WO1996020959A1 - Nouvel anticorps monoclonal ayant un effet inhibiteur sur la phospholipase a2 de type ii, et proteine contenant une partie de cet anticorps - Google Patents

Nouvel anticorps monoclonal ayant un effet inhibiteur sur la phospholipase a2 de type ii, et proteine contenant une partie de cet anticorps Download PDF

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WO1996020959A1
WO1996020959A1 PCT/JP1995/002714 JP9502714W WO9620959A1 WO 1996020959 A1 WO1996020959 A1 WO 1996020959A1 JP 9502714 W JP9502714 W JP 9502714W WO 9620959 A1 WO9620959 A1 WO 9620959A1
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phospholipase
type
monoclonal antibody
protein
antibody
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PCT/JP1995/002714
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Yasushi Kawauchi
Jun Takasaki
Tomoe Yasunaga
Yasuhiko Masuho
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Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel monoclonal antibody having an activity of strongly inhibiting type II phospholipase A2, and a protein containing a part thereof.
  • the present invention provides a novel monoclonal antibody which has excellent specificity and affinity for type II phospholipase A2, strongly inhibits type II phospholipase A2, and can be used as a therapeutic agent for diseases associated with type II phospholipase A2 Antibodies, and proteins, including portions thereof.
  • the present invention also relates to a cell producing the monoclonal antibody or protein, DNA encoding the monoclonal antibody or protein, and a recombinant vector containing the DNA.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition or a type II phospholipase A2 inhibitor comprising the monoclonal antibody or protein.
  • Phospholipase A2 is known as an enzyme that hydrolyzes the ester bond at the C2 position of 1,2-diasylphosphoglyceride, a constituent of the biological membrane. This enzyme is found in various organs and cells of mammals, and is not only responsible for the formation and metabolism of biological membrane phospholipids, but also has a role as a rate-limiting enzyme for arachidonic acid cascade, and its metabolite prostaglandin It is known that leukotriene, thromboxanthin, PAF and the like have various physiological activities.
  • Phospholipase A2 is known to be of type I, type II, intracellular, etc. Ichi, Japanese clinical practice, 1994 special issue, 202-206). Among them, type II phospholipase A2 is induced into the exudate at the local inflammation and releases a large amount of the enzyme into the blood in response to the inflammatory reaction. Furthermore, there are various reports suggesting that this enzyme is exacerbated or a part of the cause of various inflammatory diseases. For example, Kikuchi-Yanoshita et al.
  • Minami et al. Reported that the enzyme was present in the blood in patients with Crohn's disease and ulcerative colitis in higher amounts than in normal individuals, and that L, the cause, may have been exacerbated. (Minami T. et al., Gut, 33: 914-921, 19992).
  • this enzyme is also involved in diseases such as acute inflammation of the anterior segment of the eye (uvea), neonatal respiratory distress syndrome (RDS), and broncho-pulmonary dysplasia (BPD).
  • RDS neonatal respiratory distress syndrome
  • BPD broncho-pulmonary dysplasia
  • anti-human type II phospholipase A2 antibodies I have.
  • the total amount of the immunized antigen is 13; ⁇ divided into three times and immunized for 36 days.
  • Splenocytes were fused with HAT medium using mouse myeloma cells PAI-0.
  • the supernatant of the medium was examined by an ELISA system using phospholipase A2 to obtain monoclonal antibodies (PLA184, PLA185, PLA186, and PLA187).
  • These antibodies have enzyme inhibitory activity against human phospholipase A2.
  • experiments to examine the inhibitory activity against other types of phospholipase A2 were limited to rat type II phospholipase A2, and these antibodies had little or no cross-reactivity to rat type II phospholipase A2.
  • Takayama et al. Have purified human type II phospholipase A2 enzyme from synovial fluid of rheumatoid patients and used it as an immunogen to obtain monoclonal antibodies using mice. (Takayama K. et al., BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH CO MUNI CATIONS 167: 1309 1315, 1990).
  • human type II phospholipase A2 enzyme lO jug was adsorbed to a nitrocellulose membrane, and then homogenized, and this was inoculated into the spleen of a BALB / c mouse. Two weeks later, they were immunized similarly.
  • the total amount of the immunized antigen was divided into two 20 g doses and immunized for 28 days.
  • mouse myeloma cells (X63-Ag 8.6.5.3) are fused with splenocytes. Phosphorino, supernatant of medium.
  • Monoclonal antibodies (HP-K HP-2, HP-3> HP-4) were obtained by reacting the enzyme A2 with the ELISA system.
  • HP-1 has the strongest enzyme inhibitory activity against human phospholipase A2.
  • the inhibitory activity of HP-1 It is weakly active and shows only about 80% inhibitory activity even with the addition of a 200-fold molar antibody.
  • McCord and colleagues purified recombinant human type I phospholipase A2 enzyme and used it as an immunogen to obtain monoclonal antibodies using mice.
  • McCord M. et al. THE JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY 102: 980-986, 1994.
  • 100, 50, and 25 g of the phospholipase A2 enzyme mixed with Freund's complete adjuvant was immunized to CAF1 mice every four weeks. The final immunization was performed 3 days before the spleen cell fusion. Therefore, the total amount of the immunized antigen was about 200 zg divided into four times and immunized for 56 days.
  • Splenocyte fusion was selected using MT myeloma cells SP2 / 0-AG14 in MT medium.
  • the supernatant of the medium was examined for its inhibitory activity using phospholipase A2, and a monoclonal antibody (3F10) was obtained.
  • a monoclonal antibody 3F10 was obtained.
  • this antibody lg
  • the activity of inhibiting human phospholipase A2 is examined.
  • this paper does not describe how much human phospholipase A2 was used, and it is not clear whether the inhibitory activity is strong.
  • Johnson (LK) purifies the recombinant human phospholipase A2 enzyme in a patent application publication (Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-506447), uses this as an immunogen, and obtains a polyclonal antibody using egrats. .
  • This is not a monoclonal antibody, and it has two peptides as immunogens (a segment of the human phospholipase A2 sequence “GTKFLSYKFSN'SGSRITC (positions 67-85 from the N-terminal)”) and “NKTTYNKKYQ YYSNKHSRGSTPRC (position 109 from the N-terminal). ⁇ 132)))) is used to immunize.
  • human phospholipase A2 inhibitory activity is being investigated. However, from the description in this specification, it is unclear how much antibody and human phospholipase A2 were used, and it is not clear whether the inhibitory activity is strong.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-109300 discloses an antibody that promotes the binding between human ⁇ -type phospholipase A2 and a sulfated polysaccharide, and the antibody is a human ⁇ -type phosphorino. It has not been confirmed that it inhibits the activity of monoaze A2.
  • the enzyme activity center of type II phospholipase A2 and its vicinity are generally conserved among animal species, and the homology between mice and humans is quite high.
  • mice are immunized with human type II phospholipase A2
  • phospholipase A2 enzyme is required to bind to cells when hydrolyzing membrane phospholipids (Suga H. et al., Eur. J. Biochem., 218: 807). -813, 1993 / Murakami M. et al., J. Biol. Chem., 268: 839-844, 1993).
  • antibodies could not only inhibit enzymes in free form in blood or exudate, but also remove phospholipase A2 enzyme bound to cells whose membrane phospholipids were hydrolyzed, these antibodies would be novel It is expected to have a more potent phospholipase A2 inhibitory effect based on the mechanism of action.
  • the cells are complemented and complemented with Z or effector. It is expected that the target cells will attack and cause side effects. However, an antibody capable of releasing phospholipase A2 bound to cells has not yet been obtained.
  • antibodies to type II phospholipase A2 which are considered for pharmaceutical application, were able to strongly inhibit human type II phospholipase A2 and also inhibit type II phospholipase A2 derived from other animal species, or bound to cells. It has been desired to obtain an antibody having a property capable of removing type II phospholipase A2. Disclosure of the invention
  • E. coli phospholipid is used as a substrate for the phospholipase A2 enzyme activity (Jacobson PB et al., Biochem. Pharm., 39: 1557, 1990), and the preparation of E. coli phospholipid as a substrate is also performed. Devised. Thus, phospholipase A2 deficient E. coli SN17 (pldA, pla-2, thr-1, leuB6, thi) (Doi, 0. et al., J. Biochem., 80: 1247-1258) , 1976), and incorporated trioleic-labeled oleic acid.
  • Escherichia coli phospholipase A2 was not degraded by phospholipase A2, and Escherichia coli phospholipids with high specific activity and efficient tritium labeling could be prepared. Furthermore, by using an Atsey system that can increase the sensitivity as compared with the conventional method (J. Biol. Chem., 261: 4239-4246, 1986), such as by increasing the reaction time of the enzymatic reaction, it is efficient and accurate. The desired antibody-producing hybridoma was screened. And type II e derived from various animals. The inhibitory effect of spholipase A2 activity was examined.
  • the monoclonal antibody obtained by the present inventors is reactive with human type II phospholipase A2 and has a strong inhibitory activity. In addition, it has cross-reactivity with type I phospholipase A2 derived from monkey and mouse platelets and has strong inhibitory activity. Therefore, when the antibody of the present invention is used for testing a new drug in a human, an animal experiment can be performed in a monkey or a mouse in advance. Furthermore, the monoclonal antibody of the present invention can be used in the blood or in the exudate to further inhibit not only L in the blood but also the enzyme in the free state in the exudate, and the type II phospholipase A2 enzyme bound to cells by the antibody. Can be removed.
  • Type II phospholipase A2 binds to cells via heparin sulfate etc. on the cell surface, and is known to bind to hepatocytes, vascular endothelial cells, etc. that have heparin sulfate etc. on the cell surface. ing.
  • the monoclonal antibody of the present invention not only inhibits the enzyme in the free state in blood or exudate, but also has the property of removing the type II phospholipase A2 enzyme bound to cells as described above from the cell membrane. I have.
  • the present invention also includes a protein that includes a part of a monoclonal antibody having the above-mentioned properties and has the same antigen-binding ability as that of the monoclonal antibody.
  • one or more amino acids may be added, deleted, or substituted to the reduced alkyl form or the amino acid sequence of the monoclonal antibody obtained by immunizing an animal as long as it has the same antigen-binding ability as the monoclonal antibody.
  • the mutated protein is also included in the present invention.
  • the present inventors encode the variable regions of the H chain and L chain of the antibody from “Hypridoma 1.4” and “Hypridoma 10.1” that produce the antibody included in the present invention. DNA was isolated and its entire nucleotide sequence was determined. This will allow us to not only mass produce antibodies using gene engineering technology, but also use antibody engineering technology to The antibodies included in the present invention can be easily modified freely.
  • the nucleotide sequences determined for "Hyperidoma 1.4" are shown in SEQ ID NO: 1 (L chain) and SEQ ID NO: 3 (H chain).
  • the amino acid sequence predicted from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2 (L SEQ ID NO: 4 (H chain), and the base sequences determined for "Hyperidoma 10.1" are shown in SEQ ID NO: 5 (L chain) and SEQ ID NO: 7 (H chain).
  • the amino acid sequence predicted from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 6 (L chain) and SEQ ID NO: 8 (H chain).
  • the present invention includes the following.
  • Hypri-Doma 12H5 (FERM BP-5300), Hypri-Doma 1.4 (FERM BP-5297) or Hypri-Doma 10.1 (FERM BP-5298) or a protein containing a part thereof Or a protein comprising a monoclonal mononal antibody or a part thereof having an action on type II phospholipase A2 equivalent thereto.
  • ⁇ including a protein having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 9 to 20 or an amino acid sequence in which one or more amino acids contained in the amino acid sequence have been subjected to amino acid substitution, deletion or insertion.
  • a protein comprising the monoclonal antibody described in (1) or (2) or a part thereof.
  • the cell according to 8 which is a cell transformed with the recombinant DNA.
  • a pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody or protein according to any of (1) to (4) and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a type I phospholipase A2 inhibitor comprising the monoclonal antibody or protein according to any of 1) to 2).
  • the “protein” referred to in the present invention is not particularly limited in the number of amino acids, but also includes a so-called “peptide” having a small number of amino acids.
  • the “monochrome” includes all cells such as bacteria, yeast, and mammalian cells as long as they produce the monoclonal antibody or protein of the present invention.
  • the monoclonal antibody of the present invention is produced, for example, by culturing a mouse hybridoma in a medium or mouse ascites.
  • the fragments F (ab ') 2, Fab, Fab *, etc. can be obtained by digesting the produced antibody with a proteolytic enzyme selected from the group consisting of trypsin, papain, and pepsin. It can be obtained by performing purification.
  • hybridoma of the present invention for example, hybridoma 12H5, 1.4, 10.1 is a spleen cell of a BALB mouse sensitized with healthy human type II phospholipase A2 by increasing the frequency of immunization and prolonging the immunization period. It can be obtained by fusing mouse myeloma cells P3 63Ag8 / Ul (P3Ul) with a conventional method, for example, a cell fusion method between Koehler and Milstein (see Examples below).
  • mice hybridomas 12H5, 1.4, 10.1 obtained by the present inventors and included in the present invention have been deposited as follows.
  • Examples of the culture medium for culturing the above-mentioned hybridoma include, for example, Dulbecco's modified minimum "Normal” minimum medium (Dalbecco's modified minimum essential medium; hereinafter referred to as "DMEM").
  • Dulbecco's modified minimum essential medium hereinafter referred to as "DMEM”
  • a medium containing L-glutamine, glucose, sodium pyruvate, 2-mercaptoethanol and antibiotics eg, penicillin G, streptomycin, gentamicin, etc.
  • Culture of hybridomas is usually performed in the medium at 37% for 5 days in 5% carbon dioxide, 95% air for 2-4 days, or 2,6,10. It is performed in the abdominal cavity of BALB / c mouse pretreated with Aldrich (Pristane) for about 10 to 20 days to produce a purifiable amount of antibody.
  • the protein containing the monoclonal antibody of the present invention or a part thereof can be produced by incorporating all or a part of the gene encoding the antibody of the present invention into an expression vector, introducing the gene into Escherichia coli, yeast, or animal cells. Can also be obtained.
  • the monoclonal antibody thus produced can be separated and purified from the culture supernatant or ascites by a conventional method for protein isolation and purification.
  • a conventional method for protein isolation and purification examples include centrifugation, dialysis, salting out with ammonium sulfate, column chromatography with DAE-cellulose, hydroxylapatite, protein-A agarose, and the like.
  • the antibody separated and purified in this manner can be used to treat pepsin, papain, etc.
  • Digestion with a proteolytic enzyme and subsequent isolation and purification according to a conventional method for protein isolation and purification can yield active parts, for example, F (ab ') 2, Fab. Fab' and Fv.
  • dithiothreitol and odoacetamide, etc. are used to form an H chain with only a non-covalent bond by reductive alkylation of the disulfide bond connecting the H chain and H chain and the Z or H chain to the L chain of the antibody by a conventional method.
  • the reduced alkyl form of the antibody can be obtained by linking the L chains (useful immunity experiment method p.39 Kodansha Scientific).
  • the monoclonal antibody of the present invention or a protein containing a part of the antibody is used for treating a human
  • the monoclonal antibody having a high ratio of the part derived from a human or a protein containing a part of the antibody is used. It is desirable to use quality.
  • monoclonal antibodies include: (1) an antibody in which only the variable region is composed of an amino acid sequence derived from an animal such as a mouse, and the constant region is composed of an amino acid sequence derived from human, ie, a so-called “chimeric antibody”.
  • complementarity determining region (or hypervariable region Z or less, abbreviated as “CDR” (complementarity-determing region)) consists of an amino acid sequence derived from an animal such as a mouse, and the other region consists of an amino acid sequence derived from a human. That is, so-called “humanized antibodies” are mentioned, and these types of antibodies are also included in the present invention.
  • These “chimeric antibodies” or “humanized antibodies” can be obtained, for example, by isolating the gene corresponding to the variable region or CDR from the hybridoma of the present invention, recombining with a human antibody gene, and introducing the gene into a host cell.
  • Express Can be easily manufactured by those skilled in the art (Int. J.
  • the DNA comprises the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 L or the CDR portion thereof, or one or more nucleotides in the nucleotide sequence of the DNA.
  • a DNA gene having a base sequence obtained by substitution, deletion or insertion of a base or a DNA having a part thereof can be suitably used.
  • the introduction of mutation such as substitution, deletion or insertion of a base can be performed by a known method (Gillanm et al., Gene. 8, 81-97 (1979), Roberts et al., Nature, 328, 731-734 (1987)).
  • a method using a phage display method (Annu. Rev.
  • human antibodies in which only the CDR site is replaced with CDRs from organisms other than humans ie, the basic skeleton of humanized antibodies
  • the high-human antibodies homologous to the mouse antibodies included in the present invention obtained by the present inventors are, for example,? 3 £ —1 antibody (Hughes-Jones, NC et. Al. Biochem. J., 268, 135-140 (1990)), WEA antibody (Goni, F. et. Al. Proc. Natl. Acad.
  • a “chimeric antibody” can also be easily produced by those skilled in the art according to known methods (Nature, 314, 268-270 (1985): Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 8). 4, 3439-3443 (1987): Pro Natl. Acad. Sci. USA., 84, 214-218 (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, 6851-6855 (1984)).
  • Suitable monoclonal antibodies or proteins included in the present invention include the monoclonal antibody 12H5 or 1.4 sensitized with human type 11 phospholipase A2 as described above and its fragment F (ab ') 2, Fab, Fab ", etc. Further, these monoclonal antibodies or those having a variable region or hypervariable region of a part thereof, and the other part thereof include human-derived monoclonal antibodies.
  • compositions for parenteral administration usually comprise a solution of the protein containing the monoclonal antibody or a portion thereof, dissolved in an administrable carrier, preferably an aqueous carrier.
  • aqueous carriers can be used, eg, water, buffered water, 0.4% saline, 0.3% glycine, 5% glucose, human albumin solutions, and the like. These solutions are sterile and generally free of particle-forming substances.
  • These compositions can be sterilized by conventional, well-known sterilization techniques.
  • compositions may contain pharmaceutically acceptable auxiliaries necessary to approximate physiological conditions, such as buffering agents, tonicity agents, etc., for example, sodium acetate, sodium chloride, chloride. It can contain potassium lime, calcium chloride, sodium lactate, sodium citrate, etc.
  • buffering agents for example, sodium acetate, sodium chloride, chloride.
  • It can contain potassium lime, calcium chloride, sodium lactate, sodium citrate, etc.
  • the actual manufacture of parenterally administrable compositions can be performed using techniques known or known to those skilled in the art, for example, as described in “Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, Mack. Publishing Company, Ys, Pennsylvania Tons (1980) ".
  • the monoclonal antibody or protein or the pharmaceutical composition of the present invention can be stored after being frozen or stored by lyophilization and dissolved in an appropriate solvent before use for regeneration. Lyophilization and regeneration can use techniques known to those skilled in the art. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 shows the results of the ELISA for 12H5, 10.1 and 1.4 recombinant human type I phospholipase A2.
  • FIG. 2 shows the results of ELISA for 12H5, 10.1 and 1.4 on rat platelet-derived phospholipase A2 activity.
  • FIG. 3 shows the inhibitory effect of 12H5, 10.1 and 1.4 on recombinant human type I phospholipase A2 activity.
  • FIG. 4 shows the inhibitory effect of 12H5, 10.1 and 1.4 on rat II type I phospholipase A2 activity.
  • Figure 5 shows 12H5 phosphorylation from various animal platelets. It shows an inhibitory effect on the activity of Azeze.
  • FIG. 6 shows the inhibitory effect of 10.1 on the activity of platelet-derived phospholipase A2 from various animals.
  • FIG. 7 shows the inhibitory effect of 1.4 on the activity of platelet-derived phospholipase A2 in various animals.
  • FIG. 8 shows the action of 12H5, 10.1 and 1.4 to release phospholipase A2 bound to BR3A cells.
  • FIG. 9 shows the method of uncarded PCR cloning of the H chain and L chain variable region cDNA in 1.4.
  • Figure 10 shows the cDNA sequence of the variable region of the L chain of antibody 1.4 and the translated amino acid sequence. Indicates a column. Note that the sequence expected to correspond to the CDR sequence is underlined.
  • FIG. 11 shows the cDNA sequence of the variable region of the heavy chain of antibody 1.4 and the translated amino acid sequence. Note that the sequence expected to correspond to the CDR sequence is underlined.
  • FIG. 12 shows the method of PCR cloning of the H chain and L chain variable region cDNA in 10.1.
  • FIG. 13 shows the cDNA sequence of the variable region of the light chain of antibody 10.1 and the translated amino acid sequence. The sequence expected to correspond to the CDR sequence is underlined.
  • FIG. 14 shows the cDNA sequence and translated amino acid sequence of the variable region of the heavy chain of antibody 10.1. The sequence expected to correspond to the CDR sequence is underlined. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by immunizing recombinant human type II phospholipase A2, but the preparation of recombinant human type II phospholipase A2 is entirely carried out according to the method described in JP-A-5-192167. went.
  • BALB / c male mouse (6 weeks old at the start of immunization), which was prepared by dissolving recombinant human type II phospholipase A2 purified in Example 1 a) in 20 tg / 0 ml of physiological saline About the same volume with Freund's complete adjuvant to emulsify, Intraperitoneal administration (primary immunization). Thereafter, booster administration was carried out seven times at intervals of 2 to 3 weeks with the same amount of phospholipase A2 mixed with the same volume of Freund's complete adjuvant to emulsify the mixture.
  • phospholipase A2 / animal Twenty-four days after the seventh immunization, 20 phospholipase A2 / animal were dissolved in 0.2 ml of physiological saline and administered intraperitoneally (final immunization). Three days after the final immunization, spleen cells were collected from one mouse and suspended in DMEM medium.
  • Splenocytes (8 LxlO) with mouse myeloma cells P3x63Ag8'Ul (P3Ul) (2xl0 7 cells) prepared above, Ke one color and Milstein method [Nature, 256 Vol 495 (197 5 years ) See]. That is, after spleen cells and P3U1 cells were washed several times with DMEM, both were put into a 50-nil plastic centrifuge tube and mixed well. Then, the medium was removed by centrifugation, and DMEMlml containing 50% (w / v) polyethylene glycol (Sigma, average molecular weight 3350) kept at 37 was gradually added with stirring for 1 minute. .
  • DMEMlOml kept at 37 ° C was added dropwise to terminate the cell fusion reaction.
  • the reaction mixture was centrifuged, after removing the supernatant, HAT culture medium [hypoxanthine (1 X 10- 4 M), amino Noputerin (4x10- 7 M), was added thymidine (1.6xlO- 5 M) 10 DMEM medium containing% ⁇ fetal serum] was added to the residue so that the spleen cell concentration was 6 xlO 5 cells, Iml.
  • the antibody activity in the culture supernatant was measured by the following method d). Positive clones were transferred to 48-well plastic plates, and further transferred to 24-well plastic plates, and cultured in the same medium as described above except that aminobuterin was eliminated. Using a 24-well plastic plate culture supernatant, the reproducibility of the antibody activity was confirmed by the method of d), and the enzyme inhibitory activity was measured by the method of e).
  • the three clones showing enzyme inhibitory activity were sequentially cloned by the limiting dilution method to ensure monoclonality.
  • the resulting clone The monoclonal antibodies thus produced were named 12H5, 1.4 and 10.1, respectively.
  • the purified recombinant human type II phospholipase A2 was dissolved in each well (well) of a 96-well flat bottom microtiter plate at 0.05 g / ml with 20 mM Tris buffered saline (TBS, pH 7.4). And stored at 4 ° C overnight in a humid chamber. Thereafter, the solution was discarded, and TBS containing 1% BSA was added at 200/21 each, and allowed to stand at 37 ° C for 1 hour to block an unadsorbed portion of each well. Thereafter, the plate was washed several times with a solution of 0.05% Tween 20 (trade name of Tween 20 in TBS CTBS-Tween).
  • Recombinant human type II phospholipase ⁇ 2 Purified sample 0.5 ⁇ g and culture supernatant or purified antibody sample were treated with 150 mM sodium chloride, 12.5 mM calcium chloride, and 125 mM Tris containing 250 g / ml bovine serum albumin. Pre-incubation was performed for 2 hours at room temperature in hydrochloric acid buffer (pH 8.0). Next, an autoclaved sample of Escherichia coli SN17 251 (50,000 to 100,000 cpm) incorporating tritium-labeled oleic acid was added to the reaction solution. Reaction was carried out at 37 for 30 minutes. The reaction was transferred to ice and stopped by adding 25 1 of 4N hydrochloric acid. After terminating the reaction, 25 mg of 40 mg / ral bovine serum albumin was added, mixed, and then left on ice for 30 minutes.
  • the radioactivity of the supernatant centrifuged at 15000 rpm for 2 minutes was measured.
  • the value obtained by subtracting the negative control (radioactivity of the sample containing no phospholipase A2 and the antibody) from the obtained radioactivity was defined as phospho-ze A2 activity.
  • the percentage inhibition of the antibody against phospholipase A2 activity was expressed as a percentage based on the following calculation based on the phospholipase A2 activity of the positive control (L containing phosphonase A2 without the antibody, and the phospholipase A2 activity of the sample). .
  • Phospholipase A2 activity inhibition rate U-(phospholipase A2 activity when phospholipase A2 is incubated with culture supernatant or purified antibody preparation) no (positive control phospholipase A2 activity) ⁇ X 100
  • the autoclave standard of Escherichia coli incorporating tritium-labeled oleic acid used as a substrate in the measurement of phospholipase A2 activity was prepared according to the method described on page 8 of JP-A-5-192167. .
  • mice BALB / c male mice, 5-6 weeks of age, 2,6,10,14-tetramethylpentyldecane (Sigma, Pristan) 0.5 ml after intraperitoneal injection, 14-21 5 ⁇ 10 6 hybridomas were suspended in 0.5 ml of physiological saline and inoculated intraperitoneally. The ascites produced 10 to 20 days later was collected from mice that had been sacrificed and opened. 5 to 10 ml of ascitic fluid containing the monoclonal antibody was obtained from one mouse.
  • 2,6,10,14-tetramethylpentyldecane Sigma, Pristan
  • the ascites was centrifuged to remove insolubles, an equal volume of a saturated ammonium sulfate solution was added, and the mixture was stirred on ice for 1 hour.
  • the resulting precipitate was centrifuged and dissolved in a small amount of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.9% sodium chloride.
  • the buffer was dialyzed to obtain a crude purified gamma globulin fraction. From this fraction, IgG was purified using a MAPS-II mouse monoclonal antibody purification kit (trademark, manufactured by Biorad Laboratories).
  • a binding buffer of the same volume is added to the gamma globulin fraction, mixed, and then mixed with the same binding buffer.
  • the column (gel beb) packed with “Protein A-Sepha rose CL4B” (Pharmacia) is fully equilibrated. And washed with 3 column volumes of binding buffer.
  • IgG was eluted with about 3 column volumes of the elution buffer contained in the kit. The eluted IgG was dialyzed against 20 mM Tris-buffered saline (pH 7, 4) or the like, and used as an antibody standard. Normally, 5 to 10 mg of IgG was obtained per 1 ml of ascites fluid.
  • the IgG subclass was determined using a mouse monoclonal antibody evening kit manufactured by Amersham. This method was based on the ELISA method and determined to be 12H5 (IgG2a), 1.4 (IgG2a), and 10.1 (IgGl), respectively.
  • ACD solution (2! 3 ⁇ 4 (w IV) glucose solution containing 65 mM citric acid and 85 mM sodium citrate) to rat PRP (platelet-rich plasma), and 2500 X g for 10 minutes Centrifuged.
  • ACD / F10 medium (1: 5) to reduce precipitated platelets to 2 x 10 9 cells / ml
  • a washing solution (0.1 M acetate buffer (pH 6.0) containing 0.5 M sodium chloride) was passed through the column and washed thoroughly, and the eluate (0.1 M acetate buffer containing 1.5 M sodium chloride) was passed through the column.
  • the solution (pH 6.0) was passed through 30 ml, and the obtained fraction was used as a sulfated cell port fine binding fraction.
  • the sulfated cell port fine binding fraction was fractionated by HPLC.
  • the column was CAPCELL PAK C18 (4.6 mm ID x 25 cm; manufactured by Shiseido), and the HPLC system was LC-4A (manufactured by Shimadzu Corporation), and all were performed at a flow rate of lml / min. After passing the sulfated cellulofine-bound fraction, 0.1% trifluoroacetic acid was passed for 60 minutes. Thereafter, phospholipase A2 was eluted by applying a linear gradient of 0 to 50% acetonitrile in the presence of 0.1% trifluoroacetic acid. The peak of phospholipase A2 appeared at about 30% acetonitrile, which was recovered.
  • phospholipase A2 was detected as a single band. This was designated as rat type I phospholipase A2.
  • PRP thin platelet-rich plasma
  • EDTA is added to a final concentration of 2 mM
  • the cells are centrifuged at 2500 xg for 10 minutes.
  • the cells were suspended in 30 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 120 mM sodium chloride and 2 mM EDTA, and centrifuged again at 2500 xg for 10 minutes. After performing this operation twice, reduce the resulting cells to 2 x 10 9 cells per ml.
  • the suspension was resuspended in 30 ⁇ Tris-HCl buffer ( ⁇ 47.4) containing 120 mM sodium chloride and 2 mM EDTA, and frozen under liquid nitrogen.
  • the IgG preparation was adjusted to 10 / g / ml with BSA-TBS-Tween to prepare a 3-fold dilution series.
  • An ELISA was performed according to Example 1 d), and cross-reactivity with recombinant human type I phospholipase A2 and rat type I phospholipase A2 was examined.
  • ELISA for rat type I phospholipase A2 was performed by replacing the recombinant human type I phospholipase A2 of Example Id) with rat type I phospholipase A2.
  • the inhibitory activity against phospholipase A2 was measured by replacing the recombinant human type I phospholipase A2 of Example le) with the purified rat type I phospholipase A2 sample (0.5 ng) of Example 4 a).
  • the abscissa represents the antibody concentration when phospholipase A2 and the antibody preparation were pre-incubated, and the inhibitory rate of each antibody to rat II type I phospholipase A2 activity is shown in FIG. 12H5 and 1.4 also inhibited the activity of rat type I phospholipase, and the antibody concentration required to inhibit 50% of the phospholipase A2 activity was 5 g / ml at 12H5.
  • the inhibitory activity against phospholipase ⁇ 2 was measured by replacing the recombinant human type II phospholipase A2 of Example le) with a fixed amount (20 to 40 ⁇ 1) of each platelet lysate.
  • the abscissa plots the antibody concentration when the platelet lysate was pre-incubated with the antibody preparation, and the inhibition rate of each antibody against the platelet-derived phosphorinoxase-2 activity is shown in FIGS. 5 to 7. 12 ⁇ 5, 1.4 and 10.1 inhibited phospholipase ⁇ 2 activity from human platelets in the same manner as recombinant human type II phospholipase ⁇ 2 activity.
  • the antibody against recombinant human type II phospholipase # 2 of the present invention had the ability to inhibit the activity of natural human type II phospholipase # 2.
  • the antibodies of the present invention inhibited phospholipase-2 activity derived from rhesus monkey and mouse platelets. In addition, it inhibited a part of the activity of phospholipase-2 derived from canine platelets.
  • egrets and cat blood small The plate-derived phospholipase A2 activity was not inhibited.
  • Example 5 Activity of releasing antibody type 11 phospholipase A2 bound to antibody cells Hepatocytes (BRL-3A : purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) were cultured on a 96-well plate culture plate (Falcon) using F12K / 103 ⁇ 4FCS (F12K: (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.). Except for culture of cells cultured until Konfuruento, and incubated with added 37 ° C the F12K / 10% FCS containing recombinant human Bok II type phosphorylase Horipaze A2 labeled with 1 2 5 1 4 ng, cells ho Suhoripaze A2 was bound.
  • the activity of the antibody to release phosphorinolase A2 from the cells is based on the radioactivity of the added phospholipase A2, based on the binding activity of the phospholipase A2 to the cells, adding F12K / 10% FCS, and incubating the culture medium. Assuming that the value obtained by subtracting the radioactivity was 100%, the radioactivity of the culture solution when the concentration of the added antibody was changed and the incubation was carried out is shown as a percentage.
  • Rikonbinan Bok human type II phospholipase A2 was performed by the following method. I0D0GEN (manufactured by Pierce) To a glass test tube coated with 10 g, add 100 g of lOOraM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 30 g of recombinant human type II phospholipase A2, and add lOOmCi / ml Na 1 2 5 I (ICN Inc.) after the 61 addition of and left for 20 minutes at room temperature. The reaction was stopped by removing the reaction solution from the glass test tube. Na 1 2 5 1 non reaction was removed by gel filtration.
  • Radioactivity of the culture solution was measured when various concentrations of purified antibody preparations were added to the cells to which phospholipase A2 was bound and incubation was performed.
  • the horizontal axis represents the antibody concentration in the culture solution after addition of the antibody, and the activity of each antibody to release phosphorylase A2 bound to the cells is shown in FIG.
  • the control mouse antibody does not release any phospholipase A2 from the cells, whereas 12H5, 10.1 and 1.4 Lipase A2 was released.
  • RNA was used in c DN A Cloning was created from the "QuickPrep Micro mR NA Purification Kit (Pharmacia Co., Ltd.)" about 10 7 High Priestess dough Ma cells using. That is, the cells were suspended and dissolved in an extraction buffer, and mRNA was isolated using oligo dT cellulose (Oligo (dT) -Cellulose).
  • the H-chain and L-chain variable region cDNAs of Antibody 4 were prepared according to the procedure shown in FIG. 9 using “5 ′ RACE System Kit (manufactured by Gibco)”. That is, using a primer that forms a hybrid with the constant region gene (C) and a reverse transcriptase (SUPER SCRIPT II Reverse Transcriptase), 1 g of the messenger RNA was type II, and single-stranded cDNA was synthesized.
  • C constant region gene
  • SUPER SCRIPT II Reverse Transcriptase reverse transcriptase
  • the primer used here is GSP 1 L (5'-G GCACCTCCAGATGTTAACTGC-3 ') NO sequence number 21 J for the L chain, and GSP 1 H (5 * -G GAA (AG) TA (AGC ) CCCTTGACCAGGC-3 ′) / SEQ ID NO: 22 ”.
  • the sequence in parentheses in the sequence of GSP1H indicates a base corresponding to degeneracy.
  • the ⁇ -type mRNA was digested with RNase H, and then “single-stranded cDNA was purified using GLASS MAX Spin Cartridge J. d CTP and terminal deoxynucleotide transferase were purified.
  • a poly (dC) tail was attached to the 3 'end of the single-stranded cDNA.
  • H- and L-chain variable region genes (V) are linked to the anchor primer (5 '-CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGG 11 GGG 11 GGG IIG-3' SEQ ID NO: 23) which forms a hybrid with the poly (dC) tail and the constant region gene (C).
  • GSP 2 L 5'-TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3 ') NO SEQ ID NO: 24 (for L chain) or GSP 2 H (5'-TATAGAGCTCAAGCT TCCAGTGGATAGAC (CAT) GATGGGG (GC) TGT TC) GTTTTGGC-3 ′) Z SEQ ID NO: 25 ”(in the case of H chain) using LAT aq (Takara Shuzo).
  • the sequence in parentheses in the GSP 2H sequence indicates a base corresponding to degeneracy.
  • This PCR reactant is When subjected to 2% agarose gel electrophoresis, both H and L chains were about 550-57
  • the H chain and L chain variable region cDNA of antibody 10.1 was prepared by the method shown in FIG. 12 using "Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech)". That is, single-stranded cDNA was synthesized using “Marathon cDNA synthesis primer” and reverse transcriptase to convert 1 g of messenger RNA into type II. The reaction solution was further reacted withase H, DNA polymerase I (DNA polymerase I) and DM ligase (D'Aligase) to synthesize double-stranded cDNA. Further, the reaction solution was reacted with T4 DM polymerase (T4 DNA polymerase) to blunt-end double-stranded cDNA.
  • T4 DM polymerase T4 DNA polymerase
  • H-chain and L-chain variable region genes are prepared using the adapter primer 1 and primer GSP 2 L (for L chain) or GSP2 H (for H chain) that form a hybrid with the adapter. (Manufactured by Takara Shuzo). When the PCR product was subjected to 1.2% agarose gel electrophoresis, a single band was detected at about 550 to 570 base pairs in both the H chain and the L chain.
  • the fragment amplified by PCR was incorporated into a pCR TM II vector using the “TA cloning Kit (Invitrogen)”.
  • the pCR TM II plasmid into which this fragment was inserted was transformed into a competent cell of Escherichia coli JMl09 (Takara Shuzo).
  • Colonies and pCR TM to II and hybrid formation came out on the plate "5 'primer UD (5'- ACC GAGCTCGGATCCACTAG-3' ) Z SEQ ID NO: 26" and "3 'primer one DU (5' -ATG CATGCTCGAGCGGCCGCC Using “-3 ′) NO SEQ ID NO: 27”, colony PCR was performed using Ding aq polymerase (manufactured by Takara Shuzo).
  • the amplified DNA fragment was analyzed by 1.2% agarose gel electrophoresis, and the colony in which the fragment of about 600 to 620 base pairs was amplified was used as an antibody.1.4 clones for the 1.4 L chain, 4 clones for the H chain, and Antibody 10.1 clones for light chain, 4 clones for heavy chain — I selected Escherichia coli of each clone was cultured, and plasmid DNA was prepared using “QIAwell-8 Plasmid Purification Kit” (manufactured by Qiagen).
  • the kit was used to perform a sequencing reaction using "Kit (Perkin Elmer)" and analyzed using "373 DNA Sequencer (ABI)".
  • the clones of three L chain specificities and four heavy chain specificities of antibodies 1 and 4 and the clones of two light chain specificities and four heavy chain specificities of antibody 10.1 were identical, respectively.
  • Figure 10 (SEQ ID NOS: 1 and 2) shows the L chain of Antibody 1.4
  • Figure 11 SEQ ID NOs: 3 and 4) shows the H chain of Antibodies 1 and 4, respectively. Is shown.
  • FIG. 13 (SEQ ID NOS: 5 and 6) shows the L chain of antibody 10.1
  • FIG. 14 (SEQ ID NOs: 7 and 8) shows the H chain of antibody 10.1, respectively.
  • the predicted CDR sequence of the L chain of antibody 4 is SEQ ID NOS: 9-11
  • the predicted CDR sequence of the H chain of antibody 1.4 is SEQ ID NOs: 12-14
  • the predicted CDR sequence of the L chain of antibody 10.1 is the sequence Number 15-: L7, antibody 10.
  • Example 7 H promotion of antibody 1.4 and antibody 10.1, and homology search of amino acid sequence of L chain variable region with amino acid sequence of human antibody
  • a human antibody having a high homology with the amino acid sequences of the H chain and L chain variable regions of the antibody 1.4 and the antibody 10.1 obtained in Example 6 was obtained by using GenBank, EMBL, and SW.
  • I SS Searched from PROT, PIR, PRF database.
  • the homology search was performed using the BLASTP 1.4.8 MP (Altschul, SF et. Al. J. Mol. Biol., 215, 403-410 (1990)) program.
  • the antibody 1.4 was, for example, a Pag-1 antibody (Hughes-Jones, NC et. Al. Biochem. J., 268, 135-140 (1990)) or a WEA antibody (Goni, F. et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4837-4841 (198 3)) It was found to have a high homology.
  • Antibody 10.1 is, for example, an ITH5-2 antibody (Chin, LT, et al., Iryu unol. Letter, 44, 25-30 (1995)), an IT C48 antibody (Ohlin, M., et al., Mol. Immunol., 31. 983-991 (1994)) and the like. Industrial applicability
  • the protein containing the monoclonal antibody of the present invention and a part thereof is reactive with human type I phospholipase A2 and has a strong inhibitory activity.
  • it shows cross-reactivity with monkey and Z or mouse platelet-derived type II phospholipase A2
  • it can be applied to these animals as experimental animals.Before testing the pharmacological effects on humans, There is an advantage that animal experiments can be performed on monkeys and mice.
  • the monoclonal antibody of the present invention and the protein containing a part thereof can remove the type II phospholipase A2 enzyme bound to cells, it has a particularly strong L and inhibitory activity against the type II phospholipase A2 enzyme. However, it is considered that no side effect is caused by the attack of complement and Z or effector cells.
  • the monoclonal antibody of the present invention and a protein containing a part thereof are useful for various diseases (myocardial infarction, cerebral infarction, acute renal disease) suggesting that human type II phospholipase A2 is exacerbated or a part of the cause thereof.
  • allergic diseases such as asthma, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, septic shock, spleenitis, psoriasis, multiple organ disease (M0F), Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS), Crohn's disease and ulcerative colon Can be used as a treatment for inflammation, acute inflammation of the anterior segment of the eye (uvea), neonatal respiratory distress syndrome (RDS), broncho-pulmonary dysplasia (BPD), and others.
  • M0F multiple organ disease
  • ARDS Acute Respiratory Distress Syndrome
  • BPD broncho-pulmonary dysplasia
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • CDS Array features Characteristic symbol
  • Sequence type nucleic acid
  • Gly Ala Asp Gly Asn lie Val Met Thr Gin Ser Pro Lys Ser Met Ser
  • Lys Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80
  • Sequence type nucleic acid
  • ATC CTT TCC CAG GTG CAG CTG AAG GAG TCA GGA CCT GGC CTG GTG GCG 96 lie Leu Ser Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • N represents inosine (I).
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明細書
I I型ホスホリパーゼ A 2阻害作用を持つ新規なモノク口一ナル抗体
及びその一部分を含む夕ンパク質
技術分野 本発明は I I型ホスホリパーゼ A2を強力に阻害する活性を有する新規なモノクロ —ナル抗体、 及びその一部分を含むタンパク質に関する。
更に詳しくは、 本発明は I I型ホスホリパーゼ A2に対する特異性、 親和性に優れ、 かつ I I型ホスホリパーゼ A2を強力に阻害し、 I I型ホスホリパーゼ A2を伴った疾患 の治療薬としても利用可能な新規なモノクローナル抗体、 及びその一部分を含む タンパク質に関する。 また、 本発明は、 該モノクローナル抗体またはタンパク質 を産生する細胞、 該モノクローナル抗体または夕ンパク質をコードする D N A及 び該 D N Aを含む組換えべクタ一に関する。 更に、 本発明は、 該モノクローナル 抗体または夕ンパク質を含む医薬組成物または I I型ホスホリパーゼ A2阻害剤に関 する。 背景技術
ホスホリパーゼ A2は、 生体膜構成成分の 1, 2-ジァシルホスホグリセリ ドの C2位 のエステル結合を加水分解する酵素として知られる。 この酵素は哺乳動物の種々 の臓器や細胞に見られ、 生体膜リン脂質の新生や代謝を司るのみならず、 ァラキ ドン酸カスケ一ドの律速酵素としての役割があり、 その代謝産物のプロスタグラ ンジン、 ロイコトリェン、 トロンボキサンチン、 PAF等はさまざまな生理活性をも つことが知られている。
ホスホリパーゼ A2には、 I 型、 I I型、 細胞内等の種類が知られている （厚味厳 一ら、 日本臨床、 1994年特別号、 202-206) 。 この中でも、 I I型ホスホリパーゼ A 2は、 炎症反応に伴い、 炎症局所の浸出液中に誘導されたり、 多量の酵素が血中に 放出される。 さらにこの酵素は種々の炎症性疾患においてその病態の増悪化ある いはその原因の一部であることを示唆する種々の報告がある。 例えば、 Kikuchi- Yanoshitaらは、 心筋梗塞のモデルであるラットの虚血性心疾患のモデルで臓器障 害の進展と相応してこの酵素の活性が上昇していることを報告している （Kikuch i-Yanoshita, R. et al. , J. Biochemistry, 114 : 33- 38， 1993 ) 。 Leongらは、 心筋 梗塞の患者では血中に正常人より多量に本酵素が存在していることを報告してい る (Leong L. L. et al.， Clinical Experimental Pharmacology and Physiology, 19 ： 113-118, 1992) 。
Lauritzenらは、 脳梗塞の虚血再かん流障害において、 病態の悪化に本酵素が主 要な役割を果していることを示唆する報告をしている （Lauritzen I. et al. , Β rain Research, 651 : 353-356, 1994) 。 Baurらは、 急性腎不全において、 病態の 悪化に本酵素が主要な役割を果していることを示唆する報告をしている （Baur M. , Klin Wochenschr, 67 ： 196-202， 1989) 。 Murakamiらは、 喘息等のアレルギー 性疾患において中心的な役割を果たす、 肥満細胞のヒスタミン顆粒放出をこの酵 素が促進し、 この酵素を阻害することにより喘息等のァレルギ一性疾患の治療薬 につながる可能性を示唆している (Murakami, M. et al. , Journal of Immunolo gy, 151 : 5675-5684, 1993) 。
Smithらおよび Pruzanskiらは、 慢性関節炎リウマチ患者では、 その血中に正常 人より多量に本酵素が存在することを報告し、 その原因あるいはその増悪化を行 つている可能性があることを示唆している （Smith G. M. et al. , British Journ al of Rheumatology, 31 ： 175- 178, 1992、 Pruzanski W. et al. , J. R eumato 1. , 15 ： 1351 -1355, 1988) 。 Pruzanskiらは、 同様に変形性関節症の患者浸出液 中に正常人より多量に本酵素が存在することを報告し、 その原因あるいはその増 悪化を行っている可能性があることを示唆している （Pruzanski W. et al. , Lif e Sciences, 48 ： 2457-2462, 1991 ) 。 Vadasらおよび Greenらは、 敗血症ショッ クの患者では血中に正常人より多量に本酵素が存在することを報告し、 その原因 あるいはその増悪化を行っている可能性があることを示唆している （Vadas P. e t al. , Life Sciences, 50 : 807-811, 1992 ， Green J. , Inflammation, 15 : 3 55-367 ， 1991 ) 。
Nevalainenらは、 胖炎患者で、 特に重症な患者の血中に多量に本酵素が存在す ることを報告し、 その原因あるいはその増悪化を行っている可能性があることを 示唆している (Nevalainen T. J. et al. , Gut, 34： 1133- 1136, 1993) 。 Ander sonらは、 乾せん症の患者では皮膚中に多量に本酵素が存在することを報告し、 そ の原因あるいはその増悪化を行っている可能性があることを示唆している （Ande rson S. et al. , Inflammation, 18 ： 1 - 12, 1994) 。
Koikeらは、 多臓器疾患 （M0F) では、 本酵素がこの疾患の原因の主要な役割を 果していることを示唆する報告をしている （Koike K. et al. , Surgery, 112 : 17 3- 180, 1992) ο Koeniger ら、 Edelson らおよび Romaschinらは、 Acute Respira tory Distress Syndrome (ARDS) の患者では血中に正常人より多量に本酵素が存 在していることを報告し、 その原因あるいはその増悪化を行っている可能性があ ることを示唆している (Koeniger R. et al. , lin Wochenschr , 67 ： 212-216， 1989， Edelson J. D. et al. , AM REV RESPIR DIS, 143 ： 1102- 1109 ， 1991、 R omaschin A. et al. , Clin. Biochem. , 25 ： 55-60, 1992) 0
Minamiらは、 クローン病および潰瘍性大腸炎の患者では血中に正常人より多量 に本酵素が存在していることを報告し、 その原因ある L、はその増悪化を行ってい る可能性があることを示唆している （Minami T. et al. , Gut, 33 ： 914-921， 1 992 ) 。
この他、 急性炎症前眼部炎症 （ぶどう膜炎） 、 新生児呼吸障害症候群 （RDS) 、 気管支肺異形成症 （BPD) などの疾患でも本酵素が関与していることが推察される。 ところで、 抗ヒト I I型ホスホリパーゼ A 2抗体として、 以下のものが知られて いる。
Stonerらはヒ卜胎盤および滑液からヒト I I型ホスホリパーゼ A2酵素を精製し、 これを免疫原とし、 マウスを用い、 モノクローナル抗体を取得している （Stoner C. R. et al.， Jounal of Immunological Methods, 145 ： 127- 136, 1991 ) 。 ここ で用いた免疫方法は、 BALB/cByJ系のマウスにフロインド完全アジュバントと混合 したホスホリパーゼ A2酵素 5 gを先ず免疫し、 さらに 25日後 3 / ^を免疫した。 脾 細胞の融合を行なう 3日前 （免疫から 36日後） 5 /2 gを最終免疫している。 従って、 免疫した抗原の全量は 13 ; ^を 3回に分けて、 36日間に免疫している。 脾細胞の融 合はマウスミエローマ細胞 PAI -0を用い、 HAT培地で選択した。 培地の上清をホス ホリパ一ゼ A2を用いた ELISA系で調べモノクローナル抗体 (PLA184、 PLA185, PLA1 86、 PLA187)を取得した。 これらの抗体はヒ卜ホスホリパーゼ A2に対し酵素阻害活 性はある。 しかし、 他種のホスホリパ一ゼ A2に対する阻害活性を調べる実験はラ ッ ト I I型ホスホリパーゼ A2に対してのみであり、 これらの抗体は殆ど或いは全く ラッ ト I I型ホスホリパーゼ A2に対し交差反応性がなく、 ラッ 卜の動物実験には用 いることができないと報告している。
また、 Takayamaらは、 リウマチ患者の関節液からヒ ト I I型ホスホリパーゼ A2酵 素を精製し、 これを免疫原とし、 マウスを用い、 モノクローナル抗体を取得して いる。 （Takayama K. et al. , BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH CO MUNI CATIONS 167： 1309 1315, 1990 ) 。 ここで用いた免疫方法は、 ニトロセルロース 膜にヒ卜 I I型ホスホリパーゼ A2酵素 lO ju gを吸着させた後ホモジナイズし、 これを BALB/c系のマウスの脾内に接種した。 2週間後、 同じように免疫した。 従って、 免 疫した抗原の全量は 20 gを 2回に分けて、 28日間に免疫している。 さらに 3日後、 マウスミエローマ細胞 （X63— Ag8. 6. 5. 3) と脾細胞の融合を行なっている。 培地 の上清をホスホリノ、。一ゼ A2を用 L、た ELISA系で調べ反応するモノクローナル抗体 (HP- K HP- 2、 HP-3> HP-4)を取得した。 これらの抗体の中でヒ 卜ホスホリパーゼ A2に対し酵素阻害活性が最も強いのが HP- 1である。 し力、し、 HP- 1でもその阻害活 性は弱く、 モル比で 200倍の抗体を加えても、 約 80%の阻害活性しか示さない。
McCordらはリコンビナントヒト I I型ホスホリパーゼ A2酵素を精製し、 これを免 疫原とし、 マウスを用い、 モノクローナル抗体を取得している。 （McCord M. et al.， THE JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY 102 : 980-986， 1994) 。 ここ で用いた免疫方法は、 CAF1系マウスにフロインド完全アジュバン卜と混合したホ スホリパーゼ A2酵素 100、 50、 25 gをおのおの 4週間毎に免疫した。 脾細胞の融合 を行なう 3日前に最終免疫をした。 従って、 免疫した抗原の全量は約 200 z gを 4回 に分けて、 56日間に免疫している。 脾細胞の融合はマウスミエローマ細胞 SP2/0 - AG14を用い、 MT培地で選択した。 培地の上清をホスホリパーゼ A2を用いた阻害活 性を調べ、 モノクローナル抗体（3F10)を取得した。 この抗体 l gを用いヒ卜ホス ホリパーゼ A2阻害活性を調べている。 しかし、 この論文中ではどのくらいの量の ヒトホスホリパーゼ A2を用いたかの記載はなく阻害活性が強いのかどうか明確で ない。
さらにジョンソン （Johnson L. K. ) は、 特許出願公表 （特表平 4-506447号公報） においてリコンビナントヒトホスホリパーゼ A2酵素を精製し、 これを免疫原とし、 ゥサギを用い、 ポリクロ一ナル抗体を取得している。 これは、 モノクローナル抗 体ではなく、 しかも、 免疫原として 2種のペプチド （ヒトホスホリパーゼ A2配列の セグメント 「GTKFLSYKFSN'SGSRITC ( N末端から 67位〜 85位） 」及び 「NKTTYNKKYQ YYSNKHSRGSTPRC ( N末端から 109位〜 132位） 」 ） を用い免疫をしている。 この抗 体を用いヒトホスホリパーゼ A2阻害活性を調べている。 しかし、 本明細書の記載 からは、 どのくらいの量の抗体とヒトホスホリパーゼ A2を用いたか不明であり、 阻害活性が強いのかどうか明確でない。
また、 特開平 7— 1 0 9 3 0 0号においては、 ヒト Π型ホスホリパーゼ A2と硫 酸化多糖との結合を促進する抗体が開示されているが、 該抗体がヒ卜 Π型ホスホ リノ、。一ゼ A2活性を阻害することは確認されていない。
更に、 上述の従来公知の抗体においては、 サル、 マウス、 ゥサギ、 ネコ、 ィヌ、 ラッ 卜の II型ホスホリパーゼ A2に対する阻害活性について、 または、 細胞に結合 したヒトホスホリパーゼ A2を遊離するか否かについては知られていない。
マウスにヒ 卜の酵素を免疫すると、 マウスとヒ卜の酵素のアミノ酸配列の異な る部分に抗体はできやすい。 従って、 ヒ卜 I I型ホスホリパーゼ A2をマウスに免疫 するとヒ 卜 I I型ホスホリパーゼ A2に結合する抗体のほとんどはマウス II型ホスホ リノ 一ゼ A2には結合しないと理論的に推定される。
また、 I I型ホスホリパーゼ A2の酵素活性中心およびその近傍は一般に動物種間 で保存されており、 マウスとヒトでもかなりホモロジ一が高い。 ヒ ト II型ホスホ リパーゼ A2をマウスに免疫すると免疫学的なトレランスにより酵素活性中心およ びその近傍部分を認識する抗体も得られ難い。 従って、 ヒ ト I I型ホスホリパーゼ A2を強く阻害する抗体も得られ難いのが現状である。
ヒト I I型ホスホリパーゼ A2を強く阻害し、 しかもマウス I I型ホスホリパーゼ A2 及び Zまたはサル I I型ホスホリパーゼ A2をも阻害する抗体は知られていない。 新 薬のヒ卜での試験を行う場合、 予め動物実験によってその薬効を明らかにせねば ならない。 従って、 実験動物、 特にマウスのような小動物およびサルで薬効を発 揮するモノクローナル抗体、 即ち、 ヒト I I型ホスホリパーゼ A2を阻害するととも に、 これら動物の 11型ホスホリ/ ーゼ A2を強く阻害するモノクロ一ナル抗体が必 要である。
また、 ホスホリパ一ゼ A2酵素が膜リン脂質を加水分解する際、 細胞に結合する ことが必須であることが知られている （Suga H. et al. , Eur. J. Biochem. , 218 ： 807-813, 1993 /Murakami M. et al. , J. Biol. Chem. , 268: 839-844， 1993) 。 従って、 血中あるいは浸出液中で遊離状態にある酵素を阻害するばかりでなく、 その膜リン脂質が加水分解される細胞に結合したホスホリパーゼ A2酵素を抗体が はずすことができれば、 これらの抗体は新規な作用機序に基づくさらに強力なホ スホリパーゼ A2阻害効果を有することが期待される。 しかも、 細胞表面に結合し たホスホリパーゼ A2に抗体が結合すると、 その細胞を補体及び Zまたはエフェク ター細胞が攻撃し副作用をもたらすことが予想される。 しかしながら、 細胞に結 合したホスホリパーゼ A2をはずすことができる抗体も未だ得られていない。
従って、 医薬品化を考慮した I I型ホスホリパーゼ A2に対する抗体において、 ヒ ト I I型ホスホリパーゼ A2を強く阻害し、 かつ他の動物種由来 I I型ホスホリパーゼ A2をも阻害することができる抗体や、 細胞に結合した I I型ホスホリパーゼ A2をも はずすことが'できる性状をもつ抗体を取得することが望まれていた。 発明の開示
本発明者らは、 これらの問題点を克服するため鋭意研究を行い、 以下の知見を 得て発明を完成した。
即ち、 リコンビナン卜ヒト I I型ホスホリパーゼ A2をマウス一匹当り 20 gフロイ ンド完全アジュバントと混合し 2〜3週間の間隔で計 8回免疫した。 このように、 他 の研究者と異なり、 免疫の頻度を多く、 しかも、 免疫期間も長くすることにより、 免疫学的なトレランスの回避を試みた。 さらに、 抗体をスクリーニングする際、 ホスホリパーゼ A2阻害活性に用いるアツセィ系についても工夫を行った。
即ち、 ホスホリパーゼ A2酵素活性で用いる基質として感度がよい大腸菌リン脂 質を用い （Jacobson P. B. et al. , Biochem. Pharm. , 39 : 1557， 1990) 、 さらに基 質としての大腸菌リン脂質の調製についても工夫した。 即ち、 大腸菌りン脂質の 調製はホスホリパーゼ A2が欠損した大腸菌 SN17(pldA， pla- 2， thr-1, leuB6, thi) (Doi, 0. et al. , J. Biochem. , 80 : 1247-1258, 1976) を用い、 卜リチウムラベ ル化したォレイン酸を取り込ませ、 調製した。 この菌を用いることにより大腸菌 ホスホリパーゼ A2によるリン脂質の分解を受けなくなり効率良く トリチウムラ ベル化された比活性の高い大腸菌リン脂質が調製できた。 さらに、 酵素反応の反 応時間を長くするなど従来法（J. Biol. Chem. , 261： 4239-4246, 1986)より感度をで きるだけあげたアツセィ系を用いることにより、 効率良くしかも正確に目的の抗 体産生ハイプリ ドーマをスクリーニングした。 そして、 各種の動物由来の I I型ホ スホリパーゼ A2活性の阻害効果を調べた。
また、 得られた抗体が細胞に結合したホスホリパーゼ A2酵素を外すことができ るかどうかを調べるアツセィ系を用い、 抗体の新規な作用を調べた。
その結果、 下記性質を持つことを特徴とするモノクローナル抗体の取得に成功 した。
即ち本発明者らが取得したモノクローナル抗体は、 ヒト I I型ホスホリパーゼ A2 と反応性であり、 強い阻害活性を持つ。 また、 サル、 マウス血小板由来 I I型ホス ホリパーゼ A2と交差反応性を示し、 強い阻害活性を持つ。 従って、 本発明の抗体 を用いれば新薬のヒ卜での試験を行う場合、 予めサル、 マウスでの動物実験を行 うことができる。 更に、 本発明のモノクローナル抗体は、 血中或いは浸出液中で さらに、 血中ある L、は浸出液中で遊離状態にある酵素を阻害するばかりでなく、 細胞に結合した I I型ホスホリパーゼ A2酵素を抗体が外すことができる。 I I型ホス ホリパ一ゼ A2は細胞表面のへパリン硫酸等を介して細胞に結合することから、 へ パリン硫酸などを細胞の表面に持つ、 肝細胞、 血管内皮細胞などに結合すること が知られている。 本発明のモノクローナル抗体は、 血中或いは浸出液中で遊離状 態にある酵素を阻害するばかりでなく、 上述のような細胞に結合した I I型ホスホ リパーゼ A2酵素を細胞膜から外すという性質も有している。
なお、 本発明には、 上記性質を有するモノクローナル抗体の一部分を含み、 該 モノクローナル抗体と同等の抗原結合能等を有するタンパク質も含まれる。 また、 該モノクローナル抗体と同等の抗原結合能等を有する限り、 還元アルキル体や、 動物を免疫して得たモノクローナル抗体のァミノ酸配列に対し、 1又は複数個の アミノ酸を付加、 欠失、 置換、 変異させたタンパク質も、 本発明に含まれる。 更に、 本発明者らは、 本発明に含まれる抗体を産生する 「ハイプリ ドーマ 1 . 4」 および 「ハイプリ ドーマ 1 0 . 1」から、 抗体の H鎖及び L鎖可変領域をコ ードする c D N Aを単離し、 その全塩基配列を決定した。 このことによって、 遺 伝子工学技術を利用した抗体の大量生産はもとより、 抗体工学技術を利用して、 本発明に含まれる抗体を自由に改変することが容易に行えるようになった。
( 「ハイプリ ドーマ 1 . 4」 について決定した塩基配列を配列番号 1 ( L鎖） 、 配列番号 3 ( H鎖） に示す。 また、 該塩基配列から予想されるアミノ酸配列を、 配列番号 2 ( L鎖） 、 配列番号 4 ( H鎖） に示す。 また、 「ハイプリ ドーマ 1 0 . 1」 について決定した塩基配列を配列番号 5 ( L鎖） 、 配列番号 7 ( H鎖） に示 す。 また、 該塩基配列から予想されるアミノ酸配列を、 配列番号 6 ( L鎖） 、 配 列番号 8 ( H鎖） に示す。 ）
即ち、 本発明は、 以下のものを含む。
① ヒト由来 I I型ホスホリパーゼ A2の活性を阻害し、 かつサル由来 I I型ホスホリ パーゼ A2及びノまたはマウス由来 I I型ホスホリパ一ゼ A2の活性を阻害することが できるモノクローナル抗体、 またはその一部分を含み該阻害能を有するタンパク 質。
② 細胞膜に結合した I I型ホスホリパーゼ A2を遊離する作用を有するモノクロー ナル抗体、 またはその一部分を含む該作用を有するタンパク質。
③ ホスホリパーゼ A2がヒト由来である②記載のモノクローナル抗体またはタン パク質。
④ ヒト由来 I I型ホスホリパ一ゼ A2の活性を阻害し、 かつサル由来 I I型ホスホリ パーゼ A2及び Zまたはマウス由来 I I型ホスホリパーゼ A2の活性を阻害することが でき、 かつ細胞膜に結合した I I型ホスホリパーゼ A2を遊離する作用を有するモノ クロ一ナル抗体、 またはその一部分を含み該作用を有するタンパク質。
⑤ ハイプリ ドーマ 12H5 (FERM BP- 5300) 、 ハイプリ ドーマ 1. 4 (FERM BP-5297) またはハイプリ ドーマ 10. 1 (FERM BP-5298) のいずれかにより産生されるモノク ローナル抗体もしくはその一部分を含むタンパク質、 またはそれらと同等の I I型 ホスホリパーゼ A 2に対する作用を有するモノク口一ナル抗体もしくはその一部 分を含むタンパク質。
⑥ 配列番号 2、 4、 6または 8のいずれかに示されるアミノ酸配列または該ァ ミノ酸配列に含まれる 1つまたは複数のァミノ酸に対しァミノ酸の置換、 欠失ま たは挿入を行ったアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、 ①または②に記載の モノク口一ナル抗体、 またはその一部分を含む夕ンパク質。
⑦ 配列番号 9〜2 0のいずれかに示されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列 に含まれる 1つまたは複数のアミノ酸に対しアミノ酸の置換、 欠失または挿入を 行ったァミノ酸配列を有するタンパク質を含む、 ①または②に記載のモノクロー ナル抗体、 またはその一部分を含むタンパク質。
⑧ ①〜⑦のいずれかに記載のモノクローナル抗体または夕ンパク質を産生する 細胞。
⑨ ハイプリ ドーマである⑧記載の細胞。
⑩ 組換え D N Aによつて形質転換された細胞である⑧記載の細胞。
⑪ ⑧記載の細胞を培養し、 培養上清からモノクローナル抗体またはタンパク質 を回収する工程を含む、 ①〜⑦のいずれかに記載のモノクローナル抗体または夕 ンパク質を製造する方法。
⑫ ①〜⑦のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはタンパク質をコードす る D N A。
⑬ 配列番号 1、 3、 5または 7のいずれかに示される塩基配列または該塩基配 列に含まれる 1つまたは複数の塩基に対し塩基の置換、 欠失または挿入を行った 塩基配列を含む、 ⑫に記載の D N A。
⑭ ⑫または ®の D N Aを含む組換えベクター。
⑮ ①〜⑦のいずれかに記載のモノクローナル抗体または夕ンパク質と薬剤学的 に許容される担体とからなる医薬組成物。
⑯ ①〜⑦のいずれかに記載のモノクローナル抗体または夕ンパク質を含む I I型 ホスホリパーゼ A2阻害剤。
なお、 本発明でいう 「タンパク質」 は、 アミノ酸数に特に限定はなく、 ァミノ 酸の少ないいわゆる 「ペプチド」 も包含される。 また、 本発明でいう 「モノクロ ーナル抗体またはタンパク質を産生する細胞」 は、 本発明のモノクローナル抗体 またはタンパク質を産生する限りにおいて、 細菌、 酵母、 哺乳動物細胞などあら ゆる細胞が含まれる。
本発明のモノクローナル抗体は、 例えば、 マウスハイプリ ドーマを培地または マウスの腹水中で培養することにより生産される。 また、 その断片 F(ab' )2、 Fab、 Fab* 等は、 例えば、 産生された抗体をトリプシン、 パパイン、 ペプシンからなる 群より選ばれた夕ンパク質分解酵素を用いて消化し、 適切な精製を行うことによ つて得ることが可能である。
本発明のハイブリ ドーマ、 例えばハイブリ ドーマ 12H5、 1. 4、 10. 1は、 免疫の頻 度を多くかつ免疫期間を長く して、 健常人 I I型ホスホリパーゼ A2で感作した BALB 系マウスの脾細胞とマウスの骨髄腫細胞 P3 63Ag8/Ul (P3Ul )とを常法、 例えば ケーラーとミルスタインの細胞融合法により融合して得ることが可能である （後 記実施例参照） 。
なお、 本発明者らによって取得され、 本発明に含まれるマウスハイプリ ドーマ 12H5、 1. 4、 10. 1は、 それぞれ次の通り寄託されている。
ハイプリ ドーマ 12H5に関する寄託：
(ィ） 寄託機関の名称 ·あて名
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名： 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 ) (口） 寄託日 （原寄託日） 平成 6年 1 1月 2 2日
(ハ） 受託番号 生命研条寄第 5300号 （FERM BP-5300)
ハイプリ ドーマ 1. 4に関する寄託：
(ィ） 寄託機関の名称，あて名
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名： 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 )
(口） 寄託日 （原寄託日） 平成 6年 1 1月 2 2日 (ハ） 受託番号 生命研条寄第 5297号 （FERM BP-5297)
ハイプリ ドーマ 10. 1に関する寄託：
(ィ） 寄託機関の名称，あて名
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名 ： 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 )
(口） 寄託日 （原寄託日） 平成 6年 1 1月 2 2日
(ハ） 受託番号 生命研条寄第 5298号 （FERM BP-5298)
上記ハイプリ ドーマを培養する培地としては、 例えば、 ダルベッコ氏変法ィー ク"ノレ ·¾最少'必須培地 (Dalbecco s modified minimum essential medium；以下 「D M E M」 と略称する）【こゥシ胎仔血清、 L -グルタミ ン、 グルコース、 ピルビン 酸ナトリウム、 2-メルカプトエタノール及び抗生物質 （例えばペニシリン G、 ス トレブトマイシン、 ゲンタマイシン等） を含有せしめた培地等が使われる。
ハイプリ ドーマの培養は通常、 培地中で 3 7 にて 5 %二酸化炭素、 9 5 %空 気の気相で 2〜 4日間、 或は 2, 6, 10. 14-テトラメチルペン夕デカン （例えばプリ スタン、 アルドリッチ社製） で前処置された BALB/ c系マウスの腹腔内にて 10〜 20日間程度で行われ、 精製可能な量の抗体が産生される。
また、 本発明のモノクローナル抗体またはその一部分を含むタンパク質は、 本 発明の抗体をコードする遺伝子の全部または一部を発現ベクターに組み込み、 大 腸菌、 酵母または動物細胞に導入して生産させることによっても得ることが可能 である。
このように製造されたモノクローナル抗体は培養上清或は腹水からタンパク質 の単離精製の常法により分離精製することができる。 そのような方法としては例 えば、 遠心分離、 透析、 硫酸アンモニゥムによる塩析、 D E A E—セルロース、 ハイ ドロキシルァパタイ ト、 プロテイン一 Aァガロース等によるカラムクロマト グラフィ一等が挙げられる。
このように分離精製された抗体につき、 常法により、 ペプシン、 パパイン等の タンパク質分解酵素によって消化を行い、 引続きタンパク質の単離精製の常法に よって単離精製を行って活性ある一部分、 例えば F(ab' )2、 Fab. Fab'、 Fvを得る ことができる。 さらにジチオスレィ トール及びョードアセトアミ ドなどを用いて 常法による抗体の H鎖と H鎖および Zまたは H鎖と L鎖を結んでいるジスルフィ ド結合の還元アルキル化によつて非共有結合のみで H鎖と L鎖が結び t、た抗体の 還元アルキル体を得ることができる （役に立つ免疫実験法 p 3 9講談社サイェン ティフィ ック） 。
更に、 本発明のモノクローナル抗体またはその一部分を含む夕ンパク質につい て、 エフェクター活性を抑制するために、 Fc部分のアミノ酸配列を変異させるこ とも可能である （Duncan. A. et. al. Nature, 332 ： 738. 1988 ' Tao, . et al. , J. Exp. Med. , 178 ： 661 -667, 1993 ' Lund, J. , J. Immunology, 147 ： 2657, 1991 ) 。 また、 他のタンパクを Fc部分に置き換えることも可能である。 さらには、 他のタンパクを Fc部分に融合し、 新規な作用をもたせることも可能で ある。
なお、 ヒ卜の治療に本発明のモノクローナル抗体または該抗体の一部を含む夕 ンパク質を用いる場合は、 ヒ 卜由来の部分の割合が高いモノクローナル抗体また は該抗体の一部を含む夕ンパク質を用いることが望ましい。 そのようなモノク口 ーナル抗体の例として、 ① 可変領域のみマウス等の動物由来のアミノ酸配列か らなり、 定常領域はヒ ト由来のアミノ酸配列からなる抗体、 即ちいわゆる 「キメ ラ抗体 （chimeric antibody) 」 ② 相補性決定領域 （または超可変領域 Z以下 「C D R」 （complementarity- determing region) と略称） のみマウス等の動物 由来のアミノ酸配列からなり、 その他の領域はヒト由来のアミノ酸配列からなる 抗体、 即ちいわゆる 「ヒ ト化抗体 （humanized antibody) 」 が挙げられ、 これら のタイプの抗体も本発明に含まれる。 これらの 「キメラ抗体」 または 「ヒ卜化抗 体」 は、 例えば、 本発明のハイプリ ドーマから、 可変領域または C D Rに対応す る遺伝子を単離して、 ヒト抗体遺伝子と組み換え、 宿主細胞に導入して発現させ ることによって、 当業者が容易に製造することが可能である （Int. J. Cancer, 44, 424〜433(1989)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8095〜8099(1990)参照) 。 また、 遺伝子は配列決定後、 対応する配列を合成したものを用いることも、 ハイプリ ド 一マゃヒト抗体産生細胞から得た遺伝子と合成した遺伝子を結合させて用いるこ ともできる。 また、 可変領域または C D Rに対応する遺伝子としては、 本発明者 らが単離した、 配列番号 1、 3、 5ま は 7いずれか記載の塩基配列またはその C D R部分の塩基配列を含む D N Aが最も好適であり、 または配列番号 2、 4、 6または 8 L、ずれか記載のァミノ酸配列またはその C D R部分をコードする塩基 配列を含む D N A、 または該 D N Aの塩基配列の 1つまたは複数の塩基に対し塩 基の置換、 欠失または挿入を行った塩基配列を有する D N A遺伝子またはその一 部を有する D N Aが好適に用いうる。 なお、 塩基の置換、 欠失または挿入等の変 異導入は、 公知の方法で行うことができる （Gillanm et al.， Gene. 8， 81〜97(197 9)、 Roberts et al.， Nature, 328， 731〜734( 1987)) 。 また、 得られた変異塩基配 列のうち好適な性質を有するァミノ酸配列をコードする配列を選択するには、 フ ァージディスプレー法を利用した方法 (Annu. Rev. Immunol. , 12, 433-455(1994) ) 等が用いられる。 特に 「ヒ卜化抗体」 については、 具体的には、 公知の方法に従 つて、 当業者が容易に製造することが可能である (Nature, 321, 522-525(1986) : S cience. 239, 1534- 1536(1988) :Proc. Natl. Acad. Sci, USA.， 86, 10029- 10033( 1989 )： Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 88, 2869-2873( 1991 ) ) 。 なお、 これらの文献等によれ ば、 「ヒ卜化抗体」 を製造する際、 C D R部位のみヒト以外の生物の C D Rと置 換されるヒト抗体 （即ち 「ヒ卜化抗体」 の基本骨格を構成する抗体ノ 「ヒト受容 体抗体」 と称する） として、 該移植される C D Rが由来するヒ卜以外の生物の抗 体とホモロジ一の高いヒト抗体を用いることが好ましいとされている。 実施例 7 に示すように、 本発明者らが得た本発明に含まれるマウス抗体とホモロジ一の高 ぃヒト抗体は、 例えば、 ？ 3 £— 1抗体 （Hughes-Jones, N. C. et. al. Bioche m. J. , 268, 135-140(1990)) 、 W E A抗体 (Goni, F. et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4837-4841 (1983)) 、 I T H 5— 2抗体 (Chin, L. T. , et al. , Imiun ol. Letter, 44. 25-30(1995)) 、 I T C48抗体 (Ohlin, M.， et al. , Mol. Immunol.， 3 1, 983-991(1994) ) であったので、 これらの抗体が「ヒ卜化抗体」 を作製する際の 「ヒト受容体抗体」 として好適であると考えられる。
また、 「キメラ抗体」 についても、 公知の方法に従って、 当業者が容易に製造 することが可能である (Nature, 314, 268- 270(1985) :Proc. Natl. Acad. Sci. USA.， 8 4， 3439-3443(1987) :Pro Natl. Acad. Sci. USA. , 84, 214-218( 1987), Proc. Natl. Aca d. Sci. USA.， 81， 6851 - 6855(1984) ) 。
本発明に含まれる好適なモノクローナル抗体または夕ンパク質としては、 ヒ卜 11型ホスホリパーゼ A2で感作して上述のように作製したモノクローナル抗体 12H5 または 1. 4及びその断片 F(ab' )2、 Fab, Fab" 等が挙げられる。 また、 これらのモ ノクローナル抗体またはその一部分の可変領域または超可変領域を有し、 他の部 分はヒト由来のモノクローナル抗体が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、 非経口投与、 即ち、 皮下、 筋肉内または静脈内投与に 特に有効である。 非経口投与用組成物は、 通常、 投与可能な担体、 好ましくは水 性担体に溶解した、 モノクローナル抗体またはその一部分を含むタンパク質の溶 液からなる。 種々の水性担体、 例えば水、 緩衝水、 0. 4%の食塩水、 0. 3%のグリ シン、 5%のグルコース、 ヒトアルブミン溶液等を使用することができる。 これら の溶液は無菌であり、 そして一般的に粒子形成性物質を有していない。 これらの 組成物は、 慣用で周知の滅菌技術によって滅菌することができる。 これら組成物 は、 緩衝化剤、 等張化剤等のような、 生理的条件に近づけるのに必要な薬剤学的 に許容される補助物、 例えば、 酢酸ナ卜リゥム、 塩化ナ卜リゥム、 塩化力リゥム、 塩化カルシウム、 乳酸ナトリウム、 クェン酸ナトリウム等を含有することができ る。 非経口的に投与できる組成物の実際の製造は、 当該技術分野の熟練者に既知 または周知の技術を用いて行うことが可能であり、 例えば「Remington' s Pharma ceutical Science, 第 15版， Mack Publishing Company, ペンシノレべニァ州ィース トン（1980)」 に記載されている。
本発明のモノクローナル抗体またはタンパク質または医薬組成物は、 冷凍して 貯蔵するか、 凍結乾燥によつて貯蔵し使用する前に適当な溶媒に溶解して再生し て使用することができる。 凍結乾燥及び再生は、 当業者に既知の技術を用いるこ とができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 12H5、 10. 1および 1. 4のリコンビナントヒト I I型ホスホリパーゼ A2のェ ライザの結果を示す。
図 2は、 12H5、 10. 1および 1. 4のラッ 卜血小板由来ホスホリパーゼ A2 活性に対 するェライザの結果を示す。
図 3は、 12H5、 10. 1および 1. 4のリコンビナントヒト I I型ホスホリパ一ゼ A2活性 に対する阻害作用を示す。
図 4は、 12H5、 10. 1および 1. 4のラッ ト I I型ホスホリパーゼ A2活性に対する阻害 作用を示す。
図 5は、 12H5の各種動物血小板由来ホスホリ '、。一ゼ A2活性に対する阻害作用を 示す。
図 6は、 10. 1の各種動物血小板由来ホスホリパーゼ A2活性に対する阻害作用を 示す。
図 7は、 1. 4の各種動物血小板由来ホスホリパーゼ A2活性に対する阻害作用を 示す。
図 8は、 12H5、 10. 1および 1. 4の BRい 3A細胞に結合したホスホリパーゼ A2を遊離 する作用を示す。
図 9は、 1. 4の H鎖および L鎖可変領域 c D N Aのアンカード P C Rクローニン グの方法を示す。
図 1 0は抗体 1. 4の L鎖の可変領域の c D N A配列および翻訳されたァミノ酸配 列を示す。 なお、 CDR配列に対応すると予想される配列には下線が付されてい る。
図 1 1は抗体 1.4の H鎖の可変領域の c DN A配列および翻訳されたァミノ酸配 列を示す。 なお、 CDR配列に対応すると予想される配列には下線が付されてい る。
図 12は 10.1の H鎖および L鎖可変領域 c DNAの P CRクローニングの方法 を示す。
図 13は抗体 10.1の L鎖の可変領域の c D N A配列および翻訳されたァミノ酸 配列を示す。 なお、 CDR配列に対応すると予想される配列には下線が付されて いる。
図 14は抗体 10.1の H鎖の可変領域の c DN A配列および翻訳されたァミノ酸 配列を示す。 なお、 CDR配列に対応すると予想される配列には下線が付されて いる。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を示すが、 本発明はこれらの実施例に制限を受けるもの ではない。
(実施例 1) ハイプリ ドーマ 12.5、 1.4、 10.1の調製
a ) リコンビナントヒ 卜 II型ホスホリパーゼ A2の調製
本発明のモノクローナル抗体はリコンビナン卜ヒト II型ホスホリパーゼ A2を免 疫することにより得られるが、 リコンビナントヒ卜 II型ホスホリパーゼ A 2のそ の調製はすべて特開平 5-192167号公報記載の方法に準じて行った。
b)免疫した脾細胞の調製
BALB/c系雄マウス （免疫開始時で 6週齢） に、 実施例 1 a)で精製したリコンビ ナントヒト II型ホスホリパーゼ A2を一匹当り 20tg、 0· lmlの生理的食塩水に溶解 させたものについて同容量のフロインド完全アジュバン卜と混合し乳濁化させ、 腹腔内投与した （初回免疫） 。 以後 2〜3週間の間隔で 7回、同量のホスホリパーゼ A2を同容量のフロインド完全アジュバントと混合して乳濁化させたものでブース ター投与を行った。第 7回免疫の 24日後、一匹当り 20 のホスホリパーゼ A2を 0.2m 1の生理的食塩水に溶解させて、 腹腔内投与した （最終免疫） 。 最終免疫の 3日後 に脾臓細胞を 1匹のマウスから採取し、 DMEM培地に懸濁させた。
c) ハイプリ ドーマ 12H5、 1.4、 10.1の調製
上記で調製した脾細胞 （lxlO8個） をマウス骨髄腫細胞 P3x63Ag8'Ul(P3Ul) (2xl07個） と、 ケ一ラーとミルスタインの方法 [Nature,第 256巻第 495頁 （197 5年） 参照] により融合した。 即ち脾細胞と P3U1細胞を DMEMで数回洗浄した後、 両 者を 50nilプラスチック製遠心管に入れ、 充分混合した。 次いで遠心分離して培地 を除去し、 これに 37 に保温した 50% (w/v) ポリエチレングリコール （シグマ社 製、 平均分子量 3350) を含む DMEMlmlを 1分間を要して撹拌下徐々に加えた。
次に 37°Cに保温した DMEMlOmlを滴下して細胞融合反応を終了させた。 反応液を 遠心分離し、 上澄液を除去した後、 HAT培地 [ヒポキサンチン （1 X 10— 4M) 、 アミ ノプテリン （4x10— 7M) 、 チミジン （1.6xlO-5M) を添加した 10%ゥシ胎仔血清 を含む DMEM培地] を残さに加え、 脾細胞濃度が 6 xlO5細胞数 I mlになるようにし た。 この懸濁液を 96穴プラスチック製プレー卜に、 1穴当り 200 1 (脾細胞 1·2χ 105個） ずつ分注した。 11日後に培地の半量を吸引除去し、 上記 HAT培地を加え た。 細胞融合の 7〜10日後約半数の穴の中に於てハイプリ ドーマの増殖がみられた。 下記 d) の方法で培養上清中の抗体活性を測定した。 陽性のクローンは 48穴ブラ スチック製プレートに移し、 更に 24穴プラスチック製プレートに移し、 アミノブ テリンをなくす以外は上述したものと同じ培地で培養した。 24穴プラスチック製 プレート培養上清を用いて抗体活性の再現性を d) の方法で確認するとともに、 e) の方法で酵素阻害活性を測定した。
酵素阻害活性を示した 3つのクローンは、 単クローン性を保証するために、 限 界希釈法によって、 順次クローニングを行った。 こうして得られたクローンによ つて産生されるモノクローナル抗体をそれぞれ 12H5、 1. 4、 10. 1と命名した。
d ) ェライザ （ELISA) 法による抗体活性の測定
96穴平底マイクロタイタープレー卜の各ゥエル （穴） に精製したリコンビナン トヒ卜 I I型ホスホリパーゼ A2を 20mM卜リス緩衝食塩水 （TBS、 pH7. 4) で 0. 05 g/ mlに溶解し、 100 1ずつ添加し、 湿潤室中で一晩 4°Cに保存した。 そののち、 溶液 を捨て、 1%BSAを含む TBSを 200 /2 1ずつ添加し、 37°Cで 1時間静置し、 各ゥエルの 未吸着部分をブロックした。 その後、 0. 05%ツイーン 20 (Tween 20商品名） を含 む TBS CTBS-Tween) 溶液で数回洗浄を行った。 ハイプリ ドーマ培養上清或は腹水 或は精製抗体標品を、 0. 2%BSAを含む TBS- Tween (BSA-TBS-T een) 溶液で希釈し、 100 1ずつ各ゥェルに添加し、 室温で 2時間反応を行った。
先と同様に TBS-Tween溶液で洗浄後、 BSA- TBS-Tween溶液で 2000倍希釈した西洋 ヮサビペルォキシダーゼ標識抗マウス抗体 （ザィメッド社製） を 100 ^ 1ずつ各ゥ エルに添加し、 室温で 2時間反応を行った。 反応後、 先と同様に TBS-Tween溶液で 洗浄後、 酵素基質として、 0. 006%過酸化水素水、 並びに 0. lmg/mlの 3, 3' , 5, 5' - テトラメチルベンチジンを含む 0. 1M酢酸ークェン酸ナトリゥム緩衝液 （pH5. 8) を 100 1ずつ添加し、 室温で 30分間静置した。静置後、 3M硫酸を 25 1ずつ加え反 応を停止し、 450nmの吸光度を測定した。
e ) ホスホリパーゼ A2阻害活性の測定
抗体のホスホリパーゼ A 2に対する阻害活性の測定法はジャーナル ォブ バイ ォロジカルケミストリー （Pepinsky. R. B. et. al. ,、 J. Biol. Chem. , 261(9), 4239-4 246(1986)) を若干改良し、 以下の方法で測定した。
リコンビナン卜ヒト I I型ホスホリパーゼ Α2精製標品 0. 5ngと培養上清或は精製抗 体標品を 150mM塩化ナトリゥムと 12. 5 mMの塩化カルシウムおよび 250 g/mlの牛 血清アルブミンを含む 125mM卜リス塩酸緩衝液 (pH8. 0) 1中で室温で 2時間プ レインキュベーションを行った。 次に、 トリチウム標識ォレイン酸を取り込ませ た大腸菌 SN17のオートクレイブ標品 25 1 (5万から 10万 cpm) を反応液に添加し、 37 で 30分間反応させた。 反応は氷中に移して、 4規定塩酸を 25 1添加して停止 させた。 反応停止後、 40mg/ralの牛血清アルブミンを 25 i l加えて混合したのち氷 中で 30分間放置した。
その後、 15000rpmで 2分間遠心した上清の放射活性を測定した。 得られた放射活 性より陰性対照 （ホスホリパーゼ A2と抗体を含まないサンプルの放射活性） を減 じた値をホスホ °-ゼ A2活性とした。 抗体のホスホリパーゼ A2活性に対する阻 害率は陽性対照 （ホスホ 一ゼ A2を含み抗体を伴わな L、サンプルのホスホリパ ーゼ A2活性） のホスホリパーゼ A2活性を基準に以下の計算に基づいて百分率で表 した。
ホスホリパーゼ A2活性阻害率 = U - (ホスホリパーゼ A2と培養上清或は精製抗体 標品をインキュベーションしたときのホスホリパ一ゼ A2活性） ノ （陽性対照のホ スホリパーゼ A2活性） } X 100
なお、 ホスホリパーゼ A2活性の測定の際に基質として用いた卜リチウム標識ォ レイン酸を取り込ませた大腸菌のォ一トクレイブ標品は特開平 5- 192167号公報 8頁 に記載の方法に準じで調製した。
(実施例 2 ) モノクローナル抗体の産生と精製
a ) モノクローナル抗体の産生
BALB/c系雄マウス、 生後 5〜6週齢に 2， 6, 10, 14-テトラメチルペン夕デカン （プ リスタン、 シグマ社製） 0. 5mlを腹腔内注射した後、 14〜21曰後に 5 x l06 個のハ イブリ ドーマを生理的食塩水 0. 5mlに懸濁して腹腔内に接種した。 10〜20日後に産 生された腹水を屠殺開腹したマウスより採取した。 1匹のマウスより 5〜10mlのモ ノクローナル抗体含有腹水が得られた。
b ) モノクローナル抗体の精製
この腹水につき遠心分離して不溶物除去後、 等容量の飽和硫酸アンモニゥム溶 液を加え、 氷上で一時間拢拌した。 生じた沈澱を遠心分離し、 少量の 0. 9%の塩化 ナトリウムを含む 0. 1 M燐酸緩衝溶液 （pH7. 4) に溶解し、 一晩 4 にて 100倍容の 同緩衝液に対して透析を行い、 粗精製ガンマグロブリン画分を得た。 この画分よ り、 MAPS-I Iマウスモノクローナル抗体精製キッ 卜 （商標、 バイオラッ ドラボラト リーズ社製） を利用して IgGを精製した。
即ち、 ガンマグロブリン画分に同容量のバインディングバッファーを加え、 混 合した後、 同じバインディングバッファ一で充分平衡化した 「Protein A -Sepha rose CL4B (フアルマシア社製） 」 を充填したカラム （ゲルべッ ドボリューム 20m 1) にかけ、 バインディングバッファー 3カラム容量で洗浄した。 ついでキッ 卜に 含まれる溶出バッファー約 3カラム容量で IgGを溶出した。 溶出した IgGは、 20mM トリス緩衝食塩水 （pH7, 4) 等に対して透析し、 これを抗体標品とした。 通常腹水 lml当り 5〜10mgの IgGが得られた。
(実施例 3 ) 抗体のサブクラスの決定
ハイプリ ドーマ培養上清を用いて、 アマシャム製マウスモノクローナル抗体夕 ィビング用キッ トにより IgGサブクラスを決定した。 本法はエライザ法によるもの で、 各々 12H5 ( IgG2a)、 1. 4 ( IgG2a) 、 10. 1 ( IgGl ) と決定した。
(実施例 4 ) 抗体の交差反応性
a ) ラッ ト I I型ホスホリパーゼ A2の精製
ラッ 卜 PRP (血小板濃厚血漿） に 1/5容の ACD液 （65mMのクェン酸と 85mMのクェン 酸ナトリゥムを含む 2!¾ (w I V ) のブドウ糖液） を添加し、 2500 X gで 10分間遠心 した。 沈澱した血小板を lmlあたり 2 X 109細胞になるように ACD/F10培地 （1 : 5)
(F10； Gibco社製） 混液を加えて懸濁した後、 2500 x gで 10分間遠心した。 さら に沈澱した血小板を lmlあたり 2 X 109細胞になるように F10培地で再懸濁したのち に、 最終濃度が 2mMおよび 2. 5unitになるように 1Mの塩化カルシウム および 2500u nit / mlの卜ロンビンを順次添加した。
添加後、 37 で 5分間ィンキュベーションした後、 4てで 3000 X gで 15分間遠心 した上清 （ラッ 卜血小板トロンビン刺激上清） を回収し、 この上清をその後の精 製操作に供した。 ホスホリパーゼ A2の精製は特開平 5- 192167号公報の第 12頁記載 の方法を若干改良して行った。 すなわち、 ラッ ト血小板トロンビン刺激上清を予 め 0. 1M酢酸緩衝液 （pH6. 0) で平衡化してある硫酸化セル口ファイン （生化学工業 社製） カラム （ェコノカラム；カラムサイズ 20ml； BI0-RAD社製） に通液した。 力 ラムに洗浄液 （0. 5M塩化ナトリウムを含む 0. 1M酢酸緩衝液 （pH6. 0) ) を 200ml通 液して充分洗浄した後、 溶出液 （1. 5M塩化ナトリゥムを含む 0. 1M酢酸緩衝液 （p H6. 0) ) を 30ml通液して得られた画分を硫酸化セル口ファイン結合画分とした。 つぎに、 硫酸化セル口ファイン結合画分を HPLCにて分画した。
カラムは CAPCELL PAK C18 (4. 6mmID x 25cm；資生堂製） 、 HPLCシステムは LC- 4A (島津製作所製） を用いて、 すべて lml /分の流速で行った。 硫酸化セルロファ イン結合画分を通液した後、 0. 1%トリフルォロ酢酸を 60分間通液した。 その後、 0. 1¾トリフルォロ酢酸存在下で、 0〜50%ァセトニ卜リルのリニアグラジェ ントをかけてホスホリパーゼ A2を溶出した。 ホスホリパーゼ A2のピークは約 30% ァセ卜二卜リル付近に現れるのでこれを回収した。
回収した画分を SDS—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法および銀染色法を用い て検定したところホスホリパーゼ A2が単一バンドとして検出されたので、 これを ラッ ト I I型ホスホリパーゼ A2とした。
b ) ヒト、 サル、 ィヌ、 ゥサギ、 ネコ、 マウス血小板由来 I I型ホスホリパーゼ A2 の調製
各種動物血小板由来 I I型ホスホリパ一ゼ A2の調製はジャーナル ォブ バイオ ロジカルケミストリ一 （J. Biol. Chem.， 264 ( 10) , 5768-5775 ( 1989) ) のヒト 血小板破砕液の調製法に準じて調製した。
すなわち、 ヒト、 ァカゲザル、 ィヌ、 ゥサギ、 マウス、 ネコより P R P (血小 板濃厚血漿） を調製し、 最終濃度 2mMになるように EDTAを添加した後に、 2500 x gで 10分間遠心をして細胞を回収した。 細胞を 120mMの塩化ナトリゥムと 2mMの EDT Aを含む 30mMトリス塩酸緩衝液 （pH7. 4) に懸濁し、 再度 2500 x gで 10分間遠心を した。 この操作を 2回行った後、 得られた細胞を lmlあたり 2 X 109細胞になるよう に 120mM塩化ナトリウムと 2mMの EDTAを含む 30ιπΜトリス塩酸緩衝液 （ρΗ7. 4) で再懸 濁して、 液体窒素下で凍結した。
凍結した細胞懸濁液を融解し、 同量の 0. 36規定の硫酸を添加して超音波破砕
(BI0MC 7040 ULTRA SONIC PROCESSOR：セイコー社製； output 80, 15秒 x 6回) を行った。 得られた細胞超音波破粋液を氷中に 60分間放置した後、 4 で 10000 X gで 30分間遠心し上清を回収した。 沈澱にはさらに遠心上清の 1 /3容の 0. 18規定 の硫酸を添加して再懸濁後、 氷中に 60分間放置した。 その後、 4°Cで 10000 X gで 30分間遠心し上清を回収した。 両方の遠心上清を合わせて、 200mMの塩化ナトリウ ムを含む 50mM酢酸緩衝液 （pH4. 5) に対して一晩透析操作を行った。 透析後、 細胞 破砕液を 4°Cで 15000 X gで 40分間遠心した上清を回収し、 血小板由来ホスホリパ ーゼ A2とした。
c ) ェライザ反応性
実施例 2 b)で得られた各種モノク口一ナル抗体精製品を用 t、て以下の実験を行 つた。
IgG標品を BSA- TBS- Tweenで 10 / g/mlとし、 3倍希釈系列を作製した。 実施例 1 d) に従ってェライザを行い、 リコンビナントヒト I I型ホスホリパーゼ A 2およ びラッ 卜 I I型ホスホリパーゼ A2に対する交差反応性を調べた。 ラッ 卜 I I型ホスホ リバーゼ A2に対する ELISAは、 実施例 Id)のリコンビナントヒト I I型ホスホリパ ーゼ A 2をラット I I型ホスホリパ一ゼ A2に置き換えて行った。
結果を、 横軸に抗体濃度、 縦軸に 450nmにおける吸光度をとり、 図 1〜図 2に示 した。 12H5、 および 1. 4にはラッ 卜ホスホリパーゼ A2への交差反応性が認められた 、 10. 1には交差反応性は認められなかった。
d ) 各種動物由来ホスホリパーゼ A 2に対する阻害活性
実施例 2 b)で得られた各種モノクローナル抗体精製品を用 L、て以下の実験を行 つた。
① リコンビナントヒト 11型ホスホリパーゼ A2に対する阻害活性 実施例 1 a)のリコンビナントヒト II型ホスホリパーゼ A2を用い、 実施例 le)に 従い、 ホスホリパーゼ A 2に対する阻害活性を測定した。 横軸にホスホリパーゼ A 2と抗体標品をプレインキュベーションしたときの抗体濃度をとって、 各抗体 のリコンビナントヒト II型ホスホリパーゼ A2活性に対する阻害率を図 3に示した。
12H5および 1. 4は 10 g I mlの濃度でホスホリパーゼ A2活性をほぼ完全に阻害した c 一方、 10. 1は 3 g/mlの濃度で 8( ^の阻害率に達した。
② ラッ 卜 I I型ホスホリパーゼ A2に対する阻害活性
実施例 l e)のリコンビナントヒト I I型ホスホリパーゼ A2を実施例 4 a)のラッ ト I I型ホスホリパ一ゼ A2精製標品 （0. 5ng) に置き換えて、 ホスホリパーゼ A2に対す る阻害活性を測定した。 横軸にホスホリパーゼ A2と抗体標品をプレインキュベー シヨンしたときの抗体濃度をとつて、 各抗体のラッ ト I I型ホスホリパーゼ A2活性 に対する阻害率を図 4に示した。 12H5および 1. 4はラッ 卜 I I型ホスホリパ一ゼ の 活性をも阻害し、 ホスホリパーゼ A2活性の 50%を阻害するのに必要な抗体濃度は 1 2H5で 5 g/mlであった。
③ ヒト、 サル、 ィヌ、 ゥサギ、 ネコ、 マウス、 血小板由来 I I型ホスホリパーゼ A2に対する阻害活性
実施例 l e)のリコンビナントヒ 卜 I I型ホスホリパーゼ A2を各血小板破砕液の一 定量 （20から 40 ί 1 ) に置き換えて、 ホスホリパーゼ Α2に対する阻害活性を測定し た。 横軸に血小板破砕液と抗体標品をプレインキュベーションしたときの抗体濃 度をとつて、 各抗体の血小板由来ホスホリノぐーゼ Α2活性に対する阻害率を図 5〜 図 7に示した。 12Η5、 1. 4および 10. 1はヒト血小板由来のホスホリパーゼ Α2活性を リコンビナントヒ ト I I型ホスホリパーゼ Α2活性と同様に阻害した。 このことより 本発明のリコンビナントヒト II型ホスホリパーゼ Α2に対する抗体は天然のヒト I I 型ホスホリパーゼ Α2の活性を阻害する能力を有していた。 一方、 本発明の抗体は ァカゲザル、 マウス血小板由来のホスホリパーゼ Α2活性を阻害した。 また、 ィヌ 血小板由来のホスホリパーゼ Α2活性の一部を阻害した。 一方、 ゥサギ、 ネコ血小 板由来のホスホリパーゼ A2活性は阻害しなかった。
(実施例 5 ) 抗体の細胞に結合した 11型ホスホリパーゼ A2を遊離する活性 肝細胞 （BRL-3A :大日本製薬より購入） を 96穴平板培養プレート （Falcon社製） で F12K / 10¾FCS (F12K：大日本製薬社製） を用いて培養した。 コンフルェント迄 培養した細胞の培養液を除き、 4ngの1 2 51で標識したリコンビナントヒ卜 I I型ホス ホリパーゼ A2を含む F12K/ 10%FCSを 添加し 37°Cでインキュベーションし、 ホ スホリパーゼ A2を細胞に結合させた。 1時間後、 精製抗体標品を含む F12K / 10¾F CSまたは F12K/10 CSを 1添加し更に 2時間ィンキュベ一シヨンした。 インキュ ベーシヨン後、 培養液を回収し、 その放射活性を測定した。 同時に、 反応系に添 加した 4ngの 1 2 51で標識したホスホリパーゼ A2の放射活性を別途に測定した。
抗体の細胞からホスホリノ 一ゼ A2を遊離する活性は、 添加したホスホリパーゼ A2の放射活性から、 ホスホリパーゼ A2を細胞に結合後 F 1 2 K / 1 0 % F C Sを 添加しインキュベー卜したときの培養液の放射活性を引いた値を 1 0 0 %として、 添加した抗体濃度を変えインキュベーションしたときの培養液の放射活性を百分 率で示した。
なお、 リコンビナン卜ヒト I I型ホスホリパーゼ A2の1 2 51での標識は以下の方法 で行った。 I0D0GEN (ピアス社製） 10 gでコートしたガラス試験管に 30 gのリコ ンビナン卜ヒ 卜 I I型ホスホリパーゼ A2を含む lOOraMのトリス塩酸緩衝液 （pH7. 4) 100 ^ 1を添加し、 lOOmCi/mlの Na 1 2 5 I ( ICN社製） を 6 1添加した後、 20分間室温 にて放置した。 ガラス試験管より反応液を取り出すことで反応を停止した。 未反 応の Na 1 2 51はゲル濾過法により除いた。
ホスホリパーゼ A2を結合させた細胞に種々の濃度の精製抗体標品を添加してィ ンキュベーシヨンしたときの培養液の放射活性を測定した。 横軸に抗体添加後の 培養液中の抗体濃度をとって、 各抗体の細胞に結合したホスホリ ' ーゼ A2を遊離 する活性を図 8に示した。 コントロールのマウス抗体は細胞からホスホリパーゼ A2をまったく遊離しないが、 12H5、 10. 1および 1. 4は濃度依存的に細胞よりホスホ リパーゼ A2を遊離した。
(実施例 6) 抗体の H鎖および L鎖可変領域 c DN Aのクローニング
c DN Aクローニングに用いたメッセンジャー RNAは 「QuickPrep Micro mR NA Purification Kit (フアルマシア社製） 」 を使用して約 107個のハイプリ ドー マ細胞から作成した。 すなわち細胞を抽出緩衝液 （Extraction buffer) で懸濁溶 解し、 オリゴ dTセルロース （Oligo(dT)- Cellulose) を用いて m RNAを単離し た。
抗体 4の H鎖および L鎖可変領域 c DNAは 「5' RACE System Kit (ギブコ 社製） 」 を使用して図 9に示す手順で作成した。 すなわち、 定常領域遺伝子 （C) とハイプリッ ド形成するプライマーおよび逆転写酵素 （SUPER SCRIPT II Revers e Transcriptase) を使用して 1 gのメッセンジャー R N Aを铸型にして一本鎖 c DNAを合成した。 ここで使用したプライマーは L鎖では 「G S P 1 L (5' - G GCACCTCCAGATGTTAACTGC- 3' ) ノ配列番号 2 1 J で、 H鎖では 「G S P 1 H (5* -G GAA(AG)TA(AGC)CCCTTGACCAGGC-3' ) /配列番号 22」であった。 なお、 GS P 1 Hの配列で括弧内の配列は、 縮重に対応する塩基を示す。 次に、 铸型となった m RN Aを RN a s e Hにて消化した後、 「GLASS MAX Spin CartridgeJ にて一本 鎖 c DNAを精製した。 d C TPおよび末端デォキシヌクレオチドトランスフエ ラーゼを使用して一本鎖 c DNAの 3' 末端にポリ （d C) テールを結合させた。
H鎖および L鎖可変領域遺伝子 （V) はポリ （d C) テールとハイブリツド形成 するアンカープライマ一 （5' - CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGG 11 GGG 11 GGG IIG-3' 配列番号 23) および定常領域遺伝子 （C) とハイプリッ ド形成するプ ライマー 「G S P 2 L (5' -TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC- 3' ) ノ配列番号 24」 （ L鎖の場合） または 「 G S P 2 H (5' -TATAGAGCTCAAGCT TCCAGTGGATAGAC(CAT)GATGGGG(GC)TGT(TC)GTTTTGGC-3' ) Z配列番号 25」 （ H鎖 の場合） を用いて L AT a q (宝酒造社製） を使用して.増幅させた。 G S P 2H の配列で括弧内の配列は、 縮重に対応する塩基を示す。 この PC R反応物を 1· 2%ァガロースゲル電気泳動にかけたところ H鎖および L鎖とも約 550〜57
0塩基対付近に単一バンドが検出できた。
また、 抗体 10. 1の H鎖および L鎖可変領域 c DNAは 「Marathon cDNA Am plification Kit (クロンテック社製） 」 を使用して図 12の方法で作成した。 す なわち、 「Marathon cDNA合成プライマー」 および逆転写酵素を使用して 1 gの メッセンジャー RN Aを铸型にして一本鎖 c DN Aを合成した。 この反応液にさ らに R aseH、 DNAポリメラーゼ I (DNA polymerase I )、DMライゲース （D'A liga se) を反応させて二本鎖 c DNAを合成した。 さらに、 この反応液に T4 DMポリ メラーゼ （T4 DNA polymerase) を反応させて二本鎖 c D N Aを平滑末端化した。 T4 DNA ligaseを使用して Marathon cDNA了ダブターを二本鎖 c D N Aに結合させた。 H鎖および L鎖可変領域遺伝子 （V) はアダプターとハイプリッ ド形成するァダ プタ一プライマー 1およびプライマー G S P 2 L (L鎖の場合） または GSP2 H (H鎖の場合） を用いて L AT a q (宝酒造社製） を使用して増幅させた。 こ の P C R反応物を 1. 2 %ァガロースゲル電気泳動にかけたところ H鎖および L 鎖とも約 550〜570塩基対付近に単一バンドが検出できた。
配列決定のため 「TA cloning Kit (インビトロジヱン社製） 」 を使用して p C R™I Iベクターに PCRで増幅したフラグメントを組み込んだ。 このフラグメ ン卜の挿入された p CRTMI Iプラスミ ドを、 大腸菌 J Ml 09のコンビテント セル （宝酒造社製） にトランスフォーメションした。 プレート上にでてきたコロ ニーおよび pCRTMI Iとハイブリッ ド形成する 「5' プライマー UD (5'- ACC GAGCTCGGATCCACTAG-3' ) Z配列番号 26」 および 「 3 ' プライマ一 D U (5' -ATG CATGCTCGAGCGGCCGCC-3' ) ノ配列番号 27」 を用い、 丁 a qポリメラ一ゼ （宝酒造 社製） を用いたコロニー PCRを行った。 増幅した DNAフラグメン卜を 1. 2 %ァガロースゲル電気泳動により分析し、 約 600〜620塩基対のフラグメン 卜が増幅したコロニーを抗体 1. 4 L鎖についは 3クローン、 H鎖については 4 クローン、 また抗体 10. 1 L鎖については 2クローン、 H鎖については 4クロ —ンを選択した。 各クローンの大腸菌を培養し 「QIAwell- 8 Plasmid Purificati on Kit (キアゲン社製） 」 を使用してプラスミ ド DN Aを調製した。
調製した各クローンのプラスミ ド DNAおよびプライマー UD、 プライマー D U、 または L鎖では G S P 2 L、 H鎖では G S P 2 Hを用いて 「DNA Sequencing
Kit (パーキンエルマ一社製） 」 を利用して配列決定反応を行い 「373DNA Seque ncer (ABI社製） 」 を用いて解析を行った。 抗体 1 · 4の 3つの L鎖特異性および 4つの H鎖特異性のクローン、 および抗体 10. 1の 2つの L鎖特異性および 4 つの H鎖特異性のクローンはそれぞれ配列が同一であった。 図 10 (配列番号 1 及び 2) は抗体 1. 4の L鎖について、 図 11 (配列番号 3及び 4) は抗体 1, 4の H鎖について、 それぞれ可変領域の c DN A配列および推定アミノ酸配列を 示す。 また、 図 13 (配列番号 5及び 6) は抗体 10. 1の L鎖について、 図 1 4 (配列番号 7及び 8) は抗体 10. 1の H鎖について、 それぞれ可変領域の c DN A配列および推定アミノ酸配列を示す。 なお、 各図中、 CDR配列に対応す ると予想される配列には下線が付されている。 （抗体 4の L鎖の予想 CDR 配列は配列番号 9〜 1 1、 抗体 1. 4の H鎖の予想 C D R配列は配列番号 12〜 14、 抗体 10. 1の L鎖の予想 CD R配列は配列番号 15〜： L 7、 抗体 10.
1の H鎖の予想 CD R配列は配列番号 18〜20にそれぞれ示されている。 ）
(実施例 7) 抗体 1. 4および抗体 10. 1の H銷および L鎖可変領域アミノ 酸配列のヒト抗体アミノ酸配列とのホモロジ一検索
実施例 6で得られた抗体 1. 4及び抗体 10. 1の H鎖および L鎖可変領域の アミノ酸配列とホモロージーの高いヒト抗体を G e n B a n k、 EMBL、 SW
I SS— PROT、 P I R、 PRFデータベースより検索した。 ホモロジ一検索 は BLASTP 1. 4. 8MP (Altschul, S. F. et. al. J. Mol. Biol. , 21 5， 403-410(1990)) プログラムで実施した。 この結果、 抗体 1. 4は、 例えば P a g— 1抗体 (Hughes-Jones, N. C. et. al. Biochem. J. , 268, 135-140(1990)) や WE A抗体 （Goni, F. et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4837-4841(198 3)) 等と高いホモロジ一を有していることが判明した。 また、 抗体 1 0 . 1は例 えば、 I T H 5— 2抗体 （Chin, L. T.， et al.， I龍 unol. Letter, 44， 25-30(1995)) 、 I T C48抗体 (Ohlin, M. , et al. , Mol. Immunol. , 31. 983-991(1994)) 等と高いホモ 口ジーを有していることが判明した。 産業上の利用の可能性
本発明のモノクローナル抗体及びその一部分を含むタンパク質は、 ヒ 卜 I I型ホ スホリパーゼ A2と反応性であり、 強い阻害活性を持つ。 また、 サル及び Zまたは マウス血小板由来 I I型ホスホリパーゼ A2と交差反応性を示すので、 実験動物とし てのこれらの動物にも適用可能であり、 ヒ 卜に対する薬理効果を試験するに先だ つて、 予めサル、 マウスでの動物実験を行うことができるという利点がある。 ま た、 本発明のモノクローナル抗体及びその一部分を含むタンパク質は、 細胞に結 合した I I型ホスホリパーゼ A2酵素をはずすことができるので、 I I型ホスホリパー ゼ A2酵素に対して特に強 L、阻害活性を有するし、 補体及び Zまたはエフェクター 細胞の攻撃による副作用が生じないと考えられる。
本発明のモノクローナル抗体及びその一部分を含むタンパク質は、 ヒト I I型ホ スホリパーゼ A2がその病態の増悪化あるいはその原因の一部であることを示唆す る種々の疾患 （心筋梗塞、 脳梗塞、 急性腎不全、 喘息等のアレルギー性疾患、 慢 性関節炎リウマチ、 変形性関節症、 敗血症ショック、 脾炎、 乾せん症、 多臓器疾 患 （M0F) 、 Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) 、 クローン病および 潰瘍性大腸炎、 急性炎症前眼部炎症 （ぶどう膜炎） 、 新生児呼吸障害症候群 （RD S) 、 気管支肺異形成症 （BPD) 、 その他） の治療薬として使用されうる。 配列表
配列番号 ： 1
配列の長さ ： 393
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： cDNA to mRNA
起源
セルライン ： 1. 4
配列の特徴
特徴を表す記号 ： CDS
存在位置 ： 1 . . 393
特徴を決定した方法 ： E
配 列
ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC TGG GTT CCA 48 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
GGT TCC ACA GGT GAC ATT GTG CTG ACC CAA TCT CCA GCT TCC TTG GCT 96 Gly Ser Thr Gly Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
GTG TCT TTA GGG CAG AGG GCC ACC ATA TCC TGC AGA GCC AGT GAA AGT 144 Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr He Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
35 40 45
GTT GAT AGT TAT GGC ATT AGT TTT ATG CAC TGG TAT CAG CAG AAA CCA 192 Val Asp Ser Tyr Gly l ie Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro
50 55 60 GGA CAG CCC CCC AAA CTC CTC ATT TAT CGT GCA TCC AAC CTA GAA TCT 240 Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu l ie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
GGG ATC CCT GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT AGG ACA GAA TTC ACC 288 Gly l ie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Glu Phe Thr
85 90 95
CTC ACC ATT AAT CCT GTG GAG GCT GAT GAT GTT GCA ACC TAT CAC TGT 336 Leu Thr l ie Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr His Cys
100 105 110
CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAG TTG 384 Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
115 120 125
GAA ATA AAA 393 Glu l ie Lys
130 配列番号 ： 1
配列の長さ ： 131
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 1. 4
配 列
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu leu Trp Val Pro
1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr He Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
35 40 45
Val Asp Ser Tyr Gly lie Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro
50 55 60
Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu l ie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80
Gly He Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Glu Phe Thr
85 90 95
Leu Thr l ie Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr His Cys
100 105 110
Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu He Lys
130 配列番号 ： 3
配列の長さ ： 408
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： cDNA to mRNA
起源
セルライン ： 1. 4
配列の特徴 特徴を表す記号 ： CDS
存在位置 ： 1 . . 408
特徴を決定した方法 ： E
配 列
ATG AGA GTG CTG ATT CTT TTG TGG CTG TTC ACA GCC TTT CCT GGT TTC 48 Met Arg Val Leu l ie Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Phe
1 5 10 15
CTG TCT GAT GTG CAG CTT CAG GAA TCG GGA CCT GGC CTG GTG AAA CCT 96 Leu Ser Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
20 25 30
TCT CAA TCT CTG TCC CTC ACC TGC ATG GTC ACT GGC TAC TCA ATC ACC 144 Ser Gin Ser Leu Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Gly Tyr Ser l ie Thr
35 40 45
AGT GAT TAT GCC TGG AAC TGG ATC CGG CAG TTT CCG GGA AAC AAA CTG 192 Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp l ie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu
50 55 60
GAG CGG ATG GGA TAC ATA AGG TAC AGT GGT TAC ACT AGC TAC AAC CCA 240 Glu Arg Met Gly Tyr l ie Arg Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro
65 70 75 80
TCT CTC AAA AGT CGA ATC TTT ATC ACG CGA GAC ACA TCC CAG AAC CAG 288 Ser Leu Lys Ser Arg l ie Phe l ie Thr Arg Asp Thr Ser Gin Asn Gin
85 90 95
TTC TTC CTA CAT TTG ACT TCT GTG ACT ACT GAG GAC ACA GCC ACA TAT 336 Phe Phe Leu His Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
100 105 110 TAC TGT ACA AGA GAC TTG GAC GCC TGG TAC TTC GAT GTT TGG GGC GCA 384 Tyr Cys Thr Arg Asp Leu Asp Ala Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
115 120 125
GGG ACA ACG GTC ACC GTC TCC TCA 408 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 配列番号 ： 4
配列の長さ ： 136
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 1. 4
配 列
Met Arg Val Leu lie Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Phe
1 5 10 15
Leu Ser Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly leu Val Lys Pro
20 25 30
Ser Gin Ser Leu Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Gly Tyr Ser l ie Thr
35 40 45
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp l ie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu
50 55 60
Glu Arg Met Gly Tyr lie Arg Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro
65 70 75 80 Ser Leu Lys Ser Arg lie Phe He Thr Arg Asp Thr Ser Gin Asn Gin
85 90 95
Phe Phe Leu His Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Thr Arg Asp Leu Asp Ala Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
115 120 125
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 配列番号 ： 5
配列の長さ ： 381
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： cDNA to mRNA
起源
セルライン ： 10. 1
配列の特徴
特徴を表す記号 ： CDS
存在位置 ： 1 . . 381
特徴を決定した方法 ： E
配 列
ATG GAA TCA CAG ACT CTG GTC TTC ATA TCC ATA CTG CTC TGG TTA TAT 48 Met Glu Ser Gin Thr Leu Val Phe He Ser l ie Leu Leu Trp Leu Tyr
1 5 10 15 GGA GCT GAT GGG AAC ATT GTA ATG ACC CAA TCT CCC AAA TCC ATG TCC 96 Gly Ala Asp Gly Asn l ie Val Met Thr Gin Ser Pro Lys Ser Met Ser
20 25 30
ATG TCA GTA GGA GAG AGG GTC ACC TTG ACC TGC AAG GCC AGT GAG AAT 144 Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn
35 40 45
GTG GTT ACT TAT GTT TCC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GAG CAG TCT CCT 192 Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Gin Ser Pro
50 55 60
AAA CTG CTG ATA TAC GGG GCA TCC AAC CGG TAC ACT GGG GTC CCC GAT 240 Lys Leu Leu l ie Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GCA ACA GAT TTC ACT CTG ACC ATC AGC 288 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr l ie Ser
85 90 95
AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTT GCA GAT TAT CAC TGT GGA CAG GGT TAC 336 Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gin Gly Tyr
100 105 110
AGC TAT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA 381 Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu l ie Lys
115 120 125 配列番号 ： 6
配列の長さ ： 127
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状 配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 10, 1
配 列
Met Glu Ser Gin Thr Leu Val Phe l ie Ser l ie Leu Leu Trp Leu Tyr
1 5 10 15
Gly Ala Asp Gly Asn lie Val Met Thr Gin Ser Pro Lys Ser Met Ser
20 25 30
Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn
35 40 45
Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Gin Ser Pro
50 55 60
Lys Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr l ie Ser
85 90 95
Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gin Gly Tyr
100 105 110
Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu l ie Lys
115 120 125 配列番号 ： 7
配列の長さ ： 414
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状 配列の種類 ： cDNA to mRNA
起源
セルライン ： 10. 1
配列の特徴
特徴を表す記号 ： CDS
存在位置 ： 1 . . 414
特徴を決定した方法 ： E
配 列
ATG GCT GTC CTG GCA TTA CTT TTT TGC CTG GTA ACA TTC CCA AGC TGT 48 Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Phe し ys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys
1 5 10 15
ATC CTT TCC CAG GTG CAG CTG AAG GAG TCA GGA CCT GGC CTG GTG GCG 96 lie Leu Ser Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
20 25 30
CCC TCA CAG AGC CTG TCC ATC ACA TGT ACC GTC TCA GGG TTC TCA TTA 144 Pro Ser Gin Ser Leu Ser l ie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
ACC GAC TTT GGT GTA AAC TGG GTT CGC CAG CCT CCA GGA AAG GGT CTG 192 Thr Asp Phe Gly Val Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
GAG TGG CTG GGA ATG ATA TGG ACT GAT GGA ATC ACA GAC TAT AAT TCA 240 Glu Trp Leu Gly Met l ie Trp Thr Asp Gly He Thr Asp Tyr Asn Ser
65 70 75 80
GTT CTC AAA TCC AGA CTG AGC ATC AGC AAG GAC ACC TCC AAG AGC CAA 288 Val Leu Lys Ser Arg Leu Ser l ie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gin
85 90 95 GTT TTC TTG AAA ATG AAC AAT CTG CAA ACT GAT GAC ACA GCC AGG TAC 336 Val Phe Leu Lys Met Asn Asn Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr
100 105 110
TAC TGT GCC AGA GAT GCA TAC TAC GGC TTC TAT GCT ATG GAC TAC TGG 384 Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Tyr Tyr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
115 120 125
GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 414 Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135 配列番号 ： 8
配列の長さ ： 138
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 10. 1
配 列
Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys
1 5 10 15
lie Leu Ser Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
20 25 30
Pro Ser Gin Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Thr Asp Phe Gly Val Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60 Glu Trp Leu Gly Met lie Trp Thr Asp Gly l ie Thr Asp Tyr Asn Ser 65 70 75 80
Val Leu Lys Ser Arg Leu Ser l ie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gin
85 90 95
Val Phe Leu Lys Met Asn Asn Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Tyr Tyr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135 配列番号 ： 9
配列の長さ ： 15
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 1. 4
配 列
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly l ie Ser Phe Met His 1 5 10 15 配列番号 ： 10
配列の長さ ： 7
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状 配列の種類 ： タンパク質 起源
セルライン ： 1. 4
配 列
Arg Ala Ser Asn Leu Glu 5er
1 5 配列番号 ： 11
配列の長さ ： 9
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 1. 4
配 列
in Gin Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr 1 5 配列番号 ： 12
配列の長さ ： 6
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 1. 4 配 列
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5 配列番号 ： 13
配列の長さ ： 16
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 1. 4
配 列
Tyr lie Arg Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
配列番号 ： 14
配列の長さ ： 9
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 1. 4
配 列
Asp Leu Asp Ala Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 配列番号 ： 15
配列の長さ ： 11
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 10, 1
配 歹 IJ
Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser 1 5 10 配列番号 ： 16
配列の長さ ： 7
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 10. 1
配 列
Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5 配列番号 ： 17
配列の長さ ： 9
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状 配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 10. 1
配 列
Gly Gin Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 配列番号 ： 18
配列の長さ ： 5
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 1
配 列
Asp Phe Gly Val Asn
1 5 配列番号 ： 19
配列の長さ ： 16
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 10. 1 配 列
Met lie Trp Thr Asp Gly He Thr Asp Tyr Asn Ser Val Leu Lys Ser
1 5 10 15 配列番号 ： 20
配列の長さ ： 11
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
起源
セルライン ： 10. 1
配 列
Asp Ala Tyr Tyr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10 配列番号 ： 21
配列の長さ ： 22
配列の型 ： 核酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A
配 列
GGCACCTCCA GATGTTAACT GC 22 配列番号 ： 22
配列の長さ ： 20
配列の型 ： 核酸 トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A
配 列
GAARTAVCCC TTGACCAGGC 20 配列番号 ： 23
配列の長さ ： 48
配列の型 ： 核酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A
配列の特徴
存在位置 ： 36， 37， 41, 42， 46, 47
その他の特徴 ： Nはイノシン（I )を表す。
配 列
CUACUACUAC UAGGCCACGC GTCGACTAGT ACGGGNNGGG NNGGGNNG 48 配列番号 ： 24
配列の長さ ： 46
配列の型 ： 核酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A
配 列
TATAGAGCTC AAGCTTGGAT GGTGGGAAGA TGGATACAGT TGGTGC 46
配列番号 ： 25
配列の長さ ： 50 配列の型 ： 核酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 合成 DNA
配 列
TATAGAGCTC AAGCTTCCAG TGGATAGACH GATGGGGSTG TYGTTTTGGC 50 配列番号 ： 26
配列の長さ ： 20
配列の型 ： 核酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 合成 DNA
配 列
ACCGAGCTCG GATCCACTAG 20 配列番号 ： 27
配列の長さ ： 21
配列の型 ： 核酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 他の核酸 合成 DNA
配 列
ATGCATGCTC GAGCGGCCGC C 21

Claims

請求の範囲
1 . ヒト由来 I I型ホスホリパーゼ A2の活性を阻害し、 かつサル由来 I I型ホスホリ パーゼ A2及びノまたはマウス由来 I I型ホスホリパーゼ A2の活性を阻害することが できるモノクローナル抗体、 またはその一部分を含み該阻害能を有するタンパク 質。
2 . 細胞膜に結合した I I型ホスホリパーゼ A2を遊離する作用を有するモノクロ一 ナル抗体、 またはその一部分を含む該作用を有するタンパク質。
3 . ホスホリパ一ゼ A2がヒ 卜由来である請求の範囲 2記載のモノクローナル抗体 または夕ンパク質。
4 . ヒト由来 I I型ホスホリパーゼ A2の活性を阻害し、 かつサル由来 I I型ホスホリ パーゼ A2及び Zまたはマウス由来 I I型ホスホリパーゼ A2の活性を阻害することが でき、 かつ細胞膜に結合した I I型ホスホリパーゼ A2を遊離する作用を有するモノ クローナル抗体、 またはその一部分を含み該作用を有するタンパク質。
5 . ハイプリ ドーマ 12H5 (FERM BP-5300) 、 ハイプリ ドーマ 1. 4 (FERM BP-5297) またはハイプリ ドーマ 10. 1 (FERM BP- 5298) のいずれかにより産生されるモノク ローナル抗体もしくはその一部分を含む夕ンパク質、 またはそれらと同等の I I型 ホスホリパーゼ A2に対する作用を有するモノクローナル抗体もしくはその一部分 を含むタンパク質。
6 . 配列番号 2、 4、 6または 8のいずれかに示されるアミノ酸配列または該ァ ミノ酸配列に含まれる 1つまたは複数のァミノ酸に対しアミノ酸の置換、 欠失ま たは挿入を行ったアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、 請求の範囲 1または 2に記載のモノクローナル抗体、 またはその一部分を含むタンパク質。
7 . 配列番号 9〜 2 0のいずれかに示されるァミノ酸配列または該ァミノ酸配列 に含まれる 1つまたは複数のアミノ酸に対しァミノ酸の置換、 欠失または挿入を 行ったァミノ酸配列を有する夕ンパク質を含む、 請求の範囲 1または 2に記載の モノクローナル抗体、 またはその一部分を含むタンパク質。
8. 請求の範囲 1〜7のいずれかに記載のモノクローナノレ抗体またはタンパク質 を産生する細胞。
9. ハイプリ ドーマである請求の範囲 8記載の細胞。
10. 組換え DNAによって形質転換された細胞である請求の範囲 8記載の細胞。
1 1. 請求の範囲 8記載の細胞を培養し、 培養上清からモノクローナル抗体また は夕ンパク質を回収する工程を含む、 請求の範囲 1〜 7のいずれかに記載のモノ クローナル抗体またはタンパク質を製造する方法。
12. 請求の範囲 1〜 7のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはタンパク 質をコ一ドする DNA。
13. 配列番号 1、 3、 5または 7のいずれかに示される塩基配列または該塩基 配列に含まれる 1つまたは複数の塩基に対し塩基の置換、 欠失または挿入を行つ た塩基配列を含む、 請求項 12に記載の DNA。
14. 請求の範囲 12または 13の DN Aを含む組換えベクター。
15. 請求の範囲 1〜 7のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはタンパク 質と薬剤学的に許容される担体とからなる医薬組成物。
16. 請求の範囲 1〜 7のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはタンパク 質を含む II型ホスホリノ、。一ゼ A2阻害剤。
PCT/JP1995/002714 1994-12-29 1995-12-27 Nouvel anticorps monoclonal ayant un effet inhibiteur sur la phospholipase a2 de type ii, et proteine contenant une partie de cet anticorps WO1996020959A1 (fr)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NZ298145A NZ298145A (en) 1994-12-29 1994-12-29 Monoclonal antibodies having inhibitory effect on type ii phospholipase a2, proteins forming part thereof, cells producing them, dna encoding them, recombinant vector comprising the dna and medicament
KR1019970702456A KR970707162A (ko) 1994-12-29 1995-12-27 II종 포스포리파제 A2 저해작용을 갖는 신규한 모노클로날 항체 및 그 일부를 포함하는 단백질(Novel monoclonal antibody having inhibitory effect on type II phospholipase A2 and protein containing a part of the same)
AU43554/96A AU4355496A (en) 1994-12-29 1995-12-27 Novel monoclonal antibody having inhibitory effect on type ii phospholipase a2 and protein containing a part of the same
EP95942277A EP0799836A1 (en) 1994-12-29 1995-12-27 Novel monoclonal antibody having inhibitory effect on type ii phospholipase a2 and protein containing a part of the same
FI972754A FI972754A (fi) 1994-12-29 1997-06-26 Uusi monoklonaalinen vasta-aine, jolla on tyypin II fosfolipaasia A2 inhiboiva aktiivisuus, ja tämän osan sisältävä proteiini
MXPA/A/1997/004879A MXPA97004879A (en) 1994-12-29 1997-06-27 Announcing monoclonal antibody that has an inhibitory activity against types ii type ii phospholipase and protein that comprises a part of my
NO973026A NO973026L (no) 1994-12-29 1997-06-27 Nye monoklonale antistoffer med virksom inhibitorisk aktivitet mot type II-fosfolipase A2 og proteiner omfattende en del derav

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997049427A1 (fr) * 1996-06-27 1997-12-31 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Medicament permettant d'attenuer les problemes renaux
EP1084108A4 (en) * 1998-05-01 2005-01-12 Lilly Co Eli SPLA 2 INHIBITORS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
US8158127B2 (en) 2003-09-22 2012-04-17 Pentracor Gmbh Compounds for neutralizing the effects of secreted PLA2 IIA

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6197582B1 (en) 1998-03-18 2001-03-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Development of human monoclonal antibodies and uses thereof
AU2001229252A1 (en) * 2000-03-09 2001-09-17 Eli Lilly And Company Method for the treatment of renal dysfunction with spla2 inhibitors
US7060802B1 (en) 2000-09-18 2006-06-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tumor-associated marker
DE10219545A1 (de) * 2002-04-26 2003-11-06 Lang Florian Regulation der Apoptose
US20090191213A9 (en) 2003-07-02 2009-07-30 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for regulating NK cell activity
MXPA05013923A (es) 2003-07-02 2006-08-11 Univ Genova Anticuerpos nk receptores de pan-kir2dl y su utilizacion en diagnostico y terapia.
WO2006003179A2 (en) 2004-07-01 2006-01-12 Novo Nordisk A/S Antibodies binding to receptors kir2dl1, -2, 3 but not kir2ds4 and their therapeutic use
AU2007274738B2 (en) * 2006-07-18 2013-11-28 Sanofi-Aventis Antagonist antibody against EphA2 for the treatment of cancer
EP2581388A1 (en) * 2011-10-14 2013-04-17 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Anti-sPLA2-V antibodies and uses thereof
EP2832747A1 (en) * 2013-08-01 2015-02-04 Université Catholique de Louvain Anti-GARP protein and uses thereof
MX2016001356A (es) 2013-08-01 2016-10-26 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Proteina anti-garp y sus usos.
US10371705B2 (en) 2014-11-06 2019-08-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Atomic description of immune complex that causes heparin-induced thrombocytopenia
GB201707561D0 (en) 2017-05-11 2017-06-28 Argenx Bvba GARP-TGF-beta antibodies
CN108840918B (zh) * 2018-06-14 2021-07-23 浙江农林大学 Pla2抑制剂编码基因的克隆方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63258898A (ja) * 1987-04-15 1988-10-26 Shionogi & Co Ltd ヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼に対するモノクロ−ナル抗体、その製造法、該モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マおよび該モノクロ−ナル抗体を用いたヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼の測定方法
JPH0436193A (ja) * 1990-05-30 1992-02-06 Shionogi & Co Ltd 膜型ホスホリパーゼａ↓２を認識するモノクローナル抗体および膜型ホスホリパーゼａ↓２の免疫測定法
JPH07109300A (ja) * 1993-10-13 1995-04-25 Teijin Ltd ヒトｉｉ型ホスホリパーゼａ２と結合する抗体

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63258898A (ja) * 1987-04-15 1988-10-26 Shionogi & Co Ltd ヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼に対するモノクロ−ナル抗体、その製造法、該モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マおよび該モノクロ−ナル抗体を用いたヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼の測定方法
JPH0436193A (ja) * 1990-05-30 1992-02-06 Shionogi & Co Ltd 膜型ホスホリパーゼａ↓２を認識するモノクローナル抗体および膜型ホスホリパーゼａ↓２の免疫測定法
JPH07109300A (ja) * 1993-10-13 1995-04-25 Teijin Ltd ヒトｉｉ型ホスホリパーゼａ２と結合する抗体

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., (1990), Vol. 167, No. 3, TAKAYAMA K. et al., "Monoclonal Antibodies Against Human Synovial Phospholipase A2", pages 1309-1315. *
J. CLIN. BIOCHEM. NUTR., (1991), Vol. 11, No. 2, MISAKI A. et al., "Production and Characterization of Monoclonal Antibodies Against Human Pancreatic Phospholipase A2", pages 79-90. *
J. IMMUNOL. METHODS, (1991), Vol. 145, Nos 1 to 2, STORNER C.R. et al., "Human Group II Phospholipase A2 Characterization of Monoclonal Antibodies and Immunochemical Quantitation of the Protein in Synovial Fluid", pages 127-136. *
METHODS ENZYMOL., (1991), Vol. 197, MURAKAMI M. et al., "Preparation of Antibodies to Phospholipase A2", pages 223-233. *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997049427A1 (fr) * 1996-06-27 1997-12-31 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Medicament permettant d'attenuer les problemes renaux
EP1084108A4 (en) * 1998-05-01 2005-01-12 Lilly Co Eli SPLA 2 INHIBITORS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
US8158127B2 (en) 2003-09-22 2012-04-17 Pentracor Gmbh Compounds for neutralizing the effects of secreted PLA2 IIA

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