UA100888C2

UA100888C2 - Гуманізоване антитіло проти фактора d та його застосування

Info

Publication number: UA100888C2
Application number: UAA201014073A
Authority: UA
Inventors: Артур Дж. ХУАН; Роберт Ф. КЕЛЛИ; Генри Лоумен; ЛОКЕРЕН КАМПАГНЕ Менно ВАН; Чарльз М Винтер
Original assignee: Дженентек, Инк.
Priority date: 2008-04-28
Filing date: 2009-04-27
Publication date: 2013-02-11
Also published as: AR114997A2

Abstract

Винахід належить до гуманізованого антитіла, яке специфічно зв'язується з фактором D, полінуклеотиду, що його кодує, вектору, клітини-хазяїна, способу одержання антитіла. Винахід також належить до фармацевтичної композиції для лікування захворювання, пов'язаного з комплементом, промислового виробу, набору для лікування захворювання та способу лікування захворювання, пов'язаного з комплементом, де захворювання являє собою запальне захворювання або захворювання очей.

Description

0 Контроль без снроватки І ши

І ро Контроль сироваткового л ізису

М (гтуманізованай Каб проти фактора Г) ях Са тео им можу 238 (мОДНфікований Баблроти фактора ОЗ) лов им

І янняррнн- 2 38-1 (модифікований Каб проти фактора 0)

ТІС503 Ов НМ 120 !

ЇТ5 /Контрользлюдським (Й. «й 0 Контроль хвр 120 100 па ке

Ж во їх

Є де т в З "а " У ще її

Є 5 ха А ій т 4о- р я

М. ї

Ко

А хе

Ф й, о 01 | 10 300 1000 104

Концентрація (ВМ)

ФІ

Перехресні посилання на споріднені заявки

За даною заявкою, поданою згідно з 37 СЕК 51.53(Б), запитується пріоритет згідно з 35 ОЗС 5119(е) по попередній патентній заявці США Мо 61/048431, поданій 28 квітня 2008 р., і попередній патентній заявці США Мо 61/048689, поданій 28 квітня 2008 р., повний зміст яких включений в даний документ за допомогою посилань.

Рівень техніки винаходу

Система комплементу відіграє центральну роль у виведенні імунних комплексів і імунній відповіді на збудників інфекції, чужорідні антигени, інфіковані вірусом клітини і пухлинні клітини.

Однак комплемент також відіграє роль у патологічному запаленні і аутоїмунних захворюваннях.

В результаті цього, інгібування надлишкової або неконтрольованої активації каскаду комплементу може забезпечити клінічний ефект у пацієнтів з такими захворюваннями і станами.

Система комплементу включає два різних шляхи активації, які називаються класичний і альтернативний шляхи (М. М. Ноїегв, Іп Сіїіпіса! Іттипоіоду: Ргіпсіріез5 апа Ргасіїсе, ей. К.К. Кісп,

Мозбу Ргевз5; 1996, 363-391). Класичний шлях являє собою кальцій/магній-залежний каскад, що звичайно активується утворенням комплексів антиген-антитіло. Альтернативний шлях являє собою магній-залежний каскад, що активується депонуванням і активацією СЗ3 на деяких сприйнятливих поверхнях (наприклад, полісахаридах клітинної стінки дріжджів і бактерій, а також деяких біополімерних матеріалах). Активація шляху комплементу створює біологічно активні фрагменти білків комплементу, наприклад, анафілотоксини СЗа, С4а і Сба, і мембраноатакуючі комплекси С5р-9 (МАС), що опосередковують запальні активності, що включають хемотаксис лейкоцитів, активацію макрофагів, нейтрофілів, тромбоцитів, гладких клітин і ендотеліальних клітин, проникність судин, цитоліз і ушкодження тканин.

Фактор Ю являє собою високоспецифічну серинову протеазу, необхідну для активації альтернативного шляху комплементу. Він розщеплює фактор В, зв'язаний з СЗр, утворюючи фермент СЗБ/ВЬ, що є активним компонентом С3/С5 конвертаз альтернативного шляху. Фактор

Ор може бути прийнятною мішенню для інгібування, оскільки його концентрація в плазмі людини дуже низька (1,8 мкг/мл) і встановлено, що він є лімітуючим ферментом для активації альтернативного шляху комплементу (Р.Н. І езамге апа Н.). МапПег-Ерегага. 9. Ехр. Меа., 1978; 148: 1498-1510; У.Е. Моіапаків егаІ., Мем Епа. у. Мед., 1985; 312: 395-401).

Зо Показано, що понижуюча регуляція активації комплементу ефективна для лікування деяких симптомів захворювання в моделях на тваринах і в дослідженнях ех мімо, наприклад, системного червоного вовчака і гломерулонефриту (У. Мапа еї аї., Ргос. Маї!. Асай. 5сі.; 1996, 93: 8563-8568), ревматоїдного артриту (У. УМапд еї аї., Ргос. Май. Асайд. зсі., 1995; 92: 8955- 8959), серцево-легеневого шунтування і гемодіалізу (С.5. Кіпаег, 9. Сііп. Іпмеві., 1995; 96: 1564- 1572), надгострого відторгнення при трансплантації органів (Т.У. Кгозпиз еї аї!., Тгапзріапіайоп, 1995; 60: 1194-1202), інфаркту міокарда (9У.МУ. Нотеївіег еї аї., у. Іттипої., 1993; 150: 1055-1064;

Н.Е. Меївтап еї аї!., 5сіепсе, 1990; 249: 146-151), реперфузійного ушкодження (Е.А. Атвівтдат еї аї,, Ат. У. РНузіо!., 1995; 268: Ні48-Н457) і респіраторного дистрес-синдрому дорослих (К.

Вабіпомісі еї аї., У. Іттипої., 1992; 149: 1744-1750). Крім того, інші запальні стани і захворювання, викликані аутоїмунними/мунними комплексами, також тісно зв'язані з активацією комплементу (М.М. Ноїег5, там же, В.Р. Могдап. Еиг. У. Сіїп. Іпме5і, 1994: 24: 219-228), включаючи термічну травму, тяжку форму астми, анафілактичний шок, запалення кишечнику, кропивницю, набряк Квінке, васкуліт, розсіяний склероз, міастенію, мембранозно- проліферативний гломерулонефрит і синдром Шегрена.

В галузі лікування опосередкованих комплементом захворювань існує потреба в терапевтичних засобах на основі антитіл, і гуманізовані антитіла проти фактора 0, а також варіанти даних антитіл і їхні фрагменти (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти) за даним винаходом являють собою високосафінні антитіла, корисні для задоволення цієї потреби.

Суть винаходу

В одному аспекті даний винахід в основному належить до антитіл, здатних інгібувати біологічні активності, пов'язані з фактором 0.

В одному аспекті даний винахід належить до гуманізованих антитіл проти фактора 0, що має різні терапевтично корисні властивості. Винахід включає амінокислотні послідовності НМК5 даних гуманізованих антитіл проти фактора О і відповідні їм послідовності нуклеїнових кислот.

Винахід включає амінокислотні послідовності варіабельних доменів важкого і легкого ланцюгів гуманізованих антитіл проти фактора 0 і відповідні їм послідовності нуклеїнових кислот. Винахід включає амінокислотні послідовності важкого і легкого ланцюгів гуманізованих антитіл проти фактора 0 і відповідні їм послідовності нуклеїнових кислот.

В одному аспекті специфічні антитіла в рамках даного винаходу включають, без обмежень, бо гуманізовані антитіла проти фактора 0, що містять НМЕ5 гуманізованих Раб проти фактора 0 клонів Ме 238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 або 238-11. В одному варіанті здійснення гуманізовані антитіла проти фактора О містять варіабельні домени важких і/або легких ланцюгів гуманізованих баб проти фактора О клонів Мо 238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 або 238-11. В одному варіанті здійснення гуманізовані антитіла проти фактора О містять важкі і/або легкі ланцюги гуманізованих Бар проти фактора О клонів Ме 238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238- або 238-11. В одному варіанті здійснення винахід включає гуманізовані баб проти фактора Ю клонів Ме 238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 або 238-11. В одному варіанті здійснення винахід включає фрагменти антитіл (наприклад, антигензв'язувальні 10 фрагменти) повнорозмірних антитіл з гуманізованими Раб проти фактора О клонів Мо 238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 або 238-11. В одному варіанті здійснення винахід включає повнорозмірні антитіла або їхні антигензв'язувальні фрагменти, що містять антигензв'язувальні послідовності важкого ланцюга і/або легкого ланцюга гуманізованих

Еаб проти фактора О клонів Ме 238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 або 238-11. В одному варіанті здійснення такі антигензв'язувальні послідовності містять щонайменше один, два або три НМЕК5 важкі ланцюги. В одному варіанті здійснення такі антигензв'язувальні послідовності містять щонайменше одну, дві або три НМК5 легкі ланцюги. В одному варіанті здійснення такі антигензв'язувальні послідовності містять щонайменше частину або весь варіабельний домен важкого ланцюга. В одному варіанті здійснення такі антигензв'язувальні послідовності містять щонайменше частину або весь варіабельний домен легкого ланцюга.

В одному аспекті даний винахід належить до фрагментів антитіл (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів) або повнорозмірних антитілах з гуманізованими Раб проти фактора О клону Мо 111, що містить щонайменше одну модифікацію послідовності гуманізованих Бар проти фактора ЮО клону Мо 111, де такі повнорозмірні антитіла або такі антигензв'язувальні фрагменти включають антигензв'язувальні послідовності важкого ланцюга іабо легкого ланцюга гуманізованих Бар проти фактора Ю клону Мо 111. В одному варіанті здійснення фрагменти антитіл (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти) або повнорозмірні антитіла з гуманізованими Бар проти фактора О клону Мо 111, що містять щонайменше одну

Зо модифікацію послідовності гуманізованих Бар проти фактора О клону Мо 111, що містять антигензв'язувальні послідовності важкого ланцюга і/або легкого ланцюга гуманізованих Бар проти фактора О клону Мо 111, крім того, зв'язуються в основному з тим же епітопом, що і Бар гуманізованого антитіла клону Мо 111. В одному варіанті здійснення такі антигензв'язувальні послідовності містять щонайменше один, два або три НМК5 важкі ланцюги. В одному варіанті здійснення такі антигензв'язувальні послідовності містять щонайменше один, два або три НМК5 легкі ланцюги. В одному варіанті здійснення такі антигензв'язувальні послідовності містять щонайменше частину або весь варіабельний домен важкого ланцюга. В одному варіанті здійснення такі антигензв'язувальні послідовності містять щонайменше частину або весь варіабельний домен легкого ланцюга. В одному варіанті здійснення така модифікація в зазначених фрагментах антитіл або зазначених повнорозмірних антитілах знаходиться у важкому ланцюзі. В одному варіанті здійснення така модифікація в зазначених фрагментах антитіл або зазначених повнорозмірних антитілах знаходиться в легкому ланцюзі. В одному варіанті здійснення така модифікація в зазначених фрагментах антитіл або зазначених повнорозмірних антитілах знаходиться у варіабельному домені важкого ланцюга. В одному варіанті здійснення така модифікація в зазначених фрагментах антитіл або зазначених повнорозмірних антитілах знаходиться у варіабельному домені легкого ланцюга. В одному варіанті здійснення така модифікація в зазначених фрагментах антитіл або зазначених повнорозмірних антитілах знаходиться щонайменше в одній, двох або трьох НМК5 важкого ланцюга. В одному варіанті здійснення така модифікація в зазначених фрагментах антитіл або зазначених повнорозмірних антитілах знаходиться щонайменше в одній, двох або трьох НМК5 легкого ланцюга.

В одному аспекті винахід належить до антитіл за даним винаходом або їхніх фрагментах (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів), що зв'язуються з фактором О з афінністю зв'язування, що складає щонайменше приблизно 107-1072М.

В одному аспекті винахід належить до антитіл за даним винаходом або їхніх фрагментах (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів), у яких Рар-фрагмент таких антитіл інгібує біологічну функцію фактора Ю при молярному відношенні РГаб-фрагмента до фактора 0, що складає від приблизно 0,05:1 (0,05) до приблизно 10:1 (10), або від приблизно 0,09:1 (0,09) до приблизно 8:1 (8), або від приблизно 0,1:1 (0,1) до приблизно 6:1 (б), або від приблизно 0,15:1 60 (0,15) до приблизно 5:1 (5), або від приблизно 0,19:1 (0,19) до приблизно 4:1 (4), або від приблизно 0,2:1 (0,2) до приблизно 3:1 (3), або від приблизно 0,3:1 (0,3) до приблизно 2:1 (2), або від приблизно 0,4:1 (0,4) до приблизно 1:1 (1), або від приблизно 0,5:1 (0,5) до приблизно 1:22 (0,5), або від приблизно 0,6:1 (0,6) до приблизно 1:3 (0,33), або від приблизно 0,7:1 (0,7) до приблизно 1:4 (0,25), або від приблизно 0,8:1 (0,8) до приблизно 1:5 (0,2), або від приблизно 0,91 (0,9) до приблизно 1:6 (0,17).

В одному аспекті антитіла за даним винаходом включають людські, гуманізовані або химерні антитіла.

В іншому аспекті даний винахід включає фрагменти антитіл (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти) гуманізованих антитіл проти фактора 0. Фрагменти антитіл за даним винаходом можуть, наприклад, являти собою фрагменти Раб, Раб", Е(аб)», зсЕм, (5сЕм)г, дАБ, що визначає комплементарність ділянки (СОК), лінійні антитіла, одноланцюжкові молекули антитіл, мінітіла, діатіла або мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл.

В інших аспектах винаходу даний винахід включає композиції, що містять антитіло за винаходом або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент). В іншому варіанті здійснення винахід належить до клітинних ліній і векторів кодуючі щонайменше частину антитіла за винаходом або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента). В одному аспекті винахід включає спосіб одержання, спосіб виробництва і спосіб застосування антитіл або їхніх фрагментів (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів) і композицій за винаходом. В одному варіанті здійснення спосіб одержання антитіла за винаходом або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента) включає (а) культивування клітини- хазяїна, наприклад, еукаріотичної СНО або клітини, що містить вектор, який містить полінуклеотид, кодуючий антитіло за винаходом або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент), в умовах, що підходять для експресії поліонуклеотиду, кодуючого антитіло або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент), і (Б) виділення антитіла або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента).

У ще одному аспекті винахід належить до визначеної композиції, що містить антитіло за винаходом або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент), як описано в даному документі, у сполученні з носієм. Необов'язково, носій є фармацевтично прийнятним носієм.

Зо Ще одним аспектом даного винаходу є використання даних гуманізованих антитіл або фрагментів цих антитіл (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів) для одержання лікарського засобу або композиції для запобігання і/або лікування захворювань, пов'язаних з надлишковою або неконтрольованою активацією комплементу. Вони включають активацію комплементу в процесі операцій серцево-легеневого шунтування, активацію комплементу в результаті ішемії-реперфузії при гострому інфаркті міокарда, аневризмі, інсульту, геморагічного шоку, ушкодження з роздробленням тканин, поліорганної недостатності, гіповолемічного шоку, кишкової ішемії або інших подій, що є причиною ішемії. Також установлено, що активація комплементу зв'язана з запальними станами, такими як важкі опіки, ендотоксемія, септичний шок, респіраторний дистрес-синдром дорослих, гемодіаліз, анафілактичний шок, тяжка форма астми, набряк Квінке, хвороба Крона, серповидно-клітинна анемія, постстрептококовий гломерулонефрит і панкреатит. Захворювання може бути результатом побічної дії лікарських засобів, лікарської алергії, індукованого І/-2 синдрому судинного випоту або алергії на рентгеноконтрастну речовину. Сюди також належать аутоїмунні захворювання, такі як системний червоний вовчак, міастенія, ревматоїдний артрит, хвороба Альцгеймера і розсіяний склероз. В іншому варіанті здійснення активація комплементу також пов'язана з відторгненням трансплантата. В іншому варіанті здійснення активація комплементу також пов'язана з очними хворобами (усіма патологічними станами і захворюваннями ока, патологія яких пов'язана з комплементом, включаючи класичний і альтернативний шлях активації комплементу), такими як, наприклад, без обмеження, макулярне дегенеративне захворювання, таке як усі стадії вікової макулярної дегенерації (АМО), у тому числі суха і мокра (не ексудативна і ексудативна) форми, діабетична ретинопатія й інші пов'язані з ішемією ретинопатії, хороїдальна неоваскуляризація (СММ), увеїт, діабетичний макулярний набряк, патологічна короткозорість, хвороба фон Хіпель-Ліндау, гістоплазмоз очей, оклюзія центральної вени сітківки (СКМО), неоваскуляризація рогівки і неоваскуляризація сітківки. В одному прикладі патологічні стани очей, зв'язані з комплементом, включають вікову макулярну дегенерацію (АМО), у тому числі не ексудативну (наприклад, проміжну суху АМО або географічну атрофію (СА)) і ексудативну (наприклад, мокру АМО (хороїдальну неоваскуляризацію (СММ)) АМО, діабетичну ретинопатію (ОК), ендофтальміт і увеїт. У ще одному прикладі не ексудативна АМО може включати наявність твердих друз, м'яких друз, географічну атрофію і/або агрегацію пігменту. В іншому бо прикладі патологічні стани очей, зв'язані з комплементом, включають вікову макулярну дегенерацію (АМО), у тому числі ранню АМО (наприклад, наявність від множини невеликих до однієї або більше не дисемінованих середнього розміру друз), проміжну АМО (наприклад, наявність від дисемінованих середніх друз до однієї або більше великих друз) і прогресуючу

АМО (наприклад, включає географічну атрофію або прогресуючу мокру АМО (СММ). У наступному прикладі проміжна суха АМО може включати наявність великих друз, що зливаються. У ще одному прикладі географічна атрофія може включати утрату фоторецепторів і/або пігментованого епітелію сітківки (КРЕ). У ще одному прикладі ділянки географічної атрофії можуть бути маленькими або великими і/або можуть знаходитися в ділянці макули або в периферичній сітківці. В одному прикладі патологічний стан очей, зв'язаний з комплементом, являє собою проміжну суху АМО. В одному прикладі патологічний стан очей, пов'язаний з комплементом, являє собою географічну атрофію. В одному прикладі патологічний стан очей, пов'язаний з комплементом, являє собою мокру АМО (хороїдальну неоваскуляризацію (СММ)).

В іншому аспекті винахід належить до набору, який включає антитіло за винаходом або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент). В одному варіанті здійснення винахід належить до набору, який включає антитіло за винаходом або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) і інструкції із застосування. В одному варіанті здійснення винахід належить до набору, який включає антитіло за винаходом або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) і інструкції з введення вказаного антитіла для лікування захворювання, пов'язаного з комплементом. В одному варіанті здійснення винахід належить до набору, який включає перший контейнер, що містить композицію, що містить одне або декілька антитіл за винаходом або фрагментів даних антитіл (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів); і другий контейнер, що містить буферний розчин. В одному варіанті здійснення буферний розчин є фармацевтично прийнятним. В одному варіанті здійснення композиція, що містить антитіло за винаходом, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент), додатково містить носій, що у деяких варіантах здійснення є фармацевтично прийнятним. В одному варіанті здійснення набір додатково містить інструкції по введенню композиції (наприклад, антитіла або фрагмента даного антитіла (наприклад, антигензв'язувального фрагмента)) суб'єкту. В одному варіанті здійснення набір додатково містить інструкції по застосуванню набору.

В одному аспекті винахід належить до виробу, що містить матеріали, корисні для лікування, запобігання і/або діагностики захворювань, пов'язаних з комплементом. В одному варіанті здійснення винахід належить до виробу, що включає: (а) контейнер, (Б) етикетку на контейнері і (с) композицію, що містить антитіло або його варіант, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) за даним винаходом, укладений у контейнері, де етикетка на зазначеному контейнері свідчить, що композицію можна використовувати для лікування, запобігання і/або діагностики захворювань, пов'язаних з комплементом.

В одному аспекті винахід належить до використання антитіла проти фактора О за винаходом або фрагмента даного антитіла (наприклад, антигензв'язувального фрагмента), нуклеїнової кислоти за винаходом, експресійного вектора за винаходом або клітини-хазяїна за винаходом для одержання лікарського засобу для терапевтичного і/або профілактичного лікування захворювання, такого як пов'язаний з комплементом патологічний стан очей. В одному варіанті здійснення пов'язаний з комплементом патологічний стан очей вибирають з вікової макулярної дегенерації (АМО), включаючи не ексудативну (наприклад, проміжну суху

АМО або географічну атрофію (5А)) і ексудативну (наприклад, мокру АМО (хороїдальну неоваскуляризацію (СММ)) АМО, діабетичну ретинопатію (ОК), ендофтальміт і увеїт. В одному прикладі пов'язаний з комплементом патологічний стан очей являє собою проміжну суху АМО. В одному прикладі пов'язаний з комплементом патологічний стан очей являє собою географічну атрофію. В одному прикладі пов'язаний з комплементом патологічний стан очей являє собою мокру АМО (хороїдальну неоваскуляризацію (СММ)).

В одному аспекті винахід належить до використання виробу за винаходом для одержання лікарського засобу для терапевтичного і/або профілактичного лікування захворювання, такого як пов'язаний з комплементом патологічний стан очей. В одному варіанті здійснення пов'язаний з комплементом патологічний стан очей вибирають з вікової макулярної дегенерації (АМО), включаючи не ексудативну (наприклад, проміжну суху АМО або географічну атрофію (СА)) і ексудативну (наприклад, мокру АМО (хороїдальну неоваскуляризацію (СММ)) АМО, діабетичну ретинопатію (ОК), ендофтальміт і увеїт. В одному прикладі пов'язаний з комплементом патологічний стан очей являє собою проміжну суху АМО. В одному прикладі пов'язаний з комплементом патологічний стан очей являє собою географічну атрофію. В одному прикладі пов'язаний з комплементом патологічний стан очей являє собою мокру АМО (хороїдальну бо неоваскуляризацію (СММ)).

В одному аспекті винахід належить до використання набору за винаходом для одержання лікарського засобу для терапевтичного і/або профілактичного лікування захворювання, такого як пов'язаний з комплементом патологічний стан очей. В одному варіанті здійснення пов'язаний з комплементом патологічний стан очей вибирають з вікової макулярної дегенерації (АМО), включаючи не ексудативну (наприклад, проміжну суху АМО або географічну атрофію (СА)) і ексудативну (наприклад, мокру АМО (хороїдальну неоваскуляризацію (СММ)) АМО, діабетичну ретинопатію (ОК), ендофтальміт і увеїт. В одному прикладі пов'язаний з комплементом патологічний стан очей являє собою проміжну суху АМО. В одному прикладі пов'язаний з комплементом патологічний стан очей являє собою географічну атрофію. В одному прикладі пов'язаний з комплементом патологічний стан очей являє собою мокру АМО (хороїдальну неоваскуляризацію (СММ)).

Короткий опис фігур

На фігурах 1А-1С представлене вирівнювання послідовностей варіабельних доменів легень ланцюгів для: гуманізованого Габ проти фактора О клону Мо 111 (5ЕО ІЮО Мо: 1), гуманізованих

Еарз проти фактора О 238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-868, 238-9, 238-10 і 238-11 (ЗЕО ІО МоМо: 6-17, відповідно) і консенсусної послідовності МІ. каппа І (ЗЕО ІЮО Мо: 65).

Позиції пронумеровані згідно з КаБбаї і гіперваріабельні ділянки (по Караї-визначення НУК по

Споїпіа) укладені в рамку (НМЕ5: (1) НМК-11 ідентифікована як А1-АТ1 (ІТ5ТОІЮСОММ (ЗЕО 10

Мо: 30), ІТ5ТОІВООСМ (5ЕО ІО Ме: 31), ІТ5ТОІВОВІМ (5ЕО ІО Ме: 32), ІТ9ТОІЮОСОМА (5ЕО ІО Мо: 33) або ІТ2ТОІЮСОМО (ЗЕО ІЮ Мо: 34)), (2) НМК-12, ідентифікована як В1-87 (сОМТІ ВР (ЗЕО

ІО Ме: 35), СО5ТІ КР (ЗЕО ІЮ Мо: 36) або ССАТІ КР (ЗЕО ІЮ Мо: 37)), (3) НМК-1І 3, ідентифікована як С1-С9 (95051 РУТ (5ЕО ІО Мо: 38)). Зміни амінокислот у кожному гуманізованому Раб проти фактора 0 виділені жирним шрифтом і курсивом.

На фігурах 2А-С представлене вирівнювання послідовностей варіабельних доменів важких ланцюгів для: гуманізованого баб проти фактора О клону Мо 111 (5ЕО ІО Мо: 2) і гуманізованих

Еарз проти фактора О 238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-868, 238-9, 238-10 і 238-11 (ЗЕО ІЮО МоМо: 18-29, відповідно) і консенсусної послідовності МН підгрупи 7 (ЗЕО ІО Мо: 66). Позиції пронумеровані згідно з КаБбаї і гіперваріабельні ділянки (по Кабаїнвизначення НУ по Споїйіа) укладені в рамку (НМК5: (1) НМЕ-НІ, ідентифікована як 01-010 (МТЕТММамММ

Коо) (ЗЕО ІО Мо: 39), (2) НМЕ-На2, ідентифікована як Е1-Е19 (МЛМ УТОЕТТУАООРКО (5ЕО ІЮ Ме: 40), (3) НУВ-НЗ, ідентифікована як 1-6 (ЕССМММ (5ЕБО ІЮ МО: 41), ЕСОМАМ (ЗЕБО ІО Мо: 42),

ЕССМОМ (5ЕБЕО ІЮ Мо: 43), ЕССОММА (ЗЕО ІО Мо: 44) або ЕССОММО (ЗЕО ІЮ Мо: 45)). Зміни амінокислот у кожному гуманізованому Раб проти фактора ОО виділені жирним шрифтом і курсивом.

На фігурі З представлена нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІЮО Мо: 46) легкого ланцюга гуманізованого Бар проти фактора ЮО 238. Нуклеотидна послідовність кодує легкий ланцюг гуманізованого Баб проти фактора О 238 з ініціюючим і термінуючим кодоном, виділеними жирним шрифтом і підкресленими. Кодон, що відповідає першій амінокислоті на фігурі 4 (ЗЕО

ІО Ме: 47), виділений жирним шрифтом і курсивом.

На фігурі 4 представлена амінокислотна послідовність (ЗЕ ІЮО Мо: 47) легкого ланцюга гуманізованого Бар проти фактора О 238. В амінокислотній послідовності відсутня М-кінцева сигнальна послідовність поліпептиду, кодованого ЗЕО ІО Мо: 46, представленої на фігурі 3.

Послідовності НМ виділені жирним шрифтом і курсивом. Варіабельні ділянки є непідкресленими ділянками, тоді як перший константний домен сС11 підкреслений.

Представлено каркасні (ЕК) ділянки і НМЕК ділянки: ЕК1-Ї С (5ЕО ІЮ Мо: 48), ЕК2-І С (5ЕО ІЮО Мо: 49), ЕВЗ-І С (5ЕО ІЮ Ме: 50), ЕК4-І С (ЗЕО ІО Мо: 51), НМА1-І С (ЗЕО ІО Мо: 30 (ІТ5ТОІЮСОММ)),

НМНА2-І-С (5ЕО ІЮ Мо: 35 (СОМ КР)), НМАЗ-І С (5ЕО ІО Ме: 38 (О5ОБІ РУТ) і СІ 1 (5ЕО ІО Ме: 52).

На фігурі 5 представлена нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІО Мо: 53) важкого ланцюга гуманізованого баб проти фактора О 238. Нуклеотидна послідовність кодує важкий ланцюг гуманізованого Баб проти фактора О 238 з ініціюючим і термінуючим кодоном, виділеними жирним шрифтом і підкресленими. Кодон, що відповідає першій амінокислоті на фігурі 6 (ЗЕО

ІО Мо: 54), виділений жирним шрифтом і курсивом.

На фігурі 6 представлена амінокислотна послідовність (5ЕО ІЮ Мо: 54) важкого ланцюга гуманізованого Бар проти фактора О 238. В амінокислотній послідовності відсутня М-кінцева сигнальна послідовність поліпептиду, кодованого ЗЕО ІО Мо: 53, представленої на фігурі 5.

Послідовності НМ виділені жирним шрифтом і курсивом. Варіабельні ділянки є непідкресленими ділянками, тоді як перший константний домен СНІ підкреслений.

Представлено каркасні (ЕК) ділянки і НУК ділянки: ЕК1-НС (ЗЕО ІЮО Мо: 55), ЕК2-НС (5ЕО ІЮ Мо: бо 56), ЕВЗ-НС (5ЕО ІО Ме: 57), ЕК4-НС (5ЕО ІЮО Ме: 58), НМК1-НС (ЗЕО ІО Мо: 39 (ЗУТЕТМУОММ)),

НМА2-НО (5ЕО ІО Ме: 40 (МЛМ УТОЕТТУАВОЕКС)), НМК3-НС (ЗЕО ІЮО Мо: 41 (ЕСОСМУММ)) і СНІ (ЗЕО ІО Мо: 59).

На фігурі 7 представлена нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІЮО Мо: 60) легкого ланцюга гуманізованого бар проти фактора О 238-1. Нуклеотидна послідовність кодує легкий ланцюг гуманізованого баб проти фактора О 238-1 з ініціюючим і термінуючим кодоном, виділеними жирним шрифтом і підкресленими. Кодон, що відповідає першій амінокислоті на фігурі 8 (ЗЕО

ІО Мо: 61), виділений жирним шрифтом і курсивом.

На фігурі 8 представлена амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮ Мо: 61) легкого ланцюга гуманізованого Бар проти фактора О 238-1. В амінокислотній послідовності відсутня М-кінцева сигнальна послідовність поліпептиду, кодованого ЗЕО ІО Мо: 60, представленої на фігурі 7.

НМНА2-І-С (5ЕО ІО Мо: 35 (СОМТІ КР)), НМАЗ-І С (5ЕО ІО Ме: 38 (О5ОБІ РУТ) ї СІ1 (ЗЕО ІЮ Мо: 52).

На фігурі 9 представлена нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІО Мо: 62) важкого ланцюга гуманізованого бар проти фактора О 238-1. Нуклеотидна послідовність кодує важкий ланцюг гуманізованого Бар проти фактора О 238-1 з ініціюючим і термінуючим кодоном, виділеними жирним шрифтом і підкресленими. Кодон, що відповідає першій амінокислоті на фігурі 10 (ЗЕО

ІО Ме: 63) виділений жирним шрифтом і курсивом.

На фігурі 10 представлена амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮ Мо: 63) важкого ланцюга гуманізованого Бар проти фактора О 238-1. В амінокислотній послідовності відсутня М-кінцева сигнальна послідовність поліпептиду, кодованого ЗЕО ІЮО Мо:6б2, представленої на фігурі 9.

Послідовності НМК виділені жирним шрифтом і курсивом. Варіабельні ділянки є непідкресленими ділянками, тоді як перший константний домен СНІ підкреслений.

Представлено каркасні (ЕК) ділянки і НУК ділянки: ЕК1-НО (5ЕО ІЮ Мо: 64), ЕК2-НС (ЗЕО ІЮ Мо: 56), ЕВЗ-НС (5ЕО ІО Ме: 57), ЕК4-НС (5ЕО ІЮО Ме: 58), НМК1-НС (ЗЕО ІО Мо: 39 (ЗУТЕТМУОММ)),

НМНА2-НС (5ЕО ІО Мо: 40 (ММІМТ УТОЕТТУАВОРКОС)), НМАЗ-НС (5ЕО ІЮО Ме: 41 (ЕСОСУММ)) і СНІ

Коо) (ЗЕО ІО Мо: 59).

На фігурі 11 представлені результати гемолітичного аналізу, що демонструють інгібування активності альтернативного шляху комплементу, для гуманізованого Бар проти фактора 0 клону Мо 111 і гуманізованих Рарх проти фактора О 238 і 238-1. Приведено значення ІСзо.

На фігурі 12 представлені результати гемолітичного аналізу, що демонструють інгібування активності альтернативного шляху (АР) комплементу, для гуманізованого Бар проти фактора О 238 при трьох концентраціях у сироватці крові (9,7 нМ, 16,2 нМ і 26,5 нМ) фактора 0. У таблиці З приведені значення ІСво (НМ) і ІСео (НМ) (значення являють собою середнє з трьох повторних експериментів), що відповідають трьом концентраціям у сироватці крові фактора О. Молярні відношення антитіла до цільового фактора О також представлені в таблиці 3.

На фігурі 13 представлена змодельована тривалість інгібування альтернативного шляху (АР) активації комплементу в оці людини за допомогою одиничної інтравітреальної (ІМТ) ін'єкції

Рар проти фактора О 238 у дозі 2,5 мг (рахуючи час напівжиття (1172) баб проти фактора Ю 238-11,5 днів, на основі міжвидового масштабування від кролика). По оцінці, одинична ІМТ ін'єкція Раб проти фактора О 238 інгібує АР активацію комплементу в тканині сітківки протягом щонайменше приблизно 74 днів і в склоподібному тілі протягом щонайменше приблизно 97 днів. На фігурі 13 пунктирна лінія показує змодельовану концентрацію Бар проти фактора 0 238 у склоподібному тілі після інтравітреального введення. На фігурі 13 суцільна лінія показує змодельовану концентрацію Раб проти фактора О 238 у тканині сітківки після інтравітреального введення. Різниця в концентрації в склоподібному тілі і тканині сітківки основана на оцінці коефіцієнта розподілу тканини сітківки, що дорівнює 2095, іншими словами, 20 95 усього лікарського засобу, введеного в склоподібне тіло, зможе проникнути в тканину сітківки.

Докладний опис винаходу

І. Визначення

Терміни, використовувані в даній заявці, повинні бути витлумачені в звичайному і типовому значенні фахівцями в даній галузі. Однак заявники бажають, щоб наступним термінам було дано конкретне визначення, як це зазначено нижче.

Словосполучення "в основному ідентична" застосовно до послідовності поліпептидного ланцюга антитіла може бути витлумачене як ланцюг антитіла, що має щонайменше 70 95 або 8095, або 9095, або 9595 ідентичності послідовності з контрольною поліпептидною 60 послідовністю. Термін застосовно до послідовності нуклеїнової кислоти може бути витлумачений як послідовність нуклеотидів, що має щонайменше приблизно 85 95 або 90 95, або 9595, або 97 95 ідентичності послідовності з контрольною послідовністю нуклеїнової кислоти.

Термін "ідентичність" або "гомологія" варто тлумачити як процентний вміст амінокислотних залишків у послідовності-кандидаті, що ідентичні залишкам відповідної послідовності, з якою її порівнюють, після вирівнювання послідовностей і внесення розривів при необхідності для досягнення максимальної процентної ідентичності для цілої послідовності, і не розглядаючи будь-які консервативні заміни як частину ідентичності послідовності. Ні М-, ні С-кінцеві або подовження вставки не повинні вважатися такими, що зменшують ідентичність або гомологію.

Методи і комп'ютерні програми для вирівнювання добре відомі в даній галузі. Ідентичність послідовності можна кількісно визначати за допомогою програм для аналізу послідовностей.

Термін "антитіло" використовується в найширшому змісті і конкретно охоплює моноклональні антитіла (включаючи повнорозмірні моноклональні антитіла), поліклональні антитіла і мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла). Антитіла (АбБв) і імуноглобуліну (195) являють собою глікопротетни, що мають однакові структурні характеристики. У той час як антитіла мають специфічність зв'язування з визначеною мішенню, імуноглобуліни включають як антитіла, так і інші антитілоподібні молекули, у яких відсутня специфічність відносно мішені. Природні антитіла й імуноглобуліни, як правило, являють собою гетеротетрамірні глікопротеїни масою приблизно 150000 дальтон, що складаються з двох ідентичних легких (І) ланцюгів і двох ідентичних важких (Н) ланцюгів. Кожен важкий ланцюг має на одному кінці варіабельний домен (Мн), за яким йде ряд константних доменів. Кожен легкий ланцюг має варіабельний домен на одному кінці (Мі) і константний домен на іншому її кінці. "Виділене" антитіло являє собою антитіло, яке ідентифіковане і виділене і/або вилучене з компонентів його природного оточення. Домішкові компоненти його природного оточення являють собою матеріали, що заважали б діагностичному або терапевтичному застосуванню антитіла, і можуть включати ферменти, гормони й інші білкові або небілкові розчинені речовини.

В одному прикладі антитіло буде очищене (1) до більш ніж 9595 по вазі антитіла, що визначають методом Лоурі, і найбільш переважно до більше ніж 99 95 по вазі, (2) до ступеня, достатнього для одержання щонайменше 15 залишків М-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності за допомогою секвенатора з обертовою склянкою, або (3) до гомогенності при 50О5-РАСЕ у відновлюючих або не відновлюючих умовах з використанням

Кумаси блакитного або, переважно, фарбування сріблом. Виділене антитіло включає антитіло іп 5йи у рекомбінантних клітинах, оскільки щонайменше один компонент природного оточення антитіла буде відсутній. Однак, як правило, виділене антитіло одержують, використовуючи щонайменше одну стадію очищення.

Фраза "антитіло проти фактора О людини", використовувана в даному документі, означає антитіло, що специфічно зв'язується з людським фактором Ю таким чином, що інгібує або істотно знижує активацію комплементу.

Термін "фактор 0" використовують у даному документі для позначення поліпептидів фактора 0 із природною послідовністю і його варіантами.

Фактор 0 "із природною послідовністю" являє собою поліпептид, що має ту ж амінокислотну послідовність, що і природний поліпептид фактора 0, незалежно від способу його одержання.

Таким чином, фактор О із природною послідовністю можна виділяти з природних джерел або можна одержувати рекомбінантними і/або синтетичними методами. Крім зрілого білка фактора р, такого як зрілий білок людського фактора Ю (ММ 001928), термін "фактор О із природною послідовністю" спеціально включає природні форми попередників фактора О (наприклад, неактивний білок-попередник, що протеолітично розщеплюється до активної форми), природні варіантні форми (наприклад, альтернативно сплайсовані форми) і природні алельні варіанти фактора О, а також структурні конформаційні варіанти молекул фактора О з тією ж амінокислотною послідовністю, що і поліпептид фактора 0, отриманий із природних джерел.

Поліпептиди фактора 0 із тварин, відмінних від людини, у тому числі вищих приматів і ссавців, відмінних від людини, спеціально включені в дане визначення. "Варіант фактора р" означає активний поліпептид фактора 0, як визначено нижче, що має щонайменше приблизно 8095 ідентичності амінокислотної послідовності з природною послідовністю поліпептиду фактора 0, такий як природна послідовність поліпептиду фактора Ю людини (ММ 001928). Як правило, варіант фактора О буде мати щонайменше приблизно 80 95 ідентичності амінокислотної послідовності, або щонайменше приблизно 8595 ідентичності амінокислотної послідовності, або щонайменше приблизно 90 95 ідентичності амінокислотної послідовності, або щонайменше приблизно 95 95 ідентичності амінокислотної послідовності, або 60 щонайменше приблизно 9895 ідентичності амінокислотної послідовності, або щонайменше приблизно 9995 ідентичності амінокислотної послідовності зі зрілою амінокислотною послідовністю людини (ММ 001928). "Відсоток (95) ідентичності амінокислотної послідовності" визначають як процентний вміст амінокислотних залишків у послідовності-кандидаті, що ідентичні амінокислотним залишкам у контрольній послідовності фактора О після вирівнювання послідовностей і внесення розривів при необхідності для досягнення максимальної процентної ідентичності послідовності, і не розглядаючи будь-які консервативні заміни як частину ідентичності послідовності. Вирівнювання з метою визначення відсотка ідентичності амінокислотної послідовності можна проводити різними способами, відомими в даній галузі, наприклад, за допомогою загальнодоступних комп'ютерних програм, таких як програми ВГАЗТ, ВІ АБЗТ-2, АПОМ або Меодаїїдп (ОМА5ТАК).

Фахівці в даній галузі можуть визначати прийнятні параметри для кількісного визначення вирівнювання, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання по всій довжині порівнюваних послідовностей. Потім розраховують ідентичність послідовності щодо більш довгої послідовності, тобто, навіть, якщо більш коротка послідовність демонструє 100 95 ідентичності послідовності з частиною більш довгої послідовності, загальна ідентичність послідовності буде меншою ніж 100 95. "Відсоток (95) ідентичності послідовності нуклеїнової кислоти" визначають як процентний вміст нуклеотидів у послідовності-кандидаті, що ідентичні нуклеотидам у контрольній послідовності, що кодує фактор 0, після вирівнювання послідовностей і внесення розривів при необхідності для досягнення максимальної процентної ідентичності послідовності.

Вирівнювання з метою визначення відсотка ідентичності послідовності нуклеїнової кислоти можна проводити різними способами, відомими в даній галузі, наприклад, за допомогою загальнодоступних комп'ютерних програм, таких як програми ВГА5Т, ВІ АБТ-2, АМІОМ або

Медаїїдп (ОМАБТАК). Фахівці в даній галузі можуть визначати прийнятні параметри для кількісного визначення вирівнювання, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання опо всій довжині порівнюваних послідовностей. Потім розраховують ідентичність послідовності щодо більш довгої послідовності, тобто, навіть, якщо більш коротка послідовність демонструє 100 95 ідентичності послідовності з частиною більш довгої послідовності, загальна ідентичність послідовності буде меншою ніж 100 95.

Зо "Виділена" молекула нуклеїнової кислоти являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, що ідентифікована і відділена щонайменше від однієї домішкової молекули нуклеїнової кислоти, з якою вона звичайно зв'язана в природному джерелі нуклеїнової кислоти. Виділена молекула нуклеїнової кислоти знаходиться в іншій формі або оточенні, ніж ті, у яких вона зустрічається в природі. В результаті цього, виділені молекули нуклеїнової кислоти відрізняються від молекули нуклеїнової кислоти, що існує в природних клітинах. Однак виділена молекула нуклеїнової кислоти включає молекули нуклеїнової кислоти, що містяться в клітинах, які звичайно експресують кодований поліпептид, якщо, наприклад, молекула нуклеїнової кислоти має хромосомну локалізацію, що відрізняється від такої в природних клітинах. "Виділена" молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид фактора О, являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка ідентифікована і відділена щонайменше від однієї домішкової молекули нуклеїнової кислоти, з якою вона звичайно зв'язана в природному джерелі нуклеїнової кислоти, що кодує фактор О. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид фактора 0, знаходиться в іншій формі або оточенні, ніж ті, у яких вона зустрічається в природі. В результаті цього, виділені молекули нуклеїнової кислоти кодуючі поліпептид фактора 0, відрізняються від кодуючої молекули(молекул) нуклеїнової кислоти, що існує в природних клітинах. Однак виділена молекула нуклеїнової кислоти кодуючої фактор О, включає молекули нуклеїнової кислоти кодуючі фактор О, що містяться в клітинах, які звичайно експресують фактор О, якщо, наприклад, молекула нуклеїнової кислоти має хромосомну локалізацію, що відрізняється від такої в природних клітинах.

Термін "антагоніст" використовується в найширшому змісті і включає будь-яку молекулу, що здатна нейтралізувати, блокувати, частково або повністю інгібувати, скасовувати, зменшувати або перешкоджати біологічній активності фактора О. Антагоністи фактора ЮО включають, без обмежень, антитіла проти фактора О і варіанти даних антитіл, їхні антигензв'язувальні фрагменти, інші зв'язуючі поліпептиди, пептиди і непептидні малі молекули, що зв'язуються з фактором 0 і здатні нейтралізувати, блокувати, частково або повністю інгібувати, скасовувати, зменшувати або перешкоджати активностям фактора О, таким, як здатність фактора 0 відігравати роль у патології зв'язаного з комплементом патологічного стану очей.

У даному документі "малу молекулу" визначають як ту, яка має молекулярну масу меншу ніж приблизно 600, переважно, меншу ніж приблизно 1000 дальтон.

"Активний" або "активність" або "біологічна активність" у контексті антагоніста фактора О за даним винаходом являє собою здатність протидіяти (частково або повністю |інгібувати) біологічній активності фактора 0. Одним із прикладів біологічної активності антагоніста фактора

О є здатність викликати помітне поліпшення стану, наприклад, патології, зв'язаного з фактором р захворювання або стану, такого як, наприклад, пов'язаний з комплементом патологічний стан очей. Активність можна визначати в аналізах іп мійго або іп мімо, включаючи аналізи на зв'язування, аналізи на гемоліз, пов'язаний з альтернативним шляхом активації (наприклад, аналізи, у яких вимірюють інгібування або активності активації комплементу альтернативним шляхом), використання відповідних моделей на тваринах або клінічні випробування на людині.

Термін "пов'язане з комплементом захворювання" використовується в найширшому змісті і включає захворювання, пов'язані з надлишковою або неконтрольованою активацією комплементу. Вони включають активацію комплементу в процесі операцій серцево-легеневого шунтування, активацію комплементу в результаті ішемії-реперфузії при гострому інфаркті міокарда, аневризми, інсульту, геморагічного шоку, ушкодження з роздробленням тканин, поліорганної недостатності, гіповолемічного шоку, кишкової ішемії або інших подій, що є причиною ішемії. Також установлено, що активація комплементу пов'язана з запальними станами, такими як важкі опіки, ендотоксемія, септичний шок, респіраторний дистрес-синдром дорослих, гемодіаліз, анафілактичний шок, тяжка форма астми, набряк Квінке, хвороба Крона, серповидно-клітинна анемія, постстрептококовий гломерулонефрит і панкреатит. Захворювання може бути результатом побічної дії лікарських засобів, лікарської алергії, індукованого 1-2 синдрому судинного випоту або алергії на рентгеноконтрастну речовину. Сюди також належать аутоїмунні захворювання, такі як системний червоний вовчак, міастенія, ревматоїдний артрит, хвороба Альцгеймера і розсіяний склероз. Активація комплементу також пов'язана з відторгненням трансплантату. Активація комплементу також пов'язана з очними хворобами, такими як вікова макулярна дегенерація, діабетична ретинопатія й інші зв'язані з ішемією ретинопатії, хороїдальна неоваскуляризація (СММ), увеїт, діабетичний макулярний набряк, патологічна короткозорість, хвороба фон Хіпель-Ліндау, гістоплазмоз очей, оклюзія центральної вени сітківки (СКМО), неоваскуляризація рогівки і неоваскуляризація сітківки.

Термін "пов'язаний з комплементом патологічний стан очей" використовується в

Зо найширшому змісті і включає всі патологічні стани очей, патологія яких пов'язана з комплементом, включаючи класичний і альтернативний шляхи, і зокрема альтернативний шлях активації комплементу. Пов'язані з комплементом патологічні стани очей включають, без обмеження, макулярні дегенеративні захворювання, такі як усі стадії вікової макулярної дегенерації (АМО), у тому числі суху і мокру (не ексудативну і ексудативну) форми, хороїдальну неоваскуляризацію (СМУ), увеїт, діабетичну й інші зв'язані з ішемією ретинопатії, а також інші внутрішньочні неоваскулярні захворювання, такі як діабетичний макулярний набряк, патологічна короткозорість, хвороба фон Хіпель-Ліндау, гістоплазмоз очей, оклюзія центральної вени сітківки (СКМО), неоваскуляризація рогівки і неоваскуляризація сітківки. В одному прикладі патологічні стани очей, зв'язані з комплементом, включають вікову макулярну дегенерацію (АМО), у тому числі не ексудативну (наприклад, проміжну суху АМО або географічну атрофію (СА)) і ексудативну (наприклад, мокру АМО (хороїдальну неоваскуляризацію (СММ)) АМО, діабетичну ретинопатію (ОК), ендофтальміт і увеїт. У ще одному прикладі не ексудативна АМО може включати наявність твердих друз, м'яких друз, географічну атрофію і/або агрегацію пігменту. В одному прикладі патологічні стани очей, зв'язані з комплементом, включають вікову макулярну дегенерацію (АМО), у тому числі ранню АМО (наприклад, наявність від множини невеликих до однієї або більше не дисемінованих середнього розміру друз), проміжну АМО (наприклад, наявність від дисемінованих середніх друз до однієї або більше великих друз) і прогресуючу АМО (наприклад, включає географічну або атрофію прогресуючу мокру АМО (СМУ). (Реттіз єї ані., АВЕО5 Вероп Мо. 18, Заїо єї а!., Еує Вев., 34(3): 238-40 (2009); дадег еї аї.,

Мем Епої. У. Мей., 359(1): 1735 (2008)). У наступному прикладі проміжна суха АМО може включати наявність великих друз, що зливаються. У ще одному прикладі географічна атрофія може включати втрату фоторецепторів і/або пігментованого епітелію сітківки (КРЕ). У ще одному прикладі ділянки географічної атрофії можуть бути маленькими або великими і/або можуть знаходитися в ділянці макули або в периферичній сітківці В одному прикладі патологічний стан очей, зв'язаний з комплементом, являє собою проміжну суху АМО. В одному прикладі патологічний стан очей, зв'язаний з комплементом, являє собою географічну атрофію.

В одному прикладі патологічний стан очей, зв'язаний з комплементом, являє собою мокру АМО (хороїдальну неоваскуляризацію (СММ)). "Лікування" означає втручання, яке здійснюється з метою запобігання або розвитку зміни 60 патології захворювання. Відповідно, "лікування" означає як терапевтичне лікування, так і профілактичні або превентивні міри. Ті, хто має потребу в лікуванні, включають тих, хто вже страждає від даного захворювання, а також тих, у кого захворювання повинно бути відвернуте.

При лікуванні захворювань, пов'язаних з імунною системою, терапевтичний засіб може безпосередньо змінювати інтенсивність імунної реакції компонента імунної ї відповіді або робити захворювання більш сприйнятливим до лікування іншими терапевтичними засобами, наприклад, антибіотиками, протигрибковими препаратами, протизапальними засобами, засобами для хіміотерапії і так далі. "Патологія" захворювання, такого як пов'язаний з комплементом патологічний стан очей, включає всі явища, що піддають ризику здоров'я пацієнта. Це включає, без обмеження, аномальний або неконтрольований ріст клітин (клітин нейтрофілів, еозинофілів, моноцитів, лімфоцитів), продукцію антитіл, продукцію аутоантитіл, продукцію комплементу, перешкоду нормальному функціонуванню сусідніх клітин, виділення цитокінів або інших секреторних продуктів в аномальних кількостях, або придушення загострення будь-якої запальної або імунної відповіді, інфільтрацію запальних клітин (нейтрофілів, еозинофілів, моноцитів, лімфоцитів) у клітинний простір, і так далі.

Термін "ссавець", використовуваний у даному документі, означає будь-яку тварину, що класифікується як ссавець, включаючи, без обмеження, людей, вищих приматів, домашніх і сільськогосподарських тварин і тварин у зоопарку, тварин для занять спортом або домашніх улюбленців, таких як коні, свині, велика рогата худоба, собаки, кішки і тхори, і так далі. В одному варіанті здійснення винаходу ссавець являє собою людину.

Введення "у сполученні з" одним або великою кількістю додаткових терапевтичних засобів включає одночасне (спільне) або послідовне введення в будь-якому порядку. "Терапевтично ефективна кількість" являє собою кількість "антагоніста фактора 0", яка необхідна для досягнення вимірних поліпшень у стані, наприклад, патології, цільового захворювання або стану, такого як, наприклад, пов'язаний з комплементом патологічний стан очей.

Термін "контролюючі послідовності" означає послідовності ДНК, необхідні для експресії функціонально зв'язаної кодуючої послідовності у конкретному організмі-хазяїні. Контролюючі послідовності, що підходять для прокаріот, наприклад, включають промотор, необов'язково

Зо послідовність оператора і сайт зв'язування рибосоми. У еукаріотичних клітинах, як відомо, використовуються промотори, сигнали поліаденілювання і енхансери.

Нуклеїнова кислота є "функціонально зв'язаною", коли вона знаходиться у функціональній залежності від іншої послідовності нуклеїнової кислоти. Наприклад, ДНК для передпослідовності або секреторної лідерної послідовності є функціонально зв'язаною з ДНК для поліпептиду, якщо він експресується у вигляді білка-попередника, що приймає участь у секреції поліпептиду; або промотор енхансер є функціонально зв'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію послідовності; або сайт зв'язування рибосоми є функціонально зв'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він розташований таким чином, щоб полегшувати трансляцію. У цілому, "функціонально зв'язаний" означає, що послідовності ДНК, які зв'язані, є суміжними і, у випадку секреторної лідерної послідовності, є суміжними й у фазі зчитування. Однак енхансери не обов'язково повинні бути суміжними. Сполука здійснюється шляхом лігування в прийнятних сайтах рестрикції. Якщо таких сайтів не існує, відповідно до звичайної практики використовують синтетичні олігонуклеотидні або адаптери лінкери. "Суворість умов" реакцій гібридизації може бути легко визначена рядовим фахівцем у даній галузі і, як правило, визначається емпіричним розрахунком у залежності від довжини зонда, температури промивання і концентрації солі. Як правило, більш довгі зонди вимагають більш високих температур для належного відпалу, тоді як для більш коротких зондів потрібні більш низькі температури. Гібридизація в основному залежить від здатності денатурованої ДНК до повторного відпалу, коли комплементарні нитки присутні в середовищі при температурі нижчій їхньої температури плавлення. Чим вищий ступінь бажаної гомології між зондом і здатної до гібридизації послідовністю, тим вища відносна температура, яку можна використовувати. З цього випливає, що більш високі відносні температури будуть робити умови реакції більш суворими, а більш низькі температури - менш суворими. Щоб одержати додаткову інформацію і роз'яснення щодо твердості умов реакції гібридизації, дивися А!йзирбеї еї аї., Сштепі Ргоїосої5 іп

Моїесшіаг Віоіоду, УМіеу Іпіегзсіеєпсе Рибіївпегв, (1995). "Жорсткі умови" або "дуже жорсткі умови", відповідно до даного документа, можна визначити як такі, якщо: (1) використовують низьку іонну силу і високу температуру для промивання, наприклад, 0,015М хлорид натрію/0,0015М цитрат натрію/0,1 95 додецилсульфат натрію при 502С; (2) використовують у процесі гібридизації денатуруючу речовину, таку як бо формамід, наприклад, 50 95 (про/про) формамід із сумішшю 0,1 95 бичачого сироваткового альбуміну/0,1 95 фіколу/0,1 95 полівінілпіролідону/50 мМ натрій-фосфатного буфера при рН 6,5 з 750 мМ хлориду натрію, 75 мМ цитрату натрію при 422С; або (3) використовують 50 95 формамід, 5х55С (0,75М Масі, 0075М цитрат натрію), 50 мМ фосфат натрію (рН 6,8), 0,1 95 пірофосфат натрію, 5хрозчин Денхардта, оброблену ультразвуком ДНК зі сперми лосося (50 мкг/мл), 0,1 956 505 і 10 95 сульфат декстрану при 422С, із промиванням при 422С у 0,2х550 (хлорид натрію/цитрат натрію) і 50 96 формаміду при 55 "С, з наступним промиванням у дуже суворих умовах, що представляють собою використання 0,1х555 зі вмістом ЕОТА при 5526. "Помірковано суворі умови" відповідають визначенню, приведеному в Затбгоок еї аї.,

МоїІесшіаг Сіопіпд: А Гарогаїгу Мапиаї, Мем МогКк: Соїй Зргіпд Нагрог Ргез5, 1989, і включають використання промиваючого розчину, і умов гібридизації (наприклад, температури, іонної сили і 96505) менш суворих, ніж ті, які описані вище. Прикладом помірковано суворих умов є інкубація протягом ночі при 37 "С у розчині, що містить: 20 95 формаміду, 5х55С (150 мм Масі, мм тринатрівєвий цитрат), 50 мм фосфат натрію (р 7,6), зхрозчин Денхардта, 10 95 сульфат декстрану і 20 мг/мл денатурованої фрагментованої ДНК сперми лосося, з наступним 15 промиванням фільтрів у їх55С приблизно при 37-50 "С. Кваліфікований фахівець у даній галузі знає як регулювати температуру, іонну силу і так далі в міру необхідності для відповідності таким факторам, як довжина зонда тощо.

Термін "варіабельний" у контексті варіабельного домену антитіл означає той факт, що деякі частини варіабельних доменів широко розрізняються по послідовності середовищ антитіл і відповідають за зв'язування і специфічність кожного конкретного антитіла у відношенні його конкретної мішені. Однак варіабельність не розподілена рівномірно по всіх варіабельних доменах антитіл. Вона зосереджена в трьох сегментах, що називаються визначальними комплементарність ділянками (СОК»5), також відомих як гіперваріабельні ділянки (НМК5), у варіабельних доменах як легкого ланцюга, так і важкого ланцюга. Більш висококонсервативні частини варіабельних доменів називаються каркасними ділянками (ЕК). Кожен з варіабельних доменів природних важких і легких ланцюгів містить чотири ЕК ділянки, що, переважно, приймають В-складчасту конфігурацію, з'єднані трьома СОК5, що утворюють петлі, які з'єднуються і в деяких випадках утворюють частину ВД-складчастої структури. СОК5 у кожному ланцюзі містяться разом у безпосередній близькості за допомогою ЕЕ ділянок і разом з СОКЗ» з

Зо іншого ланцюга вносять вклад в утворення сайту зв'язування мішені в антитілах (дивися Кабраї еї а). Нумерація амінокислотних залишків імуноглобуліну, використовувана в даному документі, виконана відповідно до системи нумерації амінокислотних залишків імуноглобулінів

Кабаї єї аї. (Зедиепсевз ої Ргоївіпв ої Іттипо|одісаї Іпіегеві, Маїйопаї! Іпвійше ої Неаци, Веїпезаа,

Ма. 1987), якщо не зазначене інше.

Термін "гіперваріабельна ділянка", "НМЕ" або "НУ", використовуваний у даному документі, означає ділянки варіабельного домену антитіла, що є гіперваріабельними в послідовності і/або утворюють структурно обкреслені петлі. Як правило, антитіла містять шість гіперваріабельних ділянок, три в МН (НІ, Н2, НЗ) і три в МІ (11, 12, І 3). Ряд діаграм гіперваріабельних ділянок використовуються й охоплюються рамками даного документа. Система Кабраї визначальних комплементарність ділянок (СОМ5) основана на варіабельності послідовностей і використовується найчастіше (Кабаї еї аї., Зедоепсе5 ої Ргоївіп5 ої Іттипоїодісаї! Іптегев5і, 5

Е4. Рибіїс Неакй Зегмісе, Майопаї! Іпзійшев ої Неакй, Веїпезаа, МО. (1991)). Споїпіа замість цього посилається на розташування структурних петель (Споїпіа апа ГІ е5К У. Мої. Віої. 196: 901- 917 (1987)). Кінець петлі СОК-НІ по Споїйіа при нумерації відповідно до системи нумерації

Кабаї варіює між НЗ2 ії НЗ4 у залежності від довжини петлі (це відбувається через те, що за схемою нумерації Кабаї наявні вставки на НЗ5БА їі НЗ5ОВ; якщо відсутній як З5А, так і 358, петля закінчується на 32; якщо є присутнім тільки З5А, петля закінчується на 33; якщо є присутнім і

З5А і 358, петля закінчується на 34). Гіперваріабельні ділянки АБ являють собою компроміс між

СОМК5 по Караї і структурними петлями по СПоїпіа, і використовуються програмою для моделювання антитіл Охіога МоїІесшіаг5 АБ апіїбоду тодеїїйпд. Зони "контакту" гіперваріабельних ділянок основані на аналізі наявних у розпорядженні складних кристалічних структур. Залишки з кожної з таких гіперваріабельних ділянок приведені нижче.

Гіперваріабельні ділянки можуть включати наступні "подовжені гіперваріабельні ділянки": 24-36 або 24-34 (11), 46-56 або 50-56 (І 2) і 89-97 (І 3) у МІ. ії 26-35В8 (НІ), 50-65, 47-65 або 49-65 (Н2) і 93-102, 94-102 або 95-102 (НЗ) у МН. Залишки варіабельного домену пронумеровані згідно з Кабраї еїаї!., вище для кожної з даних дефініцій. "Каркасні" або "БК" залишки являють собою такі залишки варіабельного домену, що відрізняються від залишків гіперваріабельної або ділянки залишків СОК, визначених у даному документі.

Терміни "нумерація залишків варіабельного домену по Кара! або "нумерація амінокислотних позицій по Караї"» а також їхньої варіації означають систему нумерації, використовувану для варіабельних доменів важкого або ланцюга варіабельних доменів легкого ланцюга компіляції антитіл у Кабаї єї аіІ., зедоепсез ої Ргоївіп5 ої Іпттипо|одісаї! Іпіегеві, Бій Еа.

Рибіїс Неайй зЗегмісе, Майопаї Іпзійшев ої Неакй, Веїпезаа, МО. (1991). При використанні цієї системи нумерації фактична лінійна амінокислотна послідовність може містити менше або більше амінокислот, що відповідає укорочуванню або вставці в ЕЕ або СОК варіабельного домену. Наприклад, варіабельний домен важкого ланцюга може містити вставку однієї амінокислоти (залишок 52а згідно Кабаї) після залишку 52 у Н2 і вставлені залишки (наприклад, залишки 82а, 82р і 82с і так далі згідно Караї) після залишку 82 у ЕК важкого ланцюга.

Нумерацію залишків по Караї можна проводити для даного антитіла шляхом вирівнювання в ділянках гомології послідовності антитіла з "стандартною" пронумерованою послідовністю

Кабаї.

Систему нумерації Караї, як правило, використовують при посиланні на залишок у варіабельному домені (приблизно залишки 1-107 у легкому ланцюзі і залишки 1-113 у важкому ланцюзі) (наприклад, публікація Кабаї еї а!І., Зедоепсез ої Іттипоїодіса! Іпсеге5і. Бій Ей. Рибіїс

Неанй 5бегуісе, Маїйопаї! Іпзійшев ої Неанй, Веїпезаа, Ма. (1991), спеціально включена в даний документ за допомогою посилання). "Систему нумерації ЕО" або "індекс БО", як правило, використовують при посиланні на залишок у константній ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну (наприклад, індекс ЄЮ, приведений у КаБбаї єї аїІ., вище; шарнірна ділянка у

Зо константному домені важкого ланцюга приблизно відповідає залишкам 216-230 (нумерація ЕЕ) важкого ланцюга). "Індекс ЄЮ по системі Кабаї" означає нумерацію залишків антитіла БО Ід чоловік. Якщо в даному документі не зазначене інше, посилання на номери залишків у варіабельному домені антитіл означають нумерацію залишків по системі нумерації Кабраї. Якщо в даному документі не зазначене інше, посилання на номери залишків у константному домені антитіл означає нумерацію залишків по системі нумерації ЄЮ (наприклад, дивися попередню заявку Сполучених Штатів Мо 60/640323, фігури для нумерації ЕО).

Термін "поліпептид", використовуваний у даному документі, як правило, означає пептиди і білки, що містять більше, ніж приблизно десять амінокислот. В одному прикладі поліпептид являє собою білок ссавця, приклади якого включають фактор О і фрагменти і/або варіанти фактора 0. В іншому прикладі поліпептид являє собою повнорозмірне антитіло або фрагмент даного антитіла (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент), що зв'язує фактор ЮО людини, приклади якого включають фрагменти Бар, Раб, Е(аб)» і Ем, діатіла, лінійні антитіла, одноланцюжкові молекули антитіл і мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів). "Варіант" або "варіант амінокислотної послідовності" вихідного поліпептиду являє собою поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, відмінну від послідовності вихідного поліпептиду. Як правило, варіант буде мати щонайменше 80 95 ідентичності послідовності, переважно, щонайменше 90 95 ідентичності послідовності, більш переважно щонайменше 95 95 ідентичності послідовності і найбільше переважно щонайменше 98 95 ідентичності послідовності з природним поліпептидом. Ідентичність послідовності у відсотках визначають, наприклад, за допомогою статті Ейсп еї аї., Ргос. Май. Асай. 5сі. ОБА, 80: 1382-1386 (1983), версії алгоритму, описаної МееаІетап еї аї., У. Мої. Віоі!., 48: 443-453 (1970), після вирівнювання послідовностей для забезпечення максимальної гомології. Варіанти амінокислотної послідовності поліпептиду можна одержувати, вносячи відповідні нуклеотидні зміни в ДНК, що кодує поліпептид, або за допомогою пептидного синтезу. Такі варіанти включають, наприклад, делеції і/або вставки і/або заміни залишків в амінокислотній послідовності цікавлячого поліпептиду. Здійснюють будь-які сполучення делецій, вставок і замін для одержання кінцевої конструкції, за умови, що кінцева конструкція має необхідні характеристики. Амінокислотні зміни також можуть змінювати посттрансляційні процеси в поліпептиді, наприклад, змінюючи або число положення сайтів глікозилування. Способи одержання варіантів амінокислотної послідовності поліпептидів описані, наприклад, у патенті США Мо 5534615, спеціально включеному в даний документ за допомогою посилання. "Варіант антитіла" або "модифіковане антитіло" з вихідного антитіла являє собою антитіло, що містить амінокислотну послідовність, відмінну від послідовності вихідного антитіла, у якій один або більше амінокислотних залишків вихідного антитіла були модифіковані. Як правило, варіант антитіла буде мати щонайменше 8095 ідентичності послідовності, переважно, щонайменше 90 95 ідентичності послідовності, більш переважно щонайменше 95 95 ідентичності послідовності і найбільш переважно щонайменше 98 95 ідентичності послідовності з вихідним антитілом. Ідентичність послідовності у відсотках визначають, наприклад, за допомогою статті

ЕйсН еї аї., Ргос. Май). Асад. осі. ОБА, 80: 1382-1386 (1983), версії алгоритму, описаної

МееаіІетанп еї аї., у. Мої. Віо!., 48: 443-453 (1970), після вирівнювання послідовностей вихідного антитіла і потенційного варіанта антитіла для забезпечення максимальної гомології. Або ідентичність подібність стосовно вихідної послідовності визначають у даному документі як процентний вміст амінокислотних залишків у послідовності потенційного варіанта, що ідентичні (тобто, той же самий залишок) або аналогічні (тобто, амінокислотний залишок з тієї ж групи за принципом спільності властивостей бічних ланцюгів, дивися нижче) залишкам вихідного антитіла, після вирівнювання послідовностей і внесення розривів при необхідності для досягнення максимальної процентної ідентичності послідовності. Варіанти амінокислотної послідовності антитіла можна одержувати, вносячи відповідні нуклеотидні зміни в ДНК, що кодує антитіло, або за допомогою пептидного синтезу. Такі варіанти включають, наприклад, делеції і/або вставки і/або заміни залишків в амінокислотній послідовності цікавлячого антитіла.

Здійснюють будь-як сполучення делецій, вставок і замін для одержання кінцевої конструкції, за умови, що кінцева конструкція має необхідні характеристики. Амінокислотні зміни також можуть змінювати посттрансляційні процеси в антитілі, наприклад, змінюючи або число положення сайтів глікозилування. Способи одержання варіантів послідовності антитіла для антитіл аналогічні способам одержання варіантів амінокислотної послідовності поліпептидів, наприклад, описаним у патенті США Мо 5534615, спеціально включеному в даний документ за допомогою посилання. "Дезамідований" варіант поліпептидної молекули являє собою поліпептид, у якому один або більше залишків аспарагіну (М або Авзп) оригінального поліпептиду були перетворені в аспартат (О або Ар), тобто, нейтральний амідний бічний ланцюг був перетворений у залишок, який має у цілому кислу характеристику. Дезамідування можна запобігти, перетворюючи залишки аспарагіну (М або Азп) у залишки глютаміну (0 або Сіп) або аланіну (А або Аїа) або серину (5 або 5ег) (АтрПей, 0. еї аІ., Рпагт. Віотеснпо!., 9: 1-140 (1996)). "Окиснений" варіант поліпептидної молекули являє собою поліпептид, у якому один або більше залишків метіоніну (М або Ме) або триптофану (М/ або Тгр) оригінального поліпептиду були перетворені в сульфон або сульфоксид через сірку залишку метіоніну. Окислюванню можна запобігти, перетворюючи залишки метіоніну (М або Ме) у залишки лейцину (ГІ. або І еи) або ізолейцину (І або Пе) (Атрпей, о. еї а!., Ріагіт. Віотесппої!., 9: 1-140 (1996)). "Піроглютаматний" варіант поліпептидної молекули являє собою поліпептид, у якому один або більше залишків глютаміну (0 або Сіп) оригінального поліпептиду були перетворені в піроглютамат, що утворюється, коли залишки глютаміну, наприклад М-кінцеві залишки глютаміну, спонтанно циклізуються з утворенням піроглютамату. Піроглютаматним перетворенням можна запобігти, перетворюючи залишки глютаміну (0 або Сіп) у глютамат (Е або Си) (Атрпей, 0. еї аІ., Рпапт. Віоїесппої., 9: 1-140 (1996)).

Термін "фрагмент антитіла" означає частину повнорозмірного антитіла, як правило, що зв'язує мішень або варіабельну ділянку. Приклади фрагментів антитіл включають фрагменти

Еаб, Раб", Кар)» і Ем. Фраза "функціональний фрагмент або аналог" антитіла означає сполуку, що має якісну біологічну активність, спільною з повнорозмірним антитілом. Наприклад, бо функціональний фрагмент або аналог антитіла проти фактора О людини являє собою фрагмент або аналог, що може зв'язуватися з фактором О таким чином, що запобігає або істотно знижує активацію комплементу. Термін "функціональний фрагмент", використовуваний у даному документі, стосовно антитіл означає фрагменти Ем, Е(аб) і Е(аб)». Фрагмент "Гу" являє собою мінімальний фрагмент антитіла, що містить цілий сайт розпізнавання і зв'язування мішені. Ця ділянка складається з димера варіабельного домену одного важкого й одного легкого ланцюга в щільній нековалентній асоціації (димер Мн-Мі). Саме в цій конфігурації три СОК5 кожного варіабельного домену взаємодіють, утворюючи сайт зв'язування мішені на поверхні димера Мн-

Мі. У сукупності шість СОК5 визначають специфічність зв'язування мішені антитіла. Однак навіть один варіабельний домен (або половина Ем, що містить тільки три СОК5, специфічних для мішені) має здатність розпізнавати і зв'язувати мішень. "Одноланцюжкові Ем" або "5Еу" фрагменти антитіла містять Мн і Мі домени антитіла, при цьому дані домени знаходяться на одному поліпептидному ланцюзі. Як правило, поліпептид Ем додатково містить поліпептидний лінкер між Мн і М. доменами, що дозволяє 5Ем утворювати необхідну структуру для зв'язування мішені.

Еаб-фрагмент містить константний домен легкого ланцюга і перший константний домен (СНІ) важкого ланцюга. ЕРар'іфрагменти відрізняються від ЕРар-фрагментів додаванням декількох залишків на карбоксильному кінці домену СНІ важкого ланцюга, включаючи один або більше залишків цистеїну із шарнірної ділянки антитіла. Е(ар')-фрагменти одержують шляхом розщеплення дисульфідного моста на залишках цистеїну шарнірної ділянки продукту розщеплення пепсином Е(аб')». Рядовим фахівцям у даній галузі відомі й інші хімічні сполуки фрагментів антитіл (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

Термін "бібліотека", використовуваний у даному документі, означає множину послідовностей антитіла або фрагментів антитіла (наприклад, поліпептидів за винаходом), або нуклеїнових кислот кодуючих дані послідовності, при цьому послідовності розрізняються по сполученню варіантів амінокислот, що введені в дані послідовності у відповідності зі способами за винаходом.

Термін "моноклональне антитіло", використовуваний у даному документі, означає антитіло, отримане з в основному гомогенній популяції антитіл, тобто, окремі антитіла, що складають популяцію, ідентичні, за винятком можливих природних мутацій, що можуть бути присутнім у

Зо незначних кількостях. Моноклональні антитіла високоспецифічні, будучи спрямованими проти одного цільового сайта. Крім того, на відміну від препаратів звичайних (поліклональних) антитіл, що, як правило, включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло спрямоване проти однієї детермінанти на мішені. На додаток до їхньої специфічності, моноклональні антитіла мають ту перевагу, що їх можна синтезувати за допомогою культури гібридом без домішки інших імуноглобулінів. Визначення "моноклональне" вказує на характер антитіла як отриманого з в основному гомогенної популяції антитіл, і не повинно тлумачитися як вимога одержання антитіла будь-яким конкретним методом.

Наприклад, моноклональні антитіла для використання за даним винаходом можна виділяти з фагової бібліотеки антитіл за допомогою добре відомих методів. Вихідні моноклональні антитіла для використання згідно із даним винаходом можна одержувати методом гібридом, вперше описаним Койіег і Міїбієвїп, Маїшге 256, 495 (1975), або можна одержувати рекомбінантними методами. "Гуманізовані" форми антитіл, відмінних від людських (наприклад, мишачих), являють собою химерні імуноглобуліни, ланцюги або імуноглобулінів їхні фрагменти (такі як Ем, Раб, Раб,

Каб)»: або інші єднальні мішені підпослідовності антитіл), що містять мінімальну послідовність, що походить з імуноглобуліну, відмінного від людського. Як правило, гуманізоване антитіло містить практично усі з щонайменше одного, і звичайно двох варіабельних доменів, у яких всі або майже всі ділянки СОК відповідають ділянкам імуноглобуліну, відмінного від людського, і всі або майже всі ділянки ЕК є ділянками консенсусної послідовності імуноглобуліну людини.

Гуманізоване антитіло може також містити щонайменше частину константної ділянки (Ес) імуноглобуліну, як правило, ділянки з вибраною матриці імуноглобуліну людини.

Терміни "клітина", "лінія клітин" і "культура клітин" включають і їхнє потомство. Також очевидно, що все потомство може бути не повністю ідентичним по сполуці ДНК, в результаті навмисних або випадкових мутацій. Варіантні нащадки, що мають ту ж функцію або біологічні властивості, на яких проводиться добір споконвічно трансформованих клітин, також включені. "Клітини-хазяї" використовувані в даному винаході, як правило, є прокаріотичними або еукаріотичними хазяїнами.

Термін "вектор" означає конструкцію ДНК, що містить послідовність ДНК, що функціонально зв'язана з відповідною контролюючою послідовністю, здатною здійснювати експресію ДНК у бо прийнятному хазяїні. Такі контролюючі послідовності включають промотор для здійснення транскрипції, необов'язкову послідовність оператора для керування такою транскрипцією, послідовність, що кодує відповідні сайти зв'язування мРНК із рибосомою, і послідовності, що контролюють термінацію транскрипції і трансляції. Вектор може являти собою плазміду, фагову частинку або просто потенційну геномну вставку. Після трансформації в прийнятного хазяїна вектор може реплікуватися і функціонувати незалежно від геному хазяїна, або може в деяких випадках інтегруватися в геном. У даному описі терміни "плазміда" і "вектор" іноді використовуються як синоніми, оскільки плазміда є найбільш часто використовуваною формою вектора. Однак винахід повинен включати й інші форми векторів, які виконують аналогічні функції і відомі або будуть відомі в даній галузі.

Термін "мітка", використовуваний у даному документі, означає детектовану сполуку або композицію, який можна прямо або опосередковано кон'югувати з молекулою або білком, наприклад, з антитілом. Мітка може сама бути детектованою (наприклад, радіоізотопні мітки або флуоресцентні мітки) або, у випадку ферментативної мітки, можуть каталізувати хімічні зміни субстратної сполуки або композиції, які можна виявляти.

Термін "тверда фаза", використовуваний у даному документі, означає неводну матрицю, до якої антитіло за даним винаходом може прикріплюватися. Приклади твердих фаз, охоплених даним документом, включають ті, котрі частково або повністю створені зі скла (наприклад, скла з контрольованим розміром пор), полісахаридів (наприклад, агарози), поліакриламідів, полістиролу, полівінілового спирту і силіконів. У деяких варіантах здійснення в залежності від контексту тверда фаза може являти собою лунку аналітичного планшета; в інші - колонку для очищення (наприклад, колонку для афінної хроматографії). "Фаговий дисплей" являє собою метод, за допомогою якого варіантні поліпептиди експонуються у вигляді злитих білків із щонайменше частиною білка оболонки на поверхні часток фагу, наприклад, нитчастого фагу. Корисність фагового дисплея полягає в тому, що великі бібліотеки рандомізованих варіантів білка можна швидко й ефективно сортувати в пошуках тих послідовностей, що з високої афінністю зв'язуються з цільовим антигеном. Дисплей пептидних і білкових бібліотек на фагах був використаний для скринінгу мільйонів поліпептидів у пошуках поліпептидів 3 визначеними єднальними властивостями. Методи полівалентного фагового дисплея були використані для експонування малих випадкових пептидів і невеликих білків шляхом злиття або з геном І, або з геном МІ! нитчастого фагу. Умеїї5 апа Гоултап (1992)

Сит. Оріп. Бігисі. Віої. 3: 355-362 і приведені там посилання. У моновалентному фаговому дисплеї білкова або пептидна бібліотека є злитою з геном ІІЇ або його частиною, і експресується на низьких рівнях у присутності білка гена ІП дикого типу, так, що частинки фагу експонують одну або ні однієї копії злитих білків. Ефекти авідності знижені в порівнянні з полівалентним фагом, так, що сортування відбувається на основі власної афінності ліганду, і використовуються фагмідні вектори, що спрощують маніпуляції з ДНК. І омлтап апа Умеїї5 (1991) Меїпоа5: А сотрапіоп (о Меїпод5 іп Епгутоіоду 3: 205-0216. "Фагміда" являє собою плазмідний вектор, що має бактеріальну крапку початку реплікації, наприклад СО1ЕТ, їі копію міжгенної ділянки бактеріофага. Фагміда може бути використана на будь-якому відомому бактеріофагу, включаючи нитчастий бактеріофаг і лямбдоподібний бактеріофаг. Плазміда також звичайно містить селектований маркер резистентності до антибіотиків. Сегменти ДНК, клоновані в такі вектори, можуть репродукуватися як плазміди.

Коли в клітинах, що містять такі вектори, є всі гени, необхідні для продукції фагових часток, спосіб реплікації плазміди змінюється на реплікацію по типу "кільця, що котиться, » для створення копій однієї нитки плазмідної ДНК і упакування фагових часток. Фагміда може утворювати інфекційні або неінфекційні частинки фагу. Даний термін включає фагміди, що містять ген білка оболонки фагу або його фрагмент, зв'язаний з геном гетерологічного поліпептиду у вигляді злитого гена таким чином, що даний гетерологічний поліпептид експонується на поверхні фагової частинки. "Варіантна Ес-ділянка" містить амінокислотну послідовність, що відрізняється від послідовності іншої Ес-ділянки через щонайменше одну "модифікацію амінокислоти", описану в даному документі. Переважно, варіантна Ес-ділянка містить щонайменше одну амінокислотну заміну в порівнянні Ес-ділянкою з природною послідовністю або з Ес- ділянкою вихідного поліпептиду, наприклад, від приблизно однієї до приблизно десяти амінокислотних замін, і, переважно, від приблизно однієї до приблизно п'яти амінокислотних замін у Есо-ділянки з природною послідовністю або в Ес-ділянки вихідного поліпептиду. У даному документі варіантна

Ес-ділянка буде, переважно, мати щонайменше приблизно 80 95 гомології з ЕРо- ділянкою з природною послідовністю і/або з Ес- ділянкою вихідного поліпептиду, і найбільш переважно щонайменше приблизно 90 95 гомології з нею, більш переважно щонайменше приблизно 95 95 60 гомології з нею. Приклади "Гс-ділянок людини з природною послідовністю" представлені на фігурі 23 у УМО 00/42072 і включають Ес-ділянка 91 людини із природною послідовністю (алотипи не-А і А), Ес-ділянка Ід2 людини із природною послідовністю, Ес-ділянка ІдЗ людини із природною послідовністю і Ес-ділянка 34 людини із природною послідовністю, а також їхні природні варіанти. Ес-ділянки миші з природною послідовністю представлені на фігурі 22А у УМО 00/42072.

Відповідно до даного винаходу "змінена" афінність зв'язування ЕРсКп являє собою афінність, що характеризується або підвищеною, або зниженою активністю зв'язування ЕсКп у порівнянні з вихідним поліпептидом або з поліпептидом, що містить Ес-ділянку із природною послідовністю. В одному прикладі, антитіло зі зміненою афінністю зв'язування ЕсКп сильніше зв'язується з БсКп при рН 6,0 і/або слабше зв'язується з БсКп при рН 7,0. Варіант, що "демонструє посилене зв'язування" з Ес, зв'язує щонайменше одну Ес із кращою афінністю, ніж вихідний поліпептид. Варіант, що "демонструє ослаблене зв'язування" з Ес, зв'язує щонайменше одну Ес з гіршою афінністю, ніж вихідний поліпептид. Варіант, що зв'язує Ес з "кращою афінністю", ніж вихідний поліпептид, являє собою варіант, що зв'язує Ес з істотно вищою афінністю зв'язування, ніж вихідне антитіло, коли кількості варіанта поліпептиду і вихідного поліпептиду в аналізі на зв'язування є практично однаковими. Наприклад, варіант поліпептиду з поліпшеної афінністю зв'язування Ес може демонструвати від приблизно 1,15- кратного до приблизно 100-кратного, наприклад, від приблизно 1,2-кратного до приблизно 50- кратного посилення афінності зв'язування Ес у порівнянні з вихідним поліпептидом при визначенні афінності зв'язування Ес. "Амінокислотна модифікація" означає зміну в амінокислотній послідовності заданої амінокислотної послідовності. Приклади модифікацій включають амінокислотну заміну, вставку і/або делецію. Одним із прикладів амінокислотної модифікації в даному документі є заміна. "Амінокислотна модифікація на" визначеній позиції, наприклад, у Ес-ділянки, означає заміну або делецію визначених залишків, або вставку щонайменше одного амінокислотного залишку поруч з визначеним залишком. Під вставкою "поруч" з визначеним залишком розуміють вставку в межах одного-двох залишків від нього. Вставка може бути з М-кінця або С-кінця стосовно визначеного залишку. "Амінокислотна заміна" означає заміну щонайменше одного існуючого амінокислотного залишку в заданій амінокислотній послідовності іншим відмінним "замінюючим" амінокислотним залишком. Замінюючий залишок або залишки можуть являти собою "природні амінокислотні залишки" (тобто, кодовані генетичним кодом) і вибрані з групи, що складається з: аланіну (аїа), аргініну (Агоу), аспарагіну (Азп), аспарагінової кислоти (А5р), цистеїну (Суз), глютаміну (іп), глютамінової кислоти (Сім), гліцину (Су), гістидину (Ні), ізолейцину (Пе), лейцину (Геи), лізину (Гуз), метіоніну (Ме), фенілаланіну (Ре), проліну (Рго), серину (зег), треоніну (Тпг), триптофану (Ттр), тирозину (Туг) і валіну (Маї). Заміна одним або декількома неприродними амінокислотними залишками також охоплена визначенням амінокислотної заміни, приведеним у даному документі. "Неприродний амінокислотний залишок" означає залишок, відмінний від природних амінокислотних залишків, перерахованих вище, що здатний ковалентно зв'язувати сусідній амінокислотний залишок(ки) у поліпептидному ланцюзі. Приклади неприродних амінокислотних залишків включають норлейцин, орнітин, норвалін, гомосерин та інші аналоги амінокислотних залишків, такі як ті, що описані в ЕІПтап еї аї., Ме. Епгут, 202: 301-336 (1991). Для створення таких неприродних амінокислотних залишків можна використовувати методи, описані в Могеп еї аІ.,, Зсіепсе, 244: 182 (1989) і ЕЄПтап еї аїІ., вище. Коротенько, дані методи включають хімічну активацію супресорної тРНК за допомогою неприродного амінокислотного залишку, з наступною іп міго транскрипцією і трансляцією РНК. "Амінокислотна вставка" означає вбудовування щонайменше однієї амінокислоти в задану амінокислотну послідовність. Хоча вставка, як правило, складається з вставки одного або двох амінокислотних залишків, дійсна заявка передбачає довші "пептидні вставки", наприклад, вставку від приблизно трьох до приблизно п'яти або навіть аж до приблизно десяти амінокислотних залишків. Уставлений залишок(ки) може бути природним або неприродної, як описано вище. "Амінокислотна делеція" означає видалення щонайменше одного амінокислотного залишку з заданої амінокислотної послідовності.

ІЇ. Докладний опис

Описаний в даному документі винахід належить до антагоністів фактора О, включаючи антитіла проти фактора 0 і їхні варіанти, а також їхні фрагменти (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти), корисні для запобігання і лікування зв'язаних з комплементом станів, включаючи патологічні стани очей (усі патологічні стани і захворювання очей, патологія 60 яких зв'язана з комплементом, включаючи класичний і альтернативний шляхи, і зокрема,

альтернативний шлях активації комплементу), такі як, наприклад, макулярні дегенеративні захворювання, такі як всі стадії вікової макулярної дегенерації "(АМО), у тому числі суха і мокра (не ексудативна і ексудативна) форми, хороїдальна неоваскуляризація (СММ), увеїт, діабетична й інші зв'язані з ішемією ретинопатії, ендофтальміт і інші внутрішньочні неоваскулярні захворювання, такі як діабетичний макулярний набряк, патологічна короткозорість, хвороба фон

Хіпель-Ліндау, гістоплазмоз очей, оклюзія центральної вени сітківки (СКМО), неоваскуляризація рогівки і неоваскуляризація сітківки. Одна група патологічних станів очей, зв'язаних з комплементом, включає вікову макулярну дегенерацію (АМО), у тому числі не ексудативну (наприклад, проміжну суху АМО або географічну атрофію (СА)) і ексудативну (наприклад, мокру

АМО (хороїдальну неоваскуляризацію (СММ)) АМО, діабетичну ретинопатію (ОК), ендофтальміт і увеїт. В одному прикладі патологічний стан очей, зв'язаний з комплементом, являє собою проміжну суху АМО. В одному прикладі патологічний стан очей, зв'язаний з комплементом, являє собою географічну атрофію. В одному прикладі патологічний стан очей, зв'язаний з комплементом, являє собою мокру АМО (хороїдальну неоваскуляризацію (СММ)).

АМО являє собою вікову дегенерацію макули, що є ведучою причиною необоротного порушення зору в осіб у віці старше 60. Існує два типи АМО, не ексудативна (суха) і ексудативна (мокра) АМО. Суха або не ексудативна форма включає атрофічні і гіпертрофічні зміни пігментного епітелію сітківки (КРЕ), що знаходиться під центральною сітківкою (макулою), а також депозити (друзи) на КРЕ. Не ексудативна АМО у пацієнтів може прогресувати до мокрої або ексудативної форми АМО, при якій аномальні кровоносні судини, які називаються хороїдальними неоваскулярними мембранами (СММУМ5), розвиваються під сітківкою, виникає витік рідини і крові і в остаточному підсумку виникає сліпучий дископодібний шрам у сітківці і під нею. Не ексудативна АМО, що, як правило, передує ексудативної АМО, зустрічається частіше.

Проявлення не ексудативної АМО варіюють: можуть бути присутніми тверді друзи, м'які друзи, географічна атрофія КРЕ і агрегація пігменту. Компоненти комплементу осаджуються на КРЕ на ранній стадії АМО і є основними складовими друз. 1. Гуманізовані антитіла проти фактора О

Описаний в даному документі винахід включає одержання і використання гуманізованих антитіл проти фактора 0 і їхніх фрагментів. Приклади способів одержання антитіл описані більш

З0 докладно в наступних розділах.

Способи гуманізації антитіл, відмінних від людських, добре відомі в даній галузі. Як правило, у гуманізованому антитілі мається один або більше амінокислотних залишків, введених у нього з джерела, відмінного від людини. Дані амінокислотні залишки, відмінні від людських, часто називають "імпортними" залишками, що, як правило, узяті з "імпортного" варіабельного домену.

Гуманізацію можна в основному проводити по методу У/іпіег і співробітників (Чопез еї аї., Маїиге, 321: 522-525 (1986), Віесптапп сеї а!., Маїшге, 332: 323-327 (1988), Метовєуеп вї а!., Зсієпсе, 239: 1534-1536 (1988)), шляхом заміни послідовностями СОК5 або СОК гризунів відповідних послідовностей людського антитіла. Відповідно, такі "гуманізовані" антитіла є химерними антитілами (патент США Мо 4816567), у яких істотно менше, ніж цілий варіабельний домен людини, замінено відповідною послідовністю з видів, відмінних від людини. На практиці, гуманізовані антитіла, як правило, є людськими антитілами, у яких деякі залишки СОК і, можливо, деякі залишки ЕК замінені залишками з аналогічних сайтів в антитілах гризунів.

Вибір людських варіабельних доменів, як легкого, так і важкого ланцюга, використовуваних для одержання гуманізованих антитіл, може в деяких випадках бути важливим для зменшення антигенності і/або НАМА-реакції (імунна відповідь людини на антитіло миші), якщо антитіло призначене для терапевтичного застосування для людини. Або зменшення виключення НАМА- реакції, як правило, є важливим аспектом клінічної розробки відповідних терапевтичних засобів.

Дивися, наприклад, Кпахлаеєїї еї аїЇ., 9. Май. Сапсег Іпб5і. (1988), 80: 937, дайМегв5 еї аї.,

Тгаперіапіайоп (1986), 41: 572, ЗНнаулег евї аї., у. Іттипої. (1985), 135: 1530, 5ваїгз еї аї., 9. Віої!.

Везропзе Мод. (1984), 3: 138; Міїег єї а!., Віоса (1983), 62: 988, НакКіті еї аї., у. Іттипо)!. (1991), 147: 1352, Веісптапп еї а!., Майте (1988), 332: 323, УипдуНапз еї а!., Сапсег Вев. (1990), 50: 1495.

Винахід, описаний у даному документі, належить до антитіл, що гуманізовані таким чином, що

НАМА-реакція знижена або виключена. Варіанти даних антитіл можна також одержувати, використовуючи рутинні методи, відомі в даній галузі, деякі з який додатково описані нижче.

Згідно з так званим методом "найкращої відповідності" проводять скринінг послідовності варіабельного домену антитіла гризуна проти цілої бібліотеки відомих послідовностей варіабельних доменів людини. Послідовність людського М-домену, що найбільш близька до послідовності гризуна, ідентифікують і людську каркасну ділянку (ЕК) у її сполуці вибирають для гуманізованого антитіла (біт еї аї., у. Іттипої. 151: 2296 (1993), Споїпіа еї аї., У. Мої. Віої., 196: бо 901 (1987)). В іншому методі використовують конкретну каркасну ділянку з консенсусної послідовності всіх людських антитіл конкретної підгрупи легких або важких ланцюгів. Той самий каркас можна використовувати для декількох різних гуманізованих антитіл (Сагег еї аї., Ргос.

Маї!. Асад. 5сі. ОА, 89: 4285 (1992), Ргевіа вї аї., у. Іттипої!. 151: 2623 (1993)).

Наприклад, амінокислотна послідовність з антитіла, описаного в даному документі, може служити стартовою (вихідною) послідовністю для диверсифікованості каркасної і/або гіперваріабельної послідовності(тей). Вибрана каркасна послідовність, до якої приєднана стартова гіперваріабельна послідовність, називається в даному документі акцепторною каркасною послідовністю людини. При тому, що акцепторна каркасна послідовність людини може бути з, або походити з, людського імуноглобуліну (його МІ. і/або МН ділянок), акцепторні каркасні послідовності людини можуть бути з, або походити з, консенсусної каркасної послідовності людини, оскільки встановлено, що такі каркасні послідовності мають мінімальну або зовсім не мають імуногенності для пацієнтів- людей. Термін "акцепторна каркасна послідовність людини", використовуваний у даному документі, означає каркасну послідовність, що містить амінокислотну послідовність каркаса Мі або УН, що походить з каркаса людського імуноглобуліну або з консенсусної каркасної послідовності людини. Акцепторна каркасна послідовність людини, "походить з" каркаса людського імуноглобуліну або з консенсусної каркасної послідовності людини, може містити незмінену амінокислотну послідовність 3 нього, або може містити вже існуючі зміни амінокислотної послідовності. Якщо маються вже існуючі зміни амінокислотної послідовності, переважно, присутні не більше ніж 5 і, переважно, 4 або менше, або З або менше, вже існуючих змін амінокислотної послідовності. В одному варіанті здійснення акцепторна каркасна послідовність МН людини ідентична по послідовності каркасної послідовності МН імуноглобуліну людини або консенсусної каркасної послідовності людини. В одному варіанті здійснення акцепторна каркасна послідовність Мі людини ідентична по послідовності каркасної послідовності МІ. імуноглобуліну людини або консенсусної каркасної послідовності людини. "Консенсусна каркасна послідовність людини" є каркасною послідовністю, що являє собою амінокислотні залишки, які найчастіше зустрічаються в наборі каркасних послідовностей МІ. або МН імуноглобуліну людини. Як правило, набір послідовностей

МІ. або МН імуноглобуліну людини походить з підгрупи послідовностей варіабельних доменів. Як правило, підгрупа послідовностей являє собою підгрупу по Кабаї еї аІ. В одному варіанті

Зо здійснення для МІ, підгрупа являє собою підгрупу каппа І по Кабаї еї а). В одному варіанті здійснення для МН підгрупа являє собою підгрупу ІІІ по Кабаї еї а).

Якщо акцепторна послідовність походить з імуноглобуліну людини, можна за бажанням вибирати людську каркасну послідовність, що вибрана на основі її гомології з донорською каркасною послідовністю при вирівнюванні донорської каркасної послідовності з різними каркасними послідовностями людини в колекції людських каркасних послідовностей, і вибирати найбільш гомологічну каркасну послідовність як акцепторну. Акцепторна каркасна послідовність людини може бути з, або походити з послідовностей зародкової лінії антитіл людини, доступних у публічних базах даних.

В одному варіанті здійснення по даному документу консенсусні послідовності людини є, або походять з підгрупи МІ! МН і/або підгрупи І каппа МІ. консенсусних каркасних послідовностей.

В одному варіанті здійснення матриця каркасної послідовності людини, використовувана для одержання антитіла проти фактора 0, може містити каркасні послідовності з матриці, що містить сполучення МІ-4.1 р (сімейство МН7) і УН4а для ланцюга МН і/або сполучення ОРКА (сімейство УКІ) і УК2 для ланцюга МІ.

В одному варіанті здійснення акцепторна каркасна послідовність МН людини включає одну, дві, три або всі з наступних каркасних послідовностей:

ЕКТ, що містить ФОМОЇ МОБОРЕЇ ККРОАБУКМУЗСКАФЗ (амінокислоти 1-25 з БЕО ІЮ Ме: 2),

ЕКЗ, що містить МУМКОАРСОСІ Е (амінокислоти 36-49 з БЕО ІЮО Ме: 2),

ЕКЗ, що містить КЕМЕБОТЗМЗТАМІ ОІ55І КАЕОТАМУУСЕК (амінокислоти 67-98 з 5ЕО ІЮ

Мо: 2),

ВЕМЕБГОТЗУЗТАМІ ОІ55І КАЕОТАМУУСЕ (амінокислоти 67-97 з ЗЕО ІЮ Мо: 2),

КЕМЕБГОТМЗТАМІ ОІ551 КАЕОТАМУ УС (амінокислоти 67-96 з БЕО ІЮ Мо: 2),

ЕЕМЕЗІ ЮОТЗУЗТАМІ ОІ55І КАЕОТАМУУС5 (ЗЕО ІЮ Мо: 3), або

КЕМЕБГОТМЗТАМІ ОІ551 КАЕОТАМУУСЗК (5ЕО ІЮ Ме: 4)

ЕКА4, що містить М/ЗОСТІ МТУ5З5 (амінокислоти 105-115 з БЕО ІЮО Мо: 2).

В одному варіанті здійснення акцепторна каркасна послідовність МІ людини може включати одну, дві, три або всі з наступних каркасних послідовностей:

ЕКТ, що містить ОІЮОМТО5РББІ БАЗМООКМТІТС (амінокислоти 1-23 з БЕО ІЮО Мо: 1),

ЕКЗ, що містить МУМООКРОКМУРКИІЗ (амінокислоти 35-49 з БЕО ІЮ Мо: 1),

ЕКЗ, що містить СМРІКЕБОБОЗОТОЕТІ ТІ ОРЕОМАТУУС (амінокислоти 57-88 з БЕО ІЮ

Мо: 1),

ЕК4, що містить ЕСОСТКІ ЕК (амінокислоти 98-107 з ЗЕО ІЮ Мо: 1), або

ЕСОСТКМЕЇК (5ЕО ІО Мо: 5).

При тому, що акцептор може бути ідентичний по послідовності з вибраною каркасною послідовністю людини, чи вона з людського імуноглобуліну або консенсусної каркасної послідовності людини, за даним винаходом передбачено, що акцепторна послідовність може містити вже існуючі амінокислотні заміни в порівнянні з послідовністю імуноглобуліну людини або консенсусною каркасною послідовністю людини. Такі вже існуючі заміни, переважно, мінімальні; як правило, всього чотири, три, два або одне амінокислотне розходження в порівнянні з послідовністю імуноглобуліну людини або консенсусною каркасною послідовністю людини.

Залишки гіперваріабельної ділянки антитіла, відмінного від людського, включають в акцепторні каркасні послідовності МІ. і/або МН людини. Наприклад, можна включати залишки, що відповідають залишкам СОК по Кабраї, залишки гіперваріабельних петель по СпПоїпіа, залишки Арт і/або контактні залишки. За бажанням, включають наступні залишки подовженої гіперваріабельної ділянки: 24-36 або 24-34 (11), 46-56 або 50-56 (12) і 89-97 (І 3), 26-358 (НІ), 50-65, 47-65 або 49-65 (Н2) і 93-102, 94-102 або 95-102 (НЗ).

В одному аспекті винахід належить до антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО Мо: 2. В одному аспекті винахід належить до антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО

ІЮ Мо: 1. В одному аспекті винахід належить до антитіла проти фактора О, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО Мо: 2, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить 5ЗЕО ІЮ Мо: 1. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В одному аспекті винахід належить до антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 97 95, 9895 або 9995 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю ЕС ІО Мо: 2. У деяких варіантах здійснення амінокислотна

Зо послідовність, що має щонайменше 90 95, 91 Фо, 92 9», 93 о, 94 90, 95 У, 96 Фо, 97 Уо, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовності, містить заміни, вставки або делеції в порівнянні з контрольною послідовністю, але антитіло, що містить таку амінокислотну послідовність, зберігає здатність зв'язувати фактор О. У деяких варіантах здійснення в цілому від 1 до 10 амінокислот були замінені, вставлені або делетовані в послідовності 5ЕО ІЮ Мо: 2. У деяких варіантах здійснення заміни, вставки і делеції мають місце в ділянках за межами НМК5 (тобто, у ЕК5). У деяких варіантах здійснення антитіло проти фактора О містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ Мо: 2. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

У деяких варіантах здійснення винахід належить до антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95, 91 95, 92 95, 93 90, 94 95, 95 95, 96 95, 97 Уо, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕ ІО Мо: 1. У деяких варіантах здійснення амінокислотна послідовність, що має щонайменше 90 95, 91 95, 92 У, 93 Уо, 94 Уо, 95 90, 96 95, 97 У», 98 95 або 99 95 ідентичності послідовності, містить заміни, вставки або делеції в порівнянні з контрольною послідовністю, але антитіло, що містить таку амінокислотну послідовність, зберігає здатність зв'язувати фактор О. У деяких варіантах здійснення в цілому від 1 до 10 амінокислот були замінені, вставлені або делетовані в послідовності ЕС ІЮО Мо:1. У деяких варіантах здійснення заміни, вставки і делеції мають місце в галузях за межами НМУКз5 (тобто, у

ЕК5). У деяких варіантах здійснення антитіло проти фактора О містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО Мо: 1. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора ОО (наприклад, антигензв'язувальних Фрагментів).

Антитіло проти фактора ОО може містити будь-яку прийнятну каркасну послідовність варіабельного домену, за умови, що антитіло зберігає здатність зв'язувати фактор 0.

Наприклад, у деяких варіантах здійснення антитіла проти фактора О за винаходом містять каркасну послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, що являє собою сполучення

МІ.4.1 р ї УНаа (дивися фігуру 3). У деяких варіантах здійснення антитіла проти фактора О за винаходом містять консенсусну каркасну послідовність важкого ланцюга підгрупи МІ! людини. У деяких варіантах здійснення антитіла проти фактора ОО за винаходом містять каркасну бо послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, що містить ЕК, що містить амінокислоти

1-25 з 5БЕО ІО Мо: 2, ЕК2, що містить амінокислоти 36-49 з 5ЕО ІЮ Мо: 2, ЕКЗ, що містить амінокислоти 67-98 з 5ЕО ІЮО Мо: 2 їі ЕК4, що містить амінокислоти 105-115 з БЕО ІЮ Мо: 2. В одному варіанті здійснення даних антитіл послідовність варіабельного домену важкого ланцюга містить заміну(и) у позиції 40 і/або 88 (нумерація Кара). В одному варіанті здійснення даних антитіл позиція 40 являє собою цистеїн (С) або аланін (А) і/або позиція 88 являє собою цистеїн (С) або аланін (А). У деяких варіантах здійснення антитіла проти фактора Ю за винаходом містять каркасну послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, що являє собою сполучення ЮОРК4А ії 2К2 (дивися фігуру 4). У деяких варіантах здійснення антитіла проти фактора 0 за винаходом містять консенсусную каркасну послідовність легкого ланцюга каппа І (кІ) людини. У деяких варіантах здійснення антитіла проти фактора О за винаходом містять каркасну послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, що містить ЕКТ, що містить амінокислоти 1-23 з БЕО ІЮ Мо: 1, ЕК2, що містить амінокислоти 35-49 з БЕО ІО Мо: 1, ЕКЗ, що містить амінокислоти 57-88 з БЕО ІЮ Мо: 1, і ЕК4, що містить амінокислоти 98-107 з БЕО ІЮ Мо: 1.

В одному варіанті здійснення даних антитіл каркасна послідовність варіабельного домену легкого ланцюга містить одну або більше замін у позиції 15, 43 і/або 104 (нумерація Кава). В одному варіанті здійснення даних антитіл позиція 15 являє собою цистеїн (С) або валін (М), позиція 43 являє собою цистеїн (С) або аланін (А), позиція 104 являє собою валін (М) або лейцин (3. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

Крім того, антитіло проти фактора О може містити будь-яку прийнятну послідовність константного домену, за умови, що антитіло зберігає здатність зв'язувати фактор 0. Наприклад, у деяких варіантах здійснення антитіла проти фактора О за винаходом містять щонайменше частину константного домену важкого ланцюга. В одному варіанті здійснення антитіла проти фактора О за винаходом містять константний домен важкого ланцюга або з одним, або із сполученням а, б, є, у або | важких ланцюгів. У залежності від амінокислотної послідовності константного домену їхніх важких ланцюгів (Сн), імуноглобуліни можуть бути віднесені до різних класів або ізотипів. Існує п'ять класів імуноглобулінів: Ід, Ід, Ід, Ід і (Ід з важкими ланцюгами, позначеними а, 6, є, у ії М, відповідно. Класи у і « додатково поділяються на підкласи на основі порівняно незначних розходжень у послідовності і функції Сн, наприклад, у людини

Зо експресуються наступні підкласи: Ід1, Ід2, ДЗ, 1д4, Ід1 і Ід2. В одному варіанті здійснення антитіла проти фактора ЮО за винаходом містять константний домен важкого ланцюга, який містить заміни на амінокислотних позиціях, що потрібним чином впливають на ефекторну функцію (наприклад, афінність зв'язування). В одному варіанті здійснення антитіла проти фактора О за винаходом містять константний домен важкого ланцюга, що містить заміни на амінокислотних позиціях, що не впливають на ефекторну функцію (наприклад, афінність зв'язування). В одному варіанті здійснення антитіла проти фактора О за винаходом містять константний домен важкого ланцюга Ід типу (наприклад, Ід, Ід2, ІдЗ або Ід4) і додатково містять заміну в позиції 114 (нумерація Кабраї; еквівалентно 118 у нумерації Е)О), 168 (нумерація Кара; еквівалентно 172 у нумерації Е)), 172 (нумерація Кабаї; еквівалентно 176 у нумерації ЕМ) і/або 228 (нумерація ЕШ). В одному варіанті здійснення антитіла проти фактора О за винаходом містять константний домен важкого ланцюга Ід типу (наприклад, Ід, Ід2, ІдЗ або Ід4) і додатково містять заміну в позиції 114, де позиція 114 являє собою цистеїн (С) або аланін (А), позиція 168 являє собою цистеїн (С) або аланін (А), позиція 172 являє собою цистеїн (С) або аланін (А) і/або позиція 228 являє собою пролін (Р), аргінін (К) або серин (5). В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

Крім того, наприклад, у деяких варіантах здійснення антитіла проти фактора О за винаходом містять щонайменше частину константного домену легкого ланцюга. В одному варіанті здійснення антитіла проти фактора О за винаходом містять константний домен легкого ланцюга

БО або з одного, або зі сполученням каппа або лямбда легких ланцюгів, оскільки легкий ланцюг будь-якого виду хребетних можна віднести до одного з двох чітко розрізнюваних типів, які називаються каппа і лямбда, на основі амінокислотних послідовностей їхній константних доменів. В одному варіанті здійснення антитіла проти фактора О за винаходом містять константний домен легкого ланцюга, що містить заміни на амінокислотних позиціях, що потрібним чином впливають на ефекторну функцію (наприклад, афінність зв'язування). В одному варіанті здійснення антитіла проти фактора О за винаходом містять константний домен легкого ланцюга, що містить заміни на амінокислотних позиціях, що не впливають на ефекторну функцію (наприклад, афінність зв'язування). В одному варіанті здійснення антитіла проти фактора О за винаходом містять константний домен легкого ланцюга типу каппа і додатково бо містять заміни в позиції 110, 144, 146 і/або 168 (нумерація Кава). В одному варіанті здійснення антитіла проти фактора О за винаходом містять константний домен легкого ланцюга типу каппа і додатково містять заміни в позиції 110, де 110 являє собою цистеїн (С) або валін (М), у позиції 144, де 144 являє собою цистеїн (С) або аланін (А), у позиції 146, де 146 являє собою ізолейцин (І) або валін (М) і/або в позиції 168, де 168 являє собою цистеїн (С) або серин (5). В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних Фрагментів). 2. Модифіковані антитіла проти фактора О

У даному документі винахід включає одержання і використання модифікованих антитіл проти фактора 0, наприклад, модифікованих гуманізованих антитіл проти фактора О і їхніх варіантів, а також їхніх фрагментів (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів). Типові методи одержання модифікованих антитіл описані більш докладно в наступних розділах.

Вихідне антитіло проти фактора О, включаючи гуманізоване антитіло проти фактора 0, можна модифікувати для створення модифікованих антитіл проти фактора 0 і їхніх варіантів. В одному варіанті здійснення дані модифіковані антитіла проти фактора 0О і їхні варіанти можуть мати поліпшеними в порівнянні з вихідним антитілом фізичними, хімічними, біологічними або властивостями гомогенністю. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В одному варіанті здійснення антитіло за даним винаходом містить один або більше амінокислотних змін (наприклад, замін) в одній або декількох з гіперваріабельних ділянок вихідного антитіла. Або альтернативно додатково у вихідне антитіло можна вносити одну або більше змін (наприклад, замін) залишків каркасної ділянки. Приклади залишків каркасної ділянки для модифікації включають ті, котрі безпосередньо нековалентно зв'язують антиген (Атії еї а!., (1986) бсіепсе, 233: 747-753), взаємодіють/впливають на конформацію СОЕК (Споїпіа еї а!. (1987) 9. Мої. Віої., 196: 901-917) і/або знаходяться в зоні контакту Мі-Мн (ЕР 239 40081). У деяких варіантах здійснення модифікація одного або більшої кількості таких залишків каркасної ділянки приводить до збільшення афінності зв'язування антитіла з антигеном. Наприклад, у даному варіанті здійснення винаходу можна змінювати від приблизно одного до приблизно 5 каркасних залишків. Приклади залишків каркасної або НУЕ ділянки для модифікації включають сайти, у яких модифікації приводять до утворення дезамідованих варіантів (наприклад,

Зо залишок(ки) аспарагіну (М або Авп), модифікований до аспартату (О або Азр), окислених варіантів (наприклад, залишок(ки) метіоніну (М або Мей і/або залишок(ки) триптофану (М/ або

Тгр), модифікований до сульфону або сульфоксиду), або піроглютаматних варіантів (наприклад, залишок(ки) глютаміну (0 або Сіп), модифікований до піроглютамату). Приклади залишків каркасної або ділянки НУК ділянки для модифікації включають потенційні сайти дезамідування (тобто, аспарагін (М або Азп)), сайти окислювання (тобто, метіонін (М або Ме) або триптофан (ММ або Тгр)), або сайти конверсії піроглютамата (тобто, глютамін (0 або сСіп)), у яких модифікація запобігає дезамідування і/або окислювання, і/або конверсію піроглютамата, відповідно. Для запобігання утворення дезамідованих варіантів аспарагін (М або Ахп) може бути мутований в аланін (А або Аїа), глютамін (0 або Сіп) або серин (5 або Зег). Для запобігання утворення окислених варіантів, метіонін (Ме) або триптофан (МУ або Тгр) може бути мутований у лейцин (І) або ізолейцин (І). Для запобігання утворення піроглютаматних варіантів, глютамін (О або Сіп) може бути мутований у глютамат (Е або Сіц). (Атрпей, б. еї аІ., Ріагіт. Віогеснпої., 9: 1-140 (1996)). Або альтернативно додатково, одна або більше змін (наприклад, замін) залишків каркасної ділянки можуть знаходитися в Ес-ділянці вихідного антитіла. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних Фрагментів).

В одному варіанті здійснення антитіло за даним винаходом містить такий варіант Ес-ділянки, що час напівжиття антитіла іп мімо збільшується або зменшується в порівнянні з вихідним антитілом або антитілом, що містить Ес-ділянку із природною послідовністю. В одному варіанті здійснення антитіло містить варіант Ес-ділянки, що збільшує або зменшує афінність зв'язування неонатального Ес-рецептора (ЕсКп) з антитілом (дивися М/О2000042072, повний зміст якого включено за допомогою посилання). Наприклад, таке антитіло може містити модифікацію амінокислот на будь-який одній або більшій кількості амінокислотних позицій 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, зб2, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 або 447 Ес-ділянки, де нумерація залишків у Ес-ділянці відповідає індексу ЄЮ по системі Кабаї. Такі поліпептидні варіанти зі зниженим зв'язуванням з ЕсКп можуть містити модифікацію амінокислот на будь-якій одній або більшій кількості амінокислотних позицій 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 або 447 Ес-ділянки, де нумерація залишків у Ес-ділянці відповідає індексу ЄЮ по бо системі Караї. Вищевказані поліпептидні варіанти можуть, альтернативно, демонструвати підвищене зв'язування з РсКп і містити модифікацію амінокислот на будь-якій одній або більшій кількості амінокислотних позицій 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 або 434 Ес-ділянки, де нумерація залишків у Ес-ділянці відповідає індексу ЄЮ по системі Кабаї. Наприклад, антитіло містить варіант Ес-ділянки, що зв'язується з підвищеним часом напівжиття іп мімо у порівнянні з вихідним антитілом або антитілом, що містить Ес-ділянку із природною послідовністю. Наприклад, антитіло містить варіант Ес-ділянки, що зв'язується з БсКп з підвищеної афінністю в порівнянні з вихідним антитілом або антитілом, що містить Ес-ділянку із природною послідовністю.

Афінність зв'язування ЕсКп можна вимірювати в такий спосіб:

Зв'язування антитіл проти ЕсКп людини за даним винаходом можна вивчати за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, наприклад, приладу ВіаСоге 3000. Людський ЕсКп зв'язують із сенсорним чіпом за допомогою набору для зв'язування через аміногрупи.

Наприклад, сенсорний чіп СМ5 можна активувати за допомогою ЕОС/МН5З протягом 7 хв. при 5 мкл/хв. Людський ЕсКп (100 мкг/мл) можна ін'єктувати протягом 30 сек. - 2 хв. при швидкості потоку 10 мкл/хв над поверхнею активованого чіпа, що дає остаточне число одиниць реакції зв'язування (КІ) від 100 до 200. Після кон'югації чіп зі зв'язаним ЕсКп можна блокувати ін'єкцією 35 мкл 1 М гідрохлориду етаноламіну при 5 мкл/хв.

Можна визначати зв'язування антитіл за даним винаходом з ЕсКп людини при рН 6,0 або рн 7,4. Рухливий буфер для експериментів по зв'язуванню являє собою РВ5 або з рН 6,0, або з рн 7,4, що містить 0,01 95 Р20 і 0,0295 азиду натрію. Антитіла за даним винаходом можна переводити в рухливий буфер або з рН 6,0, або з рН 7,4. В одному варіанті здійснення експерименти проводять при 25 "С. Для серії з рН 6,0 антитіла в концентраціях від 4 мкМ до 0,7

НМ пропускають потоком над чіпом, покритим ЕсКп, при 30 мкл/хв. протягом 4 хв., а потім дають можливість відокремитися від чіпа протягом 5 хв. Для серії з рН 7,4 антитіла в концентраціях від 12 мкМ до 100 нМ ін'єктують над чіпом, покритим ЕсКп, при 20 мкл/хв. протягом 1,5 хв., а потім вивільняють протягом 2 хв. Антитіла також пропускають потоком над некон'югованим стільником на сенсорному чіп, що дозволяє відняти фонове неспецифічне зв'язування зі зв'язування з чіпом, до якого приєднаний ЕсКп. Чіп можна регенерувати шляхом 30-секундного упорскування 0,1М Тріс рН 8,3 у проміжку між ін'єкціями. Рівноважне значення КИ для кожної

Зо ін'єкції можна реєструвати наприкінці кожної фази ін'єкції, ії константи дисоціації (Ко) можна потім розраховувати шляхом побудови графіка залежності рівноважних КИ від ін'єкційних концентрацій.

Один з корисних способів для одержання таких модифікованих антитіл і їхніх фрагментів (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів), а також їхніх варіантів, називається "аланін- скануючий мутагенез" (Сиппіпдайат апа М/еїї5 (1989) 5сіеєпсе 244: 1081-1085). У даній роботі один або більше залишків гіперваріабельної ділянки заміщають залишком(ами) аланіну або поліаланіну, щоб вплинути на взаємодію амінокислот з антигеном. Той залишок(ки) гіперваріабельної ділянки, що має функціональну чутливість до замін, потім уточнюють шляхом введення додаткових або інших мутацій на сайтах або для сайтів заміни. Таким чином, при тому, що сайт для введення варіації амінокислотної послідовності визначений, характер мутацій, власне кажучи, не обов'язково визначати заздалегідь. Для мутантів, отриманих таким способом, проводять скринінг на їхню біологічну активність (тобто, аналіз на афінність або зв'язування гемоліз), як описано в даному документі.

Як правило, починають з консервативної заміни, такої як представлено нижче під заголовком "переважні заміни". Якщо такі заміни приводять до зміни біологічної активності (наприклад, афінності зв'язування), то вносять більш істотні зміни, названі в наступній таблиці "типові заміни" або описані нижче в застосуванні до груп амінокислот, і проводять скринінг продуктів. Переважні заміни приведені нижче в таблиці.

Таблиця 1

Переважні заміни бус) 77777771 Трава

Ше() 11111111 Мем,ма, тебай, ре норлейцин.///////// Пе цец(Ю 77111111 |норлейцин,йе,мабтебай,рне 7 (Пе СС

ПЕТ НИ МС ОН ЕТО

Ще більш істотні модифікації біологічних властивостей або антитіл їхніх фрагментів (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів) здійснюють шляхом підбору замін, що значно відрізняються за своїм впливом на підтримку (а) структури кістяка поліпептиду в ділянці заміни, наприклад, у вигляді складчастої або спіральної конформації, (5) або заряду гідрофобності молекули на цільовому сайті, або (с) основного обсягу бічного ланцюга. Природні залишки поділяються на групи на основі загальних властивостей бічного ланцюга: (1) гідрофобні: норлейцин, пеї, аїа, маї, Іеим, Пе, (2) нейтральні гідрофільні: суз, зег, їйг, азп, діп, (3) кислі: азр, дім, (4) основні: Пі5, Іув, агод, (5) залишки, що впливають на орієнтацію ланцюга: ау, рго, і (6) ароматичні: ігр, їуг, рпе.

Неконсервативні заміни спричиняють заміну члена однієї з цих груп на члена іншої групи.

В іншому варіанті здійснення сайти, вибрані для модифікації, модифікують і модифікації з підвищеної афінністю зв'язування відбирають методом фагового дисплея.

Молекули нуклеїнових кислот кодуючі мутантні амінокислотні послідовності або модифіковані амінокислотні послідовності, одержують різними методами, відомими в даній галузі. Ці методи включають, але не обмежуються ними, олігонуклеотид-опосередкований (або сайт-спрямований) мутагенез, мутагенез за допомогою ПЛР і касетний мутагенез раніше створених варіантних або неваріантних версій вихідного антитіла. Одним з методів одержання мутантів або варіантів, або модифікованих амінокислотних послідовностей є сайт-спрямований мутагенез (дивися, наприклад, КипкКеї (1985) Ргос. Май. Асад. зсі. ОБА 82: 488).

У деяких варіантах здійснення в модифікованого антитіла буде тільки один замінений залишок у гіперваріабельній ділянці. В інших варіантах здійснення будуть замінені два або більше залишків гіперваріабельної ділянки вихідного антитіла, наприклад, від приблизно двох до приблизно десяти замін у гіперваріабельній ділянці. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

Зо Як правило, модифіковане антитіло має амінокислотну послідовність, що має щонайменше 75965 ідентичності або подібності амінокислотної послідовності (як зазначено вище в розділі "Визначення") з амінокислотною послідовністю варіабельного домену або важкого, або легкого ланцюга вихідного антитіла, більш переважно щонайменше 8095, більш переважно щонайменше 85 95, більш переважно щонайменше 90 95, і найбільше переважно щонайменше

95 95. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

Після одержання модифікованого антитіла або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента) визначають біологічну активність молекули в порівнянні з вихідним антитілом або його фрагментом (наприклад, антигензв'язуюючим фрагментом). Як відзначалося вище, це може включати визначення афінності зв'язування і/або інших біологічних активностей варіанта антитіла або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента). В одному варіанті здійснення винаходу створюють панель модифікованих антитіл або їхніх фрагментів (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів) і проводять її скринінг на афінність зв'язування антигену, такого як фактор Ю або його фрагмент. Одне або більше з мутантних антитіл або модифікованих антитіл, або їхніх фрагментів (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів), відібраних у результаті такого первісного скринінгу, необов'язково піддають одному або декільком додатковим аналізам біологічної активності, щоб підтвердити, що даний варіант(и) антитіла або його фрагменти (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти) дійсно є корисними, наприклад, для проведення досліджень.

Модифіковані антитіла проти фактора 0 або їхні фрагменти (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти), описані в даному документі, можуть бути піддані подальшим модифікаціям, часто в залежності від передбачуваного використання модифікованого антитіла або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента). Такі модифікації можуть включати подальша зміна амінокислотної послідовності, злиття з гетерологічним поліпептидом(ами) і/або ковалентні модифікації, такі як докладно описані нижче. Що стосується змін амінокислотної послідовності, типові модифікації докладно описані вище. Наприклад, будь-який залишок цистеїну, що не бере участь у підтримці правильної конформації модифікованого антитіла, також можна заміняти, як правило, серином для підвищення окисної стійкості молекули і запобігання аномальної перехресної зшивки. Навпаки, антитілу можна додавати цистеїновий зв'язок(и) для підвищення його стабільності (особливо в тому випадку, коли антитіло є фрагментом антитіла, таким як Ем- фрагмент). Інший тип амінокислотного мутанта має змінений характер глікозування. Це може бути досягнуте шляхом видалення однієї або декількох вуглеводних функціональних груп, що входять до складу антитіла, і/або додавання одного або більше сайтів глікозування, що відсутні

Зо в антитілі. Глікозування антитіл фрагментів або антитіл (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів), як правило, є або М-зв'язаним, або О-зв'язаним. М-зв'язане означає приєднання вуглеводної функціональної групи до бічного ланцюга залишку аспарагіну. Трипептидні послідовності аспарагін-Х-серин і аспарагін-Х-треонін, де Х є будь-якою амінокислотою за винятком проліну, є послідовностями розпізнавання для ферментативного приєднання вуглеводної функціональної групи до бічного ланцюга аспарагіну. Таким чином, наявність у поліпептиді кожної з цих трипептидних послідовностей створює потенційний сайт глікозування.

О-зв'язане глікозування означає приєднання одного з цукрів М-ацетилгалактозаміну, або галактози ксилози до гідроксіамінокислоти найчастіше серину або треоніну, хоча також можна використовувати 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин. Додавання сайтів глікозування в антитіло зручно здійснювати шляхом такої зміни послідовності амінокислот, щоб вона містила одну або більше з описаних вище трипептидних послідовностей (для М-зв'язаних сайтів глікозування).

Така зміна також можна здійснювати шляхом додавання або заміни на один або кілька залишків серина або треоніну в послідовності вихідного антитіла (для О-зв'язаних сайтів глікозування).

В одному варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора

О, отриманого з вихідного антитіла проти фактора ЮО за даною заявкою, де модифіковане антитіло проти фактора О містить амінокислотну послідовність такого вихідного антитіла проти фактора О за даною заявкою, де щонайменше на одній позиції (відповідно до нумерації по

Кара!) амінокислотної послідовності такого вихідного антитіла проти фактора О за даною заявкою має місце заміна одним або декількома з наступного: (а) амінокислота в позиції 33 легкого ланцюга являє собою І або І, (р) амінокислота в позиції 34 легкого ланцюга являє собою А або 0, (с) амінокислота в позиції 52 легкого ланцюга являє собою 5 або А, (8) амінокислота в позиції 104 легкого ланцюга являє собою У.

В одному прикладі винахід належить до фрагмента вказаного антитіла проти фактора Ю (наприклад, антигензв'язувального фрагмента).

О, отриманого з вихідного антитіла проти фактора ОО за даною заявкою, де модифікований варіант антитіла проти фактора О містить амінокислотну послідовність такого вихідного антитіла проти фактора О за даною заявкою, де щонайменше на одній позиції (відповідно до нумерації по Кара) амінокислотної послідовності такого вихідного антитіла проти фактора О за даною заявкою має місце заміна одним або декількома з наступного: (а) амінокислота в позиції 1 важкого ланцюга являє собою Е, (Б) амінокислота в позиції 99 важкого ланцюга являє собою А або С, або (с) амінокислота в позиції 100 важкого ланцюга являє собою А або 0.

Кара) амінокислотної послідовності такого вихідного антитіла проти фактора О за даною заявкою має місце заміна одним або декількома з наступного: (а) амінокислота в позиції 33 легкого ланцюга являє собою | або Ї, (р) амінокислота в позиції 34 легкого ланцюга являє собою А або 0, (с) амінокислота в позиції 52 легкого ланцюга являє собою 5 або А, (8) амінокислота в позиції 104 легкого ланцюга являє собою У, (є) амінокислота в позиції 1 важкого ланцюга являє собою Е, (Ї) амінокислота в позиції 99 важкого ланцюга являє собою А або СО, або (9) амінокислота в позиції 100 важкого ланцюга являє собою А або 0.

О, отриманого з вихідного антитіла проти фактора ЮО за даною заявкою, де модифіковане антитіло проти фактора О містить амінокислотну послідовність такого вихідного антитіла проти фактора О за даною заявкою, де щонайменше на двох позиціях (відповідно до нумерації по

Кара!) амінокислотної послідовності такого вихідного антитіла проти фактора О за даною заявкою має місце заміна одним або декількома з наступного: (а) амінокислота в позиції 33 легкого ланцюга являє собою | або Ї,

Зо (р) амінокислота в позиції 34 легкого ланцюга являє собою А або 0, (с) амінокислота в позиції 52 легкого ланцюга являє собою 5 або А, (8) амінокислота в позиції 104 легкого ланцюга являє собою У.

Кара) амінокислотної послідовності такого вихідного антитіла проти фактора О за даною заявкою має місце заміна одним або декількома з наступного: (а) амінокислота в позиції 1 важкого ланцюга являє собою Е, (Б) амінокислота в позиції 99 важкого ланцюга являє собою А або С, або (с) амінокислота в позиції 100 важкого ланцюга являє собою А або 0.

Кара) амінокислотної послідовності такого вихідного антитіла проти фактора О за даною заявкою має місце заміна одним або декількома з наступного: (а) амінокислота в позиції 33 легкого ланцюга являє собою І або І, (Б) амінокислота в позиції 34 легкого ланцюга являє собою А або 0, (с) амінокислота в позиції 52 легкого ланцюга являє собою 5 або А, (8) амінокислота в позиції 104 легкого ланцюга являє собою У, (є) амінокислота в позиції 1 важкого ланцюга являє собою Е, (І) амінокислота в позиції 99 важкого ланцюга являє собою А або С, або (9) амінокислота в позиції 100 важкого ланцюга являє собою А або 0.

В одному варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 60 О, отриманого з вихідного антитіла проти фактора ЮО за даною заявкою, де модифіковане антитіло проти фактора О містить амінокислотну послідовність такого вихідного антитіла проти фактора О за даною заявкою, де щонайменше на трьох позиціях (відповідно до нумерації по

Кара) амінокислотної послідовності такого вихідного антитіла проти фактора О за даною заявкою має місце заміна одним або декількома з наступного: (а) амінокислота в позиції 33 легкого ланцюга являє собою І або Її, (р) амінокислота в позиції 34 легкого ланцюга являє собою А або 0, (с) амінокислота в позиції 52 легкого ланцюга являє собою 5 або А, (8) амінокислота в позиції 104 легкого ланцюга являє собою У.

О, отриманого з вихідного антитіла проти фактора ЮО за даною заявкою, де модифіковане антитіло проти фактора О містить амінокислотну послідовність такого вихідного антитіла проти фактора О за даною заявкою, де щонайменше на трьох позиціях (відповідно до нумерації по

Кара)ю) амінокислотної послідовності такого вихідного антитіла проти фактора О за даною заявкою має місце заміна одним або декількома з наступного: (а) амінокислота в позиції 1 важкого ланцюга являє собою Е, (Б) амінокислота в позиції 99 важкого ланцюга являє собою А або С, або (с) амінокислота в позиції 100 важкого ланцюга являє собою А або 0.

В одному прикладі винахід належить до фрагмента вказаного антитіла проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язувального фрагмента).

Кара) амінокислотної послідовності такого вихідного антитіла проти фактора ЮО за даною заявкою має місце заміна одним або декількома з наступного: (а) амінокислота в позиції 33 легкого ланцюга являє собою | або Ї, (Б) амінокислота в позиції 34 легкого ланцюга являє собою А або 0,

Зо (с) амінокислота в позиції 52 легкого ланцюга являє собою 5 або А, (8) амінокислота в позиції 104 легкого ланцюга являє собою У, (є) амінокислота в позиції 1 важкого ланцюга являє собою Е, (І) амінокислота в позиції 99 важкого ланцюга являє собою А або С), або (9) амінокислота в позиції 100 важкого ланцюга являє собою А або 0.

В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора 0, який містить

НМЕК5 легких ланцюгів контрольного антитіла, де вказане антитіло проти фактора О додатково містить заміну на одній або декількох позиціях вказаного контрольного антитіла, де вказане контрольне антитіло містить НМК-1 легкого ланцюга, що містить ІТЄТОІЮОЮОММ (ЗЕО ІЮ Мо: 30),

НМВ-2 легкого ланцюга, що містить СОМТІКР (ЗЕО ІЮО Ме: 35), ії НМАК-3 легкого ланцюга, що містить ГОБОБІ РУТ (5ЕБО ІО Мо: 38), і вказана заміна являє собою одне або декілька з наступного: (а) амінокислота в позиції 33 легкого ланцюга являє собою І. або Ї, (р) амінокислота в позиції 34 легкого ланцюга являє собою А або 0, (с) амінокислота в позиції 52 легкого ланцюга являє собою 5 або А, (8) амінокислота в позиції 104 легкого ланцюга являє собою У, (є) амінокислота в позиції 1 важкого ланцюга являє собою Е, (Ї) амінокислота в позиції 99 важкого ланцюга являє собою А або СО, або (9) амінокислота в позиції 100 важкого ланцюга являє собою А або 0.

НМЕК5 важких ланцюгів контрольного антитіла, де вказане антитіло проти фактора О додатково містить заміну на одній або декількох позиціях вказаного контрольного антитіла, де вказане контрольне антитіло містить НМК-1 важкого ланцюга, що містить ЗУТЕТММОММ (ЗЕО ІЮ Мо: 39),

НМУВ-2 важкого ланцюга, що містить УЛІМГУТЗЕТТМАООЕКО (5ЕБЕО ІЮ Мо: 40), і НМК-3 важкого ланцюга, що містить ЕССМММ (5ЕБО ІЮ Мо: 41), і де вказана заміна являє собою одне або декілька з наступного: 60 (а) амінокислота в позиції 33 легкого ланцюга являє собою І або І,

(р) амінокислота в позиції 34 легкого ланцюга являє собою А або 0, (с) амінокислота в позиції 52 легкого ланцюга являє собою 5 або А, (8) амінокислота в позиції 104 легкого ланцюга являє собою У" (є) амінокислота в позиції 1 важкого ланцюга являє собою Е, (Ї) амінокислота в позиції 99 важкого ланцюга являє собою А або СО, або (9) амінокислота в позиції 100 важкого ланцюга являє собою А або 0).

НМР легких ланцюгів і НМК5 важких ланцюгів контрольного антитіла, де вказане антитіло проти фактора О додатково містить заміну в одній або декількох позиціях вказаного контрольного антитіла, де вказане контрольне антитіло містить НМК-1 легкого ланцюга, що містить

ІТ5ТІОСОММ (5ЕО ІЮ Мо: 30), НМК-2 легкого ланцюга, що містить СОМТІ КР (5ЕО ІЮ Мо: 35), і

НМА-3 легкого ланцюга, що містить ГО5ОБІ РУТ (ЗБО ІЮ Ме: 38), а також НМК-1 важкого ланцюга, що містить СУТЕТММСОММ (5ЕБО ІО Ме: 39), НМК-2 важкого ланцюга, що містить

УМІМТУТОЕТТУМАВОРКО (ЗЕО ІЮ Мо: 40), і НМА-3 важкого ланцюга, що містить ЕССМУММ (5ЕО ІЮ

Мо: 41), і де вказана заміна являє собою одне або декілька з наступного: (а) амінокислота в позиції 33 легкого ланцюга являє собою | або Ї, (р) амінокислота в позиції 34 легкого ланцюга являє собою А або 0, (с) амінокислота в позиції 52 легкого ланцюга являє собою 5 або А, (8) амінокислота в позиції 104 легкого ланцюга являє собою У, (є) амінокислота в позиції 1 важкого ланцюга являє собою Е, (Ї) амінокислота в позиції 99 важкого ланцюга являє собою А або СО, або (9) амінокислота в позиції 100 важкого ланцюга являє собою А або 0.

В одному аспекті винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить: (а) щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НМК5, вибраних з: () НМЕА-НІ, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95, 91 95, 92 95, 9396, 94 95, 9595, 9695, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю, вибраною з ЗЕО ІЮ Мо: 39, (її) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95, 91 Фо, 92 9о, 9396, 94 95, 9595, 9695, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю, вибраною з ЗЕО ІЮ Мо: 40, (ії) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95, 91 Фо, 92 9о, 93 96, 94 95, 9595, 9695, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю, вибраною з ЗЕО ІЮО Мо: 41, ЗЕО ІЮ Мо: 42, БЕО ІЮ Мо: 43, 5ЕО ІО Мо: 44 і ЗЕО ІЮ

Мо: 45, (м) НМВА-І1, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95, 91 Фо, 92 9о, 93 96, 94 95, 9595, 9695, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю, вибраною з ЗЕО ІЮО Мо: 30, ЗЕО ІЮ Мо: 31, 5ЕО ІЮ Ме: 32, 5ЕО ІО Мо: 33 і ЗЕО ІЮ

Мо: 34, (м) НМА-1І2, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95, 91 Фо, 92 9о, 9396, 94 95, 9595, 9695, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю, вибраною з ЗЕО ІЮО Мо: 35, БЕО ІЮ Мо: 36 і 5ЕО ІЮ Мо: 37, і (мі) НМА-І-3, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95, 91 Фо, 92 9о, 93 96, 94 95, 9595, 9695, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю, вибраною з ЗЕО ІО Мо: 38, або (б) щонайменше один варіант НМК, де даний варіант НМК містить модифікацію щонайменше одного залишку послідовності, представленої в ЗЕО ІЮО Мо: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 або 38.

У деяких варіантах здійснення НМЕК, що має амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 90 95, 91 95, 92 95, 93 90, 94 95, 95 95, 96 95, 97 Уо, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовності, містить заміни, вставки або делеції в порівнянні з контрольною послідовністю, однак антитіло, що містить дану амінокислотну послідовність, зберігає здатність зв'язуватися з фактором 0. У деяких варіантах здійснення в цілому від 1 до 10 амінокислот були замінені, бо вставлені або вилучені в контрольній послідовності, вибраній з групи, що складається з ЗЕО ІЮ

Мо: 39, БЕО ІЮО Ме: 40, 5ЕО ІО Мо: 41, 5ЕО ІО Мо: 42, 5ЕО ІЮО Мо: 43, 5БЕО ІЮО Мо: 44, 5ЕО ІЮО Ме: 45,

ЗЕО ІЮО Мо: 30, 5ЕО ІЮ Мо: 31, 5ЕО ІЮО Мо: 32, 5ЕО ІЮ Мо: 33, 5ЕО ІЮ Мо: 34, БЕО ІО Мо: 35, БЕО ІЮ

Мо: 36, БЕО ІЮ Ме: 37 і 5ЕО ІЮ Мо: 38.

В одному аспекті винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить: (а) щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість НУК, вибраних з: () НМА-НІ, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з БЕО ІЮ Мо: 39, (ії) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 40, (її) НУВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮ Мо: 41, БЕО ІЮ Мо: 42, ЗЕО ІО Мо: 43, БЕО ІО Мо: 44 ії БЕО ІЮО Мо: 45, (м) НУВ-І1, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮ Мо: 30, ЗЕО ІЮ Мо: 31, 5ЕО ІЮ Ме: 32, БЕО ІЮ Мо: 33 і 5ЕО ІЮ Мо: 34, (м) НУВ-1І2, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з БЕО ІО Мо: 35, ЗЕО ІЮ Мо: 36 і 5ЕО ІЮ Ме: 37, і (мі) НУВ-І3, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮ Мо: 38, або (б) щонайменше один варіант НМЕК, де даний варіант НМК містить модифікацію щонайменше одного залишку послідовності, представленої в ЗЕО ІЮ Мо: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 або 38.

О, який містить НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО Мо: 39. В іншому варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО Мо: 40. В іншому варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить НМА-

НЗ, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІО Ме: 41. В іншому варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ Мо: 30. В іншому варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить НМК-12, що містить амінокислотну послідовність БХЕО ІЮ Мо: 35. В іншому варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО Мо: 38. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних Фрагментів).

В іншому варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора

О, який містить НМЕ-НІ1, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ Мо: 39, НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО Мо: 40, Її НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 41. В одному прикладі винахід належить до фрагмента вказаного антитіла проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язувального фрагмента).

О, який містить НМК-11, що містить амінокислотну послідовність ЕС ІЮО Мо: 30, НМК-12, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО Мо: 35, ії НМК-ІЗ3, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 38. В одному прикладі винахід належить до фрагмента вказаного антитіла проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язувального фрагмента).

О, який містить НМЕ-НІ1, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ Мо: 39, НМВА-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІО Мо: 40, НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕС ІЮО Мо: 41, НМК-І11, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ Мо: 30,

НМВ-12, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО Мо: 35, і НМК-ІЇ3, що містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ Мо: 38. В одному прикладі винахід належить до фрагмента вказаного антитіла проти фактора О (наприклад, антигензв'язувального фрагмента).

В одному аспекті винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 90 95, 91 95, 92 95, 93 90, 94 95, 95 95, 96 95, 97 Уо, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, що складається з 5ЕО ІЮ Мо: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 і 29. У деяких варіантах здійснення амінокислотна послідовність, що має щонайменше 90 95, 91 Фо, 92 9», 93 о, 94 90, 95 У, 96 Фо, 97 Уо, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовності, містить заміни, вставки або делеції в порівнянні з контрольною послідовністю, однак антитіло, що містить дану амінокислотну послідовність, зберігає здатність зв'язуватися з фактором 0. У деяких варіантах здійснення в цілому від 1 до 10 амінокислот були 60 замінені, вставлені або вилучені в послідовності, вибраної з групи, що складається з 5ЕО ІЮ Мо:

18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 і 29. У деяких варіантах здійснення заміни, вставки або делеції мають місце в ділянках за межами НМК (тобто, у ЕК). У деяких варіантах здійснення модифіковане антитіло проти фактора ЮО містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з ЗЕО ІЮ Мо: 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 і 29. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В одному аспекті винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 90 95, 91 95, 92 95, 93 90, 94 95, 95 95, 96 95, 97 Уо, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, що складається з 5ЕО ІЮО Мо: б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ії 17. У деяких варіантах здійснення амінокислотна послідовність, що має щонайменше 90 95, 91 Фо, 92 9», 93 о, 94 90, 95 У, 96 Фо, 97 Уо, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовності, містить заміни, вставки або делеції в порівнянні з контрольною послідовністю, однак антитіло, що містить дану амінокислотну послідовність, зберігає здатність зв'язуватися з фактором 0. У деяких варіантах здійснення в цілому від 1 до 10 амінокислот були замінені, вставлені або вилучені в послідовності, вибраної з групи, що складається з 5ЕО ІЮ Мо: б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 і 17. У деяких варіантах здійснення заміни, вставки або делеції мають місце в ділянках за межами НМР (тобто, у ЕК). У деяких варіантах здійснення модифіковане антитіло проти фактора Ю містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з ЗЕО ІО Мо: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 і 17. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО Мо: 18. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО Ме: 6. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ Мо: 18, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ Ме: 6. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ Мо: 19. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ Мо: 7.

Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ Мо: 19, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО Ме: 7. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ Мо: 20.

Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ Мо: 8. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ Мо: 20, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО Мо: 8.

Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО Мо: 21. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО Ме: 9. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить зЕО ІЮ Мо: 21, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ Ме: 9. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ Мо: 22. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО Мо: 10.

Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ХЕО ІЮ Ме: 22, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ Мо: 10. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ Мо: 23.

Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить 5ХЕО ІЮ Мо: 11. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮО Мо: 23, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ

Мо: 11. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО Ме: 24. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить варіабельний домен легкого 60 ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ Мо: 12. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ Мо: 24, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить 5ХЕО ІЮ Мо: 12. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ Мо: 25. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ХЕО ІЮ Мо: 13.

Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ХЕО ІЮ Мо: 25, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ Мо: 13. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ Мо: 26.

Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІО Мо: 14. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІО Мо: 26, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ

Мо: 14. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО Ме: 27. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ Мо: 15. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить зЕО ІЮ Мо: 27, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ХЕО ІЮ Мо: 15. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ Мо: 28. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІО Мо: 16.

Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить ХЕО ІЮ Мо: 28, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ Мо: 16. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ Мо: 29.

Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗХЕО ІЮ Ме: 17. Наприклад, винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, який містить варіабельний домен важкого

Зо ланцюга, що містить 5ЕО ІО Мо: 29, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ

Мо: 17. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В одному варіанті здійснення винахід належить до поліпептиду, що містить наступну амінокислотну послідовність:

Х1МОІ МОБОРЕЇ ККРОАБУКУЗСКАБИУТЕТММаММУУМВОАРИССГ ЕМ МОУМІМТ МТИаЕТТМА

РОРКОаВЕМЕ5І ОТ5У5ТАМІ 0ОІ55І КАЕОТАМУУСЕВЕСИУХ2ХЗУУМСОСТІ МТУ55 (ЗЕО ІЮ Мо: 74), у якій Хі являє собою О або Е, Хо являє собою М, А або 0, і Хз являє собою М, А або 0. В одному варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, який містить наступну амінокислотну послідовність:

РОРКОаВЕМЕ5І ОТ5У5ТАМІ 0ОІ55І КАЕОТАМУУСЕВЕСИУХ2ХЗУУСОСТІ МТМ55 (ЗЕО ІЮ Мо: 74), у якій Хі являє собою О або Е, Хо являє собою М, А або 0, і Хз являє собою М, А або 0. В одному прикладі винахід належить до фрагмента зазначеного поліпептиду.

ТОМТО5РББІ БАБМОаОГМТІТСІТ5ТОІ00ОХАХБМ МООКРОКМРКИИ ІС ХОТІ ВРОМРОВЕЗО

ЗабБатТОгІ ТІВ ОРЕЮМАТУУСІ О5051 І РУТЕСОСТКХ7ЕІК (ЗЕБО ІО Мо: 73), у якій Ха. являє собою М, Ї. або І, Хо являє собою М, А або СО), Хє являє собою М, 5 або А, і Х7 являє собою І або

М. В одному варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора

Ор, який містить поліпептид, що містить наступну амінокислотну послідовність:

ЗО5ОТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕОМАТУУСІ О5ОБІ РУТЕООСТКХ7БІК (5ЕБО ІО Мо: 73), у якій Ха. являє собою М, Ї. або І, Хо являє собою М, А або О, Хє являє собою М, 5 або А, і Х7 являє собою І або

М. В одному прикладі винахід належить до фрагмента зазначеного поліпептиду.

В одному варіанті здійснення винахід належить до поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що включає ЗЕО ІЮ Мо: 18, БЕО ІЮО Мо: 19, 5ЕО ІЮ Мо: 20, 5ЕО ІЮ

Мо: 21, ЗЕО ІО Ме: 22, 5ЕО ІО Мо: 23, 5ЕО ІО Мо: 24, 5ЕО ІЮО Мо: 25, 5ЕО ІЮО Мо: 26, 5ЕО ІЮО Ме: 27,

ЗЕО ІЮО Мо: 28 і 5ЕО ІО Мо: 29. В іншому варіанті здійснення винахід належить до поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що включає 5ЕО ІЮ Мо: 6, ЗЕО ІЮ Мо: бо 7, ЗЕО ІЮ Мо: 8, 5ЕО ІЮ Мо: 9, БЕО ІЮ Мо: 10, 5ЕО ІЮ Мо: 11, 5ЕО ІЮ Мо: 12, 5ЕО ІО Мо: 13, 5ЕО І ко)

Мо: 14, 5ЕО ІО Мо: 15, 5ЕО ІЮ Мо: 16 і 5ЕО ІЮО Мо: 17. В одному прикладі винахід належить до фрагмента зазначеного поліпептиду.

В одному аспекті винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, де домен легкого ланцюга містить послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 47. В іншому аспекті винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, де домен важкого ланцюга містить послідовність

ЗЕО ІЮО Мо: 54. В одному аспекті винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора

О, де домен легкого ланцюга містить послідовність 5ЕО ІО Мо: 61. В іншому аспекті винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, де домен важкого ланцюга містить послідовність 5ЕО ІЮ Мех63. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В одному аспекті винахід належить до поліпептиду, що містить послідовність ЖЕО ІЮ Мо: 47.

В іншому аспекті винахід належить до поліпептиду, що містить послідовність зЕО ІО Мо: 54. В одному аспекті винахід належить до поліпептиду, що містить послідовність ЕС ІЮ Мо: 61. В іншому аспекті винахід належить до поліпептиду, що містить послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 63. В одному прикладі винахід належить до фрагмента зазначеного поліпептиду.

В одному аспекті винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора Ю Мо 111, де варіабельний домен легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ Ме: 6,

ЗЕО ІО Мо: 7, БЕО ІЮ Мо: 8, 5ЕО ІЮ Мо: 9, 5ЕО ІЮ Мо: 10, 5ЕО ІЮ Мо: 11, ЗЕО ІЮ Мо: 12, ЗЕО ІЮО Мо: 13, 5ЕО ІО Мо: 14, 5ЕО ІЮО Мо: 15, 5БО ІЮО Мо: 16 ії 5ЕО ІЮО Мо: 17. В одному прикладі винахід належить до фрагмента вказаного антитіла проти фактора О (наприклад, антигензв'язувального фрагмента).

В одному аспекті винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора Ю Мо 111, де варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮО Мо: 18, 5ЕО ІЮО Мо: 19,

ЗЕО ПО Мо: 20, 5ЕБО ІЮО Мо: 21, БЕО ІЮ Ме: 22, 5ЕО ІО Мо: 23, 5ЕО ІО Ме: 24, БЕО ІЮО Ме: 25, 5ЕО ІЮ

Мо: 26, 5ЕО ІЮ Ме: 27, 5ЕО ІЮ Мо: 28 і 5ЕО ІЮО Мо: 29. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В одному аспекті винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, що

Зо походить з гуманізованого антитіла проти фактора О Ко 111, де домен легкого ланцюга містить послідовність ЗЕО ІЮ Мо: 47. В іншому аспекті винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора О Мо 111, де домен важкого ланцюга містить послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 54. В одному аспекті винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора ОО, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора О Мо 111, де домен легкого ланцюга містить послідовність 562 ІЮО Мо: 61. В іншому аспекті винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора О Мо 111, де домен важкого ланцюга містить послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 63. В одному прикладі винахід належить до фрагмента вказаного антитіла проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язувального фрагмента).

В одному аспекті винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора Ю Мо 111, де варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність ЗЕО ІЮ Мо: 6 і варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність БЕО ІЮО Мо: 18. В одному варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора О Мо 111, де варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність 5ЕО ІО Мо: 7 і варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 19. В іншому варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора О Мо 111, де варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність ЗЕО ІЮ

Мо: 8 і варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність 5ЕО ІЮ Мо: 20. В іншому варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора Ю Мо 111, де варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність ЗЕО ІЮ Мо: 9 і варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність БЗЕО ІЮ Ме: 21. В іншому варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора О Мо 111, де варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність зЕО ІЮ Мо: 10 і варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність 5ЕО ІЮО Мо: 22. В іншому варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора О Мо 111, де варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність ЗЕО ІЮ

Мо: 11 ї варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність ЗЕО ІЮ Мо: 23. В іншому бо варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора Ю Мо 111, де варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність ЗЕО ІЮ Мо: 12 і варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність БХЕО ІЮ Ме: 24. В іншому варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора О Мо 111, де варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність «ЕС ІЮ Мо: 13 і варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 25. В іншому варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора О Мо 111, де варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність ЗЕО ІЮ

Мо: 14 і варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність 5ЕО ІЮ Мо: 26. В іншому варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора О, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора Ю Мо 111, де варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність 5ЕО ІЮ Мо: 15 і варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність БЗЕО ІЮ Ме: 27. В іншому варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора О Мо 111, де варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність зЕО ІЮ Мо: 16 і варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність 5ЕО ІО Мо: 28. В іншому варіанті здійснення винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора О Мо 111, де варіабельний домен легкого ланцюга містить послідовність ЗЕО ІЮ

Мо: 17 і варіабельний домен важкого ланцюга містить послідовність 5ЕО ІЮО Мо: 29. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних Фрагментів).

В одному аспекті винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора О Ко 111, де домен легкого ланцюга містить послідовність ЕС ІЮО Мо: 47 і домен важкого ланцюга містить послідовність БЕО ІЮ Мо: 54. В одному аспекті винахід належить до модифікованого антитіла проти фактора 0, що походить з гуманізованого антитіла проти фактора ЮО Мо 111, де домен легкого ланцюга містить послідовність зЕО ІЮ Мо: 61 і домен важкого ланцюга містить послідовність зЕО ІЮ Мо: 63. 3. Афінність і біологічна активність антитіл проти фактора Ю

У даному документі винахід включає антитіла і їхні варіанти або їхні фрагменти (наприклад,

Зо антигензв'язувальні фрагменти), що мають характеристики, визначені в даному документі як бажані для антитіла проти фактора 0. Антитіла і їхні варіанти або їхні фрагменти (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти), що мають характеристики, визначені в даному документі як бажані для антитіла проти фактора О, можна піддавати скринінгу на інгібіторну біологічну активність, наприклад, іп міго або іп мімо, або шляхом вимірювання афінності зв'язування. а. Афінність

Щоб визначити, чи зв'язується антитіло проти фактора 0, а також його варіанти або його фрагменти (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти) з тим же епітопом людського фактора

О, з яким зв'язується цікавляче антитіло (наприклад, ті антитіла, які антагоністичні активності фактора 0), можна проводити епітоп-перехресний конкурентний аналіз (Апіібодієв5, А Гарогаїогу

Мапиаї, Соїй 5ргіпд Нагрог І арогафогу, Ей Нагіоу апа Вамід І апе (1988)). Альтернативно можна проводити квартирування епітопів, щоб визначити, чи зв'язується антитіло проти фактора О з цікавлячим епітопом (Спатре еї аї., У. Віої. Спет., 270: 1388-1394 (1995). Афінності антитіл, наприклад, для людського фактора Ю можна визначати, використовуючи стандартні методи, включаючи ті, що описані в прикладі 3.

В одному аспекті винахід належить до антитіл проти фактора 0 або варіантів даних антитіл, або їхніх фрагментів (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів), що конкурують з антитілом миші проти фактора О і/або гуманізованим антитілом проти фактора О клону Мо 111, і/або антитілом, що містить послідовності варіабельного домену або НМК гуманізованого антитіла проти фактора О клону Мо 111. Також запропоновані антитіла проти фактора О або їхні варіанти, або їхні фрагменти (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти), що зв'язуються з тим же епітопом, що й антитіло миші проти фактора О і/або гуманізоване антитіло проти фактора Ю клону Мо 111, (або антитіло, що містить послідовності варіабельного домену або НУК гуманізованого антитіла проти фактора О клону Мо 111.

В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому моновалентна афінність антитіла до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Еар-фрагмента до фактора 0) нижча, наприклад, щонайменше в 1-2 рази нижче, ніж моновалентна афінність химерного антитіла (наприклад, афінність химерного антитіла у вигляді Гарб-фрагмента до фактора О), який містить той, що складається з або складається в основному з варіабельного домену легкого ланцюга і варіабельного домену важкого ланцюга антитіла миші проти фактора Ю. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому бівалентна афінність антитіла до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді (Яд до фактора О) нижча, наприклад, щонайменше в 1-2 рази нижча, ніж бівалентна афінність химерного антитіла (наприклад, афінність химерного антитіла у вигляді Ід до фактора 0), який містить, що складається з або складається в основному з варіабельного домену легкого ланцюга і варіабельного домену важкого ланцюга антитіла миші проти фактора

О. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому моновалентна афінність антитіла до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Гар-фрагмента до фактора 0) вища, наприклад, щонайменше в 1-2 рази вища, ніж моновалентна афінність химерного антитіла (наприклад, афінність химерного антитіла у вигляді Баб-фрагмента до фактора 0), який містить, що складається з або складається в основному з варіабельного домену легкого ланцюга і варіабельного домену важкого ланцюга антитіла миші проти фактора Ю. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому бівалентна афінність антитіла до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Яд до фактора Ю) вища, наприклад, щонайменше в 1-2 рази вища, ніж бівалентна афінність химерного антитіла (наприклад, афінність химерного антитіла у вигляді Ід до фактора 0), який містить, що складається з або складається в основному з варіабельного домену легкого ланцюга і варіабельного домену важкого ланцюга антитіла миші проти фактора

О. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора 0 (наприклад, афінність антитіла у вигляді Еар-фрагмента до фактора 0) складає 20 нМ (20х10-

Зо М) або краще. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора Ю (наприклад, афінність антитіла у вигляді Еар-фрагмента до фактора 0) складає 10 нМ (10х10-

М) або краще. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора 0 або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора Ю (наприклад, афінність антитіла у вигляді ГЕар-фрагмента до фактора 0) складає 1,0 нМ (1,0х10-

М) або краще. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора Ю (наприклад, афінність антитіла у вигляді Гар-фрагмента до фактора 0) складає 0,5 нМ (0,5х10-

М) або краще. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора 0 або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора Ю (наприклад, афінність антитіла у вигляді Еар-фрагмента до фактора 0) складає 1,0 пМ (1,0х10- 1Т2М) або краще. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора Ю або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора 0 (наприклад, афінність антитіла у вигляді Еар-фрагмента до фактора 0) складає 0,5

ПМ (0,5х1072М) або краще. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Ід до фактора 0) складає 10,0 нМ (10,0х102М) або краще. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора Ю або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Ід до фактора 0) складає 5,0 нМ (5,0х1029М) або краще. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Ід до фактора 0) складає 1,0 нМ (1,0х1029М) або краще. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Дд до фактора 0) складає 0,5 нМ (0,5х109М) або краще. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного бо антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора О (наприклад,

афінність антитіла у вигляді Ід до фактора О) складає 5,0 пМ (5,0х1072М) або краще. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Ід до фактора 0) складає 2,0 пМ (2,0х1072М) або краще. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора ОО або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Ід до фактора 0) складає 1,0 пМ (1,0х10-2М) або краще. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Ід до фактора 0) складає 0,5 пМ (0,5х1072М) або краще. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних Фрагментів).

В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора 0 (наприклад, афінність антитіла у вигляді Еар-фрагмента до фактора О) складає від 0,5 мМ (0,5х105М) до 0,5 пМм (0,5х1072М). В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора 0 або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Гар-фрагмента до фактора 0) складає від 15 нМ (15х109М) до 0,1 нМ (0,1х109М). В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора 0 або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Еар- фрагмента до фактора 0) складає від 5,5 НМ (5,5х109М) до 1 нМ (1х109М). В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Гар-фрагмента до фактора 0) складає від 0,5 пМ (0,5х10-2М) до 2 пМ (2х10- 1Т2М). В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора Ю (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Ід до фактора 0) складає від 0,5 мМ (0,5х102М) до 0,5 пМ (0,5х10- 12М). В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Ід до фактора І) складає від 10 нМ (10х102М) до 0,05 нм (0,05х10-

ЗМ). В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Ід до фактора 0) складає від 5,5 НМ (5,5х109М) до 1 нм (1х109М).

В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Ід до фактора 0) складає від 0,5 пМ (0,5х1072М) до 2 пМ (2х1072М).

В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора 0 (наприклад, афінність антитіла у вигляді Рар-фрагмента до фактора 0) складає приблизно 1,4

ПМ (1,4х1072М). В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Я до фактора О) складає приблизно 1,1 пМ (1,1х10- 12М). В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора 0 або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора 0 (наприклад, афінність антитіла у вигляді Еар-фрагмента до фактора 2) складає приблизно 0,19

НМ (0,19х109М). В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора Ю або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора Ю (наприклад, афінність антитіла у вигляді Ід до фактора 0) складає приблизно 0,08 нМ (0,08х10-

ЗМ). В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора 0 (наприклад, афінність антитіла у вигляді Гар-фрагмента до фактора І) складає приблизно 12,3

НМ (12,3х102М). В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора Ю або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора Ю (наприклад, афінність антитіла у вигляді Ід до фактора 0) складає приблизно 9,0 нм (9,0х102М).

В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора 0 (наприклад, афінність антитіла у вигляді Еаб-фрагмента до фактора І) складає приблизно 1,4

ПМ (1,4х1072М) 0,5. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора р або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора р (наприклад, афінність антитіла у вигляді Ід до фактора 0) складає приблизно 1,1 пМ (1,1х10- 12М)20,6. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Гар-фрагмента до фактора І) складає приблизно 0,19

НМ (0,19х102М)2-0,01. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора 0 або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора 0 (наприклад, афінність антитіла у вигляді Ід до фактора 0) складає приблизно 0,08

НМ (0,08х102М)20,01. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора 0 або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Гар-фрагмента до фактора 0) складає приблизно 12,3 нМ (12,3х109М)22. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора О або варіанту даного антитіла, у якому афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора ОО (наприклад, афінність антитіла у вигляді (Д до фактора 0) складає приблизно 9,0 нМ (9,0х109М) 21. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В іншому варіанті здійснення антитіло проти фактора О або варіант даного антитіла може мати афінність у його моновалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Гар-фрагмента до фактора Ю) приблизно 1,4 пМ (1,4х1072М)-2. В іншому варіанті здійснення антитіло проти фактора О або варіант даного антитіла може мати афінність у його бівалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Ід до фактора 0) приблизно 1,1 пМ (1,1х1072М)22. В іншому варіанті здійснення антитіло проти фактора О або варіант даного антитіла може мати афінність у його моновалентній формі до фактора 0

Зо (наприклад, афінність антитіла у вигляді Габ-фрагмента до фактора Б) приблизно 0,19 нм (0,19х109М)-2. В іншому варіанті здійснення антитіло проти фактора Ю або варіант даного антитіла може мати афінність у його бівалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Ід до фактора Ю) приблизно 0,08 нМ (0,08х109М)ж2. В іншому варіанті здійснення антитіло проти фактора О або варіант даного антитіла може мати афінність у його моновалентній формі до фактора О (наприклад, афінність антитіла у вигляді Рар-фрагмента до фактора 0) приблизно 12,3 нМ (12,3х109М)ж22. В іншому варіанті здійснення антитіло проти фактора ОО або варіант даного антитіла може мати афінність у його бівалентній формі до фактора 0 (наприклад, афінність антитіла у вигляді Ід до фактора 0) приблизно 9,0 нМ (9,0х10:- 9М)«22. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора Ю (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

Як добре відомо в даній галузі, афінність зв'язування ліганду з його рецептором можна визначати за допомогою кожного з множини різноманітних аналізів і виражати у вигляді різних кількісних значень. Відповідно, в одному варіанті здійснення афінність зв'язування виражена у вигляді значень Ко і відбиває власну афінність зв'язування (наприклад, з мінімізованими ефектами авідності). У більшості випадків і переважно афінність зв'язування вимірюють іп міїго або в безклітинному, або в зв'язаному з клітинами оточенні. Як описано більш докладно в даному документі, кратне розходження в афінності зв'язування можна кількісно визначати у вигляді співвідношення значення афінності моновалентного зв'язування гуманізованого антитіла (наприклад, у формі Еаб) і значення афінності моновалентного зв'язування контрольного/порівняльного антитіла (наприклад, у формі Раб) (наприклад, антитіла миші, що містить донорські послідовності гіперваріабельної ділянки), для якого значення афінності зв'язування визначали в аналогічних умовах аналізу. Таким чином, в одному варіанті здійснення кратне розходження в афінності зв'язування визначають у вигляді співвідношення значень Ко гуманізованого антитіла у формі Раб ї зазначеного контрольного/порівняльного ЕРабр-антитіла.

Наприклад, в одному варіанті здійснення, якщо антитіло за винаходом (А) має афінність "у З рази нижчу", ніж афінність контрольного антитіла (М), тоді якщо значення Ко для А дорівнює Зх, значення Ко для М буде 1х і відношення Ко для А до Ко для М складе 3:1. Навпаки, в одному варіанті здійснення, якщо антитіло за винаходом (С) має афінність "у З рази вищу", ніж афінність контрольного антитіла (К), тоді, якщо значення Кб для С дорівнює 1х, значення Ко для 60 Е буде Зх і відношення Ко для С до Ко для К складе 1:3. Будь-яке число аналізів, відомих у даній галузі, включаючи описані в даному документі, можна використовувати для проведення вимірів афінності зв'язування, у тому числі, наприклад, Віасоге, радіоімуноаналіз (КІА) і ЕГІЗА.

Крім того, значення Ко для антитіла за винаходом можуть варіювати в залежності від умов конкретного використаного аналізу. Наприклад, в одному варіанті здійснення афінність зв'язування можна кількісно визначати в аналізі, у якому Раб або антитіло іммобілізоване і вимірюють зв'язування ліганду, тобто, фактора 0, або альтернативно, ліганд, тобто, фактор Ю для Раб або антитіла іммобілізований і вимірюють зв'язування Раб або антитіла. В одному варіанті здійснення афінність зв'язування можна кількісно визначати в аналізі, у якому умови регенерації можуть включати (1) 10 мм або гліцин 4М Маосі» при рн 1,5, і (2) рН від рН 1,0 до рн 7,5, у тому числі рН 1,5, рН 5,0, рН 6,0 ї рН 7,2. В одному варіанті здійснення афінність зв'язування можна кількісно визначати в аналізі, у якому умови зв'язування можуть включати (1)

РВ5 або НЕРЕ5-сольовий буфер і (2) Тмееп-20, тобто, 0,1 95 Гмуееп-20. В одному варіанті здійснення афінність зв'язування можна кількісно визначати в аналізі, у якому джерело ліганду, тобто, фактора О, може бути з комерційно доступних джерел. В одному варіанті здійснення афінність зв'язування можна кількісно визначати в аналізі, у якому (1) Раб або антитіло іммобілізоване і вимірюють зв'язування ліганду, тобто, фактора 0, (2) умови регенерації включають 4М МасСІі» при рН 7.2 ії (3) умови зв'язування включають НЕРЕЗ-сольовий буфер, рн 7,2, що містить 0,195 Гиуееп-20. В одному варіанті здійснення афінність зв'язування можна кількісно визначати в аналізі, у якому (1) ліганд, тобто, фактор 0, іммобілізований і вимірюють зв'язування Раб або антитіла, (2) умови регенерації включають 10 мм гліцин при рН 1,5 ї (3) умови зв'язування включають буфер РВ5. р. Біологічна активність

Для того, щоб визначити, чи здатне антитіло проти фактора О або його варіант, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) зв'язуватися з фактором О і чинити біологічну дію, наприклад, інгібувати гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, можна використовувати аналізи інгібування гемолізу з використанням еритроцитів кролика, включаючи ті, що описані в прикладі 2. Таке інгібування гемолізу можна визначати за допомогою стандартних аналізів (Козіамавії еї аї., У. ої Іттипоїіоду, 158(4): 1763-72 (1997), Міезтанпп еї аї.,

Маїцге, 444(7116): 159-600 (2006)). Активацію комплементу в таких аналізах можна ініціювати

Зо сироваткою або плазмою. Відповідні концентрації фактора О у сироватці або плазмі (Разсцаї еї а!., Кідпеу Іпіегпаййопаї, 34: 529-536 (1998), Сотріетепі Расів ВоокК, Ветага У. Мопієу апа Мак У.

МаїІрон, едіюг5, Асадетіс Ргев55 (2000), Ватит еї аї., У. Іттипої. Меїйоав5, 67: 303-309 (1984)) звичайно можна визначати методами, відомими в даній галузі, включаючи ті, що описані в таких роботах, як Разсцпцаї еї аї., Кідпеу Іпіегпайопаї, 34: 529-536 (1998) і Вагпит еї аї., У. Іттипої.

Меїпоаз, 67: 303-309 (1984), а також у прикладі 4. Даний винахід в основному належить до антитіл, здатних інгібувати біологічні активності, зв'язані з фактором 0. Наприклад, при концентрації 18 мкг/мл (еквівалент приблизно 1,5-кратної молярної концентрації людського фактора О у крові, молярне відношення антитіла проти фактора ОО до фактора О приблизно 1,5:1) можна спостерігати істотне інгібування альтернативної активності комплементу антитілом (дивись, наприклад, патент США Мо 6956107).

В одному варіанті здійснення винахід включає антитіла проти фактора 0, де Бар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСхо меншими ніж 30 нМ. В одному варіанті здійснення винахід включає антитіла проти фактора 0, де Рар- фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСзо меншими ніж 15 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора

Ор, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСзо меншими ніж 10 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСбо меншими ніж 5 нМ. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар- фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСзо від ЗО нМ до 2 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Еар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСбво від 25 нМ до 7 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСво від 20 нМ до 12 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора О, де Раб-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСвхо від 30 нМ до 15 нМ. В одному варіанті здійснення бо винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз,

зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСвзо від 12 НМ до 8 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСво від 7 нМ до 2 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора О, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСбхо від 6 нМ до З

НМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора О, де Еар- фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСзо від 8 НМ до 5 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Еабр-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСвзо від 5 НМ до 2 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСвхо від 10 нМ до 5 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора О, де Раб-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСво від 8 нМ до 2 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Раб-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСво від 7 НМ до З нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСзхо від б нМ до 4 нМ. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора О, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значенням ІСво приблизно 4,7 нМ20,6 нМ. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар- фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значенням ІСзо приблизно 6,4 нМ.0,6 нМ. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значенням ІСзо приблизно 3,5 нМ.0,5 нМ. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора О, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значенням ІСво приблизно 4,4 нМя1,5 нМ. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значенням ІСзо приблизно 10,2 нмМж0,8 нМ. В

Зо іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора О, де Раб-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значенням ІСзо приблизно 23,9 нМж5,0 нМ. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар- фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСзоо меншими ніж 80 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора

Ор, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСео меншими ніж 50 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСео меншими ніж 40 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора О, де Раб-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСоо меншими ніж 20 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСзо меншими ніж 15 нМ. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних Фрагментів).

В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар- фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСзоо від 80 нМ до 10 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Еаб-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСео від 75 НМ до 15 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСео від 70 нМ до 20 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора О, де Раб-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСоо від 65 НМ до 25 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСзо від 60 нМ до 30 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСвоо від 55 НМ до 35 нМ. В одному бо варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора О, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСоо від 50 нМ до 40

НМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора О, де Еар- фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСзоо від 80 нМ до 70 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Еаб-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСео від 55 НМ до 25 нМ. В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значеннями ІСоео від 16 нМ до 12 НМ. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора О, де Раб-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значенням ІСео приблизно 14,0 нМа1,0 нМ. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де Рар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значенням ІСсо приблизно 38,0 нМ.-11,0 нм. В іншому варіанті здійснення винахід належить до антитіл проти фактора 0, де РБар-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, зі значенням ІСео приблизно 72,6 нМ.4,8 нМ. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В одному варіанті здійснення винахід належить до антитіла проти фактора Ю або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента), де ЕРаб-фрагмент таких антитіл інгібує гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, при молярному відношенні антитіла до фактора 0 від приблизно 0,05:1 (0,05) до приблизно 10:1 (10), або від приблизно 0,09:1 (0,09) до приблизно 8:1 (8), або від приблизно 0,1:1 (0,1) до приблизно 6:1 (б), або від приблизно 0,15:1 (0,15) до приблизно 5:1 (5), або від приблизно 0,19:1 (0,19) до приблизно 4:1 (4), або від приблизно 0,2:1 (0,2) до приблизно 3:1 (3), або від приблизно 0,3:1 (0,3) до приблизно 2:1 (2), або від приблизно 0,4:1 (0,4) до приблизно 1:1 (1), або від приблизно 0,5:1 (0,5) до приблизно 1:22 (0,5), або від приблизно 0,6:1 (0,6) до приблизно 1:3 (0,33), або від приблизно 0,7:1 (0,7) до приблизно 1:4 (0,25), або від приблизно 0,8:1 (0,8) до приблизно 1:5 (0,2) або від приблизно 0,9:1 (0,9) до приблизно 1:6 (0,17). В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора 0 (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В одному варіанті здійснення даний винахід включає фрагменти гуманізованих антитіл

Зо проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти). Фрагменти антитіл за даним винаходом можуть, наприклад, являти собою фрагменти Раб, Рар', ЕК(аб)», зсЕм, (ЗесЕм)», аАБ, що визначає комплементарність ділянки (СОК), лінійні антитіла, одноланцюжкові молекули антитіл, мінітіла, діатіла або мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. У додатковому варіанті здійснення винахід належить до фрагмента гуманізованого антитіла проти фактора О (наприклад, антигензв'язувального фрагмента), що здатний проникати практично через всю сітківку. У наступному додатковому варіанті здійснення винахід належить до фрагмента гуманізованого антитіла проти фактора О (наприклад, антигензв'язувального фрагмента), що здатний проникати через усю товщу сітківки. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора О (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів).

В одному варіанті здійснення даний винахід включає гуманізовані антитіла проти фактора 0, де Рар-фрагмент таких антитіл має час напівжиття щонайменше 3, 5, 7, 10 або 12 днів після введення в око ссавця (наприклад, людини) за допомогою одиничної інтравітреальної ін'єкції. В іншому варіанті здійснення даний винахід включає гуманізовані антитіла проти фактора 0, де

Еаб-фрагмент таких антитіл інгібує альтернативний шлях (АР) активації комплементу щонайменше протягом 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 або 115 днів після введення в око ссавця (наприклад, людини) за допомогою одиничної інтравітреальної ін'єкції. В іншому варіанті здійснення даний винахід включає гуманізовані антитіла проти фактора 0, де концентрація Рар-фрагмента таких антитіл, що інгібує альтернативний шлях (АР) активації комплементу, зберігається в тканині сітківки щонайменше протягом 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 або 85 днів після введення в око ссавця (наприклад, людини) за допомогою одиничної інтравітреальної ін'єкції. В іншому варіанті здійснення даний винахід включає гуманізовані антитіла проти фактора О, де концентрація Баб-фрагмента таких антитіл, що інгібують альтернативний шлях (АР) активації комплементу, зберігається в склоподібному тілі щонайменше протягом 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 або 115 днів після введення в око ссавця (наприклад, людини) за допомогою одиничної інтравітреальної ін'єкції. В одному прикладі винахід належить до фрагментів зазначених антитіл проти фактора ОО (наприклад, антигензв'язувальних Фрагментів).

Одержання антитіл бо Селекція і трансформація клітин-хазяїв

Клітини-хазяї трансфікували або трансформували експресійними або клонуючими векторами, описаними в даному документі для одержання антитіла проти фактора 0, і культивували в звичайних живильних середовищах з відповідними модифікаціями для індукції промоторів, селекції трансформантів або ампліфікації генів кодуючі потрібні послідовності.

Умови культивування, такі як середовища, температура, рН тощо, можуть бути підібрані кваліфікованим фахівцем без зайвих експериментів. У цілому, принципи, протоколи і практичні методи для максимального підвищення продуктивності клітинних культур можна знайти в

Маттаїап СеїЇ ВіоїесппоЇоду: а Ргасіїса! Арргоасп, М. ВиШег, ей. (ІК Ргез5, 1991), а також у затьгоок еї аї., вище.

Способи трансфекції еукаріотичних клітин і трансформації прокаріотичних клітин, що означає введення ДНК у клітину-хазяїна так, що ДНК є реципльованою або у вигляді позахромосомного, або хромосомного компонента, відомі рядовим фахівцям, наприклад, з використанням Сасі», СаРО»з, ліпосом, суміші поліетиленгліколь/"ДМСО і електропорації. У залежності від використовуваної клітини-хазяїна трансформацію проводять стандартними методами, що підходять для таких клітин. Обробку кальцієм з використанням хлористого кальцію, як описано в Затьгоок еї аїЇ., вище, або електропорацію звичайно використовують для прокаріот. Інфікування за допомогою Адгорасіегійт їшптеїасієп5 застосовують для трансформації деяких рослинних клітин, як описано в Зпаму еї аї!., Сепе, 23: 315 (1983), а також у

МО 89/05859, опублікованої 29 червня 1989 р. Для клітин ссавців, позбавлених таких клітинних стінок, можна використовувати метод преципітації фосфатом кальцію, описаний у Ссгайат апа мап дег ЕБ, Мігоїоду, 52: 456-457 (1978). Загальні аспекти трансфекцій системи клітин-хазяїв ссавців описані в патенті США Мо 4399216. Трансформації в дріжджові клітини звичайно проводять по методу Мап зЗоїїпдеп еї аї., 9. Васі., 130: 946 (1977), а також Нбіао еї аї., Ргос. Май).

Асад. 5сі. (ОБА), 76: 3829 (1979). Однак можна також використовувати й інші способи введення

ДНК у клітини, такі як мікроін'єкція в ядро, електропорація, злиття бактеріальних протопластів з інтактними клітинами або застосування полікатіонів, наприклад, полібрену, поліорнітину.

Стосовно різних методів трансформації клітин ссавців дивися Кеом/уп еї аї., Меїпоаз5 іп

Епгуто!оду, 185: 527-537 (1990), а також Мапзоиг єї аї., Майиге, 336: 348-352 (1988).

У даному документі прийнятними клітинами-хазяїнами для клонування або експресії ДНК у

Зо векторах є клітини прокаріот, або дріжджів вищих евкаріот. Придатні для цієї мети прокаріоти включають як грамнегативні, так і грампозитивні мікроорганізми, наприклад, Епіегобасіеєгіа, такі як ЕзсПегіспіа, наприклад, БЕ. соїї, Епіегорасіег, Егміпіа, КіІерзіеМПа, Ргоїеи5, зЗаїЇтопегїа, наприклад, ЗаІтопеїа їурпітигішт, 5еїтайца, наприклад, Зеїтайа тагсезсап5 і ЗпідеПа, а також

Васійї, такі як В. з,ибійі5 і В. Пспепітогтів (наприклад, В. Іспепіптів АТР, описана в БО 266710, дата публікації 12 квітня 1989), Рхейдотопах, такі як Р. аегидіпоза, КПі2обіа, МігеозсіМа,

Рагасоссив і зігеріотусе5. Одним переважним хазяїном для клонування в Е. сої є Е. соїї 294 (АТСС Мо 31446), хоча прийнятними є й інші штами, такі як Е. соїї В, Е. соїї Х1776 (АТСС Мо 31537), Е. соїї МУ3110 (АТСС Мо 27325) і К5 772 (АТСС Мо 53635). Ці приклади є скоріше ілюстративними, ніж обмежуючими. Штам УУЗ3110 є одним з особливо переважних хазяїв, або вихідним хазяїном, оскільки це загальноприйнятий штам-хазяїн для ферментації продуктів рекомбінантної ДНК. Переважно, клітина-хазяїн секретує мінімальну кількість протеолітичних ферментів. Наприклад, штам МУЗ110 (Васптапп, СеїйшШаг апа Моїіесшіаг Віоіоду, мої. 2 (УуазПпіпдіоп, О0.С.: Атегісап Босієїу Тог Місгобіоіоду, 1987), рр. 1190-1219; АТС Мо 27325) можна модифікувати, щоб викликати генетичну мутацію в генах кодуючих білки, ендогенні для хазяїна, із прикладами таких хазяїв, що включають Е. соїї М/3110 штам 1А2, що має повний генотип пАА; Е. соїї М/3110 штам 9Е4, що має повний генотип (опА рігЗ3; Е. соїї МУ3110 штам 27С7 (АТСС Мо 55244), що має повний генотип опА ріг3 рпоА Е15 (агде-Іас)169 аеоР отр Кап;;

Е. соїї МУ3110 штам 3706, що має повний генотип (опА ріг3 рпоА Е15 (агдеЕ-Іас)169 аедР отр по57 мс Кап'; Е. соїї М/3110 штам 4084, що є штамом 3706 з нестійкої до канаміцину делеційною мутацією аед; Е. соїї М/3110 штам 3303, що має генотип М/3110 АТРишА (АІопА) ріїЗ

Іас Ід Іасі 8 лотрТАД(птро-їтерЕ) аедР41 Кап" (патент США Мо 5639635) і штам Е. соїї, що має мутантну періплазматину протеазу, розкритий у патенті США Мо 4946783, виданому 7 серпня 1990 р. Інші штами і їхні похідні, такі як Е. соїї 294 (АТСС Мо 31446), Е. сої В, Е. соїїх 1776 (АТОС

Мо 31537) і Е. соїї КМ308 (АТСС Мо 31608) також є прийнятними. Ці приклади є скоріше ілюстративними, ніж обмежуючими. Способи створення похідних кожної з вищезгаданих бактерій, що мають визначеним генотипом, відомі в даній галузі й описані, наприклад, у Вав5 еї а!., Ргоївіїпє, 8: 309-314 (1990). У цілому, необхідно вибирати відповідні бактерії з обліком репліційності реплікону в бактеріальних клітинах. Наприклад, види Е. соїї, Зегтайа або заітопейа можна адекватно використовувати як хазяїна, коли для доставки реплікону бо використовують такі добре відомі плазміди, як рРВК322, рВК325, рАСУС177 або рКМ410. Як правило, клітина-хазяїн повинна секретувати мінімальну кількість протеолітичних ферментів, і за бажанням у культуру клітин можна вводити додаткові інгібітори протеаз. Альтернативно, підходящими є способи клонування іп мійго, наприклад, ПЦР або інші полімеразні реакції нуклеїнових кислот.

Повнорозмірне антитіло, фрагменти антитіла (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти) і злиті білки антитіла можна продукувати у бактеріях, особливо, якщо немає необхідності в глікозуванні і ефекторної функції Ес, наприклад, коли терапевтичне антитіло кон'юговане з цитотоксичним засобом (наприклад, токсином) і імунокон'югат самостійно демонструє ефективність при знищенні пухлинних клітин. Повнорозмірні антитіла мають більший час напівжиття в кровотоці. Продукція в Е. соїї є білеш швидкою й економічною. Для експресії фрагментів антитіл і поліпептидів у бактеріях, дивися, наприклад, патент США Мо 5648237 (Сапег еї. аІ.), патент США Мо 5789199 (Чоїу еї а.) і патент США Мо 5840523 (ЗіттопзФ еї аї.), що описують ділянки ініціації трансляції (ТІК) і сигнальні послідовності для оптимізації експресії і секреції, ці патенти включені в даний документ за допомогою посилання. Після експресії дане антитіло виділяють із клітинної маси БЕ. соїї у складі розчинної фракції і його можна очищати, наприклад, на колонку з білком А або с, у залежності від ізотипу. Остаточне очищення можна проводити аналогічно способу очищення антитіл, експресованих, наприклад, у клітинах СНО.

На додаток до прокаріотів, еукаріотичні мікроорганізми, такі як міцеліальні гриби або дріжджі, є прийнятними хазяїнами для клонування або експресії векторів кодуючі антитіло. засспаготусе5 сегемізіає використовуються найчастіше серед нижчих еукаріотичних мікроорганізмів-хазяїв. Однак у даному документі загальнодоступні і застосовні множина інших пологів, видів і штамів, таких як Зспігозасспаготусез ротре, Кінумеготусе5, Сапаїда,

Тіісподегта, Меигозрога сгазза і міцеліальні гриби, такі як, наприклад, Меигозрога, Репісійит,

Тоїуросіадіт і Азрегоїо5, такі як А. підшапз і А. підег. Метилотрофні дріжджі є прийнятними в даному документі і включають, але не обмежуються ними, дріжджі, здатні рости на метанолі, вибрані з пологів, що складаються з Напзепшціа, Сапаїйда, КіоесКега, Ріспіа, Засспаготусев,

Тогиіорвзі5 і КПподоїогиіа. Перелік конкретних видів, що є прикладами даного класу дріжджів, можна знайти в С. Апіпопу, Те Віоспетівігу ої МеїпуЇІоїгорп5, 269 (1982).

Придатні для експресії глікозилованих антитіл клітини-хазяї походять з багатоклітинних

Зо організмів. У принципі, будь-яка культура клітин вищих евкаріот придатна для роботи, будь ту культури хребетних, або безхребетних. Приклади клітин безхребетних включають клітини рослин і комах, І исКком/ еї аї., Віо/Гесппоїоду 6, 47-55 (1988); МіМег єї аї., Сепеїїс Епдіпеегіпд,

Зейому єї аї. ед5. Мої. 8, рр. 277-279 (Ріепат рибіїзніпа 1986); Мзеда еї аї., Маїште 315, 592-594 (1985). Ідентифіковано численні бакуловірусні штами і варіанти, а також відповідні пермісивні клітини-хазяї комах з таких хазяїв, як 5родорієга Іігидірегаа (гусінь), Аєдез (комар), ЮОгозорпійа теїІаподавзіег (плодова мушка) і Вотбрух тогі. Загальнодоступні різні вірусні штами для трансфекції, наприклад, варіант Г-1 МРМ Ашодгарна саїйогпіса і штам Віт-5 МРМ Вотрух тогі, і такі віруси можна використовувати в даному документі як вірус за даним винаходом, особливо для трансфекції клітин Зродоріега їтидірегча. Крім того, як хазяїв можна використовувати культури рослинних клітин бавовни, кукурудзи, картоплі, сої, петунії, томатів і тютюну.

Використання клітин хребетних і розмноження клітин хребетних у культурі (тканинній культурі) стало рутинною процедурою. Дивися Тіззце Сийиге, Асадетіс Рге55, Кгизе апа

Ранегзоп, ед5. (1973). Прикладами прийнятних ліній клітин-хазяїв ссавців є лінія клітин нирки мавпи, лінія клітин ембріональної нирки людини, клітини нирки новонародженого хом'ячка, клітини яєчника китайського хом'ячка/-«ОНЕВ (СНО, пацб еї а!., Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 77: 4216 (1980)), мишачі клітини Сертоли, клітини карциноми шейки матки людини (НЕГА), клітини нирки собаки, клітини легень людини, клітини печінки людини, клітини пухлини молочної залози миші і клітини МБО.

Для рекомбінантної продукції антитіла за винаходом або фрагмента даного антитіла (наприклад, антигензв'язувального фрагмента) нуклеїнову кислоту (наприклад, КДНК або геномну ДНК), що кодує його, виділяють і вбудовують у реплікований вектор для подальшого клонування (ампліфікації ДНК) або для експресії. ДНК, що кодує антитіло або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент), можна легко виділяти і секвенувать за допомогою звичайних методів (наприклад, за допомогою олігонуклеотидних зондів, що здатні специфічно зв'язуватися з генами кодуючими важкі і легкі ланцюги антитіла). Багато векторів загальнодоступні. Вибір вектора залежить почасти від використовуваної клітини-хазяїна. Як правило, переважні клітини-хазяї мають або прокаріотичне, або еукаріотичне (у більшості випадків - від ссавців) походження.

Вектор, наприклад, може бути у вигляді плазміди, косміди, вірусної частинки або фагу. бо Відповідні послідовності нуклеїнової кислоти можна вбудовувати у вектор множиною різних способів. Як правило, ДНК вбудовують по відповідному сайту(ам) ендонуклеази рестрикції за допомогою методів, відомих у даній ділянки. Компоненти вектора, як правило, включають, але не обмежуються ними, одну або більш сигнальних послідовностей, точку початку реплікації, один або більше генів-маркерів, енхансерний елемент, промотор і послідовність термінації транскрипції. Для створення прийнятних векторів, що містять один або декілька з цих компонентів, застосовують стандартні методи лікування, що відомі фахівцям.

Фактор ЮО можна одержувати рекомбінантними методами не тільки прямо, але також у вигляді злитого поліпептиду з гетерологічним поліпептидом, що може бути сигнальною послідовністю, або з іншим поліпептидом, що має специфічний сайт розщеплення на М-кінці зрілого білка або поліпептиду. Як правило, сигнальна послідовність може бути компонентом вектора, або вона може бути частиною ДНК, що кодує антитіло проти фактора 0, що вбудовують у вектор. Сигнальною послідовністю може бути прокаріотична сигнальна послідовність, вибрана наприклад, із групи лідерних послідовностей лужної фосфатази, пеніцилінази, Ірр або термостабільного ентеротоксину ІІ. Для секреції в дріжджах сигнальною послідовністю може бути, наприклад, лідерна послідовність дріжджової інвертази, лідерна послідовність альфа-фактора (включаючи лідерні послідовності с-фактора засспаготусез і

Кісулеготусев5, останні описані в патенті США Мо 5010182), або лідерна послідовність кислої фосфатази, лідерна послідовність глюкоамілази С. аіІрісап5 (ЕР 362179, дата публікації 4 квітня 1990 р.), або сигнальна послідовність, описана в УМО 90/13646, дата публікації 15 листопада 1990 р. У випадку експресії в клітинах ссавців, для прямої секреції білка можна використовувати сигнальні послідовності ссавців, такі як сигнальні послідовності із секретованих поліпептидів того ж самого або споріднених видів, а також вірусні секреторні лідерні послідовності.

Клітини-хазяї трансформують вищеописаними векторами для продукції антитіл і культивують у традиційних живильних середовищах з відповідними модифікаціями для індукції промоторів, селекції трансформантів або ампліфікації генів кодуючі потрібні послідовності.

Клітини-хазяї, використовувані для продукції антитіла або варіанта даного антитіла, або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента) за даним винаходом, можна культивувати в різних середовищах. а. Прокаріотичні клітини-хазяї

Зо Прокаріотичні клітини, використовувані для продукції поліпептидів за винаходом, вирощують у середовищах, відомих у даній галузі і прийнятних для культивування вибраних клітин-хазяїв.

Приклади прийнятних середовищ включають живильний бульйон Лурії (8) плюс необхідні живильні добавки. У деяких варіантах здійснення середовище також містить засіб селекції, вибраний, виходячи з конструкції експресійного вектора, для селективного росту прокаріотичних клітин, що містять експресійний вектор. Наприклад, у середовища додають ампіцилін для росту клітин, експресуючих ген стійкості до ампіциліну.

Будь-які необхідні добавки, крім джерел вуглецю, азоту і неорганічного фосфату, також можна включати у відповідних концентраціях, додаючи окремо, або у вигляді суміші з іншими добавками або середовищем, наприклад, комплексне джерело азоту. Культуральне середовище може необов'язково містити одне або кілька відновлюючих засобів, вибраних із групи, що складається з глутатіону, цистеїну, цистаміну, тіогліколю, дитіоеритритолу і дитіотреїтолу.

Прокаріотичні клітини-хазяї культивують при відповідних температурах. Для росту БЕ. соїїЇ, наприклад, переважний діапазон температур складає від приблизно 202С до приблизно 399С, більш переважно від приблизно 2593 до приблизно 37С, навіть більш переважно приблизно 309С. рН середовища може бути будь-яким рН у діапазоні від приблизно 5 до приблизно 9, що головним чином залежить від організму-хазяїна. Для Е. соїї рН, переважно, складає від приблизно 6,8 до приблизно 7,4, і більш переважно приблизно 7,0.

Якщо в експресійному векторі за винаходом використовують індукований промотор, експресію білка індукують в умовах, що підходять для активації промотору. В одному аспекті винаходу для контролю транскрипції поліпептидів використовують промотори Ріо. Відповідно, трансформовані клітини-хазяї для індукції культивують в обмеженому по фосфатах середовищі.

Переважно, обмежене по фосфатах середовище являє собою середовище С.К.А.Р (дивися, наприклад, біттопз еї аї., У). Іттипої. Меїпоаз (2002), 263: 133-147). Як відомо в даній галузі, можна використовувати множину інших індукторів, у залежності від конструкції використовуваного вектора.

В одному варіанті здійснення експресовані поліпептиди за даним винаходом секретуються в периплазму клітин-хазяїв і витягаються з неї. Добування білків звичайно включає руйнування мікроорганізмів, як правило, за допомогою таких способів, як осмотичний шок, обробка бо ультразвуком або лізис. Після того як клітини зруйновані, клітинний дебрис або цілі клітини можна видаляти центрифугуванням або фільтрацією. Білки можна додатково очищати, наприклад, хроматографією на афінній смолі. Альтернативно, білюи можна переводити в культуральне середовище і виділяти 3 нього. Клітини можна видаляти з культури і культуральний супернатант фільтрувати і концентрувати для подальшого очищення продукованих білків. Далі експресовані поліпептиди можна виділяти й ідентифікувати за допомогою широко відомих методів, таких як електрофорез у поліакриламідному гелі (РАСЕ) і вестерн-блотинг.

В одному аспекті винаходу продукцію антитіла у великій кількості здійснюють за допомогою процесу ферментації. Для продукції рекомбінантних білків існують різні великомасштабні методи періодичної ферментації з додаванням субстрату. Продуктивність великомасштабних ферментацій складає щонайменше 1000 літрів, переважно, від приблизно 1000 до 100000 літрів. У цих ферментерах використовують перемішуючі пристрої пропелерного типу для розподілу кисню і живильних речовин, особливо глюкози (краще джерело вуглецю/енергії).

Дрібномасштабна ферментація означає, як правило, ферментацію у ферментері, об'ємна місткість якого не перевищує приблизно 100 літрів і може знаходитися в діапазоні від приблизно 1 літра до приблизно 100 літрів.

У процесі ферментації індукцію експресії білка, як правило, ініціюють після того, як клітини вирощені в прийнятних умовах до потрібної оптичної густини, наприклад, ОЮ55о, що приблизно дорівнює 180-220, на етапі чого клітини знаходяться в ранній стаціонарній фазі росту. Як відомо в даній галузі й описано вище, можна використовувати ряд індукторів, у залежності від конструкції застосовуваного вектора. Клітини можна вирощувати протягом більш коротких періодів перед індукцією. Клітини звичайно індукують протягом приблизно 12-50 годин, хоча можна використовувати довший або коротший час індукції.

Щоб удосконалити вихід продукції і якість поліпептидів за винаходом, можна модифікувати різні умови ферментації. Наприклад, щоб удосконалити правильну зборку і згортання секретованих поліпептидів антитіла, можна використовувати додаткові вектори з підвищеною експресією білків-шаперонів, таких як білки 056 (056, О56, О55, О5р0 і/або О55) або ЕКр (петидилпроліл-цис, транс-ізомераза з активністю шаперонів), для спільної трансформації прокаріотичних клітин-хазяїв. Показано, що білки-шаперони сприяють правильному згортанню і

Зо розчинності гетерологічних білків, продукованих у бактеріальних клітинах-хазяях. Спеп еї аї. (1999) ) Віо Спет 274: 19601-19605; Сеогдіоци еї аІ., патент США Мо 6083715; Сеогдіои еї аї., патент США Мо 6027888; Вошттапп апа Рінскіпип (2000) У. ВіоЇ. Спет. 275: 17100-17105; Ватт апа Рійскійип (2000) У. Вісі. Спет. 275: 17106-17113; Агів єї а. (2001) Мої. Місгобіо!. 39: 199-210.

Щоб звести до мінімуму протеоліз експресованих гетерологічних білків (особливо тих, що чутливі до протеолізу), у рамках даного винаходу можна використовувати визначені штами- хазяї, позбавлені протеолітичних ферментів. Наприклад, штами клітин-хазяїв можна модифікувати, щоб викликати генетичну мутацію() у генах кодуючих відомі бактеріальні протеази, такі як протеаза І, Отр, Ред, Т5р, протеаза І, протеаза Мі, протеаза М, протеазам! і їхнього сполучення. Деякі позбавлені протеаз штами Е. соїїі доступні й описані, наприклад, у доїу еї аІ. (1998), вище; Сеогдіои еї аіІ., патент США Мо 5264365; Сеогдіои еї аІ., патент США Мо 5508192; Нага вї аї., Містобіа! Огид Незівіапсе, 2: 63-72 (1996).

В одному варіанті здійснення штами БЕ. соїї, позбавлені протеолітичних ферментів і трансформовані плазмідами, надмірно експресуючими один або більше білків-шаперонів, використовують як клітини-хазяї у системі експресії за винаходом. р. Еукаріотичні клітини-хазяї

Наявні в продажу середовища, такі як середовище Хема Е10 (Зідта), мінімальне основне середовище (МЕМ, Зідта), ЕРМІ-1640 (бідта) і модифіковане по Дульбеко середовище Ігла (ОМЕМ, 5Зідта) підходять для культивування клітин-хазяїв. Крім того, кожне із середовищ, описаних у Нат еї аї., Мей. Епгутої!. 58:44 (1979), Вагпез еї а!., Апаї. Віоспет. 102: 255 (1980), патентах США МоМо 4767704, 4657866, 4560655, 5122469, 5712163 або 6048728 можна використовувати як культуральні середовища для клітин-хазяїв. Кожне з цих середовищ можна доповнювати при необхідності гормонами і/або іншими факторами росту (такими як інсулін, трансферин або епідермальний фактор росту), солями (такими як Х-хлориди, де Х являє собою натрій, кальцій, магній, і фосфати), буферними розчинами (такими як НЕРЕ5), нуклеотидами (такими як аденозин і тимідин), антибіотиками (такими як лікарський засіб гентаміцин "М), мікроелементами (визначаються як неорганічні сполуки, звичайно присутні в кінцевих концентраціях у мікромолярному діапазоні), а також глюкозою або еквівалентним джерелом енергії. Будь-які інші необхідні добавки також можна включати у відповідних концентраціях, що відомі фахівцям у даній галузі. Умови культивування, такі як температура, рН тощо, є тими ж,

що раніше використовували для клітин-хазяїв, вибраних для експресії, ії очевидні рядовому фахівцю.

Очищення антитіл

Форми антитіл проти фактора О або їхні фрагменти (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти) можна виділяти з культурального середовища або з лізатів клітин-хазяїв. Якщо вони зв'язані з мембраною, їх можна вивільняти від мембрани за допомогою прийнятного розчину детергенту (наприклад, Тритона-Х 100) або ферментативним розщепленням. Клітини, використовувані для експресії антитіла проти фактора 0, можна руйнувати різними фізичними або хімічними способами, такими як циклічне заморожування-відтавання, обробка ультразвуком, механічне руйнування або лізуючі клітини засобу.

Може виявитися бажаним очищати антитіло проти фактора О від білків або поліпептидів рекомбінантних клітин. Наступні методи є типовими прикладами прийнятних методів очищення: фракціонування на іонообмінній колонці, осадження етанолом, зворотно-фазова ВЕЖУ, хроматографія на силікагелі або на катіонообмінній смолі, такий як ОЕАЕ, хроматофокусування,

ЗО5-РАСЕ, осадження сульфатом амонію, гель-фільтрація з використанням, наприклад, сефадексу 0-75, колонки з білок-А-сефарозою для видалення таких домішок, як Ід, і метал- хелатуючі колонки для зв'язування епітоп-мічених форм антитіла проти фактора О. Можна використовувати різні способи очищення білків, і такі способи відомі в даній галузі, а також описані, наприклад, у Оеції5зспег, Меїтоавз іп Епгутоїіоду, 182 (1990); Зсорез, Ргоївіп Ригіїісайоп:

Ргіпсірієхє апа Ргасіїсе, Зргіпдег-Мегіад, Мемж/ ЖМогк (1982). Вибрана стадія() очищення буде залежати, наприклад, від суті використовуваного способу продукції і конкретного продукованого антитіла проти фактора 0.

При використанні рекомбінантних методів антитіло або варіант антитіла, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) може продукуватися всередині клітини, У периплазматичному просторі або секретуватися безпосередньо в культуральне середовище.

Якщо антитіло або варіант антитіла, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) продукується всередині клітини, як першу стадію можна видаляти дисперсний дебрис, або клітини-хазяї, або лізовані фрагменти, наприклад, центрифугуванням або ультрафільтрацією. Сагпег еї аї!., Віо/Гесппоіоду 10: 163-167 (1992) описують спосіб виділення

Зо антитіл, що секретуються в периплазматичний простір ЕЕ. соїї. Коротко, клітинну масу розморожують у присутності ацетату натрію (р 3,5), ЕДТА і фенілметилсульфонілфториду (РМ5БЕ) протягом приблизно 30 хвилин. Клітинний дебрис можна видаляти центрифугуванням.

Коли антитіло або варіант антитіла, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) секретується в культуральне середовище, супернатанти таких систем експресії в більшості випадків спочатку концентрують за допомогою комерційно доступних фільтрів для концентрування білка, наприклад, ультрафільтраційних комірок Атісоп або Міїїроге Реїїсоп. На кожній з вищевказаних стадій можна включати інгібітор протеаз, такий як РМБ5Б, для інгібування протеолізу і можна включати антибіотики для запобігання росту випадкових забруднень.

Композицію антитіл, отриману з клітин, можна очищати, наприклад, за допомогою хроматографії на гідроксилапатиті, гель-електрофорезу, діалізу й афінної хроматографії, при тому, що афінна хроматографія є методом очищення номер один. Придатність білка А як афінний ліганд залежить від виду і ізотипу будь-якого Ес-домену імуноглобуліну, що є в даному антитілі або варіанті антитіла, або його фрагменті (наприклад, антигензв'язуюючому фрагменті).

Білок А можна використовувати для очищення антитіл, що мають в основі важкі ланцюги Ід1, Ідг2 або Ід4 людини (І іпатагк еї аї., У). Іттипої Мей. 62: 1-13 (1983)). Білок С рекомендований для всіх ізотипів миші і для ЇДЗ людини (Си55 еї аіІ., ЕМВО 3. 5: 1567-1575 (1986)). Матрицею, до якої приєднують ліганд, найчастіше є агароза, але придатні й інші матриці. Механічно стійкі матриці, такі як скло з контрольованим розміром пор або полі(стирендивініл)бензол, допускають більшу швидкість потоку і більш короткі періоди обробки, ніж цього можна досягти з агарозою. Коли антитіло або варіант антитіла, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) містить домен СНЗ, для очищення корисна смола ВаКегропа АВХ мМ (). Т. ВакКег, РийрзБриго,

М.У.). Інші методи очищення білків, такі як фракціонування на іонообмінній колонці, осадження етанолом, обернено-фазова ВЕЖХ, хроматографія на силікагелі, хроматографія на гепарин- сефарозітм, хроматографія на аніоно- або катіонообмінній смолі (наприклад, на колонці з поліаспарагіновою кислотою), хроматофокусування, 505-РАСЕ і осадження сульфатом амонію, також придатні в залежності від виділюваного антитіла або варіанта антитіла, або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента).

Після будь-якої попередньої стадії(ій) очищення суміш, що містить цікавляче антитіло або варіант антитіла, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) і домішки, бо можна піддавати хроматографії гідрофобних взаємодій при низьких значеннях рн,

використовуючи буфер для елюції в діапазоні рН приблизно 2,5-4,5, переважно, проводячи її при низьких концентраціях солей (наприклад, приблизно 0-0,25 М сіль).

Фармацевтичні композиції

Терапевтичні препарати поліпептиду або антитіла, або фрагмента даного антитіла (наприклад, антигензв'язувального фрагмента), або варіанта даного антитіла можна готувати для збереження у вигляді ліофілізованих препаратів або водяних розчинів шляхом змішування поліпептиду, що має потрібний ступінь чистоти, з необов'язковими "фармацевтично прийнятними" носіями, ексципієнтами або стабілізаторами, звичайно використовуваними в даній галузі (усі вони називаються "ексципієнтами"). Наприклад, буферні речовини, стабілізатори, консерванти, засоби, що додають |ізотонічність, неіоногенні детергенти, антиоксиданти й інші різні добавки. (Дивися КептіпдіопА"5 Рпагтасешііса! Зсіепсев5, 161п еайіоп,

А. О50ІЇ, Ба. (1980)). Такі добавки повинні бути нетоксичними для реципієнтів у використовуваних дозах і концентраціях.

Буферні речовини допомагають підтримувати рН у діапазоні, що приблизно відповідає фізіологічним умовам. Вони, переважно, присутні в діапазоні концентрацій від приблизно 2 мм до приблизно 50 мм. Прийнятні буферні речовини для використання за даним винаходом включають як органічні, так і неорганічні кислоти і їхні солі, такі як цитратні буфери (наприклад, суміш цитрату натрію однозаміщеного і цитрату натрію двозаміщеного, суміш лимонної кислоти і цитрату натрію тризаміщеного, суміш лимонної кислоти і цитрату натрію однозаміщеного і так далі), сукцинатні буфери (наприклад, суміш бурштинової кислоти і сукцинату натрію однозаміщеного, суміш бурштинової кислоти і гідроксиду натрію, суміш бурштинової кислоти і сукцинату натрію двозаміщеного і так далі), тартратні буфери (наприклад, суміш винної кислоти і тартрату натрію, суміш винної кислоти і тартрату калію, суміш винної кислоти і гідроксиду натрію і так далі), фумаратні буфери (наприклад, суміш фумарової кислоти і фумарату натрію однозаміщеного і так далі), фумаратні буфери (наприклад, суміш фумарової кислоти і фумарату натрію однозаміщеного, суміш фумарової кислоти і фумарату натрію дозаміщеного, суміш фумарату натрію однозаміщеного і фумарату натрію двозаміщеного і так далі), глюконатні буфери (наприклад, суміш глюконової кислоти і глюконату натрію, суміш глюконової кислоти і гідроксиду натрію, суміш глюконової кислоти і глюконату калію і так далі), оксалатні буфери

Зо (наприклад, суміш щавлевої кислоти й оксалату натрію, суміш щавлевої кислоти і гідроксиду натрію, суміш щавлевої кислоти й оксалату калію і так далі), лактатні буфери (наприклад, суміш молочної кислоти і лактату натрію, суміш молочної кислоти і гідроксиду натрію, суміш молочної кислоти і лактату калію і так далі) і ацетатні буфери (наприклад, суміш оцтової кислоти й ацетату натрію, суміш оцтової кислоти і гідроксиду натрію і так далі). Крім того, можна згадати фосфатні буфери, гістидинові буфери і триметиламінові солі, такі як Тріс.

Для уповільнення росту мікроорганізмів можна додавати консерванти, і їх можна додавати в кількостях 0,2 905-195 (вага/об'єм). Прийнятні консерванти для використання за даним винаходом включають фенол, бензиловий спирт, мета-крезол, метилпарабен, пропілпарабен, октадецилдиметилбензил амонію хлорид, галогеніди бензалконію (наприклад, хлорид, бромід, іодид), хлорид гексонію, алкілпарабени, такі як метил- або пропілпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол і З-пентанол.

Засоби, що додають ізотонічність, які іноді називають "стабілізаторами", можна додавати для забезпечення ізотонічності рідких композицій за даним винаходом, і вони включають багатоатомні цукрові спирти, переважно триатомні або цукрові спирти більш високого порядку, такі як гліцерин, еритрит, арабіт, ксиліт, сорбіт і маніт.

Стабілізатори належать до широкої категорії ексципієнтів, функції яких можуть варіювати від наповнювача до добавки, що солюбілізує терапевтичний засіб або допомагає запобігти денатурації або адгезії до стінок контейнера. Типові стабілізатори можуть являти собою багатоатомні цукрові спирти (перераховані вище); амінокислоти, такі як аргінін, лізин, гліцин, глютамін, аспарагін, гістидин, аланін, орнитін, І -лейцин, 2-фенілаланін, глютамінова кислота, треонін і так далі; органічні цукри або цукрові спирти, такі як лактоза, трегалоза, стахіоза, маніт, сорбіт, ксиліт, рибіт, міоіїнозит, галактит, гліцерин тощо, у тому числі циклотоли, такі як інозит; поліетиленгліколь; полімери амінокислот; сірковмісні відновники, такі як сечовина, глютатіон, тіоктова кислота, тіогліколят натрію, тіогліцерин, альфа-монотіогліцерин і тіосульфат натрію; низькомолекулярні поліпептиди (тобто, «10 залишків); білки, такі як людський сироватковий альбумін, бичачий сироватковий альбумін, або желатин імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як моносахариди полівінілпіролідону, наприклад, ксилоза, маноза, фруктоза, глюкоза; дисахариди, такі як лактоза, мальтоза, сахароза, і трисахариди, такі як рафіноза; полісахариди, такі як декстран. Стабілізатори можуть бути присутнім у діапазоні вагових часток від 0,1 до 60 10000 щодо ваги активного білка.

Неїіонні сурфактанти або детергенти (також відомі як "зволожуючі засоби") можна додавати для полегшення солюбілізації терапевтичного засобу, а також для захисту терапевтичного білка від викликаної перемішуванням агрегації, що також дозволяє препарату піддаватися впливу напруги поверхневого зрушення без денатурації білка. Придатні неіонні сурфактанти включають полісорбати (20, 80 і так далі), полоксамери (184, 188 і так далі), поліоли Ріигопіс." м, прості поліоксіетиленові моноефіри сорбітану (Тжеепитм-20, Тмуеєпитм-80 і так далі). Неїонні сурфактанти можуть бути присутнім у діапазоні від приблизно 0,05 мг/мл до приблизно 1,0 мг/мл, переважно, від приблизно 0,07 мг/мл до приблизно 0,2 мг/мл.

Додаткові різноманітні ексципієнти включають наповнювачі (наприклад, крохмаль), хелатуючі речовини (наприклад, ЕДТА), антиоксиданти (наприклад, аскорбінова кислота, метіонін, вітамін Е) і розчинники. Препарат у даному документі також може містити більше однієї активної сполуки, якщо це необхідно в результаті індивідуальних показань до лікування, переважно, тих з них із вваємодоповнюючими активностями, що не будуть впливати один на одного. Наприклад, може виявитися бажаним додатково включати імунодепресант. Зручно, коли такі молекули присутні в сполуці в кількостях, що є ефективними для намічених цілей.

Активні інгредієнти можна також укладати в підготовлені мікрокапсули, наприклад, методом коацервації або шляхом міжфазної полімеризації, наприклад, гідроксиметилцелюлозні або желатинові мікрокапсули і полі-"«метилметакрилат)ні мікрокапсули, відповідно, у колоїдні системи доставки лікарських засобів (наприклад, ліпосоми, мікросфери альбуміну, мікроемульсії, наночастинки і нанокапсули) або в макроемульсії. Такі методи розкриті в

ВетіпдюпА"5 Рнаптасеціїса! Зсієпсев, 161й єдійоп, А. Озаї, Ед. (1980).

Використовувані для введення іп мімо препарати повинні бути стерильними. Це легко здійснювати, наприклад, шляхом фільтрації через стерильні фільтрувальні мембрани. Можна створювати препарати з уповільненим вивільненням. Прийнятні приклади препаратів з уповільненим вивільненням включають напівпроникні матриці твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло, або варіант антитіла, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент), якісь матриці знаходяться у вигляді формованих виробів, наприклад, плівок або мікрокапсул. Приклади матриць з уповільненим вивільненням включають поліефіри, гідрогелі (наприклад, полі(2-гідроксіетилметакрилат) або полі(вініловий спирт)), полілактиди (патент США

Зо Мо 3773919), співполімери І-глютамінової кислоти і етил-І-глютамату, недеградуючий етиленвінілацетат, деградуючі співполімери молочної кислоти і гліколевої кислоти, такі як

ГОРКОМ ОЕРОТ "М (ін'єктовані мікросфери, що складаються зі співполімеру молочної кислоти і гліколевої кислоти і лейпролідацетату), і полі-О-(-)-3-оксимасляну кислоту. У той час як полімери, такі як полімери етилену і вінілацетату, а також молочної кислоти і гліколевої кислоти дають можливість вивільнення молекул протягом більше 100 днів, деякі гідрогелі вивільняють білки за більш короткі періоди часу. Коли інкапсульовані антитіла залишаються в організмі протягом тривалого часу, вони можуть денатурувати або агрегувати у результаті впливу вологи при 37 "С, що призводить до втрати біологічної активності і можливих змін у імуногенності.

Можна розробити раціональну стратегію стабілізації в залежності від використовуваного механізму. Наприклад, якщо встановлено, що механізм агрегації являє собою утворення міжмолекулярних 5-5 зв'язків за допомогою тіо-дисульфідного обміну, стабілізацію можна забезпечити шляхом модифікації сульфгідрильних залишків, ліофілізації з кислих розчинів, контролю вологості за допомогою відповідних добавок і розробки конкретних композицій полімерної матриці.

Сполуки за винаходом для запобігання або лікування захворювання або патологічного стану очей, як правило, вводять очною, внутрішньоочною і/або інтравітреальною ін'єкцією, і/або навколосклеральною ін'єкцією, і/або субтеноновою ін'єкцією, і/або суперхоріоїдальною ін'єкцією, іМабо локальним введенням у вигляді очних крапель і/або мазі. Такі сполуки за винаходом можна доставляти множиною різних способів, наприклад, інтравітреально у вигляді пристрою і/або депо, що забезпечує повільне вивільнення сполуки в склоподібне тіло, у тому числі тих, які описані в літературі, наприклад, Іпігаосшіаг Огид Оеїїмегу, Уапйе, Чайне, Авпюп, ап Реаїгзгоп, еййоге, Тауїог 4 Егапсі5 (Магсйп 2006). В одному прикладі пристрій може бути у формі мінінасоса іабо матриці, і/або системи пасивної дифузії, іиабо інкапсульованих комірок, що вивільняють сполуку протягом тривалого періоду часу (Іпігтаосшаг Огид Оеєїїмегу, Чайне, Чане, Азпюп, апа

Реагхоп, еайоге, Тауог 8 Егапсіз (Магсй 2006). Можна також використовувати інші способи введення, що включають, але не обмежувані ними, локальне, парентеральне, підшкірне, внутрішньоочеревинне, внутрішньолегеневе, інтраназальне і внутрішньоосередкове введення.

Парентеральні інфузії включають внутрішньом'язове, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньоочеревинне або підшкірне введення.

Препарати для очного, внутрішньочного або інтравітреального введення можна одержувати способами і з використанням інгредієнтів, що відомі в даній галузі. Основною вимогою для ефективного лікування є належне проникнення крізь око. На відміну від захворювань передньої частини ока, коли лікарські засоби можна доставляти локально, захворювання сітківки вимагають більш специфічно спрямованого підходу. Очні краплі і мазі рідко проникають до задньої частини ока і гематоофтальмічний бар'єр перешкоджає проникненню лікарських засобів, що вводяться системно в очні тканини. Відповідно, як правило, який вибираються способом доставки лікарського засобу для лікування захворювання сітківки, такого як АМО і

СММ, є пряма |інтравітреальна ін'єкція. Інтравітреальні ін'єкції звичайно повторюють з інтервалами, що залежать від стану пацієнта, а також властивостей і часу напівжиття лікарського засобу, що доставляється. Для внутрішньочного (наприклад, інтравітреального) проникнення, як правило, більш переважними є молекули меншого розміру.

Ефективність лікування зв'язаних з комплементом патологічних станів очей, таких як АМО або СММ, можна оцінювати за допомогою системи різних очікуваних результатів, звичайно використовуваної для кількісної оцінки тяжкості внутрішньочних захворювань. Наприклад, можна оцінювати втрату зору. Утрату зору можна оцінювати, у числі іншого, наприклад, вимірюючи середню зміну гостроти зору з максимальною корекцією (ВСМА) від вихідного рівня до необхідного моменту часу (наприклад, коли ВСМА основана на таблиці для визначення гостроти зору по програмі Досліджень Раннього Лікування Діабетичної Ретинопатії (ЕТОКЗ) і обстеженні на тестовій відстані 4 метри), визначаючи кількість суб'єктів, що втрачають менше 15 символів у таблиці гостроти зору в необхідний момент часу в порівнянні з вихідним рівнем, визначаючи кількість суб'єктів, що додали 15 або більше символів таблиці гостроти зору в необхідний момент часу в порівнянні з вихідним рівнем, визначаючи кількість суб'єктів з еквівалентом гостроти зору Снеллена 20/2000 або гірше в необхідний момент часу, проводячи виміру по опитувальному листі функціональності зору МЕЇ, визначаючи масштаб СММ і об'єму витоку при СММ у необхідний момент часу, наприклад, за допомогою флуоресцеїнової ангіографії, і так далі Можна проводити офтальмологічне обстеження, наприклад, що включають, але не обмежуються ними, проведення медичного огляду очей, вимірювання внутрішньоочного тиску, вимірювання гостроти зору, вимірювання внутрішньочного тиску за

Зо допомогою щілинної лампи, оцінку внутрішньочного запалення і так далі.

Кількість терапевтичного поліпептиду, антитіла або варіанта даного антитіла, або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента), що буде ефективним для лікування конкретного захворювання або патологічного стану, буде залежати від природи даного захворювання або патологічного стану і може бути визначено стандартними клінічними методами. Там, де можливо, бажано визначати криву залежності від дози фармацевтичних композицій за винаходом спочатку іп міїго, а потім за допомогою застосовних модельних систем на тварин до початку випробувань на людях.

В одному варіанті здійснення водяний розчин терапевтичного поліпептиду, антитіла або варіанта даного антитіла, або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента) уводять підшкірною ін'єкцією. В іншому варіанті здійснення водяний розчин терапевтичного поліпептиду, антитіла або варіанта даного антитіла, або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента) вводять інтравітреальної ін'єкцією. Кожна доза може знаходитися в діапазоні від приблизно 0,5 мкг до приблизно 50 мкг на кілограм маси тіла, або більш переважно від приблизно З мкг до приблизно 30 мкг на кілограм маси тіла.

Режим дозування для підшкірного введення може варіювати від одного разу на місяць до щоденного, у залежності від ряду клінічних факторів, у тому числі типу захворювання, тяжкості захворювання і чутливості суб'єкта до терапевтичного засобу.

Наступні приклади приводяться винятково в ілюстративних цілях і не призначені для обмеження обсягу дійсного винаходу будь-яким чином.

Повний зміст усіх патентних і літературних джерел, цитованих у даному описі, спеціально включено в даний документ за допомогою посилання.

Вироби і набори

Інший варіант здійснення винаходу являє собою виріб, що містить матеріали, корисні для лікування, запобігання і/або діагностики патологічних станів, на які спрямовані антитіла за даним винаходом або їхні варіанти, або їхні фрагменти (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти). Наприклад, винахід належить до виробу, що містить матеріали, корисні для лікування, запобігання і/або діагностики захворювань, пов'язаних з комплементом. Виріб включає контейнер і етикетку або листок-вкладиш в упаковці або прикріплений до контейнера.

Придатні контейнери включають, наприклад, пляшечки, флакони, шприци і так далі. Контейнери бо можуть бути створені з різних матеріалів, таких як стекло, або пластик. Контейнер містить композицію, ефективну для лікування, запобігання і/або діагностики зв'язаного з комплементом захворювання і може мати стерильний вхідний отвір (наприклад, контейнер може являти собою мішок із внутрішньовенним розчином або флакон, що має пробку, яка проколюється голкою для підшкірних ін'єкцій). Щонайменше одним активним засобом у композиції є антитіло проти фактора ОО або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) за винаходом.

Етикетка або листок-вкладиш в упаковці вказує, що дана композиція корисна для лікування, запобігання і/або діагностики конкретного патологічного стану.

У листку-вкладиші містяться інструкції терапевтичних засобів, що включаються звичайно в комерційні упаковки, що інформують про показання, застосування, дозування, введення, протипоказання і/або попередження, що стосуються застосування таких терапевтичних засобів.

В одному варіанті здійснення або етикетка листок-вкладиш вказує, що композицію використовують для лікування захворювань, пов'язаних з комплементом, таких як, наприклад, будь-які патологічні стани, перераховані раніше, включаючи захворювання очей, наприклад, вікову макулярну дегенерацію (АМО). Етикетка або листок-вкладиш додатково містить інструкції з введення даної композиції антитіл пацієнту.

Крім того, виріб може додатково включати другий контейнер, що містить фармацевтично прийнятний буферний розчин, такий як бактеріостатична вода для ін'єкцій (ВУМЕІ), фосфатно- сольовий буферний розчин, розчин Рінгера і розчин декстрози. Він також може містити інші матеріали, бажані з комерційної і споживчої точок зору, включаючи інші буферні розчини, розріджувачі, фільтри, голки і шприци.

В іншому варіанті здійснення запропоновані також набори, корисні для різних цілей, наприклад, для лікування, запобігання і/або діагностики захворювань, пов'язаних з комплементом, для аналізів на зв'язаний з комплементом гемоліз, для очищення або імунопреципітації поліпептиду фактора О із клітин. Для виділення й очищення поліпептиду фактора О набір може містити антитіло проти фактора 0, зв'язане з гранулами (наприклад, гранулами сефарози). Можна створювати набори, що містять антитіла для виявлення і кількісного визначення поліпептиду фактора 0 іп міго, наприклад, методом ЕГІЗА або вестерн- блотингу. Як і у випадку виробу, набір включає контейнер і етикетку або листок-вкладиш на або поверхні прикріплені до контейнера. У контейнері знаходиться композиція, що містить

Зо щонайменше одне антитіло проти фактора ОО його або фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) за винаходом. Можна включати додаткові контейнери, що містять, наприклад, розріджувачі і буферні розчини, контрольні антитіла. Або етикетка листок- вкладиш може містити опис композиції, а також інструкції для використання по призначенню іп міго або для детекції. Етикетка або листок-вкладиш може містити інструкції із введення (наприклад, антитіла або фрагмента даного антитіла (наприклад, антигензв'язувального фрагмента)) суб'єкту.

Використання гуманізованого антитіла

Гуманізовані антитіла або їхні фрагменти (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти), або їхні варіанти за даним винаходом застосовні в діагностичних аналізах, наприклад, для виявлення експресії цікавлячих цілей у конкретних клітинах, або тканинах сироватках. Для діагностичного застосування антитіло або варіант даного антитіла, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент), як правило, мітять детектований фрагментом.

Доступні різні мітки. Методи кількісного визначення зміни флуоресценції описані вище. У хемілюмінесцентного субстрату в результаті хімічної реакції електрони стають збудженими, після чого він здатний випромінювати світло, яким можна вимірювати (за допомогою хемілюмінометра, наприклад), або він передає енергію флуоресціюючому акцептору. Приклади ферментативних міток включають люциферази (наприклад, люциферазу світлячків і бактеріальну люциферазу, патент США Мо 4737456), люциферин, 2,3-дигідрофталазіндіони, малатдегідрогеназу, уреазу, пероксидазу, таку як пероксидаза хріну (НКРО), лужну фосфатазу, бета-галактозидазу, глюкоамілазу, лізоцим, сахаридоксидази (наприклад, глюкозоксидазу, галактозоксидазу і глюкозо-6-фосфат дегідрогеназу), гетероцикличні оксидази (такі як уриказа і ксантиноксидаза), лактопероксидазу, мікропероксидазу і т. п... Методи кон'югації ферментів з антитілами описані в О'ЗцйіЇїмап еї аї., Меїйоавз ог (пе Ргерагайоп ої Еплуте-Апіїроду Сопідаїев ог бе іп Епгуте Іттипоаззау, іп Меїйпоа5 іп Епгут. (Ед. У. Іапдопе 4 Н. Мап Мипаків),

Асадетіс ргез55, Мем/ Могк, 73: 147-166 (1981).

Іноді мітка не прямо кон'югована з антитілом або варіантом даного антитіла, або його фрагментом (наприклад, антигензв'язуюючим фрагментом). Кваліфікованому фахівцю відомі різні способи досягнення цієї мети. Наприклад, Антитіло або варіант даного антитіла, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) можна кон'югувати з біотином, і кожну з бо трьох великих категорій вищевказаних міток можна кон'югувати з авідином, або навпаки. Біотин винахідливо зв'язує авідин і, отже, мітку можна кон'югувати з антитілом або варіантом даного антитіла, або його фрагментом (наприклад, антигензв'язуюючим фрагментом) таким непрямим чином. Альтернативно, для здійснення непрямої кон'югації мітки з антитілом або варіантом даного антитіла, або його фрагментом (наприклад, антигензв'язуюючим фрагментом) антитіло або варіант даного антитіла, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) кон'югують з низькомолекулярним гаптеном (наприклад, диглоксином), а одну з різних типів вищевказаних міток кон'югують з антитілом проти гаптену або варіантом даного антитіла (наприклад, антитіла проти диглоксину), або його фрагментом (наприклад, антигензв'язуюючим фрагментом). Таким чином, можна здійснювати непряму кон'югацію мітки з антитілом або варіантом даного антитіла, або його фрагментом (наприклад, антигензв'язуюючим фрагментом).

В іншому варіанті здійснення винаходу немає необхідності мітити антитіло або варіант даного антитіла, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент), і його присутність можна виявляти за допомогою міченого антитіла, що зв'язується з даним антитілом або варіантом даного антитіла, або його фрагментом (наприклад, антигензв'язуюючим фрагментом).

Антитіла або варіанти даних антитіл, або їхні фрагменти (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти) за даним винаходом можна використовувати в будь-якому відомому методі аналізу, такому як аналіз конкурентного зв'язування, прямі і непрямі сандвічі-аналізи й аналізи імунопреципітації. 20іа, Мопосіопа! Апііроадіе5: А Мапиаї ої Тесппіднев, рр. 147-158 (СВО Ргезв,

Іпс. 1987).

Аналіз конкурентного зв'язування оснований на здатності міченого стандарту конкурувати з досліджуваним зразком за зв'язування з обмеженою кількістю антитіла або варіанта даного антитіла, або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента). Кількість мішені в досліджуваному зразку обернено пропорційно кількості стандарту, що зв'язується з антитілами.

Для спрощення визначення кількості стандарту, що зв'язується, антитіла, як правило, переводять у нерозчинну форму до або після конкурування. У результаті стандарт і досліджуваний зразок, що зв'язані з антитілами, можна легко відокремлювати від стандарту і досліджуваного зразка, що залишаються незв'язаними.

Зо Сандвічі-аналізи включають використання двох антитіл або їхніх фрагментів (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів), кожне з який здатне зв'язуватися з різною імуногенною частиною або епітопом, або білком для визначення. У сандвіч-аналізі призначений для аналізу досліджуваний зразок зв'язується з першим антитілом, що іммобілізовано на твердому носії, а потім друге антитіло зв'язується з досліджуваним зразком, утворюючи нерозчинний комплекс із трьох компонентів. Дивися, наприклад, патент США Мо 4376110. Саме друге антитіло можна мітити детекованим фрагментом (прямий сандвіч-аналіз) або його можна кількісно визначати за допомогою антитіла проти імуноглобуліну, що помічено детекованим фрагментом (непрямий сандвіч-аналіз). Наприклад, одним з видів сандвіч-аналізу є аналіз ЕГІЗА, у цьому випадку детекованим фрагментом є фермент.

Для імуногістохімічного дослідження зразок пухлини може бути свіжим або замороженим, або може бути вміщений у парафін і фіксований консервантом, наприклад, таким як формалін.

Антитіла або варіанти даних антитіл, або їхні фрагменти (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти) можна також використовувати для діагностичних аналізів іп мімо. Як правило, антитіло або варіант даного антитіла, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) мітять радіонуклідами (такими як "п, 99Тс, 140, 1911, ЗН, З2Р або 355) так, що пухлина можна локалізувати за допомогою імуносцинтиграфії. Наприклад, можна використовувати високоафінне антитіло проти Ід за даним винаходом для визначення кількості Ід, що присутні, наприклад, у легенях страждаючого астмою пацієнта.

Антитіло або варіант даного антитіла, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) за даним винаходом можна пропонувати в наборі, тобто, упакованої сукупності реагентів у заданих кількостях з інструкціями для виконання діагностичного аналізу. Коли антитіло або варіант даного антитіла, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) мітять ферментом, набір може включати субстрати і кофактори, необхідні ферменту (наприклад, попередник субстрату, що надає детектований хромофор або флуорофор). Крім того, можна включати й інші добавки, такі як стабілізатори, буферні розчини (наприклад, що блокує буфер або лізисний буфер) тощо. Відносні кількості різних реагентів можуть варіювати в широких межах для забезпечення концентрації в розчині реагентів, що істотно оптимізує чутливість аналізу. Зокрема, реагенти можна поставляти у вигляді сухих порошків, як правило, ліофілізованих, включаючи ексципієнти, що при розчиненні забезпечують розчин реагенту, що бо має відповідну концентрацію.

Способи застосування антитіла іп мімо

Передбачається, що антитіла або похідні від них антитіла, або їхні фрагменти (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти) за даним винаходом можна використовувати для лікування ссавців. В одному варіанті здійснення антитіло або похідне від нього антитіло вводять ссавцю, відмінному від людини, наприклад, з метою одержання доклінічних даних. Типові ссавці, відмінні від людини, що підлягають лікуванню, включають нелюдиноподібних приматів, собак, кішок, гризунів і інших ссавців, на яких виконують доклінічні дослідження. Такі ссавці можуть являти собою загальноприйняті тваринні моделі захворювання, що підлягає лікуванню за допомогою антитіла або похідного від нього антитіла, або можуть бути використані для дослідження токсичності цікавлячого антитіла. У кожному з таких варіантів здійснення на ссавці можна виконувати дослідження зі збільшенням дозування.

Антитіло або його варіант, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент), або поліпептид вводять будь-яким прийнятним способом, включаючи парентеральне, підшкірне, внутрішньоочеревинне, внутрішньолегеневе і інтраназальне введення, а також, якщо необхідний місцевий імуносупресорний вплив, внутрішньоосередкове введення. Парентеральні інфузії включають внутрішньом'язове, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньоочеревинне або підшкірне введення. Крім того, антитіло або варіант даного антитіла, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) можна вводити імпульсною інфузією, особливо зі зниженням дози антитіла або варіанта даного антитіла, або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента) Краще введення роблять за допомогою ін'єкцій, найбільш переважно внутрішньовенних або підшкірних ін'єкцій, почасти в залежності від того, чи є введення короткочасним або хронічним.

Для запобігання або лікування захворювання відповідне дозування антитіла або варіанта даного антитіла, або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента), або поліпептиду буде залежати від типу захворювання, що підлягає лікуванню, ступеню тяжкості і перебігу захворювання, від того, чи вводять антитіло або варіант даного антитіла, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) із профілактичною або терапевтичною метою, від попередньої терапії, клінічної історії пацієнта і реакції на антитіло або варіант даного антитіла, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент), а також від розсуду

Зо лікуючого лікаря.

У залежності від типу і тяжкості захворювання приблизно від 0,1 мг/кг до 150 мг/кг маси тіла (наприклад, 0,1-20 мг/кг) або антитіла варіанта даного антитіла, або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента) є потенційною початковою дозою для введення пацієнту, наприклад, або одним, або декількома окремими введеннями, або шляхом безупинної інфузії. Типова добова доза може варіювати від приблизно 1 мг/кг до 100 мг/кг маси тіла або більше у залежності від згаданих вище факторів. Для повторних введень протягом декількох днів або довше, у залежності від стану, лікування продовжують до бажаного придушення симптомів хвороби. Однак можуть бути корисні інші режими дозування. Успішність даного лікування можна легко контролювати загальноприйнятими методами й аналізами. Типовий режим дозування розкритий у УМО 94/04188.

Композиції з антитілом можна складати, дозувати і вводити відповідно до належної медичної практики. Фактори, які варто брати до уваги в даному контексті, включають конкретне виліковувань захворювання, конкретний ссавець, що піддається лікуванню, клінічний стан окремого пацієнта, причину захворювання, зону доставки засобу, спосіб введення, графік введень і інші фактори, відомі практикуючим медичним працівникам. "Терапевтично ефективна кількість" антитіла або варіанта даного антитіла, або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента), яке варто вводити, буде регулюватися такими розуміннями і являє собою мінімальна кількість, необхідне для запобігання, поліпшення або стану лікування або захворювання порушення. Антитіло або варіант даного антитіла, або його фрагмент (наприклад, антигензв'язувальний фрагмент) не обов'язково повинен, але при бажанні сполучається в препараті з одним або декількома засобами, у даний час використовуваними для запобігання і лікування розглянутого захворювання. Ефективна кількість таких інших засобів залежить від кількості антитіла або варіанта даного антитіла, або його фрагмента (наприклад, антигензв'язувального фрагмента), що присутні у препараті, від типу захворювання або лікування, а також інших факторів, зазначених вище. Як правило, їх використовують у тих же дозах і з застосуванням тих же шляхів введення, що зазначені раніше в даному документі, або приблизно від 1 до 99 95 від раніше зазначених доз.

Антитіла або варіанти даних антитіл, або їхні фрагменти (наприклад, антигензв'язувальні фрагменти) за даним винаходом, що виїзнають фактор ЮО як свою мішень, можна бо використовувати для лікування захворювань, пов'язаних з комплементом. Ці захворювання зв'язані з надлишковою або неконтрольованою активацією комплементу. Вони включають: активацію комплементу в процесі операцій серцево-легеневого шунтування, активацію комплементу в результаті ішемії-реперфузії при гострому інфаркті міокарда, аневризми, інсульту, геморагічного шоку, ушкодження з роздробленням тканин, поліорганної недостатності, гіповолемічного шоку ії кишкової ішемії. Ці захворювання можуть також включати захворювання або стан, що представляє собою запальний стан, таке як тяжкі опіки, ендотоксемія, септичний шок, респіраторний дистрес-синдром дорослих, гемодіаліз, анафілактичний шок, тяжка форма астми, набряк Квінке, хвороба Крона, серповидно-клітинна анемія, постстрептококовий гломерулонефрит і панкреатит. Захворювання може бути результатом побічної дії лікарських засобів, лікарської алергії, індукованого І/-2 синдрому судинного випоту або алергії на рентгеноконтрастну речовину. Сюди також належать аутоїмунні захворювання, такі як системний червоний вовчак, міастенія, ревматоїдний артрит, хвороба Альцгеймера і розсіяний склероз. Активація комплементу також зв'язана з відторгненням трансплантата. Останнім часом установлена наявність сильної кореляції між активацією комплементу й очних хвороб, таких як вікова макулярна дегенерація, діабетична ретинопатія й інші зв'язані з ішемією ретинопатії, хороїдальна неоваскуляризація (СММ), увеїт, діабетичний макулярний набряк, патологічна короткозорість, хвороба фон Хіпель-Ліндау, гістоплазмоз очей, оклюзія центральної вени сітківки (СКМО), неоваскуляризація рогівки і неоваскуляризація сітківки.

Приклади

Наступні приклади приводяться як ілюстрацію, а не з метою обмеження. Комерційно доступні реагенти, згадані в прикладах, були використані відповідно до інструкцій виробника, якщо не зазначене інше. Джерелом клітин, позначених у наступних прикладах і у всьому тексті опису номерами АТСС, є Американської колекції типових культур, 10801 Опімегейу Вошемага,

Мапаззавз, МА 20110-2209.

Приклад 1: Модифікація АТ (АбБз) проти фактора Ю

Для ідентифікації модифікованих антитіл проти фактора 0О і їхніх варіантів, і їхніх фрагментів (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів), що мали б комерційно бажані характеристики, такі як гомогенність у процесі виробництва й одержання, або для цілей аналітичної характеристики, використовували підхід сайт-спрямованого мутагенезу для одержання

Зо модифікованих гуманізованих антитіл проти фактора О і їхніх варіантів, і їхніх фрагментів (наприклад, антигензв'язувальних фрагментів). По-перше, варіабельні домени важкого і легкого ланцюга з гуманізованого Бар проти фактора ЮО клону Мо 111 (ЗЕО ІО Мо: 2 і 5ЕО ІЮО Мо: 1, відповідно) субклонували в експресійну плазміду. По-друге, олігонуклеотиди кодуючі одиничні мутації, відпалювали з отриманою експресійною плазмідою для внесення сайт-спрямованих мутацій.

Спочатку варіабельні домени важкого і легкого ланцюга гуманізованого Бар проти фактора

О клону Мо 111 субклонували в плазміду рРАЕРІ (рАЕРІТ являє собою плазміду для експресії

Еаб-антитіл у Е.сої), при цьому субклонування призводило до введення залишку валіну (М) на позицію 104 (по нумерації Кабаї, дивися фігуру 10) варіабельного домену легкого ланцюга.

Субклонування варіабельного домену легкого ланцюга гуманізованого баб проти фактора Ю клону Мо 111 у рАЕРІТ включало лігування двох фрагментів ДНК. Перший фрагмент являв собою вектор рАЕР'Ї, у якому був вилучений невеликий фрагмент ЕсоеМ/Крп. Другий фрагмент являв собою ПЛР-фрагмент ЕсоЕМ-Крп приблизно з 300 пар основ, отриманий із плазміди легкого ланцюга гуманізованого бар проти фактора О клону Мо 111 за допомогою наступних праймерів: 5-ПТОоССТТТОАТАТССАСатадсссАаТатстТоСАТОСТ-3' (ЗЕО ІО Ме: 67) 5Б-тпптоссстттсатАсСсСстТайССАААСататАСаасСАААаААТО-З (ЗЕО ІО Мо: 68).

Субклонування варіабельного домену легкого ланцюга гуманізованого Раб проти фактора Ю клону Мо 111 у рАЕРІТ призводило до введення залишку валіну (М) на позицію 104, оскільки позиція 104 знаходиться на 2 амінокислоти нижче сайтів ендонуклеази рестрикції, ЕСОКМ і Крп, що використовували для вбудовування варіабельного домену легкого ланцюга гуманізованого

Еар проти фактора О клону Мо 111 у рАЕРТ, і в результаті цього - у каркасі плазміди рАЕР'1.

Отримана проміжна плазміда в даному документі називається "рРАЕР1-283-МІ ".

Субклонування варіабельного домену важкого ланцюга гуманізованого Бар проти фактора Ю клону Мо 111 у рАЕР1-238-МІ. включало лігування двох фрагментів ДНК. Перший фрагмент являв собою вектор рАЕР1-238-МІ,, у якому був вилучений невеликий фрагмент ВзіуУМ/РЗрОМІ.

Другий фрагмент являв собою ПЛР-фрагмент В5імМмІі-РероОМІ приблизно з 364 пар основ, отриманий із плазміди важкого ланцюга гуманізованого баб проти фактора О клону Мо 111 за допомогою наступних праймерів: (510) 5Б-тптасатттсатАаСсастоада,аатоСАаасСстасТасСААТСТОасца-3 (ЗЕО ІО Мо: 69) 5О0

5Б-птасаттаеасасоставатасааваставдасАаАСа,атаАССАсИастТ-3 (5ЕО ІЮ Ме: 70).

Це лігування двох фрагментів ДНК призводило до створення плазміди для гуманізованого варіанта Баб-антитіла проти фактора О 238 (також позначеного в даному документі "238", плазміда в даному документі позначена "р238").

Після субклонування варіабельних доменів легкого і важкого ланцюга з гуманізованого Раб проти фактора О клону Мо 111 використовували сайт-спрямований ПЛР-мутагенез для мутування залишку глютаміну (С) на позиції 1 (нумерація по Караї, дивися фігуру 1) варіабельного домену важкого ланцюга гуманізованого варіанта Рар-антитіла проти фактора Ю 238 у глютамат (Е), що призводило до створення гуманізованого варіанта Раб-антитіла проти фактора О 238-1 (також позначеного в даному документі "238-1"). Конструювання плазміди для гуманізованого варіанта Раб-антитіла проти фактора ОО 238-1 (плазміда в даному документі позначена "р238-1") включало лігування двох фрагментів ДНК. Перший фрагмент являв собою вектор р238, у якому був вилучений невеликий фрагмент ВзіуМи/Р5роОМІ. Другий фрагмент являв собою ПЛР-фрагмент ВзіумМ-РороМіІ приблизно з 364 пар основ, отриманий із плазміди р238 за допомогою наступних праймерів: 5Б-тптасатттсатАяСастаддатоСсАаастаатасСААТСТОаса-3' (5ЕО І Мо: 71) 5Б-птасаттаеасасоставатасааваставдасАаАСа,атаАССАсИастТ-3 (5ЕО ІЮ Ме: 72).

Це лігування двох фрагментів ДНК призводило до створення плазміди для гуманізованого варіанта Раб-антитіла проти фактора О 238-1 (також позначеного в даному документі "238-17, плазміда в даному документі позначена "р238-1"), що містила сайт-спрямовану мутацію на позиції 1 у глютамат (Е) Установлено, що дана мутація інгібує часткове перетворення глютаміну (С) у гуманізованому варіанті Гар-антитіла проти фактора О 238-1 у піроглютамат (АтрпНіей, а. еї а!., Рнагт. Віоїеснпо)., 9: 1-140 (1996)).

Подальший сайт-спрямований ПЛР-мутагенез можна використовувати для мутування залишків метіоніну (М або Ме) або триптофану (М/ або Тгр) з метою запобігання окисненню, або для мутування залишків аспарагіну (М або Авзп) для запобігання дезамідуванню. Щоб запобігти утворенню окиснених варіантів гуманізованих антитіл проти фактора 0, залишки метіоніну (М або Мед), наприклад, на позиції 33 легкого ланцюга можна мутувати у лейцин (Ї або І еи), що найближчий по розмірах і гідрофобності до метіоніну, однак позбавлений сірки для окиснення,

Зо або альтернативно мутувати у ізолейцин (І або Пе) (Атрпей, 0. еї аІ., Рпапгт. Віотесппої., 9: 1- 140 (1996)). Щоб запобігти утворенню дезамідованих варіантів гуманізованих антитіл проти фактора 0, залишки аспарагіну (М або Авзп), наприклад, на позиції 34 і 52 легкого ланцюга, або позиції 99 або 100 важкого ланцюга можна мутувати у глютамін (0 або Сіп), що найближчий по хімічних властивостях до аспарагіну (М або Авп), або мутувати в аланін (А або Аїа) або серин (5 або 5ег), що є загальноприйнятими замінами на даних позиціях в інших антитілах (Атрпей, о. еї аї., Рнатпт. Віотесппо)!., 9: 1-140 (1996)).

На фігурах 1-2 представлені послідовності варіабельного домену легкого ланцюга і варіабельного домену важкого ланцюга для гуманізованого варіанта ЕРаб-антитіла проти фактора О 238 (ЗЕО ІО МоМе: 6 і 18, відповідно) і гуманізованого варіанта Раб-антитіла проти фактора 0 238-1 (5ЕБО ІЮО МоМо: 7 і 19, відповідно). На фігурі 4 і фігурі 6 представлені послідовності легкого ланцюга і важкого ланцюга (ЗЕО ІЮ МоМо: 47 і 54, відповідно) для гуманізованого варіанта Раб-антитіла проти фактора О 238. На фігурі 8 і фігурі 10 представлені послідовності легкого ланцюга і важкого ланцюга (ЗЕ ІО МоМо: 61 їі 63, відповідно) для гуманізованого варіанта Рар-антитіла проти фактора О 238-1.

Дані ВіаСоге демонстрували афінність гуманізованого варіанта Раб-антитіла проти фактора р 238 до людського фактора 0, а також афінність гуманізованого повнорозмірного варіанта мАТ проти фактора О клону Мо 111 (гуманізоване повнорозмірне мАТ проти фактора О 234) (позначене в даному документі "234" або "повнорозмірне мАТ проти фактора Ю 234" або "гуманізоване повнорозмірне мАТ проти фактора О 234") (таблиця 2). Гуманізовані варіанти

Еаб-антитіла проти фактора О 238 і 238-1 також тестували в аналізі інгібування гемолізу (фігура 11) для оцінки інгібування альтернативного шляху (дивись приклад 3).

Приклад 2: Аналіз гемолізу, зв'язаного з АР

Біологічну функцію модифікованих АТ проти фактора О визначали за допомогою аналізу інгібування гемолізу з використанням виснаженої по С1д людської сироватки й аналізу ВіаСоге (дивися приклад З нижче). Гемолітичний аналіз проводили в такий спосіб.

Для визначення активності альтернативного шляху еритроцити кролика (Ег, Соїогадо Зегит) промивали Зх у СМУВ і ресуспендували до 2х109У/мл. Інгібітори (50 мкл) і 20 мкл суспензії Ег змішували 1:11 з СМВ/0,1 М ЕСТА/0),1М МОсСі». Активацію комплементу ініціювали додаванням виснаженої по С1д4 людської сироватки (щоб уникнути активації комплементу по класичному бо шляху) (СотрТесі; 30 мкл, розведеної 1:3 у СМВ). Після 30-хвилинної інкубації при кімнатній температурі, 200 мкл ЗМВ/ЛО мм ЕОТА додавали для зупинки реакції, і зразки центрифугували протягом 5 хв при 500 9. Гемоліз визначали в 200 мкл супернатанта, вимірюючи абсорбцію при 412 нм. Дані виражали як 95 гемолізу, індукованого під час відсутності інгібітору.

На фігурі 11 представлена інгібуюча дія гуманізованого Бар проти фактора О клону Мо 111 (ІСво-4,7-0,6 нМ), модифікованого Раб проти фактора О 238 (ІСто-6,4-0,6 нМ) і модифікованого

Еар проти фактора О 238-1 (ІСво-3,52-0,5 НМ) на гемоліз, зв'язаний з альтернативним шляхом, в аналізі гемолізу еритроцитів кролика с використанням виснаженої по С1д людської сироватки як джерела комплементу. Контролями були фактор Н ("людський !") (від СотртТесі) і антитіла проти глікопротеїну 120 ("хар120").

Приклад 3: Кінетичний аналіз Раб проти фактора О людини за допомогою ВіаСоге

Кінетичні константи і константи афінності для зв'язування людського фактора О (Адмапсей

Кезеагсі, Іпс.) з іммобілізованим модифікованим Бар проти фактора О 238 (позначеним у даному документі "238"; дивися приклад 1) визначали шляхом вимірів поверхневого плазмонного резонансу на приладах ВіаСоге 3000 і ВіаСоге А100. Для значень у таблиці 2, що приведені у вигляді результатів "ВіаСоге 3000/ВіаСоге А100", окремі експерименти виконували на кожному приладі і дані окремих експериментів аналізували для одержання кінетичних констант, а кінетичні константи усереднювали для одержання значень, представлених у таблиці 2. Альтернативно, кінетичні константи і константи афінності для зв'язування людського фактора

Ор можна вимірювати шляхом іммобілізації людського фактора 0 і вимірювання зв'язування мАТ або Раб, і можна вимірювати, використовуючи різні умови регенерації (наприклад, що включають 4М МасСі») або можна вимірювати, використовуючи різні буферні розчини для зв'язування (наприклад, що містять РВ5). Також аналізували гуманізований повнорозмірний варіант мАТ проти фактора ОО клону Мо 111 (позначений у даному документі "234" або "повнорозмірне мАТ проти фактора О 234" або "гуманізоване повнорозмірне мАТ проти фактора р 2347). 1. Іммобілізація

МАТ або Раб іммобілізували зв'язуванням через аміногрупи, використовуючи стандартний протокол виробника. Густину зв'язування регулювали шляхом зміни концентрації або рн ін'єкгованих розчинів мАТ або Бар таким чином, що загальний сигнал для насичуючого

Зо зв'язування людського фактора, ЮО складав від 50 до 150 резонансних одиниць (КИ). Після зв'язування необхідної кількості мАТ або Раб непрореагувавші функціональні групи сенсорного чіпа блокували ін'єкцією етаноламіну. 2. Кінетичний аналіз

Експерименти по зв'язуванню проводили шляхом ін'єкцій б0-мкл аліквот із серії розчинів людського фактора 0, що розрізняються по концентрації від 500 нМ до 0,98 нМ із 2-кратним кроком розведення. Усі зразки розбавляли в рухомому буфері, що складається з 150 мМ Масі, 0,01 95 ПГуееп-20 і одного з наступних компонентів буфера: (а) рН 7,2 (10 мМ НЕРЕЗ (4-(2- гідроксіетил)-1-піперазинетансульфонова кислота); (Б) рН 60 (10 мМ МЕБ5 (2-|М- морфоліно|єтансульфонова кислота); або рН 5,0 (10 мМ ацетат натрію). Швидкість потоку складала 30 мкл/хв і дисоціацію контролювали протягом 10 хвилин для кожної тестованої концентрації людського фактора 0. Сигнал (сенсограму), що спостерігається при ін'єкції тих же розчинів над контрольною коміркою (блокованої етеноламіном), віднімали із сенсограми. Між сенсограмами поверхня регенерували ін'єкцією 30 мкл 4М Маосі», щоб викликати дисоціацію людського фактора ОО, що залишається зв'язаним з іммобілізованим антитілом. Контрольну сенсограму, записану для ін'єкції одного тільки буфера над поверхнею сенсорного чіпа, віднімали із сенсограм для людського фактора 0. Ці дані аналізували нелінійною регресією відповідно до моделі зв'язування Ленгмюра 1:1 з використанням програми ВіАемаїЇчайоп м4.1.

Кінетичні константи і константи афінності представлені в таблиці 2 нижче. Технологія ВіаСоге обмежена і не дає можливість точно вимірювати швидкості асоціації, що є занадто великими (тобто, значення Ко менше, ніж приблизно 10 пМ) (Заївіеп еї а!., Апаї. Віоспет., 353: 181 (2006)).

Таблиця 2

Результати ВіаСоге

Ка(М-т18-1 ниаЕриниининининнининниннишншишишишиш

Модифікований Раб проти фактора 0 238 в їй 1,0х10-2 (р 7,2: А100) Т9х10 Тихо (1,0 пМ-ю0 05)

Модифікований Рар проти фактора 0 238 в 8 1,4х1072 (р 7,2:3000/А100) важх10 тако (1,4 пМн0,5)

Модифікований Рар проти фактора 0 238 в а 0,19х109 (рН 6; 3000) 1,9х10 3,6х10 (0,19 нМ-0,01) і Й -9

Модифікований Еаб проти фактора О 238 12х106 0,02 12,3х10 (РН 5хАТ00) (12,3 нМ 5-2)

Повнорозмірне мАТ проти фактора О 234 в а 0,7х1072 (рН 7,2: А100) Тяхто 1,3х10 (0,7 ріМ-0,04)

Повнорозмірне мАТ проти фактора О 234 в 8 1,1х1072 (р 7,2:3000/А100) Зжохто уко (11 пМжО,б)

Повнорозмірне мАТ проти фактора О 234 в а 0,вх109 (рН 6; 3000) 2,8х10 2210 (0,08 НМ 50,01)

Повнорозмірне мАТ проти фактора О 234 в їй дх109 (р 5: А100) 2,2х10 2.,0х10 (9,0 нМчи1,0)

Приклад 4: Аналіз гемолізу, зв'язаного з АР, при різних концентраціях фактора Ю

Біологічну функцію модифікованих АТ проти фактора О, включаючи Бар проти фактора Ю 238, визначали за допомогою аналізу інгібування гемолізу з використанням виснаженої по С14 людської сироватки й аналізу ВіаСоге (дивися приклад 2 вище) при трьох концентраціях у сироватці крові фактора 0.

Виснажену по С1д людську сироватку (СотрТесі), а також рідину склоподібного тіла і тканину оболонки Бруха з очей пацієнтів з АМО (отримані в результаті співробітництва з Соїе

Еує Іпзійше, СіІємеіапа, ОН) аналізували кількісним методом ЕГІЗБА для фактора О (дивися нижче). Концентрація фактора О у виснаженій по С1д сироватці складала 97 нм, у той час як рівень у рідині склоподібного тіла і тканини оболонки Бруха від пацієнтів з АМО складав 16,2-10,3 нм (середнєх50О, п-10).

Кількісний аналіз ЕГІЗА для фактора Ю проводили шляхом розведення поліклонального антитіла кози проти фактора ЮО людського комплементу (КО Зузіет5, Міппеароїї5, ММ) до концентрації 1 мкг/мл у фосфатно-сольовому буферному розчині (РВ5) і нанесення поліклонального антитіла проти фактора Ю (К850О Зузіет5, Міппеароїї5х, ММ) на 384-ямкові планшети для ЕГІ5ЗА (планшети високого зв'язування; Огеїпег Віо Опе (годи МУК Іпіегпайопаї,

Вгіддерогі, МУ) у процесі інкубації протягом ночі при 4 "С. Після промивання З рази промивним буфером (РВЗ/0,05 95 Тжмееп-20) планшети блокували протягом 1-2 годин сумішшю РВ5Б/0О,5 95 бичачого сироваткового альбуміну (ВЗА). Цю і всі інші інкубації проводили при кімнатній температурі на орбітальному шейкері. Стандартну криву для фактора О (Сотріетепі

Тесппооду, Іпс., Туїег, Техаз) одержували в суміші РВЗ/0,5 95 ВБА/О,05 95 Гуееп-20 у діапазоні 15,6-1000 пг/мл. Розморожували заморожені контрольні зразки, попередньо розведені для кількісного визначення в зонах високої, середньої і низької концентрацій на стандартній кривій.

Зразки виснаженої по С14 людської сироватки і рідини склоподібного тіла людини, а також лізат оболонки Бруха розчиняли, використовуючи розчин для розведення (РВБ/0,5 95 ВБА/0,5 95

Тмжееп-20). Після етапу блокування планшети промивали, додавали розведені зразки (сироватки, рідини склоподібного тіла і лізатів оболонки Бруха), стандартні і контрольні розчини

Зо і інкубували протягом 2 годин. Через 2 год. інкубації планшети промивали і фактор 0, що зв'язався, визначали в процесі 1-2 час інкубації з біотинільованим моноклональним антитілом проти фактора О (клон 907.1.16, отриманим у Сепепіесп, розведеним до концентрації 62,5 нг/мл) з наступною 30-хвилинною інкубацією з кон'югатом стрептавідин-пероксидазу хріну (5А-

НАР) (Атегзпат Рвпагтасіа Віоїесп, Різсаїажау, МУ), розведеним 1/10000 у розчині для розведення. Після етапу останнього промивання додавали тетраметилбензидин (Кігкедаага 8

Реггу Іарогаїйогіе5, Іпс., саййегериго, МО) і залишали для розвитку фарбування на 5-7 хв.

Реакцію зупиняли додаванням 1 М фосфорної кислоти. Оптичну густину визначали за допомогою мікропланшетного рідера (450 нм, референсна довжина хвилі 650 нм) і концентрації зразків розраховували, виходячи з чотирипараметричного припасування стандартних кривих.

Мінімальні концентрації фактора 0, які піддавались кількісному визначенню, у людських зразках рідини склоподібного тіла і лізатів оболонки Бруха складали 780 пг/мл (мінімальне розведення 1/50) і 156 пг/мл (мінімальне розведення 1/10), відповідно.

Для визначення значень ІСво і ІСео для інгібування альтернативного шляху комплементу за допомогою модифікованого Бар проти фактора О 238 у присутності фактора 0 у концентраціях, подібних до концентрацій фактора О у рідині склоподібного тіла і тканинах оболонки Бруха з очей пацієнтів з АМО, проводили гемолітичний аналіз як описаний у прикладі 2, використовуючи 10 95 виснажену по С14 сироватку (9,7 нМ фактор 0), або використовуючи 10 95 виснажену по

Ст4 сироватку, додатково збагачену фактором О (СотртТесі), для досягнення концентрацій фактора О, що представляють собою середню (16,2 нМ) або середню ж 1 50 (26,5 нМ) концентрацію, що спостерігається в рідині склоподібного тіла і тканинах оболонки Бруха з очей пацієнтів з АМО. Дані виражали у вигляді 95 гемолізу, індукованого під час відсутності інгібітору (фігура 12). Концентрації Баб проти фактора О 238, що викликають 50 95 і 90 95 інгібування гемолітичної реакції (значення ІСво і ІСоо, відповідно), визначали для трьох повторних експериментів шляхом нелінійної регресії кривих інгібування з використанням чотирипараметричної логістичної моделі (Каїеіїдасгарі, Зупегду ЗБоймаге, Кеадіпо, РА). Також розраховували молярні відношення значень ІСво і ІСео до відносної концентрації фактора 0.

Середні значення ІСво і ІСобо і молярні відношення представлені в таблиці 3.

Таблиця З

ІСво і ІСоо для Рар проти фактора Ю (нм) відношення . Молярне я

ІСсо/ відношення (ІСзо/Ї)

Приклад 5: Тривалість інгібування альтернативного шляху активації комплементу

Вимірювали змодельовану тривалість інгібування альтернативного шляху (АР) активації комплементу в оці людини за допомогою одиничної інтравітреальної (ІМТ) ін'єкції Раб проти фактора О 238 у дозі 2,5 мг (вважаючи час напівжиття (172) Раб проти фактора О 238-11,5 днів, на основі міжвидового масштабування від кролика) (приклад 13). Змодельовані дані основані на масштабування результатів РК дослідження одиничної інтравітреальної дози Раб 238 у кролику лінії Мем 7еаіапа Уупе.

Зо Для оцінки часу напівжиття Рар проти фактора О 238 в організмі людини розраховували час напівжиття антитіла проти фактора О 238 в організмі кроликів. Дванадцяти (12) кроликам лінії

Мем 2еаіапа М/пце вводили одиничну інтравітреальну дозу Бар 238, що складає 1 мг, у кожне око. Зразки рідини склоподібного тіла і тканини сітківки відбирали з обох очей у визначеного числа тварин у наступні часові точки: З тварин через 4, 24 і 96 годин (п-6 зразків у кожну з цих часових точок), одна тварина через 216 годин (п-:2 зразки в дану часову точку) і 2 тварин через 240 годин (п-4 зразки в дану часову точку). Концентрації Раб 238 в очних матрицях вимірювали методом ЕГІЗА зі зв'язуванням фактора 0.

Дані залежності концентрації в рідині склоподібного тіла від часу для усіх тварин аналізували для оцінки фармакокінетичних параметрів, застосовуючи підхід зі спрощеним об'єднаним пулом даних на моделі болюсного в/в введення (МодеїЇ5 201, М/пМопіїп Рго мегвіоп 5.2.1; Ріагзіднї Согрогайоп, Моипіаійп Міем, СА) для одержання однієї оцінки кінцевого часу напівжиття (Т1/2), що складає 3,83 днів. Коефіцієнт розподілу в сітківці був розрахований як співвідношення концентрацій у тканині сітківки і рідини склоподібного тіла, усереднене для всіх очей і всіх часових точок, і дорівнював 0,24. Параметри РК для рідини склоподібного тіла були масштабовані до людини за допомогою тих же коефіцієнтів перерахування, що і для ранібізумаба. Людське око, як передбачається, має Мі, що дорівнює 4 мл. Співвідношення часу напівжиття для організмів людини і кролика приблизно дорівнює 3, на підставі чого 112» у людини оцінюється в 11,5 днів. Це призводить до наступної оцінки концентрації в склоподібному тілі і концентрації в тканині сітківки в залежності від часу: концентрація в склоподібному тілі-(доза//ї)"ехр(-Іщ2г нг час) концентрація в тканині сітківки:(доза/м:) ехр(|-Іп(2)и»| час) "(коефіцієнт розподілу в сітківці)

На фігурі 13 представлений графік для одиничної ІТМ дози, що складає 2,5 мг/око, що охоплює час від 1-0 до 1-112 днів. ЇСео являє собою концентрацію Бар 238, що викликає 90 95 інгібіторний ефект в аналізі гемолізу, виконаному як зазначено в прикладах 2 і 4, у яких 10 95 об'єднану людську сироватку збагачували фактором ЮО до концентрації 16,2 нМ. Результат аналізу склав ІСео-38 нМ Рар 238. Для порівняння з концентраціями в сітківці і склоподібному тілі переводили молярність у масу за допомогою наступного рівняння:

ІСоо-38х1079 моль/л

МУУ для Рар 238-50000 грам/моль

ІСео (мкг/мл)-(38х107 моль/л) х (50х103 грам/моль)-1,9х107 грам/л або 1,9 мкг/мл

Як показано на фігурі 13, "дні вище ІСоо" оцінювали як кількість часу, коли концентрація в склоподібному тілі або сітківці за прогнозами буде вищою 1,9 мкг/мл після одиничної ІТМ дози, що складає 2,5 мг/око, і спостерігали як точку, де графік концентрацій у склоподібному тілі або сітківці перетинає лінію на 1,9 мкг/мл. По оцінках одинична ІМТ ін'єкція Рар проти фактора 0 238 інгібувала АР активацію комплементу в тканині сітківки протягом щонайменше приблизно 74 днів і в рідині склоподібного тіла - протягом щонайменше приблизно 97 днів. Пунктирна лінія на фігурі 13 показує змодельовану концентрацію Бар проти фактора О 238 у рідині склоподібного тіла після інтравітреального введення. Суцільна лінія на фігурі 13 показує змодельовану концентрацію Бар проти фактора О 238 у тканині сітківки після інтравітреального введення.

Різниця між концентраціями в рідині склоподібного тіла і тканини сітківки основана на оцінці коефіцієнта розподілу в тканині сітківки, що дорівнює 20 95; іншими словами, 20 95 усього лікарського засобу, введеного в рідину склоподібного тіла, буде досягати тканини сітківки.

Фахівці в даній галузі визнають або зможуть переконатися, використовуючи не більше, ніж звичайні експерименти, що існує множина еквівалентів конкретних варіантів здійснення винаходу, описаного в даному документі. Такі еквіваленти повинні бути охоплені формулою винаходу, що йде далі.

Хоча вищевикладений винахід описаний у деяких деталях шляхом ілюстрацій і прикладів для ясності розуміння, описи і приклади не повинні розглядатися як обмежуючий обсяг винаходу. Повний зміст розкриттів усіх патентних і наукових літературних джерел, цитованих у даному документі, спеціально включений в даний документ за допомогою посилань.

Вищевикладена письмова специфікація вважається достатньою, щоб дозволити фахівцю в даній галузі здійснити на практиці даний винахід. Даний винахід не повинен бути обмежений по обсягу депонованою конструкцією, оскільки депонований варіант здійснення призначений бути лише однією ілюстрацією деяких аспектів винаходу і будь-яких конструкцій, що функціонально еквівалентні, знаходяться в рамках цього винаходу. Дійсно, різні модифікації даного винаходу на додаток до тих, що приведені й описані в даному документі, будуть очевидні для фахівців у даній галузі з вищевикладеного опису і попадають у рамки формули винаходу, що додається.

список ПОСЛІДОВНОСТЕЙ «1ї0з ЗзВМЕМЕТБСВ, ІМС.

НИАКО, АкЕМПих с.

КЕПЕХ, орех ЕЕ.

ПОММАМ; Непжу

МАМ ГООКЕВЕМ САМБАОМЕ, Мепйо чІШтТЕв, Спахіва М. «130» ГУМАНІЗОВАНТІ АНТИТІЛА ПРОТИ ФАКТОВА пПОТА ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ «1302 РЯзТВаНІ ЩО кій» Че 51/048,431 «15» 2408-04-28 кій» ЦЕ бБ1/0а8,689 «-«151з 2008-04-59 «іх 74 «8109 «Вуз 107 «Зв БІЛОК Й «йі3» Штучна послідовність «аайх «323» Варіабельний домен легкого ланцюга гуманізованого клону Ж 111 «ай

Авр о їіе піп ушї Так біп Яєк РКО Бех бек Бей Бек Аїз Бек Уві ї В ї0 ї5 сіу дво Ака Уаії тТвЕ тів тп оСув тіе Тпх бех ТИХ Авр и ттїе дер а зо

Авр Ар Меб Ав Ткр ТУК сій зійп був руо піу Був уві БКо Був ка 45

Бей їви Тіє бек пїу б1у Ап ТВу Пец Аже бжо біу Маї ро беж ва

АжхЧ РНе бех бі дек сіуУу Бек піу ТПпх о Акр Ве Так Пед Тк Біб ве та та

Бех бех Пец біп Рко бі Авроуаі Аїа Тих о Тук Тук о Сув о йво бід о 85 зо

Бех Авр беж цем Рко Тут ТЕ Рне З1у б1ів біу тТву Був тез бій 35 100 105

Тїє Був «20» 2 «2ї3» 115 -8ї1а5» БІЛОК ж йі13» Штучна послідовність А «й» І «иї3» Варізбельний домен важкого ланцюта гуманізованогро клону Ж 11

«4005 2 сЕпоУаї бів Бей Уаї біб бек біу рко бі Бей Був Пув Рхо сту

Ії 5 о 15

А1їз Бех уаї цпув узі Бек Суб буз Аза Бех біу тую ТМ Ре тик 29 25 30 дво Тух біу Мес дви Тхр уві дкФ бій діа ро біу бій сту печ

За 40 в сіш Ткр Меє сіу тТЕр х16 Ап отак тук ТВк біу сти ТтБх тТЬК Отух 5О 5 во із Авр дер бе муз Піу Ака Рце Узі ре дек їеч Авр тах Зех ва о 78 та) бех ТНт Аза Тух Пец бій їЇ1ї6 бек бек Пец ув Аза 01 Дар во 5 88

Тк Аіа уаї Ту Тух Сук піц Акад 10 біу біу Чаї Авп о дев Тер 95 180 їт05 соіу сі сту тп пе Уаї Тк уаї ех бек 116 115 «їй» З «їж» ЗІ «21Т2з БІЛОК «2і3з Штучна послідовність кох «235 Послідовність синтезована (БЕБ3 із акцепторної пюдської каркасної послідовності УНІ) «005 3

Акч Епе Уаї пе бех бец Авр о ТВХ Бек уаї беж ТТ Аїа Тук цей ї Б та ї5 біп І1е бер Бех їни буяє А1їа іч дво о Тбх Аїа Чаї Тух Тух був ав за

Бек «Ві0» 4 «ит 33 «212» ВІЛОК «213з Штучна послідовність «шо «223» Послідовність синтезована (БНЗ їз зкцепторної людської каркасної послідовності УНІ «сабо» 4 дхч впае уві Ре бек Бей Авр от бех Маї бек Тих Аїя Тук Бей ї 5 18 ї5 418 І1їв бек бек бе пув Аза біб Авр отих Ата Узі тТукх Тук Сув 20 25 За

Бак дк «105 5 «її» 10

«12» БОЮ «23» Штучна послідовність «в «223» Поспідовність синФезована їЇЖКН4 їз акцептоарнаї пюдської каркасної песлідовностий М) «дО» 5 вБпе о Біу сій с0ї1у Твк Був улі сій їїе Був

КЗ Що «2103. 8 «і» 107: «812 БІЛОК. «2135 Штучва послідовність «230» «й23» Варіабельний домен леркого ланцюта модифіковаворго гуманізованого Ба проти фактора 0 538 хАдОоз б

Авротіеє Зібр Уаї ТП бів Бек Руб Беж Баж рез Бех Аїа Бек Уаї их 5 о 15

З1у АвроАкЯ Чаї ТЕ Ті ТП о Сув діє Так Бек Тк Ар т18 Авр 25 30

АвроАвро» Мес Ав Тхр Тук біп бїлй був рхб біУ Був баї Ро пу за 40 45

Тем Пеш Тіе бек сі лу Ав ТВк цей йка БкОо ї1у Уаї Вко беж

БО За БО

Ака Ре Бех біу бах Ту бехш віу Тих Ввр ває ТК о рек о тТлх тів 65 та 78 бек Бек Бей біп Рко сій Авроуаі Аїа Та Тук о тТук Су печ сій ао 85 зо

Вежт др обех без бхо Тух Так пе сіу біп б)у ТВ був таз аби як 100 105

Жіе Був «гій» 7 «аїіз ТО «дів» БІЛОК «213» Штучна послідовність «жй» «ої» Варіабельний домен легкого ланцюга модифікованого гуманізованого Каб проти

Фбактора їх 238-1 каб 7

Аво ті бів заі1і Те бів бек ро Вех бек це) бек віза Бех Ух 1 5 То 15 с1іу Аво АкЯ уаї ТБ ті тик суб ЇКе Тпв Бек ТЕ Да тіе дер. 25 25 30 двр о авр Мес Авпотко Тук біп біб цув во ОВУ Цув Уаї рЕО Був 358 ай 45 цем пен їі Бек біу сіу АБп от Пеб Аха Рко біу Уа) Ро Бек 5О 5 о

Ахка ВБе Бех біу Беж С1у бех Сіу ТБ Анр РБе тиж бе ТЕ тії 85 70 75 бек Бек ей зіп рхо піч Аво чаї Віа тТВх Тух Тут Сув цех дін во ве 30

Зек Авр обех цем Рко ТтТук Так Рпе опіу сій Сі ТК Буй У 1 95 500 105 тів ув «абз В «21їз 107 «218» БІЛОК «213» ШоуУучна послідовність «Ва «2232 Варівбельний домен легкого ланцюга модифікованого гуманізованого Баю проти фактора 5 83Я-2 «400» В йвр І1е Зі) Уаї ТК обіб йеж Ро бек Дек бе бек Аза беж Чаї ї 5 10 15 с-іу Ав Аку Чаї Тих її ТЕ Сув їїє тТпЕ Бех Тйх Авр 11е Авр й а 3

АвроАвр о леч АвпоткротТух віп біп був Рхо бу душ Уаї хо Дув 35 аб 5 ей бе жів ек щіу шту зви Тк Без овйка Еко Ху Уаї Рхо Бех 5О 55 5О

Ахч4 гпе Бех біу беж біу бек 015 ТЬкК дДяр Рре тТцкЕ Пе) ТОК ї1е

БЕ 70 75

Вех чек оте Сів Ро сій Авроуаї іа Так о Тух Тук о Сув Бей СІЙ о 85 зо

Бек Авр Бех цею вхо їух Тнх ре Зіу Бі сіу ТВжЖ Був пек 1 400 ща

І1е Був ; «10 «и 107 «-213з»з БІЛОК «2ї3» Штучна послідовність «220» «223» Варієбельний домен легкого ланцюга монифікованого гуманізованого Кар проти фактора В 238-3 «Ой» З

Авв оті біп уаї Ту бів бек Рко бек бЗег Бей бек Аїа Бех Уаі1ї 1 в 10 ї5 шу Ав Ат Уаї ТВЕ її тик Сув їїе ТЕ Вет Тих Авр о І1е Авр за 23 39 вро Авр тів Ана тТкр о тТукх піп йів цув о рхОо сіу Ммув уаї РКО Буа 35 40 45 їви пен Ї1є беж зіу Су двп отих пе» Ах Рхо зіу чаї Ро век 50 5 60

Ахкч Вів Бек слу бек й піу бак С1у тиж Др Бе тв Бей те ї18 : 25 о 75

Зек Бех цей сів Рхо сі АвроУаї Аїа ТЕ Тую Тух сСув цей сій во 85. ва

Чек Авробах бей Вро Тух Так Ре сіу бів біу ТаХх Пув Бей 10 95 ї0а 05

Щіе цув «10» 10 «аю» 07 «812» БІЛОК «23» Штучна послідовність «й» «23» Наріабельний домен легкого ланинюра модифікозаного гумакізованого Каю проти вБактора 0 2385-4 «4005 10

Авр її біп оМаї ТЕ біп Бек Ро Баж бек Бей Бех Аза Бех Уві 1. - Мо ї5 біу длр дк уві ТВ 116 Твж Сув їїє Ту бек ТНЕ Дар Гі Ави 20 25 30

Азродар Ме: Аза Тур тує біп піп ув Бго біу Був Уві Рко Був 35 40 45 цец пен тіє Бех О1Уу СІуУу дап ТВх ей Ак рко піу уаї Вко беж

БО

Ака Рпе бет біу Бек біу бек біу Тьи Авр РПе ТК цей Тих ї1їє

Б То 75

Бек Бек цем сі рко Зі1О Ар оМаї Аза Тах Тухк Тук Сув це) ба во в ЗО

Зах Авр Бех цем Ро тТух тах Бре сі» сій б1їу Тв зув бей осів

З5 100 а

Ті Був «20» 1 сії 107 «їй» БІЛОК «зі3З» Штучна послідовність «йо «23» Взвріабельний домен легкого ланцюга модифікованого гуманізованого Каб проти шпактора 0. 238-5 «абаз 11

Авр І1е сбіп Уаї Тбх біп бек Рко Зех Бех без Бек А1їа Бек Уві і 5 . 10 15 бо а1у Авр Яку Уві Тйх іє ТБЕ Сув Т1е ТВ Бек Тйк о Авр ї1е Авр ха 25 30

Авр Авр Меб біп Ткр Тук сіп бів Ппув Рго біу Був Чаї рко Був за о 5 реч без ї312 бех с015у біу Акп о тре ве дгя рко б1і1у Уаї рко бех 50 55 Бо

АкЧ Ре Бех біу беж біу бек спіу тіх двр ре Таж Бе) Так їІі1е 7 75 беж Бех Пес саіг вхо З1ч Авро уві Аіа тТіх туї Тук Ссув Бей сій во ва Зо

Бек АвробВет їжи Рко Тук Те РНе біу шіп сіу тк Був дей б

ЗБ 100 105 те їув «310» 12 «їх 07 «2125 БІЛОК «213з Штучна послідовність «820 «з33з Варіабельний домен леркого ланцюга модифікованого гуманізованого Ба проти

Фактора п 238-6 «400 12.

Авроїїе біп уУаї Тьх піп Бех Бгто бек бек пей бах лів Бех Уа ня 5 0 Е5

Зіу вве Ак Уві Тих ї16є Тл Сув Ті Твх бек ТИЖ Авв ті зве

Авр о Авр Ме Явно Тер Тут віп сій був Рко б1у Сув Уаї Рко Був о ж їецоцез тів Явх Зіу пу Бех тТНх тем о дтЯ ро 01у Ууаї рхо Бех 59 Ба 0

АхчЧ Епе бек сіу бек біу Бех сСіу ТВЕ Авр о вце ТЕ Без тВЕ Т16 І ве за 75

Яех Бек Пец бів Рко бід Вер Чаї Віа ТБх о Тук тує Сук Тем біл ва 85 о

Зеж Авр о бек Пец рРко ТУ Тпж Ре З1у бів біу Тпк пув без вів ах 100 05 тів цув «ЯОз 33 «її» 107 «фії» БІЛОК «213» Штучна послідовність са» «223» Варіабельвий помен легкоро панцюга модифікованого гуманізованого кав проти фактова 0 О238-7

«А00з 43

Авр о Її сій уаї твх о біп бег Бко Беж Бех пем Бех Аїа Беж Уаї ї 5 10 15 сіу АвроАку уві Тих їТїе тТвЕ о Суз Щ1іє Тв бек ТЕХ Авроїзіе Авр 20 -5 30

АвроАвр Мес Авпотжр о Тук біл бій пуб ро сіу Був туаі Вхо Був 35 ща 45 цей бе) ї3е бех біу зїу Аза так їв Вжу рхо а1їу Уві рко Зех

БО 55 БО

Акч4 Ве бек біу дек п1іу бах сі ТВж Дар РБе Тпх БПеп ТБх їТе 85 сх ВИЙ 78 бех бек пей Зіп рхо бім дар уві Аіа Тих Тук о Тук Су цем сішп во 85 що

Бех Анр бек Без рко Тук ТЕ Рцпе біу сіп піу Таж Був бей 1 00 ї05 їле Був «МОР 14 «її» 107 «2125 БОюЮК «ЗЕ3х Штучна послідовність «836» «ва3» Баріабельний домен дегксого ланцюта мопифікованого гуманізованого Раб проти фактора р. ЗНАВ «-500з 35

Авр ті бзта уаї ТЬх сь Бей вхо Зех ех дез бек Аза век Уда 4 5 то їв сіу Аз; Аа уві Таж ті ТпЕ оСув ї1ії6 ТЬк Беж Тк оАвроїїе Авр 5 38 вер.Авр Меє Ап Тур Тук чіп біп Був вус біу ру Узі руб ув 35 «о ав

Пец пемої1є Бех Зту біу аБа Так Без акФ бхо п1іу Уаї Рко пет

За З ва

ДхУу Впе бех піу бек зіу дек с1у Тк Авр Рпе ТУ Без тп їїе 85 за 75

Бех Зех Пец іп Еко бій Авроуаї діа Тек тТух Тух Суб Бей бій во 85 за

Бех Авро беж Бе) Рко Тук Тс Вре соїу сій сі1у тв о Мув Бей БІО 150 05

Іїе Був «їй» 15 «А ЗУ. «дав БІЛОК -йі3» Штучна послідовність

«223» Варіабельний домен девкого ланцюта модифіковавого гуманізованото Бай проти фактора 0 238-9 «400» 15

Авр о т11е бів Уаї Тих Сів бек рРхо бех йех пе) Бек Аїа Век Уаї ня Б 10 15

Зі Авр Акт уаї Трх о І1їе Тпж Сув Ї1їє Так обех Тих АвроТї1а двр й " а 30 др о Авр Меб АвпоТкротТук бій бів Це ко біу Був Уаї Вко Пцув 35 40 45 ем їем ТТе бек З1У біу АвпоТтТук рез дха рхо Зіу Уді рРхе бек

Ба в єо

Аха Рів обет пі Бех Су Бек біу ТБжх Авр о Бре Тихо обеш ТНк їте

Б 70 т5

Бек век ем бзіп Рхо ЗІ Авр оУуаї АТа ТБ оТук Тух Сув пем Зіп во 85 ява дек Авр Бек пей РО Тук тах вне бі піп бі1у тк пув цей Зі 00 ща тТїе Був «210 1К «21їз 107 «Її БІЛОК сії» Шкучна послідовність «аб «223» Варіабелений домен легкого ланцюга модифікованого гуманізованого Ба» проти фактора 0 ое38-1й «4б0ж 16 дер їі1еє бій Маі Тнж біп Бек рт чек Бек пец Бех діа Бех чаї

Ії 5 19 15

Чіу Авр о дтЧ уа1ї тк о ІВе Тих Сув її ТВЕ Ббет ТК Ав 15 Авр зо аво Авр о Ме дай отТтротук шій сіп Ппув вхо піу Му Чаї рхо пу

Кз йо 45 ївц бам тів беж біу бру Авп отТіг Гей Ак рЕо піу аї Вхо Бех 5О 55 0

Ага РБе бек о1у бех сіу Бах с01у ТБЕ АвровБбе ТБ ем Тйк Гіє 70 дея дек бек деп бів ро бій дяр уаї ліз тн тук тук Сув ей їй во аз зо

Бек Авр обех цем вхо Тух Тйх ре спі 515 су ТВх Був ей 1 5 їпо 05

Іїв Був

«й .ії7 «їз 07 «312» БІЛОК «2132 Штучна леослідоввість кий» «223» Варіабельний домен леккого ланцюга модифікованого гуманізованохо Беб проти фактора ДВ УЗЯ-1ї «4002 17

Авр тіє бід Увь тбжх біп бек Бко Бак беж ре) бек Аїза паж уві ї 5 ї1а 15 с1у' Авр.Ака Чаї Тпж ЖХіестнЕ Сув ї1їе Тк Бех ТК о Авр Т1е Авр 20 25 зо

Авр о Азр о Меї Дяп Тхр отут бЗіп сів пув рго б1у був Уаї рко Був 35 40 45 їез печ Тіє бек обіу Сіу АвпоТпх Пец Акч Рхо біу Уві Рхо бех 50 БЕ бо

Ахе Ре бек біж бек біу бех б1уУ ТВх Авр оре ТБ Бец ТВх ї1е 85 70 75

Беж Бех їз біп Рго біц Авр о уваї діа Тк Тук Тух Сув ем 1 ва вв з

Бек Авр бек цей РЕ Тук Тпжх Ре бту піп зЗіу Так цув пе 01 95 700 105 тіє Був «1 ЇВ «й1їз» 145 «2123 БІЛОК «?213з Штучна послідовність «гай» «ваЗ3» Варіабельний домен важкого ланцюга модифікованого гуманізованого Каб проти актора ПЗ 238 «фйпох 18 ої Чаї зій рей таї біп Звк о біУу Рхо б1й Бей буаз ув Вго Ту:

Х 5 ї0 5

АТа Беж Уді Був уаї Беж Сув Був Аза бех біб Ту тТВвх Ре ТНЕ 20 5 зо

Ав) тук сту Меє Авп о Тїр уві Аху пів Аза ржхо бБіу й біу Бей

З я 45 ій Тжр Має б1їу ТЕр Ті Аве ТНІ Ту Ту бі Бі Тк ТЕ тує

Бо В 60

Аїа Азр авр о Бле Був с1іу Аку Ре Уві Ре Беж Бе) Авротпх бек а5 то 78

Уві Бех ТВх Аза Тук пе сій ї1ї6 Зву Зеж ей пу йіа ім даю во 55 за

Тих Аїа уаї Тук Тухк був сій дка сі) бі Біу Маї АвБ'Авп тер ї00 105 зі чів біу Тк їва Узі Ту Уаї бек бак 110 щ15 «Віз Ма «вії 15 «7212з ВІЛОК. «213з Штучна послідовність «й «2235 Варізбельний домен важкого ланцюга модифікованого гуманізованого ЕдЮ проти фактора Бог -4 ««00ж 15

Зіцй чаї біб бецш Уві бів бек сіу Рко 310) Бей пу Був око сіу 3 гі х5 ї5 віза бек Уаї Шуа уУаї Зех Сув пув Ага Бех Зіу Тук ТВж ре Тнх з 25 35

Ави тухк зіу Мес дип Ткр Уві АкЯ спіп діа Ро 5Біу 015 Ту гей 45 чо 5 сій Ткр Меб сіу Тр г3іе дак тик тТух ТрЖ біу бій ТНЕ ТЕ Тух

З за БО

Вів Ар о АвБр ввпе бук ЗУ Ак Рце Чаї Бе Бег цей Авр о тТНЕ Бек

Б то 75 чаї Бак ТБх Ата Тук цес бій о їїе бек беж пец був Аїа ЗМ зво во 5 Ка тах Аза Маі Тук Тух Сув біз Ак бій б1у біу Маї Ап Ав ТЕр ч5 106 185 сіу бБіп оту Тр цем Чаї ТБ Уві беж Бех їїо їБ «2105 20 «Віїхж 115 «Зі2з БІЛОК «213 Штучна послідовність «280» к2335 Барівбельний домен важкого ланцюга модифікованого пуманізованого наб опроти фактора п о 238-2 «4005 зп піп уаї бій Бе) Уві біб дек 01у ко бів без Був був руб сту 1 5 що 5 діа Бек уаї був узі бек Сув Був Аза Бек о біу ТтТук тих Рце ТК ай 25 35

Ав Тух зіу Має Авпоткр о Уаї Ах сів Аза РКО іх Зіп зІУ Беч ее ва сій Ткр Меє біб Тжр ї1іе АвпотТНЕ Тут Тих бі бій Тв о тТбк Тук

БО 55 60 діа Авр Авр Рце цув біу Ак РП Узі ре Бех Пед Авр отак Бек 65 70 75

Уа1ії бек Тьх Аїа Тух бец сСіп Тіє бек бек Пец цуя іа біц Адо о 85 зо

Тк Аїа Чаї Тук тТук сув Зі Ах бі сту б1у Маї Ава Авй откв зв щов ЩОБ біу біп с1іу тТпх цеб уві ТпЕ Заї Зех бак. 110 Ко: вїй» 1 -21з 15 . крій БІЛОК «2135 Штучна послідовність «220 «223 Варіабельний домен важкого ланцюга модифікованого гуманізованого Каб проти фактора Пп 2383 -500з 21 сіп'уаі біп цем уаї сіло обех сіу Рко бій цеч був був Рео щіу

І я 19 15

Аїа Бех Уві Пув уві бек Суз Буш діа бек біу Тук Тк Ра ТНуе 20 25 30

Ава тукос1іу Меб дай Ткр Уві Ага біп діа ро Сіу біп п1у шШец 35 о а5 іч тТероМмек сіру ТЕкр Іі бяп о Тпх Тух Таж біу сті) тТвЕ тк тТух 55 о

Аза Авр оАвровНе був біу Аку Рра Уа) ре беж Тей Аве ТВ бек 65 76 75 чуаї Беж тик діа туУК Гей сій її бек бак йви Пув Аза 10: Ар во 85 зо тах А)іа маї Тух Тук Сув вій ка бії біу біу уві Ав дай отжр 95 ав аз піу стіп біу Твх Бей Маї Тк оуаї Беж Бек

Мо 115 «ож а «21» 115 «2ї1й3з БІЛОК «213» Штучна послідовність «ай» І - «вії» Варіабельний домен нажкаго ланцюга модифікованого руманівованогоа Кай проти фактора р О238-4 «ай» 25 сів уві сбіп оцез уаї бтй Бех обі Вко сім ем оПпув Був Вко Оїу 1 В 10 15

Віа Бек Уа Був Уаї Бек Су пу Аза Зек сТїу Тук ТВХ ВЛ ТНЕ 29 25 за

Авп отут біу Меє Аво Тер о уаї Ак бій Аза Рго біу бів бі Бех «0 ак під тур мес біу Ткр Іїе авп тих Тук ТвЕ зу піц Тік ТвВк Тук 5 вО діа Аво Авр Бе Був Б1у Аку Вбе уаї Бе бах пед Ав» ТБ век 65 7 75 аж бек ТБ діа Тук пей зі Її бЗех бек реп пуб Аза іх Дар во 5 Зо

Тих Аза баї Тук Тук Сув 10 Ах піч біу біу Уаї Ав АБ Тер 95 160 105

Чу піп сіу Тк тей Уаії Тау уві бек бетє 116 115. «3195 23 «Еїїз 115 «йтідз БІЛОК «віз» Штучна паслідовність «вай «ЯЗ» Варіабельнций домен важкого панчюра модифікованого вуманівованохга Бар прати фактора ШО 238-5 «00» яз а)п уві 015 цев уві бів дек ЯЗу Вко бій Пей буз ув Рко с1у ї 5 10 15

Кіа бек Уаї Був Усі Бех Сув був діа бек с1у Тух Тих Ре тнх о 25 30 дя туї зіу Мек Ави Тхро уаії Ак Зіп Віа Брхо зіу бій біу цей 35. 9 а зіч ткр мес сту Тер Ії Авт тик оОТує твх сім бій тТвЕ Те тує

Ба а о

Аа Авр Вер бпе пув піу Ак Впе уві рре бек цес Аяр Твх век 65 Каей 5

Уаї Бех ТИХ А1їза Тук цем сію Ії Бех бЗву ей цув Аів біш АвБр о 5 о

ТвІ Аїа Уаї Ттук Тук Сув бін Ах їй сі1у Біу У) АвпоАяп о ткр з5 100 165 зіу віп сту Тих бедш Уаі Так Уві Дех ес

ТІ

«а10з А «ії» ТБ «312» БІЛОК «213» Штучна послідовність «ах «223» Вартабельний домен важкого ланцюга модисбікованого гуманізованого Ккаю проти

Фактора й о 238-6 «в00х 24 біп Ууаї 6135 без Уві піп о бат піу ва біз пе о пув Був Бко щу ї 5. 15 15

Віа Бех уаї Був раї Бек Сув був Аїа ех біу Тух Тк вва тнЕ

Ко) 25 зо

Ава тує З1у Меб Аз» Тур Чаї Аку бів Аза Рко бі бів біу Бех 20 5

210 ТЕв Меє Стьу тТкр о ї1е двап отв Тує Тих біу бій тт Тре тує во 58 во дів дар Авр Рре цу біу Ахя Рне Маї Бре йех фем Авр Тако бех бе та 75

Чаї бек ТБЕ Аіїза Тук печ біп ї1є ех бек ей був Аза б1м Дар

І о 85 ! Зо тах АТа чаї Тук Ту Сув 61) Акч 010 біу сіу чаї Авп Ав Ткв ва 100 05 5зіу біп с1у Тих їеви аї ТБ Уді бех бек 115 «8ї0з 95 «91їз 15 «їй» БІЛОК «2ї3з» Штучна послідовність ка2й» «23» Варіабельний домен важкого ланцюга модифікованого гуманізованого вав проти фактора 0 238-7 «4005 25 зі Уві бів пец уві сіп бек зу рко 41; пем пув пув Рхо Їїу ї 5 ТО Ех іа бек туаї Пук Узі Бех Сув Пув Діа бек сіу Тук Тих Рре тру о 5 30 ява Тук біу МессАвпоткрозаї АкЯ бСіпоАіа бо біт віп спіу цей ї49 45 чі тЕр Меє біу Ткрої3Зе Авп оту Тук Так СКУ біб тв отТвх тує

БО 55 «0

Аїа дер Авр о врпе пу С01у дк Рпе ча1ї рРКе бек Ццев ввр твжЕ беж 65 то те чаї бек тих діа тух ре) сіп ї112е Бех Бек цей ув Аіа 01 АБор во в5 зо

ТВх діа Уа) Тук Тужх Суя бід дк бі сту біу Уві дви деп тТхр 95 | зо 105

Ф1іу бів діу тах їеч Уаї Ти уаї Зек бех 110 їїІБ «210» 6 «21їз 115 «-812з ВІЛОЮ -Ві13їз Штучна пазолідсовність «2 «223» Наріабельний домен важкого панцюга модибікованого гуманізованого Каї: проти фактора В 238-8 «00з аб бів) баї віл опей Уві бій Зеє біу Бко біз ей Був був реко С01у ї 5 16 і15

КХіа бек Чаї Був Уаї Бек Сув був йіа Беж Зуу тТух Тих Рв 'тТвЕ

20 5 Зо

АвпОотТУХ Зіу Мес дви Три чаї Аку зів Кіа ру віу 1 Зіу ех 35 ча 5 сти ткроМмеб піу Ткр тів Ава тах тує Тих біу бім тах тТвх тує 50 55 50

Атївв АвроАБр о Бве Був ЗУ АкЧ РПе уві Ре бек тей Авротих бек 85 та тя чаї Бех Тих Аза тТух пес бій їієеє Беж Бех Пер пу діа со Авр 80 85 за

Тк Аіїа уаії Тук ТтТук Сув бі АФ бій сіу Зі Уві Аза Ап ТЖо яв їп0 За. піУу Біп о1уУу Тих оцей Заї1ї Тах Уві Вес бак 118 115 «230 37 ешії» 5 «виз БЕЛОК «2і3» Штучна послідзаність «2205 «Зх Вартабельний домен важкого ланцюга модифіковавого гуманізованого Каб праєи фактора б о238-З «пай» й зій уаї сів рей уаї Зіпй бех й01їу ркс біб) пев був був руб Ч1У

Е 5 то 15 діа Бех Ууаі пуп уаї Бех Сув бу Віа дет піу Тух Тк о вде ТВЕ 29 25 За дви отТухк бі Меб авп Ткр о Заі дхчЧ біп дів рго спіу Біло бі Без 35. «0 45 біз Ткр Мех біу Тер їіє Авп оте Тух Так аїу дії тТдк Тк тук ва ве во ауа Авр вир ре уз піу дк ВБе Уаї впе Бех цес АвроТнх Бех ве 79 75

Уаії дек ту Аза Тух без йів ї16е бек Дек Пец пев Аза бів Авр чно 85. 90

Тнж Аза Маї Тужх Тух Сув Бі Ако сій БіУу біу Маї бій Аво Тер 155 сіу вій біу Так Сей Уві ТБЕ узі Бех век 110 їЬ5 «10» 28 «тії 155 кій ВІЛОК «гії3з Штучна послідовність -2йх «23» Варіабельний домен важкого ланцюга модифікованого гуманізованоко Ба прати фактора Б 238-100 «баз 8 іп уаї піп без уаї бій век ЗІ Ро 510 пей о пув Був рРхо Біу 1 Е яз; 15

Аза бек чаї цу Уві бек Суз пуд Аза бах б1іу Ту ТЬжЖ Ве ТпкЕ 29 25 30

Аза отукє у мес Ап тив Узі Аг сій Аза ро О1у біб б53у Бей 35 «0 45 січ Тур Мек сіру Тур о тіє Ав) отТВах Тух Тпх БіУу сіш ТвжЖ таК тТук 50 кВ 5

Аїа Авр Анр вда цу сіу Ажа Ре чаї Ре бех Пец дво ТтпЕ веж а 7о 75 уаї чек ТвЕ Аіа тух Бем сіп тіе Бек Зех цей Мув Аїа зі Авр зо вв зо тих Аїа Ууаї Тух Тук Сув бій йка біо О1їу бі ух дви Діво тер за 100 108 іу бій сі тТдх Без Уві Тих Уаї Бех бех 110 115 «їй» 53 «й1їз 115 «12» БІДОК «Вї13з Швучма послідбаність «вий «243» Варіабельний домен важкого ланцюга модифікованого гуманізованосю Баю проти

Фактора б оз -1 «00» 85 біп уаї біп цем Чаї бів Бех піу ВБсо біб Сей Пув о був вхо у ї 5 10 15

Аіа бех Чаї Був уді бек Су цув Аза Бек біу Тук Три Ре ТЕ ва 25 Зо

Авп оТук буу Меб дво Тхр уаї Ахе сіп Аза Рко Фіу бій сту цей ай 35 бій Тер Меб біу Ткр Ті Авп ТБ Тук Твх біу бій так Тк тТук о ВЗ бо

Аіа Авр двр Рре пув біу Ак Рпе Уаї Епе Бек йви Авр Таж Бех та 75 таї вер ТдЕ Віа Тух Мей 010) т1іє бек бек Гай був Аїа бій Авр во ва за твх Атїа уаї Тук Тут Сув із Ата Біз біу біу Уві Авип бій тТЕр 95 100 15 зіу бБіп сіу Твкх їй уаї Тит о Ууаї Бех Бех

Тро 115 «3105 30 «її «та» БІЛОК к2і3з Штучна послідовність «70»

«ай3з НУК-Ї1 З М О111ї їз 238 по 238-Жж, з 83856 по 8385-11 «або» 30 ' І

Іїе тих бек Ту Аве Ті АвроАвр о Авр Меє Ави 2 10 «зо 33 «вії» 11 «212з БІЛОК «-213з Штучна послідовність «вах «2235 НУВ-Іі модибікованого гуманізованого Баб проти фактора В 238-8 кап ЗІ

Тїе Тлпх Век Так Авр Ії Звр Авродяр йеи Анп їо «дій 38 «й1їз» К1 с«иї2з БІЛОК «213» Штучна послідовність «ВО «223» НУуй-мі модифікованого гуманізованого БабБ проти фактора 0 538-3 «400» 392

Ті Тпжх Бек Тік оАврошіє АвБЮ Ар и АвБр її Ав в то «ах 3. «115 11. «вІ12з БІЛОК «213з Штучна послідовність «ваз» «823» НУК-1і1 модифікованого гумавізованого Каю проти фактора 0 о 238-8 «4005 33

Тіє ТтЬх Бех ТНх Авр Т1е Авр одер Авро Меї діа

У о «21іЙйз 34 «211» її «айв ВІНОК «Ві3з Штучна послідовність «020» «рії» НУБ-Ї1 модифікованого гуманізованаго Каб опротм фактора Ю 238-5 «00 34 жі тТвж бех Так о Анр ї1е Авр о Авр дао Ммеб сій 5 10 «210» 35 «а1їз 7 «Ха» БІЛОК «2135 Штучна поспідовність «ках «823» НУВ-Т2 з вО131 їі з 238 по 2838-55 з 82388 по 23-11 «аз 35

С1іу біУу Авп Тих Пец АкЯ ро

Фо «2105 36 «Тіз 7 «ей» БІЛОК «ВІЗ» Штучна послідовність «2202 «3 НУВ-І модифікованого гуманізованого Бабопроти фактора Ю У58ев «400» 36. сіу бпіу Бех тп певи Ака рКо

І. ой» 37 сеї» «212з БІЛОК «-21ї13з» Штучна послідовність «ий» «-з23з НУув-ї2 модифікованого гуманізованого ка» прожи фактора й -38-7 каййз 37 чіу ту АТа Так ої Ак во «205 ЗВ «31155 «Зі2х БІЛОК «213» Штучна послідовність «Же й «23» НУВ-З з ОЗ Її з 238 по 2338-31 «аж За їви сій бах дДвБр Бек Бем о Бго Тух ТОК 5 «210» 35 ей» Хо «2125 БІЛОК «2132 Штучна послідовність «ай» «Во» НУК-НІі з В 131 їі з 238 по 738-131 «005 8 сту Тук Тк впае так Авп оТук біу Меб Аа 5 10 «210» 40 ері1і1ї» 17 «212» БІЛОК «213» Штучна послідовність ках «йВіз НУК-На з Ж О111 її з 238 по еЗ38-Х «-400з 40

ТЕр І1е Адапотиу Тух Твк біу сії тих те тук Віз Авродвр Ре 1 5 | 16 15

Був 'ЗЕХ

«510 41 «аїїж в -2125 БІДОК «2ї3» Штучна послідовність «й20х «83» МНУВ-НЗ з БІТ 5 з 3В по 23847 «кап» 4аї зри -1У біу ча1ї1 Авт дай «їв» ай «і» б «212з БІЛОК «2135 Штучна послідовність. «2 «Фг23» ЦУуВ-НІ модифікованого гуманізованого Бар проти фактора В з38-8 «4005 45. із сіу Бі Уаї АтТа Ав 5 «2105 43 «її 6 «212» БІЛОК «-813з Штучна послідовність «Вб» «223» НУВ-НЗ модифікованого гуманізованого ВаюЮ проти фактора 0 238-3 «дах аз сі аіу б3іу Уаї сів Ввй

Е

«йо» 44 «ри» 6 «12» ВІЛОК «її» Штучна послідовність «29» «23» НМЕ-НЗ3 модифікованого гуманізованоко Каб проти фактора Б 2238-10 каз» 44 сі сіу біу Чаї зво діа 5 «8Х0з 45 «21її» в «аЩМаз БІЛОК «213з Штучна йослідовність «пох «223» НУВ-НЗ модифікованого гуманізованого Ба проти фактора в 238511 «фаз 45 ій біу піу Уаі Авп бів 5 «210» че «а1їз 714 «218» ДНК

«кава» Щтучна послідовність «ах «223» Домен легкого ланцюхтча модифікованого гуманізованеово Каб проти фактора й з38 «ай» 46 асгчаачавув асассвасаве сесасссасс всбасябсву рсскессваб 50 вадстасаваєсє чсчравосвчЯ абасссовяче Часосацієв ссабостсоссо то

ЕчсстЧдоавс гчсвачачас саосдесасса ссастівцсаєЄ сассачсаєї 150 чатасгчася зссасасчаа сеччкассад сачаваєсач здаааасесс 290 сазадесгссся ассстссудач зсавкасесе гсабссрачч ЧдЕсссаєство 250 ччасесвасач сачсчтався чачасачаєве сосассеїсас сассаусаде 390 седсачзссвч азазсассцо васебаєсас бєцЕссасаза чечасксьск 35 чесасасаса бБЕБцоссавау чсСассавцяю ччнуаєсвава сдаасьувца 400 стчсассасс Бессевсасс сЕсссдссає сспавсдадса чегдазавев 450 чавастчстЕ ссУуссЯсчся собостааає двассвесбаєс ссачачачеаєс 500 сагаціасач ссувачасоя абаасуссоєЄ ссадьсазчає васксссаче 550 ададсассяс ауадсадавс аусваучаса дбасобсасач собозосаче 600 асссспласчс Бдадсавацс ачассассвач авасасзаву ЕссасЯчсова 50 созачесасс сассвчачис бовасесчас суссасваавя ачссЕсваса 700 чуччасачкя Єсва 714 їй» а «ВІіїз 214 «2і82» БІЛОК «их» Штучна послідовність ках . «»З» домен легкого ланцюга модифікованого гуманізовансто Еаб проти фактора бр 238 «00» 47 лАвр тіє піп Уа) Трк бій бех Рго бек бек ву бек Аза бек Чаї 1 5 16 й із

Ф1у Авр Ак Маї тк І3Зе трк о Сує тів ТБх бек ть Авр Т1е Авр ав 30

Авр Авр Ме Ап оТкроТук біп біп Був хо Щіу Шпук Чаї рко був

Беп йец ї1е Бек Озіу сіу Ана Тих Пем Ака Ро біу Уві БКОо бек

БО 55 бо

АкЧ вне Беж біУу бех сіу Беж СІ Те о двроббе тах Бео ту ї1е

БЕ та 75

Зеж век Бей бій бко ЗіМ Авромаї Аза ТНЕ Тух Тук Сув ем піп ва в5 за бек дар Бет йви Рко Тук Тк Ре біу біп біу ТБ Буз Уаї сій 85 100 ков

Іуе був Аку ТНЕ Уаї Аїд Аза РХо зех Маї Рне ї1є Бпе Бго Ко іо 1 Е29О

Зеїг Авр осів бі Бей Був бек біу Таж Аіз Бех Маї маї Стев реч ї25 30 ї35 гез Авп о Ава вБе Тух Рхо Аку зіз Аза уз Уаії біп Ткр був Уаї і45 155 МО

Авр о двп діа цес бів беу П1іу деп бек бій бій дех уаї Тк 915 158 1660 155

Оїп о вер обех о пцув йвробех Тву Тух дек ев бек бех тк бен отТрк о ї7О ї75 188 еп Бех цув Аїа АвроТух 01: Був Нів пуя уаї Тук Ала Сув сій ч85 199 ї5З чаї тбж Нівобіп біу цей бек Бек рго Уаї Тв Був бек рРбе Аз 205 з05 239

Ака зТу сти сСув «віз 48 «й11їз 23 «їз БІДОК Е «-2135 Штучна послудовність «аа «235 КЕКА-0С домена легкого ланцюга модибікованого гуманізованого каб проти фактора й 238 «вп0з 48 І дво тіє бБіп Маії Трхі бів бех рхо Бех бек Бей; Бах Аїа Бек Ууаї1 1 5 : 10 15 біу Вар йху Мах ТЕ тіє ТвЕ Сув «810» 45 «її» 15 «їй БІЛОК «Вї3» Штучна послідовність «ЖИ» «233» КІС домена леккого панцюга модифікованово гуманізованого Баб дроти фактора БоеЗЯ «во зх ча

ТкЕр тук біп бів пує Вхо бі Буа Маї ро цув Пец Без Ті ЗвЕ ї 5 їо 15 «810» ви «811» 37 «ваз» БІЛОК «-233з Штучна послідовність «220»

«зй3» ЕНЗ-ТС домена пегкоро ланцюра модифікованого гуманізсваного БабБ прот:

Фактора Б 238 «400» 50 піу Маї Рко Бех АкЯ вре бех біу бех сіус Бек б51у ТЕЖ Авр о вБе 1 а та 15

Тих рес Тк оЇ1ї6 бек Бех пе біп ро із Авр Уаї лЛіа так отух о 25 3

Тук Суа «вій» І «аії 10 «Ти» БІЛОК. «13» Штучна послідавність «220 каз3» ЕБа-1С домена лебкого лакцюга кодифікованого гГуманізованоко Баб проти фактора 0 238 «пох вх вце сіу зіп з1у Тк Був уаї сій ї12е ув

З 10 кій» Ба «вії 1а7 «212 БІЛОК : «»іЗзз Шесучна послідовність «0» «зах СЬ1 домена леткого ланцюга модифікованого гуманізованого Каб проти фактора бос 238 по 238-ї хавоз БИ дкч Тпж Уаї Аіа Аїа Рко Бех Уаї Бле їі РНе рко рРхо Бек Авр ї 5 1 ІВ ші бів цей цу Бех біу Ту Аїа Бех а) уаї був ти ем АБО 29 25 зп

Авп ббйе Тук ро Ага Січ Аза уз уаї бій Тер Був уаї АДвроАви «0 45

Аїва іїво біп Беж біу Авп бек Зіп сій беж Уаї ТВх біо бів вар во

Зак Був АвробБек ТрВу Тух бек їец Бех Бех Так Пем Тк бе бву 55 70 78

Гуз Діа Ар о Тук бім йув Ні був уві Ту Аза Сув Зі Заї тех о 5 зо

Нів зів 'о1у без Бех бек Бко Уал Тих був Бех Ве Авподха оїу 958 їо8 05 сіш Сув «еібз 53 «21ї» 74ї квідз ДНК «?1і3» Штучна послідовність

«В» «283» НЦомен важкоко ланцюга модифікованого гуманізованого Бай проти фактора б «400з 3 зкдаазавцча абассусакс бессссєцса БоБасчєссся СЕЕСрсссає 50 киссасадас чечкасусьс зудсесачеє часусваасес чодесєзадче 00 сЧаачаачсс бооздадсссса чеочаазччсе себусаздас сСеЕссоцчавсає 150 засерсастя вссаєаваає двассуччса суссвадчссо сгудасаачя 29

ЧсЕсдазссоя аєчучасача ссзнасассиса савосччачач асавовтаєсоа 7250 ссчаєдаєсее савзудчасчч вод ссЕвсс ссєсодасаз сестовсаве 300 васечсасаєс хасадаєсац садссссзад дссчавчаса сбасечечва 350

Егаскуєчацч сасчаачача чадесаасза есодЧчдссава чочассовча з0й ссассчеессс сесадосьсо ассваадучес савсядчесье сссесвдцса 559 сскссссса зчассасоїс сазочесаса чсапсссбая черасеваві 500 савучаєсєсає брссссчавс седезасчче чеЕсатодавс бсазтодссс 55 судассачесча счбчсасассо ЕКоссеччєса Боссасачес сгсазчассое бо басссссіса чсацсодсяаб чдассясдесо бссачсвяаєсв Боддсасссв 650 часссасасо сусзасцсда ассасаацсес сацсавсаєс вадувачаса 790 ачазвзачЕсча чсосаватсь гічасалзав стсасасаса а 741 «0» 54 каві 233 «212» БІЛОК «213» Штучна послідовність «Ва «223» Домен важкого панцюга модифікованого гуманізованого ЕабБ прози Ффактсовра б 248 карб» Ба

Чіп Уві бій ез уаї біл обек біу Бхо б1чм Пец Буш Був КЕхо в1у

У З 10 і5 діа дек уаї був чаї Чек оСув був Аїд дек Чіу Тук Тк рпе тих 70 25 30

Авип Тук біу Меб Авп Тур Уві Ахч б1п Ада вВкб біу сів сту Бей зо 5 сі) Ткр Має сту тер оІїфе Ап о тОх тую так о с1у біо тТнЕ твкЕотух во 55 в

Аїа Авр Ав Бе Був б1у Ака Рів чаї ве Бек їеи Аврв о тах бек 70 75

Уа» Бас ТП Аїз Тут ем бій їїе бек Бех Пез Бузв'Аїа 010 Авр но 85 зо

Тк віз уаї Тук Тух Су біо Акч обі сьу сту чаї АввоАвп Тер кад 105 зі біп сіу ТНж Пе) уаі тТнх уаї бек Беб Аїа8 бек Твх Був'яюїу ї1а Мі 2о

Рко Бек Уві Рбе ро Пем Аїда ро бек бек цув бек Тк деко біу 125 ї30 135 чі тк Аїа Аза бе сіу Сув ем Уаії цив дер Тухк Рпе ро 510 149 ї14к 156

Рко Уві Трх Уаі бек Ткр деп Бех біу Віз ем Твх Бек Сіу чаї їв 160 185

Ні Так Бе Рко Діа Уаї Ппеп біт; бек бЗеїг біу ву Тух бек оп) 7 МБ тво

Вес Бех уві уві Ту Уаї хо ЯЗехк бек Вес рем Зі Тв біб тру їі185 190 1955

Тух їХіз Сув Авп Уві Ав Нів пух Руб Беж Авт отТлк цив ді дер 2859 205 ато

Ппуво'був уаї 10 во уз Бех Сує Авр Був ТВЖХ нів тв 25 реж жії0йз 55 «їх. 25 «7їйх БІЛОК «із» Щтучна послідовність «йайх «ийї» КЕВІіІ-НС домена важкого ланцюга модифікованого суманізованого Каб проти

Фактора Б 28 «400» 55 сСійп Ууаї Зіп цем чаї Сів беж біу рко сій Бев ув Був Бго с1у

Х 5 0. Що

Аїа Бек узі цув уві Бек Сув цуз 'віа Бек -30ї 86 : «1 14 «212» БІЛОК «2135 Штучна послідовність «иа каа3Зх КЕЯ-НО домена важкого ланцюга модифікованого гуманіззваноро Жар преси актора 1 738 «4005 55

Ткр о Уаії Аж бір Аіа Рко Ту бію сіу Пей 015 Тр Меб сіу в 19 «2300 57 «РІ 38 «212» БІЛОК. «З13ж Штучна послідовність «пе»

«223» ЕВЗ-НС домена Важкото ланцюга модифікованого гуманізованого ЕВ прати фактора 0 О238 кайоз» 57 І

Ахкч Ре Уаї пе Бех Пп АБроТпк Бех Уаї Бех ТБЕ діа Тук йец 1 5 10 15

Зіп'отіє бек бек ви Муво Аївн біз Ввр о Тк Аза За3 тує тує Сув 20 5 30 бій дхо «810». В «Т1ї» ЩІ «вій» БІЛОК «ВіЗ» Штучна послідсвність «20 х жкеа3х ЕВА-НС домена важкого ланцюга модифікованого гуманізованово вав прати фактора й 236 «ад» ва тТхр ЧіУу біп біу ТЕХ Пец уві Тих уаії Бек Вех «210» 59 «21їз ДОВ «віт» БІЛОК «213» Штучна послідовність «ай» «ВЗ» СНі домена важкого ланиюра модифікованого гумамізованогко Каб проти фактора поз о'аЗ8 по ?38-1 «4005 я

Аїа бвт ТнНЕ Пув с1у Рко беж Уаї РН с рко Ппей Аза рко Бех бек ї 3 та ІВ вув Бех тру век піУу 1У тк АїТа А13 пе сіу сув ви Ууді Ццув 29 25 Зо

Авр Тук впе Рко біз Бто уаї Те Ма) бек Тур Авп бек бСіу Аза іїєм Тік Бех зЗ1іу уаї Нів ТВх Ре рко Аіа уві Бей зів бек дех зо 5 0

Б1у цпебз Тух бек рей бех Бех Узі Уаії так оуаі Ркго беу беж век в 70 75 йес бі Тік сіп ту Тук Ї116 Суз Ава Ма) Ави Ні їв рко Бех во ве о

Аяп отих Пцуз Маї йяр Був цув а) сій рКко був Бех Сув Ар тув

ЗЕ 100 105

Ти: Ні ТВЕ «10» БО «її» 714 «їв» ДНК «віЗ» Штучна посліцповнисть

«Ваз «223» Домен легкого ланцюга модифікованого туманізованого Каюв проти фактора 5. азя-ї «5005 БО. асчаачаача аравссчссчск сесасскусс Бссасасека Бесесбсває 50 ачссасадаєс чесчтасцска асассевач часосвадвеє бсавссбосе 105 багосусаєс сезсбадчачас сосчссасса бсассвкаасак бассадесвої 150 чаєзсєссаса асчасасайа сезусассая сачазассвя човавчессю 200

Евадсссскоа абєстстовад ссваєбасесє ссчсоссрадеа чбоссассве 250 ччсссазсуч сачсучассе чачасачавс Ссасссссас саєсачсаде зба ссоесадесся зачаєзчЕсяс аасскассас суБбесдсава збЯаврсЕстьев 350

Чосябсасася сЕбдуссадч чрассезачус дуауассааа ссайссчкоя 409 вкчсассавс єЯЕскЕсавс СКессдссає ссдаєцадся десцдааасов 459 зчавскдосе скчскусуся сесчоєуаве засебссаєс ссездачавчує 50О сазачксасад Спчазачцсчу асзасцсоссс ссааєсусує аасьзссацза 5590 ачачечісвс вчассаучас ачдсааучаса Чозсссасач сСоссаасвас 500 ассстчасчо бсачсазачс звчастасчаФє авасасвавч кскасчсеся бо счаачссасс саксаччвсс Єдадсссчес счуссасааау ачссксавса 700 ччачазачєя бах 714 «2102 Бі квії» 214 «авта» БІЛОК «13» Штучна послідовність «-2й0х «223» Домем погкого ланцюга модифікованого гуманізованого Баю проти фактора: В з38-1 «ап» ву

Авв тів вів уаї Тк сіп Бех Рхо бек бех реч бек Ата бек уаї 1 5 19 15 сп1у двр Акч уаї Тв ї1їе Тис Суа Хі ТБХ бет Тк Ан о їїв дар йо 25 30

Авр оВар Мебє АвпотЕр тук 010 біп пув Бко Ту був чЧАх ро Був чо «5 цем без І1е Веїт бі пі1у Ави Тіп Пец Аку ро сіУ Уаї рхо Бек я 55 ба

Ахч рРНе Бех сіу бек щіу бек Зіу тиж Авв пе тних їво ТЕ ТІВ 655 то 75 бек Бех ей сіп Рго 03 Авроуаї Аза тах тТух Тук Сув бем щ1ц 8 85 зо бах Ар обеє без Бхо Тук Твк Ре Сбіу піп п1у Так пу Ууаї бі 95 лаз а5

Іїе цу Ако ТБх Заї Аза діа Рко бек Уві Рае сів рресрхо РКО о її5 129 ех Авр бІч бів йей Був бек біу Тк Аза бек баї Увї був цей 125 за хз їм Ав о Ави Бе тТух рго АкЯ біз Аїа Буз Маї сів Ткро був о Уаї чай 145 50

АвроАвБп Аза Пей сії бек бі Авип Бех зів біо Бех Уді Тк а1й 155 160 165 сій вВвр Бек їуя др бек Трх Тухк дак пен бек Бек тах Бей Тих та 75 їі80

Іїви Бех мув Атїа Ав оТух сім Був Ні був Чаї Тук Аза Сув 61 185 І90. 185

Ууаї тТЬх Нів під біу цез бек Бек Ркес Маі Тк Був Бех Ре Ав 2500 205 зх

Акч Фу біз Суд «2ї0» 65 «їз 741 «гій» ДНК «із» Штучна послідсвнійть ква» -223з Помен важкого ланцюра модисікованогоОо гуманізованого ЕвО опроти Фактора 5 53в-1 «абз б ассазазвзача зсабсвсавс єсСЄсвесвсуса Бсгакяєсся БЕЄСЕвссСав 50 тЧсстасазає дсорасачсвя вачсссачее зуБасавкеб чЧадесвова 300 гчЧаачазвацсс сСацдадсссса яечавчоссс сегцозаччо ссесочцасасєс 159 ассрісасса аставадяазає дадсвЧчачса сассазассс сподасааця 540 чекссвасЧат аЕчЧодцасЯЧа Ксгавсасскса сассучачач асвасабаба 950 вЕчаєчаскс сазудчасуя СЕС КсвЕек сессцавсаєс спосувсвЯс 300 асчосатаєс басвавксацч садссссвач спосаадчаса сбуссекУуєа 350

ЕзСссЗсЧаУ сЧсузаччаа чЗочссаасСав ссЗчЧачоова задчЧассссач 500 їевасозссео сбсадесесс ассавоасчесс савкодавеве ссособудеся 450 поесссессса адачсасесс сочоаччсаса чедчесстоуя десасссдЯак 500 сваваччассас сесссспавс свчсчасччс пдссасЗЧавс ссвадодссое 55 І счЧассачсач сабЯсасасс БЕССсСесЯЧскУ сссасацєсє стсзудаєте 500 каскоссоса чсачсусачЕ сассчЕдсесс Бесадсачеє сччасассоа 65) цасскасасс Садсазоядеза агсозсвачес садспаасасо азудсччаса 700 ачавачссса дессазаєсь бчсдасвава сосасасабєв а 741 «21йз 53 «йіїз 273 «3175» БІДОК «2і3» Нтучна послідовність «220» Я «223» Домен важкого ланцюга модифікованого гуманізоввнего Баб проти фактора В тз8-1 ках 63 зіа уаї бій певно маї сб) век Зі Ро 9015 пей Пув Боб Бко ау ї 5 ке) що діа бек чаї Був Уві бе Су Був Ава дек 5Ііу тух ТВжЖ Ра о тТвЕ 3о

АвипотТух бі Меб анпоТтр о хаї Ате бій Аза рхо сі біп біу Бер чо 45

Зі ТЕр Меє сіУ Ткр Їїє дДямп Ту Тух ТИЖ о сї1уУу віз тТВжЖ Твх тує еВ 85 во діа АВ Авр Бе Пув сСіу Ак Риж Уві Бре Бек печзц Авр о тБкК о бех ва 7о 75 таї бак Тпх Аїаа Тух Гем біп тї)Зе бек бек орен рун Аїа Сім Авв во в Зо

Тих Ата заї Тук Тух Сув бі ака бій зу біу таї Ав дев отко з5 100 їа5 віу сів зіу тиж рев Заї твху узі Бек бе Аїа Бек тп Був сїу 110 ЗІЗ 120

Рко Бек Уа) вира рко Без Аіїа рко Бех бек Був Бех Тіло бек Б5іу 125 130 135 сіУу Тв: Аа дія пез 01У Сув геч уУваї Буя Ввр Тух Ре Рхо піч 155 ї55 ї15й

Бко Уві Тии Уаї бек Тер ойяп Бех Зі Ада Пец Тк бек обіу раї 155 160 155

Нів Тих Рре Еко Аіа Маї Пен; біп бек Бех бБіу Гей Тух Беж Цец ї79 ї75 ї80 бек Бех Уві уаї Тах Уаї Бо бЗеїх бек бек бен біу ТБх біп ТНх 185 190 135

Тук ї1е Сув Ава о уУді Ап оНів Пув Бхо Вех Ав о їВк був Уві Авр 290 205 24о

Гуз пу Уві Сіїх Рко Уч бек Сув Авромув ТвЕОонНів ТпК аа 220 «210» 64 «її» и «13» БІЛОЮ «23» Штучна послідовність кеЕййх к2а3» БЕКІ«НС домена важкого ланцюга модифікованого пуманізованого Каб прати фактора р З «ап ва сі Уві сіп тей аї бів Бех бїу Бко біш без пув був Бко спіу ї З 10 15 діа Бех Уві Дув маії бек Суя Гув Аіїа Бех 20 З «210» 65 «21» 07 «2їй» БІЛОК «ВЕЗж Штучна посдідовність чих «223» Консенсусна послідовність У капца Ї «4005 5

Авр їіїів біп Меє тп бій беж рРро бех Бек пей бек Аїа бек чаї ї 5 я 5) 15 сіуУу АВБ Ак Уві Твх її тТпк Су Аж Аїа бек сій сіу ї1є Бек 20 5 30

Беж тТух Бай Аїз То Тук бій сій Пув Рхо бі пуд Ада ро цу 35 9 45 ївм Пе) Т1е Тух о Аїа Віа Бех дах без; піп бек біу Уаї Ру беж о ве 5О

Аха Впе Бех Сіу Бех Шіу Чек бСіу тЯх АвроБйе Три цем Так її8 85 70 5

Бет бек їй бій Рко бій Авр Ріє Аіа Тйх тТух Тух Сув іп бів во 85 ві

Тук Авп Бех Тух Втхо Тек Ре бБіу Зіп сьу Твх Був Чаї бів тів 55 кн ее ха5

Пцує ДЕ «ката» 56 «21їхж 109 «вій» БІЛОЮ «2і3» Штузна послілдловнУєть «205 к223» Консенсусна послідовність МН? падкруки МІ «таб» єБ сів Мві бій їви хуаї бій беж піу бех ій Бей о пув пув Ро біх 1 5. то 15

Аїа дек Маї Муя Уаї Бак Сув Був А1а бек 91у Тук Тих рРре ТЕХ 2а 25 з

Чек Тух Дія Меє дяп Ткр о уаї Акт біп Ліа Рхо іу дій бІу Бей 35 40 45 сій Тхр Мес Біу Тгр тів Ав Тихо дДап ТВж б1у вп Бкго Так Тух в аб

Авіа сів сіу вче тн сіу вхеа Рпе чаї РВє Бех ей Ввр Тбх Беж 65 то 75

Ууаї Бах ТП: Ата тТук їз 51) Тіе Зек бах дез Цпув АтТа 515 дер о в5 90

Тви Аїа Уа) Тук Тукх Сув Аїз Аку Ттроб1іу біп сіу Так бех Гей 100 105.

Тих Уаї бек Бех «210» 87 «їз 37 «2125 ДНК «аії3» Штучна ПОсЛіІіДОВНість кий х «23» Синтезований оліронуклеотидний праймер ля рАЕРІ-ЗВа Мр «00» 57 гсСсосесегсаЯа асасссачує Засссачков ссаєсої 37 «й» 68 «йїїх 45 «вій» ДНК «ІЗ» Штучна послідовність еВ «223» Синтозований олігонуклеотидний праймер для ЮлЛЕРІ-2З3В-Ь «4002 68

БЕБЄсссвЕКУ Чсасссбуде сазасябсаба садсааачаа бе 42 «210з 9 «Тіз зх «вій» ДНК «кві3» Штучна послідовність «220» «а23» Синтезований олігонуклестидний праймер для резя «400з 69 сссасесссоусасосссая чсоссачссач сцсзаєссвоч ча: «а10х ТИ «В1ї» 47 «ві2У ДАК «3» Штучна послідовність кий» «223» Синтезований олігонуклеотидний праймер для рив «00» 70

БЕвЯаЧакуса дасосесоає уЧазасьчад дачасочедча ссачацчь 47 «210х 71 «їв» аї «2195 ДНК «йї3» Штучна послідовність «22йх «223» Синтазований олітонУкюлесотидний праймер для розв-ї1

«зп» 7

ЕЕсЧсЧуЄссо чЧсвсассова Чдоссадссччя бачсавкссЯач ч 51 «вій» 78 «8115 47 «віх ДНК «2135 Штучна послідовність «229» «2332 Синтезований олітануклеотидний праймер для везн-ї «400» 72 текаЧасЕсЯ Часесетове очавдчссуач чадасачедча сеацадче 47 «МО» З «їй 107 «2122 БІЛОК «ві3» Штучна послідовність «ей «223» Популяція варіабаеальвих доменів леркого ланцюга клонів модифікованого туманізованого жЕаЮВ прости фактора п «20» «21» КХаа «282» 33-34 «223» Невідома амінокислота. «2255 «їз» Хайа «Ева ВЕ «23 Цеазвідома амінокислота «й2й0з «851з Хва «вий» 10 «823» Невідома вмінокислота «адОо» 73

Авр іє бів уві ТЕ сбіп Бех Ро Бех Бех Бей Бех Аїа Бех Уві ї 5 36 15 сзу вар АжхЯ хаї Три тіе тах Сув ї116 Так Бек ТП оАвр ї3Зе Авр 50 5 за авр Авр Хай Хаа Ттр Тук сіп бій був Бгто Зіу Був Чаї рРго Шуз

З йо 45 їесп рем її Беж сіу сіу Хаа Тк їеч Акад Руб й1у Уві Бко вес во: Ба І ба

Акч Рпе Бех сіу Бек зіу бек сіу ЇНжЖ Авр Рпе о тТвк бе ТК ТІЇ 85. 70 75

Бег бех ви іп РКО З1й Аво о Ууаї діа Твк Тух Туж Сув рей ої во 5 ай ек Авр Бех йез Рко Тух Тк Ре сіу 015 с1іу Таж Був Хаа іш 109 105

Із Був «їз тА «2іїз 115

«812» БІЛОК «З13» Штучна поспідовніств «22й» «223з Популяція варіабельних доменів важкого ланцюга клонів модифікованого гуманізоаваного КВ проти фактора «З20х «айії» ка «иа» 1 «3» Невідома амінокислота «вай «221 Хва «ваз 103 «2а3з Невідома амінокмелата «ах «221» Хаа «а325 Щ04 «293» Невідома амінокислота «400» 75

Хаз чаї бБіп ії Уаї чіп Зек З1у Еко ЗТ Бец пув цу РКО о01у 1 5 то ї5

Аїа ек уаї пув узі Бек Сув Був Аїа бек піу Тук Таж вБе тТвЕ

АвопоТух б1іу Мес Авп тТЕр Уві АхФ бій Аза Бо біу бін піу пей сти тТкр о Меб бтТу Тхвр ї12 Авп тп тує тпкоспіу Ра Тахо тк о тух во 55 В д;із Авр о АвВо ре був Пуу Ако Бре уаї вне дек Бе АвроТие Бех 70 те чаї Беж Тих Аїа тТук пе сін тів Беж Бех Бей Був Аза б1а Авр яо ва зо тик Ата чУпі Тук Тух Су 01 Акч біб б1У с1іу Узі Хаа Хва Ткр ах 100 105 а1у бір біу твх пев уаї Тв уа1і Зах Бех

Claims

110 115 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Антитіло проти фактора ЮО або його антигензв'язувальний фрагмент, яке містить варіабельний домен легкого ланцюга, який включає гіперваріабельну ділянку (НМК) 1 легкого ланцюга, що містить ІТ5ТОІЮСОММ (5ЕБО ІО МО: 30), НМК-2 легкого ланцюга, що містить СОМТІ ЕР (ЗЕО ІЮО МО: 35), і НМК-3 легкого ланцюга, що містить ГО5О5БІ РУТ (ЗЕО ІЮО МО: 38), і варіабельний домен важкого ланцюга, який містить НМК-1 важкого ланцюга, що містить СМТЕТММСОММ (ЗЕО ІО МО: 39), НУВ-2 важкого ланцюга, що містить УЛМТУТОЕТТУАСОЕКО (ЗЕБЕО ІЮ МО: 40), ії НМК-3 важкого ланцюга, що містить ЕСОМММ (ЗЕО ІО МО: 41), ї де амінокислота в позиції 1 важкого ланцюга являє собою Е.

2. Антитіло проти фактора О або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 1, де варіабельний домен легкого ланцюга включає каркасну ділянку (ЕК) 4, яка містить ЕСЄОСТКМЕЇК (ЗЕО ІЮ МО:

51).

3. Антитіло проти фактора О або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 1, де варіабельний домен важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність 5Е0 ІЮ МО: 19.

4. Антитіло проти фактора О або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 1, де варіабельний домен легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 7.

5. Антитіло проти фактора О або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 1, де варіабельний домен важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 19 і варіабельний домен легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 7.

6. Антитіло проти фактора Ю або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 1, яке містить важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 63.

7. Антитіло проти фактора 0 або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 1, яке містить легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 61.

8. Антитіло проти фактора Ю або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 1, яке містить важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність зЕО ІО МО: 63, і легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 61.

9. Антитіло проти фактора 0 або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-7, де антитіло або фрагмент є моноклональним.

10. Антитіло проти фактора О або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-7, де фрагмент вибраний з фрагментів Раб, Бар'-5Н, Ем, зсЕм або (Баб)».

11. Антитіло проти фактора О або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-7, де антитіло або фрагмент є гуманізованим.

12. Антитіло проти фактора О або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-8, де фактор О являє собою фактор О ссавця.

13. Антитіло проти фактора О або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 12, де фактор Ю являє собою людський фактор 0.

14. Антитіло проти фактора 0 або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить поліпептид, який містить наступну амінокислотну послідовність: ХІМОГ МО5ОаРЕЇ ККРОАБУКУЗСКАБИаМ ТЕТММамМмМУМУВАОАРООСІ ЕМ МСОСУЛМТУТаЕТТ МАО КавеЕМЕ5І ОТ5МЗТАМІ ОІ55І КАЕОТАМУМСЕНЕСИМХ»2ХзЗУМОСТтІ МТУ55 (ЗЕО ІЮО МО: 74), де Хі являє собою Е; Хг2 являє собою М; і Хз являє собою М, і поліпептид, який містить наступну амінокислотну послідовність: РІОМТОБРББІ БАБМаОВмМТІТСІТ5ТОІЮВОХхаХХАММ ХООКРОКУРКІ ІЗССИХТ !АРОаМРЗА!нЕЗОВИБ СТОР ТІ ОРЕОМАТУМСІ ОБОБІ РУТРЕОСИТКХ»УЕЇІК (ЗЕО ІО МО: 73), де Ха являє собою М; Х5 являє собою М; Хє являє собою М; і Х7 являє собою ГІ. або М. Зо 15. Антитіло проти фактора О або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 14, де Х7 у послідовності 5ЕО ІЮ МО: 73 являє собою У.

16. Антитіло проти фактора О або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 14 або 15, де антитіло або фрагмент є моноклональним.

17. Антитіло проти фактора О або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 14 або 15, де фрагмент вибраний з фрагментів Раб, Бар'-5Н, Ем, 5сЕм або (Баб)».

18. Антитіло проти фактора О або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 14 або 15, де антитіло або його фрагмент є гуманізованим.

19. Антитіло проти фактора О або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 14 або 15, де фактор О являє собою фактор О ссавця.

20. Антитіло проти фактора О або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 19, де фактор О являє собою людський фактор 0.

21. Полінуклеотид, що кодує антитіло проти фактора ОО або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-20.

22. Вектор експресії, що містить полінуклеотид за п. 21.

23. Клітина-хазяїн, що містить вектор експресії за п. 22, яка продукує антитіло проти фактора ОЮ або його антигензв'язувальний фрагмент.

24. Клітина-хазяїн за п. 23, що є еукаріотичною.

25. Клітина-хазяїн за п. 24, що є клітиною СНО.

26. Клітина-хазяїн за п. 23, що є прокаріотичною.

27. Клітина-хазяїн за п. 23, що є бактеріальною.

28. Спосіб одержання антитіла проти фактора О або його антигензв'язувального фрагмента, що включає (а) культивування клітини-хазяїна за будь-яким з 23-27 в умовах, прийнятних для експресії поліонуклеотиду, що кодує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, і (Б) виділення антитіла або його антигензв'язувального фрагмента.

29. Фармацевтична композиція для лікування захворювання, пов'язаного з комплементом, що містить ефективну кількість антитіла проти фактора О або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з 1-20 і фармацевтично прийнятний розріджувач, носій або ексципієнт.

30. Фармацевтична композиція за п. 29, де захворювання, пов'язане з комплементом, являє собою захворювання очей.

31. Фармацевтична композиція за п. 30, де захворювання очей вибране з групи, яка включає вікову макулярну дегенерацію, діабетичну ретинопатію, хороїдальну неоваскуляризацію (СММ), увеїт, діабетичний макулярний набряк, патологічну короткозорість, хворобу фон Хіппель-Ліндау, гістоплазмоз очей, оклюзію центральної вени сітківки (СКМО), неоваскуляризацію рогівки і неоваскуляризацію сітківки.

32. Фармацевтична композиція за п. 31, де вікова макулярна дегенерація вибрана з групи, яка включає проміжну суху АМО і географічну атрофію.

33. Фармацевтична композиція за п. 29, де захворювання, пов'язане з комплементом, являє собою запальне захворювання.

34. Фармацевтична композиція за п. 33, де запальне захворювання являє собою аутоімунне захворювання.

35. Фармацевтична композиція за п. 34, де аутоїмунне захворювання вибране з групи, яка включає системний червоний вовчак, міастенію, ревматоїдний артрит, хворобу Альцгеймера і розсіяний склероз.

36. Промисловий виріб для лікування захворювання, пов'язаного з комплементом, що включає: (а) фармацевтичну композицію за п. 29 в контейнері або контейнерах; (р) упаковку, яка містить вказаний в підпункті (а) контейнер або контейнери, і (с) листок-вкладиш або етикетку, яка вказує на те, що сполуку можна використовувати для лікування захворювання, пов'язаного з комплементом.

37. Промисловий виріб за п. 36, де захворювання, пов'язане з комплементом, являє собою захворювання очей.

38. Промисловий виріб за п. 37, де захворювання очей вибирають із групи, що включає вікову макулярну дегенерацію, діабетичну ретинопатію, хороїдальну неоваскуляризацію (СММ), увеїт, діабетичний макулярний набряк, патологічну короткозорість, хворобу фон Хіппель-Ліндау, гістоплазмоз очей, оклюзію центральної вени сітківки (СКМО), неоваскуляризацію рогівки і неоваскуляризацію сітківки.

39. Промисловий виріб за п. 38, де вікова макулярна дегенерація вибрана з групи, що включає проміжну суху АМО і географічну атрофію.

40. Промисловий виріб за п. 36, де захворювання, пов'язане з комплементом, являє собою Зо запальне захворювання.

41. Промисловий виріб за п. 40, де запальне захворювання являє собою аутоімунне захворювання.

42. Промисловий виріб за п. 41, де аутоїмунне захворювання вибране з групи, що включає системний червоний вовчак, міастенію, ревматоїдний артрит, хворобу Альцгеймера і розсіяний склероз.

43. Набір для лікування захворювання, пов'язаного з комплементом, який включає антитіло проти фактора О або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-20 в упаковці або упаковках та інструкції по введенню вказаного антитіла або його фрагмента для лікування захворювання, пов'язаного з комплементом.

44. Набір за п. 43, де захворювання, пов'язане з комплементом, являє собою захворювання очей.

45. Набір за п. 44, де захворювання очей вибране з групи, що включає вікову макулярну дегенерацію, діабетичну ретинопатію, хороїдальну неоваскуляризацію (СММ), увеїт, діабетичний макулярний набряк, патологічну короткозорість, хворобу фон Хіппель-Ліндау, гістоплазмоз очей, оклюзію центральної вени сітківки (СКМО), неоваскуляризацію рогівки і неоваскуляризацію сітківки.

46. Набір за п. 45, де вікова макулярна дегенерація вибрана з групи, що включає проміжну суху АМО і географічну атрофію.

47. Набір за п. 43, де захворювання, пов'язане з комплементом, являє собою запальне захворювання.

48. Набір за п. 47, де запальне захворювання являє собою аутоїмунне захворювання.

49. Набір за п. 48, де аутоїмунне захворювання вибране з групи, яка включає системний червоний вовчак, міастенію, ревматоїдний артрит, хворобу Альцгеймера і розсіяний склероз.

50. Спосіб лікування захворювання, пов'язаного з комплементом, який включає введення пацієнту, що потребує цього лікування, антитіла проти фактора ОО або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з пп. 1-20, де захворювання, пов'язане з комплементом, являє собою запальне захворювання.

51. Спосіб за п. 50, де запальне захворювання являє собою аутоіїмунне захворювання.

52. Спосіб за п. 51, де аутоїмунне захворювання вибране з групи, яка включає системний бо червоний вовчак, міастенію, ревматоїдний артрит, хворобу Альцгеймера і розсіяний склероз.

53. Спосіб лікування захворювання, пов'язаного з комплементом, який включає введення пацієнту, що потребує лікування, антитіла проти фактора О або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з пп. 1-20, де захворювання, пов'язане з комплементом, являє собою захворювання очей.

54. Спосіб за п. 53, де захворювання очей вибране з групи, що включає вікову макулярну дегенерацію, діабетичну ретинопатію, хороїдальну неоваскуляризацію (СММ), увеїт, діабетичний макулярний набряк, патологічну короткозорість, хворобу фон Хіппель-Ліндау, гістоплазмоз очей, оклюзію центральної вени сітківки (СКМО), неоваскуляризацію рогівки і неоваскуляризацію сітківки.

55. Спосіб за п. 54, де вікова макулярна дегенерація вибрана з групи, що включає проміжну суху АМО і географічну атрофію.

56. Антитіло проти фактора О або його антигензв'язувальний фрагмент, отримане способом за п. 28.

57. Антитіло проти фактора ЮО або його антигензв'язувальний фрагмент, яке містить варіабельний домен легкого ланцюга, який включає гіперваріабельну ділянку (НМК) 1 легкого ланцюга, що містить ІТ5ТОІЮСОММ (5ЕБО ІО МО: 30), НМА-2 легкого ланцюга, що містить СОМТІ ЕР (ЗЕО ІЮО МО: 35), і НМК-3 легкого ланцюга, що містить ГО5О5БІ РУТ (ЗЕО ІЮО МО: 38), і варіабельний домен важкого ланцюга, який містить НМК-1 важкого ланцюга, що містить СМТЕТММСОММ (ЗЕО ІО МО: 39), НУВ-2 важкого ланцюга, що містить УЛМТУТОЕТТУАСОГКО (ЗЕО ІО МО: 40), і НМК-3 важкого ланцюга, що містить ЕБСМУММ (5ЕО ІЮ МО: 41), де амінокислота в позиції 1 варіабельного домену важкого ланцюга являє собою Е і варіабельний домен легкого ланцюга включає каркасну ділянку (БК) 4, яка містить ЕСОСТКМЕЇК (5ЕО І МО: 51).

58. Антитіло проти фактора ЮО або його антигензв'язувальний фрагмент, яке містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО: 7.

59. Спосіб лікування захворювання, пов'язаного з комплементом, який включає введення пацієнту, що потребує цього лікування, антитіла проти фактора ОО або його антигензв'язувального фрагмента за п. 57 або 58, де захворювання, пов'язане з комплементом, Зо являє собою захворювання очей.

60. Спосіб за п. 59, де захворювання очей вибране з групи, що включає вікову макулярну дегенерацію, діабетичну ретинопатію, хороїдальну неоваскуляризацію (СММ), увеїт, діабетичний макулярний набряк, патологічну короткозорість, хворобу фон Хіппель-Ліндау, гістоплазмоз очей, оклюзію центральної вени сітківки (СКМО), неоваскуляризацію рогівки і неоваскуляризацію сітківки.

61. Спосіб за п. 60, де вікова макулярна дегенерація вибрана з групи, що включає проміжну суху АМО і географічну атрофію. нини ОН ФІ ІА | ОРМІВ У ФігісС ї пошшт жов жи шишки -ї Фіг, 1

Кей зіз4553) 8 дВОбвиВНнОовЗнавниинвВЕй в сб авннийиВи» Кава!- СОРТ сти

Ї. нн пня) Кк І ПКУ о АММАААЮАН Ковсексує вІДЕтТОзуівавтаоаттіІіСЯЕО з греки ті АС зіотуа фік івазуєсть в в сстеив віза) ті 23 піз о Азію СІ і і б гавані АЮ віІЗУВабїРзкіхвУ Ти тво т 00005185 20АС бідУ ОдвІацоаауєовктит ств в18звк15 ВМС відледтавкя вк віт сіяв я вх ДЕС вібрувати ств» 000 МІВ КАН ВВС відтоку аакт йти 7715 Св я ВВС сіфуєєвкіивахуУєовУТ Іо ОВ 000000 вліво ас гіфлтоерівкіазяавитут іст 00077 кхтх ВяС сі у дв аатсякуУІТТВ? 000000000000хІВРаАКВИК» Зааіс відтво увуувожуУтТІ ст | т в вакюя и ВНС тут йтися 000 10851

Фіг. ІА Кай нива сонесвпнзвониапвявиписновивввоввопивчви тю Кава СОБІ

С. Конта СОН Х. хі в'я ВІ ВЕ 85 В ЩІ Консенсує сх? ожиРхьі ліз оівяваии аа та яв лів! МАС ФфЕРСЖТЕкЕ»: зонтик іл вв ттгя из ЗМС фкескуРКЬІ «КЕН ТТЕМЕВаа? сечо Р тхЕЯрвЕїОов ЗАС бхзакавкиі Зфебит Во Вков аби тг і ВС оквскткьсІ БссюУ БАРЕЖЕЗЖЕЯ ЄВ отит тов МНС дквбкуВКЬІ ето аз візетТт з ох 8 дкЕстуРЕвЬ: 85075 ВРЮ У РУ? 586 РТЕТІВ Й НС дХвскУРИІ: Ес БІТ: своя тав БІ 28С ОК вскТВЖЕевІ вбік ьт І 550 23АЄ дфеЕРСбкУХ:ьІ Зстіт о вЗк? сл 5 ?т17р8 6 ОЗВВІС бжтбкткс: ФСОКТБЕІСУВРЕ яти в:во ВНС бкрсІіІ?кр: ЕТ Р СТВА ся о тт 5 Я 21зс сктскуркьсі Бетті 278575 65556 о0тЬїї: 550 НА зви сут екв: ЕЕ Т КУ У БЖ В я 5 5 в й РИТИ ОВ

Фіг. ІВ

Кара ме) 50309292 В Є 0 8 й З 318 ЗК 190 НТ НУ БК 6 Є що ЦЯ ш--ОМТаКТ -СОКІЯ КІ посесс ве Консежує хат хг собів «Тек фа ж ж І кі ВОЮ ВВ НИ ІТТ ЬОТ Ох? уча бах ьїк ВЕ Ж ЗВО вохатстуєіутть 000000 їли вет увіІ Кк 5БОЮТЯ С хау сьїгЬїь ШОВ И и ни ле ЗЕ ли Ше ВО ми: ЗМсС фбуатттустОАВЕІР 00 тб б'я т ях ЯЕОЮМИВ ВС хотатттусиоявь 00000000 Ява кьяж в ж 0 ВЕОЮЖ:о ВАС євуй теор, яко кігті ЗЕ ЮК: 10 е3с т и ПИ її вам 28О фату сЬОВОВО? то а ть ВЕС Ми ЗВЛАС Ер вин ши Я Я А БОЮ Ме вс каотатсттсвстьсяво 00000000 Якби ЗБОЮ 289С ко УКТУСсЬ ІВ | утивастгяькиІх ЗЕСЛО-КЬ ВОМС гот сов? ши т? хкБитя ВЕОІЮ Ме 16 ДНО хотуктхтисься осів 00000000 117606 к вк ЗЮМ:?

Фіг. ІС сег, 2А Фіг ОВ о ФІгаАС ! а ! 1 і

Кі 11з«х5ап7 зви нсуваипивнвинпиавВюпиЗих хз ни Ї Кона СОКН У пл нічия зує нит; ТАЖНУУник НИНО бт5зуо?й5ккоі: т коса тка» АНС дтйстувасааккиси?ї КУ скх( віти ТВ ЖЕК ВНС тчавтурібрвкЕХА СІ уки ска ВТ КИ яО? ЗВОНС пз слугу ки? са Укус ва іст? вт и ТК кКЖжУяОА» МНС побудов тку скати тю» АН ото Бу(тбтіьккваї ку скати Тен Яка БОНН усьо Укуси? 5 Кия ЗЯВНС усього ткктсактУЄСкіИи отут" тс МІН фут ясеня у куски ІТ ТЕКУ? ОН отв ккгсв тк? сват АтТи тс НЩиУА 2ЗВАНС отрьу ов овиькксаЗ У Ск азів твтеи тку? ПОН о тобто БО РЕКС тА ТЕСТЯ тка нс ітосзавствіхковха ку БеКкАЦІІТУЕтТЕ її;

Фіг. 2А Ковай Не а о е 55 565 Б и июня ВИ В В ЄС не. СОН ущ? ЕЕ БА БЮРО ВІ5 БЕК ВІВ Консенсус сосьякоитно нта? тетТАТ НИ соськунсятнт тб ит т узори ЕитувьОтТет ау МНС боссвнтКсік? т? Ето вх сів жЕВОТ І УЮтТА НЕ БЯЄ собів УТ Еїт та КІС? тт: тк тах ЗОН боскекнотінт тобто котрі овтеУвлаІ ЛЮНС собів нисітія? її кт А091х (и ктй ота ВН соськвисінтиг тт АТАЦІ РУРЬВ" УЗА ЗББНС сосіужексівтї 15171100 (І т жо увікТіІ аа оосьвексієти й їси зво Чак ьо і ті ВІН бобівикотіІк 170 тт ові АНЕТЬОСТІл УЗА МОН собаки нносіятя? У? 887 крОІ В? УРЕБУУУБИІІ ІОН соськИиксіІ? їсти АВ ТІ НІЧ? т ТАТІ пиво гостя нкокіІк? ТХІР ати? тях дейнссасівиноттьт т: тт Це титьстиувтині

Фіг. 28

Кв ЗІ в нео 5 Я Ех В Св Я ЕЕ В Ж Бо КОНІ МОЗ ОК Ве НЯМ НВ М 3 3 ше: їн - Спобма У СОМ НУ Н нта» СУК НУ й Гу; нев Хокенс біта заоч тея жа ут ав я я я ЗЕВС ННЯ дБА ВТАУТІСЯ Ес жи я важ ж вся ЗЕМ Ж бІЕБбБКАВоТтТІІтсявботі я бабку ху в ЮМиХ МЕН дла8:кАВОВЧТІЕВКЕС СТИ Е | жовте т в з ЗМІЮ ВВ ЯКІС фтабьквкоТкУТІТСЕХЕ СТИ | і б беж тв ВМ: МЕНЕ стігбїі кавова тує всі Же феЕЖЕ У ти ж ВОЮ піно алтязкаотктяясва й в увя Тева же я Бі нио УБНС аль какзтктуттсяатв о вини 00341 ра вх я вже ВОЮ ДЕН бів БбкахВТ тата Вих. заживе жі Ом: ЗЕНО ФІ пені НН аб то ях ЗЮМ: МВ ЗЕВС духовний: | 7 Теж афетьтт ж в я воюМ В ЯН бі мно нини ну ре жь т ж в я ою ХМЮНС орі вуха утвсхвІ й. жать т вже я ВЕДЮМ Я ЕНН різці УтТЕІсСТики т |жефрст век ва юю

Фіг. С ДЖОААВААОААТАТТЗСОТТОСТАСТТаССТОТАТаТТТОТСТТТТСТАТАССТАСАЛАсОсаТАТа ств АТССАСОТСАСССАОТСТССАТССФТСССТОТСТОСАТСТОТАССАСАССОСОТСАССАТСАСтТтТвсСАТТАСС АОСАСТОАТАТТСАТОАТОАТАТОААСТООТАТОАОСАСАВАССАЙЙОААЛОТТССТААВСТССТОдТсТОТ СЗАСОСААТАСТСТРОСТССТачастсссСАТСТСССТРСАСТООСАСТООАТС ТВО АСАСАТЕТСАСТСТС ВССАТСАОСАССОСТОСАОССТОААСАТИТТССААСТТАТТАСТтОоТЕтОсАААстТОоАТКОКТпссОтТАСАСО ТТТООССАСОСТАССВАВОСТОСАСАТСАЛАССААСТСТОССТОСАССАТСТОТОТТСАтСТтТОеССвОссАТСТ ПАТОВОСАСТТСАКАТСТОСААСТОСТІСТОТТО ОТО ССТОСТОААТААСТТСТАТСССАсАававссААА СТАСАСТИСВАСОТОСАТААСОСОСТССААТССССТААСТОССАССВИВОТО САС САсОАсСАЄСАВ САСАВСАССТАСВОПИТОАаСАССАСССТОАСаСТОАОСАААОСАСАСТАСОАСАААСАСАААсТИТАСоСС ТОСОААСТСАСССАТСАСОСССТОАаСТСЧОССОТОВСВАВОЛОСТТСАВСАССОАСАСТОТА В

Фіг. З ОІОУТОЗРЕВЖЬСАВУСОВУТІВТСТРУТрІ ВОВНИ ООКРОКУРК:оІВСОИТЬАВСсУвБВкБОВсаотТОг БТІВЕБОРЕПУАТУТСВОДОБЬРЕТЕСОСТКУКІКИТУААВИУРТЕЗРЕВВОВКОСсТтАВУУСЬСЯНКУВАКА КУСИКУОНАБОВСНЕВЕВИТЕОНЕКОБТУВСЕВТЬТЬВКАВТЕКНКУТАСВуУТНОСЬСУВУТКЕКНиСЕС БЕ НО м: 47, | | | | ШИ тпі-БсО: рІОУТОБРОБВЬбАБУЄВУТІТЕ (ЗЕ ОО Ме 48) Ена-шез жхооКеоКУРКШЄЇїВ (ЗО Мі; 49, ІАЗ-ЬОї ОУРНУНУБОВОСОТОРТЬТІБсЬОРЕОХУАРУТС ВЕС МО Ме: 503 вна-псСі вСостТкУвІКЮ (БЕ Ме 51) нукі-всі жтятохвроии (БЕЗ Мі: 301 кув2-с» вантьше БЕБСЮ Ме 38) нувз-ьсзі бовоаяваихт (БО. МОЗ сЬ1з НТУААРБУКІКРЕЕОЕСЬКОСТАВМУСТЬМНРУРНВАКУОНКУВМНАЛИЗсМаОВВУТКОБаКОВТУВЬВОТО то;еКавуккнкууУсСвутнОоСсьнеРОТКВЕМНоВО (ЕС М: 82 Фіг, 4

АТОАВАААСААТАТСССАТТТСТТСТТОСАТСТАТаРЕСоРТТТТТСТАТТССТАСАААСОССОТАСССТСАЄ стссдлостостоеадтетооовсстТокетТсААсААйСстТовоОсоРоАСТоААсстТЕТОстТосААвОосСтІСТ ОФАТАСАССТТОСАСТААСТАТИСЛАТОВАСТОВсТОоСОоССААСССоСтосАсдАвсссСтТТсАСТОовАтТОоссА ТОСАТТВАСАССТАСВСтТОсасАСАСААСАТАТОСТОАТОАСТТоеААсобАСОсТтТтТОаТстТтотТесттоаАо АССТСТСТСАССАССОСАТАТСТОСАОАТСАССАСССТОА АСИСТ ООАСАСТОССОТОТАТТАСТоТаЛО соссвосососсботТТААТАдСстТовсоссадоосАСссстостТорассотетостевасстесАссАввсососА тесстоттессосставевосстостосАаваасАсстотоосооосАсвосвасостоовостасстТОостевАо САСТАСтТТССсоесААСссовотодесетестеотебААсСтТодсссоссстоАссвесаосстоодедесттоссе сестотостасАстестововАстетастосстовосАсСстостсАссстоссстТосАссАсесттовсссАсо СаАСОТАСАТСТОСААСОТОАВТСАСЛАЙСССАОСЛАСАССААООТОАСЛАВАААСТТОАССОСАЛАЖСТ ТСТСАСАВААСТСАСАСАТАХ

Фіг. 5 ОУОБУОБОРЕЬКЕКРОАБУКУВСКАСОУТРТНІОМИНУВОВРСОСОВИМСМІКТЕУТОВТТХАВОКОВЕУВ В, ОТБУБТАУСОТЕВЬКАВОТАУУУСВНЕСаУМНИКОСОСТЬУТУВВАВТКЕСЕВУВНЬАРЕВКОТЕССТААТОСТУ, КОУДЕЕРУТУВНЕВСсЛЬТВОУуВТррАУКОВВОСИВЬО ТИВ БОТОГУТСНУННЕРВНТКУрККУввХ всоктнт (ЗБОООІО Ме: Б) ЕВІ1-НСсСІі ОУОПУОБОРЕШКЕРСАвУКУВСКАЄ (ЕС ОО в: Б вйа-но: жУводвсодьниМме (ВЕОЛО й: 58) тА3-НОї ВЕУКЗПОТЕУВТАХЬОІВВСКАВОТАУХТСсСВВ ЗКОЮ М 57) ка4-нС: мсострутувЕ (ЗБ ЦО Ме: БВ) нУуві-нСсї зЕжкЕтТкуВМНИ (БЕСНІ Мі: 38) нукаое-нсі нуту тТсЕтТтТулЛопЕКа (БЕОІЮ Ме 40) нуяз-нс: ксауни (ЕФ Мосс) пні: ДЕТКЕРБУТРВБАЗЕБКЕТВСОТААЬСОКУКОУКРЕРУТУВННаАьтТВоУнТЕвАУьОвЗвЬувЬвУуцтУЮ БавистотУІснуннкРрЕнтТКУВккКТЕРКссритня (БО Ж: 59

Фіг. 6 ВТОХАСАХОХАТАТТИсСстТТОСтТАСТТОССТОТАТОТТТОТСТТТТСТАТАССТАСААВСасОотТАТОстТоА т АТССАЧСТОАСССАСТСТОСАТОСТОССТОТОТОСАТСТОТАВВАВАССОССТоАССАТСАСТТОСАтТТАСО АССАСТСАТАТТОАТСАТСАТАТОСААОСТОССТАТОАССАСАААССАСССАААСТТССТААОСТОСТвАТСТСТ ССАПССААТАСТСТТСОТССТОССОТСССАТСТСОСТТСАСТОССАСТОСАТСТОССАСВСАТУТСАСТОТ дос тТеВасСАпСсСтТОсАВССТОААСАТОТТОСААСТТАТТАСТОТТТОсАВОТОАТТОТТТОосестТАСАСО ТТТОСССАСССТАССААССТЕВАСАТСАААССААСТИЖООСТОСАССАТОТО ТО КТСАТСТІСССпССАТИТ САФТСВССАСТТОЛААТСТООААСТОСТТУСТОТТОТОТОССТОСТОААТААСТТСТАТСССАСАСАВСССААА СТАСАСТОСААССТОССАТВАСОСССТССВАТССОСТВАСТОССАСОАОВОТОТСАСАВАССАСОАСАССАдС САСАБСАССТАСАСССТИАСОСАССАСССТОАСОСТОАССААВОСАСАСТАССАОАААСАСХААОТСТАСССС ТОСОЛ АВТСАСОСАТСАССПСОТОАОСТоСССсстТоАСАААСАОСТТСААсСАссОсАсвОотТОотІАА Фіг, 7

ПІОУТОВРЕВСВАВУЄВКУТІТСІТЕТВІРРОНИЧМУООКРОКУРКЬсІЗОСНТЬЕРОоУванКосВоЗотТои т БЕІБВБОРЕВУАТУХСТЛОВОВІРУТЕСОСТКУКВІКЕТУЛАРЕУ ТЕО ВВЕОСКЗОТАВУХУСССММЕХРЯКА куоикхУвнакОовсндоЕВУТКООВКОоЗТтУсЬВаТІТьЕКАВТККНЕУХАСВУТНОСШТЬЗеВУТКВЕНВСЕС (БЕН) Ме: 51) вЕНІ1-ПСІ БІОУТОЯРЕВЬЗАВУСОВУТІТО (БЕЄО Мо: 48) КЕКЗеВСі МУдОКРОКУРКШОВІВ СЕСІЮ Мі: 48) ' ЕВЗ-ЬСІ бУРВВВЕЗСВСЕСТОЕТЬТІЗВЬОБЕПУАТЖУЄ. (ВЕСНУ Ме: БО) Ед4-їб: ЕБЕсОбтТЕУувІК (ЗБЕ МІ нУв1-всСІ жтТетТвІВОВМИ (БОБ Ме: 30) цУво-всі абитБаРк (БЕ І : 35) нУяз-с: вовоявРАУтТ (ВЕЙІВ М: ЗА Сі: ВТУААРОУКІгрРРЕрковкватавучСсьсинехХрРВЕАКУОНКУрМАБОвСНВвОВсУТКОрКОЕТуУвЬсОТЬ ТЬБКАВУККНКУТУАСЕУТНОСЬОВРУТКОКЕМАСИЄ (БО Ж 53 Фіг, 5 ВІТОААААЛАСААТАТСОСАТТТСТТОТТССАТСТАТСТТООТТУТТІСТАВТсСТАСАААсосСотТАСоСтвАА втоскостоотосСААТетососстТовВотТтовАвААссстосоасстТсАаТоАдотТІтТестосАва вот СОАТАСАОСТТСАОТААСТАТООЛАТОКАСТИСОТИСОССААСССОСТОСАСААвОССТТОАСТОовВАТООСА. ТОСАТТАВСВССтТАСАСТОСВПАСАСААСАТАТОоСТОАТОветТСААсосАСссотТтТОа Отто ТОосАС ВССТСТОТСАССАСОССАТАТСТаСАСАТОВОСАСССТоЗАВОСТвАсоВсСАСсТосСсОтТотАЙТАСсТта тво сесопаасосвосотТтТААТААСТОСССССААсОсАСсстТоостТоАссототостсавсотссАссАвОовОосСсА тосатоттссосстобсвосотТостесААпАзсАСстТоетТоосоосАсСАосссососсТтодсостосстТооТсААО ЗАстасттсссссАвссостовссстатсстсаВАстоАоссоссстоАссАсссссотосасасесттоесо астТотостАСАстТеСстТеАсвАстТетТАСТОССтТоАССЬССотоотадссстТвесстТосАСсАССТТавОсСАСО САСаССОТАСАТСсТаСААССТОААТОЗСАВОССсАОСААСАССААОСТСОАСААСАААСсТТОВВСССВАВТОХ ТОТОВСВАААСТОАСАСАТАХ

Фіг. 9 ТУ ЧОВОРЕКЕРОАВУКУВСКАВОХТРТНУ МИХ КО АВОООПЕННОМІНТУТОВТТУАОБВРЕКОВЕМЕ ВІ, ОТБУЄТАТУБОІББІКАЖОТАУЧХУСЕНВОСУННЯ ОСТ РУББАВТЕСРОХЕРЕАРБІБКВІВОСТААВОСЬХ КОУЕРЕВУТУВИНВСЛИТЕОУНТЕРАУБОВЕСЬУВЬОБУУТРЕЕВОСТОТУТСНУЮНКРЕНТКУВККУЮВХ БОВКЖНЕ (БЕЙІЮ Ме: 63) ЕВ1-ВС: БУОБУОБОВЕБККРСАВУКУвсСКАВ (ВЕС ІЮ М: Б) тво-нСь мудлодвсоськимо ЗЕОІЮ Ме: 86 Що КЕВЗ-НС: ДРУК ББОТЗУБТАУБОЇВБВЬКАВОТАЧУЖОВВ (БЕ І в) гв4-но: йсоствутува (СОН) Ме: 58) нуві-нс: шжТРІНТУВМИ (5БСІО Ме: 38) нУВі-ВСї МІНтТУтТсвТттуароиКИ СВББОІЮ Ме:49) нукз»-нсі шеойинк (БО НІ Ме СВІ ДОТЕСВЯУХРБАРЕСЕБВТВССТАЛЬССЬУКОУКРИРУТУВНИВОЗТІБСУНТРРАУуБОВасЬУВЬВОУУТУВ БІЗБЬСТОТІІСМУВНКВВнтКУСККУКРрКСОКТИТ (КОЮ М 58)

Фіг. 10

Фо 0 Контрольбез сироватки ШИ п Контроль сироваткового лізису М бтумавнізований Ки? проти фактора У су О50:4,740,6 ЯМ пежідун н 238 (модифікований КБ проти фактора І іс, о вн неннядвсн-я Т38-1 (модифікований Каб проти фактора З) 1С50:3,550,5 М 120 ши /Ковтроль з людським ТН «Й 0 Контрользхар 120 100 вх ща - 4 А тво У й е ко Ку ; В ; Ж їх | х Е 60 З 5 ве Ж е ще й х Ах о ь А у, г ! ай ь Я їх й хх В А у КА ї т ві о 8 вів 0 0 1 та 0 1000 10 Концентрація (ЯМІ)

Фіг. 11

Бай ослроти кл НИ шо 100-4 ек «ЇЇ ще Т, і 2 4 , Е х | 97 1 | у ТО 182 НМ З БО гн До : і їх 8 ро Й з ше 405 її 4 ій ІЗ ї | ! у я ї ; ; х. ! і ! х ні Кк х - І Вк че уза ік й :

0.01 0 З 10 100 Кониентрація (нм) КО аб проти пппінн ск с плин вл | 62 | 265 сотий Іво (НМ) 140 зво | 726

Фіг. І?