SK13542000A3 - Fragmenty chitinázy viažuce chitín - Google Patents

Fragmenty chitinázy viažuce chitín Download PDF

Info

Publication number
SK13542000A3
SK13542000A3 SK1354-2000A SK13542000A SK13542000A3 SK 13542000 A3 SK13542000 A3 SK 13542000A3 SK 13542000 A SK13542000 A SK 13542000A SK 13542000 A3 SK13542000 A3 SK 13542000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
chitinase
chitin
polypeptide
seq
amino acid
Prior art date
Application number
SK1354-2000A
Other languages
English (en)
Inventor
Patrick W. Gray
Larry W. Tjoelker
Original Assignee
Icos Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Icos Corporation filed Critical Icos Corporation
Publication of SK13542000A3 publication Critical patent/SK13542000A3/sk

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56961—Plant cells or fungi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Description

Oblasť techniky
Obecne možno povedať, že vynález popisuje materiály zahŕňajúce chitín-väzobné fragmenty ľudskej chitinázy a analógy týchto fragmentov. Presnejšie potom, vynález popisuje novo purifikované a izolované polynukleotidy kódujúce tieto fragmenty, ďalej fragmenty chitinázy kódované týmito polynukleotidy, materiály a spôsobmi prípravy týchto fragmentov chitinázy rekombinantnými technikami a terapeutické a diagnostické využitie týchto fragmentov chitinázy.
Doterajší stav techniky
Chitín je lineárny homopolymér tvorený Nacetylglukózamínovými zvyšky spojenými β—(1,4) väzbou. Tento polysacharid je po celulóze druhou najčastejšie sa vyskytujúcou organickou látkou. Z chitínu je napríklad exoskelet členovcov. Chitín je taktiež obsažený v bunečných stenách cu- dzopasných húb a iných patogénov, kde hraj e významnú štruk- túrnu a ochranú rolu. Narušenie bunečnej steny a membrány cudzopasných húb je účinnou terapeutickou stratégiou používa- nou proti týmto cudzopasným hubám a patogénom. Antifungálna aktivita amfotericínu B a flukonazolu je napríklad založená na ovplyvnení steroidov v membránach buniek. Aj cez to, že existujú antifungálne terapeutiká, pliesňové infekcie sú v poslednej dobe zodpovedné za výskyt porúch ohrozujúcich životy ludí (viď. Georgopapadakou a ďalší, Trends Microbiol., 3:98 až 104, 1995). Medzi patogény vyvolávajúce vyššie spomínané ochorenia patrí predovšetkým zástupcovia rodov Candida, Aspergillus, Cryptococcus, • · • · · • · · • · • · ··
·· · • · · • · · · • ····· • · · ·· · • · • · · • · • · · • · ·· ·
Histoplasma, Coccidiodides a Pneumocystis. Tieto patogénové sú obzvlášť nebezpečné pre jedince s oslabeným imunitným systémom, ako napríklad pre pacienty postižené AIDS, pacienty podstupujúci liečbu chemoterapeutikami a imunosuprimované pacienty po transplantácii orgánov.
Chitín môže být degradovaný chitinázou. Chitinázy sú produkované rastlinami, mikroorganizmy aj živočíchy. Bakteriálna chitináza napríklad pomáha dodávať zdroj uhlíka nezbytný pro rást baktérií. Hmyz produkuje chitinázu za účelom degradácie kutikuly pri raste. U rastlín pravdepodobne hrá chitináza dôležitú úlohu pri ochrane proti patogénnym hubám. Chitinázy boli klonované z velkého počtu rôznych druhov baktérií (napríklad Serratia marcescens, Heitz a ďalší, EMBO J., 5:467 až 473, 1986), rastlín (napríklad tabáku, Heitz a ďalší, Mol. Gen. Genet., 245:246 až 254, 1994) a hmyzu (napríklad vôs, Krishnan a ďalší, J. Biol. Chem., 269:20971 až 20976, 1994) a na základe sekvenčnej analógie boli rozdelené do dvoch skupín označovaných ako rodina 18 a rodina 19 (Henrissat a Bairoch, Biochem. J., 293:781 až 788, 1993).
Ačkolvek je katalytická oblasť medzi zástupcami rodiny 18 medzidruhovo konzervovaná, medzidruhová sekvenčná homológia v chitín-väzobné doméne je minimálna. Jediným znakom spoločným pre chitín-väzobné domény u chitináz rodiny 18 je výskyt niekolkých cysteinových zvyškov.
U cicavcov bolo identifikované niekolko proteínov s nízkym stupňom homológie k bakteriálnym, hmydzím a rástlinným chitinázám (menej ako 40% identita aminokyselín). Takými proteíny sú napríklad ludský gp-39 chrupaviek (C-gp-39; Hakala a ďalší, J. Biol. Chem., 268:25803 až 25810., 1993), ludský glykoproteín YKL-40 (Johansen a ďalší, Eur. J. Cancer, 31A:1437 až 1442, 1995), estrogénom indukovaný proteín ·· • · ···· • · · ·· ·· ·· · • · ··· • t
špecificky exprimovaný vo vajcovodoch ovci, hovädzieho dobytka a ludí (DeSouza a ďalší, Endocrinology, 136:2485 až 2496, 1995) a sekretovaný proteín aktivovaných mýšich makrofágov (Chang a ďalší, Genbank M94584). U týchto proteínov nebola nicmenej popísaná schopnosť degradovať chitín. Funkcie týchto proteínov nie je známa, ale predpokládá sa, že hrajú úlohu pri remodelingu tkání. Hakala a ďalší (viď. vyššie) poísali, že proteín C-gp39 možno detekovať vo vzorkoch synovia a chrupaviek pacientov postižených reumatickou artritídou, ale nie vo vzorkoch odobraných z organizmu zdravých jedincov. Recklies a ďalší (Arthritis Rheumatism, 36(9Suppl.):S190, 1993) popisujú lokalizáciu C-gp39 v jednotlivých bunkách tvoriacich povrchovoú vrstvu chrupavky. Johansen a ďalší (viď. vyššie) udávajú, že sérová koncentrácia YKL-40 môže slúžiť ako prognostický marker rozsahu metastáz a prežívania pacientov s recidivujúcimi nádory pŕs.
Escott a ďalší (Infec. Immun., 63:4770 až 4773, 1995) preukázali chitinázú aktivitu v ľudských leukocytoch a v séru. Overdijk a ďalší (Glycobiology, 4:797 až 803, 1994) popisujú izoláciu chitinázy (hydrolázy metylumbelliferyl- tetra-Nacetylchitotetraozidu) z ľudského séra a potkanej pečene. Renkema a ďalší (J. Biol. Chem., 270:2198 až 2202, február 1995) izolovali ľudskú chitotriozidázu ze sleziny pacientov postižených Gaucherovým ochorením. Tento izolát vykazoval chitinázovú aktivitu a v spomínanom článke je uvedená časť aminokyselinové sekvencie proteínovej zložky izolátu (22 koncových aminokyselín a 21 áminokyselinových zvyškov z fragmenta získaného štiepením trypsínom). Funkcie ľudskej chitinázy je taktiež neznáma, ale v tomto článku bola naznačenaámožná súvislosť s patofyziológiou Gaucherova ochorení. Neskoršia práca publikovaná rovnakou skupinou (Boot a ďalší, J. Biol. Chem., 270(44):26252 až 26256, november
1995) popisuje klonovanie cDNA z ludských makrofágov kódujúci produkt s chitinázovou aktivitou. Čiastočná aminokyselinová sekvencia uvedená v publikácii tejto skupiny z februára 1995 (viď. vyššie) se zhoduje s časťou predpokladanej amínokyselinovej sekvencie produkta cDNA z ludských makrofágov. Taktiež medzinárodná prihláška W096/40940 popisuje dve rozdielne ludské cDNA kódujúce produkty s chitotriozidázovou aktivitou o velkosti 50 kDa a 39 kDa, kde obaja tieto produkty sú enzymaticky aktívne. Renkema a ďalší (Eur. J. Biochem., 244:279 až 285, 1997) popisuje skutočnosť, že ludská chitináza je v makrofázach najprv produkovaná ako 50 kDa proteín, ktorý je následne z časti procesovaný na 39 kDa formu, ktorá je akumulovaná v lysozómeoch. V tejto publikácii je taktiež uvedené, že alternatívnym zostrihom je produkovaná mRNA kódujúca chitinázu o velkosti 40 kDa. Ako 39 kDa, tak 40 kDa izo-formy sú pravdepodobne skrácené na C-konci a vyznačujú sa úplnou chitinázovou aktivitou, ale iba slabou väzbou chitínu.
Vzhladom ku zvyšujúcemu sa výskytu pliesňových ochorení ohrozujúcich život jedincov s oslabeným imunitným systémom je žiadúce identifikovať nové látky a spôsoby použitelné k diagnostike a liečbe týchto ochorení.
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález popisuje novo purifikované a izolované polynukleotidy (t. j. DNA a RNA, ako kódujúce ako antikódujúce vlákna) kódujúce fragmenty lidské chitinázy a j ej ich analogy, kde tyto fragmenty alebo analógy majú chitínväzobnú aktivitu, ale postrádajú chitinázovú aktivitu. Vynález • · ·· ··· · · • · ·· ·
• · ·· • · · · • · · · · • * ···· · · • · · · ·· ·· · ·· · ďalej popisuje prípravu takých fragmentov rekombinantnými technikami, farmaceutické prípravky zahŕňajúce tieto fragmenty a diagnostické a terapeutické látky konjugované s týmito fragmentárni. Predpokládá sa, že tieto fragmenty konjugované s diagnostickými alebo terapeutickými lát- kami budú použiteľné k detekcii chitínu, väzbe chitínu a liečbe pliesňových infekcií alebo k vývoju produktov využiteľných k liečbe pliesňových ochorení.
Nukleotidové sekvencie dvoch Ľudských cDNA kódujúcich predpokládané alelícke varianty ludskej chitinázy, vrátane nekódujúcich 5' a 3’ sekvencii, sú uvedené ako SEK. ID.
Č.: la SEK. ID. Č.: 3. Kódujúcu oblasť pre ľudskú chitinázu odpovedá v SEK. ID. Č.: 1 nukleotídom 2 až 1399 a v SEK. ID.
Č.: 3 nukleotídom 27 až 1424. Predpokládaná kódujúca sekvencia matúrnej ľudskej sekretovanej chitinázy bez signálnej sekvencie odpovedá nukleotídom 65 až 1399 v SEK. ID.
Č.: la nukleotídom 90 až 1424 v SEK. ID. Č.: 3. Aminokyselinové sekvencie polypeptidov kódovaných DNA popísanými SEK. ID. Č.: 1 a SEK. ID. Č.: 3 sú uvedené ako SEK. ID. Č.:
2, respektíve SEK. ID. Č.: 4. Dvadcať jeden N-koncových aminokyselín (v SEK. ID. Č.: 2 a 4 na pozíciách -21 až -1) tvoria signálny peptid, ktorý je odštiepený za vzniku matúrnej ludské chitinázy (v SEK. ID. Č.: 2 a 4 odpovedá aminokyselinám 1 až 445) . Bylo zistené, že 72 C-koncových aminokyselínových zvyškov ľudskej chitináze nie je nezbytných pre chitinázovú aktivitu. Príklad 5 popisuje produkciu Nkoncového fragmenta ľudskej chitinázy, ktorý je na C-konci skrátený o 72 aminokyselín. Dôsledkom zavedenia stop kodónu za kodón pre aminokyselinu 373 je produkcia rekombinantného fragmenta chitinázy o veľkosti 39 kDa, ktorý si, vzhľadom neskrátenej k rekombinantnej ludskej chitináze, zachováva podobnú špecifickú chitinázovú aktivitu. Klonovanie cDNA
·· • · ·· kódujúcej ludskú chitinázu a jej expresie a biologické aktivity rekombinantnej ľudskej chitinázy sú detailne popísané v prihláške US 08/877599, podanej 16. júna, 1997, ktorá nadväzuje na prihlášku US 08/663618, podanou 14. júna, 1996. Obe tieto prihlášky sú zde uvedené zámenou za prenesenie ich celého obsahu do popisu tohto vynálezu.
Podstatou predkladaného vynálezu je neočekávane zistenie, že takmer všetka chitín-väzobná aktivita ľudskej chitinázy je situovaná v 99 C-koncových aminokyselinách zo 445 aminokyselín intaktného enzýmu. Vynález špecificky popisuje polypeptidové produkty viazače chitin, ale postrádající chitinázovú aktivitu. Ve výhodnom provedeni vynálezu sa jedná o fragmenty obsahujúci chitín-väzobnú časť, ktorá zahŕňa 54 aminokyselín na C-konci ľudskej chitinázy. Takými fragmentárni sú napríklad fragment zahŕňajúci približne 99 aminokyselín z C-konca ludskej chitinázy (približné aminokyselínové zvyšky 347 až 445 v SEK. ID. Č.: 2), fragment zahŕňajúci približné 72 aminokyselín z C-konca ludskej chitinázy (približne aminokyselínové zvyšky 374 až 445 v SEK. ID. Č.: 2), fragment zahŕňajúci približné 54 aminokyselín z C-konca ludskej chitinázy (približné aminokyselínové zvyšky 392 až 445 v SEK. ID. Č.: 2) a fragment zahŕňajúci približné 49 aminokyselín z C-konca Ľudskej chitinázy (približné aminokyselínové zvyšky 397 až,445 v SEK. ID. Č.: 2). Vynález taktiež popisuje purifikované, izolované polynukleotídy vrátane DNA kódujúcej vyššie uvedené polypeptidové fragmenty; vektory zahŕňajúce také DNA, obzvlášť pak expresívne vektory, kde sú tieto DNA funkčne spojené so sekvenciou umožňujúcou ich expresiu; hostitelské bunky stabilne transformované alebo transfekované vyššie spomínanými DNA tak, že v týchto hostiteľských bunkách je umožnéná expresia fragmentov ludskej chitinázy; spôsoby produkcie polypeptidových fragmenov ludskej chitinázy ·· • · • · · • · · · ·· ·· • · · · · • ···:·; • · · · ·· ·· • · · 1 • ···· · · • · · zahŕňajúce kultiváciu spomínaných hostitelských buniek v živnom médiu a izolácii uvedených polypeptidov z hostitelských buniek alebo kultivačného média; purifikované, izolované polypeptidy produkované týmto spôsobom; fúzne proteíny zahŕňajúce vyššie spomínané polypeptidy spojené s nejakým heterelógnym peptidom alebo polypeptidom, vrátane nejakého enzýmu ako napríklad sekretované alkalické fosfatázy (SEAP); prípravky zahŕňajúce vyššie spomínané ľudské polypeptidové fragmenty; prípravky zahŕňajúce polypeptidové fragmenty ľudskej chitinázy konjugovanej s nejakou antifungálnou látkou a zpôsoby liečby pliesňových ochorení aplikáciou týchto prípravkov, voliteľne aplikáciou spolu s antifungálnymi látkami neobsahujúcimi fragmenty chitinázy; prípravky zahŕňajúce polypeptidové fragmenty chitinázy konjugované s detekovatelnou značkou (vrátane rádioizotopov, fluórofórov, barvív, elektrondenzných zlúčenín a enzýmov); spôsoby použitia téchto prípravkov k detekcii výskytu a množstva chitínu v nejakej vzorke, kde tieto spôsoby zahŕňajú nasledujúce kroky: (a) kontakt spomínanej vzorky s polypeptidovým fragmentom ľudskej chitinázy konjugovanej s detekovatelnou značkou a (b) stanovenie množstva označeného fragmentu naviazaného na chitín; súpravy pre diagnostiku prítomnosti chitínu vo vzorkoch; monoklonálne protilátky, ktoré špecificky interagujú s chitín-väzobným fragmentom ľudskej chitinázy postrádajúcej chitinázovou aktivitu, vrátane protilátok špecificky interagujúcich s epitópom v oblasti 54 C-koncových aminokyselinových zvyškov ľudskej chitinázy o sekvencii uvedenej ako SEK.
LD. Č.: 2; a výhodné používané monoklonálne protilátky 243Q a 243M a protilátky, ktoré kompetujú s alebo se viažú k rovnakým epitópom ako protilátky 243Q a 243M.
Polypeptidové fragmenty chitinázy podľa vynálezu zahŕňajú fragmenty ľudské chitinázy alebo ich alelíckej varianty, ktoré ·· ·· ·· · » · · · · · · Ä · · · · · · · · ·
B · ··· · · · ···· · · ·· ·· se vyznačujú tým, že si zachovávajú chitin-väzobnú aktivitu, ale postrádajú chitinázovú aktivitu, analógy týchto fragmentov a fúzne proteíny zahŕňajúce tieto fragmenty alebo analógy. Polypeptidové fragmenty chitinázy sú využiteľné v terapeutických a diagnostických aplikáciách popísaných v ďalšom texte.
* Fragmenty chitín-väzobné domény”, ktoré spadajú do rozsahu vynálezu, sú v SEK. ID. Č. : 2 reprezentované amínokyselinovými zvyšky od X po Y, kde X zahŕňa všetky celé čísla v intervalu 347 až 397 a Y je 445. Do rozsahu vynálezu taktiež spadajú časti vyššie uvedených fragmentov, ktoré si uchovávajú chitin-väzobnú aktivitu. Jedným z výhodne používaných fragmentov je fragment zahŕňajúci 99 C-koncových aminokyselín, ludskej chitinázy (aminokyselinové zvyšky 347 až 445 v SEK. ID. Č.: 2); v príklade 7 (viď. nižšie) bylo preukázané, že tento fragment si zachováva 80% chitín-väzobné aktivity matúrnej chitinázy. Výhodnejšie používanými fragmentárni sú potom fragment zahŕňajúci 54 C-koncových aminokyselín ludskej chitinázy (aminokyselinové zvyšky 392 až 445 v SEK. ID. Č. : 2) a fragment zahŕňfejúci 49 C-koncových aminokyselín ludskej chitinázy (aminokyselinové zvyšky 397 až 445 v SEK. ID. Č.: 2), ktoré majú taktiež zachovanú chitinväzobnú aktivitu (viď. príklad 7). Príklad 7 ukazuje, že fúzny * proteín zahŕňajúci 99 C-koncových aminokyselín ľudskej chitinázy obsahuje doménu odpovednú za väzbu chitínu. Hranice tejto chitín-viazajúcej domény boli presnejšie definované skracovaním spomínanej 99-ti aminokyselinové oblasti ako z Nkonca, tak z C-konca, a meraním chitín-väzobné aktivity fúznych proteínov zahŕňajúcich takto skrátené úseky. Medzi tieto skrátené úseky patria aminokyselinové reťazce s Nkoncom začínajúcom aminokyselinovým zvyškom 347, 374, 392,
• · · • · • · • · ·· ·
395, 397, 400 alebo 409 a na C-koncu ukončené aminokyselinovým zvyškom 431, 443 alebo 445.
Analógy môžu zahŕňať analógy fragmentov chitinázy, u ktorých je jedna alebo viacej špecifikovaných (t.j prirodzene sa vyskytujúcich) aminokyselín odstránené alebo nahradené, alebo do ktorých je pridaná jedna alebo viacej nešpecifikovaných aminokyselín: (1) bez straty, jednej, alebo viacej biologických aktivít (vrátane schopnosti viazať chitín) alebo imunologických charakteristík špecifických pre chitinázu; alebo (2) za účelem potlačenia (odstránenia) príslušnej biologickej aktivity chitinázy. Predpokládá sa, že konzervatívne aminokyselinové zámeny (ako sú v súčasnosti chápané) môžu byť provedené bez akéhokoľvek ovplyvnenia biologickej aktivity príslušného fragmentu.
Výhodne používanými sekvenciami DNA podľa vynálezu sú sekvencie genómovej DNA alebo cDNA a taktiež sekvencie DNA zcela alebo čiastočné pripravené chemickou syntézou, ktoré kódujú fragmenty ľudskej chitinázy s chitín-väzobnou aktivitou, ale postrádajúcu chitinázovú aktivitu, ich analógy a fúzne proteíny zahŕňajúce tieto fragmenty alebo analógy. Jednou z výhodne používaných nukleotidových sekvencii je sekvencie kódujúca v SEK. ID. Č.: 2 aminokyselinové zvyšky od X po Y, kde X zahŕňa všetky celé čísla v intervalu 347 až 397 a Y je 445. Zvlášte výhodnou sekvenciou DNA je sekvencia nukleotidov 1238 až 1399 v SEK. .ID. Č.: 1 (kódujúce aminokyselinové zvyšky 92 až 445 v SEK. ID. Č.: 2). Do rozsahu vynálezu spadá vyššie spomínaná sekvencia DNA a ďalšej sekvencie DNA, ktoré za štandardných podmienok hybridizujú s antikódujúcim vláknom vyššie uvedenej sekvencie DNA, alebo ktoré v dôsledku degenerácie genetického kódu s touto sekvenciou nehybridizují, a ktoré kódujú fragmenty chitinázy s ·’··· : : ::. : : ’ : :·..... ....· ·; :
·..· ..· ’·· · ·· ·
I chitín-väzobnou aktivitou. Príkladom štandardných hybridizačných podmienok sú podmienky: hybridizácia pri 42°C v 50% formamidu a premytie pri 60°C roztokom 0,1 x SSC, 0,1% SDS. Odborníkom je zrejmé, že uvedené hybridizačné podmienky môžu byť zmenené v závislosti na sekvencii a zastúpenie CG párov, štandardných hybridizačných podmienok sú uvedené napríklad v publikácii Sambrook a další, 9.47 až 9.51, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989.
dĺžke hybridizovaných Vzorce pre výpočet
Polynukleotidy podlá vynálezu môžu byť použité ako hybridizačné sondy k identifikácii a izolácii genómových DNA a cDNA kódujúcich chitín-viazajúce oblasti proteínov homológnych k ludskej chitináze; a k identifikácii buniek exprimujúci chitín-viazajúce biologických podmienok, pri exprimované.
časti takých proteínov a ktorých sú tieto proteíny
Ďalšia stránka vynálezu se týka biologických replík (tj. kópií izolovaných sekvenciou DNA pripravených in vitro alebo in vivo) sekvenciou DNA podía vynálezu. Vynález popisuje autonómne sa replikujúce rekombinantnej konštrukty ako napríklad plazmidy a vírové vektory zahŕňajúce polynukleotidy kódujúce fragmenty ludskej chitinázy s chitín-väzobnou aktivitou, vrátane akékoľvek z DNA popísaných vyššie. Medzi výhodne používané vektory patria expresívne vektory, ktoré obsahujú cDNA kódujúce fragmenty chitinázy funkčne spojené s nejakou endogénnou alebo heterológnou sekvenciou riadiacou expresiu a neakým terminátorom transkripcie. Tieto expresívne vektory môžu ďalej obsahovať sekvencie DNA kódujúce polypeptidy, kde tieto sekvencie DNA sú funkčne spojené so sekvenciami DNA kódujúcimi fragmenty chitinázy tak, že ·· ·· • · · • · · • · • · ·· ··· · ·· ·· · • · · • · · · • · ···♦ • · · ·· • · · • · ♦ · · • · ·« s,využitím týchto vektorov je možné exprimovať neaký fúzny proteín obsahujúci požadovaný polypeptid.
Ďalšia stránka vynálezu se týka prokaryotíckych alebo eukaryotíckych hostiteľských buniek stabilne transfekovaných alebo transformovaných polynukleotidovými sekvenciami podlá vynálezu tak, že tieto bunky umožňujú expresiu požiadovaného produktu zahŕňajúceho fragment chitinázy. Hostiteľské bunky exprimujúce fragmenty chitinázy môžu byť použité k mnohá účelom. Tieto bunky sú cenným zdrojom imunogénom použiteľných k príprave protilátok špecificky reagujúcich s chitinázou. Hostiteľské bunky podľa vynálezu sú použiteľné pre produkciu fragmentov chitinázy ve veľkom merítku tým, že tieto bunky sú kultivované vo vhodnom kultivačnom médiu a požadované polypeptidové produkty sú z buniek alebo kultivačného média izolované napríklad imunoafinítnou purifikáciou.
Znalosť sekvencií DNA kódujúcich časť ľudskej chitinázy viažiacej chitín umožňuje modifikáciu buniek tak, aby exprimovali tieto chitín-vázebnej časti alebo aby bola expresia týchto častí zvýšená. Vložením časti alebo kompletného heterologneho promotóra do vhodného miesta vnútri génu pre chitinázu môže byť u takto modifikovaných buniek (napríklad homológnou rekombináciou) dosiahnuté zvýšenie expresie chitín-väzebné časti ludskej chitinázy. Tento heterológny promotor je do génu vložený tak, aby bol funkčne spojený so sekvenciou kódujúci chitín-väzobné časti ludskej chitinázy. Viď. napríklad medzinárodné prihlášky W094/12650, W092/20808 a W091/09955. Spolu so spomínaným heterológnym promotórom môže byť do génu vložený amplifikovatelný markér a/alebo intrón.
I · ··· ·· · • · · .
• · · • · ···· • · i ·· ·
Fragmenty chitinázy môžu byť získáné ve forme izolátov z prirodzených zdrojov alebo môžu byť syntetizované chemickou cestou, ale vo výhodnom provedení sú produkované rekombinantnými technikami využívajúcimi prokaryotícké alebo eukaryotícké hostiteľské bunky podľa vynálezu. Pŕredpokládá sa, že pri použití cicavských hostiteľských buniek bude produkt posttranslačne modifikovaný (napríklad myristilovaný, glykosylovaný, čiastočne štiepený, fosforylovaný na tyrozínu, serínu alebo treonínu alebo modifikovaný kovalentným pripojením lipidov) . Tieto posttranslačné modifikáice môžu byť nezbytné pre optimálnu biologickú aktivitu rekombinantných produktov podLa vynálezu.
Do rozsahu vynálezu ďalej prináleží použitie fragmentov chitinázy pri screeningu proteinov alebo iných molekúl (napríklad malých molekúl), ktoré sa špecificky viažu na chitín-väzobnú doménu ludskej chitinázy, alebo ktoré modulují väzbu ľudskej chitinázy k chitínu alebo k proteínom extracelulárnej matrixe, ako napríklad kyseline hyaluronóvej. Pomocou fragmentov chitinázy izolovaných z plazmy, rekombinantných fragmentov chitinázy alebo buniek exprimujúcich tieto produkty môžu byť identifikované proteíny alebo iné molekuly (napríklad malé molekuly), ktoré sa špecificky viažu k chitináze. Proteíny alebo iné molekuly, ktoré se viažu k chitín-väzobné doméne chitinázy môžu byť využité k modulácii aktivity chitínnázy. Proteíny, ktoré se špecificky viažú k chitín-väzobné doméne chitinázy taktiež spadajú do rozsahu vynálezu a zahŕňajú protilátky (napríklad monoklonálne alebo polyklonálne protilátky, jednotlivé reťazce protilátok, chimerícké protilátky, humanizované protilátky, ľudské protilátky a protilátky s vloženými CDR sekvenciami vrátane zlúčenín zahŕňajúcich sekvencie CDR, ktoré špecificky rozpoznávajú akýsi ·· ·· ··· · · ···· · « · ··· ···· · · · · ·· • · ··· · · · ··· · · · • · · · · ·· ···· ·· · ·· 9 polypeptid podía vynálezu). Slovné spojenie špecificky sa viažú k chitín-väzobné doméne chitinázy označuje skutečnosť, že spomínaný väzobný proteín rozpoznáva výlučne chitín-väzobnou doménu chitinázy a nie katalytický aktívnu časť chitinázy. Tieto väzobné proteíny sú napríklad použiteľné v prípravkoch pre imunizáciu, ako aj pre purifikáciu chitinázy, a sú použiteľné k detekcii alebo kvantifikácii chitinázy vo vzorkoch tkáni alebo telnich tekutín pomocou známych imunologických metód. Do rozsahu vynálezu taktiež spadajú anti-idiotypícké protilátky špecificky reagujúce s protilátkami proti chitináze.
Protilátky špecificky interagujúce s chitín-väzobnou doménou sú použiteĽné k detekcii alebo kvantifikácii prítomnosti chitinázy, napríklad pri sandwich ELISA, a k detekcii alebo kvantifikácii výskytu kvasiniek alebo cudzopasných húb, napríklad pridaním chitín-väzobné domény interagujúce s kvasinkami alebo cudzopasnými húbami a následným pridáním značenej protilátky špecificky interagujúcej s touto chitínväzobnou doménou. Detekcia chitín-väzobnéj domény vo vzorkách ľudskej krve (plazme alebo séru) môže byť korelovaná s nejakým štandardným diagnostickým markerom ochorenia zahŕňajúcim chitinázu, napríklad Gaucherovým ochorením. V súčanosti sú výhodne používané protilátky 243Q a 243M produkované hybridómy 243Q (prístupové číslo ) a 243M (prístupové číslo ) a monoklonální protilátky, ktoré kompetujú s alebo se viažu do rovnakéného epitópa rozpoznávaného protilátkami 243Q a 243M.
Vedecká hodnota informácií vyplývajúca z uvedení sekvencií
DNA a sekvencií aminokyselín podía vynálezu je zrejmá. Znalosť sekvencie cDNA pro chitinázu napríklad umožňuje izoláciu sekvencií genómových DNA kódujúcich iné cicavčie chitinázy (a im podobné proteíny) s využitím hybridizáce DNA/DNA alebo ·· ·· ·· · « ···· · · · · ···· · · · · · • e ··· · · · ···· 9 9
99 polymerázovou reťazovou reakciou (PCR). Je velmi pravdepodobné, že hybridizáciou DNA/DNA alebo FCR využívajúcich sekvencie DNA podía vynálezu provádzaných za štandardných podmienok, bude možné izolovať DNA kódujúci alelické varianty ludské chitinázy, iné štruktúrne príbuzné ludské proteíny vyznačujúce sa chitín-väzobnou aktivitou podobnou chitináze a chitín-väzobné oblasti proteínov homológnych k chitináze z iných živočíšnych druhov. Sekvencia DNA popísaná v tejto prihláške taktiež umožňujú (homológna rekombinácia alebo knockoutovanim génov; viď. napríklad Kapecchi, Science, 244:1288 až 1292, 1989) získanie živočíchov, ktorí neexprimujú fúnkčnu chitinázu, chitinázu exprimujú exprimují rôné varianty chitinázy. Tieto slúžiť ako modely ke štúdiu aktivity chitinázy in vivo alebo k štúdiu modulátorov chitinázy in vivo.
nadmerne alebo živočichové môžu
Vhodne značené polynukleotidy podía vynálezu môžu byť použité pri hybridizačných reakciách k detekcii schopností buniek syntetizovať chitinázu. Polynukleotidy podía vynálezu môžu byť taktiež základom diagnostických metód použitelných k identifikácii genetických zmien v oblasti chitinázy, kde tieto zmeny sú príčinou ochorení. Vynález taktiež umožňuje prípravu antisensie polynukleotidov použitelných k regulácii expresie chitinázy v bunkách, ktoré chitinázu exprimujú.
Vynález taktiež predpokladá, že chitín-väzobné fragmenty môžu býť pripojené k nejakému heterolognému peptidu. Pripojení týchto fragmentov k nejakej časti imunoglobulínov, napríklad ku konštantnej oblasti, môže byť napríklad využité terapeuticky. Iným príkladom je pripojenie týchto fragmentov k polypeptidu použitelnému ako detekčná značka alebo marker, ako napríklad polypeptidu s enzymatickou aktivitou alebo • · · ·· • · · * • · · · • · ··· • · · ·· ·· ·· · • · · • · · · • · ···· · • · · ·· ·
• · ·· · polypeptidu zahjŕňajúcem nejaký detekovatelný epitóp napríklad epitóp myc alebo epitóp FLAG (Eastman Kodak).
ako
Chitín-väzobné fragmenty môžu býť taktiež pripojené k nejakému inému proteínu a tým usnadniť purifikáciu tohto proteínu afinítnou väzbou na chitínovou matricu. Tieto fúzne proteíny môžu byť následne z kolóny eluované alebo môžu byť od chitín-väzobné domény odštiepené a odštiepený proteín potom eluovaný (viď. napríklad Chong a ďalší, Gene, 192:271 až 281, 1997).
Fragmenty ľudskej chitinázy podľa vynálezu môžu byť taktiež využité ako látky špecificky interagujúce s chitínom a to k identifikácii výskytu chitínu v biologických vzorkách. Ďalšia stránka vynálezu popisuje chitín-väzobné fragmenty chitinázy konjugované s nejakou detekovateľnou značkou ako napríklad radioizotópem, fluórofóreom, farbou, elektróndénznou zlúčeninou alebo enzýmom, ktoré sú uvedené do kontaktu s testovanoum vzorkou a prítomnosť chitínu je analyzovaná kvalitatívne alebo kvantitatívne. Termín konjugovaný znamená spojený kovalentnou väzbou. Tieto techniky sú v súčasnosti známe a sú napríklad ilustrováné v prihláške US 5587292, ktorá je zde uvedená zámenou za prenesenie jej celého obsahu do popisu tohto vynálezu. Množstvo týmto spôsobom detekovaného chitínu môže indikovať množstvo patogénnych húb v organizmu infikovaného pacienta. Dvoma fragmentárni výhodne používanými pri týchto stanoveniach sú chitín-väzobná doména o velkosti 54 aminokyselín zahŕňajúci v ludskej chitináze popísané v SEK. ID. Č.. 2 aminokyselinové zvyšky 392 až 445 a chitín-väzobná doména o velkosti 49 aminokyselín zahŕňajúcej v lidské chitináze popsané v SEK. ID. Č.. 2 aminokyselinové zvyšky 397 až 445.
·· ·· · • · · • · e • ··· • · · • ····
Vynález taktiež popisuje konjugáty zahŕňajúce chitínväzobné fragmenty chitinázy a nejakú zlúčeninu vhodnú pre diagnostiku ako napríklad rádioizotopy emitujúce gama žiarenie alebo pozitrónové žiarenie pre radionukleárnu diagnostiku (napríklad 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr, 56Fe, Hlín, 97Ru, 67Ga, 68Ga, 72As, 89Zr, 201T1, 99Tn, 90Y); cheláty . paramagnetíckych kovov, zlúčeniny značené nitroxylovou spinovou značkou a iné látky (napríklad Gd(III), Eu(III),
Dy(III), Pr(III), Pa(IV), Mn(II), Cr(III), Co(III), Fe(III), Cu(II), Ni(II), Ti(III) aV(IV), GdDTPA/dimeglumin[Magnevist ™]) pre diagnostiku MRI; kontrastne látky pro diagnostiku založenú na rentgenovom žiareniu, vrátane CT (napríklad zlúčeniny obsahujúce bróm alebo jód); a ďalšie látky v súčasnosti známe. Predpokládá sa, že tieto konjugáty se budú viazať na chitín bunečnej steny kvasiniek a budú tak využiteľné v stanoveniach k detekcii alebo lokalizácii kvasiniek in vivo v organizmu cicavcov.
Do rozsahu vynálezu taktiež spadá aplikácia fragmentov chitinázy a terapeutických látok obsahujúcich tieto fragmenty do organizmu cicavcov, zvlášte pak ludí, za účelom liečby ochorení vyvolaných patogény obsahujúcimi chitín ako napríklad pliesňami. Infekcie pliesňami (mykózy) ako napríklad
·. kandidóza, aspergilóza, ko|ccidioidomykóza, blastomykóza, parakokcidioidomykóza, histoplasmóza, kryptokokóza, chromoblastomykóza, sporotrichóza, mukormykóza a dermatofytózy môžu byť alebo chronické alebo akútne. V organizmu hostiteľov s oslabenou imunitou spôsobujú patogénne huby viažne, často smrteľné ochorenia. Pacienti s rakovinou podstupujúcich chemoterapiu, imunosuprimovaní jedinci a jedinci infikovaní vírom HIV sú náchylný k mykózam spôsobených mikroorganizmy Candida, Aspergilus, Pneumocystis carnii a inými. K liečbe mykóz sú ·· • · • · • · · · • · · · • · ··· · • · · ·· ·· ·· · • · · • · · · • · · · · · • · · ·· · ·· používáné amfotericín B a flukonazol, ale ich použitelnost je limitovaná nepriaznivými vedlajšími účinkami, ktoré sú dôsledkom toxicity týchto zlúčenín. Aj cez liečbu amfotericínom B je úmrtnosť na systemickú kandidózu vyššia ako 50%. V súčasnosti známe živočíšne modely pliesňových ochorení sú popísané v príkladoch 9 až 15.
butokonazolom, itrakonazolom ekonazolom, terkonazolom, sulkonazolom, allylaminovtiokarbamátov ako
Do rozsahu vynálezu taktiež spadajú prípravky zahŕňajúce fragmenty chitinázy používané k liečbe cicavcov náchylných k alebo postihnutých pliesňovými ochoreniami. Vynález predpokládá, že fragmenty chitinázy môžu byť konjugované s dalšími konvenčnými antifungálnymi zlúčeninami vrátane amfotericínu B a štruktúrne podobnými zlúčeninami nystatínom a pimaricínom; 5-fluorcytozínu; derivátov azolu ako napríklad flukonazolom, ketokonazolom, klotrimazolom, mikonazolom, oxikonazolom, a tiokonazolom;
napríklad tolnaftátom, naftifínom a terbinafínom; griseofulvínu; ciklopirox olamínu; haloprogínu; kyseliny undecylenové; a kyseliny benzoové (viď. napríklad Goodman a Gilman, The Farmacological Basis of Therapeutics, 9. vydanie, McGraw-Hill, NY, 1996).Podlá tejto stránky vynálezu slúži chitín-väzobné fragmenty ako vektory ke smerovanie známych fungicídnych alebo fungistatíckych zlúčenín k patogénnym hubám obsahujúcim chitin a môžu tak zefektívniť účinok týchto antifungálnych látok pravdepodobne tým, že u spomínaných patogénnych húb vyvolajú väčšiu citlivosť voči použitým zlúčeninám. Zníženie množstva bežne používaných antifungálnych zlúčenín potrebného k dosaženiu požadovaného terapeutického účinku môže umožniť použitie týchto liečiv v menej toxických hladinách. Schopnosť selektívneho smerovania na patogénne huby alebo kvasinky s využitím fragmentov chitínväzobné domény taktiež umožňuje aplikáciu týchto fragmentov «· ·· ·· · ·· • · · · · · · ·· ···· · · · · ·· • · ··· · · · ···· · · · konjugovaných s cytotoxíckymi zlúčeninami, ktoré sami o sebe nie sú selektívne anti-fungálne. Táto stránka vynálezu sa týka konjugácie chitín-väzobných fragmentov chitinázy k akékolvek cytotoxickej látke v súčasnosti známe, vrátane rádioizotopov (ako napríklad 90Y, 188Re, 186Re, 199Au, 64Cu, 67Cu, 1311), < toxínov a chemoterapeutík; ktorá bude účinná voči kvasinkám. Postupy v súčasnosti známymi môžu byť vhodné cytotoxícké látky snadno identifikované. Oproti použitiu chitín-väzobných domén chitináz z iných organizmov je použitie chitin-väzobné domény ludskej chitinázy v týchto prípadoch výhodnejší, pretože sa predpokladá, že ľudské polypeptidy budú v organizmu ludí neimunogénne.
Fragmenty chitín-vazobné domény môžu sami o sebe vykazovať antifungálnu aktivitu, a to narušením tvorby príčnych väzieb v bunečnej stene kvasiniek. Tieto fragmenty môžu byť aplikované samostatne alebo v kombinácii s inými antifungálnymi látkami. Do rozsahu vynálezu taktiež spadajú multimérne fragmenty chitín-väzobných domén, ktoré sú k tomuto účelu zvlášte vhodné. Medzi tieto multimérne fragmenty patrí fragmenty, ktoré boli kovalentne zosítované chemicky alebo rekombinantne produkované polypeptidy zahŕňajúce väčší počet chitín-väzobných domén tandémovo spojených. Aplikácia fragmentov chitín-väzobných domén, alebo monomérnych alebo multimérnych, môže znížiť množstvo súčasne aplikovaných antifungálnych látok nezbytné k dosaženiu požadovaného terapeutického účinku.
Do rozsahu vynálezu tedy spadá použitie fragmentov chitinázy pri príprave liečiv k profylaxii alebo liečbe mykóz.
Terapeutícke/farmaceutícke prípravky spadajúce do rozsahu vynálezu zahŕňajú fragmenty chitinázy, ktoré môžu byť ·· ·· • e · · • · · · • · ·· • e · «· ·· • · · • · · · • · · ···· · • · · ·· · ·· • · · • · • · • · ·· · konjugované s inou terapeutickou látkou a fyziologicky prijatelným rozpoušťadlom alebo nosičom a môžu taktiež zahŕňať iné antifungálne látky. Naznačené podávané množstvá by dostačovala k nahradeniu endogénnej chitinázovej aktivity. Obecne prijímané dávkovacie režimy sú uvedené v publikácii Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. vydanie, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Podávané dávky sa budú pohybovať v intervalu 1 ug/kg až 100 mg/kg telesnej hmotnosti a vo výhodnom prevedení pak v rozmedzí približne 0,1 až približné 20 mg chitinázy na kilogram telesnej hmotnosti. Terapeutické prípravky podľa vynálezu môžu byť v závislosti na typu liečené infekcie aplikované rožnými zpôsobmi, vrátane aplikácie subkutánne, intramuskulárne, intravenózne, intrapulmonárne, transdermálne, intrathekálne, lokálne, orálne alebo prostredníctvom čípkov.
Vynález taktiež predpokládá, že nadmerná expresia chitinázy pri Gaucherove ochorení alebo v miestach zápalu (ako napríklad pri reumatické artritíde) môže mať škodlivý vplyv na extracelulárny matrix a v týchto prípadoch môžu byť inhibítory chitinázovej aktivity, vrátane fragmentov chitinázy alebo inhibítorov väzby na chitín identifikované spôsoby popísanými vyššie, terapeuticky účinné, napríklad redukciou remodelácie alebo deštrukcie extracelulárnej matrix.
cDNA kódujúca ľudskou chitinázu bola izolovaná z cDNA knižnice makrofágov. Je známe, že makrofágy majú blízky vzťah k léziam reumatickej artritídy (Feldman a ďalší, Celí, 85:307 až 310, 1996) a produkty makrofágov ako napríklad TNF-oí majú na svedomie progresiu tohto ochorenia. V synóviu a chrupavkách pacientov postihnutých reumatickú artritídou bol identifikovaný proteín C-gp39, homológny k ľudskej chitináze. Ačkoľvek prirodzeným substrátom ľudskej chitinázy je ···· · · · · · · ···· · · · · · · • · ·· · · · ···· · · · • · ···· · · ·· ·· ·· · ·· · organizmov, tento enzým makromolekuly, ktoré sú pravdepodobne chitín z patogénnych môže taktiež pôsobiť na endogénne prirodzenou súčasťou extracelulárnej matrix. Predpokládá sa napríklad, že kyselina hyaluronová, hlavná zložka extracelulárnej matrix, obsahuje jadro z oligomérov chitínu (Semino a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:4548 až 4553, 1996;
Varki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:4523 až 4525, 1996).
Chitináza se tedy môže účastniť degradácie extracelulárnej matrix u ochorení akým je napríklad reumatická artritída. Táto úloha chitinázy môže byť stanovená meraním množstva chitinázy a/alebo účinkov aplikácie chitinázy alebo inhibície chitinázy v synoviálnej tekutine izolovanej z kĺba pacientov postižených artritídou. Množstvo endogénnej chitinázy môže byť stanovované enzymatícky alebo s využitím protilátok. Viskozita synoviálnej tekutiny môže byť meraná pred a po vystavení pôsobenia chitinázy; zníženie viskozity asociované s chitinázovou aktivitou by ukazovalo na prítomnosť endogénneho substrátu pre chitinázu. Modulácia aktivity chitinázy tedy môže modulovať progresiu poškodenia kĺbov pri reumatickej artritíde.
Do rozsahu vynálezu taktiež spadajú spôsoby screeningu inhibítorov chitinázovej aktivity, ktoré môžu byť použiteľné v prípadoch popísaných v predchodzom odstavci. Spôsoby screeningu vzorkov použiteľné k identifikácii látok inhibujúcich chitinázu sú napríklad popísaný v prihláške W095/34638, publikovanej 21. decembra 1995.
Príklady provedenia vynálezu • · ·· ·· • · ·
I · · ·
I · ··· · • · ·· ·· ·· · ·· • · ·
I · · · · «
B · ···· · · 1
B · · · « ·· · ··
Ďalšie stránky a výhody predkladaného vynálezu budú lepšie zrozumiteľné po prečítaniu následujúcich ilustratívnych príkladov. Príklad 1 popisuje izoláciu cDNA klonov ludskej chitinázy z cDNA knižnice ľudských makrofágov. V príkladu 2 je uvedená topológia expresia génu pre chitinázu' v rožných ľudských tkániach. Príklad 3 popisuje rekombinantnú expresiu génu pre ľudskú chitinázu v prokaryotíckých bunkách a purifikáciu vzniklého produktu. V príkladu 4 je uvedený postup rekombinantnej produkcie ľudskj chitinázy v kvasinkách. Príklad 5 popisuje rekombinantnú expresiu génu pre ľudskú chitinázu v cicavčích bunkách a purifikáciu vzniklého produktu. Príklad 6 popisuje produkciu polypeptidových analogov a fragmentov ľudskej chitinázy peptidovou syntézou alebo rekombinantnými technikami. Príklad 7 popisuje produkciu fragment a analógov ludskej chitinázy vykazujúcej chitín-väzobnú aktivitu. V príklade 8 je uvedený postup prípravy monoklonálnych protilátok špecificky reagujúcich s ľudskou chitinázou. popisuje stanovenie aktivity chitinázy použiteľné k Príklad 10 meraniu popisuje
Príklad 9 katalytickej stanovenie antifungálne aktivity testovaných látok in vitro. Príklad 11 popisuje stanovenie antifungálnej aktivity testovaných látok in vivo na myššom modelu a príklady 12 až 15 popisujú králičie modely invazívnej aspergilózy, diseminovanej kandidózy, oftalmitídy vyvolanej zástupcami rodu Candida a endokarditídy vyvolanej zástupcami rodu Candida. Príklad 16 uvádza srovnanie chitín-väzobných a hydrolytíckych aktivít kompletnej ľudskej chitinázy a ich C-koncového fragmentu. Príklad 17 popisuje konjugáciu chitín-väzobných fragmentov k iným zlúčeninám.
·· ·· ·· · ·· ···· ··· · · · ···· · · · · ·· • · ··· · · · ···· · ·
Príklad 1
Izolácia klonov cDNA kódujúcich chitinázu cDNA knižnica bola pripravená z makrofágov monocytárnej línie z periférnej krve postupom popísaným v publikácii Tjoelker a ďalší, Náture, 374:549 až 552, 1995. Klony z tejto knižnice boli vybraté náhodne a z jednotlivých klonov bola izolovaná plazmidová DNA. S využitím priméru JHSP6, ktorý je komplementárny k sekvencii priléhajúce vo vektore pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA) ku klonovaciemu miestu pre cDNA, bola automatickým sekvenátorom (model 373, Applied Biosystems, Foster City, CA) u každého klonu stanovená sekvencie približné 300 až 500 báz od konca DNA.
JHSP6: 5'-GACACTATAGAATAGGGC-3' (SEK: ID. Č.: 5)
Za účelom nalezenia podobnosti so známymi génami boli nukleotidová a odvodená aminokyselinová sekvencia týchto cDNA klonov porovnané so sekvenciami v databázach nukleotidov a peptidov. Srovnanie sekvencii bolo prevedené službou BLAST Národného centra pre biotechnologické informácie s využitím priradzovacieho algoritmu podľa Altschul a ďalší, J. Mol. Biol., 215:403 až 410, 1990. Kloň MO-119 vykazoval vysokú mieru homológie s niekoľkými rožnými sekvenciami, vrátane prekurzoru proteínu YM-1 sekretovaného myššími makrofágmi (v databázi Genbank pod prístupovým číslom M94584), gp-39 z ľudských chrupaviek (Hakala a ďalší, viď. vyššie), glykoproteínu vejcovodov ovci, hovädzieho dobytka a ľudí (DeSouza a ďalší, viď. vyššie) a chitináz parazitov (Oncocerce, v databáze Genbank pod prístupovým číslem U1469), vos (Chelonus, v databázi Genbank pod prístupovým číslom U10422), rastlín (Nicotiana, v databáze Genbank pod prístupovým číslom X77111) a ·· ·· · ·· • · · · ··· ··· ···· ···· 9 · • · ··· · · · ···· · · · baktérií (Serratia, v databáze Genbank pod prístupovým číslom Z36295) . Nejvyššia miera homológie bola pozorovaná u cicavčích génov kódujúcich proteíny homologne k chitináze, ale postrádajúce chitinázovú aktivitu. Ďalšia sekvenčná analýza klonu MO-911 podporuje domnienku, že tento kloň zahŕňa časť kódujúci oblasti homológov ludskej chitinázy.
DNA sekvencia klonu pMO-218 (v súladu Budapeštskou úmluvou s ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA, uložená 7. júna, 1996, pod prístupovým číslom 98077) je uvedená ako SEK. ID. Č.: la kóduje aminokyselinovou sekvenciu uvedenú ako SEK. ID. Č.: 2. Zdá sa, že MO-218 zahŕňa celú kódujúcu oblasť cDNA ludskej chitinázy (nukleotidy 2 až 1399 v SEK. ID. Č.: 1), vrátane predpokladanej signálnej sekvencie o dĺžke 21 aminokyselín nasledované 445 kódovanými aminokyselinami (aminokyselinové zvyšky 1 až 445 v SEK. ID. Č.: 2). Dvadcať jedna aminokyselín nasledujúcich po predpokladanej signálnej sekvencii sa presne zhoduje s Nkoncovou sekvenciou purifikovanej ludskej chitotriosidázy popípsané v publikácii Renkema a ďalší, viď. vyššie. Renkema a ďalší taktiež popisujú sekvenciu 21 aminokyselín fragmentu získaného štiepením ludskej chitotriosidázy trypsínom, ktorá sa dokonale zhodujú so sekvenciou aminokyselín 157 až 177 v klonu MO-218 (SEK. ID. Č. : 2) . Boot a ďalší publikovali klonovanie cDNA ludskej chitotriosidázy, kde táto cDNA kóduje sekvenciu v podstate identickú so sekvenciou MO-218. Sekvencia MO-218 zahŕňa v srovnaní so sekvenciou popísanou v publikácii Boot a ďalší naviac 14 nukleotidov na 5' konci a ďalší odlišnosť je v nukleotidu 330 v kódujúcej oblasti.
Za účelom potvrdenia, že MO-218 skutečne zahŕňa celú kódujúcu oblasť pripravenej cDNA bola syntetizovaná sonda PI značená 32 P ·· • · • · • · · · · • · · · · • · ··· · · • · · ·
·· ·· ·
·· · (TGGGATCATCAGCAGGACCATGAAACCTGCCCAGGCCACAGACCGCACCAT, SEK.
ID. Č.: 6), ktorá je komplementárna k nukleotidom 2 až 52 v klonu MO-218 (SEK. ID. Č.: 2). Sonda Pl byla navržená tak, aby hybridizovala s klony, ktoré sú na 5' koncu prinajmenšom tak dlhé ako kloň MO-218. Táto sonda bola cez noc pri 42 °C hybridizovaná s časťou (približné 30000 klonov) knižnice cDNA z ludských makrofágov popísané v predchodzom texte vo 40% formamidu a hybridizačnom pufru (5 x SSPE, 10 x Denhardtov roztok, 100 ug/ml denaturovanej DNA zo spermií lososa a 2% SDS) . Po promytí filtrov boli vybrané tri klony poskytujúce pozitívny hybridizačný signál a tieto klony boli osekvenované. Najdlhší kloň bol označený pM0-13B (v súlade s Budapeštskou úmluvou s ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA, uložený 7. júna, 1996, pod prístupovým číslom 12301). DNA sekvencia klonu pM0-13B je uvedená ako SEK. ID. Č.: 3 a kóduje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako SEK. ID. Č.: 4. V srovnaní s klonom MO-218 obsahuje kloň pM0-13B naviac na 5' koncu 25 nukleotidov. Ďalšou zmenou oproti klonu MO-218 je zámena nukleotidu 330 (odpovedá nukleotidu 305 klonu MO-218 popísaného sekvencí SEK.
ID. Č.: 1) v klonu MO-13B (SEK. ID. Č.: 3), kde táto zámena mení aminokyselinu na pozíciu 80 v maturnom proteínu z glycínu (v SEK. ID. Č.: 2) na serín (v SEK. ID. Č.: 4).
Príklad 2
Lokalizácia expresia génu pre chitinázú v ludských tkániach
Identifikácia tkání, ve ktorých je exprimovaná ľudská chitináza, bola provedená metódou Northern blot. Za štandardných podmienok (podľa doporučenia výrobca) bol ·· ·· · · ·· • · · · ··· ·· ···· · · · · ·· ··:· ·: s ·· ·· ·· · ··
Northern blot sa vzorky mRNA z rôznych ludských tkaní (Clontech, Pa- lo Alto, CA) hybridizovaný z celou kódujúcou oblasťou klonu MO-218. Maximálna hybridizácia bola pozorovaná v pľúcnej tkáni (+++) a vaječníkoch (+++), menšia intenzita (+) pak thymu a placente. Velikosť hybridizujúcich mRNA z pľúc, vaječníkov a thymu bola 2,0 kb, čo je v dobrej shode s veľkosťou klonovanej cDNA (1,6 kb alebo približne 1,8 kb vrátane polyA konca). Velkosť hybridizujúcich mRNA z placenty byla podstatne menší - približne 1,3 kb. Hybridizácia nebola pozorovaná v slezine, prostate, varlatoch, tenkom čreve, tlustom čreve, leukocytoch periférnej krvi, srdcu, mozgu, pečeni, kosterných svaloch, ľadvinách alebo slinivke. Expresia chitinázy v pľúciach odpovedá jej ochrannej roli voči patogénnym organizmom obsahujúcim chitín, nakoľko pľúca sú primárnou cestou vstupu fungálnych patogénov do organizmu.
Príklad 3
Produkcia rekombinantnej ľudskej chitinázy v bakteriálnych bunkách
Matúrna kódujúca oblasť z klonu MO-218 bola upravená tak, aby mohla byť v E.coli exprimovaná vo forme analógu skráteného z N-konca. S využitím priméru o sekvencií odpovedajúcej nukleotidom 65 až 88 v cDNA klonu chitinázy MO-218, kde pred túto sekvenciu bol predražený kodón pre metionín a reštrikčné miesto Xbal (5'TACATCTAGAATTATGGCAAAACTGGTCTGCTACTTCACC-3', SEK. ID. Č.: 7) a reverzného priméru v klonu MO-218 komplementárneho k nukleotidom 1163 až 1183 a následovaného stop kodónom a reštrikčným miestom HindlII (5'AGATCTAACCTTAGGTGCCTGAAGACAAGTATGG-3', SEK. ID. Č.: 8) bol PCR ·· · ·· ·· • · · · · • · · · · • · ··· · · • · · • 9 · · • ···· · · ·· • · · • · ·· ·· ·· vytvorený fragment chitinázy použiteľný pre expresiu. V reverznom priméru je na pozícii 25 adenín, zatial čo v sekvencii MO-218 sa na tomto mieste vyskytuje guanín. Z toho vyplýva, že vo fragmentu vytvorenom s využitím tohto priméru bude na pozícii 1172 v sekvencii MO-218 miesto cytozínu tymidín. Dôsledkom tejto skutočnosti taktiež je, že fragment chitinázy kódovaný spomínanou sekvenciou bude v pozícii 370 (počítané v matúrnom proteínu) obsahovať serín namiesto prolínu, ako je tomu v klonu MO-218. Získaný fragment DNA bol rozštiepený enzýmy Xbal a HindlII a zaklonovaný do plazmidu pAra- BAD (taktiež označovaného ako pAraCB).
Plazmid pAraCB byl pripravený nasledovne. Plazmid pUC19 byl upravený tak, aby obsahoval arabinózový promotór a kódujúce sekvencie AKAP 79. Arabinózový promotór (Wilcox a ďalší, Gene, 34:123 až 128, 1985; Wilcox a ďalší, Gene, 18:157 až 163, 1982) a gen araC boli metódou PCR amplifikované z arabinózového operónu BAD Salmonella typhimurium vo forme fragmentu ohraničeného reštrikčnými miestami EcoRI/Xbal. Pri tomto postupe boli využité priméry araC-2 (SEK. ID. Č.: 9) a arab-1 (SEK. ID. Č.. 10):
SEK. ID. Č.: 9 araC-2TACAGAATTCTTATTCACATCCGGCCCTG
SEK. ID. Č.. 10 arab-1TACATCTAGACTCCATCCAGAA. AAACAGGTATGG
Primér araC-2 kóduje reštrikčné miesto EcoRI a stop kodón pre produkt génu araC. Primér arab-1 kóduje doménu viažúci se na ribozóm a reštrikčné miesto Xbal. PCR provedenú s týmito priméry bol získaný fragment o veľkosti 1,2 kb, ktorý bol po štiepení reštrikčnými enzýmy EcoRI a Xbal zaklonovaný do • · • · ·· ·· • · · · • · · · • · ··· • · · ·· ·· ·· · ·· ··· · · • · · · · · • ······· · • · · · · ·· · ·· vektoru pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) taktiež štiepeného spomínanými enzýmy. Takto pripravený plazmid bol označený pAraCB a obsahoval polyklonovacie miesto (SEK. ID.
Č.: 11) ohraničené na 5' koncu reštrikčný miestom Xbal a na 3' koncu reštrikčným miestom HindlII.
polyklonovacie miesto araCB
SEK. ID. Č.: 11
TCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT
Transformované bunky obsahujúce takto pripravený expresívny plazmid (pAraM0218) boli indukované prídavkom arabinózy a kultivované pri 37°C. Inklúzne telieska z týchto buniek obsahovala 39 kDa proteín, ktorý je skrátenou formou chitinázy (konštruovaný tak, aby bol tvorený 373 namiesto 445 aminokyselinami). Tento .fragment chitinázy obsahuje 4 cysteínové zvyšky, zatial čo intaktná chitináza obsahuje týchto zvyškov desať. Produkovaná inklúzna telieska bola oddelená od bunečnej kultúry E.coli a získané proteíny boli rozdelené elektroforézou na SDS polyakrylamidovom gélu (SDS-PAGE). Prúžok o veľkosti 39 kDa bol prenesený na PVDF membránu a osekvenovaný z N-konce. Väčšina (približne dve tretiny) tohto materiálu začínala sekvenciou odpovedajúcej aminokyselinovéj sekvencii N-konca ludskej chitinázy. Zvyšný materiál odpovedal kontaminujúcemu proteínu z E.coli, ktorým byl porín. Takto pripravená rekombinantná chitináza bola použitá pre prípravu polyklonálnych a monoklonálnych protilátok (táto príprava je popísána v príklade 8).
Ak boli bunky, transformované expresívnym plazmidom Ara-chitináza, kultivované pri 25°C, nebyla pozorovaná , ·· ·· ·· · « ···· · · · · ···· · ·· · · • · ··· · · · ···· · · • · · · · · · ·· ·· ·· · « produkcia inklúznych teliesok a expresie rekombinantného proteínu bola znížená z pôvodných desiatich percent na približné jedno percento z celkového bunečného proteínu. Materiál produkovaný pri 25°C nicmenej vykazoval chitinázovú aktivitu.
Príklad 4
Produkcia rekombinantnej ludskej chitinázy v kvasinkách
V následujúcom texte sú uvedené ukážky postupov pre rekombinantnú expresiu ludskej chitinázy v kvasinkách a purifikácie produkovaného rekombinantného proteínu. S využitím PCR alebo spojujúcich oligonukleotidov bola kódujúca oblasť ludskej chitinázy zaklonovaná do vektorov pre expresiu v Saccharomyces cerevisiae tak, že k sekvencií kódujúci N-koniec ludskej chitinázy bola funkčne pripojená vedúca sekvencia (signálny peptid). Medzi signálne peptidy patrí napríklad SUC2 alebo ekvivalentne vedúce sekvencie so štiepiacim miestom pre signálnu peptidázu alebo pre-pro-alfa faktor alebo iné komplexné vedúce sekvencie zahŕňajúce pre-sekvenciu alebo signálny peptid a pre-sekvenciu alebo sekvenciu so štiepným místem KEX2. DNA kódující signálni sekvenci múže být získána PCR nebo oligonukleotidovou syntézou. DNA kódujúca vedúcu sekvenciu pre-pro-alfa faktoru bola pripravená PCR s využitím priméru zahŕňajúceho oligonukleotidy 1 až 20 v sekvencií génu pre alfa faktor a priméru o sekvencií komplementárnej k nukleotidom 255 až 235 tohto génu (Kurjan a Herskowitz, Celí, 30:933 až 943, 1982). Táto kódujúca sekvencia signálneho peptidu pre-pro-alfa faktoru spolu s fragmentárni sekvencie kódujúcu ludskú chitinázu boli zaligované do plazmidu obsahujúceho promotor pre alkohol dehydrogenázu kvasiniek (ADH2) tak, aby tento promotor riadil expresiu výsledného ·· ·· · ·· ···· · · · ·· • I · · ···· · · • · ··· · · · ···· · · · ·· ·· ·· · ·· fúzneho proteínu. Ako uvádzajú Rose a Broach (Meth. Enz., 185:234 až 279, D. Goeddel, ed., Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1990), tento vektor ďalej, po smere transkripcie za klonovacím miestom, obsahuje terminátor transkripcie ADH2, počiatok replikácie 2-μ, nejaký selekčný marker napríklad TRPÍ, CUPI nebo LEU-2 (alebo LUE2-d) alebo ekvivalentný gén, kvasinkové gény REPI a REP2, gén pre beta laktamázu z
E. coli a počiatok replikácie pre E. coli. Gény pr beta laktamázu a TRPÍ umožňujú selekciu v baktériách respektíve v kvasinkách. Gény REPI a REP2 kódujú proteíny hrajúci úlohu v udržovaní počtu kópií plazmidu v bunke.
V kódujúcej oblasti pro chitinázu môžu byť taktiež zvolená aj iná miesta fúzie. Za účelom zvýšenia homogenity produktu, zvýšenia špecifickej aktivity alebo zmeny substrátovej špecifity môžu byť pripravené skrátené verzie kódujúce oblasti.
S využitím známych postupov, napríklad pôsobenie octanu lithného (Sterarns a ďalší, Meth. Enz., viď. vyššie, strany 280 až 297) a podobne, sú konštrukty DNA popísanými v predchádzajúcich odssekoch transformované bunky kvasiniek.
Po vyčerpaní glukózy z kultivačného média je indukovaný promotor ADH2 (Price a ďalší, Gene, 55:287, 1987). Pre-proalfa sekvencia nebo j iné vedoucí sekvence umožňuj í sekreci fúzního proteínu a polypeptidový reťazec maturovanej ludskej chitinázy je uvoľňovaný z buniek. Signálny peptid je odštiepený signálnou peptidázou alebo v prípade pre-pro-alfa sekvencie proteázou KEX2 (Bittner a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:5330 až 5334, 1984).
V aminokyselinovej sekvencii maturovanej ludskej chitinázy se nachádzajú dve miesta s po sebe idúcimi bázickými aminokyselinami, a to na pozícii 107-108 (Lys-Arg) a 209-210 ·· · ·· • · · · · · • · · · · · • · · ···· · · · • a · · · ·· · ·· · ·· ·· • · · · • · · · • · ··· • · · ·· ·· (Arg-Lys), která môžu byť v priebehu sekrecie proteolytícky štiepena proteázou KEX2. Za účelom stabilizácie a/alebo zvýšenie množstva produktu sekretovaného z buniek môžu byť tieto sekvencie mutované tým, že sú odstránená potenciálne miesta proteolýzy (Gillis a ďalší, Behring Inst. Mitt., č. 83:1 až 7, 1988) alebo expresii chitinázy bez provedenia takých mutácií, ale v hostiteľských bunkách deficientných v KEX2 aktivite. Také hostiteľské bunky môžu byť získané alebo screeningem mutantov neexprimujúcich proteázu KEX2 alebo manipuláciou miesta pre KEX2 v genómové DNA a to technikami nahradzenie génu/pôrušenie génu” (Orr-Weaver a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:6354 až 6358, 1981).
Rekombinantná chitináza môže byť zo Saccharomyces cerevisiae sekretovaná s využitím obdobných vektorov obsahujúcich alternatívne promotory, ako napríklad PRB1, GAL4, TPI alebo iné vhodné silné promotory, alebo ako fúzny proteín s množstvom iných vedúcich sekvencií (Sleep a ďalší, Bio/Technol., 8:42 až 46, 1990).
Medzi iné hostiteľské bunky vhodné pre expresiu patria Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces plombe, Pichia pastoris a zástupcovia rodov Hansenula nebo Aspergillus. Tieto systémy pre expresiu rekombinantných proteínov zahŕňajú príslušný hostiteľský organizmus a vhodný, autonómne sa replikujúce vektor (napríklad Falcone a ďalší, Plasmid, 15:248 až 252, 1988), alebo expresívne kazety schopné mnohonásobnej integrácie do genómovej DNA. Tieto systémy taktiež využívajú k sekrecii do kultivačného média rovnaké typy signálnych sekvencií alebo vedúcich peptidov popísaných v predchodzom texte.
·· · ·· ·· • · · · • · · · • · ·*· • · · ·· ·· ·· ·· • · • · · • ···· • · ·· ·
Sekretovaná ľudská chitináza je z kultivačného média purifikovaná napríklad postupmi použitými pri purifikácii chitinázy z bakteriálnych supernatantov alebo supernatantov cicavčích buniek (viď. príklady 3 a 5) .
Inou možnosťou je expresia rekombinantnej chitinázy v cytoplazme Saccharomyces cerevisiae alebo podobných hostiteľských buniek a následná purifikácia z týchto lyzovaných buniek. V priebehu purifikácie môže byť proteín refoldovaný tak, aby bolo dosiahnuté dostatočné špecifické aktivity.
Príklad 5
Produkcia rekombinantnej ľudskej chitinázy v cicavčiach bunkách
A. Expresia v bunkách COS
Boli izolované klony MO-218 a M0-13B. Oba tieto klony obsahujú cDNA kódujúcu neskrátenú ľudskou chitinázu pripojenú na 3' koniec promotora CMV v plazmidu pRc/CMV. Tretí plazmid, ktorý odpovedá C-koncovému fragmentu exprimovanému v bakteriálnych bunkách z príkladu 3, bol pripravený následujúcim postupom. S využitím oligonukleotidového priméru 218-1 (CGCAAGCTTGAGAGCTCCGTTCCGCCACATGGTGCGGTCTGTGGCCTGGG, SEK. ID. Č.: 12) zahŕňajúceho reštrikčné miesto HindlII a sekvenciu odpovedajúcu nukleotidom 2 až 23 v cDNA klonu chitinázy MO-218 (SEK. ID. Č.: 1) a reverzného priméru T-END (GACTCTAGACTAGGTGCCTGAAGGCAAGTATG, SEK. ID. Č.: 13) v klonu MO-218 komplementárneho k nukleotidom 1164 až 1183 a následovaného stop kodónom a reštrikčným miestom Xbal, bol kloň MO-218 amplifikovaný PCR. Amplifikovaná DNA bola ·· ·· ·· · ·· ···· ··· ·· ···· ···· ·· • · ··· · · · ···· · · · • · · · · · · · ·· ·· ·· · ·· elektroforetícky purifikovaná, štiepená reštrikčnými enzýmy Xbal a HindlII a zaklonovaná do vektora pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA) štiepeného rovnakými reštrikčnými enzýmami. Miesta spojenia výsledného klonu bola sekvenovaná s využitím sekvenátora model 737 (Applied Biosystems, Foster City, CA) a bolo potvrdené, že tento kloň kóduje sekvenciu odpovídajúcu sekvencii uvedenej ako SEK. ID. Č.: 14.
Všetky tri plazmidy boli použité k transientné transfekcii buniek COS metódou využívajúci DEAE dextrán (viď. napríklad Sambrook a ďalší, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. vydanie, Cold Spring Harbor, New York, Cold
Spring Harbor Laboratory, 1989). Po troch dňoch kultivácie pri 37°C bola, postupom popísaným v príklade 9, in vitro v kultivačných médiách stanovená chitinázová aktivita. V každej z kultúr bola detekovaná významná hladina chitinázovej aktivity (600 až 800 mU/ml/min) a u každého z konštruktov bola pozorovaná srovnatelné množstvá exprimovaného produktu.
Rekombinantná ludská chitináza bola purifikovaná následujúcim spôsobom. Päť dní po transfekcii COS buniek plazmidom pRc/CMV-M0-13B bolo kultivačné médium separované a zriedené rovnakým objemom vody. Takto zriedené médium bolo aplikované na kolónu Q-Sepharózy Fast Flow (Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko) ekvilibrovanou pufrom o zložení 25 mM Tris, 10 mM chlorid sodný, 1 mM EDTA, pH 8,0. Približné 95% chitinázovej aktivity preteklo cez kolónu bez naviazania. Táto vzorka (frakcie protečená cez Q-Sepharôzu) bol upravená na 1,2 M koncentráciu síranu amonného v 25 mM Trisu, pH 8,0. Pri nízkej koncentrácii soli bola eluovaná jedna frakcia (merané absorbanciou pri 280 nm) s chitinázovou aktivitou. Čistota tohto materiálu bola vyššia ako 85% (stanovené SDS-PAGE) a táto frakcia obsahovala približne 60% chitinázovej aktivity.
·· ·· · · ·· • · · · ··· ·· ···· ···· · · • · ·· · · · ···· · · ·
S využitím membrány s MWCO 10000 (UltrafreeTM IOK, Millipore Corp., Bedford, MA) bola vzorka zakoncentrovaná a prevedená do pufra o zložení 20 mM Tris, 150 mM chlorid sodný, pH 8,0. U takto pripravenej vzorky bola následne in vitro testovaná enzymatícka a anti-fungálna aktivita postupmi popísanými v príkladoch 9 a 10. Chitotriosidázová aktivita takto pripravenej vzorky bola 90 nmol/min na mg proteínu.
B. Expresia v bunkách CHO
Gén pre chitinázu bol vložený do vektoru pDEFI (tento je popísané v príklade 4 v prihláške US 08/847218, podanej 1. mája, 1997, ktorá je tu uvedená zámenou za prenesenie jejho celého obsahu do popisu, tohto vynálezu) tak, že z plazmidu pRc/CMV/M0-13B bol reštrikčnými enzýmy HindlII/Xbal vyštiepený 1,77 kb fragment génu kódujúci neskrátenou chitinázu a tento fragment bol zaligován do vektora pDEFI štiepeného rovnakými dvoma enzymy. Takto pripravený plazmid bol označený pDEFI/CTN.I. Spomínaný HindlII/Xbal fragment m o velkosti 1,77 kb bol taktiež zaligovaný do vektora pHDEFI štiepeného reštrikčnými enzýmy HindlII/Xbal a výsledný konštrukt bol označený pHDEFI/CTN.I. Plazmid pHDEFI sa od plazmidu pDEFI líši iba v dvoch čiasťach: 1) v plazmidu pHDEFI nahradzuje Ehel/Sall fragment o velkost 2 kb odvodený z plazmidu pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) obsahujúci gén pre rezistenciu voči hygromycínu fragment Pmel/Sall o velkosti 19 bp z pDEFI; 2) v plazmidu pHDEFI je expresia génu pre dihydrofolát reduktázu (DHFR) riadená skráteným promotorom 5V40 umiesteným na Nhel/Asp718 fragmentu o velkosti 120 bp. Tento fragment nahradzuje odpovedajúci Nhel/Asp718 fragment o velkosti 212 bp z pDEFI a bol pripravený PCR amplifikáciu 171 bp fragmentu s využitím primeru 94-26 ·· ·· ·· · ·· «··· ··· ·· • e·· · · · · ·· • · ··· · · · ···· · · · ·· ···· ·· ·· ·· ·· · ·· (5' -TGATACGGTACCGCCCCATGGCTGACTA-3 ', SEK. ID. Č. : 16, obsahuje novo zavedené reštrikčné miesto Asp718) a 94-27 (5ZGCAAGTTTGGCGCGAAATCG-3', SEK. ID. Č.: 17). Pri tejto reakcii bola ako templát použitá DNA z plazmidu pDCI (popísané v príkladu 4 v prihláške US 08/847218, podané 1. mája, 1997), ktorý obsahuje kazetu 5V40-DHFR. Získaný produkt PCR reakcie o velkosti 171 bp byl následne štiepený reštrikčnými enzýmy NheI a Asp718.
Bunečná línia DG44 odvodená z ovárií čínského škrečka (CHO), ktorá neexprimuje DHFR, bola transfekovaná plazmidom pDEFI/CTN.I postupom popísaným v príklade 5 v prihláške US 08/847218, podané 1. mája, 1997. Táto línia buniek CHO DG44 bola taktiež transfekovaná plazmidom pHDEFI/CTN.l a následne pak selektovaná následujúcim upraveným postupom.
Najprv boli v médiu DMEM/F-12 doplnenom 2 až 10% FBS
- r obsahujúcim hygromycín (Calbiochem, San Diego, CA) v koncentrácii 800 mg/ml a taktiež obsahujúcim hypoxantin a thymidín (toto médium nebolo tedy selektívne pre gén kódujúci DHFR) selektované iba bunky rezistentné voči hygromycínu. Po selekcii transfektantov rezistentných voči hygromycínu boli tieto bunky následne selektované kultiváciou v médiu postrádajúcim hypoxantin a tymidín. Takto vyselektované CHO bunky exprimujúci DHFR a rezistentný voči hygromycínu boli ďalej selektované v médiu obsahujúcom najprv 10 nM, potom 20 nM a nakoniec 50 nM metotrexát, tým bylo dosiahnuté selekcie buniek exprimujúcich väčšie množstvo chitinázy.
Rekombinantná ludská chitináza (rH-chitináza) bola zo supernatantu z kultivácie buniek CHO transfekovaných pHDEFI/CTN.l purifikovaná nasledujúcim spôsobom. Pri príprave na chromatografiiu na anexe bol supernatant zriedený v pomere 1:3 pufrom o zložení 20 mM Tris, pH 7,0 (pufor A). Kolóna pre ·· ·· ·· ·· • · · · ··· · · · • t · · · · · · ·· • · ··· · · · ···· · · · • · ···· · · ·· ·· ·· · ·· · anexovú chromatografiu, naplnená Q-Sepharózou Fast Flow (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ), bola ekvilibrovaná pufrom A a na 1 liter nosiče bolo aplikované 15 litrov zriedeného supernatantu. rH-chitináza byla zachytená vo frakcii preteklé cez sltípec Q-Sepharózy a zloženie tejto frakcie bolo upravené na výsledné koncentrácie 5% polyetylénglykol (PEG) 400 (Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ), 30 mM octan sodný, pH 4,3. Kolóna pre katexovú chromatografiu, naplnená CM-Sepharózou Fast Flow {Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NsJ) bola ekvilibrovaná pufrom o zložení 30 mM octan sodný, 5% PEG 400, pH 4,3 (pufor B) . Vzorka rH-chitinázy bol na stĺpec CM-Sepharózy nanesený v množstve 1 mg na ml nosiče a rH-chitináza bola z nosiča eluovaná pufrom o zložení 40 mM Tris, 5% PEG 400, pH 7,5 (pufor C) . Následne byla vzorka rH-chitinázy pre hydrofóbne chromatografiu upravená prídavkom (NH4)2 SO4 na výslednú koncentráciu 1,5 M. Kolona naplnená nosičom Macro-Prep Methyl H1C Support (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) bola ekvilibrovaná pufrom o zložení 20 mM Tris, 5% PEG 400, pH 7,0 (pufor D) . Vzorka rH-chitinázy bola na stĺpec nosiča MacroPrep Methyl H1C nanesená v množstve 1 mg na ml nosiča. Kolóna bola premytá pufrom D obsahujúcim 1,1 M (NH4)2 S04 a rHchitináza bola z nosiča eluovaná pufrom D obsahujúcim 0,2 M (NH4)2SO4. Filtrácciou cez membránu bol purifikovaný eluát prevedený do pufru o zložení 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,0 (pufor E) ,
Produkcia analógov a fragmentov ľudskej chitinázy
Príklad 6
I
Polypeptidové analógy a fragmenty ludskej chitinázy boli pripravené technikami popísanými v predchodzích príkladoch. Presnej i povedané, polynukleotídy kódujúce ludskou chitinázu boli známymi metódami, napríklad cielenou mutagenéziou a polymerázovou ŕeťazcovou reakciou, modifikované tak, aby kódovali požadované peptidové analógy. Boli taktiež pripravené Ckoncové a N-koncové delécie, napríklad odstránením vhodné časti polynukleotidové kódujúce sekvencie (napríklad Sambrook a ďalší, viď. vyššie, kapitola 15) . Takto modifikované polynukleotidy sú exprimované a analógy alebo fragmenty rekombinantných polypeptidov sú purifikované postupmi popísanými v predchodzích príkladoch.
Aminokyselínové zvyšky dôležité pre aktivitu ludskej chitinázy sú identifikované napríklad podlá homológie s inými chitinázami alebo náhradou aminokyselinových zvyškov v natívnej ludskej chitináze alaníny. Vzhiadom k schopnosti vytvárať disulfidícke môstky a stabilizovať sekundárne štruktúry sú cysteíny často kritické pre udrženie funkčnej integrity proteínov. Za účelom zjištenia, ktoré z cysteínov v ludskej chitináze sú nepostradatelné pre enzymovú aktivitu, bol každý cysteín jednotlivé mutovaný na serín.
Postupem popísaným v príkladech 3 a 5, t j. zavedením stop kodónu za kodón pre aminokyselinu 373, bol pripravený fragment maturovanej ludskej chitinázy o velkosti 39 kDa zkrátený z Ckonca. Tento 39 kDa fragment postráda, v srovnaní s nezkráteným proteínom, 72 C-koncových aminokyselín, vrátane šiestich cysteínov, a cez to si ve srovnaniu s nezkrátenou rekombinantnou ludskou chitinázou zachováva podobnou špecifickou aktivitu. Tento výsledok naznačuje, že chýbajúcich 72 Ckoncových aminokyselinových zvyškov, vrátane šiesti cysteínov, nie je pre enzymatickú aktivitu nezbytných.
·· · ··
• ·
Môžu byť pripravené ďalšie delécie C-koncových aminokyselín, napríklad štiepením 3' konca sekvencie kódujúcu skrátenou ludskou chitinázu popísané v príkladu 3 exonukleázou III v rôzných časových intervaloch a následnou ligáciou takto skrátených kódujúcich sekvencii do plazmidovej DNA kódujúcej stop kodóny ve všetkých troch čítacích rámcoch. N-koncové delécie sú pripravené podobným postupom štiepením 5' konca spomínanej kódujúcej sekvencie a následnou ligáciou štiepených fragmentov do plazmidu obsahujúceho proti smeru transkripcie od týchto fragmentov promotorovú sekvenciu a štartovný metionin. Tieto N-koncové delečné analógy alebo fragmenty môžu byť taktiež exprimované vo forme fúznych proteínov.
Inou možnosťou je príprava polypeptidových analóg ludskej chitinázy celkovou alebo čiastočnou chemickou syntézou peptidov s využitím techník v súčasnosti známych (viď. napríklad syntéza IL-8 v publikácii Clark-Lewis a ďalší, J. Biol. Chem., 266:23128 až 23134, 1991; syntéza IL-3 v publikácii Clark-Lewis a ďalší, Science, 231:134 až 139, 1986; a syntéza ligáciou popísaná v publikácii Dawson a ďalší, Science, 266:776 až 779, 1994). Tieto postupy syntézy taktiež umožňujú zavedenie nových, prirodzene sa nevyskytujúcich aminokyselín a iných modifikácií.
Biologické aktivity polypeptidových analógov ludskej chitinázy, vrátane aktivity enzymatícke, anti-fungálne a remodelingu extracelulárnej matrix, sú stanovované v súčasnosti používanými technikami, ako napríklad postupmi popísanými v príkladoch 9 až 15 uvedených v ďalšom texte.
Príklad 7 ·· ·· • · · · • · · · • · ··· · • · · ·· ·· ai a • a a • a a · a a aaaa • a · aa a aa a a a a a a · a • a aa a
Produkcia chitín-väzobných fragmentov a analogov ľudskej chitinázy
Umiestnenie chitín-väzobnej domény v ľudskej chitináze bolo určované tak, že boli konštruované fúzne proteíny obsahujúce čásť ľudskej chitinázy skrátenej z N-konca a u týchto produktov bola testovaná chitín-väzobná aktivita. Následujúcim postupom bol najprv vytvorený chimerícký proteín zahŕňajúci neskrátenú sekretovanú alkalickú fosfatázu (SEAP; na N-koncu tohto chimeríckeho konštruktu) (Berger a ďalší, Gene, 66:1 až 10, 1988) pripojenú k 99 C-koncovým aminokyselinám ludskej chitinázy (na C-koncu tohto chimeríckeho konštruktu). SEAP slúži v tomto chimeríckom produktu ako detekovatelná značka.
S využitím primérov SEAP Štart (SEK. ID. Č.: 18) a SEAP Stop (SEK. ID. Č.: 19), ktoré zavádzajú na 5' koniec reštrikčné miesto HindlII a na 3' koniec polyklonovacie miesto, bola z kontrolného plazmidu pSEAP2 (Clontech, Palo Alto, CA) PCR reakciou amplifikovaná DNA kódujúca SEAP. Pri PCR bolo použité 100 ng templátovej DNA, 1 ug každého z primérov, 0,125 mM jednotlivej dNTP, 10 mM TriS-HCl, pH 8,4, 50 mM MgCl2 a 2,5 jednotky polymerázy Taq. Prvým krokom bola denaturácia pri 94 °C po dobu 4 minút a potom následovalo 30 cyklov amplifikácie: 1 minúta pri 94°C, 1 minúta pri 60°C a 2 minúty pri 72°C. Takto pripravená DNA bola zaklonovaná do miest HindlII a Apal v vektore pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) a vzniklý produkt bol označený pcDNA-SEAP. DNA kódujúca
C-koncových aminokyselín ludskej chitinázy (aminokyselinové zvyšky 347 až 445) bola amplifikovaná PCR za podmienok uvedených vyššie a s využitím primérov popísaných v tabulke uvedenej ďalej v texte (tieto priméry zavádzajú na 5' koniec a ·· ·· • · · · • · · · • · ··· · • · · • · · • · · · • · ···· · «· ·· ·· ·
3' koniec reštrikčné miesta EcoRI respektíve Xbal). Táto DNA kódujúca chitinázu bola zaklonovaná do miest EcoRI a Xbal v polyklonovaciej oblasti plazmidu pcDNA-SEAP.
Výsledným konštruktom kódujúcim uvedený chimerícky proteín boli tranzientne transfekované bunky COS7 1,5 hodinovou inkubáciou v DMEM (Dulbecco's modified Eagle médium) obsahujúcom 0,5 mg/ml DEAE dextránu, 0,1 mM chloroquin a 10 ug plazmidovej DNA. Následne boli bunky na 45 sekúnd vystavené pôsobeniu 10% DMSO vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátovým pufrom, premyté bezsérovým médiem a inkubované v DMEM doplnenom 1 mM glutamínom, 100 U/ml penicilínu, 100 ug/ml streptomycínu a 10% fetálnym telacím sérom. Po štyroch dňoch bola postupom popísaným v publikáci Flanagan a Leder (Celí, 63:185 až 194,1990) v kultivačnom médiu stanovená aktivita SEAP. Táto aktivita bola dobre detekovatelná. Inkubácia tohto kultivačného média obsahujúceho spomínanýný fúzny proteín s nerozpustným chitínom (Sigma, St. Louis, MO) po dobu 1 hodiny pri 4°C mala za následok precipitáciu viacej ako 80% aktivity SEAP. Tento výsledok ukazuje, že celá chitín-väzobná doména spadá do oblasti 99 C-koncových aminokyselín ludskej chitinázy.
PCR boli pripravené ďalšie skrátené verzie DNA kódujúce chitín-väzobné domény a tieto, boli exprimované ako fúzne proteíny s SEAP, ako je uvedené v predchodzom texte. U týchto fúznych proteínov bola stanovovaná chitín-väzobná aktivita a získané výsledky sú uvedené v tabulke 1.
·* • · • · • · • · · ·· · • · ·· ·· • 9 9 9 • · · · • · ··· · • · · ·· ·· • · ···· ··
Tabulka 1
Testované zkrácené kon- stxukty Použité prirr.ery C’nitin-vazebnS aktivita
Aminokyseliny 347 až 445 SE/ι? CBD 1143 (SEK. ID. Č.: 20) a Hu Chit Stop (SSK. ID. Č.: 26) +
Aminokyseliny 374 až 445 SEŕ.P CBD 1231 {SEK. ID. Č.: 21) a Ku Chit Stop (SEK. ID. Č.: 26) +
Äi.-.inokyS’.'lir.y 352 až 445 SKAP CED 12Š5 (SEK. ID. Č.: 22) a Ku Chit Stop (SEX. ID. Λ . *·» v t i„. : í. c, +
Ar · rz-kysol ir.y 4?J až 445 SEA? CBD 13C93 (SEK. ID. Č.: 23) a Ku Chit Stop (SEK. ID. ': 2 ύ; -
SEAÍ CSU Iíj; (SEK. TD. Č.: 24) a Hu Cnit Stop (SEK. ID. Č. : ? ó; -
445
£jt t n -z· k y1 i r. y 3 4a ž 431 SEA? CľP 114? (SEK. ID. Č.: 20) a SEA.F CBD 1357 (SEK. ID. Č.: 25) -
Am: r.o ys e 1 i n y 37 4 až 431 SEA: CBD 1231 (3EK. ID. Č.: 21) a SEA? CBD 1357 (SEK. ID. Λ· . c » · · t. t -
Aminokyseliny 392 až 431 SEA? CBD 1255 (SEK. ID. Č.: 22) a SEAP CBD 1357 (SEK. ID. Č.: 25) -
Aminokyseliny 395 až 445 SEA? CBD 1256 (SEK. ID. Č.: 35) a Hu Chit Sto? (SEK. ID. Č.: 26) +
Aminokyseliny 357 až 445 SEA? CBD 1307 (SEK. ID. Č.: 36) a Ku Chit Sto? (SEK. ID. Č.: 26) +
Aminokyseliny 3?2 až 443 C f *· 13 .*’Ľ , * *) 2 £ ' 2 ?ľ T h Λ . “ teCto/ X w J ( t X L·* a <·« · 22) a Ku Chit Step 7 (SEK. ID. u. : ”! -
·· ·· ·· · ··
B··· ··· ··
B··· I··· · »
B · ··· · · · ···· · · ·
B · · · · · · · ·· «· ·· · ·· ··
B. Príprava analógov s mutovanými cysteíny
Za účelom zistenia, či nejaký z šiestich cysteínových zvyškov prítomných v sekvencií 99 C-koncových aminokyselín ľudskej chitinázy nepostradatelný pre väzbu chitínu, boli pripravené analógy fragmentov chitinázy, kde bol každý jednotlivý cysteín mutovaný na serín. S využitím primérov popísaných v tabulke 2 bolo PCR prístupom vytvorené šesť produktov, kde v každom z nich byl mutovaný jeden z prítomných cysteínov na serín. Tieto produkty boli postupom uvedenom v predchozom texte pripojené k cDNA kódujúcej SEAP. Chitínväzobná aktivita chimeríckych proteínov produkovaných transientne transfekovanými bunkami COS bola stanovovaná postupom popísaným vyššie. Získané výsledky ukazujú, že každý z týchto šiestich cysteínových aminokyselinových zvyškov je nezbytný pre chitin-väzobnú aktivitu.
Tabulka 2
Testovaný ar.alog Pobité prinery 1 Ch i t i n -vatehná aktivita
./.v- c-/j oci í sek. ID. Č. : 27i a
C3995
Hu Cm t Stop (SE/. ID. C. : 26)
SEA? CÔD cC2 {SEK. ID. Č. : 28; a
C419S
Ku Chit Stop (SEK. ID. C. : 26)
SEA? C3D 1235 (SEK . ID. Č .: 22) Ί .........
C4293
a S ĽA? CH? dC3 '? E <. IC. C.: 23)
SEA.- C3? 12S5 (SEK . ID. Č .: 22)
C43S5
a SEA? CE? dC4 (SE <. IC. Č.: 30;
SEA? CS? 1235 (SEK . ID. Č . : 22) —
C441S
SEAP CRD dC5 {SFK. ID. Č.: 31)
SEA? CS? i2»5 (SEK . ID. Ú . : 22)
C4423
?. SEA? CED dCô ΈΕΚ. IL. C.: 32)
·· ·· ·· · ·· • · · · ··· ··· ···· ···· ·· • · ··· · · · ···· · · ·
Ako je popísané v príklade 6, rekombinantnými technikami alebo čiastočnou alebo totálnou chemickou syntézou môžu byť pripravené ďalšie chitín-väzobné fragmenty a ich analógy.
C. Expresia chitín-väzobných fragmentov v kvasinkách
Fragment chitín-väzobnéj domény zahŕňajúce aminokyselinové zvyšky 392 až 445 (v SEK. ID. Č.: 2) bol vo velkom množstve exprimovaný v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae. Expresívny konštrukt a-FLAG-CBD bol pripravený tak, že nukleotidová sekvencia odpovedajúca v SEK. ID. Č. : 2 aminokyselinovým zvyškom 392 až 445 bola pripojená k 3' koncu sekvencie kódujúci pre-pro-sekvenciu α-faktoru S. cerevisiae (Brake a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:4642 až 4646, 1984) a epitópu FLAG (Eastman Kodak) . Za týmto účelom bol DNA templát neskrátenej ľudskej chitinázy PCR amplifikovaný s využitím primérov CBDaaxFLAG (priamy, SEK. ID. Č.: 33) a Hu Chit Stop 5 (reverzný, SEK. ID. Č.: 34). Sekvencia priméru CBDaaxFLAG obsahuje v smere proti smeru transkripcie od oblasti kódujúcu FLAG epitóp reštrikčné miesto Asp718 a FLAG epitop je v rovnakom čítacom rámci so sekvenciou kódujúcou prvých osem aminokyselín chitín-väzobné domény fragmentu 392 až 445. Primer Hu Chit Stop S kóduje sedem C-koncových aminokyselín spomínaného fragmentu chitín-väzobné domény a ďalej sekvenciu Gly-Ala-Gly pripojenú k šiesti histidínovým zvyškom (Hise), za ktorou následuje segment troch aminokyselín a kodón pre ukončenie translácie. Sekvencia Hiss je zavedená za účelom usnadnenia purifikácie exprimovaného produktu afinítnou chromatografiou na imobilizovanom kove (popísaná v publikácii Nilsson a ďalší, Prot. Expr. Purification, 11:1 až 16, ·· ·· ·· ·· · • · · · ··· · ·
Λ · · · ···· ·· • · ··· · · · ···· · · · ·· ·· ·· · ··
1997). Ihneď za stop kodón bolo zavedené reštrikčné miesto Nôti.
Produkt amplifikovaný s využitím spomínaných primérov bol štiepený reštrikčnými enzýmy Nôti a Asp718 a zaklonovaný do odpovedajúcich miest v expresívnej kazete plazmidu pAYE/VEC, ktorý je odvodený od plazmidu pAYE674 (Delta Biotechnology Limited; Sleep a ďalší, Bio/Technology, 9:183 až 187,
1991). Takto bola taktiež zavedená reštrikčné miesta usnadňujúca inkorporáciu expresívnych kaziet do vektora pSAC/VEC (viz. nižše). Expresívna kazeta v pripravenom konštruktu, označenom pAYE/AF/CBD, zahŕňa fúziu nukleotidov (v rovnakom čítacom rámci) kódujúcich pre-pro-sekvenciu α-faktoru S. cerevisiae a fragment chitín-väzobné domény. Po syntéze je tento fúzny protein smerovaný k bunečnej membráne, kde je peptid FLAG-fragment chitín-väzobné domény-Hiss činnosťou proteázy KEX2 odštiepený od pre-pro-sekvencie a-faktoru. Transkripcia fúzneho proteínu pre-pro-CBD je riadená silným promotórom PRBI a transkripcia je ukončená terminátorom transkripcie ADHI.
Spomínaná expresívna kazeta bola z plazmidu pAYE/AF/CBD vyštiepená reštrikčnými enzýmy Sfil a PacI a zaklonovaná do odpovedajúcich miest vo vektore pSAC/VEC, ktorý je odvodený od vektoru pSAC35 (Delta Biotechnology Limited; Sleep a ďalší, viď. vyššie) začlenením polyklonovacieho miesta. Člnkový vektor pSAC35 zahŕňa kompletný plazmid 2 μ so selekčným markerom LEU2 a dve repetitívne sekvencie ohraničujúce počiatok replikácie pre expresiu v E.coli a gén pre βlaktamázu, odvodené od vektoru pUC. Výsledným plazmidom pSAC2/AF/CBD bol postupom podlá Ito a ďalší, J. Bacteriol., 153:163 až 168, 1983, transformovaný hostiteľský kmeň Saccharomyces cerevisiae IE41 (cir°leu2 pep4::URA3 L261, ·· • · · · • · · · • ·· · • · · ·· ·· ·· · ·· • · · · · · • · · · · · • · ···· · · · • · · · ·
Sleep a ďalší, viď, vyššie) a rezistentné bunky boli selektované na médiu postrádajúcom leucín. Po transformácii plazmidu pSAC2/AF/CBD do hostitelského kmeňa dôjde k rekombinácii repetitívnych sekvencií, čím je eliminovaná sekvencia pUC. Vzniklý vektor je autonómne replikovaný, velmi stabilný a umožňuje vysokú hladinu expresie kódovaného produktu pri kultiváci hostitelských buniek ako v selekčnom, tak neselekčnom médiu (Sleep a ďalší, viď. vyšie).
Po klonálnej selekcii boli štyry ze získaných klonov kvasiniek kultivované 16 hodín pri 30°C v 2 ml selekčného média. Tieto kultúry boli následne prenesené do 18 ml média YEPD a kultivované pri 30°C ďalších 40 hodín. Kultivačné médiá boli oddelené od buniek a expresia rekombinantného proteínu bola stanovená SDS-PAGE. Z gélu bolo zrejmé, že rekombinantný fragment chitín-väzobnej domény (aminokyseliny 392 až 445) byl sekretovaný všetkými štvormi klonami, ale nie bunkami transformovanými prázdnym kontrolným vektorom. Metódou Western blot, s využitím monoklonálnej protilátky 243Q namierenej proti chitín-väzobnej doméne, bolo preukázané, že sekretovaným proteínom je vskutku fragment chitín-väzobnej domény.
Médium je fragmentom chitín-viažúcej domény velmi nabohatené, ale tento proteín tu nie je v čistej forme. Najprv bola provedená pilotná purifikácia malého množstva proteínu afinítnou chromatografiou na nosiču s imobilizovaným kovom, čím bol získaný čistý preparát. Do kolóny o objemu 12 ml (BioRad) boli umiestené 2 ml chelatačnej Sepharózy Fast Flow (Pharmacia). Potom bol nosič nabitý ióny niklu aplikáciou 10 ml 50 mM roztoku síranu nikelnatého. Následovalo premytie 10, ml destilovanej vody a kolóna bola ekvilibrovaná 10 ml pufra A (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 M NaCl). Pred nanáškou na kolónu bolo pH kultivačného média (kultiváce klonu 34A) upravené ·· ·· • · · · • · · · ·· • · ·· · • · · ·· ·· ··· · · · · • · ···· · · • · · · ·· · ·· · prídavkem Trisového pufra na hodnotu 8 a výslednou koncentráciu 20 mM Tris. Na kolónu bolo aplikované 14 ml takto upraveného média a následovalo premytie 10 ml pufra A. Rekombinantný proteín bol následne eluovaný pufrom A obsahujúcom 10 (2 ml), 50 (2 ml) a 100 mM (3 ml) imidazol. Desať mikrolitrov z každej frakcie pri purifikácii bolo analyzováné SDS-PAGE. Z gélu bolo patrné, že rekombinantný fragment chitín-väzobnej domény (aminokyseliny 392 až 445) bol v podstate v čistej forme eluovaný 100 mM imidazolom. Frakcie 2 a 3 získané elúciou 100 mM imidazolom boli spojené. Tieto spojené frakcie obsahovali purifikovaný proteín v koncentrácii približné 0,4 mg/ml.
Funkčnosť rekombinantného proteínu bola analyzovaná inkubáciou 25 μΐ roztoku fragmentu chitín-väzobnej domény (aminokyseliny 392 až 445) s 1 mg práškového chitínu po dobu 1 hodiny pri 4°C. Po ukončení inkubácie bol nerozpustný chitín odstránený centrifugáciou a množstvo proteínov ostalého v supernatantu bolo (SDS-PAGE) srovnané s množstvom prítomným v kontrolnom médiu bez prídavku chitínu. V médiu s prídavkom chitínu bolo pozorované približne 50% zníženie množstvá rekombinantného proteínu. To ukazuje, že aspoň signifikantné frakcie tohto rekombinantného proteínu si uchováva schopnosť viazať chitín.
Za účelom expresie fragmentu chitín-väzobnej domény zahŕňajúci aminokyselinové zvyšky 392 až 445 (v SEK. ID. Č.: 2) bez epitópov FLAG a His6 bol vytvorený druhý konštrukt pre expresiu v kvasinkách. Tento konštrukt bol vytvorený postupom obdobným postupu popísanom v predchodzom texte s tým rozdielom, že k amplifikácii oblasti chitín-väzobnej domény boli použité priméry CBDa (priamy, SEK. ID. Č.: 38) a Hu Chit ·· ·· ·· · ·· ···· ··· ··· ···· · · · · · · • · ··· · · · ···· · · · ·· ·· ·· · ·· ···
Stop 4 (reverzný, SEK. ID. Č.: 39). Bunky boli transformované a selektované postupom popísaným vyššie.
Transformované klony kvasiniek exprimujúci rekombinantná chitín-väzobnú doménu boli pri 30°C kultivované cez noc v 10 ml média SC-leu-ura (BiolOl, Vista, CA) obsahujúceho 2% glukózu. Jedným mililitrom tejto kultúry bolo inokulované 100 ml totožného média a inkubácia ďalej pokračovala pri 30°C za stáleho trepania. Po 19 hodinách bolo 65 ml tejto kultúry prevedené do 1,2 litra média YB2V (0,2% glukóza, 0,008% FeCl3, 1 g/1 citrátu trisodného, 25 g/1 casamino kyselín, 13,5 g/1 KH 2PO4, 3, 8 g/1 (NH4)2 SO4, 4 mM MgSO4, 0, 0004 % thiamín, stopové prvky a vitamíny) ve fermentore o objeme 3 litre. Fermentácia prebiehala pri 30°C, pH 5,5, rýchlosti trepania 1200 otáčok za minútu a prúdenia vzduchu 3 1/min. pH kultivačného média bolo udržované pomocou kyseliny fosforečnej a hydroxidu amónneho. Prvých 13 hodín bol fermentor vo vsádzkovom režime a potom začalo pridávanie ďalších živín. Najprv bylo do fermentóra po dobu 4 hodín pridávané médium YFV6.1 (50% glukóza, 0,02% FeCl3, 1 g/1 citrátu trisodného, 50 g/1 casamino kyselín, 2,9 g/1 KH 2PO4, 5 g/1 (NH4)2 SO4, 15,2 mM MgSO4, 0, 001 % thiamín, stopové prvky a vitamíny) konštantnou rýchlosťou 3,6 ml/hod a potom bola rýchlosť vstrikovania zvyšovaná exponenciálne s dobou zdvojenia 5 hodín na maximum 9,38 ml/hodina. Po ukončení kultivácie po 93 hodinách boli bunky zcentrifugované. 1,6 litrov kultivačného média bolo centrifugované 40 minút pri 5000 x g a teplote 4°C. Bunečná peleta bola odstránená a supernatant zfiltrovaný cez 0,2 pm filter.
Rekombinantná chitín-väzobná doména bola z kultivačného média z fermentóra purifikovaná na stĺpci chitinových čiastíc.
Do kolóny o objeme 50 ml (Amicon) bylo vnesené 25 ml ·· ·· ·· · • · · • · · · • · ···· · • · · ·· · ·· • · · • · ·· · chitinových partikulí (New England Biolabs), kolóna bola premytá 250 ml 1% SDS a ekvilibrovaná 250 ml pufra A (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 M NaCl) pri prietoke 2 ml/min. Vycerené médium bolo na kolónu aplikované rýchlosťou 1 ml/min. Následne byla kolóna premytá 250 ml pufra A a proteín bol z kolóny eluovaný 50% acetonitrilom, 0,1% trifluóroacetátom a eluát bol zbieraný vo frakciách o objeme 4 ml. Acetonitril bol z eluátu odparený vákuovou centrifugáciou. Analýzou eluovaných frakcií SDS-PAGE a kvantifikáciou obsahu proteínu bylo zistené, že 94% purifikovanej chitín-väzobnej domény bolo prítomné v troch po sebe idúcich frakciách. Celkom bolo zo 130 ml kultivačného média získané 109 mg chitín-väzobnej domény. Analýza purifikovaného proteínu hmotnostnou spektrometriou metódou MALDI (Perseptive Biosystems) ukázala jeden vrchol s molekulovou hmotnosťou 5911,9, čo dobre korešponduje s predpovedanou molekulovou hmotnosťou 5909,8. Pri testovaní funkčnej integrity bolo 20 pg purifikovanej chitín-väzobnej domény zmiešané s 250 μΐ chitinových partikulí a výsledkom bolo naviazanie viacej ako 95% peptidu na nosič.
Príklad 8
Príprava monoklonálnych protilátok proti ludskej chitináze
K príprave monoklonálnych protilátok proti ludskej chitináze môžu byť použité následujúce dva protokoly (imunizácie jednou dávkou a alebo viacnásobná imunizácia). Pri prvom z postupov bola myš imunizovaná opakovanými injekciami rekombinantnej ludskej chitinázy (napríklad 10 až 20 pg chitinázy emulzifikovanej v kompletnom Freundove adjuvans) získané akýmkoľvek z postupov popísaných v príkladoch 3 až 6. 4 dny po poslednej posilovacej dávke ludské chitinázy v PBS ·· • · »· · · • · • · · • ···· • · ·· • · • · • · • · bola myš usmrtená a bola jej odobratá slezina. Slezina bola umiestená do 10 ml bezsérového média RPMI 1640 a suspenzia jednotlivých buniek bola vytvorená rozmrvením sleziny medzi koncami dvoch mikroskopických podložných sklíčok v bezsérovom médiu. RPMI 1640 doplnenom 2 mM L-glut amínom, 1 mM pyruvátom sodným, 100 U/ml penicilínu a 100 pg/ml streptomycínu (RPMI) (Gibco, Kanada). Bunečná suspenzia bola prefiltrovaná cez sterilné bunečné sietko Nitex (70-mesh, Becton Dickinson, Parsippany, New Yersey) a dvakrát premytá centrifugáciou pri 200 g po dobu 5 minút a následným rozsuspendovaním v 20 ml bezsérového média RPMI. Ako kontrola boli použité splenocyty izolované podobným postupom zo slezín troch neimunizovaných myšacích Balb/c. Myelómy NS-1, udržované tri dni pred fúziou v logaritmickej fázi rastu v RPMI doplnenom 11% fetálnym teľacím sérom (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah), boli centrifugované pri 200 g po dobu 5 minút a bunečná peleta bola dvakrát premytá.
x 106 splenocýtov bylo zmiešané 2 x 10' buniek NS-1, táto zmes bola zcentrifugovaná a supernatant odstránený. Poklopkaním na stenu skúmavky bola bunečná peleta uvoľnená a po dobu 1 minúty bol pri 37°C za stáleho miešania pridávaný 1 ml 50% PEGu 1500 (v 75 mM HEPES, pH 8,0) (Boehringer Mannheim). Nasledovalo pridávanie 7 ml bezsérového RPMI v časovom intervalu 7 minút. Bylo pridané ďalších 8 ml RPMI a bunky boli centri f ugované pri 200 g po dobu 10 minút. Po odstránení supernatantu bola bunečná peleta rozsuspendovaná v 200 ml RPMI obsahujúceho 15% FBS, 100 pM hypoxantín sodný, 0,4 pM aminopterín, 16 pM thymidín (HAT; Gibco), 25U/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) a 1,6 x 106 splenocýtov/ml a zmes bola vysiatá do desiatich 96-ti jamkových doštičiek pre tkáňovej kultúry s plochým dnom ( Corning, Corning New York).
·· ·· ·· · ···· ··· ··· • · · · · · · · ·· • · ··· · · · ···· «f ·
Druhý, štvrtý a šiesty deň po fúzii bolo 100 pl média z každej jamky nahradené médiom čerstvým. Ôsmy deň po fúzii bola v médiu metódou ELISA testovaná prítomnosť myšacích IgG schopných viazať ľudskou chitinázu. Toto testovanie bolo prevedené následujúcim spôsobom. Doštičky Immulon 4 (Dynatech, Cambridge, MA) boli potiahnuté 100 pg/jamka ľudskej chitinázy v 25 mM Trisu, pH 7,5. Poťahovanie prebiehalo 2 hodiny pri 37°C. Poťahovací roztok byl odstránený a do misiek bolo na 30 minút pri 37°C pridané 200 pl/jamka blokovacieho roztoku (0.5% želatína z rybacej kože (Sigma) rozpustená v CMF-PBS). Doštičky boli trikrát premyté PBS s 0,05% Tweenem 20 (PBST) a do každej jamky bolo pridané 50 pl supernatantov. Po 30-ti minútovej inkubácii pri 37°C a premytiu popísanom vyššie bolo pridané 50 pl kozacej protilátky proti myšacím IgG(fc) konjugované s chrenovou peroxidázou (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) riedené v pomeru 1:3500 v PBST. Inkubácia prebiehala 30 minút pri 37°C a po štyroch premytiach PBST bolo pridané 100 pl substrátu, tj. 1 mg/ml o-fenylén diamínu (Sigma) a 0, 1 pl/ml 30% H2O2 v 100 mM citrátovom pufre, pH 4,5. Farebná reakcia bola zastavená po 5 minútach prídavkom 50 pl 15% kyseliny sírovej a na čítačke doštičiek (Dynatech) bola nameraná absorbancia pri 490 nm. Zvolené jamky s hybridómy boli dvakrát klonované zriedením do 96-jamkových doštičiek a vizuálnym vyhodnotením počtu kolónií v jednej jamke po piatich dňoch. Izotypizácia monoklonálnych protilátok produkovaných hybridómy bola provedená pomocou systému Isostrip (Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN).
Druhý protokol využíva intraslezinnú imunizáciu jednou dávkou tak, ako je obecne popísaná v publikácii Spitz, Methods
Enzymol., 121:33 až 41, 1986). Do obnaženej sleziny bola injekovaná rekombinantná ludská chitináza (napríklad ·· ·· ·· ·· · • · · · ··· ··· ···· · · · · · 0 · · ··· · · · ···· · · · ········ *** ·· ·· ·· · ·· · až 20 pg v PBS v koncentrácii približne 0,02% až 0,04%, s alebo bez adjuvans) pripravená postupmi popísanými v príkladoch 3 až 6. Po tejto injikácii bola slezina vrátená zpäť do peritoneálnej dutiny a zvieratá boli zošité. Po troch dňoch bola myš usmrtené a bola jej zobratá slezina. Pripravená • suspenzia splenocýtov bola dvakrát premytá RPMI 1640 doplneným 3% fetálnym ťelacím sérom (FCS) a rozsuspendovaná v 25 ml
W tohto média. Myelómy NS-0 byly zobraté v logaritmickej fázi rastu, raz premyté a v 50 ml skúmavke pridané k suspenzii splenocýtov v pomeru 3:1 alebo 2:1 (splenocyty:myelómy). Táto zmes bola centrifugovaná pri približne 400 x g (1500 otáčok za minútu), supernatant bol odstránený a bunečná peleta bola uvolnená poklepom na stenu skúmavky. Fúzia bola prevedená pri pokojovej teplote prídavkom 1 ml polyetylénglykolu 1500 (PEG 1500) po dobu 1 minúty za stáleho miešanie. Táto zmes bola inkubovaná ďalšiu jednu minútu, potom bolo po dobu 1 minúty pridávané teplé médium RPMI (1 ml, 30 až 37°C) . Následoval prídavok 5 ml RPMI v intervalu 3 minút a ďalší prídavok 10 ml RPMI behom dalších troch minút. Táto bunečná suspenzia bola zcentrifugovaná a rozsuspendovaná v približné 200 ml selekčného média HAT obsahujúceho RPMI 1640 doplnenom 100 U/ml penicilínu a 100 pg/ml streptomycínu, 20% FCS, 100 μΜ hypoxantínom sodným, 0,4 uM aminopterínom, 16 uM thymidínom. Táto bunečná suspenzia bola v objemoch 1 ml rozdelená do k
doštičiek pre tkáňové kultúry a pri 37 C kultivovaná po dobu 8 až 10 dní ve vlhkej atmosfére s obsahom CO2 5%. V závislosti na raste buniek boli supernatanty v jednotlivých jamkách odstraňované a nahrazované 1 ml média HAT každé 2 až 3 dny. V supernatantoch z jamiek s konfluentnou vrstvou buniek bola zisťovaná prítomnosť špecifických protilátok a bunky z pozitívnych jamiek boli klonované.
• · ·· • · · * · • · · · · • · 999 9 9 • · · · ·· ·· ·· ·· • ···· · · ·· ·
S využitím protokolov uvedených v predchodzom texte bolo pripravené niekolko monoklonálnych protilátok špecificky reagujúcich s ludskou chitinázou. U fúzie 243 bolo každej z piatich myšacích Balb/c v starobe 6 až 12 týdňov najprv pred imunizáciou odobraté malé množstvo krvi a potom boli myši imunizované subkutánne injekciou 10 až 20 pg rekombinantnej ludskej chitinázy pripravenej postupom uvedeným v príklade 5, emulsifikovanej v kompletnom Freudove adjuvans. V dňoch 21, 42 a 60 po prvej imunizácii bola myšiam aplikovaná posilovacia dávka 50 pg rekombinantnej ludskej chitinázy v nekompletnom Freundove adjuvans. Myši 2483 bolo naviac v dňoch 216 až 219 denne aplikované 20 pg rekombinantnej ludskej chitinázy 220. Deň po prvej imunizácii bola myši 2483 sterílne odobratá slezina a spracovaná postupom uvedeným vyššie. Stručne povedané, najprv bola, rozmliaždením sleziny medzi koncami dvoch mikroskopických podložných skliečok v bezsérovom médiu RPMI 1640 doplnenom 2 mM L-glutamínom, 1 mM pyruvátom sodným, 100 U/ml penicilínu a 100 pg/ml streptomycínu (RPMI) (Gibco, Kanada), pripravená suspenzia jednotlivých buniek. Táto suspenzia bola prefiltrovaná cez sterílne bunečné sietko (Becton Dickinson, Parsippany, New Yersey) a dvakrát premytá centrifugáciou pri 200 g po dobu 5 minút a následným rozsuspendovaním v 20 ml bezsérového média RPMI. Thymocýty získané z neimunizovaných myší Balb/c boli pripravené podobným spôsobom.
Myelómy NS-1, udržované tri dny pred fúziou v logaritmickej fázi rastu v RPMI doplnenom 10% fetálnym telacím sérom (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah), boli centrifugované pri 200 g po dobu 5 minút a bunečná peleta bola dvakrát premytá a rozsuspendovaná v 10 ml bezsérového média
RPMI ·· ·· ·· · ·· • · · · ··· · · · • · · · · ι · ι ·· • · ··· · · · ···· · · · • · · · · · ·· ·· ·· ·· · ·· ·
Slezinné bunky boli zmiešané s bunkami NS-1 v pomere 1:5, táto zmes bola zcentrifugovaná pri 200 x g a supernatant odstránený. Poklopaním na stenu skúmavky bola bunečná peleta uvolnená a po dobu 1 minúty boli pri 37°C za stáleho miešania pridávané 2 ml 50% PEGu 1500 (v 75 mM HEPES, pH 8,0) (Boehringer Mannheim). Následovalo pridávanie 14 ml bezsérového RPMI v časovom intervalu 7 minút. Bolo pridané ďalších 16 ml RPMI a bunky boli centri f ugované pri 200 g po dobu 10 minút. Po odstránení supernatantu bola bunečná peleta rozsuspendovaná v 200 ml RPMI obsahujúceho 15% FBS,
100 μΜ hypoxantín sodný, 0,4 μΜ aminopterín, 16 μΜ thymidín (HAT; Gibco), 25U/ml rekombinantného ľudského IL-6 (Boehringer Mannheim) a 1,5 x 106 tymocýtov/ml. Táto suspenzie bola vysiata do desiatich 96-tich jamkových doštičiek pre tkáňové kultúry s plochým dnom (Corning, Spojené kráľovstvo) v objemu 200 μΙ/jamka. Pred screeningom bolo bunkám 3 až 5-krát vymenené približné 100 μΐ média nahradením rovnakým médiom popísaným vyššie, ale obsahujúcim lOU/ml IL-6 a neobsahujúcim thymocýty.
Supernatanty z fúzie 243 boli najprv testované metódou ELISA (ako imunogén bola použitá neskrátená forma ľudskej chitinázy), kde ako sekundárna protilátka bol použitý konjugát kozej protilátky proti myšacím IgG(fc) s chrenovou peroxidázou. Bunky z pozitívne reagujúcich jamiek boli 4-krát subklonované limitným riedením v médiu bez aminopterínu. Klonovaním boli získané bunečné línia 243K, 243M a 243Q.
Monoklonálne protilátky produkované dvomi bunečnými líniami boli izotypizované alebo súpravou Isostrip (Boehringer Mannheim) alebo metódou ELISA s využitím činidiel špecificky reagujúcich s jednotlivými izotýpmi (Zymed Laboratories,
South San Francisco, CA). Všetky protilátky sú izotýpu IgGI.
• · · · • · · · · • · · · β • · ··· · · • · · · ·· · • · « I · • · ·· • ···· · · • · » ·· • · · • · ·· ·
Testovanie, ak niektorá z týchto protilátok špecificky interaguje s chitín-väzobnou doménou, bolo prevedené tak, že každá z protilátok bola použitá pri Western blote s neskrátenou chitinázou, chitinázou skrátenou z C-konca (aminokyseliny 1 až 373) a rekombinantnej chitín-väzobnou doménou (aminokyseliny 392 až 445) produkovanými v kvasinkách. Všetky tri protilátky 243K, 243M a 243Q sa viažú na neskrátenú chitinázu a na chitín-väzobnú doménu, ale nie na konštrukt skrátený z C-konca.
Všetky kombinácie všetkých troch protilátok boli testované pre použitie v sendvičovej ELISA. Doštičky Nunc-Immuno Module boli cez noc pri 4°C inkubované s 125 μΐ prvej protilátky v koncentrácii 2 pg/ml. Následne bol roztok protilátky nahradený blokovacím roztokom v objeme 300 μΐ/jamka (5% Teleostean želatína, 0,05% Proclin 300 v CMF-PBS). Po 30 minútach inkubácie pri pokojovej teplote bol blokujúci roztok nahradený 20 ng/ml rekombinantnej chitín-väzobnej domény v Omni Diluent (5% Teleostean želatína, 0,05% Tween 20, 0,05% Proclin 300 v
CMF-PBS) a inkubácia pokračovala 30 minút pri 37°C. Jamky boli 5-krát premyté premývacím pufrom (145 mM NaCl, 1,5% Tween 20) a následne bola aplikovaná biotinylovaná sekundárna protilátka v koncentrácii 0,25 pg/ml. Po 30 minútach inkubácie pri 37°C boli jamky znovu 5-krát premyté potom 30 minút pri 37 °C inkubované s 100 μΐ chrenovej peroxidázy konjugovanej so streptavidínom (Pierce). Po ďalšom päťnásobnom premytí bolo do jamiek nanesené 100 μΐ substrátu (0,01 g/ml tetramethylbenzidínu v dimetylsulfoxidu zriedeného 1:100 do 100 mM trihydrátu octanu sodného, pH 5,5, 0,015% H 20 2) a inkubácia prebiehala v tme pri pokojovej teplote. Po 30 minútach bola reakcia zastavená prídavkom IN H2 SO4 a boli stanovené absorbancie pri vlnových dĺžkach 450 a 630 nm.
Pri tomto experimente bolo zistené, že najsilnejší signál bol • · ·· ·· · • · · • · ·
• · ·· ·· • ···· · · ·· ο • · ·· • t ·· · získaný použitím kombinácie protilátok 243Q (primárna protilátka) a 243M (sekundárna protilátka). Hybridom 243Q produkucom protilátku 243Q bol uložený_(dátum) v American
Type Culture Collection, 10801 Univesity Blvd., Manassas, VA 20110-2209 a bolo mu pridelené prístupové číslo Hybridom 243M produkujúci protilátku 243M bol uložený (dátum) v American Type Culture Collection, 10801 Univesity Blvd., Manassas, VA 20110-2209 a bolo mu pridelené prístupové číslo _
Príklad 9
Katalytická aktivita rekombinantnej chitinázy
Chitotriozidázová (chitinázová) aktivita bola stanovovaná pomocou fluorogeného substrátu 4-metylumbelliferyl-p- N,N',N'' -triacetylchitotriózy (4-MU-chitotriozid, Sigma Chemical, St. Louis, MO) v Mcllvainove pufru (Holak a ďalší, viď. vyššie) . Desať mikrolitrov vzorkov rekombinantného proteínu popísaného v príklade 5A bolo zmiešané s 10 μΐ bovinného sérového albumínu (10 mg/ml), 15 μΐ fluorogenného substrátu (2, 71 mM) a 65 μΐ pufru (0, 1 M kyselina citrónová, 0,2 M fosforečnan sodný, pH 5,2) v celkovom objeme 100 μΐ. Reakcia prebiehala 15 minút pri 37°C a bola zastavená prídavkom 2 ml 0,3 M pufra glycín/NaOH (pH 10,6). Fluorescenčný produkt štiepenia (4-metylumbelliferon) bol detekovaný na fluorimetru (SLM-AMINCO Instruments, Inc., Rochester, NY) pri 450 nm. Štandardná krivka bola získaná štiepením niekolko koncentrácií substrátu nadbytkom bakteriálnej chitinázy; tento pomer substrát chitináza zaručoval, že bude substrát kompletne rozštiepený. Známe množstvo 4-MU bylo následne korelované s nameraným fluorescenčným signálom a bola vytvorená štandardná ·· ·· ·· · ·· • · · · · · · · · « • · · · ···· ·· • · ··· · · · ···· · · · • · ···· ·· ·· ·· ·· · ·· · krivka. Intenzita fluorescencie zmeranej pri stanovení so zriedenou rekombinantnou chitinázou bola následne interpolovaná, čím bolo získané množstvo substrátu (v nmolech) rozštiepené enzýmom za daný čas. Toto číslo bolo následne vydelené koncentráciou proteínu, čím bola získána aktivita v jednotkách nmol/min/mg proteínu (množstvo proteínu bolo stanovené meraním pri A2eo a z vypočítaného molárneho extinkčného koeficientu).
Chitotriozidázová aktivita rekombinantnej ludské chitinázy produkovanej v COS bunkách (postupom popísaným v príklade 5A) bola 90 nmol/min/mg proteínu. Týmto spôsobom byla taktiež testovaná chitinázová aktivita každého z fragmentov chitinázy podía vynálezu.
Príklad 10
Antifungálna aktivita fragmentov chitinázy in vitro
Inhibície fungálneho rastu bežne používanými antifungálnymi zlúčeninami konjugovanými s fragmentárni ludskej chitinázy podľa vynálezu môže byť testovaná in vitro. Candida albicans a Aspergillus fumigatis sú nebezpečnými patogény pre jedinca s oslabeným imunitným systémom. Candida i Aspergillus boli kultivované pri 37°C v médiu RPMI do hustoty približné 10000 až 50000 jednotiek tvoriacich kolónie (CFU, colony forming unints) na ml. K týmto kultúram sú v rôznych riedeniach pridávané testované látky a meraním turbidíty kultúr po 24 hodinách je určovaná rýchlosť rastu.
· ·· *· · ·· • · * · ··· ··· • · · · · · · · · · • · ··· · · · ···· · · · • ···· ··
Antifungálna aktivita sledovaných látok môže byť taktiež testovaná metódou difúzie v agare, stanovením v živnom médiu podie National Committee on Clinical Laboratory Standards alebo testovaním inhibície syntézy bunečných stien podlá Selitrennikoff a ďalší (Anitimicrob. Agents Chemother., 23:757 až 765, 1983) .
Pri stanovení metodou difúzie v agare je 1,5% agar (s médiom RPMI pufrovaným kyselinou 2-(Nmorpolíno)propánsulfonovou) (MOPS), pH 7,0) inokulovaný Candida albicans (ATCC č. 90028) v koncentrácii približne lxlO6 buniek/ml. Na tento agar je umiestený disk obsahujúci definované množstvo, napríklad 50 pg, testovanej látky a je sledovaná oblasť inhibície rastu.
Pri stanovení v živnom médiu je definované množstvo, napríklad 50 pg, testovanej látky alebo kontrolnej látky spolu s určitou koncentráciou testovaného organizmu umiestené do média RPMI 1640 pufrovaného MOPSom, pH 7,0. Tieto vzorky sú za stálého trepania (120 otáčok za minútu) po dobu 48 hodín inkubované pri 35°C a rast kultúr je následne stanovovaný meraním turbidíty suspenzie. Vhodnými koncentráciami testovaných organizmov sú: 2,5xl04 buniek/ml Candida albicans (ATCC č. 90028); 5xl04 buniek/ml Candida albicans rezistentných voči polyénom (ATCC č. 38247); lxlO4 buniek/ml Aspergillus fumigatis (ATCC č. 16424); lxlO4 buniek/ml Neurospora crassa (ATCC č. 18889); a lxlO4 buniek/ml Saccharomyces cerevisiae (ATCC č. 26108).
Stanovenie využívajúce mutanty os-1, pomocou ktorého je možné identifikovať inhibítory biosyntézy bunečnej steny, je v podstate prevádzané postupom podía publikácie Selitrennikoff ·· ·· ·· · ·· • · · · ··· ··· ···· · · · ·· • · ··· · · · ···· · · · a ďalší, viď. vyššie. Inokulum l,5xl05 protoplastov/ml kultivovaných v agare (Vogelovo médium N, 7,5% sorbitol, 1,5% sacharóza, 10 pg/ml nikotinamid a 1% agar) je inkubované 72 hodín pri 25°C. Po umiestení disku obsahujúceho definované množstvo, napríklad 50 pg, testovanej látky alebo kontrolnej zlúčeniny sú sledované zmeny v raste a morfológii buniek. Buňky os-1 sú mutantným kmeňom Neurospora crassa, ktorý, ak je kultivovaný za určitých podmienok pri 37°C, rastú vo forme protoplastov, ale za vhodných podmienok a pri teplote 22°C znovu vytvárajú bunečnú stenu. Vzorky inhibujúce rast sú označované ako inhibítory rastu pliesní, zatial čo vzorky inhibujúce regeneráciu bunečnej steny, ale nezabíjajúce bunky, sú inhibítory špecificky blokujúci syntézu bunečnej steny.
Príklad 11
Antifungálna aktivita rekombinantnej chitinázy in vivo na myšacom modelu
Farmakokinetické parametre rekombinantnej ludskej chitinázy v organizme myší boli stanovené následujúcom spôsobom. Intravenóznou injekciou do ocasnej žily bylo samiciam myší Balb/c, vo veku 6 až 8 týždňov, aplikováné 0,5 mg/kg, 5 mg/kg a 50 mg/kg rekombinantnej ludskej chitinázy. 0,01, 0,25, 1, 8 a 24 hodín po injekciách boli myši dekapitované (dve zvieratá v danom čase a pre danú dávku) . Vo vzorkách séra bola následne stanovená chitinázová aktivita a koncentrácia chitinázy. Získané výsledky sú uvedené v tabulke 3.
·· ·· ·· · ·· • · · · ··· ···
9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · ··· · · 9 ···· · · · ·· · · · 9 9 9
Tabulka 3
Dávka AUC Vss cL MRT Biologický Cmax
(mg/kg) (pg/ml/h) (ml/kg) (ml/h/kg) (h) poiočas (h) (ug)
0,5 31,24 12,03 16,01 0,75 0,74 22,30
5,0 278,50 13,61 17,95 0,76 1,38 162,84
50,0 2505,83 52,92 19,95 2,65 2,33 1179,19
AUC: plocha pod krivkou do nekonečna
Vss: distribúčny objem cL: clearence
MRT: priemerná doba setrvania v organizm Cmax: maximálna sérová koncentrácia
Farmakokinetícké parametre fragmentov chitinázy podlá vynálezu alebo terapeutických zlúčenín zahŕňajúcich tieto fragmenty chitinázy môžu byť testované rovnakým spôsobom.
Za účelom testovania anti-fungálnych zlúčenín bolo vyvinuté niekolko živočíšnych modelov (viď. Louie a ďalší, Infect. Immun., 62:2761 až 2772, 1994; Kinsman a ďalší, Antimicrobial Agents and Chemoterapy, 37:1243 až 1246, 1993;
Nakajima a ďalší, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 39:1517 až 1521, 1995; Tonetti a ďalší, Eur. J. Immunol.,
25:1559 až 1565, 1995; Denning a Stevens. Anitimicrob.
Agents Chemother., 35:1329 až 1333, 1991; Stevens, J. Mycol.
Med., 6(Suppl. I):7 až 10, 1996). Stručne povedané, pokúsna zvieratá sú infikovaná patogénnymi hubami a následne sú im aplikované rôzne dávky testovaných zlúčenín a je sledovaná dĺžka prežívania. Môžu byť prevedené srovnávacie experimenty, pri ktorých je aplikovaná antifungálna látka samostatne alebo tá istá látka konjugovaná s nejakým fragmentom chitinázy.
·· ·· ·· ·· · • · · · ··· · • · · · · « · 9 · • · ··· · · · ···· · · ·· ·· ··
Týmto spôsobom je možné stanoviť, či konjugácia danej látky s chitin-väzobným fragmentom vylepšuje účinnosť tejto antifungálnej látky, napríklad vyvolaná aplikáciou Candida
Akútna systemická kandidóza u myší je intraperitoneálnou alebo intravenóznou albicans v množstve 10 x 106 CFU.
Terapeutické látky sú aplikované pred alebo v intervalu 1 až 5 hodín po infikácii a po piatich dňoch je stanovený počet jedincov, ktorí prežili. Myši môžu byť taktiež usmrtené a v jednotlivých orgánoch ako napríklad mozgu, ľadvinách, pľúcach, pečeni a slezine môže byť stanovené množstvo infekčných agens. V inom prípade môžu byť myši infikované nižšou dávkou patogénnych húb, napríklad Aspergillus (8 až 10 x 10® CFU) nebo Candida (1 x 10® CFU) , a prežívanie môže byť stanovované v dlhšom časovom intervalu, napríklad za 45 dni. Dlhodobá fungicídna/fungistatícka aktivita testovaných zlúčenín môže byť testovaná pokračovaním terapie po dobu jedného týždňa alebo dlhšie, napríklad 11 dní, a sledovaním pokusných zvierat v časovom horizonte niekolkých týždňov, napríklad 18 dní až jedného mesiaca. Účinné antifungálne látky zlepšujú dlouhodobé prežívanie pokusných živočíchov a znižujú počet infekčných agens v krvi a vnútorných orgánoch.
Príklad 12
Aktivita chitinázy in vivo na králičom modelu invazívnej aspergilózy
Účinnosť terapeutických látok zahŕňajúcich fragmenty chitinázy môže byť sledovaná na modelu invazívnej aspergilózy imunosuprimovaných králikov, ktorý je po viacej ako desať rokov používaný k testovaniu množstva nej rôznejších ·· ·· ·· ·· · • ••e ··· ·· • · · · ···· ·· • · ··· · · · ···· · · · antifungálnych terapií (viď. napríklad Andriole a ďalší, Clin. Infect. Dis., 14(Suppl. 1):5134 až 138, 1992). Tieto štúdie sú zvyčajne prevádzané postupmi podlá Patterson a ďalší, Anitimicrob. Agents Chemother., 37:2307 až 2310, 1993 alebo George a ďalší, J. Infect. Dis., 168:692 až 698, 1993. Stručne vzaté, prvý deň je králikom intravenózne podaný cyklofosfamid (200 mg), čím sa stanú leupenickými, a behom experimentu je im každý deň subkutánne aplikovaný triamcinolon acetonid (10 mg). Druhý deň, t j. 24 hodín po imunosupresii, je pokusným zvieraťom intravenózne aplikované približne 106 (letálna dávka) alebo približne 105 (subletálna dávka) konídií A. fumigatus. Antifungálna terapia s testovanou zlúčeninou je započatá 24 hodín po infikácii alebo 48 hodín pred infikáciou (prevencia) a pokračuje 5 až 6 dňov alebo do úmrtia pokusného zvieraťa. Dávky bežne používaných antifungálnych zlúčenín sa pohybujú v intervalu 1,5 nebo 0,5 mg/kg/deň pre intravenózne podávaný amfotericín B, 60 alebo 120 mg/kg/deň pre orálne podávaný flukonazol a 100 mg/kg/deň pre orálne podávaný 5-fluorcytozín. Kontrolnej skupine králikov nie je podávaná žiadna antifungálna zlúčenina.
Po úhyne alebo autopsii sú vzorky pečene, plúc, sleziny, ladvín a mozgu sledované histopatologícky a v týchto orgánoch je taktiež sledované množstvo CFU infekčného agens. Taktiež môžu byť prevádzané kultivácie infekčných agens zo vzoriek srdca, moči a krvi. V časových intervaloch sú odobraté vzorky krvi a v týchto je stanovovaný počet bielych krviniek a množstvo sacharidového antigénu z Aspergillus (metódou ELISA). Vplýv liečby testovanou zlúčeninou je vyhodnotený tromi parametrami: znížením mortality, znížením počtu mikroorganizmov Aspergillus kultivovaných z jednotlivých orgánov (mikrobiálna nálož) a zníženie množstvá antigénu z Aspergillus v cirkulácii. Účinne antifungálne látky znižujú mortalitu a/alebo mikrobiálnu nálož.
·· ·· ·· · ·· • · · · ··· ··
9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · ··· · · 9 9999 9 9 · ·· ·· ·· · ··
Na tomto modele môže byť taktiež testovaná pulmonálna aspergilóza postupom podľa Chilvers a ďalší, Mycopathologia, 108:163 až 171, 1989). Imunosuprimovaní králici sú intratracheálnou instiláciou infikovaní konídiemi Aspergillus fumigatus a v dňoch 1, 2, 4, 7 a 10 po infikácii nasleduje bronchoalveolárny výplach. Mikrobiálna nálož v pľúcach je kvantifikovaná kultiváciou infekčných agens, stanovením chitínu, počtom bielych krviniek a histopatológiou. Účinné antifungálne látky znižujú mikrobiálnu nálož alebo rozsah zápalu v plúcach.
Príklad 13
Aktivita chitinázy in diseminovanej kandidózy vivo na králičom modelu
Účinnosť terapeutických látok zahŕňajúcich fragmenty
chitinázy môže byť sledovaná na modelu diseminovanej kandidózy
postupom popísaným v publikácii Rouse a ďalší, Anitimicrob. Agents Chemother., 36:56 až 58, 1992. Novozélandské biele králiky boli systemícky infikovaní približne 3 x 106 blastospórami Candida albicans. Antifungálna terapia testovanými zlúčeninami bola zahájená 48 hodín po infikácii kandidami (alebo pred infekciou pri prevencii) a pokračovala napríklad 4 dny. Jedinci, ktorí prežili, boli usmrtené a z chlopne aorty, plúc, ladvín a sleziny boli kultivované infekčné agens. Tieto kultivácie a histopatologické pozorovanie môžu byť taktiež prevedené u iných orgánov ako napríklad pečene, mozgu alebo srdca. Kultivácie môžu byť taktiež prevedené zo vzorkov krvi a moči. Je stanovovaný vplyv antifungálnej terapie na úmrtnosť a mikrobiálna nálož v krvnom ·· ·· ·· · ·· • · · · ··· ··· • · · · · · · · ·· • · ··· · · · ···· · · · • · ···· ·· ·· ·· ·· e ·· · obehu alebo tkaniach. Bayer a ďalší, Anitimicrob. Agents Chemother., 19:179 až 184, 1981, popisuje model, v ktorom sú králici intraperitoneálne infikované približné 5 x 108 CFU Candida albicans. Štyry dni po tejto infikácii je králikom odobratá vzorka intraperitoneálnej tekutiny a kultiváciou je zistovaná prítomnosť infekčných agens. Pokusné zvieratá, u ktorých je týmto spôsobom prokázaný výskyt patogénnych húb, sú náhodne rozdelené do dvoch skupín - kontrolnej a liečenej. Antifungálna liečba testovanými látkami je zahájená sedem dňov po infikácii. Oči všetkých králikov sú sledované nepriamou oftalmoskopiou, pretože diseminovaná kandidóza môže viesť k endoftalmitíde spôsobenej Candidami. Po 7, 11 a 14 dňoch od zahájení terapie sú zvieratá usmrtená a v brušnej dutine sú sledované známky peritonitídy a tvorba intraabdominálnych abscesov. V očiach je sledovaný výskyt makroskopických lézí. Vzorky tkání z peritoneálnych abscesov, všetkých ďalších viditelných abscesov, ladvín, pečene, sleziny a očí sú zvážené, homogenizované v živnom bujóne z hovädzieho srdca, postupne riedené a kultiváciou je v nich stanovený počet CFU na gram tkáne. Renálne a peritoneálne abscesy sú taktiež 10% neutrálnym formaldehydom a analýze. Fungálna nálož a patogénnych húb sú v týchto rezoch stanovované farbením kyselinou jodistou Schiffovým činidlom. Je sledováné zlepšenie prežívania a sníženie fungálnej nálože ako dôsledku aplikácie testovaných látok.
podrobené morfológia fixované histopatologickej
Príklad 14
Aktivita chitinázy in vivo na králičom modelu fungálnej endoftalmitídy zahŕňajúcich na modele ·· ·· ·· · ·· ···· · · · · · · • · · · e · · · · · • · ··· · · · ···· · · · ·· ·· ·· fragmenty fungálnej postupom popísaným v
Účinnosť terapeutických látok chitinázy môže být sledovaná endoftalmitídy vyvolanej Candidami publikácii Park a ďalší, Anitimicrob. Agents Chemother., 39:958 až 963, 1995. Novozélandské biele králiky (2 až 2,5 kg) boli intravitreálne infikovaní približne 1000 CFU Candida albicans. Päť dní po infikácii bola endoftalmitída potvrdená nepriamou oftalmoskopiou a bola definovaná ako priemerný až ťažký zákal sklivca s čiastočným alebo úplným zastienením vaskulatúry retiny a choroidei vyššiej ako 50%. Zákal sklivca je klasifikovaný podía definovanej stupnice a vzhlad očného pozadia môže byť klasifikovaný a dokumentovaný fotograficky. Králiky boli následne liečené podávaním testovaných látok po dobu 2 až 4 týždňov. Tradične používané antifungálne látky sú zvyčajne aplikované v dávkách 80 mg/kg/den pri orálnej aplikácii flukonazolu a 100 mg/kg každých dvanácť hodín pri orálnej aplikácii 5-fluorcytozínu.
Účinnosť léčby je stanovovaná 2 až 4 týždne po zahájení a to nepriamou oftalmoskopiou, kvantifikáciou fungálnej nálože a histopatológiou. Fungálna nálož je kvantifikovaná tak, že sú odobrané a zvážené oči a odvážená časť každej vzorky je homogenizovaná a kultivovaná po dobu 48 hodín na brucela agaru-5% koňská krv pri 35°C v atmosfére 5 až 10% C02. Homogenizované vzorky môžu byť pred rozotretím na misky taktiež lOx až lOOx zriedenej sterilným fyziologickým roztokom.
Je stanovený počet kolónií na miskách a celkový počet CFU v oku je vypočítaný na základe znalosti počtu kolónií získaných z testovanej časti. Účinnosť liečby je potom definovaná znížením fungálnej nálože v oku. Pre histopatologické pozorovanie sú vzorky očí fixované vo folmalínu, zaliaté a rozkrájané na plátky o hrúbke 5 pm. Miesta zápalu, organizácie ·· ·· ·· · ·· ···· ··· ··· • · · · ···· · · • · ··· · · · ···· · · · • · ···· · · ·· ·· ·· · Φ· · väzivovej tkáne a prítomnosť patogénnych húb bola stanovovaná svetelnou mikroskópiou po odfarbení rezov zmesí hematoxylieozín alebo Gomorovým meténamino striebrom. Bol vyhodnotený vplýv testovaných antifungálnych látok na zníženie úmrtnosti, zníženia fungálnej nálože alebo zmiernenie zápalové • reakcie spojenej s infekciou.
Inou možnosťou je využitie králičieho modelu endoftalmitídy vyvolanej zástupcami rodu Aspergillus, a to podľa publikácie Jain a ďalší, Doc. Ophthalmol., 69:227 až 235, 1988. Do jedného z očí novozélandských bielych králikov je vpravené približné 40 sporá Aspergillus fumigatus. Do kontralatelárneho (kontrolného) oka je vpravené sterilné inokulum. Účinnosť liečby prostredníctvom testovaných látok základe klinického obrazu očí, nepriamou oftalmoskópiou,
Klinicky môže byť stanovená na elektroretinograficky, kvantifikáciou fungálnej nálože a histopatológiou. pozorovateľná endoftalmitída začína približne tri dňov po infikácii.
Príklad 15
Aktivita chitinázy in vivo na králičom modelu endokarditídy až sedem fungálnej
Účinnosť terapeutických látok zahŕňajúcich fragmenty chitinázy môže byť sledovaná na králičom modelu endokarditídy vyvolanej Candidami postupom popísaným v publikáciách
Witt a Bayer, Anitimicrob. Agents Chemother., 35:2481 až 2485, 1991; alebo Longman a ďalší, Rev. Infect. Dis., 12(Suppl. 3):5294 až 5298, 1990. Trombotická endokarditída (sterilná) je ·· ·· • · • · · · · • · · · · • · ··· · · • · · · ·· ·· ·· · • · · • · · · ·· ·· • · · · • ···· · · · • · · · u novozélandských bielych králikov vyvolaná transaortálnym valvulárnym zavedením sterilného polyetylénového katétra (vnútorný priemer 0,86 mm). Tento katéter zostáva zavedený po celú dobu trvania experimentu. 48 hodín po zavedení katétra je intravenóznou injekciou približné 2 x 107 blastospór C. albicans vyvolaná infekčná endokarditída. K tomuto účelu môže byť taktiež využitá C. parapsilosis. Antifungálna terapia testovanými látkami bola zahájená 24 hodín pred alebo 24 až 60 hodín po infikáci a terapia pokračovala 9 až 12 dňov. Tradične používané antifungálne látky sú zvyčajne aplikované v dávkach 1 mg/kg/deň pri intravenóznej aplikácii amfotericínu B, 50 alebo 100 mg/kg/deň pri intravenóznej alebo intraperitoneálnej aplikácii flukonazolu. Kontrolnej skupine králikov neboli podávané žiadné antifungálne zlúčeniny. Po usmrtení boli odobrané srdcia a bolo prekontrolované správne umiestnenie katétra. Mikrobiálna vegetácia ze sŕdc usmrtených zvierat bola zobraná, zvážená a homogenizovaná v 1 ml sterilného fyziologického roztoku. Homogenáty boli postupne riedené a počet infekčných agens kvantifikovaný kultiváciou na kvasničnom dextrózovom agare po dobu 48 hodín pri teplote 35°C. U vegetácie, ktorá nedala vzniknúť žiadnej kolónii, sa predpokládá, že obsahuje menej ako 2 logio CFU/gram hmotnosti vegetácii.
Príklad 16
Chitin-väzobná a chitinázová (chitín-hydrolytícka) aktivita fragmentov ludskej chitinázy
A. Chitín-väzobná doména je nepostradatelná pre väzbu chitinázy k chitínu
Chitín-väzobná a chitotriozidázová aktivita neskrátenej chitinázy (445 aminokyselín) boli srovnáváné s týmito aktivitami u N-koncového fragmenta (aminokyseliny 1 až 373) popísaného v príklade 5. Neskrátená chitináza a spomínaný fragment chitinázy boli pripravené následujúcim spôsobom. Expresívne konštrukty kódujúce neskrátenú chitinázu (M0-13B) a fragment o dĺžke 373 aminokyselín skrátený z C-konca (popísané v príklade 5) boli transfekované do buniek COS. Po 24 hodinách bolo kultivačné médium (Eaglovo médium modifikované podľa Dulbecca (DMEM (Gibco)) + 10% fetálne bovinné sérum + 1 mM Lglutamín + 100 U/ml penicilínu + 100 pg/ml streptomycínu) nahradené médiom bez fetálneho bovinného séra. Bunky boli kultivované ďalšie tri dni, potom bolo médium zobrané a boli v ňom stanovené hydrolytícka a chitín-väzobná aktivita.
Chitotriozidázové aktivity, stanovované postupom popísaným v príklade 9, boli v médiu, v ktorom boli kultivované bunky exprimujúce neskrátenú chitinázu (57,6 nmol/ml/min), a v médiu, kde boli kultivované bunky exprimujúce fragment chitinázy skrátený z C-konce (57,8 nmol/ml/min), takmer totožné. To odpovedá výsledkom uvedeným v príklade 6. Substrátom pre stanovenie chitotriozidázovej aktivity (postupom popísaným v príklade 9) je triacetylchitotrióza, čo je rozpustný trisacharid.
Za účelom srovnania chitín-väzobnej aktivity bol na jemný prášok v mažiari rozotretý chitín z panciera kraba (Sigma). Takto získaný prášok bol trikrát premytý ekvilibračným pufrom (20 mM Tris, pH 8, 500 mM NaCl) a ro z suspendovaný na koncentrácii 100 mg/ml. 100 pl tejto suspenzie bolo pridáné k ml kultivačného média transfekovaných buniek COS a vzniknutá zmes bola pri 4°C za stálého miešania inkubovaná po dobu 4 hodín. Po ukončení inkubácie bol chitín odstránený ·· • · · · · • · · · · • · ··· · · • · · · ·· ·· ·· • ···· · · • · · ·· · ·· centrifugáciou (5 minút, 12000 x g) . K rovnakým objemom takto získaných supernatantov bol pridaný Laemliho pufor a 50 mM ditiotreitol (DTT)z vzorky boli uvarené a elektroforetícky rozdelené na 12% polyakrylamidovom géle (Novex). Následná analýza metódou Western blot s využitím monoklonálnej protilátky špecificky nameranej proti chitináze (206A) odhalila, že v supernatantoch nezostala žiadná neskrátená chitináza, čo znamená, že všetka neskrátená chitináza sa naviazala na chitín a společne s ním prešla pri centrifugácii do sedimenta. Naproti tomu v supernatantoch s fragmentom skráteným z C-konca (aminokyseliny 1 až 373) nebolo po inkubácii s chitínom pozorované zníženie množstva tohto fragmentu čo ukazuje, že tento skrátený konštrukt sa na chitín neviaže.
Získané výsledky naznačujú, že 72 C-koncových aminokyselín ludskej chitinázy je nepostradatelných pre chitín-väzobnú aktivitu, ale nie pre hydrolýzu triacetylchitotriózy.
B. Chitín-väzobná doména je nepostradatelná pre hydrolýzu chitínu, ale nie pre hydrolýzu triacetylchitotriózy.
Substrát použitý v príklade 16A ke stanoveniu chitotriozidázovej aktivity je rozpustný trisacharid. Natívny chitín je naproti tomu nerozpustný polysacharid s dlhým reťazcom. Je tedy možné, že schopnosť enzýmu hydrolyzovať krátke analógy nemusia predikovať schopnosť hydrolyzovať chitín. Chitín z panciera kraba bol za účelom srovnania chitinolytíckej aktivity neskrátenej chitinázy (445 aminokyselín) a fragmentu skráteného z C-konca (aminokyseliny 1 až 373) zainkorporovaný do agarózového gélu. Do ztuhnutého gélu boli vyrezané jamky a do nich bola umiestená alebo neskrátená chitináza alebo skrátený fragment. Po ukončení ·· ·· ·· · ·· k··· ··· ···
I · · · t··· ·· k · ··· · · · ···· · · · k· ···· · · ·· ·· ·· · ·· · inkubáce bol rozsah hydrolýzy chitínu indikovaný zónou presvetlenia okolo každej z jamiek.
s MWCO 30000 nanesená rovnaká
Tento pokus bol provedený následovne. Suspenzia 0,4% chitínu a 1,5% agarózy vo 20 mM fosforečnanu sodnom, pH 6, byla uvarená, ve vrstve o hrúbke 2 mm nalitá na Petriho misky (priemer 10 cm) a ponechaná ztuhnúť. Do tejto matrice (agaróza/chitín) boli vyrezané jamky o priemere 3 mm. Pred nanesením do jamiek boli proteíny v médiách použitých ke kultivácii transfekovaných buniek COS 70-ti násobne zakoncentrované cez filtračnú membránu (Millipore). Do súsedných jamiek bola množstva rekombinantnej neskrátenej chitinázy a rekombinantnej chitinázy skrátenej z C-konca. Do tretiej jamky bolo umiestené médium použité pre kultiváciu buniek COS transfekovaných kontrolným plazmidom. Aby bylo možné pozorovať zóny presvetlenia okolo jednotlivých jamiek, bolo nutné nanášku vzoriek niekoľkokrát opakovať. Okolo jamiek naplnených koncentrovaným médiom použitým pri kultivácii buniek COS produkujúcich neskrátenú chitinázu bola pozorovaná zóna presvetlenia o šírke 3 mm. KOkolo jamiek naplnených koncentrovanými médií použitými pri kultiváci buniek COS produkujících alebo skrátený fragment alebo transfekovaný prázdnym vektorom nebola táto zóna pozorovaná.
Tieto výsledky ukazujú, že 72 C-koncových aminokyselín je nutných k hydrolýze chitínu ľudskou chitinázou.
Chemická modifikácia rekombinantnej chitín-väzobnej domény konjugáciou s inými látkami
Príklad 17 ·· ·· ·· · ·· • · · · ·«· · » · • ·· · ···· ·· • · ··· · · · ···· · · · • · ···· ··
Za účelom zistenia, či môže byť chitín-väzobná doména použitá ako nosič pre nízkomolekulárne farmaceutické látky, bola táto chitín-väzobná doména zahŕňajúca v ludskej chitináze aminokyseliny 392 až 445 chemicky konjugovaná s biotínom alebo rhodamínom, a to následujúcim spôsobom.
Biotinylácia bola prevedená súpravou EZ-link-Sulfo-NHSBiotinylation (Pierce) postupom doporučeným výrobcom. Je pravdepodobné, že biotinylačné činidlo bude na chitínväzobnej doméne atakovať volné aminoskupiny, čo sú N- koncová aminoskupina a aminoskupiny na lyzínoch 402 a 440. V súlade s týmito predpokladmi preukázala hmotnostná spektrometria (MALDI) tri entity s molekulovými hmotnosťami odpovedajúcimi prítomnosti jednej, dvoch alebo tro molekúl biotínu na molekulu peptidu. Prevážna časť peptidov (viacej ako 60%) bola biotinylovaná trojnásobne.
Rhodamín bol na N-koniec chitín-väzobné domény pripojený prostredníctvom väzby so sukcinimidom (Molecular Probes).
Chitín-väzobné charakteristiky peptidov s naviazaným biotínom alebo rhodamínom boli nerozlišitelné od charakteristík neznačeného peptidu. To naznačuje, že chitínväzobná doména je bez ovplyvnenia chitín-väzobnéj aktivity schopná tolerovať niektoré chemické modifikácie.
Je zrejmé, že odborníci môžu vymyslieť vela modifikácií a obmien tohto vynálezu. Vynález je tedy limitovaný iba pripojenými patentovými nárokmi
ZOZNAM SEKVENCIÍ ·· ·· • · · · · • · · · · • ··· · · · • · · · ·· ·· ·· ·· ·· • e ····
·· · <110> (vynálezca) Gray, Patrick W.
(vynálezca) Tjoelker, Larry w.
ICOS Corporation <120> Chitín-väzobné fragmenty chitinázy <130> 27866/35407 <140>
<141>
<150> <151> 09/09198 1998-03-12
<160> 39
<170> Patentln Ver.
<210> 1 <211> 1636 <212> DNA <213> Homo sapiens
<220> <221> <222> CDS (2) . . (1399)
<220> <221> <222> mat peptid (65)..(1399)
<400> 1
c atg gtg cgg tct gtg gcc tgg gca ggt ttc atg gtc ctg ctg atg atc 49
Met -20 Val Arg Ser Val Ala -15 Trp Ala Gly Phe Met -10 Val Leu Leu Met íle
cca tgg ggc tct get gca aaa ctg gtc tgc tac ttc acc aac tgg gcc 97
Pro -5 Trp Gly Ser Ala -1 Ala 1 Lys Leu Val Cys 5 Tyr Phe Thr Asn Trp 10 Ala
cag tac aga cag ggg gag get ege ttc ctg cce aag gac ttg gac ccc 145
Gin 15 Tyr Arg Gin Gly Glu 20 Ala Arg Phe Leu Pro 25 Lys Asp Leu Asp Pro
agc ctt tgc acc cac ctc atc tac gcc ttc get < ggc atg acc aac cac 193
Ser 30 Leu Cys Thr His Leu 35 íle Tyr Ala Phe Ala 40 Gly Met Thr Asn His
cag ctg agc acc act gag tgg aat gac gag act ctc tac cag gag í ttc 241
Gin Leu Ser Thr Thr Glu Trp Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Gin Glu Phe
• · • · · · • · · · • · ··· • · · ·· ·· ·· · • · · • · · · • · · ···· • · · ·· · ·· · • · ·· • · · • · · · • · · ·· ···
50 55
aat ggc ctg aag aag atg aat ccc aag ctg aag acc ctg tta gcc atc 289
Asn Gly Leu Lys Lys Met Asn Pro Lys Leu Lys Thr Leu Leu Ala íle
60 — 65 70 75
gga ggc tgg aat ttc ggc act cag aag ttc aca gat atg gta gcc acg 337
Gly Gly Trp Asn Phe Gly Thr Gin Lys Phe Thr Asp Met Val Ala Thr
80 85 90
gcc aac aac cgt cag acc ttt gtc aac tcg gcc atc agg ttt ctg cgc 385
Ala Asn Asn Arg Gin Thr Phe Val Asn Ser Ala íle Arg Phe Leu Arg
95 100 105
aaa tac age ttt gac ggc ctt gac ctt gac tgg gag tac cca gga age 433
Lys Tyr Ser Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser
110 115 120
cag ggg age cct gcc gta gac aag gag cgc ttc aca acc ctg gta cag 481
Gin Gly Ser Pro Ala Val Asp Lys Glu Arg Phe Thr Thr Leu Val Gin
125 130 135
gac ttg gcc aat gcc ttc cag cag gaa gcc cag acc tca ggg aag gaa 529
Asp Leu Ala Asn Ala Phe Gin Gin Glu Ala Gin Thr Ser Gly Lys Glu
140 145 150 155
cgc ctt ctt ctg agt gca gcg gtt cca get ggg cag acc tat gtg gat 577
Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ala Val Pro Ala Gly Gin Thr Tyr Val Asp
160 165 170
get gga tac gag gtg gac aaa atc gcc cag aac ctg gat ttt gtc aac 625
Ala Gly Tyr Glu Val Asp Lys íle Ala Gin Asn Leu Asp Phe Val Asn
175 180 185
ctt atg gcc tac gac ttc cat ggc tet tgg gag aag gtc acg gga cat 673
Leu Met Ala Tyr Asp Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His
190 195 200
aac age ccc ctc tac aag agg caa gaa gag agt ggt gca gca gcc age 721
Asn Ser Pro Leu Tyr Lys Arg Gin Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser
205 210 215
ctc aac gtg gat get get gtg caa cag tgg ctg cag aag ggg acc cct 769
Leu Asn Val Asp Ala Ala Val Gin Gin Trp Leu Gin Lys Gly Thr Pro
220 225 230 235
gcc age aag ctg atc ctt ggc atg cct acc tac gga cgc tcc ttc aca 817
Ala Ser Lys Leu íle Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr
240 245 250
ctg gcc tcc tca tca gac acc aga gtg ggg gcc cca gcc aca ggg tet 865
Leu Ala Ser Ser Ser Asp Thr Arg Val Gly Ala Pro Ala Thr Gly Ser
255 260 265
ggc act cca ggc ccc ttc acc aag gaa gga ggg atg ctg gcc tac tat 913
Gly Thr Pro Gly Pro Phe Thr Lys Glu Gly Gly Met Leu Ala Tyr Tyr
270 275 280
• · • · • · • · • · • · • · ·· • · • · ··· ·· • · • · • · • · · • · ·· ·· · gaa gtc tgc tcc tgg aag ggg gcc acc aaa cag aga atc cag gat cag 961 Glu Val Cys Ser Trp Lys Gly Ala Thr Lys Gin Arg íle Gin Asp Gin 285 290 295 aag gtg ccc tac atc ttc cgg gac aac cag tgg gtg ggc ttt gat gat 1009
Lys Val Pro Tyr íle Phe Arg Asp Asn Gin Trp Val Gly Phe Asp Asp 300 305 310 315 gtg gag agc ttc aaa acc aag gtc agc tat ctg aag cag aag gga ctg 1057
Val Glu Ser Phe Lys Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gin Lys Gly Leu 320 325 330 ggc ggg gcc atg gtc tgg gca ctg gac tta gat gac ttt gcc ggc ttc 1105
Gly Gly 335 Ala Met Val Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe
340 345
tcc tgc. aac cag ggc ega tac ccc ctc atc cag acg cta cgg cag gaa 1153
Ser Cys Asn Gin Gly Arg Tyr Pro Leu íle Gin Thr Leu Arg Gin Glu
350 355 360
ctg agt ctt cca tac ttg cct tca ggc acc cca gag ctt gaa gtt cca 1201
Leu Ser Leu Pro Tyr Leu Pro Ser Gly Thr Pro Glu Leu Glu Val Pro
365 370 375
aaa cca ggt cag ccc tet gaa cct gag cat ggc ccc agc cct gga caa 1249
Lys Pro Gly Gin Pro Ser Glu Pro Glu His Gly Pro Ser Pro Gly Gin
380 385 390 395
gac acg ttc tgc cag ggc aaa get gat ggg ctc tat ccc aat cct cgg 1297
Asp Thr Phe Cys Gin Gly Lys Ala Asp Gly Leu Tyr Pro Asn Pro Arg
400 405 410
gaa cgg tcc agc ttc tac agc tgt gca gcg ggg cgg ctg ttc cag caa 1345
Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Cys Ala Ala Gly Arg Leu Phe Gin Gin
415 420 425
agc tgc ccg aca ggc ctg gtg ttc agc aac tcc tgc aaa tgc tgc acc 1393
Ser Cys Pro Thr Gly Leu Val Phe Ser Asn Ser Cys Lys Cys Cys Thr
430 435 440 tgg aat tgagtcgcta aagcccctcc agtcccagct ttgaggctgg gcccaggatc 1449
Trp Asn
445
actctacagc ctgcctcctg ggttttccct gggggccgca atctggctcc tgcaggcctt 1509
tctgtggtct tcctttatcc aggctttctg ctctcagcct tgccttcctt ttttctgggt 1569
ctcctgggct gcccctttca cttgcaaaat aaatctttgg tttgtgcccc tcttcccaaa 1629
aaaaaaa 1636
<210> 2 <211> 466 ·· • · ·· • · e»·· ··· · · - - -• ··· · · · ···· · · · • · · · · · · ·· ·· · ·· · <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Met -20 Val Arg Ser Val Ala Trp -15 Ala Gly Phe Met Val -10 Leu Leu Met íle
Pro Trp Gly Ser Ala Ala Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala
-5 1 1 5 1 10
Gin Tyr Arg Gin Gly Glu Ala Arg Phe Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro
15 20 25
Ser Leu Cys Thr His Leu íle Tyr Ala Phe Ala Gly Met Thr Asn His
30 35 40
Gin Leu Ser Thr Thr Glu Trp Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Gin Glu Phe
45 50 55
Asn Gly Leu Lys Lys Met Asn Pro Lys Leu Lys Thr Leu Leu Ala íle
60 65 70 75
Gly Gly Tr Asn Ph Gly Thr Gin Lys Phe Thr Asp Met Val Ala
80 85 90
Ala Asn Asn Arg Gin Thr Phe Val Asn Ser Ala íle Arg Phe Leu Arg
95 100 105
Lys Tyr Ser Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser
110
115
120
Gin Gly Ser Pro Ala Val Asp Lys Glu Arg Phe Thr Thr Leu Val Gin 125 130 135
Asp Leu Ala Asn Ala Phe Gin Gin Glu Ala Gin Thr Ser Gly Lys Glu
140 145 150 155
Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ala Val Pro Ala Gly Gin Thr Tyr Val Asp
160 165 170
Ala Gly Tyr Glu Val Asp Lys íle Ala Gin Asn Leu Asp Phe Val Asn
175 180 185
Leu Met Ala Tyr Asp Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His
190 195 200
Asn Ser Pro Leu Tyr Lys Arg Gin Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser
205 210 215
Leu Asn Val Asp Ala Ala Val Gin Gin Trp Leu Gin Lys Gly Thr Pro
220 225 230 235
Ala Ser Lys Leu íle Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr
240 245 250
Leu Ala Ser Ser Ser Asp Thr Arg Val Gly Ala Pro Ala Thr Gly Ser
255 260 265
·· ·· • · · · • · · · • · ··· • · · ·· ·· ·· · • · · • · · · • · ···· • · · ·· · ·· • · · • · • · ·· ·
Gly Thr Pro Gly Pro Phe Thr Lys Glu Gly Gly Met Leu Ala Tyr Tyr
270 275 280
Glu Val Cys Ser Trp Lys Gly Ala Thr Lys Gin Arg íle Gin Asp Gin
285 290 295
Lys Val Pro Tyr íle Phe Arg Asp Asn Gin Trp Val Gly Phe Asp Asp
300 305 310 315
Val Glu Ser Phe Lys Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gin Lys Gly Leu
320 325 330
Gly Gly Ala Met Val Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe
335 340 345
Ser Cys Asn Gin Gly Arg Tyr Pro Leu íle Gin Thr Leu Arg Gin Glu
350 355 360
Leu Ser Leu Pro Tyr Leu Pro Ser Gly Thr Pro Glu Leu Glu Val Pro
365 370 375
Lys Pro Gly Gin Pro Ser Glu Pro Glu His Gly Pro Ser Pro Gly Gin
380 385 390 395
Asp Thr Phe Cys Gin Gly Lys Ala Asp Gly Leu Tyr Pro Asn Pro Arg
400 405 410
Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Cys Ala Ala Gly Arg Leu Phe Gin Gin
415 420 425
Ser Cys Pro Thr Gly Leu Val Phe Ser Asn Ser Cys Lys Cys Cys Thr
430 435 440
Trp Asn
445 <210> 3 <211> 1656 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (27)..(1424) <220>
<221> mat peptid <222> (90)..(1424)
Met Val Arg Ser Val Ala Trp Ala Gly -20 -15 <400> 3 gctgcagcct gccgctgagc tgcatc atg gtg cgg tct gtg gcc tgg gca ggt 53 • · ·· ··
ttc atg gtc ctg Leu ctg atg Leu Met -5 atc cca tgg ggc tet get gca aaa ctg gtc 101
Phe Met -10 Val íle Pro Trp Gly Ser Ala Ala Lys Leu Val
-1 1
tgc tac ttc acc aac tgg gcc cag tac aga cag ggg gag get ege ttc 149
Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala Gin Tyr Arg Gin Gly Glu Ala Arg Phe
5 10 15 20
ctg ccc aag gac ttg gac ccc age ctt tgc acc cac ctc atc tac gcc 197
Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro Ser Leu Cys Thr His Leu íle Tyr Ala
25 30 35
ttc get ggc atg acc aac cac cag ctg agt· acc act gag tgg aat gac 245
Phe Ala Gly Met Thr Asn His Gin Leu Ser Thr Thr Glu Trp Asn Asp
40 45 50
gag act ctc tac cag gag ttc aat ggc ctg aag aag atg aat ccc aag 293
Glu Thr Leu Tyr Gin Glu Phe Asn Gly Leu Lys Lys Met Asn Pro Lys
55 60 65
ctg aag acc ctg tta gcc atc gga ggc tgg aat ttc age act cag aag 341
Leu Lys Thr Leu Leu Ala íle Gly Gly Trp Asn Phe Ser Thr Gin Lys
70 75 80
ttc aca gat atg gta gcc acg gcc aac aac cgt cag acc ttt gtc aac 389
Phe Thr Asp Met Val Ala Thr Ala Asn Asn Arg Gin Thr Phe Val Asn
85 90 95 100
tcg gcc atc agg ttt ctg ege aaa tac age ttt gac ggc ctt gac ctt 437
Ser Ala íle Arg Phe Leu Arg Lys Tyr Ser Phe Asp Gly Leu Asp Leu
105 110 115
gac tgg gag tac cca gga age cag ggg age cct gcc gta gac aag gag 485
Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser Gin Gly Ser Pro Ala Val Asp Lys Glu
120 125 130
ege ttc aca acc ctg gta cag gac ttg gcc aat gcc ttc cag cag gaa 533
Arg Phe Thr Thr Leu Val Gin Asp Leu Ala Asn Ala Phe Gin Gin Glu
135 140 145
gcc cag acc tca ggg aag gaa ege ctt ctt ctg agt gca gcg gtt cca 581
Ala Gin Thr Ser Gly Lys Glu Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ala Val Pro
150 155 160
get ggg cag acc tat gtg gat get gga tac gag gtg gac aaa atc gcc 629
Ala Gly Gin Thr Tyr Val Asp Ala Gly Tyr Glu Val Asp Lys íle Ala
165 170 175 180
cag aac ctg gat ttt gtc aac ctt atg gcc tac gac ttc cat ggc tet 677
Gin Asn Leu Asp Phe Val Asn Leu Met Ala Tyr Asp Phe His Gly Ser
185 190 195
tgg gag aag gtc acg gga cat aac age ccc ctc tac aag agg caa gaa 725
Trp Glu Lys Val Thr Gly His Asn Ser Pro Leu Tyr Lys Arg Gin Glu
200 205 210
gag agt ggt gca gca gcc age ctc aac gtg gat get get gtg caa cag 773
Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser Leu Asn Val Asp Ala Ala Val Gin Gin
·· • · • · · · • · · ·
9 999 9 • · ·· ·· ··
• ·
9999 9 • · · • · ·
• · ·
215 220 225
tgg ctg cag aag ggg acc cct gcc agc aag ctg atc ctt ggc atg cct 821
Trp Leu Gin Lys Gly Thr Pro Ala Ser Lys Leu íle Leu Gly Met Pro
230 235 240
acc tac gga cgc tcc ttc aca ctg gcc tcc tca tca gac acc aga gtg 869
Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Ser Asp Thr Arg Val
245 250 255 260
ggg gcc cca gcc aca ggg tct ggc act cca ggc ccc ttc acc aag gaa 917
Gly Ala Pro Ala Thr Gly Ser Gly Thr Pro Gly Pro Phe Thr Lys Glu
265 270 275
gga ggg atg ctg gcc tac tat gaa gtc tgc tcc tgg aag ggg gcc acc 965
Gly Gly Met Leu Ala Tyr Tyr Glu Val Cys Ser Trp Lys Gly Ala Thr
280 285 290
aaa cag aga atc cag gat cag aag gtg ccc tac atc ttc cgg gac aac 1013
Lys Gin Arg íle Gin Asp Gin Lys Val Pro Tyr íle Phe Arg Asp Asn
295 300 30S
cag tgg gtg ggc ttt gat gat gtg gag agc ttc aaa acc aag gtc agc 1061
Gin Trp Val Gly Phe Asp Asp Val Glu Ser Phe Lys Thr Lys Val Ser
310 315 320
tat ctg aag cag aag gga ctg ggc ggg gcc atg gtc tgg gca ctg gac 1109
Tyr Leu Lys Gin Lys Gly Leu Gly Gly Ala Met Val Trp Ala Leu Asp
325 330 335 340
tta gat gac ttt gcc ggc ttc tcc tgc aac cag ggc ega tac ccc ctc 1157
Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe Ser Cys Asn Gin Gly Arg Tyr Pro Leu
345 350 355
atc cag acg cta cgg cag gaa ctg agt ctt cca tac ttg cct tca ggc 1205
íle Gin Thr Leu Arg Gin Glu Leu Ser Leu Pro Tyr Leu Pro Ser Gly
360 365 370
acc cca gag ctt gaa gtt cca aaa cca ggt cag ccc tct gaa cct gag 1253
Thr Pro Glu Leu Glu Val Pro Lys Pro Gly Gin Pro Ser Glu Pro Glu
375 380 385
cat ggc ccc agc cct gga caa gac acg ttc tgc cag ggc aaa get gat 1301
His Gly Pro Ser Pro Gly Gin Asp Thr Phe Cys Gin Gly Lys Ala Asp
390 395 400
ggg ctc tat ccc aat cct cgg gaa cgg tcc agc ttc tac agc tgt gca 1349
Gly Leu Tyr Pro Asn Pro Arg Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Cys Ala
405 410 415 420
gcg ggg cgg ctg ttc cag caa agc tgc ccg aca ggc ctg gtg ttc agc 1397
Ala Gly Arg Leu Phe Gin Gin Ser Cys Pro Thr Gly Leu Val Phe Ser
425 430 435
aac tcc tgc aaa tgc tgc acc tgg aat tgagtcgcta « aagcccctcc 1444
Asn Ser Cys Lys Cys Cys Thr Trp Asn
440 445
·· • · · · • · · · • · ··· · • · · ·· · ·· • · · • · · · • · ···· • · · ·· · ·· · agtcccagct ttgaggctgg gcccaggatc actctacagc ctgcctcctg ggttttcccl504 gggggccgca atctggctcc tgcaggcctt tctgtggtct tcctttatcc aggctttctl564 ctctcagcct tgccttcctt ttttctgggt ctcctgggct gcccctttca cttgcaaaal624 aaatctttgg tttgtgcccc tcaaaaaaaa aa 1656 <210> 4 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Met -20 Val Arg Ser Val Ala -15 Trp Ala Gly Phe Met -10 Val Leu Leu Met íle
Pro -5 Trp Gly Ser Ala Ala 1 1 Lys Leu Val C Cys Tyr Phe Thr Asn 10 Trp Ala
Gin 15 Tyr Arg Gin Gly Glu 20 Ala Arg Phe Leu Pro 25 Lys Asp Leu Asp Pro
Ser 30 Leu Cys Thr His Leu 35 íle Tyr Ala Phe Ala 40 Gly Met Thr Asn His
Gin 45 Leu Ser Thr Thr Glu 50 Trp Asn Asp Glu Thr 55 Leu Tyr Gin Glu Phe
Asn 60 Gly Leu Lys Lys Met 65 Asn Pro Lys Leu Lys 70 Thr Leu Leu Ala íle 75
Gly 80 Gly Trp Asn Phe Ser 85 Thr Gin Lys Phe Thr Asp 90 Met Val Ala Thr
Ala 95 Asn Asn Arg Gin Thr 100 Phe Val Asn Ser Ala 105 íle Arg Phe Leu Arg
Lys 110 Tyr Ser Phe Asp Gly 115 Leu Asp Leu Asp Trp 120 Glu Tyr Pro Gly Ser
Gin 125 Gly Ser Pro Ala Val 130 Asp Lys Glu Arg Phe 135 Thr Thr Leu Val Gin
Asp 140 Leu Ala Asn Ala Phe 145 Gin Gin Glu Ala Gin 150 Thr Ser Gly Lys Glu 155
Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ala Val Pro Ala Gly Gin Thr Tyr Val Asp
160 165 170 ·· ·· ··
Ala Gly 175 Tyr Glu 78 ·· Phe • · Val • Asn
Val Asp Lys 180 íle Ala Gin Asn Leu Asp 185
Leu 190 Met Ala Tyr Asp Phe His 195 Gly Ser Trp Glu Lys 200 Val Thr Gly His
Asn 205 Ser Pro Leu Tyr Lys Arg 210 Gin Glu Glu Ser Gly 215 Ala Ala Ala Ser
Leu 220 Asn Val Asp Ala Ala Val 225 Gin Gin Trp Leu Gin 230 Lys Gly Thr Pro 235
Ala 240 Ser Lys Leu íle Leu Gly 245 Met Pro Thr Tyr Gly 250 Arg Ser Phe Thr
Leu 255 Ala Ser Ser Ser Asp Thr 260 Arg Val Gly Ala Pro 265 Ala Thr Gly Ser
Gly 270 Thr Pro Gly Pro Phe Thr 275 Lys Glu Gly Gly Met 280 Leu Ala Tyr Tyr
Glu 285 Val Cys Ser Trp Lys Gly 290 Ala Thr Lys Gin Arg 295 íle Gin Asp Gin
Lys 300 Val Pro Tyr íle Phe Arg 305 Asp Asn Gin Trp Val 310 Gly Phe Asp Asp 315
Val 320 Glu Ser Phe Lys Thr Lys Val 325 Ser Tyr Leu Lys 330 Gin Lys Gly Leu
Gly Gly Ala Met Val Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe
335 340 345
Ser Cys Asli Glri Gly Arg Tyr Fro Lee íle Gin Thr Leu Arg Gin Glu 350 355 360
Leu 365 Ser Leu Pro Tyr Leu Pro Ser 370 Gly Thr Pro Glu 375 Leu Glu Val Pro
Lys 380 Pro Gly Gin Pro Ser Glu Pro 385 Glu His Gly Pro 390 Ser Pro Gly Gin 395
Asp 400 Thr Phe Cys Gin Gly Lys Ala 405 Asp Gly Leu Tyr 410 Pro Asn Pro Arg
Glu 415 Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Cys 420 Ala Ala Gly Arg 425 Leu Phe Gin Gin
Ser 430 Cys Pro Thr Gly Leu Val Phe 435 Ser Asn Ser Cys 440 Lys Cys Cys Thr
<210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
• · • · · · • · · · • · ··· · • · · ·· ·· ·· ·· · • · · • · · · • · ··· • · · ·· · • · • · · • · • · · • · ·· · <223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 5 gacactatag aatagggc 18 <210> 6 <211> 51 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 6 tgggatcatc agcaggacca tgaaacctgc ccaggccaca gaccgcacca t 51 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 7 tacatctaga attatggcaa aactggtctg ctacttcacc 40 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 8 agatctaacc ttaggtgcct gaagacaagt atgg 34 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 9 tacagaattc ttattcacat ccggccctg • · • · ··· » • · • · ·· ·· ·· ·· • · · • · · · • · ···· · • · · ·· · ·· ·· · <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 10 tacatctaga ctccatccag aaaaacaggt atgg 34 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 11 tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt 30 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravené sekvencie: primér <400> 12 cgcaagcttg agagctccgt tccgccacat ggtgcggtct gtggcctggg 50 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 13 gactctagac taggtgcctg aaggcaagta tg • · • · • · · · • · · · • · ··· · • · · ·· e · • · ··
·· · <210> 14 <211> 373 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14
Ala Lys 1
Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala 5 10
Gin Tyr
Arg Gin Gly 15
Glu 20 Ala Arg Phe Leu Pro 25 Lys Asp Leu Asp 30 Pro Ser Leu Cys Thr His
Leu íle Tyr Ala Phe Ala Gly Met Thr Asn His Gin Leu Ser Thr Thr
35 40 45
Glu Trp Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Gin Glu Phe Asn Gly Leu Lys Lys
50 55 60
Met Asn Pro Lys Leu Lys Thr Leu Leu Ala íle Gly Gly Trp Asn Phe
65 70 75 80
Gly Thr Gin Lys Phe Thr Asp Met Val Ala Thr Ala Asn Asn Arg Gin
85 90 95
Thr Phe Val . Asn Ser Ala íle Arg Phe Leu Arg Lys Tyr Ser Phe Asp
100 105 110
Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser Gin Gly Ser Pro Ala
115 120 125
Val Asp Lys Glu Arg Phe Thr Thr Leu Val Gin Asp Leu Ala Asn Ala
130 135 140
Phe Gin Gin Glu Ala Gin Thr Ser Gly Lys Glu Arg Leu Leu Leu Ser
145 150 155 160
Ala Ala Val Pro Ala Gly Gin Thr Tyr Val Asp Ala Gly Tyr Glu Val 165 170 175
Asp Lys íle Ala Gin Asn Leu Asp Phe Val Asn Leu Met Ala Tyr Asp 180 185 190
Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His Asn Ser Pro Leu Tyr 195 200 205
Lys Arg Gin Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser Leu Asn Val Asp Ala 210 215 220
Ala Val Gin Gin Trp Leu Gin Lys Gly Thr Pro Ala Ser Lys Leu íle 225 230 235 240
Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Ser 245 250 250 ·· ·· ·· · • · · · · · · • · · · · ··· • · ··· · · · ···· · • · · · · · ·· ·· ·· · ·· ·· ·
Asp 260 Thr Arg Val Gly Ala 265 Pro Ala Thr Gly 270 Ser Gly Thr Pro Gly Pro
Phe Thr Lys Glu Gly Gly Met Leu Ala Tyr Tyr Glu Val Cys Ser Trp
275 280 285
Lys Gly Ala Thr Lys Gin Arg íle Gin Asp Gin Lys Val Pro Tyr íle
290 295 300
Phe Arg Asp Asn Gin Trp Val Gly Phe Asp Asp Val Glu Ser Phe Lys
305 310 315 320
Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gin Lys Gly Leu Gly Gly Ala Met Val
325 330 335
Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe Ser Cys Asn Gin Gly
340 345 350
Arg Tyr Pro Leu íle Gin Thr Leu Arg Gin Glu Leu Ser Leu Pro Tyr
355 360 365
Leu Pro Ser Gly Thr
370 c210> 15 c211> 373 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15
Ala Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala Gin Tyr Arg Gin Gly 15 10 15
Glu Ala Arg Phe Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro Ser Leu Cys Thr His 20 25 30
Leu íle Tyr Ala Phe Ala Gly Met Thr Asn His Gin Leu Ser Thr Thr 35 40 45
Glu Trp Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Gin Glu Phe Asn Gly Leu Lys Lys 50 55 60
Met Asn Pro Lys Leu Lys Thr Leu Leu Ala íle Gly Gly Trp Asn Phe
65 70 75 80
Gly 85 Thr Gin Lys Phe 90 Thr Asp Met Val Ala 95 Thr Ala Asn Asn Arg Gin
Thr Phe Val Asn Ser Ala íle Arg Phe Leu Arg Lys Tyr Ser Phe Asp
100 105 110 • · ·· • · • · · · • · · · • · ··· • · · ·· ·· • · • · • · • · • · ·· • · ····
Gly 115 Leu Asp Leu Asp Trp Glu 120 Tyr Pro Gly Ser 125 Gin Gly Ser Pro Ala
Val 130 Asp Lys Glu Arg Phe Thr 135 Thr Leu V Val Gin 140 Asp Leu Ala Asn Ala
Phe 145 Gin Gin Glu Ala Gin Thr 150 Ser Gly Lys Glu 155 Arg Leu Leu Leu 160 Ser
Ala 165 Ala Val Pro Ala Gly Gin Thr Tyr Val 170 Asp Ala 175 Gly Tyr Glu Val
Asp Lys íle Ala Gin Asn Leu Asp Phe Val Asn Leu Met Ala Tyr Asp
180 185 190
Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His Asn Ser Pro Leu Tyr
195 200 205
Lys Arg Gin Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser Leu Asn Val Asp Ala
210 215 220
Ala Val Gin Gin Trp Leu Gin Lys Gly Thr Pro Ala Ser Lys Leu íle
225 230 235 240
Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Ser
245 250 255
Asp Thr Arg Val Gly Ala Pro Ala Thr Gly Ser Gly Thr Pro Gly Pro
260 265 270
Phe Thr Lys Glu Gly Gly Met Leu Ala Tyr Tyr Glu Val Cys Ser Trp
275 280 285
Lys Gly Ala Thr Lys Gin Arg íle Gin Asp Gin Lys Val Pro Tyr íle
290 295 300
Phe Arg Asp Asn Gin Trp Val Gly Phe Asp Asp Val Glu Ser Phe Lys
305 310 315 320
Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gin Lys Gly Leu Gly Gly Ala Met Val
325 330 335
Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe Ser Cys Asn Gin Gly
340 345 350
Arg Tyr Pro Leu íle Gin Thr Leu Arg Gin Glu Leu Ser Leu Pro Tyr
355 360 365
Leu Ser Ser Gly Thr
370 • · ·· ·· ·· • · · · · · • · · · · · • · ··· · · · • · · · · · ·· ·· ·· · ·· · <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umele pripravenej sekvencie: primár <400> 16 tgatacggta ccgccccatg gctgacta 28 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Umele pripravená sekvence <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvence: primár <400> 17 gcaagtttgg cgcgaaatcg 20 <210> 18 <211> 66 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvenia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primár <400> 18 gcttaagctt gctgcagcct gccgctgagc tgcatcatgc tactactact gctgctgctg 60 ggcctg 66 <210> 19 <211> 115 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvence: primár ·· ··
B · · ·
I · · ·
B · ···
B · · ·· ·· ·· · ··
B · · · «
I · · · · I
B ······· B
B · · ·· <400> 19 aacagggccc ttaattaatt aggtacctgc gcggccgcag catgattgc tctagaagcg 60 aacagcga attctgtctg ctcgaagcgg ccggccgccc cgactcgaga gtaac 115 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220> ' <223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 20 tatagaattc ttctcctgca accagggccg atac <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primer <400> 22 tatagaattc ccagagcttg aagttccaaa accag <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravene sekvencie: primér <400> 22 tatagaattc agccctggac aagacacgtt ctgcc <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia ·· ·· ·· • · · · · • e · · · • · ··· · · • · · • ···· ·· • · · • · • · ·· ·· <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primer <400> 23 agaggaattc cagggcaaag ctgatgggct ctatc <210> 24 <211> 37 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 24 acaggaattc aatcctcggg aacggtccag cttctac <210> 25 <211> 37 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 25 cacatctaga ttatgtcggg cagctttgct ggaacag <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 26 agagtctaga tcaattccag gtgcagcatt tgcagg <210> 27 <211> 35 <212> DNA ·· ·· • · · · · · • · · · · · • · ····· · • · · · · ·· ·· ·· • · ···· ·· ·· · <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 27 agaggaattc agccctggac aagacacgtt cagcc 35 <210> 28 <211> 97 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 28 agaggaattc agccctggac aagacacgtt ctgccagggc aaagctgatg ggctctatcc 60 caatcctcgg gaacggtcca gcttctacag cagtgca 97 <210> 29 <211> 67 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umele pripravenej sekvencie: primér <400> 29 tgcttctaga ttaattccag gtgcagcatt tgcaggagtt gctgaacacc aggcctgtcg 60 ggctgct <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 30 tgcttctaga ttaattccag gtgcagcatt tgctgg · · ·· ··
I · · ·
I · · · • · ··· • · • · · • ···· ·· <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primár <400> 31 b tgcttctaga ttaattccag gtgcagcttt tgcagg 36 <210> 32 <211> 36 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primár <400> 32 tgcttctaga ttaattccag gtgctgcatt tgcagg 36 <210>33 <211> 72 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primár <400> 33 ctctggtacc tttggataaa agagactaca aggacgacga tgacaagagc cctggacaag 60 acacgttctg cc 72 <210> 34 <211> 77 <212> DNA ·· ·· ·· · ·· ···· · · · ··· ···· · · · · ·· • · ··· · · · ···· · · · ·· · · · · · ♦ <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 34 atatgcggcc gcgacttatc cactactatg atgatgatga tgatgtcctg ctccattcca 60 ggtgcagcat ttgcagg 77 <210> 35 <211> 37 <212> DNA <213> Umele pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 35 ctctgaattc caagacacgt tctgccaggg caaagct 37 <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 36 atatgaattc acgttctgcc agggcaaagc tgatg 35 <210> 37 ·· • · ·· ·· • · · · · · • · · · · · • · ··· · · · • · 9 9 9 · ·· ·· ·· • · ···· <211> 41 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 37 aacatctaga ttaggtgcag catttgcagg agttgctgaa c 41 <210> 38 <211> 48 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 38 aagaggtacc tttggataaa agaagccctg gacaagacac gttctgcc 48 <210> 39 <211> 41 <212> DNA <213> Umelo pripravená sekvencia <220>
<223> Popis umelo pripravenej sekvencie: primér <400> 39 ·· · gagagcggcc gcgacttaat tccaggtgca gcatttgcag g

Claims (24)

PATENTOVÉ NÁROKY
1. Polypeptid s chitín-väzobnou aktivitou, ale postrádajúci chitinázovú aktivitu vyznačujúci sa tým, že tento polypeptid zahŕňa chitín-väzobný fragment 54 Ckoncových aminokyselín ludskej chitinázy ako je popísané v SEK. ID. Č.: 2.
2. Polypeptid podía nároku lvyznačuj úci sa tým, že tento polypeptid je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej polypeptid o aminokyselinovej sekvencií odpovídajúcej v SEK. ID. Č.: 2 aminokyselinovým zvyškom 347 až 445, polypeptid o aminokyselinovej sekvencií odpovídajúcej v SEK. ID. Č.: 2 aminokyselinovým zvyškom 374 až 445, polypeptid o aminokyselinovej sekvencií odpovídajúcej v SEK. ID. Č. : 2 zvyškom 392 až 445, polypeptid o sekvencií odpovídajúcej v SEK. ID. Č.: 2 zvyškom 395 až 445 a polypeptid o sekvencií odpovídajúcej v SEK. ID. Č.: 2 zvyškom 397 až 445.
vyznačujúci sa tým, že je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej polypeptidy so sekvenciou aminokyselín odpovídajúcich v SEK. ID. Č.: 2 aminokyselinovým zvyškom X až Y, kde X zahŕňa všetky celé čísla v intervalu 347 až 397 a Y je 445.
3. Polypeptid tento polypeptid ·· ·· ·· · ·· ···· ··· ··· ···· · · · ·· • · ··· · · · ···· · · · ·· · · · · · · ·· ·· ·· · ·· ·
4. Polypeptid s chitín-väzobnou aktivitou, ale postrádajúci chitinázovú aktivitu vyznačujúci sa tým, že tento polypeptid zahŕňa nejaký polypeptid podía nároku 3.
aminokyselinovým aminokyselinovej aminokyselinovým aminokyselinovej aminokyselinovým
5. Fúzny proteín vyznačujúci sa t ý m, že tento proteín zahŕňa polypeptid podía nároku 1 pripojený k nejakému heterológnemu polypeptidu.
6. Fúzny proteín podía nároku 5 vyznačujúci sa tým, že spomínaným heterológnym polypeptidom je nejaký enzým.
7. Prípravok vyzná čujúci sa tým, ž e tento prípravok zahŕňa polypeptid podľa nároku 1 a fyziologicky prijateľné rozpoušťadlo.
8. Prípravok podľa nároku 7 vyznačujúci sa tým, že tento prípravok ďalej zahŕňa antifungálnu látku non-chitinázovej povahy.
9. Prípravok vyznačujúci sa tým, ž e tento prípravok zahŕňa polypeptid podľa nárokov 1 alebo 4 konjugovaný s nejakou antifungálnou látkou.
10. Spôsob liečby infekcií patogénnymi hubami (mykóz) vyznačujúci sa tým, že tento spôsob zahŕňa podanie prípravku podlá nejakého v nárokoch 7 alebo 8 subjektov postiženému nejakou infekciou patogénnymi hubami.
11. Spôsob podľa nároku 10 vyznačujúci satým, ž e tento spôsob ďalej zahŕňa aplikáciu antifungálnej látky non-chitinázovej povahy spomínanému subjektu.
·· ·· ·· · ·· ···· · · · ··· ···· · · · · · · • · ··· · · · ···· · · · • · ···· ·· ·· ·· ·· · ·· ·
12 a (b) kvantifikáciu značeného polypeptidu naviazaného na chitín.
12. Prípravok vyznačujúci sa tým, ž e tento prípravok zahŕňa polypeptid podlá nárokov 1 alebo 4 konjugovaný s nejakou detekovatelnou značkou.
13. Prípravok podľa nároku 12 vyznačujúci sa tým, že spomínaná detekovateľná značka je vybraná zo skupiny zahŕňajúci rádioizotopy, fluorofory, farby, elektrondénznej zlúčeniny a enzýmy.
14. Spôsob pre stanovenie prítomnosti chitínu ve vzorkách vyznačujúci sa tým, že tento spôsob zahŕňa:
(a) kontakt sledovanej vzorky s prípravkom podľa nároku
15. Súprava pre stanovenie prítomnosti chitínu ve vzorkách v y značujúci sa tým, že táto súprava zahŕňa prípravok podľa nároku 12.
16. Purifikovaný izolovaný polynukleotid kódujúci polypeptid podľa nároku 1.
17. Polynukleotid podlá nároku 16 vyznačujúci sa tým, že týmto polynukleotidom je DNA.
18. Nejaký vektor vy značuj ú c i s a t ý m, ž e tento vektor zahŕňa DNA podľa nároku 17.
19. Hostiteľská bunka stabilne transformovaná alebo transfekovaná DNA podľa nároku 17 ·· ·· ·· · ·· ···· · · · · · · ···· ···· · · • · ··· · · · ···· · · · ·· ·· ·· · ·· · vyznačujúca satým, že táto hostiteľská bunka exprimuje polypeptid kódovaný spomínanou DNA.
20. Spôsob produkcie polypeptidu zahŕňajúceho fragment ludskej chitinázy vyznačujúci sa tým, ž e tento spôsob zahŕňa kultiváciu hostiteľských buniek podľa nároku 19 v živnom médiu a izolácii spomínaného polypeptidu z týchto hostiteľských buniek alebo živného média.
21. Purifikovaný izolovaný polypeptid vyznačujúcis a tým, že tento polypeptid je produkovaný spôsobom podía nároku 20.
22. Monoklonálna protilátka vyznačujúca sa tým, že táto monoklonálna protilátka špecificky interaguje s epitópom v oblasti 54 C-koncových aminokyselín ludskej chitinázy popísané sekvenciou SEK. ID. Č.: 2:
23. Monoklonálna protilátka podľa nároku 22 v y z n a c u táto monoklonálna protilátkou 243Q, j u c a sa protilátka kompetuje produkovanou hybridómom tým, že s monoklonálnou uloženým pod ve väzbe k fragmentu aktivitou, ale prístupovým číslom ATCC _ ludskej chitinázy s chitín-väzobnou postrádajúcim chitinázovú aktivitu.
24. Monoklonální protilátka podía nároku 22 v y značujúca s a t ý m, ž e táto monoklonálna protilátka kompetuj e s monoklonálnou
·· ·· ·· e ·· ···· ··· ··· ···· ···· ·· • · ··· · · · ···· · · · ·· ·· ·· · ·· · protilátkou 243M, produkovanou hybridómom uloženým pod prístupovým číslom ATCC _ , vo väzbe k fragmentu ludskej chitinázy s chitín-väzobnou aktivitou, ale postrádajúcim chitinázovú aktivitu.
SK1354-2000A 1998-03-12 1999-03-12 Fragmenty chitinázy viažuce chitín SK13542000A3 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/039,198 US6200951B1 (en) 1998-03-12 1998-03-12 Chitinase chitin-binding fragments
PCT/US1999/005343 WO1999046390A1 (en) 1998-03-12 1999-03-12 Chitinase chitin-binding fragments

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK13542000A3 true SK13542000A3 (sk) 2001-07-10

Family

ID=21904197

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1354-2000A SK13542000A3 (sk) 1998-03-12 1999-03-12 Fragmenty chitinázy viažuce chitín

Country Status (14)

Country Link
US (3) US6200951B1 (sk)
EP (1) EP1078073A1 (sk)
JP (1) JP2002505882A (sk)
CN (1) CN1357046A (sk)
AU (1) AU763582B2 (sk)
BR (1) BR9908724A (sk)
CA (1) CA2323070A1 (sk)
HU (1) HUP0101078A3 (sk)
IL (1) IL138375A0 (sk)
NO (1) NO20004522L (sk)
PL (1) PL343197A1 (sk)
RU (1) RU2000123559A (sk)
SK (1) SK13542000A3 (sk)
WO (1) WO1999046390A1 (sk)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7741000A (en) * 1999-09-30 2001-04-30 Icos Corporation Chitinase immunoglobulin fusion products
AU2001291049A1 (en) 2000-09-15 2002-03-26 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health, Office Of Technology Transfer Defensin-antigen fusion proteins
US7244703B2 (en) * 2001-06-22 2007-07-17 Bentley Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions and methods for peptide treatment
HUP0400659A3 (en) 2001-07-24 2005-06-28 Zhu Zhou Woodbridge Methods, compositions and kits relating to chitinases and chitinase-like molecules and inflammatory disease
US7632654B2 (en) * 2002-04-29 2009-12-15 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Means and methods for detecting endoglycosidase activity
NZ537225A (en) * 2002-05-16 2008-09-26 Sepracor Inc Amines that inhibit a mammalian anandamide transporter, and methods of use thereof
CN1756838A (zh) * 2003-01-07 2006-04-05 杰诺瓦有限公司 心血管疾病中减少的分泌性多肽种类(来自壳三糖苷酶的片段)
WO2005005955A2 (en) * 2003-06-27 2005-01-20 New England Biolabs, Inc. Specific detection of chitin using chitin-binding domain
BRPI0418589A (pt) * 2003-12-08 2008-01-29 Bentley Pharmaceuticals Inc composições farmacêuticas e métodos para tratamento por insulina
US8377650B2 (en) * 2006-03-17 2013-02-19 The Norwegian University Of Life Sciences (Umb) Method of enhancing degradation of chitin
FR2908654B1 (fr) 2006-11-20 2014-04-04 Oreal Utilisation cosmetique de proteines de type chitinase
US20110070601A1 (en) * 2008-01-23 2011-03-24 Rigshospitalet Classification of individuals suffering from cardiovascular diseases according to survival prognoses as found by measuring the levels of biomarker ykl-40
EP2245459A1 (en) 2008-01-23 2010-11-03 Herlev Hospital Ykl-40 as a general marker for non-specific disease
NZ592241A (en) 2008-09-15 2012-11-30 Herlev Hospital Ykl-40 as a marker for gastrointestinal cancers
JP5036741B2 (ja) * 2009-02-18 2012-09-26 中原大學 翻訳段階で自己切断活性を有するポリヌクレオチド配列を同定するための方法およびシステム
WO2011135578A1 (en) 2010-04-28 2011-11-03 Chetan Balar Composition comprising chitin and tinosporin for use in the treatment of viral diseases
BR112016023418A8 (pt) 2014-04-10 2019-12-10 MEP Equine Solutions LLC método e kit para a quantificação de ovos de parasitas nas fezes
WO2020146514A1 (en) * 2019-01-08 2020-07-16 University Of Georgia Research Foundation Targeted nanoparticles and their uses related to fungal infections
CN109943621B (zh) * 2019-01-22 2022-07-01 美林美邦（厦门）生物科技有限公司 来自弧菌属的碱性几丁质酶在真菌染色中的应用
CN115087668A (zh) * 2020-01-31 2022-09-20 奥斯瓦道·克鲁兹基金会 抗体、其用途、药物组合物，包括真菌感染诊断方法、真菌感染诊断试剂盒和真菌感染治疗方法
WO2023074415A1 (ja) * 2021-10-25 2023-05-04 学校法人東京薬科大学 キチン結合ポリペプチドならびにキチンの検出方法および検出キット

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5587292A (en) 1987-05-22 1996-12-24 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Diagnosis of fungal infections with a chitinase
US5258502A (en) * 1989-01-30 1993-11-02 Massachusetts Institute Of Technology Immobilization and purification of fusion proteins using chitin-binding ability
EP0779362B2 (en) 1989-12-22 2012-06-13 Laboratoires Serono SA DNA constructs for endogenous gene activation and expression modification
WO1992020808A1 (en) 1991-05-15 1992-11-26 Cell Genesys, Inc. Genomic modifications with homologous dna targeting
US5326561A (en) 1992-12-15 1994-07-05 Cornell Research Foundation, Inc. Antifungal synergistic combination of enzyme fungicide and non-enzymatic fungicide and use thereof
TW402639B (en) 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery
US5496934A (en) * 1993-04-14 1996-03-05 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Nucleic acids encoding a cellulose binding domain
US5561051A (en) 1994-06-14 1996-10-01 American Cyanamid Company Screen for inhibitors of chitinase
US5928928A (en) 1995-06-07 1999-07-27 Universiteit Van Amsterdam Human chitinase, its recombinant production, its use for decomposing chitin, its use in therapy or prophylaxis against infection diseases
WO1997036917A1 (en) 1996-03-29 1997-10-09 Smithkline Beecham Corporation Chitotriosidase
US20030017570A1 (en) 1996-06-14 2003-01-23 Patrick W. Gray Chitinase materials and methods

Also Published As

Publication number Publication date
BR9908724A (pt) 2000-11-21
US6200951B1 (en) 2001-03-13
EP1078073A1 (en) 2001-02-28
WO1999046390A1 (en) 1999-09-16
US20030143216A1 (en) 2003-07-31
NO20004522L (no) 2000-11-01
HUP0101078A3 (en) 2002-09-30
JP2002505882A (ja) 2002-02-26
AU763582B2 (en) 2003-07-24
PL343197A1 (en) 2001-07-30
CA2323070A1 (en) 1999-09-16
IL138375A0 (en) 2001-10-31
AU2998999A (en) 1999-09-27
US6399571B1 (en) 2002-06-04
RU2000123559A (ru) 2002-12-27
CN1357046A (zh) 2002-07-03
NO20004522D0 (no) 2000-09-11
HUP0101078A2 (hu) 2001-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK13542000A3 (sk) Fragmenty chitinázy viažuce chitín
Galjart et al. Expression of cDNA encoding the human “protective protein≓ associated with lysosomal β-galactosidase and neuraminidase: Homology to yeast proteases
JP4503708B2 (ja) ヒト血漿ヒアルロニダーゼ
AU752642B2 (en) Antibody against LAR phosphatase subunit
JP4145356B2 (ja) Ｐ―セレクチンリガンド蛋白
HU228743B1 (en) Treatment of alpha-galactosidase a deficiency
EP1396542B1 (en) P-Selectin Ligand Protein
EA015009B1 (ru) АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ К СВЯЗЫВАНИЮ С Fc-РЕЦЕПТОРОМ И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ
JPH07507679A (ja) セレクチンリガンド
WO1991007483A2 (en) Mammalian pancreatic cholesterol esterase
JP2002524099A (ja) 脈管形成の調節における内皮細胞表面受容体活性の調節
US6372212B1 (en) Chitinase materials and methods
US5648465A (en) Cloning and expression of neurocan, a chondroitin sulfate proteoglycan
WO1994003601A9 (en) Cloning, expression and uses for neurocan as a chondroitin sulfate proteoglycan
WO2013001819A1 (ja) 可溶性インテグリンα４変異体
JP3394540B2 (ja) Ｏ−フコシルトランスフェラーゼ
WO1993021330A1 (en) Human glutamine:fructose-6-phosphate amino-transferase
WO1998054333A2 (en) Mammalian caax processing enzymes
CZ20003308A3 (cs) Chitin-vazebné fragmenty chitinázy
WO2001046415A1 (fr) Polypeptides de type tachykinine et utilisation associee
MXPA98010619A (en) Materials and methods for the production of quitin
Selvanayagam Cloning, sequencing and expression of cDNA encoding two lysosomal membrane proteins, and generation of monoclonal antibodies against them