CZ20003308A3 - Chitin-vazebné fragmenty chitinázy - Google Patents

Abstract

Polypeptid s chitin-vazebnou aktivitou, ale postrádající chitinázovou aktivitu, který zahrnuje chitin-vazebný fragment 54 C-koncových aminokyselin lidské chitinázy.

Description

Oblast techniky

Obecně lze říci, že vynález popisuje materiály zahrnující chitin-vazebné fragmenty lidské'chitinázy a analogy těchto fragmentů. Přesněji pak, vynález popisuje nově purifikované a izolované polynukleotidy kódující tyto fragmenty, dále fragmenty chitinázy kódované těmito polynukleotidy, materiály a způsoby přípravy těchto fragmentů chitinázy rekombinantními technikami a terapeutické a diagnostické využití těchto fragmentů chitinázy.

Dosavadní stav techniky

Chitin je lineární homopolymer tvořený Nacetylglukosaminovými zbytky spojenými β—(1,4) vazbou. Tento polysacharid je po celulóze druhou nejčastěji se vyskytující organickou látkou. Z chitinu je například exoskelet členovců. Chitin je rovněž obsažen v buněčných stěnách cizopasných hub a jiných patogenů, kde hraje významnou strukturní a ochrannou roli. Narušení buněčné stěny a membrány cizopasných hub je účinnou terapeutickou strategií používanou proti těmto cizopasným houbám a patogenům. Antifungální·. aktivita amfotericinu B a flukonazolu je například založena na ovlivnění steroidů v membránách buněk. I přesto, že existují antifungální terapeutika, plísňové infekce jsou v poslední době zodpovědné za výskyt poruch ohrožujících životy lidí (viz. Georgopapadakou a další, Trends Microbiol., 3:98 až 104, 1995). Mezi patogeny vyvolávající výše zmíněná onemocnění patří především zástupci rodů Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Coccidiodides a Pneumocystis. Tito patogenové jsou zvláště nebezpeční pro jedince s oslabeným imunitním systémem, jako například pro pacienty

postižené AIDS, pacienty podstupující léčbu chemoterapeutiky a imunosuprimované pacienty po transplantaci orgánů.

Chitin může být degradován chitinázou. Chitinázy jsou produkovány rostlinami, mikroorganizmy i živočichy. Bakteriální chitináza například pomáhá dodávat zdroj uhlíku nezbytný pro růst baktérií. Hmyz produkuje chitinázu za účelem degradace kutikuly při růstu. U rostlin pravděpodobně hraje chitináza důležitou úlohu při ochraně proti patogen/* ft ním houbám. Chitinázy byly klonovány z velkeho poctu ruzných druhů bakterií (například Serratia marcescens, Heitz a další, EMBO J., 5:467 až 473, 1986), rostlin (například tabáku, Heitz a další, Mol. Gen. Genet., 245:246 až 254,

1994) a hmyzu (například vos, Krishnan a další, J. Biol. Chem., 269:20971 až 20976, 1994) a na základě sekvenční analogie byly rozděleny do dvou skupin označovaných jako rodina 18 a rodina 19 (Henrissat a Bairoch, Biochem. J., 293:781 až 788, 1993). Ačkoliv je katalytická oblast mezi zástupci rodiny 18 mezidruhově konzervována, mezidruhová sekvenční homologie v chitin-vazebné doméně je minimální. Jediným znakem společným pro chitin-vazebné domény u chitináz rodiny 18 je výskyt několika cysteinových zbytků.

U savců bylo identifikováno několik proteinů s nízkým stupněm homologie k bakteriálním, hmyzím a rostlinným chitinázám (méně než 40% identita aminokyselin). Takovými pro* teiny jsou například lidský gp-39 chrupavek (C-gp-39; Hakala a další, J. Biol. Chem., 268:25803 až 25810, 1993), lidský glykoprotein YKL-40 (Johansen a další, Eur. J. Cancer, 31A:1437 až 1442, 1995), estrogenem indukovaný protein specificky exprimovaný ve vejcovodech ovcí, hovězího dobytka a lidí (DeSouza a další, Endocrinology, 136:2485 až 2496,

1995) a sekretovaný protein aktivovaných myších makrofágů (Chang a další, Genbank M94584). U těchto proteinů nebyla nicméně popsána schopnost degradovat chitin. Funkce těchto proteinů není známa, ale předpokládá se, že hrají úlohu při remodelingu tkání. Hakala a další (viz. výše) popsali, že protein C-gp39 lze detekovat ve vzorcích synovia a chrupavek pacientů postižených revmatickou arthritidou, ale ne ve vzorcích odebraných z organizmu zdravých jedinců. Recklies a další (Arthritis Rheumatism, 36 (9Suppl.) :S190, 1993) popisují lokalizaci C-gp39 v jednotlivých buňkách tvořících povrchovou vrstvu chrupavky. Johansen a další (viz. výše) udávají, že sérová koncentrace YKL-40 může sloužit jako prognostický markér rozsahu metastáz a přežívání pacientů s recidivujícími nádory prsu.

Escott a další (Infec. Immun., 63:4770 až 4773, 1995) prokázali chitinázovou aktivitu v lidských leukocytech a v séru. Overdijk a další (Glycobiology, 4:797 až 803, 1994) popisují izolaci chitinázy (hydrolázy methylumbelliferyltetra-N-acetylchitotetraosidu) z lidského séra a potkaních jater. Renkema a další (J. Biol. Chem., 270:2198 až 2202, únor 1995) izolovali lidskou chitotriosidázu ze sleziny pacientů postižených Gaucherovým onemocněním. Tento izolát vykazoval chitinázovou aktivitu a ve zmíněném článku je uvedena část aminokyselinové sekvence proteinové složky izolátu (22 koncových aminokyselin a 21 aminokyselinových zbytků z fragmentu získaného štěpením trypsinem). Funkce lidské chitinázy je rovněž neznámá, ale v tomto článku byla naznačena možná souvislost s patofyziologií Gaucherova onemocnění. Pozdější práce publikovaná·stejnou skupinou (Boot a další, J. Biol. Chem., 270(44):26252 až 26256, listopad 1995) popisuje klonování cDNA z lidských makrofágů kódující produkt s chitinázovou aktivitou. Částečná aminokyselinová sekvence uvedená v publikaci této skupiny z února 1995 (viz. výše) se shoduje s částí předpokládané aminokyselinové sekvence produktu cDNA z lidských makrofágů. Rovněž mezinárodní přihláška W096/40940 popisuje dvě rozdílné lidské • · cDNA kódující produkty s chitotriosidázovou aktivitou o velikosti 50 kDa a 39 kDa, kde oba tyto produkty jsou enzymaticky aktivní. Renkema a další (Eur. J. Biochem., 244:279 až 285, 1997) popisuje skutečnost, že lidská chitináza je v makrofázích nejprve produkována jako 50 kDa protein, který je následně z části procesován na 39 kDa formu, která je akumulována v lysozymech. V této publikaci je rovněž uvedeno, že alternativním sestřihem je produkována mRNA kódující chitinázu o velikosti 40 kDa. Jak 39 kDa, tak 40 kDa izoformy jsou pravděpodobně zkrácené na C-konci a vyznačují se úplnou chitinázovou aktivitou, ale pouze slabou vazbou chitinu.

Vzhledem ke zvyšujícímu se výskytu plísňových onemocnění ohrožujících život jedinců s oslabeným imunitním systémem je žádoucí identifikovat nové látky a způsoby použitelné k diagnostice a léčbě těchto onemocnění.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález popisuje nově purifikované a izolované polynukleotidy (t. j. DNA a RNA, jak kódující tak antikódující vlákna) kódující fragmenty lidské chitinázy a jejich analogy, kde tyto fragmenty nebo analogy mají chitin-vazebnou aktivitu, ale postrádají chitinázovou aktivitu. Vynález dále popisuje přípravu takových fragmentů rekombinantními technikami, farmaceutické přípravky zahrnující tyto fragmenty a diagnostické a terapeutické látky konjugované s těmito fragmenty. Předpokládá se, že tyto fragmenty konjugované s diagnostickými nebo terapeutickými látkami budou použitelné k detekci chitinu, vazbě chitinu a léčbě plísňových infekcí nebo k vývoji produktů využitelných k léčbě plísňových onemocnění.

Nukleotidové sekvence dvou lidských cDNA kódujících předpokládané alelické varianty lidské chitinázy, včetně • * ·· ···· · · • · · · · · · ···· ·· · ·· • · ·· · · · · ··· nekódujících 5' a 3' sekvencí, jsou uvedeny jako SEK. ID.

Č.: 1 a SEK. ID. Č.: 3. Kódující oblast pro lidskou chitinázu odpovídá v SEK. ID. Č.: 1 nukleotidům 2 až 1399 a v SEK. ID. Č.: 3 nukleotidům 27 až 1424. Předpokládaná kódující sekvence maturní lidské sekretované chitinázy bez signální sekvence odpovídá nukleotidům 65 až 1399 v SEK. ID.

Č.: 1 a nukleotidům 90 až 1424 v SEK. ID. Č.: 3. Aminokyselinové sekvence polypeptidů kódovaných DNA popsanými SEK.

ID. Č.: 1 a SEK. ID. Č.: 3 jsou uvedeny jako SEK. ID. Č.:

2, respektive SEK. ID. Č.: 4. Dvacet jedna N-koncových aminokyselin (v SEK. ID. Č.: 2 a 4 na pozicích -21 až -1) tvoří signální peptid, který je odštěpen za vzniku maturní lidské chitinázy (v SEK. ID. Č.: 2 a 4 odpovídá aminokyselinám 1 až 445). Bylo zjištěno, že 72 C-koncových aminokyselinových zbytků v lidské chitináze není nezbytných pro chitinázovou aktivitu. Příklad 5 popisuje produkci Nkoncového fragmentu lidské chitinázy, který je na C-konci zkrácen o 72 aminokyselin. Důsledkem zavedení stop kodonu za kodon pro aminokyselinu 373 je produkce rekombinantního fragmentu chitinázy o velikosti 39 kDa, který si, vzhledem nezkrácené k rekombinantní lidské chitináze, zachovává podobnou specifickou chitinázovou aktivitu. Klonování cDNA kódující lidskou chitinázu a její exprese a biologické aktivity rekombinantní lidské chitinázy jsou detailně popsány * v přihlášce US 08/877599, podané 16. června, 1997, která navazuje na přihlášku US 08/663618, podanou 14. června,

1996. Obě tyto přihlášky jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu ..tohoto vynálezu.

Podstatou předkládaného vynálezu je neočekávané zjištění, že téměř veškerá chitin-vazebná aktivita lidské chitinázy je situována v 99 C-koncových aminokyselinách ze 445 aminokyselin intaktního enzymu. Vynález specificky popisuje polypeptidové produkty vážící chitin, ale postrádající chi• · • · tinázovou aktivitu. Ve výhodném provedení vynálezu se jedná o fragmenty obsahující chitin-vazebnou část, která zahrnuje 54 aminokyselin na C-konci lidské chitinázy. Takovými fragmenty jsou například fragment zahrnující přibližně 99 aminokyselin z C-konce lidské chitinázy (přibližně aminokyselinové zbytky 347 až 445 v SEK. ID. Č.: 2), fragment zahrnující přibližně 72 aminokyselin z C-konce lidské chitinázy (přibližně aminokyselinové zbytky 374 až 445 v SEK. ID. Č.: 2), fragment zahrnující přibližně 54 aminokyselin z C-konce lidské chitinázy (přibližně aminokyselinové zbytky 392 až 445 v SEK. ID. Č.: 2) a fragment zahrnující přibližně 49 aminokyselin z C-konce lidské chitinázy (přibližně aminokyselinové zbytky 397 až 445 v SEK. ID. Č.: 2). Vynález rovněž popisuje purifikované, izolované polynukleotidy včetně DNA kódující výše uvedené polypeptidové fragmenty; vektory zahrnující takové DNA, zvláště pak expresívní vektory, kde jsou tyto DNA funkčně spojeny se sekvencí umožňující jejich expresi; hostitelské buňky stabilně transformované nebo transfekované výše zmíněnými DNA tak, že v těchto hostitelských buňkách je umožněna exprese fragmentů lidské chitinázy; způsoby produkce polypeptidových fragmentů lidské chitinázy zahrnující kultivaci zmíněných hostitelských buněk v živném médiu a izolaci uvedených polypeptidů z hostitelských buněk nebo kultivačního média; purifikované, izolované polypeptidy produkované tímto způsobem; fúzní proteiny zahrnující výše zmíněné polypeptidy spojené s nějakým heterelogním peptidem nebo polypeptidem, včetně nějakého enzymu jako například sekretované alkalické fosfatázy (SEAP); přípravky zahrnující výše zmíněné lidské polypeptidové fragmenty; přípravky zahrnující polypeptidové fragmenty lidské chitinázy konjugované s nějakou antifungální látkou a způsoby léčby plísňových onemocnění aplikací těchto přípravků, volitelně aplikací spolu s antifungálními látkami neobsahu6

jícími fragmenty chitinázy; přípravky zahrnující polypeptidové fragmenty chitinázy konjugované s detekovatelnou značkou (včetně radioizotopů, fluoroforů, barviv, elektrondenzních sloučenin a enzymů); způsoby použití těchto přípravků k detekci výskytu a množství chitinu v nějakém vzorku, kde tyto způsoby zahrnují následující kroky: (a) kontakt zmíněného vzorku s polypeptidovým fragmentem lidské chitinázy konjugovaným s detekovatelnou značkou a (b) stanovení množství značeného fragmentu navázaného na chitin; soupravy pro diagnostiku přítomnosti chitinu ve vzorcích; monoklonální protilátky, které specificky interaguj£ s chitin-vazebným fragmentem lidské chitinázy postrádajícím chitinázovou aktivitu, včetně protilátek specificky interagujících s epitopem v oblasti 54 C-koncových aminokyselinových zbytků lidské chitinázy o sekvenci uvedené jako SEK.

ID. Č.: 2; a výhodně používané monoklonální protilátky 243Q a 243M a protilátky, které kompetují s nebo se vážou ke stejným epitopům jako protilátky 243Q a 243M.

Polypeptidové fragmenty chitinázy podle vynálezu zahrnují fragmenty lidské chitinázy nebo jejich alelické varianty, které se vyznačují tím, že si zachovávají chitinvazebnou aktivitu, ale postrádají chitinázovou aktivitu, analogy těchto fragmentů a fúzní proteiny zahrnující tyto fragmenty nebo analogy. Polypeptidové fragmenty chitinázy jsou využitelné v terapeutických a diagnostických aplikacích popsaných v dalším textu.

Fragmenty chitin-vazebné domény, které spadají do rozsahu vynálezu, jsou v SEK. ID. Č.: 2 reprezentovány aminokyselinovými zbytky od X po Y, kde X zahrnuje všechna celá čísla v intervalu 347 až 397 a Y je 445. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají části výše uvedených fragmentů, které si uchovávají chitin-vazebnou aktivitu. Jedním z výhodně požívaných fragmentů je fragment zahrnující 99 C-koncových ami• · ·· • · · nokyselin lidské chitinázy (aminokyselinové zbytky 347 až 445 v SEK. ID. Č.: 2); v příkladu 7 (viz. níže) bylo prokázáno, že tento fragment si zachovává 80% chitin-vazebné aktivity maturní chitinázy. Výhodněji používanými fragmenty jsou pak fragment zahrnující 54 C-koncových aminokyselin lidské chitinázy (aminokyselinové zbytky 392 až 445 v SEK. ID. Č.: 2) a fragment zahrnující 49 C-koncových aminokyselin lidské chitinázy (aminokyselinové zbytky 397 až 445 v SEK. ID. Č.: 2), které mají rovněž zachovanou chítínvazebnou aktivitu (viz. příklad 7). Příklad 7 ukazuje, že fúzní protein zahrnující 99 C-koncových aminokyselin lidské chitinázy obsahuje doménu odpovědnou za vazbu chitinu. Hranice této chitin-vázající domény byly přesněji definovány zkracováním zmíněné 99-ti aminokyselinové oblasti jak z Nkonce, tak z C-konce, a měřením chitin-vazebné aktivity fúzních proteinů zahrnujících takto zkrácené úseky. Mezi tyto zkrácené úseky patří aminokyselinové řetězce s Nkoncem začínajícím aminokyselinovým zbytkem 347, 374, 392, 395, 397, 400 nebo 409 a na C-konci ukončené aminokyselinovým zbytkem 431, 443 nebo 445.

Analogy mohou zahrnovat analogy fragmentů chitinázy, u kterých je jedna nebo více specifikovaných (t.j přirozeně se vyskytující) aminokyselin odstraněno nebo nahrazeno, nebo do nichž je přidána jedna nebo více nespecifikovaných ’ aminokyselin: (1) bez ztráty, jedné nebo více biologických aktivit (včetně schopnosti vázat chitin) nebo imunologických charakteristik specifických pro chitinázu; nebo (2) za účelem potlačení (odstranění) příslušné biologické aktivity chitinázy. Předpokládá se, že konzervativní aminokyselinové záměny (jak jsou v současnosti chápány) mohou být provedeny bez jakéhokoliv ovlivnění biologické aktivity příslušného fragmentu.

9 ·· ··

Výhodně používanými sekvencemi DNA podle vynálezu jsou sekvence genomové DNA nebo cDNA a rovněž sekvence DNA zcela nebo částečně připravené chemickou syntézou, které kódují fragmenty lidské chitinázy s chitin-vazebnou aktivitou, ale postrádající chitinázovou aktivitu, jejich analogy a fúzní proteiny zahrnující tyto fragmenty nebo analogy. Jednou z n· výhodně používaných nukleotidových sekvencí je sekvence kódující v SEK. ID. Č.: 2 aminokyselinové zbytky od X po Y, kde X zahrnuje všechna celá čísla v intervalu 347 až 397 a Y je 445. Zvláště výhodnou sekvencí DNA je sekvence nukleotidů 1238 až 1399 v SEK. ID. Č.: 1 (kódující aminokyselinové zbytky 92 až 445 v SEK. ID. Č.: 2). Do rozsahu vynálezu spadá výše zmíněná sekvence DNA a další sekvence DNA, které za standardních podmínek hybridizují s antikódujícím vláknem výše uvedené sekvence DNA, nebo které v důsledku degenerace genetického kódu s touto sekvencí nehybridizují, a které kódují fragmenty chitinázy s chitin-vazebnou aktivitou. Příkladem standardních hybridizačních podmínek jsou podmínky: hybridizace při 42°C v 50% formamidu a promytí při 60°C roztokem 0,1 x SSC, 0,1% SDS. Odborníkům je zřejmé, že uvedené hybridizační podmínky mohou být změněny v závislosti na délce hybridizovaných sekvencí a zastoupení CG párů. Vzorce pro výpočet standardních hybridizačních podmínek jsou uvedeny například v publikaci Sambrook a další, 9.47 až 9.51, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989.

Polynukleotidy podle vynálezu mohou být použity jako hybridizační sondy k identifikaci a izolaci genomových DNA a cDNA kódujících chitin-vázající oblasti proteinů homologních k lidské chitináze; a k identifikaci buněk exprimující chitin-vázající části takových proteinů a biologických podmínek, při kterých jsou tyto proteiny exprimovány.

·· ι «a • · ··· • · · ·· ·· ··· · « * · ·· ·φ ·· ··

Další stránka vynálezu se týká biologických replik (tj. kopií izolovaných sekvencí DNA připravených in vitro nebo in vivo) sekvencí DNA podle vynálezu. Vynález popisuje autonomně se replikující rekombinantní konstrukty jako například plazmidy a virové vektory zahrnující polynukleotidy kódující fragmenty lidské chitinázy s chitin-vazebnou aktivitou, včetně jakékoliv z DNA popsaných výše. Mezi výhodně používané vektory patří expresívní vektory, které obsahují cDNA kódující fragmenty chitinázy funkčně spojené s nějakou « endogenní nebo heterologní sekvencí řídící expresi a nějakým terminátorem transkripce. Tyto expresívní vektory mohou dále obsahovat sekvence DNA kódující polypeptidy, kde tyto sekvence DNA jsou funkčně spojeny se sekvencemi DNA kódujícími fragmenty chitinázy tak, že s .yyužitím těchto vektorů je možné exprimovat nějaký fúzní protein obsahující požadovaný polypeptid.

Další stránka vynálezu se týká prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk stabilně transfekovaných nebo transformovaných polynukleotidovými sekvencemi podle vynálezu tak, že tyto buňky umožňují expresi požadovaného produktu zahrnujícího fragment chitinázy. Hostitelské buňky exprimující fragmenty chitinázy mohou být použity ke mnoha účelům. Tyto buňky jsou cenným zdrojem imunogenů použitelných k přípravě protilátek specificky reagujících s chitinázou. Hostitelské buňky podle vynálezu jsou použitelné pro » produkci fragmentů chitinázy ve velkém měřítku tím, že tyto buňky jsou kultivovány ve vhodném kultivačním médiu a požadované polypeptidové produkty jsou z buněk nebo kultivačního média izolovány například imunoafinitní purifikací.

Znalost sekvencí DNA kódujících část lidské chitinázy vážící chitin umožňuje modifikaci buněk tak, aby exprimovaly tyto chitin-vazebné části nebo aby byla exprese těchto částí zvýšena. Vložením části nebo kompletního heterologní10 ·· ·· · · ···· ·· · ··· ·· · · · · · ····· · · · · · · • ·· ··· · ··· · · ···· ···· ·· · • · ·· ·· ·· ·· ··· ho promotoru do vhodného místa uvnitř genu pro chitinázu může být u takto modifikovaných buněk (například homologní rekombinací) dosaženo zvýšení exprese chitin-vazebné části lidské chitinázy. Tento heterologní promotor je do genu vložen tak, aby byl funkčně spojen se sekvencí kódující chitin-vazebné části lidské chitinázy. Viz. například mezinárodní přihlášky WO94/12650, W092/20808 a WO91/09955. Spolu se zmíněným heterologním promotorem může být do genu •t vložen amplifikovatelný markér a/nebo intron.

• Fragmenty chitinázy mohou být získány ve formě izolátů z přirozených zdrojů nebo mohou být syntetizovány chemickou cestou, ale ve výhodném provedení jsou produkovány rekombinantními technikami využívajícími prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky podle vynálezu. Předpokládá se, že při použití savčích hostitelských buněk bude produkt posttranslačne modifikován (například myristilován, glykosylován, částečně štěpen, fosforylován na tyrosinu, šeřinu nebo threoninu nebo modifikován kovalentním připojením lipidů) . Tyto posttranslační modifikace mohou být nezbytné pro optimální biologickou aktivitu rekombinantních produktů podle vynálezu.

Do rozsahu vynálezu dále.spadá použití fragmentů chiti-. názy při screeningu proteinů nebo jiných molekul (například malých molekul), které se specificky vážou na chitini vazebnou doménu lidské chitinázy, nebo které modulují vazbu ♦ lidské chitinázy k chitinu nebo k proteinům extracelulární matrix, jako například kyselině hyaluronové. Pomocí fragmentů chitinázy izolovaných z plazmy, rekombinantních fragmentů chitinázy nebo buněk exprimujících tyto produkty mohou být identifikovány proteiny nebo jiné molekuly (například malé molekuly), které se specificky vážou k chitináze. Proteiny nebo jiné molekuly, které se váží k chitin-vazebné doméně chitinázy mohu být využity k modulaci aktivity chi• · · ·· · ··· φφφφφ φ φ φ · · φ ·· · φ * φ Φ·· φ tinázy. Proteiny, které se specificky vážou k chitinvazebné doméně chitinázy rovněž spadají do rozsahu vynálezu a zahrnují protilátky (například monoklonální nebo polyklo1' j ¹ nální protilátky, jednotlivé řetězce protilátek, chimérické protilátky, humanizované protilátky, lidské protilátky a protilátky s vloženými CDR sekvencemi včetně sloučenin zahrnujících sekvence CDR, které specificky rozpoznávají nějaký polypeptid podle vynálezu). Slovní spojení specificky se vážou k chitin-vazebné doméně chitinázy označuje skutečnost, že zmíněný vazebný protein rozpoznává výlučně chitin-vazebnou doménu chitinázy a ne katalyticky aktivní část chitinázy. Tyto vazebné proteiny jsou například použitelné v přípravcích pro imunizaci, jakož i pro purifikaci chitinázy, a jsou použitelné k detekci nebo kvantifikaci chitinázy ve vzorcích tkání nebo tělních tekutin pomocí známých imunologických metod. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají anti-idiotypické protilátky specificky reagující s protilátkami proti chitináze.

Protilátky specificky interagující s chitin-vazebnou doménou jsou použitelné k detekci nebo kvantifikaci přítomnosti chitinázy, například při sandwich ELISA, a k detekci nebo kvantifikaci výskytu kvasinek nebo cizopasných hub, například přidáním chitin-vazebné domény interagující s kvasinkami nebo cizopasnými houbami a následným přidáním značené protilátky specificky interagující s touto chitinvazebnou doménou. Detekce chitin-vazebné domény ve vzorcích lidské krve (plazmě nebo séru) může být korelována s nějakým standardním diagnostickým markérem onemocnění zahrnujícím chitinázu, například Gaucherovým onemocněním. V současnosti jsou výhodně používány protilátky 243Q a 243M produkované hybridomy 243Q (přístupové číslo _) a 243M (přístupové číslo _) a monoklonální protilátky, které kom7) ·· · · · · ·· • · * · · · • · · · · • · · · · · petují s nebo se vážou do stejného epitopu rozpoznávaného protilátkami 243Q a 243M.

Vědecká hodnota informací vyplývající z uvedení sekvencí DNA a sekvencí aminokyselin podle vynálezu je zřejmá. Znalost sekvence cDNA pro chitinázu například umožňuje izolaci sekvencí genomových DNA kódujících jiné savčí chitinázy (a jim podobné proteiny) s využitím hybridizace DNA/DNA nebo polymerázovou řetězcovou reakcí (PCR). Je velmi pravděpodobné, že hybridizací DNA/DNA nebo PCR využívajících sekvence DNA podle vynálezu prováděných za standardních podmínek, bude možné izolovat DNA kódující alelické varianty lidské chitinázy, jiné strukturně příbuzné lidské proteiny vyznačující se chitin-vazebnou aktivitou podobnou chitináze a chitin-vazebné oblasti proteinů homologních k chitináze z jiných živočišných druhů. Sekvence DNA popsané v této přihlášce rovněž umožňují (homologní rekombinací nebo knockoutováním genů; viz. například Kapecchi, Science, 244:1288 až 1292, 1989) získání živočichů, kteří neexprimují funkční chitinázu, chitinázu exprimují nadměrně nebo exprimují různé varianty chitinázy. Tito živočichové mohou sloužit jako modely ke studiu aktivity chitinázy in vivo nebo ke studiu modulátorů chitinázy in vivo.

Vhodně značené polynukleotidy podle vynálezu mohou být použity při hybridizačních reakcích.k detekci schopnosti buněk syntetizovat chitinázu. Polynukleotidy podle vynálezu mohou být rovněž základem diagnostických metod použitelných k identifikaci genetických změn v oblasti chitinázy, kde tyto změny jsou příčinou onemocnění. Vynález rovněž umožňuje přípravu antisense polynukleotidů použitelných k regulaci exprese chitinázy v buňkách, které chitinázu exprimují.

Vynález rovněž předpokládá, že chitin-vazebné fragmenty mohou být připojeny k nějakému heterolognímu peptidu. Připojení těchto fragmentů k nějaké části imunoglobulinu, na1?

• · příklad ke konstantní oblasti, může být například využito terapeuticky. Jiným příkladem je připojení těchto fragmentů k polypeptidu použitelnému jako detekční značka nebo markér, jako například polypeptidu s enzymatickou aktivitou nebo polypeptidu zahrnujícímu nějaký detekovatelný epitop jako například epitop myc nebo epitop FLAG (Eastman Kodak).

Chitin-vazebné fragmenty mohou být rovněž připojeny k nějakému jinému proteinu a tím usnadnit purifikaci tohoto proteinu afinitní vazbou na chitinovou matrici. Tyto fúzní proteiny mohou být následně z kolony eluovány nebo mohou být od chitin-vazebné domény odštěpeny a odštěpený protein pak eluován (viz. například Chong a další, Gene, 192:271 až 281, 1997).

Fragmenty lidské chitinázy podle vynálezu mohou být rovněž využity jako látky specificky interagující s chitinem a to k identifikaci výskytu chitinu v biologických vzorcích. Další stránka vynálezu popisuje chitin-vazebné fragmenty chitinázy konjugované s nějakou detekovatelnou značkou jako například radioizotopem, fluoroforem, barvou, elektrondenzní sloučeninou nebo enzymem, které jsou uvedeny do kontaktu s testovaným vzorkem a přítomnost chitinu je analyzována kvalitativně nebo kvantitativně. Termín konjugovaný znamená spojený kovalentní vazbou. Tyto techniky jsou v současnosti známé a jsou například ilustrovány v přihlášce US 5587292, která je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Množství tímto způsobem detekovaného chitinu může indikovat množství patogenních hub v organizmu infikovaného pacienta. Dvěma fragmenty výhodně používanými při těchto stanoveních jsou chi-. tin-vazebná doména o velikosti 54 aminokyselin zahrnující v lidské chitináze popsané v SEK. ID. Č.: 2 aminokyselinové zbytky 392 až 445 a chitin-vazebná ,doména o velikosti 49 • · • · u -u· aminokyselin zahrnující v lidské chitináze popsané v SEK.

ID. Č.: 2 aminokyselinové zbytky 397 až 445.

Vynález rovněž popisuje konjugáty zahrnující chitinvazebné fragmenty chitinázy a nějakou sloučeninu vhodnou pro diagnostiku jako například radioizotopy emitující gama záření nebo pozitronové záření pro radionukleární diagnostiku (například 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr, 56Fe, Hlín,

97Ru, 67Ga, 68Ga, 72As, 89Zr, 201T1, 99Tn, 90Y); cheláty paramagnetických kovů, sloučeniny značené nitroxylovou spinovou značkou a jiné látky (například Gd(III), Eu(III), Dy(III), Pr(III), Pa(IV), Mn(II), Cr(III), Co(III),

Fe(III), Cu(II), Ni(II), Ti(III) aV(IV), GdDTPA/dimeglumin[Magnevist™] ) pro diagnostiku MRI; kontrastní látky pro diagnostiku založenou na rentgenovém záření, včetně CT (například sloučeniny obsahující brom nebo jod); a další látky v současnosti známé. Předpokládá se, že tyto konjugáty se budou vázat na chitin buněčné stěny kvasinek a budou tudíž využitelné ve stanoveních k detekci nebo lokalizaci kvasinek in vivo v organizmu savců.

Do rozsahu vynálezu rovněž spadá aplikace fragmentů chi· tinázy a terapeutických látek obsahujících tyto fragmenty do organizmu savců, zvláště pak lidí, za účelem léčby one- . mocnění vyvolaných patogeny obsahujícími chitin jako například plísněmi. Infekce plísněmi (mykózy) jako například kandidóza, aspergilóza, kokcidioidomykóza, blastomykóza, parakokcidioidomykóza, histoplasmóza, kryptokokóza, chromoblastomykóza, sporotrichóza,, mukormykóza a dermatofytózy mohou být buď chronické nebo akutní. V organizmu hostitelů s oslabenou imunitou způsobují patogenní houby vážná, často smrtelná onemocnění. Pacienti s rakovinou podstupující chemoterapii, imunosuprimovaní · jedinci a jedinci infikovaní virem HIV jsou náchylní k mykózám způsobených mikroorganizmy Candida, Aspergilus, Pneumocystis carnii a jinými. K • · · ·

I. .

léčbě mykóz jsou používány amfotericin B a flukonazol, ale jejich použitelnost je limitována nepříznivými vedlejšími účinky, které jsou důsledkem toxicity těchto sloučenin. I přes léčbu amfotericinem B je úmrtnost na systemickou kandidózu vyšší než 50%. V současnosti známé živočišné modely plísňových onemocnění jsou popsány v příkladech 9 až 15.

Do rozsahu vynálezu rovněž spadají přípravky zahrnující fragmenty chitinázy používané k léčbě savců náchylných k nebo postižených plísňovými onemocněními. Vynález předpokládá, že fragmenty chitinázy mohou být konjugovány s dalšími konvenčními antifungálními sloučeninami včetně amfotericinu B a strukturně podobnými sloučeninami nystatinem a pimaricinem; 5-fluorcytosinu; derivátů azolu jako například flukonazolem, ketokonazolem, klotrimazolem, mikonazolem, ekonazolem, butokonazolem, oxikonazolem, sulkonazolem, terkonazolem, itrakonazolem a tiokonazolem; allylaminůthiokarbamátů jako například tolnaftátem, naftifinem a terbinafinem; griseofulvinu; ciklopirox olaminu; haloproginu; kyseliny undecylenové; a kyseliny benzoové (viz. například Goodman a Gilman, The Farmacological Basis of Therapeutics, 9. vydání, McGraw-Hill, NY, 1996). Podle této stránky vynálezu slouží chitin-vazebné fragmenty jako vektory ke směrování známých fungicidních nebo fungistatických sloučenin k patogenním houbám obsahujícím chitin a mohou tudíž zefektivnit účinek těchto anti-fungálních látek pravděpodobně tím, že u zmíněných patogenních hub vyvolají větší citlivost vůči použitým sloučeninám. Snížení množství běžně používaných anti-fungálních sloučenin potřebného k dosažení požadovaného terapeutického účinku může umožnit použití těchto léčiv v méně toxických hladinách. Schopnost selektivního směrování na patogenní houby nebo kvasinky s využitím fragmentů chitin-vazebné domény rovněž umožňuje aplikaci těchto fragmentů konjugovaných s cytotoxickými sloučeniió • · • ·

námi, které sami o sobě nejsou selektivně anti-fungální. Tato stránka vynálezu se týká konjugace chitin-vazebných fragmentů chitinázy k jakékoliv cytotoxické látce v současnosti známé, včetně radioizotopů (jako například 90Y,

188Re, 186Re, 199Au, 64Cu, 67Cu, 1311), toxinů a chemoterapeutik, která bude účinná vůči kvasinkám. Postupy v současnosti známými mohou být vhodné cytotoxické látky snadno identifikovány. Oproti použití chitin-vazebných domén chitináz z jiných organizmů je použití chitin-vazebné domény lidské chitinázy v těchto případech výhodnější, protože se předpokládá, že lidské polypeptidy budou v organizmu lidí neimunogenní.

Fragmenty chitin-vazebné domény mohou sami o sobě vykazovat antifungální aktivitu, a to narušením tvorby příčných vazeb v buněčné stěně kvasinek. Tyto fragmenty mohou být aplikovány samostatně nebo v kombinaci s jinými antifungálními látkami. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají multimerní fragmenty chitin-vazebných domén, které jsou k tomuto účelu zvláště vhodné. Mezi tyto multimerní fragmenty patří fragmenty, které byly kovalentně zesíťovány chemicky nebo rekombinantně produkované polypeptidy zahrnující větší počet chitin-vazebných domén tandemově spojených. Aplikace fragmentů chitin-vazebných domén, buď monomerních nebo multimerních, může snížit množství současně aplikovaných antifungálních látek nezbytné k dosažení požadovaného terapeutického účinku.

Do rozsahu vynálezu tudíž spadá použití fragmentů chiti názy při přípravě léčiv k profylaxi nebo léčbě mykóz.

Terapeutické/farmaceutické přípravky spadající do rozsa hu vynálezu zahrnují fragmenty chitinázy, které mohou být konjugovány s jinou terapeutickou látkou a fyziologicky přijatelným rozpouštědlem nebo nosičem a mohou rovněž zahrnovat jiné antifungální látky. Naznačená podávané množství • ·

by dostačovala k nahrazení endogenní chitínázové aktivity. Obecně přijímané dávkovači režimy jsou uvedeny v publikaci Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. vydání, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Podávané dávky se budou pohybovat v intervalu 1 pg/kg až 100 mg/kg tělesné hmotnosti a ve výhodném provedení pak v rozmezí přibližně 0,1 až přibližně 20 mg chitinázy na kilogram tělesné hmotnosti. Terapeutické přípravky podle vynálezu mohou být v závislosti na typu léčené infekce aplikovány různými způsoby, včetně aplikace subkutánní, intramuskulární, intrak· ' ? ' venózní, intrapulmonární, transdermálni, intrathekálni, lokální, orální nebo prostřednictvím čípků.

Vynález rovněž předpokládá, že nadměrná exprese chitinázy při Gaucherově onemocnění nebo v místech zánětu (jako například při revmatické arthritidě) může mít škodlivý vliv na extracelulární matrix a v těchto případech mohou být inhibitory chitínázové aktivity, včetně fragmentů chitinázy nebo inhibitorů vazby na chitin identifikované způsoby popsanými výše, terapeuticky účinné, například redukcí remodelace nebo destrukce extracelulární matrix.

cDNA kódující lidskou chitinázu byla izolovaná z cDNA knihovny makrofágů. Je známo, že makrofágy mají blízký vztah k lézím revmatické arthritidy (Feldman a další, Cell, 85:307 až 310, 1996) a produkty makrofágů jako například

TNF-α mají na svědomí progresi tohoto onemocnění. V synoviu a chrupavkách pacientů postižených revmatickou arthritidou byl identifikován protein C-gp39, homologní k lidské chitináze. Ačkoliv přirozeným substrátem lidské chitinázy je pravděpodobně chitin z patogenních organizmů, tento enzym může rovněž působit na endogenní makromolekuly, které jsou přirozenou součástí extracelulární matrix. Předpokládá se například, že kyselina hyaluronová, hlavní složka extracelulární matrix, obsahuje jádro z oligomerů chitinu (Semino

ES

a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 93:4548 až 4553, 1996; Varki, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 93:4523 až 4525, 1996). Chitináza se tudíž může účastnit degradace extracelulární matrix u onemocnění jakým je například revmatická arthritida. Tato úloha chitinázy může být stanovena měřením množství chitinázy a/nebo účinků aplikace chitinázy nebo inhibice chitinázy v synoviální tekutině izolované z kloubů pacientů postižených arthritidou. Množství endogenní chitinázy může být stanovováno enzymaticky nebo s využitím protilátek. Viskozita synoviální tekutiny může být měřena před a po vystavení působení chitinázy; snížení viskozity asociované s chitinázovou aktivitou by ukazovalo na přítomnost endogenního substrátu pro chitinázu. Modulace aktivity chitinázy tudíž může modulovat progresi poškození kloubů při revmatické arthritidě.

Do rozsahu vynálezu rovněž spadají způsoby screeningu inhibitorů chitinázové aktivity, které mohou být použitelné v případech popsaných v před.chozím-_;pdstavci. Způsoby screeningu vzorků použitelné k identifikaci látek inhibujících chitinázu jsou například popsány v přihlášce WO95/34638, publikované 21. prosince 1995.

Příklady provedení vynálezu

Další stránky a výhody předkládaného vynálezu budou lépe srozumitelné po přečtení následujících ilustrativních příkladů. Příklad 1 popisuje izolaci cDNA klonů lidské chitinázy z cDNA knihovny lidských makrofágů. V příkladu 2 je uvedena topologie exprese genu pro chitinázu v různých lidských tkáních. Příklad 3 popisuje rekombinantní expresi genu pro lidskou chitinázu v prokaryotických buňkách a purifikaci vzniklého produktu. V příkladu 4 je uveden postup rekombinantní produkce lidské chitinázy v kvasinkách. Příklad 5 popisuje rekombinantní expresi genu pro lidskou chi19 ·· ·· » · · » · · ·· • · ·

tinázu v savčích buňkách a purifikaci vzniklého produktu. Příklad 6 popisuje produkci polypeptidových analogů a fragmentů lidské chitinázy peptidovou syntézou nebo rekombinantními technikami. Příklad 7 popisuje produkci fragmentů a analogů lidské chitinázy vykazující chitin-vazebnou aktivitu. V příkladu 8 je uveden postup přípravy monoklonálních protilátek specificky reagujících s lidskou chitinázou. Příklad 9 popisuje stanovení použitelné k měření katalytické aktivity chitinázy. Příklad 10 popisuje stanovení antifungální aktivity testovaných látek in vitro. Příklad 11 popisuje stanovení antifungální aktivity testovaných látek in vivo na myším modelu a příklady 12 až 15 popisují králičí modely invazivní aspergilózy, diseminované kandidózy, oftalmitidy vyvolané zástupci rodu Candida a endokarditidy vyvolané zástupci rodu Candida. Příklad 16 uvádí srovnání chitin-vazebných a hydrolytických aktivit kompletní lidské chitinázy a jejích C-koncového fragmentu. Příklad 17 popisuje konjugaci chitin-vazebných fragmentů k jiným sloučeninám.

Příklad 1

Izolace klonů cDNA kódujících chitinázu cDNA knihovna byla připravena z makrofágů monocytární linie z periferní krve postupem popsaným v publikaci Tjoelker a další, Nátuře, 374:549 až 552, 1995. Klony z této knihovny byly vybrány náhodně a z jednotlivých klonů byla izolována plazmidová DNA. S využitím primeru JHSP6, který je komplementární k sekvenci přiléhající ve vektoru pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA) ke klonovacímu místu pro cDNA, byla automatickým sekvenátorem (model 373, Applied Biosystems, Foster City, CA) u každého klonu stanovena sekvence přibližně 300 až 500 bází od konce DNA.

JHSP6: 5'-GACACTATAGAATAGGGC-3' (SEK. ID. Č.: 5) • · ·· ··· ·

Za účelem nalezení podobnosti se známými geny byly nukleotidová a odvozená aminokyselinová sekvence těchto cDNA klonů porovnány se sekvencemi v databázích nukleotidů a peptidu. Srovnání sekvencí bylo provedeno službou BLAST Národního centra pro biotechnologické informace s využitím přiřazovacího algoritmu podle Altschul a další, J. Mol. Biol., 215:403 až 410, 1990. Klon MO-119 vykazoval vysokou míru homologie s několika různými sekvencemi, včetně prekurzoru proteinu YM-1 sekretovaného myšími makrofágy (v databázi Genbank pod přístupovým číslem M94584), gp-39 z lidských chrupavek (Hakala a další, viz. výše), glykoproteinu vejcovodů ovcí, hovězího dobytka a lidí (DeSouza a další, viz. výše) a chitináz parazitů (Oncocerce, v databázi Genbank pod přístupovým číslem U1469), vos (Chelonus, v databázi Genbank pod přístupovým číslem U10422), rostlin (Nicotiana, v databázi Genbank pod přístupovým číslem X77111) a baktérií (Serratia, v databázi Genbank pod přístupovým číslem Z36295). Nejvyšší míra homologie byla pozorována u savčích genů kódujících proteiny homologní k chitináze, ale postrádající chitinázovou aktivitu. Další sekvenční analýza klonu MO-911 podporuje domněnku, že tento klon zahrnuje část kódující oblasti homologu lidské chitinázy.

DNA sekvence klonu pMO-218 (v souladu Budapešťskou úmluvou s ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA, uložena 7. června, 1996, pod přístupovým číslem 98077) je uvedena jako SEK. ID. Č. : 1 a kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEK. ID. Č.: 2. Zdá se, že MO-218 zahrnuje celou kódující oblast cDNA lidské chitinázy (nukleotidy 2 až 1399 v SEK. ID. Č.: I), včetně předpokládané signální sekvence o délce 21 aminokyselin následované 445 kódovanými aminokyselinami (aminokyselinové zbytky 1 až 445 v SEK. ID. Č.: 2). Dvacet jedna aminokyselin následujících po předpokládané signální sekvenci se přesně shoduje s N·· ·· • · · • · ·«· • · · ·» ·· ·· ···· • · · • · · • · · · • 9 · · ·· ··

koncovou sekvencí purifikované lidské chitotriosidázy popsané v publikaci Renkema a další, viz. výše. Renkema a další rovněž popisují sekvenci 21 aminokyselin fragmentu získaného štěpením lidské chitotriosidázy trypsinem, která se dokonale shodují se sekvencí aminokyselin 157 až 177 v klonu MO-218 (SEK. ID. Č. : 2) . Boot a další publikovali klonování cDNA lidské chitotriosidázy, kde tato cDNA kóduje sekvenci v podstatě identickou se sekvencí MO-218. Sekvence MO-218 zahrnuje ve srovnání se sekvencí popsanou v publikaci Boot a další navíc 14 nukleotidů na 5' konci a další odlišnost je v nukleotidu 330 v kódující oblasti.

Za účelem, potvrzení, že MO-218 skutečně zahrnuje celou kódující oblast připravené cDNA byla syntetizována sonda PÍ značená ³²P (TGGGATCATCAGCAGGACCATGAAACCTGCCCAGGCCACAGACCGCACCAT, SEK. ID. Č.: 6), která je komplementární k nukleotidům 2 až 52 v klonu MO-218 (SEK. ID. Č.: 2). Sonda PÍ byla navržena tak, aby hybridizovala s klony, které jsou na 5' konci přinejmenším tak dlouhé jako klon MO-218. Tato sonda byla přes noc při 42°C hybridizována s částí (přibližně 30000 klonů) knihovny cDNA z lidských makrofágů popsané v předchozím textu ve 40% formamidu a hybridizačním pufru (5 x SSPE, 10 x Denhardtův roztok, 100 pg/ml denaturované DNA ze spermií lososa a 2% SDS). Po promytí, filtrů byly vybrány tři klony poskytující pozitivní hybridizační signál a tyto klony byly osekvenovány. Nejdelší klon byl označen pMO-13B (v souladu Budapešťskou úmluvou s ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA, uložen 7. června, 1996, pod přístupovým číslem 12301) . DNA sekvence klonu pMO-13B je uvedena jako SEK. ID. Č.: 3 a kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEK. ID. Č.: 4. Ve srovnání s klonem MO-218 obsahuje klon pMO-13B navíc na 5' konci 25 nukleotidů. Další změnou oproti klonu MO-218 je záměna nukleotidu 330 (odpo» ·

vídá nukleotidu 305 klonu MO-218 popsaného sekvencí SEK.

ID. Č. ; 1) v klonu MO-13B (SEK. ID. Č.: 3), kde tato záměna mění aminokyselinu na pozici 80 v maturním proteinu z glycinu (v SEK. ID. Č.: 2) na serin (v SEK. ID. Č.: 4).

Příklad 2

Lokalizace exprese genu pro chitinázu v lidských tkáních

Identifikace tkání, ve kterých je exprimována lidská chitináza, byla provedena metodou Northern blot. Za standardních podmínek (podle doporučení výrobce) byl Northern blot se vzorky mRNA z různých lidských tkání (Clontech, Palo Alto, CA) hybridizován z celou kódující oblastí klonu MO-218. Maximální hybridizace byla pozorována v plicní tkáni (+++) a vaječnících (+++), menší intenzita (+) pak thymu a placentě. Velikost hybridizujících mRNA z plic, vaječníků a thymu byla 2,0 kb, což je v dobré shodě s velikostí klonované cDNA (1,6 kb nebo přibližně 1,8 kb včetně polyA konce). Velikost hybridizujících mRNA z placenty byla podstatně menší - přibližně 1,3 kb. Hybridizace nebyla pozorována ve slezině, prostatě, varlatech, tenkém střevu, tlustém střevu, leukocytech periferní krve, srdci, mozku, játrech, kosterních svalech, ledvinách nebo slinivce. Exprese chitinázy v plicích odpovídá její ochranné roli vůči patogenním organizmům obsahujícím chitin, jelikož plíce jsou primární cestou vstupu fungálních patogenů do organizmu.

Příklad 3

Produkce rekombinantní lidské chitinázy v bakteriálních buňkách

Maturní kódující oblast z klonu MO-218 byla upravena tak, aby mohla být v E.coli exprimována ve formě analogu zkráceného z N-konce. S využitím primeru o sekvenci odpovídající nukleotidům 65 až 88 v cDNA klonu chitinázy MO-218, i;

• Λ Λ Λ • 9

kde před tuto sekvenci byl předřazen kodon pro methionin a restrikční místo Xbal (5TACATCTAGAATTATGGCAAAACTGGTCTGCTACTTCACC-3' , SEK. ID. Č.:

7) a reverzního primeru v klonu MO-218 komplementárního k nukleotidům 1163 až 1183 a následovaného stop kodonem a restrikčním místem HindlII (5'AGATCTAACCTTAGGTGCCTGAAGACAAGTATGG-3' , SEK. ID. Č.: 8) byl PCR vytvořen fragment chitinázy použitelný pro expresi. V reverzním primeru je na pozici 25 adenin, zatímco v sekvenci MO-218 se na tomto místě vyskytuje guanin. Z toho vyplývá, že ve fragmentu vytvořeném s využitím tohoto primeru bude na pozici 1172 v sekvenci MO-218 místo cytosinu thymidin. Důsledkem této skutečnosti rovněž je, že fragment chitinázy kódovaný zmíněnou sekvencí bude v pozici 370 (počítáno v maturním proteinu) obsahovat serin namísto prolinu, jak je tomu v klonu MO-218. Získaný fragment DNA byl rozštěpen enzymy Xbal a HindlII a zaklonován do plazmidu pAraBAD (rovněž označovaného jako pAraCB).

Plazmid pAraCB byl připraven následovně. Plazmid pUC19 byl upraven tak, aby obsahoval arabinózový promotor a kódující sekvence AKAP 79. Arabinózový promotor (Wilcox a další, Gene, 34:123 až 128, 1985; Wilcox a další, Gene, 18:157 až 163, 1982) a gen araC byly metodou PCR amplifikovány z arabinózového operonu BAD Salmonella typhimurium ve formě fragmentu ohraničeného restrikčními místy EcoRI/Xbal. Při tomto postupu byly využity primery .araC-2 (SEK. ID. Č.: 9) a arab-1 (SEK. ID. Č.: 10):

SEK. ID. Č.: 9 araC-2 TACAGAATTCTTATTCACATCCGGCCCTG SEK. ID. Č.: 10 a rab -1TACATCTAGACTCCATCCAGAAAAACAGGTATGG ·· Μ • · · , . ··· « 9 » «

Primer araC-2 kóduje restrikční místo EcoRI a stop kodon pro produkt genu araC. Primer arab-1 kóduje doménu vážící se na ribozom a restrikční místo Xbal. PCR provedenou s těmito primery byl získán fragment o velikosti 1,2 kb, který byl po štěpení restrikčními enzymy EcoRI a Xbal zaklonován do vektoru pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) rovněž štěpeného zmíněnými enzymy. Takto připravený plazmid byl i a · označen pAraCB a obsahoval polyklonovací místo (SEK. ID.

Č.: 11) ohraničené na 5' konci restrikční místem Xbal a na 3' konci restrikční místem HindlII.

polyklonovací místo araCB

SEK. ID. Č.: 11

TCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT

Transformované buňky obsahující takto připravený expresívní plazmid (pAraMO218) byly indukovány přídavkem arabinózy a kultivovány při 37°C. Inkluzní tělíska z těchto buněk obsahovala 39 kDa protein, který je zkrácenou formou chitinázy (konstruován tak, aby byl tvořen 373 namísto 445 aminokyselinami). Tento fragment chitinázy obsahuje 4 cysteinové zbytky, zatímco intaktní chitináza obsahuje těchto . zbytků deset. Produkovaná inkluzní tělíska byla oddělena od buněčné kultury E.coli a získané proteiny byly rozděleny elektroforézou na SDS polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE). Proužek o velikosti 39 kDa byl přenesen na PVDF membránu a osekvenován z N-konce. Většina (přibližně dvě třetiny) tohoto materiálu začínala sekvencí odpovídající aminokyselinové sekvenci N-konce lidské chitinázy. Zbylý materiál odpovídal kontaminujícímu proteinu z E.coli, kterým byl porin. Takto připravená rekombinantní chitináza byla použita pro přípravu polyklonálních a monoklonálních protilátek (tato příprava je popsána v příkladu 8).

I · · · * · · » ·· · o »» « » ·· ·· ···

Jestliže byly buňky, transformované expresívním plazmidem Ara-chitináza, kultivovány při 25°C, nebyla pozorována produkce inkluzních tělísek a exprese rekombinantního proteinu byla snížena z původních deseti procent na přibližně jedno procento z celkového buněčného proteinu. Materiál produkovaný při 25°C nicméně vykazoval chitinázovou aktivitu.

Příklad 4

Produkce rekombinantní lidské chitinázy v kvasinkách V následujícím textu jsou uvedeny ukázky postupů pro rekombinantní expresi lidské chitinázy v kvasinkách a purifikaci produkovaného rekombinantního proteinu. S využitím PCR nebo spojujících oligonukleotidů byla kódující oblast lidské chitinázy zaklonována do,.vektorů pro expresi v Saccharomyces cerevisiae tak, že k sekvenci kódující N-konec lidské chitinázy byla funkčně připojena vedoucí sekvence (signální peptid). Mezi signální peptidy patří například SUC2 nebo ekvivalentní vedoucí sekvence se štěpícím místem pro signální peptidázu nebo pre-pro-alfa faktor nebo jiné komplexní vedoucí sekvence zahrnující pre-sekvenci nebo signální peptid a pro-sekvenci nebo sekvenci se štěpným místem KEX2. DNA kódující signální sekvenci může být získána PCR nebo oligonukleotidovou syntézou. DNA kódující vedoucí sekvenci pre-pro-alfa faktoru byla připravena PCR s využitím primeru zahrnujícího oligonukleotidy 1 až 20 v sekvenci genu pro alfa faktor a primeru o sekvenci komplementární k nukleotidům 255 až 235 tohoto genu (Kurjan a Herskowitz, Cell, 30:933 až 943, 1982). Tato kódující sekvence signálního peptidu pre-pro-alfa faktoru spolu s fragmenty sekvence kódující lidskou chitinázu byly zaligovány do plazmidu obsahujícího promotor pro alkohol dehydrogenázu kvasinek (ADH2) tak, aby tento promotor řídil expresi výsledného • » · · · · * · ··· fúzního proteinu. Jak uvádějí Rose a Broach (Meth. Enz., 185:234 až 279, D. Goeddel, ed. , Academie Press, lne., San Diego, CA, 1990), tento vektor dále, po směru transkripce za klonovacím místem, obsahuje terminátor transkripce ADH2, počátek replikace 2-μ, nějaký selekční markér například TRPÍ, CUP1 nebo LEU-2 (nebo LUE2-d) nebo ekvivalentní gen, kvasinkové geny REP1 a REP2, gen pro beta laktamázu z E.coli a počátek replikace pro E.coli. Geny pro beta laktamázu a TRPÍ umožňují selekci v baktériích respektive v kvasinkách. Geny REP1 a REP2 kódují proteiny hrající úlohu v udržování počtu kopií plazmidu v buňce.

V kódující oblasti pro chitinázu mohou být rovněž zvolena i jiná místa fúze. Za účelem zvýšení homogenity produktu, zvýšení specifické aktivity nebo změny substrátové specifity mohou být připraveny zkrácené verze kódující oblasti .

S využitím známých postupů, například působení octanu lithného (Sterarns a další, Meth. Enz., viz. výše, strany 280 až 297) a podobně, jsou konstrukty DNA popsanými v předcházejících odstavcích transformovány buňky kvasinek.

Po vyčerpání glukózy z kultivačního média je indukován promotor ADH2 (Price a další, Gene, 55:287, 1987). Pre-proalfa sekvence nebo jiné vedoucí sekvence umožňují sekreci fúzního proteinu a polypeptidový řetězec maturované lidské chitinázy je uvolňován z buněk. Signální peptid je odštěpen signální peptidázou nebo v případě pre-pro-alfa sekvence proteázou KEX2 (Bittner a další, Proč. Nati. Acad. Sci.

USA, 81:5330 až 5334, 1984).

V aminokyselinové sekvenci maturované lidské chitinázy se nacházejí dvě místa s po sobě jdoucími bazickými aminokyselinami, a to na pozici 107-108 (Lys-Arg) a 209-210 (Arg-Lys), která mohu být v průběhu sekrece proteolyticky štěpena proteázou KEX2. Za účelem stabilizace a/nebo zvýše27 • · · · · » · » • ♦ · · · • · · · • λ. · Β · ní množství produktu sekretovaného z buněk mohou být tyto sekvence mutovány tím, že jsou odstraněna potenciální místa proteolýzy (Gillis a další, Behring Inst. Mitt., č. 83:1 až 7, 1988) nebo expresí chitinázy bez provedení takových mutací, ale v hostitelských buňkách deficientních v KEX2 aktivitě. Takové hostitelské buňky mohu být získány buď screeningem mutantů neexprimujících proteázu KEX2 nebo manipulací místa pro KEX2 v genomové DNA a to technikami nahrazení genu/porušení genu (Ořr-Weaver a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 78:6354 až 6358, 1981).

Rekombinantní chitináza může být ze Saccharomyces cerevisiae sekretována s využitím obdobných vektorů obsahujících alternativní promotory, jako například PRB1, GAL4, TPI nebo jiné vhodné silné promotory, nebo jako fúzní protein s množstvím jiných vedoucích sekvencí (Sleep a další, Bio/Technol., 8:42 až 46, 1990).

Mezi jiné hostitelské buňky vhodné pro expresi patří Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces plombe, Pichia pastoris a zástupci rodů Hansenula nebo Aspergillus. Tyto systémy pro expresi rekombinantních proteinů zahrnují příslušný hostitelský organizmus a vhodný, autonomně se replikující vektor (například Falcone a další, Plasmid, 15:248 až 252, 1988), nebo expresívní kazety schopné mnohonásobné integrace do genomové DNA. Tyto systémy rovněž využívají k sekreci do kultivačního média stejné typy signálních sekvencí nebo vedoucích peptidů popsaných v předchozím textu.

Sekretovaná lidská chitináza je z kultivačního média pu rifikována například postupy použitými při purifikaci chitinázy z bakteriálních supernatantu nebo supernatantu savčích buněk (viz. příklady 3 a 5).

Jinou možností je exprese rekombinantní chitinázy v cytoplazmě Saccharomyces cerevisiae nebo podobných hostitelských buněk a následná purifikace z těchto lyžovaných bu28 něk. V průběhu purifikaci může být protein refoldován tak, aby bylo dosaženo dostatečné specifické aktivity.

i ·

Příklad 5

Produkce rekombinantní lidské chitinázy v savčích buňkách

A. Exprese v buňkách COS

Byly izolovány klony MO-218 a M0-13B. Oba tyto klony obsahují cDNA kódující nezkrácenou lidskou chitinázu připojenou na 3' konec promotoru CMV v plazmidu pRc/CMV. Třetí plazmid, který odpovídá C-koncovému fragmentu exprimovanému v bakteriálních buňkách z příkladu 3, byl připraven následujícím postupem. S využitím oligonukleotidového primeru 218-1 (CGCAAGCTTGAGAGCTCCGTTCCGCCACATGGTGCGGTCTGTGGCCTGGG,

SEK. ID. Č.: 12) zahrnujícího restrikční místo HindlII a sekvenci odpovídající nukleotidům 2 až 23 v cDNA klonu chitinázy MO-218 (SEK. ID. Č.: 1) a reverzního primeru T-END (GACTCTAGACTAGGTGCCTGAAGGCAAGTATG, SEK. ID. Č.: 13) v klonu MO-218 komplementárního k nukleotidům 1164 až 1183 a následovaného stop kodonem a restrikčním místem Xbal, byl klon MO-218 amplifikován PCR. Amplifikovaná DNA byla elektroforeticky purifikována, štěpena restrikčními enzymy Xbal a HindlII a zaklonována do vektoru pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA) štěpeného stejnými restrikčními enzymy. Místa spojení výsledného klonu byla sekvenována s využitím sekvenátoru model 737 (Applied Biosystems, Foster City, CA) a bylo potvrzeno, že tento klon kóduje sekvenci odpovídající sekvenci uvedené jako SEK. ID. Č.: 14.

Všechny tři plazmidy byly použity k transientní transfekci buněk COS metodou využívající DEAE dextran (viz. například Sambrook a další, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Po třech dnech kultivace při 37°C byla, postupem popsaným v příkladu 9, in vitro v kultivačních médiích stanovena chitinázová aktivita. V každé z kultur byla detekována významná hladina chitinázové aktivity (600 až 800 mU/ml/min) a u každého z konstruktů byla pozorována srovnatelná množství exprimovaného produktu .

Rekombinantní lidská chiťináza byla purifikována následujícím způsobem. Pět dní po transfekci COS buněk plazmidem pRc/CMV-MO-13B bylo kultivační médium separováno a zředěno stejným objemem vody. Takto zředěné médium bylo aplikováno na kolonu Q-Sepharózy Fast Flow (Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko) ekvilibrovanou pufrem o složení 25 mM Tris, 10 mM chlorid sodný, 1 mM EDTA, pH 8,0. Přibližně 95% chitinázové aktivity proteklo přes kolonu bez navázání. Tento vzorek (frakce proteklá přes Q-Sepharózu) byl upraven na 1,2 M koncentraci síranu amonného v 25 mM Trisu, pH 8,0. Při nízké koncentraci soli byla eluována jedna frakce (měřeno absorbancí při 280 nm) s chitinázovou aktivitou. Čistota tohoto materiálu byla vyšší než 85% (stanoveno SDS-PAGE) o tato frakce obsahovala přibližně 60% chitinázové aktivity.

S využitím membrány s MWCO 10000 (Ultrafree™ 10K, Millipore Corp., Bedford, MA) byl vzorek zakoncentrován a převeden do pufru o složení 20 mM Tris, 150 mM chlorid sodný, pH 8,0. U takto připraveného vzorku byla následně in vitro testována enzymatická a anti-fungální aktivita postupy popsanými v příkladech 9 a 10. Chitotriosidázová aktivita takto připraveného vzorku byla 90 nmol/min na mg proteinu.

B. Exprese v buňkách CHO

Gen pro chitinázu byl vložen do vektoru pDEFl (tento je popsán v příkladu 4 v přihlášce US 08/847218, podané 1. května, 1997, která je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu.tohoto vynálezu) tak, že z • 4 · 9 • · ♦ • ··· «7 · · · · • « · • » * plazmidu pRc/CMV/M0-13B byl restrikčními enzymy HindlIl/Xbal vyštěpen 1,77 kb fragment genu kódující nezkrácenou chitinázu a tento fragment byl zaligován do vektoru pDEFl štěpeného stejnými dvěma enzymy. Takto připravený plazmid byl označen pDEFl/CTN.l. Zmíněný HindlII/Xbal fragc ment o velikosti 1,77 kb byl rovněž zaligován do vektoru pHDEFl štěpeného restrikčními enzymy HindlII/Xbal a výsledný konstrukt byl označen pHDEFl/CTN.1. Plazmid pHDEFl se od plazmidu pDEFl liší pouze ve dvou částech: 1) v plazmidu pHDEFl nahrazuje Ehel/Sall fragment o velikost 2 kb odvozený z plazmidu pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) obsahující gen pro rezistenci vůči hygromycinu fragment Pmel/Sall o velikosti 19 bp z pDEFl; 2) v plazmidu pHDEFl je exprese genu pro dihydrofolát reduktázu (DHFR) řízena zkráceným promotorem SV40 umístěným na Nhel/Asp718 fragmentu o velikosti 120 bp. Tento fragment nahrazuje odpovídající Nhel/Asp718 fragment o velikosti 212 bp z pDEFl a byl připraven PCR amplifikací 171 bp fragmentu s využitím primerů 94-26 (5'-TGATACGGTACCGCCCCATGGCTGACTA-3' , SEK. ID. Č. : 16, obsahuje nově zavedené restrikční místo Asp718) a 94-27 (5'-GCAAGTTTGGCGCGAAATCG-3', SEK. ID. Č.: 17). Při této reakci byla jako templát použita DNA z plazmidu pDCl (popsán , v příkladu 4 v přihlášce US 08/847218, podané 1. května, 1997), který obsahuje kazetu SV40-DHFR. Získaný produkt PCR reakce o velikosti 171 bp byl následně štěpen restrikčními enzymy Nhel a Asp718.

Buněčná linie DG44 odvozená z ovarií čínského křečka (CHO), která neexprimuje DHFR, byla transfekována plazmidem pDEFl/CTN.l postupem popsaným v příkladu 5 v přihlášce US 08/847218, podané 1. května, 1997. Tato linie buněk CHO DG44 byla rovněž transfekována plazmidem pHDEFl/CTN.l a následně pak selektována následujícím upraveným postupem. Nejprve byly v médiu DMEM/F-12 doplněném 2 až 101 FBS obsa«4 4 « ► ♦ 4

I 9 · · 4 • 4 · · · · * · * • · 4 · 9 · ·

4 4 · 9 · · · · 9 4 · · * .· 4 · · · · ·· · · · · ···

1·ν hujícím hygromycin (Calbiochem, San Diego, CA) v koncentraci 800 mg/ml a rovněž obsahujícím hypoxanthin a thymidin (toto médium nebylo tudíž selektivní pro gen kódující DHFR) selektovány pouze buňky rezistentní vůči hygromycinu. Po selekci transfektantů rezistentních vůči hygromycinu byly tyto buňky následně selektovány kultivací v médiu postrádajícím hypoxanthin a thymidin. Takto vyselektované CHO buňky exprimující DHFR a rezistentní vůči hygromycinu byly dále selektovány v médiu obsahujícím nejprve 10 nM, poté 20 nM a nakonec 50 nM methotrexát, čímž bylo dosaženo selekce buněk exprimujících větší množství chitinázy.

Rekombinantní lidská chitináza (rH-chitináza) byla ze supernatantu z kultivace buněk CHO transfekovaných pHDEFl/CTN.l purifikována následujícím způsobem. Při přípravě na chromatografii na anexu byl supernatant zředěn v poměru 1:3 pufrem o složení 20 mM Tris, pH 7,0 (pufr A). Kolona pro anexovou chromatografii, naplněná Q-Sepharózou Fast Flow (Pharmacia Biotech lne., Piscataway, NJ), byla ekvilibrována pufrem A a na 1 litr nosiče bylo aplikována 15 litrů zředěného supernatantu. rH-chitináza byla zachycena ve frakci proteklé přes sloupec Q-Sepharózy a složení této frakce bylo upraveno na,.výsledné koncentrace 5% polyethylenglykol (PEG) 400 (Mallinckrodt Baker, lne., Phillipsburg, NJ), 30 mM octan sodný, pH 4,3. Kolona pro katexovou chromatografii, naplněná CM-Sepharózou Fast Flow (Pharmacia Biotech lne., Piscataway, NJ) byla ekvilibrována pufrem o složení 30 mM octan sodný, 5% PEG 400, pH 4,3 (pufr B). Vzorek rH-chitinázy byl na sloupec CM-Sepharózy nanesen v množství 1 mg na ml nosiče a rH-chitináza byla z nosiče eluována pufrem o složení 40 mM Tris, 5% PEG 400, pH 7,5 (pufr C). Následně byl vzorek rH-chitinázy pro hydrofobní chromatografii upraven přídavkem (NH₄)₂SO₄ na výslednou koncentraci 1,5 M. Kolona naplněná nosičem Macro-Prep Methyl * « • · • · · · 9 » « · ·· ·

Z « · « · · · · * · * · ···· · · ♦ * ·· ·

II ·· · · ·* · · · · ·

HIC Support (Βίο-Rad Laboratories, Hercules, CA) byla ekvilibrována pufrem o složení 20 mM Tris, 5% PEG 400, pH 7,0 (pufr D). Vzorek rH-chitinázy byl na sloupec nosiče MacroPrep Methyl HIC nanesen v množství 1 mg na ml nosiče. Kolona byla promyta pufrem D obsahujícím 1,1 M (NH₄)₂SO₄ a rHchitináza byla z nosiče eluována pufrem D obsahujícím 0,2 M (NH₄)₂SO₄. Filtrací přes membránu byl purifikovaný eluát převeden do pufru o složení 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,0 (pufr E).

Příklad 6

Produkce analogů a fragmentů lidské chitinázy

Polypeptidové analogy a fragmenty lidské chitinázy byly připraveny technikami popsanými v předchozích příkladech. Přesněji řečeno, polynukleotidy kódující lidskou chitinázu byly známými metodami, například cílenou mutagenezl a polymerázovou řetězcovou reakcí, modifikovány tak, aby kódovaly požadované peptidové analogy. Byly rovněž připraveny Ckoncové a N-koncové delece, například odstraněním vhodné části polynukleotidové kódující sekvence (například Sambrook a další, viz. výše, kapitola 15). Takto modifikované polynukleotidy jsou exprimovány a analogy nebo fragmenty rekombinantních polypeptidů jsou purifikovány postupy popsanými v předchozích příkladech.

Aminokyselinové zbytky důležité pro aktivitu lidské chi tinázy jsou identifikovány například podle homologie s jinými chitinázami nebo náhradou aminokyselinových zbytků v nativní lidské chitináze alaniny. Vzhledem ke schopnosti vytvářet disulfidické můstky a stabilizovat sekundární struktury jsou cysteiny často kritické pro udržení funkční integrity proteinů. Za účelem zjištěni, které z cysteinů v lidské chitináze jsou nepostradatelné pro enzymovou aktivitu, byl každý cystein jednotlivě mutován na serin.

• · · · • · • ·

Postupem popsaným v příkladech 3 a 5, tj . zavedením stop kodonu za kodon pro aminokyselinu 373, byl připraven fragment maturované lidské chitinázy o velikosti 39 kDa zkrácený z C-konce. Tento 39 kDa fragment postrádá, ve srovnání s nezkráceným proteinem, 72 C-koncových aminokyselin, včetně šesti cysteinů, a přesto si ve srovnání s nezkrácenou rekombinantní lidskou chitinázou zachovává podobnou specifickou aktivitu. Tento výsledek naznačuje, že chybějících 72 C-koncových aminokyselinových zbytků, včetně šesti cysteinů, není pro enzymatickou aktivitu nezbytných.

Mohou být připraveny další delece C-koncových aminokyselin, například štěpením 3' konce sekvence kódující zkrácenou lidskou chitinázu popsané v příkladu 3 exonukleázou III v různých časových intervalech a následnou ligací takto zkrácených kódujících sekvencí do plazmidové DNA kódující stop kodony ve všech třech čtecích rámcích. N-koncové delece jsou připraveny podobným postupem štěpením 5' konce zmíněné kódující sekvence a následnou ligací štěpených fragmentů do plazmidu obsahujícího proti směru transkripce od těchto fragmentů promotorovou sekvenci a startovní methionin. Tyto N-koncové deleční analogy nebo fragmenty mohou být rovněž exprimovány ve formě fúzních proteinů.

Jinou možností je příprava polypeptidových analog lidské chitinázy celkovou nebo částečnou chemickou syntézou peptidů s využitím technik v současnosti známých (viz. například syntéza IL-8 v publikaci Clark-Lewis a další, J. Biol.

Chem., 266:23128 až 23134, 1991; syntéza IL-3 v publikaci Clark-Lewis a další, Science, 231:134 až 139, 1986; a syntéza ligací popsaná v publikaci Dawson a další, Science, 266:776 až 779, 1994). Tyto postupy syntézy rovněž umožňují zavedení nových, přirozeně se nevyskytujících aminokyselin a jiných modifikací.

Biologické aktivity polypeptidových analogů lidské chitinázy, včetně aktivity enzymatické, anti-fungální a remodelingu extracelulární matrix, jsou stanovovány v současnosti používanými technikami, jako například postupy popsanými v příkladech 9 až 15 uvedených v dalším textu.

Příklad 7

Produkce chitin-vazebných fragmentů a analogů lidské chitinázy

Umístění chitin-vazebné domény v lidské chitináze bylo ΐ^υ určováno tak, že byly konstruovány fúzní proteiny obsahující část lidské chitinázy zkrácenou z N-konce a u těchto produktů byla testována chitin-vazebná aktivita. Následujícím postupem byl nejprve vytvořen chimérický protein zahrnující nezkrácenou sekretovanou alkalickou fosfatázu (SEAP; na N-konci tohoto chimérického konstruktu) (Berger a další, Gene, 66:1 až 10, 1988) připojenou k 99 C-koncovým aminokyselinám lidské chitinázy (na C-konci tohoto chimérického konstruktu). SEAP slouží v tomto chimérickém produktu jako detekovatelná značka.

S využitím primerů SEAP Start (SEK. ID. Č.: 18) a SEAP Stop (SEK. ID. Č.: 19), které zavádějí na 5' konec restrikční místo HindlII a na 3' konec polyklonovací místo, byla z kontrolního plazmidu pSEAP2 (Clontech, Palo Alto,

CA) PCR reakcí amplifikována DNA kódující SEAP. Při PCR bylo použito 100 ng templátové DNA, 1 pg každého z primerů, 0,125 mM jednotlivé dNTP, 10 mM Tris-HCl, pH 8,4, 50 mM MgCl₂ a 2,5 jednotky polymerázy Taq. Prvním krokem byla denaturace při 94°C po dobu 4 minut a poté následovalo 30 cyklů amplifikace: 1 minuta při 94°C, 1 minuta při 60°C a 2 minuty při 72°C. Takto připravená DNA byla zaklonována do míst HindlII a Apal ve vektoru pcDNA3 (Invitrogen, San Diego,

CA) a vzniklý produkt byl označen pcDNA-SEAP. DNA kódující • · • « • ·

C-koncových aminokyselin lidské chitinázy (aminokyselinové zbytky 347 až 445) byla amplifikována PCR za podmínek uvedených výše a s využitím primerů popsaných v tabulce uvedené dále v textu (tyto primery zavádějí na 5' konec a 3' konec restrikční místa EcoRI respektive Xbal). Tato DNA kódující chitinázu byla zaklonována do míst EcoRI a Xbal v polyklonovací oblasti plazmidu pcDNA-SEAP.

Výsledným konstruktem kódujícím uvedený chimérický protein byly tranzientně transfekovány buňky COS7 1,5 hodinovou inkubací v DMEM (Dulbeccos modified Eagle medium) obsahujícím 0,5 mg/ml DEAE dextranu, 0,1 mM chloroquin a 10 pg plazmidové DNA. Následně byly buňky na 45 sekund vystaveny působení 10% DMSO ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátovým pufrem, promyty bezsérovým médiem a inkubovány v DMEM doplněném 1 mM glutaminem, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu a 10% fetálním telecím sérem. Po čtyřech dnech byla postupem popsaným v publikaci Flanagan a Leder (Cell, 63:185 až 194,,- 1990) v kultivačním médiu stanovena aktivita SEAP. Tato aktivita byla dobře detekovatelná. Inkubace tohoto kultivačního média obsahujícího zmíněný fúzní protein s nerozpustným chitinem (Sigma, St. Louis,

MO) po dobu 1 hodiny při 4°C měla za následek precipitaci . více než 80% aktivity SEAP. Tento výsledek ukazuje, že celá chitin-vazebná doména spadá do oblasti 99 C-koncových aminokyselin lidské chitinázy.

PCR byly připraveny další zkrácené verze DNA kódující chitin-vazebné domény a tyto byly exprimovány jako fúzní proteiny s SEAP, jak je uvedeno v předchozím textu. U těchto fúzních proteinů byla stanovována chitin-vazebná aktivita a získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

· • ·

4 4 4

4 4 • 4 4 4

4 4

9 44 4 • · · » 9 4

9 4»

Tabulka 1

Testované zkrácené konstrukty	Použité primery	Chitin-vazebná aktivita
Aminokyseliny 347 až 445	SEAP CBD 1149 (SEK. ID. Č.: 20) a Hu Chit Stop (SEK. ID. Č. : 26)	+
Aminokyseliny 374 až 445	SEAP CBD 1231 (SEK. ID. Č.: 21) a Hu Chit Stop (SEK. ID. Či: 26)	+
Aminokyseliny 392 až 445	SEAP CBD 1285 (SEK. ID. Č.: 22) a Hu Chit Stop (SEK. ID. Č.: 26)	+
Aminokyseliny 400 až 445	SEAP CBD 1309B (SEK. ID. Č.: 23) a Hu Chit Stop (SEK. ID. Č.: 26)	-
Aminokyseliny 409 až 445	SEAP CBD 1338 (SEK. ID. Č.: 24) a Hu Chit Stop (SEK. ID. Č. : 26)	-
Aminokyseliny 347 až 431	SEAP CBD 1149 (SEK. ID. Č.: 20) a SEAP CBD 1357 (SEK. ID. Č.: 25)	-
Aminokyseliny 374 až 431	SEAP CBD 1231 (SEK. ID. Č. : 21) a SEAP CBD 1357 (SEK. ID. Č. : 25) '·?	-
Aminokyseliny 392 až 431	SEAP CBD 1285 (SEK. ID. Č.: 22) a SEAP CBD 1357 (SEK. ID. Č.: 25)	-
Aminokyseliny 395 až 445	SEAP CBD 1296 (SEK. ID. Č.: 35) a Hu Chit Stop (SEK. ID. Č.: 26)	+
Aminokyseliny 397 až 445	SEAP CBD 1300 (SEK. ID. Č.: 36) a Hu Chit Stop (SEK. ID. Č.: 26)	+
Aminokyseliny 392 až 443	SEAP CBD 1285 (SEK. ID. Č.: 22) a Hu Chit Stop 7 (SEK. ID. Č.: 7)	-

• · • «

Β. Příprava analogů s mutovanými cysteiny

Za účelem zjištění, je-li nějaký z šesti cysteinových zbytků přítomných v sekvenci 99 C-kóncových aminokyselin lidské chitinázy nezbytný pro vazbu chitinu, byly připraveny analogy fragmentů chitinázy, kde byl každý jednotlivý cystein mutován na serin. S využitím primerů popsaných v tabulce 2 bylo PCR přístupem vytvořeno šest produktů, kde v každém z nich byl mutován jeden z přítomných cysteinů na serin. Tyto produkty byly postupem uvedeným v předchozím textu připojeny k cDNA kódující SEAP. Chitin-vazebná aktivita chimérických proteinů produkovaných transientně transfekovanými buňkami COS byla stanovována postupem popsaným výše. Získané výsledky ukazují, že každý z těchto šesti cysteinových aminokyselinových zbytků je nezbytný pro chitin-vazebnou aktivitu.

Tabulka 2

Testovaný analog	Použité primery	Chitin-vazebná aktivita
C399S	SEAP CBD dCl (SEK. ID. Č.: 27) a Hu Chit Stop (SEK. ID. Č.: 26)	-
C419S	SEAP CBD dC2 (SEK. ID. Č.: 28) a Hu Chit Stop (SEK. ID. Č.: 26)	- .
C429S	SEAP CBD 1285 (SEK. ID. Č.: 22) a SEAP CBD dC3 (SEK. ID. Č.: 29)	-
C439S	SEAP CBD 1285 (SEK. ID. Č.: 22) a SEAP CBD dC4 (SEK. ID. Č.: 30)	-
C441S	SEAP CBD 1285 (SEK. ID. Č.: 22) a SEAP CBD dC5 (SEK. ID. Č.: 31)	-
C442S	SEAP CBD 1285 (SEK. ID. Č.: 22) a SEAP CBD dC6 (SEK. ID. Č.: 32)	-

• · • ·

Jak je popsáno v příkladu 6, rekombinantními technikami nebo částečnou nebo totální chemickou syntézou mohou být připraveny další chitin-vazebné fragmenty a jejich analogy.

C. Exprese chitin-vazebných fragmentů v kvasinkách

Fragment chitin-vazebné domény zahrnující aminokyselinové zbytky 392 až 445 (v SEK. ID. Č.: 2) byl ve velkém množství exprimován v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae. Expresívní konstrukt α-FLAG-CBD byl připraven tak, že nukleotidová sekvence odpovídající v SEK. ID. Č.: 2 aminokyselinovým zbytkům 392 až 445 byla připojena ke 3' konci sekvence kódující pre-pro-sekvenci α-faktoru S. cerevisiae (Brake a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81:4642 až 4646, 1984) a epitopu FLAG (Eastman Kodak). Za tímto účelem byl DNA templát nezkrácené lidské chitinázy PCR amplifikován s využitím primerů CBDaaxFLAG (přímý, SEK. ID. Č.: 33) a Hu Chit Stop 5 (reverzní, SEK. ID. Č.: 34). Sekvence primeru CBDaaxFLAG obsahuje ve směru proti směru transkripce od oblasti kódující FLAG epitop restrikční místo Asp718 a FLAG epitop je ve stejném čtecím rámci se sekvencí kódující prvních osm aminokyselin chitin-vazebné domény fragmentu 392 až 445. Primer Hu Chit Stop 5 kóduje sedm C-koncových aminokyselin zmíněného fragmentu chitin-vazebné domény a dále sekvenci Gly-Ala-Gly připojenou k šesti histidinovým zbytkům (His₆) , za níž následuje segment tří aminokyselin a kodon pro ukončení translace. Sekvence His₆ je zavedena za účelem usnadnění purifikace exprimovaného produktu afinitní chromatografií na imobilizovaném kovu (popsána v publikaci Nilsson a další, Prot. Expr. Purification, 11:1 až 16,

1997). Ihned za stop kodon bylo zavedeno restrikční místo Notl.

Produkt amplifikovaný s využitím zmíněných primerů byl štěpen restrikčními enzymy Notl a Asp718 a zaklonován do

V) • ·

odpovídajících míst v expresívní kazetě plazmidu pAYE/VEC, který je odvozen od plazmidu pAYE674 (Delta Biotechnology Limited; Sleep a další, Bio/Technology, 9:183 až 187,

1991). Takto byla rovněž zavedena restrikční místa usnadňující inkorporaci expresívních kazet do vektoru pSAC/VEC (viz. níže). Expresívní kazeta v připraveném konstruktu, označeném pAYE/AF/CBD, zahrnuje fúzi nukleotidů (ve stejném čtecím rámci) kódujících pre-pro-sekvenci α-faktoru S. cerevisiae a fragment chitin-vazebné domény. Po syntéze je tento fúzní protein směrován k buněčné membráně, kde je peptid FLAG-fragment chitin-vazebné domény-His₆ činností proteázy KEX2 odštěpen od pre-pro-sekvence α-faktoru. Transkripce fúzního proteinu pre-pro-CBD je řízena silným promotorem PRB1 a transkripce je ukončena terminátorem transkripce ADH1.

Zmíněná expresívní kazeta byla z plazmidu pAYE/AF/CBD vyštěpena restrikčními enzymy Sfil a PacI a zaklonována do odpovídajících míst ve vektoru pSAC/VEC, který je odvozen od vektoru pSAC35 (Delta Biotechnology Limited; Sleep a další, viz. výše) začleněním polyklonovacího místa. Člunkový vektor pSAC35 zahrnuje kompletní plazmid 2 μ se selekčním markérem LEU2 a dvě repetitivní sekvence ohraničující počátek replikace pro expresi v E.coli a gen pro βlaktamázu, odvozené od vektoru pUC. Výsledným plazmidem pSAC2/AF/CBD byl postupem podle Ito a další, J. Bacteriol., 153:163 až 168, 1983, transformován hostitelský kmen Saccharomyces cerevisiae IE41 (cir°leu2 pep4::URA.3 L261,

Sleep a další, viz, výše) a rezistentní buňky byly selektovány na médiu postrádajícím leucin. Po transformaci plazmidu pSAC2/AF/CBD do hostitelského kmene dojde k rekombinaci repetitivních sekvencí, čímž je eliminována sekvence pUC. Vzniklý vektor je autonomně replikován, velmi stabilní a umožňuje vysokou hladinu exprese kódovaného produktu při

kultivaci hostitelských buněk jak v selekčním, tak neselekčním médiu (Sleep a další, viz. výše).

Po klonální selekci byly čtyři ze získaných klonů kvasinek kultivovány 16 hodin při 30°C ve 2 ml selekčního média. Tyto kultury byly následně přeneseny do 18 ml média YEPD a kultivovány při 30°C dalších 40 hodin. Kultivační média byla oddělena od buněk a exprese rekombinantního proteinu byla stanovena SDS-PAGE. 2 gelu bylo zřejmé, že rekombinantní fragment chitin-vazebné domény (aminokyseliny 392 až 445) byl sekretován všemi čtyřmi klony, ale ne buňkami transformovanými prázdným kontrolním vektorem. Metodou Western blot, s využitím monoklonální protilátky 243Q namířené proti chitin-vazebné doméně, bylo prokázáno, že sekretovaným proteinem je vskutku fragment chitin-vazebné domény.

Médium je fragmentem chitin-vázající domény velmi nabohaceno, ale tento protein zde není v čisté formě. Nejprve byla provedena pilotní purifikace malého množství proteinu afinitní chromatografií na nosiči s imobilizovaným kovem, čímž byl získán čistý preparát. Do kolony o objemu 12 ml (BioRad) byly umístěny 2 ml chelatační Sepharózy Fast Flow (Pharmacia). Poté byl nosič nabit ionty niklu aplikací 10 ml 50 mM roztoku síranu nikelnatého. Následovalo promytí 10 ml destilované vody a kolona byla ekvilibrována 10 ml pufru A (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 M NaCl). Před nanáškou na kolonu bylo pH kultivačního média (kultivace klonu 34A) upraveno přídavkem Trisového. puf ru.na hodnotu 8 a výslednou koncentraci 20 mM Tris. Na kolonu bylo aplikováno 14 ml takto upraveného média a následovalo promytí 10 ml pufru A. Rekombinantní protein byl následně eluován pufrem A obsahujícím 10 (2 ml), 50 (2 ml) a 100 mM (3 ml) imidazol. Deset mikrolitrů z každé frakce při purifikaci bylo analyzováno SDS-PAGE. Z gelu bylo patrné, že rekombinantní fragment chitin-vazebné domény (aminokyseliny 392 až 445) byl v pod·· ·· ·· ···· • · · · · ·

statě v čisté formě eluován 100 mM imidazolem. Frakce 2 a 3 získané elucí 100 mM imidazolem byly spojeny. Tyto spojené frakce obsahovaly purifikovaný protein v koncentraci přibližně 0,4 mg/ml.

Funkčnost rekombinantního proteinu byla analyzována inkubací 25 μί roztoku fragmentu chitin-vazebné domény (aminokyseliny 392 až 445) s 1 mg práškového chitinu po dobu 1 • 11;

hodiny při 4°C. Po ukončení inkubace byl nerozpustný chitin odstraněn centrifugací a množství proteinu zůstavšího v supernatantu bylo (SDS-PAGE) srovnáno s množstvím přítomným v kontrolním médiu bez přídavku chitinu. V médiu s přídavkem chitinu bylo pozorováno přibližně 50% snížení množství rekombinantního proteinu. To ukazuje, že alespoň signifikantní frakce tohoto rekombinantního proteinu si uchovává schopnost vázat chitin.

Za účelem exprese fragmentu chitin-vazebné domény zahrnující aminokyselinové zbytky 392 až 445 (v SEK. ID. Č.: 2) bez epitopů FLAG a His₆ byl vytvořen druhý konstrukt pro expresi v kvasinkách. Tento konstrukt byl vytvořen postupem obdobným postupu popsaném v předchozím textu s tím rozdílem, že k amplifikací oblasti chitin-vazebné domény byly použity primery CBDa (přímý, SEK. ID. Č.: 38) a Hu Chit Stop 4 (reverzní, SEK. ID. Č.: 39). Buňky byly transformovány a selektovány postupem popsaným výše.

Transformované klony kvasinek exprimující rekombinantní chitin-vazebnou doménu byly při 30°C kultivovány přes noc v 10 ml média SC-leu-ura (BiolOl, Vista, CA) obsahujícího 2% glukózu. Jedním mililitrem této kultury bylo inokulováno 100 ml totožného média a inkubace dále pokračovala při 30°C za stálého třepání. Po 19 hodinách bylo 65 ml této kultury převedeno do 1,2 litru média YB2V (0,2% glukóza, 0,008% FeCl₃, 1 g/1 citrátu trisodného, 25 g/1 casamino kyselin, 13,5 g/1 KH₂PO₄, 3,8 g/1 (NH₄)₂SO₄, 4 mM MgSO₄, 0,0004% thiamin,

*)

9 · · · · • · · · · • · * 9 · ·

9 9 9 9 9

99 99 9 stopové prvky a vitamíny) ve fermentoru o objemu 3 litry. Fermentace probíhala při 30°C, pH 5,5, rychlosti třepání 1200 otáček za minutu a proudění vzduchu 3 1/min. pH kultivačního média bylo udržováno pomocí kyseliny fosforečné a hydroxidu amonného. Prvních 13 hodin byl fermentor ve vsádkovém režimu a poté začalo přidávání dalších živin. Nejprve ' -a bylo do fermentoru po dobu 4 hodin přidáváno médium YFV6.1 (50% glukóza, 0,02% FeCl₃, 1 g/1 citrátu trisodného, 50 g/1 casamino kyselin, 2,9 g/1 KH₂PO₄, 5 g/1 (NH₄)₂SO₄, 15,2 mM MgSO₄, 0,001% thiamin, stopové prvky a vitamíny) konstantní rychlostí 3,6 ml/hod a poté byla rychlost nástřiku zvyšována exponenciálně s dobou zdvojení 5 hodin na maximum 9,38 ml/hodina. Po ukončení kultivace po 93 hodinách byly buňky zcentrifugovány. 1,6 litrů kultivačního média bylo centrifugováno 40 minut při 5000 x g a teplotě 4°C. Buněčná peleta byla odstraněna a supernatant zfiltrován přes 0,2 pm filtr.

Rekombinantní chitin-vazebná doména byla z kultivačního média z fermentoru purifikována na sloupci chitinových částic. Do kolony o objemu 50 ml (Amicon) bylo vneseno 25 ml chitinových partikul! (New England Biolabs), kolona byla promyta 250 ml 1% SDS a ekvilibrována 250 ml pufru A (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 M NaCl) při průtoku 2 ml/min. Vyčeřené médium bylo na kolonu aplikováno rychlosti 1 ml/min. Následně byla kolona promyta 250 ml pufru A a protein byl z kolony eluován 50% acetonitrilem, 0,1% trifluoroacetátem a eluát byl sbírán ve frakcích o objemu 4 ml. Acetonitril byl z eluátu odpařen vakuovou centrifugací. Analýzou eluovaných frakcí SDS-PAGE a kvantifikací obsahu proteinu bylo zjištěno, že 94% purifikované chitin-vazebné domény bylo přítomno ve třech po sobě jdoucích frakcích. Celkem bylo ze 130 ml kultivačního média získáno 109 mg chitin-vazebné domény. Analýza purifikovaného proteinu hmotnostní spektrometrií ♦ 4 metodou MALDI (Perseptive Biosystems) ukázala jeden vrchol s molekulovou hmotností 5911,9, což dobře koresponduje s předpovězenou molekulovou hmotností 5909,8. Při testovaní funkční integrity bylo 20 pg purifikované chitin-vazebné domény smícháno s 250 μΐ chitinových partikulí a výsledkem bylo navázání více než 95% peptidu na nosič.

Příklad 8

Příprava monoklonálních protilátek proti lidské chitiná ze

K přípravě monoklonálních protilátek proti lidské chiti· náze mohou být použity následující dva protokoly (imunizace jednou dávkou a nebo vícenásobná imunizace). Při prvním z postupů byla myš imunizovány opakovanými injekcemi rekombinantní lidské chitinázy (například 10 až 20 pg chitinázy emulsifikované v kompletním Freundově adjuvans) získané jakýmkoliv z postupů popsaných v příkladech 3 až 6. 4 dny po poslední posilovači dávce lidské chitinázy v PBS byla myš usmrcena a byla jí odebrána slezina. Slezina byla umístěna do 10 ml bezsérového média RPMI 1640 a suspenze jednotlivých buněk byla vytvořena rozmělněním sleziny mezi konci dvou mikroskopických podložních sklíček v bezsérovém médiu RPMI 1640 doplněném 2 mM L-glutaminem, 1 mM pyruvátem sodným, 100 U/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu (RPMI) (Gibco, Kanada). Buněčná suspenze byla přefiltrována přes sterilní buněčné sítko Nitex (70-mesh, Becton Dickinson, Parsippany, New Yersey) a dvakrát promyta centrifugací při . i

200 g po dobu 5 minut a následným rozsuspendováním ve 2 0 ml bezsérového média RPMI. Jako kontrola byly použity splenocyty izolované podobným postupem ze slezin tří neimunizovaných myší Balb/c. Myelomy NS-1, udržované tři dny před fúzí v logaritmické fázi růstu v RPMI doplněném 11% fetálním telecím sérem (FBS) (Hyclone Laboratories, lne., Logan, • 9

9 · ·

Utah), byly centrifugovány při 200 g po dobu 5 minut a buněčná peleta byla dvakrát promyta.

x 10⁶ splenocytů bylo smícháno 2 x 10⁷ buněk NS-1, tato směs byla zcentrifugována a supernatant odstraněn. Poklepáním na stěnu zkumavky byla buněčná peleta uvolněna a po dobu 1 minuty byl při 37°C za stálého míchání přidáván 1 ml 50% PEGu 1500 (v 75 mM HEPES, pH 8,0) (Boehringer Mannheim) . Následovalo přidávání 7 ml bezsérového RPMI v časovém intervalu 7 minut. Bylo¹ přidáno dalších 8 ml RPMI a buňky byly centrifugovány při 200 g po dobu 10 minut. Po odstranění supernatantu byla buněčná peleta rozsuspendována ve 200 ml RPMI obsahujícího 15% FBS, 100 μΜ hypoxanthin sodný, 0,4 μΜ aminopterin, 16 μΜ thymidin (HAT; Gibco), 25U/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) a 1,6 x 10⁶ splenocytů/ml a směs byla vyseta do deseti 96-ti jamkových destiček pro tkáňové kultury s plochým dnem (Corning, Corning New York).

Druhý, čtvrtý a šestý den po fúzi bylo 100 μΐ média z každé jamky nahrazeno médiem, čerstvým. Osmý den po fúzi byla v médiu metodou ELISA testována přítomnost myších IgG schopných vázat lidskou chitinázu. Toto testování bylo provedeno následujícím způsobem. Destičky Immulon 4 (Dynatech, Cambridge, MA) byly potaženy 100 ng/jamka lidské chitinázy . ve 25 mM Trisu, pH 7,5. Potahování probíhalo 2 hodiny při 37°C. Potahovací roztok byl odstraněn a do misek bylo na 30 minut při 37°C přidáno 200 μΐ/jamka blokovacího roztoku (0.5% želatina z rybí kůže (Sigma) rozpuštěna v CME-PBS). Destičky byly třikrát promyty PBS s 0,05% Tweenem 20 (PBST) a do každé jamky bylo přidáno 50 μΐ supernatantu. Po 30-ti minutové inkubaci při 37°C a promytí popsaném výše bylo přidáno 50 μΐ kozí protilátky proti myším IgG(fc) konjugované s křenovou peroxidázou (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) ředěné v poměru 1:3500 v PBST. Inkubace probíhala 30 minut při 37°C a po čtyřech promytích PBST ·· »··· bylo přidáno 100 μΐ substrátu, tj. 1 mg/ml o-fenylen diaminu (Sigma) a 0,1 μΙ/ml 30% H₂O₂ ve 100 mM citrátovém pufru, pH 4,5. Barevná reakce byla zastavena po 5 minutách přídavkem 50 μΐ 15% kyseliny sírové a na čtečce destiček (Dynatech) byla změřena absorbance při 490 nm. Zvolené jamky s hybridomy byly dvakrát klonovány zředěním do 96-jamkových destiček a vizuálním vyhodnocením počtu kolonií v jedné jamce po pěti dnech. Izotypizace monoklonálních protilátek produkovaných hybridomy byla provedena pomocí systému Isostrip (Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN).

Druhý protokol využívá intraslezinnou imunizaci jednou dávkou tak, jak je obecně popsána v publikaci Spitz, Methods Enzymol., 121:33 až 41, 1986). Do obnažené sleziny byla injikována rekombinantní lidská chitináza (například 10 až 20 pg v PBS v koncentraci přibližně 0,02% až 0,04%, s nebo bez adjuvans) připravená postupy popsanými v příkladech 3 až 6. Po této injikaci byla slezina vrácena zpět do peritoneální dutiny a zvířata byla zašita. Po třech dnech byla myš usmrcena a byla jí odejmuta slezina. Připravená suspenze splenocytů byla dvakrát promyta RPMI 1640 doplněným 3% fetálním telecím sérem (FCS) a rozsuspendována ve 25 ml tohoto média. Myelomy NS-0 byly sebrány v logaritmické fázi růstu, jednou promyty a v 50 ml zkumavce přidány k suspenzi splenocytů v poměru 3:1 nebo 2:1 (splenocyty:myelomy). Tato směs byla centrifugována při přibližně 400 x g (1500 otáček za minutu), supernatant byl odstraněn a buněčná peleta byla uvolněna poklepem na stěnu zkumavky. Fúze byla provedena při pokpjové teplotě přídavkem 1 ml polyethylenglykolu 1500 (PEG 1500) po dobu 1 minuty za stálého míchání. Tato směs byla inkubována další jednu minutu, poté bylo po dobu 1 minuty přidáváno teplé médium RPMI (1 ml, 30 až 37°C). Následoval přídavek 5 ml RPMI v intervalu 3 minut a další přídavek 10 ml RPMI během dalších tří mi44

· · 4 • · 444

4444 «· 44 · · • · * • 44 · 4 • 4 4 4

44 nut. Tato buněčná suspenze byla zcentrifugována a rozsuspendována v přibližně 200 ml selekčního média HAT obsahujícího RPMI 1640 doplněné 100 U/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu, 20% FCS, 100 μΜ hypoxanthinem sodným, 0,4 μΜ aminopterinem, 16 μΜ thymidinem. Tato buněčná suspenze byla v objemech 1 ml rozdělena do destiček pro tkáňové kultury a při 37°C kultivována po dobu 8 až 10 dnů ve vlhké atmosféře s obsahem CO₂ 5%. V závislosti na růstu buněk byly supernatanty v jednotlivých jamkách odstraňovány a nahrazovány 1 ml média HAT každé 2 až 3 dny. V supernatantech z jamek s konfluentní vrstvou buněk byla zjišťována přítomnost specifických protilátek a buňky z pozitivních jamek byly klonovány .

S využitím protokolů uvedených v předchozím textu bylo připraveno několik monoklonálních protilátek specificky reagujících s lidskou chitinázou. U fúze 243 bylo každé z pěti myší Balb/c ve stáří 6 až 12 týdnů nejprve před imunizací odebráno malé množství krve a poté byly myši imunizovány subkutánní injekcí 10 až 20 pg rekombinantní lidské chitinázy připravené postupem uvedeným v příkladu 5, emulsifikované v kompletním Freudově adjuvans. Ve dnech 21, 42 a 60 po první imunizaci byla myším aplikována posilovači dávka 50 pg rekombinantní lidské chitinázy v nekompletním Freundově adjuvans. Myši 2483 bylo navíc ve dnech 216 až 219 denně aplikováno 20 pg rekombinantní lidské chitinázy. 220. den po první imunizaci byla myši 2483 sterilně odebrána slezina a zpracována postupem uvedeným výše. Stručně řečeno, nejprve byla, rozmělněním sleziny mezi konci dvou mikroskopických podložních sklíček v bezsérovém médiu RPMI 1640 doplněném 2 mM L-glutaminem, 1 mM pyruvátem sodným,

100 U/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu (RPMI) (Gibco, Kanada), připravena suspenze jednotlivých buněk. Tato suspenze byla přefiltrována přes sterilní buněčné sítko * 9 • · (Becton Dickinson, Parsippany, New Yersey) a dvakrát promyta centrifugací při 200 g po dobu 5 minut a následným rozsuspendováním ve 20 ml bezsérového média RPMI. Thymocyty získané z neimunizovaných myší Balb/c byly připraveny podobným způsobem.

Myelomy NS-1, udržované tři dny před fúzí v logaritmické fázi růstu v RPMI doplněném 10% fetálním telecím sérem (FBS) (Hyclone Laboratories, lne., Logan, Utah), byly centrifugovány při 200 g po dobu 5 minut a buněčná peleta byla dvakrát promyta a rozsuspendována v 10 ml bezsérového média RPMI.

Slezinné buňky byly smíchány s buňkami NS-1 v poměru 1:5, tato směs byla zcentrifugována při 200 x g a supernatant odstraněn. Poklepáním na stěnu zkumavky byla buněčná peleta uvolněna a po dobu 1 minuty byly při 37 °C za stálého míchání přidávány 2 ml 50% PEGu 1500 (v 75 mM HEPES, pH 8,0) (Boehringer Mannheim)Následovalo přidávání 14 ml bezsérového RPMI v časovém intervalu 7 minut. Bylo přidáno dalších 16 ml RPMI a buňky byly centrifugovány při 200 g po dobu 10 minut. Po odstranění supernatantu byla buněčná peleta rozsuspendována ve 200 ml RPMI obsahujícího 15% FBS,

100 μΜ hypoxanthin sodný, 0,4 μΜ aminopterin, 16 μΜ thymidin (HAT; Gibco), 25U/ml rekombinantního lidského IL-6 (Boehringer Mannheim) a 1,5 x 10⁶ thymocytů/ml. Tato suspenze byla vyseta do deseti 96-ti jamkových destiček pro tkáňové kultury s plochým dnem (Corning, Spojené království) v objemu 200 μΐ/jamka. Před screeningem bylo buňkám 3 až 5-krát vyměněno přibližně 100 μΐ média nahrazením stejným médiem popsaným výše, ale obsahujícím lOU/ml IL-6 a neobsahujícím thymocyty.

Supernatanty z fúze 243 byly nejprve testovány metodou ELISA (jako imunogen byla použita nezkrácená forma lidské chitinázy), kde jako sekundární protilátka byl použit kon* · • · ···w ·· « · · · « · ··· jugát kozí protilátky proti myším IgG(fc) s křenovou peroxidázou. Buňky z pozitivně reagujících jamek byly 4-krát subklonovány limitním ředěním v médiu bez aminopterinu. Klonováním byly získány buněčné linie 243K, 243M a 243Q.

Monoklonální protilátky produkované dvěmi buněčnými liniemi byly izotypizovány buď soupravou Isostrip (Boehringer

Mannheim) nebo metodou ELISA s využitím činidel specificky

- o o reagujících s jednotlivými izotypy (Zymed Laboratories,

South San Francisco, CA). Všechny protilátky jsou izotypu IgGl.

Testování, jestli některá z těchto protilátek specificky interaguje s chitin-vazebnou doménou, bylo provedeno tak, že každá z protilátek byla použita při Western blotu s nezkrácenou chitinázou, chitinázou zkrácenou z C-konce (aminokyseliny 1 až 373) a rekombinantní chitin-vazebnou doménou (aminokyseliny 392 až 445) produkovanými v kvasinkách. Všechny tři protilátky 243K, 243M a 243Q se vážou na nezkrácenou chitinázu a na chitin-vazebnou doménou, ale ne na konstrukt zkrácený z C-konce.

Všechny kombinace všech tří protilátek byly testovány pro použití v sendvičové ELISA. Destičky Nunc-Immuno Module byly přes noc při 4°C inkubovány se 125 μΐ první protilátky v koncentraci 2 pg/ml. Následně byl roztok protilátky nahrazen blokovacím roztokem v objemu 300 μΐ/jamka (5% Teleostean želatina, 0,05% Procl,in 300 v CMF-PBS) . Po 30 minutách inkubace při pokojové teplotě byl blokující roztok nahrazen 20 ng/ml rekombinantní chitin-vazebné domény v Omni Diluent (5% Teleostean želatina, 0,05% Tween 20, 0,05% Proclin 300 v CMF-PBS) a inkubace pokrčovala 30 minut při 37°C. Jamky byly 5-krát promyty promývacím pufrem (145 mM NaCl, 1,5% Tween 20) a následně byla aplikována biotinylovaná sekundární protilátka v koncentraci 0,25 pg/ml. Po 30 minutách inkubace při 37°C byly jamky opět 5-krát promyty • · *

• · · 9 poté 30 minut při 37 °C inkubovány se 100 μΐ křenové peroxidázy konjugované se streptavidinem (Pierce) . Po dalším pětinásobném promytí bylo do jamek naneseno 100 μΐ substrátu (0,01 g/ml tetramethylbenzidinu v dimethylsulfoxidu zředěného 1:100 do 100 mM trihydrátu octanu sodného, pH 5,5, 0,015% H₂O₂) a inkubace probíhala ve tmě při pokojové teploi;-.

tě. Po 30 minutách byla reakce zastavena přídavkem IN H₂SO₄ a byly stanoveny absorbance při vlnových délkách 450 a 630 nm. Při tomto experimentu bylo zjištěno, že nejsilnější signál byl získán použitím kombinace protilátek 243Q (primární protilátka) a 243M (sekundární protilátka). Hybridom

243Q produkující protilátku 243Q byl uložen _ (datum) v

American Type Culture Collection, 10801 Univesity Blvd., Manassas, VA 20110-2209 a bylo mu přiděleno přístupové číslo _. Hybridom 243M produkující^protilátku 243M byl uložen _ (datum) v American Type Culture Collection,

10801 Univesity Blvd., Manassas, VA 20110-2209 a bylo mu přiděleno přístupové číslo _.

Příklad 9

Katalytická aktivita rekombinantní chitinázy Chitotriosidázová (chitinázová) aktivita byla stanovová· na pomocí fluorogenního substrátu 4-methylumbelliferyl-pN,N' ,N' '-triacetylchitotriózy (4-MU-chitotriosid, Sigma Chemical, St. Louis, MO) v Mcllvainově pufru (Holak a další, viz. výše). Deset mikrolitrů vzorků rekombinantního proteinu popsaného v příkladu 5A bylo smícháno s 10 μΐ bovinního sérového albuminu (10 mg/ml), 15 μΐ fluorogenního t

substrátu (2,71 mM) a 65 μΐ pufru (0,1 M kyselina citrónová, 0,2 M fosforečnan sodný, pH 5,2) v celkovém objemu 100 μΐ. Reakce probíhala 15 minut při 37°C a byla zastavena přídavkem 2 ml 0,3 M pufru glycin/NaOH (pH 10,6). Fluorescenční produkt štěpení (4-methylumbelliferon) byl detekován • · ♦ · •· «· · · ·· ·· · na fluorimetru (SLM-AMINCO^Instruments, lne., Rochester,

NY) při 450 nm. Standardní křivka byla získána štěpením několika koncentrací substrátu nadbytkem bakteriální chitinázy; tento poměr substrát chitináza zaručoval, že bude substrát kompletně rozštěpen. Známé množství 4-MU bylo následně korelováno s naměřeným fluorescenčním signálem a byla vytvořena standardní křivka. Intenzita fluorescence změřené při stanovením se zředěnou rekombinantní chitinázou byla následně interpolována, čímž bylo získáno množství substrátu (v nmolech) rozštěpené enzymem za^rdaný čas. Toto číslo bylo následně vyděleno koncentrací proteinu, čímž byla získána aktivita v jednotkách nmol/min/mg proteinu (množství proteinu bylo stanoveno měřením při A₂ao a z vypočítaného molárního extinkčního koeficientu).

Chitotriosidázová aktivita rekombinantní lidské chitinázy produkované v COS buňkách (postupem popsaným v příkladu 5A) byla 90 nmol/min/mg proteinu. Tímto způsobem byla rovněž testována chitinázová aktivita každého z fragmentů chitinázy podle vynálezu.

Příklad 10

Antifungální aktivita fragmentů chitinázy in vitro

Inhibice fungálního růstu běžně .používanými antifungálními sloučeninami konjugovanými s fragmenty lidské chitinázy podle vynálezu může být testována in vitro. Candida albicans a Aspergillus fumigatis jsou nebezpečnými patogeny pro jedince s oslabeným imunitním systémem. Candida i Aspergillus byly kultivovány při 37 °C v médiu RPMI do hustoty přibližně 10000 až 50000 jednotek tvořících kolonie (CFU, colony forming unints) na ml. K těmto kulturám jsou v různých ředěních přidávány testované látky a měřením turbidity kultur po 24 hodinách je určována rychlost růstu.

« · »

Antifungální aktivita sledovaných látek může být rovněž testována metodou difúze v agaru, stanovením v živném médiu podle National Committee on Clinical Laboratory Standards nebo testováním inhibice syntézy buněčných stěn podle Selitrennikoff a další (Anitimicrob. Agents Chemother., 23:757 až 765, 1983).

Při stanovení metodou difúze v agaru je 1,5% agar (s médiem RPMI pufrovaným kyselinou 2-(Nmorpholino)propansulfonovou) (MOPS), pH 7,0) inokulován Candida albicans (ATCC č. 90028) v koncentraci přibližně lxlO⁶ buněk/ml. Na tento agar je umístěn disk obsahující definované množství, například 50 pg, testované látky a je sledována oblast inhibice růstu.

Při stanovení v živném médiu je definované množství, například 50 pg, testované látky nebo kontrolní látky spolu s určitou koncentrací testovaného organizmu umístěno do média RPMI 1640 pufrovaného MOPSem, pH 7,0. Tyto vzorky jsou za stálého třepaní (120 otáček za minutu) po dobu 48 hodin inkubovány při 35°C a růst kultur je následně stanovován měřením turbidity suspenze. Vhodnými koncentracemi testovaných organizmů jsou: 2,5xl0⁴ buněk/ml Candida albicans (ATCC č. 90028); 5xl0⁴ buněk/ml Candida albicans rezistentních vůči polyenům (ATCC č. 38247); lxlO⁴ buněk/ml Aspergillus fumigatis (ATCC č. 16424); lxlO⁴ buněk/ml Neurospora crassa (ATCC č. 18889); a lxlO⁴ buněk/ml Saccharomyces cerevisiae (ATCC č. 26108).

Stanovení využívající mutanty os-1, pomocí něhož je možné identifikovat inhibitory biosyntézy buněčné stěny, je v podstatě prováděno postupem podle publikace Selitrennikoff a další, viz. výše. Inokulum l,5xl0⁵ protoplastů/ml kultivovaných v agaru (Vogelovo médium N, 7,5% sorbitol, 1,5% sacharóza, 10 pg/ml nikotinamid a 1% agar) je inkubováno 72 hodin při 25°C. Po umístění disku obsahujícího definované • · množství, například 50 pg, testované látky nebo kontrolní sloučeniny jsou sledovány změny v růstu a morfologii buněk.

Buňky os-1 jsou mutantním kmenem Neurospora crassa, který, .1 je-li kultivován za určitých podmínek při 37°C, rostou ve formě protoplastů, ale za vhodných podmínek a při teplotě 22°C znovu vytvářejí buněčnou stěnu. Vzorky inhibující růst jsou označovány jako inhibitory růstu plísní, zatímco vzorky inhibující regeneraci buněčné stěny, ale nezabíjející buňky, jsou inhibitory specificky blokující syntézu buněčné stěny.

Příklad 11

Antifungální aktivita rekombinantní chitinázy in vivo na myším modelu

Farmakokinetické parametry rekombinantní lidské chitinázy v organizmu myší byly stanoveny následujícím způsobem. Intravenózní injekcí do ocasní žíly bylo samicím myší Balb/c, ve stáří 6 až 8 týdnů, aplikováno 0,5 mg/kg, 5 mg/kg a 50 mg/kg rekombinantní lidské chitinázy. 0,01,

0,25, 1, 8 a 24 hodin po injekcích byly myši dekapitovány (dvě zvířata v daném čase a pro danou dávku). Ve vzorcích séra byla následně stanovena chitinázová aktivita a koncentrace chitinázy. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3

Dávka	AUC	Vss	cL	MRT	Biologický	Cmax
(mg/kg)	(pg/ml/h)	(ml/kg)	(ml/h/kg)	(h)	poločas (h)	(pg)
0,5	31,24	12,03	16,01	0,75	0,74	22,30
5,0	278,50	13,61	17,95	0,76	1,38	162,84
50,0	2505,83	52,92	19,95	2,65	2,33	1179,19

AUC: plocha pod křivkou do nekonečna Vss: distribuční objem • (, · · · · • · · • · * cL: clearence

MRT: průměrná doba setrvání v organizmu Cmax: maximální sérová koncentrace

Farmakokinetické parametry fragmentů chitinázy podle vynálezu nebo terapeutických sloučenin zahrnujících tyto fragmenty chitinázy mohou být testovány stejným způsobem.

Za účelem testování anti-fungálních sloučenin bylo vyvinuto několik živočišných modelů (viz. Louie a další, Infect. Immun., 62:2761 až 2772, 1994; Kinsman a další, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37:1243 až 1246, 1993; Nakajima a další, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 39:1517 až 1521, 1995; Tonetti a další, Eur. J. Immunol., 25:1559 až 1565, 1995; Denning a Stevens. Anitimicrob. Agents Chemother., 35:1329 až 1333, 1991; Stevens, J. Mycol. Med., 6(Suppl. I):7 až 10, 1996). Stručně řečeno, pokusná zvířata jsou infikována patogenními houbami a následně jsou jim aplikovány různé dávky testovaných sloučenin a je sledována délka přežívání. Mohou být provedeny srovnávací experimenty, při nichž je-aplikována antifungální látka samostatně nebo tatáž látka konjugovaná s nějakým fragmentem chitinázy. Tímto způsobem je možné stanovit, zda konjugace dané látky s chitin-vazebným fragmentem vylepšuje účinnost této antifungální látky. Akutní systemická kandidóza u myší je například vyvolána intraperitoneální nebo intravenózní aplikací Candida albicans v množství 10 x 10^s CFU. Terapeutické látky jsou aplikovány před nebo v intervalu 1 až 5 hodin po infikaci a po pěti dnech je stanoven počet přeživších jedinců. Myši mohou být rovněž usmrceny a v jednotlivých orgánech jako například mozku, ledvinách, plicích, játrech a slezině může být stanoveno množství infekčních agens. V jiném případě mohou být myši infikovány nižší dávkou patogenních hub, například Aspergillus (8 až • 9

X 10⁶ CFU) nebo Candida (1 x 10⁶ CFU), a přežívání může i '·. 6 být stanovováno v delším časovém intervalu, například za 45 dní. Dlouhodobá fungicidní/fungistatická aktivita testovaných sloučenin může být testována pokračováním terapie po dobu jednoho týdne nebo déle, například 11 dní, a sledováním pokusných zvířat v časovém horizontu několika týdnů, například 18 dní až jednoho měsíce. Účinné antifungální látky zlepšují dlouhodobé přežívání pokusných živočichů a snižují počet infekčních agens v krvi a vnitřních orgánech.

Příklad 12

Aktivita chitinázy in vivo na králičím modelu invazivní aspergilózy

Účinnost terapeutických látek zahrnujících fragmenty /

chitinázy může být sledována na modelu invazivní aspergilózy imunosuprimovaných králíků, který je po více než deset let používán k testování množství nejrůznějších antifungálních terapií (viz. například Andriole a další, Clin. Infect. Dis., 14(Suppl. 1):S134 až 138, 1992). Tyto studie jsou obvykle prováděny postupy podle Patterson a další, Anitimicrob. Agents Chemother., 37:2307 až 2310, 1993 nebo George a další, J. Infect. Dis., 168:692 až 698, 1993. Stručně vzato, první den je králíkům intravenózně podán cyklofosfamid (200 mg), čímž se stanou leupenickými, a během experimentu je jim každý den subkutánně aplikován triamcinolon acetonid (10 mg) . Druhý den, tj . 24 hodin po imunosupresi, je pokusným zvířatům intravenózně aplikováno přibližně 10⁶ (letální dávka) nebo přibližně 10⁵ (subletální dávka) konidií A. fumigatus. Antifungální terapie s testovanou sloučeninou je započata 24 hodin po infikaci nebo 48 hodin před infikaci (prevence) a pokračuje 5 až 6 dnů nebo do úmrtí pokusného zvířete..Dávky běžně používaných antifungálních sloučenin se pohybují v intervalu 1,5 nebo 0,5 • ·

mg/kg/den pro intravenózně podávaný amfotericin B, 60 nebo 120 mg/kg/den pro orálně podávaný flukonazol a 100 mg/kg/den pro orálně podávaný 5-fluorcytosin. Kontrolní skupině králíků není podávána žádná antifungální sloučenina .

Po úhynu nebo autopsií jsou vzorky jater, plic, sleziny, ledvin a mozku sledovány histopatologicky a v těchto orgánech je rovněž sledováno množství CFU infekčního agens. Rovněž mohou být prováděny kultivace infekčních agens ze vzorků srdce, moči a krve. V časových intervalech jsou odebírány vzorky krve a v těchto je stanovován počet bílých krvinek a množství sacharidového antigenu z Aspergillus (metodou ELISA). Vliv léčby testovanou sloučeninou je vyhodnocen třemi parametry: snížením mortality, snížením počtu mikroorganizmů Aspergillus kultivovaných z jednotlivých orgánu (mikrobiální nálož) a snížení množství antigenu z Aspergillus v cirkulaci. Účinné antifungální látky snižují mortalitu a/nebo mikrobiální nálož.

Na tomto modelu může být rovněž testována pulmonální aspergilóza postupem podle Chilvers a další, Mycopathologia, 108:163 až 171, 1989). Imunosuprimovaní králíci jsou intratracheální instilací infikováni konidiemi Aspergillus fumigatus a ve dnech 1, 2, 4, 7 a 10 po infikaci následuje bronchoalveolární výplach. Mikrobiální nálož v plicích je kvantifikována kultivací infekčních agens, stanovením chitinu, počtem bílých krvinek a histopatologií. Účinné antifungální látky snižují mikrobiální nálož nebo rozsah zánětu v plicích.

Příklad 13

Aktivita chitinázy in vivo na králičím modelu diseminované kandidózy <· · • · · · • ·

Účinnost terapeutických látek zahrnujících fragmenty chitinázy může být sledována na modelu diseminované kandidózy postupem popsaným v publikaci Rouse a další, Anitimicrob. Agents Chemother., 36:56 až 58, 1992. NovozélandŠtí bílý králíci byli systemicky infikováni přibližně 3 x 10⁶ blastosporami Candida albicans. Antifungální terapie testovanými sloučeninami byla zahájena 48 hodin po infikaci kandidami (nebo před infekcí při prevenci) a pokračovala například 4 dny. Přeživší jedinci byli usmrceni a z chlopně aorty, plic, ledvin a sleziny byly kultivovány infekční agens. Tyto kultivace a histopatologická pozorování mohou být rovněž provedeny u jiných orgánů jako například jater, mozku nebo srdce. Kultivace mohou být rovněž provedeny ze vzorků krve a moči. Je stanovován vliv antifungální terapie na úmrtnost a mikrobiální nálož v krevním oběhu nebo tkáních. Bayer a další, Anitimicrob. Agents Chemother., 19:179 až 184, 1981, popisuje model, ve kterém jsou králíci intraperitoneálně infikováni přibližně 5 x 10⁸ CFU Candida albicans. Čtyři dny po této infikaci je králíkům odebrán vzorek intraperitoneální tekutiny a kultivací je zjišťována přítomnost infekčních agens. Pokusná zvířata, u kterých je tímto způsobem prokázán výskyt patogenních hub, jsou náhodně rozdělena do dvou skupin - kontrolní a léčené. Antifungální léčba testovanými látkami je zahájena sedm dnů po infikaci. Oči všech králíků jsou sledovány nepřímou oftalmoskopií, protože diseminovaná kandidóza může vést k endoftalmitidě způsobené Candidami. Po 7, 11 a 14 dnech od zahájení terapie jsou zvířata usmrcena a v břišní dutině jsou sledovány známky peritonitidy a tvorba intraabdominálních abscesů. V očích je sledován výskyt makroskopických lézí. Vzorky tkání z peritoneálních abscesů, všech dalších viditelných abscesů, ledvin, jater, sleziny a očí jsou zváženy, homogenizovány v živném bujónu z hovězího srdce, postupně • · « · ředěny a kultivací je v nich stanoven počet CFU na gram tkáně. Renální a peritoneální abscesy jsou rovněž fixovány 10% neutrálním formaldehydem a podrobeny histopatologické analýze. Fungální nálož a morfologie patogenních hub jsou v těchto řezech stanovovány barvením kyselinou jodistouSchiffovým činidlem. Je sledováno zlepšení přežívání a snížení fungální nálože jako důsledku aplikace testovaných látek.

Příklad 14

Aktivita chitinázy in vivo na králičím modelu fungální endoftalmitidy

Účinnost terapeutických látek zahrnujících fragmenty chitinázy může být sledována na modelu fungální endoftalmitidy vyvolané Candidami postupem popsaným v publikaci Park a další, Anitimicrob. Agents Chemother., 39:958 až 963,

1995. Novozélandští bílý králíci (2 až 2,5 kg) byli intravitreálně infikováni přibližně 1000 CFU Candida albicans.

Pět dní po infikaci byla endoftalmitida potvrzena nepřímou oftalmoskopií a byla definována jako průměrný až těžký zákal sklivce s částečným nebo úplným zastíněním vaskulatury retiny a choroidei vyšší než 50%. Zákal sklivce je klasifikován podle definované stupnice a vzhled očního pozadí může být klasifikován a dokumentován fotograficky. Králíci byli následně léčeni podáváním testovaných látek po dobu 2 až 4 týdnů. Tradičně používané antifungální látky jsou obvykle aplikovány v dávkách 80 mg/kg/den při orální aplikaci flukonazolu a 100 mg/kg každých dvanáct hodin při orální aplikaci 5-fluorcytosinu.

Účinnost léčby je stanovována 2 až 4 týdny po zahájení a to nepřímou oftalmoskopií, kvantifikací fungální nálože a histopatologií. Fungální nálož je kvantifikována tak, že jsou odebrány a zváženy oči a odvážená část každého vzorku • · je homogenizována a kultivována po dobu 48 hodin na bručela agaru-5% koňská krev při 35°C v atmosféře 5 až 10% CO₂. Homogenizované vzorky mohou být před rozetřením na misky rovněž lOx až lOOx zředěny sterilním fyziologickým roztokem.

Je stanoven počet kolonií na miskách a celkový počet CFU v oku je vypočítán na základě znalosti počtu kolonií získaných z testované části. Účinnost léčby je poté definována snížením fungální nálože v oku. Pro histopatologická pozorování jsou vzorky očí fixovány ve folmalínu, zality a rozkrájeny na plátky o tloušťce 5 pm. Místa zánětu, organizace vazivová tkáně a přítomnost patogenních hub byla stanovována světelnou mikroskopií po obarvení řezů směsí hematoxylin-eosin nebo Gomorovým methenamino stříbrem. Byl vyhodnocen vliv testovaných antifungálních látek na snížení úmrtnosti, snížení fungální nálože nebo zmírnění zánětlivé reakce spojené s infekcí.

Jinou možností je využití králičího modelu endoftalmitidy vyvolané zástupci rodu Aspergillus, a to podle publikace Jain a další, Doc. Ophthalmol., 69;227 až 235, 1988. Do jednoho z očí novozélandských bílých králíků je vpraveno přibližně 40 spora Aspergillus fumigatus. Do kontralatelárního (kontrolního) oka je vpraveno sterilní inokulum. Účinnost léčby prostřednictvím testovaných látek může být stanovena na základě klinického obrazu očí, elektroretinograficky, nepřímou oftalmoskopií, kvantifikací fungální nálože a histopatologií. Klinicky pozorovatelná endoftalmitida začíná přibližně tři až sedm dnů po infikaci.

Příklad 15

Aktivita chitinázy in vivo na králičím modelu fungální endokarditidy

Účinnost terapeutických látek zahrnujících fragmenty chitinázy může být sledována na králičím modelu endokardi59 • ·

tidy vyvolané Candidami postupem popsaným v publikacích Witt a Bayer, Anitimicrob. Agents Chemother., 35:2481 až 2485, 1991; nebo Longman a další, Rev. Infect. Dis.,

12(Suppl. 3):S294 až S298, 1990. Trombotická endokarditida (sterilní) je u novozélandských bílých králíků vyvolána transaortálním valvulárním zavedením sterilního polyethylenového katetru (vnitřní průměr 0,86 mm). Tento katetr zůstává zaveden po celou dobu trvání experimentu. 48 hodin po zavedení katetru je intravenózní injekcí přibližně 2 x 10⁷ blastospor C. albicans vyvolána infekční endokarditida. K tomuto účelu může být rovněž využita C. parapsilosis. Antifungální terapie testovanými látkami byla zahájena 24 hodin před nebo 24 až 60 hodin po infikaci a terapie pokračovala 9 až 12 dnů. Tradičně používané antifungální látky jsou obvykle aplikovány v dávkách 1 mg/kg/den při intravenózní aplikaci amfotericinu B, 50 nebo 100 mg/kg/den při intravenózní nebo intraperitoneální aplikaci flukonazolu. Kontrolní skupině králíků nebyly podávány žádné antifungální sloučeniny. Po usmrcení byla odebrána srdce a bylo překontrolováno správné umístění katetru. Mikrobiální vegetace ze srdcí usmrcených zvířat byla sebrána, zvážena a homogenizována v 1 ml sterilního fyziologického roztoku. Homogenáty byly postupně ředěny a počet infekčních agens kvantifikován kultivací na kvasničném dextrózovém agaru po dobu 48 hodin při teplotě 35°C. U vegetace, která nedala vzniknou žádné kolonii, se předpokládá, že obsahuje méně než 2 log₁₀ CFU/gram hmotnosti vegetace.

Příklad 16

Chitin-vazebná a chitinázová (chitin-hydrolytická) aktivita fragmentů lidské chitinázy • i

A. Chitin-vazebná doména je nepostradatelné pro vazbu chitinázy k chitinu

Chitin-vazebná a chitotriosidázová aktivita nezkrácené chitinázy (445 aminokyselin) byly srovnávány s těmito aktivitami u N-koncového fragmentu (aminokyseliny 1 až 373) popsaného v příkladu 5. Nezkrácená chitináza a zmíněný fragment chitinázy byly připraveny následujícím způsobem. Expresívní konstrukty kódující nezkrácenou chitinázu (M0-13B) a fragment o délce 373 aminokyselin zkrácený z C-konce (popsány v příkladu 5) byly transfekovány do buněk COS. Po 24 hodinách bylo kultivační médium (Eaglovo médium modifikované podle Dulbecca (DMEM (Gibco)) + 10% fetální bovinní sérum + 1 mM L-glutamin + 100 U/ml penicilinu + 100 pg/ml streptomycinu) nahrazeno médiem bez fetálního bovinního séra. Buňky byly kultivovány další tři dny, poté bylo médium sebráno a byly v něm stanoveny hydrolytická a chitinvazebná aktivita.

Chitotriosidázové aktivity, stanovované postupem popsaným v příkladu 9, byly v médiu, ve kterém byly kultivovány buňky exprimující nezkrácenou chitinázu (57,6 nmol/ml/min), a v médiu, kde byly kultivovány buňky exprimující fragment chitinázy zkrácený z C-konce (57,8 nmol/ml/min), téměř totožné. To odpovídá výsledkům uvedeným v příkladu 6. Substrátem pro stanovení chitotriosidázové aktivity (postupem . popsaným v příkladu 9) je triacetylchitotrióza, což je rozpustný trisacharid.

Za účelem srovnání chitin-vazebné aktivity byl na jemný prášek v hmoždíři rozetřen chitin z krunýře kraba (Sigma). Takto získaný prášek byl třikrát promyt ekvilibračním pufrem (20 mM Tris, pH 8, 500 mM NaCl) a rozsuspendován na koncentraci 100 mg/ml. 100 μΐ této suspenze bylo přidáno k 1 ml kultivačního média transfekovaných buněk COS a vzniklá směs byla při 4°C za stálého míchání inkubována po dobu 4 hodin. Po ukončení inkubace byl chitin odstraněn centrifugací (5 minut, 12000 x g). Ke stejným objemům takto získa61

ných supernatantů byl přidán Laemliho pufr a 50 mM dithiothreitol (DTT), vzorky byly uvařeny a elektroforeticky rozděleny na 12% polyakrylamidovém gelu (Novex). Následná analýza metodou Western blot s využitím monoklonální protilátky specificky namířené proti chitináze (206A) odhalila, že v supernatantech nezůstala žádná nezkrácená chitináza, což znamená, že veškerá nezkrácená chitináza se navázala na chitin a společně s ním přešla při centrifugaci do sedimentu. Naproti tomu v supernatantech s fragmentem zkráceným z C-konce (aminokyseliny 1 až 373) nebylo po inkubaci s chitinem pozorováno snížení množství tohoto fragmentu což ukazuje, že tento zkrácený konstrukt se na chitin neváže.

Získané výsledky naznačují, že 72 C-koncových aminokyselin lidské chitinázy je nezbytných pro chitin-vazebnou aktivitu, ale ne pro hydrolýzu triacetylchitotriózy.

v ’ i;

B. Chitin-vazebná doména je nezbytná pro hydrolýzu chitinu, ale ne pro hydrolýzu triacetylchitotriózy.

Substrát použitý v příkladu 16A ke stanovení chitotriosidázové aktivity je rozpustný trisacharid. Nativní chitin je naproti tomu nerozpustný polysacharid s dlouhým řetězcem. Je tudíž možné, že schopnost enzymu hydrolyzovat krátké analogy nemusí predikovat schopnost hydrolyzovat chitin. Chitin z krunýře kraba byl za účelem srovnání chitinolytické aktivity nezkrácené chitinázy (445 aminokyselin) a fragmentu zkráceného z C-konce (aminokyseliny 1 až 373) zainkorporován do agarózového gelu. Do ztuhlého gelu byly vyříznuty jamky a do nich byla umístěna buď nezkrácená chitináza nebo zkrácený fragment. Po ukončení inkubace byl rozsah hydrolýzy chitinu indikován zónou prosvětlení kolem každé z jamek.

Tento pokus byl proveden následovně. Suspenze 0,4% chitinu a 1,5% agarózy ve 20 mM fosforečnanu sodném, pH 6, by62

la uvařena, ve vrstvě o tloušťce 2 mm nalita na Petriho misky (průměr 10 cm) a ponechána ztuhnout. Do této matrice (agaróza/chitin) byly vyříznuty jamky o průměru 3 mm. Před nanesením do jamek byly proteiny v médiích použitých ke kultivaci transfekovaných buněk COS 70-ti násobně zakoncentrovány přes filtrační membránu s MWCO 30000 (Millipore).

Do sousedních jamek byla nanesena stejná množství rekombinantní nezkrácené chitinázy a rekombinantní chitinázy zkrácené z C-konce. Do třetí jamky bylo umístěno médium použité pro kultivaci buněk COS transfekovaných kontrolním plazmidem. Aby bylo možné pozorovat zóny prosvětlení kolem jednotlivých jamek, bylo nezbytné nanášku vzorků několikrát opakovat. Kolem jamek naplněných koncentrovaným médiem použitým při kultivaci buněk COS produkujících nezkrácenou chitinázu byla pozorována zóna prosvětlení o šířce 3 mm. Kolem jamek naplněných koncentrovanými médii použitými při kultivaci buněk COS produkujících buď zkrácený fragment nebo transfekovaných prázdným vektorem nebyla tato zóna pozorována .

Tyto výsledky ukazují, že 72 C-koncových aminokyselin j nezbytných k hydrolýze chitinu lidskou chitinázou.

Příklad 17

Chemická modifikace rekombinantní chitin-vazebné domény konjugací s jinými látkami

Za účelem zjištění, zda-li může být chitin-vazebná domě na použita jako nosič pro nízkomolekulární farmaceutické látky, byla tato chitin-vazebná doména zahrnující v lidské chitináze aminokyseliny 392 až 445 chemicky konjuaována s biotinem nebo rhodaminem, a to následujícím způsobem.

Biotinylace byla provedena soupravou EZ-link-Sulfo-NHSBiotinylation (Pierce) postupem doporučeným výrobcem. Je pravděpodobné, že biotinylační činidlo bude na chitin63 • · · · vazebné doméně atakovat volné aminoskupiny, což jsou Nkoncová aminoskupina a aminoskupiny na lysinech 402 a 440.

V souladu s těmito předpoklady prokázala hmotnostní spektrometrie (MALDI) tři entity s molekulovými hmotnostmi odpovídajícími přítomnosti jedné, dvou nebo tří molekul biotinu na molekulu peptidu. Převážná část peptidů (více než 60%) byla biotinylována trojnásobně.

Rhodamin byl na N-konec chitin-vazebné domény připojen prostřednictvím vazby se sukcinimidem (Molecular Probes) .

Chitin-vazebné charakteristiky peptidů s navázaným biotinem nebo rhodaminem byly nerozlišitelné od charakteristik neznačeného peptidu. To naznačuje, že chitin-vazebná doména je bez ovlivnění chitin-vazebné aktivity schopna tolerovat některé chemické modifikace.

Je zřejmé, že odborníci mohou vymyslet spoustu modifika cí a obměn tohoto vynálezu. Vynález je tudíž limitován pouze připojenými patentovými nároky.

• · · · · · • · · ·

SEZNAM SEKVENCÍ <110> (vynálezce) Gray, Patrick W.

(vynálezce) Tjoelker, Larry W.

ICOS Corporation <120> Chitin-vazebné fragmenty chitinázy <130> 27866/35407 <140>

<141>

<150> 09/09198 <151> 1998-03-12 <160> 39 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1636 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (2) . . (1399) <220>

<221> mat_peptid <222> (65) . . (1399) <400> 1 c atg gtg cgg tet gtg gcc tgg gca ggt ttc atg gtc ctg ctg atg atc 49 Met Val Arg Ser Val Ala Trp Ala Gly Phe Met Val Leu Lsu Met Ilc

-20 -15 -10

cca Pro -5

tgg ggc tet

get gca Ala Ala

aaa ctg gtc tgc

tac Tyr

ttc acc Phe Thr

aac Asn

tgg Trp 10

gcc Ala

97

Trp Gly

Ser

Lys Leu Val

Cys 5

-1

1

cag

tac

aga

cag

959

gag

get

ege

ttc

ctg

ccc

aag

gac

ttg

gac

ccc

145

Gin

Tyr

Arg

Gin

Gly

Glu

Ala

Arg

Phe

Leu

Pro

Lys

Asp

Leu

Asp

Pro

15

20

25

age

ctt

tgc

acc

cac

ctc

atc

tac

gcc

ttc

get

ggc

atg

acc

aac

cac

193

Ser

Leu

Cys

Thr

His

Leu

Ile

Tyr

Ala

Phe

Ala

Gly

Met

Thr

Asn

His

30

35

40

cag

ctg

age

acc

act

gag

tgg

aat

gac

gag

act

ctc

tac

cag

gag

ttc

241

Gin

Leu

Ser

Thr

Thr

Glu

Trp

Asn

Asp

Glu

Thr

Leu

Tyr

Gin

Glu

Phe

45

50

55

·* ··*· ·· ·· * . · • · · ·· • · · · • · · · ·· ·· aat ggc ctg aag Asn Gly Leu Lys aag atg aat ccc aag ctg Lys Met Asn Pro Lys Leu aag acc ctg tta gcc atc Lys Thr Leu Leu Ala Ile

7S

289 gga ggc tgg aat ttc ggc act cag aag Gly Gly Trp Asn Phe Gly Thr Gin Lys ttc aca gat atg gta gcc acg Phe Thr Asp Met Val Ala Thr

90

337 gcc aac aac cgt cag acc Ala Asn Asn Arg Gin Thr ttt gtc aac tcg gcc atc agg Phe Val Asn Ser Ala Xle Arg

100 ttt ctg cgc Phe Leu Arg 105

385 aaa tac agc Lys Tyr Ser

110 ttt gac ggc ctt gac Phe Asp Gly Leu Asp

115 ctt gac tgg gag tac Leu Asp Trp Glu Tyr

120 cca gga agc Pro Gly Ser

433

cag ggg Gin Gly 125

agc 'Ser

cct Pro

gcc Ala

gta gac

aag gag

cgc ttc

aca acc ctg gta

cag Gin

481

Val

Asp 130

Lys

Glu

Arg

Phe

Thr 135

Thr Leu

Val

gac

ttg

gcc

aat

gcc

ttc

cag

cag

gaa

gcc

cag

acc

tea

ggg

aag

gaa

529

Asp

Leu

Ala

Asn

Ala

Phe

Gin

Gin

Glu

Ala

Gin

Thr

Ser

Gly

Lys

Glu

140-

145

150

155

cgc

ctt

ctt

ctg

agt

gca

gcg

gtt

cca

gct

ggg

cag

acc

tat

gtg

gat

577

Arg

Leu

Leu

Leu

Ser

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Gin

Thr

Tyr

Val

Asp

160

165

170

gct

gga

tac

gag

gtg

gac

aaa

atc

gcc

cag

aac

ctg

gat

ttt

gtc

aac

625

Ala

Gly

Tyr

Glu

Val

Asp

Lys

Ile

Ala

Gin

Asn

Leu

Asp

Phe

Val

Asn

175

180

185

ctt

atg

gcc

tac

gac

ttc

cat

ggc

tet

tgg

gag

aag

gtc

acg

gga

cat

673

Leu

Met

Ala

Tyr

Asp

Phe

His

Gly

Ser

Trp

Glu

Lys

Val

Thr

Gly

His

190

195

200

aac

agc

ccc

ctc

tac

aag

agg

caa

gaa

gag

agt

ggt

gca

gca

gcc

agc

721

Asn

Ser

Pro

Leu

Tyr

Lys

Arg

Gin

Glu

Glu

Ser

Gly

Ala

Ala

Ala

Ser

205

210

215

ctc

aac

gtg

gat

gct

gct

gtg

caa

cag

tgg

ctg

cag

aag

ggg

acc

cct

769

Leu

Asn

Val

Asp

Ala

Ala

Val

Gin

Gin

Trp

Leu

Gin

Lys

Gly

Thr

Pro

220

225

230

235

gcc

agc

aag

ctg

atc

ctt

ggc

atg

cct

acc

tac

gga

cgc

tcc

ttc

aca

817

Ala

Ser

Lys

Leu

Ile

Leu

Gly

Met

Pro

Thr

Tyr

Gly

Arg

Ser

Phe

Thr

240 245 250

ctg gcc

tcc Ser

tea Ser 255

tea gac acc Ser Asp Thr

aga gtg ggg gcc cca

gcc aca ggg tet

865

Leu

Ala

Arg Val 260

Gly Ala Pro

Ala

Thr Gly 265

Ser

ggc

act

cca

ggc

ccc

ttc

acc

aag

gaa

gga

ggg

atg

ctg

gcc

tac

tat

913

Gly

Thr

Pro

Gly

Pro

Phe

Thr

Lys

Glu

Gly

Gly

Met

Leu

Ala

Tyr

Tyr

270

275

280

··» ··'· gaa gtc Cgc tcc tgg aag ggg gcc acc aaa cag aga atc cag gat cag 961

Glu Val Cys Ser Trp Lys Gly Ala Thr Lys Gin Arg Ile Gin Asp Gin

285 290 295 aag gtg ccc tac atc ttc cgg gac aac cag tgg gtg ggc ttt gat gat 1009

Lys Val Pro Tyr Ile Phe Arg Asp Asn Gin Trp Val Gly Phe Asp Asp

300 305 310 315 gtg gag agc ttc aaa acc aag gtc agc tat ctg aag cag aag gga ctg 1057

Val Glu Ser Phe Lys Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gin Lys Gly Leu

320 325 330 ggc ggg gcc atg gtc tgg gca ctg gac tta gat gac ttt gcc ggc ttc 1105

Gly Gly Ala Met Val Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe

335 340 345 tcc tgc.aac cag ggc ega tac ccc ctc atc cag acg cta cgg cag gaa 1153

Ser Cys Asn Gin Gly Arg Tyr Pro Leu Ile Gin Thr Leu Arg Gin Glu

350 355 360 ctg agt ctt cca tac ttg cct tea ggc acc cca gag ctt gaa gtt cca 1201

Leu Ser Leu Pro Tyr Leu Pro Ser Gly Thr Pro Glu Leu Glu Val Pro

365 370 375 aaa cca ggt cag ccc tet gaa cct gag cat ggc ccc agc cct gga caa 1249

Lys Pro Gly Gin Pro Ser Glu Pro Glu His Gly Pro Ser Pro Gly Gin

330 305 350 395 gac acg ttc tgc cag ggc aaa get gat ggg ctc tat ccc aat cct cgg 1297

Asp Thr Phe Cys Gin Gly Lys Ala Asp Gly Leu Tyr Pro Asn Pro Arg

400 405 410 gaa cgg tcc agc ttc tac agc tgt gca gcg ggg cgg ctg ttc cag caa 1345

Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Cys Ala Ala Gly Arg Leu Phe Gin Gin

415 420 425 agc tgc ccg aca ggc ctg gtg ttc agc aac tcc tgc aaa tgc tgc acc 1393

Ser Cys Pro Thr Gly Leu Val Phe Ser Asn Ser Cys Lys Cys Cys Thr

430 435 440 tgg aat tgagtcgcta aagcccctcc agtcccagct ttgaggctgg gcccaggatc 1449 Trp Asn

445 actctacagc ctgcctcctg ggttttccct gggggccgca atctggctcc tgcaggcctt 1509 tctgtggtct tcctttatcc aggctttctg ctctcagcct tgccttcctt ttttctgggt 1569 ctcctgggct gcccctttca cttgcaaaat aaatctttgg tttgtgcccc tcttcccaaa 1629 aaaaaaa 1636 • · · · > · · , · · ·· • · · ' • · · • · · ·

<210>	2
<211>	466
<212>	PRT
<213>	Homo
<400>	2

sapiens

Met

Val -20

Arg

Ser

Val

Ala

Trp -15

Ala

Gly

Phe

Met

Val -10

Leu

Leu

Met

Ile

Pro -5

Trp

Gly

Ser

Ala -1

Ala 1

Lys

Leu

Val

Cys 5

Tyr

Phe

Thr

Asn

Trp 10

Ala

Gin

Tyr

Arg

Gin 15

Gly

Glu

Ala

Arg

Phe 20

Leu

Pro

Lys

Asp

Leu 25

Asp

Pro

Ser

Leu

Cys 30

Thr

His

Leu

Ile

Tyr 35

Ala

Phe

Ala

Gly

Met 40

Thr

Asn

His

Gin

Leu 45

Ser

Thr

Thr

Glu

Trp 50

Asn

Asp

Glu

Thr

Leu 55

Tyr

Gin

Glu

Phe

Asn 60

Gly

Leu

Lys

Lys

Met 65

Asn

Pro

Lys

Leu

Lys 70

Thr

Leu

Leu

Ala

Ile 75

Gly

Gly

Trp

Asn

Phe 80

Gly

Thr

Gin

Lys

Piie 85

Thr

Asp

Met

Val

>tlu 90

Thr

Ala

Asn

Asn

Arg 95

Gin

Thr

Phe

Val

Asn 100

Ser

Ala

Ile

Arg

Phe 105

Leu

Arg

Lys

Tyr

Ser 110

Phe

Asp

Gly

Leu

Asp 115

Leu

Asp

Trp

Glu

Tyr 120

Pro

Gly

Ser

Gin

Gly

Ser

Pro

Ala

Val

Asp

Lys

Glu

Arg

Phe

Thr

Thr

Leu

Val

G1 n

125 130 135

Asp Leu Ala Asn Ala Phe Gin Gin Glu Ala Gin Thr Ser Gly Lys Glu

140 145 150 155

Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ala Val Pro Ala Gly Gin Thr Tyr Val Asp

ISO 1S5 170

Ala Gly Tyr Glu Val Asp Lys Ile Ala Gin Asn Leu Asp Phe Val Asn 175 180 185

Leu Met Ala Tyr Asp Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His 190 195 200

Asn Ser Pro Leu Tyr Lys Arg Gin Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser 205 210 215

Leu Asn Val Asp Ala Ala Val Gin Gin Trp Leu Gin Lys Gly Thr Pro

220 225 230 235

Ala Ser Lys Leu Ile Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr

240 245 250

Leu Ala

Ser

Ser Ser 255

Asp

Thr Arg Val Gly Ala Pro Ala Thr

Gly

Ser

260

265

Gly

Thr

Pro

Gly

Pro

Phe

Thr

Lys

Glu

Gly

Gly

Met

Leu

Ala

Tyr

Tyr

270

275

280

Glu

Val

Cys

Ser

Trp

Lys

Gly

Ala

Thr

Lys

Gin

Arg

Ile

Gin

Asp

Gin

285

290

295

Lys

Val

Pro

Tyr

Ile

Phe

Arg

Asp

Asn

Gin

Trp

Val

Gly

Phe

Asp

Asp

300

305

310

315

Val

Glu

Ser

Phe

Lys

Thr

Lys

Val

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gin

Lys

Gly

Leu

320

325

330

Gly

Gly

Ala

Met

Val

Trp

Ala

Leu

Asp

Leu

Asp

Asp

Phe

Ala

Gly

Phe

335

340

345

Ser

Cys

Asn

Gin

Gly

Arg

Tyr

Pro

Leu

Ile

Gin

Thr

Leu

Arg

Gin

Glu

350

355

360

Leu

Ser

Leu

Pro

Tyr

Leu

Pro

Ser

Gly

Thr

Pro

Glu

Leu

Glu

Val

Pro

365

370

375

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Ser

Glu

Pro

Glu

His

Gly

Pro

Ser

Pro

Gly

Gin

380

385

390

395

Asp

Thr

Phe

Cys

Gin

Gly

Lys

Ala

Asp

Gly

Leu

Tyr

Pro

Asn

Pro

Arg

400

405

410

Glu

Arg

Ser

Ser

Phe

Tyr

Ser

Cys

Ala

Ala

Gly

Arg

Leu

Phe

Gin

Gin

415

420

425

Ser

Cys

Pro

Thr

Gly

Leu

Val

Phe

Ser

Asn

Ser

Cys

Lys

Cys

Cys

Thr

430 435 440

Trp Asn 445 <210> 3 <211> 1656 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (27) .. (1424) <220>

<221> mat_peptid <222> (90) . . (1424) <400> 3 gctgcagcct gccgctgagc tgcatc atg gtg cgg tet gtg gcc tgg gca ggt ·

< · · «

Ala Trp Ala Gly • · i

• ·

9

Met Val Arg Ser Val -20

ttc atg gtc ctg

ctg atg

atc Ile

cca Pro -5

tgg ggc Trp Gly

tet Ser

get gca Ala Ala

aaa Lys

ctg Leu

gtc Val

101

Phe

Met

Val -10

Leu

Leu

Met

-1

1

tgc

tac

ttc

acc

aac

tgg

gcc

cag

tac

aga

cag

ggg

gag

get

ege

ttc

14 9

Cys

Tyr

Phe

Thr

Asn

Trp

Ala

Gin

Tyr

Arg

Gin

Gly

Glu

Ala

Arg

Phe

5

10

15

20

ctg Leu

ccc aag Pro Lys

gac Asp

ttg gac ccc Leu Asp Pro 25

age Ser

ctt Leu

tgc Cys 30

acc Thr

cac His

ctc Leu

atc Ile

tac gcc Tyr Ala 35

197

ttc

get

ggc

atg

acc

aac

cac

cag

ctg

age

acc

act

gag

tgg

aat

gac

245

Phe

Ala

Gly

Met

Thr

Asn

His

Gin

Leu

Ser

Thr

Thr

Glu

Trp

Asn

Asp

40

45

50

gag

act

ctc

tac

cag

gag

ttc

aat

ggc

ctg

aag

aag

atg

aat

ccc

aag

293

Glu

Thr

Leu

Tyr

Gin

Glu

Phe

Asn

Gly

Leu

Lys

Lys

Met

Asn

Pro

Lys

55

60

65

ctg

aag

acc

ctg

tta

gcc

atc

gga

ggc

tgg

aat

ttc

age

act

cag

aag

341

Leu

Lys

Thr

Leu

Leu

Ala

Ile

Gly

Gly

Trp

Asn

Phe

Ser

Thr

Gin

Lys

70

75

80

ttc

aca

gat

atg

gta

gcc

acg

gcc

aac

aac

cgt

cag

acc

ttt

gtc

aac

389

Phe

Thr

Asp

Met

Val

Ala

Thr

Ala

Asn

Asn

Arg

Gin

Thr

Phe

Val

Asn

85

90

95

100

tcg

gcc

atc

agg

ttt

ctg

ege

aaa

tac

age

ttt

gac

ggc

ctt

gac

ctt

437

Ser

Ala

Xle

Arg

Phe

Leu

Arg

Lys

Tyr

Ser

Phe

Asp

Gly

Leu

Asp

Leu

105

110

115

gac

tgg

gag

tac

cca

gga

age

cag

ggg

age

cct

gcc

gta

gac

aag

gag

485

Asp

Trp

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ser

Gin

Gly

Ser

Pro

Ala

Val

Asp

Lys

Glu

120

125

130

ege

ttc

aca

acc

ctg

gta

cag

gac

ttg

gcc

aat

gcc

ttc

cag

cag

gaa

533

Arg

Phe

Thr

Thr

Leu

Val

Gin

Asp

Leu

Ala

Asn

Ala

Phe

Gin

Gin

Glu

135

140

145

gcc

cag

acc

tea

ggg

aag

gaa

ege

ctt

ctt

ctg

agt

gca

gcg

gtt

cca

581

Ala

Gin

Thr

Ser

Gly

Lys

Glu

Arg

Leu

Leu

Leu

Ser

Ala

Ala

Val

Pro

150

155

160

get

ggg

cag

acc

tat

gtg

gat

get

gga

tac

gag

gtg

gac

aaa

atc

gcc

629

Ala

Gly

Gin

Thr

Tyr

Val

Asp

Ala

Gly

Tyr

Glu

Val

Asp

Lys

Ile

Ala

165

170

175

180

cag

aac

ctg

gat

ttt

gtc

aac

ctt

atg

gcc

tac

gac

ttc

cat

ggc

tet

677

Gin

Asn

Leu

Asp

Phe

Val

Asn

Leu

Met

Ala

Tyr

Asp

Phe

His

Gly

Ser

185

190

195

• « • · · ·

I · · ► · · · « · ♦ ·

tgg gag Trp Glu

aag Lys

gtc Val 200

acg Thr

gga Gly

cat His

aac Asn

agc Ser 205

ccc Pro

ctc Leu

tac aag Tyr Lys

agg Arg 210

caa gaa Gin Glu

725

gag

agt

ggt

gca

gca

gcc

agc

ctc

aac

gtg

gat

get

get

gtg

caa

cag

773

Glu

Ser

Gly

Ala

Ala

Ala

Ser

Leu

Asn

Val

Asp

Ala

Ala

Val

Gin

Gin

215

220

225

tgg

ctg

cag

aag

ggg

acc

cct

gcc

agc

aag

ctg

atc

ctt

ggc

atg

cct

821

Trp

Leu

Gin

Lys

Gly

Thr

Pro

Ala

Ser

Lys

Leu

lle

Leu

Gly

Met

Pro

230

235

240

acc

tac

gga

cgc

tcc

ttc

aca

ctg

gcc

tcc

tea

tea

gac

acc

aga

gtg

869

Thr

Tyr

Gly

Arg

Ser

Phe

Thr

Leu

Ala

Ser

Ser

Ser

Asp

Thr

Arg

Val

245

250

255

260

ggg

gcc

cca

gcc

aca

ggg

tet

ggc

act

cca

ggc

ccc

ttc

acc

aag

gaa

917

Gly

Ala

Pro

Ala

Thr

Gly

Ser

Gly

Thr

Pro

Gly

Pro

Phe

Thr

Lys

Glu

26 5

270

275

gga

ggg

a tg

ctg

gcc

tac

tat

gaa

gtc

tgc

tcc

tgg

aag

ggg

gcc

acc

965

Gly

Gly

Met

Leu

Ala

Tyr

Tyr

Glu

Val

Cys

Ser

Trp

Lys

Gly

Ala

Thr

280 285 290

aaa Lys

cag aga

atc lle

cag Gin

gat Asp

cag aag

gtg Val

ccc Pro

tac atc

ttc Phe 305

cgg Arg

gac aac Asp Asn

1013

Gin

Arg 295

Gin

Lys 300

Tyr

lle

cag

tgg

gtg

ggc

ttt

gat

gat

gtg

gag

agc

ttc

aaa

acc

aag

gtc agc

1061

Gin

Trp

Val

Gly

Phe

Asp

Asp

Val

Glu

Ser

Phe

Lys

Thr

Lys

Val Ser

310

315

320

tat

ctg

aag

cag

aag

gga

ctg

ggc

ggg

gcc

atg

gtc

tgg

gca

ctg gac

1109

Tyr

Leu

Lys

Gin

Lys

Gly

Leu

Gly

Gly

Ala

Met

Val

Trp

Ala

Leu Asp

325

330

335

340

tta

gat

gac

ttt

gcc

ggc

ttc

tcc

tgc

aac

cag

ggc

ega

tac

ccc ctc

1157

Leu

Asp

Asp

Phe

Ala

Gly

Phe

Ser

Cys

Asn

Gin

Gly

Arg

Tyr

Pro Leu

345

350

355

atc

cag

acg

cta

cgg

cag

gaa

ctg

agt

ctt

cca

tac

ttg

cct

tea ggc

1205

lle

Gin

Thr

Leu

Arg

Gin

Glu

Leu

Ser

Leu

Pro

Tyr

Leu

Pro

Ser Gly

360

365

370

acc

cca

gag

ctt

gaa

gtt

cca

aaa

cca

ggt

cag

ccc

tet

gaa

cct gag

1253

Thr

Pro

Glu

Leu

Glu

Val

Pro

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Ser

Glu

Pro Glu

375

380

385

cat

ggc

ccc

agc

cct

gga

caa

gac

acg

ttc

tgc

cag

ggc

aaa

get gat

1301

His

Gly

Pro

Ser

Pro

Gly

Gin

Asp

Thr

Phe

Cys

Gin

Gly

Lys

Ala Asp

390

395

400

ggg

ctc

tat

ccc

aat

cct

cgg

gaa

cgg

tcc

agc

ttc

tac

agc

tgt gca

1349

Gly

Leu

Tyr

Pro

Asn

Pro

Arg

Glu

Arg

Ser

Ser

Phe

Tyr

Ser

Cys Ala

405

410

415

420

• ·

• ·

« · φ ·

• · · · •

• · « ·

• • ·

• · · <t · · i · · 1 · ’ • ·

• · • · • • ·

• · * · • · • ·

• • 9 · • 9

9 9 9 9 · • · • ·

• • « • · ·

gcg

ggg

cgg

ccg

ttc

cag

caa

agc

tgc

ccg

aca ggc

ctg

gtg

ttc

agc

1397

Ala

Gly

Arg

Leu

Phe

Gin

Gin

Ser

Cys

Pro

Thr Gly

Leu

Val

Phe

Ser

425

430

435

aac

tcc

tgc

aaa

tgc

tgc

acc

tgg

aat

tgagtcgcta

aagcccctcc

1444

Asn

Ser

Cys

Lys

Cys

Cys

Thr

Trp

Asn

440

445

agtcccagct tcgaggctgg gcccaggatc actctacagc ctgcctcctg ggttttccct 1504 gggggccgca atctggctcc tgcaggcctt tctgtggtct tcctttatcc aggctttctg 1564 ctctcagcct tgccttcctt ttttctgggt ctcctgggct gcccctttca cttgcaaaat 1624 aaatctttgg tttgtgcccc tcaaaaaaaa aa 1656

<210>	4
<211>	466
<212>	PRT
<213>	Homo
<400>	4

Met

Val -20

Arg Ser

Val

Ala

Trp -15

Ala Gly Phe Met

Val -10

Leu

Leu

Met

Ile

Pro

Trp

Gly

Ser

Ala

Ala

Lys

Leu

Val

Cys

Tyr

Phe

Thr

Asn

Trp

Ala

-5

-1

1

5

10

Gin

Tyr

Arg

Gin

Gly

Glu

Ala

Arg

Phe

Leu

Pro

Lys

Asp

Leu

Asp

Pro

15

20

25

Ser

Leu

Cys

Thr

His

Leu

Ile

Tyr

Ala

Phe

Ala

Gly

Met

Thr

Asn

His

30

35

40

Gin

Leu

Ser

Thr

Thr

Glu

Trp

Asn

Asp

Glu

Thr

Leu

Tyr

Gin

Glu

Phe

45

50

55

Asn

Gly

Leu

Lys

Lys

Met

Asn

Pro

Lys

Leu

Lys

Thr

Leu

Leu

Ala

Ile

60

65

70

75

Gly

Gly

Trp

Asn

Phe

Ser

Thr

Gin

Lys

Phe

Thr

Asp

Met

Val

Ala

Thr

80

85

90

Ala

Asn

Asn

Arg

Gin

Thr

Phe

Val

Asn

Ser

Ala

Ile

Arg

Phe

Leu

Arg

95

100

105

Lys

Tyr

Ser

Phe

Asp

Gly

Leu

Asp

Leu

Asp

Trp

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ser

110

115

120

Gin

Gly

Ser

Pro

Ala

Val

Asp

Lys

Glu

Arg

Phe

Thr

Thr

Leu

Val

Gin

125

130

135

Asp

Leu

Ala

Asn

Ala

Phe

Gin

Gin

Glu

Ala

Gin

Thr

Ser

Gly

Lys

Glu

140

145

150

155

• · · ·

Arg

Leu Leu

Leu

Ser Ala Ala Val 160

Pro Ala Gly Gin Thr Tyr Val Asp

165

170

Ala

Gly

Tyr

Glu

Val

Asp

Lys

Ile

Ala

Gin

Asn

Leu

Asp

Phe

Val

Asn

175

180

185

Leu

Met

Ala

Tyr

Asp

Phe

His

Gly

Ser

Trp

Glu

Lys

Val

Thr

Gly

His

190

195

200

Asn

Ser

Pro

Leu

Tyr

Lys

Arg

Gin

Glu

Glu

Ser

Gly

Ala

Ala

Ala

Ser

205

210

215

Leu

Asn

Val

Asp

Ala

Ala

Val

Gin

Gin

Trp

Leu

Gin

Lys

Gly

Thr

Pro

220

225

230

235

Ala

Ser

Lys

Leu

Ile

Leu

Gly

Met

Pro

Thr

Tyr

Gly

Arg

Ser

Phe

Thr

240

245

250

Leu

Ala

Ser

Ser

Ser

Asp

Thr

Arg

Val

Gly

Ala

Pro

Ala

Thr

Gly

Ser

255

260

265

Gly

Thr

Pro

Gly

Pro

Phe

Thr

Lys

Glu

Gly

Gly

Met

Leu

Ala

Tyr

Tyr

270

275

280

Glu

Val

Cys

Ser

Trp

Lys

Gly

Ala

Thr

Lys

Gin

Arg

Ile

Gin

Asp

Gin

285

290

295

Lys

Val

Pro

Tyr

Ile

Phe

Arg

Asp

Asn

Gin

Trp

Val

Gly

Phe

Asp

Asp

300

305

310

315

Val

Glu

Ser

Phe

Lys

Thr

Lys

Val

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gin

Lys

Gly

Leu

320

325

330

Gly

Gly

Ala

Met

Val

Trp

Ala

Leu

Asp

Leu

Asp

Asp

Phe

Ala

Gly

Phe

335

340

345

Ser Cys Asn Gin Gly Arg Tyr Fro Leu Ile Gin Thr Leu Arg Gin Glu 350 355 360

Leu Ser Leu Pro Tyr Leu Pro Ser Gly Thr Pro Glu Leu Glu Val Pro 365 370 375

Lys Pro Gly Gin Pro Ser Glu Pro Glu His Gly Pro Ser Pro Gly Gin

380 385 390 395

Asp Thr Phe Cys Gin Gly Lys Ala Asp Gly Leu Tyr Pro Asn Pro Arg

400 405 410

Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Cys Ala Ala Gly Arg Leu Phe Gin Gin 415 420 425

Ser Cys Pro Thr Gly Leu Val Phe Ser Asn Ser Cys Lys Cys Cys Thr 430 435 440 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 5 gacactatag.aatagggc <210> 6 <211> 51 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 6 tgsigatcatc agcaggacca tgaaacctgc ccaggccaca gaccgcacca t <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 7 tacatctaga attatggcaa aactggtctg ctacttcacc

<210>	8
<211>	34
<212>	DNA
<213>	Uměle	připravená sekvence
<220>
<223>	Popis	uměle připravené sekvence:
<400>	8

agatctaacc ttaggtgcct gaagacaagt atgg <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 9 tacagaattc ttattcacat ccggccctg <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 10 tacatctaga ctccatccag aaaaacaggt atgg <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 11 tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223 > Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 12 cgcaagcttg agagctccgt tccgccacat ggtgcggtct gtggcctggg

<210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 13 gactctagac taggtgcctg aaggcaagta tg • · · · β · » « · · · · • · · · • · · ¹ • · ·· <210> 14 <211> 373 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Ala

Lys

Leu

Val

Cys

Tyr

Phe

Thr

Asn

Trp

Ala

Gin

Tyr

Arg

Gin

Gly

1

5

10

15

Glu

Ala

Arg

Phe

Leu

Pro

Lys

Asp

Leu

Asp

Pro

Ser

Leu

Cys

Thr

His

20

25

30

Leu

Ile

Tyr

Ala

Phe

Ala

Gly

Met

Thr

Asn

His

Gin

Leu

Ser

Thr

Thr

35

40

45

Glu

Trp

Asn

Asp

Glu

Thr

Leu

Tyr

Gin

Glu

Phe

Asn

Gly

Leu

Lys

Lys

50'

55

60

Met

Asn

Pro

Lys

Leu

Lys

Thr

Leu

Leu

Ala

Ile

Gly

Gly

Trp

Asn

Phe

65

70

75

80

Gly

Thr

Gin

Lys

Phe

Thr

Asp

Met

Val

Ala

Thr

Ala

Asn

Asn

Arg

Gin

85

90

95

Thr

Phe

Val

Asn

Ser

Ala

Ile

Arg

Phe

Leu

Arg

Lys

Tyr

Ser

Phe

Asp

100

105

110

Gly

Leu

Asp

Leu

Asp

Trp

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ser

Gin

Gly

Ser

Pro

Ala

115

120

125

Val

Asp

Lys

Glu

Arg

Phe

Thr

Thr

Leu

Val

Gin

Asp

Leu

Ala

Asn

Ala

130

135

140

Phe

Gin

Gin

Glu

Ala

Gin

Thr

Ser

Gly

Lys

Glu

Arg

Leu

Leu

Leu

Ser

145

150

155

160

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Gin

Thr

Tyr

Val

Asp

Ala

Gly

Tyr

Glu

Val

165

170

175

Asp

Lys

Ile

Ala

Gin

Asn

Leu

Asp

Phe

Val

Asn

Leu

Met

Ala

Tyr

Asp

180

185

190

Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His Asn Ser Pro Leu Tyr 195 200 205

Lys Arg Gin Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser Leu Asn Val Asp Ala 210 215 220

Ala Val Gin Gin Trp Leu Gin Lys Gly Thr Pro Ala Ser Lys Leu Ile 225 230 235 240

Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Ser 245 250 255

Asp Thr

Arg Val 260

Gly

Ala

Pro

Ala Thr Gly Ser 265

Gly

Thr

Pro 270

Gly

Pro

Phe

Thr

Lys

Glu

Gly

Gly

Met

Leu

Ala

Tyr

Tyr

Glu

Val

Cys

Ser

Trp

275

280

285

Lys

Gly

Ala

Thr

Lys

Gin

Arg

lle

Gin

Asp

Gin

Lys

Val

Pro

Tyr

lle

290

295

300

Phe

Arg

Asp

Asn

Gin

Trp

Val

Gly

Phe

Asp

Asp

Val

Glu

Ser

Phe

Lys

305

310

315

320

Thr

Lys

Val

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gin

Lys

Gly

Leu

Gly

Gly

Ala

Met

Val

325

330

335

Trp

Ala

Leu

Asp

Leu

Asp

Asp

Phe

Ala

Gly

Phe

Ser

Cys

Asn

Gin

Gly

340

345

350

Arg

Tyr

Pro

Leu

lle

Gin

Thr

Leu

Arg

Gin

Glu

Leu

Ser

Leu

Pro

Tyr

355

360

365

Leu

Pro

Ser

Gly

Thr

	370
<210>	15
<211>	373
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	15

Ala 1

Lys

Leu

Val

Cys 5

Tyr Phe Thr Asn Trp Ala Gin Tyr Arg Gin Gly

10

15

Glu

Ala

Arg

Phe

Leu

Pro

Lys

Asp

Leu

Asp

Pro

Ser

Leu

Cys

Thr

His

20

25

30

Leu

lle

Tyr

Ala

Phe

Ala

Gly

Met

Thr

Asn

His

Gin

Leu

Ser

Thr

Thr

35

40

45

Glu

Trp

Asn

Asp

Glu

Thr

Leu

Tyr

Gin

Glu

Phe

Asn

Gly

Leu

Lys

Lys

50

55

60

Met

Asn

Pro

Lys

Leu

Lys

Thr

Leu

Leu

Ala

lle

Gly

Gly

Trp

Asn

Phe

65

70

75

80

Gly

Thr

Gin

Lys

Phe

Thr

Asp

Met

Val

Ala

Thr

Ala

Asn

Asn

Arg

Gin

85

90

95

Thr

Phe

Val

Asn

Ser

Ala

lle

Arg

Phe

Leu

Arg

Lys

Tyr

Ser

Phe

Asp

100

105

110

Gly

Leu

Asp

Leu

Asp

Trp

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ser

Gin

Gly

Ser

Pro

Ala

115 120 125

• * « « • * · • · · · · • » · · · 9 · · · 9 · · ·

• 9 • 9 • · » · « · • 9

• 9 · · « • • 9 9 *

9 · • • • 9 • • ·

• • · · • · • 9 • · 9 ·

Val

Asp

Lys

Glu

Arg

Phe

Thr

Thr

Leu

Val

Gin

Asp

Leu

Ala

Asn

Ala

130

135

140

Phe

Gin

Gin

Glu

Ala

Gin

Thr

Ser

Gly

Lys

Glu

Arg

Leu

Leu

Leu

Ser

145

150

155

160

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Gin

Thr

Tyr

Val

Asp

Ala

Gly

Tyr

Glu

Val

165

170

175

Asp

Lys

Ile

Ala

Gin

Asn

Leu

Asp

Phe

Val

Asn

Leu

Met

Ala

Tyr

Asp

180

185

190

Phe

His

Gly

Ser

Trp

Glu

Lys

Val

Thr

Gly

His

Asn

Ser

Pro

Leu

Tyr

195

200

205

Lys

Arg

Gin

Glu

Glu

Ser

Gly

Ala

Ala

Ala

Ser

Leu

Asn

Val

Asp

Ala

210

215

220

Ala

Val

Gin

Gin

Trp

Leu

Gin

Lys

Gly

Thr

Pro

Ala

Ser

Lys

Leu

Ile

225

230

235

240

Leu

Gly

Met

Pro

Thr

Tyr

Gly

Arg

Ser

Phe

Thr

Leu

Ala

Ser

Ser

Ser

245

250

255

Asp

Thr

Arg

Val

Gly

Ala

Pro

Ala

Thr

Gly

Ser

Gly

Thr

Pro

Gly

Pro

260

265

270

Phe

Thr

Lys

Glu

Gly

Gly

Met

Leu

Ala

Tyr

Tyr

Glu

Val

Cys

Ser

Trp

275

280

285

Lys

Gly

Ala

Thr

Lys

Gin

Arg

Ile

Gin

Asp

Gin

Lys

Val

Pro

Tyr

Ile

290

295

300

Phe

Arg

Asp

Asn

Gin

Trp

Val

Gly

Phe

Asp

Asp

Val

Glu

Ser

Phe

Lys

305

310

315

320

Thr

Lys

Val

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gin

Lys

Gly

Leu

Gly

Gly

Ala

Met

Val

325

330

335

Trp

Ala

Leu

Asp

Leu

Asp

Asp

Phe

Ala

Gly

Phe

Ser

Cys

Asn

Gin

Gly

340

345

350

Arg

Tyr

Pro

Leu

Ile

Gin

Thr

Leu

Arg

Gin

Glu

Leu

Ser

Leu

Pro

Tyr

355 360 365

Leu Ser Ser Gly Thr 370

» ·

Λ · * • · · ·» • · · • · * ·· ·· <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 16 tgatacggta ccgccccatg gctgacta 28 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 17 gcaagtttgg cgcgaaatcg <210> 18 <211> 66 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 18 gcttaagctt gctgcagcct gccgctgagc tgcatcatgc tactactact gctgctgctg 60 ggcctg ⁶⁶ <210> 19 <211> 115 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 19 aacagggccc ttaattaatt aggtacctgc gcggccgcag catcgattgc tctagaagcg 60 atatcagcga attctgtctg ctcgaagcgg ccggccgccc cgactcgaga gtaac 11 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence • · • · · · • · · • · · · · • · · • · • · · v · • · ·· <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 20 tatagaattc ttctcctgca accagggccg atac 34 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 21 tatagaattc ccagagcttg aagttccaaa accag

<210>	22
<211>	35
<212>	DNA
<213>	Uměle	připravená sekvence
<220>
<223>	Popis	uměle připravené sekvence
<400>	22

tatagaattc agccctggac aagacacgtt ctgcc <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 23 agaggaattc cagggcaaag ctgatgggct ctatc <210> 24 <211> 37 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence

·. ·· > · · , . · · · · · ' • · · ¹ <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 24 acaggaattc aatcctcggg aacggtccag cttctac <210> 25 <211> 37 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 25 cacatctaga ttatgtcggg cagctttgct ggaacag

<210>	26
<211>	36
<212>	DNA
<213>	Uměle
<220>
<223>	Popis
<400>	26
agagtctaga

<210> 27 <211> 35 <212> DNA <213> Uměle <220> <223> Popis
<400>	27
agaggaattc
<210>	28
<211>	97

připravená sekvence uměle připravené sekvence: primer tcaattccag gtgcagcatt tgcagg připravená sekvence uměle připravené sekvence: primer agccctggac aagacacgtt cagcc <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence • · • ·

··«·

<220?

<223? Popis uměle připravené sekvence: primer <400? 28 agaggaattc agccctggac aagacacgtt ctgccagggc aaagctgatg ggctctatcc 60 caatcctcgg gaacggtcca gcttctacag cagtgca 97 <210? 29 <211? 67 <212> DNA <213? Uměle připravená sekvence <220?

<223? Popis uměle připravené sekvence: primer <400? 29 tgcttctaga ttaattccag gtgcagcatt tgcaggagtt gctgaacacc aggcctgtcg 60 ggctgct <210? 30 <211? 36 <212? DNA <213? Uměle připravená sekvence <220?

<223? Popis uměle připravené sekvence: primer <400? 30 tgcttctaga ttaattccag gtgcagcatt tgctgg 36 <210? 31 <211? 36 <212? DNA <213? Uměle připravená sekvence <220?

<223? Popis uměle připravené sekvence: primer <400? 31 tgcttctaga ttaattccag gtgcagcttt tgcagg <210? 32 <211? 36 <212? DNA <213? Uměle připravená sekvence <220?

<223? Popis uměle připravené sekvence: primer

• · • · <400> 32 tgcttctaga ttaattccag gtgctgcatt tgcagg <210> 33 <211> 72 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 33 ctctggtacc tttggataaa agagactaca aggacgacga tgacaagagc cctggacaag 60 acacgttctg cc 72 <210> 34 <211> 77 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 34 ata.tgcggcc gcgacttatc cactactatg atgatgatga tgatgtcctg ctccattcca 60 ggtgcagcat ttgcagg 77 <210> 35 <211> 37 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 35 ctctgaattc caagacacgt tctgccaggg caaagct <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer • · • · • · · • · · · · . · · · • » · · .· ·· <400> 36 atatgaattc acgttctgcc agggcaaagc tgatg <210> 37 <211> 41 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 37 aacatctaga ttaggtgcag catttgcagg agttgctgaa c <210> 38 <211> 48 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 38 aagaggtacc tttggataaa agaagccctg gacaagacac gttctgcc <210> 39 „ <211> 41 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: primer <400> 39 gagagcggcc gcgacttaat tccaggtgca gcatttgcag g

Claims (24)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polypeptid s chitin-vazebnou aktivitou, ale postrádající chitinázovou aktivitu vyznačující se tím, že tento polypeptid zahrnuje chitin-vazebný fragment 54 Ckoncových aminokyselin lidské chitinázy jak je popsána v SEK. ID. Č.: 2.
2. 2. Polypeptid podle nároku lvyznačující se tím, že tento polypeptid je vybrán ze skupiny zahrnující polypeptid o aminokyselinové sekvenci odpovídající v SEK. ID. Č.: 2 aminokyselinovým zbytkům 347 až 445, polypeptid o aminokyselinové sekvenci odpovídající v SEK. ID. Č.: 2 aminokyselinovým zbytkům 374 až 445, polypeptid o. aminokyselinové sekvenci odpovídající v SEK. ID. Č.: 2 aminokyselinovým zbytkům 392 až 445, polypeptid o aminokyselinové sekvenci odpovídající v SEK. ID. Č.: 2 aminokyselinovým zbytkům 395 až 445 a polypeptid.o aminokyselinové sekvenci odpovídající v SEK. ID. Č.: 2 aminokyselinovým zbytkům 397 až 445.
3. 3. Polypeptid vyznačující se tím, že tento polypeptid je vybrán ze skupiny zahrnující polypeptidy se sekvencí aminokyselin odpovídající v SEK. ID. Č.: 2 aminokyselinovým zbytkům X až Y, kde X zahrnuje všechna celá čísla v intervalu 347 až 397 a Y je 445.
4. 4. Polypeptid s chitin-vazebnou aktivitou, ale postrádající chitinázovou aktivitu vyznačující se tím, že tento polypeptid zahrnuje nějaký polypeptid podle nároku 3.
5. 5. Fúzní protein vyznačující se tím, že tento protein zahrnuje polypeptid podle nároku 1 připojený k nějakému heterolognímu polypeptidů.
6. 6. Fúzní protein podle nároku 5vyznačuj ící se tím, že zmíněným heterolognim polypeptidem je nějaký enzym.
7. 7. Přípravek vyznačující se tím, že tento přípravek zahrnuje polypeptid podle nároku 1 a fyziologicky přijatelné rozpouštědlo.
8. 8. Přípravek podle nároku 7vyznačující se tím, že tento přípravek dále zahrnuje antifungální látku non-chitinázové povahy.
9. 9. Přípravek vyznačující se tím, že tento přípravek zahrnuje polypeptid podle nároků 1 nebo 4 konjugovaný s nějakou antifungální látkou.
10. 10. Způsob léčby infekcí patogenními houbami (mykóz) vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje podání přípravku podle nějakého v nároků 7 nebo 8 subjektu postiženému nějakou infekcí patogenními houbami.
11. 11. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že tento způsob dále zahrnuje aplikaci antifungální látku non-chitinázové povahy zmíněnému subjektu.

    ·· ··

    I · · » · · ·· ι · · · · • · · · ·« · ·
12. 12. Přípravek vyznačující se tím, že tento přípravek zahrnuje polypeptid podle nároků 1 nebo 4 konjugovaný s nějakou detekovatelnou značkou.
13. 13. Přípravek podle nároku 12 vyznačující se tím, že zmíněná detekovatelná značka je vybrána ze skupiny zahrnující radioizotopy, fluorofory, barvy, elektron-denzní sloučeniny a enzymy.
14. 14. Způsob pro stanovení přítomnosti chitinu ve vzorcích vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje:

    (a) kontakt sledovaného vzorku s přípravkem podle nároku 12 a (b) kvantifikaci značeného polypeptidů navázaného na chitin.
15. 15. Souprava pro stanovení přítomnosti chitinu ve vzorcích vyznačující se tím, že tato souprava zahrnuje přípravek podle nároku 12.
16. 16. Purifikovaný izolovaný polynukleotid kódující polypeptid podle nároku 1.
17. 17. Polynukleotid podle nároku 16 vyznačuj ící se tím, že tímto polynukleotidem je DNA.
18. 18. Nějaký vektor vyznačující se tím, že tento vektor zahrnuje DNA podle nároku 17.
19. 19. Hostitelská buňka stabilpě transformovaná nebo transfekovaná DNA podle nároku 17 vyznačující se tím, že tato ·« ··♦· hostitelská buňka exprimuje polypeptid kódovaný zmíněnou DNA.
20. 20. Způsob produkce polypeptidu zahrnujícího fragment lidské chitinázy vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje kultivaci hostitelských buněk podle nároku 19 v živném médiu a izolaci zmíněného polypeptidu z těchto hostitelských buněk nebo živného média.
21. 21. Purifikovaný izolovaný polypeptid vyznačuj ící se tím, že tento polypeptid je produkován způsobem podle nároku 20.
22. 22. Monoklonální protilátka vyznačuj ícíse tím, že tato monoklonální protilátka specificky interaguje s epitopem v oblasti 54 C-koncových aminokyselin lidské chitinázy popsané sekvencí SEK. ID. Č. : 2:
23. 23. Monoklonální protilátka podle nároku 22 vyznačující se tím, že tato monoklonální protilátka kompetuje s monoklonální protilátkou 243Q, produkovanou hybridomem uloženým pod přístupovým číslem ATCC _, ve vazbě k fragmentu lidské chitinázy s chitin-vazebnou aktivitou, ale postrádajícím chitinázovou aktivitu.
24. 24. Monoklonální protilátka podle nároku 22 vyznačující se tím, že tato monoklonální protilátka kompetuje s monoklonální protilátkou 243M, produkovanou hybridomem uloženým pod přístupovým číslem ATCC _, ve vazbě k fragmentu ·»

    9 * • ··· • · · • · «

    Β ·· « Μ ·, lidské chitinázy s chitin-vazebnou aktivitou, ale postrádajícím chitinázovou aktivitu.