Leu Gly Tyr

65 70 75 80

Glu Tyr Thr Gly Ser Lys Lys Glu Phe Pro Cys Val Asp Gly Tyr Ile

85 90 95

Tyr Asp Gln Asn Thr Trp Lys Ser Thr Ala Val Thr Gln Trp Asn Leu

100 105 110

Val Cys Asp Arg Lys Trp Leu Ala Met Leu Ile Gln Pro Leu Phe Met

115 120 125

Phe Gly Val Leu Leu Gly Ser Val Thr Phe Gly Tyr Phe Ser Asp Arg

130 135 140

Leu Gly Arg Arg Val Val Leu Trp Ala Thr Ser Ser Ser Met Phe Leu

145 150 155 160

Phe Gly Ile Ala Ala Ala Phe Ala Val Asp Tyr Tyr Thr Phe Met Ala

165 170 175

Ala Arg Phe Phe Leu Ala Met Val Ala Ser Gly Tyr Leu Val Val Gly

180 185 l90

Phe Val Tyr Val Met Glu Phe Ile Gly Met Lys Ser Arg Thr Trp Ala

195 200 205

Ser Val His Leu His Ser Phe Phe Ala Val Gly Thr Leu Leu Val Ala

210 215 220

Leu Thr Gly Tyr Leu Val Arg Thr Trp Trp Leu Tyr Gln Met Ile Leu

225 230 235 240

Ser Thr Val Thr Val Pro Phe Ile Leu Cys Cys Trp Val Leu Pro Glu

245 250 255

Thr Pro Phe Trp Leu Leu Ser Glu Gly Arg Tyr Glu Glu Ala Gln Lys

260 265 270

Ile Val Asp Ile Met Ala Lys Trp Asn Arg Ala Ser Ser Cys Lys Leu

275 280 285

Ser Glu Leu Leu Ser Leu Asp Leu Gln Gly Pro Val Ser Asn Ser Pro

290 295 300

Thr Glu Val Gln Lys His Asn Leu Ser Tyr Leu Phe Tyr Asn Trp Ser

305 310 315 320

Ile Thr Lys Arg Thr Leu Thr Val Trp Leu Ile Trp Phe Thr Gly Ser

325 330 335

Leu Gly Phe Tyr Ser Phe Ser Leu Asn Ser Val Asn Leu Gly Gly Asn

340 345 350

Glu Tyr Leu Asn Leu Phe Leu Leu Gly Val Val Glu Ile Pro Ala Tyr

355 360 365

Thr Phe Val Cys Ile Ala Met Asp Lys Val Gly Arg Arg Thr Val Leu

370 375 380

Ala Tyr Ser Leu Phe Cys Ser Ala Leu Ala Cys Gly Val Val Met Val

385 390 395 400

Ile Pro Gln Lys His Tyr Ile Leu Gly Val Val Thr Ala Met Val Gly

405 410 415

Lys Phe Ala Ile Gly Ala Ala Phe Gly Leu Ile Tyr Leu Tyr Thr Ala

420 425 430

Glu Leu Tyr Pro Thr Ile Val Arg Ser Leu Ala Val Gly Ser Gly Ser

435 440 445

Met Val Cys Arg Leu Ala Ser Ile Leu Ala Pro Phe Ser Val Asp Leu

450 455 460

Ser Ser Ile Trp Ile Phe Ile Pro Gln Leu Phe Val Gly Thr Met Ala

465 470 475 480

Leu Leu Ser Gly Val Leu Thr Leu Lys Leu Pro Glu Thr Leu Gly Lys

485 490 495

Arg Leu Ala Thr Thr Trp Glu Glu Ala Ala Lys Leu Glu Ser Glu Asn

500 505 510

Glu Ser Lys Ser Ser Lys Leu Leu Leu Thr Thr Asn Asn Ser Gly Leu

515 520 525

Glu Lys Thr Glu Ala Ile Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Gly Glu

530 535 540

Claims

1.一种具有转运肉碱及其类似物能力的蛋白，包括由SEQ IDNO.1所表示的氨基酸序列或者通过缺失，取代或者添加一个到多个氨基酸从所述氨基酸序列衍生的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的蛋白，其中蛋白来自人。

3.权利要求1或者2所述的蛋白，其中蛋白来自器官，组织或者培养细胞。

4.一种编码权利要求1所定义的蛋白的基因。

5.一种基因，其包括由SEQ ID NO.1所表示的碱基序列的DNA或者编码一种蛋白的DNA，所述蛋白与上述DNA在严格条件下杂交，并且能够以钠依赖方式转运肉碱及其类似物。

6.权利要求5所述的基因，其中基因来自人。

7.权利要求5或者6所述的基因，其中基因来自器官，组织或者培养的细胞。

8.一种表达载体，其具有权利要求4到7中任一项所定义的基因或者包括所述基因中编码蛋白的基因。

9.根据权利要求8所述的表达载体，其中表达载体为质粒。

10.一种由权利要求8所定义的表达载体转化的宿主细胞。

11.一种核苷酸，其包括由SEQ ID NO.1所表示的碱基序列中所含的连续14个或者更多个碱基的部分序列或者其互补序列。

12.一种探针，其包括权利要求11所定义的核苷酸并检测编码能够以钠依赖方式转运肉碱及其类似物的蛋白的基因。

13.一种通过利用权利要求11所定义的核苷酸调节编码一种蛋白的基因的表达的方法，所述蛋白能够以钠依赖方式转运肉碱及其类似物。

14.一种针对权利要求1到3中任一项所定义的蛋白。

15.一种使用权利要求1到3中任一项所定义的蛋白，检测受试材料作为底物对所述蛋白的以钠依赖方式转运肉碱及其类似物的能力的作用的方法。

16.一种通过利用所述蛋白、其特异性抗体、其启动子或者抑制剂调节所述蛋白转运肉碱及其类似物的能力，来调节由权利要求1到3中任一项所定义的蛋白在睾丸和附睾中转运肉碱及其类似物的动态的方法。

17.一种通过利用所述蛋白、其特异性抗体、其启动子或者抑制剂调节所述蛋白转运肉碱及其类似物的能力，来调节由权利要求1到3中任一项所定义的蛋白转运的肉碱及其类似物对于精子细胞的影响的方法。

18.一种通过利用所述蛋白、其特异性抗体、其启动子或者抑制剂调节所述蛋白转运肉碱及其类似物的能力，来调节由权利要求1到3中任一项所定义的蛋白转运的肉碱及其类似物对于精子受精能力的影响的方法。

19.一种通过利用所述蛋白、其特异性抗体、其启动子或者抑制剂使蛋白在特定细胞中过量表达、或者调节细胞中现存的所述蛋白转运肉碱及其类似物的能力，来检测或者调节由权利要求1到3中任一项所定义的蛋白转运的肉碱及其类似物对于精子细胞受精或者个体受精能力的影响的方法。