CN1171792A - 具有ii型磷脂酶a2抑制作用的新型单克隆抗体及含其一部分的蛋白质 - Google Patents

具有ii型磷脂酶a2抑制作用的新型单克隆抗体及含其一部分的蛋白质 Download PDF

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Abstract

本发明获得了抑制Ⅱ型磷脂酶A2活性的新型单克隆抗体。该抗体抑制人Ⅱ型磷脂酶A2的活性,同时也可抑制猴Ⅱ型磷脂酶A2和/或小鼠Ⅱ型磷脂酶A2的活性,因此不仅在临床上有用,而且也可在使用猴或小鼠的临床前试验中直接加以利用。此外,该抗体具有游离结合于细胞膜的Ⅱ型磷脂酶A2的全新性质,被认为以新的机制强力抑制Ⅱ型磷脂酶A2活性。本发明的单克隆抗体或含有该抗体一部分的蛋白质可用作涉及Ⅱ型磷脂酶A2的心肌梗塞、脑梗塞等的治疗剂。

Description

具有II型磷脂酶A2抑制作用的新型单克隆抗体 及含其一部分的蛋白质
技术领域
本发明涉及对II型磷脂酶A2具有强抑制活性的新型单克隆抗体及含其一部分的蛋白质。
更具体地，本发明涉及对II型磷脂酶A2特异性、亲和性好，同时抑制II型磷脂酶A2作用强，作为涉及II型磷脂酶A2的疾病的治疗药可利用的新型单克隆抗体及含其一部分的蛋白质。本发明涉及产生该单克隆抗体或蛋白质的细胞，编码该单克隆抗体或蛋白质的DNA及含有该DNA的重组载体。本发明进一步涉及含有该单克隆抗体或蛋白质的医药组合物或II型磷脂酶A2抑制剂。
背景技术
已知磷脂酶A2是生物膜构成成分1，2-二酰基磷酸甘油酯C2位上的酯键的水解酶。此酶见于哺乳动物的各种脏器和细胞，不仅调节生物膜磷脂的生成和代谢，而且起花生四烯酸级联反应的限速酶的作用，已知其代谢产物前列腺素、白三烯、血栓烷、PAF等具有很多生理活性。
磷脂酶A2已知有I型、II型、细胞内等种类(厚味严一等，日本临床，1994年特刊，202-206)。其中，II型磷脂酶A2会伴随炎症反应进入炎症部位的渗出液，大量释放到血液中。有各种报告表明，这种酶在各种炎症性疾病中使病情恶化或成为一部分病因。例如，Kikuchi-Yanoshita等报告了在心肌梗塞模型大鼠的缺血性心脏疾病中，此酶活性的上升与脏器损害的进展相对应(Kikuchi-Yanoshita，R.et al.，J.Biochemistry，114：33-38，1993)。Leong等报告了心肌梗塞患者血中存在比正常人多的此种酶(Leong，L.L et al.，Clinical ExperimentalPharmacology and Physiology，19：113-118，1992)。
Lauritzen等报告了在脑梗塞的缺血再灌流障碍中，本酶对疾病的恶化起了重要的作用(Lauritzen I.et al.，Brain Research，651：353-356，1994)。Baur等报告了在急性肾功能衰竭中，本酶在病情的恶化上起了重要作用(Baur M.，KlinWochenschr，67：196-202，1989)。Murakami等提出，该酶在哮喘等变态反应性疾病中起着中心作用，会促进肥大细胞释放组胺颗粒，抑制此酶可能开发出哮喘等变态反应性疾病的治疗药(Murakami，M.et al.，Journal of Immunology，151：5675-5684，1993)。
Smith等和Pruzanski等报告了慢性类风湿性关节炎患者血中存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重该病的可能性(Smith G.M.et al.，British Journal ofRheumatology，31：175-178，1992；Pruzanski W.et al.，J.Rheumatol.，15：1351-1355，1988)。Pruzanski等报告了变形性关节炎患者渗出液中同样存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重该病的可能性(Pruzanski W.et al.，Life Sciences，48：2457-2462，1991)。Vadas等报告了败血性休克患者血中存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重该病的可能性(Vadas P.et al.，Life Sciences，50：807-811，1992，Green J.，Inflammation，15：355-367，1991)、
Nevalainen等报告了胰腺炎患者、特别是重症患者的血中存在大量本酶，提示此酶引起或加重该病的可能性(Nevalainen T.J.et al.，Gut，34：1133-1136，1993)。Anderson等报告了牛皮癣患者皮肤中存在大量本酶，提示此酶引起或加重该病的可能性(Anderson S.et al.，Inflammation，18：1-12，1994)。
Koike等报告了在多器官衰竭(MOF)中，该酶作为病因起了主要作用(Koike K.et al.，Surgery，112：173-180，1992)。Koeniger等、Edelson等及Romaschin等报告了在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者血中存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重该病的可能性(Koeniger R.et al.，Klin Wochenschr，67：212-216，1989；Edelson J.D.et al.，AM REV RESPIRDIS，143：1102-1109，1991；Romaschin A.et al.，Clin.Biochem.，25：5-60，1992)。
Minami等报告了在克罗恩病及溃疡性大肠炎患者血中存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重该病的可能性(Minami T.et al.，Gut，33：914-921，1992)。
另外，据推测，眼色素层炎、新生儿呼吸窘迫综合征(RDS)、支气管肺发育异常(BPD)等疾病也与本酶有关。
作为抗人II型磷脂酶A2抗体，报道了以下情况。
Stoner等从人胎盘和滑液精制了人II型磷脂酶A2，将其作为抗原，用小鼠获得单克隆抗体(Stoner C.R.et al.，Journal of Immunological Methods，145：127-136，1991)。此文中所用的免疫方法是将BALB/cByJ系小鼠先用与福氏完全佐剂混合的磷脂酶A25μg免疫，再在25日后用3μg免疫。进行脾细胞融合三天前(免疫36天后)以5μg最终免疫。因此，免疫的抗原全量13μg分三次、经36天进行免疫。脾细胞的融合采用小鼠骨髓瘤PAI-0细胞，选择HAT培养基。培养基上清液用磷脂酶A2经ELISA系统检测，获得单克隆抗体(PLA184、PLA185、PLA186、PLA187)。这些抗体具有对人磷脂酶A2的抑制活性。但是，对其它动物磷脂酶A2抑制活性的检测试验仅对大鼠II型磷脂酶A2进行了试验，这些抗体对大鼠II型磷脂酶A2几乎没有或完全没有交叉反应，因此不能用于大鼠动物试验。
Takayama等从风湿症患者的关节液中提纯了人II型磷脂酶A2，作为免疫原，用小鼠获得了单克隆抗体(Takayama K.et al.，BIOCHEMICAL ANDBIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 167：1309-1315，1990)。该文所用的免疫方法为在硝酸纤维素膜上吸附人II型磷脂酶A2 10μg后，制成匀浆，将其接种于BALB/c小鼠脾内。2周后，进行同样的免疫。从而，免疫的抗原全量20μg分两次、于28日内免疫。然后，在3天后，进行脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(X63-Ag8.6.5.3)的融合。通过使用磷脂酶A2的ELISA系统检测培养基的上清液，得到有反应性的单克隆抗体(HP-1、HP-2、HP-3、HP-4)。这些抗体中，对人磷脂酶A2抑制活性最强的为HP-1。然而，即使HP-1，其抑制活性也是弱的，即使加入200倍摩尔比的抗体，也只显示约80％的抑制活性。
McCord等精制了重组人II型磷脂酶A2，将其作为免疫原，用小鼠得到单克隆抗体(McCord M.et al.，THE JOURNAL OF INVESTIGATIVEDERMATOLOGY 102：980-986，1994)。该文所用的免疫方法是对CAF1系小鼠用混合了福氏完全佐剂的磷脂酶A2各以100、50、25μg的量每4周免疫一次。在进行脾细胞融合前3天，进行最终免疫。因而免疫的抗原全量约200μg，分4次，于56日内进行免疫。脾细胞的融合采用小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-AG14，选择HAT培养基。将培养基上清液。用磷脂酶A2检测抑制活性，获得单克隆抗体(3F10)。用此抗体1μg检测人磷脂酶A2抑制活性。然而，该论文中没有记载用多少量的人磷脂酶A2，抑制活性是否强并不明确。
Johnson等还在专利申请公开公报(特表平4-506447号公报)中公开了精制重组人磷脂酶A2，将其作为免疫原，用家兔获得多克隆抗体的方法。这不是单克隆抗体，而且，他们用两种肽(人磷脂酶A2序列的片断GTKFLSYKFSNSGSRITC(N末端67-85位)和NKTTYNKKYQYYSNKHSRGSTPRC(N末端109-132位))作为免疫原进行免疫。用此抗体检测磷脂酶A2抑制活性。然而，从该说明书的记载中，用多少量的抗体和人磷脂酶A2是不清楚的，抑制活性是否强也不明确。
在特开平7-109300号中揭示了能促进人II型磷脂酶A2与硫酸化多糖结合的抗体，但该抗体对人II型磷脂酶A2活性的抑制作用未加以确认。
在上述公知的抗体中，关于对猴、小鼠、家兔、猫、狗和大鼠的II型磷脂酶A2的抑制作用，以及是否能释放结合于细胞的人磷脂酶A2，尚不明了。
一旦以人的酶免疫小鼠，就容易对人酶的氨基酸序列与小鼠不同的部分产生抗体。因而，将人II型磷脂酶A2给小鼠免疫后，从理论上推断，结合于人II型磷脂酶A2的抗体与小鼠II型磷脂酶A2几乎完全不结合。
II型磷脂酶A2的酶活性中心及其邻近部位一般在动物种间具保守性，即便在小鼠与人之间同源性也相当高。当用人II型磷脂酶A2对小鼠免疫时，由于免疫学的耐受性，难以得到识别酶活性中心及其邻近部位的抗体。因此，对人II型磷脂酶A2抑制作用强的抗体也难以得到，这是目前的状况。
强力抑制人II型磷脂酶A2、同时抑制小鼠II型磷脂酶A2和/或猴II型磷脂酶A2的抗体尚未被发现。新药在进行人体临床试验前，必须先通过动物试验阐明其药效作用。因此，必须有对实验动物特别对小鼠等小动物和猴发挥药效作用的单克隆抗体，即抑制人II型磷脂酶A2的同时，强力抑制这些动物的II型磷脂酶A2的单克隆抗体。
已知在磷脂酶A2水解膜磷脂时，必须与细胞结合(Suga H.et al.，Eur.J.Biochem.，218：807-813，1993；Murakami M.et al.，J.Biol.Chem.，268：839-844，1993)。因此，如果抗体不但能抑制血中或渗出液中游离状态的酶，而且能释放结合于其膜磷脂将被水解的细胞上的磷脂酶A2，由于新的作用机制，可望这样的抗体具有更强力的磷脂酶A2抑制作用。然而，抗体一旦与结合于细胞表面的磷脂酶A2结合，可预想到补体和/或效应细胞可攻击所述细胞，因而具有副作用。然而，可释放结合于细胞的磷脂酶A2的抗体尚未得到。
因此，在考虑作为医药品的抗II型磷脂酶A2抗体时，期望获得强力抑制人II型磷脂酶A2、同时可抑制来自其它动物种类的II型磷脂酶A2的抗体、及具有可释放与细胞结合的II型磷脂酶A2的性质的抗体。
发明的揭示
本发明者们为克服这些问题而进行了刻意研究，完成了以下发明。
即将重组人II型磷脂酶A2按每只小鼠20μg与福氏完全佐剂混合，以2-3周间隔共免疫8次。这样，与其他研究者不同，免疫的频率高，同时免疫的时间长，旨在避免免疫学的耐受性。而且，在筛选抗体时，努力改善了用于磷脂酶A2抑制活性的检测系统。
即用敏感性高的大肠杆菌磷脂作为磷脂酶A2活性检测用底物(Jacobson P.B.et al.，Biochem.Pharm.，39：1557，1990)，并改进了作为底物的大肠杆菌磷脂的制备。大肠杆菌磷脂的制备系采用磷脂酶A2缺失的大肠杆菌SN17(pldA，pla-2，thr-1，leuB6，thi)(Doi，O.et al.，J.Biochem.，80：1247-1258，1976)，搀入氚标记的油酸，进行制备。使用这种菌，高效地制成了不被大肠杆菌磷脂酶A2分解的、氚标记的比活性高的大肠杆菌磷脂。而且，使用比现有技术(J.Biol.Chem.，261：4239-4246，1986)酶反应时间长、敏感性高的检测系统，高效、精确地筛选了产生目标抗体的杂交瘤。从而，检测了对得自各种动物的II型磷脂酶A2的活性的抑制效果。
而且，采用检测所得抗体是否释放结合于细胞的磷脂酶A2的系统，检测了抗体的新作用。
结果，成功地获得以具有如下性质为特征的单克隆抗体。
即，本发明者们获得的单克隆抗体对人II型磷脂酶A2有反应性，具有强的抑制活性。而且，与得自猴和小鼠血小板的II型磷脂酶A2显示交叉反应性，具有强的抑制活性。因此，如果使用本发明的抗体，在进行人体试验时，可先进行猴、小鼠的动物试验。此外，本发明的抗体不仅能抑制血中或渗出液中的酶，特别是血中或渗出液中的游离酶，而且能释放结合于细胞的II型磷脂酶A2。已知II型磷脂酶A2通过细胞表面的硫酸肝素与细胞结合，从而与细胞表面具有硫酸肝素等的肝细胞。血管内皮细胞等结合。本发明的单克隆抗体不仅抑制血中或渗出液中呈游离状态的酶，而且具有如上所述的从细胞膜释放结合于细胞的II型磷脂酶A2的性质。
此外，本发明中包括包含具有上述性质的单克隆抗体的一部分，而与该单克隆抗体有同等的抗原结合能力的蛋白质。而且，本发明还包括还原烷基化衍生物，以及对于免疫动物所得的单克隆抗体的氨基酸序列进行了一个或几个氨基酸添加、缺失、取代或变异而得到的蛋白质，只要它们具有与该单克隆抗体同等的抗原结合能力。
本发明者还从产生本发明所包括的抗体的“杂交瘤1.4”和“杂交瘤10.1”分离出编码抗体的H链和L链可变区的cDNA，确定其全碱基序列。据此，不但可利用遗传工程技术大量生产抗体，而且可利用遗传工程技术将本发明所包括的抗体自由地进行改变。(将“杂交瘤1.4”确定的碱基序列表示为序列1(L链)、序列3(H链)。从该碱基序列推测的氨基酸序列表示为序列2(L链)、序列4(H链)。将“杂交瘤10.1”确定的碱基序列表示为序列5(L链)、序列7(H链)。从该碱基序列推测的氨基酸序列表示为序列6(L链)、序列8(H链)。)
即，本发明包含以下内容：
(1)可抑制人II型磷脂酶A2的活性、同时抑制猴II型磷脂酶A2和/或小鼠II型磷脂酶A2活性的单克隆抗体，或含有该抗体的一部分、具有该抑制活性的蛋白质。
(2)具有释放结合于细胞膜的II型磷脂酶A2的作用的单克隆抗体，或含有该抗体的一部分、具有该作用的蛋白质。
(3)如(2)中所述的单克隆抗体或蛋白质，其中磷脂酶A2来自人。
(4)可抑制人II型磷脂酶A2的活性、同时抑制猴II型磷脂酶A2和/或小鼠II型磷脂酶A2活性、而且具有释放结合于细胞膜的II型磷脂酶A2的作用的单克隆抗体，或含有该抗体的一部分、具有该作用的蛋白质。
(5)从杂交瘤12H5(FERM BP-5300)、杂交瘤1.4(FERM BP-5297)或杂交瘤10.1(FERM BP-5298)产生的单克隆抗体或含有该抗体一部分的蛋白质，或具有与它们同等的对II型磷脂酶A2的作用的单克隆抗体或含有该抗体一部分的蛋白质。
(6)如(1)或(2)中所述的单克隆抗体或含有其一部分的蛋白质，所述单克隆抗体或蛋白质包含具有序列2、4、6或8之一所示的氨基酸序列或具有对该氨基酸序列中所含的一个或几个氨基酸进行了氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列的蛋白质。
(7)如(1)或(2)中所述的单克隆抗体、含有该抗体一部分的蛋白质，其中所述单克隆抗体或蛋白质包含具有序列9-20之一所示的氨基酸序列或具有对该氨基酸序列中所含的一个或几个氨基酸进行了有氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列的蛋白质。
(8)产生(1)-(7)之一所述的单克隆抗体或蛋白质的细胞。
(9)如(8)所述的细胞，所述细胞为杂交瘤。
(10)如(8)所述的细胞，所述细胞是用重组DNA转化的细胞。
(11)如(1)-(7)之一所述的单克隆抗体或蛋白质的制备方法，所述方法包含培养(8)中所述的细胞，从培养上清液回收单克隆抗体或蛋白质的工序。
(12)编码(1)-(7)之一所述的单克隆抗体或蛋白质的DNA。
(13)如(12)所述的DNA，所述DNA包含序列1、3、5或7之一所示的碱基序列或对该碱基序列中所含的一个或几个碱基进行了碱基取代、缺失或插入的碱基序列。
(14)含有(12)或(13)的DNA的重组载体。
(15)由(1)-(7)之一所述的单克隆抗体或蛋白质与药剂学上允许的载体组成的医药组合物。
(16)含有(1)-(7)之一所述的单克隆抗体或蛋白质的II型磷脂酶A2抑制剂。
本发明所述的“蛋白质”并不特别限定氨基酸的数目，也包含氨基酸较少的肽。本发明所述的“产生单克隆抗体或蛋白质的细胞”，也只要是产生本发明的单克隆抗体或蛋白质的细胞即可，包含细菌、酵母、哺乳动物细胞等所有细胞。
本发明的单克隆抗体例如可通过在培养基或小鼠腹水中培养小鼠杂交瘤而产生。其片断F(ab′)2、Fab、Fab′等，例如可将产生的抗体用选自胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等的蛋白分解酶进行消化，再作适当的精制而得到。
本发明的杂交瘤，例如杂交瘤12H5、1.4、10.1，可这样得到：将以高的免疫频率、长的免疫时间用健康人II型磷脂酶A2致敏的BALB/c系小鼠的脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞P3×63Ag8/U1(P3U1)按常规方法，如Kohler和Milstein的细胞融合法进行融合(参照后面的实施例)。
本发明者们取得的、本发明中所包含的小鼠杂交瘤12H5、1.4、10.1分别保藏如下：
关于杂交瘤12H5的保藏
(1)保藏机构名称、地址
名称：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所
地址：日本国茨城县つくば市东1丁目1番3号(邮政编码305)
(2)保藏日(最初保藏日)1994年11月22日
(3)保藏编号生命研条寄第5300号(FERM BP-5300)
关于杂交瘤1.4的保藏
(1)保藏机构名称、地址
名称：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所
地址：日本国茨城县つくば市东1丁目1番3号(邮政编码305)
(2)保藏日(最初保藏日)1994年11月22日
(3)保藏编号生命研条寄第5297号(FERM BP-5297)
关于杂交瘤10.1的保藏
(1)保藏机构名称、地址
名称：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所
地址：日本国茨城县つくば市东1丁目1番3号(邮政编码305)
(2)保藏日(最初保藏日)1994年11月22日
(3)保藏编号生命研条寄第5298号(FERM BP-5298)
作为上述杂交瘤的培养基，可使用在例如Dalbecco改良的Eagle极限必需培养基(以下简称“DMEM”)中含有胎牛血清、L-谷氨酰胺、葡萄糖、丙酮酸钠、2-巯基乙醇及抗生素(如青霉素G、链霉素、庆大霉素等)的培养基等。
杂交瘤的培养通常在如下条件下进行：在培养基中于37℃、5％CO2、95％空气的气相中培养2-4天，或在以2，6，10，14-四甲基正十五烷(例如姥鲛烷，Aldrich公司制)预处理的BALB/c小鼠腹腔内培养10-20天左右，产生可精制量的抗体。
将编码本发明抗体的基因的全部或部分插入表达载体中，转移到大肠杆菌、酵母或动物细胞中，使其产生本发明的单克隆抗体或含其一部分的蛋白质，也可得到它们。
这样制得的单克隆抗体可用从培养上清液或腹水中分离精制蛋白质的常规方法加以分离精制。这样的方法可列举如离心分离、透析、硫酸铵盐析、用DEAE-纤维素、羟基磷灰石、A蛋白琼脂糖等柱层析等。
这样分离精制所得的抗体，可按常规方法，用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等蛋白酶进行消化，再按蛋白质分离精制的常规方法进行分离精制，得到具有活性的部分，如F(ab′)2、Fab、Fab′、Fv。进一步通过用二硫苏糖醇和碘乙酰胺等按常规方法将桥接抗体的H链与H链和/或H链与L链的二硫键还原烷基化，可得到H链与L链仅以非共价键结合的抗体的还原烷基化衍生物(有用的免疫试验法，第39页，讲谈社科学书籍)。
关于本发明的单克隆抗体或含其一部分的蛋白质，为了抑制效应细胞的活性，也可改变Fc部分的氨基酸序列(Duncan，A.R.et al.，Nature，332：738，1988；Tao，M.et al.，J.Exp.Med.，178：661-667，1993；Lund，J.，J.Immunology，147：2657，1991)。也可以用其他蛋白质置换Fc部分。还可将其他蛋白质融合于Fc部分，使其产生新的作用。
在人的治疗中使用本发明的单克隆抗体或含该抗体一部分的蛋白质时，较佳的是使用来自人的部分比例高的单克隆抗体或含该抗体一部分的蛋白质。这样的单克隆抗体的例子可列举：(1)仅作为可变区由来自小鼠等动物的氨基酸序列、作为恒定区由来自人的氨基酸序列组成的抗体，即所谓“嵌合抗体”；(2)仅在互补决定区(或高变区，以下简称“CDR”)由来自小鼠等动物的氨基酸序列、其他区域由来自人的氨基酸序列组成的抗体即所谓“人源化抗体”。这些类型的抗体也包括在本发明中。本领域技术人员例如可通过从本发明的杂交瘤分离对应于可变区或CDR的基因，将其与人抗体基因重组，引入宿主细胞进行表达，来制备这些“嵌合抗体”或“人源化抗体”(参照Int.J.Cancer，44，424-433(1989)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87,8095-8099(1990))。当基因的碱基序列确定后，即可使用合成的相应序列的基因，也可使用从杂交瘤和人抗体形成细胞所得的基因与合成基因结合而成的基因。作为对应于可变区或CDR的基因，最好为本发明者们分离所得的、序列1、3、5或7之一所记载的碱基序列或含其CDR部分的碱基序列的DNA，或包含编码序列2、4、6或8之一所记载的氨基酸序列或其CDR部分的碱基序列的DNA，或具有对该DNA的碱基序列的一个或几个碱基进行了碱基的取代、缺失或插入的碱基序列的DNA基因或其一部分的DNA。碱基的取代、缺失或插入等变异的引入可用公知的方法进行(Gillamn et al.，Gene，8，81-97(1979)；Roberts et al.，Nature，328，731-734(1987))。在所得的变异碱基序列中，选择编码具有较佳性质的氨基酸序列的序列，可用噬菌体展示法(Annu.Rev.Immunol.，12，433-455(1994))等。特别是，具体的关于“人源化抗体”，本领域技术人员可按照公知的方法容易地进行制备(Nature，321，522-525(1986)；Science，239，1534-1536(1988)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，86,10029-10033(1989)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，88,2869-2873(1991))。根据这些文献，制备“人源化抗体”时，较佳的是使用与衍生该被移植的CDR的人以外的生物的抗体高度同源的人抗体，作为仅在CDR部位以人以外的生物衍生的CDR取代的人抗体(即构成“人源化抗体”的基本骨架的抗体，称为“人受体抗体”)。如实施例7所示，与本发明者们所得到的本发明中所包括的小鼠抗体高度同源的人抗体有例如Pag-1抗体(Hughes-Jones，N.C.et al.，Biochem.J.，268，135-140(1990))、WEA抗体(Goni，F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80,4837-4841(1983))、ITH5-2抗体(Chin，L.T.，et al.，Immunol.Letter，44，25-30(1995))、ITC48抗体(Ohlin，M.，et al.，Mol.Immunol.，31，983-991(1994))，这些抗体据认为适于作为制备“人源化抗体”时的“人受体抗体”。
至于“嵌合抗体”，本领域技术人员可按照公知的方法容易地进行制备(Nature，314，268-270(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84,3439-3443(1987)；ibid.，84，214-218(1987)；ibid.，81，6851-6855(1984))。
本发明中所包含的较好的单克隆抗体或蛋白质可列举用人II型磷脂酶A2致敏，如上所述制成的单克隆抗体12H5或1.4及其片断F(ab′)2、Fab、Fab′等。可列举具有这些单克隆抗体或其一部分的可变区或高变区、其他部分来自人的单克隆抗体。
本发明的医药组合物非经口投与，即皮下、肌肉或静脉注射特别有效。非经口投与用的组合物通常由溶解于可投与的载体(较佳为水性载体)的单克隆抗体或含其一部分的蛋白质的溶液组成。各种水性载体，如水、缓冲液、0.4％食盐水、0.3％甘氨酸溶液、5％葡萄糖溶液、人白蛋白溶液等均可使用。这些溶液为无菌的，并且一般不含有会形成颗粒的物质。这些组合物可用常规所用的公知的灭菌技术进行灭菌。这些组合物可含有缓冲剂、等渗剂之类为接近生理条件所必需的药剂学上允许的辅助剂，如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠、枸橼酸钠等。可非经口投与的组合物的实际制备可采用本领域熟练技术人员知道的或众所周知的技术，如记载于“Remington′s Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，Easton，PA(1980)＂的技术。
本发明的单克隆抗体或蛋白质或医药组合物可冷冻储存，或冷冻干燥储存而于使用前用适当的溶剂溶解再生后使用。冷冻干燥和再生可用采用本领域技术人员已知的技术。
附图的简单说明
图1表示用重组人II型磷脂酶A2对12H5、10.1和1.4的ELISA结果。
图2表示12H5、10.1和1.4对来自大鼠血小板的磷脂酶A2活性的ELISA结果。
图3表示12H5、10.1和1.4对重组人II型磷脂酶A2活性的抑制作用。
图4表示12H5、10.1和1.4对大鼠II型磷脂酶A2活性的抑制作用。
图5表示12H5对来自各种动物血小板的磷脂酶A2活性的抑制作用。
图6表示10.1对来自各种动物血小板的磷脂酶A2活性的抑制作用。
图7表示1.4对来自各种动物血小板的磷脂酶A2活性的抑制作用。
图8表示12H5、10.1和1.4释放结合于BRL-3A细胞的磷脂酶A2的作用。
图9表示1.4的H链和L链可变区cDNA锚式PCR克隆方法。
图10表示抗体1.4的L链可变区的cDNA序列及翻译所得的氨基酸序列。对应于CDR序列的推测的序列加下划线。
图11表示抗体1.4的H链可变区的cDNA序列及翻译所得的氨基酸序列。对应于CDR序列的推测的序列加下划线。
图12表示10.1的H链和L链可变区cDNA的PCR克隆方法。
图13表示抗体10.1的L链可变区的cDNA序列及翻译所得的氨基酸序列。对应于CDR序列的推测的序列加下划线。
图14表示抗体10.1的H链可变区的cDNA序列及翻译所得的氨基酸序列。对应于CDR序列的推测的序列加下划线。
实施发明的最佳方案
以下描述本发明的实施例，但本发明不受这些实施例的限制。
实施例1  杂交瘤12.5、1.4、10.1的制备
(a)重组人II型磷脂酶A2的制备
本发明的单克隆抗体可通过将重组人II型磷脂酶A2免疫动物而得到，关于重组人II型磷脂酶A2的制备，按照特开平5-192167号公报中记载的方法进行。
(b)经免疫的脾细胞的制备
将实施例1(a)中精制所得的重组人II型磷脂酶A2按每只动物20μg溶解于0.1ml生理盐水中，与等体积福氏完全佐剂混合，乳化，给BALB/c雄性小鼠(开始免疫时是6周龄)腹腔注射(初次免疫)。以后按2-3周间隔，用同量的磷脂酶A2和同体积福氏完全佐剂混合乳化而成的乳剂进行加强免疫7次。第7次免疫的24天后，将磷脂酶A2(20μg/只)溶于0.2ml生理盐水，腹腔注射(最终免疫)。最终免疫3天后，从1只小鼠取脾细胞，悬浮于DMEM培养基中。
(c)杂交瘤12H5、1.4、10.1的制备
将如上制备的脾细胞(1×108个)与小鼠骨髓瘤细胞P3×63Ag8·U1(P3U1)(2×107个)按Kohler&Milstein的方法(见Nature，256，495(1975))进行融合。即将脾细胞与P3U1细胞用DMEM洗涤几次后，一起放入50ml塑料离心管，充分混合。再离心分离除去培养基，在搅拌下，用1分钟向其中缓缓加入保温于37℃的含50％(w/v)聚乙二醇(Sigma，平均分子量3350)的DMEM1ml。
然后，滴加保温于37℃的DMEM 10ml，使细胞融合反应终止。离心分离反应液，除去上清液后，向残渣中加入HAT培养基(含有添加了次黄嘌呤(1×10-4M)、氨基喋呤(4×10-7M)、胸苷(1.6×10-5M)的10％胎牛血清的DMEM培养基)，使脾细胞浓度达到6×105个/ml。将此细胞悬浮液按每孔200μl(脾细胞1.2×105个)分别注入96孔塑料板。11天后，吸去半量培养基，加入上述HAT培养基。细胞融合7-10天后，约半数孔中见到杂交瘤的增殖。用下述(d)的方法测定培养上清液中的抗体活性。将阳性的克隆移至48孔塑料板，再移至24孔塑料板，除了不含氨基喋呤外，用与上述同样的培养基进行培养。用24孔塑料板培养上清液按(d)的方法确认抗体活性的重现性，同时用(e)的方法测定酶抑制活性。
为了证实显示酶抑制活性的3个克隆为单克隆，用有限稀释法进行连续克隆化。将这样所得的克隆产生的单克隆抗体分别命名为12H5、1.4和10.1。
(d)用ELISA法测定抗体的活性
将精制的重组人II型磷脂酶A2用20mM Tris缓冲的食盐水(TBS，pH7.4)溶解成0.05μg/ml，在96孔平底微量滴定板的各孔中每孔加入100μl，在湿润室中于4℃保存一夜。然后，弃去溶液，每孔添加含有1％BSA的TBS 200μl，37℃静置1小时，以封闭各孔的未吸附部分。然后，用含0.05％吐温20(商品名)的TBS(TBS-吐温)溶液洗涤几次。将杂交瘤培养上清液或腹水或精制的抗体制品用含0.2％BSA的TBS-吐温(BSA-TBS-吐温)溶液稀释，在每孔中各加入100μl，室温反应2小时。
与前面同样的用TBS-吐温溶液洗涤后，在每个孔中各加入以BSA-TBS-吐温溶液200倍稀释的辣根过氧化物酶标记的抗小鼠抗体(Zymed公司制)100μl，室温下反应2小时。反应后，与前面同样的用TBS-吐温溶液洗涤后，各加入含0.006％过氧化氢和3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(0.1mg/ml)的0.1M乙酸-枸橼酸钠缓冲液(pH5.8)100μl作为酶底物，室温下静置30分钟。静置后，各加入3M硫酸25μl使反应停止，测定450nm的吸光度。
(e)磷脂酶A2抑制活性的测定
用如下对生物化学杂志的方法(Pepinsky，R.B.et al.，J.Biol.Chem.，261(9)，4239-4246(1986))作了若干改良的方法测定抗体对磷脂酶A2的抑制活性。
将重组人II型磷脂酶A2精制制品0.5ng和培养上清液或精制抗体制品在含150mM氯化钠、12.5mM氯化钙和250μg/ml牛血清白蛋白的125mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)100μl中，室温下预培养2小时。然后，将掺入氚标记的油酸的大肠杆菌SN17的高压消毒的制品25μl(5万-10万cpm)加入反应液中，37℃反应30分钟。将反应混合物转入冰中，加入4N盐酸25μl终止反应。反应终止后，加入40mg/ml牛血清白蛋白25μl，混合后在冰中放置30分钟。
然后，于15000rpm离心2分钟，测定上清液的放射活性。从所得的放射活性中减去阴性对照(不含磷脂酶A2和抗体的样品的放射活性)，所得的值作为磷脂酶A2的活性。抗体对磷脂酶A2活性的抑制率以阳性对照的磷脂酶A2活性(含所述磷脂酶A2但不含抗体的样品的磷脂酶A2活性)为基准，按如下计算表示为百分率。
磷脂酶A2活性抑制率＝{1-(磷脂酶A2与培养上清液或精制抗体制品一起保温后的磷脂酶A2活性)/(阳性对照的磷脂酶A2活性)}×100
在磷脂酶A2活性测定中作为底物用的掺入氚标记油酸的大肠杆菌的高压消毒制品按特开平5-192167号公报第8页记载的方法进行制备。
实施例2 单克隆抗体的产生和精制
(a)单克隆抗体的产生
BALB/c小鼠出生后5-6周腹腔注射2，6，10，14-四甲基正十五烷(姥鲛烷，Sigma)0.5ml，14-21天后，腹腔内接种以0.5ml生理盐水悬浮的5×106个杂交瘤细胞。10-20天后，处死小鼠，剖腹，取其产生的腹水。从每只小鼠得到5-10ml含有单克隆抗体的腹水。
(b)单克隆抗体的精制
将此腹水离心分离除去不溶物后，加入等体积的饱和硫酸铵溶液，于冰上搅拌1小时。离心分离产生的沉淀，溶于少量含0.9％氯化钠的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)，对100倍体积的同一缓冲液于4℃透析一夜，得到粗Y-球蛋白部分。使用MAPS-II小鼠单克隆抗体精制试剂盒(商标，BioRad Laboratories制)，从此部分提纯IgG。
即在Y-球蛋白部分加入等体积的结合缓冲液，混合后，加到以同样的结合缓冲液充分平衡过的A蛋白-琼脂糖CL4B(Pharmacia制)填充的柱上(凝胶床体积20ml)，用3倍柱体积的结合缓冲液洗涤。然后用试剂盒中所装的洗脱缓冲液约3倍柱体积洗脱IgG。洗脱的IgG对20mM Tris-缓冲食盐水(pH7.4)等进行透析，将此作为抗体制品。通常每ml腹水中得到5-10mg IgG。
实施例3抗体亚类的确定
用杂交瘤培养上清液，采用Amersham制的小鼠单克隆抗体分型用试剂盒测定其IgG亚类。本方法基于ELISA法，分别确定了12H5(IgG2a)、1.4(IgG2a)和10.1(IgGl)。
实施例4抗体的交叉反应性
(a)大鼠II型磷脂酶A2的精制
在大鼠PRP(富血小板血浆)中加入1/5体积的ACD液(含65mM柠檬酸和85mM柠檬酸钠的2％(w/v)的葡萄糖液)，以2500×g离心10分钟。将沉淀的血小板加ACD/F10培养基(1∶5)(F10，Gibco制)混合液悬浮成2×109个细胞/毫升后，以2500×g离心10分钟。再将沉淀的血小板用F10培养基再悬浮成2×109个细胞/毫升，然后依次加入1M氯化钙和2500单位/毫升凝血酶使终浓度为2mM和2.5单位。
添加后，37℃培养5分钟，再于4℃、3000×g离心15分钟，回收上清液(凝血酶刺激的大鼠血小板上清液)，将此上清液供给以后的精制操作。磷脂酶A2的精制系将特开平5-192167号公报第12页记载的方法作若干改良。即将凝血酶刺激的大鼠血小板上清液通过预先用0.1M乙酸盐缓冲液(pH6.0)平衡过的硫酸化cellulofine(生化学工业株式会社制)柱(Econocolumn，柱体积20ml，BIO-RAD公司制)。将洗涤液(含0.5M氯化钠的0.1M乙酸盐缓冲液(pH6.0))200ml通过该柱进行充分洗涤后，用30ml洗脱液(含1.5M氯化钠的0.1M乙酸盐缓冲液(pH6.0))洗脱，所得的流份为硫酸化cellulofine结合部分。然后，再用HPLC分离出硫酸化cellulofine结合部分。
用LC-4AHPLC系统(岛津制作所制)，采用CAPCELL PAK C 18柱(4.6mmID×25cm；资生堂制)，全部以1ml/分的流速进行HPLC。硫酸化cellulofine结合部分通过柱后，让0.1％三氟乙酸通过柱60分钟。然后，在0.1％三氟乙酸存在下，以0-50％的线性梯度的乙腈洗脱磷脂酶A2。磷脂酶A2的峰出现在约30％乙腈附近，故在此加以回收。
回收的部分用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色法鉴定，检出磷脂酶A2单一区带，证实此带为大鼠II型磷脂酶A2。
(b)来自人、猴、狗、家兔、猫和小鼠血小板的II型磷脂酶A2的制备
按照生物化学杂志(J.Biol.Chem.，264(10)，5768-5775(1989))记载的人血小板破碎液的制备方法制备来自各种动物血小板的II型磷脂酶A2。
即，从人、恒河猴、狗、家兔、小鼠和猫制备PRP(富血小板血浆)，添加EDTA使终浓度成为2mM后，2500×g离心10分钟，回收细胞。将细胞悬浮在含有120mM氯化钠和2mM EDTA的30mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)中，再以2500×g离心10分钟。本操作进行2次后，将所得的细胞再悬浮于含有120mM氯化钠和2mM EDTA的30mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)中，使每毫升含2×109个细胞，冷冻于液氮中。
使冷冻的细胞悬浮液融解，加入等体积0.36N的硫酸，进行超声粉碎(BIOMC 7040 ULTRA SONIC PROCESSOR：Seiko制，输出80，15秒×6次)。所得的细胞超声波破碎液在冰中放置60分钟后，于4℃、10000×g离心30分钟，回收上清液。在沉淀中再加入离心上清液1/3体积的0.18N硫酸，再悬浮后，在冰中放置60分钟。然后于4℃、10000×g离心30分钟，回收上清液。合并两次离心上清液，对含有200mM氯化钠的50mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)透析一夜。透析后，将细胞破碎液于4℃、15000×g离心40分钟，回收上清液，作为来自血小板的磷脂酶A2。
(c)ELISA反应性
用实施例2(b)中所得的各种单克隆抗体纯品进行如下实验。将IgG制品用BSA-TBS-吐温配成10μg/ml，进行系列3倍稀释。按照实施例1(d)，进行ELISA，研究对重组人II型磷脂酶A2和大鼠II型磷脂酶A2的交叉反应性。将实施例1(d)的重组人II型磷脂酶A2换成大鼠II型磷脂酶A2，进行对大鼠II型磷脂酶A2的ELISA。
结果见图1-图2，图中横轴为抗体浓度，纵轴为450nm处的吸光度。对于12H5和1.4观察到对大鼠磷脂酶A2的交叉反应性，对于10.1未见交叉反应性。
(d)对来自各种动物的磷脂酶A2的抑制活性
用实施例2(b)中所得的各种单克隆抗体纯品进行如下实验。
(1)对重组人II型磷脂酶A2的抑制活性
用实施例1(a)的重组人II型磷脂酶A2，按照实施例1(e)测定对磷脂酶A2的抑制活性。各抗体对重组人II型磷脂酶A2活性的抑制率见图3，将磷脂酶A2和抗体样品预培养后的抗体浓度作为横轴。12H5和1.4在10μg/ml的浓度时几乎完全抑制磷脂酶A2的活性。而10.1在3μg/ml的浓度达到80％的抑制率。
(2)对大鼠II型磷脂酶A2的抑制活性
将实施例1(e)的重组人II型磷脂酶A2换成实施例4(a)的大鼠II型磷脂酶A2精制品(0.5ng)，测定对磷脂酶A2的抑制活性。各抗体对大鼠II型磷脂酶A2活性的抑制率见图4，将磷脂酶A2和抗体样品预培养后的抗体浓度作为横轴。12H5和1.4也抑制大鼠II型磷脂酶A2的活性，抑制磷脂酶A2活性50％所需的抗体浓度在12H5为5μg/ml。
(3)对来自人、猴、狗、家兔、猫和小鼠血小板的II型磷脂酶A2的抑制活性
将实施例1(e)的重组人II型磷脂酶A2换成一定量的各血小板破碎液(20-40μl)，测定对磷脂酶A2的抑制活性。各抗体对来自血小板的磷脂酶A2活性的抑制率见图5-图7，横轴为血小板破碎液和抗体样品预培养后的抗体浓度。12H5、1.4和10.1对来自人血小板的磷脂酶A2活性与重组人II型磷脂酶A2活性同样地具有抑制作用。从而表明，本发明的抗重组人II型磷脂酶A2的抗体具有抑制天然人II型磷脂酶A2活性的能力。另一方面，本发明的抗体抑制来自恒河猴、小鼠的血小板的磷脂酶A2的活性。对来自狗血小板的磷脂酶A2活性也能部分抑制。而对来自家兔、猫的血小板的磷脂酶A2活性则无抑制作用。
实施例5  抗体释放结合于细胞的II型磷脂酶A2的活性
在96孔平板培养皿(Falcon公司制)上，用F12K/10％FCS(F12K：大日本制药社制)培养肝细胞(BRL-3A：购自大日本制药)。将长成铺满细胞后的培养基弃去，加入含有以4ng 125I标记的重组人II型磷脂酶A2的F12K/10％FCS 50μl，于37℃培养，使磷脂酶A2与细胞结合。1小时后，加入含有精制抗体制品的F12K/10％FCS或者F12K/10％FCS 50μl，再培养2小时。培养后，回收培养液，测定其放射活性。同时，将添加到反应系统中的4ng 125I标记的磷脂酶A2的放射活性另外加以测定。
以所添加的磷脂酶A2的放射活性减去磷脂酶A2与细胞结合后添加F12K/10％FCS培养后的培养液的放射活性所得的值作为100％，抗体从细胞释放磷脂酶A2的活性表示为添加各种浓度抗体进行培养后的培养液的放射活性的百分率。
重组人II型磷脂酶A2的125I标记用以下方法进行。在涂有IODOGEN(Pierce公司制)10μg的玻璃试管中加入含有30μg重组人II型磷脂酶A2的100mMTris-盐酸缓冲液(pH7.4)100μl，加入100mCi/ml Na125I(ICN公司制)6μl后，在室温下放置20分钟。从玻璃试管中取出反应液使反应终止。用凝胶过滤法除去未反应的Na125I。
在结合了磷脂酶A2的细胞中加入各种浓度的精制抗体制品进行培养，测定
培养液的放射活性。各抗体释放结合于细胞的磷脂酶A2的活性见图8，横轴为加入抗体后培养液中的抗体浓度。作为对照的小鼠抗体完全不从细胞释放磷脂酶A2，而12H5、10.1和1.4浓度依赖性地从细胞释放磷脂酶A2。
实施例6 抗体的H链和L链可变区cDNA的克隆
使用QuickPrep Micro mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制)，从约107个杂交瘤细胞制成用于cDNA克隆的信使RNA。即将细胞悬浮于提取缓冲液，用寡(dT)-纤维素分离mRNA。
使用5′RACE系统试剂盒(Gibco制)，按图9所示顺序制成抗体1.4的H链和L链可变区cDNA。即使用与恒定区基因(C)杂交形成的引物和逆转录酶(SUPER SCRIPTII逆转录酶)，以1μg mRNA为模板，合成单链cDNA。此处所用的引物对于L链为“GSP 1L(5′-GGCACCTCCAGATGTTAACTGC-3′)/序列21”，对于H链为“GSP 1H(5′-GGAA(AG)TA(AGC)CCCTTGACCAGGC-3′)/序列22”。GSP 1H序列中，括号内的序列表示对应于简并的碱基。然后，在用RNA酶H消化作为模板的mRNA后，用“GLASSMAX Spin Cartridge”提纯单链DNA。用dCTP和末端脱氧核苷酸转移酶在单链cDNA的3′末端连接聚(dC)尾。使用与聚(dC)尾杂交的锚定引物(5′-CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3′/序列23)和与恒定区基因(C)杂交的引物“GSP 2L(5′-TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3′)/序列24”(在L链的情况下)或“GSP 2H(5′-TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGAC(CAT)GATGGGG(GC)TGT(TC)GTTTTGGC-3′)/序列25”(在H链的情况下)，使用LATaq(宝酒造社制)，使H链和L链可变区基因(V)扩增。GSP 2H序列中括号内的序列表示对应于简并的碱基。将这些PCR反应产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，可检出对应于约550-570碱基对的H链和L链单一区带。
使用“Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontec制)”，按图12的方法制成抗体10.1的H链和L链可变区cDNA。即使用“Marathon cDNA合成引物”和逆转录酶，以1μg mRNA为模板，合成单链cDNA。再使此反应液与RNA酶H、DNA聚合酶I、DNA连接酶反应，合成双链cDNA。然后，将此反应液用T4 DNA聚合酶催化反应，使双链DNA末端平整。使用T4 DNA连接酶，使MarathoncDNA衔接头结合于双链cDNA。用与衔接头杂交的衔接引物1和引物GSP2L(在L链的情况下)或GSP2H(在H链的情况下)，使用LATaq(宝酒造社制)使H链和L链可变区基因(V)扩增。将此PCR反应产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，可检出对应于约550-570碱基对的H链和L链单一区带。
为了测定序列，使用“TA克隆试剂盒(Invitrogen制)”，将PCR扩增的片断整合到pCRTMII载体中。将插入此片断的pCRTMII质粒转化到大肠杆菌JM109的感受态细胞(宝酒造社制)中。用板上形成的集落和与pCRTMII杂交的“5′引物UD(5′-ACCGAGCTCGGATCCACTAG-3′)/序列26”和“3′引物-DU(5′-ATGCATGCTCGAGCGGCCGCC-3′)/序列27”，使用Taq聚合酶(宝酒造社制)进行克隆-PCR。用1.2％琼脂糖凝胶电泳分析扩增的DNA片断，从约600-620个碱基对的片断扩增的克隆中选出抗体1.4L链3个克隆，H链4个克隆，及抗体10.1L链2个克隆，H链4个克隆。培养各克隆的大肠杆菌，用“QIAwell-8质粒纯化试剂盒(Qiagen制)”制备质粒DNA。
用所制得的各克隆的质粒DNA和引物UD、引物DU，或L链用的GSP2L，H链用GSP2H，使用“DNA序列测定试剂盒(Parkin-Elmer制)，进行序列测定反应，用373DNA序列分析仪(ABI制)进行分析。抗体1.4的3个L链特异性和4个H链特异性克隆，及抗体10.1的2个L链特异性和4个H链特异性克隆分别具有相同的序列。图10(序列1和2)关于抗体1.4的L链、图11(序列3和4)关于抗体1.4的H链，分别表示可变区的cDNA序列及推断的氨基酸序列。图13(序列5和6)关于抗体10.1的L链、图14(序列7和8)关于抗体10.1的H链，分别表示可变区的cDNA序列及推断的氨基酸序列。在各图中，对应于CDR序列推测的序列加下划线。(抗体1.4L链的推测的CDR序列以序列9-11表示，抗体1.4H链的推测的CDR序列以序列12-14表示，抗体10.1L链的推测的CDR序列以序列15-17表示，抗体10.1H链的推测的CDR序列以序列18-20表示。)
实施例7  抗体1.4和抗体10.1的H链和L链可变区的氨基酸序列与人抗体氨基酸序列的同源性检索
从GenBank、EMBL、SWISS-PROT、PIR、PRF数据库检索与实施例6中所得的抗体1.4和抗体10.1的H链和L链可变区的氨基酸序列具有高度同源性的人抗体。同源性检索采用BLASTP 1.4.8MP(Altschul，S.F.et al.，J.Mo1.Biol.，215，403-410(1990))方案进行。其结果表明，抗体1.4与诸如Pag-1抗体(Hughes-Jones，N.C.et al.，Biochem.J.，268，135-140(1990))和WEA抗体(Goni，F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80,4837-4841(1983))等具有高度同源性。抗体10.1与诸如ITH 5-2抗体(Chin，L.T.et al.，Immunol.Letter，44，25-30(1995))、ITC 48抗体(Ohlin，M.，et al.，Mol.Immunol.，31，983-991(1994))等具有高度同源性。
产业上利用的可能性
本发明的单克隆抗体及含其一部分的蛋白质与人II型磷脂酶A2有反应性，具有强的抑制活性。而且，所述抗体和蛋白质与来自猴和/或小鼠血小板的II型磷脂酶A2显示交叉反应性，因此在作为实验动物的这些动物上也可适用，在对人试验药理效应前可先在猴、小鼠身上进行动物试验，这是其有利之处。此外，本发明的单克隆抗体及含其一部分的蛋白质可释放结合于细胞的II型磷脂酶A2，因此对II型磷脂酶A2具有特别强的抑制活性，被认为不会产生因补体和/或效应细胞的攻击而引起的副作用。
本发明的单克隆抗体及含其一部分的蛋白质可用作人II型磷脂酶A2被认为是病情恶化或引起疾病的原因之一的各种疾病的治疗剂，如心肌梗塞、脑梗塞、急性肾衰竭、哮喘等变应性疾病、慢性类风湿性关节炎、变形性关节炎、败血性休克、胰腺炎、牛皮癣、多脏器衰竭(MOF)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、克罗恩病和溃疡性大肠炎、葡萄膜炎、新生儿呼吸窘迫综合征(RDS)、支气管肺发育异常(BPD)等。
序列表
序列编号：1
序列长度：393
序列类型：核酸
链的数目：双链
拓扑学：直链状
序列的种类：mRNA的cDNA
起源
    细胞系：1.4
序列的特征
表示特征的代号：CDS
存在的位置：1..393
鉴定特征的方法：E
序列ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC TGG GTT CCA    48Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1               5                   10                  15GGT TCC ACA GGT GAC ATT GTG CTG ACC CAA TCT CCA GCT TCC TTG GCT    96Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
        20                  25                  30GTG TCT TTA GGG CAG AGG GCC ACC ATA TCC TGC AGA GCC AGT GAA AGT   144Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
    35                  40                  45GTT GAT AGT TAT GGC ATT AGT TTT ATG CAC TGG TAT CAG CAG AAA CCA   192Val Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50                  55                  60GGA CAG CCC CCC AAA CTC CTC ATT TAT CGT GCA TCC AAC CTA GAA TCT   240Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser65                  70                  75                  80GGG ATC CCT GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT AGG ACA GAA TTC ACC   288Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Glu Phe Thr
            85                  90                  95CTC ACC ATT AAT CCT GTG GAG GCT GAT GAT GTT GCA ACC TAT CAC TGT   336Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr His Cys
        100                 105                 110CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAG TTG   384Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
    115                 120                 125GAA ATA AAA                                                       393Glu Ile Lys
130序列编号：2序列长度：131序列类型：氨基酸拓扑学：直链状序列的种类：蛋白质起源
细胞系：1.4序列Met  Glu  Thr  Asp  Thr  Leu  Leu  Leu  Trp  Val  Leu  Leu  Leu  Trp  Val  Pro1                   5                        10                       15Gly  Ser  Thr  Gly  Asp  Ile  Val  Leu  Thr  Gln  Ser  Pro  Ala  Ser  Leu  Ala
           20                       25                       30Val  Ser  Leu  Gly  Gln  Arg  Ala  Thr  Ile  Ser  Cys  Arg  Ala  Ser  Glu  Ser
      35                       40                       45Val  Asp  Ser  Tyr  Gly  Ile  Ser  Phe  Met  His  Trp  Tyr  Gln  Gln  Lys  Pro
 50                       55                       60Gly  Gln  Pro  Pro  Lys  Leu  Leu  Ile  Tyr  Arg  Ala  Ser  Asn  Leu  Glu  Ser65                       70                       75                       80Gly  Ile  Pro  Ala  Arg  Phe  Ser  Gly  Ser  Gly  Ser  Arg  Thr  Glu  Phe  Thr
                85                       90                       95Leu  Thr  Ile  Asn  Pro  Val  Glu  Ala  Asp  Asp  Val  Ala  Thr  Tyr  His  Cys
           100                      105                      110Gln  Gln  Ser  Asn  Glu  Asp  Pro  Phe  Thr  Phe  Gly  Ser  Gly  Thr  Lys  Leu
      115                      120                      125Glu  Ile  Lys
 130序列编号：3序列长度：408序列类型：核酸链的数目：双链拓扑学：直链状序列的种类：mRNA的cDNA起源
细胞系：1.4序列的特征
表示特征的代号：CDS
存在的位置：1..408
鉴定特征的方法：E序列ATG AGA GTG CTG ATT CTT TTG TGG CTG TTC ACA GCC TTT CCT GGT TTC    48Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Phe1               5                   10                  15CTG TCT GAT GTG CAG CTT CAG GAA TCG GGA CCT GGC CTG GTG AAA CCT    96Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
        20                  25                  30TCT CAA TCT CTG TCC CTC ACC TGC ATG GTC ACT GGC TAC TCA ATC ACC   144Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
    35                  40                  45AGT GAT TAT GCC TGG AAC TGG ATC CGG CAG TTT CCG GGA AAC AAA CTG   192Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu
50                  55                  60GAG CGG ATG GGA TAC ATA AGG TAC AGT GGT TAC ACT AGC TAC AAC CCA  240Glu Arg Met Gly Tyr Ile Arg Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro65                  70                  75                  80TCT CTC AAA AGT CGA ATC TTT ATC ACG CGA GAC ACA TCC CAG AAC CAG  288Ser Leu Lys Ser Arg Ile Phe Ile Thr Arg Asp Thr Ser Gln Asn Gln
            85                  90                  95TTC TTC CTA CAT TTG ACT TCT GTG ACT ACT GAG GAC ACA GCC ACA TAT  336Phe Phe Leu His Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
        100                 105                 110TAC TGT ACA AGA GAC TTG GAC GCC TGG TAC TTC GAT GTT TGG GGC GCA  384Tyr Cys Thr Arg Asp Leu Asp Ala Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
    115                 120                 125GGG ACA ACG GTC ACC GTC TCC TCA                                  408Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130                 135序列编号：4序列长度：136序列类型：氨基酸拓扑学：直链状序列的种类：蛋白质起源
细胞系：1.4序列Met  Arg  Val  Leu  Ile  Leu  Leu  Trp  Leu  Phe  Thr  Ala  Phe  Pro  Gly  Phe1                   5                        10                       15Leu  Ser  Asp  Val  Gln  Leu  Gln  Glu  Ser  Gly  Pro  Gly  Leu  Val  Lys  Pro
           20                       25                       30Ser  Gln  Ser  Leu  Ser  Leu  Thr  Cys  Met  Val  Thr  Gly  Tyr  Ser  Ile  Thr
      35                       40                       45Ser  Asp  Tyr  Ala  Trp  Asn  Trp  Ile  Arg  Gln  Phe  Pro  Gly  Asn  Lys  Leu
 50                       55                       60Glu  Arg  Met  Gly  Tyr  Ile  Arg  Tyr  Ser  Gly  Tyr  Thr  Ser  Tyr  Asn  Pro65                       70                       75                       80Ser  Leu  Lys  Ser  Arg  Ile  Phe  Ile  Thr  Arg  Asp  Thr  Ser  Gln  Asn  Gln
                85                       90                       95Phe  Phe  Leu  His  Leu  Thr  Ser  Val  Thr  Thr  Glu  Asp  Thr  Ala  Thr  Tyr
           100                      105                      110Tyr  Cys  Thr  Arg  Asp  Leu  Asp  Ala  Trp  Tyr  Phe  Asp  Val  Trp  Gly  Ala
      115                      120                      125Gly  Thr  Thr  Val  Thr  Val  Ser  Ser
 130                      135序列编号：5序列长度：381序列类型：核酸链的数目：双链拓扑学：直链状序列的种类：mRNA的cDNA起源
细胞系：10.1序列的特征
表示特征的代号：CDS
存在的位置：1..381
鉴定特征的方法：E序列ATG GAA TCA CAG ACT CTG GTC TTC ATA TCC ATA CTG CTC TGG TTA TAT    48Met Glu Ser Gln Thr Leu Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr1               5                   10                  15GGA  GCT  GAT  GGG  AAC  ATT  GTA  ATG  ACC  CAA  TCT  CCC  AAA  TCC  ATG  TCC    96Gly  Ala  Asp  Gly  Asn  Ile  Val  Met  Thr  Gln  Ser  Pro  Lys  Ser  Met  Ser
           20                       25                       30ATG  TCA  GTA  GGA  GAG  AGG  GTC  ACC  TTG  ACC  TGC  AAG  GCC  AGT  GAG  AAT   144Met  Ser  Val  Gly  Glu  Arg  Val  Thr  Leu  Thr  Cys  Lys  Ala  Ser  Glu  Asn
      35                       40                       45GTG  GTT  ACT  TAT  GTT  TCC  TGG  TAT  CAA  CAG  AAA  CCA  GAG  CAG  TCT  CCT   192Val  Val  Thr  Tyr  Val  Ser  Trp  Tyr  Gln  Gln  Lys  Pro  Glu  Gln  Ser  Pro
 50                       55                       60AAA  CTG  CTG  ATA  TAC  GGG  GCA  TCC  AAC  CGG  TAC  ACT  GGG  GTC  CCC  GAT   240Lys  Leu  Leu  Ile  Tyr  Gly  Ala  Ser  Asn  Arg  Tyr  Thr  Gly  Val  Pro  Asp65                       70                       75                       80CGC  TTC  ACA  GGC  AGT  GGA  TCT  GCA  ACA  GAT  TTC  ACT  CTG  ACC  ATC  AGC   288Arg  Phe  Thr  Gly  Ser  Gly  Ser  Ala  Thr  Asp  Phe  Thr  Leu  Thr  Ile  Ser
                85                       90                       95AGT  GTG  CAG  GCT  GAA  GAC  CTT  GCA  GAT  TAT  CAC  TGT  GGA  CAG  GGT  TAC   336Ser  Val  Gln  Ala  Glu  Asp  Leu  Ala  Asp  Tyr  His  Cys  Gly  Gln  Gly  Tyr
           100                      105                      110AGC  TAT  CCG  TAC  ACG  TTC  GGA  GGG  GGG  ACC  AAG  CTG  GAA  ATA  AAA 381Ser  Tyr  Pro  Tyr  Thr  Phe  Gly  Gly  Gly  Thr  Lys  Leu  Glu  Ile  Lys
      115                      120                      125序列编号：6序列长度：127序列类型：氨基酸拓扑学：直链状序列的种类：蛋白质起源
细胞系：10.1序列Met  Glu  Ser  Gln  Thr  Leu  Val  Phe  Ile  Ser  Ile  Leu  Leu  Trp  Leu  Tyr1                   5                        10                       15Gly  Ala  Asp  Gly  Asn  Ile  Val  Met  Thr  Gln  Ser  Pro  Lys  Ser  Met  Ser
           20                       25                       30Met  Ser  Val  Gly  Glu  Arg  Val  Thr  Leu  Thr  Cys  Lys  Ala  Ser  Glu  Asn
      35                       40                       45Val  Val  Thr  Tyr  Val  Ser  Trp  Tyr  Gln  Gln  Lys  Pro  Glu  Gln  Ser  Pro
 50                       55                       60Lys  Leu  Leu  Ile  Tyr  Gly  Ala  Ser  Asn  Arg  Tyr  Thr  Gly  Val  Pro  Asp65                       70                       75                       80Arg  Phe  Thr  Gly  Ser  Gly  Ser  Ala  Thr  Asp  Phe  Thr  Leu  Thr  Ile  Ser
                85                       90                       95Ser  Val  Gln  Ala  Glu  Asp  Leu  Ala  Asp  Tyr  His  Cys  Gly  Gln  Gly  Tyr
           100                      105                      110Ser  Tyr  Pro  Tyr  Thr  Phe  Gly  Gly  Gly  Thr  Lys  Leu  Glu  Ile  Lys
      115                      120                      125序列编号：7序列长度：414序列类型：核酸链的数目：双链拓扑学：直链状序列的种类：mRNA的cDNA起源
细胞系：10.1序列的特征
表示特征的代号：CDS
存在的位置：1..414
鉴定特征的方法：E序列ATG  GCT  GTC  CTG  GCA  TTA  CTT  TTT  TGC  CTG  GTA  ACA  TTC  CCA  AGC  TGT    48Met  Ala  Val  Leu  Ala  Leu  Leu  Phe  Cys  Leu  Val  Thr  Phe  Pro  Ser  Cys1                   5                        10                       15ATC  CTT  TCC  CAG  GTG  CAG  CTG  AAG  GAG  TCA  GGA  CCT  GGC  CTG  GTG  GCG    96Ile  Leu  Ser  Gln  Val  Gln  Leu  Lys  Glu  Ser  Gly  Pro  Gly  Leu  Val  Ala
           20                       25                       30CCC  TCA  CAG  AGC  CTG  TCC  ATC  ACA  TGT  ACC  GTC  TCA  GGG  TTC  TCA  TTA   144Pro  Ser  Gln  Ser  Leu  Ser  Ile  Thr  Cys  Thr  Val  Ser  Gly  Phe  Ser  Leu
      35                       40                       45ACC  GAC  TTT  GGT  GTA  AAC  TGG  GTT  CGC  CAG  CCT  CCA  GGA  AAG  GGT  CTG   192Thr  Asp  Phe  Gly  Val  Asn  Trp  Val  Arg  Gln  Pro  Pro  Gly  Lys  Gly  Leu
 50                       55                       60GAG  TGG  CTG  GGA  ATG  ATA  TGG  ACT  GAT  GGA  ATC  ACA  GAC  TAT  AAT  TCA   240Glu  Trp  Leu  Gly  Met  Ile  Trp  Thr  Asp  Gly  Ile  Thr  Asp  Tyr  Asn  Ser65                       70                       75                       80GTT  CTC  AAA  TCC  AGA  CTG  AGC  ATC  AGC  AAG  GAC  ACC  TCC  AAG  AGC  CAA   288Val  Leu  Lys  Ser  Arg  Leu  Ser  Ile  Ser  Lys  Asp  Thr  Ser  Lys  Ser  Gln
                85                       90                       95GTT  TTC  TTG  AAA  ATG  AAC  AAT  CTG  CAA  ACT  GAT  GAC  ACA  GCC  AGG  TAC   336Val  Phe  Leu  Lys  Met  Asn  Asn  Leu  Gln  Thr  Asp  Asp  Thr  Ala  Arg  Tyr
           100                      105                      110TAC  TGT  GCC  AGA  GAT  GCA  TAC  TAC  GGC  TTC  TAT  GCT  ATG  GAC  TAC  TGG   384Tyr  Cys  Ala  Arg  Asp  Ala  Tyr  Tyr  Gly  Phe  Tyr  Ala  Met  Asp  Tyr  Trp
      115                      120                      125GGT  CAA  GGA  ACC  TCA  GTC  ACC  GTC  TCC  TCA  414Gly  Gln  Gly  Thr  Ser  Val  Thr  Val  Ser  Ser
 130                      135序列编号：8序列长度：138序列类型：氨基酸链的数目：双链拓扑学：直链状序列的种类：蛋白质起源
细胞系：10.1序列Met  Ala  Val  Leu  Ala  Leu  Leu  Phe  Cys  Leu  Val  Thr  Phe  Pro  Ser  Cys1                  5                        10                       15Ile  Leu  Ser  Gln  Val  Gln  Leu  Lys  Glu  Ser  Gly  Pro  Gly  Leu  Val  Ala
           20                       25                       30Pro  Ser  Gln  Ser  Leu  Ser  Ile  Thr  Cys  Thr  Val  Ser  Gly  Phe  Ser  Leu
      35                       40                       45Thr  Asp  Phe  Gly  Val  Asn  Trp  Val  Arg  Gln  Pro  Pro  Gly  Lys  Gly  Leu
 50                       55                       60Glu  Trp  Leu  Gly  Met  Ile  Trp  Thr  Asp  Gly  Ile  Thr  Asp  Tyr  Asn  Ser65                       70                       75                       80Val  Leu  Lys  Ser  Arg  Leu  Ser  Ile  Ser  Lys  Asp  Thr  Ser  Lys  Ser  Gln
                85                       90                       95Val  Phe  Leu  Lys  Met  Asn  Asn  Leu  Gln  Thr  Asp  Asp  Thr  Ala  Arg  Tyr
           100                      105                      110Tyr  Cys  Ala  Arg  Asp  Ala  Tyr  Tyr  Gly  Phe  Tyr  Ala  Met  Asp  Tyr  Trp
      115                      120                      125Gly  Gln  Gly  Thr  Ser  Val  Thr  Val  Ser  Ser
 130                      135序列编号：9序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：直链状序列的种类：蛋白质起源
细胞系：1.4
序列Arg  Ala  Ser  Glu  Ser  Val  Asp  Ser  Tyr  Gly  Ile  Ser  Phe  Met  His1                   5                        10                       15
序列编号：10
序列长度：7
序列类型：氨基酸
拓扑学：直链状
序列的种类：蛋白质
起源
细胞系：1.4
序列Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser1              5
序列编号：11
序列长度：9
序列类型：氨基酸
拓扑学：直链状
序列的种类：蛋白质
起源
细胞系：1.4
序列Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr1               5
序列编号：12
序列长度：6
序列类型：氨基酸
拓扑学：直链状
序列的种类：蛋白质
起源
细胞系：1.4
序列Ser Asp Tyr Ala Trp Asn1               5
序列编号：13
序列长度：16
序列类型：氨基酸
拓扑学：直链状
序列的种类：蛋白质
起源
细胞系：1.4
序列Tyr Ile Arg Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser1               5                   10                  15
序列编号：14
序列长度：9
序列类型：氨基酸
拓扑学：直链状
序列的种类：蛋白质
起源
细胞系：1.4
序列
Asp Leu Asp Ala Trp Tyr Phe Asp Val
1               5
序列编号：15
序列长度：11
序列类型：氨基酸
拓扑学：直链状
序列的种类：蛋白质
起源
细胞系：10.1
序列
Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser
1               5                   10
序列编号：16
序列长度：7
序列类型：氨基酸
拓扑学：直链状
序列的种类：蛋白质
起源
细胞系：10.1
序列
Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr1                5
序列编号：17
序列长度：9
序列类型：氨基酸
拓扑学：直链状
序列的种类：蛋白质
起源
细胞系：10.1
序列Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr1                5
序列编号：18
序列长度：5
序列类型：氨基酸
拓扑学：直链状
序列的种类：蛋白质
起源
细胞系：10.1
序列Asp Phe Gly Val Asn1                 5
序列编号：19
序列长度：16
序列类型：氨基酸
拓扑学：直链状
序列的种类：蛋白质
起源
细胞系：10.1
序列Met Ile Trp Thr Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Val Leu Lys Ser1               5                   10                  15
序列编号：20
序列长度：11
序列类型：氨基酸
拓扑学：直链状
序列的种类：蛋白质
起源
细胞系：10.1
序列Asp Ala Tyr Tyr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr1                5                  10
序列编号：21
序列长度：2
序列类型：核酸
拓扑学：直链状
序列的种类：其它核酸合成DNA
序列GGCACCTCCA  GATGTTAACT  GC    22
序列编号：22
序列长度：20
序列类型：核酸
拓扑学：直链状
序列的种类：其它核酸合成DNA
序列GAARTAVCCC  TTGACCAG  GC  20
序列编号：23
序列长度：48
序列类型：核酸
拓扑学：直链状
序列的种类：其它核酸合成DNA
序列的特征：
存在的位置：36，37，41，42，46，47
其它特征：N表示肌苷(I)。
序列CUACUACUAC  UAGGCCACGC  GTCGACTAGT  ACGGGNNGGG  NNGGGNNG  48
序列编号：24
序列长度：46
序列类型：核酸
拓扑学：直链状
序列的种类：其它核酸  合成DNA
序列TATAGAGCTC  AAGCTTGGAT  GGTGGGAAGA  TGGATACAGT  TGGTGC    46
序列编号：25
序列长度：50
序列类型：核酸
拓扑学：直链状
序列的种类：其它核酸合成DNA
序列TATAGAGCTC AAGCTTCCAG TGGATAGACH GATGGGGSTG TYGTTTTGGC    50
序列编号：26
序列长度：20
序列类型：核酸
拓扑学：直链状
序列的种类：其它核酸合成DNA
序列ACCGAGCTCG  GATCCACTAG    20
序列编号：27
序列长度：21
序列类型：核酸
拓扑学：直链状
序列的种类：其它核酸  合成DNA
序列ATGCATGCTC  GAGCGGCCGCC    21

Claims (16)

1.抑制人II型磷脂酶A2活性，同时也可抑制猴II型磷脂酶A2和/或小鼠II型磷脂酶A2活性的单克隆抗体，或含其一部分、具有该抑制活性的蛋白质。
2.具有释放结合于细胞膜的II型磷脂酶A2的作用的单克隆抗体，或含其一部分、具有该作用的蛋白质。
3.如权利要求2所述的单克隆抗体或蛋白质，其中磷脂酶A2来自人。
4.抑制人II型磷脂酶A2活性，同时也可抑制猴II型磷脂酶A2和/或小鼠II型磷脂酶A2的活性，并具有释放结合于细胞膜的II型磷脂酶A2的作用的单克隆抗体，或含其一部分、具有该作用的蛋白质。
5.从杂交瘤12H5(FERM BP-5300)、杂交瘤1.4(FERM BP-5297)或杂交瘤10.1(FERM BP-5298)之一产生的单克隆抗体或含其一部分的蛋白质，或有与它们同等的对II型磷脂酶A2的作用的单克隆抗体或含其一部分的蛋白质。
6.如权利要求1或2所述的单克隆抗体或含其一部分的蛋白质，其特征在于包含具有序列2、4、6或8之一所述的氨基酸序列或对于该氨基酸序列中所含的1个或几个氨基酸进行了氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列的蛋白质。
7.如权利要求1或2所述的单克隆抗体或含其一部分的蛋白质，其特征在于包含具有序列9-20之一所述的氨基酸序列或对于该氨基酸序列中所含的1个或几个氨基酸进行了氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列的蛋白质。
8.产生如权利要求1-7之一所述的单克隆抗体或蛋白质的细胞。
9.如权利要求8所述的细胞，其中所述细胞为杂交瘤。
10.如权利要求8所述的细胞，其中所述细胞为用重组DNA转化的细胞。
11.制备如权利要求1-7之一所述的单克隆抗体或蛋白质的方法，其特征在于包括培养权利要求8所述的细胞，从培养上清液中回收单克隆抗体或蛋白质的工序。
12.编码权利要求1-7之一所述的单克隆抗体或蛋白质的DNA。
13.如权利要求12所述的DNA，其中包含序列1、3、5或7之一所示的碱基序列或该碱基序列中所含的1个或几个碱基进行了碱基取代、缺失或插入的碱基序列。
14.包含权利要求12或13的DNA的重组载体。
15.权利要求1-7之一所述的单克隆抗体或蛋白质与药剂学上允许的载体组成的医药组合物。
16.包含权利要求1-7之一所述的单克隆抗体或蛋白质的II型磷脂酶A2抑制剂。
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