EA016245B1 - Антитела против альфа2-интегрина и их применение - Google Patents

Антитела против альфа2-интегрина и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA016245B1
EA016245B1 EA200801314A EA200801314A EA016245B1 EA 016245 B1 EA016245 B1 EA 016245B1 EA 200801314 A EA200801314 A EA 200801314A EA 200801314 A EA200801314 A EA 200801314A EA 016245 B1 EA016245 B1 EA 016245B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
integrin
antibody
amino acid
δεο
acid sequence
Prior art date
Application number
EA200801314A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200801314A1 (ru
EA016245B9 (ru
Inventor
Элиас Лазарайдес
Катрин Вудс
Марк Бернард
Original Assignee
Гленмарк Фармасеутикалс С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Гленмарк Фармасеутикалс С.А. filed Critical Гленмарк Фармасеутикалс С.А.
Publication of EA200801314A1 publication Critical patent/EA200801314A1/ru
Publication of EA016245B1 publication Critical patent/EA016245B1/ru
Publication of EA016245B9 publication Critical patent/EA016245B9/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2842—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70546—Integrin superfamily
    • C07K14/7055—Integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70546—Integrin superfamily, e.g. VLAs, leuCAM, GPIIb/GPIIIa, LPAM
    • G01N2333/7055—Integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49

Abstract

Изобретение касается антител к интегрину анти-α2 и их применения. Раскрыты гуманизированные антитела, которые связывают I-домен интегрина α2 и ингибируют взаимодействие интегрина α2β1 с коллагеном. Также раскрыто терапевтическое применение антител к интегрину-α2 при лечении расстройств, связанных с α2β1, включая применение антител к интегрину α2, которые связывают интегрин α2 без активации тромбоцитов.

Description

Заявка на данное изобретение испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 60/738303, поданной 18 ноября 2005 г. и включенной в заявку на изобретение во всей полноте посредством ссылки, в соответствии со Сводом законов США 35, § 119(е).
Область техники
Настоящее изобретение относится в целом к антителам к интегрину α2β1, включая гуманизированные антитела к интегрину альфа 2 (антиинтегрин α2 антитела), их применению и способам лечения с применением антител к интегрину α2.
Предпосылки создания изобретения
Интегрин α2β1 (очень поздний антиген 2; УЪА-2) экспрессируется на разных типах клеток, включая тромбоциты, клетки эндотелия сосудов, клетки эпителия, активированные моноциты/макрофаги, фибробласты, лейкоциты, лимфоциты, активированные нейтрофилы и тучные клетки. (Нет1ег, Аппи Веу 1ттипо1. 8:365:-400 (1999); XVи апб 8ап!ого, Эеу. Эуп. 206:169-171 (1994); Ебекоп е1. а1., В1ооб.. 103(6):2214-20 (2004); Оюкеюп е! а1., Се11 Абйещоп апб СоттишеаИоп. 5:273-281 (1998)). Наиболее типичными лигандами для α2β1 являются коллаген и ламинин, каждый из которых обнаружен во внеклеточном матриксе. Обычно 1-домен интегрина α2 связывается с коллагеном при участии двухвалентного катиона, а с ламинином тот же самый домен связывается по двум механизмам: с участием двухвалентных катионов или независимо. (Шекеюп е! а1., Се11 Абйеыоп апб СошшишсаНоп. 5:273-281 (1998)). Интегрин α2β1 обладает разной специфичностью в зависимости от типа клетки и для определенных типов клеток является рецептором коллагена и/или ламинина, например интегрин α2β1 известен как рецептор коллагена для тромбоцитов и рецептор ламинина для эндотелиальных клеток. (Шекером е! а1., 1. Вю1. Сйет. 272:7661-7668 (1997)). Вирус ЕСНО-1, декорин, Е-кадгерин, металлопротеиназа матрикса I (ΜΜΡ-Ι), эндорепеллин, многие коллектины и белок комплемента С1с.| также являются лигандами для интегрина α2β1. (Ебекоп е! а1., В1ооб. 107(1):143-50 (2006)). Интегрин α2β1 задействован в нескольких биологических и патологических процессах, включая стимулируемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, миграцию клеток по коллагену, реорганизацию волокон коллагена в зависимости от типа клеток, а также зависимые от коллагена клеточные ответы, которые вызывают усиление экспрессии цитокинов и их быструю пролиферацию (Оепбгоп, 1. Вю1. Сйет. 278:48633-48643 (2003); Апбгеакеп е! а1., 1. 1ттипо1. 171:2804-2811 (2003); Вао е! а1., 1. 1ттипо1. 165(9):4935-40 (2000)), аспекты функционирования Т-клеток, тучных клеток и нейтрофилов (Сйап е!. а1., 1. 1ттипо1. 147:398-404 (1991); ЭиШп апб бе ЕоидегоПек, Сигг Орш 1ттипо1 13:286-290 (2001), Ебекоп е!. а1., В1ооб.. 103(6):2214-20 (2004), №егг е! а1., В1ооб. 95:18041809 (2000), аспекты гиперчувствительности замедленного типа, контактной гиперчувствительности, артрит, индуцированный коллагеном (бе ЕоидегоПек е!. а1., 1. С1ш. 1пуе§!. 105:721-720 (2000); Кпедек!еш е! а1., 1. Сйп. 1пуе§!. 110(12):1773-82 (2002)), морфогенез протоков молочной железы (Кее1у е!. а1., 1. Се11 8οί. 108:595-607 (1995); 2ийег е! а1., Ат. 1. Ра!йо1. 155(3):927-940 (1995)), заживление ран тканей эпидермиса (Рбейег е!. а1., 1. Вю1. Сйет. 272:181457-54 (1997)), а также в процессах, связанных с ангиогенезом, стимулируемым УЕОЕ (фактором роста эндотелия сосудов) (8епдег е! а1., Ат. 1. Ра!йо1. 160(1):195-204 (2002)).
Интегрины являются гетеродимерами, которые состоят из одной субъединицы α и одной субъединицы β и включают большое семейство белков, расположенных на поверхности клеток, которые обеспечивают адгезию клеток к компонентам внеклеточного матрикса (ВМ), а также белкам плазмы крови и являются основными участниками в некоторых типах взаимодействий между клетками. Интегрины взаимодействуют с компонентами внеклеточного матрикса через свои внеклеточные домены (Ро/ζί и 2еп!, Ехр. Ыерйго1. 94:77-84 (2003)). После связывания с лигандами интегрины передают внутриклеточные сигналы на цитоскелет, что приводит к изменению активности клетки в ответ на такие события клеточной адгезии, которые называют передачей сигналов снаружи вовнутрь (см., например, Нет1ег, Аппи Веу 1ттипо1 8:365:365-400 (1999); Нупек, Се11. 110(6):673-87 (2002)). Такая передача сигналов может активировать также другие подтипы интегринов, экспрессируемых на той же клетке, и называется передачей сигналов изнутри наружу. Дальнейшая передача сигналов изнутри наружу происходит через регуляторные сигналы, которые образуются в цитоплазме клетки, такие как, например, ассоциация субъединиц α и β, которые затем передаются на внешний лиганд-связывающий домен рецептора. Интегрины могут играть важную роль в процессах адгезии клеток, которые управляют развитием и морфогенезом органов, физиологией и патологией, а также нормальным гомеостазом ткани, иммунным ответом и ответом тромбоцитов, и, кроме того, они служат рецепторами внешней среды для клетки. Эти белки характеризуются тем, что при нормальных условиях находятся в свернутой конформации, а после возбуждения происходит быстрое изменение их конформации, в результате которого открывается сайт связывания лиганда. Современным инструментом, который используют для изучения структуры интегринов и механизмов их возбуждения, является рентгеноструктурный анализ. Понимание структурных особенностей интегрина облегчает лучшее понимание сайтов связывания, дифференцированных состояний и их активных и неактивных пространственных структур. Обычно сайт связывания с лигандом/противорецептором всех интегринов находится в пределах домена α и состоит из зависящего от иона металла сайта связыва
- 1 016245 ния, называемого в дальнейшем доменом ΜΙΌΆ8. (ЦетЬо е1 а1., 1. ΒίοΙ. Скет. 274, 32108-32111 (1988); Ееих1оп е1 а1., 1. Меб. Скет. 46:5316-5325 (2003); Сабек е1 а1., 8с1епсе. 295(5557):1086-9 (2002); Сшга1к е1 а1., Еиг. 1. Вюскет. 210:911-921 (1992)). В субъединицах α коллагенсвязывающих интегринов, которые включают интегрины α1, α2, α10 и α11, сайт ΜΙΌΆ8 расположен в пределах дополнительного вставленного домена на Ν-конце, который известен как I, А или Ι/Α-домен - свойство, общее и для субъединиц α семейства лейкоцитарных интегринов-в2 (Вапб1 апб Нодд, 1. Βίο1 Скет. 269:12395-8 (1994), Ьатхоп е1 а1. 1. Се11 Вю1. 108(2):703-12 (1989), Ьее е1 а1., 1. Вю1 Скет. 269:12395-8 (1995); Етх1еу е1 а1., 1. Вю1. Скет. 272:28512-28517 (1997) и Се11 100:47-56 (2000)). Ι-домены являются структурно гомологичными домену А1 фактора фон Виллебранда и содержат шесть цепей β-складчатой укладки Россмана, окруженной семью α-спиралями (Со1отЬаШ апб Вопа1бо, В1ооб. 77(11):2305-15 (1991); Ьатхоп е1 а1. 1. Се11 Вю1. 108(2):703-712 (1989); Етх1еу е1 а1., 1. Вю1. Скет. 272:28512-28517 (1997); №11е е1 а1.; ЕЕВ8 Ьекегх, 452(3):379-385 (1999)). Коллаген-связывающие интегрины имеют дополнительную α-спираль, известную как спираль аС (Етх1еу е1 а1., 1. Вю1. Скет. 272:28512-28517 (1997) и Се11 100:47-56 (2000); №11е е1 а1.; ЕЕВ8 Ьекегх, 452(3):379-385(1999)).
Взаимодействие интегрин лиганд может облегчать транссудацию лейкоцитов в воспаленные ткани (1аскхоп е1 а1., 1. Меб. Скет. 40:3359-3368 (1997); Сабек е1 а1., 8с1епсе. 295(5557):1086-9 (2002), 8исаг е1 а1., Вюотд. Меб. Скет. 10:2051-2066 (2002)) и играть определенную роль в процессах, следующих за начальной транссудацией лейкоцитов из кровяного русла в ткани в ответ на воспалительные стимулы, включая миграцию, рекрутинг и активацию провоспалительных клеток в участке воспаления (ЕЬ1е 1.А., Сигг. Ркаг. Эех. 11(7):867-880 (2005)). Имеются данные о некоторых антителах, блокирующих интегрин α2β1, которые, как сообщалось, влияют на реакции гиперчувствительности замедленного типа и эффективность в модели ревматоидного артрита с использованием мышей и в модели воспалительной болезни кишечника (КпедеШеш е1 а1., 1. Скп. 1пуех1. 110(12):1773-82 (2002); бе Еоидетокех е1. а1., 1. Скп. 1пуех1. 105:721-720 (2000), а также уменьшают пролиферацию и миграцию клеток эндотелия ш укто (8епдет е1 а1., Ат. 1. Ра1ко1. 160(1):195-204 (2002), что указывает на то, что возможно блокирование интегрина α2β1, предотвращает/ингибирует аномальный или повышенный ангиогенез, наблюдаемый в различных раковых образованиях.
Тромбоциты обычно циркулируют в крови в неактивном состоянии, однако именно они отвечают за быстрый ответ на всевозможные агонисты на пораженных участках. После стимуляции изменяется их форма, и они активно взаимодействуют с белками плазмы крови, такими как фибриногены, фактор фон Виллебранда (у\УГ). с другими тромбоцитами, а также с эндотелиальной выстилкой стенок сосудов. Все эти взаимодействия направлены на облегчение быстрого образования тромбоцитарно-фибриновой гемостатической пробки (Сгатег, 2002 ш Нетох1а515 апб ТкготЬох15, 4'1' ебйюп). После связывания с лигандом рецепторы тромбоцита запускают пути сигнала снаружи вовнутрь, которые, в свою очередь, запускают сигнал изнутри наружу, что приводит к активации вторичных рецепторов, таких как рецептор тромбоцитов к фибриногену, интегрин αΙΛβ3, вызывая агрегацию тромбоцитов. Предполагают, что антитела или пептидны-миметики лигандов, которые связываются или взаимодействуют с рецепторами тромбоцитов, стимулируют подобный каскад передачи сигналов, ведущий к активации тромбоцитов. Даже незначительная активация тромбоцитов может привести к тромбообразующему ответу тромбоцитов, тромбоцитопении и кровотечениям.
Интегрин α2β1 является единственным коллагенсвязывающим интегрином, который экспрессируется на тромбоцитах и, вероятно, играет определенную роль в адгезии тромбоцитов к коллагену и в гемостазе (Сгипег е1 а1., В1ооб. 102:4021-4027 (2003); №ех\\'апб1 апб Уа1хоп, В1ооб. 102(2):449-461 (2003); 8ап1ото е1 а1., ТкготЬ. Настой. 74:813-821 (1995); ЗЩапбег е1 а1., В1ооб. 15:1333-1341 (2004); Уапкооге1Ьеке е1 а1., Сигг. Эгид Татде1х Сатбюуахс. Наета1о1. ЭАогб. 3(2):125-40 (2003)). Кроме того, интегрин α2β1, возможно, играет определенную роль в регулировании размера агрегатов тромбоцитов (ЗЩапбег е1 а1., В1ооб. 103(4):1333-1341 (2004)).
Было также показано, что интегрин α2β1 является ламинин-связывающим интегрином, который экспрессируется на клетках эндотелия (Ьапдшпо е1 а1., 1. Се11 Вю. 109:2455-2462 (1989)). Считают, что клетки эндотелия связываются с ламинином через механизм, опосредуемый интегрином, однако было выдвинуто предположение, что Ι-домен а2 может действовать как лиганд-специфичная последовательность, вовлеченная во взаимодействия клеток эндотелия (Вакой е1 а1., В1ооб.. 84(11):3734-3741(1994)).
Ожидается, что терапевтическое антитело, которое связывает интегрин α2β1, включая интегрин α2β1 на тромбоцитах, может вызывать осложнения, связанные с кровотечениями. Например, антитела, нацеленные на другие рецепторы тромбоцитов, такие как СРЛ (Уаикооте1Ьеке е1 а1., Сигг. Эгид Татде1х Сатбюуахс. Наета1о1. ЭАогб. 3(2):125-40 (2003) или СР ПЬ/Ша (8ске11 е1 а1., Апп. Нета1о1. 81:76-79 (2002), №ех\\'апб1 апб Уа1хоп, В1ооб. 102(2):449-461 (2003), Меткш е1 а1., Сйси1а1юп. 109:2203-2206 (2004)), вызывают тромбоцитопению, хотя механизмы, стоящие за этим явлением, не совсем понятны. Была высказана гипотеза, что связывание антитела с рецептором тромбоцита может изменять его трехмерную структуру и воздействовать на эпитопы, которые обычно ему не подвергаются, что затем приводит к гибели тромбоцитов (МетНш е1 а1., Сйси1а1юп 109:2203-2206 (2004)). Действительно, кровотечения,
- 2 016245 связанные с оральным приемом доз антагонистов СР 11а/111Ь, были описаны в качестве темной стороны данного класса соединений (Вйай апб Τοροί, Νοί. Кеу. Эгид Όίδοον. 2(1):15-28 (2003)). Если интегрин α2β1 играет такую важную роль в миграции лейкоцитов через воспаленную ткань, следовало бы разработать терапевтические агенты, которые могли бы действовать на α2β1 при заболеваниях и расстройствах, которые связаны с интегрином α2β1, и/или клеточных процессах, связанных с такими расстройствами, включая рак, воспалительные и аутоиммунные заболевания, при условии, что такие агенты не будут активизировать тромбоциты. Таким образом, в уровне техники существует необходимость разработки соединений, влияющих на интегрин α2β1, такой как лейкоцитарный интегрин α2β1, который не вызывал бы побочных осложнений в виде кровотечений.
Блокирующее антитело ВНА 2.1 к интегрину α2β1 человека было впервые описано у Напдап е1 а1., (Сапсег Ке8. 56:3142-3149 (1996)). Известны и другие антитела к интегрину α2β1, их используют ίη νίίτο, например, доступные в продаже антитела АК7 (Махигот е1 а1., ТйгошЬ. Наетοк!. 66(4):494-9 (1991), Р1Е6 (\аупег е! а1., 1. Се11 Βίοί. 107(5):1881-91 (1988)), 10С11 (С11!ау е! а1., Βίοοά. 73(5):1235-41 (1989) и А2-11Е10 (Вегде^п е! а1., Се11 Абйек. Соттии. 2(5):455-64 (1994). Напдап е! а1. (Сапсег Кек. 56:31423149 (1996)) применяли антитела ВНА2.1 ш νίνο для изучения блокирования функций интегрина α2β1 при транссудации раковых клеток человека в печени и способности таких опухолевых клеток образовывать очаги метазстазирования при лечении с применением антител. Антитело На1/29 (Мепбпск апб Ке11у, ЬаЬ 1пуек1. 69(6):690-702 (1993)), специфичное к интегрину α2β1 мышей и крыс, применяли ш νίνο для изучения действия интегрина α2β1 на Т-клетки после активации вирусом ЬСМУ (Апбгеакеп е! а1., 1. Ттшилцк 171:2804-2811 (2003)), для изучения гиперчувствительности замедленного типа на введение эритроцитов барана и ответной реакции гиперчувствительности контактного типа, вызванной Б1ТС, а также артрита, вызванного коллагеном (бе РоидегоИек е!. а1., 1. С1ш. 1пуек1. 105:721-720 (2000)), для изучения роли интегрина α2β1 при ангиогенезе, регулируемом фактором роста эндотелия сосудов УЕСБ (Бепдег е! а1., Ат. 1. РаМ. 160(1):195-204 (2002); Бепдег е! а1., Рт§ 94(25):13612-7 (1997)), а также для изучения роли интегрина α2β1 в передвижении периферических мононуклеаров (РМЦ) в ответ на фактор активации тромбоцитов (РАР) (\егг е! а1., В^б. 95:1804-1809 (2000)).
Применение моноклональных антител мыши, наподобие описанных выше, в качестве терапевтических агентов для лечения пациентов-людей с нормальным, не пониженным, иммунитетом, было ограничено устойчивой иммунной реакцией, направленной против вводимых антител мыши, особенно при повторном введении. Такая ответная реакция не только не может сократить эффективное время полужизни антитела мыши в крови, но также может привести к мощному ответу в месте инъекции и/или анафилактической реакции (Бйа^1ег е! а1., 1. Ттшилцк 135(2):1530 (1985)). Кроме того, при введении людям эффекторные функции антител грызунов, связанные с константными областями (Рс), значительно менее эффективны, чем аналоги человека, что обусловливает потерю активации комплемента и антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЭСС), которые могут быть желательными.
Таким образом, существует потребность в разработке антител к интегрину α2β1, включая антитела для лечения расстройств, связанных с интегрином α2β1, а также механизмов и клеточных процессов, включая воспалительные и аутоимунные заболевания. Кроме того, было бы желательно получить антитела к интегрину α2β1, которые не будут связаны с развитием ответа на антитела у пациента.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Графические результаты исследований действия антитела к интегрину α2 на паралич в модели экспериментального аутоиммунного энцефалита на мышах, при введении с появлением первых признаков заболевания (см. пример 7).
Фиг. 2. Графические результаты исследований действия интегрина α2 на паралич, при введении на индукционной фазе (см. пример 7).
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает антитела к интегрину альфа 2 (α2) и способы их применения, предпочтительно гуманизированные антитела к интегрину альфа 2 (α2) и способы их применения.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитело к интегрину α2 содержит одну или несколько константных областей человека (например, Сь и/или СН) и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот БЕС ГО ΝΟ: 19, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот БЕС ГО ΝΟ: 21 или последовательности аминокислот, представляющие собой варианты указанных последовательностей. В данном документе рассмотрены различные формы антител. Например, антитело к интегрину α2 может представлять собой полноразмерное антитело (например, содержать константные области иммуноглобулина человека) или фрагмент антитела (например, фрагменты РаЬ или Р(аЬ')2 или РаЬ' или Ρν или ксЕу). Кроме того, антитело может быть помечено обнаруживаемой (детектируемой) меткой, иммобилизировано на твердой фазе и/или конъюгировано с гетерологичным соединением (таким как цитотоксический агент).
- 3 016245
В дополнение к применению антител к интегрину α2 в терапии и диагностике рассматриваются также профилактическое или превентивное применение. Для применения в диагностике предложен способ определения присутствия белка интегрина α2β1, включающий обработку образца, предположительно содержащего белок интегрина α2β1, антителом к интегрину α2 и определение связывания антитела с образцом. Для такого применения предложен набор, включающий антитело к интегрину α2 и инструкцию по применению антитела для обнаружения белка интегрина α2β1. Применение в терапии включает, но не ограничивается, лечение расстройств, связанных с интегрином α2β1, механизмами и клеточными процессами, включающими воспалительные и аутоиммунные заболевания, в частности рассеянный склероз.
Предусмотрено применение генной терапии с использованием антител к интегрину α2. Для создания популяции клеток, продуцирующих моноклональное антитело (МАТ) к α2β1, в клетки (например, фибробласты, стволовые клетки) вводят различные векторы (например, ретровирусные векторы, хромосомы), кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей ΗΜΗ-α2β1 антител. Эти клетки могут обладать таким специфическим свойством специфического хойминга в различных типах клеток, тканей и/или органов. Такие клетки, продуцирующие антитела, в свою очередь, можно ввести пациенту для локализованной доставки анти-α2β1 МАТ. Например, стволовые клетки мезенхимы, модифицированные вектором ΗΜπ-α2β1 МАТ, можно ввести в мозг пациента, страдающего рассеянным склерозом. Стволовые клетки дифференцируются в невральные клетки и выделяют анти-α2β1 МАТ для лечения воспаления, связанного с рассеянным склерозом. В дополнение к этому, ΗΜΗ-α2β1 можно конъюгировать с вирусами, кодирующими терапевтические гены (например, с рицином). Модифицированные вирусы могут специфическим образом связываться с клетками, экспрессирующими α2β1 на клеточной поверхности, повышают эффективность трансгенного переноса. Далее, пациенту можно внутривенно вводить иммуноконъюгаты, состоящие из комплексов антитело к α2β1-липосоме, содержащие нуклеиновые кислоты, которые кодируют терапевтические гены. Иммуноконъюгат с анти-α2β1 может связываться с клетками, экспрессирующими интегрин α2β1, и способствовать эффективному поглощению терапевтических генов.
Также предложена изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к интегрину α2; вектор, содержащий такую нуклеиновую кислоту, возможно, функционально связанную с контрольными последовательностями, распознаваемыми клеткой-хозяином, трансформированной вектором; клеткахозяин, содержащая такой вектор; способ получения антитела к интегрину α2, который включает выращивание клетки-хозяина, в условиях, обеспечивающих экспрессию в ней нуклеиновой кислоты и, возможно, выделение антитела из культуры клетки-хозяина (например, из культуральной среды клеткихозяина). Также предложена композиция, которая содержит гуманизированное антитело к интегрину α2 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Композиции для применения в терапии могут быть стерильными и лиофилизированными. Также предложен способ лечения расстройств, связанных с интегрином α2β1, включающий введение субъекту фармацевтически эффективного количества антител к интегрину α2, например введение млекопитающему гуманизированного антитела к интегрину α2. При таком терапевтическом применении млекопитающему можно вводить и другие агенты (например, другой антагонист интегрина α2β1) для совместного приема до, после или одновременно с введением антител к интегрину α2.
Также предложено гуманизированное антитело к интегрину α2, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот:
(a) НСИВ2 (УАУАНбЕТХУУААЕМК 8ЕС ΙΌ N0: 2);
(b) НСИВ1 (С1Е8ЕТХ Υ6Ι11, 8ЕС ΙΌ N0: 1), НСИВ2 (УАУАНСЕТХУХХАЕМК 8ЕС ΙΌ N0: 2) и НСИК.3 (АХЭССУУАМЭУ. 8ЕС ΙΌ N0: 3) или (c) 8ЕС ΙΌ N0: 40.
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутая выше вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот 8Еф ΙΌ N0: 185.
В другом варианте реализации изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот 8Еф ΙΌ N0: 185, в которой:
(a) в положении 71 находится Ьуз;
(b) в положении 73 - Азп;
(c) в положении 78 - Уа1 или (б) присутствует любое сочетание (а)-(с).
В следующем варианте реализации изобретения упомянутая выше вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот, выбранную из 8Еф ΙΌ N0: 70-79 и 8ЕС ΙΌ N0: 109-111.
В одном из вариантов реализации изобретения вышеупомянутое антитело к интегрину α2 содержит дополнительно область Е\\4. содержащую последовательность аминокислот \\СОСТЕУТУ88 (8ЕС ΙΌ N0: 13).
- 4 016245
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутое выше антитело к интегрину α2 содержит последовательность аминокислот ΗΟΌΒΙ (гипервариабельный участок 1 тяжелой цепи) (8ЕО ГО N0: 1), 11С1Ш2 (8Е0 ГО N0: 2) и Η0ΌΚ3 (8Е0 ГО N0: 3).
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутое выше антитело к интегрину α2 содержит также легкую цепь.
Изобретение также обеспечивает гуманизированное антитело к интегрину α2, которое содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот:
(a) ЬСИГО (гипервариабельного участка легкой цепи), выбранную из 8ΛΝ88νΝΥΙΗ (8Е0 ΙΌ N0: 4) или 8АО88\1ЖП 1 (8Е0 ГО N0: 112);
(b) ЬСИКЗ (ИТ8КЬА8; 8Е0 ГО N0: 5) и (c) ЬСИКЗ (('ХЖТТМ’ЕТ. 8ЕО ГО N0: 6).
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутая выше вариабельная область легкой цепи содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 186.
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутая выше вариабельная область легкой цепи содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 186, в которой:
(a) в положении 2 находится РНе;
(b) в положении 45 - Ьук;
(c) в положении 48 - Туг или (Ф) присутствует любое сочетание (а)-(с).
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутая выше вариабельная область легкой цепи содержит последовательность аминокислот, выбранную из 8Е0 ГО N0: 41, 8Е0 ГО N0 : 80-92 и 8Е0 ГО N0: 108.
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутое выше гуманизированное антитело к интегрину α2 содержит также область Е\У4. содержащую последовательность аминокислот ЕСРСТКУЕПС. представленную в 8Е0 ГО N0: 38.
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутое выше гуманизированное антитело к интегрину α2 содержит последовательность аминокислот ЬСИГО (8Е0 ГО N0: 4), ЕСГОН2 (8Е0 ГО N0: 5) и ЬСИВЗ (8Е0 ГО N0: 6).
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутое выше гуманизированное антитело к интегрину α2 содержит дополнительно тяжелую цепь.
Изобретение также обеспечивает гуманизированное антитело к интегрину α2, которое содержит: (ί) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит последовательность аминокислот:
(a) ИС0В2 АЖ'АНбЕТЖЖАЕХК 8ЕО ГО N0: 2), (b) ПСОН1 (СЕ81 .ТА'УСП 1, 8ЕО ГО N0: 1), 11С1Ж2 (VIА'АНСЕТЖЛААЕХК 8ЕО ГО N0: 2) и ЖИВЗ (АN^6VΥΥАΜ^Υ, 8ЕО ГО N0: 3) или (c) 8Е0 ГО N0: 40;
(ίί) вариабельную область легкой цепи, которая содержит последовательность аминокислот:
(a) БСГОВЕ выбранную из 8АN88VNΥIΗ (8Е0 ГО N0: 4) и 8А^88VNΥIΗ (8Е0 ГО N0: 112), (b) ЬСИИТ (ИТ8КЬА8, 8Е0 ГО N0: 5) и (c) ЬСИВЗ (00\\'ТТМ’1 ,Т, 8Е0 ГО N0: 6).
Также предложено упомянутое выше гуманизированное антитело к интегрину α2, в котором:
(a) вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 185;
(b) вариабельная область легкой цепи содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 186 или (c) присутствует сочетание (а) и (Ь).
Также предложено упомянутое выше гуманизированное антитело к интегрину α2, в котором:
(ί) вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 185, в которой:
(a) в положение 71 находится Ьук;
(b) в положении 73 - Аки;
(c) в положении 78 - Vа1 или (Ф) присутствует любое сочетание (а)-(с);
(ίί) вариабельная область легкой цепи включает последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 186, в которой:
(a) в положении 2 находится РНе;
(b) в положении 45 - Ьук;
(c) в положении 48 - Туг или (Ф) присутствует любое сочетание (а) - (с); или (ίίί) - и (ί) и (ίί).
- 5 016245
Также предложено упомянутое выше гуманизированное антитело к интегрину α2, в котором:
(a) вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот, выбранную из 5ЕО ГО N0: 70-79 и 8Ер ГО N0: 109-111;
(b) вариабельная область легкой цепи включает последовательность аминокислот, выбранную из 5ЕО ГО N0: 41, 5ЕО ГО N0: 80-92 и 8Ер ГО N0: 108; или (c) - и (а) и (Ь).
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутое выше антитело к интегрину α2 распознает I-домен интегрина α2 человека.
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутое выше антитело к интегрину α2 связывает интегрин α2β1.
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутое выше антитело к интегрину α2 связывает эпитоп интегрина α2, содержащий:
(a) остаток Бук, соответствующий положению 192 последовательности аминокислот α2 интегрина, приведенной в 8Е0 ГО N0: 8, или положению 40 последовательности аминокислот Ι-домена интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 11;
(b) остаток Аки, соответствующий положению 225 последовательности аминокислот интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 8, или положению 73 последовательности аминокислот Ι-домена интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 11;
(c) остаток С1п, соответствующий положению 241 последовательности аминокислот интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 8, или положению 89 последовательности аминокислот Ι-домена интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 11;
(б) остаток Туг, соответствующий положению 245 последовательности аминокислот интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 8, или положению 93 последовательности аминокислот Ι-домена интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 11;
(е) остаток Агд, соответствующий положению 317 последовательности аминокислот интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 8, или положению 165 последовательности аминокислот Ι-домена интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 11;
(1) остаток Акп, соответствующий положению 318 последовательности аминокислот α2 интегрина, приведенной в 8Е0 ГО N0: 8, или положению 166 последовательности аминокислот Ι-домена интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 11; или (д) любое сочетание (а)-(1).
Также предложено антитело к интегрину α2, которое связывает эпитоп интегрина α2, содержащий:
(a) остаток Бук, соответствующий положению 192 последовательности аминокислот интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 8, или положению 40 последовательности аминокислот Ι-домена интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 11;
(b) остаток Акп, соответствующий положению 225 последовательности аминокислот интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 8, или положению 73 последовательности аминокислот Ι-домена интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 11;
(c) остаток С1п, соответствующий положению 241 последовательности аминокислот интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 8, или положению 89 последовательности аминокислот Ι-домена интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 11;
(б) остаток Туг, соответствующий положению 245 последовательности аминокислот интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 8, или положению 93 последовательности аминокислот Ι-домена интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 11;
(е) остаток Агд, соответствующий положению 317 последовательности аминокислот интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 8, или положению 165 последовательности аминокислот Ι-домена интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 11;
(1) остаток Акп, соответствующий положению 318 последовательности аминокислот интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 8, или положению 166 последовательности аминокислот Ι-домена интегрина α2, приведенной в 8Е0 ГО N0: 11; или (д) любое сочетание(а)-(1).
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутое выше гуманизированное антитело к интегрину α2 является полноразмерным антителом.
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутое выше гуманизированное антитело к интегрину α2 является фрагментом антитела.
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутое выше гуманизированное антитело к интегрину α2 связано с определяемой меткой.
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутое выше гуманизированное антитело к интегрину α2 иммобилизировано на твердой фазе.
- 6 016245
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутое выше гуманизированное антитело к интегрину α2 ингибирует связывание интегрина α2 или α2β1 с лигандом интегрина α2β1.
В одном из вариантов реализации изобретения упомянутый выше лиганд интегрина α2β1 выбран из коллагена, ламинина, вируса ЕСНО-1, декорина, Е-кадгерина, металлопротеиназы матрикса I (ΜΜΡ-Ι), эндорепеллина, коллектина и С1д-белка комплемента.
Изобретение также представляет способ определения присутствия в образце интегрина α2, интегрина α2β1 или обоих из них, который включает приведение исследуемого образца в контакт с упомянутым выше гуманизированным антителом к интегрину α2 и последующее определение связывания антитела с образцом, которое является признаком того, что препарат содержит интегрин α2, интегрин α2β1 или оба из них.
Изобретение также обеспечивает набор, который включает упомянутый выше гуманизированный интегрин α2, и, возможно, инструкции по его использованию для обнаружения белка интегрина α2 или α2β1.
Изобретение также обеспечивает изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую гуманизированное антитело к интегрину α2β1, упомянутое выше.
Изобретение также обеспечивает вектор, содержащий упомянутую выше нуклеиновую кислоту.
Изобретение также обеспечивает клетку-хозяина, содержащую упомянутые выше нуклеиновую кислоту или вектор.
Изобретение также обеспечивает способ получения гуманизированного антитела к интегрину α2, включающий выращивание упомянутой выше клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, допускающих экспрессию антитела. В одном из вариантов реализации изобретения способ включает выделение гуманизированного антитела к интегрину α2 из клетки-хозяина. В следующем варианте реализации изобретения способ включает выделение гуманизированного антитела к интегрину α2 из культуральной среды клеток-хозяев.
Изобретение также обеспечивает способ скрининга, включающий определение связывания интегрина α2 или α2β1 с антителом, содержащим Уя-область, представленную в 8ЕО ΙΌ N0: 19, и УН-область, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 21, в присутствии и в отсутствие тестируемого антитела; выбор тестируемого антитела, если его присутствие коррелирует с пониженным связыванием интегрина α2 или α2β1 с антителом, содержащим У|-область. представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 19, и УН-область, представленную в 8Е0 Ш N0: 21. В одном из вариантов реализации изобретения интегрин α2 или α2β1 иммобилизирован на твердой подложке.
Изобретение также обеспечивает способ скрининга, включающий определение связывания интегрина α2β1 с коллагеном в присутствии тестируемого антитела, где тестируемое антитело связывает Iдомен α2; определение связывания тестируемого антитела с Ι-доменом α2 в присутствии ионов Мд44; определение связывания тестируемого антитела с Ι-доменом α2 в присутствии ионов Са; определение связывания тестируемого антитела с Ι-доменом α2 в присутствии среды, не содержащей катионов; а также выбор тестируемого антитела, которое ингибирует связывание интегрина α2β1 с коллагеном и связывает с Ι-домен α2 в присутствии ионов Мд'' и Са46, а также в среде, не содержащей катионов.
Изобретение также обеспечивает композицию, содержащую указанное гуманизированное антитело к интегрину α2 и фармацевтически приемлемый носитель.
Изобретение также обеспечивает способ лечения у субъекта расстройств, связанных с интегрином α2β1, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества указанного антитела к интегрину α2 или указанной композиции.
Изобретение также обеспечивает способ ингибирования связывания лейкоцитов с коллагеном, который включает введение субъекту количества указанного антитела к интегрину α2β1, эффективного для ингибирования связывания лейкоцитов с коллагеном.
Изобретение также обеспечивает применение указанного гуманизированного антитела к интегрину α2 в качестве лекарственного средства.
Изобретение также обеспечивает применение указанного гуманизированного антитела к интегрину α2 или соответствующей композиции для лечения расстройств, связанных с интегрином α2β1.
Изобретение также обеспечивает применение указанного гуманизированного антитела к интегрину α2 или соответствующей композиции для изготовления лекарственного средства для лечения расстройств, связанных с интегрином α2β1.
Изобретение также обеспечивает композицию для лечения расстройств, связанных с интегрином α2β1, которая содержит указанное гуманизированное антитело к интегрину α2 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
Изобретение также обеспечивает упаковку, заключающую указанное гуманизированное антитело к интегрину α2 или указанную композицию вместе с инструкцией по лечению расстройств, связанных с интегрином α2β1.
- 7 016245
В вариантах реализации данного изобретения расстройство, связанное с интегрином α2β1, выбирают из заболеваний воспалительного и аутоиммунного характера, а также заболеваний, характеризующихся аномальным или повышенным ангиогенезом.
В вариантах реализации данного изобретения расстройство, связанное с интегрином α2β1, выбирают из воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, реакции на трансплантат, неврита зрительного нерва, повреждений спинного мозга, ревматоидного артрита, системной красной волчанки (СКВ), сахарного диабета, рассеянного склероза, синдрома Рейно, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, синдрома Сьергена, склеродермии, юношеского диабета, диабетической ретинопатии, возрастной дистрофии желтого пятна, сердечно-сосудистых заболеваний, псориаза, рака, а также инфекций, которые вызывают воспалительный ответ.
В вариантах реализации данного изобретения расстройство, связанное с интегрином α2β1, выбирают из таких заболеваний, как рассеянный склероз (например, характеризующийся рецидивами, лечением острого состояния, замедленным лечением), ревматоидный артрит, ретробульбарный неврит и повреждение спинного мозга.
В вариантах реализации данного изобретения указанный способ не связан с (а) активацией тромбоцитов, (Ь) агрегацией тромбоцитов, (с) уменьшением содержания тромбоцитов в крови, (б) осложнениями, связанными с кровотечением, или (е) любой комбинацией пунктов (а)-(б).
В одном варианте реализации данного изобретения указанное антитело к интегрину α2 включает тяжелую цепь с 8Еф ΙΌ N0: 174 или 8Еф ΙΌ N0: 176, а также легкую цепь с 8Еф ΙΌ N0: 178.
В одном варианте реализации данного изобретения указанное антитело к интегрину α2 конкурентно препятствует связыванию антитела, содержащего Уь-область, представленную в 8Еф ΙΌ N0: 19, и Ун-область, представленную в 8Еф ΙΌ N0: 21, человеческого интегрина α2β1 или его Ι-домена, упомянутого ранее.
В одном варианте реализации данного изобретения указанный способ ассоциируется со смягчением воспалительной гиперемии или последствий, связанных с рассеянным склерозом.
В одном варианте реализации данного изобретения указанное антитело к интегрину α2 препятствует связыванию интегрина α2β1 с коллагеном и не является миметиком лиганда.
Также предложен способ направленного воздействия на объект, такой как молекула, белок, нуклеиноваякислота, вектор, композиция, комплекс и т.д., на участке, который характеризуется присутствием лиганда α2β1, причем такой способ включает присоединение или связывание объекта с указанным гуманизированным антителом к интегрину α2.
Также предложен эпитоп интегрина α2, который связывает антитело к интегрину α2, причем эпитоп не содержит лиганд-связывающий сайт интегрина α2. В одном из вариантов реализации изобретения связывание с эпитопом не связано с (а) активацией тромбоцитов, (Ь) агрегацией тромбоцитов, (с) уменьшением концентрации тромбоцитов в крови, (б) осложнениями, связанными с кровотечением, (е) активацией α2 интегрина, или (Г) любым сочетанием (а)-(е).
Предпочтительные антитела связывают Ι-домен интегрина α2β1 человека. В частности, предпочтительные антитела способны блокировать а2-зависимую адгезию клеток к внеклеточному матриксу (ВМ), в частности к коллагену, ламинину или к обоим. Предложены гуманизированные антитела, включая антитела на основе антитела, упоминаемого в данном документе как ТМС-2206. Предложены антитела к интегрину α2, обладающие высокой специфичностью к интегрину α2β1 человека, введение которых не связано с нежелательными побочными эффектами, такими как, например, осложнения из-за кровотечения или осложнения из-за активации клеток. Специфичность связывания (например, специфичность к эпитопам) таких антител связана с их непредвиденными негеморрагическими эффектами.
Гуманизированное антитело к интегрину α2β1 может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот НСОВ1 (ΟΡδΕΤΗΥΟΙΗ: 8Еф ΙΌ N0: 1), и/или НСЭВ2 (УЗУ'ЛНСЕТХУХ/ЛЕМУ 8 ЕЕ) ΙΌ N0: 2), и/или 11С01У (АХЕСУΥΥΆΜΌΥ; 8 ЕЕ) ΙΌ N0: 3). Гуманизированное антитело к интегрину α2β1 может содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот НСОВ1 ЕСЭВ1 (/А^/УКУШ; 8Еф ΙΌ N0: 4 или 8ΆΕ)88\Λ'ΥΙ1Ε 8 ЕЕ) ΙΌ N0: 112), и/или ЬС0В2 (ΌΤ8ΚΕΆ8; 8 ЕЕ) ΙΌ N0: 5), и/или ЕС1)1У (^^\VΤΤХΡ^Τ; 8 ЕС ΙΌ N0: 6). В некоторых вариантах реализации изобретения гуманизированное антитело к интегрину α2β1 содержит тяжелую цепь, содержащую НСЭВ1 (СΕ8^ΤNΥСIН; 8 ЕС ΙΌ N0: 1), и/или 11С1Ж2 (УI№ΆВ6ΕΤNΥN8Ά^Μ8; 8 ЕЕ) ΙΌ N0: 2), и/или ИСОЮ (ΆN^СУΥΥΆΜ^Υ; 8Еф ΙΌ N0: 3), и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот ЕС1Ш1 (8ΆN88УNΥIН; 8ЕЕ) ΙΌ N0: 4), и/или ЬСПВ2 (ΌΤ8ΚΕΆ8; 8ЕЕ) ΙΌ N0: 5), и/или ЬСОВЗ (фр^ТТ^ЕТ; 8Еф ΙΌ N0: 6). В других вариантах реализации изобретения антитело содержит вариант последовательности аминокислот, состоящий из одного или более таких участков СЭВ, причем вариант включает одну или более вставок аминокислот в области СЭВ или на смежном участке, и/или делеций в области СЭВ или на смежном участке, и/или замен остатка в СЭВ (где замена является предпочтительным типом замены аминокислоты для создания таких вариантов).
- 8 016245
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает антитела, специфическим образом реагирующие с интегрином альфа 2 (α2) человека, включая гуманизированные антитела, и способы их применения. Гуманизированные антитела могут содержать каркасные участки (Εν) антител человека и участки, определяющие комплементарность (участки СЭВ или гипервариабельные участки) антител организмов, не являющихся людьми, обычно мышей, специфическим образом реагирующие с интегрином α2 человека. Предложены последовательности нуклеотидов, кодирующие, а также аминокислотные последовательности, содержащие антитела с тяжелыми и легкими цепями. В преимущественных вариантах реализации один или более СОВ получены из антитела мыши, выделяемого клоном гибридомы ВНА2.1 [в дальнейшем - антитело ТМС-2206]. Кроме того, в настоящем изобретении предложены антитела, обладающие близкими свойствами связывания, и антитела (или другие антагонисты), обладающие сходной функциональностью. Предпочтительные антитела к α2 интегрину включают антитела, которые (а) связывают 1-домен интегрина α2, (Ь) ингибируют функцию интегрина α2 (например, связывание коллагена или ламинина), (с) связывают интегрин α2 на покоящихся тромбоцитах, не вызывая их возбуждения, и (б) распознают связывающий эпитоп ТМС-2206 (например, конкурируют с ТМС-2206 при связывании с интегрином α2). Такие антитела могут предпочтительно связываться с инертной или закрытой конформацией молекулы целевого интегрина α2 без конкурирования за лиганд-связывающий сайт. Неожиданным преимуществом описанных в настоящем изобретении антител к интегрину α2, которые связываются предпочтительно с закрытой конформацией интегрина α2β1 и/или связывают интегрин α2β1 без конкурирования за сайт связывания лиганда (например, не являются миметиком лиганда), является предотвращение возможного возбуждения тромбоцитов, их агрегации, уменьшения их количества в крови и/или осложнений, связанных с кровотечением у субъекта, подвергающегося лечению.
К осложнениям, связанным с кровотечением, упоминаемым в данном документе, относятся любые нежелательные реакции на уровнях крови и физиологии, включая ответ тромбоцитов, тромбоцитопению, увеличение времени свертывания, увеличение времени кровотечения и потери крови, которые ограничивают терапевтическое применение антитела к интегрину α2.
Интегрин α2β1 представляет собой молекулу, состоящую из одной субъединицы интегрина α2 (см., например, 8ЕО ΙΌ N0: 7, где представлена последовательность ДНК, и 8Е0 ΙΌ N0: 8, где представлена последовательность белка α2 человека) из семейства интегринов альфа, а также субъединицы интегрина β1 (см., например, 8Е0 ΙΌ N0: 9, где представлена последовательность ДНК, и 8Е0 ΙΌ N0: 10, где представлена последовательность белка β1 человека) из семейства интегринов бета, и может иметь любое происхождение, включая млекопитающих, но предпочтение отдается человеку. Интегрин 2αβ1 может быть выделен из любого естественного источника или может быть изготовлен путем синтеза (например, с применением технологии рекомбинантной ДНК).
Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие интегрин α2 и интегрин β1, описаны в Такаба апб Нет1ег 1. Се11 ΒίοΙ. 109(1):397-407 (1989; Карточка СеиЬаик Х17033; 5иЬ5Сцисп11у ирба1еб ίο еп1гу NМ 002203) и у Агдгауек, ν.δ, 1. Се11. Βίο1. 8ер. 105(3):1183-90 (1987; регистрация в СеиЬаик Х07979,1 и родственные последовательности, представляющие варианты сплайсинга) соответственно.
Ι-домен молекулы интегрина α2β1 соответствует участку молекулы интегрина α2β1 в пределах субъединицы α2 и описан, например, у Катай е! а1., 1. Βίο1. Скет. 269:9659-9663 (1994); Ет§1еу е! а1., 1. Βίο1. Скет. 272:28512 (1997) и Се11. 101:47 (2000). Последовательность аминокислот Ι-домена интегрина α2 человека представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 11 (см. также, например, 8Е0 ΙΌ N0: 107). Ι-домен интегрина α2 содержит лиганд-связывающий сайт типа МГОА8 (Ме!а1 Ιοη Оерепбеп! Абкекюп 8ке), специфичность связывания которого в отношении лиганда проявляется в присутствии определенного двухвалентного катиона. Последовательности аминокислот для Ι-домена интегрина α2 крысы, представленные в 8ЕС ΙΌ N0: 93 (см. также, например, 8Е0 ΙΌ N0: 113), и для интегрина мыши - в 8Е0 ΙΌ N0: 94 (см. также, например, 8ЕС ΙΌ N0: 114) показаны в табл. 28. Последовательности Ι-домена макак-крабоедов и макак-резусов были клонированы из лейкоцитарной фракции, полученной из цельной крови; они приведены в 8ЕС ΙΌ N0: 103 (ДНК), 8Е0 ΙΌ N0: 171 (аминокислоты) для макак-крабоедов и 8Е0 ΙΌ N0: 104 (ДНК), 8ЕС ΙΌ N0: 172 (аминокислоты) для макак-резусов соответственно.
Эпитоп ТМС-2206 (ВНА2.1) соответствует участку Ι-домена α2 человека, который связывает антитело ТМС-2206. Такой эпитоп охватывает область, содержащую остатки аминокислот К40, N73, 089. Υ93, В165 и N166, а также, возможно, другие остатки аминокислот Ι-домена интегрина α2.
Расстройство, связанное (ассоциированное) с интегрином α2, относится к расстройствам, заболеваниям или состояниям, затрагивающим процессы или функции с участием интегрина α2 (например, связывание, активность), которые вызывают ненормальные клеточные реакции в ткани-мишени. Примеры процессов, зависящих от интегрина α2 и вовлеченных в течение заболеваний, включают коллагензависимые клеточные ответы, такие как ответы, участвующие в усилении экспрессии и пролиферации цитокинов, функционировании Т-клеток, тучных клеток и нейтрофилов, воспалительные расстройства, морфогенез протоков грудной железы, заживление поражений эпидермиса и ангиогенез.
- 9 016245
Примеры расстройств, ассоциированных с интегрином α2, содержат, но не ограничиваются, воспалительные заболевания или расстройства, включая воспалительные заболевания пищеварительного тракта (такие как болезнь Крона и язвенный колит), реакции на трансплантат (включая отторжение трансплантата), неврит зрительного нерва, повреждение спинного мозга, ревматоидный артрит, рассеянный склероз (включая лечение сопровождающих его неврологических последствий, а также лечение рецидивирующего рассеянного склероза), аутоиммунные заболевания или расстройства (включая системную красную волчанку (СКВ), сахарный диабет, синдром Рейно, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, синдром Сьергена, склеродермию), юношеский диабет, а также расстройства, характеризующиеся аномальным или повышенным ангиогенезом (такие, как диабетическая ретинопатия, возрастная дистрофия желтого пятна, сердечно-сосудистые заболевания, псориаз, ревматоидный артрит и рак), а также инфекции, которые вызывают воспалительный ответ.
Лечение расстройств, связанных с интегрином α2β1, связано с терапевтическим и профилактическим применением антител к интегрину α2, описанным в настоящем изобретении. Нуждающиеся в лечении включают тех, у кого уже диагностировали подобное расстройство, а также тех, у кого необходимо предотвратить или отсрочить начало данного расстройства.
Термин млекопитающие обозначает любых животных, относящихся к классу млекопитающих, включая человека, домашних и сельскохозяйственных животных, а также диких, спортивных животных и животных, которые живут непосредственно рядом с людьми, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д. Предпочтительным млекопитающим является человек.
Термин периодическое дозирование или дозирование с перерывами обозначает дозирование, которое является непрерывным в определенный период времени и повторяется через определенные интервалы, которые предпочтительно отделены один от другого промежутком большим, чем один день.
Термин антитело или иммуноглобулин используется в самом широком смысле и охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, полиспецифичные антитела и фрагменты антител при условии, что они проявляют необходимую биологическую активность. Фрагменты антитела содержат часть полноразмерного антитела, как правило, его антиген-связывающий или вариабельный участок. К примерам фрагментов антител относятся фрагменты РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2 и Ρν, диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител, однодоменные антитела (например, из камелид), однодоменные антитела к ΝΑΚ (новому антигенному рецептору акул), а также полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Фрагментами антител можно также назвать области связывания, содержащие участки СЭЯ или антиген-связывающие домены, включая, без ограничения, такие как Ун-области (Ун, Ун-Ун), антикалины, РерВоб1е8™, гибриды Т-клетка-антитело (ТгоуЬоб1е§) или РерйЬоШек.
Термин моноклональное антитело относится к антителам, получаемым из популяции практически гомогенных антител; например отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, поскольку направлены к одному антигенному сайту. Кроме того, в отличие от препаратов обычных (т.е. поликлональных) антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных детерминант (например, эпитопов) антигена, каждое моноклональное антитело направлено, по меньшей мере, против одной детерминанты антигена. Определение моноклональный указывает на характер антитела, полученного из популяции практически гомогенных антител и не ограничивается необходимостью получения антитела определенным методом. Например, моноклональные антитела могут быть получены методом гибридом, впервые описанным у КоЫег е! а1., №щ.1ге. 256:495 (1975), или могут быть произведены методами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567). Моноклональные антитела можно также выделить из фаговых библиотек антител, например, с применением методик, описанных в С1аск§оп е! а1., №11иге. 352:624-628 (1991), а также Магкк е! а1., 1. Мо1. Вю1. 222:581-597 (1991). Моноклональные антитела можно также выделить способами, описанными в патентах США № 6025155 и 6077677, а также в публикациях заявок на патент США № 2002/0160970 и 2003/0083293 (см. также, например ЬшбепЬаит, е! а1., М|с1е1с Аабк Яекеагсй. 32(21):0177 (2004)).
Моноклональные антитела могут также включать химерные антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной с или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных от одного вида или принадлежащих к отдельному классу или подклассу антител, в то время как остальные цепи идентичны или гомологичны соответствующим последовательностям антител, полученным от других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют необходимую биологическую активность (см., например, патент США № 4816567 и Мопгкоп е! а1., Ргос. №И. Асаб 8с1. И8А. 81:6851-6855 (1984) для химерных антител, содержащих участки антител мыши и человека).
- 10 016245
Термин гипервариабельный участок относится к остаткам аминокислот антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельная область включает остатки аминокислот участка, определяющего комплементарность, или СЭК (например, остатки 24-34 (Ь1), 50-56 (Ь2) и 89-97 (Ь3) в вариабельной области легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельной области тяжелой цепи; КаЬа! е! а1., 8едиеисе§ оГ Рго!еш8 оГ 1ттипо1ощса1 1и!еге8!, 5'1' Ей. РиЫю НеаПП 8егу1ее, Ναΐίοηαΐ 1п81Ии1е8 оГ НеаИЬ, ВеШекйа, Мй. (1991)) и/или остатки гипервариабельной петли (например, остатки 2632 (Ь1), 50-52 (Ь2) и 91-96 (Ь3) в вариабельной области легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельной области тяжелой цепи; С1ю11иа аий Ьекк 1. Мо1. Вю1. 196:901-917 (1987)). Остатки каркаса или ЕР. - это остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельного участка. В отношении описанных здесь антител, СОК и каркасные участки определяют по номенклатуре КаЬа!, за исключением того, что СЭК1 тяжелой цепи был определен по ОхГогй Мо1еси1аг'§ АЬМ как остатки в интервале от 26 до 35. Программное обеспечение для моделирования антител ОхГогй Мо1еси1аг'§ АЬМ (Ы1р://реор1е.сгу81.сск.ас.ик/~иЬс078/) (Майш е! а1., Ргос. №111 Асай. 8ск И8А, 86, 9268-9272 (1989); Майш е! а1., Ме!кой§ Еигуток, 203, 121-153 (1991); Рейегаеи е! а1., 1ттииоте1Ьой8, 1, 126 (1992) и Кее§ е! а1., 1и 8!егиЬегд М.1.Е. (ей.), Рго!еш 81гис!иге Ргейкйои. ОхГогй Ишуегайу Рге§8, ОхГогй, 141-172 (1996)) комбинирует системы нумерации гипервариабельных участков СОК по КаЬа! и СЬо!Ыа для определения участков СОК.
Гуманизированные формы антител, не являющихся антителами человека (например, антител мыши), представляют собой химерные антитела, которые включают минимальную последовательность иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека. В большей своей части гуманизированные антитела являются иммуноглобулинами человека (донорное или акцепторное антитело), в которых остатки гипервариабельного участка реципиента замещены на остатки гипервариабельной области видов, отличных от человека (донорное антитело), таких как мыши, крысы, кролики или не человекообразные обезьяны, которые обладают требуемыми специфичностью, аффинностью и активностью. Кроме того, отдельные остатки каркаса (ЕК) иммуноглобулина человека или их группы могут быть замещены соответствующими остатками, не характерными для иммуноглобулина человека. Более того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не обнаруживаются ни в акцепторном антителе, ни в антителе-доноре. Целью этих модификаций является дальнейшее улучшение активности антитела. Обычно гуманизированное антитело содержит в основном все, по меньшей мере из одной, как правило, двух, вариабельные области или домены, в которых все или в основном все из гипервариабельных петель соответствуют петлям иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека, а все или в основном все из участков ЕК - это участки, которые соответствуют последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также может содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина человека (например, Ес), как правило иммуноглобулина человека (см., например, Циееи е! а1., Ргос. №11. Асай. 8ск И8А. 86:10029 (1989) и Еоо!е аий ^ш!ег, 1. Мо1. Вю1. 224:487 (1992)).
Одноцепочечные фрагменты антител Εν или ксЕу могут содержать области или домены УН и Уъ антитела, причем указанные домены находятся в одной полипептидной цепи. Обычно полипептид Εν содержит также полипептидный линкер между доменами УН и Уь, что позволяет фрагменту 5сР\г образовывать структуру, необходимую для связывания антигена (обзор можно найти, например, в РЫскШии ш Т1е Ркагтасо1о§у оГ Моиос1оиа1 АийЬой1е8, νο1. 113, КокеиЬигд аий Мооге ей§. 8рйидег-Уег1ад, Νο\ν Уогк, р. 269-315 (1994)).
Термин диатела относится к небольшим фрагментам антитела с двумя антиген-связывающими сайтами, причем эти фрагменты образуют вариабельный домен тяжелой цепи (Ун), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (Уъ) в одной и той же полипептидной цепи (УН-УЪ). Путем использования линкера, который является слишком коротким для объединения двух доменов в одной цепи, домены принуждают к конъюгации с комплементарными доменами другой цепи и созданию двух антигенсвязывающих сайтов. Более полное описание диател имеется, например, в ЕР 404097 XVО 93/11161; и НоШидег е! а1., Ргос. №!1. Асай. 8ск И8А. 90:6444-6448 (1993).
Линейное антитело относится к антителам, описанным в 2ара!а е! а1., Рго!еш Еид. 8(10):1057-1062 (1995). Вкратце, эти антитела содержат пару тандемных сегментов Ей (УН-СН1-УН-СН1), которые образуют пару антиген-связывающих участков. Линейные антитела могут быть как биспецифичными, так и моноспецифичными.
Изолированным называется антитело, идентифицированное и отделенное и/или выделенное из компонентов среды, в которой он обычно существует. Загрязняющие компоненты его природной среды представляют собой материалы, которые мешают диагностическому или терапевтическому применению антитела, и могут включать ферменты, гормоны и иные белковые или небелковые растворы. В предпочтигельных вариантах антитело подвергается очистке (1) свыше 95 мас.% антитела согласно анализу по методу Лоури, а наиболее предпочтительно более чем 99 мас.%, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков Ν-концевой или внутренней последовательности аминокислот при применении секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности в полиакриламидном геле (δΌδ-РАОЕ) с додецилсульфатом натрия в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с
- 11 016245 использованием окрашивания кумасси синим или предпочтительно серебром. К изолированным антителам относят антитело ш δίΐιι внутри рекомбинантных клеток, поскольку не будет присутствовать по меньшей мере один компонент естественного окружения антитела. Однако обычно изолированное антитело получают с использованием по меньшей мере одной стадии очистки.
Термин меченное эпитопом антитело относится к антителу, связанному с эпитопной меткой. Полипептид эпитопной метки содержит достаточно остатков, чтобы обеспечить эпитоп, против которого можно получить антитело, однако он достаточно короткий, чтобы не препятствовать активности антитела к интегрину α2β1. Эпитопная метка в идеале является достаточно уникальной, чтобы антитело к ней вступало в перекрестные реакции с другими эпитопами. Подходящие полипептиды-метки обычно содержат по меньшей мере 6 остатков аминокислот, а обычно от 8 до 50 остатков аминокислот (предпочтительно примерно 9-30 остатков). К примерам относятся полипептид метки гриппа НА и антитело 12СА5 к нему (Е1е1б е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 8:2159-2165 (1988)); метка с-тус и антитела 8Е9, 3С7, 6Е10, 64, В7 и 9Е10 к ней (Еуап е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 5(12):3610-3616 (1985)); а также метка гликопротеина Р (др) вируса простого герпеса и антитело к ней (РаЬогкку е! а1., Рго!ет Епдтеегшд. 3(6):547-553 (1990)). В некоторых вариантах реализации изобретения эпитопная метка служит эпитопом утилизации, связывающим рецептор, который является эпитопом Ес-области молекулы 1д6 (например, 1д6ь 1д62, 1д63 или 1д64), которая отвечает за увеличение периода полувыведения молекулы 1д6 из сыворотки крови ш утуо.
Термин цитотоксический агент относится к соединению, которое ингибирует или ограничивает функцию клеток и/или вызывает разрушение клеток. К ним относят радиоактивные изотопы (например, 131Ι, 125Ι, 90Υ и 186Ве), агенты химиотерапии и токсины, такие как обладающие ферментативной активностью токсины бактериального, дрожжевого, растительного или животного происхождения, или их фрагменты.
Термин нецитотоксический агент относится к соединению, которое не ингибирует или не ограничивает функцию клеток и/или не вызывает разрушение клеток. К нецитотоксическим агентам можно отнести агент, который становится цитотоксичным после активации. Нецитотоксический агент может включать гранулу, липосому, матрицу или частицу (см., например, публикации заявок на патент США № 2003/0028071 и 2003/0032995, которые включены здесь для ссылки). Такие агенты могут быть конъюгированы, сопряжены, связаны или объединены с антителом к интегрину α2β1, как описано выше.
Термин химиотерапевтический агент обозначает химическое соединение, которое можно применять в лечении рака. К примерам химиотерапевтических агентов относятся, без ограничения, следующие средства: адриамицин, доксорубицин, 5-фторурацил, цитозина арабинозид (Ага-С), циклофосфамид, тиотепа, таксотере (доцетаксел), бусульфан, цитоксин, таксол, метотрексат, цисплатин, мелфалан, винбластин, блеомицин, этопозид, ифосфамид, митомицин С, митоксантрон, винкристин, винорелбин, карбоплатин, тенипозид, дауномицин, карминомицин, аминоптерин, дактиномицин, митомицины, эсперамицины (см. патент США № 4675187), мелфалан и другие производные азотистого иприта.
Термин пролекарство относится к предшественнику или производному фармацевтически активного вещества, которые являются менее цитотоксическими по отношению к клеткам опухоли по сравнению с исходным препаратом и способны к активации под действием ферментов или превращению в более активную исходную форму (см., например, \νί1ιηηιτ. Ргобгидк т Сапсег Сйето!йегару Вюсйетюа1 8ос1е1у Тгапкасбопк, 14, р. 375-382, 615Л Меебпд Ве1£а§! (1986) и 8!е11а е! а1. Ргобгидк: А Сйетюа1 Арргоасй !о Тагде!еб Ргид Рейуегу, Риес!еб Ргид РеНуегу, Вогсйагб! е! а1. (еб.), р. 247-267, Нитапа Рге§8 (1985). Пролекарства согласно настоящему изобретению включают, без ограничения, фосфатсодержащие пролекарства, тиофосфат-содержащие пролекарства, сульфатосодержащие пролекарства, пептид-содержащие пролекарства, модифицированные Р-аминокислотами пролекарства, гликозилированные пролекарства, β-лактам-содержащие пролекарства, возможно замещенные феноксиацетамидсодержащие пролекарства или возможно замещенные фенолацетамид-содержащие пролекарства, 5-фторцитозин и др. 5-фторуридиновые пролекарства, которые могут превращаться в более активные цитотоксические лекарственные средства. Примерами цитотоксических препаратов, которые можно перевести в форму пролекарства, могут служить химиотерапевтические агенты, описанные выше.
Термин метка относится также к обнаруживаемому (определяемому, детектируемому) соединению или композиции, прямо или опосредованно конъюгированным или сопряженным с антителом. Метка может быть обнаруживаемой сама по себе (например, радиоизотопные или флуоресцентные метки) или, в случае ферментативной метки, может катализировать химическое изменение субстратного соединения или композиции, которые поддаются обнаружению.
Термин твердая фаза относится к неводной матрице, на которой можно закрепить антитело согласно настоящему изобретению. Примеры твердых фаз, включенных в настоящее описание, содержат частично или полностью изготовленные из стекла (например, стекло с контролируемым размером пор) полисахариды (например, агароза), полиакриламиды, полистирол, поливиниловый спирт и силиконы. В некоторых вариантах реализации, в зависимости от контекста, под твердой фаза может подразумеваться лунка планшета для анализа; в других - это колонка для очистки (например, колонка для аффинной хроматографии). Этот термин также подразумевает непрерывную твердую фазу дискретных частиц, таких
- 12 016245 как описано в патенте США № 4275149.
Липосома представляет собой небольшую везикулу, состоящую из различных типов липидов, фосфолипидов и/или поверхностно-активного вещества, которую применяют для доставки препарата (такого, как антитело согласно настоящему изобретению и, возможно, химиотерапевтический агент) млекопитающему. Компоненты липосомы, как правило, расположены в виде двойного слоя, подобно расположению липидов в биологических мембранах.
Изолированная молекула нуклеиновой кислоты обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно связана в природном источнике нуклеиновой кислоты антитела. Форма или окружение изолированной молекулы нуклеиновой кислоты отличаются от свойственных ей природе. Поэтому изолированные молекулы нуклеиновой кислоты отличаются от молекул нуклеиновой кислоты, которые существуют в природных клетках. Однако к изолированным молекулам нуклеиновой кислоты относят молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно экспрессируют антитело, где, например, указанная молекула нуклеиновой кислоты расположена в хромосоме в положении, отличном от положения в нормальных клетках.
Термин вирусный вектор подразумевает средство для переноса нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК) в клетки посредством вирусной инфекции или трансдукции. Примеры вирусных векторов включают ретровирусы, аденовирусы, поксвирусы и бакуловирус.
Термин невирусный вектор обозначает такое средство переноса нуклеиновой кислоты, как СА^ плазмида или хромосома, которое доставляется в клетки без участия вирусов, такими средствами, как электропорация, инъекции, а также трансфекция катионоактивным реагентом.
Последовательностями, контролирующими экспрессию, называют последовательности ДНК, необходимые для экспрессии функционально связанной с ними кодирующей последовательности в определенном организме-хозяине. Контролирующие последовательности, подходящие для прокариот, например, включают промотор, последовательность оператора и сайт связывания рибосомы. Как известно, в эукариотических клетках действуют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.
Нуклеиновая кислота является функционально связанной, если она находится в функциональном взаимодействии с последовательностью другой нуклеиновой кислоты. Например, ДНК предшествующей последовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связана с ДНК для полипептида, если она экспрессируется в составе белка-предшественника и участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если его расположение способствует трансляции. Обычно функционально связанные последовательности ДНК являются смежными и, в случае секреторной лидерной последовательности, являются смежными и в фазе считывания. Энхансеры, однако, не должны быть смежными. Сшивание осуществляется путем лигирования в подходящих сайтах рестрикции. Если такие сайты отсутствуют, то в соответствии с обычной практикой используют синтетические олигонуклеотидные перемычки или линкеры.
Следующим аспектом настоящего изобретения является лечение расстройств, связанных с интегрином α2β1, путем введения пациенту молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело к интегрину α2 согласно настоящему изобретению. Подходящие способы введения включают генотерапевтические способы (см. ниже).
Нуклеиновую кислоту в том смысле, в котором она используется в настоящем изобретении можно доставлять в клетки ίη νίνο с применением таких методов, как прямая инъекция ДНК, опосредуемый рецептором захват ДНК, вирус-опосредуемая трансфекция или невирусная трансфекция и липидная трансфекция, при этом все они могут включать применение векторов с терапевтическими генами. Прямую инъекцию применяют для введения депротеинизированной ДНК в клетки ίη νίνο (см., например, Асхаб1 е! а1. (1991), №11иге. 332:815-818; ^οΐίί е! а1. (1990), 8с1епсе. 247:1465-1468). Для инъекции ДНК в клетки ίη νίνο можно применять устройство для доставки (например, генная пушка). Для этого можно применить коммерчески доступный аппарат (например, от ВюРаб). Депротеинизированную ДНК можно вводить в клетки путем комплексообразования ДНК с катионом, таким как полилизин, который связывается с лигандом рецептора поверхности клетки (см., например, ^и, С. апб ^и, С.Н. (1988), ί. Βίο1. Сйет. 263:14621; \νί1χοη е1 а1. (1992), I. Βίο1. Сйет. 267:963-967 и патент США № 5166320). Связывание комплекса ДНК-лиганд с рецептором может облегчать захват ДНК по механизму рецептор-опосредуемого эндоцитоза. Чтобы избежать разрушения этого комплекса межклеточными лизосомами, можно применять комплекс ДНК-лиганд, связанный с аденовирусными капсидами, которые расщепляют эндосомы, что приводит к высвобождению материала в цитоплазму (см., например, Сипе1 е1 а1. (1991), Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А. 88:8850; Спхбаш е! а1. (1993), Ргос. Асаб. 8ск И8А. 90:2122-2126).
- 13 016245
Дефектные ретровирусы хорошо зарекомендовали себя для применения в качестве векторов генной терапии (см. Обзор в МШег, ΛΌ. (1990), В1ооб.. 76:271). Протоколы получения рекомбинантных ретровирусов и инфицирования клеток ίη νίίΓΟ или ίη νίνο такими вирусами можно найти в Сиггеи! Рго!осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, АизиЬе1, Е.М. е! а1. (ебз.). Огееие РиЬбзЫид Аззос1а!ез (1989), Зесбоиз 9,10-9,14 и других стандартных лабораторных руководствах. Примерами подходящих ретровирусов являются рШ, ρΖΙΡ, р\Е и рЕМ, которые хорошо известны специалистам в данной области. Примеры подходящих линий вирусов с дефектом упаковки включают.рз1.Спр,.рз1.Сге,.рз1,2 и рз1.Ат. Ретровирусы используют для введения ряда генов во многие типы клеток, включая клетки эпителия, клетки эндотелия, лимфоциты, миобласты, гепатоциты, клетки костного мозга, ίη νίΐΐΌ и/или ίη νί\Ό (см., например, Ед1111з, е! а1. (1985), 8с1еисе. 230:1395-1398; Иаииоз апб МиШдап (1988), Ргос. №!1. Асаб. δα. ИЗА. 85:6460-6464; \11зои е! а1. (1988). Ргос. №111. Асаб. δα. ИЗА. 85:3014-3018; АгтеШаио е! а1. (1990), Ргос. №!1. Асаб. δα. ИЗА. 87:6141-6145; НиЬег е! а1. (1991), Ргос. №б. Асаб. 8οΐ. ИЗА. 88:8039-8043; Ееггу е! а1. (1991), Ргос. №б. Асаб. δα. ИЗА. 88:8377-8381; Сбо^ббигу е! а1. (1991), Заеисе. 254:1802-1805; сап Веизесбет е! а1. (1992), Ргос. №ι!1. Асаб. δα. ИЗА. 89:7640-7644; Кау е! а1. (1992). Нитаи Оеие Тбегару. 3:641-647; Эа1 е! а1. (1992), Ргос. №б. Асаб. δα. ИЗА. 89:10892-10895; 1№и е! а1. (1993), I. ^тииок 150:4104-4115; патент США № 4868116; патент США № 4980286; международную публикацию патента \0 89/07136; международную публикацию патента \0 89/02468; международную публикацию патента \0 89/05345 и международную публикацию патента \0 92/07573).
Для применения в качестве вектора генной терапии геном аденовируса можно обработать таким образом, чтобы он кодировал и обеспечивал экспрессию нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению, но в то же время он был неактивен в смысле способности к репликации в обычном литическом цикле жизни вируса. См., например, Вегкиег е! а1. (1988), ВюТесбшдиез. 6:616; ВозеиГе1б е! а1. (1991), Заеисе. 252:431-434 и ВозеиГе1б е! а1. (1992), Се11. 68:143-155. Подходящие векторы на основе аденовирусов, полученные из штамма аденовируса Аб тип 5 б1324 либо других штаммов аденовирусов (например, Аб2, Аб3, Аб7 и др.), хорошо известны специалистам в данной области. Рекомбинантные аденовирусы имеют свои преимущества, поскольку могут эффективно доставлять ген, не требуя деления клеток, и их можно применять для инфицирования целого ряда различных типов клеток, включая эпителий дыхательных путей (ВозеиГе1б е! а1. (1992) сйеб зирга), клетки эндотелия (Ьетагсбаиб е! а1. (1992), Ргос. №!1. Асаб. δα. ИЗА. 89:6482-6486), гепатоциты (Неге аиб Оегагб (1993), Ргос. №И1. Асаб. δα. ИЗА. 90:2812-2816) и миоциты (фиаиби е1 а1. (1992), Ргос. №!1. Асаб. δα. ИЗА. 89:2581-2584).
В качестве вектора для доставки ДНК с целью проведения генной терапии можно применять аденоассоциированные вирусы (ААВ). ААВ представляет собой встречающийся в природе дефектный вирус, которому для репликации и продуктивного жизненного цикла необходим другой вспомогательный вирус, такой как аденовирус или герпесвирус (Ми/усхка е! а1. Сигг. Торюз ίη М1сго и Тттииок (1992), 158:97-129). ААВ можно применять для встраивания ДНК в неделящиеся клетки (например, 11о!!е е! а1. (1992), Ат. I. Везрб. Се11. Мо1. Вю1. 7:349-356; Зати1зк1 е! а1. (1989), I. Убо1. 63:3822-3828 и МсЬаидЫт е! а1. (1989), I. У1го1. 62:1963-1973). Вектор ААВ, описанный в Тга!зсЫи е! а1. (1985), Мо1. Се11. Вю1. 5:3251-3260, можно применять для внедрения ДНК в клетки (например, Негтоиа! е! а1. (1984), Ргос. №а11. Асаб. δα. ИЗА. 81:6466-6470; Тга!зсЫи е! а1. (1985), Мо1. Се11. Вю1. 4:2072-2081; \оиб1зГогб е! а1. (1988), Мо1. Еибоато1. 2:32-39; Тга!зсЫи е! а1. (1984), I. У1го1. 51:611-619 и Е1о!!е е! а1. (1993), I. Вю1. СБет. 268:3781-3790). Для применения согласно изобретению можно адаптировать лентивирусные генотерапевтические векторы.
Основные методы генной терапии хорошо известны в уровне техники. Например, см. патент США № 5399346 авторов Аибегзои е! а1. Биосовместимая капсула для доставки генетического материала описана в международной публикации патента \0 95/05452 авторами Вае!де е! а1. Способы переноса генов в гематопоэтические клетки также были описаны ранее (см. С1арр, Ό.\., е! а1., В1ооб.. 78:1132-1139 (1991); Аибегзои, Заеисе. 288:627-9 (2000) и Сауах/аиа-Сако е! а1., Заеисе. 288:669-72 (2000)).
Термины клетка, линии клеток, а также культура клеток часто используются как взаимозаменяемые; все подобные определения предполагают получение потомства. Трансформанты и трансформированные клетки (например, полученные путем трансфекции, трансформации либо трансдукции нуклеиновыми кислотами, векторами, вирусами и т.д.) включают первичные клетки, подвергнутые воздействию, и культуры, полученные из них, вне зависимости от количества переносов. Понятно, что в результате преднамеренных либо спонтанных мутаций все потомство не может быть абсолютно идентичным по содержанию ДНК. Мутировавшее потомство, имеющее те же функции или биологическую активность, что и те, по которым отбирали первоначально трансформированные клетками, также включены в объем данного изобретения. Из контекста будет понятно, где подразумеваются другие определения.
Описанные в настоящем изобретении гуманизированные антитела включают антитела, имеющие каркасный участок вариабельной области, полученный из молекулы акцепторного антитела человека, гипервариабельные или СИВ-последовательности из донорного антитела мыши и константными областями, если такие присутствуют, полученными из последовательностей человека.
- 14 016245
Антитела согласно настоящему изобретению были получены таким образом, что они содержат участки СЭР из вариабельных участков как тяжелой, так и легкой цепей клона ВНА2.1 моноклонального антитела крысы (Напдап е1 а1., Сапсег Рек. 56:3142-3149 (1996)). Предпочтительными исходными материалами для получения антител являются антитела к интегрину α2, такие как секретируемые гибридомой ВНА2.1 (например, ТМС-2206), которые являются антителами, блокирующими функцию, направленными против интегрина α2 человека, и зависят, в отношении связывания и активности, от присутствия интактного Ι-домена в интегрине α2. Предпочтительными являются антитела с эпитопной специфичностью ТМС-2206 (или ВНА2.1), включая антитела, которые связывают молекулу интегрина α2 в неактивной конформации, и/или не выступающие как миметики лиганда. Предпочтительными являются антитела с эпитопной специфичностью ТМС-2206 (или ВНА2.1), которые, хотя и взаимодействуют с интегрином α2β1 как в лейкоцитах, так и в тромбоцитах, но в применяемых концентрациях, включая терапевтические дозы 1п νίνο, не вызывают активации тромбоцитов, нарушения агрегации активированных тромбоцитов на коллагене, имеют минимальное влияние либо не влияют на кровотечение и/или не ассоциированы с осложнениями, связанными с кровотечением.
Можно сконструировать такие антитела, что акцепторную молекулу человека для вариабельного участка легкой цепи в них выбирают на основании гомологии между вариабельными областями потенциальной акцепторной молекулы и вариабельным участком легкой цепи антитела крысы. Предпочтительно применять зародышевые акцепторные молекулы человека для снижения потенциальной антигенности. Базы данных зародышевых молекул составляют из последовательностей антител, которые прочитываются до конца области Е^3 тяжелой цепи и частично в последовательности СЭР3. Для выбора области Е\У4 предпочтительно проводить поиск в базах данных последовательностей зрелых антител, которые были получены из выбранных зародышевых молекул; для применения в молекуле рекомбинантного антитела предпочтительно выбирать области Е\У4 с достаточной степенью гомологии. Предпочтительно отбирать акцепторные молекулы, являющиеся молекулами человека, из того же класса легкой цепи, что и донорные молекулы мыши, и из того же канонического структурного класса вариабельной области, что донорная молекула мыши. Вторичные факторы для отбора акцепторной молекулы человека для вариабельного участка легкой цепи включают гомологию по длине участка СОР между донорной молекулой мыши и акцепторной молекулой человека. Молекулы акцепторного антитела человека предпочтительно отбирать путем поиска гомологий в базе данных У-ВА8Е и других базах данных, таких как КаЬа! и общедоступная база данных NСВI. Для гуманизированных антител к интегрину α2 с эпитопной специфичностью и/или функциональными свойствами, такими же, как у ТМС-2206, или близкими к ним, предпочтительной легкой цепью акцепторной молекулы человека является 8Е0 ΙΌ N0: 37, имеющая последовательность зародышевого антитела А14 для участка Е^1-3 и последовательность ЕСОСТКУЕК для Е\У4 (8Е0 ΙΌ N0: 38), которая представляет общий участок Е\У4 зрелой легкой цепи каппа 1 (например, последовательность легкой цепи ААВ24132 (запись д1/259596/дЬ/ААВ24132 в NСВI).
Можно сконструировать такое антитело, в котором акцепторная молекула человека для вариабельного участка тяжелой цепи выбрана на основании гомологии между вариабельными областями потенциальной акцепторной молекулы и вариабельной областью тяжелой цепи антитела крысы. Предпочтительно применять зародышевые акцепторные молекулы человека для снижения потенциальной антигенности. Базы данных зародышевых молекул составляют из последовательностей антител, которые прочитываются до конца области Е\У3 тяжелой цепи и частично в последовательности СЭР3. Для выбора области Е\У4 предпочтительно проводить поиск в базах данных последовательностей зрелых антител, которые были получены из выбранных зародышевых молекул; для применения в молекуле рекомбинантного антитела предпочтительно выбирать области Е\У4 с достаточной степенью гомологии. Предпочтительно отбирать акцепторные молекулы, являющиеся молекулами человека, из того же класса легкой цепи, что и донорные молекулы мыши, и из того же канонического структурного класса вариабельной области, что и донорная молекула мыши. Вторичные факторы для отбора акцепторной молекулы человека для вариабельного участка легкой цепи включают гомологию по длине участка СОР между донорной молекулой мыши и акцепторной молекулой человека. Молекулы акцепторного антитела человека предпочтительно отбирать путем поиска гомологий в базе данных У-ВА8Е и других базах данных, таких как КаЬа! и общедоступная база данных NСВI. Для гуманизированных антител к интегрину α2 с эпитопной специфичностью и/или функциональными свойствами, такими же, как у ТМС-2206, или близкими к ним, предпочтительной тяжелой цепью акцепторной молекулы человека является 8Е0 ΙΌ N0: 39, содержащая зародышевую последовательность антитела 4-59 для участка Е^1-3 (8Е0 ΙΌ N0: 12) и антитело САА48104,1 (д1/33583/етЬ/САА48104,1 запись в NСВI), зрелое антитело, полученное из зародышевой последовательности 4-59 для участка Е\У4 (8Е0 ΙΌ N0: 13) (Ьйρ://^^^.ηсЬ^.η1т.η^Ь.дον).
В настоящем изобретении, включая примеры, приведенные ниже, описаны способы гуманизации негуманизированного антитела к интегрину α2. Для гуманизации негуманизированного антитела к интегрину α2 получают исходный материал - негуманизированное антитело, не являющееся антителом человека, например, путем получения методом иммунизации либо покупают коммерчески доступные антитела. Типичные технологи получения антител описаны ниже.
- 15 016245
Антиген, используемый для получения антител к интегрину α2β1, может существовать, например, в виде растворимой формы интегрина α2β1 или другого фрагмента интегрина α2β1 (например, фрагмента интегрина α2β1, содержащего 1-домен интегрина α2 человека (8ΕΟ Ш N0: 11); также см., например, 8Ε0 Ш N0: 107). Другие формы интегрина α2, используемые для получения антител, на основе последовательности интегрина α2 (например, интегрина α2 человека, как в 8Ε0 Ш N0: 8) будут очевидны для специалистов в данной области.
Поликлональные антитела предпочтительно получают из организма животных путем многократных подкожных (δ/с), внутривенных (ί/ν) либо внутрибрюшинных (ί/ρ) инъекций соответствующего антигена с адъювантом или без него. Полезной может оказаться конъюгация соответствующего антигена с белком, иммуногенным для подвергаемых иммунизации видов, таким как, например, гемоцианин лимфы улитки, сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин или ингибитор трипсина сои, с применением бифункционального или дериватизирующего агента, например малеимидобензоилсульфосукцинимида (конъюгация через остатки цистеина), Ν-гидроксисукцинимид (через остатки лизина), глутарового альдегида, янтарного ангидрида, З0С12 или Κ1Ν=0=ΝΚ, где К. и К1 - различные алкильные группы.
Животных можно иммунизировать антигеном, иммуногенным конъюгатом либо производными, полученными путем смешивания антигена или конъюгата (например, 100 мкг для кроликов или 5 мкг для мышей) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда, путем инъекции раствора внутрикожно в различные участки. Через 1 месяц животным повторно вводят антиген или конъюгат (например, от 1/5 до 1/10 первоначального количества, используемого для иммунизации) в полном адъюванте Фрейнда путем подкожной инъекции в различные участки. Через 7-14 дней у животных отбирают кровь и определяют титр антител в сыворотке. Поддерживающие иммунизации животных проводят до тех пор, пока титр не станет постоянным. Для иммунизации конъюгатом предпочтительно, чтобы поддерживающие иммунизации животных проводили с применением одного и того же антигена, но конъюгированного с разными белками и/или с применением разных перекрестно сшивающих реагентов. Конъюгаты также можно получить в культуре рекомбинантных клеток, в виде гибридных белков. Для применения также подходят агрегирующие агенты, такие как квасцы, обеспечивающие усиление иммунного ответа.
Моноклональные антитела можно получить с применением гибридомной технологии, описанной впервые КоЫет с1 а1., №11иге. 256:495 (1975), или рекомбинантными способами ДНК (например, патент США № 6204023). Моноклональные антитела можно получить по технологии, описанной в патентах США № 6025155 и 6077677 а также в публикациях заявок на патент США № 2002/0160970 и 2003/0083293 (см. также, например, ЬтбепЬаит, е1 а1., Шс1е1с Ас1бк Кекеагсй. 32(21):0177 (2004)).
В методе гибридом мышь или другое подходящее животное-хозяин, такое как крыса, хомяк или обезьяна, подвергают иммунизации (например, как описано выше), чтобы вызвать образование лимфоцитов, которые продуцируют либо способны продуцировать антитела, которые специфическим образом связывают антиген, используемый для иммунизации. В качестве альтернативы можно иммунизировать ίη νίίτο. Затем лимфоциты подвергают гибридизации с клетками миеломы с применением подходящего агента для слияния, такого как полиэтиленгликоль, в результате чего получают клетки гибридомы (см., например, Собшд. Мопос1опа1 Ап1|ЬоФе5: Рппс1р1е8 апб Ртасйсе, р, 59-103 (Асабетк Ргекк, 1986)).
Клетки гибридомы, полученные таким способом, высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более соединений, ингибирующих рост или выживание неслитых, исходных клеток миеломы. Например, если в исходных клетках миеломы отсутствует фермент гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (НСРКТ или НРКТ), культуральная среда для гибридом должна включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда НАТ), эти соединения препятствуют росту НСРКТ-дефицитных клеток.
В предпочтительном случае клетки миеломы эффективно гибридизуются, поддерживают стабильно высокий уровень продуцирования антител отобранными антителообразующими клетками и чувствительны к такой среде, как среда НАТ. Среди них предпочтительными линиями клеток миеломы являются линии миелом мыши, такие как получаемый из опухолей мыши М0Р-21 и М.С.-11 от За1к [пкШШе Се11 ОМпЬиЦоп СеШет, Зап П1едо, СаНЕ И8А, и клетки 8Р-2 или Х63-Ад8-653 из Атепсап Туре Си 11 иге Со11есбоп, Коску Ше, Мб. И8А. Для получения моноклональных антител человека были описаны линии клеток миеломы человека и клеток гетеромиеломы мышь-человек (например, Ко/Ьог, 1 1ттипо1., 133:3001 (1984); Вгобеиг е1 а1., Мопос1опа1 АпбЬобу Ргобисйоп Тес11пк|ие5 апб АррНсабопк, р. 51-63 (Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уогк, 1987)).
Культуральную среду, в которой выращивают клетки гибридомы, анализируют на продукцию моноклональных антител, направленных против антигенов. Предпочтительно определяют специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, методом иммунопреципитации или в анализе связывания ш уйго, таком как радиоиммуноанализ (РИА), либо твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА).
Аффинность связывания моноклонального антитела можно определить, например, с помощью анализа по Скэтчарду, см. Мипкоп е1 а1., Апа1. Вюсйет., 107:220 (1980).
- 16 016245
После выявления клеток гибридомы, продуцирующих антитела желаемой специфичности, аффинности и/или активности, клоны можно субклонировать с применением процедур ограничивающего разведения и выращивать обычными методами (^бтд, Мοηοсίοηа1 Ак^б^к: Ргтар1ек апб Ргасйсе, р, 59103 (Асабетк Ргекк, 1986)). Подходящие для этой цели культуральные среда включают, например, среду Ό-МЕМ или КРМ1-1640. Кроме того, клетки гибридомы можно выращивать ш νίνο в виде асцитных опухолей у животных.
Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, соответственно выделяют из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки обычными способами очистки иммуноглобулинов, например, путем хроматографии с белком А, гидрофобной хроматографии, хроматографии на гидроксилапатите, с помощью гель-электрофореза, диализа и/или аффинной хроматографии.
ДНК, кодирующую моноклональные антитела, легко выделить и секвенировать с применением обычных методов (например, с применением олигонуклеотидных зондов, способных специфическим образом связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи моноклональных антител). Клетки гибридомы выступают как предпочтительный источник такой ДНК. После выделения ДНК можно поместить в векторы экспрессии, которыми затем трансфецируют клетки-хозяева, такие как клетки Е.тоН, клетки обезьяны СОБ, клетки яичников китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, включая клетки, которые в норме не продуцируют белок-иммуноглобулин, для обеспечения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Получение антител рекомбинантными методами подробно описано ниже.
В приведенных примерах описаны способы, применяемые для гуманизации антитела к интегрину α2. В определенных вариантах реализации может быть необходимым получение вариантов последовательности аминокислот гуманизированного антитела, в частности, для улучшения аффинности связывания или получения других биологических свойств гуманизированного антитела.
Варианты последовательности аминокислот гуманизированного антитела к интегрину α2β1 получают путем внесения необходимых изменений нуклеотидов в ДНК гуманизированного антитела к интегрину α2β1 или путем синтеза пептидов. Такие варианты включают, например, делеции, и/или вставки, и/или замены остатков в последовательностях аминокислот, приведенных для антитела ТМС-2206 к интегрину α2 (например, полученного из или основанного на последовательностях вариабельных участков, как показано в БЕС ΙΌ ΝΟ: 19 и 21). Можно выполнить любую комбинацию делеций, вставок и замен аминокислот при условии, что конечная структура имеет желаемые характеристики. Изменения последовательности аминокислот также могут вызывать изменения посттрансляционной обработки гуманизированного антитела к интегрину α2, такие как изменение количества или положения сайтов гликозилирования.
Существует целый ряд методов получения антител: человека или подобных антителам человека (например, гуманизация). Подходы к гуманизации антител изменялись на протяжении многих лет. Один из подходов состоял в создании вариабельных областей антител мыши, связанных с константными областями антител человека, так называемые Рс-химеры мышь-человек (см., например, Мο^^^кοη е! а1., Ргос. №111. Асаб. Бс1. ИБА. 81:6851-6855 (1984); патент США № 5807715). Другой подход основан на том факте, что участки СОК можно легко идентифицировать на основании их гипервариабельной природы (КаЬа! е! а1., I. Вю1. СНет. 252:6609-6616 (1977)), КаЬа!, А6у. Рго!ет СНет. 32:1-75 (1978)) и канонической структуры (С1ю11на апб Ьекк, I. Μο1. Вю1. 196(4):901-17 (1987); Ьахакаш е! а1., I. Μο1. Вю1. 272:929 (1997) и гуманизировать путем прививки участков СОК организмов, отличных от человека (относится к донорным СОК), на каркасную область человека (имеется в виду каркасная область акцептора), как показано, например, в кпек е! а1., №11иге. 321(6069):522-5 (1986); (см., например, патент США № 5225539; патент США № 6548640). Шесть петель СОК располагаются в кластере и на основании данных рентгеноструктурного анализа можно легко определить важные остатки каркасного участка в пределах так называемой области Вернье, фланкирующей участки СОК на границе раздела тяжелой-легкой цепей (см., например, С1ю11на апб Ьекк, I. Μο1. Вю1. 196(4):901-17 (1987); С1ю11на е! а1., I. Μο1. Вк1. 186(3):651-63 (1985); С1ю11на е! а1., №11иге. 342(6252):877-83 (1989)). Эти остатки можно путем мутации преобразовать обратно в остатки, характерные для мыши, с восстановлением правильной относительной ориентации шести участков СЭК (см., например, Уег1юуеп е! а1., Бскпсе. 239(4847):1534-6 (1988); Кекйтап е! а1., №1иге. 332(6162):323-7 (1988); Тетрек! е! а1., Β^ο!есйηοίοду (ΝΥ) 9(3):266-71 (1991)). Поскольку вариабельные области можно классифицировать по семействам, которые имеют относительно высокую степень гомологии между мышами и людьми (обзор дан, например, в Раксиа1 апб Сарга Абу. Iттиηοί. 49:174 (1991)), эти исследования также демонстрируют, что вероятность потери аффинности привитого антитела можно минимизировать путем подбора зародышевой последовательности человека с максимальной гомологией с антителом мыши для применения в акцепторной молекуле человека (см., например, патент США № 5225539; Уег^уеп е! а1., Бскпсе. 239(4847):1534-6 (1988)).
- 17 016245
Гомология семейств и структурные связи между каркасными участками, которые обеспечивают правильную каноническую структуру данного типа СЭВ были описаны ранее (см., например, Л1-Ба/акаш с( а1., 1. Μοί. ΒίοΙ. 273(4):927-48 (1997) со ссылками). Предпочтительно следует выбирать наиболее подходящую зародышевую последовательность или последовательность человека. Для определения подтипа семейства данной тяжелой или легкой цепи мыши и для определения наиболее подходящих последовательностей, которые можно применять для акцепторных каркасных участков человека в пределах подсемейства человека, используют имеющиеся базы данных зародышевых последовательностей антител. Предпочтительно принимать во внимание как линейную гомологию аминокислот донорного и акцепторного каркасного участка, так и каноническую структуру СОВ.
Примеры остатков тяжелой цепи, которые можно заменить в гуманизированном антителе к интегрину α2, включают любой или несколько из следующих номеров остатков каркасного участка: Н37, Н48, Н67, Н71, Н73, Н78 и Н91 (система нумерации КаЬа!). Предпочтительно, чтобы были заменены по крайней мере четыре из этих остатков каркасного участка. Наиболее предпочтительным набором для замен в тяжелой цепи гуманизированного антитела к интегрину α2 является: Н37, Н71, Н73 и Н78. Подобным образом, можно заменять и остатки в легкой цепи. Примеры остатков легкой цепи для замены включают любой или несколько из следующих остатков: Ь1, Ь2, Ь4, Ь6, Ь46, Ь47, Ь49 и Ь71. Предпочтительно, чтобы были заменены по крайней мере три из этих остатков каркасного участка. Наиболее предпочтительный набор для замещения легкой цепи в гуманизированном антителе к интегрину α2 состоит из Ь2, Ь46 и Ь49.
Полезный метод идентификации определенных остатков или областей гуманизированного антитела к интегрину α2, которые представляют предпочтительные положения для мутагенеза, называется аланин-сканирующий мутагенез (см., например, Сипшидйат апб Ае11к 8с1епсе, 244:1081-1085 (1989)). В этом методе определяют остаток или группу целевых остатков (например, заряженные остатки, такие как агд, акр, Ык, 1ук и д1и) и заменяют нейтральными или отрицательно заряженными аминокислотами (предпочтительно аланином либо полиаланином), чтобы изменить взаимодействие аминокислот с антителом к интегрину α2β1. Эти положения аминокислот, проявляющие функциональную чувствительность к заменам, затем очищают путем введения дополнительных или других вариантов в или для сайтов замещения. Таким образом, хотя сайт для введения изменений последовательности аминокислот определяют заранее, природу мутации рег ке заранее определять не требуется. Например, для анализа влияния мутации в данном сайте проводят аланин-сканирующий или случайный мутагенез в целевом кодоне или области и экспрессированные варианты гуманизированного антитела к интегрину α2 подвергают скринингу на желаемую активность.
Вставки в аминокислотную последовательность включают присоединение на амино- и/или карбоксильном концах последовательностей длиной от одного остатка до полипептида, содержащего сотни или более остатков, а также вставки внутри последовательности единичных или множественных остатков аминокислот. Примеры концевых вставок включают гуманизированное антитело к интегрину α2 с остатком метионила на Ν-конце или антитело, соединенное с маркером эпитопа. Другие варианты молекулы гуманизированного антитела к интегрину α2 со вставками включают присоединение к Ν- или С-концу гуманизированного антитела к интегрину α2 фермента или полипептида, который повышает период полувыведения антитела из сыворотки крови (см. ниже).
Другим типом варианта является вариант с заменой аминокислот. В данных вариантах по крайней мере один остаток аминокислоты в молекуле гуманизированного антитела к интегрину α2 заменяют другим остатком. Для заместительного мутагенеза особый интерес представляют гипервариабельные петли, но изменения каркаса также рассматриваются. Гипервариабельные участки и каркасные участки, участвующие в связывании антигена обычно заменяют относительно консервативным образом. Такие консервативные замены представлены в приведенной ниже таблице в столбце предпочтительные замены. Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то вводят более значительные замены, названные примерными заменами или описанные ниже в связи с классами аминокислот, и проводят скрининг полученных продуктов.
- 18 016245
Первоначальный остаток Примерные замены Предпочтительные замены
А1а (А) уа1; 1еи; Не Уа1
Агд (К) 1уз; д1п; азп Ьуз
Азп(Ν) д1п; Н|з; 1уз; агд С1п
Азр (ϋ) д1и С1и
Суз (С) вег Зег
<31п (О) азп Азп
С1и (Е) азр Азр
С1у (С) рго; а1а А1а
Ηί3 (Н) азп; д1п; 1уз; агд Агд
Не (1) 1еи; νβΙ; те!; а1а; рЬе; пог1еис1пе Ъеи
Ьеи (Ь) пог1еис1пе; Не; уа1; те!; а1а; рЬе Не
Ьуз (К) агд; д1п; азп Агд
Ме! (М) 1еи; рйе; Не 1еи
РЬе (Р) 1еи; νβΙ; Не; а1а; !уг Ьеи
Рго(Р) а1а А1а
Зег (5) !Ьг ТЬг
ТЬг(Т) &ег Зег
Тгр(УУ) !уг; рНе Туг
Туг(У) !гр; рЬе; Пэг; зег РЬе
Уа1 (V) Не; 1еи; те!; рЬе; а1а; пог!еис1пе Ьеи
Существенные модификации биологических свойств антитела проводят путем выбора замен, которые значительно различаются по их действию на (а) структуру полипептидного каркаса в участке замены, например конформацию в виде складчатого слоя или спирали; (б) заряд или гидрофобность молекулы в целевом сайте, (в) величину боковой цепи. Природные остатки разделяют на группы на основании общих свойств боковых цепей:
(1) гидрофобные: норлейцин, те!, а1а, уа1, 1еи, 11е;
(2) нейтральные гидрофильные: сук, Бет, !Пг;
(3) кислотные: акр, д1и;
(4) основные: акп, д1п, Ыб, 1уБ, агд;
(5) остатки, оказывающие влияние на ориентацию цепи: д1у, рго;
(6) ароматические: !гр, !уг, рйе.
Неконсервативные замены - это замены, при которых член одного из этих классов замещается членом другого класса. Любой остаток цистеина, не участвующий в сохранении правильной конформации гуманизированного антитела к интегрину α2, также можно, как правило, заменить на серин, чтобы повысить устойчивость молекулы к окислению и предотвратить ненормальное перекрестное сшивание. Цистеиновые связи можно, наоборот, вводить в антитело для повышения его стабильности (особенно, если речь идет о таком фрагменте антитела, как Εν-фрагмент).
Другой тип варианта последовательности аминокислот антитела изменяет характер первоначального гликолизилирования антитела. Под изменением подразумевают делецию одной или более углеводных групп, обнаруженных в антителе, и/или добавление одного или более сайтов гликолизилирования, которых нет в антителе.
Гликолизирование антител обычно бывает либо Ν-связанным, либо О-связанным. Ν-связывание относится к присоединению углеводной группы к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту, кроме пролина, являются последовательностями узнавания для ферментативного присоединения углеводных частиц к боковым цепям аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт для гликолизилирования. О-связанное гликолизирование относится к присоединению одного из сахаров Ν-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, обычно это серин или треонин, хотя возможно также участие 5-гидроксипролина или 5-гидроксилизина.
Добавление или удаление сайтов для гликолизилирования антитела обычно осуществляют путем изменения последовательности аминокислот таким образом, чтобы она содержала или в ней отсутствовала одна или более упомянутых выше трипептидных последовательностей (для сайтов Ν-связанного гликолизилирования). Изменение также осуществляют путем добавления, замены или удаления одного или более остатков серина или треонина в последовательности исходного антитела (для сайтов Освязанного гликолизилирования). Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты последовательности аминокислот гуманизированного антитела к интегрину α2, можно получить различными методами, известными в данной области. Эти методы включают, без ограничения, выделение из природного источника (в случае природных вариантов последовательности аминокислот) или получение с помощью мутагенеза, опосредованного олигонуклеотидами (направленный мутагенез), ПЦР-мутагенеза или кассетного мутагенеза полученного ранее варианта или невариантной версии гуманизированного антите
- 19 016245 ла к интегрину α2.
Обычно варианты последовательности аминокислот гуманизированного антитела к интегрину α2 предполагают наличие последовательности аминокислот, имеющей по крайней мере 75%-ную идентичность по отношению к исходным последовательностям гуманизированного антитела как тяжелой, так и легкой цепей (например, последовательности с вариабельными областями, как в 8Е0 ΙΌ N0: 21 или 8Е0 ΙΌ N0: 19 соответственно), предпочтительно не меньше 80%, предпочтительнее не меньше 85%, предпочтительнее не меньше 90%, наиболее предпочтительно 95%, включая, например, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 и 100%. Идентичность или гомология данной последовательности определяется как процентное соотношение остатков аминокислот в последовательностикандидате, которые идентичны остаткам гуманизированного α2 интегрина, после выравнивания всех последовательностей и введения пробелов, если это необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей, без учета консервативных замен (описанных выше), как доли идентичности последовательностей. Ни одно из Жконцевых, С-концевых или внутренних присоединений, делеций и вставок в последовательности антитела не рассматривают как влияющее на гомологию или идентичность последовательности. Таким образом, идентичность последовательности определяется стандартными способами, обычно используемыми для определения близости позиций аминокислот двух полипептидов. С помощью таких компьютерных программ, как ВЬА8Т или ЕА8ТА, два полипептида располагают таким образом, чтобы оптимально совместить соответствующие аминокислоты (либо по всей длине, либо по отдельно выбранным участкам последовательностей). Программы по умолчанию предполагают значение на отбраковку стыковки, на отбраковку несоответствия, а также матрицу замен РАМ250 (стандартная матрица замен; см. ЭаукоГГ е! а1., в АИак οί ΡΐΌΐοίη 8ес.|иепсе апф 81гис1иге, νοί 5, кирр. 3 (1978)), которую можно применять вместе с компьютерной программой. Например, процент идентичности можно вычислить следующим образом: общее количество совпадений умножают на 100 и делят на сумму длины более длинной последовательности в сравниваемом участке и количества пробелов, введенных в более длинные последовательности, чтобы совместить эти две последовательности.
Антитела, обладающие характеристиками, определенными здесь как желаемые для гуманизированного антитела к интегрину α2, подвергают скринингу описанными в данном изобретении способами. Например, применяют способы скрининга подходящих антител к интегрину α2 на предпочтительные характеристики и функциональность, включая скрининг антител на связывание с эпитопом интегрина α2β1, связанного с интересующим антителом (например, тем, которое конкурирует, ингибирует или блокирует связывание антитела ТМС-2206 с интегрином α2β1). Типичные способы и материалы описаны в примере 13. Анализы перекрестного блокирования описаны, например, в АпйЬоФ1ек, А ЬаЬогаФгу Мапиа1, Со1Ф 8рппд ЧагЕог ЬаЬога!огу, ЕФ ΗηιΊο\ν апф ΩηνίΦ Ьапе (1988), их можно проводить согласно приведенным методикам. В качестве дополнения или альтернативы, для определения того, связывается ли представляющий интерес эпитоп с антителом, выполняют картирование эпитопов, например, как описано в Скатре е! а1., ί. Вю1. Скет. 270:1388-1394 (1995) (см., например, пример 12 для исследования по картированию эпитопов ТМС-2206).
Подобным же образом применяют иммобилизированный интегрин α2β1 для определения относительной способности связывания путем измерения величин К1 в конкурентном анализе (см., например, пример 2). Например, флуоресцентно меченый Еи-ТМС-2206 используют при различных концентрациях немеченого анализируемого антитела, например, с применением системы для анализа, подобной описанной выше. Следуя установленному времени инкубирования, определяют количество связанного Еи-ТМС-2206. Кривые ингибирования, соответствующие модели конкуренции в одном сайте, строили с помощью программного обеспечения Рпкт (ОгарЬРаФ, 1пс. СА), определяли величины 1С50 и рассчитывали К1 по уравнению Ченга-Прусоффа (Вюскет, Ркагтасо1. 22(23):3099-108 (1973)).
Желательно получить, идентифицировать и/или отобрать гуманизированные антитела к интегрину α2, имеющие хорошую активность связывания, например, в условиях, описанных в примере 2, когда анализируемые антитела подвергают скринингу на способность блокировать опосредованную интегрином α2β1 адгезию клеток по сравнению с ТМС-2206 и химерным антителом мышь-человек, полученными из ТМС-2206, как описано в примере 2. Например, получают клетки ΟΗ0, экспрессирующие интегрин α2 человека и эндогенный интегрин β1 хомячка (8уттд1оп е! а1., ί. Се11 Вю1. 120(2):523-35 (1993)), и метят их СЕ8Е (Мо1еси1е РгоЬек, 0Н). Готовят меченые клетки готовят и корректируют концентрацию клеток; клетки выдерживают в темноте. Подготавливают покрытый коллагеном планшет (коллаген из хвоста крысы, тип I; ВО Вюкаепсек) и добавляют серийные разведения раствора каждого антитела в планшет с коллагеном. Меченые клетки добавляют в лунку и планшет инкубируют. После промывания клетки лизируют и считывают интенсивность флуоресцентности (возбуждение при 485 нм, излучение при 535 нм). Рассчитывают ингибирующую активность каждого антитела.
В дополнение, рассчитывают константы связывания исследуемых антител для иммобилизированного лиганда интегрина α2β1, как показано в примере 2. Лунки в планшете для микротитрования на 96 лунках покрывают интегрином α2β1 тромбоцитов (специальное покрытие α2β1 тромбоцитов человека от ОТ1 1пс., XVI), а затем блокируют. Например, для определения аффинности ТМС-2206 к анти
- 20 016245 гену - интегрину α2, используют флуоресцентно меченый ТМС-2206 или антитела контрольного изотипа 1дС (см. примеры ниже). Флуоресцентно меченое антитело, включая Еи-ТМС-2206 или Еи-контрольный изотип вносят на блокированный планшет для микротитрования, покрытый интегрином α2β1. После инкубирования запечатанных планшетов до достижения равновесия взаимодействия антителоантиген образцы из каждой лунки переносят в другую лунку с проявляющим раствором для измерения концентрации свободной (несвязанной) метки. Также проявляющий раствор добавляют в пустые лунки для измерения концентрации связанной метки. Величины Кб антитела к интегрину α2 рассчитывают по методу Скэтчарда. Относительную аффинность производных ТМС-2206 (включая гуманизированные антитела, происходящие от или на основе ТМС-2206) можно определить путем определения величин К1 в конкурентном анализе. Например, для конкурентного анализа меченое Еи-ТМС-2206 добавляют в лунки, покрытые α2β1 в присутствии немеченых антител к интегрину α2, включая ТМС-2206 или химерные (включая гуманизированные) антитела, полученные из или на основе ТМС-2206, или антитела контрольного изотипа 1дС, в разных концентрациях. После инкубирования для достижения равновесия лунки промывают и измеряют уровни связывания меченых антител по сохранившейся в лунках европиевой метке. Величина К1 может быть рассчитана по значению ЕС50, при этом используют значения Кб, полученные для Еи-ТМС-2206 антитела в анализе прямого связывания, как описано выше.
В некоторых вариантах реализации гуманизированное антитело к интегрину α2 представляет собой фрагмент антитела. Разработаны различные методы получения фрагментов антител. Обычно эти фрагменты получают путем протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Мο^^тοΐο е1 а1., οί Вюскетюа1 апб Вюркущса1 Ме11юб5. 24:107-117 (1992) и Вгеппап е1 а1., 8с1епсе. 229:81 (1985)). Однако эти фрагменты можно получить непосредственно с помощью рекомбинантных клетокхозяев, таких как бактерии (см., например, Вейег е1 а1., 8с1епсе. 240(4855):1041-1043 (1988); патент США № 6204023). Например, фрагменты ЕаЬ'-8Н можно непосредственно выделить из Е.той и химическим путем получить из них фрагменты Е(аЬ')2 (Сайег е1 а1., Вю/Тескш^^у. 10:163-167 (1992)). Согласно другому подходу фрагменты Е(аЬ')2 можно непосредственно выделить из культуры рекомбинантной клеткихозяина. Другие способы получения фрагментов антител будут очевидными для специалиста в данной области.
В некоторых вариантах реализации изобретения желательно получить мультиспецифичные (например, биспецифичные) гуманизированные антитела к интегрину α2, которые обладают специфичностью связывания в отношении по меньшей мере двух различных эпитопов. Типичные биспецифичные антитела (например, с двумя разными плечами связывания) могут связывать два различных эпитопа белка интегрина α2β1. В качестве альтернативы, связывающее плечо интегрина α2 можно соединить с плечом, которое связывает стимулирующую молекулу на лейкоците, такую как молекула рецептора Т-клеток (например, СЭ2 или СЭ3) или рецепторы для ^С (ЕсуВ), такие как ЕсуШ (СЭ64), ЕсуВП (СЭ32) и ЕсуКШ (СО16), для того, чтобы сконцентрировать клеточные защитные механизмы на клетках, поверхность которых связана с интегрином α2β1. Биспецифичные антитела можно использовать для локализации цитотоксических агентов на клетках, поверхность которых связана с интегрином α2β1. Такие антитела обладают связывающим плечом для интегрина α2β1 и плечом, которое связывается с цитотоксическим агентом (например, гелонином, сапорином, антиинтерфероном α, алкалоидом барвинка, цепью рицина А или меченным радиоактивным изотопом гаптеном). Биспецифичные антитела можно получить в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, Е(аЬ')2 биспецифичные антитела).
В соответствии с другим подходом к получению биспецифичных антител границу раздела между парой молекул антител можно сконструировать с максимальным увеличением процента гетеродимеров, которые выделяют из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная граница раздела включает по меньшей мере часть домена СН3 константной области антитела. В данном способе одну или более небольших боковых цепей аминокислот из границы раздела первой молекулы антитела замещают более крупными боковыми цепями (например, тирозин или триптофан). На границе раздела второй молекулы антитела создают компенсирующие полости, одинаковые или меньшие по размеру крупным боковым цепям, путем замены крупных боковых цепей аминокислот на меньшие (например, аланин или треонин). Это обеспечивает механизм повышения выхода гетеродимера по сравнению с другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры (см., например, ν0 96/27011).
Биспецифичные антитела включают перекрестно сшитые или гетероконъюгированные антитела. К примеру, одно из антител в гетероконъюгате можно соединить с авидином, другое - с биотином. Гетероконъюгированные антитела можно получить любыми обычными методами перекрестного сшивания. Подходящие перекрестно сшивающие агенты хорошо известны в данной области и раскрыты, например, в патентах США № 4676980, наряду с некоторыми методами перекрестного сшивания.
Способы получения биспецифичных антител из фрагментов антител также описаны в литературе. Биспецифичные антитела можно получить путем химического связывания. Например, Вгеппап е1 а1. (8с1епсе. 229:81 (1985)) описывает метод, при котором интактные антитела протеолитически расщепляют с получением Е(аЬ')2. Данные фрагменты восстанавливают в присутствии дитиолового комплексообразующего агента на основе арсенита натрия для стабилизации смежных дитиолов и предотвращения обра
- 21 016245 зования межмолекулярных дисульфидных связей. Полученные ЕаЬ'-фрагменты затем превращают в производные тионитробензоата (ТNΒ). Затем одно из производных ЕаЬ'-'Т№ вновь превращают в ЕаЬ'-тиол восстановлением меркаптоэтиламина и смешивают с эквимолярным количеством другого производного ΕаЬ'-ТNΒ с образованием биспецифического антитела. Полученные биспецифичные антитела можно использовать в качестве агентов для избирательной иммобилизации ферментов.
Фрагменты ЕаЬ'-8Н, выделенные из Е.со11, можно соединить химической связью с образованием биспецифичных антител. Например, 8ка1аЬу е1 а1. (1. Ехр. Меб. 175:217-225 (1992)) описывают получение молекулы полностью человеческого биспецифичного антитела Е(аЬ')2. Каждый ЕаЬ'-фрагмент по отдельности секретировался в Е.Со11, затем его подвергали непосредственному химическому соединению ш уйго с образованием биспецифичного антитела. Полученное таким образом биспецифичное антитело было способно связываться с клетками с гиперэкспрессией рецептора НЕК2 и нормальными Т-клетками человека, а также стимулировать литическую активность цитотоксических лимфоцитов человека против клеток-мишеней опухоли молочной железы человека.
Также описаны различные методы получения и выделения фрагментов биспецифичных антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифичные антитела получали с применением лейциновых молний (см, например, Кох1де1пу е1 а1., 1. Iттипο1. 148(5):1547-1553 (1992)). Белки лейциновых молний из белков Еох и 1ип соединяли с ЕаЬ'-участками из двух разных антител путем рекомбинации. Гомодимеры антител восстанавливали в шарнирной области с образованием мономеров, а затем вновь окисляли с образованием гетеродимеров антитела. Этот способ можно также применять для получения гомодимеров антител. Технология получения диатела (см, например, НоШпдег е1 а1., Ргос. Асаб. δα. И8А. 90:6444-6448 (1993) обеспечила альтернативный механизм получения фрагментов биспецифичных антител. Фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи (УН), связанную с вариабельной областью легкой цепи (Уь) с помощью линкера, который является слишком коротким, чтобы произошло соединение двух доменов в одной и той же цепи. Следовательно, домены УН и У, одного фрагмента вынуждены конъюгировать с комплементарными доменами Уъ и УН другого фрагмента, и таким образом образуются два антигенсвязывающих сайта. Также была описана другая стратегия получения фрагментов биспецифичных антител с применением (χΕν или хсΕν) димеров Εν с одной цепью (см, например, СгиЬег е1 а1., 1. ^типоЕ 152:5368 (1994)). В качестве альтернативы, биспецифичное антитело может представлять собой линейное антитело, например, если оно получено, как описано в 2ара1а е1 а1., Рго1еш Епд. 8(10):1057-1062 (1995).
Предусмотрены антитела более чем с двумя валентностями. Например, можно получить триспецифичные антитела (см, например, Тий е1 а1., 1. Iттиηο1. 147:60(1991)).
Также предусмотрены другие модификации антител человека к интегрину α2. Например, может быть желательна модификация антитела для улучшения эффекторной функции с целью усиления или снижения эффективности антитела, например, при лечении рака. Этого можно достичь введением остатка(ов) цистеина в Ес-область, что обеспечивает образование дисульфидных связей между цепями в данной области. Гомодимерное антитело, полученное таким способом, обладает улучшенной способностью к интернализации, и/или улучшенными комплемент-опосредованным цитолизом клеток (СМС), и/или антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АЗКЦ) (см например, Сагоп е1 а1., 1. Ехр. Меб. 176:1191-1195 (1992) и 8корех, В. 1. Iттипο1. 148:2918-2922 (1992)). Можно также получить гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью с использованием гетеробифункциональных перекрестно сшивающих агентов (см., например, описанные в Уо1ГГ е1 а1., Сапсег Яехеагск. 53:2560-2565 (1993)). В качестве альтернативы, можно сконструировать антитело, содержащее двойные Ес-области, и тем самым можно повысить способность к СМС и/или АЗКЦ (см, например, 8ΐеνеηхοη е1 а1., АпЦ-Сапсег Эгид Эех1дп. 3:219-230 (1989)).
Иммуноконъюгаты, содержащие антитело человека к интегрину α2, конъюгированное, например, с молекулой, композицией, комплексом или агентом, например цитотоксическим агентом, таким как химикотерапевтический агент, токсин (например, обладающий ферментной активностью токсин бактериального, дрожжевого, растительного или животного происхождения или его фрагменты) или радиоактивный изотоп (например, радиоконъюгат), для нацеливания агента на клетки, ткани или органы, экспрессирующие интегрин α2. Такой иммуноконъюгат можно применять в способе направления объекта или агента к определенному сайту действия, который характеризуется присутствием интегрина α2 или α2β1.
Химиотерапевтические агенты, подходящие для создания таких иммуноконъюгатов, описаны выше. Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Рхеиботопах аегидтоха), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модецина, α-оксипурин, белки А1еигйех Гогби, белки диантина, белки Рку1о1аса атепсапа (РАРЕ РАРП и РАР-δ), ингибитор Мотогбюа Скатала, курцин, кротин, 8араопапа ОГйапайх, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин или трихотхецин. Для получения радиоконъюгированных антител к интегрину α2 доступны различные радиоактивные изотопы. Примеры включают 212В1, ^Л, 90Υ или 186Ке.
- 22 016245
Конъюгаты антитела и цитотоксического агента можно получить с применением разнообразных бифункциональных белок-связывающих агентов, таких как Ы-сукцинимидил-3-(2пиридилдитиол)пропионат (8РРР), иминотиолан (ΙΤ), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат НСЬ), активные эфиры (такие как дисукцинимидил суберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) или биактивные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицина может быть приготовлен, как описано в У1!е!!а е! а1., 8аепсе. 238:1098 (1987). Меченная 14углеродом 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (МХ-РТРА) представляет пример хелатообразующего агента для конъюгации радиоизотопа с антителом (см, например, νθ 94/11026).
В еще одном воплощении антагонист может конъюгировать с рецептором (таким как стрептавидин) для применения в целях предварительного целенаправленного воздействия на клетку, ткань или орган, экспрессирующие α2 интегрин, где конъюгат антитело-рецептор вводят пациенту с последующим удалением несвязанного конъюгата из кровообращения с использованием выводящего агента и затем введением лиганда (например, авидина), который конъюгирован с цитотоксическим агентом (например, радиоизотопом).
Антитела к интегрину α2, описанные здесь, можно также получать в виде иммунолипосом. Липосомы, содержащие антитело, получают методами, уже известными в этой области, как описано в Ерк!еш е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А. 82:3688 (1985); Н\гапд е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А. 77:4030 (1980) и патентах США № 4485045 и 4544545. Липосомы с повышенным временем циркуляции описаны в патенте США № 5013556.
Особенно подходящие липосомы можно получить методом обращенной фазы при выпаривании с липидным составом, включающим фосфатидилхолин, холестерин и ПЭГ-производное фосфатидилэтаноламина (РЕ6-РЕ). Липосомы пропускают через фильтры с определенным размером пор, чтобы собрать липосомы желаемого диаметра. ЕаЬ'-фрагменты антитела к интегрину α2 можно конъюгировать с липосомами, как описано в Магйп е! а1., I. Вю1. Сйет. 257:286-288 (1982), посредством дисульфидной обменной реакции. Внутри липосомы может необязательно содержаться химиотерапевтический агент (например, доксорубицин) (см., например, 6аЬ^ζоη е! а1., I. Ыа!юпа1 Сапсег 1пк!. 81(19):1484 (1989)).
Гуманизированные антитела к интегрину α2 могут также применяться для антителонаправленной фермент-пролекарственной терапии (АРЕРТ) посредством конъюгации антитела с активирующим пролекарство ферментом, который превращает пролекарство (например, пептидильный химиотерапевтический агент, см., например, νθ 81/01145) в активную лекарственную форму (см., например, νθ 88/07378 и патент США № 4975278). Ферментный компонент иммуноконъюгата, полезный для АРЕРТ, включает любой фермент, способный действовать на пролекарство таким образом, чтобы перевести его в более активную форму. Подходящие ферменты включают, но не ограничиваются, такие как щелочные фосфатазы, подходящие для конвертации фосфатсодержащих пролекарственных форм в свободные лекарственные формы; арилсульфатазы, подходящие для конвертации сульфатосодержащих пролекарственных форм в свободные лекарственные формы; цитозин-дезаминазы, подходящие для конвертации нетоксичных 5-фтороцитозинов в противораковый препарат 5-фторурацил; протеазы, такие как внеклеточная протеиназа 8еггаба тагсексепк, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие как катепсины В и Ь), которые подходят для конвертации пептидсодержащих пролекарственных форм в свободные лекарственные формы; Р-аланилкарбоксипептидазы, которые полезны для конвертации пролекарственных форм, которые содержат Р-аминокислотные заменители; ферменты, расщепляющие углеводы, такие как β-галактозидаза и нейраминидаза, подходящие для конвертации гликозилированных пролекарственных форм в свободные лекарственные фомры; β-лактамазы, подходящие для конвертации лекарственных форм, полученных от β-лактамаз, в свободные лекарственные формы; и пенициллин-амидазы, такие как пенициллин-У-амидаза или пенициллин-6-амидаза, подходящие для конвертации лекарственных форм, полезных для перевода препаратов, содержащих аминогруппу, защищенную феноксиацетильной или фенилацетильной группами соответственно, в свободные лекарственные формы. Альтернативно, можно использовать антитела с ферментативной активностью, также известные как абзимы, для превращения пролекарственных форм согласно изобретению в свободные активные препараты (см., например, Маккеу, Ыа!иге. 328:457-458 (1987)). Конъюгаты антитело-абзим для доставки абзима в клетку, ткань или орган, экспрессирующие интегрин α2, можно получить так, как описано далее.
Ферменты могут ковалентно связываться с антителами к интегрину α2 с помощью методов, хорошо известных в этой области, использующих гетеробифункциональные перекрестно сшивающие реагенты, описанные выше. Альтернативным образом, слитые белки, включающие, как минимум, антигенсвязывающую область антитела к интегрину α2, связанную, как минимум, с функционально активной частью фермента, могут быть получены с применением технологии рекомбинантной ДНК, хорошо известной в данной области (см., например, ЫеиЬегдег е! а1., Ыа!иге. 312:604-608 (1984)).
- 23 016245
В некоторых вариантах реализации изобретения может быть желательным применение фрагмента антитела, а не интактного антитела, например, для увеличения проникающей способности в ткань или опухоль. Также может быть желательным модифицировать фрагмент антитела для увеличения его периода полувыведения из сыворотки крови. Этого можно достигнуть введением спасательного эпитопа, связывающего рецептор, во фрагмент антитела, например мутацией соответствующей области во фрагменты антител или введением эпитопа в пептидный таг, который затем сливают с фрагментом антитела в любом конце или в середине, например, путем ДНК или пептидного синтеза (см., например, XVО 96/32478).
Ковалентные модификации гуманизированных антител к интегрину α2 получают, например, химическим синтезом, а также ферментным или химическим расщеплением антитела. Другие типы ковалентных модификаций антител вводятся в молекулу взаимодействием нужных остатков аминокислот антитела с дериватизирующим агентом, способным взаимодействовать с выбранными боковыми цепями или N или С-концевыми остатками. Цистеинильные остатки, например, чаще всего вступают в реакцию с α-галогенацетатами (и соответствующими аминами), такими как монохлоруксусная кислота или хлорацетамид, с образованием карбоксиметильных или карбоксимидометильных производных. Остатки цистеинила также модифицируют реакцией с бромтрифторацетоном, α-бром-β-(5имидазоил)пропионовой кислотой, хлороацетилфосфатом, №алкилмалеинимидами, 3-нитро-2пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, п-хлоромеркуриобензоатом, 2-хлоромеркурио-4нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом. Остатки гистидила, например, модифицируют реакцией с диэтилпирокарбонатом при рН 5,5-7,0, так как этот агент относительно специфичен для гистидиловой боковой цепи. Парабромофенацилбромид также полезен: реакцию предпочтительно проводят в 0,1 М какодилате натрия при рН 6,0. Лизинильные и аминоконцевые остатки, например, взаимодействуют с антигидридами янтарной или других карбоновых кислот. Получение производных с помощью этих агентов производит эффект обращения заряда остатков лизинила. Другие подходящие реагенты для получения производных α-аминосодержащих остатков, такие как метилимидоэфир, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлороборгидриды, тринитробензолсульфоновая кислота, 0-метилизомочевина, 2,4-пентандион, и трансаминазо-катализированная реакция с глиоксилатом. Остатки аргинила, например, модифицируют с помощью реакции с одним или несколькими традиционными реагентами, среди которых фенилглиоксаль, 2,3-бутанодион, 1,2-циклоацетонилацетон и нингидрин. Получение производных остатков аргинина требует, чтобы реакция выполнялась в щелочной среде из-за высокого рКа гуанидиновой функциональной группы. Также эти реагенты могут вступать в реакцию с группами лизина, а также с эпсилон-аминогруппой аргинина. Остатки тирозила, например, специфично модифицируют с определенной целью, а именно для введения спектральных меток в остатки тирозила с помощью реакции с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. Более часто для образования О-ацетилтирозильных производных и 3-нитропроизводных используют №ацетилимидазол и тетранитроимидазол соответственно. Для получения маркированных белков для применения в радиоиммунологическом анализе остатки тирозила йодируют с применением 125Ι или 131Ι. Карбоксильные группы, например аспартил или глутамил, селективно взаимодействуют с карбодиимидами (Я-Ы=С=№Я'), где К. и Я' представляют собой различные алифатические группы, такие как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азониа-4,4-диметилфенил)карбодиимид. Также остатки аспартила и глутамила переводят в остатки аспарагинила и глуминила через реакцию с ионами аммония. Остатки глутаминила и аспартила часто дезамидируютя в соответствующие остатки глутамила и аспартила. Эти остатки дезамидируются в нейтральных или основных условиях. Дезамидированная форма этих остатков также входит в рамки данного изобретения. Другие модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серила или треонила, метилирование α-аминогрупп лизина, аргинина и гистидина в боковой цепи (Т.Е. С^е^дй!οη, Рго!етх: 81гис!иге анб ΜοΕαιΕπ Ргорегйех, №.Н. Егеетаа и Οο., 8ав Ειπη^^, р. 79-86 (1983)), ацетилирование №концевых аминов и амидирование любых С-концевых карбоксильных групп.
Другой тип ковалентных изменений включает химические или ферментативные присоединения гликозидов к антителу. Эти способы предпочтительнее в том, что они не требуют выработки антител в клетке-хозяине, которая имеет возможность N или О-связанного гликозилирования. В зависимости от условий реакции сахар может присоединяться к (а) аргинину и гистидину, (Ь) свободным карбоксильным группам, (с) свободным сульфгидрильным группам, таким как цистеин, (б) свободным гидроксильным группам, таким как серин, треонин или гидроксипролин, (е) ароматическим остаткам, таким как фенилаланин, тирозин или триптофан, или (ί) амидной группе глутамина (см. ^№О 87/05330; Ар1т авб νηχ!οη, СЯС Сп!. Яеν. Вюсйет., р. 259-306 (1981)).
Также можно осуществить удаление любых углеводных остатков на антителах, например химически или ферментативно. Химическое дегликозилирование требует взаимодействия антитела с трифторметансульфоновой кислотой или с эквивалентным соединением. Такая реакция приводит к расщеплению сахаров, кроме связывающего сахара (№ацетилглюкозамин или №ацетилгалактозамин), оставляя антитело нетронутым (см. НаИтиббт, е! а1., Агсй. Вюсйет. Вюрйух. 259:52 (1987); Ебде е! а1., Ληη1.
- 24 016245
Вюсйет., 118:131 (1981)). Ферментативное расщепление углеводных частей на антителах может быть достигнуто при применении разных эндо- и экзоглюкозидаз (см. Тйо1акига е! а1., Ме!1. Епхуток 138:350 (1987)).
Другой тип ковалентного связывания антител включает в себя присоединение антител к одному из многих небелковых полимеров, таких как полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль или полиоксиалкилены (см. патенты США № 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337).
Здесь описаны выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие гуманизированные антитела к интегрину α2, также как векторы и клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, а также рекомбинантные техники получения антител. Для рекомбинантного получения антител выделяют нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, и вводят их в реплицируемый вектор для дальнейшего клонирования (амплификация ДНК) или экспрессирования. Используя известные процедуры, выделяют и секвенируют ДНК, кодирующую антитело (например используя олигонуклеотидные зонды, которые способны специфично связывать гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи антитела). Доступны многие векторы. Компоненты вектора в основном включают, но не ограничиваются, один или несколько следующих элементов: сигнальная последовательность, репликатор, один или несколько маркирующих генов, генусилитель, промотер, последовательность терминации транскрипции.
Антитела к интегрину α2 можно получить рекомбинантно, в том числе и в виде слитого полипептида с гетерологичным полипептидом, который предпочтительно является сигнальной последовательностью, или другим полипептидом со специфичным сайтом расщепления на Ν-конце зрелого белка или полипептида. Предпочтительно выбранной гетерологичной сигнальной последовательностью является та, которую распознает и обрабатывает (например, расщепляет сигнальной пептидазой) клетка-хозяин. Для прокариотической клетки-хозяина, которая не распознает и не анализирует эукариотическую сигнальную последовательность (например, сигнальную последовательность иммуноглобулина), сигнальную последовательность заменяют прокариотической сигнальной системой, которая включает, например, лидерную последовательность пектат лизазы (такой как ре1В), щелочной фосфатазы, очищенного фермента 1рр или термоустойчивого энтеротоксина II. Для секреции дрожжей может применяться дрожжевая сигнальная последовательность, включая, например, лидерную последовательность дрожжевой инвертазы, фактора (включая α-фактор лидерной последовательности 8ассйаготусе§ и К1иутеготусе8) или лидерную последовательность кислотной фосфатазы, лидерную или сигнальную последовательность С.А1Ысап§ д1исоату1а§е, описанные в XVО 90/13646. В отношении экспрессии клеток млекопитающих используют доступные сигнальные последовательности млекопитающих, а также секреторные лидерные последовательности вирусов, например сигнальную последовательность вируса Иегрех 81тр1ех. ДНК для такой прототипной области (например, сигнальной последовательности) лигируют в рамке считывания ДНК, кодирующей антитело к интегрину α2.
Экспрессирующий и клонирующий векторы включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая позволяет вектору реплицироваться в одной или нескольких клетках-хозяевах. Как правило, в клонирующем векторе эта последовательность позволяет вектору реплицироваться независимо от хромосомной ДНК хозяина и включает точку начала репликации или автономно реплицирующиеся последовательности. Такие последовательности хорошо известны для разнообразных бактерий, дрожжей и вирусов. Например, точка начала репликации из плазмиды рВЯ322 подходит для большинства грамотрицательных бактерий, 2 μ точка начала репликации плазмиды подходит для дрожжей и разных вирусов (8У40, полиома, аденовирус, У8У или ВРУ) и полезны для клонирования векторов в клетках млекопитающих. Как правило, компонент точки начала репликации не является необходимым для экспрессирующего вектора млекопитающих (например, точка начала репликации вирус. 8У40 изначально может применяться только из-за того, что включает ранний промотор).
Экспрессирующие и клонирующие векторы могут включать селективный ген, также называемый селектируемым маркером. Типичные селективные гены кодируют белки, которые (а) обеспечивают резистентность к антибиотикам или другим токсинам, например ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, (Ь) дополняют ауксотрофный дефицит или (с) предоставляют незаменимые питательные вещества, недоступные из комплексной среды (например, ген, кодирующий Ό-аланинрацемазу для палочковидных бактерий).
Один пример селективной схемы использует лекарственное средство для задержки роста клеткихозяина. Те клетки, которые были успешно преобразованы гетерологичным геном, производят белок, обеспечивающий резистентность препарату и, таким образом, сохранение режима селективности. В примерах такой доминирующей селективности используют препараты метотрексат, неомицин, гистидинол пуромицин, микофеноловую кислоту и гигромицин.
Другим примером подходящих селектируемых маркеров для клеток млекопитающих являются маркеры, позволяющие идентификацию клеток, способных захватывать нуклеиновые кислоты антитела к интегрину α2, такие как ЭнЕЯ тимидинкиназа, металлотионеин-Ι и -II, предпочтительно гены металлотиона приматов, аденозиндезаминаза, орнитиндекарбоксилаза и т.д.
- 25 016245
Например, клетки, преобразованные селективным геном ОНЕВ, сначала идентифицируют выращиванием всех трансформантов в культуральной среде, которая содержит метотрексат (Μΐχ), конкурентоспособный антагонист ЭНЕК. При использовании ЭНЕК дикого типа клеткой-хозяином является линия клеток яичников китайского хомячка (СНО), лишенная ЭНЕК активности.
В качестве альтернативы, клетки-хозяева (особенно клетки дикого типа, содержащие эндогенный ОНЕВ), трансформированные или ^трансформированные с последовательностями ДНК, кодирующими антитело к интегрину α2, белком ЭНЕК дикого типа и другим селектируемым маркером, таким как аминогликозид-3'-фосфотрансфераза (АРН), можно выбрать путем выращивания клеток в среде, содержащей селективный агент для селектируемого маркера, включая аминогликозидный антибиотик, такой как канамицин, неомицин или 0418 (см. например, патент США № 4965199).
Один подходящий селективный ген, применяемый для дрожжей, - ген !гр1, присутствующий в плазмиде дрожжей УКр7 (8!шсйсотЬ е! а1., №!иге, 282:39 (1979)). Ген 1гр1 обеспечивает селектируемый маркер для мутантного штамма дрожжей, не способных расти в триптофане, например АТСС 44076 или РЕР4-1 (см., например, 1оиек, Оеиебск, 85:12 (1977)). Наличие !гр1-повреждения в геноме клетки-хозяина дрожжей обеспечивает эффективную среду для обнаружения трансформаций, полученных в результате роста в отсутствие триптофана. Точно также Ьеи2-дефицитные штаммы дрожжей (АТСС 20 622 или 38 626) дополнены известными плазмидами, несущими ген Ьеи2.
Кроме того, векторы, полученные из 1,6μ кольцевых плазмид рКЭ1, могут применяться для трансформации дрожжей К1цууеготусек. В качестве альтернативы, система экспрессии для крупномасштабного получения рекомбинантного телячьего химозина описана для К.1асйк у Уаи беи Вегд, Вю/Тесйио1оду, 8:135 (1990). Также были раскрыты устойчивые мультикопии экспрессирующих векторов для секреции зрелого рекомбинантного сывороточного альбумина человека промышленными штаммами К1цууеготусек (см., например, Е1еег е! а1., В1о/Тесйио1оду, 9:968-975 (1991)).
Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно содержат промотор, который распознается организмом-хозяином и является функционально связанным с нуклеиновой кислотой антитела к интегрину α2. Промоторы, подходящие для использования с прокариотическими хозяевами, включают промотор арабинозы (например, агаВ), промотор рйоА, промоторные системы лактозы и β-лактамазы, щелочную фосфатазу, промоторную систему триптофана (!гр) и гибридные промоторы, такие как !ас-промотор. Однако являются подходящими и другие известные бактериальные промоторы. Промоторы для применения в бактериальных системах также будут содержать последовательность Шайн-Дальгарно (8.Ό.), функционально связанную с ДНК, кодирующей антитела к интегрину анти-а2.
Промоторные последовательности известны также для эукариотов. Большинство эукариотических генов имеют АТ-богатую область, расположенную приблизительно на 25-30 оснований выше от сайта инициирования транскрипции. Другая последовательность находится на 70-80 оснований выше от начала транскрипции многих генов в области СNСААТ (8Е0 Ш N0: 115), где N может быть любым нуклеотидом. В 3'-конце большинства эукариотических генов последовательность ААТААА (8Е0 Ш N0: 116) может быть сигналом для дополнения поли-А-хвоста к 3'-концу кодирующей последовательности. Такие последовательности являются подходящими для внедрения в эукариотические экспрессирующие векторы.
Примеры подходящих последовательностей промотора для применения с дрожжевыми хозяевами включают, но не ограничиваются, промоторы 3-фосфоглицераткиназы или другие гликолитические ферменты, такие как энолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируват декарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкоза-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триосефосфатизомераза, фосфоглюкозизомераза и глюкокиназа. Другие промоторы дрожжей, которые являются индуцируемыми промоторами, имеющими как дополнительное преимущество транскрипцию, управляемую условиями выращивания, являются промоторными областями для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, разлагающих ферментов, связанных с метаболизмом азота, металлотионеином, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой, и ферментами, ответственными за усваивание галактозы и мальтозы. Подходящие векторы и промоторы для применения в экспрессии дрожжей описаны также в ЕР 73657. Дрожжевые энхансеры также преимущественно используют с промоторами дрожжей.
Транскрипцию антитела к интегрину α2 из векторов в клетках-хозяевах млекопитающих контролируют, например, промоторами, полученными из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус птичьей оспы, аденовирус (таких как Аденовирус 2), бычий папилломавирус, птичий вирус саркомы, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В или обезьяний вирус 40 (8У40), из гетерологических промоторов млекопитающих, например промотор актина или промотор иммуноглобулина, из промоторов теплового шока при условии, что такие промоторы совместимы с системами клетки-хозяина. Ранние и поздние промоторы вируса 8У40 удобно получают как рестрикционный фрагмент 8У40, который также содержит вирусное начало репликации 8У40. Непосредственный ранний промотор цитомегаловируса человека получают как рестрикционный фрагмент НшбШ Е. Система для экспрессии ДНК в клетках млекопитающих, с использованием бычьего папилломавируса в качестве вектора, раскрыта в патенте США № 4419446, а модификация этой системы описана в патенте США № 4601978 (см. также Кеуек е! а1., №11иге. 297:598-601 (1982) по экспрессии комплементарной ДНК β-интерферона человека в клетках мы
- 26 016245 ши под контролем промотора тимидинкиназы из вируса простого герпеса). В качестве альтернативы, промотор может применяться как длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса.
Транскрипция ДНК, кодирующей антитело к интегрину α2 более высокими эукариотами, часто увеличивается при вставке в вектор энхансерной последовательности. Многие энхансерные последовательности известны сейчас из генов млекопитающих (глобин, эластаза, альбумин, α-фетопротеин и инсулин). Однако часто используют энхансер из эукариотической клетки вируса. К примерам относится 8У40энхансер на зрелой стороне точки начала репликации (Ьр 100-270), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне репликатора и энхансеры аденовируса (см. также, например, Υαηίν. N№1^. 297:17-18 (1982) об энхансерных элементах активации эукариотических промоторов). Энхансер можно сплайсировать в вектор кодирующей последовательности антитела к интегрину α2 по положению 5' или 3', однако предпочтительно его размещают на сайте 5' от промотора. Другие генрегулирующие системы, хорошо известные в данной области (например, индуцируемые системы, такие как тетрациклин-индуцируемые системы и Сепе8^11ск™), могут применяться для контроля транскрипции ДНК, кодирующей интегрин α2.
Экспрессирующие векторы, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (клетках дрожжей, грибков, насекомых, растений, животных, человека или ядерных клетках других многоклеточных организмов), также содержат последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности, как правило, доступны из 5' и иногда из 3' положений нетранслируемых областей эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые как полиаденилированные фрагменты в нетранслируемой части мРНК, кодирующей антитело к интегрину α2. Одним полезным компонентом терминации транскрипции является область полиаденилирования бычьего гормона роста (см., например, №0 94/11026 и экспрессирующие векторы, о которых идет здесь речь).
Клетками-хозяевами, подходящими здесь для клонирования или экспрессии ДНК в векторах, являются прокариотические, дрожжевые или более высокие эукариотические клетки, как описано выше. Подходящие для этой цели прокариоты включают эубактерии, в том числе грамотрицательные или грамположительные организмы, например энтеробактерии такие как ЕкскепсЫа, например Е.со11, Еп1егоЬас1ег, Его1ша, К1еЬк1е11а, РгоГеик, 8а1топе11а, например 8а1топе11а 1урЫтигшт, 8еггайа, например 8еггайа тагсексапк, и 8Ыде11а, а также Вас1Ш, такие как В.киЫШк и В.1юкепйогш18, Ркеиботопак, такие как Р. аегидтока, и 81гер1отусек. Подходящие Е.со11 клонирующие хозяева включают Е.со11 294 (АТСС 31,446), Е.со11 В, Е.со11 Х1776 (АТСС 31,537) и Е.со11 №3110 (АТСС 27,325).
В дополнение к прокариотам, эукариотические микробы, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, являются подходящими клонирующими или экспрессирующими хозяевами для векторов, кодирующих антитела к интегрину α2. Наиболее широко используемыми среди низших эукариотических микроорганизмов-хозяев являются 8ассЬаготусек сегеуШае или обычные пекарские дрожжи. Однако обычно имеются в наличии и используются ряд других родов, видов и штаммов, такие как 8с1и/окасскаготусек ротЬе; Ииууеготусек-хозяева, включая К.1асйк, К.ГгадШк (АТСС 12,424), К.Ьи1дапси8 (АТСС 16,045), К.мчскегати (АТСС 24,178), К.таПп (АТСС 56,500), К.бгокорШагит (АТСС 36,906), К.111егто1о1егап5 или К.татапик; уагготаа (ЕР 402226); РюЫа ракШпк (ЕР 183070); Сапб1ба; ТпсНобегта геек1а (ЕР 244234); Nеи^о8ро^а сгакка; 8ск^апп1отусе8, такие как 8с11\уаппютусе8 осс1беп1а118; и мицелиальные грибы, в том числе Nеи^о8ро^а, РешсШшт, То1урос1абшт, или АкрегдШик-хозяева, такие как А.шби1апк или А.шдег.
Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного антитела к интегрину α2 получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных животных включают клетки растений и клетки насекомых. Были идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы и варианты, а также соответствующие пермиссивные клетки-хозяева насекомых от таких организмов, как 8робор1ега Ггид1регба (гусеница), Аебек аедурй (москит), Аебек а1Ьорю!и8 (москит), ЭгокорШа те1аподак1ег (дрозофила) и ВотЬух топ. Общедоступен ряд вирусных штаммов для трансфекции, например Ь-1 вариант кРУ Аи1одгарка саБГогшса и Вт-5 штамм кРУ ВотЬух топ, такие вирусы применяют, в частности, для трансфекции клеток 8робор1ега Ггид1регба.
Культуры растительных клеток хлопка, зерновых, картофеля, соевых бобов, петунии, помидоров и табака также могут применяться в качестве хозяев.
Однако наибольший интерес вызывают клетки позвоночных животных, поэтому обычной процедурой стало размножение клеток позвоночных, в том числе многочисленных клеток млекопитающих. К примерам полезных клеток-хозяев млекопитающих относятся: линия СУ1 почечных клеток обезьяны, трансформированных 8У40 (например, С08-7, АТСС СВЬ 1651); линия 293 почечных клеток эмбриона человека или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре (см., например, СгаЪат е1 а1., 1. Се η Упо1. 36:59 (1977)); клетки почек детенышей хомячка (например, ВНК, АТСС ССЬ 10); клетки яичника китайского хомячка (СН0), включая СН0 клетки без ЭНЕВ (см., например, ЭНЕВ Иг1аиЬ е1 а1., Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А. 77:4216 (1980)); фолликулярные клетки яичника мыши ((например, ТМ4, МаЛег, Вю1. Вергоб. 23:243-251 (1980)); клетки почек обезьяны (например, СУ1 АТСС ССЬ 70); клетки
- 27 016245 почек африканской зеленой мартышки (например, УЕР0-76, АТСС СРБ-1587); клетки рака шейки матки человека (например, НЕБА, АТСС ССБ 2); клетки почек собаки (например, МОСК, АТСС ССБ 34); клетки печени быка и крысы (например, ВРБ 3А, АТСС СРБ 1442); клетки легких человека (например, ^138, АТСС ССБ 75); клетки печени человека (например, Нер 62, НВ 8065); опухоль молочной железы мыши (например, ММТ 060562, АТСС ССБ51); ТРБклетки (см., например, МаШег е! а1., Аппа1к КУ Асаб. 8с1. 383:44-68 (1982)); МРС5-клетки; Е84-клетки или линия гепатомы человека (например, Нер 62).
Для получения антител к интегрину α2 клетки-хозяева трансформируют описанными выше экспрессирующими или клонирующими векторами и культивируют в традиционно используемой питательной среде, модифицированной надлежащим образом для индуцирования промоторов, отбора трансформантов и/или амплификации генов, кодирующих необходимые последовательности.
Клетки-хозяева, используемые для получения антитела к интегрину α2, могут быть культивированы в ряде сред. Коммерчески доступные среды, такие как среда Хама Е10 (81дта), минимальная поддерживающая среда ((МЕМ), 81дта), РРМБ1640 (81дта) и среда Игла, модифицированная Дульбекко ((ИМЕМ), 81дта), подходят для культивирования клеток-хозяев. Кроме этого, любая из сред, описанных в Нат е! а1., Ме!Б Епх. 58:44 (1979), Вагпек е! а1., Апа1. Вюсйет. 102:255 (1980), патентах США № 4767704; 4657866; 4927762; 4560655 или 5122469; \\'0 90103430; \\'0 87/00195 или патенте США № 30985, может применяться как культуральные среды для клеток-хозяев. Любая из этих сред может быть дополнена, при необходимости, гормонами и/или иными факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, фосфат кальция и магния), буферными растворами (такими как НЕРЕ8), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как гентамицин), следовыми элементами (определяющимися как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микромолярных количествах), а также глюкозой или эквивалентным источником энергии. Также в надлежащих концентрациях могут включаться любые другие необходимые добавки, известные специалистам в данной области. Культуральные условия, такие как температура, рН и подобные, подбираются специалистами в данной области, в том числе такие культуральные условия, которые до этого применялись по отношению к клетке-хозяину для экспрессии.
Антитела к интегрину α2 можно выделять из клеток, включая микробные клетки или клетки млекопитающих с применением, например, хроматографии с участием белка А, ионообменной хроматографии, гидрофобной интерактивной хроматографии, гель-электрофореза, диализа и/или аффинной хроматографии. Пригодность протеина А в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа любого Ес-домена иммуноглобулина, который присутствует в антителе. Белок А можно применять для очистки антител, в основе которых лежат тяжелые цепи γ1, γ2 или γ4 человека (см., например, Бтбтагк е! а1., 1. Iттиηο1. Ме111. 62:1-13 (1983)). Белок 6 полезен для изотипов мыши и для γ3 человека (см., например, 6икк е! а1., ЕМВ0 1. 5:1516-1517 (1986)). Матрицей, с которой связан аффинный лиганд, чаще всего является агароза, однако доступны и другие матрицы. Механически стабильные матрицы, такие как стекло с контролируемым размером пор или полистиролдивинилбензол, позволяют достичь большей скорости потока и меньшего времени обработки, чем при использовании агарозы. Если антитело содержит СН3домен, для его очистки полезно применять ВакегЬопб АВХ™ (ВТ. Вакег, РЫШркЬигд, N.1.). Очистка белков может включать один или более способов, таких как фракционирование на ионообменной колонке, преципитация этанолом, ВЭЖХ с обращенной фазой, хроматография на силикагеле, хроматография на гепарин-сефарозе™, хроматография на анионо- или катионообменной смоле (например, на полиаспарагиновой колонке), хроматофокусирование, электрофорез в полиакриламидном геле (8Э8-РА6Е), осаждение сульфатом аммония и/или гидрофобная хроматография. Например, может быть полезным, следуя любому этапу очистки, подвергнуть смесь, содержащую интересующее антитело и загрязняющие вещества, гидрофобной хроматографии с низким рН, применяя элюирующий буфер с рН в пределах 2,5-4,5, предпочтительно с низкой концентрацией солей (например, от 0-0,25 М).
Композиции антитела к интегрину α2, включая композиции, предназначенные для применения в терапии, готовят для хранения смешиванием антитела, имеющего необходимую степень чистоты, с необязательными физиологически приемлемыми носителями, разбавителями, наполнителями или стабилизаторами (Реттд!оп’к Рйагтасеибса1 8аепсек 164Ь еббюп, 0ко1, А. Еб. (1980)) в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Приемлемые носители, разбавители, наполнители или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатные, цитратные и содержащие другие органические кислоты; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаэкзаметония; хлорид бензаклония, хлорид бензэтония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин, или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гис
- 28 016245 тидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкоза, манноза или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами (например, комплексы Ζη-белок) и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как твин, плуроникс или полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Композиция антитела может также включать более чем одно активное соединение, если необходимо, для особого указания для лечения, предпочтительно таковые с комплементарной активностью, которые не оказывают отрицательного воздействия друг на друга. Может быть желательным применение антитела к интегрину α2 в дополнение к одному или более агентам, на данный момент используемым для предотвращения или лечения рассматриваемого расстройства. Кроме того, может оказаться желательным продолжать вводить иммуноподавляющий агент. Такие соединения пригодно присутствуют в сочетании и в количествах, эффективных для достижения намеченной цели.
Активный ингредиент также может захватываться микрокапсулами, полученными, например, методом коацервации или межфазной полимеризацией, например, микрокапсулами из гидроксиметилцеллюлозы, желатина или полиметилметакрилата, коллоидными системами доставки лекарственных средств (например, липосомами, микросферами альбумина, микроэмульсиями, наночастицами и нанокапсулами) или макроэмульсиями. Такие способы раскрываются, например, в К.етшд1оп'з Рйаттасеийса1 8с1епсез 164Ь ебйюп, Озо1, А. Еб. (1980).
Композиции, которые используют для введения ίη νίνο, должны быть стерильными. Это легко выполнить фильтрованием через стерильные мембраны для фильтрования.
Можно приготовить препараты с замедленным высвобождением. Подходящими примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, причем матрицы имеют подходящую форму, например, такую как пленка или микрокапсулы. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли-2-гидроксиэтилметакрилат или поливиниловый спирт), полиактиды (патент США № 3773919), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и γ-этил-Ь-глутамата, неразлагающийся сополимер этилена и винилацетата, разлагающиеся сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как по технологии Ьиртоп Эеро1™ (микросферы для инъекций, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролидацетата), а также поли-Э-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. В то время как полимеры, такие как сополимер этилена и винилацетата и молочной и гликолевой кислот, способны высвобождать молекулы в течение длительного времени - свыше 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более короткого периода. Когда инкапсулированные полипептиды остаются в организме в течение длительного времени, они могут денатурироваться или агрегироваться в результате воздействия влаги при 37°С, причем в результате утрачивается биологическая активность и возможные изменения иммуногенности. Разумная стратегия может быть рассчитана на стабилизацию, зависящую от заключенного в ней механизма. Например, если обнаруживается, что механизм агрегации является образованием межмолекулярной связи 8-8 через взаимообмен тиодисульфид, стабилизации можно достигнуть путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизацией из кислых растворов, регулированием содержания влаги, применением соответствующих добавок и разработкой определенных составов полимерных матриц.
Антитела к интегрину α2 можно применять в качестве агентов аффинной очистки. В этом процессе антитела иммобилизируют на твердой фазе, такой как 8ерйабех или фильтровальная бумага, применяя методы, хорошо известные в данной отрасли. Иммобилизированное антитело вводят в контакт с образцом, содержащим белок интегрина α2β1 (или его фрагмент), подлежащий очистке, и после этого носитель промывают подходящим растворителем, который удаляет по сути весь материал образца, кроме белка интегрина α2β1, который связан с иммобилизированным антителом. И, наконец, носитель промывают другим подходящим раствором, таким как глициновый буфер с рН 5,0, что приводит к высвобождению белка интегрина α2β1 из антитела.
Антитела к интегрину α2 могут также быть полезными в диагностических анализах на белок интегрина α2β1, например, при определении его экспрессии в конкретных клетках, тканях или сыворотке. Для диагностических целей антитело, как правило, метят обнаруживаемым агентом. Существует много меток, которые можно обычно сгруппировать по таким категориям: радиоизотопы, флуоресцентные метки и фермент-субстратные метки. Радиоизотопы, такие как 358, 14С, 1251, 3Н и 1311, являются подходящими метками. Антитело может маркироваться радиоизотопом, например, с использованием методов, описанных в СиггеШ Рго1осо1з ίη 1ттипо1оду. Уо1итез 1 апб 2, Сойдеп е1 а1., Еб. Абеу-1п1ег5с1епсе. Ыете Уогк, Ν.Υ., РиЬз. (1991), и радиоактивность измеряют, например, с помощью сцинтилляционного счетчика. Флуоресцентные метки, такие как хелаты с редкоземельными элементами (хелаты европия) или флуоресцеином и его производными, родамином и его производными, дансилом, лиссаминовым зеленым, фикоэритрином и техасским красным, тоже могут быть полезны. Флуоресцентные метки можно конъюгировать к антителу, например, используя способы, раскрытые в СиггеШ Рго1осо1з ш 1ттипо1оду, зирга. Флуоресценцию можно определить количественно, например, используя флуориметр. Различные фер
- 29 016245 мент-субстратные метки также полезны (см., например, патент США № 4275149 для обзора). Фермент обычно выступает в роли катализатора химического изменения хромогенного субстрата, которое можно измерить различными способами. Например, фермент может катализировать изменение цвета субстрата, которое можно измерить спектрометрически. И наоборот, фермент может изменять флуоресценцию или хемилюминесценцию субстрата. Способы количественного определения изменения флуоресценции описаны выше. Хемилюминесцентный субстрат переходит в возбужденное состояние под действием химической реакции и может потом выделять свет, который можно измерить (например, применяя хемилюминометр), или отдает энергию флуоресцентному акцептору. Примерами ферментативних меток являются люциферазы (например, люцифераза светлячка и бактериальная люцифераза; патент США № 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малеатдегидрогеназа, уреаза, пероксидаза, такая как пероксидаза хрена (НКРО), алкалинфосфатаза, β-галактозидаза, глюкоамилаза, лизозим, сахаридоксидазы (например, глюкозооксидаза, галактозооксидаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа), гетероциклические оксидазы (такие как уриказа и ксантиноксидаза), лактопероксидаза, микропероксидаза и т.д. Способы конъюгации ферментов к антителам описываются, например, в О'БиПкап е! а1., Ме11юбк £ογ !1е Ргерага!юп ο£ Еπζуте-Аπ!^Ьοбу Εοι·^^!^ &г ике ίπ Епхуте ^тима^иу, ίπ Мебюбк т Епхут. (еб I. Ьапдспе и Н. Уап УипаИк), Асабетк ргекк, Ν.Υ., 73:147-166 (1981). Примерами комбинаций ферментсубстрат служат, например:
(ί) пероксидаза хрена (НКРО) с гидрогенпероксидазой в качестве субстрата, в которой гидрогенпероксидаза окисляет исходный материал красителя (например, ортофенилендиамин (ОРО) или 3,3',5,5'тетраметилбензидина гидрохлорид (ТМВ));
(ίί) алкалинфосфата (АР) с паранитрофенилфосфатом в качестве хромогенного субстрата;
(ίίί) β-Ό-галактозидаза (β-Ό-СаЕ) в качестве хромогенного субстрата (например, р-нитрофенил-β-Όгалактозидаза) и фторогенный субстрат 4-метилумбеллиферил-β-^-галактозидаза. Имеется ряд других комбинаций фермент-субстрат, очевидных для специалистов в данной области (см., например, патенты США № 4275149 и 4318980 для общего обзора).
Иногда метка непрямым образом конъюгирует с антителом. Квалифицированному специалисту известны различные методы достижения такого результата. Например, антитело может конъюгировать с биотином и с любой из трех категорий меток, упоминаемых выше, может конъюгировать с авидином, или наоборот. Биотин селективно связывается с авидином, и, таким образом, метка может конъюгировать с антителом непрямым образом. В качестве альтернативы, чтобы достичь непрямой конъюгации метки с антителом, антитело может быть конъюгировано с малым гаптеном (например, дигоксином) и одна из различных типов меток, упоминаемых выше, может конъюгировать с антителом антигаптена (например, антителом к антидигоксину). Таким образом, может быть получена конъюгация метки с антителом.
Антитело к интегрину α2 не обязательно должно быть меченым и его присутствие может быть обнаружено при использовании меченого антитела, которое связывается с антителом к интегрину анти-а2. Антитела к интегрину α2 можно использовать в любых известных методах, таких как анализ конкурентного связывания, прямой и непрямой сэндвич-анализ и иммунопреципитация (см. например, Ζο1ο, Мοποскпа1 Аπ!^Ьοб^ек: А Мапиа1 ο£ Тес11пк|иек. р. 147-158 (СКС Ргекк, 1пс. 1987)). Конкурентный анализ связывания основывается на способности меченого стандартного вещества конкурировать с образцом исследуемого вещества при связывании с ограниченным количеством антитела. Например, содержание белка интегрина α2β1 в испытуемом образце обратно пропорционально содержанию стандарта, который становится связанным с антителами. Для облегчения определения количества связанного стандарта антитела обычно переводят в нерастворимую форму до или после конкурентного взаимодействия с тем, чтобы стандарт и исследуемое вещество, связанные с антителом, можно было легко отделить от стандарта и исследуемого вещества, которые остались несвязанными. Сэндвич-анализ предполагает применение двух антител, каждое из которых способно к связыванию с разными иммуногенными участками или эпитопами исследуемого белка. В ходе сэндвич-анализа образец исследуемого вещества связывают с первым антителом, иммобилизированым на твердофазной подложке, после чего с исследуемым веществом связывают второе антитело, таким образом формируя нерастворимый комплекс из трех составляющих (см., например, патент США № 4376110). Второе антитело может само по себе быть помечено обнаруживаемой группой (например, прямые сэндвич-анализы) или его количество можно определить, используя антитело к антииммуноглобулину, которое помечено обнаруживаемой группой (например, непрямой сэндвич-анализ). Например, одним из типов сэндвич-анализов является иммуноферментный анализ (ИФА), когда исследуемым веществом является фермент.
Для иммуногистохимического исследования образец ткани, включая образец опухоли, может быть свежим или замороженным, парафинированым или законсервированным в формалине.
Антитела к интегрину α2 также можно применять для диагностического анализа ίπ νίνο. Обычно антитело метят радиоактивным изотопом (1ΠΙη, 99Тс, 14С, 131Ι, 125Ι, 3Н, 32Р или 35Б) для того, чтобы локализовать ткань, например раковую, применяя иммуносцинтиографию.
- 30 016245
Для удобства, антитело к интегрину α2 может быть предоставлено в наборе, представляющем собой упакованную комбинацию реактивов с предварительно определенной концентрацией и инструкциями, необходимыми для выполнения диагностического анализа. В случае антитела, меченного ферментом, комплект будет включать необходимые для фермента субстраты и кофакторы (например, предшественник субстрата, который обеспечивает обнаруживаемый хромофор или флуорофор). Другие вспомогательные вещества также могут быть включены в комплект, например, такие как стабилизаторы, буферные растворы (например, блокирующий буфер или лизирующий буфер) и им подобные. Относительные количества различных реактивов, предоставляемых в наборе, могут значительно отличаться, например, для обеспечения концентрации в растворе реактивов, которая существенно повысит чувствительность анализа. Реактивы могут быть предоставлены в виде сухих порошков, обычно лиофилизированных, и могут включать наполнители, которые при растворении, например, обеспечили бы раствор реактива соответствующей концентрации.
Антитело к интегрину α2 можно применять для лечения различных расстройств, связанных с α2β1, как описано для данного изобретения. Антитело к интегрину α2 вводят любым подходящим способом, включая парентеральный, подкожный, внутрибрюшинный, внутрилегочный или интраназальный способы введения. При необходимости, для местного иммунодепрессивного лечения антитело вводят внутрь пораженной ткани (включая орошение или же другой контакт трасплантата с антителом перед трансплантацией). Парентеральное введение включает внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Кроме того, антитело к интегрину α2, соответственно, удобнее вводить посредством пульсовой инфузии, например со снижением дозы антитела. Предпочтение отдают внутривенному или подкожному введению. Способ введения частично может зависеть того, является ли назначение препарата краткосрочным или хроническим.
Для предотвращения или лечения заболевания соответствующая дозировка антитела будет зависеть от типа заболевания, как описано выше, серьезности и протекания болезни, а также от того, назначается антитело к интегрину α2 в профилактических или терапевтических целях, от предыдущего лечения, от истории болезни пациента и реакции на антитело, а также на усмотрение лечащего врача. Антитело соответственно назначают пациенту единовременно или курсами.
В зависимости от типа и серьезности заболевания [от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 15 мг/кг или от приблизительно 0,05 мкг/кг до приблизительно 20 мг/кг] антитела являются начальной дозировкой для введения субъекту, например за один или более прием, или же непрерывной инфузией. Типичная ежедневная дозировка может изменяться от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг или более в зависимости от факторов, упомянутых выше. При повторном введении в течение нескольких дней или более, в зависимости от состояния, лечение продолжают до тех пор, пока не произойдет подавление признаков заболевания. Тем не менее, могут быть полезны и другие режимы дозирования. Специалисты в данной области могут легко отслеживать прогресс такой терапии.
Композицию антитела к интегрину α2 формулируют, подбирают дозировку и вводят в соответствии с имеющейся медицинской практикой. Факторы для рассмотрения в таком контексте включают конкретное заболевание конкретного млекопитающего, клиническое состояние конкретного пациента, причину расстройства, место назначения агента, способ введения, режим введения, результаты фармакологических и токсических исследований и другие факторы, известные практикующим врачам. Терапевтически эффективное количество антитела, необходимое для введения и определяемое с учетом данных факторов, является минимальным количеством, необходимым для предотвращения, облегчения или лечения расстройства, связанного с интегрином α2β1. Такое количество предпочтительно меньше токсической дозы для организма-хозяина или меньше дозы, которая делает его более восприимчивым к инфекциям.
Антитело к интегрину α2 может входить в состав композиции, назначаться в сочетании с другими препаратами или применяться в качестве вспомогательного препарата с одним или более известных агентов для предотвращения или лечения рассматриваемых расстройств, хотя в этом нет необходимости. Например, при ревматоидном артрите антитело можно вводить вместе с глюкокортикостероидом, препаратом Кетюа1б® или любым другим средством, применяемым для лечения ревматоидного артрита. При рассеянном склерозе можно назначать антитело вместе с β-интерфероном, препаратами авонекс, копаксон и другими лекарствами, применяемыми для лечения симптомов и признаков рассеянного склероза. При трансплантации антитело может быть назначено одновременно с или отдельно от иммунодепрессивного агента, описанного выше, такого как циклоспорин А, для модулирования эффекта иммунодепрессанта. Альтернативно или в дополнение к уже сказанному, антагонисты интегрина α2β1 могут быть назначены млекопитающему, страдающему от расстройства, связанного с интегрином α2β1. Эффективное количество других агентов зависит от количества антитела к интегрину α2, присутствующего в композиции, типа расстройства и способа его лечения, а также других факторов, упоминаемых выше. Обычно их используют в тех же дозировках и теми же способами введения, как описано выше, или в количестве от 1 до 99% применяемых отдельно дозировок.
- 31 016245
Представляют изделие, содержащее материалы, включающие антитело к интегрину α2, полезное для лечения расстройств, описанных выше. Изделие включает также контейнер и этикетку. Удобные контейнеры включают, например, бутылки, ампулы, шприцы и пробирки для анализов. Контейнеры могут быть изготовлены из разных материалов, таких как стекло или пластик. В контейнере находится композиция, эффективная для лечения разных состояний, кроме того, он может иметь стерильный доступ (например, в контейнере может быть пакет для внутривенного раствора или ампула с пробкой, которую можно проколоть иглой для подкожных инъекций). Активным агентом в композиции является антитело к интегрину α2. Этикетка на контейнере или внутри него указывает, что композицию используют для лечения предпочтительных состояний. Изделие может дополнительно включать второй контейнер с фармацевтически приемлемым буфером, таким как забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы. В комплект также могут входить другие материалы, необходимые с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы, а также вкладыши с инструкциями для применения.
Принципы, описанные выше, применялись, например, к антителу к интегрину α2, выделяемому гибридомой ВНА2.1 (Напдап е! а1., Сапсег Век., 56(13):3142-9 (1996)). Данное антитело связывается с интегрином α2β1 человека и крысы, но не связывается с его аналогом у мышей. Антитело, продуцируемое гибридомой ВНА2.1, упоминается здесь как ТМС-2206 и является коммерчески доступным от Сйеннсоп (вошедшей в М1Шроге, са!а1од Νο МАВ1998). Анализы проводились ш νίίτο с химерными, в том числе и гуманизированнными, вариантами ТМС-2206. Также были проведены исследования ш νί\Ό с применением ТМС-2206 антител или им подобных, включая антитело, способное распознавать интегрин α2β1 мыши. Приведенные далее примеры иллюстративны и ограничивают настоящее изобретение. Все приведенные цитаты включены в данное описание с помощью ссылок.
Пример 1.
Разработаны и выделены антитела, специфичные к интегрину α2β1. Неизвестные прежде последовательности вариабельной области антител мыши, обозначенных ТМС-2206, выделили из гибридомы ВНА2.1, как описано в настоящем изобретении. УН и У|, кДНК были клонированы из мРНК клеток гибридомы ВНА2.1 с помощью ОТ-ПЦР, используя набор праймеров, соответствующих аминокислотам в Ν-положении вариабельной области тяжелой (УН) или легкой (Уь) цепей, мыши, и второй набор праймеров, соответствующих константным областям тяжелой γ1 и легкой к цепей. Последовательность была определена из кДНК, которая, в свою очередь, была синтезирована из мРНК, выделенной стандартными способами, описанными в этом документе.
Цитоплазматическая мДНК была получена приблизительно из 1 млн (1х106) клеток гибридомы ВНА2.1, экспрессирующих ТМС-2206, с использованием стандартных методик, известных специалистам в данной области. Для отделения поли-(А) мРНК клетки лизировали в 5 М гуанидинтиоционата, смешивали с олиго(бТ) целлюлозой (АтЬюп, ТХ) и инкубировали при комнатной температуре с плавным встряхиванием в течение 60 мин. Поли-(А) мРНК, связанную с олиго(бТ) целлюлозой, осаждали, промывали и затем обрабатывали в промывочной колонке (АтЬюп, ТХ). Колонку центрифугировали при 3000 об/мин, затем РНК элюировали с помощью буферного раствора, содержащего 200 мкл 10 мМ триса, мМ ЭДТА (ТЕ) буфер, при рН 8,0 и осаждали с помощью 0,1 объема 5 М ацетата аммония (ИН4Ас) и 2,5 объемов 100% этанола при -20°С. РНК гранулировали с помощью центрифугирования, сушили и растворяли в воде, обработанной ПЕРС.
кДНК синтезировали из мРНК, выделенной из ВНА2.1, путем обратной транскрипции, инициированной затравками, соответствующими аминокислотам в Ν-положении вариабельной области тяжелой (УН) или легкой (Уъ) цепей мыши, и вторым набором праймеров, соответствующих константным областям тяжелой γ1 и легкой к цепей. Поскольку последовательность антитела ВНА2.1 была неизвестна, использовали коммерческие затравки с вырожденным кодом, соответствующие аминокислотам в Ν-положении вариабельной области тяжелой (УН) или легкой (Уь) цепей мыши (Ыд11! рптег т1х, #27-1583-01 и Неасу Рптег т1х, #27-1586-01, от Атеткйат ВюБшепсеБ), как это показано в табл. 1. Эти затравки описаны для того, чтобы охватить гетерогенную композицию аминокислот в Ν-положении тяжелой или легкой цепи мыши соответственно. Для проведения полимеразний цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) были использованы следующие реагенты (01адеп ВТ Βί!): 0,5 мкг мРНК; 10 мкл 5х буферного раствора ВТ; 2 мкл 10 мМ смеси 6ΝΓΡ; 5 мкл 10 мМ раствора каждой затравки и мкл смеси ферментов в 50 мкл общего объема. Реакцию обратной транскрипции проводили при 50°С в течение 30 мин с последующим шагом активации ПЦР при 95°С в течение 15 мин и заканчивали программой ПЦР, предназначенной для смесей вырожденных праймеров и используемой для усиления вариабельных областей как легкой, так и тяжелой цепей: 94°С в течение 30 с, 56°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин в 28 циклах с конечным прогоном в течение 10 с при 72°С. Последовательные ПЦР реакции применяли для пар праймеров, перечисленных в табл. 2 и синтезированных Ве!тодеп (§ап Э1едо, СА). Все затравки перечислены от 5' к 3'.
- 32 016245
Таблица 1
Название затравки Нуклеотидные последовательности (5Г - 3’)
УНЪ-£ох (ЗЕО Ю № 14) ССАТСеСТСТСТТСССССТЗСТСТТСТ
НС-геу СбСеССАОТССАТАбАС
(ЗЕО ΙΟ № 15)
УЬЪ- £ог ССАТССАТТТТСААСТССАСАТТТТСАС
(ЗЕО Ю № 16)
ЬСк-геу (5Е0 ΙΓ) № 17) СТТССТССАССАТСАСС
Таблица 2
Название затравки Нуклеотидные последовательности (5Г - 3’)
1дк-3 СЗЕО Ю Ν·:27) ТССАСССАССАТССАСАСАСАСАСАСТССТЗСТАТСССТАСТС СТССТСТССС ТТССАССТТССАСТССАСАСеСС
1дк-АЗ (5Е£ Ю ΝΤ28) ААТТСОССТСТССАСТССААССТССААСССАСАССАССАСТАС ССАТАССАСС АСТЗТСТСТСТСТССАТССТ&ЗС
ТМС-2206-г51 (ЗЕО Ю №:22) ССССААТТСАСАССТССАСТТСААССАСТСА
ТМС-22О6“ГЗ ’ (ЗЕр Ю №:23) ССССАТССТТАСОАТСАТТТАССАССАСАСТСССА
ТМС-2206-к5' (ΞΕ2 Ю №;24) ССССААТТСАСААТТТСТТСТСАСССАСТСТ
ТМС-2206-кЗ' (5Е0 ΙΏ №: 25) СеССАТССТТАТСТСТААСАСТСАТТССТСТТСАА
ТМС-22О6УНЫд51/4Гс-За11 (5Е0 Ю №: 29) СТТССТССАС6СТСА6САСАСССТСАСТСАССТ
ТМС22067Ь-ЬКс- 5а11 ’ (5Е0 Ю №: 32) ТССТТТСАТСТССАССТТССТСССАССАСССААССТСАС
ЫдС1/4Гс- 5а11~Е (3Εζ) Ю №: 30) ТСАСССТССАССААССССССАТСЗСТСТТС
Н1дС1/4Ес- ИоЫ-Н ЗЕ<2 Ю №: 31) ААСССААССССССССТТАТСАТТТАСССУСАСАСАСССАСАСС СТСТТ
НКс-За11-Г (ЗЕО Ю №:33) АССААССТССАСАТСАААССААСТСТСССТССАСС
Карра-Е (ЗЕО Ю №:95) ССААСТСТСССТЗСАССАТСТСТСТТ
Карра-ВашН1-Е (ЗЕО ΙΟ №:96) ААТТСООАТССТТАСТААСАСТСТССССТЗТТСААбСТСТТ
ЪКс-ЫоЫ-К 5Е0 ΙΟ- №: 34) ААСССААССССССССТТАТСАКСАСТСТССССТСТТСААССТС ТТ
ТМС-220б7Ьи£- ЬКс-Г (ЗЕО Ιϋ Ν’: 35) АСССТССАССТСАААССААСТСТСССТеС
тмс-ггобуъиъ- ЬКс-К (5Е0 Ιϋ №:36) тсстттсасстссассстсстссс
Продукты ПЦР длиной приблизительно 350 Ьр были получены для УН и для Уъ. Эти продукты ПЦР были выделены из 1% геля агарозы, клонированы в вектор для клонированя рСК2,1-ТОРО (1№1!годеи, СА) и секвенированы.
Секвенирование выполняли на секвенаторе СЕР ΏΝΛ с применением прямых и обратных праймеров М13 (1№1!годеи, СА). Плазмидные ДНК получали из 1,5 мл бактериальных культур с применением набора О|адеи в соответствии с инструкциями производителя. В каждой последовательной реакции ПЦР секвенирования использовали около 300 нг ДНК, обычно в объеме 10 мкл. ДНК денатурировали при 96°С в течение 2 мин и затем смешивали с секвенирующей затравкой в конечной концентрации 0,3 мкМ. К смеси добавляли 4 мкл ЭТС8 Ошск 81аг1 мастер-микса (Весктаи Сои1!ег, Еи11епои, СА) и проводили секвенирование в течение 30 циклов: при 96°С в течение 20 с, при 50°С в течение 20 с и при 60°С в течение 2 мин. Продукты секвенирования осаждали с помощью этанола в присутствии ацетата натрия (МаАс), ЭДТА и гликогена. Осадок дважды промывали с помощью 70% этанола, сушили и повторно растворяли в 20 мкл раствора 8атр1е Ьоайтд 8о1ийои (который входит в состав набора). Восемь отдельных клонов УН и Уъ секвенировали с помощью стандартных методик, и заключительные аминокислотные последовательности УН (8ЕР ГО ЫО: 21) и Уь (8ЕР ГО ЫО: 19) приведены в табл. 3 и 4 соответственно. Последовательности, полученные из всех восьми клонов, были идентичными, за исключением первых одной или двух аминокислот. В клонах Уь с равной частотой появлялись С1и-Аки или С1и-РЬе. В клонах УН с равной частотой появлялись С1и или С1и. Последовательности были сверены с базой данных ВЬА8Т протеинов ЫСВ1 (ЬйрУ/^тете.исЬгшЬ.до^ЬАЗТ/. Уе е! а1., Ыис1е1с аайк Кек., Л11 1:34 ^еЬ 8ег\'ег 1ккие): ν6-9). Все последовательности по запросу (например, УН или Уъ ТМС-2206) были выстроены с помо- 33 016245 щью СЬиЗТАЬ\ (МиШр1е Зециеисе АБдитеи!) на ББρ://с1изΐа1^.^епοте.^ρ/ (А1уаг, Ме1Бобз Мо1 Вю1., 132:221-41 (2000)). Клонированные ДНК-вставки показали лучшее совпадение с тяжелыми ПдС|) и легкими (к) цепями мыши, что и было ожидаемым изотипом. Последовательности клонированных областей УН и Уь свидетельствуют о лидирующей и фланкирующей последовательности константной области, которые были использованы для разработки более точных праймеров для полного клонирования тяжелой и легкой вариабельных областей из гибридомы ТМС-2206 мРНК. Все затравки были синтезированы Кейодеи (Зап О|едо, СА).
Для реклонирования вариабельной области тяжелой цепи использовали пару праймеров УНь для ССАТСССТСТСТТСССССТССТСТТСТ (ЗЕО ΙΌ N0: 14) и НС-ге\
ССССССАСТССАТАСАС (ЗЕО ΙΌ N0: 15; от мыши Есу СН1);
для реклонирования вариабельной области легкой цепи из гибридомы мРНК использовали пару праймеров Уьь:
для ССАТССАТТТТСААСТССАСАТТТТСАС (ЗЕО ΙΌ N0: 16) и ЕСк-ге\
СТТССТССАССАТСАСС (ЗЕО ΙΌ N0: 17), с применением указанных выше условий ПЦР.
Секвенирование продуктов подтвердило, что первых два остатка легкой цепи ТМС-2206 идентичны Б1-0 и Б2-Е, а первыми двумя остатками тяжелой цепи являются Н1-ф и Н2-У. Оставшиеся нуклеотидные последовательности были идентичны тем, которые были клонированы с применением вырожденных смесей праймеров.
Таблица 3
Название ЕИ1 ΗΟϋΚΙ ЕИ2 НС0К2 ЕИЗ НСГОВЗ ЕИ 4
---9---- 11 —
Номер КаЬаО: 1234567890123456789012345 6789012345 67890123456789 012345678901234 67890123456789012АВС3456 78901234 567890АВС1 2 345678901 23
ТМС-2206 νΗ (ЗЕ<2 ГО №:21) СУ<2ЬКЕ5СРОЬУАРЗ<25Ь31ТСТУ5 ΟΕδΙ,ΤΝΥΟΙΗ ИУКОРРСКСЬЕИЬС νΐΗΑΒ0ΕΤΝΥΝ8ΑΕΜ КЬ11ТКОЫ5030УГЬКМЫЗЬС)РОО 8ΑΤΥΓ0ΑΚ ΑΝϋΟνΥΥΑΜϋ Υ Η&26Τ5ντν 33
Таблица 4
Название ГИ1 ЬСБК! ЕИ2 ЕСОК2 ГИЗ ЬСОКЗ ГИ4
Номер КаЬаС: 12345678901234567890123 45678901234 567890123456789 0123456 78901234567890123456789012345678 901234567 8901234567
ТМС-2206 VI, (8Εζ>ΙΟ№:19) ОГУЬТОЗРАГЬЗАЗРСЕКУТМТС 5ΑΝ3-3νΝΥΙΗ ΝΥ<2<2Κ5ΟΤ3ΡΚΚΝΙΥ ΌΤ3ΚΙΛ3 0νρνΚΕ303650Τ3Υ8ΣΤΙ88ΜΕΤΕ0ΑΑΤΥΥ0 20ΗΤΤΝΡΙ.Τ ГСАСТВУЕЬК
Клонированая область Уь составляла 106 аминокислот и УН составляла 119 аминокислот в длину. Как показано в табл. 3 и 4, в клонированных тяжелой (УН) и легкой (Уь) вариабельных областях существуют три СОК (СОК1-3) и четыре каркасных участка (Е\1-4). Каркасные участки и СОК были идентифицированы, основываясь на системе нумерации КаЬа! (КаЬа! е! а1., 1983), за исключением того, что СОК1 тяжелой цепи был определен определителем 0х£огб Мо1еси1аг'з АЬМ как основные остатки с 26 по 35. Программное обеспечение для моделирования антител ТБе 0х£огб Мо1еси1аг'з АЬМ Ббр://реор1е.сгу81.ЬЬк.ас.ик/~иЬсд078/, Магби е! а1., Ргос. №11 Асаб. Зс1 ИЗА, 86, 9268-9272 (1989); Майш е! а1., Ме1боб8 Еп7ущо1., 203, 121-153 (1991); Ребегзеи е! а1., IттипοтеΐБοб8. 1, 126 (1992) и Кеез е! а1., Ιη З1етЬегд М.б.Е. (еб.), Рго1еш З1гис1иге РгебюБои. 0хГогб иикегзйу Ргезз, 0хГогб, 141-172 (1996)) объединяет системы нумерации КаЬа! СОК и гипервариабельного участка СБо1Ыа. Для согласования нумерации ДНК-вставки в каркасных участках и в СОК согласно стандартам называются как положение остатка, за которой следует буква в алфавитном порядке (например, остатки 82А, 82В, 82С вставлены между остатками 82 и 83 тяжелой цепи, как показано в табл. 3). УН и Уь последовательности имеют относительно короткие С0В.3. Существует потенциальный участок гликозилирования (Азр-Зег-Зег, NЗЗ) внутри СОК1 клонированной легкой цепи. Это согласуют с наблюдением о том, что легкая цепь ТМС-2206 имеет молекулярную массу 29 кО согласно ЗОЗ-РАСЕ, которая может быть изменена путем обработки эндогликозидазой до 25 ΕΌ (типичной молекулярной массы легких цепей антитела).
Для подтверждения того, что клонированные последовательности представляют биоактивные УН и Уь антител ТМС-2206, антитело, очищенное от среды гидробиомы, было подвергнуто Эдмановскому вырождающему ^концевому пептидному секвенированию. Полученная аминокислотная последовательность УН и Уь клонов свидетельствовала о вероятном присутствии № концевого глутамина в каждом из них, что повысило возможность ^концевой защиты, возникающей при циклизации ^концевого глутаминового остатка с образованием пироглутамата (рС1и). Таким образом, чтобы удалить любые потенциально циклизованые концевые глутамины, белок подвергали пироглутаматному аминопептидазному расщеплению с применением термоустойчивых ферментов из термофильных Ругососсиз Гипозиз перед ^концевым пептидным секвенированием тяжелых и легких цепей. Очищенный пироглутамат аминопептидазы (0,01 и) из Ругососсиз Гипозиз (З1дта, З1. Ьошз, М0) был восстановлен в 50 мкл расщепляющем буферном растворе (50 мМ гидрофосфата натрия, рН 7,0, 1 мМ ЭДТА и 10 мМ дитиотреитола (ОТТ)). Препарат ТМС-2206 расщепляли обработкой раствором с молярным соотношением пироглутаматаминопептидаза: белок как 1:100 при 95°С в течение 1 ч. Расщепленные белки растворяли с примене
- 34 016245 нием 10% δΌδ-РАСЕ геля (Тб8-д1усте, ВюВаб ^аЬο^аΐο^^е8, Негси1е8, СА) с меркаптоацетатом натрия (0,1 г в 150 мл οί Випптд В и Пег) в верхней емкости. Затем гель был перенесен методом блоттинга на мембрану ΙιηιηοΕί1οι·ι Р РУЭЕ (М^11^рο^е, ВШебса, МА) в гибридизационном буфере ТгапПег ВиППег (10 мМ САРУ рН 10,5, 0,5 г/л ОТТ и 15% метанола) при 250 мА в течение 1 ч. Блот подкрашивали с применением свежего раствора 0,1% понсо 8 в 1% уксусной кислоты. Блот подвергли пептидному секвенированию, где было обнаружено, что 20 из первых 21 ^концевых аминокислот легкой цепи были успешно секвенированы и показали точную идентичность выведенным пептидным последовательностям, полученным в результате клонирования. Это подтвердило идентичность первых аминокислот в клонированной Уъ остатку С1и. Расщепленный пироглутаматом аминопептидозы УН не принес никаких данных о пептидной последовательности.
Пример 2.
Разработаны и получены химерные антитела, обладающие специфичностью к интегрину α2β1, включая химерные антитела мышь-человек. УН- и У|,-области клонированных ТМС-2206, которые описаны в примере 1, применяли для разработки и получения химерных тяжелых и легких цепей соответственно при помощи стандартных техник молекулярного клонирования (см., например, Пособие по молекулярной биологии Самбрука и Рассела - Мο1еси1а^ Вюйду Мапиа1 Ьу ЗатЬгсюк апб Ви88е11, 2001).
Тяжелые и легкие цепи клонировали посредством введения следующих сайтов рестрикции. Затравки, ТМС-2206-Г5' ССССААТТСАСАССТССАСТТСААССАСТСА (8ЕС) ΙΌ N0: 22) и ТМС-2206-г3' ССССАТССТТАССАТСАТТТАССАССАСАС ТСССА (8ЕС) ΙΌ N0: 23), применялись для клонирования тяжелой цепи ТМС-2206 посредством реакции ОТ-ПЦР из матричной РНК (мРНК) гибридомы ВНА2.1, а затравки ТМС-2206-к5' ССССААТТСАСААТТТСТТСТСАСССАСТСТ (8ЕС) ΙΌ N0: 24) и ТМС-2206-к3' ССССАТССТТАТСТСТААСАСТСАТТССТСТТСАА (8ЕС) ΙΌ N0: 25) - для клонирования легкой цепи ТМС-2206. Эти затравки вводили сайты ЕотШ и ВатШ в концевые участки 5' и 3' соответственно, чтобы сделать возможным последующее клонирование клонированных тяжелых и легких цепей в векторы экспрессии млекопитающих рШЕЗЗ-СЕР и рШЕЗЗ-Ох Веб (Скйеск, каталожные номера 632306 и 632420) соответственно. Оба вектора были разработаны для переноса лидерной последовательности Ιβκ \11)Т1)ТЕЕЕ\\'УЕЕЕ\\ЛТС,С18ТС11) (8ЕС) ΙΌ N0: 26).
Для выделения мРНК приблизительно 1 млн клеток гибридомы, экспрессирующих ТМС-2206, осаждали при низкой скорости (10 мин при 800 об/мин), промывали фосфатно-солевым буфером и растворяли в 1 мл тризола ^ηζο^ (Iиν^бοдеи, СА). После интенсивного перемешивания в вортексе взвесь клеток экстрагировали с помощью 0,2 мл хлороформа и после центрифугирования (14,000 об/мин в течение 5 мин при температуре 4°С) надосадочную жидкость переносили в новую пробирку, где осаждалали РНК посредством смешивания с 0,5 мл изопропанола при последующем центрифугировании (14,000 об/мин в течение 10 мин при 4°С). После центрифугирования осадок РНК в пробирке промывали 1 мл 75% этанола и растворяли в 50 мл ОЕРС-обработанной воды.
Реакцию ОТ-ПЦР (набор реактивов 01адеп ВТ) осуществляли, как описано выше, с применением 0,5 мг РНК, 10 мл 5х ВТ буфера, 2 мл 10 мМ смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфата (бЭТР), 5 мл 10 мМ раствора каждого праймера и 2 мкл смеси ферментов общим объемом 50 мл. Продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) расщепляли рестрикционными ферментами ЕтоВ! и ВатШ и очищенные из 1% агарозного геля фрагменты затем лигировали в участки ΒсοΒI/ΒатНI векторов рIΒΒ82-СΕР (тяжелая цепь) и р!ВЕ82-О8 Веб (легкая цепь). Дальнейшие секвенирования вариабельных областей подтвердили, что посредством реакции ОТ-ПЦР не было введено никаких мутаций.
В качестве вектора экспрессии для клонирования химерных, в том числе гуманизированных, молекул антител на основе ТМС-2206 или полученных из ТМС-2206 был выбран рСI-иеο (Рготеда, са^акд N Е1841), как описано ниже. Чтобы уменьшить возможность введения мутаций в константные области посредством ПЦР, кассеты клонирования были получены как для УН-, так и для Уъ-цепей. Сначала ДНК, кодирующую лидерную последовательность Юк (8Е0 ΙΌ N0: 26), клонировали в сайты клонирования Χ1οΙ и ΒсοΒI рСI-иеο, используя олигонуклеотиды Ιβκ-8 (8Е0 ΙΌ N0: 27) и Ιβκ-Λ8 (8Е0 ΙΌ N0: 28), перечисленные в табл. 2, которые были взаимно гибридизированы и затем лигированы непосредственно в XкοI-ΒсοΒI путем расщепления с рСI-иеο в присутствии лигазы Т4. Это обеспечило родительский вектор для всех последующих этапов клонирования. В дальнейшем были получены две кассеты экспрессии: одна - для клонирования в УН-областях, смежных с Ес IдС| человека (кЕс) и вторая - для клонирования в Уь-областях, расположенных выше от константной области каппа-цепи человека (ккс).
Ввиду отсутствия в ЕтоВ^ ХЬа1, НшбШ или 8аП сайтах, которые встречаются в последовательностях Ес Ιβ^ человека (кЕс) или констатной области каппа-цепи (ккс), любые из этих сайтов рестрикции могли быть введены в 5'-концевые части константных областей для облегчения клонирования. 8аб-положение было выбрано в качестве клонирующего, поскольку это свело бы к минимуму число изменений в аминокислотах в вариабельно-константных участках соединения. Для химеры тяжелой цепи введение 8аб-сайта в соединение УН мыши с Вс человека осуществлялось, не вызывая каких-либо изменений в последовательности аминокислот. Сначала УН-фрагмент ΒсοΒI-8а1I был получен посредством ПЦР с применением пар праймеров ТМС-2206-г5' (8Е0 ΙΌ N0: 22) и ТМС-2206УН-кIдС1/4Εс-8а1I
- 35 016245 (8Е0 ΙΌ N0: 29), показанных в табл. 2, для введения 8аИ-сайта рестрикции в 3'-концевую часть последовательности νΗ мыши, используя в качестве образца клонированную тяжелую цепь в векторе рГКЕ8СЕР. Ес ΙβΟ| человека были получены при амплификации [МАСЕ-клона 20688 (ΙηνίΐΐΌ^η, Са!а1од №. 4764519) ДНК при применении праймеров, показанных в табл. 2, ЫдС1/4Ес-8аП-Е (8Е0 ΙΌ N0: 30) и Ыд61/4Ес-№П-К. (8Е0 ΙΌ N0: 31). Два продукта ПЦР расщепляли ЕсоК1/8аЛ и 8аИ/№П соответственно, очищали и лигировали с вектором рСЕпеоЧдк, расщепленным ЕсоЮЖоП. Результирующий вектор получил название рСЕпеоЧдк-ТМС^-ЬЕс.
Для химеры легкой цепи было невозможно создать сайт 8аП без изменения двух аминокислот в соединении ^-кС, Е105Э и Ь106Е Этот процесс осуществлялся посредством получения продукта ПЦР с использованием праймеров, показанных в табл. 2, ТМС-2206-к5' (8Е0 ΙΌ N0: 24) и ТМС-2206V,-ккс8аП (8Е0 ΙΌ N0: 32), для амплифицирования сайта 2206ν2 из плазмиды, рIΚЕδ-^8ВеΦ2-ТМС-2206^С, указанной выше. Продукт ПЦР расщепляли с ЕсоВ1/8аП, выделяли на 1% агарозном геле, очищали с помощью гель-экстракционного набора (ОЛадеп) и лигировали с константной областью Юк легкой цепи человека, амплифицированной из IМАСЕ-клона № 4704496 (АТСС), с применением праймеров 11кс-8аН-Е (8Е0 ΙΌ N0: 33) и ккс-ШБ-В (8Е0 ΙΌ N0: 34), а также вектора рСЕпеоЧдк, описанного выше. Результирующая плазмида получила название рСI-ηеο-Iдκ-ТМС-2206V^-йκс.
Чтобы оценить влияние изменения двух аминокислот в соединении ^-кС на активность антитела, была построена вторая химерная конструкция легкой цепи, которая кодировала родительскую плазмиду химерной конструкции легкой цепи последовательности аминокислот. Сначала V и константные каппаобласти человека амплифицировали с парой праймеров ТМС-2206Ж| \\1-11кс-В и ТМС-2206-к5' (8Е0 ΙΌ N0: 36 и 24) и парой праймеров ТМС-2206^Ш-йкс-Е и ккс-ШБ-В (8Е0 ΙΌ N0: 35 и 34) соответственно с применением вектора рIΚЕ82-^8Κ.еΦ2-Iдκ-ТМС-2206^С, указанного выше, в качестве образца. Затем для связывания двух продуктов осуществляли сплайсинг посредством ПЦР удлинения перекрытия (Ыопоп е! а1., Сепе/ 77(1):61-8 (1989)) с праймерами ТМС-2206-к5' (8Е0 ΙΌ N0: 24) и ккс-ШП-В (8Е0 ΙΌ N0: 34) и конечный продукт ПЦР расщепляли и клонировали в рСЕпеоЧдк.
Чтобы подтвердить, что клонированное химерное антитело мышь-человек имеет такую же специфичность, как исходное моноклональное антитело ТМС-2206, выделенное из гибридомы ВΗА2.1, химерное антитело мышь-человек экспрессировали в клетки 293Е, используя метод кратковременной трансфекции с помощью трансфекционной смеси, состоящей из равных частей ДНК/0рйМЕМ и 293Гесйп/0рйМЕМ (Iην^ΐ^οдеη). Каждый раствор готовили с 0рйМЕМ, предварительно подогретой до комнатной температуры. Смесь ДНК/0рДМЕМ содержала 20 мг экспрессирующей плазмиды тяжелой цепи (ТЦ), 20 мг экспрессирующей плазмиды легкой цепи (ЛЦ) и 0рйМЕМ общим объемом 1,3 мл. Смесь 293Гес1т и 0рйМЕМ содержала 53 мл 293Гесйп и 0рДМЕМ общим объемом 1,3 мл. Смесь 293Гесйп добавляли в смесь ДНК, перемешивали и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. В колбу, содержащую 40 мл клеточной культуры 293Е при 106 клеток/мл, добавляли 2,6 мл трансфекционной смеси. Колбу помещали в термостат при 37°С, 8% С02 и содержимое перемешивали при 120 об/мин. Через 3 дня взвесь клеток центрифугировали и сразу подвергали аффинной хроматографии в присутствии белка А для очистки антитела. Конечный продукт концентрировали, анализировали посредством δΌδ-РАСЕ и определяли концентрацию белка по Лоури.
Чтобы подтвердить, что очищенное химерное антитело мышь-человек имело такую же связывающую активность, как родительское антитело ТМС-2206, очищенное химерное антитело мышь-человек исследовали на его способность блокировать «2β1-интегринмедиаторную адгезию клеток. ΕΗ0 клетки, экспрессирующие интегрин «2 человека (8Е0 ΙΌ N0: 8) и эндогенный β1 хомячка (8уттд1оп е! а1., Л. Се11 Вю1. 120(2):523-35 (1993)), были выделены из колбы с культурой посредством инкубирования в фосфатно-солевом буфере (РВ8) свободном от ионов Са++ и Мд++, содержащем 5 мМ ЭДТА. Затем клетки центрифугировали (1200 об/мин в течение 8 мин в роторе Бекмана ΟΗ 38) и осадок в пробирке после центрифугирования повторно суспендировали в 10 мл КРМЫ640. Во взвесь клеток добавляли 30 мл 17 мМ карбоксифлуоресцеина (СЕ8Е) (Мо1еси1аг РгоЬек, 0В) и смесь помещали в термостат при температуре 37°С на 15 мин. Меченые клетки осаждали при низкой скорости, ресуспендировали в 10 мл КРМЕ 1640 с 0,1% бычьего сывороточного альбумина (В8А) и производили расчеты. Концентрацию клеток приводили к 8х105 клеток/мл и хранили в темноте до начала использования. Покрытый коллагеном планшет (коллаген мышиного хвоста, тип 1; от ВЭ ВюксЛепсек) блокировали по 100 мкл/лунку с 0,1% бычьего сывороточного альбумина (В8А) в фосфатно-солевом буфере (РВ8) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Образцы белка дробно разбавляли в бессывороточной питательной среде и 50 мкл каждой порции разбавленного раствора антитела добавляли к коллагеновому планшету. 50 мкл/лунку меченых клеток затем добавляли в лунку и планшет инкубировали в течение 1,5 ч при температуре 37°С. После промывания клетки растворяли в 0,1% растворе Тгйоп Х-100 и считывали интенсивность флуоресценции (длина волны 485 нм против 535 нм) с помощью ридера Шс!ог2 1420 (Регкт-Е1тег). Клонированная химера ТМС-2206 оказалась сильным ингибитором «^^медиаторной адгезии клеток к коллагену типа 1 и продемонстрировала активность, эквивалентную ТМС-2206, при
- 36 016245 значении ЕС50, равном 1,8 нм по сравнению с 1,2 нм для ТМС-2206 соответственно. В этих экспериментах применение контрольного не давало ингибирования связывания, тогда как применение ТМС-2206 мыши или химерного антитела демонстрировало ингибирование связывания при исследованиях в диапазоне молярной концентрации от 10-11 до 10-6.
Аффинность химерного антитела мышь-человек для иммобилизованного интегрина α2β1 также сравнивали с родительским антителом ТМС-2206 для определения его способности к полному связыванию Еи-меченого ТМС-2206 с а2в1-покрытыми планшетами, например, посредством определения значений К1. Сначала аффинность родительского антитела ТМС-2206 для иммобилизованного интегрина α2β1 определяли посредством равновесного связывания. Лунки в 96-луночном планшете микротитратора покрывали тромбоцитарным а2в1-интегрином (покрытые по специальному заказу тромбоцитами α2β1 человека фирмой СТ[ Шс., VI) и затем блокировали обезжиреным молоком. Для анализа связывания и конкуренции применяли флуоресцентно меченый ТМС-2206 или антитело ^С с изотопной меткой. Для маркирования антител реагентом Еи-№-ГГС приблизительно 2 мг ТМС-2206 или изотопной метки, МОРС-21 (Шт^го^еи) суспендировали и ставили на диализ против фосфатно-солевого буфера (РВЗ; 1,47 мМ Кн2РО4, 8,1 мМ №2нРО4; рн 7,4, 138 мМ №1С1 и 2,67 мМ КС1). После концентрирования в М1сго8ер (отсечка 30-кЭа; Ра11 Ь1Ге 8с1епсе§ при 9500 об/мин (7000х г) в роторе ΙΑ-20 (Весктап ИгЛгитепК Шс.) в течение 20 мин при температуре 4°С) антитела были приведены к 4,0 мг/мл с помощью фосфатно-солевого буфера (РВ8), содержащего конечную концентрацию 100 мМ NаΗСОз, рн 9,3. Смесь МАТ/бикарбонатную (0,250 мл) осторожно переносили в сосуд, содержащий 0,2 мг №-(р-изотиоцианатобензил)диэтилентриамин-№^2^3^3-тетрауксусной кислоты, хелатизированной с Еи3+ (Еи-М-РТС; Регкш Е1тег Ь1Ге Заепсек), и оставляли на ночь при температуре 4°С без перемешивания. Каждую смесь, содержащую меченое антитело, наносили на отдельную колонку РЭ-10 (СЕ Вюкаепсек, Рщса!атау, N1), предварительно уравновешенную с подвижным буфером (50 мМ Тп5. рн 7,4 и 138 мМ №1С1). Фракции (0,5 мл) собирали и анализировали на общий белок (ВгабГогб геадеп!; Вю-Каб ЬаЬога!ог1е8, негси1е8, СА) с помощью планшетного спектрофотометра 8рес1гаМах 384 и на европий после разбавления 1:10,000 в усиливающий раствор ПЕЕЕ^ (Регкш-Е1тег) посредством флуоресценции с временным разрешением (ТКЕ) с помощью многофункционального планшетного спектрофотометра У1с!ог2 (Регкш Е1тег). Фракции, позитивные по наличию белка и европиевой метки, объединяли и наносили на новые колонки РЭ-10, образцы собирали и анализировали на общий белок и содержание европия посредством ТКЕ, калиброванной относительно стандартного раствора европия (Регкш-Е1тег), чтобы подсчитать соотношение изотоп/белок. Флуоресцентно-меченое антитело, Еи-ТМС-2206 или Еиизотопный контроль, затем наносили на блокированные а2в1-интегрином планшеты в объеме 10 мкм/лунку. После инкубирования герметизированных планшетов в течение 1 ч при температуре 37°С, чтобы дать возможность достичь равновесного связывания, по 2 мкм образцов переносили из каждой лунки в новую лунку, содержащую усиливающий раствор ПЕЕЕ^ (100 мкм/лунку; Регкш-Е1тег) для измерения свободного (несвязанного) маркера. Усиливающий раствор ПЕЕЕ^ (100 мкм/лунку) добавляли в пустые лунки для измерения связанного маркера. Планшет встряхивали (при 5-й скорости планшетного шейкера в течение 5 мин при комнатной температуре) и считывали флуоресцентную интенсивность с временным разрешением (ТКЕ) с помощью многофункционального планшетного спектрофотометра У1с!ог2 (Регкш-Е1тег Vа11ас, Вок!оп, МА). Значение Кб подсчитывали по методу Скэтчарда, которое для ТМС-2206 должно составлять 0,374 нм.
Относительную эффективность связывания с иммобилизированным интегрином α2β1 анализировали посредством измерения значений К1 в конкурентном анализе с помощью 100 пМ флуоресцентномеченого Еи-ТМС-2206 в присутствии переменных концентраций немаркированного антитела ТМС-2206 или химерного антитела в качестве конкурирующих веществ, с помощью системы анализа, подобной той, которая описана выше. Тестовые комбинации антител затем наносили на покрытые α2β1интегрином лунки, испытывали в пределах диапазона концентрации от 10-11 до 10-7 М и после заданного времени определяли количество связанного антитела Еи-ТМС-2206. Кривые ингибирования приводили в соответствие с требованиями модели односайтовой конкуренции с помощью программы РгЕш (СгарйРаб, Шс.), чтобы получить значения Κ'50 для вычисления К1 с помощью уравнения ЧенгаПрусоффа (1973) и значения Кб=0,374 нм, указанного выше. Родительское антитело ТМС-2206 демонстрировало К1, равное 0,22±0,04 нм (п=10) по сравнению со значением 0,27±0,07 нм (п=5) для химеры дикого типа (те!). Активность химеры \\1 была соизмерима с активностью химерной формы, имеющей две мутации легкой цепи, введенной посредством создания сайта 8аП (К1 также 0,27 нм), подтверждая, что эти мутации не влияли на активность. В этих экспериментах покрытые бычьим сывороточным альбумином контрольные лунки, которые испытывали с контрольным ^С или ТМС-2206, не демонстировали какое-либо связывание антитела.
- 37 016245
Пример 3.
Были разработаны и получены гуманизированные антитела со специфичностью к α2β1 интегрину. Определены остатки клонированного антитела ТМС-2206, которые содержат участки, определяющие комплементарность (СРВ) тяжелых и легких цепей, и получены следующие гуманизированные варианты. Три области гипервариабельности в пределах менее вариабельных каркасных участков выявлены в вариабельных участках антитела как тяжелой, так и легкой цепей. В большинстве случаев эти гипервариабельные участки соответствуют, но могут выходить за пределы, СРВ-областям. Аминокислотные последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепей ТМС-2206 определены в табл. 3 и 4 соответственно. СРВ и каркасные участки пояснены в целом согласно КаЬа! посредством группирования с другими участками УН и Уь с помощью поиска общей гомологичности на основе базы данных ВБА8Т белков ΝΟΕΙ (ййр://те^те.псЫ.шй.доу/ВЬА8Т/, Υе е! а1., Ыис1е1с аабк Век., й.11. 1:34 ^еЬ 8егуег 1ккие): ν6-9)), за исключением НСРВ1. НСРВ1 были определены с помощью метода АЬМ как совершенно новые остатки от 26 до 35. Программа моделирования антител ОхГогб Мо1еси1аг'к АЬМ (й!1р://реор1е.сгук!.ЬЬк.ас.ик/~иЬсд07к/. Майш е! а1., Ргос. Ν;·ι11 Асаб. δα. И8А, 86, 9268-9272 (1989); Майш е! а1., Ме!йобк Еηζуто1., 203, 121-153 (1991); Ребегкеп е! а1., 1ттипоте1йобк, 1, 126 (1992) и Веек е! а1., 1п 8!етЬегд М.ЕЕ. (еб.), Рго!ет 8!гис!иге Ргебюйоп. ОхГогб Итуегкйу Ргекк, ОхГогб, 141-172 (1996)) объединяет системы нумерации КаЬа! и Сйойиа при определении СРВ-областей. Так, участки СРВ тяжелой цепи определены следующим образом:
НСОК1 аа26- аа35
НСОР2 аа50- аа65
НСОКЗ аа95-аа102
Аналогично, участки СРВ легкой цепи определены следующим образом:
1СОК1 аа24- аа34
Ю0К2 аа50- аа56
1СОКЗ аа89- аа97
Предпочтительно сохранить связывающую аффинность антитела мыши в гуманизированном аналоге. Возможно, предпочтительно выбрать акцепторную молекулу человека, которая имеет общую гомологичность с антителом мыши. Предпочтительными акцепторами человека являются зародышевые структуры человека, поскольку отсутствие соматических мутаций может уменьшать степень иммуногенности, однако отдельные зрелые структуры антител могут также применяться в качестве акцепторных молекул. База данных У-ВА8Е (ййр://Ьаке.шгс-сре.сат.ас.ик) дает полный перечень зародышевых последовательностей тяжелых и легких цепей человека и была применена в качестве источника зародышевых последовательностей человека для сравнения с УН и Уь из ТМС-2206; использовалась также база данных КаЬа! (й!!р://каЬа!баΐаЬаке.сош/, 1ойпкоп, 6. апб νυ Т.Т. (2001), №с1ею Аабк Век., 29, 205-206).
Лунка, сгруппированная с УН ТМС-2206 с тремя из 51 зародышевой последовательности человека в базе данных У-ВА8Е, 4-59, 4-61 и 4-30,4, не имеющих последовательностей, демонстрирует максимальное соответствие в каркасной структуре 3. Отрезки СРВ Н1 и Н2 в 4-59 были идентичны тем, которые свойственны ТМС-2206 УН, и в качестве акцептной структуры выбрана 4-59 (8ЕО ΙΡ NО: 39). Она содержала такой же класс 1 канонической структуры для СРВ Н1 и СРВ Н2, как ТМС-2206 СРВ Н1 и СРВ Н2. Участки СРВ3 и Εν4 УН не включаются в зародышевые последовательности У-ВА8Е, поскольку часть СРВ3 и участки каркасной структуры 4 получены из другого и функционально несцепленного гена, который изменяется во время созревания каждого антитела. Последовательность антитела, САА48104 (NСВI запись: д1/33583/етЬ/САА48104; ййр:/Уте^.псЬ1.п1т.шй.доу/ВЬА8Т) применялась, чтобы обеспечить последовательности СРВ3 и Εν4 для группирования и акцепторную молекулярную последовательность Εν4. Сравнение ТМС-2206 УН с 4-59 и СРВ3 и участков Εν4 последовательности антитела САА48104 приводится в табл. 5.
- 38 016245
Таблица 5
Наименование ГН1 НСОК1 ГИ2 НСОК2
---------1---------2----- ----3----- ----4--------- 5---------6-----
Номер КаЬаР: 1234567890123456789012345 6789012345 67890123456789 0123456789012345
ТМС-2206 (ЗЕО Ю Ν·:21) СУОЬКЕЗбРСЪУАРЗОЗЬЗГТСТУЗ 6Γ3ΕΤΝΥ5ΙΗ итадррсксьЕиьс νΐΚΑΚ(3ΕΤΝΥΝ3ΑΕΜ3
4-59 (3Εβ Ю Ν·:39) ОУОЬОЕЗОРСЬУКРЗЕТЬЗЬТСТУЗ 665Ι3ΞΥΥΗ3 И1К0РРбКСЬЕН1С ΥΙΥΥ3Ε3ΤΝΥΝΡ5ΕΚ5
Наименование ГИЗ НСОКЗ ΓΗ 4
ξξξ^Ζξξξ 8 --- 11 —
Номер КаЬаР: 67890123456789012АВС3456 78901234 567890АВСО Е12 345678901 23
ТМС-2206 (ЗЕО Ю №:21) ΚΙ,ΙΙΤΚϋΝ8030νΓΙ,ΚΜΝ3Ι.0ΡΏΏ ЗАТУЕСАК ΑΝϋΟνΥΥΑΜ-ϋΥ ИСОСТЗУТУ 33
4-59 (ЗЕО ЮН·: 39) КУТХЗУОТЗКЫОГЗЬКЬЗЗУТААО ТАУУУСАК ΗΝ333ΗΥ6ΚΥ ΓϋΥ ИСОСТЬУТУ 55
САА48104 (ЗЕО Ю №: 183) НЫЗЗЗИУСКУ ΓϋΥ ИСОСТЬУТУ 33
Зародышевая последовательность, А14 (8Е0 ΙΌ NО: 37), была одной из 38 последовательностей антитела V,. человека в базе данных У-ВА8Е и была выбрана в качестве акцепторной структуры Уь. А14 находится в семействе УК V и ее ЬСОЯ1 и ЬСПЯ2 группируются в канонические классы 2 и 1 соответственно. ТМС-2206 ЬСОЯ2 являются также классом 1, хотя ТМС-2206 ЬСПЯ1 являются подобными, но не идентичными структуре канонического класса 1. Зародышевые последовательности Уя проходят через СПЯ-Ь3, поэтому выбрана дополнительная последовательность для Εν4 У|, человека. Выбранная последовательность представляет широко применяемый ген структуры 4 для легких цепей каппа-сегмента в зрелых антителах человека (например, введение ААВ24132, NСΒI д1/259596/дЬ/ААВ24132; 1Шр://\ν\ν\ν.ηсЬ^.η1т.η^11.дον/Β^Λ8Т).
Несмотря на то что при введении сайта 8аП, в данной последовательности была произведена замена двух аминокислот во время построения химеры легкой цепи (Έ105Ό и Ό106Ι, которые не влияли на связывание антитела, см. выше), человеческий акцептор легкой цепи Εν4 уже имеет изолейцин в положении 106, поэтому это изменение дало только одну консервативную мутацию аминокислоты (Έ105Ό) в гуманизированных вариантах. Сравнение ТМС-2206 Уъ с А14 и участком Εν4 последовательности антитела ААВ24132 приводится в табл. 6.
Таблица 6
Наименование ΕΉ1 ЬСОК! ЕН2 10’1)32
---------1---------2--- ------з---- -----4--------- 5------
Номер КаЬаР: 12345678901234567890123 45678901234 567890123456789 0123456
ТМС-2206 (ЗЕО Ю В·: 19) ОГУЬТОЗРАЕЬЗАЗРСЕКУТМТС 3ΑΝ3-3νΝΥΙΗ ΗΥ00ΚΞ6ΤΞΡΚΚΗΙΥ ОТЗКЬАЗ
А14 (ЗЕО Ю Ν':37) ОУУМТОЗРАГ13УТРСЕКУТIТС ОАЗЕбТСЦУЬУ НУООКРООАРКЬЫК ΥΑ303Ι3
Наименование ГИЗ ЬСОКЗ ГИ4
___6 7 8- _9 -10------
Номер КаЬаЪ: 7890123456789012345678901 2345678 9012345 67 890123456 7
ТМС-2206 (ЗЕО ЮН·: 19) СУРУКЕ5С3636Т5УЗЬТ155МЕТЕ ϋΑΑΤΥΥΟ ΟΟΗΤΤΝΡ ЬТ ЕбАСТКУЕЬ К
А14 (ЗЕО ЮН·:37) СУРЗКГЗСЗСЗСТОГТЕ,Т133ЬЕАЕ ϋΑΑΤΥΥΟ ΟΟΜΤΤΝΡ ЬТ реосткУЕь к
ААВ24132 (ЗЕО Ю №:184) ООСЫТЬР ИТ Г60СТКУЕ1 к
- 39 016245
Гуманизированные варианты ТМС-2206 были получены из последовательностей СОЯ ТМС-2206 УН и УЪ и человеческих структурных остатков, как описано выше. Чтобы поддерживать надлежащее представление СОЯ, некоторые канонические остатки акцепторных структур (см., например, Ско1к1а е1 а1., 1985, 1992; Онееп е1 а1., 1989; Еоо1е апб Ут1ег, 1992; кйр://реор1е.сгух1.ЬЬк.ас.ик/~иЬсд07х) можно заменить на аналогичные канонические остатки мыши-донора, этот процесс называют обратной мутацией. Табл. 7 и 8 приводят перечень остатков, которые могут влиять на конформацию СОЯ и межцепьевое заполнение соответственно, и показывают разницу между остатками ТМС-2206 УН и УЪ донора и соответствующими остатками акцепторной структуры человека (выделенные жирным курсивом). Остаток Ь46, помеченный звездочкой в табл. 8, может играть определенную роль как в представлении канонической структуры СОЯ, так и в межцепьевом заполнении.
Как показано в табл. 7 и 8, одиннадцать структурных остатков, влияющих на каноническое представление СОЯ, и два остатка, влияющие на межцепьевое заполнение, различаются между акцепторными зародышевыми последовательностями ТМС-2206 донора и А14 и 4-59 человека, при этом остаток Ь46 встречается в обеих категориях. В частности, эти различия являются позициями Н37, Н48, Н67, Н71, Н73, Н78 и Н91 для тежелой цепи и Ь2, Ь4, Ь46, Ь47, Ь49 и Ь71 в вариабельных каркасных участках легкой цепи. Эти остатки были идентифицированы и выбраны в качестве кандидатов для обратной мутации.
Таблица 7
VI. ΥΗ
№ остатка КаЬа1 ТМС2206 А14 акцептор № остатка КаЬа1 ТМС- 2206 4-59 акцептор
2 Е V 2 V V
4 й м 47-49 ОТ, Ь, Θ От, /, с
35-36 ОТ, Υ \Ν, Υ 67 Е V
46-49 к, ОТ, I, Υ ί., к I, к 69 I I
64 с 6 71 К V
66 с с 73 N т
68-69 с, т Θ, Т 78 V Р
71 Υ Р 93-94 А, Р А, К
98 Е Е 103 ОТ ОТ
Таблица 8
VI-
№ остатка КаЬа( ТМС- 2206 А14 акцептор
34 Н Υ
36 Υ Υ
38 0 0
44 Р Р
46* к
87 Υ Υ
89 0 Ω
91 от Θ
96 ь I.
УН
№ остатка КаЬа1 ТМС2206 4-59 акцептор
35 Н 8
37 V /
39 Ω О
45 ί ь
47 ОТ от
91 Е У
93 А А
95 А Н
100с М К
Е Е 103 I ОТ I ОТ * Мутация также воздействует на конформацию СБЯ.
Обратные мутации 13 определенных кандидатов, где 11 имели правильную каноническую структуру, а у двух было межцепьевое уплотнение, были включены в первый человеческий вариант ТМС-2206. В дополнение аминокислотное окончание О было сохранено в человеческой Уъ. Это положение было сохранено и в модели на мышах, так как оно примыкает к Рке на Ь2, что является необычной аминокислотой для такого положения. Эти варианты человеческих легких и тяжелых цепей были названы ТМС2206УН1.0 и ТМС-2206УЯ1.0. Дополнительные человеческие варианты были подготовлены с меньшим количеством обратных мутаций через обращение последовательностей мыши обратно в несущие последовательности человека. Таким образом, были определены несущие последовательности, чувствительные к мутации в человеческие последовательности (с целью сохранения активности антител). Параллельно с этим было выполнено компьютерное моделирование для содействия выбору последовательности-кандидатов для возвращения человеческому прототипу.
Для отображения всех человеческих вариантов были использованы экспрессирующие векторы легкой и тяжелой цепей химеры рСЧ-пео, описанные в примере 1. Версия 1.0 человеческой ТМС-2206 УН (кУН1.0, 8ЕО ΙΌ N0: 40) и версия 1.0 человеческой Уь (кУЪ1.0, 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 41), включающие 14 обратных мутаций, определенных выше, были переведены в нуклеотидную последовательность, оптимизированную для экспрессии клеток млекопитающих с применением программного обеспечения УесЮг ΝΊΊ. Эти последовательности были синтезированы совместно с одноплазмидной конструкцией Яе1годеп (8ап П1едо, СА) и клонированы в области ЕсοЯI и 8аП родительских экспрессионных векторов ТМС-2206 ЬС и НС, заменяя таким образом части УН и У, мыши. В частности, ЕсоШ-^аИ расщепление плазмидной
- 40 016245
ДНК привело к двум фрагментам различного размера, больший из которых ЙУН1.0, а меньший - НУЬ1.0. Эти два фрагмента были затем клонированы в области ЕсоК! и За11 родительских рС1-ТМС-2206 химерных экспрессионных векторов ЬС и НС, заменяя области УН и Уъ мыши соответственно вслед за расщеплением ЕсоК1 и За11 и очисткой гелем большего фрагмента от рС1-пео1дк-ТМС-2206-УС-НЕс и рС1пео1дк-ТМС-2206УЪйкс соответственно. Данная стратегия была применена для подготовки последующих вариантов. Полученная в результате плазмида содержала лидирующий 1дк, оптимальную последовательность, стимулирующую трансляцию, Ко/ак, У-сегмент и человеческий С-сегмент.
Варианты с версией 1.0 человеческой ТМС-2206 УН (8ЕО Ш N0: 40) и версией 1.0 человеческой Уъ (ЗЕО Ш N0: 41), как описано выше, были протестированы на активность через α2β1-интегрин опоследованный тест клеточной адгезии и через конкурентный анализ на связывание с иммобилизированным интегрином α2β1 вместе с химерой и исходным антителом ТМС-2206, как описано в примере 2. Величина К1 для человеческого прототипа, равная 0,32 нМ, сопоставима с измеренной К1 родительского антитела ТМС-2206 (0,21 нМ), а также и с химерой (0,27 нМ), что показывает, что эта первая человеческая версия сохранила связывающую аффинность. Похожим образом, первый человеческий прототип показал сопоставимую ингибирующую активность по отношению к родительскому антителу ТМС-2206, блокируя α2β1-интегрин опосредованную адгезию клеток к коллагену (например, ЕС50 от 1,5 нМ для обоих).
Используя данные, полученные для версии варианта 1.0, была проделана серия мутаций для возврата к человеческим несущим последовательностям УН или У|, с ипользованием методик ПЦР и было определено минимальное количество обратных мутаций (последовательности мыши), чтобы избежать изменения специфичности и аффинности исходного моноклонального антитела ТМС-2206. Желательные человеческие варианты включают те, что сохранили биологическую активность родительского антитела мыши, и также содержат меньшее количество последовательностей мыши, что уменьшает потенциальную антигенность.
Индивидуальные последовательности праймера были синтезированы с помощью 81дта-Сепо5у8, и их секвенированные последовательности приведены в табл. 9. Пары праймеров и матриц, использованные для получения вариантов, показаны в табл. 10 и 11. Реакции ПЦР были осуществлены с применением следующих условий: праймер 1 и 2 (0 конечная концентрация, 6 мкМ), б№ГР (1 мМ конечная концентрация), ДНК матрица (от 1 до 10 нг) и блок 1 РГх полимеразы ДНК (1№Йгодеп, СА) обычно в конечном объеме 50 мкл.
Программа ПЦР состояла из первичной денатурации при 95°С в течение 2 мин, за чем последовало 30 циклов, каждый из которых проходил при 95°С в течение 30 с, при 56°С в течение 45 с и при 68°С в течение 1,5 мин. Завершающий цикл проходил при 68°С в течение 10 мин.
- 41 016245
Таблица 9
Имя прайма Нуклеотидная последовательность (5' - 3’)
ГМНЗ.О-Е (8ΕΩ Ю №:42) АбСОТбеАСАССАОСААОААССАОТТСАСССТСААССТОАС СОТО
ЬУНЗ.О-К (8ΕΩ Ю №:43) ЭТТСТТОСТОСТСТССАСССТСАТССТСАСОССеОАСАТО А0АССССТ6ТТ
п\/Н4.0-Р (δΕΩ Ю №:44) ССТССАбССААеСОССТОСАбТССАТССОСеТСАТАТСО естссссес
ΪΛ/Η4.0-Κ (δΕΩ Ю №:45) СТССАСССССТТСССТССАСССТСОССТАТССАеТСОАТСС ΑΤΑΘΤΤΘΘΤ
ГМ.3.0-Е (δΕΩ Ю №:46) СССААССТССТСАТСТАТСАСАСТТССААОСТС
ГМ-З.О-К (8ΕΩ Ю №:47) АОТСТСАТАСАТСАССАССТТСОССОССТеОТСССССТТС ТС
ήνΐ_4.Ο-Ε (8ΕΩ Ю №:48) : еАССССААТТСАСАССТССТСАТСАСССАСТСТССАеСАТ тесте
ήνΗ2.0-Ρ (8ΕΩ Ю №:49) СТеАССАТСАССААбСАСААСАСС
ГЛ/Н2.0-К (δΕΩ Ю №:50) естеттетссттсстсАтеетсАсессееАСАтеАеАесе стетт
ИХ/Нб.О-Е (8ΕΩ Ю №:51) АтсессотсАТАтессстсесеесттс
ИУН5.0-К (8ΕΩ Ю №:52) ССССССАОСССАТАТСАСеСССАТССАСТССАеССССТТС сстее
ГЛ/Нб.О-Е (δΕΩ Ю №:53) АТАтееестсесеесттсАСАААс
ήνΗ6.0-Κ (δΕΩ Ю №:54) : еТТГОТСААеСССССАССССАТАТ
ГЛ/Н7.0-Е (δΕΩ Ю №:55) ессесесАСАСсессстетАСТАСтссессАСАОссААС сАсеес
ήνΗ7.0-Κ (δΕΩ Ю №:56) етАСТАСАсеесеететссссеесест
ΚνΗ8.0-Γ (δΕΩ Ю №:57) АТАТССААСТАТСеСАТССАСТССеТТ
ΚνΗ8.0-Ρ (δΕΩ Ю №:58) ССАСТеСАТОССАТАеТТеОАТАТеСТАААТССАСАСАСе етАСАеет
Х/Н12.0(К71\/)-Е (δΕΩ Ю №:97) есствАССАтсАвсетееАСААСАесААеААссАеотсА е
\/Н12.0(Κ7ΐν)-Κ (δΕΩ Ю №:98) стсАССтсеттсттестеттетссАССстбАтсетсАесс
νΗ13.0(Ν73Τ)-Ε (δΕΩ Ю №:99) СТеАССАТСАбСААееАСАССАССААСААССАОеТСАССС
νΗ13.0(Ν73Τ)-Κ (δΕΩ Ю №:100) : еестсАсстееттсттестеететссттестсАтеетсАс
νΗ14.0(ν78Ε)-Ε (δΕΩ Ю №:101) θοααθθαοααοαοοααθααοοαθττταθοοτθααθοτθαθ с
νΗ14.0(ν78Ε)-Ρ (δΕΩ Ю №:102) естсАесттсАссстАААСтссттсттестеттетссттсс
ήνί2.0-Κ (δΕΩ Ю №:59) сАесттеоААотстсАТАОАтсААтттсттееесесстее тсесе
ΪΑ/1.5.0-Ε (δΕΩ Ю №:60) сАсесеААттсАеАс тгсетестеАсссАетстссАЗСАТтссте
- 42 016245
Имя прайма Нуклеотидная последовательность (5' - 3')
к/1_6.0-Е (8ΕΩ Ю №:61) САСССОААТТСАСАО ТТССТОАТСАСССАбТСТССАеСАТТССТС
ГЛ/1_7.0-Е (8ΕΩ Ю №:62) ; ОАСССОААТТСАСАСТТСОТСАТОАСССАОТСТССАОСАТ тесте
кМ_8.0-Е (8ЕО Ю №:63) ТТСАССТТСАССАТСАОСАСССТееде
п\Л_8.0-Р (8ЕО Ю №:64) стссАеестестсАтеетеААеетеААСтсеетессест ессестесс
νΗ12.0(К71\0-Е (8ΕΩ Ю №:97) ΘΟΟΤΘΑΟΟΑΤΟΑΘΟΟΤΘβΑΟΑΑΟΑΘΟΑΑΟΑΑΟΟΑΘΘΤΘΑ с
νΗ12.0(Κ7ΐν)-Κ (8ЕО Ю №:98) ; стсАсстеоттсттестоттетссАсестеАтеетсАеес
ЫСОЗ-Е (8ΕΩ Ю №:65) ССААТСААССеТСААСТАСАТТСАСТСе
ЫСОЗ-К (8ЕО Ю №:66) ссАетсААтетАеттсАсесттеАттееесестесАсетс АтеетсАС
1дк-Еог (8ЕО Ю №:67) АстсстестАтееетАстестес
ЫдС1Ес-СН1- К (8ΕΩ Ю №:68) СААСТАбТССТТеАССАСССАС
С1-пео-пг)8сЗ' (8Е0 Ю №:69) тттсАСтесАттстАсттетее
Таблица 10
Варианты νΗ ПЦР праймеры ДЛЯ Фрагмента 1 ПЦР праймеры ДЛЯ Фрагмента 2 ПЦР праймеры ДЛЯ завершения УН
2.0 1дк-Рог и Ь7Н2.0-Р |1УН2.0-Р и Ыд61 РсСН1-К 1дк-Рог и ЫдС1 РсСН1-Е?
3.0 1дк-Рог и МУНЗ.О-К НУНЗ.О-Р и 111д61 РсСН1-Е? 1дк-Рог и ЫдС1 РсСН1-Е?
4.0 1дк-Рог и НУН4.0-К ΕινΗ4.0-Ρ и Ыд<31 РсСН1-К 1дк-Рог и Н1д<31 РсСН1-К
5.0 1дк-Рог и ήνΗ5.0-Ρ НУН5.0-Р и 1т1д<31 РсСН1-Е? 1дк-Рог и Ыд61 РсСН1-Р?
б.О 1дк-Рог и ИУН6.0-Е? МУНб.О-Е и ЫдО1 РсСН1-К 1дк-Рог и ЫдО1 РсСН1-К
7.0 1дк-Рог и ЬУН7.0-К ΕΛ/Η7.0-Ε и ЫдС1 РсСН1-Е? 1дк-Рог и ЫдС1 РсСН1-Е?
8.0 1дк-Рог и ьун8.о-н ΕΛ/Η8.0-Ρ и ЫдО1 ЕсСН1-Е? 1дк-Рог и ЫдС1 РсСН1-Е?
9.0 1дк-Еог и ЬУН7.0-В ΙΛ/Η7.0-Ε и ЫдО1 ЕсСН1-Е? 1дк-Рог и 1г1д<31 РсСН1-Р?
10.0 1дк-Рог и ЬУН7.0-К НУН7.0-Р и ЫдС1 РсСН1-Е? 1дк-Рог и ЫдС1 РсСН1-К
11.0 1дк-Рог и КУН2.0-К ΗνΗ2.0-Ρ и 1т1д<31 ЕсСН1-Н 1дк-Рог и ЫдО1 Ес- СН1-К
12.0 1дк-Рог и УН 12.0-Е? УН 12.0-Е и М1д©1РсСН1-К 1дк-Рог и Ыд61 ЕсСН1-Е?
13.0 1дк-Рог и УН13.0-К УН13.0-Еи ЫдС1ЕсСН1-Р 1дк-Еог и ЫдС1 РсСН1-Р?
14.0 |дк-Рог и УН14.0-Е? УН14.0-Е и Н1дСЭ1 РсСН1-Е? 1дк-Рог и ЫдС1 РсСН1-Е?
- 43 016245
Таблица 11
Варианты νί ПЦР праймеры ДЛЯ Фрагмен та 1 ПЦР праймеры ДЛЯ Фрагмента 2 ПЦР праймеры для завершения VI-
2.0 !дк-Еог и п\Л.2.0Р ήνΐ_2.0-Ε и С1-пеотзсЗ' 1дк-Еог и С1-пеотзсЗ'
3.0 1дк-Еог и ήνΐ_3.0Е! Κνΐ_3.0-Ε и С1-пеотзсЗ' 1дк-Еог и' С1-пеотзсЗ'
4.0 н/д н/д Ηνί4.0-Ε и С1-пеотзсЗ'
5.0 н/д н/д ИУЬб.О-Е и С1-пеотзсЗ'
6.0 н/д н/д ПУЬб.О-Е и С!-пеотзсЗ'
7.0 н/д н/д ίινΐ_7.0-Ε и С1-пеотасЗ'
8.0 1дк-Еог и Ηνΐ.8.0- В ήνί8.0-Ε и СЕпеотзсЗ' 1дк-Еог и С1-пеотзсЗ'
9.0 1дк-Еог и ίινΐ.2.0Р ήνΐ_2.0-Ε и С1-пеотзсЗ' 1дк-Еог и С1-пеотасЗ'
10.0 1дк-Еог и ήνί.8.0В ГМ.8.0-Е и С1-пеотзсЗ' 1дк-Еог и С1-пеотзсЗ'
11.0 1дк-Еог и ПУЬЗ.ОЕ! Κνΐ_8.0-Ε и С1-пеотзсЗ' 1дк-Еог и С1-пеотзсЗ1
12.0 1дк-Еог и \Л.12.0К νί12.0-Ε и СкпеотзсЗ' 1дк-Еог и С1-пеотасЗ1
Табл. 12 показывает варианты УН, а табл. 13 - варианты У|, и сравнивает выбранные человеческие акцепторные конструкции с исходными вариантами УН и Уъ (1,0).
Варианты УН, показанные в табл. 12, включают: 11УН1.0 (8ЕО ГО N0: 21); 11УН2.0 (8Е0 ГО N0: 70); ЙУН3.0 (8ЕЕ) ГО N0: 71); ИУН4.0 (8ЕЕ) ГО N0: 72); ИУН5.0 (8ЕО ГО N0: 73); ИУН6.0 (8НО ГО N0: 74); 11УН7.0 (8ЕЕ) ГО N0: 75); ИУН8.0 (8ЕЕ) ГО N0: 76); ИУН9.0 (8ЕЕ) ГО N0: 77); ИУН10.0 (8ЕЕ) ГО N0: 78); ЬУН11.0 (8ЕЕ) ГО N0: 79); ИУН12.0 (8ЕЕ) ГО N0: 109); ИУН13.0 (8ЕЕ) ГО N0: 110); ИУН14.0 (8ЕЕ) ГО N0: 111).
Варианты Уъ, как показано в табл. 13, включают ЬУЪ1.0 (8Е0 ГО N0: 41); ЬУЪ2.0 (8Е0 ГО N0: 80); ЬУЬ3.0 (8 ЕЕ) ГО N0: 81); ЬУЪ4.0 (8ЕЕ) ГО N0: 82); ЬУЪ5.0 (8ЕЕ) ГО N0: 83); ЬУЪ6.0 (8ЕЕ) ГО N0: 84); ЬУЪ7.0 (8ЕЕ) ГО N0: 85); ЬУЪ8.0 (8ЕЕ) ГО N0: 86); Ι1ΥΕ9.0 (8ЕЕ) ГО N0: 87); ЬУЪ10.0 (8ЕЕ) ГО N0: 88); ЬУЬ11.0 (8ЕЕ) ГО N0: 89); ИУЫ2.0 (8ЕЕ) ГО N0: 108).
Сохраненные последовательности мыши показаны жирным шрифтом. Каждый дополнительно созданный вариант (см. ниже) также показан в табл. 12. Каждый вариант УН1.0, показанный в табл. 12 ниже, имеет такую же последовательность, как и УН1.0 (выделенные с помощью тире [-]), кроме тех случаев, когда показан определенный заменитель аминокислоты, которые изменяют сохраненную последовательность мыши на его человеческий эквивалент. Похожим образом каждый вариант Уъ, показанный в табл. 13, имеет ту же последовательность, что и вариант УЪ1.0, кроме тех случаев, когда указаны определенные заменители аминокислоты.
- 44 016245
Таблица 12
Название РУУ1 СЭК1 РУУ2 СОК2
КаЬа1 ΕΖΕΙ-”1 ____3 ____4 5---------
ТМС-2206 УН 0ν2ΣΚΕ5ΟΡθΣνΑΡ303Ι3Ι ТСТУЗ СЕЗЬТЫУС ΙΗ иукорроксеен ъс νίΜΑΕΟΕΤΝΥΝδ АБМЗ
4-59 УН СУЗЬдЕЗСРСЪУКРЗЕТЬЗЪ ТСТУЗ 003Ι33ΥΥ ИЗ И1Е0РР6КСЪЕИ 10 ΥΙΥΥ303ΤΝΥΝΡ ЗЕКЗ
ΗνΗΙ.Ο СУОЬОЕЗОРСЬУКРЗЕТЕЗЪ ТСТУЗ 0Γ3ΕΤΝΥ0 ΙΗ иуеоррсксеен ЕС νΐΚΑΚ0ΕΤΝΥΝ3 АЪМЗ
КУН2.0
— — —
1-1УН3.0
— — —
КУН4.0
— I- —
КУН5.0
— I- —
КУН6.0
— I- —
КУН7.0
— — —
КУН8.0
— —
КУН9.0
— — —
КУН 10.0
— — —
КУН11.0
— — —
МУН12.0
— —
НУН13.0
— I- —
КУН14.0
— —
Название РУУЗ ΟϋΗ3 РУУ4
КаЬа1 ----7---------8--АВС-------9---- -----10----- -------ц__
ТМС-2206 УН КЬЫТКОЫЗОЗОУГЕКМКЗЬОРООЗАТУГСАК ΑΝϋΟνΥΥΑΜ ΡΥ Νοςοτεντνδδ
4-59 УН ЕУТТЗУОТЗКЫОТЗЬКЕЗЗУТААПТАУУУСАЕ ΗΝ535ΚΥ0ΗΥΓ0Υ ТСС£)СТЬУТУ83
НУН 1.0 ΚΕΤΙ8ΚΟΝ5ΚΝ<2ν3ΕΚΕ55νΤΑΑηΤΑνΥΓ€ΑΚ ΑΝΌΟνΥΥΑΜ ΡΥ ИС<2СТЬУТУЗЗ
КУН2.0
КУНЗ.О
ν ν
КУН4.0
КУН5.0
КУН6.0
КУН7.0
КУН8.0
КУН9.0 ττ
КУН 10.0 σ’
КУН 11.0 ρ
КУН 12.0
КУН 13.0
КУН14.0
V —————— —— X
- 45 016245
Таблица 13
Название ПЛИ СОЯ1 ΕΪΪ2 С0Р2
КаЬа4 1 ΞΞΞΞ-4 5____
ТМС2206 VI ОГУЬТОЗРАРЬЗАЗРСЕ КУТМТС 3 ΑΝ 83 νΝΪΙΗ ΗΥ2ΏΚ3£Τ3ΡΚ КИ1У этзкь АЗ
А14 VI ϋννΜΤΟδ РАЕЪЗντ РСЕ κντιτο 0Α3Ε6Ι6Ν ΥΙυΥ ΗΥΟΟΚΡϋΟΑΡΚ ШК УАЗ 03 13
нуи.о СГУЬТСЗРАЕЬЗУТРСЕ κντιτσ 5ΑΝ55 νΝΥΙΗ ΝΥ£ΏΚΡϋΟΆΡΚ ΚΝΙΥ ЕТЗКЪ АЗ
Κνΐ.2.0 ___ -Ъ— —
κνι.3.0
— — ъь— —
ήνΐ.4.0
___ — —
ήνΐ.5.0
___ — —
ήνΐ.6.0
___ — —
ίινΐ.7.0 Π -Μ — ~ - ___ — —
ήνΐ.8.0
___ — —
ήνΐ-9.0 ___ —к —
ήνΐ-10.0 0__Μ ___ -ь— —
МУИ 1.0 с__м ___ — —
НУН 2.0 0__Μ ___ -Е— —
- 46 016245
Название РУУЗ ΟϋΚ3 РУУ4
КаЬа1 ___6 7 8_ _9 — 10---
ТМС-2206 νί ΘνΡνΚΕ363633Τ3Υ8ΣΤΙ53ΜΕΤΕ ΟΑΑΤΥΥΟ <2£ΗΤΤΝΡΣ Τ ΓΟΑΟΤΕν ЕЬК
А14 VI. СУРЗНЕ’ЗСЗСЗСТОГТГТ183ЬЕАЕ ϋΑΑΤΥΥΟ СОСЫКНРЬ Τ РОСТКУ ΞΙΚ
ΗνΙΙ.Ο 0νΡ3ΚΓ3Θ3Θ3ΘΤϋΥΤΕΤΙ33ΕΕΑΕ ΕΑΑΤΥΥΟ СОНТТЙРЬ Τ ΕΘΟΟΤΚν ΕΙΚ
Ηνΐ.2.0
-
ήνΐ-3.0
- ___
ήνΐ_4.0
- ___
ήνΐ.5.0
- ___
ήνί.6.0
- ___
Ηνΐ-7.0
- ___
πνίδ.ο --------------ρ---------- - ___
Κνΐ.9.0
- ---
НУН 0.0
- ___
НУН 1.0
- ___
НУН 2.0
- ___
Аминокислотная последовательность ТМС-2206 с последовательностями зародышевых линий показали агрегацию последовательностей модели, которая прошла обратную мутацию до эквивалента у мыши в своем первичном человеческом ТМС-2206 варианте (ТМС-2356). Как показывает последовательность, наблюдают две агрегации, которые попадают в рамки Е\У2 и Е\У3 тяжелой цепи, и подобным же образом наблюдают две агрегации, одна из которых расположена в Е\УН а другая - в Е\У2 легкой цепи. Два варианта 11УН и НУЪ, содержащие обратные мутации в сторону человеческих последовательностей в интересующих местах, были вариантами 3.0 и 4.0, которые должны были нести агрегационные мутации, чтобы помочь определить области, в которых могут находиться интересующие последовательности (табл.12 и 13). В дополнение к различиям в последовательностях, описанных в табл. 7 и 8 для области Уъ, область Ь1 была изменена на человеческую посредством Акр в УЪ4.0, так как это обычная последовательность человеческой легкой цепи к. Тяжелые цепи 11УН3.0 и 11УН4.0 прошли котрансфекцию с помощью легких цепей НУЪ3.0 и НУЪ4.0 в различных комбинациях УН/УЪ, и полученные в результате антитела были сравнены с антителами ЬУН1.0/йУЬ1.0, описанными выше для аффинности лигандов, один к одному с немаркированными моноклональными антителами ТМС-2206. В табл. 14, последовательности в версии 1.0 человеческих УН или Уъ, которые были обращены назад в человеческие последовательности, указаны жирным курсивом. Цифры в скобках в табл. 14 показывают изменение активности по сравнению с вариантами НУШ.0, НУЪ1.0.
Таблица 14
\ УН νί\ ЬУН1.0 значения К, [нМ] ИУНЗ.О (Н67, Н71, Н73, Н78) Значения К: [нМ] ИУН4.0 (Н37, Н48) Значения К, [нМ]
κνυ.ο 0,33 12,0 (36х) 0,44 (1,3х)
НУЬЗ.О 0,64 202 1,34
(1.46, ίΑΤ) (1,9х) (631х) (4,2х)
ήνΐ.4.0 1,40 118 2,60
(11,1.2,1.4) (4,2х) (358х) ίΖζθΧ)
- 47 016245
По значениям К1 видно, что изменения в варианте УН 3.0 (при включении человеческих последовательностей в Н67, Н71, Н73 и Н78 получен кластер Εν3) вызвали большое снижение активности в йУН3.0, содержащих антитела; подобным образом снижение было обнаружено для вариантов йУЪ4.0 (при включении человеческих последовательностей в Ь1, Ь2 и Ь4 получен кластер Εν1). Кроме комбинаций антител йУН1.0/йУЪ3.0 и йУН4.0/йУЪ1.0, которые показали изменение в активности в 1,9 и 1,3 раза при сравнении с антителом йУН1.0/йУЪ1.0 соответственно, все оставшиеся комбинации показали уменьшение активности в 4 раза (табл. 14). Эти данные показали, что обратные мутации Н37 (V к Ι) и Н48 (Ь к Ι), обе из которых являются умеренными изменениями аминокислот, были хорошо перенесены. Изменения Ь46 (К к Ь) и Ь47 (V к Ь) последовательностей мыши назад к человеческим последовательностям были перенесены достаточно хорошо в комбинации с йУН1.0, но имели выраженную синергическую побочную реакцию на аффинность антител, если были в комбинации с вариантом йУН3.0.
Исследования различий в последовательностях между конструкциями УН и Уъ человека и мыши, показали, что некоторые из них были с умеренными изменениями. В дополнение к этому было проведено трехмерное компьютерное моделирование УН и Уъ ТМС-2206 мыши, человеческих акцепторных молекул и структур йУН1.0 и йУЫ.0. Чтобы проводить компьютерное моделирование, был проведен поиск ВЬА8Т для определения структур баз данных, близко похожих на ТМС-2206 Уъ и УН. Структура I8Υ6.рбЬ (расщепление 2,0 А) была выбрана для ТМС-2206 Уъ, а структура ЮЮ.рбЬ (расщепление 2,3 А) была выбрана для ТМС-2206 УН. Для человеческой легкой цепи акцепторных молекул А14 была выбрана структура ГСЕТрбЬ (расщепление 1,9 А), а для человеческой тяжелой цепи акцепторных молекул УН была выбрана 4-59, ΙΡΝ0 (расщепление 2,3 А).
Моделирование предсказало, что последовательности мыши, сохранившиеся в человеческой УЫ.0, очевидно будут контактировать с антигеном, кроме двух (Ь1 и Ь4). Модели также показали, что сохранившиеся человеческие последовательности зародышевой модели не вступали в контакт с СРВ, в то время как сохранившиеся последовательности мыши модели обычно скапливались вокруг СРВ.
В У-области тяжелой цепи было определено три области различий между смоделированными областями УН мыши и человека. Первая область представляла собой последовательности Н27-Н33, которые по прогнозам должны контактировать с антигеном и СРВ Н1. Эти последовательности также могут влиять на угол сочленения УЪ/УН и иметь дополнительное влияние на связывание антигенов. Вторая область - это первая петля СРВ Н2, которая может потребовать Εν последовательность Н71. Третья область - СРВ Н3.
Для областей легкой цепи были выделены три зоны различий между смоделированными структурами Уъ мыши и человека. Первая структура была СРВ1, которая на один остаток длиннее в Уъ мыши антитела ТМС-2206. Υ мыши в Ь71 (Ε в А14) оказалась полезной, чтобы компенсировать эту разницу. Вторая область - это петля мыши от Ь40 до Ь43, которая вытолкнута дальше в растворитель по сравнению с человеческой, что указывает на то, что человеческая Ь40-43 может оказаться проблемой, хотя активность первого человеческого прототипа показала, что такие обратные мутации были хорошо перенесены в й1.0. Третья область - последовательности человеческой модели от Ь55 до Ь59, которые были смещены относительно структуры мыши. Остаток Ь73 модели (Ь у мыши, Ε у человека) согласно прогнозам вызвал такую разницу, хотя обратные мутации были хорошо перенесены в йУЪ1.0.
Используя анализ ш кШсо, были предсказаны результаты для определенных последовательностей тяжелых цепей, представлявших интерес, данные суммированы в табл. 15. Похожие результаты для последовательностей легких цепей, представляющих интерес, показаны в табл. 16.
Таблица 15
Остаток Мыши Человека Положение Тип изменения
Н37 V I Возможно в сочленении νΗΛ/Ι_ Умеренный
Н48 ί I Внутренняя, вдали от связующей точки, радом с Н67 Умеренный
Н67 ί V Внутренняя, вдали от связующей точки, радом с Н48 Умеренный
Н71 К V За СОР Н2 остатки Н53-55 Большой
Н73 N т За СЮК Н2, сольватированный, рядом с Н71 Средний
Н78 V Е Контактирует с СОК Н1 остатком Н34, внутренний Большой
Н91 Е Υ В сочленении Х/НЛ/1_ Умеренный
- 48 016245
Таблица 16
Остаток Мыши Человека Положение Тип изменения
1.1 О ϋ За СРП 1_3, сольватированный Умеренный
Ь2 Р V Расширенные контакты с СОР частично сольватированный ьз. Большой
1_4 ί м За СОР 13, частично сольватированный Умеренный
ί.46 к ь В сочленении У/НЛ/1_ Большой
1_47 νν ь VI. внутри, за СОК 1.2 Большой
1_49 Υ к Возможен прямой контакт антигеном с Большой
1_71 Υ Р За СЭК Ь1 Умеренный
Используя анализ ίη кШсо, положения были получены и упорядочены по принципу того, как человеческая замена может повлиять на поведение антитела: Н48, Н67<Н37, Н91<Н73<Н78, Н71. В этом ряду обратная мутация в человеческой модели в положении Н48 согласно прогнозу может быть перенесена лучше всего, а обратная мутация в позициях Н78 или Н71 по прогнозам будет перенесена хуже всего. Похожим образом были упорядочены интересующие позиции в области легкой цепи: Ь1<Ь4<Ь71<Ь2<Ь47<Ь46<Ь49. Обычно такая классификация привязана к величинам К1, полученным в вариантах 1УН3.0, 1УН4.0 и НУЬ-4.0. Однако разница между эффектом замены, предсказанная компьютерным моделированием и наблюдаемыми эффектами построенных вариантов была замечена в активности для варианта НУБ3.0. Например, вариант антитела, составляющий комбинацию между УН1.0/УЪ3.0, показал достаточно хорошую активность, тогда как компьютерные данные предсказывали, что вариант НУБ3.0 даст значительное снижение активности. Влияние сохраненных последовательностей мышиной модели было исследовано дальше через построение дополнительных человеческих вариантов, включая восемь УН и шесть вариантов Уъ, каждый из которых имел одну мутацию от сохраненного мышиного к человеческому эквиваленту. Были измерены относительное влияние этих изменений на активность, табл. 12 показывает варианты УН, а табл. 13 - варианты Уь.
Значения К1, полученные для этих вариантов, показали, что последовательности мыши в Н71, Н78, Ь2 и Ь46 вероятнее всего сохранили максимальную активность, а в Н37, Н48, Н67, Н91, Ь1, Ь4 и Ь71 могли быть изменены в соответствующие человеческие последовательности без значительной потери активности. Используя компьютерное моделирование, изменяя остаток Ь47 у мыши (триптофан, редкий остаток для этого положения в человеческих антителах) и Н73 согласно прогнозам должен был повлиять на связывание антигенов. Однако изменение на человеческий Уа1-Ь47 не оказало значительного влияния на связывание антигенов, а изменение на ТЬг-Н73 вызвало только небольшое смещение (уменьшение в 1,6 раза) по величине К1. Ь49 (тирозин) согласно прогнозам должен был связать антиген через модель ίη 8111со, а изменение на человеческий лизин должно было вызвать значительное изменение в активности. Однако изменение на человеческий лизин для этого положения вызвало только уменьшение активности в 3,3 раза по величине К1.
Значительное изменение было обнаружено в УН при замене Н78 с валина мыши валина на фенилаланин человека, что вызвало уменьшение активности в 70 раз для вариантов 1УН11.0, 11УБ1.0 по сравнению с вариантами 1УН1.0, 11УБ1.0 по величине К1. Моделирование показало, что этот остаток играет роль в канонической структуре НСИВ1. Эти результаты предполагают, что НСИВ1 имеет большое значение в связывании антигенов. Чтобы максимально увеличить активность сохраняют Н71. Изменяя остаток с Ьук на Уа1, получили уменьшение в 6,4 раза в варианте антитела 1УН9.0, 11УБ1.0. В дополнение к этому, среди канонических остатков легкой цепи фенилалин при Ь2 был чувствителен к изменению, как показала значительная потеря в связывающей аффинности, наблюдаемая в варианте 1УЪ4.0 по сравнению в вариантами 1УЪ5.0, 11УБ6.0 и НУЬ-7.0. Компьютерное моделирование показало, что этот Рйе-Ь2 может вступить с обширный контакт с ЬСИВ3. Поиски в базе данных человеческих и антител мыши дополнительно показали, что этот Р1е в положении Ь2 встречается достаточно редко, что предполагает, что он может представлять соматическую мутацию, которая оказывает влияние на связывание антигенов.
Остатки, выбранные после анализа и описанные выше как устойчивые к обратной мутации, были скомбинированы с вариантами 1УН12.0 до 14.0 и вариантами УЪ10.0 до 12.0, а активность этих вариантов была сравнена с исходным моноклональным антителом ТМС-2206 и химерным антителом ТМС-2206 мышь-человек. Результаты показали, что количество остатков мыши в ЙУЪ может быть сокращено до трех (например, Ь2 [Р1е], Ь46 [Ьук] и Ь49 [Туг]), не вызывая никакой потери в активности вариантов. Подобным образом количество остатков в 1УН может быть сокращено от семи до трех (например, Н71 [Ьук], Н73 [Аки] и Н78 [Уа1]), не вызывая статистически значимых изменений в активности и аффинности. Эти результаты собраны в табл. 17.
- 49 016245
Таблица 17
νΗ VI. Изменения обратно в человеческие ЧИСЛО остатков мыши К,(нМ) среднее± 5ϋ ЕСбо(нМ) среднее ±5ϋ
ТМС-2206 МАТ н/д 0,22+0,04 1,18±0,35
Химера н/д 0,26± 0,07 1,66±0,64
1.0 1.0 н/д 14 0,27+0,06 2,70+1,66
1.0 1.00 н/д 14 0,35+0,03 3,00+1,20
12.0 10.0 Н37, Н48, N91, И, Ь4, 1.47 8 0,29±0,05 2,20±0,58
12.0 10.00 Н37, Н48, Н91, И, Ь4, 147 8 0,31±0,05 2,36+1,06
14.0 10.0 Н37, Н48, Н91, Н91,1.1, 1_4, 1_47 7 0,32±0,07 2,90+2,71
14.0 10.00 Н37, Н48, Н91, Н91,1.1, Ь4, 1.47 7 0,29±0,05 2,98+1,98
14.0 12.0 Н37, Н48, Н67, Н91, И, 1_4,1.47,1_71 6 0,38±0,10 2,93+1,37
14.0 12.00 Н37, Н48, Н67, Н91, 11, 1.4, 147, 1.71 6 0,33±0,11 2,95±0,32
[анализ АN0УА совместно с критерием множественного сравнения ЭиппеЦ не показал статистически значимых различий с ТМС-2206 или химерой].
Параллельно, для этих вариантов были сконструированы гомологи, в которых была изменена консенсусная гликозилированная последовательность в ЬСОВЕ Исключение точки гликозилирования (N88 в 088) может быть полезным для последующих работ и развития исследований. Изменение N260 в вариантах кУЪ1.0, кУЪ10.0 и кУЪ12.0 (отмеченное кУЪ10.00 [8Е0 ΙΌ N0: 90], кУЪ10.00 [8Е0 ΙΌ N0: 91] и кУЪ12.00 |8Е0 ΙΌ N0: 92]) было введено в соответствующий вариант У|. с применением пар праймеров, показанных в табл. 18, чьи последовательности показаны в табл. 9. Изменение N260 не имело статистически значимого влияния на активность какого-либо результирующего антитела, как показано в табл. 17. Хотя эта точка гликозилирования встречается в легкой цепи СЭВ1 антитела дикого типа ТМС-2206, данные показывают, что она не играет роли в аффинности функционально блокирующей активности антитела ТМС-2206.
Таблица 18
Вариан ты VI- ПЦР Праймеры Фрагмента 1 ПЦР Праймеры ДЛЯ Фрагмента 2 ПЦР Праймеры Для завершенно й VI.
1.00 !дк-Еог и ЫСОЗ-К ЬЬСОЗ-Е и С1-пео-тзсЗ' 1дк-Еог и СЕпео-тзсЗ’
10.00 1дк-Еог и Н1СЧЗ-К МсцЗ-Е и С1пео-тзсЗ' 1дк-Еог и СЕпео-тзсЗ'
12.00 1дк-Еог и Н1сдЗ-В Н1сцЗ-Р и С1пео-тзсЗ' 1дк-Еог и СЕпео-тзсЗ'
Пример 4.
Человеческие антитела класса у1 несут эффекторные функции, связанные с комплементом и функциями, опосредованными рецептором Ес. Чтобы избежать антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЭСС) и дополнить результаты, специалист в данной области отдаст предпочтение цепи, не имеющей этой функциональности, такой как человеческая константная область у4. Чтобы получить версию у4 УН12.0, УБ10.00 и УН14.0, УБ10.00 антител, последовательность константной области у1 была заменена на последовательность константной области у4 тяжелой цепи УН12.0 и УН14.0, как показано ниже. Последовательность константной области у4 была получена из последовательности СепЬапк К01316. Обе последовательности у1 Ес, полученные из ПЛАСЕ клона 20688, применялись для создания интактных тяжелых цепей антител Ιβ^ в областях кУН и кУЪ, как здесь описано, и у4 Ес, полученная из последовательности К01316, содержат естественный сайт рестрикции Ара! рядом с местом соединения вариабельной и константной областей. Этот сайт был использован для клонирования константной области у4, чтобы заменить константную область у1. Положения рестрикции ВатШ и ШН бы
- 50 016245 ли помещены в точку окончания 3' последовательности, чтобы облегчить субклонирование в экспрессирующий вектор рСЧ-пео. Последовательность γ4 (δΞΟ ΙΌ ΝΟ: 105 и 106) была после этого синтезирована как синтетический ген бе ηονο компанией В1ие Негоп В|о1ес11по1оду (Во1ке11, ХУА). Плазмиду В1ие Негоп В^есйпоЛду, содержащую синтезированную бе пονο константную область ^С4, обрабатывали ΑраI и №1Е фрагмент константной области Ι1<Ό-γ4 очищали гелем и лигировали в рСГ-УНПД обработанный АраЕШО и расщепленной плазмидой рО-УНМД для получения плазмид, кодирующих УН12.0--.4 и УН14.0--.4. Они были скомбинированы, каждая отдельно, с плазмидой рСЧ-УЕ10.00 и трансформированы в клетки СНО. Через четыре дня после трансфекции выращенные супернатанты были собраны и изотипы [дС4 УН12.0, УБ10.00 и УН14.0, УБ 10.00 антител очищены аффинной хроматографией с белком А. Новые временные трансфекции конструктов γ1 этих вариантов были выполнены параллельно.
После элюирования и нейтрализации кислоты ВЭЖХ аналитических количеств показала наличие олигомерных форм высокого порядка в препаратах очищенных белком А. Поэтому была выполнена вторая очистка с помощью гель-хроматографии на 8еркасгу1 δ-300 размера 26/60 для получения монометрической фракции. Для этого колонку 8еркасгу1 δ-300 26/60 предварительно уравновесили 660 мл 8ЕС подвижного буфера (40 мМ НЕРЕδ, рН 6,5, 20 мМ Ь-гистидина, 100 мМ №1С1 и 0,02% Т^ееп-80). Смешанные фракции, содержащие белок, элюированный из колонки с белком А, были загружены (инъекция образца 12,5 мл) через δире^1οοр (Атегхкат Вюхаепсех). Фракции δЕС (5 мл каждая) были собраны при скорости потока 2,0 мл/мин. Фракции, соответствующие монометрической форме (пик элюирования при 168,4 мл), смешали и определяли содержание белка по Лоури.
Используемые в качестве примера ЦЦ антитела имеют γ тяжелую цепь кУН14.0 (δΞΟ ΙΌ ΝΟ: 181) или γ1 тяжелую цепь кУН12.0 (δΞΟ ΙΌ ΝΟ: 182) и легкую цепь кУБ10.0р (δΞΟ ΙΌ ΝΟ: 178). Используемые в качестве примера ЦС4 антитела имеют γ4 тяжелую цепь кУН14.0 (δΞΟ ΙΌ ΝΟ: 174) или кУН12.0 γ4 (δΞΟ ΙΌ ΝΟ: 176) и легкую цепь 11УБ10.00 (δΞΟ ΙΌ ΝΟ: 178). Очищенные антитела были протестированы конкурентным анализом, чтобы сравнить их активность с помощью величин К1, а также методом неспецифической адгезии клеток к коллагену, где активность измерялась как величина ЕС50. Не было отмечено никакой значительной разницы между изотипами разных вариантов, также они не имели значительных отличий от исходного ТМС-2206 МАТ в каждом из способов, как это показано в табл. 19.
Таблица 19
Изотип х/н VI. К(нМ) ЕС50 (нМ)
1дС1/к мыший МЫШИ 0,22 1,03+0,29
ЫдО1/к 14.0 10.00 0,24 1,30±0,10
Ыд61/к 12.0 10.00 0,27 2,20±012
Н1д64/к 14.0 10.00 0,36 2,82±1,04
ЫдС4/к 12.0 10.00 0,27 1,83±0,27
Пример 5.
Влияние анти-а2 на транссудацию нейтрофилов исследовалось на модели перитонита у мышей и крыс. Внутрибрюшинное введение некоторых антигенов, таких как казеин, каррагенан или тиогликолят, вызывает быструю реакцию тучных клеток, которая инициирует острую перитонитную реакцию (Ебе1хоп е1 а1., В1ооб. 103(6):2214-2220 (2004)). Для этого перитонита характерна быстрая инфильтрация нейтрофилов (в пределах нескольких часов), после чего следует более медленная инфильтрация и пролиферация макрофагов (3-5 дней). Таким образом, эта модель впервые применялась для оценивания применения антител к интегрину α2 для функционального предотвращения или уменьшения нейтрофильной реакции.
Модель острого перитонита осуществляли на крысах и мышах. Антитело ТМС-2206 распознает крысиный интегрин α2β1, но не его аналог у мыши. Однако многие ш νί\Ό модели воспалительных моделей осуществляются на мышах и суррогатном анти-а2 антителе. На1/29 (Ркагтшдеп, Вес1оп Оккепхоп, СА, са1а1од № 559987) применялся в модели острого перитонита у мышей.
Животным делались инъекции либо ί/ν, либо ί/р интегрином а2 или антителом изотипного контроля в дозах от 0,1 до 10 мг/кг в течение 15 мин до контрольного заражения, внутрибрюшинно (ί/р) вводили 1 мл либо 9% казеина (мышам), либо каррагенана (крысам) и животных возвращали в клетки на конкретные периоды времени: 3 ч (для мышей) или 5 ч (для крыс) (п=4 на группу). Затем животных умерщвляли галотаном и промывали брюшную полость 5 мл (для мышей) или 10 мл (для крыс) РΒδ, содержащим 5 мМ ЭДТА. Клетки осаждали низкоскоростной центрифугой, повторно суспендировали в 5 мл РΒδ/ЭДТА и аликвоту 100 мкл микроскопировали, при этом наблюдалось, что большинство клеток имеет полиморфно-ядерную морфологию, согласующуюся с нейтрофилами. Клетки в остальной суспензии подвергались центрифугированию для получения промытого клеточного осадка.
- 51 016245
Содержание нейтрофилов определялось измерением уровня активности миелопероксидазы (МРО) (например, Зреуег е! а1., Ат I. Ра!1о1. 163(6):2319-28 (2003)). Осадок клеток из асцитной жидкости был подвергнут ресуспендированию в 500 мкл буфера Кн2РО4 (рн 6,0), содержащего 0,5% гексадецилтриметиламмоний бромид (нТАВ; 81дта-А1бпсЬ, МР). Образцы разрушали ультразвуком на протяжении 60-90 с и центрифугировали при скорости 14,000 об/мин на протяжении 5 мин при температуре 4°С. Производили серийное разведение очищенного супернатанта в соотношении 2:1 путем переноса 50 мкл образца микропипеткой в 50 мкл НТАВ-буфера, находящегося в лунке планшета. Далее, 50 мкл этого раствора из лунки переносились в другие 50 мкл буфера и, таким образом, продолжалась последовательность разбавления. 200 мкл субстратного буфера (50 мМ Кн2РО4 буфер (рн 6,0), содержащий 0,168 мг/мл о-дианизидина и 0,0005% н2О2) добавляли к каждому образцу для инициирования колориметрической реакции, мониторинг которой производился с помощью Мо1еси1аг Эет1се5 планшетного ридера, при длине волны 460 нм. Затем подсчитывали количество единиц ферментативной активности в суспензии исходных клеток (500 мкл промытой клеточной суспензии для каждого отдельного животного). Калибровочная кривая, установленная титрованием нейтрофилы/мл (оценка путем прямого подсчета нейтрофилов) против МРО активности, указывала на сильную линейную корреляцию между количеством единиц и/мл и количеством нейтрофилов/мл в пределах измеряемого диапазона.
Как следует из табл. 20, оба антитела на1/29 и ТМС-2206 к интегрину α2β1 мыши имели заметный эффект на инфильтрацию нейтрофилов в брюшную полость после введения 9% казеина мышам или 1% каррагенана крысам, о чем свидетельствует общая МРО активность, восстановленная в асцитной жидкости. Величина ЕП50, полученная для мышей с на1/29, составляла ~0,07 мг/кг, в то время как ЕЭ50 в отношении ТМС-2206 для крыс составляла ~5 мг/кг. Эта разница совместима частично с относительным сродством человеческого интегрина α2β1 и интегрина α2β1 мыши, по сравнению со сродством антитела на1/29 и интегрина α2β1 мыши, и частично с различиями в антигенах, используемых в крысиных и моделях на мышах (соответственно с каррагенаном и казеином).
Таблица 20
Доза (мг/кг) Содержание миелоперокидазы (11) Средн. ±СОС(5ЕМ) (н)
На 1/29 0,0 44,6 ±10,1 (4)
0,05 28,1 ± 3,4 (3)
Мышь 0,1 13,6 ±0,8 (4) Р<0,01
(9% казеин) 0,5 7,3 ±2,7 (3) Р<0,01
1,0 7,5 ±1,6 (4) Р<0,01
ТМС-2206 0,0 362 ± 49 (5)
5,0 172 ±41 (6) Р<0,01
Крыса 10,0 136 ±24 (5) Р<0,01
(1% каррагенан) 15,0 82 ± 18 (6) Р<0,01
Пример 6.
Исследовалось влияние антител к интегрину α2 в модели с использованием мышей (декстран сульфат-индуцированного колита) воспалительного заболевания кишечника. В этой модели колит у мышей индуцировали путем добавления 5% раствора декстраннатрия сульфата (Ό88) в питьевую воду (Е1коп е! а1., Сак!гоеп!его1оду. 109(4):1344-67 (1995); Еддег В., е! а1., П1де81юп. 62(4):240-8 (2000)). Производилась оценка влияния лечения антителом мыши к интегрину α2β1 на развитие клинических признаков и симптомов колита, а также влияния на инфильтрацию провоспалительных лейкоцитов в толстую кишку.
Мышей линии Ва1Ь/С (наг1ап, ΡΝ) весом 16-21 г помещали парами. Животным давали дистиллированную воду или воду, содержащую 5% сульфат декстраннатрия (Ό88); ДСН ^ше, СА) аб 11Ьйит на протяжении 7 дней. На этом этапе у мышей проявлялась диарея и заметная потеря веса. Структура исследования предполагала применение четырех групп по шесть мышей в каждой; одна предназначалась для интактного контроля, другая - для Ό88 контроля и еще две получали внутрибрюшинные инъекции в дозировке либо 2, либо 5 мг/кг антитела РЗ/2 к интегрину α2 в дни 0, 2, 4 и 6. Мышей умерщвляли на 7 день (через 168 ч после начала приема Ό88). Для определения каких-либо изменений с начала исследования их взвешивали, измеряли длину толстого кишечника, а затем давалась оценка по шкале от 0 до 2, при этом оценку 2 присваивали для наиболее тяжелых состояний: для диареи, кровотечения в толстом кишечнике и ректального кровотечения, а именно:
ректальное кровотечение: количество балов 0=отсутствие видимой крови; 2=видимая кровь; консистенция стула: количество балов 0=нормальная; 1=жидкая; 2=водянистая;
кровотечение толстой кишки: количество балов 0=отсутствие видимой крови; 2=видимая кровь.
Препараты толстой кишки затем обрабатывали для проведения иммуногистохимического исследования. Толстый кишечник, от слепой кишки до прямой кишки, аккуратно удаляли и фиксировали на 2 ч при температуре 4°С в 4% параформальдегиде (РЕА), оставляли на 1 ночь в 20% сахарозе, а затем подвергали быстрой заморозке в ОСТ замораживающей смеси (Тшкие Тек). Нарезали тонкие (толщиной
- 52 016245 мкм) серийные срезы с применением криостата ЬеЛса, сушили воздухом, фиксировали на 2 ч в 3% козьей сыворотке в РВ8 и оставляли на ночь при комнатной температуре в первичном антителе. Применяемые первичные антитела включали крысиные антимышиные СЬ11Ь/тас-1 (маркер для макрофагов и активированных нейтрофилов, клон М1/70, ВО-РЬагтЛпдеп), антимышиные СЭ3 хомяка (маркер Т клетки, ВО-РЬагттдеп) и клонированные Е4/80 (маркер макрофагов, Кекеагск ЦЛадпокйск, Шс). Затем препараты промывали, инкубировали 2 ч в соответствующем вторичном антителе с А1еха 488- или ТК1ТСметкой (Мо1еси1аг РгоЬек, 0В), промывали три раза в течение 5 мин в РВ8 и помещали в среду Vес1акЫе1Ф, содержащую ОАИ ШесЮг ЬаЬк, СА). Участки рассматривались под поверхностным флуоресцентным микроскопом ЬеЛса, соединенным с камерой 8ро1 ВТ (Векеагск ЦЛадпокйск). Интенсивность флуоресценции и количество флуоресцентных клеток в выбранной зоне интереса (Η0Ι), которая очерчивала зону между ЛатЛпа ргоргЛа и верхушками ворсинок, но исключала серозную поверхность (высокая флуоресцентность) и кишечные просветы, в целом, из 5 полей обзора на пяти отдельных участках, были количественно измерены для каждого животного с применением программного обеспечения ИпадеРго (МеФЛа СуЬегпесЛЛск, МО).
Как показано в табл. 21, лечение антителом к интегрину α2 мыши имело статистически существенный обратный эффект дозы на потерю в весе и консистенцию стула, обусловленных подкормкой Ό88. В обеих группах, получавших лечение (2 и 5 мг/кг), было отмечено существенное влияние на ректальное кровотечение и кровотечение в толстой кишке, но не наблюдалось значимого влияния на укорочение толстой кишки, вызванное развитием колита. Лечение также соотносилось с заметным уменьшением количества инфильтрующих лейкоцитов (данные не показаны).
Таблица 21
Вода 058
Физиологический раствор 2 мг/кг анти-а2 5 мг/кг анти-а2
Увеличение веса (гм) 3,02 ± 1,19 -9,16 ±0,63 -0,44 ± 0,81*** -2,30 ± 0,64**
Длина толстой кишки (см) 7,43 ± 0,26 5,22 ±0,17 5,35 ± 0,17 5,32 ± 0,43
Ректальное кровотечение 0 1,67 ±0,21 0,83 ± 0,31 0,83 ± 0,31
Кровотечение толстой кишки 0 1,0 ±0,45 0* 0*
Конситенция стула 0 1,0 ±0,0 0,50 ± 0,22* 0,17 + 0,17**
*р<0,05 **р<0,01
В другом исследовании влияние интегрина α4 (клон Р8/2; 8оиЛкет ВЛоЛеск, АЬ), интегрина α2 (клон Ηη 1/29, ВО РкагтЛпдеп, СА) и интегрина α1 (клон Ш8/31; ^ЛЛгодеп, СА) анализировалось в сравнении с мышами, которым давали только Ό88 (п=8 на группу). Доза вводимых антител составляла 5 мг/кг. В литературе имеются данные, что эти антитела, блокирующие функцию интегрина, модулируют экспериментальный колит (КгЛедеЛкЛеЛп е! а1., Л. С1ш Етсек!. 110(12):1773-82 (2002); ЖаЛапаЬе е! а1., Ат. Л. РНукЛо) СакЛгоЛпЛекЛ ЬЛуег РкукЛоЛ, 283(6):С1379-87 (2002)). Как показано в табл. 22, три антитела к интегрину ассоциируются с полным отсутствием укорочения толстой кишки, однако только лечение анти-а2 антителами было отмечено в связи с существенным улучшением консистенции стула (диареи). Лечение с применением как анти-а2, так и анти-а4 привело к существенному улучшению в отношении кровотечения толстой кишки. В этом исследовании ни одно из лечений антителами не оказывало заметного влияния на потерю веса. Когда оценили количества резидентных Т-клеток, макрофагов и нейтрофилов путем непрямой иммунофлуоресценции с применением анти-СР3, Е4/80 и анти-Мас1 (как описывалось выше), три группы, которые подвергались лечению антиинтегрином, как свидетельствует табл. 23, проявили существенное уменьшение по сравнению с контрольной группой, которой давали физиологический раствор. Эти данные подтверждают вывод, что антагонизирующая а2-функция имеет сильный эффект на устойчивые уровни состояния этих имунноэффекторных клеток, накапливающихся в воспаленной толстой кишке в ответ на воздействие Ό88, и такие изменения согласуются одновременно с улучшением в клинических симптомах, связанных с колитами.
- 53 016245
Таблица 22
Вода 053
Клинические симптомы Физиологический раствор Анти-а2 Анти-а1 Анти-а4
Увеличение веса (гм) 7,10 ± 0,70 -1,67±0,76 -1,10 ± 1,69 -0,43 ± 1,17 1,62 ± 0,69
Длина толстой кишки (СМ) ' 7,43 ± 0,26 4,73 ±0,16 6,08 ± 0,25** 5,85 ± 0,22** 5,92 ± 0,09**
Ректальное кровотечение 0,0 2,00 ±0,21 0,50 ± 0,33* 0,50 ± 0,33* 0,83 ± 0,31
Кровотечение толстой кишки 0,0 1,5 ±0,33 0,25 ± 0,25** 0,75 ± 0,37 0,00**
Конситенция стула 0,0 1,0 ±0,0 0,38 ± 0,182* 0,63 ± 0,18 0,67 ± 0,21
*р<0,05 **р<0,01
Таблица 23
Вода 088
Подсчет клеток Физиологический раствор Анти-а2 Анти-а1 Анти-а4
Т клетки (СЭЗ позитивные клетки) 6,1 ± 1,5 6181160 211 ±78* 1741 48** 112 + 36**
Макрофаги (Е4/80 позитивные клетки) 21 ±3 778 ± 94 298 ± 45** 510± 132 328 ± 53**
Нейтрофилы +Макрофаги (СО11Ь/Мас-1 позитивные клетки) 19±5 1937 ±239 499 ± 144** 524 ± 141** 574 ± 192”
*р<0,05 **р<0,01
Пример 7.
Влияние антител к интегрину α2 было исследовано на клинических симптомах и симптомах экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ) модели рассеянного склероза. Модель рассеянного склероза, вызванная введением синтетического энцефалогенного пептида РЬР 139-151 вместе с адъювантом Фрейнда мышам линии Б!Ь, считается прогнозирующей моделью рассеянного склероза рецидивирующего течения (Епстак е! а1., I. №игокс1 Кек, 45(6):655-69 (1996)).
В процессе исследования четырех групп мышей (8 на группу; см. фиг. 1) двум группам вводили дозировку 5 мг/кг на 10, 11, 12, 14, 15, 18 и 20 день антитела мыши На1/29 к интегрину α2 или изотипного контроля со времени появления симптомов заболевания, которые проявлялись воспалительной гиперемией, в течение 20 дней. Применяли режим дозирования при остром состоянии. День 0 обозначал появление первичных симптомов после введения синтетического пептида РЬР 139-151 с добавлением адъюванта Фрейнда. Наступление заболевания произошло на второй день с начала потери массы. Двум другим группам был назначен отсроченный режим дозирования, где каждому животному вводили либо 5 мг/кг антитела к интегрину α2 мыши или солевого раствора три раза в неделю с 18 по 36 день, что совпадало со второй гиперемией или первым рецидивом. Мышей оценивали по клиническим проявлениям и следующим симптомам:
0,5 балла - 2 дня потери в весе;
балл - мягкость хвоста;
балла - расстройство координации движений;
балла - паралич задних конечностей;
балла - предсмертное состояние;
баллов - смерть.
Как показано в табл. 24, введение 5 мг/кг антитела к анти-а2 с момента появления первой гиперемии (например, лечение острого состояния) помогло уменьшить распространение первой воспалительной гиперемии и уменьшить проявление второй реакции. Когда введение мышам 5 мг/кг антитела к интегрину α2 мыши начинали после окончания первой реакции на 18 день (например, отсроченное лечение, см. табл. 1), также была продемонстрирована низшая клиническая оценка при первом рецидиве до 32 дня, в чем две группы показали сходные результаты, как показано в табл. 24. Когда введение препара
- 54 016245 та проводили только во время индуктивной фазы, как показано на фиг. 2, МАТ к интегрину α2 незначительно повлиял на первый приступ или на последующие стадии экспериментального аллергического энцефаломиелита, а в некоторых случаях не повлиял вообще, и в сущности, у мышей развивался синдром, сходный с теми животными, которых лечили с помощью изотипного контроля. Эти результаты контрастируют с результатами, полученными ранее для применения Р8/2 антитела к анти α4 на модели ЕАЕ (Аебпоск е! а1., №пнге. 356(6364):63-6 (1992); Тйе1еп е! а1., I. С1ш. Шуек!. 107(8):995-1006 (2001)), которые приводились в поддержку лечения рецидивирующего рассеянного склероза антителом к анти-а4 - препаратом натализумаб (МШег е! а1., Ν. Епд1. I. Меб. 348(1):15-23 (2003)). Эти результаты показывают, что различие в отличие от роли, которую играет интегрин α4 в нейровоспалительных расстройствах, где антагонист рецептора может задерживать начало появления рецидивов, связанных с рассеянным склерозом, антагонисты интегрина α2 являются полезными для терапии для ослабления и лечения симптомов, при их возникновении.
Таблица 24
Клинические показатели
Исследование 1 Среднее+СОС (п=6-8) Исследование 2 Среднее±СОС (п=17-20)
День15 Контрольный 1д6 анти-а2 анти-а4 1,56 ±0,42 1,00 ±0,37 2,22 ±0,29 0,88 + 0,21 (р<0,01) 1,64 + 0,25
День 20 Контрольный 1дС 1,13 ±0,48 1,25 + 0,28
анти-а2 анти-а4 0,58 ± 0,41 0,61 ± 0,20 1,11 ±0,22
День 35 Контрольный 1дС анти-а2 анти-а4 1,13 + 0,48 0,33 ± 0,33 1,49 ±0,29 1,08 ±0,29 1,47 ±0,27
День 55 Контрольный 1д<3 анти-а2 анти-а4 1,63 ±0,63 1,00 + 0,59 2,00 ± 0,28 0,75 + 0,31 (р<0,001) 1,33 + 0,35
Гистологические анализы были проведены на спинном и головном мозге у мышей в предсмертном состоянии (4 балла) или в конце самого исследования. Мышей умерщвляли с помощью галотана в предсмертном состоянии (4 балла) или после 55-60 дня наблюдений. Животных орошали РВ8 и 4% раствором параформальдегида. Головной мозг разделяли на 5 коронарных частей: спинной мозг на 10-12 косых срезов, ткани парафинировали и секции толщиной 4 мкм окрашивали красителем люксол голубой для проявления миелинизации. Ткани оценивали вслепую по степени миелинизации, инфильтрации (менингит) и периваскулярной инфильтрации. Для оценки срезов спинного мозга каждая его часть была поделена на квадранты: передний канатик, задний канатик и два боковых. Каждый квадрант, содержащий менингит, периваскулярную инфильтрацию или димиелинизацию, оценивали в 1 балл в данном патологическом классе. Определяли общее количество квадрантов с позитивными проявлениями в каждой патологической группе, затем делили на общее количество квадрантов на предметном стекле и умножали на 100, чтобы получить процентный вклад каждой патологической группы. Общая патологическая оценка также была установлена путем присваивания оценки в случае наличия повреждения в квадранте.
Заметные демиелинизированные очаги воспаления были найдены в спинном мозге, чаще в дгасйек £аксюн1нк заднего канатика и вентрального корешка входной области переднелатерального канатика. Наблюдалась только средняя периваскулярная инфильтрация. Менингит и степень демиелинизации были тесно взаимосвязаны с клиническими признаками (г=0,84 и 0,79 соответственно) и показали значительно более низкие оценки в группе, которой вводили анти-а2 (Р<0,01 между анти-а2 и контрольной группами по всем параметрам). Эти данные показывают, что лечение антителом к интегрину α2 ингибирует менингит и демилиенизацию в связи с воспалительным процессом и/или улучшает ремилиенизацию и восстановление. Окончательный результат применения препарата свидетельствовал об облегчении течения болезни.
- 55 016245
Другое исследование было проведено (и=17-20 на группу), чтобы сравнить лечение интегрином анти-а2 и антителом РЗ/2 к интегрину α4 (полученных от Зои!Беги Вю!есБ), со времени первых острых симптомов до наступления ремиссии (с 10 по 20 день). Две дополнительные группы также лечили контрольным Ι§0 или интегрином α2 со дня начала ремиссии (18 день) до первого рецидива (36 день) или в начале хронической фазы заболевания. Снова, лечение антителом к интегрину α2 оказывало значительное влияние на частоту возникновения неврологических последствий (паралич) и статистически значимым образом снижало среднюю оценку времени первой вспышки ЕАЕ, а также последующей рецидивирующей стадии (хроническая фаза ЕАЕ; табл. 24). Эффект улучшения во время хронической фазы заболевания по клиническим оценкам при лечении анти-а2 был достаточно слабым. Частота возникновения заболевания при возникновении первых признаков (анти-α 2,61%; контроль Ι§0 85%) и во время хронической фазы (анти-а2, 77%; контроль Ι§0 100%) была ниже для группы мышей, которым вводили антиα2 по сравнению с контрольной. В случае, если группе вводили анти-а4, частота возникновения заболевания во время появления первых симптомов (лечение анти-а4 94%; контроль 82%) и рецидивов (лечение анти-а4 89%, контроль 92%), результаты лечения антителами к α4 были похожи на результаты, полученные в контрольной группе. Данные, касающиеся антител к α4, сопоставимы с предыдущими исследованиями эффективности лечения антителами к а4 на клинических результатах для ЕАЕ (ТБе1еи е! а1., 1. СБи. Ещез!. 107(8):995-1006 (2001)).
Пример 8.
Были исследованы эффекты связывания интегрина α2β1 с тромбоцитами (α2β1 экспрессируется на поверхности тромбоцитов), включая воздействие на функцию тромбоцитов. Для изучения этих эффектов были проведены разные группы анализов.
Первые исследования оценивали, ведет ли связывание ТМС-2206 к активации тромбоцитов, с помощью измерения позитивной регуляции Р-селектина или активации тромбоцитарного интегрина α1Φβ3, который был измерен с помощью РАС-1 активационно-специфичного антитела к α1Φβ3. С помощью иглы № 21 из локтевой вены здоровых доноров, которые воздерживались от приема медикаментов как минимум в течение 10 дней, отбирали человеческую венозную кровь и вносили в 1/10 объема подкисленного цитрат-декстрозного буфера (АСЭ: 85 мМ цитрата натрия, 111 мМ декстрозы и 71 мМ лимонной кислоты без регулировки рН), который содержит 500 нг/мл простагладина Ι2 (Р&Ъ, З1дта-А1бпсБ), для создания чистых тромбоцитов. Всю кровь центрифугировали при 160хд в течение 20 мин при комнатной температуре и плазму, обогащенную тромбоцитами (РКР), удаляли, не затрагивая пенную верхушку. Отмытые тромбоциты получали разбавлением РКР в 2,5 раза солевым буфером с цитратом глюкозы (ССЗ; 13 мМ цитрата тринатрия, 120 мМ хлорида натрия и 30 мМ глюкозы, рН 7,0) и РСЕ (500 нг/мл) и центрифугировали при 160хд в течение 20 мин при комнатной температуре, чтобы отделить загрязняющие лейкоциты. Супернатант собирали и центрифугировали при 1100хд в течение 10 мин и получившийся тромбоцитарный осадок в пробирке перерастворяли в ССЗ буфере, очищали и перерастворяли в нормальном растворе Тугобез-Нерез (12 мМ NаНС0з, 138 мМ №С1, 5,5 мМ глюкозы, 2,9 мМ КС1, 10 мМ НЕРЕЗ, 1 мМ СаС12, 1 мМ МдС12, рН 7,4). Тромбоциты оставляли для восстановления в течение 30 мин при температуре 37°С. Отмытые тромбоциты подсчитывали и добавляли СаС12 и МдС12 до 1 мМ. Отмытые крысиные тромбоциты готовили по той же схеме, хотя кровь брали из полой вены для минимизации активации тромбоцитов во время взятия крови.
мкл свежеприготовленных РКР инкубировали с 5 мкг/мл ТМС-2206 и антитела ^С мыши в течение 30 мин, очищали и затем инкубировали опять с меченой А1еха-594 антимышиной сывороткой в присутствии или в отсутствие меченого А1еха-488 антитела к Р-селектину (ВО РБагштдеи, са!а1од N 555523), меченого А1еха-488 РАС-1 антитела (ВО РБагштдеи, са!а1од № 340507) или 150 нг меченого А1еха-488 фибриногена (Мо1еси1аг РгоЬез) в течение 40 мин при комнатной температуре. Р-селектин и РАС-1 являются маркерами тромбоцитарной активации, а активизированные тромбоциты способны связывать фибриноген. В конце периода инкубирования тромбоциты фиксировали 1/10 объема 4% параформальдегида и анализировали с помощью проточного цитомера ЕАСЗсаБЬиг™. Результаты этих исследований неожиданно показали, что хотя тромбоциты явно связывали ТМС-2206, как показало зарегистрированное усиление интенсивности флуоресценции, наблюдаемой при обработке ТМС-2206, но не для тромбоцитов, обработанных контрольным ЦС; никакого сопутствующего усиления окрашивания Р-селектина или РАС-1 не было, что означает, что связывание ТМС-2206 не активирует тромбоциты.
Следующие исследования оценивали, ведет ли связывание ТМС-2206 к активации тромбоцитов, которую можно оценить за счет влияния на вызванную коллагеном агрегацию тромбоцитов. Растворимый коллаген является мощным агонистом агрегации тромбоцитов, который используют как стандартный способ оценки тромбоцитарной восприимчивости (см., например, Нетоз!аз1з аиб ТБготЬоз1з (2001), еб. Со1таи е! а1.). Предполагалось, что при исследовании на мышах с а2-нокаутом тромбоциты этих мышей будут проявлять ослабленный ответ на коллаген (НоИкойег е! а1., 1. Вю1. СБет. 277(13):10789-94 (2002). Е. риЬ 1аи, 11, 2002; СБеи е! а1., Ат. 1. Ра!Бо1. 161(1):337-344 (2002)). Для проверки, будет ли ТМС-2206 иметь нежелательную реакцию на тромбоцитарный ответ на коллаген, человеческий и крысиный, были
- 56 016245 выполнены агрегационные анализы с помощью оптической агрегометрией, используя классическую аггрегометрию при прохождении светового луча с использованием агрегометра Вю-ба!а РАК4. РКР готовили, как было описано выше, и количество тромбоцитов доводили до 3/108/мл. 450 мкл РКР или отмытых тромбоцитов перемешивали магнитной мешалкой в течение 1 мин при температуре 37° в присутствии 5 мкг/мл ТМС-2206 перед добавлением коллагена телячьей кожи типа 1 в качестве индуктора агрегации. Доводили объем до 500 мкл с помощью буфера Тироде агрегации отмытых тромбоцитов и бедной тромбоцитами плазмой (РРР) для анализов плазмы, обогащенной тромбоцитами (РКР). 500 мкл буфера Тироде или РРР использовали как раствор сравнения для проведения анализа. РРР готовили путем гранулирования тромбоцитов в РКР центрифугированием при 300 об/мин в течение 5 мин в микрофуге. Сопоставляли скорость и степень агрегации тромбоцитов после добавления растворимого коллагена в присутствии ТМС-2206 или без него. Результаты этих экспериментов показали, что связывание ТМС-2206 с тромбоцитами не имело эффекта на спровоцированную коллагеном агрегацию тромбоцитов при проведении исследований ш νίΙΐΌ с испытываемыми концентрациями.
В следующих исследованиях определяли, приводит ли связывание ТМС-2206 к тромбоцитопении потенциальному результату ш νί\Ό связывания антител тромбоцитами. (Напкеп апб ВаИЪакаг, 1. РНагтасо1. Ехр. ТНег. 298(1):165-71 (2001)). Для проверки, возникнет ли тромбоцитопения после введения ТМС-2206, крысам внутрибрюшинно вводили дозу 10 мг/кг ТМС-2206 или контрольный 1§С мыши. Перед кровью, взятой из хвоста, измеряли начальное количество кровяных клеток. Пробы крови брали в определенное после ί/р введения препарата время (например, через 10, 30, 60 мин и 4, 24 и 72 ч) у неанестезированных крыс ретроорбитальным способом, используя капиллярную ипор1ре1. Приблизительно 40 мкл крови помещали в пробирку, содержащую 5 мкл ДСП, и сразу вносили в счетчик форменных элементов крови Нетауек Результаты этого исследования неожиданно показали отсутствие каких-либо значительных отличий от начального количества тромбоцитов при введении ТМС-2206 в дозах 5 или 10 мг/кг. В отличие от этого результата инъекция 0,1 мг/кг антител к другому тромбоцитарному рецептору (оПЬ, анти-СЭ41 антитела (ВО Рйагттдеп, СА)) вызывает тромбоцитопению с уменьшением количества тромбоцитов почти на 80% в течение 15 мин после введения антитела.
Пример 9.
Влияние антител к интегрину α2 были изучены на адгезии тромбоцитов к коллагену, включая адгезию к разным подтипам коллагена. Интегрин α2β1 является единственным коллагенсвязывающим интегрином, хотя и не единственным рецептором коллагена, экспрессированным на тромбоцитах. Однако, как обсуждалось раньше, существуют другие механизмы облегчения сильной адгезии к коллагеновой матрице, особенно после активации тромбоцитов. В данном примере оценивали способность антител ТМС-2206 блокировать адгезию тромбоцитов к коллагенам I, II, III, 1У и VI типов в обоих состояниях как для спокойных тромбоцитов, так и для активизированных с помощью умеренного агониста тромбоцитов АДФ.
Планшеты Iтти1οη II покрывали коллагенами типов I, II, III, IV (Коск1апб !ттипосНет1са1) и IV (81дта, 81. Ьошк, М0), солюбилизированными без взбивания в 5 мМ уксусной кислоты до конечной концентрации 1 мг/кг. Лунки дважды промывали модифицированным Тироде НЕРЕ8-буфером, без Са++ или В8А, но содержащим 2 мМ М6++, и блокировали по 100 мкл/лунку Тироде-НЕРЕ8 буфера, содержащего 2 мМ Мд и 0,35% В8А, но без Са++.
Для приготовления тромбоцитов использовали человеческую венозную кровь, включая приготовление РКР, как описано выше в примере 8. Бедную тромбоцитами плазму (РРР) готовили центрифугированием РКР при 1100/д в течение 10 мин при комнатной температуре. Для введения метки полученный тромбоцитарный осадок ресуспендировали мягко в 1,0 мл СС8 (13 мМ цитрата тринатрия, 120 мМ хлорида натрия и 30 мМ декстрозы, рН 7,0), перемещали в пробирку с круглым дном объемом 5 мл и добавляли 3 мкл СР8Е (конечная концентрация 53,7 мкМ), перемешивали на протяжении 20 мин. Меченые тромбоциты разводили СС8 буфером и отмывали. Осадок тромбоцитов повторно суспендировали в 1 мл СМРТН буфера (5 мМ НЕРЕ8, рН 7,3, 12 мМ бикарбоната натрия, 137 мМ №С1, 3 мМ КС1, 0,3 мМ NаН2Р04, 5 мМ декстрозы и 0,35% В8А) и держали по возможности в темноте. Отмытые крысиные тромбоциты получали по той же схеме, но кровь брали из полой вены в шприц, содержащий 500 нг/мл РСЕ| в АСО, для минимизации активации тромбоцитов во время отбора крови.
СР8Е-меченые тромбоциты разводили до 2,0/105/мкл, используя модифицированный Тироде НЕРЕ8 буфер, содержащий 0,35% В8А. Меченые тромбоциты (1,0/107 на лунку) вносили в лунки, содержавшие 20 мкМ АДФ в модифицированном Тироде НЕРЕ8 буфере с 0,35% В8А и различными концентрациями анализируемых ингибиторов. Планшеты для микротитрования, содержащие тромбоцитные смеси, центрифугировали при 50/д в течение 10 мин при комнатной температуре и инкубировали в темноте еще 10 мин. Лунки промывали с помощью модифицированного Тироде НЕРЕ8 буфера. Флуоресценцию определяли с помощью флуоресцентного планшетного ридера У1с!ог2. Для определения зависимости интенсивности флуоресценции от количества тромбоцитов меченые тромбоциты в разной степени разбавляли модифицированным Тироде НЕРЕ8 буфером, содержащим 0,35% В8А (без Са++ или АДФ), вносили в лунки, покрытые коллагеном типа 1 или типа 1У, центрифугировали и считывали показатели
- 57 016245 флуоресцентных СЕ8Е. Как видно из табл. 25, ТМС-2206 блокирует связывание коллагена в подобных статических условиях со значением ЕС50=1,7 нМ. Подобные исследования проводили с крысиными тромбоцитами, используя ТМС-2206. Значения ЕС50=6,3 нМ ингибирования связывания крысиных тромбоцитов с крысиным коллагеном типа 1 указывают примерно на 5-кратную разницу в аффинности крысиного α2β1 по сравнению с человеческим α2β1 к тромбоцитам.
Таблица 25
Тип коллагена Источник человеческого коллагена АДФ стим. (мкМ) ЕС№ (нМ)
Тип | плацента 0 1,7
20 9,5
: Тип11 коленный хрящ 0 1,9
20 27
Тип III плацента 0 1,6
20 11
Тип IV плацента 0 10
20 >1000
Тип VI плацента 0 2,3
20 23
Как показано в табл. 25, ТМС-2206 является сильным ингибитором адгезии тромбоцитов к волокнистым коллагенам и менее сильным ингибитором адгезии к неволокнистым коллагенам типа 4 (10 нМ в сравнении с 1-2 нМ). В присутствии АДФ неожиданно было замечено 10-20-кратное уменьшение силы ингибирования связывания волокнистых коллагенов, и антитела не были эффективными при предотвращении адгезии к коллагену типа 1У. Эти наблюдения говорят о том, что ТМС-2206 и антитела с эпитопной специфичностью связывания ТМС-2206 менее активны в ингибировании взаимодействий активированных тромбоцитов с волокнистым коллагеном и не влияют на связывание коллагена типа 1У, который является преобладающим подтипом коллагена эндотелиальных стенок сосудов.
Пример 10.
Было изучено влияние антител к интегрину α2 на продолжительность кровотечения. Специалист в данной области сможет предположить, что введение антитела против тромбоцитарного интегрина может стать причиной расстройства свертываемости и вести к увеличению времени образования тромбоцитарной пробки у субъекта, которому после возникновения повреждения было введено антитело. Для того чтобы оценить, будут ли антитела, направленные против интегрина α2, увеличивать расположенность к кровотечению ίη у1уо, определяли влияние ТМС-2206 на время кровотечения у крыс.
Крысам ί/р или ί/ν вводили ТМС-2206 за 15 мин до оценки времени кровотечения. Неанестезированные крысы были зафиксированы с ограничением движения и для спровоцирования кровотечения им отрезали хвост на 0,8 см от его кончика. Хвост сразу помещали в лабораторный стакан, содержащий 30 мл РВ8, при температуре 37°С. Время, которое потребовалось для прекращения кровотечения, было обозначено как время кровотечения. Как показано в табл. 26, применение дозы ТМС-2206 до 10 мг/кг не имело значительного эффекта на время кровотечения.
Таблица 26
доза ТМС-2206 мг/кг Время кровотечения (п) минуты
0,0 3,86 ±0,32 (5)
5,0 4,51 ±0,32 (4)
10,0 4,62 ±0,67 (7)
Пример 11.
Влияние антител к интегрину α2 было изучено на модели артериального тромбоза. Другим возможным проявлением расстройства свертываемости в результате применения антител, реактивных к α2β1 тромбоцитов, может быть увеличение времени тромбозной окклюзии, вызванной нежелательным влиянием тромбоцитной функции при повреждении артерии. Поэтому антитела к интегрину α2, такие как ТМС-2206, были исследованы на крысиной модели индуцированного хлоридом железа артериального тромбоза. Это стандартная модель, которая была применена для разработки противотромботических агентов, а активность проявляется в виде задержки времени тромбозной окклюзии после обработки эндотелиального слоя кровеносных сосудов раствором ЕеС13 (Кигх е1 а1., ТЬготЬ Век. 60(4):269-80 (1990); Ноекйга е1 а1., 1. Меб. С1ет. 42(25):5254-65 (1999)).
- 58 016245
Антитело ТМС-2206 вводили крысам инъекцией в хвостовую вену в дозе от 1 до 15 мг/кг за 30 мин до повреждения артерий. Для 4 инъекций многие антитела концентрировали до 4-5 мг/мл, чтобы сократить вводимый объем, нужный для повышения дозировки. Испытуемым группам вводили 1,0, 2,5, 5,0, 10,0 и 15 мг/кг ТМС-2206, 5,0 мг/кг контрольного ^СДк) мыши (клон МОРС21), 5,0 мг/кг кроличьего поликлонального анти-νVЕ (ТОАКО) или физиологический раствор, в каждой экпериментальной группе было 3-4 животных.
Крыс линии 8ргадие-0а\\'1еу (наг1ап), которые весили 220-270 г анестезировали 60 мг/кг пентабарбитала натрия. Когда они достигали достаточного уровня анестезирования, открывали доступ к сонной артерии и помещали ее на кусок фильтровальной бумаги (4x5 мм), которая была сложена вдоль 4 мм стороны, чтобы поддержать сонную артерию и обеспечить поверхность для обработки хлоридом железа (35%). На 5 мин применяли 12 мкл 35% ЕеС1з, потом фильтровальную бумагу убирали, а вокруг сонной артерии размещали проточный зонд Тгапкошс Зук!етк Шс. Ток крови измеряли в течение 45 мин.
Были записаны средние значения и стандартная ошибка среднего СОС для скорости тока жидкости у нескольких животных одной группы в определенное время после обработки хлоридом железа. Никаких существенных изменений времени окклюзии при введении любой из доз ТМС-2206 не произошло, даже при таких больших дозах, как 15 мг/кг, в сравнении с контрольным солевым раствором, значит, введение ТМС-2206 не имеет нежелательных побочных эффектов на тромбоциты. Хотя начальные значения скорости тока крови могут меняться в зависимости от животного, время окклюзии, одинаковое для всех, составляло от 10 до 16 мин после применения хлорида железа в группах, которым вводили ТМС-2206, что было очень похоже на результаты в группах, которым вводили солевой раствор и контрольный ^С. Соответствующим образом, общее время окклюзии составляло 14 мин. Единственным испытанным препаратом, который имел отношение к предотвращению окклюзии, был положительный контроль, поликлональное анти-ννΓ антитело, при введении которого не произошло снижения параметров тока крови в течение 45 мин после добавления ЕеС13.
Пример 12.
Для того чтобы охарактеризовать природу сайта связывания ТМС-2206 в субъединице интегрина α2, было исследовано связывание антител к интегрину α2, а именно изучено картирование эпитопов. Антитело к интегрину α2, которое непосредственно связываетя с целевым сайтом связывания и является прямым конкурентом связывания лигандов, может, согласно предположениям, вызвать активацию тромбоцитов после связывания интегрина α2β1. В качестве альтернативы, антитело к интегрину α2, которое связывается с интегрином α2β1 в активном состоянии и не вызывает активации интегрина, может иметь неактивирующий тромбоциты профиль, похожий на неожиданно обнаруженный для ТМС-2206. Антитела с таким же или похожим связывающим эпитопом, как ТМС-2206, будут ингибировать адгезию лейкоцитов к коллагену и, таким образом, иметь значительную терапевтическую ценность, но не будут вызывать осложнений в виде кровотечения, которые может вызывать интегрин α2β1, при связывании или активировании антител.
Были проведены исследования с целью выяснить, будет ли эпитоп, распознающий ТМС-2206, находиться в лигандсвязывающем Едомене субъединицы интегрина α2 или он просто зависит от наличия интактного I-домена (напдап е! а1., Сапсег Кек. 56:3142-3149 (1996)). Для этих исследований был произведен слитый белок СЗТ-о.2 Едомена с применением модифицированной версии протокола, описанного Тиск\ге11 е! а1., I. Се11 Зск 108 (Р! 4):1629-37 (1995). Человеческий Едомен α2 клонировали из мРНК, выделенной приблизительно из 106 клеток СнО, экспрессирующих человеческий интегрин α2 (8утшд!оп е! а1., I. Се11 Вю1. 120(2):523-35 (1993). Клетки подвергали лизису в тризоле (С1Ьсо), куда добавляли хлороформ, для экстракции водной фазы перед добавлением 0,2 объема изопропанола для преципитации РНК, которую собирали центрифугированием и ресуспендировали в воде, свободной от рибонуклеазы.
Праймеры, фланкирующие Едомен человеческого α2, были синтезированы с помощью 81дтаСепокук. Праймеры созданы с сайтами ВатШ и ЕсоШ в 5'- и 3'-концах соответственно для клонирования в рСЕХ-2ТК вектор (СЕ ВюкОепсек).
Праймеры Ьа1рЬа1 Е (5'ССССАТССАСТССТСАТТТТСАССТСТСАС; 81Х) ГО 117) и Ьа1рЬа1 К (5'СССААТТСААСАСТАССТТСААТССТС; ЗЕ С) ГО 118) (см табл. 27) использовали для одношаговой ОТ-ПЦР с применением стандартного набора О|адеп, для амплификации аминокислот от 123 по 346 субъединицы зрелого интегрина α2 и для включения точки ВатШ в аминоконец (что добавляет СЗ выше остатка 124 Едомена) и дополнительный гексапептид ЕЕIУТ^ как часть клонируемого сайта ЕсоШ вплоть до терминирующего кодона. При электрофорезе в агарозном геле была обнаружена одна полоса. Реакцию ПЦР очищали с применением быстрого набора 01адеп РСК, продукт расщепляли с помощью рестрикционных ферментов и клонировали в вектор рСЕХ-2ТК (Атегкйат, СЕ) с применением стандартных молекулярно-биологических техник. Трансформированные бактерии подвергали скринингу на предмет наличия инсерционных сегментов и несколько клонов секвенировали с применением системы СЕС от Весктап-Сои1!ег. Полученная предсказанная клонированная последовательность аминокислот была идентична имеющейся последовательности Едомена человеческого α2 (8ЕО Ш NО: 11, показано в табл. 28). Единичный клон, содержащий правильную вставку ДНК, был амплифицирован в клетках
- 59 016245
ЭН5а (1пс1!годеп) и ретрансформирован в электрокомпетентную бактерию ВЬ21 (1пс1!годеп). Таблица 27
Имя праймера Нуклеотидная последовательность (5' - 3')
Ьа1рйа1 Р (ЗЕО 10 №:117) ОбСОАТССАОТССТСАТТТТСАеСТСТСАО
Ка1рНа1 Р ' (ЗЕО 10 №:118) ОССААТТСААСАОТАССТТСААТОСТС
гпа1рЬа1 Р (ЗЕО Ю№:121) СОССАТССАСТССАОАСТТТСАСТТСТТС
та1рКа1 Р (ЗЕО Ю №:122) ТСОСААТТСААСАОТОССТТСААТССТО
га1рКа! Г (ЗЕО Ю №:123) СООбАТССАОТССАОАСТТТСАСТСОТТОАС
га1рпа1 К (ЗЕО Ю №:124) ТОООААТТСТОССАТТТССАТСТбОААОТТО
Ьа1рЬа1121V Р (ЗЕО Ю №:125) сАоссстесссттссстсетАОАТОттетестто
Ьа1рЬа1121УР (ЗЕО Ю №:126) СААССАСААСАТСТАСбАСООААСООСАООССТО
Ьа1рйа1 Е44У (ЗЕО Ю №:127) САСТАААСААТТТТТТСОТААААТТГСТСААСО
па1рЬа! Е44У Р (ЗЕО Ю №:128) ССТТОАСАААТТТТАССААААААТТСТТТАСТС
Ка1рЬа1 О48Т Р (ЗЕО Ю №:129) ТТТТООАААААТТТОТААСАбОССТООАТАТАООС
па1рИа1 О48Т К (ЗЕО Ю №:130) ОССТАТАТССАСОССТОТТАСАААТТТТТССОООО
Ьа1рИа1 Ν67Ε Р (ЗЕО Ю №:131) СА6ТАТ0ССААТСА6ССАА0А0ТТ0Т0ТТТААС
Ьа1рНа1 Ν67Ε К (ЗЕО Ю№:132) ОТТАААСАСААСТСТТООСТСАТТОеСАТАСТС
Ьа1рпа! У701 Р (ЗЕО Ю №:133) ТОССААТААТССААОААТТОТОТТТААСТТОААС
На1рпа1 У701 К (ЗЕО Ю №:134) ОТТСААОТТААСАСААТТСТТССАТТАТТООСА
Ьа1рпа1 У711 Р (ЗЕО Ю №:135) ССААТААТССААСАОТТАТСТТТААСТТОААСАС
Ьа1рЬа1 У711 К (ЗЕО ΙΡ N0:136) бТеТТСААОТТАААОАТААСТСТТООАТТАТТеб
На1рНа1 Τ76ϋ Р (ЗЕО Ю№:137) СТОТТТААСТТСААСОАСТАТААААССАААОАА
На1рНа1 Τ76ϋ Р (ЗЕО Ю №:138) ТТСТТТООТТТТАТАОТССТТСААСТТАААСАС
Ьа1рНа1 Υ77Ρ Р (ЗЕО Ю №:139) ТТТААСТТОААСАСАТТТААААССАААОААОАА
Ьа1рЬа1 Υ77Ρ Р (ЗЕО Ю №:140) ТТСТТСТТТСОТТТТАААТСТСТТСААСТТААА
На1рНа! К78Е Р (ЗЕО Ю №:141) ААСТТОААСАСАТАТОАААССАААСААОАААТС
Па1рйа1 К78Е Р (ЗЕО Ю №:142) САТТТСТТСТТТООТТТСАТАТОТбТТСААСТТ
йа1рйа1 Υ93Η Р (ЗЕО Ю №:143) ТСССАОАСАТСССААСАТ6СТООООАССТСАСА
Ьа1рпа1 Υ93Η Р (ЗЕО 10№:144) ТСТОАОСТССССАССАТСТТеОСАТСТСТбООА
Ка1рНа1 Υ93Ρ Р (ЗЕО 10 №:145) АСАТеебАОАСАТСССААТТТООТССОСАССТСАСАААС
Иа1рНа1 Υ93Ρ Р (ЗЕО Ю №:146) СТТТОТОАСОТССССАССАААТТОООАТСТСТСССАТСТ
йа1рЬа1 0Ю5Е Р (ЗЕО Ю№:147) ТТСОСА6СААТТ6ААТАТОСАА6ААААТАТОСС
- 60 016245
Имя праймера Нуклеотидная последовательность (5' - 3')
На1рпа1 ОЮ5Е К (ЗЕО Ю №:148) ООСАТАТТТТСТТеСАТАТТСААТГССТССОАА
Йа1р(|а1 А114О Е (ЗЕО Ю №:149) АААТАТОССТАТТСАСААССТТСТСОТСеСССАССААСТ
На1рГ>а1 А114О К (ЗЕО Ю №:150) АСТТС6ТСОСССАССАСААССТТОТСААТАСССАТАТТТ
Ьа1рЬа1 Α115Т Г (ЗЕО Ю №:151) АААТАТСССТАТТСАОСААСТТСТССТСССССАССААСТ
Ьа1рЬа1 Α115Т К (ЗЕО Ю №:152) АСТТСетСССССАССАСА АСТТССТ6ААТАС6САТАТТТ
На1рЬа1 А115О Р (ЗЕО Ю №:153) АААТАТСССТАТТСАССАСАСТСТССТОбССОАСбААСТ
Ьа1рйа1 А115О К (ЗЕО Ю№:154) АСТТСОТСССССАССАбАСТСТССТСААТАСССАТАТТТ
Ьа1рйа1 К165ОЕ (ЗЕО Ю№:155) еТТСТТСОеТАСТТАААССАСААСОСССТТСАТАСТААА
Ьа1рйа1 К165О К (ЗЕО Ю№:156) ТТГАеТАТСААбебССТТбТССТТТААбТАСССААОААС
Ьа1рйа1 Ν166ϋ Е (ЗЕО Ю№:157) СТТСССТАСТТАААСАСОСАСССССТТОАТАСТАААААТ
па1рпа! N1660 Р (8ΕΩ Ю№:158) АТТТТТАСТАТСААСОСССТСССТСТТТААСТАСССААО
Ьа1рЬа1 Е195УУ Г (ЗЕО Ю№:159) ТТСААТСТСТСТОАТТСебСАОСТСТАСТАСААААОССТС
На1рпа1 Е195\Л/ К (ЗЕО Ю№:160) САбССТТТТСТАСТАСАССТССССААТСАСАСАСАТТСАА
На1рйа1 Κ40ϋ Е (ЗЕО Ю№:161) АТССТТСССАТбСАЭТАСАСААТТТТТТССАААААТТТ
Па1р1га1 Κ40ϋ К (ЗЕО Ю№:162) АААТТТТТССААААААТТбТСТАСТеСАТСССААСбАТ
1за1рЪа1 Κ69ϋ Р (ЗЕО Ю№:163) САСТАТСССААТААТССАОАССТТеТСТТТААСТТбААС
Ьа1рПа1 Κ69ϋ К (ЗЕО Ю№:164) СТТСААОТТАААСАСААСетСТОеАТТАТТОССАТАСТС
Ьа(рПа1 N730 Е (ЗЕО Ю №:165) ААТССААСАОТТСТСТТТСАСТТСААСАСАТАТААА
Ьа1рпа! N73 ϋ К (ЗЕО Ю №:166) ТТТАТАТОТСТТСААСТСАААСАСААСТСТТССАТТ
йа1рИа1 О89Н Е (ЗЕО Ю №:167) АТСАТТбТАОСААСАТСССАСАСАТСССААТАТССТОеС
Ма!рпа1 О89Н К (ЗЕО Ю №:168) АТСАТТСТАССААСАТСССАСАСАТСССААТАТССТ6СС
та1рпа1Н93У Е (ЗЕО Ю№:169) САСАТСТСАСАСеСОССААТАТССТСОССАССТСАСАААС
та1р11а1Н93У К (ЗЕО Ю №:170) 6ТТТ6ТСА6СТССССАССАТАТТОССОССТСТСАеАТСТ6
С8Т-слитый белок с Ι-доменом человеческого α2 экспрессировали в логарифмически растущей бактерии ВЬ21 с применением изопропилтиогалактозида (ГРТС) в качестве индуцирующего агента. Приблизительно через 4 ч после индукции бактерии собирали и осаждали при 3000 об/мин в конических пробирках объемом 50 мл. Осадок ресуспендировали в РВ8, содержащем 1% ТиШл Х-100 и ингибиторы протеазы. Гомогенат подвергали воздействию ультразвуком в течение 1 мин и центрифугировали при 3000 об/мин., чтобы очистить лизат от продуктов распада клеток. С8Т-слитый белок очищали от бактериальных лизатов с применением гранул глутатион-сефарозы (СЕ-Атегхйат) согласно инструкциям производителя и элюировали в ТВ8 (рН 8,0), содержащем 20 мМ свободного глутатиона. Очищенный Ι-домен С8Т-а2 связывал коллаген с той же специфичностью, о которой сообщалось ранее (Тисктее11 е! а1., I. Се11 8ск 108 (Р! 4):1629-37 (1995)), а именно с большей аффинностью к коллагену типа 1 по сравнению с типом Ιν. Он связывал иммобилизированный ТМС-2206 с соответствующей Кб=0,31 нМ, измеренной с помощью ИФА, которая была сравнима с наблюдаемой аффинностью связывания ТМС-2206 с интактным интегрином α2β1, равной 0,37 нМ, полученной согласно описанном в примере 2 анализе прямого связывания. Растворимый слитый белок Ι-домена С8Т-а2 после этого оценивали с точки зрения его способности конкурировать с Еи-меченым ТМС-2206 при связывании с (^[Ч-покрытыми планшетами, как описано в примере 2. Величина К1 для растворимого Ι-домена С8Т-а2 оказалась подобной (0,18 нМ по сравнению с 0,28 нМ) значению, полученному для немеченого ТМС-2206, что показывает, что сайт связывания ТМС-2206 находится в пределах Ι-домена α2 и не требует наличия субъединиц β 1.
- 61 016245
Были также проведены исследования для изучения зависимости от наличия катионов при связывании с ТМС-2206. Зависимость от наличия катионов показывает, что мишенью при связывании интегрина является двухвалентный катион-связывающий сайт (ΜI^Αδ) и, таким образом, выступает как миметик лиганда. Связывание коллагена с α2 при нормальных физиологических условиях является Мд++-зависимым, а когда Мд++ заменяют на Са++, связывание не происходит (δΐηηΐζ е1 а1., Се11 Вю1. 108(5):1917-24 (1989); Етх1еу е1 а1., Се11. 101(1):47-56 (2000)). Для этих исследований Ι-домен слитого белка Οδ^α2 иммобилизировали на глутатион-покрытых микротитровальных планшетах Яеасб-Вшб (Р1егсе В^есйпоЛду, Лс. ЯоскГогб, ГЬ) и определяли способность Еи-меченого ТМС-2206 связываться в условиях присутствия различных катионов (без Са и Мд, от 0,1 мкМ до 3 мМ Са++ или Мд++). Планшеты покрывали инкубированием с Οδ^α2 Ι слитым белком по 100 мкл/лунку (2,0 мкг/мл в свободном от двухвалентных катионов связывающем буферном растворе: 50 мМ НЕРЕδ, рН 7,4, 150 мМ №1С1 и 0,5% Тетееп-20) в течение 1 ч при комнатной температуре, затем лунки четыре раза промывали свободным от двухвалентных катионов отмывочным буфером. Лунки блокировали по 100 мкл/лунку блокирующего буфера (отмывочный буфер, содержащий 3,0 мг/мл ΒδΑ, свободного от ЦС Цаскхоп IттипοЯехеа^ск ЬаЬога1опех, Лс., Уех1 Сгоге, РА]) в течение 1 ч при комнатной температуре, четыре раза промывали свободным от двухвалентных катионов отмывочным буфером и погружали в свободный от двухвалентных катионов отмывочный буфер (300 мкл/лунку) на 45 мин при комнатной температуре. Лунки снова в течение 30 мин уравновешивали в отмывочном буфере (300 мкл/лунку), содержащем желаемый уровень содержания катионов, и после этого инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°С в присутствии 41 пМ, 199 пМ, 345 пМ или 1 нМ Еи-меченого ТМС-2206 или контрольного антитела. Связывание антитела ТМС-2206 мыши происходит с подобной активностью при любых условиях и зависит от концентрации катионов, что указывает на то, что его связывание с Ι-доменом а2 является катион-зависимым и поэтому не затрагивает ΜI^Αδ-сайт. Еи-меченый контрольный ЦС не связывался с лунками, покрытыми интегрином α2β1, что подтверждает, что связывание было специфичным.
Были проведены дополнительные исследования для изучения сайта связывания ТМС-2206. Лиганды интегрина обычно содержат ключевую кислоту, которая образует окончательную хелатную связь с двухвалентным ионом металла (Наах апб Р1оте, Сигг. Οр^п. Се11. Вю. 1994; Ьее е1 а1., δΙπιαιιΐΌ 1955), черта, свойственная многим антагонистам интегрина, включая АОС2, МАТ к интегрину а1 (Кагрихах е1 а1., 1. Мо1. Вю1. 2003), где кислота находится в Ό101 положении СЭЯ-Н3. По аналогии, Ό100 положение в участке СОЯ-Н3 ТМС-2206 может взаимодействовать подобным образом с ΜI^Αδ а2. Поэтому были получены два варианта антител мыши, содержащих УН, один с мутацией 0100А, а второй - с мутацией Ό100Ε. Их способность конкурировать при связывании Еи-ТМС-2206 оценивали с помощью анализа определения К1 в сравнении с химерным антителом мышь-человек ТМС-2206. Мутант Э100А был полностью неактивен при концентрациях до 0,9 мкМ, что представляет собой большее, чем в 1600 раз изменение активности по сравнению с химерным антителом мышь-человек ТМС-2206. В отличие от этого, мутант с реверсивной нагрузкой в 0100Я был практически настолько же активным, как и химерное антитело мышь-человек ТМС-2206, о чем свидетельствуют похожие величины К1 (0,41 нМ в сравнении с 0,52 нМ). Это является доказательством отсутствия какого-либо участия остатка Ό100 ТМС-2206 в образовании хелатного комплекса металла, который образует ΜI^Αδ-сайт лиганда.
Для изучения специфичности связывания ТМС-2206 были проведены дополнительные исследования, которые включали картирование эпитопов с этим моноклональным антителом мыши, которое направлено против Ι-домена человеческого интегрина α2β1. ТМС-2206 дает перекрестную реакцию с крысиным интегрином α2β1, но не вступает в перекрестную реакцию с интегрином α2β1 мыши. Так как белки интегрина α2β1, все, имеют большую гомологичность в рамках разных видов, остатки α2β1, которые имеют важное значение для связывания антител, были определены способами, позволяющими определить различия, существующие между интегринами разных видов, которые вступают в перекрестную реакцию с антителами, по сравнению с теми, которые не вступают (например, Скатре е1 а1., 1. Вю1. Скет. 270(3):1388-94 (1995); Кагрихах е1 а1., 1. Мо1. Вю1. 327(5):1031-41 (2003); ВоппеГоу е1 а1., В1ооб. 101(4):1375-83). Была проанализирована кристаллическая структура Ι-домена интегрина а2 отдельно и в виде комплекса с лигандом-мишенью коллагеном (Етх1еу е1 а1., 1. Вю1. Скет. 272(45):28512-7 (1997); Етх1еу е1 а1., Се11. 101(1):47-56 (2000)). Сравнение последовательное α2 Ι человека (δερ ΙΌ ΝΟ: 11), α2 Ι крысы (δερ ΙΌ ΝΟ: 93) и α2 Ι мыши (δερ ΙΌ ΝΟ: 94) доменов, полученных от СепЬапк, показаны в табл. 28. Этот анализ показывает, что Ι-домен мыши содержит 14 остатков, которые отличаются как от крысиных, так и от человеческих Ι-доменов а2 (показаны жирным шрифтом и подчеркнуты в табл. 28). Эти остатки были использованы для дальнейшего изучения связывающего эпитопа ТМС-2206.
- 62 016245
Таблица 28
«21 Человека 1 ЗРЕГОЬЗАЗГ ЗРАТОРСРЗЬ ЮУУЧУСРЕЗ №1УРТОАЧК игьекгчссь ϋίορτκτονο
а2I Крысы 1 ЗРОЕОЗЬТЗР ЗРАЧ-------фРЧУУЧСОЕЗ №1УРИЕАУК ЙЕЬЕКРУфСЬ ϋΙΟΡΚΚΤΏνΑ
α2I Мыши 1 ЗРОЕ’ОЕЬТЗГ ЗРАЧОАСРЗЬ УРУЧУЧСРЕЗ Ν3ΙΥΡΝΕΑ4Κ ЫРЬУКЕУТСЬ Р1СРККТ0ЧА
α2Ι Человека 61 ΏΙΟΥΑΝΝΡΚν νΓΝΕΝΤΥΚΤΚ ЕЕМ1УАТ30Т ЗОТССРЬТЫТ Γ6ΑΙΦΥΑΚΚΥ ΑΥ3ΑΑ3Ε6ΚΚ
α2Ι Крысы 61 ЫСУАИОРКУ νΓΝΕΤΤΥΚΝΚ ЕРМЧ<2АТЗЕТ ЕЮУССОЬТИТ ΓΚΑΙφΕΑΚϋΙ ΑΥΙ.ΡΕ533ΚΡ
α2Ι Мыши 61 ΣΙΟΥΑΝΕΡΗΙ ΙΓΝΕΝΜΈΤΚ ЕОМУСАТЗЕТ КОНССРЬТИТ ΕΚΑΙΕΕΑΚΡΥ АУЗОТЗСЗКР
α2Ι Человека 121 ЗАТКЧМУЧЧТ ОСЕЗНРЗЗМЬ КАУЮОСЯНО ΝΙΕΕΕΟΙΑνί, ΟΥΙΝΒΝΑΣΟΤ КИЫКЕ1КА1
а2I Крысы 121 САТКЧМУЧУТ ЕСЕЗНРСЗКЬ ОТУЮОСИРО Е1ЬКГС1АУЬ ΰΥΕΝΕΝΑΕΡΤ КИЫКЕ1КА1
а21 Мыши 121 САТКЧМУЧУТ ЕбЕЗНРСЗКЬ КТУЮОСЫРР Е11КЕС1АУЬ ΕΥΣΝΚΝΑΙϋΤ КИЫКЕ1КА1
а21 Человека 181 Α3ΙΡΤΕΒΥΕΕ ЙУЗСЕААЬЪЕ КА6ТЬ6Е01Г 51Е6ТЧ0ССО ΝΕφΜΕΜ
1 Крысы 181 Α3ΤΡΤΕΚΥΕΓ ΝνΑϋΕΑΑΙ.ΕΕ КАСТЬСЕНГГ ЗГЕСТЧОбеР ΝΓ0ΜΕΜΑ0
«21 Мыши 181 Α5ΤΡΤΕΚΥΓΓ ЫЧЗ ΟΕΆΆΙ,Ι,Ε КАСТЬСЕЙХГ 31ЕСТУ0ССР ΝΕΌΜΕΜ30
Ι-домены С8Т-О.2 мыши и крысы были клонированы как С8Т-слитые белки для подтверждения методом ПЦР, как это описано в примере 3, того, что необходимая перекрестная реактивность обеспечена соответствующими Ι-доменами. Ι-домен α2 мыши был клонирован из мРНК, выделенной из почки мышей линии Ва1Ь/С с помощью ОТ-ПЦР с применением праймеров та1р1а1 Е (8ЕЦ ΙΌ ЫО: 121) и та1р1а1 К (8ЕР ΙΌ ЫО: 122), а крысиный Ι-домен α2 - из почки крыс линии 8ргадие Эа\у1еу с помощью ОТ-ПЦР с применением праймеров га1рйа1 Е (8ЕЦ ΙΌ ЫО: 123) и га1рйа1 К (8ЕЦ ΙΌ ЫО: 124). В дополнение к этому два Ι-домена α2 нечеловекообразных приматов были клонированы из осадка лейкоцитов крови, полученного центрифугированием на малой скорости свежей крови, взятой отдельно у макак-резусов и макак-крабоедов. Лейкоциты затем подвергали быстрому замораживанию жидким азотом. Всего подвергли лизису 5х106 клеток (для резусов) и 2х106 клеток (для крабоедов) в 1 мл тризола (^йгодеи, са!а1од Ыо 15596-026) и РНК готовили, как описано выше. Полученный осадок РНК ресуспендировали в 50 мкл ОЕРС-обработанной Н2О. Она послужила шаблоном для первого шага обратной транскриптазы (ОТ). Реакция ОТ состояла из 8 мкл клеточной РНК (2,24 мкг для мРНК резусов, 1,44 мкг для мРНК крабоедов, 1 мкл (10 мМ) ЭЫТР и 1 мкл (2 мкМ) прямого праймера человеческого Ι-домена (ССССАТССАСТССТСАТТТ; 8ЕЦ ΙΌ ЫО: 119)). Эту смесь инкубировали при 65°С в течение 5 мин, охлаждали на льду. 5 мкл этих кДНК потом использовали как шаблоны для реакции ПЦР-амплификации с применением человеческих прямых и обратных праймеров (прямые: ССССАТССАСТССТСАТТТ, 8ЕС ΙΌ ЫО: 119; обратные: ССААТТСААСАСТАССТТ, 8ЕЦ ΙΌ ЫО: 120). Продолжительности циклов: 1 цикл при 94°С в течение 30 с, 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с, 40 циклов при 68°С в течение 1 мин и 1 цикл при 68°С в течение 5 мин. Продукты ПЦР выделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, полосу (ожидаемого размера) напрямую очищали от агарозного геля, расщепляли ВатШ и ЕсоКЕ клонировали в те же сайты вектора рСЕХ-2ТК и трансформировали в бактерию ВЬ21.
Единичные колонии выделяли и последовательности инсерционных сегментов секвенировали с применением ДНК-анализатора Весктаи СЕО 8000 для проверки идентичности Ι-доменов α2 мыши и крысы и определения гомологичности последовательностей для двух видов обезьян с человеческими. Клонированная последовательность мыши показала полную идентичность с областью Ι-домена осажденной последовательности ЫМ_008396.1. Подобным образом, клонированная крысиная последовательность была идентична образцам из СеиЬаик для крысиного интегрина, ХМ_34156.1, за исключением того, что клонированная последовательность содержала 6 дополнительных остатков по сравнению с полученной в осадке последовательностью, что позволило точно транслировать регион между остатками 16 и 21 (остатки от 139 по 144 интактного интегрина α2) крысиного домена. Эта последовательность аминокислот АСР8ЬУ была идентична остаткам мыши в этих положениях.
- 63 016245
На уровне нуклеотидов последовательности двух приматов показали очень большую гомологичность с последовательностями человеческого Ι-домена α2. Ι-домен α2 резуса в нуклеотидной последовательности (8ЕО ΙΌ N0: 104) показал различие только в одном нуклеотиде по сравнению с человеческой последовательностью нуклеотидов, а именно в пределах кодона 50 была замена СТТ на СТС, но так как оба остатка кодируют лейцин, расшифрованные последовательности белка были идентичны человеческим. Ι-домен α2 нуклеотидной последовательности крабоеда (8Е0 ΙΌ N0: 103) был идентичен человеческому, кроме кодона 40, где человеческий ААС был изменен на САС. Это привело к замене остатка лизина на остаток аспарагиновой кислоты в этом положении. Однако дальнейшие исследования показали, что такая замена нуклеотидов произошла из-за полиморфизма, который не сохраняется у других животных, так как Ι-домен α2 других крабоедов показал 100% гомологичность с человеческим (см. пример 18).
Слитые белки экспрессировали и очищали, как описано выше для человеческого С8Т-слитого белка Ι-домена α2. Анализ материала, элюированного из глутатион-сефарозной колонки, показал, что слитый белок грызунов содержал агрегатные формы. Поэтому эти и слитые белки приматов снова очищали с помощью гель-хроматографии на колонке 8еркабех 75 10/30 (СЕ-Атегккат) (примат) с помощью жидкостной экспресс-хроматографии белков (ЕРЬС) в системе АЙа-Вабс ЕРЬС (СЕ-Ате^Иат), собирая монометрическую фракцию. С8Т-слитые белки далее исследовали на способность связывать иммобилизированный ТМС-2206, а также на способность конкурировать с Еи-маркированным ТМС-2206 за связывание с иммобилизированным человеческим интегрином α2β1. Были выполнены анализы К1, как описано в примере 2. Для оценки прямого связывания с ТМС-2206 планшеты Iтти1οи 4 покрывали 50 мкл бикарбонатного раствора (рН 9,0), содержащего 5 мкг/мл ТМС-2206. Планшеты запечатывали и оставляли на ночь при 4°С. На следующее утро планшеты дважды промывали раствором ТВ8, а после блокировали с применением 200 мкл блокирующего раствора, описанного выше, в течение 1 ч при комнатной температуре и встряхивании. После блокирования блокирующий раствор удаляли, но лунки не промывали. Вместо этого выполняли одно серийное разведение С8Т-слитого белка, добавляли в лунки и после инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре и встряхивании. Лунки аспирировали, к ним в течение 5 мин при комнатной температуре добавляли промывочный буферный раствор ТВ8. Промывание повторяли еще два раза, прежде чем применить вторичное антитело. Шаг применения вторичного антитела заключался в том, что НВР-конъюгированное кроличье антитело к анти-С8Т (от Атегккат) разводили в отношении 1:2000 в блокирующем буфере. В каждую лунку добавляли 100 мкл вторичного антитела и инкубировали при комнатной температуре в течение 1,5 ч при встряхивании. Лунки снова аспирировали и промывали три раза промывочным буфером перед добавлением субстрата реакционной смеси. Далее, в каждую лунку на 6 мин добавляли по 100 мкл субстрата реакционной смеси (1:1 разведение набора ТМВ). Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 0,1 М Н2804. Степень протекания реакции в лунках потом считывали и рассчитывали с применением спектрофотометрической абсорбции на планшетном ридере Мο1еси1а^ Оупаписх и связанном с ним программном обеспечении 8οйтаx соответственно. Величины Кб рассчитывали по значениям ЕС50 с применением программного обеспечения Ргбш (Сгаркраб, СА).
Наблюдалось 3-кратное изменение Кб для связывания крысиного α2 Ι с ТМС-2206 по сравнению с α2 человека, а С8Т-слитый белок α2 Ι мыши продемонстрировал только незначительное специфичное связывание при наивысшей концентрации, демонстрируя большее чем в 1500 раз изменение аффинности (см. табл. 29). С8Т-а2 Ι резуса продемонстрировал аффинность, сравнимую с человеческим, тогда как неожиданно С8Т-а2 Ι макаки-крабоеда не показал никакой аффинности к ТМС-2206 вплоть до концентрации 1 мкМ. Такие же относительные зависимости наблюдались и в анализе К1. Недостаток перекрестной реактивности Ι-домена С8Т-слитого белка крабоеда к ТМС-2206 показывает, что остаток К40 может быть детерминантой эпитопа. Различие в аффинности клонированного крысиного С8Т α2 Ι (Кб от 0,54 нМ и величина К1 от 3,8 нМ) по сравнению с человеческим С8Т-слитым белком α2 Ι (Кб=0,18 и величина К1=0,33 нМ) коррелирует с различием в значениях ЕС50, полученных при анализе ТМС-2206, на его способность антагонизировать адгезию свежих крысиных тромбоцитов по сравнению с человеческими тромбоцитами к коллагену типа 1, как описано в примере 9. Подобным образом, отсутствие перекрестной реактивности гибридного белка С8Т мыши-а2 Ι к ТМС-2206 коррелирует с недостатком перекрестной реакивности антитела с интактным интегрином α2β1 мыши.
- 64 016245
Таблица 29
Слитый белок Κά (нМ) К,(нМ)
6а21 0,18 0,33
крысиный-а2 0,54 3,8
мышиный-а2 н/о* н/о*
крабоед а2 н/о при 40нМ н/о*
резус а2 0,04 4,4
Θ8Τ н/о* н/о*
‘показания н/о не определяются вплоть до концентраций -1 мкМ
В дополнительных исследованиях 14 остатков, соответствующих уникальным отличиям Ι-домена мышиного α2 от Ι-доменов человеческого и крысиного α2, были отдельно мутированы посредством ПЦР в клонированный слитый белок человеческого Ι-домена α2 с применением стандартных способов молекулярной биологии (последовательности праймеров показаны в табл. 30). Индивидуальные бактериальные клоны для проверки правильности мутации секвенировали и вводили в Ι-домен. Первый предполагаемый вариант, мутант С101В, не дал корректный клон, и его изучение продолжено не было. Праймеры, созданные на образование мутации Υ93^ дали один набор клонов, которые вместо нее несли мутацию Υ93Ό. Были оценены оба варианта Υ93. Оставшиеся варианты, все, имели правильные последовательности. Полученные в результате белковые варианты экспрессировали и очищали, как описано выше для Ιдомена человеческого С8Т-слитого белка α2 дикого типа (те!). После была изучена их активность в трех направлениях: во-первых - на их относительную способность связывать различные коллагены, чтобы убедиться, что мутации не повлекли за собой грубые конформационные смещения, которые мешали бы связыванию лигандов; во-вторых - на их аффинность к ТМС-2206 (прямое связывание с иммобилизированным ТМС-2206, измеренное с помощью ИФА) и в-третих - на способность действовать как конкурентные лиганды в анализе К1. Данные о К1 и соответствующие данные по Кб также суммированы в табл. 30.
Таблица 30
Мутации слитого белка Наблюдаемые кб (нМ) К| (нМ)
1-домен 6(2 0,31 0,18
1-домен 6(2 12IV 0,28 0,24
1-домен 6(2 Ε44ν 0,23 0,35
1-домен 6(2 О48Т 0,19 0,73
1-домен 6(2 Ν67Ε 0,28 0,40
1-домен 6(2 У701 0,44 0,86
1-домен 6(2 У711 0,19 0,83
1-домен 6(2 Τ76ϋ 0,17 0,15
1-домен 6(2 Υ77Ε 0,22 0,39
1-домен Ь<2 К78Е 0,16 0,51
1-домен 6(2 Υ93ϋ н/о при 440 нМ н/о*
1-домен Ιί<2 Υ93Η 6,1 н/о*
1-домен 6(2 Ω105Ε 0,15 0,38
1-домен 6(2 А114Θ 0,19 0,64
1-домен 6(2 А115Т 0,19 0,76
*н/о = не определено вплоть до концентрации ~1мкМ
Из 13 изученных остатков 12 были заменены на аналоги мыши с минимальным влиянием на аффинность, однако изменения в Υ93 вызвали заметную потерю аффинности, как показано в табл. 31. Мутация Υ93Ό исключила способность к связыванию с антигеном даже при концентрации на 3 порядка выше величины Кб для Ι-домена С8Т-слитого белка дикого типа. Замена на гистидин мыши (У93Н) вызывала уменьшение наблюдаемой аффинности к антигену ТМС-2206 в 23 раза. Обе мутации исключили способность Ι-домена С8Т противодействовать связыванию Ен-меченого антитела со своим антигеном. Замена Н93 мыши на Υ придала способность Ι-домену α2 мыши связывать ТМС-2206, хотя и с уменьшением силы связывания в 200 раз относительно Ι-домена человеческого α2 дикого типа, как показано в табл. 31.
- 65 016245
Таблица 31
Мутации слитого белка Примененные праймеры К,(нМ)
1-домен Н(2 0,28
1-домен 1з(2 Е195УУ Ьа1рНа1Е195)Л/Е (ЗЕО Ю №:159) Ьа1рпа1Е195\Л/В (ЗЕО Ю №:160) 12,8
Ι-домен Ь<2 В1651Э Ьа1р11а1В165О Е (8ЕО Ю №:155) Ьа1рНа1Е?165О К (8ΕΩ Ю №:156) 1987
1-домен Н(2 N1660 На1р1ла1М1ввС Е (8ЕО Ю №:157) Ьа1рКа1М166С К (8ЕО Ю №:158) н/о
Ι-домен Ь<2 Υ93Ε На1рЬа1У93Е Е (8ЕО Ю №:145) Ьа[рНаГГ93Е К (8ЕО Ю №:146) н/о
1-домен 11(2 К4СЮ па1рпа1К4СЮ Е (8ΕΩ 10 №:161) На1рНа1К40О К (ЗЕО Ю №:162) н/о
1-домен 11(2 Ν73ϋ На1рНа1Ы73О Е (8ЕО Ю №:165) Ьа1р1ла1М73О В (8ЕО ΙΟ №:166) 2,17
1-домен Н(2 089 Н На1р11аЮ89Н Е (8Е0 Ю №:167) На1р11аЮ89Н В (8ЕО Ю №:168) 4,46
Мутации а21 мыши
1-домен т(2 Η93Υ та1р11а1Н93У Е (8ЕО Ю №:169) та1рЬа1Н93У В (8ЕО Ю №:170) 20,2
Сравнение кристаллических структур для человеческого Ι-домена а2 в свернутой ЩСВ1 ΡΌΒ запись 1А0Х) и открытой, лигандсвязывающей (ΡΌΒ запись 1ΌΖΙ) конформации показало, что Υ93 расположен на передней части Ι-домена и находится за а7-спиралью, которая претерпевает большое движение вниз при связывании лиганда (Етз1еу е1 а1., I. Вю1. СНет. 272:28512 (1997) и Се11. 100:47 (2000)). Хотя ранее это не было определено как конформационное изменение, связанное со связыванием лиганда, исследование кристаллических структур показало, что в закрытой конформации ароматическое кольцо Υ93 выступает за рамки поверхности белка, но примыкает по сторонам и вниз, выстраиваясь вдоль передней поверхности Ι-домена в открытой лигандсвязывающей конформации. Чтобы изучить, зависит ли связывание ТМС-2206 с интегрином α2β1 от данного конформационного состояния, были введены мутации в Ι-домен, способствующие сохранению его открытой конформации. Мутация Е195А (Е318 в интактном интегрине а2), как сообщалось, фиксирует человеческий Ι-домен а2 в открытой конформации (АдцШпа е1 а1., Еиг. I. ВюсНет. 269(4):1136-44 (2002)) поэтому ее применение позволяет обнаружить, распознает ли антитело активационно-зависимую конформацию или нет. В дополнение к этому кристаллографические исследования показали, что Е195 формирует не выступающий наружу солевой мостик в остатке В165, расположенном в аС-петле, служащем для удержания петли аС в конформации, которая прикрывает сайт связывания лиганда (Етз1еу е1 а1., Се11. 100:47 (2000)). Наличие аС-петли предполагает расширенную конформацию в открытом положении, причем оба остатка - К165 и примыкающий к нему В166 обусловливают связывание с коллагеном (Етз1еу е1 а1., I. Вю1. СНет. 272:28512 (1997) и Се11. 100:47 (2000); Кару1а е1 а1., I. Вю1. СНет. 275:3348 (2000)). Поэтому были сконструированы четыре мутации: Е195А; мутация Β165Ό, для обращения заряда, чтобы таким образом разрушить солевой мостик, который образуется с Е195А в закрытой конформации, и мутация N1660, также для обращения заряда внутри аС-спирали. Замена Е195А вызвала уменьшение в 45 раз величины К1, как показано в табл. 31, что указывает на то, что антитело ТМС-2206 проявляет большую аффинность к закрытой конформации. Оба
- 66 016245 изменения К165Э и Ν166Ό исключили способность Ι-домена связывать эпитоп ТМС-2206, даже при концентрациях, поднимающихся до 1 мкМ, что снова приводит к выводу, что антитело ТМС-2206 распознает закрытую конформацию.
Исходя из исследований мутагенеза и конформации, оказалось, что Υ93 в закрытой конформации может играть роль при связывании ТМС-2206 и может обеспечивать одну детерминанту для видовой специфичности при связывании. Неожиданные результаты, полученные с полиморфным Ι-доменом крабоеда, показали, что остаток К40 может также играть роль во взаимодействии антиген-ТМС-2206. Компьютерное моделирование антитела ТМС-2206 показало, что СЭК-области образуют относительно плоский сайт связывания, что предполагает вступление антитела во множественные контакты с антигеном. Так как несколько остатков в пределах СОК-областей имеют заряды, то заряженные остатки, окружающие Υ93 в закрытом положении, которые также продемонстрировали значительные позиционные изменения в открытой конформации, были определены по структурам базы данных белков РОВ обоих открытых и закрытых конформеров как К40, К69, N73 и 089. Заряды трех из этих остатков были изменены получением мутантов К40Э, К69Э и Ν73Ό и модифицированы в четвертый получением варианта О89Н, как показано в табл. 31. В дополнение был создан третий вариант остатка 93 заменой тирозина на фенилаланин, чтобы определить, был ли ароматический характер тирозина важной структурной характеристикой или активность зависела от наличия гидроксиароматического заместителя, характерного для тирозина. Для данного набора мутаций все компоненты были подвергнуты очистке с помощью ВЭЖХ для обогащения мономерной фракцией белковых препаратов, полученных с помощью аффинной хроматографии на колонке с глутатион-сефарозой. Каждый вариант был сначала испытан на функциональность путем оценки связывания с коллагеном. Все варианты, кроме К69О, связывали коллаген с величиной ЕС50, подобной значению для Ι-домена человеческого α2 дикого типа. Соответственно, К69Э дальше не изучался. Для оставшихся мутантов введение варианта К40Э исключило способность конкурировать за связывание с эпитопом ТМС-2206. Это соответствовало результатам, полученным для клонированного Ι-домена крабоеда, у которого в этом остатке наблюдался полиморфизм (замена лизина на аспарагиновую кислоту). Похожим образом, мутация Υ93Ρ также исключила способность конкурировать за связывание с ЕИ-ТМС-2206. Ν73Ό и О89Н показали уменьшение величины К1 до 7,8 и 15,9 соответственно (табл. 30). Рассмотренные вместе результаты мутаций показывают, что остатки К40, Υ93, К165 и N166 могут быть детерминантами для связывания ТМС-2206 с его эпитопом и что N73 и 089 также влияют на энергию связывания.
Эти данные указывают, что антитело МС-2206, его производные и антитела, подобные ТМС-2206 (например, АК7), которые распознают тот же эпитоп, что и ТМС-2206 или подобные ему (см. например, пример 13), являются атипичными, нелигандными миметрическими антагонистами взаимодействий α2β1-коллаген связей. Этот вывод подтверждается ί) их способностью блокировать α2β1 интегрин опосредованную адгезию к коллагену независимо от наличия двухвалентных катионов, ίί) такое ингибирование не включает взаимодействие критической кислотной группы, такой как Ό100 внутри Н-СОК3, с МГОАБ, ίίί) антитело связывается с поверхностью Ι-домена, который отдален от непосредственного сайта связывания лиганда, ίν) сайт связывания ТМС-2206 содействует закрытой конформации рецептора и включает остатки аминокислот К40, N73, 089, Υ93, К165 и N166. Соответственно связывание ТМС-2206 и антител, подобных ТМС-2206 (например, распознающих тот же или подобный ТМС-2206 эпитоп), не будет поддерживать интегрин опосредованный сигнал снаружи-внутрь, который обычно происходит после вовлечения когнатного коллагенового лиганда, и именно такой способ связывания может повлиять на не вызывающий кровотечение профиль этого антитела и антител, подобных ТМС-2206.
Пример 13.
Проводились исследования с целью сравнить связывание других функционально блокирующих моновалентных антител к интегрину α2 с ТМС-2206. Результаты картирования, представленные в примере 12, показали, что оказывается антитело ТМС-2206 связывается с закрытой конформацией Ι-домена интегрина α2 и/или не выступает в качестве миметика лиганда. Данные неожиданные результаты, а также неожиданные результаты исследований, связанных с тромбоцитами, представленные в примерах 8-11, продемонстрировали, что эпитоп ТМС-2206 является особенно предпочтительным и что антитела, похожие по своим функциональным свойствам на ТМС-2206, являются особенно полезными. Как описывается здесь далее, были разработаны скрининговые методы для определения таких подобных антител и при помощи таких методов антитела были идентифицированы.
Для определения, какие функциональные блокирующие антитела к интегрину анти-а2 связывают ТМС-2206 таким же образом, был проведен ряд исследований перекрестной конкуренции. Для изучения коммерчески доступных человеческих антител к интегрину α2 человеческий СБТ-слитый белок α2 Ι иммобилизировали на микротитровальных планшетах, как указано выше. Подвергли анализу следующие антитела: АК7 (Мо/игоу е! а1., ТйготЬ. Наетοк!. 66(4):494-9 (1991)), Р1Е6 (\аупег е! а1., I. Се11. Вю1. 107(5):1881-91 (1988)), 10С11 (С11!ау е! а1., Вксб. 73(5):1235-41 (1989)) и А2-11Е10 (Вегде1!юп е! а1., Се11. Абйек. &μιπ. 2(5):455-64 (1994)), которые поставляются в продажу соответственно компаниями СЬетгссп (Тетеси1а, СА; номера по каталогу, СВЬ477 (АК7); МАВ1950 (Р1Е6); МАВ1988 (10С11) и
- 67 016245
Ирк1а1е (№аИйат, МА; А2-ПЕ10, номер по каталогу 05-227). Антитела анализировали с помощью того же набора микротитровальных планшетов, покрытых тромбоцитами α2β1 в используемых в картированных исследованиях эпитопов для определения их способности противодействовать связыванию ТМС-2206 с европиевой меткой. В другом виде исследований определяли способность антител противодействовать связыванию свежевыделенных, покоящихся тромбоцитов с коллагеном типа 1. Таким образом, способность различных антител, направленных против человеческого интегрина α2, противодействовать связыванию ТМС-2206 антитела с тромбоцитарным α2β1 в микротитровальных планшетах была измерена как значение К1, в то время как их противодействие адгезии покоящихся тромбоцитов с коллагеном типа 1 в статических условиях было измерено как значения ЕС50. Результаты, представленные в табл. 32, показывают, что АК7 антитело является эффективным конкурентом ТМС-2206. Клон 10С11 продемонстрировал явную бифазную конкуренцию ТМС-2206, поэтому предполагают, что он не является простым конкурентным антагонистом. А2-ПЕ10 продемонстрировал 10-кратное отличие по сравнению с ТМС-2206 при блокировании адгезии тромбоцитов, при этом приблизительно 350-кратное отличие в его способности конкурировать с меченым европием ТМС-2206, что снова указывает на то, что отсутствует прямая согласованность между двумя антителами. Р1Е6 не проявил какой-либо активности эффекат ни в одном анализе, указывая на то, что он распознает активированную конформацию.
Таблица 32
Конкурентное антитело Κι (нМ) ес50
ТМС-2206 0,11 6
АК7 0,07
10611 Высокая афин ность 0,05 Низкая афинность 7,7 >200
Α2-ΙΙΕ10 29,6 68
: Р1Е6 *[Нет конкуренции] *[Нет эффекта]
1д6 контроль *[Нет конкуренции] *[Нет эффекта]
*Не выявлено во время проведения указанных анализов.
Эти данные впервые демонстрируют, что не все функциональные блокирующие моновалентные антитела связывают интегрином α2 одинаковым образом, и, помимо этого, они показали способы определения новой подгруппы антител, подобных по эпитопной специфичности к ТМС-2206, с подобной функциональной блокирующей активностью. Эти данные также демонстрируют, что данная новая подгруппа антител к α2, в которую входят ТМС-2206 и антитела, подобные по эпитопной специфичности ТМС2206, характеризуется неожиданным отсутствием осложнений в виде кровотечений ίη νί\Ό и/или отсутствием активации тромбоцитов интегрином α2β1. Эпитопная специфичность, функциональная блокирующая активность и другие преимущества (например, отсутствие активации тромбоцитов) не являются характеристиками всех человеческих функционально-блокирующих антител к интегрину α2β1, а являются новой характеристикой новой подгруппы антител, в которую входят ТМС-2206 и подобные антитела, включая производные и/или варианты ТМС-2206, которые можно определить и/или выбрать согласно описанию данного изобретения.
После того как было показано, что не все функциональные блокирующие антитела, которые связывают Ι-доменом интегрина α2, связывают тем же эпитопом ТМС-2206 или подобным (например, перекрывающим) эпитопом ТМС-2206, проводились исследования с целью определить, будет ли суррогатное антитело, использованое для исследования эффективности антител, мыши иметь такие же свойства, как и ТМС-2206. Поскольку антитело На1/29 дает перекрестную реакцию с интегрином α2 мыши и крысы, а ТМС-2206 антитело связывается как с человеческим, так и с крысиным интегрином α2, то для определения, связываются ли два антитела в перекрывающихся участках (например, имеют общую эпитопную специфичность), применяли крысиный С8Т-слитый белок. С этой целью Ι-домен крысиного С8Тслитого белка α2 иммобилизировали на микротитровальных планшетах ВеасЕ-Втб, покрытых глутатионом (Р1егсе В^оΐесЬио1оду, Шс. ВоскГогб, ГЬ). Сначала определяли Кб связывания Еи-ТМС-2206 с Ιдоменом иммобилизированного крысино-человеческого С8Т α2 при температуре 37°С согласно описанию в примере 2. Анализ Скэтчарда на связанный и свободный Еи-ТМС-2206 показал, что значения Кб составляют 0,2 нМ для Ι-домена человеческого α2 и 1,3 нМ (6-кратный прирост) для Ι-домена крысиного α2. Затем способность меченного европием ТМС-2206 связываться с Ι-доменом крысиного α2 в присутствии различных концентраций конкурентного антитела оценивали согласно описанию в примере 2, при этом для расчета значений Κ1 из измеренного значения ЕС50 применяли значение Кб, равное 1,3 нМ. Антитело На1/29 (Меибпск апб Ке11у, ЬаЬ бгсекЕ 69(6):690-702 (1993)), но не антитело НМа2 (М1уаке е1 а1., Еиг. ί. ^тимк 24:2000-2005 (1994)), выступало эффективным антагонистом связывания Еи-ТМС-2206,
- 68 016245 указывая на то, что антитело На1/29 связывает сайты (например, перекрывающиеся), подобные сайтам связывания ТМС-2206.
Пример 14.
Также проводили исследование типичных антител ^Сд, содержащих тяжелую цепь ΐνΗ14.0 γ4 (8Е0 ΙΌ N0: 174) или тяжелую цепь ΐνΗ12.0 γ4 (8Е0 ΙΌ N0: 176) и легкую цепь 1УЫ0.0р (8Е0 ΙΌ N0: 178). Данное исследование оценивает, приводит ли связывание таких Ι§&·| антител к активации тромбоцитов, что измеряют с помощью вызванной коллагеном агрегации тромбоцитов. После сброса первых 3,0 мл свободно текущей крови пробы крови отбирали посредством венопункции из предузелковой жилки в наполненные вакуумом пробирки, в которых содержалось 3,8% цитрата натрия. Все антитела разводили в солевом растворе до конечных концентраций 140 нг/мл. Каждую аликвоту 0,5 мл цитратной цельной крови с 0,5 мл солевого раствора или раствора антител помещали в одноразовую кювету (в которой находился одноразовый электрод). Каждую кювету предварительно нагревали до температуры 37°С в течение 5 мин в тепловой лунке агрегометра (модель 591 А, Сйгопо-Ьод, Ηаνе^ιο\νη. РА), затем ее помещали в реакционную лунку, устанавливали начальную линию, а затем добавляли 20 мкл коллагена (1 мг/мл; конский коллаген тип Ι, Сйгопо-Ьод) для инициации реакции агрегации. Во время агрегации на экспонируемых поверхностях электродов образовывалось скопление тромбоцитов, что приводило к увеличению сопротивления. На протяжении 6 мин собирали показатели изменения сопротивления (ΔΩ, Ом), которые записывались регистрирующим записывающим устройством (модель 707, Сйгопо-Ьод).
Для анализа данных (табл. 33) использовали тест Крускала-Уоллиса. Этот тест применялся для проверки гипотезы, что популяционные оценки медианы каждой (солевой раствор или коллаген) из четырех групп будут эквивалентными, и эта гипотеза не будет верна (95% достоверности), если Р-значения будут меньшими или равными 0,05. Что касается солевой группы (Р-значение = 0,148), то ни антитела, используемые в качестве изотипного контроля, ни два гуманизированных антитела не вызывали агрегацию человеческих тромбоцитов по сравнению с солевым отрицательным контролем. Что касается коллагеновой группы (Р-значение = 0,201), то ни антитела, используемые в качестве изотипного контроля, ни два гуманизированных антитела не ингибировали вызванную коллагеном агрегацию по сравнению с солевым отрицательным контролем. Результаты данного исследования, а также результаты исследования из примера 8 показывают, что связывание ТМС-2206 и двух гуманизированных ^С4 вариантных антител не влияет на вызванную коллагеном агрегацию тромбоцитов при тестировании ш \т1го во всех проверенных концентрациях.
Таблица 33
Агонист Анализируемый образец Рзначение
Солевой раствор ЫдС4/к 1ИдО4/к νΗ14.0Λ/Μ0 .00 ЫдС4/к Х/Н12.0Л/1_10 .00
Солевой раствор 1,0, 2,4, 2,8, 2,8, 2,8, 3,8 2,4, 5,2, 5,6, 5,6 2,2, 3,0, 3,4, 4,2 2,8, 3,6, 3,8, 5,2 0,148
Коллаген 17,8, 18,2, 19,4, 20,4, 21,1, 21,6 15,3, 17,2, 18,4 15,0, 15,2, 16,0,21,8 13,2, 14,8, 18,1, 20,0 0,201
Пример 15.
Гуманизированный ТМС-2206 (ЫдС4/к'УШ2.0/'УЫ0.0Р) был проверен на способность блокировать связывание α2β1-интегринопосредованной адгезии клеток к коллагену типа 1 с использованием 0Η0 α2 клеток, ΗΏ080 клеток (человеческой фибросаркомы) и человеческих тромбоцитов, используя процедуру, описанную в примере 2. Гуманизированный ТМС-2206 являлся сильнодействующим ингибитором связывания клеток с коллагеном при значениях ЕС50, подобных ТМС-2206 (табл. 34).
Таблица 34
Источник коллагена типа 1 Клетки ТМС-2206 ЕС60(нм) (среднее ± СОС) гуманизированнный ТМС2206 ЕСя)(нм) (среднее ± СОС)
Крысиный хвост Человеческие тромбоциты 3,1 ±0,3 4,7 ± 0,3
НТ1080 0,90 + 0,02 0,90 ± 0,27
СНО о2 0,58 ± 0,51 1,9 ± 1,5
Человеческая плацента Человеческие тромбоциты (п = 1) 8,44 13,1
- 69 016245
Пример 16.
Гуманизированный ТМС-2206 был выделен в отдельный ряд из-за его способности связываться с иммобилизированным человеческим интегрином α1β1 в ИФА-формате. Человеческий интегрин α 1β1 (СНеписоп !п1егпа11опа1) растворяли в буфере для сорбции (25 мМ Так, рН 7,5, 150 мМ №С1, 1 мМ МдС12) до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. 96-луночные иммунопланшеты покрывали α1β1 по 50 нг/лунку и инкубировали всю ночь при температуре 4°С. Планшеты промывали три раза промывочным буфером (50 мМ Тпк, рН 7,5, 150 мМ №С1, 2 мМ МдС12, 0,5% Т\уееп-20) и блокировали 5% мас.(об.) обезжиренным молоком в промывочном буфере в течение 1 ч при комнатной температуре. Гуманизированное ТМС-2206, человеческое !^Ο.4/κ (изотипный контроль), антитело мыши к α1 человека (ЕВ-12, СНепйсоп [п1егпаиопа1 подвергали серийному разведению в связывающем буфере (0,1 мг/мл В8А, без ^6 в промывочном буфере). К α 1 [Ч-покрытым планшетам добавляли по 50 мкл/лунку хорошо разбавленных растворов антител, инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и затем промывали три раза. В лунки, содержащие изотипный контроль и гуманизированный ТМС-2206, добавляли конъюгат козьего античеловеческого ^6 и щелочной фосфатазы (вспомогательное антитело, 1асккоп IттиηοКе8еа^сй ЬаЬогакпек, \Уек1 Сгоус, РА); коньюгат ^6 козы к антителу мыши и щелочной фосфатазы (81дта) добавляли в лунки, содержащие ЕВ-12. После инкубирования в течение 1 ч при комнатной температуре планшеты промывали три раза, инкубировали в растворе субстрата (1 мг/мл 4-нитрофенилфосфата, 0,1 М диэтаноламина, 5 мМ МдС12, рН 9,8) в течение 20 мин и гасили №10Н. Абсорбцию (при 405 нм) считывали планшетным ридером 8рес1гатах Р1ик, используя программное обеспечение 8ойтах Рго. Подобные ТМС-2206, гуманизированные ТМС-2206 и кС./к антитела не связывались с α1β1. Контрольное антитело к анти-α 1 β 1 (ЕВ-12) связывается с α1β1 со значением ЕС50=0,79±0,15 нМ.
Пример 17.
Значения связывания Кб и К1 для моноклональных антител ТМС- 2206 и гуманизированного ТМС2206 с иммобилизированным α2β1 определяли с помощью конкурентного анализа связывания. 96луночные микротитровальные планшеты покрывали тромбоцитарным интегрином-α2β1 (покрытие человеческим тромбоцитарным α2β1 от 6Ή Шс., VI) и блокировали обезжиренным молоком. Гуманизированные ТМС-2206 антитела метили реагентом Еи-№-ГГС, приблизительно 2 мг суспендировали и ставили на диализ против фосфатно-буферного физиологического раствора (РВ8; 1,47 мМ КН2Р04, 8,1 мМ №2НР04; рН 7,4, 138 мМ №1С1 и 2,67 мМ КС1). После концентрации в предварительно промытых концентрационных аппаратах М1сго8ер [предел пропускания 30 кДа; Ра11 ШЕе 8с1епсек при 9500 об/мин (7000/д) в роторе 1А-20 (Весктап Iη8ΐ^итеηΐ8, Шс. 20 мин при 4°С)] антитело приводили к 4,0 мг/мл с РВ8, 100 мМ NаНС0з, рН 9,3. МАТ/бикарбонатную смесь (0,250 мл) аккуратно добавляли в пробирку, содержащую 0,2 мг хелата №-(р-изотиоцианатобензил)диэтилентриамин-№^2^3^3-тетрауксусной кислоты с Еи3+ (Еи-М-ЕТС; РегкШ Е1тег ШЕе 8с1епсек), и инкубировали всю ночь при температуре 4°С без взбалтывания. Смесь меченого антитела очищали на колонке РЭ-1 (СЕ Вюкшепсек, Р1кса1атау, N1), предварительно уравновешивали с подвижным буфером (50 мМ Тпк, рН 7,4 и 138 мМ №1С1). Фракции собирали (0,5 мл) и проверяли на общий белок (реагент Бредфорда; Вю-Каб ЬаЬогакпек, Негси1ек, СА), используя абсорбционный планшетный ридер 8рес1гаМах 384, а для европия проводили разведение 1:10,000 в усиливающем растворе от ЭЕкЕМ (Регкш-Е1тег) с помощью флуоресценции с разрешением по времени (ТКЕ), используя многофункциональный планшетный ридер УюЮг2 (Регкш Е1тег). Фракции, позитивные на наличие обоих белков и европиевой метки, собирали, наносили на новую колонку РЭ-10, полученные образцы собирали и анализировали на общий белок и содержание европия градуированным ТКЕ против стандартного раствора европия (Ре^к^η-ΕIте^), чтобы определить соотношение флуорофор: белок индекс. Гуманизированный Еи-ТМС-2206 наносили на блокированный интегрином α2β1 микротитровальный планшет по 10 мкл/лунку. После инкубирования запечатанных планшетов в течение 1 ч при температуре 39° для достижения равновесного связывания 2 мкл образца перемещали из каждой лунки в новую, содержащую усиливающий раствор от ЭЕкЕМ (100 мкл/лунку), для определения свободной (не связанной) метки. Усиливающий раствор (100 мкл/лунку) добавляли в опустошенные лунки для определения количества связанной метки. Планшет встряхивали (Тйег Р1а1е 8Накег, на 5 скорости, 5 мин при комнатной температуре) и считывали интенсивность ТКЕ с помощью многофункционального планшетного ридера УюЮг2. Значения Кс рассчитывали способом Скэтчарда.
Относительную силу связывания с иммобилизированным интегрином α2β1 анализировали измерением значений К1 в конкурентном анализе с применением 100 пМ гуманизированного Еи-ТМС-2206 в присутствии различных концентраций немеченых или гуманизированных ТМС-2206 антител, в качестве конкурентов с применением системы анализа, идентичной описанной выше в данном примере. Исследуемые комбинации антител вносил на ячейки, покрытые интегрином α2β1, анализировали в интервале концентраций от 10-11 до 10-7 М и через определенное время определяли количество связанного гуманизированного Еи-ТМС-2206. Кривые ингибирования соответствовали модели односайтной конкуренции с применением программы Рпкт (СгарНРаб, Шс.), для получения значений Κ'.'50 и расчета К1 использовали уравнение Ченга-Прусоффа (1973) и соответствующие значения Кс, приведенные выше.
- 70 016245
Значения Кс и К1 для ТМС-2206 и гуманизированного ТМС-2206 отличались примерно в 2 раза (табл. 35). Поэтому аффинности связывания ТМС-2206 и гуманизированного ТМС-2206 с иммобилизированным α2β1 были подобными.
Таблица 35
Параметр аффиности ТМС-2206 гуманизирований ТМС- 2206
к0 0,72 ±0,18 нм 1,29 ± 0,17 нм
К| 0,21 ± 0,08 нм 0,41 ± 0,06 нм
ТМС-2206 и гуманизированный ТМС-2206 были подвергнутык анализу (ЗРК) с помощью поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии для определения кинетической диссоциации и связанных констант кб и ка (также известные как коГГ и кои) соответственно к Ι-домену α2. ЗРК как оптический метод характеристики макромолекулярных взаимодействий, при котором используют свойство проходящей волны точно измерять минутные изменения показателя рефракции близко к поверхности сенсора. Связывание между антигеном в растворе (например, слитым белком) и рецептором МАТ (иммобилизированном на поверхности сенсорного чипа) приводит к изменению индекса рефракции. Взаимодействие происходит в реальном времени и количество связанного антигена и соотношение констант ассоциации и диссоциации может быть определено с высокой точностью. Равновесную константу диссоциации легко рассчитывают по формуле Кс=кб/ка=коГГ/кои. Клонирование Ι-домена человеческого α2 и очистка экспрессированного Ι-домена человеческого СЗТ-слитого белка были описаны в примере 12. Исследования были проведены при температуре 20°С с применением оптического сенсора В1асоге 2000 с сенсорным чипом для исследований СМ5 (В1асоге ЫГе Заеисез, Иррза1а, З^ебеи) и уравновешивали с помощью подвижного буфера (50 мМ НЕРЕЗ, 150 мМ №С1, 0,25 мМ МдС12, 0,25 мМ СаС12, 0,5% Т^ееи-20, 0,1 мг/мл ВЗА, рН 7,4). Для захвата ТМС-2206 сенсорным чипом поверхности двух проточных ячеек покрывали ^С против антител мыши; две другие проточные ячейки покрывали протеином А для захвата гуманизированного ТМС-2206. Каждый цикл связывания антигена (Ι-домена человеческого СЗТ-слитого белка α2) с привязанным к поверхности ^С против антител мыши включает три этапа. На первом этапе одна поверхность, покрытая иммуноглобулинами против антител мыши, захватывала ТМС-2206, а поверхность, покрытая белком А, захватывала гуманизированный ТМС-2206. [Две другие поверхности (покрытая иммуноглобулинами против антител мыши, а другая - покрытая белком А) служили как сравнение]. На втором этапе Ι-домен человеческого СЗТ-слитого белка α2 впрыскивали поперек четырех поверхностей. Показания, полученные с поверхностей сравнения (благодаря разнице показателей рефракции между антигеном и фильтрующим буфером), делили на полученные показания с прореагировавших поверхностей. На третьем этапе комплексы антиген/антитело отделяли от поверхностей таким образом, чтобы поверхности можно было использовать для следующего цикла связывания. Самая высокая концентрация Ι-домена человеческого СЗТ-слитого белка α2 составила 41 нМ. Проточные поверхности в течение 2 мин промывали раствором антигена со скоростью 50 мкл/мин и на протяжении 6 мин наблюдали диссоциацию антигена с поверхности. Рассчитанные константы скорости связывания Ι-домена человеческого СЗТ-слитого белка α2 с ТМС-2206 и гуманизированным ТМС-2206 оказались похожими (табл. 37).
Анализы конкурентного связывания и ЗРК исследования подтверждают, что процесс гуманизации не влияет на аффинность связывания гуманизированного ТМС-2206 с Ι-доменом человеческого α2.
Пример 18.
Перекрестную реактивность к гуманизированому ТМС-2206 в рамках разных видов оценивали с помощью методов аналитической биохимии. В первом исследовании аффинности связывания (величины К1) ТМС-2206, гуманизировоного ТМС-2206 и Ι-доменов человеческих СЗТ-слитых белков α2, происходящих от разных видов, определяли (величины К1) путем конкурентного связывания меченного европием гуманизированного ТМС-2206 с (^(И-покрытыми планшетами (пример 17). Клонирование человеческого, макак-резусов, Ι-доменов α2 мыши и крысы описаны в примере 12. Ι-домены α2 макак-крабоедов и, дополнительно, резус-макак были клонированы из кДНК, полученных из полной РНК, экстрагированной из тканей кожи (Меб1Согр, Ιηα, Мои!геа1, ОС). К1 связывания крысиного α2 Ι с гуманизированным ТМС-2206 был в 9 раз меньше, чем для Ι-домена, человеческого α2, в то время как гибридный белок α2 Ι мыши-СЗТ показал только слабое специфичное связывание при наивысшей концентрации (4 мкМ; табл. 36). [В обоих случаях ни негативный контроль с СЗТ-слитым белком, ни негативный изотипный контроль ^С4/к не продемонстрировали конкурентного связывания при концентрации 0,4 мкМ]. Резусные, человекообразные и человеческие α2 Ι СЗТ-слитые белки продемонстрировали аналогичное связывание. Таким образом, все четыре препарата продемонстрировали перекрестную реактивность к гуманизированному ТМС-2206.
- 71 016245
Таблица 36
Конкурент К|(нМ)
ТМС-2206 0,14 ± 0т01
Гуманизированный ТМС-2206 0,34 ± 0,00
гибридный белок О5Т- 1-домен а2 человека 0,57 ± 0,06
гибридный белок Θ8Τ- 1-домен а2 макакикрабоеда ' 0,47 ± 0,00
гибридный белок Θ8Τ- 1-домен а2 резус-макаки 0,40 ± 0,02
гибридный белок Θ8Τ- 1-домен а2 крысы 5,23 ±0,14
гибридный белок С8Т- 1-домен а2 мыши Не обнаружено при 4,0 мкМ
Гибридный белок Θ8Τ ( негативный контроль) Не обнаружено при 0,4 мкМ
1дС4/к человека (негативный изотипный контроль ) Не обнаружено при 0,4 мкМ
Во втором исследовании скорость и равновесные константы связывания ТМС-2206 и гуманизированого ТМС-2206 с выбранными С8Т-слитыми белками Ι-домена α2 были оценены с помощью 8РК анализа (табл. 37). Все кинетические и равновесные константы, полученные для родительского и гуманизированного ТМС-2206 для Ι-доменов человеческого и крысиного α2, были похожими. В дополнение, константы скорости гуманизированного ТМС-2206 для Ι-доменов α2 человека и крабоеда были похожими. Гуманизированный ТМС-2206 не связывался с Ι-доменом α2 мыши при концентрации α2 I мыши-С8Т 4,0 мкМ. Сравнимое связывание Ι-домена С8Т-слитого белка α2 крабоеда с гуманизированным ТМС2206 не согласовывалось с результатами, полученными в примере 12, где конкурентного связывания не наблюдалось при концентрациях до 1 мкМ (табл. 29). Однако анализ последовательности ДНК, выполненный на популяциях кДНК, полученных из мРНК обезьян (Мебкогр Шс.), обнаружил полиморфизм в единственной аминокислоте (положение 40) в сравнении с Ι-доменом человеческого α2. Этот полиморфизм не сохранялся среди животных, поскольку один макак-крабоед и один макак-резус показали гетероморфизм, в то время как остальные животные показали 100% гомологичность с Ι-доменом человеческого α2. С8Т-слитый белок Ι-домена α2 макаки-крабоеда, изученный в этом примере с помощью конкурентного связывания и 8РК анализа, кодирует последовательность, идентичную последовательности Ιдомена человеческого α2. Эти биохимические исследования продемонстрировали, что гуманизированный ТМС-2206 давал перекрестную реакцию с человеческим, макака-резусом и крысиным Ι-доменом α2, но не с Ι-доменом α2 мыши. Ь νίΙΐΌ исследования клеточной перекрестной реактивности (пример 20) были выполнены для проверки того, что гуманизированный ТМС-2206 давал перекрестную реакцию с клетками крови разных видов.
Таблица 37
МАТ Ι-домен а2 Θ8Τ ки (с1) ка (М’к·1) Ко (=Ι<Λ;ηΜ)
ТМС-2206 Человека (11,0 ± 0,5) х 10-4 (3,8 +0,1) х 10® 2,9 + 0,1
Крысы (8,2 ± 0,1) х ю·4 (4,2 ± 0,1) х 109 2,0 ±0,1
Гуманизированное ТМС-2206 Человека (8,2 ± 0,3) х 104 (3,5 ± 0,0) х 10® 2,3 ±0,1
Крысы (5,7 ± 0,4) х 104 (3,3 ± 0,3) х 10® 1,7 ±0,1
Человека (2,4 ± 0,9) х (5,8 ± 0,6) х 10® 4,0 ±0,1
Человека (3,0 ± 0,1) х ю·4 (5,0 ± 0,1) х 10® 5,0 + 0,1
Мыши Не обнаружено при 4,0 мкМ Не обнаружено при 4,0 мкМ Не обнаружено при 4,0 мкМ
- 72 016245
Пример 19.
Перекрестную реактивность препаратов также оценивали путем связыванием гуманизированного ТМС-2206 с клетками крови, взятыми от разных видов с помощью проточной цитометрии. В первом исследовании была изучена перекрестная реактивность гуманизированного ТМС-2206 к тромбоцитам разных видов. Кровь отбирали из вены у человеческих доноров, крыс и макак-резусов и макак-крабоедов. Человеческую кровь собирали в 3,8% цитрат натрия; кровь макак-резусов и макак-крабоедов собирали в 10 мМ ЭДТА и крысиную кровь собирали в гепарин. Цельную кровь приматов (человеческую, макакрезусов и макак-крабоедов) 10 мин инкубировали при комнатной температуре с гуманизированным ТМС-2206 в конечной концентрации 140 мкг/ мл с последующим инкубированием в течение 10 мин с Ιβ&·ι мыши против АТ человека-МТС конъюгированным МАТ (клон НР6023; 8οιι11κπ·ι Вюкск), с последующим инкубированием с видоспецифичными тромбоцитными маркерными атителами, конъюгированными с флуоресцентными молекулами. Человеческие тромбоциты идентифицировали с РЕконъюгированным СЭ42Ь мыши против АТ человека (ВО Вюкскпсек) и тромбоциты макак-резусов и макак-крабоедов идентифицировали с РЕ-конъюгированным мышиным СЭ41а мыши против АТ человека (ВО Вюкскпсек). Цельную крысиную кровь инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре с 500 мкг/мл гуманизированного ТМС-2206, конъюгированного с А1еха-488 (А1еха Ε1πογ 488 Рюкю ЬаЬе1тд кй, А10235, Мο1еси1а^ РгоЬек), с последующим инкубированием с РЕ-конъюгированным хомячьим анти-СЭ61 мыши (крысиный тромбоцитарный маркер, ВО Вюкскпсек). Все образцы промывали один раз, суспендировали в фосфатном забуференном физиологическом растворе и затем подвергали анализу с помощью проточной цитометрии. [Окна прямого и бокового рассеивания были расположены в логарифмической шкале для дальнейшего отделения тромбоцитов от крупных красных кровяных телец и лейкоцитов.] Гуманизированный ТМС-2206 связывался с тромбоцитами всех четырех видов (табл. 38).
Во втором исследовании была оценена перекрестная реактивность гуманизированного ТМС-2206 к лейкоцитам разных видов. Кровь отбирали у тех же четырех видов, за исключением того, что человеческую кровь собирали в 10 мМ ЭДТА. Гуманизированный ТМС-2206, конъюгированный с А1еха-488, добавляли в цельную кровь (конечная концентрация 225-400 мкг/мл) на 10 мин, с последующим 30-минутным инкубированием при комнатной температуре с маркерными антителами. Анти-СО45 антитела применялись для окраски всех типов лейкоцитов [для человеческих лейкоцитов РЕ-Су5-конъюгированные мышиные античеловеческие (клон Н130, ВО Вюкскпсек); для лейкоцитов макак-резусов и макак-крабоедов РΒ-Су5-конъюгированные мышиные античеловеческие (клон Ти116, ВО Вюкскпсек); и для крысиных лейкоцитов РЕ-Су5-конъюгированные мышиные антикрысиные (ВО Вю5скпсе5). Маркерные антитела применялись для окраски тромбоцитов: для человеческих тромбоцитов РЕ-Су5-конъюгированные мышиные античеловеческие СЭ42Ь (ВО Вюкскпсек); для тромбоцитов макак-резусов и макак-крабоедов В-РЕ-конъюгированные мышиные античеловеческие СЭ41а (ВО Вюкскпсек) и для крысиных тромбоцитов В-РЕ-конъюгированные хомячьи антимышиные СЭ61 (ВО Вюкскпсек]. К реакционной смеси (около 250 мкл) добавляли 1 мл воды, инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре для того, чтобы вызвать лизис красных кровяных телец, далее добавляли 2 мл РВ8 (до концентрации, предотвращающей лизис лейкоцитов) и центрифугировали. Осадок лейкоцитов ресуспендировали в 0,5 мл РВ8 и подвергали анализу с помощью проточной цитометрии. [Канал бокового рассеивания был помещен в линейную шкалу, а канал СЭ45 был помещен в логарифмическую шкалу для отделения гранулоцитарных лейкоцитов, моноцитов и лимфоцитов.] По мере того как варьирующиеся уровни эндогенной активации тромбоцитов приводили к образованию тромбоцитнолейкоцитных микроагрегатов, было важно идентифицировать лейкоциты, которые не связывались с тромбоцитами (которые конститутивно экспрессируют α2β1 интегрин). Таким образом, только те клетки, которые были СО45'/СО41а-, С^45+/С^42Ь-, или СЭ45'/СЭ61- оценивали на предмет связывания с гуманизированным ТМС-2206. Гуманизированный ТМС-2206 связывался с лимфоцитами, моноцитами и гранулоцитами всех четырех видов (табл. 38).
Эти результаты соответствовали результатам примера 19, показавшего, что гуманизированный ТМС-2206 давал перекрестную реакцию с человеческими, макак-резусов и макак-крабоедов и крысиными С8Т α2 Ι-доменами (согласно анализам К1 и 8РВ). Процент связывания клеток крысиной крови с гуманизированным ТМС-2206 был несколько слабее, чем для клеток крови приматов. В трех более ранних исследованиях (примеры 9, 19 и 12) аффинности связывания родительского и гуманизированного ТМС2206 с субъединицей крысиного интегрина α2β1 являлись меньшей величиной, чем аффинность связывания с человеческой α2 субъединицей. В первом исследовании, пример 9, величины ЕС50 для ТМС-2206 ингибирования связывания крысиных тромбоцитов с крысиным коллагеном типа 1 были 6,3 и 1,7 нМ, соответственно. Во втором исследовании, пример 19 (табл. 38), величины К1 для ингибирования связывания гуманизированного ТМС-2206 с иммобилизованным α2β1, конкурирующими С8Т-слитыми белками Ι-домена человеческого α2 и С8Т-слитыми белками Ι-домена крысиного α2 были 0,57 и 5,23 нМ соответственно. Аналогичным образом, в третьем исследовании, пример 12 (табл. 29), величины К1 ингибирования связывания ТМС-2206 с α2β1 С8Т-слитыми белками Ι-домена человеческого α2 и С8Тслитыми белками Ι-домена крысиного α2 были 0,33 и 3,8 нМ соответственно. В дополнение, в исследо
- 73 016245 ваниях как тромбоцитов, так и лейкоцитов все виды клеток, перед тем как подвергнуть анализу проточной цитометрии, промывали более гуманизированным ТМС-2206, смытым из крысиных α2 субъединиц с более низкой аффинностью в сравнении с α2 субъединицами приматов. В сочетании с предыдущими результатами это привело к более низкому процентному содержанию клеток крысиной крови, отмеченных как позитивные в сравнении с клетками крови приматов (предполагая сходную плотность α2β1рецепторов). В заключение, тромбоциты, лимфоциты, моноциты и гранулоциты всех четырех протестированных видов (человеческого, макак-резусов и макак-крабоедов и крысы), все, связывают гуманизированное ТМС-2206.
Таблица 38
Виды Кво Процентное отношение связывания клеток (Среднее ± СОС)
Т ромбоциты Лимфоциты Моноциты Гранулоцитарные лейкоциты
Человеческий 3 94,5 ±0,9 63,7 ±8,9 78,6 ±9,1 75,5 ±9,3
Макаки-резусы 4 97,2 ± 0,0 72,3 ±9,7 90,4 ± 4,9 95,3 ±2,2
Макаккрабоеды 4 96,5+0,3 73,5 ±12,1 87,4± 7,0 95,2 ± 3,0
Крысы 3 21,5 ±2,3 38,2 ±1,7 37,4 + 1,6 43,2 ±2,1
Пример 20.
Еще одно исследование оценивало, ведет ли связывание гуманизированного ТМС-2206 с α2β1 к активации тромбоцитов, согласно измерениям проточной цитометрии. Активация тромбоцитов была исследована как позитивная регуляция Р-селектина или как активация СРПЬШа (αIIЬβ3) интегрина. Препараты крови отбирали из лучевой вены в вакуумные пробирки, содержащие 3,8% цитрата натрия, после сброса первых 3,0 мл свободно текущей крови. Цельную кровь разбавляли в соотношении 1:10 в ТВЗ (рн 7,4), затем инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре с физиологическим раствором, с изотипным контролем IдС4/κ (конечная концентрация 132 мкг/ мл) или гуманизированным ТМС-2206 (конечная концентрация 144 мкг/ мл). Для активации тромбоцитов в препараты добавляли активизирующий тромбиновый рецептор пептид-6 (ТКАР-6, конечная концентрация 10 мкМ; АпаЗрес Шс., Зап .Токе, СА) или аденозиндифосфорную кислоту (АДФ, конечная концентрация 20 мкМ; З1дта) с последующим инкубированием в течение 5 мин при комнатной температуре. Для проточной цитометрии клетки обрабатывали инкубированием с маркерными антителами: с РЕ-Су5-конъюгированным мышиным античеловеческим СЭ42Ь (ВО Вюкаепсек) для окрашивания тромбоцитов; с РЕ-конъюгированным мышиным античеловеческим СЭ62Р (ВО Вюкаепсек) для окрашивания Р-селектина и Е^С-конъюгированным РАС-1 (ВО Вюкаепсек) для окрашивания стимулированного СРПЬШа (РАС-1 связывается с активной конформацией СРПЬШа интегрина). Ошибка случайного выбора для каждого образца была менее 5% (уровень достоверности 95%).
Первый эксперимент оценил, ведет ли связывание гуманизированного ТМС-2206 к активации тромбоцитов согласно измерениям позитивной регуляция Р-селектина. Активация была оценена как процентный состав тромбоцитов (СО42Ь+), которые были окрашены Р-селектин-маркером (СЭ62Р) (табл. 39). Путем однофакторного дисперсионного анализа (ΑNОУΑ) (однофакторный интервал достоверности 95%) экспрессия Р-селектина тромбоцитов, инкубированных с физиологическим раствором, либо с ^С^к, либо с гуманизированным ТМС-2206, статистически не отличалась (Р=0,96). Поэтому связывание гуманизированного ТМС-2206 с тромбоцитами не вызывало активацию тромбоцитов. В параллельных экспериментах ТКАР-6 индуцировал значительное увеличение экспрессии Р-селектина. Добавление гуманизированного ТМС-2206 статистически не повлияло на индуцированную ТКАР-6 экспрессию Р-селектина в сравнении с физиологическим раствором или изотипным контролем (Р=0,96; однофакторный ΑNОУΑ, интервал достоверности 95%). Поэтому связывание гуманизированного ТМС-2206 не ингибировало активацию тромбоцитов, вызванную ТКАР-6.
- 74 016245
Таблица 39
Экспери- Тестируемые препараты, инкубированные с цельной кровью
мент Физ. раствор 1д64/к ЬиТМС-2206 ТРАР-6 ТКАР-6 + 1д64/к ТКАР-6 + биТМС2206
1 2,44 1,21 0,85 76,60 80,35 79,50
2 8,40 9,10 5,29 97,01 86,73 83,32
3 29,54 30,08 25,70 92,71 95,63 96,88
Среднее ± сос 13,5 ±8,2 13,5 + 8,6 10,6 ±7,7 88,8 ± 6,2 87,6 ±4,4 86,6 + 5,3
Следующее исследование оценило позитивную регуляцию Р-селектина после инкубирования с/без агониста АДФ (процентное содержание тромбоцитов, экспрессирующих Р-селектин, табл. 40). Так же как и ранее, экспрессия Р-селектина на тромбоцитах, инкубированных с гуманизированным ТМС-2206, ^С4/к и физиологическим раствором, была сравнима, таким образом, гуманизированный ТМС-2206 не вызывал активации тромбоцитов. Экспрессия индуцированного АДФ Р-селектина сравнима с индукцией ТВАР-6. Возникло дополнительное повышение экспрессии Р-селектина с тромбоцитами, инкубированными с АДФ, или с ^С4/к или с гуманизированным ТМС-2206. Однако повышение позитивной регуляции Р-селектина была сходной и для изотипного контроля, и для гуманизированного ТМС-2206; еще раз свидетельствуя о том, что связывание гуманизированного ТМС-2206 с тромбоцитами не индуцирует активации тромбоцитов. Наряду с этим, экспрессия Р-селектина из АДФ-индуцированных тромбоцитов, инкубированных с ^С4/к или гуманизированным ТМС-2206, не уменьшалась. Таким образом, связывание гуманизированного ТМС-2206 не ингибирует АДФ-индуцированную активацию тромбоцитов.
Таблица 40
Агонист Тестируемые образцы, инкубированные с цельной кровью
Физиологический раствор 1д(34/к 6 иТМ С-2206
Физиологический раствор 29,54 30,08 25,70
АДФ 79,90 96,24 96,87
Следующее исследование оценивает активацию СРПЬШа после инкубирования с/без агонистов ТВАР-6 или АДФ путем подсчета процентного содержания тромбоцитного связывания с маркером антител РАС-1 (который связывается с активной конформацией СРПЬШа; табл. 41). Уровни экспрессии активированного СРПЬШа на тромбоцитах, инкубированных с гуманизированным ТМС-2206, ^64/κ, и физиологическим раствором, были сравнимы, гуманизированный ТМС-2206 не индуцировал активацию тромбоцитов. Ни ^6.·|/κ. ни гуманизированный ТМС-2206 не ингибировали ТВАР-6 или активацию, индуцированную АДФ.
Таблица 41
Агонист Тестируемые образцы, инкубированные с цельной кровью
Физиологический раствор 1дС4/к ЬиТМС-2206
Физиологический раствор 26,5 24,3 18,6
ТРАР-6 79,9 93,8 88,9
АДФ 69,1 93,1 86,0
В заключение, гуманизированный ТМС-2206 не индуцировал активацию тромбоцитов (не было увеличения позитивной регуляции Р-селектина или активации СРПЬШа), и ни один агонист ингибировния (ТВАР-6, АДФ) не индуцировал активацию тромбоцитов. Эти данные дополняют исследования агрегации тромбоцитов (пример 15, табл. 34), которые показали, что гуманизированный ТМС-2206 не индуцировал ни агрегацию тромбоцитов, не ингибировал коллаген-индуцированную агрегацию.
Пример 21.
Было оценено действие гуманизированного ТМС-2206 на внешние и внутренние пути коагуляции с помощью измерения протромбинового времени (РТ) и активированного частичного тромбопластинового времени (аРТТ). Для измерений РТ и аРТТ применяли подходящий лиофилизированный препарат человеческой плазмы (Сйгех Ι, В1о/Эа1а Согрогабоп, Ногкйат, РА). Перед тем как подвергнуть препараты коакуляционным тестам, для достижения конечных концентраций в 179, 214 и 286 мкг/ мл (соответствующих Стах разовой дозы антител в 12,5, 15,0 и 20,0 мг/кг соответственно) в плазму был добавлен гуманизированный ТМС-2206. Для РТ и аРТТ стандартные процедуры сопровождались измерениями времени коагуляции с помощью фиброметра ВВЬ (ВР, Егапкбп Ьакек, N1). Табл. 42 подводит итоги данных серии из шести экспериментов (3 РТ и 3 аРТТ). В каждом эксперименте производили контроль с помощью фи
- 75 016245 зиологического раствора. Статистический анализ т-Стьюдента каждой сопряженной пары (гуманизированный ТМС-2206 и физиологический раствор) продемонстрировал, что в каждом эксперименте не было статистически значительной разницы между средним временем коагуляции для гуманизированного ТМС-2206 в сравнении с физиологическим раствором. (Гипотеза о том, что время коагуляции должно отличаться, была отвергнута с уровнем вероятности 95% в случае, если отдельно вычисленные значения Р были менее 0,05). Таким образом, гуманизированный ТМС-2206 не влияет на коагуляцию согласно измерениям по РТ и аРТТ.
Таблица 42
Параметр коагуляции Гуманизированный ТМС-2206 Физиологический раствор Р- величина
Концентрация Время коагуляции (секунды, среднее ± СОС) Время коагуляции (секунды, среднее ± СОС)
Протромбиновое гремя 179 мкг/мл 10,8 + 0,1 10,8 + 0,1 1,00
214 мкг/мл 11,3 + 0,1 11,1 ±0,1 0,67
286 мкг/мл 11,5 ± 0,2 11,6 ± 0,1 0,62
Время образования и активности тромбопластин 179 мкг/мл 25,6 ± 0,7 24,8 + 0,6 0,43
214 мкг/мл 24,1+0,3 23,5 + 0,5 0,30
286 мкг/мл 27,9 ±0,2 27,9 ± 0,4 1,00
Пример 22.
Было оценено влияние гуманизированного ТМС-2206 на время кровотечения у крыс. Крысам линии δргадие-^а^1еу (190-200 г) были сделаны внутривенные (в хвостовую вену) инъекции физиологического раствора, гепарина (0,6 мг/кг, позитивный контроль) или гуманизированного ТМС-2206 в дозах 5 и 15 мг/кг за 1 ч до стандартного отсечения кончика (0,5 мм) каждого хвоста. Крысы не были анестезированы и были в сознании в течение наблюдаемого времени кровотечения. Кончик отсеченного хвоста каждой крысы был немедленно помещен на глубину 2 см в пробирку, содержащую физиологический раствор при температуре 37°С. Время, которое потребовалось для начала 15-секундного периода прекращения кровотечения, было оценено как время кровотечения. Максимальная продолжительность времени, которое потребовалось, было 20 мин. Потеря крови была оценена по количеству гемоглобина, выделенного в результате гемолиза (спектрофотометрически), из крови, собранной в пробирку. Гуманизированный ТМС-2206 не продемонстрировал статистически значимого влияния на время кровотечения при обеих тестированных дозах в сравнении с интактным контролем и физиологическим раствором (табл. 43; Р=0,08, однофакторный анализ ΑNΟVΑ). Гуманизированный ТМС-2206 не показал статистически значимого влияния на потерю крови при обеих исследуемых дозах в сравнении с интактным контролем и физиологическим раствором (Р = 0,22, однофакторный анализ ΑNΟVΑ). Таким образом, гуманизированный ТМС-2206 ш νί\Ό не влияет на время кровотечения или потерю крови.
Таблица 43
Тестируемые препараты, введенные внутривенно крысам
Интактный Физиологический раствор Гуманизированный ТМС-2206 Гепарин
5 мг/кг 15 мг/кг
Кол-во 10 10 10 10 10
Время кровотечения (минуты, среднее ± СОС) 3,5 ±0,4 4,5 ±0,4 5,2 + 0,6 4,3 ± 0,3 17,8 ± 1,1
Потеря крови (мг гемоглобин, среднее ± СОС) 10,3 ±3,0 17,6 ±2,0 20,5 ± 4,1 21,2 ± 5,9 115 ± 31
- 76 016245
Пример 23.
Исследование было проведено с целью определения влияния однократной дозы гуманизированного ТМС-2206 на уровни цитокинов в крови у крыс как средство определения того, вызывает ли гуманизированный ТМС-2206 детектируемую ίη νίΐΌ активацию лейкоцитов. Крысам был введен внутривенно физиологический раствор (негативный контроль), человеческий ^С./к изотипный контроль (15 мг/кг), гуманизированный ТМС-2206 (15 мг/кг) или липополисахарид (ЬР8, позитивный воспалительный контроль воспаления; 0,75 мг/кг). Крысы, не получившие инъекций, использовались для интактного контроля. Спустя 2, 4, 6 и 8 ч после инъекции, отбирали образцы крови из подкожной вены задней лапы и из них получали плазму. Образцы плазмы подвергали мультиплексному иммунологическому грануляционному анализу (ММ; Ьтсо Охад^^с^ 8ΐ. СЕаг1ек, М0) для определения уровней ΙΕ-1α, ЕЪ-1 β, Ш-2, Ш-4, Ш-5, Ш-6, Ш-12, СМ-С8Е, Ш^у, и ТОТ-а (табл. 44; пг/ мл, среднее ± С0С). МПА включает одновременное определение анализируемых веществ (до 100) при одинаковом объеме образцов (25 мкл) путем объединения нескольких индивидуальных реакций связывания антиген/антитело на спектрально различимых микрогранулах. В зависимости от антигена чувствительность МПА находится между 1,5-50 пг/мл. Каждый набор данных цитокинов был подвергнут двухфазному анализу АN0УА, с доверительным интервалом 95%, для проверки предположения о том, что индивидуальные уровни цитокинов во всех четырех временных точках и для четырех условий (интактный, носитель, ^С./к и гуманизированный ТМС-2206) были эквивалентны. Гипотеза будет отвергнута в случае, если Р-величины будут менее 0,05. Не было обнаружено статистически значимых различий между каждым из десяти наборов (все Р-величины изменялись от 0,18 до 1,0, табл. 44) наблюдаемых уровней цитокинов у крыс, получивших инъекции носителя, ^С^к, гуманизированного ТМС-2206 или не получивших инъекций (интактных). Таким образом, внутривенная инъекция однократной дозы (15 мг/кг) гуманизированного ТМС-2206 не сокращает экспрессию цитокинов, вовлеченных в воспалительный процесс.
Таблица 44
Цито- кин Зремя Интактный (п = 3) Транспор тный (п = 3) 1д64 (15мг/кг) (П =6) ГшТМС2206 (15мг/кг) (п = 6) 1_Р8 (0,75мг/кг) (п = 4) Рвеличины, 2-фазный ΑΝΟνΑ
1ЫО 2-ч 61 +30 84 ±37 75 ±29 133 ±66 788 ± 550 1,00
4-ч 69 ±38 75 ±22 101 ±46 150 ±63 806 ±641
6-м 58 ±16 90 ±54 57 ±26 80 ±53 640 ± 524
8-ч 36 ±5 85 ±11 57 + 17 101 ±48 591 ± 372
1Ы₽ 2-ч 24 ±0 24 ±0 24 ±0 24+0 733 ± 277 0,17
4-ч 45 ±15 107 ±70 44 ±17 30 ±4 527 +109
6-ч: 153 ± 78 76 ±27 61 ±27 44 ± 14 282 ± 70
8-ч 24 ±0 24 ±0 53 ±29 24 ±0 525 ± 324
1Ь6 2-ч 118 ± 35 291 ± 136 300 ± 174 309 + 155 31386±798 1 1,00
4-ч 137 ± 58 271 ± 123 329 ± 207 362 ± 163 15971±433 4
6-ч 265+12 5 359 ± 130 416 ± 209 364 ± 174 8966 + 4379
8-ч 117 + 40 341 ± 67 219 ± 133 335 + 163 3682 ± 2431
1Ы2 2-ч 54 ±30 237 ± 62 159±67 199 ± 106 950 ± 823 1,00
4-ч 43 ± 19 201 ± 44 173 ±79 219 ± 119 991 + 876
6-4; 43 ±17 205 ± 93 184 ± 108 169 ± 124 941 + 812
8-4 43 ±19 212 ±31 132 ±55 214 ± 102 794 ± 685
- 77 016245
1ΕΝ-γ 2-4 31 ±7 82 ±58 121 +72 156 ±94 959 ± 453 1,00
4-ч 24 ±0 67 ±43 127 ±77 153 ±94 7740 ± 629
6-4. 24 ±0 57 ±33 127 ± 103 115 ±91 3288 ± 756
8-ч 24 ±0 76 ±52 99 ±59 156 ± 102 1773 + 757
ΤΝΡ α 2-ч 24 ±0 24 + 0 24 ±0 24 ±0 1571 +633 1,00
4-ч 24 ±0 24 ±0 24 ±0 24 ±0 85 ±38
8-4 24 ±0 24 ±0 24 ±0 24 + 0 48 ±15
8-4 24 ±0 24 ±0 24 ±0 24 ±0 27 ±3
ΙΙ_-2 2-ч 49+25 31 ±7 47 ± 17 73 ±49 93 ±24 0,96
4-4 24 ±0 33 ±9 52 ±23 90 ±62 79 ± 14
6-4 24 ±0 47 ±23 69 ±36 33 ±9 52 + 16
8-4 24 ±0 92 ±31 47 ±23 86 ±39 39 ±15
Ιί-4 2-ч 24 ±0 24 ±0 24 ±0 24 ±0 46 + 22 0,85
4-4 24 ±0 24 ±0 24 ±0 25 ± 1 49 + 25
6-4 24 ±0 24 + 0 24 ±0 24 ±0 46 + 22
8-4, 24 ±0 24 ±0 24 ±0 24 ±0 41 ±17
Ιί-5 2-ч' 24 ±0 24 ±0 24 + 0 24 + 0 24 ±0 1,00
4-4 24 ±0 24 ±0 24 ±0 24 ±0 24 ±0
6-4 24 + 0 24 ±0 24 ±0 24 ±0 24 ±0
8-4 24 ±0 24 ±0 24 + 0 24 ±0 24 ±0
СМС8Е 2-4 66 ±0 66 ±0 66 ±0 66 ±0 66 ±0 1,00
4-ч 66 + 0 66 + 0 66 ±0 66 + 0 66 ±0
6-4 66 ±0 66 ±0 66 ±0 66 ±0 66 ±0
8-ч 66 ±0 66 ±0 66 ±0 66 ±0 66 ±0
Несмотря на то что настоящее изобретение было описано со ссылкой на его отдельные реализации, важно понимать, что эти реализации лишь иллюстрируют различные аспекты изобретения. Таким образом, в иллюстративных вариантах реализации могут быть сделаны многочисленные модификации и могут быть разработаны другие средства на их основе, которые не выходят за пределы объема охраны изобретения.
- 78 016245
Перечень последовательностей <110> ГЛЕНМАРК ФАРМАСЕУТИКАЛС С.А.
ЛАЗАРАИДЕС, ЭЛИЭС вудс, катрин БЕРНАРД, Марк
<12 0> АНТИТЕЛА К ИНТЕГРИНУ АЛЬФА2 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
<130> 14575,2
<150> <151> и5 60/738,303 2005-11-18
<160> 186
<170> патентная версия 3.3
<210> <211> <212> <213> 1 10 РКТ ното Бартелз
<220> <221> <223> М15С_РЕАТиКЕ Ьсок1 [СОК1 οί Иеауу сНатп уагтаЫе гедтоп]
<400> 1
<31 у РНе Бег Деи тЬг Азп туг <31 у 11 е нтз
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 2 16 РКТ Ното Бартепз
<220>
<221> <223> М15С_РЕАТиКЕ Ьсок2 [сок2 оГ Ьеауу сНатп уагтаЫе гедтоп]
<400> 2 ,
Уа1 11 е Тгр А1а Агд <31у Рпе Тпг азп Туг азп Бег А1а ьеи Меь 5ег
1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 3 11 РКТ ното Бартепз
<220> <221> <223> М15С_ЕЕАТийЕ НСОкЗ [СйкЗ οί Неауу сКаяп уан'аЫа гедпоп]
<400> 3
А1а Азп Азр <31 у Уа1 туг туг А1а мет дзр туг 15 10 <210> 4 <211> 10
- 79 016245 <212> РКТ <213> ното ЗарлепБ <220>
<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <22 3> 1СРК1 : [срк1 о! 1лдНт сКалп уаглаЫе гедлоп] <400> 4
Зег А1а Азп Зег Зег Уа1 Азп Туг 11е Нлз
1510 <210>5 <211>7 <212> РКТ <213> Ното Зарл'епз <220>
<221> М15С_ЕЕАТ11КЕ <223> 1СОК2 [СОК2 οί Ιϊςήΐ сКалп уапаЫе гедлоп] <400>5
Азр тИг зег 1уз 1_еи А1а зег .5 <210> 6 <211>9 <212> РКТ <213> Ното Зарлепз <22О>
<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <223> 1СРКЗ [СРКЗ οΐ ПдЬТ сЬатп уапаЫе гедлоп] <400> 6
61η <31 η тгр ТЬг тНг Аэп рго ьеи тКг
5 <210> 7 <211> 5361 <212> ΡΝΑ <213> Ното Зарлепз <220>
<221> тл5С_Театиге <223> Нитап а!рЬа2 л’пседглп ϋΝΑ <400>7 сГдсааассс адсдсаасТа сддГсссссд дгсадассса дда1ддддсс адаасддаса60 ддддссдсдс сдс1дссдсг дс1дс1ддТд ТТадсдсТса дТсааддсаТ СТТаааТГд!120 гдТХТддссТ асааТдгтдд ТсТсссадаа дсаааааТаТ ТИссддГсс ТТсаадТдаа180 садТ1гддд1 атдсадтдса дсадигата аатссаааад дсаасгддтт астддгхддт240 гсассстдда дгддстсс гдадаассда агдддадагд гдгагааагд тссгдггдас300 сгагссасгд ссасаТдхда аааасТааах ТГдсааасТТ саасаадсаТ гссааагдтг360
- 80 016245
асЕдадаХда ааассаасах дадссХсддс ХХдаХссХса ссаддаасах дддаасхдда 420
ддХХХХсХса саЕдХддхсс хсхдхдддса садсаахдхд ддаахсадха ххасасаасд 480
ддХдХдХдХХ сХдасаХсад хссхдахххх садсхсхсад ссадсххсхс ассХдсаасХ 540
садсссхдсс еххсссхсах адахдххдхд дххдхдхдтд ахдаахсааа хадхахххах 600
ссххдддахд садхааадаа ххтхххддаа ааахххдхас ааддссХХда Хахаддсссс 660
асааадасас аддХддддХХ ааХХсадХаХ дссаахаахс саададххдх дхххаасххд 720
аасасаХаХа ааассааада адааахдахх дХадсаасах сссадасахс ссаахахддх 780
ддддассхса сааасасахх сддадсааХХ сааХаХдсаа дааааХаХдс сХаХХсадса 840
дсХХсХддХд ддсдасдаад ХдсХасдааа дхаахддхад ххдхаасхда сддХдааХса 900
сахдахддхх саахдххдаа адсхдхдахх дахсаахдса ассахдасаа хахасхдадд 960
ХХХддсаХад садххсххдд дхасххааас адааасдссс ХХдахасХаа ааахххааха 1020
ааадаааХаа аадсдаХсдс ХадХаХХсса асадааадах асхххххсаа хдхдхсхдах 1080
даадсадсХс ТасХадаааа ддсХдддаса ХХаддадаас аааХХХХсад саЕХдааддХ 1140
асхдххсаад даддадасаа схххсадахд дааахдхсас аадхдддахх садхдсадах 1200
ХасХсХХсХс ааааХдаХаХ ХсХдаХдсХд ддХдсадХдд дадсХХХХдд сХддадХддд 1260
ассаххдхсс адаадасаХс хсахддссах ххдахсхххс схааасаадс схххдассаа 1320
аххсхдсадд асадааахса садххсахах ххаддххасх схдхддсхдс аахххсхасх 1380
ддадааадса сХсасХХХдХ ХдсХддХдсХ ссХсдддсаа аххахассдд ссадаХадХд 1440
сЕаЕаЕадЕд ХдааХдадаа ХддсааХаХс асддХХаХХс аддсХсассд аддХдассад 1500
аххддсхссх аххххддхад ХдХдсЕдХдХ ХсадХХдаХд ЕддаХааада сассаххаса 1560
дасдЕдсЕСЕ Хддхаддхдс ассаахдхас ахдадхдасс хааадааада ддааддаада 1620
дтсхассхдх ххасхахсаа ааадддсахх ххдддхсадс ассаасххсх хдааддсссс 1680
дадддсаххд аааасасХсд ахххддххса дсааххдсад схсхххсада саХсаасаХд 1740
даЕддсЕЕЕа аХдаХдХдаХ ХдХХддХХса ссасХадааа аХсадааХХс хддадсхдха 1800
ХасаХХХаса аХддХсаХса дддсасХаХс сдсасааадХ аххсссадаа аахсххддда 1860
хссдахддад ссхххаддад ссаХсХссад ХасХХХддда ддХссХХдда ХддсХаХдда 1920
даЕЕЕаааЕд дддаХХссаХ сассдаХдХд ХсХаХХддхд ссхххддаса адхддххсаа 1980
схсхддхсас ааадхаххдс хдахдхадсх ахадаадсхх саХХсасасс адаааааахс 2040
асхххддхса асаадаахдс хсадахаахх схсааасхсх дсХХсадХдс ааадххсада 2100
ссхасхаадс аааасаахса адхддссахх дхахахааса хсасасххда ХдсадаХдда 2160
ххххсахсса дадХаассХс садддддХХа ХХХааадааа асааХдааад дхдссхдсад 2220
аадаахахдд ХадХаааХса адсасададх Хдссссдадс асахсаххха ХаХасаддад 2280
сссХсЕдаЕд ХХдХсаасхс хххддахххд сдхдхддаса ХсадХсХдда ааасссХддс 2340
асхадсссхд сссххдаадс схаххсхдад асХдссаадд ХсХХсадХаХ ХссХХХссас 2400
ааадасхдхд дхдаддахдд асххтдсахт хсхдахсхад хссхадахдх ссдасаааХа 2460
- 81 016245
ссадсХдсХс аадаасаасс схххаххдхс адсаассааа асааааддХХ аасаХХХХса 2520
дХаасасХда ааааХаааад ддааадхдса хасаасасхд дааХХдХХдХ ХдаХХХХХса 2580
даааасХХдХ хххххдсахс аххсхсссха ссддххдахд ддасадаадх аасахдссад 2640
дхддсхдсах схсадаадхс хдххдссхдс даХдХаддсХ асссХдсХХХ ааадададаа 2700
саасаддХда сххххасхах хаасхххдас ххсаахсххс аааассххса даахсаддсд 2760
хсхсхсадхх хссаадссхх аадхдааадс саадаадааа асааддсхда хаахххддхс 2820
аассхсаааа ххссхсхссх дхахдахдсх даааххсасх хаасаадахс хассаасаха 2880
аахххххахд ааахсхсххс ддахдддаах дххссххсаа хсдхдсасад ххххдаадах 2940
дххддхссаа ааххсахсхх схсссхдаад дхаасаасад даадхдххсс адхаадсахд 3000
дсаасхдхаа хсахссасах сссхсадхах ассааадааа адаасссасх дахдхассха 3060
асхддддхдс ааасадасаа ддсхддхдас аХсадХХдХа аХдсадаХаХ сааХссасХд 3120
ааааХаддас ааасахсххс ххсхдхахсх ххсаааадхд аааахххсад дсасассааа 3180
даахХдаасХ дсадаасхдс ххссхдхадх аахдххассх дсхддххдаа адасдххсас 3240
аХдаааддад ааХасХХХдХ ХааХдХдасх ассадааХХХ ддаасдддас ХХХсдсаХса 3300
ХсаасдХХсс адасадХаса дсХаасддса дсХдсадааа ХсаасассХа ХаасссХдад 3360
аХаХаХдХда ХХдаадаХаа сасХдХХасд аХХссссХда ХдаХааХдаа ассхдахдад 3420
ааадссдаад Хассаасадд адХХаХааХа ддаадхахаа ххдсхддаах ссххххдсхд 3480
ххадсхсхдд ххдсаахххх ахддаадсхс ддсХХсХХса ааадааааХа ХдаааадаХд 3540
ассаааааХс садаХдадаХ ХдаХдадасс асададсХса дХадсХдаас садсадассх 3600
ассхдсадхд ддаассддса дсахсссадс садддхххдс хдхххдсдхд сахддахххс 3660
хххххааахс ссахаххххх хххахсахдх сдхаддхааа схаассхддх аххххаадад 3720
аааасхдсад дхсадхххдд ахдаадааах хдхддддддх дддддаддхд сддддддсад 3780
дхадддааах ааХадддааа ахассхаххх хахахдахдд дддааааааа дХааХсХХХа 3840
аасхддсхдд сссададХХХ асаххсхаах ХХдсаХХдХд ХсадааасаХ даааХдсХХс 3900
саадсаХдас аасххххааа дааааахахд аХасХсХсад аХХХХааддд ддаааасХдХ 3960
ХсХСХХХааа аХаХХХдХсХ ХХааасадса асХасадаад ХддаадхдсХ хдахахдхаа 4020
дхасххссас ххдхдхахах хххаахдаах аххдахдхха асаададддд аааасаааас 4080
асаддХХХХХ ХсааХХХаХд сХдсХсаХсс ааадХХдсса садахдахас ххссаадхда 4140
хааххххахх хахааасхад дхаааахххд ХХдХХддХХс сХХХХаХасс асддсхдссс 4200
стхссасасс ссахеххдсх схаахдахса ааасахдсхх даахаасхда дсХХададХа 4260
ХассХссХаХ ахдхссаххх аадххаддад адддддсдах аХададасХа аддсасаааа 4320
ххххдхххаа аасхсадаах ахаасаххха хдхаааахсс саХсХдсХад аадсссаХсс 4380
хдхдссадад дааддаааад даддаааххх ССХХХСХСХХ ХХаддаддса саасадххсх 4440
сххсхаддах ххдхххддсх дасХддсадХ аассХадХда аХХХХХдааа дахдадхаах 4500
- 82 016245
ххсхххддса ассххссхсс ХсссХХасХд аассасхсхс ссассхссхд дхддхассах 4560
хаххахадаа дсссхсхаса дссхдасххх схсхссадсд дХссааадХХ ахссссхссх 4620
ХХассссХса хссааадххс ссасхссххс аддасадсХд сХдХдсаХХа дахаххаддд 4680
дддааадХса ХсХдХХХааХ ххасасасхх дсахдаахха схдхахахаа асхссххаас 4740
ххсадддадс хаххххсахх хадхдсхааа саадхаадаа ааахаадсха дадхдаахтх 4800
сХаааХдХХд даахдххахд ддахдхааас аахдхааадх аааасасХсХ саддаХХХса 4860
ссадаадхха садахдаддс асхддааасс ассассааах ХадсаддХдс ассххсхдхд 4920
дсхдхсххдх ХТсХдаадХа сХХХХХсХХс сасаададхд ааХХХдасс! аддсаадххх 4980
дххсаааадд хадахссхда дахдахххдд хсадаххддд ахааддссса дсаахсхдса 5040
ххххаасаад сассссадхе асгаддаХдс адахддасса сасХХХдада аасассассс 5100
ахххсхасхх хххдсассхх ахьххсхсхд ххссхдадсс сссасаххсх схаддадааа 5160
сххадаххаа ааХХсасада сасхасахах схааадсххх дасаадхссх хдассхсхах 5220
ааасххсада дхссхсахха хааааТддда адасхдадсх ддадХХсадс адхдахдсхх 5280
хтхадхгхта ааадХсХаХд ахсхдахсхд дасххссхах ааХасаааХа сасаахссхс 5340
саадааТХХд асххддаааа д 5361
<210> 8
<211> 1181
<212> РКТ
<213> Ното Бартелз
<220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ
<22 3> Нитап а!рНа2 тпхедт'п
<400> 8
Мех 61 у 1 РГО 61 и Агд 5 ТНг 61 у А1а А1а Рго 10 Ьеи Рго Ьеи Ьеи Ьеи 15 уа1
Ьеи А1а Ьеи Бег 61 п 61 у И е Ьеи Азп Суз суз Ьеи А1а Туг А5П Уа1
20 25 30
61 у Ьеи РГО 61 и А1а Ьуз 11 е РЬе Бег 61 у РГО Бег Бег 61 и 61 п РЬе
35 40 45
61 у туг А1а Уа1 61 п 61 η рНе 11е АЗП Рго ьуз 61 у Азп Тгр Ьеи Ьеи
50 55 60
Уа1 61у Бег Рго тгр Бег 61 у РЬе РГО 61 и АЗП Агд Мех 61 у Азр νβΐ
65 70 75 80
туг ьуз Суз Рго Уа1 85 Авр ьеи Бег тЬг А1а 90 ТЬг суз 61 и ьуз Ьеи 95 Азп
Ьеи 6Ίη тЬг Бег ТНг Бег Не Рго АЗП уа! тЬг 61 и мех ьуз ТЬг Азп
100 105 110
- 83 016245
ме1 Зег Ьеи 61у Ьеи 11е ьеи ТНг Агд А5П мет 61 у ТНг 61 у 61 у РНе
115 120 125
Ьеи тНг Суз 61 у рго Ьеи тгр А1а 61 п 61 п суз 61 у Азп 61 п туг туг
130 135 140
тНг ТНг 61 у Уа1 Суз Зег Азр 11 е Зег Рго Азр рНе 61 п ьеи зег А1а
145 150 155 160
Зег РНе Зег Рго А1а ТНг 61 п Рго Суз Рго Зег ьеи 11 е Азр уа! Уа!
165 170 175
уа! Уа1 Суз Азр 61 и зег Азп зег И е Туг РГО тгр Азр А1а уа! ьуз
180 185 190
Азп РНе ьеи 61 и ьуз РНе Уа1 61 п 61 у Ьеи Азр Не 61 у Рго ТЬг ьуз
195 200 205
тНг 61 η уа! 61 у ьеи 11 е 61 п туг А1а АЗП Азп Рго Агд Уа1 Уа1 РЬе
210 215 220
АЗП ьеи Азп тНг туг ьуз тНг ьуз 61 и с!и мет 11е Уа1 А1а ТЬг Зег
225 230 235 240
61 п ТНг 5ег 61 п Туг 61 у 61 у Азр Ьеи тНг АЗП ТНг РНе 61 у А1а 11е
245 250 255
61 η туг А1а Агд ьуз туг А1а туг Зег А1а А1а Зег 61 у 61 у Агд Агд
260 265 270
5ег А1а тНг ьуз Уа! мет Уа1 Уа1 Уа1 ТНг Азр 61 у 61 и Зег Нтз Азр
275 280 285
61 у Зег 290 Мег Ьеи ьуз А1а Уа1 295 11е Аэр 61 п суз АЗП 300 НТ 5 Азр Азп 11е
Ьеи Агд РЬе 61 у 11е А1а УаТ ьеи 61 у туг ьеи АЗП Агд АЗП А1а ьеи
305 310 315 320
Азр тНг ьуз Азп Ьеи 11е ьуз 61 и 11е ьуз А1а 11е А1а Зег 11е Рго
325 330 335
ТЬг 61 и Агд Туг РНе РНе Азп Уа1 Зег Азр 61 и А1а А1а Ьеи Ьеи 61 и
340 345 350
ьуз А1а 61 у тНг Ьеи 61 у 61 и 61 п 11е РНе Зег Пе 61 и 61 у тНг Уа1
355 360 365
61 п 61 у 61 у АЗр Азп рНе 61 п мет б1и мет Зег 61 п Уа1 б!у РНе Зег
370 375 380
- 84 016245
А1а 385 Азр туг Зег Зег 61 η Азп Азр 11е Ьеи Мет: Ьеи 61 у А1 а Уа1 61 у 400
390 395
А1а рИе 61 у тгр зег 61 у ТНг Не Уа1 61 п ЬУЗ ТНг Зег Нтз 61 у нтз
405 410 415
ьеи 11 е РНе Рго Ьуз 61 η А1а РНе Азр 61 п Не Ьеи 61 п Азр Агд АЗП
420 425 430
НТ 5 Зег Зег Туг ьеи 61 у туг Зег Уа1 А1а А1а Не Зег тНг С1у 61 и
435 440 445
5ег тНг НТ 5 РНе Уа1 А1а 61 у А1а Рго Агд А1 а АЗП Туг тНг б!у 61 π
450 455 460
Не уа1 ьеи туг Зег уа1 Азп 61 и АЗП 61 у Азп Не ТНг Уа1 Не 61 п
465 470 475 480
А1а НТЗ Агд 6] у Азр 61 η Не 61 у Зег Туг РНе 61 у 5ег Уа1 Ьеи Су5
485 490 495
Зег Уа1 АЗР Уа1 АЗР ьуз Азр тНг Не ТНг Азр Уа1 Ьеи Ьеи Уа1 61 у
500 505 510
А1а Рго мег Туг мег Зег Азр ьеи ьуз Ьуз 61 и 61 и 61 у Агд Уа1 Туг
515 520 525
ьеи РНе тНг 11 е Ьуз ьуз 61 у 11 е Ьеи 61 у 61 п Нтз 61 п РНе ьеи 61 и
530 535 540
61 у Рго 61 и 61 у И е 61 и АЗП ТНг Агд РНе 61 у Зег А1а Не А1а А1а
545 550 555 560
ьеи 5ег Азр Не АЗП мег А5р 61 у РНе АЗП Азр Уа1 Не Уа1 61 у Зег
565 570 575
РГО ьеи 61 и АЗП 61 η АЗП Зег 61 у А1а Уа1 туг Не Туг АЗП 61 у НТ5
580 585 590
61 η 61 у ТНг 595 Пе Агд ТНг ьуз туг 600 зег 61 η ьуз Не Ьеи 605 61 у Зег АЗР
61 у А1а РНе Агд 5ег нтз Ьеи 61 η туг РНе 61 у Агд Зег Ьеи АЗр 61 у
610 615 620
Туг 61 у Аьр ьеи АЗП 61 у Азр Бег Не ТНг А5Р Уа1 зег Не 61 у А1а
625 630 635 640
РНе 61 у 61 η Уа1 Уа1 61 п Ьеи тгр Зег 61 η Зег 11е А1а Азр Уа1 А1а
645 650 655
11 е 61 и А1а 5ег 660 рЬе тЬг Рго 61 и Ьуз 11е 665 тНг Ьеи Уа! Азп 670 ьуз Азп
А1а С1 η 11е Пе ьеи ьуз ьеи суз РКе Зег А1а Ьуз РКе Агд Рго тКг
675 680 685
ьуз 61 η Азп А&П 61 η Уа1 А1а 11 е Уа1 Туг АЗП Не ТКг Ьеи Азр А1а
690 695 700
Азр 61 у РКе Зег Зег Агд Уа1 тНг Зег Агд 61У ьеи РКе Ьуз 61 и АЗП
705 710 715 720
АЗП 61 и Агд суз ьеи 61 п ьуз АЗП мег уа1 Уа1 АЗП 61 п А1а 61 п зег
725 730 735
Суз Рго 61 и Нт 5 Не 11 е Туг 11 е 61 η 61 и Рго зег АЗр уа1 Уа1 А5П
740 745 750
5ег ьеи Азр ьеи Агд Уа1 Азр 11 е 5ег Ьеи 61 и Азп Рго 61 у тЬг 5ег
755 760 765
Рго А1а Ьеи 61 и А1а Туг зег 61 и ТКг А1а ЬУ5 Уа1 РКе 5ег 11 е Рго
770 775 780
РНе Н1 5 ьуз Азр суз 61 у 61 и Авр 61 у Ьеи суз Не Зег Азр Ьеи Уа1
785 790 795 800
ьеи Азр Уа1 Агд 61 η Не Рго А1а А1а 61 η 61 и 61 п РГО РКе 11е Уа!
805 810 815
зег АЗП 61 п А5П ЬУ5 Агд ьеи ТКг РКе зег Уа1 тКг Ьеи ЬУ5 Азп ьуз
820 825 830
Агд 61 и Зег А1а Туг АЗП тНг 61 у Не Уа1 Уа! Азр РКе 5ег 61 и АЗП
835 840 845
Ьеи РКе РЬе А1а Зег РКе Зег ьеи Рго Уа1 Азр 61 у ТКг 61 и Уа1 ТНг
850 855 860
Суз 61 η Уа1 А1а А1а Зег 61 п ЬУ5 Зег Уа1 А1а суз Азр Уа1 С1у туг
865 870 875 880
Рго А1а Ьеи Ьуз Агд 61 и 61 п 61п Уа! тКг РКе тНг Не Азп РКе АЗР
885 890 895
РКе Азп ьеи 61 п А5П Ьеи 61 п А5П 61 η А1а Зег Ьеи Зег РКе 61η А1 а
900 905 910
Ьеи 5ег 61 и 5ег 61 п 61 и 61 и А5П ьув А1а Азр Азп Ьеи Уа! Азп ьеи
915 920 925
ьуз Не РГО ьеи ьеи туг АЗР А1а 61 и Не Нт 5 ьеи ТКг Агд Зег тКг
930 935 940
А5П 945 И е АЗП РНе Туг 61и 11е Бег 5ег Азр 61у Азп Уа1 Рго Бег 11е 960
950 955
Уа1 Н1з Бег РНе 61 и А5р Уа1 61у РГО ьуз Рпе 11е РНе Бег ьеи 1_У$
965 970 975
Уа1 ТНг ТНг 61 у Бег ν31 РГО Уа1 Бег МеТ д1а тКг Уа1 Не Не ΗΊ5
980 985 990
11е Рго 61η Туг тНг ьуз 61 и Ьуз Азп рго ьеи Мет Туг Ьеи ТНг 61у
995 1000 1005
Уа1 61 п 1010 тЬг Азр Ьуэ А1а 61у 1015 Азр 11е Бег Суз АЗП 1020 А1а АЗр 11е
Азп Рго Ьеи Ьуз Не 61 у 61п тНг Бег Бег Бег уа1 Бег РНе ьуз
1025 1030 1035
Бег 61 и Азп РНе Агд Н18 ТНг ьуз 61 и ьеи Азп суз Агд тНг А1а
1040 1045 1050
Бег Суз Бег Азп Уа1 ТНг Суз тгр Ьеи Ьуз Азр Уа1 Н1з мет ьуз
1055 1060 1065
61 у 61 и туг рНе Уа1 АЗП Уа1 тНг тНг Агд 11е Тгр АЗП 61 у ТНг
1070 1075 1080
РНе А1а Бег Бег ТЬг РНе 61 п тНг Уа1 61 π ьеи ТНг А1а А1а А1а
1085 1090 1095
61 и Не АЗП ТНг туг АЗП Рго 61 и 11е Туг Уа1 Не 61 и Азр АЗП
1100 1105 1110
тНг Уа1 тНг 11е Рго Ьеи МеТ Не МеТ ьуз Рго Аэр 61 и ьуз А1а
1115 1120 1125
61 и Уа1 Рго ТНг 61 у Уа1 11 е Не 61 у Бег 11 е 11 е А1а 61 у Не
изо 1135 1140
Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи А1а Ьеи Уа1 А1а 11е Ьеи Тгр Ьуз Ьеи 61 у РНе
1145 1150 1155
РНе Ьуз Агд ьуз туг 61 и ьуз мет ТНг Ьуз АЗП Рго Азр 61 и Не
1160 1165 1170
Азр 61 и ТНг ТНг 61 и Ьеи Бег Бег
1175 1180
<210> 9 <211> 3700 <212> ОНА <213> Ното 5артеп5 <220>
<221> тт5С_ГеаХиге <223> нитап ЬеХа1 япХедгтп сил <400> 9
адссдссдсс асссдссдсд сссдасассс дддаддсссс дссадсссдс дддададдсс 60
садсдддадх сдсддаасад саддсссдад сссассдсдс сдддссссдд асдссдсдсд 120
даааадаХда ахххасаасс ааХХХХсХдд аххддасхда ХсадХХсадХ ХХдсХдХдХд 180
хххдсхсааа садахдаааа хадахдххха ааадсааахд ссаааХсаХд ХддадааХдХ 240
аХасаадсад ддссаааХХд хдддхддхдс асаааХХсаа сахххххаса ддааддааХд 300
ссхасххсхд сасдахдхда хдахххадаа дссххааааа адаадддххд сссхссадах 360
дасаХадааа аХсссададд сХссааадаХ аХааадаааа аХаааааХдХ аассаассдх 420
адсаааддаа садсададаа дсхсаадсса даддаХаХХа схсадахсса ассасадсад 480
ххддххххдс даххаадахс аддддадсса садасаххха саххаааахх саадададсх 540
даадасХаХс ссаХХдассХ схасхассхх аХддассХдХ сххасхсаах дааадасдах 600
ХХддадааХд ХааааадХсХ ХддаасадаХ сХдаХдааХд аааХдаддад даХХасХХсд 660
дасХХсадаа ххддахххдд сХсаХХХдХд даааадасХд ХдаХдссХХа саХХадсаса 720
асассадсха адсХсаддаа сссХХдсаса адхдаасада асХдсассад сссаХХХадс 780
хасааааахд хдсхсадхсх хасхаахааа ддадаадхах ХХаахдаасх ХдХХддаааа 840
садсдсахах сХддаааХХХ ддаХХсХсса дааддхддхх ХсдаХдссаХ саХдсаадХХ 900
дсадХХХдХд дахсасхдах хддсхддадд ааХдХХасас ддсхдсхддх дххххссаса 960
даХдссдддХ ХХсасХХХдс ХддадаХддд ааасХХддХд дсаХХдХХХХ ассаааХдаХ 1020
ддасааХдХс ассХддаааа ХааХаХдХас асааХдадсс аХХаХХаХда ХХаХссХХсХ 1080
аХХдсХсасс ХХдХссадаа асХдадХдаа аахаахаххс адасааХХХХ хдсадххасх 1140
даадааХХХс адссХдХХХа сааддадсХд ааааасххда ХсссХаадХс адсадхадда 1200
асаххахсхд саааххсхад сааХдХааХХ садххдахса ххдахдсаха сааххсссхх 1260
ХссХсадаад ХсаХХХХдда ааасддсааа ХХдХсадаад дадХаасааХ аадХХасааа 1320
ХсХХасХдса адаасддддх дааХддааса ддддаааахд даадааааХд ххссаахахх 1380
хссаххддад аХдаддХХса аХХХдаааХХ адсаХаасХХ сааахаадхд Хссаааааад 1440
даххсхдаса дсхххаааах хаддссхсхд ддсхххасдд аддаадхада ддххаххсхх 1500
садХасаХс! дХдааХдХда аХдссааадс дааддсаХсс сХдааадХсс саадХдХсаХ 1560
дааддааахд ддасахххда дхдхддсдсд хдсаддхдса ахдаадддсд хдххддхада 1620
саххдхдаах дсадсасада хдаадххаас адХдаадаса ХддаХдсХХа сХдсаддааа 1680
даааасадхх садааахсхд садхаасаах ддададхдсд хсхдсддаса дхдхдхххдх 1740
аддаададдд аХааХасааа ХдаааХХХаХ ХсХддсаааХ ХсХдсдадХд хдахаахххс 1800
- 88 016245
аасхдхдаха дахссаахдд сххаахххдх ддаддаааХд дХдХХХдсаа дХдХсдХдХд 1860
хдхдадхдса ассссаасха сасХддсадХ дсахдхдасх дххсхххдда хасхадхасх 1920
хдхдаадсса дсаасддаса дахсхдсаах ддссддддса ХсХдсдадХд ХддХдХсХдХ 1980
аадхдхасад ахссдаадхх Хсаадддсаа асдхдхдада хдхдхсадас схдссххддх 2040
дхсхдгдсхд адсахааада ахдхдххсад ХдсададссХ ХсааХааадд адаааадааа 2100
дасасаХдса сасаддааХд ХХссХаХХХХ аасаххасса аддхадааад хсдддасааа 2160
ххассссадс сддхссаасс хдахссхдхд хсссаххдха аддадаадда хдххдасдас 2220
ХдХХддХХсХ аХХХХасдХа ХХсадХдааХ дддаасаасд аддхсахддх хсахдххдхд 2280
дадаахссад адхдхсссас хддхссадас аХсаХХссаа ХХдХадсхдд хдхддххдсх 2340
ддааххдххс ХХаХХддссх хдсаххасхд схдахахдда адсххххаах дахааххсах 2400
дасадааддд адхххдсхаа ахххдаааад дадааааХда ахдссааахд ддасасдддХ 2460
даааахссха ХХХаХаадад хдссдхааса асхдхддхса ахссдаадха хдадддаааа 2520
хдадхасхдс ссдхдсааах сссасаасас ХдааХдсааа дХадсааХХХ ссаХадХсас 2580
адххаддхад схххадддса ахаххдссах ддххххасхс ахдхдсаддх хххдаааахд 2640
хасаахахдх ахааххххха ааахдхххха ххаххххдаа аахаахдххд хааххсахдс 2700
садддасхда саааадасХХ дадасаддах ддххаххсхх дхсадсхаад дхсасаххдх 2760
дссхххххда ссххххсххс схддасхахх дааахсаадс ХХаХХддаХХ аадхдахахх 2820
ХсХаХадсда ХХдааадддс ааХадХХааа дХааХдадса хдахдададх ХХсХдХХааХ 2880
сахдхаххаа аасхдахххх хадсхххаса аахахдхсад хххдсадхха хдсадаахсс 2940
ааадХаааХд ХссХдсХадс ХадХХаадда ххдххххааа хсхдххаххх ХдсХаХХХдс 3000
сХдХХадаса Хдасхдахда сахахсхдаа адасаадХаХ дХХдададХХ дсХддХдХаа 3060
ааХасдХХХд аааХадХХда ХсХасааадд ссаХдддааа ааххсадада дХХаддаадд 3120
ааааассаах адсхххаааа ссХдХдХдсс аХХХХаадад ХХасХХааХд хххддхаасх 3180
ХХХаХдссХХ сасХХХасаа аХХсаадссХ ХадаХаааад аассдадсаа ххххсхдсха 3240
аааадХссХХ дахххадсас хахххасаха саддссаХас хххасааадх ахххдсхдаа 3300
ХддддассХХ ХХдадХХдаа ХХХаХХХХаХ ХаХХХХХаХХ ХХдХХХаахд хсхддхдсхх 3360
ХсХаХсассХ сххсхаахсх ХХХааХдХаХ ХХдХХХдсаа ххххддддха адасХХХХХХ 3420
аХдадХасХХ ХХХсХХХдаа дХХХХадсдд ХсааХХХдсс ХХХХХаахда асахдхдаад 3480
ХХаХасХдХд дсхахдсаас адсхсхсасс хасдсдадхс ХХасХХХдад ххадхдссах 3540
аасадассас ХдХаХдХХХа сххсХсасса ХХХдадХХдс ссахсххдхх хсасасхадх 3600
сасаххсххд ХХХХаадХдс сХХХадХХХХ аасадХХсас ХХХХХасадХ дсхахххасх 3660
даадххаххх аххааахахд ссхаааахас ххааахсдда 3700
<210> 10 <211> 798 <212> РИТ <213> Ното 5артеп5
- 89 016245 <220> , <221> М15С_РЁАТиКЕ <223> Нишап ЬеТа1 1пТедгтп <400> 10
МеТ Азп ьеи 1 61п рго 5 11е РЬе тгр 11е б1у 10 Ьеи Не Бег Бег Уа1 15 суз
су 5 уа1 РНе А1а 61 п тЬг Азр 61 и Азп Агд Суз Ьеи ьуз А1а АЗП А1а
20 25 30
ьуз Бег Суз 61 у 61 и Суз 11е 61 п А1а 61 у Рго Азп Суз <31у Тгр Суз
35 40 45
ТЬг Азп Бег ТЬг РЬе Ьеи 61 п 61 и 61 у МеТ РГО ТЬг Бег А1а Агд суз
50 55 60
Азр Азр ьеи 61 и А1 а Ьеи ьуз ьуз ьуз 61 у Суз РГО Рго А5р Азр 11 е
65 70 75 80
61 и АЗП РГО Агд 61 у Бег ьуз Азр 11е ьуз ьуз АЗП Ьу5 А5П Уа1 ТЬг
85 90 95
А5П Агд Бег Ьуз 61 у тЬг А1а 61 и Ьуз ьеи ьуз РГО 61 и А5р 11 е тЬг
100 105 110
61 п 11е г1и Рго 61 п 61п 1 А·· Уа1 1 ли Л 1 а, I Агд Сар 61 у С1 и Рго
115 120 125
61 п ТЬг 130 Рпе Тпг Ьеи ьуз РЬе 135 ьуз Агд А1а 61 и Азр 140 туг Рго 11е Азр
ьеи Туг туг Ьеи меь Азр кеи Бег Туг Бег мет Ьуз АЗр Азр кеи 61 и
145 150 155 160
АЗП Уа1 ьуз Бег ьеи 61 у Тпг Аэр ьеи МеТ АЗП 61 и мет Агд Агд 11 е
165 170 175
ТЬг Бег А5р РЬе Агд И е 61 у РЬе 61 у Бег РЬе Уа1 61 и Ьуз ТНг Уа1
180 185 190
мет рго туг 11 е Бег ТЬг ТЬг Рго А1а ьуз ьеи Агд АЗП РГО суз ТЬг
195 200 205
Бег 61 и 61 п АЗП Суэ тЬг Бег РГО РЬе Бег туг ьуз АЗП Уа1 кеи Бег
210 215 220
Ьеи Тпг А5П ьуз 61 у 61 и Уа1 РЬе Азп 61 и Ьеи Уа1 61 у ьуз <31 п Агд
225 230 235 240
11 е Бег 61 у Азп кеи Азр Бег Рго б1и 61 у 61 у РЬе Азр А1а 11е МеТ
- 90 016245
245 250 255
61 π уа! А1а Уа1 Суз 61 у Зег Ьеи Не 61 у тгр Агд АЗП Уа1 ТЬг Агд
260 265 270
ьеи Ьеи Уа1 рНе Зег ТНг Азр А1а б!у РНе Нт 5 РНе А1а 61 у Азр б1у
275 280 285
ьуз Ьеи 61 у 61 у 11 е Уа1 Ьеи Рго АЗП Аэр 61 у 61 п Суз Нтз Ьеи 61 и
290 295 300
АЗП АЗП ме± туг ТНг Мес Зег нтз Туг туг Азр Туг Рго Зег Не А1а
305 310 315 320
НТЗ ьеи Уа1 61 η Ьуз ьеи 5ег 61 и А5П Азп 11е 61 п ТНг Не рНе А1а
325 330 335
Уа! тНг 61 и 61 и РНе 61 η РГО Уа1 туг Ьуз 61 и Ьеи ьуз АЗП Ьеи 11 е
340 345 350
Рго ьуз зег А1а Уа1 61 у тЬг ьеи зег А1а Азп зег зег АЗП уа! 11 е
355 360 365
61 η Ьеи 11 е Не Азр А1а туг АЗП 5ег Ьеи Зег зег 61 и Уа1 Не Ьеи
370 375 380
61 и АЗП 61 у ьуз Ьеи 5ег 61 и 61 у Уа! ТНг 11 е 5ег Туг ьуз 5ег Туг
385 390 395 400
суз ьуз АЗП 61 у Уа1 АЗП 61 у ТНг 61 у 61 и АЗП 61 у Агд ьуз суз зег
405 410 415
А5П Не 5ег Не 61 у АЗР б!и Уа1 61 п РЬе 61 и Не зег Не ТЬг Зег
420 425 430
АЗП ьуз су 5 Рго 1-У5 ьуз Азр Зег Азр Зег РЬе ьуз Не Агд РГО ьеи
435 440 445
61у рНе 450 ТНг 61 и 61 и Уа1 61 и 455 Уа1 Не Ьеи 61 π Туг 460 11 е суз 61 и суз
61 и Суз 61 η Зег 61 и 61 у 11е Рго 61 и 5ег РГО ьуз Суз НТВ 61 и 61 у
465 470 475 480
Азп 61 у тНг РЬе 61 и суз 61 у А1а суз Агд Суз А5П 61 и 61 у Агд уа1
485 490 495
61 у Агд Н1з суз 61 и суз 5ег ТНг Азр 61 и Уа! АЗП Зег С1и А$р мес
500 505 510
Азр А1а Туг суз Агд ьуз 61 и Азп Зег Зег 61 и Не суз Зег Азп Азп
515 520 525
- 91 016245
<31 у 61 и 530 СУ5 Ча1 Суэ 61 у 61 п 535 суз Ча! суз Агд ьуз 540 Агд АЗр А5П тНг
АЗП 61 и 11е Туг 5ег 61 у ьуз рНе Суз 61 и суз Азр А5П РНе А5П суз
545 550 555 560
АЗР Агд Бег АЗП 61 у 565 ьеи 11 е суз 61 у 61 у 570 АЗП 61 у ча1 суз суз
Агд ча1 Су5 61 и Суз А5П Рго АЗП Туг тНг 61 у Бег А1а суз Азр суз
580 585 590
Бег ьеи АЗр тНг Бег тНг Суз 61 и А1а Бег АЗП 61 у 61 η Не суз АЗП
595 600 605
<31 у Агд 61 у Не СУЗ 61 и суз 61 у ча! суз ьуз суз тНг АЗр рго ьуз
610 615 620
РНе 61 η 61 у 61 η тНг Суз 61 и МеТ Суз 61 π тНг СУЗ Ьеи 61 у ча! суз
625 630 635 640
А1а 61 и Нт 5 ьуз 61 и Суз Ча1 61 п суз Агд А1а рНе АЗП ьуз 61 у 61 и
645 650 655
ЬуЗ ЬуБ А5р тНг Суз ТНг 61 п 61 и Су5 Бег Туг рНе АЗП Не ТНг Ьуз
660 665 670
Ча1 61 и 5ег 675 Агд АЗр ьуз Ьеи Рго 680 61 п Рго Ча1 61 η РГО 685 А5р Рго Ча1
Бег НТ 5 Су5 ьуз 61 и ьуз Азр Ча! А5Р Азр суз тгр РНе туг РНе ТНг
690 695 700
туг Бег ча1 АЗП 61 у АЗП Азп 61 и ча1 мет Ча1 НТВ ча! ча1 61 и АЗП
705 710 715 720
Рго 61 и Суз РГО тНг 61 у РГО Азр Не Не Рго 11е Ча1 А1а 61 у ча!
725 730 735
Уа1 А1а 61 у 11е Ча1 Ьеи Не 61 у Ьеи А1а Ьеи Ьеи Ьеи Не Тгр Ьуз
740 745 750
ьеи ьеи мет Не Не НТ 5 Азр Агд Агд 61 и РНе А1а ьуз РНе 61 и ьуз
755 760 765
01 и Ьу5 мег Азп А1а ьуз Тгр Азр ТНг 61 у 61 и Азп Рго Не Туг ьуз
770 775 780
5ег А1а ча! тНг тНг Ча1 Ча1 Азп Рго ьуз туг 61 и 61 у ьуз
785 790 795
- 92 016245 <210> 11 <211> 226 <212> РКТ <213> ното 5артепз <220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <22 3> Нитап а1рКа2 I йоталп <400> 11
Зег 1 рго Азр рКе 61 η 1_еи Зег А1а Зег РКе Зег Рго А1а ТКг 61 п 15 Рго
5 10
Суз Рго Зег |_еи Не Азр Уа1 Уа1 Уа1 Уа! СУ5 Азр 61 и 5ег Азп Зег
20 25 30
11 е Туг Рго 35 Тгр Азр А1а Уа1 |_уз 40 АЗП рКе |_еи 61 и ьуз 45 рКе Уа1 61 п
61 у Ьеи А$р Не 61 у Рго тНг ТЬг 61 п Уа1 61 у Ьеи Не 61 п туг
50 55 60
А1а АЗП АЗП Рго Агд Уа1 Уа1 рКе АЗП |_еи Азп ТКг Туг |_уз ТКг ьуз
65 70 75 80
61 и 61 и мет 11е Уа1 А1а тКг зег 61 п тпг Зег 61 п туг 61 у 61 у А5Р
85 90 95
1_еи ТНг Азп тКг рКе 61 у А1а Не 61 п туг А1а Агд ьуз туг А1а туг
100 105 110
Зег А1а А1а Зег 61 у 61 у Агд Агд Зег А1а Тпг Ьу5 Уа1 мет Уа1 Уа1
115 120 125
Уа1 ТКг Азр 61 у 61 и Зег Нлз Азр 61 у зег мет теи 1_уз А1а Уа1 Не
130 135 140
Азр 61 п Суз Азп НЛ 5 Азр АЗП 11 е |_еи Агд РНе 61 у Не А1а Уа1 ьеи
145 150 155 160
61 у Туг 1_еи АЗП Агд АЗП А1а Ьеи Азр ТКг ьуз Азп Ьеи 11е ьуз 61 и
165 170 175
И е ьуз А1а 11 е А1а зег Не РГО тКг 61 и Агд Туг РЬе РЬе Азп Уа1
180 185 190
Зег Азр 61 и А1а А1а ьеи Теи 61 и |_уз А1а 61 у тКг 1_еи 61 у 61 и 61 п
195 200 205
Не РЬе Зег Не 61 и 61 у ТКг Уа1 61п 61у 61у Азр АЗП РКе 61 п Мет
210 215 220
- 93 016245 и Μβΐ
225 <210> 12 <211> 71 <212> ΡΚΤ <213> Ното 5ар1епз <220>
<221> М13С_РЕАТиКЕ <223> Е141-3 4-59 [РИ-1-25; РИ2-26-39; тЗ=40-71] <400> 12
61 п уа1 61 п Хеи <31 п 01 и Зег 61у Рго 61 у Ьеи Уа1 хуз РГО 5ег 61 и
1 5 10 15
Тб Г ьеи Зег Хеи Тб г Су 5 Тбг Уа1 5ег Тгр 11е Агд 61 π РГО РГО 61 у
20 25 30
ьуз 61 у Хеи 61 и Тгр Не 61 у Агд Уа1 Тб Г 11е 5ег Уа1 АЗр тКг Зег
35 40 45
ьуз Азп 61 п Рбе Зег Ьеи хуз ьеи Зег Зег уа! тпг А1а А1а АЗр тб г
50 55 60
А1а уа! Туг Туг Суз А1а Агд
70 <210> 13 <211> 11 <212> РКТ <213> Ното Зарт епз <22О>
<221> М15С_РЕАТи«Е <223> РИ4 4-59 [ΝσΒΙ епХгу ρι/33583] <400> 13
Тгр б1у <31 п 61у ТНг ьеи Уа1 Тбг Уа1 5ег Зег
1510 <210>14 <211>27 <212> ΟΝΑ <213> Ното ЗартепБ <220>
<221> тт5с_ГеаХиге <223> унх-Рог [1огиагс1 рглтег] <400>14 ссаХддсХдХ схрддддсхд сХсХХсХ27 <210>15 <211>17 <212> РИА
- 94 016245 <213> Ното Бартелз <22О>
<221> ттэс^беатиге <223> НС-геу [геуегзе ргттег] <400> 15 ддддссадед даГадас <210> 16 <211> 28 <212> ОНА <213> Ното Бартелз <220>
<221> т15с_6еаТиге <223> УЬЬ-Гог [Тогиагс! ргттег] <400> 16 ссаеддаеее есаадедсад аеееесад
<210> <211> <212> <213> 17 17 ОНА Ното Бартелэ
<22О>
<221> ттзс„Теаеиге <223> ьскарра-геу [геуегзе рп'тег] <400> 17 дееддедсад саесадс <210> 18 <211> 318 <212> ΟΝΑ <213> Ното Бартелз <220> :
<221> ттэс_Теаеиге <223> ТМС-2206 УЬ <220>
<221> СО$ <222> (1)..(318) <400> 18
саа ΐΐΐ 61 η РНе 1 дее се с асе сад С1п есе сса дса еес еед ест дсе есе сса 999 с*у 48
Уа1 Ьеи тНг 5 Бег Рго А1а РЬе 10 ьеи Бег А1а Бег Рго 15
дад аад дес асе аед асе где аде дес аас гса аде дед аае Гас агг 96
61 и ьуз Уа1 Т|1Г мее тЬг Су 5 Бег А1а А5П Бег Бег уа! АЗП туг 11 е
20 25 30
сас тдд еас сад сад аад Гса ддс асе 1СС ССС ааа ааа едд агг гаг 144
Нт 5 тгр туг 61 η 61 η 1_У5 Бег 61у ТНг Бег Рго 1_У5 ьуз тгр Не туг
35 40 45
дас аст есс ааа сед дсг ГсГ дда дес ссг д« сдс еес аде ддс адг 192
Азр тНг Бег ьуз Ьеи А1а Бег 61у Уа1 РГО Уа1 Агд РНе Бег С1у Бег
50 55 60
дда ТсТ ддд асе тст Тас ТсТ СТС аса атс аде аде атд дад аст дад
61у Бег б1у тЬг Бег Туг Бег ьеи ТЬг Не Бег Бег МеТ 61 и тЬг 61и
65 70 75 80
дат дет дсс аст гат Тас Где сад сад Тдд асТ аст аас сса СТС асд
Абр А1а . А1а ТЬг туг 85 Туг Суз 61 η 61п тгр 90 ТНг тЬг Азп РГО Ьеи 95 тЬг
Г1с ддт РЬе 61 у дет ддд асе адд дтд Уа! дад стд ааа
А1а 61 у ТНг Агд 61 и Ьеи ьуз
100 105
<210> 19
<211> 106
<212> РКТ
<213> Ното Бартелз
<400> 19
61 η РКе Уа1 Ьеи ТНг 61 η Бег РГО А1а РНе ьеи Бег А1а Бег Рго б1у
1 5 10 15
61 и Ьуз уа1 тЬг МеТ тЬг Суз Бег А1а Азп Бег Бег Уа1 А5П Туг 11 е
20 25 30
Нт 5 тгр Туг 61 η 61 η ЬУБ Бег 61 у тЬг Бег Рго ьуз Ьуз Тгр 11 е туг
35 40 45
АЗр ТНг 50 Бег Ьуз Ьеи А1 а Бег 55 61 у уа1 Рго Уа1 Агд 60 РНе Бег 61 у Бег
61у Бег 61 у ТЬг Бег Туг Бег Ьеи ТНг 11е Бег Бег МеТ 61 и ТЬг б1и
65 70 75 80
абр А1а А1а ТНг Туг туг Суз 61 η 61 η Тгр ТНг тНг Азп РГО Ьеи тНг
85 90 95
РЬе 61 у А1а С1у ТЬг Агд Уа! 61 и Ьеи суз
100 105
<210> 20
<211> 357
<212> ΡΝΑ
<213> Ното заря ел5
<220> <221> СР5
<222> (1) (357)
<220>
<221> ттзс. феатиге
<222> (1).. (357)
<223> ТМС-2206 УН
<400> 20
сад дТд 61 η Уа1 сад аад дад Тса дда ССТ ддс 61 у стд дгд дед ссс Тса сад
61 η ьеи и/5 61 и Бег 61у Рго Ьеи Уа1 А1а РГО Бег 61 п
1 5 10 15
аде сТд Тсс атс асТ ТдТ асТ дТс ТсТ дда ТТТ Тса ТТа асе аас тат96
Бег Ьеи Бег 11е тНг Суз тНг Уа1 5ег С1у РНе Бег ьеи ТНг АзпТуг
2530 дат атт сас тдд дтт еде сад сст сса дда аад ддт стд дад тдд стд144 бТу 11е Нт 5 Тгр Уа1 Агд 61п Рго Рго 61у Ьуз бТу ьеи 61 и ТгрЬеи
4045 дда дтд ата гдд дет едт дда ттс аса аас тат аат тсд дсс стс агд192 у Уа1 11е тгр А1а Агд б1у РНе тЬг абп туг азп Бег А1а ьеи мех : 5560
ХСС ада сгд ат с аге аса ааа дас аах Хсс сад адт саа 9*с ххс хха 240
56 Г Агд Ьеи 11е 11е тНг ьуз Азр АЗП 5ег 01 п 5ег 01 η Уа1 РЬе ьеи
65 70 75 80
ааа агд аас адт сха саа ссх дах дас хса дсс асх хас ТТС хдх дсс 288
Ьу5 мет азп Бег ьеи 61 п Рго А5р Аэр Бег А1а тпг туг РНе Суз А1а
90 95
ада дед аас дас ддд дхс хах хах дет ахд дас Хас *дд ддт сад дда 336
Агд А1а АЗП АЗр 01у Уа1 Туг туг А1а мех АЗр туг тгр 61 у 01 η 61У
100 105 110
асе Хса дхс асе дхс ХСС Хса 357
тКг 5ег Уа1 тКг Уа1 5ег 5ег
115 <210> 21 <211>119 <212> РКТ :
<213> Ното зарт епз <400> 21
61 η Уа1 61 η ьеи ьуз б1и Бег 61 у рго 61 у ьеи уа! А1а РГО 5ег 61 п
1 5 10 15
Бег Ьеи Бег Не ТЬг Суз ТНг Уа1 Бег 61 у РЬе Бег Ьеи ТНг АЗП туг
20 25 30
61 у 11е Нтз 35 Тгр Уа1 Агд С1п Рго 40 Рго 61 у Ьуз 61 у ьеи 45 61 и Тгр Ьеи
61 у Уа1 11е тгр А1а Агд 61 у РНе тНг АЗП Туг Азп зег А1а ьеи мет
50 55 60
Бег Агд Ьеи 1]е 11 е ТНг Ьуз Азр Азп Бег 61 п Бег С1п Уа1 РНе ьеи
65 70 75 80
ьуз МеТ Азп Бег Ьеи 01 п Рго Аэр Азр Бег А1а Тпг Туг РНе Суз А1а
85 90 95
Агд А1а Азп Азр 61 у Уа1 Туг Туг А1а МеТ Азр Туг Тгр 61у 61 п 61 у
100 105 110
ТНг Бег Уа1 тНг Уа1 Бег Бег
115 <210> 22 <211> 31 <212> ΟΝΑ <213> ното 5ар1еп5 <22О>
<221> т15с_Театиге <223> ТМС-22О6-Г5' [Гогиагс! ргттег] <400>22 сссдааЬЬса саддьдсадь ьдааддадьс а31 <210> 23 <211> 35 <212> ΟΝΑ <213> Ното Зартепз <22О>
<221> ттзс_РеаЬиге <223> ТМС-2206-гЗ' [геуегзе ргттег] <400>23 сдддаьссьь аддаЬсаЬЬЬ ассаддадад ьддда35 <210>24 <211>31 <212> ΟΝΑ <213> Ното Зарпепз <220>
<221> т15с„Теагиге <223> ТМС22р6-к5' [ТогиагН ргттег] <400> 24 сссдааыса сааьььдььс ьсасссадьс ΐ 31 <210> 25 <211> 35 <212> ϋΝΑ <213> Ното 5ар1 епь <220>
<221> ггпзс^РеаЬиге <223> ТМС-2206-кЗ1 [геуегзе рптег] <400> 25 сдддаьссьь аьсьсьааса сьсаььссьд сьдаа 35 <210> 26 <211> 22 <212> РКТ :
<213> Ното Зартепз <220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <223> 1дкарра С10к) 1еас1ег зециепсе <400> 26 мет <51 и тНг Азр тИг ьеи ьеи ьеи тгр Уа1 ьеи ьеи ьеи тгр Уа1 рго 15 10 15
- 98 016245 <31у С1у 5ег тпг С1у А5р <210> 27 <211> 76 <212> ΡΝΑ <213> нолю 5ар1еп5 <220>
<221> ттзс.-реахиге <223> 1дкарра-5 О1тдопис1еох1с1е5 [Ргдтег] <400>27 хсдадссасс агддадасад асасасХссХ дсХаХдддХа схдсхдсхсх дддххссадд 60 «ссасХдда даСдсд76 <210> 28 <211>76 <212> ОНА <213> Ното 5арт епг <220>
<221> т15С_Геа1иге <223> 1дкарра-А5 о11допис1еох10е5 [ргтшег] <400>28 ааххсдсдхс хссадхддаа ссХддаассс ададсадсад ХасссаХадс аддадХдХдХ 60 сХдХсХссаХ ддХддс76 <210>29 <211> 33 <212> ΟΝΑ .
<213> Ното бартепз <220>
<221> ппЕС-ГеаГиге <223> тМС220бУН-111дб1/4Рс-5а11 <400>29 сххддхсдас дсгдаддада сддгдасхда ддх33 <210>30 <211>30 <212> ϋΝΑ <213> ното БартепБ <22О>
<221> т15с_Геагиге <223> !11дС1/4Ес-5а11-Р [Гогиагс! рп’тег] <400> 30:
ХсадсдХсда ссаадддссс аХсздХсХХс30 <210>31 <211>48 <212> ϋΝΑ
- 99 016245 <213> ното Бартепв <220>
<221> тт5С_6еаХиге <223> б1дб1/4Рс-МоС1-К [ΓβνβΓΕβ ргттег] <400>31 аадддаадсд дссдсХХаХс аХХХасссуд адасадддад аддсХсХХ48 <21О>32 <211>39 <212> ΡΝΑ <213> Ното Зартепз <220>
<221> ттЕС_ТеаХиге <223> ТМС220бУЬ-1ткс-5а11 [геуегзе ргттег] <400>32
ХсдХХХдаХд ХсдассХХдд Хсссадсасс даасдХдад39 <21О> 33 <211>35 <212> ϋΝΑ <213> ното зартепЕ <220>
<221> тт 5С_.ТеаХиге <223> Нкс-5а11-Р [Еогиагс! ргттег1 <400>33 ассааддхсд асахсааасд аасхдхддсх дсасс35 <210>34 <211>45 <212> ϋΝΑ <213> Ното зартепз <220>
<221> тт5с_ГеаХиге <223> Нкс-ΝοΧΐ-κ [геуегБе ргттег] <400>34 аадддаадсд дссдсххахс агсасхстсс ссхдххдаад схсхх45 <210> 35 <211>29 <212> ϋΝΑ <213> ното БартепЕ <220>
<221> ттзс-Геахиге <223> ТМС-2206У1_иХ-Ы<с-Р [Еопчагс! ргттег] <400> 35 адддхддадс хдааасдаас хдхддсхдс29 <21О>36 <211>24
- 100 016245 <212> ϋΝΑ <213> Ното Зартепз <22О>
<221> пл зе_СеаСиге <223> тмс-220бУЬис-Нкс-к [геуегзе ргттег] <400> 36
СсдСССсадс СссасссСдд Сссс <210> 37 <211> 107 <212> РКТ <213> ното зартепз <220>
<221> М15С_РЕАТ0КЕ <223> А14 VI. дегтНпе ргосетп <400> 37
Азр Уа1 1 Уа1 Мес тНг 5 61 гт Зег рго А1а РНе ьеи 10 зег Уа1 тНг Рго 15 61 у
61 и ьуз Уа1 тНг 11 е тНг Суз 61 η А1а Зег 61 и 61 у Пе 61 у Азп Туг
20 25 30
ьеи туг тгр 35 туг 61 η 61 η ьуз РГО 40 Азр 61 η А1а РГО ьуз 45 ьеи ьеи 11е
1-УЗ Туг А1а Зег 61 η Зег Не 5ег 61 у Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег 61 у
50 55 60
5ег 61 у Зег 61 у ТЬг Азр РЬе ТЬг РНе ТНг 11е 5ег Зег Ьеи 61 и А1а
65 70 75 80
61 и Азр А1а А1а ТНг Туг Туг суз 61 п 61 η Тгр ТНг ТНг Азп Рго Ьеи
85 90 95
тНг рНе 61 у 61 η 61 у ТНг Ьуз Уа! 61 и Не ьуз
100 105 <210> 38 <211> 10 <212> РКТ
<213> Ното Зартепз
<220>
<221> М1$С_РЕАТиКЕ
<223> ри 4 оТ тасиге карра 1тдНС сКатп
<400> 38
РНе 01у 61 п 01у тКг Ьуэ Уа1 61 и 11е Ьуз
1 5 10
<210> 39
- 101 016245 <211> 121 <212> РКТ <213> ното Барт епэ <220>
<221> М1БС_РЕАТиКЕ <223> 4-59 УН дегшИпе ргохетп <400> 39 :
61 η Уа1 61 η Ьеи 61 η 61 и Бег б1у рго б!у Ьеи Уа1 10 1-У5 Рго Бег 61 и 15
1 5
ТЬг ьеи Бег Ьеи ТЬг Суз ТЬг Уа1 Бег 61 у 61 у Бег 11е Бег Бег Туг
20 25 30
туг тгр Бег 35 тгр 11е Агд 61 η РГО 40 РГО 61 у ьуз 61 у Ьеи 45 61 и Тгр Не
61у Туг 11 е Туг туг Бег 61 у Бег тЬг Азп туг Азп Рго Бег Ьеи ьуз
50 55 60
Бег Агд Уа1 ТЬг Не Бег Уа1 А5р тЬг Бег ьуз Азп 61 п РЬе Бег ьеи
65 70 75 80
ьуз ьеи Бег Бег Уа1 тЬг А1а А1а А5Р тНг А1а Уа1 туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд нтз АЗП Бег Бег Бег тгр туг 61 у Агд Туг РЬе Азр Туг Тгр 61 у
100 105 110
61 η 61 у тЬг ьеи Уа1 ТНг Уа1 Бег Бег
115 120
<210> 40
<211> 119
<212> РРТ
<213> Ното Бартепз
<220>
<221> М15С_ЕЕАТиЯЕ
<223> Нун1, .0
<400> 40
61 η Уа1 61 п Ьеи 61 η 61 и Бег 61 у РГО 61у Ьеи Уа1 ьуз РГО Бег 61 и
1 5 10 15
тЬг Ьеи Бег Ьеи ТНг Суз ТЬг Уа1 Бег 61 у Рпе Бег Ьеи ТНг АЗП туг
20 25 30
б!у 11 е нтз тгр Уа1 Агд 61 η Рго Рго 61 у Ьуз 61 у Ьеи 61 и тгр Ьеи
35 40 45
61у уа1 Не Тгр А1а Агд 61 у РЬе ТНг АЗП туг АЗП Бег А1а Ьеи мех
50 55 60
- 102 016245
Бег Агд ьеи тНг 11е Бег ьуз Азр Азп Бег ьуз АЗП 61 п Уа1 Бег Ьеи
65 70 75 80
ьуз Ьеи Бег Бег Уа1 Тпг А1а А1а Азр тНг А1а Уа1 туг РНе Суз А1а
85 90 95
Агд А1а А5П Азр 100 61 у Уа1 туг туг А1а 105 мет Азр туг тгр 61 у 110 61 п 61 у
ТНг Ьеи Уа1 тНг Уа1 Бег Бег
115 <210> 41 <211> 106 <212> РКТ <213> Ното Бартепз <220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ
<223> НУЬ1, .0
<400> 41
61 п РЬе Уа1 Ьеи тНг 61 п Бег Рго А1а рНе Ьеи Бег Уа1 ТНг Рго 61У
1 5 10 15
61 и ьуз Уа1 тНг 11 е ТНг суз Бег А1а Азп Бег Бег Уа1 А5П туг 11е
20 25 30
нтз тгр Туг 61 п 61 п ьуз Рго А5Р 61 п А1а РГО ЬУБ ЬУБ Тгр Не туг
35 40 45
АЗр тНг Бег ьуз Ьеи А1а Бег 61 у Уа1 РГО Бег Агд РНе Бег 61 у Бег
50 55 60
61 у Бег 61 у тНг Азр Туг тНг РНе ТЬг 11е Бег Бег Ьеи 61 и А1а 61 и
65 70 75 80
Азр А1а А1а тНг туг Туг суз 61 п 61 п Тгр ТНг ТНг А5П Рго Ьеи ТНг
85 90 95
РНе 61 у 61 п 61 у тНг Ьуз Уа1 б!и Не Ьуз
100 105
<210> 42
<211> 48
<212> ΡΝΑ
<213> ното Бартепз
<220>
<221> тт 5с_!еаТиге
<223> НунЗ.О-р [Еогу/агб ргт'тег]
<400> 42
- 103 016245
адсдхддаса ссадсаадаа ссадххсадс сХдаадсХда дсадсдхд 48
<210> 43
<211> 51
<212> ΟΝΑ
<213> ното 5ар1еп5
<22О>
<221> тт5с_ТеаХиге
<223> ΙινΗ3.0-Κ [геуегБе ргттег]
<400> 43
дххсххдсхд дхдхссасдс хдахддхсас дсдддасахд ададсдсхдх х 51
<210> 44
<211> 48 '
<212> ΟΝΑ
<213> Ното 5ар1еп5
<220>
<221> ттзС-ЭеаХиге
<22 3> ήνΗ4.0-Ρ [Гогиагй рттег]
<400> 44
ссХссаддса адддссХдда дхддахсддс дхдахахддд сХсдсддс 48
<210> 45
<211> 51
<212> ϋΝΑ
<213> Ното 5ар1еп5
<220>
<221> т15с_ЕеаХиге
<223> ΗνΗ4.0-κ [геуегзе рптег]
<400> 45
сХссаддссс ххдссхддад дсхддсдхах ссадХддаХд ссаХадХХдд X 51
<210> 46
<211> 33
<212> ϋΝΑ
<213> Ното Бартелз
<220>
<221> т15с_-ГеаХиге
<22 3> НуьЗ.О-Р [богиагб рг1тег]
<400> 46
сссаадстсс гдахсхахда сасггссаад схд 33
<210> 47
<211> 42 ;
<212> βΝΑ
<213> Ното Бартелз
<220>
<221> пн’5с_6еа1:иге
<22 3> Ηνΐ-З.О-к [геуегзе ргттег]
- 104 016245
<400> 47 ; адхдхсахад аХсаддадсХ Хдддддссхд дХсдддсХХс Хд <210> 48 42
<211> <212> <213> 45 ϋΝΑ ното 5ар1еп$
<220> <221> тт5с_Хеахиге
<223> Κνι_4.0-Ρ [Гогиагс! рптег]
<400> 48
дасдсдааХХ садасдХддХ даХдасссад 1с1ссадсаТ есстд 45
<210> 49
<211> 24
<212> ϋΝΑ
<213> Ното 5артеп5
<220> <221> т!зс_Реахиге
<223> ΚνΗ2.Ο-Ρ [-Рогиагс! рптег]
<400> 49
дгдассагса дсааддасаа саде 24
<210> 50
<211> 45
<212> ϋΝΑ
<213> ното Зартепз
<22О> <221> пн зс_ГеаХиге
<223> ΚνΗ2,0-Β [геуегзе рптег]
<400> 50 ,
дстдтгдтсс тсдстдатдд ссасдсддда сахдададсд егдег 45
<210> 51
<211> 27
<212> ΡΝΑ
<213> Ното Барпепз
<220> <221> пп5С_ГеаХиге
<223> ΗνΗ5.0-Ρ [Рогиагс! рптег]
<400> 51
агеддедгда гахдддсгсд сддспс 27
<210> 52
<211> 45
<212> ΟΝΑ
<213> ното Бар1'еп5
<220> <221> т15с_Реахиге
<22 3> НУН5.О-К [геуегзе рптег]
- 105 016245 <400> 52 дссдсдадсс сататсасдс сдатссастс саддсссттд сстдд 45 <210> 53 <211> 24 <212> ЛИА <213> Ното Бартепг <22О>
<221> ттзс_Теа1иге <223> Ьчнб.О-Р [£огаагс1 ргттег] <400> 53 агатдддстс дсддсттсас ааас 24 <210> 54 <211> 24 <212> РИА <213> ното Бартелз <220> :
<221> ттзс_ТеаТиге <223> Нчнб.О-к [гечегзе ргттег] <400> 54 дТТТдТдаад ссдсдадссс атат <210> 55 <211> 45 <212> ΟΝΑ <213> ното Бартелз <22О>
<221> ттзс_£еаТиге <223> Ьчн7.0-Р [Еогиагс! ргттег] <400> 55 дссдсддаса ссдссдтдта стастдсдсс ададссаасд асддд <210> 56 ' <211> 27 <212> ΟΝΑ <213> ното Бартелз <220>
<221> пл 5с_ГеаТиге <223> КЧН7.О-К [гечегБе ргттег] <400> 56 дтадтасасд дсддтдтссд сддсддт <210> 57 <211> 27 <212> ΟΝΑ <213> Ното 5артеп5 <220>
<221> ттзс_бёа1иге
- 106 016245
<223> Кун8.0-р [Тогиагс! ргатег]
<400> 57
аХаХссаасХ ахддсахсса схдддхх 27
<210> 58
<211> 48 .
<212> ΟΝΑ
<213> Ното Зартепз
<220>
<221> пл 5с_ТеаХиге
<223> ΗνΗ8.0-κ [геуегзе рга’тег]
<400> 58
ссадХддаГд ссаХадХХдд агахдсхааа Хссададасд дХасаддХ 48
<210> 59
<211> 45
<212> ϋΝΑ
<213> Ното 5ар1еп5
<22О>
<221> пп 5с_РеаХиге
<223> Ηνί2.0-Κ [геуег5е рга’тег]
<400> 59
садсххддаа дхдхсахада хсаахххсхх дддддссЕдд хсддд 45
<210> 60
<211> 45
<212> ϋΝΑ
<213> Ното Зартепз
<220>
<221> т15С_Реахиге
<22 3> Γινΐ_5.Ο-Ρ [Рогиагс! ргатег]
<400> 60
дасдсдаахх садасххсдх дсхдасссад ХсХссадсаХ ХссХд 45
<210> 61
<211> 45
<212> ϋΝΑ ;
<213> Ното Зарлепз
<220>
<221> т15с_ТеаХиге
<223> Нуьб.О-Р [Рогиагс! ргатег]
<400> 61
дасдсдаахх сасадххсдх дахдасссад ХсХссадсаХ хссхд 45
<210> 62
<211> 45
<212> ϋΝΑ
<213> Ното Зартепз
<220>
- 107 016245
<221> тл зс_!еал:иге
<223> ЬУЬ7.0-Р [Гогиагс! рглтег]
<400> 62
дасдсдаатг садасттсдт датдасссад гсгссадсаТ ТссТд 45
<210> 63
<211> 27
<212> ΡΝΑ
<213> Ното Зарлепз
<220>
<221> тлзс_Теагиге
<223> КУ1.8.0-Р [Тогиагс! рглтег]
<400> 63
ттсассгтса ссаТсадсад ссгддад 27
<210> 64
<211> 48
<212> ΟΝΑ
<213> Ното Зарлепэ
<220>
<221> тлзс-ГеаТиге
<223> Κνίδ.Ο-Κ [геуегэе рглтег]
<400> 64
сГссаддсТд сТдаТддТда аддтдаадтс ддтдссдсхд ссдсгдсс 48
<210> 65
<211> 28
<212> РИА
<213> Ното Зарлепз
<22О>
<221> пп зс_ТеаГиге
<223> (лЬСОЗ-Р [ΐοΓκιβΓά рглтег]
<400> 65
ссааТсаадс дТдаасГаса ТТсасТдд 28
<210> 66
<211> 48
<212> ΡΝΑ
<213> Ното Зарлепз
<220>
<221> тлзс-ГеаТиге
<223> НьсоЗ-и [геуегзе рглтег]
<400> 66
ссадГдааГд тадттсасдс ТТдаТТдддс дсТдсаддТд аТддТсас 48
<210> 67
<211> 23
<212> ΟΝΑ
<213> Ното Барлепз
- 108 016245 <220>
<221> ппзс-ЕеаТиге <223> 1дк-Рог [Еогиагс! ргттег] <400> 67 асТссТдсТа ТдддТасТдс Где 23 <210> 68 <211> 22 <212> ΡΝΑ <213> Ното Зартепз <22О>
<221> ттзс_ЕеаТиге <223> Ыд61Рс-СН1-к [геуегзе ргттег] <400>68 даадтадгсс ттдассаддс ад22 <210>69 <211> 22 <212> ΰΝΑ <213> Ното 5артеп5 <220>
<221> пп’зс_ТеаТиге <223> С1-пео-т5сЗ' [Ргттег] <400> 69
ТТТсасТдса ИсТадТТдГ дд22 <210>70 <211> 119;
<212> ркт <213> Ното Зартепз <220>
<221> М13С_РЕАТиКЕ <223> КУН2.0 <400> 70
61 η 1 Уа1 61 η ьеи 61 η 61 и 5 5ег б!у Рго 61 у 10 ьеи Уа1 ьуз РГО Зег 15 61 и
тНг Ьеи зег Ьеи тЬг Суз ТНг Уа1 Бег 61 у РЬе 5ег Ьеи тЬг АЗП туг
20 25 30
61 у 11е НТ 5 Тгр Уа1 Агд 61п Рго РГО 61 у ьуз 61 у Ьеи 61 и Тгр ьеи
35 40 45
61 у Уа! 11 е Тгр А1а Агд С1у РНе ТНг Азп Туг Азп 5ег А1а Ьеи мет
50 55 60
5ег Агд уа1 тЬг 11 е 5ег Ьуз АЗр АЗП 5ег ьуз А5П 61 п Уа1 5ег Ьеи
65 70 75 80
ьуз Ьеи Зег Зег Уа! ТЬг А1а А1 а АЗр тЬг А1а Уа! Туг РЬе суз А1а
- 109 016245
95
Агд А1а Азп Азр С1у Уа1 туг туг
100
А1а мет А5р Туг Тгр б1у 61п б!у
105 НО тЬг ьеи Уа1 тЬг Уа1 5ег Зег 115 <210> 71 <211> 119 <212> РКТ <213> Ното Зартепз <220>
<221> М13С_РЕАТиКЕ <223> Кунз.о, <400> 71
61π Уа1 61п Ьеи 61η С1и эег 61у
5
Рго 61 у Ьеи Уа1 Ьуз Рго Зег 61 и 10 15
ТЬг Ьеи Зег ьеи ТЬг Суз ТЬг Уа1 20 зег 61 у РЬе зег ьеи тЬг азп туг
30 б1у 11е Н15 Тгр Уа1 Агд С1п Рго
40 рго 61 у Ьуз С1у Ьеи 61 и Тгр Ьеи у Уа1 11 е ι гр А1а Агд 61 у РЬе
55
1пг Азп |уг Азп Зег А1а Ьеи МеТ зег Агд Уа1 тЬг 11е зег Уа1 Аэр
70
ТЬг Зег Ьуз А5П 61 η РЬе Зег Ьеи 75 80
Ьу5 ьеи зег зег Уа1 тЬг А1а А1а
Азр тЬг А1а Уа1 туг рЬе Суз А1а 90 95
Агд А1а Азп Аэр 61 у Уа1 туг туг
100
А1а Мет Азр туг тгр 61 у 61 η 61 у 105 110 тЬг ьеи Уа1 тЬг Уа1 зег зег
115 <210> 72 <211> 119 <212> РКТ <213> Ното Зартепз <220>
<221> М13С_РЕАТиКЕ <223> ЬУН4.0' <400> 72 η Уа! 61 η Ьеи 61 η 61 и Зег 61 у
5
Рго б1у Ьеи Уа! Ьуз Рго 5ег 61 и
15
- 110 016245
тНг ьеи зег ьеи тНг Суз тпг Уа1 зег 61 у РНе Бег Ьеи тНг АЗП туг
20 25 30
61 у Пе Нтз 35 Тгр Не Агд 61 п РГО 40 Рго 61 у ьуз 61 у Ьеи 45 61 и тгр Пе
61 у Уа1 50 11 е Тгр А1а Агд 61 у 55 РНе ТНг АЗП туг АЗП 60 Бег А1а Ьеи мег
Зег Агд Ьеи тпг Не Бег Ьуз Азр АЗП Бег ьуз АЗП 61 п Уа! Бег Ьеи
65 70 75 80
ьуз Ьеи Зег Бег Уа1 85 ТНг А1а А1 а Азр ТНг 90 А1а Уа1 туг РНе Суз 95 А1а
Агд А1а Азп Азр 61 у Уа1 Туг туг А1а мег Азр туг тгр 61 у б1п 61 у
100 105 110
тНг ьеи уа! тНг Уа1 Бег Бег
115 <210> 73 <211> 119 <212> РКТ <213> Ното Бартепз <220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ
<223> 1 тун 5 .0
<400> 73
61 п Уа1 61 п Ьеи 61п 61 и Бег 61 у Рго 61 у Ьеи Уа1 Ьуз Рго Бег 61 и
1 5 10 15
тНг Ьеи Бег Ьеи тНг Суз тНг Уа1 Бег б1у ₽Ие Бег ьеи тНг Азп Туг
20 25 30
61 у 11 е Нтз Тгр Уа1 Агд 61 п Рго РГО 61 у ьуз 61 у Ьеи 61 и тгр Пе
35 40 45
61 у Уа1 11 е тгр А1а Агд 61 у рИе ТНг Азп Туг АЗП Бег А1а ьеи мет
50 55 60
Бег Агд Ьеи ТНг Пе Бег Ьуз Азр АЗП Бег ьуз АЗП 61 п Уа1 Бег Ьеи
65 70 75 80
ьуз Ьеи Бег Бег Уа1 тНг А1а А1а Азр ТНг А1а Уа1 Туг РНе Суз А1а
85 90 95
Агд А1а АБП АЗР 61 у Уа1 Туг туг А1а мет Азр Туг тгр 61 у 61 п С1у
100 105 110
- 111 016245 тЬг Ьеи Уа1 ткг Уа1 зег зег 115 <210> 74 <211> 119 <212> РКТ <213> ното 5ар1еп5 <22О>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <223> НУН6.0 <400> 74
61 η 1 Уа1 61 η Ьеи 61 η 5 61 и Зег 61 у Рго 61у Ьеи 10 Уа1 ьуз Рго Зег 15 61 и
ТКг ьеи 5ег Ьеи ТЬг Суз ТКг Уа1 5ег 61 у РНе Зег ьеи Ткг Азп туг
20 25 30
61у Не Ηί 5 тгр Уа1 Агд 61 п Рго Рго 61 у Ьуз 61 у ьеи 61 и тгр 11е
35 40 45
61у Уа1 50 Пе Тгр А1 а Агд 61 у 55 Рпе Тпг АЗП Туг АЗП 60 Зег А1а ьеи Мет
Зег Агд Уа1 ТНг 11 е Зег Ьуз А5р АЗП Зег ьуз АЗП 61 п Уа1 Зег ьеи
65 70 75 80
ьуз Ьеи зег Зег νηΐ 85 ТНг А1а А1а АЗр тЬг 90 А1а νβΐ Туг Рке А1а
Агд А1а А5П А5р 61 у Уа1 туг туг А1а мет Азр Туг Тгр 61 у 61 п 61 у
100 105 110
тКг Ьеи Уа1 ТЙГ Уа1 Зег Зег
115
<21О> 75
<211> 119
<212> РКТ
<213> Ното Зартепз
<220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ
<223> НУН7. .0
<4ОО> 75
61 η Уа1 61 η ьеи С1п б1и Зег 61 у РГО 61 у ьеи νβΐ ьуз Рго Зег 61 и
1 5 10 15
ТКг Ьеи Зег Ьеи Ткг Суз тЬг уа! Зег 61 у Рке эег ьеи тЬг АЗП Туг
20 25 30
- 112 016245
б!у 11 е ΗΊ5 тгр Уа1 Агд 61 η Рго Рго 61 у Ьуз 61 у ьеи 61 и Тгр Ьеи
35 40 45
61 у Уа1 11е Тгр А1а Агд 61 у РНе тЬг АЗП туг АЗП Зег А1а Ьеи мет
50 55 60
Зег Агд ьеи тНг 11е Зег ьуз Азр А5П Зег ьуз АЗП 61 п Уа1 Зег Ьеи
65 70 75 80
ьуз Ьеи Бег Зег Уа1 тНг А1а А1а Азр тНг А1а уа1 туг туг Суз А1а
85 90 95
Агд А1а АЗП АБР 61 у Уа1 Туг Туг А1а мег АБр туг тгр С1у 61 п 61 у
100 105 110
ТНг ьеи УаТ тНг Уа1 Зег Зег
115 <210> 76 <211> 119 <212> ΡΚΤ <213> Ното Бартепз <22О>
<221> М15С_РЕАТиКЕ
<223> Нун8 .0:
<400> 76
61 п Уа1 61 п Ьеи 61 п 61 и Зег 61 у Рго 61 у Ьеи Уа1 ьуз Рго 5ег 61 и
1 5 10 15
тНг Ьеи Зег ьеи тНг Суз тНг Уа1 Зег 61 у РНе зег Не Зег Азп Туг
20 25 30
61 у 11 е Нт 5 35 Тгр Уа1 Агд С1п РГО 40 Рго 61 у ьуз 61 у Ьеи 45 61 и тгр Ьеи
61 у Уа1 Не тгр А1а Агд 61 у РНе тНг Азп туг АЗП Зег А1а Ьеи мет
50 55 60
Зег Агд Ьеи ТНг Не Зег ьуз Азр А5П Зег ьуз АЗП 61 п РНе зег ьеи
65 70 75 80
ьуз Ьеи Зег Зег Уа1 ТНг А1а А1а АЗр ТЬг А1а Уа1 туг РНе Суз А1а
85 90 95
Агд А1а Азп Азр 61 у Уа1 Туг туг А1а мет АЗр туг тгр 61 у 61 п 61 у
100 105 110
ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег
115 <210> 77
- 113 016245 <211> 119 <212> РКТ <213> ното зартепз <220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <223> НУН9.0 розтхтоп 48 сап Ье 1_еис1пе ог 15о1еистпе <400> 77
61п Уа1 61п Ьеи 61 п 61 и Зег 61 у Рго 61 у Ьеи Уа1 10 ьуз Рго Зег 15 61 и
1 5
тНг ьеи Зег ьеи ТНг суз тНг Уа1 5ег 61 у РНе 5ег Ьеи ТНг А5П Туг
20 25 30
61 у Не Нт 5 тгр уа1 Агд 61 п Рго РГО 61 у 1-У5 61 у ьеи 61 и тгр 11 е
35 40 45
61у Уа1 50 11 е Тгр А1а Агд 61 у 55 РНе тНг АЗП туг АЗП 60 зег А1а ьеи мех
Зег Агд ьеи ТНг Не Зег Уа1 Азр АЗП Зег Ьуз Азп 61 η уа! 5ег Ьеи
65 70 75 80
ьуз Ьеи Зег Зег Уа1 ТНг А1а А1а АЗр ТНг А1а Уа1 Туг РНе Суз А1а
85 90 95
Агд А1а АЗП Азр 61 у Уа1 Туг Туг А1а мех Азр туг тгр 61 у 61 п 61 у
ιρο 105 110
ТЬг 1_еи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег
115
<210> 78
<211> 119
<212> РКТ
<213> Ното ЗартепБ
<22О>
<221> М15С_РЕАТиКЕ
<223> Нун ю.о
<400> 78
61 п Уа1 61 п ьеи 61 п 61 и Зег 61 у Рго 61 у ьеи Уа1 ьуз РГО 5ег 61 и
1 5 10 15
Тбг Ьеи Зег 1_еи ТНг Суз ТНг Уа1 Зег 61у РНе Зег Ьеи ТНг Азп Туг
20 25 30
61у Не Нтз Тгр Уа1 Агд 61 η Рго Рго 61 у ьуз 61 у ьеи 61 и Тгр Ьеи
35 40 45
61 у Уа1 Не Тгр А1а Агд С1у РНе тНг АЗП Туг АЗП 5ег А1а ьеи мех
50 55 60
- 114 016245
Зег Агд Ьеи ТЬг 11е Зег ьуз АЗр ТНг 5ег Ьуз АЗП 61 п Уа1 Зег ьеи
65 70 75 80
ьуз Ьеи Зег Зег Уа1 ТЬг А1а А1а АЗр ТЬг А1а Уа1 туг РНе Суз А1а
85 90 95
Агд А1а Азп Азр 61у Уа1 Туг Туг А1а мег Азр Туг тгр б1у 61 п 61 у
100 105 110 тЬг ьеи Уа1 тЬг Уа1 5ег зег
115 <210> 79 <211> 119 : <212> РКТ <213> Ното Зартепз <220>
<221> М13С_РЕАТиКЕ
<223> Нун1: ь.о Роз' ίΐΐοη 48 сап Ье 1 .еис ίηβ ог 1зо1еистпе
<400> 79
61 п Уа1 61 п ьеи 61 п 61 и Зег 61 у РГО 61 у ьеи Уа1 ьуз Рго Зег 61 и
1 5 10 15
ТНг Ьеи 5ег ьеи ТНг Суз ТНг Уа1 Зег 61 у РНе 5ег Ьеи ТЬг Азп Туг
20 25 30
61 у 11 е НТ 5 35 Тгр Уа1 Агд 61 п Рго 40 РГО 61 у ьуз 61 у ьеи 45 61 и Тгр 11е
61 у Уа1 11е Тгр А1а Агд 61 у РНе ТНг Азп Туг Азп 5ег А1а Ьеи Мес
50 55 60
Зег Агд Ьеи ТНг 11 е Зег ьуз Азр Азп Зег ьуз АЗП 61 п РЬе Зег ьеи
65 70 75 80
ьуз ьеи эег Зег Уа1 85 ТНг А1а А1а А5р тЬг 90 А1а Уа1 Туг РЬе Суз 95 А1а
Агд А1а Α5Π Азр 61 у Уа1 Туг туг А1а Мес Азр Туг Тгр 61 у 61 п 61 у
100 105 110
ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115
<210> 80 ·
<211> 106
<212> РКТ
<213> Ното Зартепз
<22О>
115 016245 <221> М15С_РЕАТиКЕ <22 3> бУЬ2.0>
<400> 80
61 η РИе Уа1 Ьеи Тб г 61 η Бег Рго А1а РИе ьеи Бег Уа1 тб г Рго 61 у
1 5 10 15
61 и Ьуз Уа1 тбг 11 е Тб Г Суз зег А1а АЗП Бег Бег Уа1 АЗП туг Не
20 25 30
Н15 тгр туг 61 п 61 η Ьуз РГО дзр 61 η А1а рго ьуз ьуз ьеи Не туг
35 40 45
Азр тНг Бег ьуз Ьеи А1а Бег 61 у Уа1 Рго Бег Агд РНе Бег 61 у Бег
50 55 60
<31 у Бег 61 у ТНг Азр Туг Тб г РИе ТНг 11 е Бег Бег Ьеи 61 и А1а 61 и
65 70 75 80
А5р А1а А1а тИг Туг Туг Су 5 61 η 61 п тгр ТНг ТНг АЗП Рго Ьеи тб г
85 90 95
Рбе 61 у 61 п 61 у 100 Тб г ьуз Уа1 61 и 11е 105 ьуз
<210> 1 51
<211> : 106
<212> 1 РКТ
<213> 1 -Юто Барт ίβπ5
<22О>
<221> М15С_РЕАТЫКЕ
<223> ИУЬЗ.О
<400> 1 81
61 η РИе Уа1 Ьеи тбг 61 η Бег Рго А1а Рбе Ьеи Бег Уа1 тбг Рго 61 у
1 5 10 15
61 и ьуз Уа1 тбг 11е Тбг Суз Бег А1а А5П Бег Бег Уа1 АЗП Туг Не
20 25 30
Н1 5 Тгр Туг 61 η 61 η ьуз Рго Азр 61 п А1а РГО ьуз Ьеи Ьеи 11 е Туг
35 40 45
Азр тб г Бег Ьуз Ьеи А1а Бег 61 у Уа1 Рго Бег Агд Рбе Бег 61 у Бег
50 55 60
61 у Бег 61 у Тбг дэр туг Тбг рбе тбг Не Бег Бег ьеи 61 и А1а 61 и
65 70 75 80
Азр А1а А1а Тбг туг Туг Суз 61 η 61 η Тгр Тбг тбг АЗП РГО ьеи Тбг
85 90 95
- 116 016245 рНе С1у 61η б1у ТНг Ьуз ча! с1и 11е ьуз
100105 <210> 82 <211> 106.
<212> РКТ' <213> Ното Бартелз <220>
<221> М15С_РЕАТиВЕ <223> НЧЬ4.О <400> 82
Азр Ча1 1 Ча1 мет тЬг 61 η 5 Бег Рго А1а РНе ьеи Бег 10 ча1 ТНг Рго 61 у 15
61 и Ьуз Ча1 тЬг 11 е ТНг суз Бег А1а АЗП Бег Бег Ча! АЗП туг Не
20 25 30
НТВ Тгр Туг 35 61 п 61 п ьуз Рго А5р 40 61 η А1а рго ьуз ьуз 45 тгр Не туг
Азр тНг Бег ьуз Ьеи А1 а Бег 61 у Ча1 Рго Бег Агд РНе Бег 61 у Бег
50 55 60
61 у Бег 61 у ТНг Азр туг тНг РНе тНг 11 е Бег Бег ьеи 61 и А1а 61 и
65 70 75 80
Азр А1а А1а тНг Туг Туг суз 61 п 61 η тгр тНг тНг АЗП РГО ьеи тНг
85 90 95
РНе 61 у 61 η 61 у тНг ьуз Ча! 61 и 11 е ьуз
100 105
<210> 1 вз
<211> : 106
<212> 1 РКТ
<213> 1 ното Барт епз
<22О>
<221> <223> М15С_РЕАТиКЕ НЧБ5.0
<400> 83
дзр рНе 1 ча1 ьеи тЬг 5 61 п Бег Рго А1а рНе 10 Ьеи Бег Ча1 тНг Рго 15 61 у
61 и Ьуз ча1 тНг 20 11е тНг Суз Бег А1 а 25 АЗП Бег Бег Ча1 А5П 30 Туг Не
нтз тгр туг 35 61 п 61 η Ьуз Рго Азр 40 61 η А1а РГО ьуз ЬУ5 45 тгр Не туг
Азр тНг Бег ьуз Ьеи А1 а Бег 61 у ча! Рго Бег Агд РНе Бег 61 у Бег
- 117 016245
55 60
б1у Бег 61 у тНг Азр туг тНг рНе тНг Не Бег Бег ьеи 61 и А1а 61 и
65 70 75 80
Авр А1а . А1а ТЬг Туг Туг суз 61 п 61 п Тгр ТНг тЬг А5П Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе б1у 61 η 61 у ТЬг ьуз Уа1 61 и Не Ьуз
100 105
<210> 84
<211> 106
<212> РКТ
<213> ното Бартепз
<220>
<221> М15С_ЕЕАТиКЕ
<223> Ηνι_6. .0
<400> 84
61 η РНе Уа1 МеТ ТЬг 61 п Бег Рго А1а рНе ьеи Бег Уа1 тНг Рго б1у
1 5 10 15
61 и Ьуэ Уа1 ТНг Не ТЬг Суз Бег А1а А5П Бег Бег уа1 АЗП туг Η е
20 25 30
Н15 Тгр Туг 61 п 61п ьуз Рго Азр 61 п А1а РГО ьуз ьуз тгр 11 е туг
35 40 45
Азр ТНг Бег Ьуз ьеи А1а Бег 61 у Уа1 РГО Бег Агд РЬе Бег 61 у Бег
50 55 60
61у Бег 61 у ТНГ А5Р туг тЬг рНе ТНг Не Бег Бег Ьеи 61 и А1а 61 и
65 70 75 80
Азр А1а А1а тНг туг Туг суз 61 п 61п тгр тЬг тЬг Азп Рго ьеи ТНг
85 90 95
РЬе 61 у 61 η 61у ТЬг ьуз Уа1 61 и 11 е ьуз
100 105
<210> 85
<211> 106
<212> РКТ
<213> ното Бартепз
<220>
<221> М15С„РЕАТиКЕ
<22 3> НУЬ7. ,0
<400> 85
Азр РЬе Уа1 МеТ ТНг 61 п Бег Рго А1а рНе ьеи Бег Уа1 тНг Рго 61 у
1 5 10 15
- 118 016245
61 и ьуз Уа1 ТНг 11е тЬг Суд Бег А1а АЗП Зег Бег Уа1 АЗП туг 11е
20 25 30
НТЗ Тгр Туг 35 61 η 61п ьуз Рго Аэр 40 61 η А1а РГО ьуз Ьуз 45 Тгр 11е туг
А5р тНг Бег Ьуз ьеи А1а 5ег 61 у уа! Рго Бег Агд РИе Бег 61 у Бег
50 55 60
61 у зег 61 у Т(1Г АЗр туг ТНг рпе ТНг 11е Бег Бег ьеи 61 и А1а 61 и
65 70 75 80
А5р А1а А1а тЬг туг туг Суз 61 η 61 η тгр тНг тНг АЗП Рго ьеи т|тг
85 90 95
рИе 61 у 61 η 61 у ТНг ьуз Уа1 б1и 11 е ьуз
100 105 <210> 86 <211> 106 <212> РКТ <213> Ното Бартепз
<22О>
<221> М15С_РЕАТиКЕ
<223> НУЬ8 .0
<400> 86
61п рИе Уа! ьеи ТЬг 61 п Бег РГО А1а РЬе Ьеи Бег Уа1 ТНг Рго 61 у
1 5 10 15
61 и Ьуз Уа1 ТНг 11е тНг суз Бег А1 а АЗП Бег Бег Уа1 АЗП Туг 11е
20 25 30
Нтз Тгр Туг 61 п 61 п ьуз Рго Азр 61 п А1а Рго ьуз ьуз Тгр 11е Туг
35 40 45
Азр тНг Бег ьуз ьеи А1 а Бег б1у Уа1 РГО Бег Агд РИе Бег 61 у Бег
50 55 60
б!у Бег б1у ТНг Азр РНе ТНг РЬе ТНг 11е Бег Бег Ьеи С1и А1а 61 и
65 70 75 80
Азр А1а А1а ТНг Туг Туг су 5 61 п 61 п тгр ТНг ТНг Азп Рго Ьеи ТНг
85 90 95
рИе 61 у б1п 61у тЬг Ьуз Уа1 61 и 11 е ьуз
100 105 <210> 87 <211> 106 <212> РКТ
- 119 016245 <213> ното Эартепз <220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <223> НУЬ9.0 <400> 87
61 η 1 РЬе Уа1 Ьеи ТЬг 61 п 5 Зег Рго А1а РНе 10 ьеи зег Уа1 тНг Рго 15 61 у
61 и ьуз Уа1 тНг 11е тНг суз Зег А1 а А5П эег Зег Уа! Азп Туг 11 е
20 25 30
Н15 тгр Туг 61 η 61 η ьуз РГО Азр 61 η А1а РГО ьуз ьуз Тгр 11е ьуз
35 40 45
Азр тНг Зег Ьуз ьеи А1а Зег С1у Уа! Рго Зег Агд РНе 5ег 61 у Зег
50 55 60
61 у Зег 61 у ТНг Азр туг ТНг РНе тЬг 11е зег Бег Ьеи 61 и А1а 61 и
65 70 75 80
АЗр А1а А1а тНг туг туг суз 61η 61 η тгр ТНг ТНг Азп Рго Ьеи ТНг
85 90 95
РНе 61 у 61 η 61 у ТЬг ьуз Уа1 61и 11 е ьуз
100 105
<210> 1 В8
<211> : 106
<212> 1 РВТ
<213> 1 Ното Зарт епз
<220>
<221> I М15С. .РЕАТиКЕ
<223> НуЫО.О
<400> 88
Азр РНе Уа1 мет тНг 5 С1п Зег Рго А1а РНе 10 Ьеи 5ег Уа1 ТНг Рго 15 61 у
61 и ьуз Уа1 тЬг Не ТНг Суз Зег А1а АЗП Зег Зег Уа1 АЗП Туг Не
20 25 30
Нтз тгр туг 61 п 61 п Ьуз Рго Азр 61 п А1а Рго ьуз ьуз ьеи 11 е Туг
35 40 45
Азр тНг Зег ьуз Ьеи А1 а 5ег 61 у Уа! Рго 5ег Агд РНе Зег 61 у Зег
50 55 60
61 у Зег С1у ТНг Азр Туг тЬг РНе тНг Не Зег Зег Ьеи 61 и А1а 61 и
65 70 75 80
- 120 016245
А5р А1а А1а тНг туг 85 Туг Суз 61 η 61 η тгр 90 ТНг тНг Α5ΙΊ Рго Ьеи 95 ТЬг
РНе 61 у 61 η 61 у ТНг 1-У5 Уа1 61 и Не ьуз
100 105
<210> 89
<211> 106
<212> РКТ
<213> ното Барпепз
<220>
<221> М18С_РЕАТиКЕ
<22 3> ЬУЫ1.0
<400> 89
Азр РНе Уа1 Мех ТЬг 6ΐη Зег Рго А1а РЬе ьеи Зег Уа1 тЬг РГО 61 у
1 5 10 15
61 и Ьуз ναΊ ТЬг 11 е ТНг Суз Зег А1а АЗП Зег Зег Уа1 А$П Туг 11 е
20 25 30
Нт з Тгр Туг 35 61 η 61 η ьуз Рго Азр 40 61 η А1а Рго ьуз ьуз 45 Тгр Не Туг
Азр ТНг Зег Ьуз Ьеи А1а Зег 61 у Уа1 РГО Зег Агд РЬе Зег 61 у зег
50 55 60
61 у Зег 61 у ТНг Азр РНе тНг рНе ТЬг 11е Зег Зег Ьеи 61 и д1а 61 и
65 70 75 80
Азр А1а А1а тНг туг Туг Суз 61 η 61 η Тгр ТЬг тЬг Азп Рго ьеи тЬг
85 90 95
РЬе б1у 61 η 61 у тНг ьуз Уа1 б1и 11 е ьуз
100 105
<210> 90
<211> 106
<212> РЕТ
<213> ноше Зартепз
<220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ
<223> ΗνίΙ.ΟΟ
<400> 90
61 η рНе νεί ьеи тЬг 61η Зег Рго А1а рЬе ьеи Зег νεί тНг Рго 61 у
1 5 10 15
61 и Ьуз ν&Ί ТЬг 11е тНг суз зег А1а 61 η зег зег Уа1 АЗП туг 11 е
20 25 30
нтэ тгр Туг 61 п 61 η ьуз Рго Азр 61 η А1а РГО ьуз ьуз Тгр Не Туг
- 121 016245
35 40 45
А5р ТНг Бег 1уз 1_еи А1 а Зег 61у Уа1 Рго Бег Агд РНе Бег 61 у Бег
50 55 60
61 у Бег 61 у ТНг Азр Туг ТНг РНе ТНг 11 е Бег Бег ьеи 61 и А1а 61 и
65 70 75 80
А5р А1а А1а тНг туг туг суз 61η 61 η тгр ТНг ТНг Азп Рго Ьеи ТНг
85 90 95
РНе б!у с1п 61 у ТНг Еуз Уа1 61 и 11е ьуз
100 105 <210> 91 <211> 106 <212> РКТ <213> Ното Бартепг <220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <223> НУЫО.ОО
<400> 91 Азр РНе Уа1 1 Мех ТНг 5 61 η Бег Рго Д1а РНе 10 ьеи Бег Уа1 тНг РГО 15 61 у
61 и Ьуз Уа1 ТЬг 11 е ТНг Суз Бег А1а 61 η Бег Бег Уа1 АЗП Туг 11е
20 25 30
нт 3 тгр туг 61 п 61 η Ьуз РГО АЗР 61 η А1а Рго Ьуз ьуз Ьеи Не Туг
35 40 45
Азр тНг Бег ьуз ьеи А1а Бег б1у Уа1 РГО Бег Агд РНе Бег 61 у Бег
50 55 60
61 у Бег 61 у ТНг Азр Туг ТНг РНе ТНг 11е Бег Бег Ьеи 61 и А1а 61 и
65 70 75 80
АЗр А1а А1а тНг туг туг Суз 61 η 61 η тгр тНг тНг АЗП РГО ьеи тНг
85 90 95
РНе 61 у 61 η 61 у ТНг ьуз уа! 61 и 11 е ьуз
100 105
<210> 92
<211> 106
<212> РКТ
<213> ното зартепз
<220>
<221> М15С_РЕАТиК£
<223> НУЬ12 .00
- 122 016245 <400> 92
Азр Рбе Уа1 мех Тбг 61 п Зег РГО А1а рбе хеи зег Уа1 тбг рго 61 у
1 5 10 15
61 и ьуз Уа1 Тбг 11е Тбг Суз Зег А1 а 61 п зег Зег уа1 АЗП Туг 11 е
20 25 30
Н13 тгр Туг ΰίη 61 п хуз Рго Азр 61 п А1а Рго Хуз хуз Хеи 11е туг
35 40 45
Азр ТбГ Зег хуз хеи А1 а 5ег 61 у Уа1 Рго Зег Агд Рбе зег 61 у зег
50 55 60
61 у Зег 61 у тбг Азр рбе тбг Рбе Тбг Не Зег Зег Хеи 61 и А1а С1и
65 70 75 80
Азр А1а А1а тбг Туг туг Суз С1п 61 п тгр тбг тбг Азп РГО хеи тбг
85 90 95
Рбе 61 у 61 η 61 у тбг хуз уа! 61и П е хуз
100 105
<210> 93
<211> 222
<212> ΡΚΤ
<213> каххиз гаххиз
<22О>
<221> 1 М15С_ЕЕАТиКЕ
<223> Ках а!рба2 тпхедгтп ] [ Йотаяп ргохетп
<400> ' 93
Зег Рго А5р Рбе 61 п Зег хеи тбг зег Рбе Зег рго А1а Уа1 61 п Азр
1 5 10 15
Уа1 ν&1 уа1 Уа1 Суз Азр 61 и Зег Азп Зег 11 е туг РГО тгр 61 и А1а
20 25 30
νβΐ ьуз А5П 35 Рбе хеи 61 и ьуз Рбе 40 Уа1 61 п 61 у Хеи А5р 45 И е 61 у Рго
1.уз хуз Тбг 61 п Уа1 А1а хеи 11 е 61 п Туг А1а Азп Азр РГО Агд Уа1
50 55 60
Уа1 Рбе Азп Ьеи тбг тбг Туг Хуз Азп хуз 61 и Азр мех Уа1 61 п А1а
65 70 75 80
тбг зег 61 и тбг лгд 61 п туг 61 у 61 у Азр Хеи Тбг А5П тбг Рбе хуз
85 90 95
А1а 11е 61 п Рбе А1а Агд АЗр Не А1а туг хеи рго 61 и зег 61 у 61 у
100 105 110
- 123 016245
Агд рго 61 у А1а ТНг ьуз уа! МеТ Уа1 Уа1 тНг Азр 61 у 61 и Бег
115 120 125
НТВ Азр С1 у Бег ьуз Ьеи б1п тНг уа1 Не 61η 61 п Суз Азп Азр Азр
130 135 140
61 и Не ьеи Агд РНе 61 у Не А1а уа! ьеи 61 у туг Ьеи АЗП Агд АЗП
145 150 155 160
А1а ьеи А5р ТНг ьуз 165 Азп Ьеи 11 е
ТНг Рго ТНг 61 и 180 Агд Туг РНе РНе
Ьеи 61 и Ьуз 195 А1а 61 у ТНг Ьеи 61 у 200
ТНг Уа1 210 61 п 61 у 61 у Азр Азп 215 РНе
ьуз 61 и 11 е Ьуз А1а 11 е А1а Бег 170 175
Азп Уа1 А1а Азр 61 и А1а А1а Ьеи 165 190 и нт 5 11е РНе Бег 11е 61 и 61у
205 п мет 61 и МеТ А1а 61 п . 220 <210> 94 <211> 228 <212> РРТ <213> Миг ти5си1из <22п>
<221> М15С_РЕАТи«Е <223> Моизе а1рНа2 тпТедгтп т Оошатп ргоТетп <400> 94
Бег Рго Азр 1 РНе 61п РНе ьеи ТНг Бег РНе Бег Рго А1а Уа1 61 п 15 А1 а
5 10
Суз Рго Бег ьеи Уа! Азр Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Суз Азр 61 и Бег Азп Бег
20 25 30
11 е туг Рго Тгр 61 и А1а Уа1 ьуз АЗП РНе Ьеи Уа! ьуз РНе Уа1 тНг
35 40 45
61 у Ьеи Азр 11 е 61 у РГО ьуг ьуз ТНг 61 п Уа1 А1а Ьеи Пе 61 п туг
50 55 60
А1 а Азп 61 и РГО Агд 11 е Не РНе АЗП Ьеи Азп Азр РНе 61 и тЬг ьуэ
65 70 75 80
61 и Азр мет Уа! 61 п 85 А1а тНг Бег 61 и тНг 90 Агд 61 п нтз 61 у 61 у 95 Азр
ьеи ТНг АЗП ТНг РНе Агд А1а 11е 61 и РНе А1а Агд АЗр туг А1а туг
100 105 110
- 124 016245
5ег 61л тЬг зег б!у 61у Агд Рго 61 у А1а 120 ТЬг Ьуз Уа1 125 мет Уа1 Уа1
115
Уа1 ТЬг А5р 61 у 61 и зег Н1з АЗр 61 у зег туз теи ьуз тЬг Уа1 11е
130 135 140
61л 61 η Суз АЗП Азр Азр 61и Не Теи Агд РЬе 61 у 11е А1а Уа1 Ьеи
145 150 155 160
61 у туг теи АЗП Агд Азп А1а Теи Азр тКг ьуз Азп Ьеи Не ьуз 61 и
165 170 175
Не ьуз А1а Не А1 а Зег тНг РГО ТЬг 61 и Агд Туг РЬе РЬе А5П Уа1
180 185 190
Зег А5Р 61 и 195 А1а А1а Ьеи Ьеи 61 и 200 туз А1а 61 у ТЬг Ьеи 205 61 у 61 и 61 п
11е РЬе Зег 11е 61и 61у ТНг Уа! 61п 61 у 61 у Α5Ρ АЗП РЬе 61 п мет
210 215 220
и мет зег 61 η
225 <210> 95 <211> 26 <212> ΟΝΑ <213> Ното Зартепз <220>
<221> штзс_ГёаТиге <223> карра-Е <400>95 сдаастдтдд стдсассатс тдтстт <210>96 <211>41 <212> ΟΝΑ <213> Ното Бартелз <220>
<221> пл зс_6еаТиге <223> карра-вашн1-к <400>96 ааТТсддаТс сттастааса стстсссстд ттдаадстст Т <21О> 97 <211> 40' <212> ϋΝΑ <213> Ното Зарт епз <220>
<221> гтпзс_ТеаТиге <223> УН12.0-(К71У)-Р
- 125 016245
<400> 97 дсстдассат садсдтддас аасадсаада ассаддтдад 40
<210> <211> <212> <213> 98 40 ϋΝΑ Ното зарлепз
<220>
<221> тл' зс_РеаТиге
<223> УН12.0(κ71ν)-Κ
<400> 98
стсасстддт ссТТдсТдТТ дгссасдсгд атддтсаддс 40
<210> 99
<211> 40
<212> ϋΝΑ :
<213> Ното Зарлепз
<220>
<221> тл5с_ГеаТиге
<223> УН13.0-(Ν73Τ)-Р
<400> 99
стдассатса дсааддасас садсаадаас саддТдадсс 40
<210> 100
<211> 40
<212;· ΠΝΛ
<213> Ното 5арлеп5
<220>
<221> тл зсЛеаТиге
<223> УН13.0-(Ν73Τ)к
<400> 100
ддстсасстд дгтсттдстд дСдгссТТдс тдатддтсад 40
<210> 101
<211> 41
<212> ЭИА
<213> Ното Эарлепз
<220>
<221> тл' 5с_Геагиге
<223> УН14.О-(У78Р)-Р
<400> 101
дсааддасаа садсаадаас садтттадсс тдаадстдад с 41
<210> 102
<211> 41
<212> ΟΝΑ
<213> Ното Зарлепз
<220>
<221> тл зс_Геатиге
- 126 016245 <223> УН14.0 (У78Р)-К <400>102 дсСсадсССс аддсСааасс ддсссссдсг дССдСссССд с41 <210>103 <211>648 <212> ϋΝΑ <213> масаса ^аэстсиЗагтз <220>
<221> тт зсШеасиге <223> супотоЗдиз а1рЬа2 I ботатп <400>103
адгссСдаСС сссадссссс адссадсССс СсассСдсаа сСсадсссСд СССГ1СССГС 60
асадасдссд сддссдсдсд СдаСдаасса аасадсассс аСссССддда СдсадСадас 120
аассссссдд ааааасссдс асааддссСд даСаСаддсс ссасааадас асаддгдддд 180
гсаасссадс аСдссааСаа СссаададГС дСдСССаасЕ СдаасасаСа Саааассааа 240
даадааасда ССдСадсаас аСсссадаса гсссааСаСд дтддддассс сасааасаса 300
Пзсддадсаа ССсааСаСдс аадааааСаС дсссаССсад садсССсСдд Сдддсдасда 360
адСдсСасда аадсаасддс адССдСаасС дасддСдааС сасаСдаСдд сссаагдссд 420
ааадсСдсда ссдассаасд саассаСдас аасасассда ддСССддсаС адсадССсСС 480
дддСасГСаа асадааасдс ссссдасасс ааааасссаа саааадааас аааадсдасс 540
дстадСаССс саасадааад аСасСССССс аагдгдСсСд аСдаадсадс СсСасСадаа 600
ааддссддда саССаддада асаааССССс адсассдаад дСасСдСС 648
<210>104 <211>648 <212> ΟΝΑ <213> Масаса тиЗаССа
<220>
<221> ш15с_ГеаСиге <223> кЬезиз а!рИа2 з [ ботат η
<400> 104 адСссСдаСС «садсссгс адссадсССс ссасссдсаа сссадсссСд сссссссссс 60
асадасдссд сддссдсдсд СдасдааСса аасадсассс асссссддда СдсадСааад 120
аассссссдд ааааассгдс асааддсссд даСаСаддсс ссасааадас асаддСдддд 180
ссаасссадс аСдссааСаа СссаададСС дсдсссаасс сдаасасаса Саааассааа 240
даадааасда ссдсадсаас ассссадаса СсссааСаСд дсддддассс сасааасаса 300
сссддадсаа ССсааСаСдс аадааааСаС дссСаССсад садсССсСдд Сдддсдасда 360
адГдсСасда аадсаасддс адсгдсаасс дасддсдаас сасагдагдд Г1саа1дпд 420
ааадссдсда ССдаСсааСд саассаСдас ааСаСасСда ддСССддсаС адсадссссс 480
дддСасССаа асадааасдс ссссдасасс ааааасссаа саааадааас аааадсдаСс 540
- 127 016245 дстадтаттс саасадааад асастттттс аатдтдтстд атдаадсадс тстастадаа 600 ааддстддда саттаддада асаааТЬТТс адсаттдаад дтастдтт648 <210>105 <211>997 <212> ϋΝΑ <213> Ното Зартелг <220>
<221> ттзс_ЕеаТиге <223> 1дС4 солэтапт гедтол <220>
<221> СОЗ <222> (1)..(978) <400> 105
тсс асе аад ддс сса тсс 9*с ттс ссс стд дед ссс *дс Тсс адд аде 48
Зег 1 тКг ьуз 61 у Рго 5 5ег Уа1 РКе рго ьеи 10 А1а Рго суэ Зег Агд 15 Зег
асе тсс дад аде аса дес дес стд ддс Где стд д*с аад дас Тас ттс 96
тКг зег 61 и 5ег тКг А1а А1а ьеи 61 у суэ Ьеи Уа1 ьуз Азр туг РКе
20 25 30
ссс даа сед 9*9 асд 9*9 тсд *дд аас Тса ддс дес с*д асе аде ддс 144
Рго 61 и Рго Уа1 тКг Уа1 Зег тгр Азп Зег 61 у А1а Ьеи тКг Зег 61 у
35 40 45
дтд сас асе ттс ссд дет дтс ста сад тсс Тса дда стс гас тсс стс 192
Уа1 Н15 тНг РКе Рго А1а Уа1 Ьеи 61η Зег Зег бТу ьеи туг Зег Ьеи
50 55 60
аде аде д^д 9*9 асе 9*9 ссс Тсс аде аде **д ддс асд аад асе Тае 240
5ег Зег Уа1 Уа1 тКг уа! рго Зег Зег Зег Ьеи 61 у тКг ьуз ТКг туг
65 70 75 80
асе где аас д*а дат сас аад ссс аде аас асе аад д*д дас аад ада 288
тКг суз А5Л уа1 Азр нт 5 ьуз Рго Зег А5П тКг ьуз Уа1 Азр ьуз Агд
85 90 95
9« дад тсс ааа тат 99* ссс сса где сса Тса где сса дса сст дад 336
Уа1 61 и зег ьуз туг 61 у Рго рго суз рго Зег суз рго А1а РГО 61 и
100 105 110
ттс стд ддд дда сса тса дтс ттс стд ттс ссс сса ааа ссс аад дас 384
РКе Ьеи б1у б!у Рго Зег уа1 рКе Ьеи РКе Рго Рго ьуз Рго ьуз АЗр
115 120 125
аст СТС атд атс тсс едд асе сст дад 9*с асд *дс 9*9 д*д 9*9 дас 432
тКг ьеи мет 11е зег Агд ТКг рго 61 и Уа1 тпг СУ5 Уа1 Уа1 Уа1 Аэр
130 135 140
9*9 аде сад даа дас ссс дад д*с сад ттс аас *дд Тас д*д дат ддс 480
Уа1 Зег 61 η 61 и Азр Рго 61и Уа1 61 п РЬе Азп тгр туг Уа1 Азр 61 у
145 150 155 160
9*9 дад 9*9 сат аат дес аад аса аад ссд едд дад дад сад «с аас 528
Уа1 61 и Уа1 нтз Азп А1а Ьуз тНг ьуз Рго Агд 61 и 61 и 61 п РКе АЗП
165 170 175
аде асд тас едт дтд дтс аде дтс стс асе дтс стд сас сад дас *дд 576
Зег тКг туг Агд Уа1 Уа1 зег Уа1 ьеи тКг уа! ьеи ΗΪ 5 61п Азр Тгр
180 185 190
стд аас ддс аад дад Тас аад *дс аад д*с тсс аас ааа ддс стс ссд 624
- 128 016245
Ьеи АЗП 61 у 195 ьуз б1и Туг ьуз Суз 200 1_У5 Ча1 Бег Азп ьуз 205 61 у ьеи Рго
Тсс тсс атс дад ааа асе атс тсс ааа 95х ааа ддд сад ссс еда дад 672
Бег Бег Не 61 и ьуз тЬг 11 е Бег ьуз А1 а ьуз 61 у 61 п Рго Агд 61 и
210 215 220
сса сад дтд Сас асе сТд ссс сса Гее сад дад дад атд асе аад аас 720
РГО 61 п ча! туг тНг ьеи Рго Рго 5ег С1п 61 и 61 и мет ТНг ьуз А5П
225 230 235 240
сад дтс аде сед асе где стд дтс ааа ддс ттс тас ссс аде дас атс 768
61 п ча1 Бег Ьеи тНг суз ьеи Ча1 ьуз 61 у РНе туг Рго 5ег Азр Не
245 250 255
дсс дтд дад тдд дад аде аат ддд сад сед дад аас аас гас аад асе 816
А1а ЧаТ С1и Тгр С1и Зег Азп сТу С1п Рго б!и Азп Аэп Туг Ьуз ТНг
260 265 270
асд тНг сст ссс Рго Рго 275 дтд стд дас тсс дас ддс 61у тсс ттс ттс сТс Тас аде адд 864
Ча1 Ьеи Азр Бег Азр 280 зег Рпе Рпе ьеи туг 285 Бег Агд
ста асе 9*9 дас аад аде адд 199 сад дад ддд аат ттс Тса Тдс 912
ьеи тНг ча! Азр ьуз Бег Агд тгр 61 п 61 и 61 у А5П Уа1 РНе Бег суз
290 295 300
ТСС 91? атд сат дад дет стд сас аас сас Тас аса сад аад аде СТС 960
Бег Ча! мет НТЗ 61 и А1а Ьеи НТ 5 Азп НТ 5 туг тНг С1п ьуз Бег Ьеи
305 310 315 320
тсс сед тст стд дат ааа ТдаТаддаТс сдсддссдс 997
Бег ьеи Бег Ьеи 61 у Ьуз
325 <210> 106 <211> 326 <212> РВТ <213> Ното Бартепз <400> 106
Бег 1 тНг ьуз С1у Рго 5 Бег Ча! РНе Рго Ьеи А1а Рго Суз 10 Бег Агд 15 Бег
тНг Бег 61 и Бег тНг А1а А1а ьеи б!у суз ьеи Ча1 суз А5р Туг РНе
20 25 30
Рго 61 и Рго Ча! тНг Ча1 Бег Тгр АЗП Бег С1у А1а Ьеи ТНг Бег 61 у
35 40 45
Ча1 НТ 5 тНг РНе Рго А1а ча1 Ьеи 61 п Бег Бег 61 у Ьеи Туг Бег Ьеи
50 55 60
Бег Бег ча1 ча! ТНг Ча1 Рго Бег Бег Бег ьеи 61 у тНг ьуз ТНг туг
65 70 75 80
ТНг суз Азп Ча1 АЗр НТ 5 ьуз РГО Бег АЗП ТНг 1-У5 ча1 АЗр ЬУ5 Агд
85 90 95
Ча1 61 и Бег ьуэ туг 61у РГО РГО Суз Рго Бег суз Рго А1а Рго 61 и
100 105 110
- 129 016245
РНе ьеи 61 у 61 у РГО зег Уа1 рНе ьеи 120 рНе Рго Рго ьуз 125 Рго Ьуз Азр
115
тЬг Ьеи мет 11е Зег Агд ТНг Рго 61 и Уа1 тНг суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр
130 135 140
Уа1 Зег 61 п 61 и Азр Рго 61 и Уа1 61 η рпе Азп тгр Туг Уа1 Азр 61 у
145 150 155 160
Уа1 61 и Уа1 НТ 5 А5П А1а ьуз тНг ьуз РГО Агд 61 и 61 и 61 п РНе Азп
165 170 175
Зег ТНг Туг лсд Уа1 Уа1 Бег Уа1 Ьеи т1тг Уа1 Ьеи НТ 5 61 п Азр тгр
180 185 190
Ьеи АЗП 61 у ьуз 61 и Туг ьуз суз ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз б1у Ьеи Рго
195 200 205
зег Зег 11е 61 и Ьуз тНг Не Зег ьуз А1а Ьуз 61 у 61 п Рго Агд 61 и
210 215 220
Рго 61 п уа! Туг тНг Ьеи РГО РГО Зег 61η 61 и 61 и мет тНг ьуз Азп
225 230 235 240
61 п Уа1 Зег ьеи тНг Суз Ьеи Уа1 ьуз б!у РНе Туг Рго зег Азр Не
245 250 255
А1а Уа1 61 и тгр б!и зег АЗП 61 у С1п Рго 61 и А5П АЗП туг Ьуз ТНг
260 265 270
тНг РГО РГО Уа1 Ьеи АЗр Зег АЗр 61у Зег РНе РНе ьеи туг Зег Агд
275 280 285
ьеи тНг Уа1 Азр ЬУ5 Зег Агд тгр б1п 61 и 61 у А5П Уа1 РНе Зег суз
290 295 300
5ег Уа1 Мет НТ 5 61 и А1а Ьеи НТ5 Азп Ηί 5 туг ТНг 61 п Ьуз Зег Ьеи
305 310 315 320
Зег ьеи Зег Ьеи 61 у ьуз
325 <210> 107 <211> 648 <212> 0ΝΑ .
<213> НОМО 5ΑΡΙΕΝ3 <220>
<221> тт5с_Ееасиге <223> Нитап а1рНа2 I Оотатп <400> 107
- 130 016245
адТссхдахх ххсадсхсхс адссадсххс хсассхдсаа схсадсссхд сссисссгс 60
ахадахдххд хддхддхдхд ХдаХдаахса ааХадХаХХХ аХссХХддда тдсадТааад 120
ааххгхххдд аааааХХТдХ асааддссХд даХаХаддсс ссасааадас асаддгдддд 180
ххааххсадх ахдссаахаа хссаададхх дхдхххаасх хдаасасаха гаааассааа 240
даадаааХда ХХдхадсаас аХсссадаса хсссаахахд дХддддассХ сасааасаса 300
ххсддадсаа ххсаахахдс аадааааХаХ дссхаххсад садсХХсХдд Тдддсдасда 360
адхдсхасда аадхаахддх адХХдХаасХ дасддХдааХ сасахдахдд тгсаагдггд 420
ааадсхдхда ххдахсаахд саассаХдас ааХаХасХда ддХХХддсаХ адсадггсгг 480
дддхасххаа асадааасдс ссххдахасх ааааахххаа хаааадааах аааадсдагс 540
дсхадхаххс саасадааад ахасхххххс ааХдХдтеХд аХдаадсадс гстасгадаа 600
ааддсхддда саххаддада асаааХХХХс адсаххдаад дХасХдХХ 648
<210> 108 <211> 106 <212> РКТ <213> ното Бартелз <220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <22 з> буыг.о <400> 108
АЗр Рбе Уа1 мех тбг 61 η Бег РГО А1а Рбе ьеи Бег Уа1 тбг РГО 61 у
1 5 10 15
61 и ьуз уа1 тбг 11е тбг суз Бег А1а АЗП Бег Бег Уа1 АЗП туг Не
20 25 30
НТВ тгр Туг 61 η 61п ьуз Рго Азр 61 η А1а Рго ьуз ьуз Ьеи 11е туг
35 40 45
Азр тбг 50 Бег ьуз Ьеи А1 а Бег 55 61 у Уа1 Рго Бег Агд 60 Рбе Бег 61 у Бег
61 у Бег 61 у тбг Азр Рбе тбг Рбе тбг 11е Бег Бег ьеи 61 и А1а 61 и
65 70 75 80
АЗр А1а А1а тбг туг туг суз 61 η 61п тгр тбг тбг АЗП РГО ьеи Тбг
85 90 95
Рбе 61 у 61 η 61 у Тбг ьуз Уа1 61 и 11е ьуз
100 105
<210> 109
<211> 119
<212> РКТ
<213> Ното Барт 1®П5
- 131 016245 <220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <223> ИУН12.0 РозтХтоп 48 сап Ье Ьеистпе ог тзоТеистпе <400> 109
61 η Уа1 1 61 η ьеи 61 п 5 61и Зег 61у Рго 61 у 10 ьеи Уа1 ьуз Рго зег 15 61 и
ТЬг Ьеи Зег Хеи ТНг Суз тНг Уа1 Зег б1у рЬе Зег Ьеи тНг АЗП Туг
20 25 30
С1у 11е НТ 5 35 тгр 11 е Агд 61 п РГО 40 РГО С1у ьуз 61 у Ьеи 45 61 и Тгр Ьеи
61 у уа! 11е тгр А1а лгд 61 у рНе ТНг Азп Туг Азп Зег А1а Ьеи Мех
50 55 60
5ег Агд ьеи ТНг 11е Зег !_уз Азр АЗП Зег ьуз А5П 61 п Уа1 Зег Ьеи
65 70 75 80
Ьуз ьеи Зег Зег Уа1 тпг А1а А1а Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд А1а Азп Азр 61 у Уа1 Туг Туг А1а мех АЗР Туг Тгр 61 у 61 п 61 у
100 105 110
ТЬг Хеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег
115
<210> 110
<211> 119
<212> РКТ
<213> Ното Зартепз
<220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ
<223> ЬУН13.0
<400> но
61 η Уа1 61 п Ьеи 61 п 61 и Зег 61 у РГО 61 у хеи Уа1 ьуз РГО Зег 61 и
1 5 10 15
ТЬг Ьеи Зег ьеи Тпг Суз ТЬг Уа1 5ег 01 у РЬе 5ег Ьеи ТЬг А5П туг
20 25 30
61у 11е Нтз 35 Тгр Уа1 Агд 61 п Рго 40 Рго 61 у ьуз 61 у ьеи 45 61 и Тгр 11е
61 у Уа! 11е тгр А1а лгд 61 у рНе ТНг А5П Туг Азп Зег А1 а ьеи мех
50 55 60
5ег Агд Уа1 ТНг 11е Зег ьуз Азр Азп Зег ьуз Азп 61 п Уа1 Зег Хеи
65 70 75 80
- 132
ьуз Ьеи Бег 5ег Уа1 ТНг А1 а αΊ а Азр тНг А1а Уа1 туг туг Суэ А1а
85 90 95
Агд А1а А5П А5р 61 у уа1 туг туг А1а мет А5Р туг тгр 61 у 61 п 61 у
100 105 110
тКг Ьеи уа! ТНг Уа1 Бег Бег
115
<210> 111 <211> 119 <212> РКТ <213> Ното Бартепз <220>
<221> М15С„РЕАТиКЕ <223> НУН14.0 РозтТтоп 48 сап Ье ьеистпе ог 15о1еистпе <400> 111
61п Уа1 1 61п ьеи 61п 5 61 и Бег 61 у Рго 61 у 10 ьеи Уа1 ьуз Рго Бег 15 61 и
ТНг ьеи Бег ьеи ТНг суз тИг уа! Бег 61 у рНе Бег ьеи тЬг АБП туг
20 25 30
61 у И е Нтз 35 Тгр 11е Агд 61 п Рго 40 РГО 61 у ьуз 61у Ьеи 45 61 и Тгр ьеи
61 у Уа1 11е Тгр А1а Агд 61 у РНе тНг АЗП туг Азп Бег А1а ьеи МеТ
50 55 60
Бег Агд Уа1 ТКг Не Бег ьуз Азр А5П Бег Ьу5 АБП 61 п Уа1 Бег ьеи
65 70 75 80
ьуз ьеи Бег Бег Уа1 ТНг а! а А1а Азр ТЬг А1а Уа1 туг туг суз А1а
85 90 95
Агд А1а АЗП АЗр 61 у Уа1 туг туг А1а МеТ Азр туг тгр 61 у 61 п 61 у
100 105 110
ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Бег Бег
115
<210> 112
<211> 10
<212> РКТ
<213> Ното БарЛепз
<220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ
<22 3> ЬСРК1 [Ν260]
<400> 112
- 133 016245 зег А1а е!п Бег Бег тгр А5П Туг 11е Нтз 15 10 <210> 113 <211> 681 <212> ΡΝΑ <213> КаХХиз гаххиз <22О>
<221> тт$с_ТеаТиге <223> КаХ а1рНа 2 I с1отатп <400> 113
адхссадасх ТХсадХсдХХ дасаадсХЛс ХсассХдсад ХХсаадсХХд сссггссстс 60
дХадаХдХсд ХадХХдХсХд ТдаТдааТСЗ аасадХаХХХ ахсссхддда адсадтааад 120
ааХХХХХХдд аааадххтдх дсааддссТд дахахаддас сХааааадас асаддТддсд 180
ххааххсаах ахдссаасда сссаададТ! дхсхххаасх ХдассасТХа сааааасааа 240
даадахахдд ххсаддссас атссдадасд сдссадХаХд дхддддассх сасааасасс 300
ХХсааддсХа хссаахххдс аададасагт дсххахххас сддадХсХдд сдддсдссса 360
ддХдсХасаа аадХсаХддХ адттдтдасс даХддддааХ сссахдахдд дгсдаадсгд 420
сааасХдХда ХссадсааХд саагдагдас дадаХасХда ддхххддсах адсддттстт 480
ддаХаХХХаа асадаааХдс тсттдагаст ааааахсхаа ХсааадаааХ ТааадсааТс 540
дсхадсасхс саасддадад дтастггггс аахдхддссд ахдаддсддс гсггсхддад 600
ааадсХддса схсхадддда дсасататтс адсаХТдаад дсасХдХХса аддаддадас 660
аасХХссада ХддаааХддс а 681
<210> 114 <211> 648 <212> ΡΝΑ <213> миз ти5си1из <220>
<221> т1зс_ТеаХиге <223> Моизе а!рКа 2 I Йошатп с!опе
<400> 114 адхссадасх ттсадттстт дассадсХХТ хсассХдсад ХХсаддсХХд сссттссстс 60
дХддаХдХХд гадггдгагд ХдаХдааХса аасадХаХХХ аХссХХддда адсадтааад 120
аасхххххдд гааадттгдт дасаддссХд дахахаддас схааааадас асаддгддсд 180
ххааххсаах атдссаатда дссдадааХХ ахахххаасх хдаасдаххх сдааассааа 240
даддахахдд тссаддссас ахсхдадасд сдссаасахд дхддддассх сасааасасс 300
ХХсададсХа £сдааттсдс аададасхас дсХХаХХсас адасХХсХдд сдддсдсссд 360
ддХдсХасаа аадТсаТддТ адХХдХдасс даХддсдадХ сссахдахдд дгсдаадстд 420
аааасхдхда гссадсаагд саахдахдас дадахасхда ддххсддсах адсадттстт 480
дддХаХХХаа асадаааТдс ХсХХдаХасХ аааааХХХаа ХсааадаааХ аааадсаатх 540
- 134 016245 дстадтастс саассдадад атасттгттс ааТдТддссд асдаадсддс ТсТТсТддад 600 ааддсхддаа сгстадддда дсааатаггс адсаТТдаад дсасТдТТ 648
<210> <211> <212> <213> 115 6 ΟΝΑ Ното 5ар1еп5
<220> <221> <22 3> тт5с_Геатиге Ехетр1агу ирзггеат зечиепсе Тгот гНе згагг οί деле ТгапзсгтрГтоп
<220> <221> <222> <223> тт з с...Те ат: иге (2).. С2) η тз а, с, д, ог ΐ
<400> спсааг 115 6
<210> 116 <211> 6 <212> ОМА <213> Ното 5артепз <220>
<221> т1зс.кеагиге <223> Ехетр1агу зечиепсе аг 3' βηά οί деле <400>116 ааГааа6 <210>117 <211>31 <212> ОМА <213> Ното зартепз <220>
<221> ттзс_Теа1иге <223> ЬаЗрНа1 Р <400>117 ддддаТссад ТссТдааТТТ ТсадсТсТса д31 <210> 118 <211>27 <212> ϋΝΑ <213> Ното зартепз <220> :
<221> тт зс-РеаТиге <223> На1рНа1 К <400> 118 дддааггсаа садтассггс аагдсгд <210> 119 <211> 19 <212> ϋΝΑ
- 135 016245 <213> ношо зартепз <220>
<221> ппзС-ГеаХиге <223> Нитап I дотатп Гогиагс) рптег <400> 119 ддддаХссад ХссХдаХХХ 19 <210> 120 <211> 18 <212> ΟΝΑ <213> ното зартепз <220>
<221> тт5с_1еаХиге <223> Нитап ί йотат'п геуегзе рптег <400>120 ддааХХсаас адХассХХ18 <210> 121 <211>29 <212> ϋΝΑ <213> Ното Бартер <220>
<221> тт5с_ГеаХиге <223> та1рНа1 Р <400> 121 ддддагссад гссадасХХХ садХХсХХд 29 <210> 122 <211> 28 ;
<212> ϋΝΑ <213> Ното Бартепз <220>
<221> т15с_Геагиге <223> та1рпа1 К <400>122 хдддааххса асадхдссхг саагдсхд28 <210>123 <211>31 <212> ϋΝΑ <213> Ното Бартелз <220>
<221> пп'5с_Геахиге <223> га1рЬа1 Р <400>123 ддддаХссад ХссадасХХХ садХсдХХда с31 <210>124 <211>31
- 136 016245
<212> <213> ОМА Ното Зйртепз
<220>
<221> Ш15с_ГеаТиге
<223> га1рНа1 к
<400> 124
ТдддааГТсТ дссаТТТсса ХсХддаадхг д 31
<210> 125
<211> 34
<212> ϋΝΑ
<213> Ното БарлепБ
<220>
<221> тт5с_Теагиге
<223> На1рНа1 Ι21ν Р
<400> 125 .
садсссгдсс стТссстсдг адахдххдхд дгсд 34
<210> 126
<211> 34
<212> ОНА
<213> Ното 5ар1’еп5
<220>
<221> тт 5с_ТеаТиге
<223> КаТрНа! Ι21ν к
<400> 126
саассасаас агссасдадд даадддсадд дстд 34
<210> 127
<211> 33
<212> ϋΝΑ
<213> ното 5артеп5
<220>
<221> низе ТеаТиге
<223> НаТрНаг Ε44ν р
<400> 127
садгааадаа гггххгддга аааггхдгса адд 33
<210> 128
<211> 33
<212> ϋΝΑ
<213> Ното Бартепз
<22О>
<221> пп 5с_ГеаТиге
<223> На1рНа1 Ε44ν к
<400> 128
ссххдасааа хггсассааа аааххсххха стд 33
<210> 129
- 137 016245
<211> <212> <213> 35 ΟΝΑ ното Зартепз
<220> ф
<221> т15с_РеаХиге
<223> На1рба1 048Т Р
<400> 129
ххххддаааа ахххдхааса ддссхддаха хаддс 35
<210> 130
<211> 35
<212> ΟΝΑ
<213> ното зартепз
<220>
<221> пл зс_€еаХиге
<223> На1рКа1 Ц48Т Н
<400> 130
дссХаХаХсс аддссХдХХа саааХХХХХс сдддд 35
<210> 131 '
<211> 33
<212> ϋΝΑ
<213> Ното Зартепз
<220>
<221> ηιι зс_ХеаХиге
<223> На1рЬа1 ν67ε е
<400> 131
садхахдсса ахдадссаад адххдхдххх аас 33
<210> 132
<211> 33
<212> ϋΚΑ
<213> ното 5ар1еп$
<220>
<221> тт зс_кеахиге
<223> Ьа1рНа1 Ν67Ε К
<400> 132
дХХааасаса асхсххддсх саххддсаха схд 33
<210> 133
<211> 34
<212> ϋΝΑ
<213> Ното Зар1еп5
<220>
<221> т1зс_ХеаХиге
<223> На1рНаг ν70ι Е
<400> 133
хдссаахаах ссаадааххд хдхххаасхх даас 34
- 138 016245 <210> 134 <211> 33 <212> ΡΝΑ <213> ното зартепБ <220>
<221> пл 5с_Театиге <223> Ьа1рИа1 ν70ΐ к <400>134 дисаадтта асасааТТсТ тддаттагтд дса <210>135 <211>34 <212> ΡΝΑ <213> Ното зартепз <220>
<221> ипзс-феатиге <223> Ьа1рНа1 ν71ΐ Р <400> 135 ссаатаатсс аададттатс тттаастгда асас <210> 136 <211> 34 <212> ΡΝΑ , <213> Ното Зёртепз <22О>
<221> им 5С_Гес1ииГё <223> На1рИа1 У711 К <400>136 дТдТТсаадТ тааадатаас тсгтддагта гтдд <210>137 <211>33 <212> ΡΝΑ <213> Ното БартепБ <220>
<221> пп 5с_6еаТиге <223> Иа1рНа1 Т76Р Р <400> 137 :
дгдгтхаасг тдаасдасга саааассааа даа <210> 138 <211> 33 <212> РИА <213> ното Зартепз <220>
<221> тт5С_ЕеаТиге <22 3> ИарИ1а1 Т76Р К <400> 138
ТТсТТТддТТ ттатадтсдт ТсаадТТааа сас
- 139 016245
<210> 139
<211> 33
<212> ϋΝΑ
<213> ното зарлепБ
<220>
<221> т15с_ГеаХиге
<223> На1рЬа1 Υ77Ρ Р
<400>139 хххаасххда асасаХХХаа аассааадаа даа <210>140 <211>33 <212> ϋΝΑ <213> Ното 5артепз <220>
<221> пп 5с_Теахиге <223> Ьа1рЬа1 Υ77Ρ к <400>140
ХХсХХсХХХд дххххааахд ХдСХсаадХХ ааа <210>141 <211>33 <212> ΟΝΑ <213> ното 5артепБ <220>
<221> т15с_ТеаХиге <223> Ьа1рНа1 К78Е Р <400>141 аасХХдааса саХаХдааас сааадаадаа аХд <210>142 <211>33 <212> ϋΝΑ <213> Ното Зартепз <220>
<221> штБС-беахиге <223> На1рЬа1 К78Е К <400>142 саХХХсХХсХ ххддхххсах аХдХдХХсаа дХХ <210>143 <211>33 <212> ϋΝΑ <213> Ното БартепБ <220>
<221> ттБС_ТеаХиге <223> На1рНа1 Υ93Η Р <400> 143 хсссадасах сссаасаХдд хддддассхс аса
- 140 016245
<210> 144
<211> 33
<212> ϋΝΑ
<213> ното зарлепз
<220>
<221> тл’ 5с_ГеаТиге
<223> На1рНа1 Υ93Η К
<400> 144
ТдТдаддТсс ссассаТдгг дддатдтсгд дда 33
<210> 145
<211> 39 :
<212> ΡΝΑ
<213> ното зарлепз
<22О>
<221> т15с_Геагиге
<223> йа1рЬа1 Υ93Ρ Р
<400> 145
асаГдддада сатсссаатс тддтддддас стсасааас 39
<210> 146
<211> 39
<212> ϋΝΑ
<213> ното Барлепз
<220>
<221> тлзс_Геа1иге
<223> 6а1рНа1 Υ93Ρ К
<400> 146
дШдТдадд Тссссассаа аТТдддаТдТ с-ЁсссаГдг 39
<210> 147
<211> 33
<212> ΰΝΑ
<213> ното Зарлепз
<220>
<221> тлзс_ГеаТиге
<223> НаТрЬаГ 0105Е Р
<400> 147
ТТсддадсаа ТТдааТаТдс аадааааТаТ дсс 33
<210> 148
<211> 33
<212> ОМА '
<213> Ното Зарлепз
<220>
<221> тл'зс_Геа1:иге
<223> Ка1рЬа1 0105Е К
<400> 148
- 141 016245
ддсатаххтт сггдсаТаТТ сааТТдсТсс даа 33
<210> 149
<211> 39
<212> ΡΝΑ
<213> нолю Бартелз
<220>
<221> тт зс_ЕеаЬиге
<223> На1рЬа1 А114Ц р
<400> 149
ааагатдссг аТТсасаадс ТТсТддТддд сдасдаадт 39
<210> 150
<211> 39
<212> ϋΝΑ
<213> Ното Бартелз
<220>
<221> ттзс_ГеаТиге
<223> На1р1га1 А114Ц К
<400> 150
асТТсдТсдс ссассадаад сТХдтдаага ддсаТаТТТ 39
<210> 151
<211> 39
<212> ΡΝΑ
<213> Ното Бартелз
<220>
<221> ттзс_ТеаТиге
<223> На1рНа1 А115Т р
<400> 151
ааататдссг ат-рсадсаас ТТсТддТддд сдасдаадт 39
<210> 152
<211> 39
<212> ΡΝΑ
<213> ното Бартепг
<220>
<221> пл зс-Ееатиге
<223> На1рНа1 А115Т к
<400> 152
асТТсдТсдс ссассадаад ТТдсТдааТа ддсаТаТТТ 39
<210> 153
<211> 39
<212> ΡΝΑ
<213> Ното Бартелз
<220>
<221> шт’зс ТеаТиге
<223> НаТрЬа! А115О Р
- 142 016245
<400> аааХаХ 153 39
дссх аххсадсаса дхсхддхддд сдасдаадх
<210> 154 :
<211> 39
<212> ϋΝΑ
<213> ното Бартелз
<220>
<221> тт зс_ТеаХиге
<223> Иа1р1та1 А115С} К
<400> 154
асХХсдХсдс ссассадасх дхдсхдааха ддсахаххх 39
<210> 155
<211> 39
<212> ΟΝΑ
<213> ното Бартелз
<220>
<221> ттзс_±еахиге
<223> Ка1рКа1 Κ165ϋ Р
<400> 155
дххсххдддх асххааасда саасдсссхх дахасхааа 39
<210> 156
<211> 39
<212> ϋΝΑ
<213> ното 5ар1епз
<220>
<221> ттзс_РеаХиге
<223> Иа1рба1 Κ165ϋ К
<400> 156
ХХХадХаХса адддсдХХдХ сдХХХаадХа сссаадаас 39
<210> 157 .
<211> 39 '
<212> ΟΝΑ
<213> Ното 5ар1елз
<220>
<221> ттзедЕеаХиге
<223> На1рЬа1 Ν166ϋ Р
<400> 157
сХХдддХасХ Хааасаддда сдсссХХдаХ асХаааааХ 39
<210> 158
<211> 39
<212> ϋΝΑ
<213> Ното Бартепз
<220>
<221> тт БС-ГеаХиге
<223> ИаЗрба! N1660 К
- 143 016245
<400> 158
атттттадта ТсаадддсдТ ссссдтттаа дтасссаад 39
<210> 159
<211> 40
<212> □НА .
<213> ното Бартепз
<220>
<221> тт зс-Реашге
<223> Ьа1р1та1 Е195И Е
<400> 159
ТГсааГдТдТ сТдаТТдддс адстстаста дааааддстд 40
<210» 160
<211> 40
<212> РИА
<213> ното Бартепз
<22О>
<221> ттзс-ГеаТиге
<223> 1та1рНа1 Е195И к
<400> 160 '
садссТТТТС тадтададст дсссааТсад асасаТТдаа 40
<210> 161
<211> 38
<212> РИА
<213> Ното Бартепз
<22О>
<221> ттзсШеаТиге
<223> Ьа1р1та1 К40Р р
<400> 161
аТссТТддда Тдсадтадас ааТГТТТТдд ааааахтт 38
<210> 162
<211> 38
<212> ΡΝΑ
<213> Ното БартепБ
<22О>
<221> ттзс_ГеаГиге
<223> Ьа1рЬа1 К40О 8
<400> 162
аааТТТТТсс ааааааТТдТ стасгдсаьс ссааддат 38
<210> 163
<211> 39
<212> ОНА
<213> ното Бартепз
<220>
<221> ттзс^Реатиге
- 144 016245
<223> <400> садХаХ НаЧрпат «690 Р
163 39
дсса аХааХссада сдххдхдххх аасххдаас
<210> 164
<211> 39
<212> ΟΝΑ
<213> Ното Бартелз
<220>
<221> пп5с_Теахиге
<223> Ьа1рЬа1 к69о К
<400> 164
дххсаадхха аасасаасдх схддаххахх ддсахасхд 39
<210> 165
<211> 36
<212> ΰΝΑ
<213> Ното Бартелз
<220>
<221> ттзс_ЕеаХиге
<223> Ьа1рЬа1 Ν73ΰ Р
<400> 165
ааХссаадад ХХдХдХХХда сХХдаасаса ХаХааа 36
<210> 166
<211> 36
<212> ϋΝΑ
<213> Ното Бартелз
<220>
<221> тт зс_ГеаХиге
<223> На1рЬа1 Ν73ϋ к
<400> 166
ггсагагдгд ггсаадгсаа асасаасхсх хддахх 36
<210> 167
<211> 39
<212> ΟΝΑ
<213> ното Бартелз
<220>
<221> пп'зс_ГеаХиге
<223> Ьа1рНа1 р89н р
<400> 167
ахдаххдхад саасахссса сасахсссаа хахддхддд 39
<210> 168
<211> 39
<212> ϋΝΑ
<213> ното Бартелз
<220>
- 145 016245 <221> гтп зс_Геахиге <223> На1рНа1 О89Н к <400?168 ахдаххдхад саасаХссса сасаХсссаа хахддхддд39 <210>169 <211>40 <212> ϋΝΑ <213> Ното Бартелз <220>
<221> тт5с_ХеаХиге <223? таТрНа! Η93Υ Е <400>169 сасахсхдад асдсдссаах ахддхдддда ссХсасааас40 <210>170 <211>40 <212> ΟΝΑ <213> ното Бартелз <220>
<221> ттзс_ГеаХиге <223> та1рНа1 Η93Υ К <400>170 дХХХдХдадд хссссассах аххддсдсдх схсадахдхд40 <210>171 <211> 216 : <212> РКТ <213> масаса Газет сиТагтз <220?
<221? М15С_РЕАТиКЕ <223> Супото1одиз <400? 171
Бег Рго А5Р РЬе 61п Хеи Бег А1а Бег РНе Бег Рго А1а ТЬг 61 η Рго
1 5 10 15
Суз Рго 5ег Хеи Не Азр Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Суз Азр 61 и Бег АЗП Бег
20 25 30
Не Туг РГО Тгр Азр А1а Уа1 Азр А5П РНе Хеи 61 и хуз РЬе Уа1 61 η
35 40 45
б!у хеи АЗр 11е 61 у РГО тНг хуз тНг 61 η Уа1 61 у хеи 11е 61 η туг
50 55 60
А1а А5Л Α5Π РГО Агд уа! Уа1 РНе АЗП хеи АЗП тНг туг ХУ5 тНг хуз
65 70 75 80
61 и 61 и меС 11 е Уа1 А1а ТЬг Бег 61 п ТНг Бег 61 η Туг 61 у 61 у Азр
90 95
- 146
ьеи тНг азп тНг РНе 61 у А1а 11 е 61 п 105 Туг А1а Агд Ьу5 Туг 110 А1а туг
100
Зег А1а А1а Зег 61 у 61 у Агд Агд Зег А1а ТНг Ьуз Уа! Мех Уа1 Уа!
115 120 125
уа! тНг АЗр 61 у 61 и Зег Нтз Азр с! у Зег Мех Ьеи ьуз А1а Уа1 11 е
130 135 140
Азр 61 η СУ 5 АЗП Нтз Азр Азп Не Ьеи Агд РНе 61 у Не А1а Уа1 Ьеи
145 150 155 160
б1у туг ьеи АЗП Агд АЗП А1 а Ьеи Азр ТНг ьуз АЗП ьеи 11е ьуз 61 и
165 170 175
И е ьуз А1а Не А1а Зег 11 е Рго тНг 61 и Агд Туг РНе РНе А5П Уа1
180 185 190
Зег Азр 61 и А1а А1а ьеи Ьеи 61 и ьуз А1а 61 у тНг ьеи 61 у 61 и 61 п
195 200 205
Не РНе Зег Не 61 и б1у ТНг Уа1
210 215
<210> 172
<211> 216
<212> РКТ
<213> 1 Масаса ти!ахха
<220>
<221> 1 М15С_РЕАТиКЕ
<223> кНезиз
<400> 172
5ег Рго АЗр РНе 61 п Ьеи Зег А1а 5ег РНе Зег Рго А1а тНг 61 п Рго
1 5 10 15
Суз РГО $ег Ьеи 11 е АЗр уа! Уа! Уа1 νβΐ Суз Азр 61 и Зег Азп Зег
20 25 30
11е туг РГО Тгр Азр А1а Уа1 1_уз АЗП РНе Ьеи 61 и ьуз рНе Уа1 61 п
35 40 45
61 у ьеи 50 Азр 11е 61 у РГО тНг 55 ьуз тНг б! п уа1 61 у 60 Ьеи Не 61 п туг
А1а А5п АЗП РНо Агд Уа1 Уа1 РНе АЗП ьеи АЗП ТНг Туг Ьуз ТНг ьуэ
65 70 75 80
61 и 61 и МеТ 11е Уа1 А1а ТНг Зег 61 п тНг Зег 61п Туг 61 у 61у АЗр
85 90 95
- 147 016245
Ьеи ТЬг Азп тЬг 100 РЬе 61 у А1а 11 е 61 п 105 Туг А1а Агд Ьуз Туг 110 А1а Туг
Зег А1а А1а 5ег 61 у 61 у Агд Агд Зег А1а ТЬг ьуз Уа1 МеТ Уа! Уа1
115 120 125
уа! тЬ г Азр 61 у 61 и 5ег нт 5 АЗр 61 у Зег мет ьеи Ьуз А1а Уа1 11 е
130 135 140
Азр 61 п Суз Азп ΗΪ 5 Азр АЗП 11 е ьеи Агд рИе 61 у Не А1а Уа1 Ьеи
145 150 155 160
61 у Туг Ьеи АЗП Агд АЗП А1а ьеи Азр тЬг 1уз АЗП Ьеи Не Туз 61 и
165 170 175
11е ЬУ5 А1а 11е А1а 5ег Не Рго тЬг 61 и Агд Туг РЬе РЬе Азп Уа1
180 185 190
5ег Азр 61 и А1а А1а Ьеи Ьеи 61 и ьуз А1 а 61 у тЬг ьеи 61 у 61 и 61 η
195 200 205
Не рИе Зег 11е 61 и 61 у ТЬг Уа!
210 215 <210> 173 <211> 1435 <212> ОНА <213> Ното Зартепз
сгс Тдд дтт сса дог
ьеи Тгр Уа1 Рго 61 у
15
ссг ддс стд дгд аад
Рго 61 у Теи Уа1 Ьуз
дад 61 и 1 аса тИг дас Азр аса сТс стд ста Тдд дТа егд ьеи 10 51
тЬг ьеи 5 ьеи ьеи тгр Уа1
Тсс асЬ дда сад дТд Уа1 сад ТТд сад дад Ьса 99
Зег ТНг 61у 61 π 61 п Ьеи 61 η 61 и Зег
20 25
ссе аде дад асе стд аде стд аес тдт асе 147
Рго Зег 61 и тЬг Ьеи зег Ьеи ТЬг Суз тНг
35 40
асе аас гаг ддс аТс сас Тдд ат а сдс сад 195
ТЬг А$П туг 61 у Не НТ 5 Тгр Не Агд 61 п
50 55
дад 61 и 65 ОД тгр егд Ьеи ддс 61 у аса 11е 70 тдд тгр дет А1а сдс Агд ддс б!у 243
дет сгс агд Тсс сде дгд асе аТс аде аад 291
- 148 016245
РНе тНг азп 75 туг АЗП зег А1а ьеи мет Зег 80 Агд Уа1 ТЬг 85 Не Зег ьуз 90
дас аас аде аад аас сад дтд Уа! аде стд аад стд аде аде я асе дсс 339
Азр Азп Зег Ьуз Азп 61 п Зег Ьеи ьуз ьеи Зег 5ег ТЬг А1а
95 100 105
дед дас асе дсс еас Тае Где дсс ада дсс аас дас ддд 9ΐί гас 387
А1а Азр ТНг А1а туг туг суз А1а Агд А1а АЗП Азр б!у Уа1 туг
110 115 120
ТаТ дсс аьд дас Тае Тдд ддс б!у сад дда бТу асе стд дтс асе дтс аде ьса 435
Туг А1а мет А5Р туг Тгр 61 п ТЬг Ьеи Уа1 тЬг уа1 зег Зег
125 130 135
дед тсс асе аад ддс с! у сса тсс дгс ТТС ссс стд дед ссс Тде гее адд 483
А1а Зег тЬг ьуз Рго Зег Уа1 РНе Рго Ьеи А1а РГО суз зег Агд
140 145 150
аде асе тсс дад аде аса дсс дсс стд ддс б!у Тде стд дтс аад дас Ьас 531
Зег· тНг Зег 61 и Зег ТНг А1а А1а ьеи Суз Ьеи Уа1 Ьуз А$р Туг
155 160 165 170
ТТС ссс даа ссд дтд Уа! асд дтд Уа! гсд тдд аас тса ддс с!у дсс ссд асе аде 579
РНе Рго 61 и Рго ТНг Зег Тгр Азп Зег А1а ьеи ТНг Зег
175 180 185
дде 61 у дтд сас асе ТТС ссд дет дсс ста сад тсс тса дда СТС Тае гее 627
Уа! Н15 тНг РНе РГО А1а Уа1 Ьеи 61 п зег 5ег е!у Ьеи туг зег
190 195 200
СТС аде аде дтд уа! дтд асе дтд Уа! ссс Тсс аде аде ттд ддс е!у асд аад асе 675
Ьеи 5ег зег Уа! ТНг Рго Зег 5ег 5ег Ьеи тКг ьуз тЬг
205 210 215
гас асе Тде аас дта дат сас аад ссс аде аас асе аад дтд уа! дае аад 723
Туг тНг Суз Азп Уа1 А5р Н1з |_уз Рго 5ег АЗП ТНг ьуз Азр ьуз
220 225 230
ада дтт дад Тее ааа СаГ ддт ссс сса тде сса тса тде сса дса сс± 771
Агд Уа1 61 и зег ьуз туг б!у РГО РГО суз РГО зег суз РГО А1а РГО
235 240 245 250
дад ТТс стд ддд дда сса тса дгс ттс стд ТТС ссс сса ааа ссс аад 819
61 и РЬе ьеи б!у б!у РГО зег уа! рЬе ьеи рНе РГО РГО ьуз Рго ьуз
255 260 265
дас аст СТС атд аТс гее едд асе ест дад дтс асд тде 867
А5р тНг ьеи мет 11 е Зег Агд ТНг рго 61 и Уа1 тНг Суз
270 275 280
дас аде сад даа дас ссс дад дтс сад ТТС аас тдд Тае дтд Уа! дат 915
Азр Зег 61 п 61 и Азр Рго 61 и Уа1 б1п РНе Азп Тгр Туг Азр
285 290 295
ддс дтд Уа! дад дтд Уа! саг аас дсс аад аса аад ссд едд дад дад сад ТТС 963
61у 61 и Н15 АЗП А1а ьуз тНг ьуз Рго 61 и 61 и 61п РЬе
300 305
аас аде асд Тае едт 33 дтс аде дтс ст с асе дтс стд сас сад дас 1011
АЗП 5ег ТНг Туг Агд Уа1 зег Уа1 Ьеи ТНг Уа1 ьеи НТЗ 61 п Азр
315 320 325 330
Тдд сТд аас ддс аад дад Тае аад Тде аад дтс тсс аас ааа ддс сТс 1059
Тгр Ьеи Азп е!у ьуз 61 и Туг ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз б!у ьеи
335 340 345
ссд Тсс Тсс аТс дад ааа асе аИс тсс ааа дее ааа ддд сад ссс еда 1107
Рго Зег Зег 11 е 61 и ьуз ТНг 11 е Зег Ьуз А1а Ьуз 61 у 61 п Рго Агд
149 016245
350 355 360
дад 61 и сса сад дхд хае асе ехд ссс сса гее сад дад дад аТд МеТ асе ТНг аад ьуз 1155
Рго 61 п Уа! Туг ТНг 365 Ьеи Рго 370 РГО Зег 61 п 61 и б1и 375
аас сад дхс аде сХд асе хде ехд дтс ааа ддс ттс тас ссс аде дас 1203
АЗП 61 п Уа1 зег ьеи тНг суз Ьеи Уа1 ьуз 61у РЬе туг Рго Зег Азр
380 и 385 390
аге дсс 9*9 дад хдд дад аде аах 999 сад сед дад аас аас Тас аад 1251
11 е А1а уа! б! и Тгр 61 и Зег АЗП 61 у 61 п Рго 61 и АЗП Азп Туг иуз
395 400 405 410
асе асд ССХ ссс 9*9 стд дас Хее дас ддс Хее ттс ТТС СТС Тас аде 1299
ТНг ТКг РГО Рго уа! ьеи АЗр зег Азр 61 у 5ег р|те рЬе ьеи Туг зег
415 420 425
адд ста асе дтд дас аад аде адд тдд сад дад ддд аат дтс ТТС хса 1347
Агд Ьеи тНг Уа1 А5р ьуз Зег Агд Тгр 61 п 61 и с’у АЗП Уа! РНе Зег
430 435 440
тде Тсс 9ΐ9 агд сах дад дсХ ехд сас аас сас тас аса сад аад аде 1395
Суз Зег Уа1 мет ΗΊ 5 61 и А1а ьеи Нтз Азп ΗΊ5 туг тЬг 61 п Ьуз Зег
445 450 455
1435 сТс Тсс стд тст стд ддТ ааа ТдаТаддаТс сдсддссдс ьеи Зег Ьеи 5ег ьеи 61у Ьуз
460 465 <210> 174 <211> 465 <212> РКТ
<213> Ното Зартепз
<400> : 1.74
61 и тНг Азр ТНг ьеи ьеи хеи тгр Уа1 ьеи Ьеи Ьеи Тгр Уа1 РГО 61 у
1 5 10 15
Зег ТЬг б1у 61 п Уа1 61 п Ьеи 61 п 61 и Зег 61у рго 61 у Ьеи Уа1 Ьуз
20 25 30
рго зег 61 и ТНг ьеи зег ьеи тНг суз тНг уа1 Зег 61 у РЬе Зег ьеи
35 40 45
ТНг Азп 50 Туг 61 у 11е ΗΊ3 тгр 55 11е Агд 61 п Рго Рго 60 б1у ьуз 61 у ьеи
61 и тгр ьеи 61 у Уа! 11е Тгр А1 а Агд 61 у РЬе тЬг АЗП Туг Азп зег
65 70 75 80
А1а ьеи мет зег Агд Уа! ТЬг 11 е зег ьуз Азр АЗП зег ьуз АЗП 61 п
85 90 95
Уа1 Зег Ьеи ьуз Ьеи зег Зег \/а1 тЬг А1а А1а Азр ТНг А1а Уа1 Туг
100 105 110
Туг Суз А1а Агд А1а АЗП А5р 61 у Уа! Туг Туг А1а МеТ Азр Туг Тгр
115 120 125
- 150 016245
61 ν 61η 61 ν ТЬг Ьеи Уа! тНг Уа1 135 Зег Зег А1а 5ег 140 ТНг Ьуз 61 у Рго
130
Зег νβΐ РЬе РГО Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд зег тЬг зег 61 и зег ТЬг
145 150 155 160
А1а А1а ьеи 61 у Суз ьеи Уа1 ьуз лзр Туг РЬе Рго 61 и РГО Уа1 ТЬг
165 170 175
Уа! Зег Тгр АЗП Зег 61 у А1а Ьеи тЬг Зег 61 у Уа! Нтз ТЬг РЬе Рго
180 185 190
А1а Уа1 ьеи 61И зег зет 61 у ьеи туг зег ьеи зег зег уа! уа! тЬг
195 200 205
уа! РГО Зег Зег Зег Ьеи 61 у ТЬг ьуз тЬг туг ТЬг Суз Азп Уа1 АЗр
210 215 220
НТЗ ьуз РГО 5ег АЗП ТЬг ьуз Уа1 АЗр ьуз Агд Уа1 61 и Зег ьуз Туг
225 230 235 240
61 у рго рго суз РГО зег суз РГО А1а РГО 61 и рЬе ьеи 61 у 61 у рго
245 250 255
Зег Уа1 РНе Ьеи РЬе Рго Рго ьуз Рго Ьуз Азр тЬг ьеи мес Не 5ег
260 265 270
Агд тЬг Рго 61 и Уа1 тЬг суз Уа! Уа1 Уа1 Азр Уа1 зег 61 п 61 и АЗр
275 280 285
Рго 61 и Уа1 61 п РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр 61 у Уа1 61 и Уа1 нтз АЗП
290 295 300
А1а Ьуз тЬг ьуз Рго Агд 61 и 61 и 61 п РЬе Азп 5ег ТЬг туг Агд Уа1
305 310 315 320
Уа1 Зег Уа1 ьеи тЬг Уа1 Ьеи Нтз 61 п АЗр Тгр Ьеи Азп 61 у Ьуз 61 и
325 330 335
Туг ьуз суз ьуз Уа1 5ег Азп ьуз 61 у Ьеи рго Зег Зег 11 е 61 и ьуз
340 345 350
тЬг 11 е Зег ьуз А1 а ьуз 61 у 61п Рго Агд 61 и РГО 61 п Уа1 Туг тЬг
355 360 365
Ьеи Рго Рго 5ег 61 п 61 и 61и МеС ТЬг ьуэ А5П 61 п Уа1 зег Ьеи ТЬг
370 375 380
суз Ьеи Уа1 ьуз 61 у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 61 и Тгр 61 и
385 390 395 400
- 151 016245
Зег Азп 61 у 61η рго 61 и Азп АЗП Туг Хуз Тбг 410 тбг РГО РГО уа! 415 хеи
405
АЗр Бег* А5р 61 у Бег Рбе Рбе ьеи туг Бег Агд хеи тпг Уа1 АЗР хуг
420 425 430
Бег Агд тгр 61 η 01и 61 у АЗП Уа1 рЬе Бег Суз Зег Уа1 Мех Н15 61 и
435 440 445
А1а ьеи ΗΊ5 АЗП ΗΊ 5 Туг тбг 61 η Ьу$ Бег ьеи зег ьеи зег ьеи С1у
450 455 460
ьуз
465 <210> 175 <211> 1435 <212> ΡΝΑ
<213> ното зартепз
<220>
<221> пл'5с_Хеахиге
<223> 6νΗ12.0 1дс4 Неауу Сбатп
<220>
<221> СРЗ
<222> (22)..(1416)
<400> 175
хсхсдадаад сххссассах д дад аса б!и тбг дас аса схе схд сха хдд тгр дХа схд 51
АЗр тбг ьеи ьеи 5 ьеи νβΐ Хеи 10
1
схд схс хдд дхх сса ддх хсс асх дда сад сад ххд сад дад хса 99
хеи Ьеи тгр Уа1 РГО 61 у Бег ТИг б1у 61 η 01 η Ьеи 61 η 61 и 5ег
15 20 25
ддс С1у ССХ 99е оТу схд Ж аад ссс аде дад асе схд аде схд асе ЕдХ асе 147
РГО хеи ху« РГО Бег 61 и тбг ьеи Бег ьеи тбг Суз Тбг
30 35 40
дхс ХСХ дда <31 у XXX аде с ха асе аас хах ддс 61у ахс сас хдд аха сдс сад 195
Уа1 зег Рбе Бег Хеи Тпг Азп Туг 11е ΗΊ3 Тгр И е Агд 61 п
45 50 55
ссх РГО сса РГО ддс с1у аад ХУ5 ддс С1у схд хеи дад 01 и хдд Тгр схд Хеи ддс 61 у аХа 11е хдд тгр дсх А1а сдс Агд ддс 61 у 243
60 65 70
хсс аса аас хах аас аде дсь СТС ахд хсс сдс схд асе аХс аде аад 291
рбе ТЬг АЗП Туг АЗП 5ег А1а Ьеи Мех Зег Агд ьеи тЬг Не Зег Хуз
75 80 85 90
дас аас аде аад аас сад аде схд аад схд аде аде дхд Уа1 асе дсс 339
АЗР АЗП $ег Хуз А5П 61 η Бег Хеи ХУЗ хеи Бег 5ег Тбг А1а
95 100 105
дед дас асе дсс дед УаТ Хас гас где дсс ада дсс аас дас ддд дхс Хас 387
А1а АЗр ТЬг А1а туг Туг суз А1а Агд А1а Азп А5р 61 у Уа1 туг
110 115 120
ХаХ дсс ахд дас Хас хдд ддс 01 у сад дда асе схд дхс асе дхс аде Хса 435
Туг А1а мех А5р Туг Тгр 61п 61у Тбг Хеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег
- 152 016245
125 130 135
дед Тсс асе аад ддс сса Тсс дтс ттс ССС стд дед ссс тде Тсс адд 483
А1а Зег ТНг ьуз бТу РГО Зег Ча1 РНе РГО Ьеи А1а Рго Суз Бег Агд
140 145 150
аде асе тсс дад аде аса дес дес стд ддс тде стд дтс аад дас тас 531
зег тЬг зег 61 и зег тНг А1а А1а ьеи 6 Ту Суз Ьеи Ча1 ьуз Азр туг
155 160 165 170
«с ссс даа сед дтд асд дтд Тед тдд аас Тса ддс дес стд асе аде 579
рЬе РГО 61 и РГО ча! тНг ча! Зег тгр А5П Зег 61 у А1а Ьеи ТНг Бег
175 1&0 185
ддс дтд сас асе ттс сед дет дтс ста сад Тсс Тса дда СТС Тас Тсс 627
61 у ЧаТ ΗΊ5 ТНг рКе Рго А1 а ча1 ьеи 61 п Зег Бег бТу Ьеи туг Бег
190 195 200
СТС аде аде дтд дтд асе дтд ссс тсс аде аде ТТд ддс асд аад асе 675
Ьеи Зег Зег ЧаТ ЧаТ тНг Ча1 Рго Зег Зег Бег Ьеи бТу ТНг Ьуз ТНг
205 210 215
тас асе Тде айс дТа дат сас аад ссс аде аас асе аад дтд дас аад 723
туг тНг Суз АЗП Ча! Азр Нт 5 Ьуз РГО Зег Азп тНг Ьуз Ча1 Азр ьуз
220 225 230
ада дтт дад ТСС ааа тат дат ссс сса Хде сса тса тде сса дса ссс 771
Агд ча1 61 и зег ьуз Туг сТу РГО РГО суз РГО зег суз РГО А1а РГО
235 240 245 250
дад ттс стд ддд еда сса тса дтс ттс ехд ттс ссс сса ааа ссс аад 819
61 и Рпе Ьеи бТу бТу Рго Зег Ча1 РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго ЬУ5
255 260 265
дас асТ СТС аТд атс Тсс едд асе сст дад дтс асд тде дтд дтд дтд 867
Аэр ТЬг ьеи Ме£ 11е Зег Агд ТНг Рго С1и Ча1 ТЬг суз ЧаТ ча! ЧаТ
270 275 280
дас дтд аде сад даа дас ссс дад дтс сад ТТС аас тдд Тас дтд дат 915
Азр Ча1 Зег 61 п 61 и А8Р РГО 61и Ча1 61п РНе АЗП тгр Туг ЧаТ Α5Ρ
285 290 295
ддс дтд дад дтд саТ аат дес аад аса аад сед едд дад дад сад ттс 963
61 у ча! 61 и Ча1 Н1з Азп А1а ьуз тНг ьуз Рго Агд 61 и 61 и 61 п РНе
300 305 310
аас аде асд Тас едт дтд дтс аде дтс схс асе дтс стд сас сад дас 1011
Азп зег тпг Туг Агд ча! Ча1 зег Ча1 Ьеи тНг Ча1 ьеи Н1 5 61 п Азр
315 320 325 330
тдд стд аас ддс аад дад Тас аад Тде аад дтс тсс аас ааа ддс СТС 1059
Тгр Ьеи АЗП 61 у ьуз С1и Туг ьуз Суз ьуз Ча1 зег Азп ьуз сТу Ьеи
335 340 345
сед Тсс тсс атс дад ааа асе атс тсс ааа дес ааа ддд сад ссс еда 1107
Рго Зег Зег 11 е 61 и Ьуз ТНг Не Зег ьуз А1а Ьуз б!у 61 η Рго Агд
350 355 360
дад сса сад дтд Тас асе стд ссс сса хсс сад дад дад атд асе аад 1155
61 и Рго 61 п ЧаТ туг тпг Ьеи Рго РГО 5ег 61 п 61 и 61 и мет тНг ьуз
365 370 375
аас сад дтс аде стд асе тде стд дтс ааа ддс ТТС тас ссс аде дас 1203
Азп С1п Ча1 Зег Ьеи Тпг Суз Ьеи ча1 ьуз бТу рНе Туг РГО Бег Азр
380 385 390
атс дес дтд дад тдд дад аде аат ддд сад сед дад аас аас тас аад 1251
11е А1а ЧаТ 61 и Тгр 61 и Зег Азп б1у 61 п Рго 61 и Азп А5П Туг ьуз
395 400 405 410
- 153 016245
асе асд сст Рго ссс дхд сХд дас АЗР Хсс дас ддс Хсс ххе хх с скс Хас аде £ег 1299
тпг ТпГ рго Уа1 415 ьеи 5ег Азр С1у 420 Бег Рпе Рпе Ьеи Туг 425
адд ста асе «3 дас аад аде адд Хдд сад дад ддд 61 у аах дхс ХХС тса 1347
Агд Ьеи ТЬг А5р ьуз 5ег Агд Тгр С1п 61 и Азп Уа1 Рпе 5ег
430 435 440
хде тсс ?я атд сат дад дет сХд сас аас сас кас аса сад аад аде 1395
су 5 5ег мет ΗΊ 5 61 и ΑΊ а Ьеи Нтз Азп нтз Туг ТНг 61 п ьуз 5ег
445 450 455
сХс Хсс сХд ХсТ кеи Бег ьеи Бег
460 сХд ддх ааа ХдаХаддаХс сдсддссдс
1_еи б1у ьуз
465
1435 <210> 176 <211> 465 <212> ΡΚΤ
<21: 1> 1 Юто Бар 1епз
<400> : 176
61 и ТНг Азр ТНг Ьеи ьеи Ьеи тгр Уа1 Ьеи кеи кеи тгр Уа! Рго 61 у
1 5 10 15
Бег тНг 61 у 61 п Уа1 61 п ьеи 61 п 61 и Бег 61 у РГО 61 у ьеи Уа1 ьуз
20 25 30
Рго Бег 61и ТНг ьеи Бег ьеи ТНг Суз тНг Уа1 Бег 61 у РНе Бег кеи
35 40 45
тНг А5П туг 61 у 11 е нтз Тгр 11 е Агд 61 п РГО Рго 61 у ьуз 61 у кеи
50 55 60
61 и тгр ьеи 61 у Уа1 11е тгр А1а Агд С1у РИе тНг АЗП туг АЗП Бег
65 70 75 80
А1а Ьеи мех Бег Агд кеи тНг 11 е Бег ЬУ5 Азр АЗП Бег ьуз АЗП 61 п
85 90 95
Уа1 Бег ьеи к,У5 кеи Бег Бег Уа! ТНг А1а А1а Азр ТНг А1а Уа1 туг
100 105 110
Туг суз А1 а Агд А1 а Азп Азр 61 у Уа1 туг туг А1а Мех Азр Туг тгр
115 120 125
61 у б1п 61 у ТНг Ьеи Уа1 т(тг Уа! Бег Бег А1а Бег тНг ьуз 61 у рго
130 13 5 140
Бег Уа1 рНе РГО Ьеи А1а РГО Суз Бег Агд Бег тНг Бег 61 и Бег тНг
145 150 155 160
А1а А1 а кои б!у Суз кеи Уа1 ьуз Азр Туг рНе Рго 61 и Рго Уа1 ТНг
165 170 175
- 154 016245
Уа1 Зег Тгр АЗП 180 Зег 61 у А1а Ьеи тЬг 185 Зег 61 у Уа1 нлз ткг 190 РЬе Рго
А1а уа1 ьеи 61 п Зег зег 61 у Ьеи туг Зег ьеи Зег 5ег Уа1 Уа1 тЬг
195 200 205
Уа1 рго 5ег 5ег Зег ьеи б1у тЬг Ьуз тЬг Туг тЬг Суз АЗП Уа! Авр
210 215 220
НЛЗ ьуз РГО Зег Азп тНг ЬУ5 Уа1 Азр ьуз Агд Уа1 61 и Зег ьуз туг
225 230 235 240
61 у Рго РГО Суз Рго Зег суз РГО А1а Рго 61 и РЬе ьеи 61 у 61 у Рго
245 250 255
Зег Уа1 рНе Ьеи РНе РГО РГО ьуз РГО ьуз Авр тЬг ьеи мет 11е Зег
260 265 270
лгд тпг Рго 61 и уа! тЬг суз Уа! Уа1 Уа1 АЗр уа! Зег 61 п 61 и АЗр
275 280 285
рго 61 и Уа1 61 п РЬе АЗП тгр туг Уа1 Аэр 61 у Уа! 61 и Уа1 НЛ5 А5П
290 295 300
А1а ьуз Ткг ьуз Рго Агд 61 и б!и 61 п РЬе Азп Зег ТЬг туг Агд Уа1
305 310 315 320
Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 ьеи нлз 61 п Азр тгр Ьеи Азп 61 у ьуз 61 и
325 330 335
туг ЬУЗ СУ5 ьуз Уа1 Зег А5П ьуз 61 у ьеи рго Зег зег 11 е 61 и ьуэ
340 345 350
тЬг 11е Зег ьуз А1а ьуз 61у 61 п Рго Агд 61 и Рго 61 п Уа1 туг тЬг
355 360 365
Ьеи Рго Рго Зег 61 п б1и 61и мет тНг ьуз АЗП 61 п Уа1 Зег ьеи тЬг
370 375 380
Суз Ьеи Уа! ьуз б!у РЬе Туг РГО зег Азр Не А1а Уа1 61 и тгр 61 и
385 390 395 400
Зег АЗП С1у 61 п РГО 61 и АЗП АЗП туг ьуз тЬг тЬг Рго Рго Уа1 Ьеи
405 410 415
Азр Зег Азр 61 у 5ег РЬе РЬе ьеи Туг Бег Агд Ьеи тЬг Уа! Азр ЬУ5
420 425 430
Зег Агд Тгр 61 п 61 и 61 у АЗП Уа1 РЬе Зег Суэ Зег Уа1 мет НЛ5 61 и
435 440 445
А1а Ьеи Н15 АЗП нлз туг тКг 61 п ьуз Зег Ьеи Зег ьеи Зег ьеи 61 у
- 155 016245
450 455 460 ьуз
465
<210> 177
<211> 744
<212> РИА
<213> ношо Заретпз
<220>
<221> 5с_Ееаьиге
<223> УЫО.Оо ИдКт сКалп
<220>
<221> СРЗ
<222> (22)..(720)
<400> 177
сгагсссдад аадсггссас с агд дад аса дас АЗр аса стс стд ста *дд тгр дта Уа1 10 51
МеТ 1 61 и ТКг тпг ьеи 5 ьеи ьеи
с*д стд стс *дд д** сса дд* Тсс асТ дда дас ттс дтд аТд асе сад 99
Ьеи Ьеи Ьеи Тгр Уа1 Рго С1у Зег ТНг 61у Азр РНе Уа1 мет ТНг 61 η
15 20 25
ТсТ сса дса ТТС стд аде дтд асе ссс ддс дад аад дтд асе атс асе 147
Зег РГО А1а РНе Ьеи Зег Уа1 ТНг Рго 61у 61 и ьуз Уа1 ТНг Не тНг
30 35 40
где аде дес саа Тса аде дтд аас Тас атт сас *дд тас сад сад аад 195
Суз Зег А1а 61 η 5ег Зег Уа1 А5П Туг 11е Η15 Тгр Туг 61 п 61 η ьуз
45 50 55
ссс дас сад дес ссс аад ааа **д ат с ТаТ дас аст ТСС аад стд дес 243
РГО Азр С1п А1а РГО ьуз ьуз Ьеи 11 е Туг Азр тНг Зег ьуз Ьеи А1а
60 65 70
аде ддс дтд ссс аде еде ТТС аде дд* аде ддс аде ддс асе дас тас 291
Зег 61 у Уа1 РГО Зег Агд РКе Зег 61 у Зег б1у зег 61у ТНг А5р Туг
75 80 85 90
асе ТТС асе атс аде аде стд дад дес дад дас дет дес асе тат тас 339
тНг РНе ТНг 11е 5ег Зег Ьеи б1и А1а 61 и Азр А1а А1а ТНг Туг туг
95 юо 105
где сад сад тдд асе аст аас сса стд асе ттс ддс сад ддс асе аад 387
суз 61 η С 3 η Тгр тНг тНг Азп РГО ьеи ТКг РКе 61 у 61 η 61 у тНг ьуз
110 115 120
дтс даа аге ааа еда аст 9*9 дет дса сса ТсТ д*с ТТС аТс ттс ссд 435
Уа1 61 и Не ьуз Агд ТНг УаТ А1а А1а Рго Зег Уа1 РНе Не РНе Рго
125 130 135
сса ТсТ дат: дад сад «9 ааа ТСТ дда аст дес ТСТ 9** д*д тде стд 483
РГО Зег Азр 61 и 61 η ьеи ьуз Зег 61у ТКг А1а зег Уа! Уа1 суз ьеи
140 145 150
стд аат аас ттс тат ссс ада дад дес ааа дта сад тдд аад дтд дат 531
Ьеи АЗП АдП РКе Туг Рго Агд 61 и А1а ьуз Уа1 61 η Тгр ьуз УаТ Азр
155 160 165 170
аас дес сгс саа Тед дд* аас Тсс сад дад адт 9*с аса дад сад дас 579
Азп А1а !_ и 61 η 5ег 61 у АЗП Зег 61 η 61 и Зег Уа1 тНг 61 и 61 η АЗр
175 180 185
- 156 016245
аде аад дас аде асс Хае Тбг Туг аде 5ег сте аде аде асс Тбг ехд асд ехд аде ааа
5ег ьуз Азр Бег 190 ьеи 5ег 195 Бег Ьеи тбг Ьеи 200 Бег ьуз
дса дас хае дад ааа сас ааа дьс 1ас дес хде даа дхс асс сах еад
А1а Азр Туг 61 и 1_У5 ΗΪ 5 ьуз Уа1 туг А1 а Суз 61 и Уа1 Тбг НТЗ бТп
205 210 215
ддс ехд аде Хед ссс д1с аса аад аде ТХс аас адд дда дад хдх
С1у Ьеи 5ег Бег РГО Уа1 тИг ьуз 5ег рбе Азп Агд 61 у 61 и суз
220 225 230
хдахаддахс сдсддссдса хадд
627
675
720
744
<210> 178
<211> 233
<212> РРТ
<213> 1 Ното Барет лз
<400> 178
МеХ 61 и тбг Азр тбг ьеи ьеи Ьеи Тгр νβΐ ьеи Ьеи ьеи тгр уа1 РГО
1 5 10 15
61у Бег Тбг 61 у Азр Рбе Уа1 мех Тбг 61л Бег РГО А1а Рбе Ьеи Бег
20 25 30
Уа1 тбг Рго 61 у 61 и ьуз Уа1 Тбг 11 е Тбг суз Бег А1а 61 п Бег Бег
35 40 45
уа1 АЗП Туг 11е НТЗ тгр Туг 61 η 61 п ьуз Рго Азр 61 п А1а Рго ьуз
50 55 60
Ьуз ьеи 11 е туг Азр Тбг Бег ьуз Ьеи А1а Бег 61 у Уа1 Рго Бег Агд
65 70 75 80
Рбе Бег 61 у Бег 61 у Бег 61у Тбг Азр Туг Тбг Рбе Тбг Не Бег Бег
85 90 95
ьеи 61 и А1 а 61и А5р А1а А1а Тбг туг Туг СУ5 61 п 61 п тгр тбг тбг
100 105 110
АЗП Рго Ьеи тбг Рбе 61 у 61 η 61 у Тбг ьуз Уа1 61 и 11 е ьуз Агд Тбг
115 120 125
уа1 А1 а А1 а РГО Бег Уа1 Рбе Пе Рбе Рго РГО Бег Авр 61 и 61 п Ьеи
130 135 140
ьуз Бег 61 у тбг А1а Бег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп АЗП Рбе туг РГО
145 150 155 160
Агд 61 и А1 а ьуз Уа1 61п Тгр Ьуз Уа1 Азр АЗП А1а Ьеи 61 п Бег 61 у
165 170 175
Азп Бег С1 η 61 и Бег уа! тбг 61 и 61 л Азр Бег ьуз Азр Бег Тбг Туг
180 185 190
- 157 016245
зег ьеи Зег Бег ТЬг ьеи тКг ьеи зег ьуз А1а Азр Туг 61 и Ьуз ΗΪ5
195 200 205
ЬУ5 Уа1 Туг А1а суз 61 и уа1 ТНг ΗΪ5 61 п С1у ьеи Зег 5ег Рго Уа1
210 215 220
тКг 225 1-У5 Бег рЬе Азп 1зг8 61 у 61 и СУ5
<210> 179 <211> 1460 <212> ОНА <213> Ното Зартепз <22О>
<221> т15с_Теагиге <223> Η2206-νκ14 1дб1 неауу сНа1п (ΟΑΝ5); Ρ03ΐΤίοη5 -24 ΐο -5 15 ТНе
1еа0ег зеяиепсе; Ρθ3ΐΐιοη -4 ΐο -1 аге ехтга апппо ас1с15; ΡΑΝ5 ат Р051Т1ОП6 -4 То -1 15 ргеТегаЫу беТетеб <220>
<221> СРВ <222> (22)..(1440) <220>
<221> глат_рерТ1с1е <222> (94)..(1440) <400> 179
асаддссадс сссдадссас с асд мег дад аса дас аса стс стд ьеи ста Тдд дса Уа1 -15 51
61 и тпг Азр тпг -20 ьеи Ьеи тгр
стд сед СТС тдд дтт сса 99ΐ ССС асе дда б1у дас дед аат Тса сад 99
ьеи Ьеи ьеи тгр уа1 Рго 61у Бег тНг Азр А1а Азп зег 61 п
-10 -5 -1 1
сад ссд сад дад Тса ддс 61у еес ддс 61 у сед дед уа1 аад ссс аде дад асе сед 147
б!п ьеи 61 п 61 и Зег РГО ьеи Ьуз Рго Зег 61 и ТНг Ьеи
5 10 15
аде сид асе ТдТ асе дес есс дда 61у ССС аде тта асе аас тат ддс аСс 195
Зег Ьеи тНг Суз тНг Уа1 Бег РКе Бег Ьеи тНг АЗП Туг сТу Не
20 25 30
сас хдд аТа сде сад ССС сса ддс сТу аад ддс б1у стд дад Ϊ99 стд ддс С1у 50 243
ΗΊ3 35 тгр 11е Агд 61 п РГО 40 Рго ьуз Ьеи 45 61 и тгр Ьеи
аТа гдд дет сде ддс б1у 55 ССС аса аас СаС аас аде дес стс асд Ссс сдс 291
Не тгр А1а Агд РНе ТЬг АЗП Туг Азп 60 Зег А1а Ьеи мет 5ег 65 Агд
асе аТ с аде аад дас аас аде аад аас сад аде стд аад стд 339
ТЬг 11е 5ег 70 ьуз А5Р А5П Бег Су$ 75 азп 61 п Зег Ьеи 80 Ьуз Ьеи
аде аде дтд уа! 85 асе дес дед дас асе дес тас Сас тде дес ада дсс 387
Бег Бег тКг А1а А1а Азр тЬг 90 А1а Туг туг су5 95 А1а Агд А1а
аас дас ддд дтс тас саг дес асд дас сас тдд ддс 61у сад дда 61у асе стд 435
АЗП Азр 61у Уа! Туг Туг А1а Мес А5Р Туг Тгр 61 п тЬг ьеи
- 158 016245
100 105 110
дхс асе дхс аде Хса дед хсд асе аад ддс сса есд дес ххе ССС схд 483
Уа1 тНг Уа1 Бег зег А1а Бег ТЬг ьуз бТу РГО Бег Уа1 РНе Рго ьеи
115 120 125 130
дса ССС хсс Хее аад аде асе хсх ддд ддс аса дед дес схд дде где 531
А1а РГО Бег Бег ьуз Бег ТЬг Бег бТу 61у тНг А1а А1а Ьеи 61 у Суз
135 140 145
схд дхе аад дас Хае ххе ССС даа сед дхд асд дед еса едд аас хса 579
ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго 61 и Рго уа! тНг Уа1 Бег тгр Азп Бег
150 155 160
ддс 9« схд асе аде ддс дхд сас асе ххе сед дсх дес сха сад Хсс 627
61 у А1а ьеи ТНг Бег 61У Уа! нтз ТЬг рЬе Рго А1а Уа! ьеи 61 п Бег
165 170 175
Хса Бег дда бТу 180 схс ьеи хае туг Хсс Бег схс ьеи аде Бег 185 аде Бег 8? Й? асе ТНг дхд Уа1 190 ссс Рго хсс Бег аде Бег аде Бег 675
ххд дос асе сад асе хае ах с хде аас дхд аах сас аад ссс аде аас 723
ьеи С1у ТЬг 61 η ТЬг Туг 11 е суз Азп Уа! Азп НТЗ ьуз Рго Бег Азп
195 200 205 210
асе аад дед дас аад ааа дхх дад ссс ааа хсх хдх дас ааа асх сас 771
ТЬг ьуз Уа1 Азр ьуз ьуз уа! 61 и РГО ьуз Бег суз Азр ьуз тНг нтз
215 220 225
аса хде сса сед хде сса дса ссх даа схс схд 999 99а сед хса дес 819
ТНг суз Рго Рго суз РГО А1а РГО б!и ьеи Ьеи 61у бТу Рго Бег Уа!
230 235 240
«с схс ххе ССС сса ааа ССС аад дас асе схс агд аге ХСС едд асе 867
РЬе Ьеи рЬе 245 РГО Рго ьу® Рго Й5 Азр ТНг Ьеи мех Не 255 Бег Агд ТЫ
ссх Рго дад 61 и 260 дес уа1 аса ТЬг Хде суз δ? И 265 И дас Азр аде Бег сас Н13 270 даа 61 и дас Азр ссх рго дад 61 и 915
дхс аад ххе аас едд хае 9*9 дас 9дс дед дад дед сае аас дес аад 963
Уа1 Ьуз РЬе Азп тгр туг Уа! Азр 61у Уа! 61 и Уа! нтз Азп А1а Ьуз
275 280 285 290
аса аад сед едд дад дад сад хае аас аде асд хае еде де? дхс аде 1011
тЬг ьуз РГО Агд 61 и 295 61 и 61 п туг Азп Бег 300 ТНг туг Агд Уа! уа1 305 Бег
дСс сте асе дхс схд сас сад дас хдд схд аах ддс аад дад хае аад 1059
ναΐ Ьеи тНг Уа1 Ьеи Н1 5 61 п АЗр тгр ьеи АЗП 61 у ьуз 61 и Туг ьуз
310 315 320
Ьдс аад дес хсс аас ааа дес схс сса дес ссс аХс дад ааа асе асе 1107
Суз Ьуз Уа1 325 Бег Азп Ьуз А1а Ьеи 330 Рго А1а Рго 11 е 61 и 335 ьуз ТНг Не
хсс ааа дес ааа 999 сад ССС еда даа сса сад дед Хае асе сед ссс 1155
Бег ьуз 340 А1а ьуз бТу 61 п РГО 345 Агд 61 и РГО 61 п Уа1 350 Туг ТНг Ьеи Рго
сса Хее едд дах дад схд асе аад аас сад дхс аде схд асе еде сед 1203
Рго Бег Агд Азр 61 и Ьеи ТЬг ЬУ5 Азп 61 п Уа1 Бег ьеи ТНг суз Ьеи
355 360 365 370
дхс ааа ддс ххе хае ССС аде дас аге дес дхд дад едд дад аде аах 1251
Уа1 ьуз 61у РЬе туг рго Бег Азр 11е А1а Уа! 61 и тгр 61 и Бег Азп
375 380 385
- 159 016245
999 61у сад 61 η ссд дад аас аас Тас аад асе асд ссх ссс дтд стд дас А$р тсс Бег 1299
РГО 61 и А5П А5П 390 Туг ЬУБ ТЬг 395 ТНг Рго Рго уа1 ьеи 400
дас ддс Тсс ТТС ХХс СТС Тас аде аад СГС асе 8? дас аад аде адд 1347
АЗр б'у Бег 405 РЬе РНе Ьеи туг Бег 410 ЬУ5 ьеи тЬг А5р 415 ьуз Бег Агд
тдд сад сад ддд бТу аас дтс ТТС тса тде ХСС дтд Уа1 аХд саХ дад дет стд 1395
Тгр б1п 61 η А5П Уа1 РЬе Бег Суз Зег мех ΗΊ5 61 и А1а ьеи
420 425 430
сас аас сас Тас асд сад аад аде стс тсс стд хсх ссд дат 61 у ааа 1440
н!б АБП Н1 5 туг тНг 61 η ЬУБ Бег ьеи Зег ьеи зег РГО ЬУ5
435 440 445
тдатаадсдд ссдсттссст
1460 <210* 180 <211> 473 <212> РКТ <213> ното БартепБ <400> 180
мет 61 и ТНг Азр ТЬг ьеи ьеи ьеи тгр Уа! Ьеи Ьеи Ьеи тгр Уа! -10 РГО
-20 -15
61 у Бег ТКг 61 у АБр а! а А5П Бег 61 η Уа! 61 п ьеи 61 η 61 и зег 61 у
-5 -1 1 5
рго 61 у ьеи Уа1 Ьуз Рго Бег 61 и тЬг ьеи Бег Ьеи ТЬг Суэ ТНг Уа1
15 20
Бег С1у РЬе Бег ьеи ТКг азп Туг С1у Не Нтз Тгр 11е Агд 61η Рго 25 30 3540
Рго б!у ьуз б!у ьеи б!и Тгр ьеи б1у Уа1 11е Тгр А1а Агд б1у РЬе 45 5055
ТЬг АЗП туг АБП 60 Бег А! а Ьеи мех Бег 65 Агд Уа1 ТЬг И е Бег 70 ЬУ5 Азр
Абп зег ьув АЗП 61 п Уа! Бег ьеи ьуз ьеи Бег Бег Уа1 ТЬг а! а а! а
80 85
А$р тЬг А1а νβΊ туг Туг суб А1а Агд А1а Абп Азр б!у уа! туг туг 90 95100
А1а мет А5р туг тгр 61у οί п 61 у тЬг ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег 5ег л!а
105 110 115 120
Бег тЬг ьуз 61 у РГО зег Уа1 РЬе Рго ьеи А1а рго Бег Зег ьуз зег
125 130 135
ТЬг Бег 61 у 61 у 140 ТЬг А1а А1а Ьеи 61 у 145 суз ьеи уа! Ьуз туг РКе
- 160 016245
рго 61 и Рго Уа1 тНг Уа1 5ег тгр 160 АЗП Бег 61у А1а хеи 165 тЬг Бег 61 у
155
Уа1 Ηί 5 ТЬг РНе РГО А1а Уа1 Хеи 61 п Бег Бег 61 у 180 Хеи туг Бег хеи
170 175
Бег Бег уа! уа! ТНг Уа1 Рго Бег Бег Бег хеи 61у тЬг б!п тЬг Туг 200
185 190 195
Не суз А5П Уа1 А5П НТ 5 1_у5 Рго Зег Азп ТНг Хуз Уа1 Азр хуз хуз
205 210 215
νβΐ 61 и Рго хуз Бег суз А5р Хуз ТНг НТ 5 ТНг суз Рго РГО суз РГО
220 225 230
А1а РГО 61 и Ьеи Хеи 61 у 61 у РГО зег Уа1 рЬе хеи рЬе РГО РГО хуз
235 240 245
Рго хуз АЗР ТНг Хеи мех Не Бег Агд тКг РГО 61 и уа1 тЬг суз Уа1
250 255 260
уа1 Уа1 Азр ν9Ί Бег Нтз 61 и Азр Рго 61 и Уа1 Хуз РЬе АЗП тгр туг 280
265 270 275
Уа1 дзр 61 у уа! 61 и 285 Уа1 НТ 5 Азп А1а Хуз 290 ТЬг хуз РГО Агд 61 и 295 61 и
61 п Туг АЗП 5ег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Бег Уа1 ьеи тЬг Уа1 хеи Нт 5
300 305 310
61 η Азр ьеи АЗП 61 у ьуз 61 и 320 Туг хуз Суз Хуз Уа1 325 Бег Азп хуз
А1а хеи Рго дПа РГО Не 61 и ХУ® тЬг 11 е Бег хуз А1а Хуз С1у 61 п
330 335 340
Рго Агд С1и Рго б1п Уа1 туг ТЬг Хеи Рго Рго Бег Агд АЗр 61 и Хеи
345 350 355 360
тЬг Хуз АЗП 61П Уа1 Бег Хеи тЬг Суз Хеи Уа1 хуз 61 у РЬе Туг Рго
365 370 375
Бег АЗр 11е А1а 390 Уа1 61 и тгр 61 и зег 385 АЗП 61 у 61 п Рго 61 и 390 Азп Азп
Туг хуз ТНг 395 ТКг Рго Рго Уа1 ьеи 400 АЗр Бег АБр 61 у Бег 405 РЬе РЬе Хеи
Туг Бег хуз ьеи ТНг Уа1 Азр хуз Бег Агд Тгр 61 п 61 п 61 у А5П Уа1
410 415 420
- 161 016245
РЬе Зег Суз 5ег уа! мег Н?5 61 и А1а Ьеи ΗΊ5 А5П НТ 5 Туг ТЬг 61 п
425 430 435 440
Ьуз Зег ьеи &ег ьеи зег РГО 61 у ьуз
445
<210> 181
<211> 469
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ
<223> ЬУН14.0 1дС1 Неауу сЬатп [ΡΑΝΒ-ΡθΙθΐθίΙ]
<400> 181
мет 61 и тНг АЗР тЬг ьеи ьеи ьеи тгр Уа! ьеи ьеи ьеи тгр Уа1 рго
1 5 10 15
61у Зег ТЬг 61 у 61 п Уа1 61 η Ьеи 61 п 61 и зег 61 у Рго 61 у Ьеи Уа1
20 25 30
ьуз РГО зег 61 и ТЬг Ьеи Зег ьеи ТЬг суз тЬг Уа1 Зег 61 у РЬе 5ег
35 40 45
Ьеи ТЬг АЗП туг 61 у Не Нтз тгр Не Агд 61 п Рго РГО 61 у ьуз 61 у
50 55 60
ьеи 61 и тгр ьеи 61 у уа! 11 е тгр А1а Агд 61 у РЬе тЬг А5П туг А5П
65 70 75 80
Зег А1а ьеи мет Зег 85 Агд уа1 тЬг 11 е Зег 90 ьуз Азр А5П 5ег ьуз 95 АЗП
61 η Уа1 Зег ьеи Ьуз ьеи Зег зег Уа1 ТЬг А1а А1а АЗр тЬг А1а Уа1
100 105 но
Туг Туг суз 115 А1 а Агд А1а Азп А£р 120 61 у Уа1 туг туг А1а 125 мет АЗр туг
Тгр 61у 61 η 61 у ТЬг Ьеи Уа1 тпг Уа1 Зег Зег А1а Зег тЬг ьуз 61у
130 13 5 140
Рго Зег Уа1 рНе Рго Ьеи А1 а Ргр Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег 61 у 61 у
145 150 155 160
Тпг А1а А1а Ьеи 61 у суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго 61 и Рго Уа1
165 170 175
тЬг уа! зег тгр АЗП зег 61 у А1а ьеи ТЬг зег 61 у Уа1 Нтз ТЬг РЬе
180 185 190
- 162 016245
Рго А1а Уа1 195 ьёи 61 η Зег Зег 61 у 200 Ьеи Туг 5ег ьеи зег 205 зег Уа1 Уа1
ТНг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи 61у ТНг 61 п ТНг туг Не суз Азп Уа1
210 215 220
АЗП нтз ьуз Рго Зег АЗП ТНг Ьуз Уа1 Аэр ьуз Ьуз уа1 61 и Рго ьуз
225 230 235 240
5ег Суз Азр ьуз тНг 245 нтз тНг Суз Рго Рго 250 суз РГО А1а Рго 61 и 255 ьеи
Ьеи 61 у 61 у Рго Зег уа1 рНе Ьеи рНе РГО Рго Ьуз Рго ьуз Азр ТНг
260 265 270
ьеи мех 11е зег Агд ТНг РГО 61 и Уа1 ТНг Суз Уа! Уа1 Уа! Азр Уа1
275 280 285
Зег Нт 5 С1и Азр РГО 61 и Уа1 ЬУ5 РНе АЗП тгр Туг Уа1 Азр 61 у Уа1
290 295 300
01 и Уа1 нт 5 АЗП А1а Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд 61 и 61 и 61п Туг АЗП Зег
305 310 315 320
тНг Туг Агд Уа1 уа! Зег Уа1 Ьеи ТНг Уа1 Ьеи НТ 5 61 п Азр Тгр Ьеи
325 330 335
Азп 61 у Ьуз 61 и туг ьуз суз ьуз Уа1 зег А5П ьуз А1а ьеи рго А1а
340 345 350
Рго 11 е С1 и ьуз ТНг Не Зег ьуз А1а ьуз 61 у 61 п РГО Агд 61 и Рго
355 360 365
61 п Уа1 туг тНг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр 61 и Ьеи ТНг ьуз А5П 61 п
370 375 380
Уа1 5ег Ьеи тНг Суз ьеи Уа1 ьуз 61 у РНе Туг Рго Зег Азр Не А1а
385 390 395 400
Уа1 61 и т гр 61 и Зег Азп 61 у 61 п Рго 61 и Азп А5П Туг ьуз ТНг ТНг
405 410 415
Рго Рго ντί Ьеи Азр Зег Азр 61 у Зег РНе РНе Ьеи туг 5ег ьуз Ьеи
420 425 430
тНг Уа! Азр ьуз Зег Агд Тгр 61 п 61 п 61 у АЗП Уа! РНе Зег суз Зег
435 440 445
Уа1 Мех пт з 61 и А1а ьеи Нтз А5П Н1 5 Туг тНг 61 п Ьуз Зег Ьеи Зег
450 455 460
Ьеи Зег Рго С1у ьуз
- 163 016245
465 <210> 182 <211> 469 <212> РКТ <213> Ното заретпэ <220> ' <221> М15С_РЕАТиКЕ <223> ΗνΗ12.0 1дб1 Ηββνγ сЬатп [РА№-0е1егеР] <400> 182
мес 1 61 и тЬг· Азр тЬг Ьеи ьеи ьеи Тгр Уа! 10 ьеи ьеи ьеи тгр Уа1 15 РГО
С1у зег тЬг 61 у 20 61 η уа! 61 п ьеи 61 п 25 61 и зег С1у Рго 61у 30 ьеи Уа1
ЬУБ РГО зег 61 и тЬг ьеи Зег ьеи тЬг суз тЬг Уа1 Зег 61у РЬе 5ег
35 40 45
ьеи тНг 50 АЗП Туг 61у 11е Ηί 5 55 Тгр 11е Агд 61 п РГО 60 РГО 61у ьуз 61 у
ьеи <51 и Тгр Ьеи С1у уа1 11е тгр А1а Агд 61 у рНе тЬг АЗП туг АЗП
65 70 75 80
5ег А1а Ьеи меь Зег 85 Агд ьеи тЬг Не зег 90 ьуз Азр АЗП Зег ьуз 95 А5П
<51 η Уа! 5ег Ьеи ьуз ьеи Зег 5ег Уа! ТЬг А1а А1а Азр тЬг А1а уа1
100 105 110
туг туг Суз 115 А1а Агд А1а АЗП АЗр 120 <51у Уа! Туг туг А1а 125 Мес АЗР туг
тгр <51 у 130 61 η 61 у ТЬг ьеи Уа1 135 ТЬг Уа1 5ег зег А1а 140 5ег тИг Ьуз 61 у
Рго 5ег уа! РЬе РГО ьеи А1а РГО зег зег Ьу5 Зег тЬг Зег С1у 61 у
145 150 155 160
тЬг А1а А1а ьеи б!у 165 суз ьеи уа! ьуз А5О 170 Туг РЬе РГО 61 и РГО 175 уа!
ТЬг Уа1 Зег тгр 180 АЗП зег С1у А1а ьеи 185 ТЬг зег 61 у Уа1 Нтз 190 ТЬг РЬе
РГО А1а Уа1 195 Ьеи С1п 5ег зег 61 у 200 ьеи Туг зег ьеи зег 205 Зег уа! уа!
ТИг Уа! Рго 5ег 5ег 5ег ьеи 61 у тЬг 61 п тЬг 11 е Суз Азп уа!
210 215
- 164 016245
Азп ΗΪ 5 ьуз Рго Бег А5П тНг ьуз уа! АЗр ьуз ьуз Уа! 61 и Рго Ьуз
225 230 235 240
Бег Су5 А5Р ьуз ТЬг 245 нтз ТЬг Суз Рго Рго 250 СУБ Рго А1а РГО 61 и 255 Ьеи
Ьеи 61 у 61у РГО 260 Бег Уа1 РЬе Ьеи РЬе 265 Рго Рго ьуз Рго ьуз 270 А5р ТНг
ьеи Нет 11 е 275 Бег Агд тЬг Рго 61 и 280 Уа1 тЬг Суз Уа1 Уа1 285 Уа1 Азр Уа!
Бег Нтз 290 61и АЗр Рго 61 и Уа1 295 ьуз РЬе Азп Тгр Туг 300 Уа1 Азр 61 у Уа1
61 и уа1 Нтз АЗП А1а ЬУЗ ТЬг Ьуз Рго Агд б1и 61 и 61 п Туг Азп Бег
305 310 315 320
ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 325 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 330 Ьеи Нтз 61 л Азр тгр 335 ьеи
Азп 61 у Ьуз 61 и 340 Туг ьуз Суз Ьуз Уа1 345 Бег Азп Ьуз А1а Ьеи 350 Рго А1а
РГО 11е 61 и ьуз тЬг 11 е Бег ьуз А1а ьуз 61у 61 п РГО Агд 61 и РГО
355 360 365
61 η уа! Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Бег Агд Азр 61и ьеи тЬг ьуз АЗП 61 л
370 375 380
Уа1 Бег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз 61 у РЬе Туг Рго Бег Азр 11 е А1а
385 390 395 400
Уа! 61 и Тгр 61и Бег АЗП 61 у 61л РГО 61 и АЗЛ А5П туг ьуз ТЬг ТЬг
405 410 415
Рго Рго Уа1 ьеи 420 Азр Бег Азр 61 у Бег 425 РЬе РЬе Ьеи Туг Зег 430 ьуз ьеи
ТЬг Уа1 Азр 435 ьуз Бег Агд Тгр 61л 440 61л 61 у АЗП Уа1 РЬе 445 Бег Суз Бег
уа! мет нтз 61 и А1а ьеи нтз АЗП Нтз Туг тЬг 61 п Ьуз Бег ьеи Бег
450 455 460
Ьеи Бег Рго 61у Ьуз
465 <210> 183 <211> 24 <212> РКТ
- 165 016245
<213> Ното зарлепз
<400> 183
Нл5 азп зег зег 5ег тгр туг С1у Агд луг ₽Ье Азр туг тгр 61у 61п
1 5 10 15
61у тЬг ьеи Уа! тЬг Уа! Зег зег <210> 184 <211> 19 <212> РКТ <213> Ното зарлепз <400> 184 б!и б!и С1у Азп ТЬг ьеи Рго Тгр ТЬг РЬе 61у 61п б1у тЬг ьуз Уа! 15 10 15
6!и 11е ьуз <210> 185 <211> 119 <212> РКТ <213> АгННсла! зечиепсе <22О>
<223> Китагпгей УН гедлоп <220>
<221> νΑΚΙΑΝΤ <222> (30)..(30)
<223> хаа аг розлтлоп 30 сап Ье тЬг ОГ 11 е
<220>
<221> νΑΚΙΑΝΤ
<222> (31)..(31)
<223> хаа аь розльлоп 31 сап Ье АЗП ог Зег
<22О>
<221> νΑΚΙΑΝΤ
<222> (37)..(37)
<223=- хаа ат розилоп 37 сап Ье уа! ог Не
<22О>
<221> νΑΚΙΑΝΤ
<222> (48)..(48)
<223> Хаа ат розлТлоп 48 сап Ье Ьеи ог Не
<220>
<221> νΑΚΙΑΝΤ
<222> (67)..(67)
<223> Хаа ат розл'Ьлоп 67 сап Ье Уа1 ог Ьеи
<220>
<221> νΑΚΙΑΝΤ
<222> (71)..(71)
<223> хаа а! розлТлоп 71 сап Ье ьуз ог Уа1
<220>
<221> νΑΚΙΑΝΤ
<222> (73)..(73)
<223> хаа ат розл'Ноп 73 сап Ье АЗП ог тЬг
166 016245 <22О>
<221> ΫΑΚΙΑΝΤ <222> (78)..(78) <223> Хаа аг розтттоп 78 сап Ье Уа1 ог Рке <220>
<221> ΫΑΚΙΑΝΤ <222> (94)..(94) <223> Хаа ат ροετΐίοη 94 сап Ье РКе ог Туг <400> 185
61 п Уа! 61 η ьеи 61 η 61 и Зег 61 у Рго 61У ьеи уа1 ьуз Рго Зег б*1и
1 5 10 15
тЬг ьеи Зег ьеи тЬг Суз ТНг Уа1 Зег 61 у РНе зег Ьеи Хаа хаа туг
20 25 30
61 у Т1е Н13 35 тгр хаа Агд 61 η РГО 40 Рго 61 у ьуз 61 у ьеи 45 61 и Тгр Хаа
61 у Уа1 50 11 е тгр А1а Агд 61 у 55 рКе тЬг АЗП туг АЗП 60 5ег А1а Ьеи мег
Зег Агд хаа тКг 11 е 5ег хаа Азр хаа 5ег ьу$ АЗП 61 п хаа Зег ьеи
65 70 75 80
ьуз Ьеи Зег зег уа1 ТКг А1а А1а Азр тКг А1а Уа1 Туг Хаа Суз А1а
85 90 95
Агд А1а АЗЛ Азр 100 61у Уа1 Туг Туг А1а 105 мет Абр туг тгр 61 у 110 61 η С1у
ТКг Ьеи уа! тКг Уа! 5ег Зег
115 <210> 186 <211> 106 <212> РКТ <213> ΑηΉιοίβΙ зедиепсе <220>
<223> Ьитаптгеб УЬ гедтоп <22О> <221> ΫΑΚΙΑΝΤ <222> (1)..(1) .
<22 3> Хаа ат розттпоп 1 сап Ье 61п ог А5р
<220>
<221> ΫΑΚΙΑΝΤ
<222> (2)..(2)
<22 3> хаа ат розттюп 2 сап Ье РЬе ОГ Уа!
<220>
<221> ΫΑΚΙΑΝΤ
<222> (4).. (4)
<223> хаа ат розиюп 4 сап Ье Ьеи ог мег
<22О>
<221> ΫΑΚΙΑΝΤ
<222> (45)..(45)
- 167 016245
<223> хаа аг’ро51Т1оп 48 сап Ье ЬУ5 ОГ ьеи
<220>
<221> νΑΚΙΑΝΤ
<222> (4 6)..(46)
<223> Хаа аг ροδίΐίοη 46 сап Ье тгр ОГ ьеи
<220>
<221> ΫΑΚΙΑΝΤ
<222> (48)..(48)
<223> Хаа ак ροδίΐίοη 48 сап Ье Туг ОГ ьуз
<220>
<221> νΑΚΙΑΝΤ
<222> (70)..(70)
<223> Хаа аг розтТтоп 70 сап Ье туг ОГ РЬе
<400> 186
Хаа Хаа УсЛ Хаа ТЬг 61 п бег Рго А1а РЬе ьеи 10 бег Уа1 тЬг РГО 15 61 у
1 . 5
61 и 1У5 Уа1 тЬг 11 е ТЬг суз бег А1а Азп бег бег Уа1 Азп Туг 11е
20 25 30
ΗΊ5 Тгр ТУГ 35 61 п 61 п ьуз Рго Азр 40 61 п А1а Рго ьуз хаа 45 хаа 11е хаа
АЗр тНг бег ьуз Ьеи А1а 5ег 61 у Уа1 Рго бег Агд РЬе бег 61 у бег
50 55 60
61у $ег 6-1 у тЬг А5р Хаа ТЬг РЬе ТЬг 11 е бег бег ьеи 61 и А1а 61 и
65 70 75 80
Азр А1а А1а тЬг туг туг Суз 61 п 61 п тгр ТЬг тЬг Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе 61 у С1 п 61 у ТЬг ьуз Уа1 61 и 11 е ьуз
100 105
- 168 -

Claims (78)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Гуманизированное антитело к интегрину α2, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую следующие последовательности аминокислот:
    (a) Η0ΌΚ2 (νΐνΛΚΟΕΤΝΥΝδΛΕΜδ, δΕβ ΙΌ N0: 2); или (b) ПСОН1 (ΟΕδΕΤΝΥΟΙΗ, δΕΟ ΙΌ N0: 1), ПСЕН2 (νΐνΛΚΟΕΤΝΥΝδΆΕΜδ, δΕΟ ΙΌ N0: 2) и Η0ΌΚ3 (ΆΝΏΟνΥΥΆΜΌΥ, δΕΟ ΙΌ N0: 3); или (c) последовательность вариабельной области тяжелой цепи δΕΟ Ш N0: 185.
  2. 2. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по п.1, в котором вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот δΕΟ ΙΌ N0: 40.
  3. 3. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по п.2, в котором вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот δΕΟ ΙΌ N0: 40, в которой:
    (a) в положении 71 находится Бук; и/или (b) в положении 73 находится Аки; и/или (c) в положении 78 находится Уа1.
  4. 4. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по п.1, в котором вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот, выбранную из δΕΟ ΙΌ N0: 70-79 и δΕΟ ΙΌ N0: 109-111.
  5. 5. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по п.1, которое содержит участок Е\У4. включающий последовательность аминокислот νΟβΟΤΕντνδδ (δΕΟ ΙΌ N0: 13).
  6. 6. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по п.5, которое содержит последовательность аминокислот ΗΟΌΚΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 1), Η0ΌΚ2 (δΕΟ ΙΌ N0: 2) и Η0ΌΚ3 (δΕΟ ΙΌ N0: 3).
  7. 7. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по любому из пп.1-6, которое также содержит легкую цепь.
  8. 8. Гуманизированное антитело к интегрину α2, которое содержит вариабельную область легкой цепи, включающую следующие последовательности аминокислот:
    (a) ЬСОКТ, выбранную из δΑΝδδνΝΥΙΗ (δΕΟ ΙΌ N0: 4) или δΑΟδδΥΧΥΙΗ (δΕΟ Ш N0: 112);
    (b) ЕСЕН2 (ΌΤδΚΌΑδ; δΕΟ ΙΌ N0: 5);
    (c) ЬСОКЗ (ββνΤΤΝΡΕΤ, δΕΟ Ш N0: 6).
  9. 9. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по п.8, в котором вариабельная область легкой цепи содержит последовательность аминокислот δΕΟ ΙΌ N0: 186.
  10. 10. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по п.9, в котором вариабельная область легкой цепи содержит последовательность аминокислот δΕΟ ΙΌ N0: 186, в которой:
    (a) в положении 2 находится Р11с; и/или (b) в положении 45 находится Ьук; и/или (c) в положении 48 находится Τ\τ.
  11. 11. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по п.8, в котором вариабельная область легкой цепи содержит последовательность аминокислот, выбранную из δΕΟ ΙΌ N0: 41, δΕΟ ΙΌ N0 : 80-92 и δΕΟ ΙΌ N0: 108.
  12. 12. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по п.8, которое содержит участок Е\У4, включающий последовательность аминокислот ΕΟΟΟΤΚΥΕΙΚ из δΕΟ ΙΌ N0: 38.
  13. 13. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по п.12, которое содержит последовательность аминокислот ЬСОКТ (δΕΟ ΙΌ N0: 4), 1,С1)Н2 (δΕΟ ΙΌ N0: 5) и ЬСОКЗ (δΕΟ ΙΌ N0: 6).
  14. 14. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по любому из пп.8-13, которое также содержит тяжелую цепь.
  15. 15. Гуманизированное антитело к интегрину α2, которое содержит:
    (ί) вариабельную область тяжелой цепи, включающую следующие последовательности аминокислот:
    (a) ΗΕ'ΌΡ2 (νΙνΑΚΟΕΤΝΥΝδΑΌΜδ, δΕΟ ΙΌ N0: 2), или (b) ПСОН1 (ΟΕδΕΤΝΥΟΙΗ, δΕΟ Ш N0: 1), 11С1Ж2 (\Ί\\'ΑΗΟιΕΤΧΥ’ΧδΑΙ ΑΙδ, δΕΟ ΙΌ N0: 2) и ^ΌΚ3 (ΑΝΌΟνΥΥΑΜΌΥ, δΕΟ ΙΌ N0: 3), или (c) последовательность вариабельной области тяжелой цепи δΕΟ Ш N0: 185;
    (й) вариабельную область легкой цепи, включающую следующие последовательности аминокислот:
    (a) ЬСОКТ, выбранную из δΑΝδδνΝΥΙΗ (δΕΟ ΙΌ N0: 4) или δΑΟδδΥΧΥΙΗ (δΕΟ ΙΌ N0: 112), (b) НСНН2 (ΌΤδΚΌΑδ; δΕΟ ΙΌ N0: 5) и (c) ЬСОКЗ (ββνΤΤΝΡΕΤ, δΕΟ Ш N0: 6).
  16. 16. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по п.15, в котором:
    (a) вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот δΕΟ ΙΌ N0: 40;
    (b) вариабельная область легкой цепи содержит последовательность аминокислот δΕΟ ΙΌ N0: 186.
  17. 17. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по пп.15, 16, в котором:
    (ί) вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот δΕΟ ΙΌ N0: 185,
    - 169 016245 в которой:
    (a) в положении 71 находится Ьух. и/или (b) в положении 73 находится Ахи, и/или (c) в положении 78 находится Уа1; и/или (ίί) вариабельная область легкой цепи содержит последовательность аминокислот БЕР ГО N0: 186, в которой:
    (a) в положении 2 находится Р11С. и/или (b) в положении 45 находится Ьух. и/или (c) в положении 48 находится Туг.
  18. 18. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по пп.15, 16. в котором:
    (a) вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот. выбранную из БЕр ГО N0: 70-79 и 8Ер ГО N0: 109-111; и (b) вариабельная область легкой цепи содержит последовательность аминокислот. выбранную из БЕр ГО N0: 41. БЕр ГО N0: 80-92 и 8Ер ГО N0: 108.
  19. 19. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по любому из пп.1. 8 или 15. которое распознает Ι-домен интегрина-а2 человека.
  20. 20. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по любому из пп.1. 8 или 15. которое связывает интегрин α2β1.
  21. 21. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по любому из пп.1. 8 или 15. которое связывает эпитоп интегрина α2. содержащий:
    (a) остаток Ьух. соответствующий положению 192 последовательности аминокислот интегрина α2 БЕР ГО N0: 8 или положению 40 интегрина α2 последовательности аминокислот Ι-домена БЕр ГО N0: 11;
    (b) остаток Ахп. соответствующий положению 225 последовательности аминокислот интегрина α2 БЕР ГО N0: 8 или положению 73 последовательности аминокислот Ι-домена интегрина α2. БЕр ΙΌ N0: 11;
    (c) остаток С1п. соответствующий положению 241 последовательности аминокислот интегрина α2 БЕР ГО N0: 8 или положению 89 последовательности аминокислот Ι-домена интегрина α2 БЕр ΙΌ N0: 11;
    (б) остаток Туг. соответствующий положению 245 последовательности аминокислот интегрина α2 БЕР ΙΌ N0: 8 или положению 93 последовательности аминокислот Ι-домена интегрина α2 БЕР ГО N0: 11;
    (е) остаток Агд. соответствующий положению 317 последовательности аминокислот интегрина α2 БЕР ΙΌ N0: 8 или положению 165 последовательности аминокислот Ι-домена интегрина α2 БЕР ГО N0: 11;
    (£) остаток Ахп. соответствующий положению 318 последовательности аминокислот интегрина α2 БЕр ΙΌ N0: 8 или положению 166 последовательности аминокислот Ι-домена интегрина α2 БЕр ΙΌ N0: 11; или (д) любое сочетание (а)-(£).
  22. 22. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по любому из пп.1.8 или 15. которое является полноразмерным антителом.
  23. 23. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по любому из пп.1. 8 или 15. которое является фрагментом антитела.
  24. 24. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по любому из пп.1. 8 или 15. которое связано с определяемой меткой.
  25. 25. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по любому из пп.1. 8 или 15. которое иммобилизировано на твердой фазе.
  26. 26. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по любому из пп.1. 8 или 15. которое ингибирует связывание интегрина α2 или α2β1 с лигандом интегрина α2β1.
  27. 27. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по п.26. отличающееся тем. что лиганд интегрина α2β1 выбран из коллагена. ламинина. вируса ЕСН0-1. декорина. Е-кадгерина. металлопротеиназы матрикса Ι (ΜΜΡ-Ι). эндорепеллина. коллектина и белка комплемента Ск|.
  28. 28. Гуманизированное антитело к интегрину α2. которое содержит вариабельную область легкой цепи. содержащую следующие последовательности аминокислот:
    (a) ЕСПН1 из БЕр ГО N0: 90; и/или (b) ЕС0Н2 из БЕр ГО N0: 90; и/или (c) ЬСОКЗ из БЕр ГО N0: 90.
  29. 29. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по п.28. в котором:
    (a) последовательность аминокислот ЬСОКГ представляет собой БАрББУЫУШ;
    (b) последовательность аминокислот Ε0ΌΕ2 представляет собой ОТБКБАБ;
    - 170 016245 (с) последовательность аминокислот ЬСИК3 представляет собой ООХУТТЫРЬТ.
  30. 30. Гуманизированное антитело к интегрину α2, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую следующие последовательности аминокислот:
    (a) НСЭК1 из 8ЕС ΙΌ ЫО: 77; и/или (b) НСИК2 из 8ЕС ΙΌ ЫО: 77; и/или (c) НСЭК3 из 8ЕС ΙΌ ЫО: 77.
  31. 31. Гуманизированное антитело к интегрину α2 по п.30, в котором:
    (a) последовательность аминокислот НСИК1 представляет собой СЕ8ЕТЫУС!Н;
    (b) последовательность аминокислот НСЭК2 представляет собой VI\VΛКСΕТNΥN8Λ^М8;
    (c) последовательность аминокислот НСИК3 представляет собой АЫИСУУУАМИУ.
  32. 32. Способ определения присутствия в образце интегрина α2, интегрина α2β1 или их обоих, включающий приведение образца в контакт с гуманизированным антителом к интегрину α2 по любому из пп.1, 8 или 15 и определение наличия связывания антитела с образцом, которое является признаком того, что препарат содержит интегрин α2, интегрин α2β1 или оба эти соединения.
  33. 33. Набор, включающий гуманизированное антитело к интегрину α2 по любому из пп.1, 8 или 15 и инструкции по его применению для определения наличия белка интегрина α2 или α2β1.
  34. 34. Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая гуманизированное антитело к интегрину α2β1 по п.1.
  35. 35. Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая гуманизированное антитело к интегрину α2β1 по п.8.
  36. 36. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.34.
  37. 37. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.35.
  38. 38. Клетка-хозяин, содержащая:
    (a) нуклеиновую кислоту по п.34; или (b) нуклеиновую кислоту по п.35; или (c) вектор по п.36; или (й) вектор по п.37; или (е) любое сочетание (а)-(й).
  39. 39. Способ получения гуманизированного антитела к интегрину α2, включающий выращивание клетки-хозяина по п.38 в условиях, обеспечивающих экспрессию антитела.
  40. 40. Способ по п.39, дополнительно включающий выделение гуманизированного антитела к интегрину α2 из клетки-хозяина.
  41. 41. Способ по п.39, в котором гуманизированное антитело к интегрину α2β1 выделяют из культуральной среды клетки-хозяина.
  42. 42. Способ скрининга гуманизированного антитела к интегрину α2 по любому из пп.1-31, включающий:
    (a) определение связывания интегрина α2 или α2β1 с антителом, содержащим Уъ-область, представленную в 8ЕЦ ΙΌ ЫО: 19, и УН-область, представленную в 8ЕЦ ΙΌ ЫО: 21, в присутствии и в отсутствие тестируемого антитела;
    (b) выбор указанного тестируемого антитела при условии, что его наличие коррелирует с пониженным связыванием интегрина α2 или α2β1 с антителом, которое содержит Уъ-область, представленную в 8ЕЦ ΙΌ ЫО: 19, и УН-область, представленную в 8ЕЦ ΙΌ ЫО: 21.
  43. 43. Способ по п.42, в котором интегрин α2 или α2β1 иммобилизирован на твердой подложке.
  44. 44. Способ скрининга гуманизированного антитела к интегрину α2 по любому из пп.1-31, включающий:
    (a) определение связывания интегрина α2β1 с коллагеном в присутствии тестируемого антитела, которое связывает Ι-домен α2;
    (b) определение связывания тестируемого антитела с Ι-доменом α2 в присутствии ионов Мд'';
    (c) определение связывания тестируемого антитела с Ι-доменом α2 в присутствии ионов Са++;
    (й) определение связывания тестируемого антитела с Ι-доменом α2 в присутствии среды, не содержащей катионов; и (е) выбор тестируемого антитела, если оно ингибирует связывание интегрина α2β1 с коллагеном и связывается с Ι-доменом α2 в присутствии ионов Мд++ и Са, а также в среде, не содержащей катионов.
  45. 45. Композиция, содержащая гуманизированное антитело к интегрину α2 по любому из пп.1, 8 или 15, и фармацевтически приемлемый носитель.
  46. 46. Композиция по п.45, используемая в способе лечения расстройства, связанного с интегрином α2β1.
  47. 47. Способ лечения расстройств, связанных с интегрином α2β1, у субъекта, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела к интегрину α2 по п.27 или композиции по п.45.
    - 171 016245
  48. 48. Способ ингибирования связывания лейкоцитов с коллагеном, включающий введение субъекту антитела к интегрину α2β1 по п.21 в количестве, эффективном для ингибирования связывания лейкоцитов с коллагеном.
  49. 49. Способ по п.47, в котором расстройство, связанное с интегрином α2β1, выбирают из воспалительных и аутоиммунных заболеваний, а также болезней, характеризующихся аномальным или повышенным ангиогенезом.
  50. 50. Способ по п.47, в котором расстройство, связанное с интегрином α2β1, выбирают из воспалительной болезни кишечника, болезни Крона, язвенного колита, реакции на трансплантат, неврита зрительного нерва, повреждений спинного мозга, ревматоидного артрита, системной красной волчанки (СКВ), сахарного диабета, рассеянного склероза, синдрома Рейно, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, синдрома Сьергена, склеродермии, юношеского диабета, диабетической ретинопатии, возрастной дистрофии желтого пятна, сердечно-сосудистых заболеваний, псориаза, рака, а также заболеваний инфекционного характера, которые вызывают воспалительный ответ.
  51. 51. Способ по п.47, в котором расстройство, связанное с интегрином α2β1, выбирают из воспалительной болезни кишечника, рассеянного склероза, ревматоидного артрита, ретробульбарного неврита и повреждения спинного мозга.
  52. 52. Способ по п.47, который не связан с (а) активацией тромбоцитов, (Ь) агрегацией тромбоцитов, (с) уменьшением концентрации тромбоцитов в крови, (ά) осложнениями, связанными с кровотечением, или (е) любой комбинацией (а)-(б).
  53. 53. Способ по п.47, в котором антитело к интегрину α2 содержит тяжелую цепь, представленную в 8ЕС ΙΌ N0: 174 или 8ЕС ΙΌ N0: 176, которая содержит ί'ΌΕδ по п.1, и легкую цепь, представленную в 8ЕС ΙΌ N0: 178, которая содержит ί'ΌΕδ по п.8.
  54. 54. Способ по п.47, в котором антитело к интегрину α2 конкурентно ингибирует связывание антитела, содержащего Уь-область, представленную в 8ЕС ΙΌ N0: 19, и Ун-область, представленную в 8ЕС Ш N0: 21, интегрина α2β1 человека или его Ι-домена.
  55. 55. Способ по п.51, в котором рассеянный склероз характеризуется рецидивами.
  56. 56. Способ по п.51, который обеспечивает снижение выраженности воспалительной гиперемии или неврологических осложнений, связанных с рассеянным склерозом.
  57. 57. Способ по п.47, в котором антитело к интегрину α2 ингибирует связывание интегрина α2β1 с коллагеном и не является миметиком лиганда.
  58. 58. Способ направленной доставки молекулы, композиции или комплекса к сайту, характеризующемуся присутствием лиганда интегрина α2β1, который включает присоединение или связывание молекулы, композиции или комплекса с гуманизированным антителом к интегрину α2 по любому из пп.1, 8 или 15.
  59. 59. Применение гуманизированного антитела к интегрину α2 по любому из пп.1-31 или композиции по п.45 в качестве лекарственного средства для лечения расстройства, связанного с интегрином α2β1.
  60. 60. Применение гуманизированного антитела к интегрину α2 по любому из пп.1-31 или композиции по п.45 в способе лечения расстройства, связанного с интегрином α2β1.
  61. 61. Применение гуманизированного антитела к интегрину α2 по любому из пп.1-31 для изготовления лекарственного средства для лечения расстройства, связанного с интегрином α2β1.
  62. 62. Применение по любому из пп.59-61, в котором расстройство, связанное с интегрином α2β1, выбирают из воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, а также заболевания, характеризующегося неправильным ангиогенезом.
  63. 63. Применение по любому из пп.59-61, в котором расстройство, связанное с интегрином α2β1, выбирают из воспалительной болезни кишечника, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, реакции на трансплантат, неврита зрительного нерва, повреждения спинного мозга, ревматоидного артрита, системной красной волчанки (СКВ), сахарного диабета, рассеянного склероза, синдрома Рейно, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, синдрома Сьергена, склеродермии, юношеского диабета, диабетической ретинопатии, возрастной дистрофии желтого пятна, сердечно-сосудистых заболеваний, псориаза, рака, а также заболеваний инфекционного характера, которые вызывают воспалительный ответ.
  64. 64. Применение по любому из пп.59-61, в котором расстройство, связанное с интегрином α2β1, выбирают из воспалительной болезни кишечника, рассеянного склероза, ревматоидного артрита, ретробульбарного неврита и повреждения спинного мозга.
  65. 65. Применение по любому из пп.59-61, в котором лечение не связано с (а) активацией тромбоцитов, (Ь) агрегацией тромбоцитов, (с) уменьшением концентрации тромбоцитов в крови, (ά) осложнениями, связанными с кровотечением, (е) активацией интегрина α2 или (ί) любой комбинацией (а)-(е).
  66. 66. Применение по любому из пп.59-61, в котором антитело к интегрину α2 содержит тяжелую цепь, представленную в 8ЕС ΙΌ N0: 174 или 8ЕС ΙΌ N0: 176, которая содержит ί'ΌΕδ по п.1, и легкую цепь, представленную в 8ЕС ΙΌ N0: 178, которая содержит СЭК.8 по п.8.
    - 172 016245
  67. 67. Применение по любому из пп.59-61, в котором антитело к интегрину α2 конкурентно ингибирует связывание антитела, содержащего область Уь, имеющую последовательность 8ЕС Ш N0: 19, и область Ун, имеющую последовательность 8ЕС Ш N0: № 21, с интегрином α2β1 человека или 1-доменом интегрина α2β1 человека.
  68. 68. Применение по п.64, в котором рассеянный склероз характеризуется рецидивами.
  69. 69. Применение по любому из пп.59-61, которое обеспечивает снижение выраженности воспалительной гиперемии или неврологических осложнений, связанных с рассеянным склерозом.
  70. 70. Применение по любому из пп.59-61, в котором антитело к интегрину α2 ингибирует связывание интегрина α2β1 с коллагеном и не является миметиком лиганда.
  71. 71. Композиция для лечения расстройств, связанных с интегрином α2β1, которая содержит гуманизированное антитело к интегрину α2 по любому из пп.1-31, а также фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
  72. 72. Композиция по п.71, отличающаяся тем, что расстройство, связанное с интегрином α2β1, выбирают из воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, а также заболевания, характеризующегося неправильным ангиогенезом.
  73. 73. Композиция по п.71, отличающаяся тем, что расстройство, связанное с интегрином α2β1, выбирают из воспалительной болезни кишечника, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, реакции на трансплантат, неврита зрительного нерва, травм спинного мозга, ревматоидного артрита, системной красной волчанки (СКВ), сахарного диабета, рассеянного склероза, синдрома Рейно, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, синдрома Сьергена, склеродермии, юношеского диабета, диабетической ретинопатии, возрастной дистрофии желтого пятна, сердечно-сосудистых заболеваний, псориаза, рака, а также заболеваний инфекционного характера, которые вызывают воспалительный ответ.
  74. 74. Композиция по п.71, где расстройство, связанное с интегрином αβ21, выбирают из воспалительной болезни кишечника, рассеянного склероза, ревматоидного артрита, ретробульбарного неврита и повреждения спинного мозга.
  75. 75. Упаковка, включающая гуманизированное антитело к интегрину α2 по любому из пп.1-31 или композицию по любому из пп.71-74, вместе с инструкциями для лечения расстройства, связанного с интегрином α2β1.
  76. 76. Упаковка по п.75, где расстройство, связанное с интегрином α2β1, выбирают из воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, а также заболевания, характеризующегося неправильным ангиогенезом.
  77. 77. Упаковка по п.75, где расстройство, связанное с интегрином-α2β1, выбрано из воспалительной болезни кишечника, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, реакции на трансплантат, неврита зрительного нерва, травм спинного мозга, ревматоидного артрита, системной красной волчанки (СКВ), сахарного диабета, рассеянного склероза, синдрома Рейно, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, синдрома Сьергена, склеродермии, юношеского диабета, диабетической ретинопатии, возрастной дистрофии желтого пятна, сердечно-сосудистых заболеваний, псориаза, рака, а также заболеваний инфекционного характера, которые вызывают воспалительный ответ.
  78. 78. Упаковка по п.75, где расстройство, связанное с интегрином α2β1, выбирают из воспалительной болезни кишечника, рассеянного склероза, ревматоидного артрита, ретробульбарного неврита и повреждения спинного мозга.
EA200801314A 2005-11-18 2006-11-17 Антитела против альфа2-интегрина и их применение EA016245B9 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US73830305P 2005-11-18 2005-11-18
PCT/CA2006/001876 WO2007056858A1 (en) 2005-11-18 2006-11-17 Anti-alpha2 integrin antibodies and their uses

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA200801314A1 EA200801314A1 (ru) 2008-10-30
EA016245B1 true EA016245B1 (ru) 2012-03-30
EA016245B9 EA016245B9 (ru) 2013-04-30

Family

ID=38048251

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801314A EA016245B9 (ru) 2005-11-18 2006-11-17 Антитела против альфа2-интегрина и их применение

Country Status (23)

Country Link
US (3) US7807794B2 (ru)
EP (2) EP1948798B1 (ru)
JP (1) JP5184367B2 (ru)
KR (1) KR101442266B1 (ru)
CN (1) CN101360826B (ru)
AP (1) AP2809A (ru)
AU (1) AU2006315037C1 (ru)
CA (1) CA2629715C (ru)
DK (1) DK1948798T3 (ru)
EA (1) EA016245B9 (ru)
ES (1) ES2541302T3 (ru)
HK (1) HK1121186A1 (ru)
HR (1) HRP20150691T1 (ru)
IL (1) IL191264A (ru)
MY (1) MY147669A (ru)
NO (1) NO20082454L (ru)
NZ (1) NZ568272A (ru)
PL (1) PL1948798T3 (ru)
PT (1) PT1948798E (ru)
RS (1) RS54111B1 (ru)
SI (1) SI1948798T1 (ru)
WO (1) WO2007056858A1 (ru)
ZA (1) ZA200804148B (ru)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ568272A (en) * 2005-11-18 2012-02-24 Glenmark Pharmaceuticals Sa Anti-alpha2 integrin antibodies and their uses
US20080267978A1 (en) * 2006-08-28 2008-10-30 Mary Zutter Anti-angiogenic targets for cancer therapy
US9029508B2 (en) 2008-04-29 2015-05-12 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
BRPI0913406A2 (pt) 2008-06-03 2018-01-09 Abbott Lab imunoglobulinas de domínio variável duplo e usos das mesmas
KR101054725B1 (ko) 2008-07-31 2011-08-05 재단법인서울대학교산학협력재단 세포외기질 성분을 함유하는 노화조절용 조성물 및 이를이용한 노화세포의 노화조절방법
WO2010052556A1 (en) * 2008-11-06 2010-05-14 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Treatment with anti-alpha2 integrin antibodies
WO2010104208A1 (en) * 2009-03-10 2010-09-16 Gene Techno Science Co., Ltd. Generation, expression and characterization of the humanized k33n monoclonal antibody
WO2011085136A2 (en) * 2010-01-06 2011-07-14 Elan Pharmaceuticals, Inc. Use of perlecan domain v in treating amyloidogenic disease
WO2011104604A2 (en) * 2010-02-23 2011-09-01 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Anti-alpha2 integrin antibodies and their uses
CN102190728B (zh) * 2010-03-17 2014-07-02 永卓博济(上海)生物医药技术有限公司 一种人源化抗cd20单克隆抗体
US8911952B2 (en) 2010-03-24 2014-12-16 Stc. Unm Method for integrin ligand discovery
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
JP2013537415A (ja) 2010-08-03 2013-10-03 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
TWI560199B (en) * 2010-08-31 2016-12-01 Sanofi Sa Peptide or peptide complex binding to α2 integrin and methods and uses involving the same
US9170138B2 (en) * 2010-10-01 2015-10-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enhanced microfluidic electromagnetic measurements
CA2981662C (en) 2011-01-14 2019-02-05 The Regents Of The University Of California Therapeutic antibodies against ror-1 protein and methods for use of same
CN107840894A (zh) 2011-03-25 2018-03-27 格兰马克药品股份有限公司 异二聚体免疫球蛋白
WO2012158989A2 (en) * 2011-05-19 2012-11-22 The Regents Of The University Of Michigan Integrin alpha-2 binding agents and use thereof to inhibit cancer cell proliferation
US20150239956A1 (en) * 2012-06-27 2015-08-27 Asahi Kasei Medical Co., Ltd. High-affinity antibody and method for manufacturing the same
CA2928043A1 (en) * 2013-10-21 2015-04-30 The Centre For Drug Research And Development Anti-podocalyxin antibodies and methods of using the same
US11090383B2 (en) 2015-10-01 2021-08-17 Centre For Drug Research And Development Anti-podocalyxin antibodies and methods of using the same
CN110007628B (zh) * 2019-04-10 2022-02-01 深圳市华星光电半导体显示技术有限公司 Goa电路及显示面板
US20220133913A1 (en) * 2019-07-24 2022-05-05 Korea Basic Science Institute SINGLE DOMAIN ANTIBODY TARGETING aVB3 INTEGRIN
WO2021050970A1 (en) * 2019-09-13 2021-03-18 Rutgers, The State University Of New Jersey Aav-compatible laminin-linker polymerization proteins
CN111088227A (zh) * 2019-12-31 2020-05-01 广州航华生物医药科技有限公司 一种细胞分离培养液和t细胞分离培养的方法
CN114931665A (zh) * 2021-12-14 2022-08-23 广州医科大学 六型胶原α2亚基在神经修复产品中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0759302B1 (en) * 1994-04-26 2000-08-16 Kanebo Ltd. Remedy for rheumatoid arthritis
WO2006022682A2 (en) * 2004-08-06 2006-03-02 Applera Corporation Method and compositions for treating diseases targeting cd49b

Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
WO1987000201A1 (en) 1985-07-05 1987-01-15 Whitehead Institute For Biomedical Research Epithelial cells expressing foreign genetic material
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
JPS63502716A (ja) 1986-03-07 1988-10-13 マサチューセッツ・インステチュート・オブ・テクノロジー 糖タンパク安定性の強化方法
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US5166320A (en) 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US5306620A (en) 1987-07-08 1994-04-26 The Scripps Research Institute Antibodies that bind to a ligand-induced binding site on integrin and induce integrin activation
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
WO1989002468A1 (en) 1987-09-11 1989-03-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Transduced fibroblasts and uses therefor
EP0391960B1 (en) 1987-12-11 1994-08-17 Whitehead Institute For Biomedical Research Genetic modification of endothelial cells
WO1989007136A2 (en) 1988-02-05 1989-08-10 Whitehead Institute For Biomedical Research Modified hepatocytes and uses therefor
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5196511A (en) * 1989-12-01 1993-03-23 The Scripps Research Institute Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand binding
US5262520A (en) * 1989-12-01 1993-11-16 The Scripps Research Institute Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand binding
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
CA2095153C (en) 1990-10-31 2007-01-09 Lori F. Rafield Genetic modification of endothelial cells
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US6291196B1 (en) * 1992-01-31 2001-09-18 Research Corporation Technologies, Inc. Melanoma and prostate cancer specific antibodies for immunodetection and immunotherapy
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
RO118524B1 (ro) 1992-11-13 2003-06-30 Idec Pharmaceuticals Corp San Metoda pentru tratarea unei tulburari legata de celulele b
DK0802800T3 (da) 1993-08-12 2002-10-07 Neurotech Sa Biokompatible immunoisolatoriske kapsler indeholdende genetisk ændrede celler for levering af biologisk aktive molekyler
US5523209A (en) * 1994-03-14 1996-06-04 The Scripps Research Institute Methods for identifying inhibitors of integrin activation
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
AU6592896A (en) 1995-07-21 1997-02-18 Regents Of The University Of Minnesota Analysis of alpha integrins for the diagnosis of diabetic nephropathy
US5858709A (en) 1996-10-15 1999-01-12 Smithkline Beecham P.L.C. Fibronectin binding protein B compounds
US6025155A (en) 1996-04-10 2000-02-15 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
US20020160970A1 (en) 1996-04-10 2002-10-31 Gyula Hadlaczky Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
WO1998022500A2 (en) 1996-11-21 1998-05-28 Cor Therapeutics, Inc. Modulation of interactions between myosin and integrins
US5932421A (en) 1996-12-06 1999-08-03 The Scripps Research Institute Methods and cell lines for identification of regulators of integrin activation
EP0879602A1 (en) 1997-05-21 1998-11-25 Rijksuniversiteit te Leiden A method to increase the survival of transplanted cells
US6596276B1 (en) 1997-09-30 2003-07-22 Beth Israel Deaconess Medical Center Method for inhibiting tumor angiogenesis in a living subject
WO2000020030A1 (en) 1998-10-07 2000-04-13 Karolinska Innovations Ab Anti-inflammatory alpha2, beta1 integrin-related substances or antibodies
US6849425B1 (en) * 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
CA2453403C (en) * 2001-07-09 2013-10-08 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of inhibiting amyloid toxicity
US7074175B2 (en) 2001-07-25 2006-07-11 Erik Schroeder Handy Thermotherapy via targeted delivery of nanoscale magnetic particles
US6997863B2 (en) 2001-07-25 2006-02-14 Triton Biosystems, Inc. Thermotherapy via targeted delivery of nanoscale magnetic particles
DE10354806A1 (de) * 2003-11-21 2005-06-02 Boehringer Ingelheim Microparts Gmbh Probenträger
EA200701211A1 (ru) * 2004-12-31 2007-12-28 Дженентек, Инк. Полипептиды, которые связываются с br3, и их применение
US20070048325A1 (en) 2005-08-24 2007-03-01 Dennis Van Epps Combination therapies for inhibiting integrin-extracellular matrix interactions
NZ568272A (en) * 2005-11-18 2012-02-24 Glenmark Pharmaceuticals Sa Anti-alpha2 integrin antibodies and their uses
US20080267978A1 (en) 2006-08-28 2008-10-30 Mary Zutter Anti-angiogenic targets for cancer therapy
FI20075258A0 (fi) * 2007-04-17 2007-04-17 Biotie Therapies Corp Menetelmä integriiniinhibiittorirespondereiden seulomiseksi

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0759302B1 (en) * 1994-04-26 2000-08-16 Kanebo Ltd. Remedy for rheumatoid arthritis
WO2006022682A2 (en) * 2004-08-06 2006-03-02 Applera Corporation Method and compositions for treating diseases targeting cd49b

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ESTAVILLO, D. et al. "Functional analysis of a recombinant glycoprotein Ia/IIa (Integrin α2β1) I domain that inhibits platelet adhesion to collagen and endothelial matrix under flow conditions". J. Biol. Chem. December 1999, vol. 274, p. 35921-35926, ISSN 0021-9258, whole document *
KAMATA, T. et al. "Identification of putative ligand binding sites within I domain of integrin α2β1 (VLA-2, CD49b/CD29)". J. Biol. Chem. April 1994, vol. 269, p. 9659-9663, ISSN 0021-9258, whole document *
SCHOOLMEESTER, A. et al. "Monoclonal antibody IAC-1 is specific for activated α2β1 and binds to amino acids 199 to 201 of the integrin α2 I-domain". Blood. 15 July, 2004, vol. 104, p. 390-396, ISSN 0006-4971, see page 392, right column, paragraph 3 and page 394, right column, paragraph 1 *
SMITH, C. et al. "Mapping the collagen-binding site in the I domain of the glycoprotein Ia/IIa (Integrin α2β1)". J. Biol. Chem. 11 February, 2000, vol. 275, p. 4205-4209, ISSN 0021-9258, whole document *
TUCKWELL, D.S. et al. "Monoclonal antibodies identify residues 199-216 of the integrin α2 vWFA domain as a functionally important region within α2β1". Biochem. J. September, 2000, vol. 350, p. 485-93, ISSN 0264-6021 *

Also Published As

Publication number Publication date
HK1121186A1 (en) 2009-04-17
CA2629715C (en) 2016-05-03
IL191264A (en) 2016-04-21
WO2007056858A1 (en) 2007-05-24
US7807794B2 (en) 2010-10-05
RS54111B1 (en) 2015-12-31
AU2006315037B2 (en) 2012-09-06
NO20082454L (no) 2008-07-17
EP1948798A1 (en) 2008-07-30
KR20080074184A (ko) 2008-08-12
AU2006315037A1 (en) 2007-05-24
EA200801314A1 (ru) 2008-10-30
KR101442266B1 (ko) 2014-11-04
US20070128190A1 (en) 2007-06-07
US20110135635A1 (en) 2011-06-09
ES2541302T3 (es) 2015-07-17
JP5184367B2 (ja) 2013-04-17
AU2006315037C1 (en) 2013-05-02
EP3023497A1 (en) 2016-05-25
US8759009B2 (en) 2014-06-24
AP2008004471A0 (en) 2008-06-30
NZ568272A (en) 2012-02-24
PL1948798T3 (pl) 2015-12-31
HRP20150691T1 (hr) 2015-11-06
EP1948798B1 (en) 2015-04-01
US20140341892A1 (en) 2014-11-20
SI1948798T1 (sl) 2015-09-30
CN101360826B (zh) 2014-04-30
DK1948798T3 (en) 2015-07-06
CN101360826A (zh) 2009-02-04
AP2809A (en) 2013-12-31
CA2629715A1 (en) 2007-05-24
PT1948798E (pt) 2015-08-05
ZA200804148B (en) 2009-12-30
EP1948798A4 (en) 2010-02-24
MY147669A (en) 2012-12-31
JP2009516506A (ja) 2009-04-23
EA016245B9 (ru) 2013-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA016245B1 (ru) Антитела против альфа2-интегрина и их применение
RU2461569C2 (ru) Агонистические антитела против notch3 и их применение для лечения notch3-ассоциированных заболеваний
CN100366293C (zh) 补体活化的抑制剂
DK2279412T3 (en) PRESENT UNKNOWN COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR TREATING IMMUNRATED DISEASES
KR20210042117A (ko) Cldn18.2 및 cd3에 대한 항체 작제물
UA74330C2 (ru) СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РАСТВОРИМОГО РЕЦЕПТОРА BR43x2
US20030186885A1 (en) Platelet membrane glycoprotein VI (GPVI) DNA and protein sequences, and uses thereof
EP2902414A1 (en) Antibodies directed against glycoprotein VI and uses thereof
US7101549B2 (en) Glycoprotein VI and uses thereof
CN101495632B (zh) 人源化抗人骨桥蛋白抗体
EA020465B1 (ru) ИЗОЛИРОВАННЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С ErbB3, НАБОРЫ И КОМПОЗИЦИИ, ИХ СОДЕРЖАЩИЕ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
UA118749C2 (uk) Конструкція антитіла до cdh19 і cd3
EA013677B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против cd25 и их применение
UA103297C2 (ru) Способ лечения заболевания, связанного с иммунитетом, путем одновременного нацеливания на il-17a и il-17f антител-антагонистов
UA123773C2 (uk) ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО ПРОТИ HtrA1 ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ ПРИ ЛІКУВАННІ ПОВ&#39;ЯЗАНОГО З HtrA1 ПОРУШЕННЯ АБО ХВОРОБИ ОКА
JP2003523207A (ja) Ｌｉｖ−１関連タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、及び癌の治療へのその利用
CN113853386A (zh) 抗可变muc1*抗体及其用途
JP2018526990A (ja) 新規な抗ヒトｇｐｖｉ抗体およびその使用
JP2002532079A (ja) 補体活性化に関連するレクチン補体経路を調節するための方法および産物
JP2002524099A (ja) 脈管形成の調節における内皮細胞表面受容体活性の調節
US11597778B2 (en) Human monoclonal autoantibodies to ADAMTS13 and uses thereof
AU2014286869A1 (en) Antibodies to Toso
JP2013048621A (ja) 免疫関連疾患の治療のための組成物と方法
KR20040031031A (ko) 면역 관련 질환 치료용 조성물 및 치료 방법
US5773293A (en) Anti-ICAM-4 antibodies and hybridomas

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Publication of the corrected specification to eurasian patent