EA020465B1 - ИЗОЛИРОВАННЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С ErbB3, НАБОРЫ И КОМПОЗИЦИИ, ИХ СОДЕРЖАЩИЕ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents

Abstract

В изобретении предлагаются изолированные моноклональные антитела или их антигенсвязывающие части, которые связываются с ErbB3. В одном воплощении антитело содержит CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий SEQ ID NO:7; CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий SEQ ID NO:8; CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий SEQ ID NO:9; CDR1 вариабельной области легкой цепи, включающий SEQ ID NO:10; CDR2 вариабельной области легкой цепи, включающий SEQ ID NO:11; и CDR3 вариабельной области легкой цепи, включающий SEQ ID NO:12. Изобретение также обеспечивает нуклеиновые кислоты, кодирующие указанное антитело, экспрессионные векторы, клетки-хозяева и трансгенные животные, не являющиеся человеком, и растения. Также обеспечены набор и композиция для ингибирования передачи сигнала ErbB3, содержащие указанное антитело, и способы получения такой композиции. Изобретение также относится к способу ингибирования передачи сигнала ErbB3 и способам диагностирования и лечения рака.

Description

В настоящем изобретении предлагается новый класс моноклональных антител, которые связываются с ЕгЬВ3 и ингибируют различные функции ЕгЬВ3. Например, антитела, описание которых приведено здесь, способны связываться с ЕгЬВ3 и ингибировать опосредованное ЕСЕ-подобными лигандами фосфорилирирование рецептора. В соответствии с настоящим описанием ЕСЕ-подобные лиганды включают ЕСЕ, ТСЕ-α, бета-целлюлин, гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста, бирегулин и амфирегулин, которые связываются с ЕСЕК и стимулируют димеризацию ЕСЕК с ЕгЬВ3. Данная димеризация, в свою очередь, вызывает фосфорилирование ЕгЬВ3 и активизирует передачу сигналов через рецептор. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением моноклональные антитела пригодны для лечения и диагностирования различных раковых опухолей, ассоциированных с ЕгЬВ3-опосредованной клеточной передачей сигналов. Соответственно, в одном из примеров осуществления настоящего изобретения предлагаются моноклональные антитела (и их антигенсвязывающие части), которые связываются с ЕгЬВ3 и ингибируют опосредованное ЕСЕ-подобными лигандами фосфорилирование рецептора ЕгЬВ3.

В одном примере моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые связываются с ЕгЬВ3, содержат СЭК1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8ЕО ГО N0:7; СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8ЕО ГО N0:8; СГОК3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8ЕО ГО N0:9; СЭК1 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ГО N0:10; СЭК2 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ГО N0:11; и СГОК3 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ГО N0:12.

В другом примере осуществления изобретения изолированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые связываются с ЕгЬВ3, содержат вариабельные области тяжелой и легкой цепей, где вариабельная область тяжелой цепи включает 8Е0 ГО N0:1.

В другом примере осуществления изобретения изолированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые связываются с ЕгЬВ3, содержат вариабельные области тяжелой и легкой цепей, где вариабельная область легкой цепи включает 8Е0 ГО N0:2.

В еще одном примере осуществления изобретения изолированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые связывается с ЕгЬВ3, содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую 8Е0 ГО N0:1, и вариабельную область легкой цепи, включающую 8Е0 ГО N0:2.

Антитела в соответствии с настоящим изобретением включают все известные формы антител. Например, антитело может быть человеческим антителом, гуманизированным антителом, биспецифическим антителом, химерным антителом. Антитело также может представлять собой ЕаЬ, ЕаЬ'₂, δсЕν или доменное антитело. Антитело также может иметь любой из следующих изотипов: 1дСь 1дС₂, 1дС₃, 1дС₄, 1дМ, 1дА], 1дА₂, 1дАкес, Ι§Ό и 1дЕ. В одном из примеров осуществления антитело представляет собой антитело 1дС₂.

В следующем примере осуществления настоящего изобретения также предложены композиции для ингибирования передачи сигнала ЕгЬВ3, включающие комбинации антител или антигенсвязывающих

- 1 020465 частей, описание которых приведено здесь, разработанные с приемлемым носителем и/или стимулятором. В конкретном примере состав включает два или несколько антител, которые связывают различные эпитопы на ЕгЪВЗ, или антитела, описание которых приведено здесь, в соединении с противоопухолевыми антителами, которые не связывают ЕгЪВЗ. В отдельном примере осуществления композиция представляет собой стерильный водный раствор или дисперсию, пригодные для инъекции или инфузии, или представляет собой стерильный порошок для приготовления ех (строгс стерильного водного раствора или дисперсии, пригодных для инъекции или инфузии. Также предусмотрен способ получения таких композиций в форме стерильного водного раствора.

В другом примере осуществления настоящего изобретения предлагаются изолированные нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и их антигенсвязывающие части, описание которых приводится здесь. В конкретных примерах осуществления нуклеиновая кислота кодирует У-область тяжелой цепи, включающую нуклеотидную последовательность, которая как минимум на 90% (например, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%) идентична ей или которая скрещивается в строгих условиях с 8ЕО ГО N0:25; или У-область легкой цепи, включающую нуклеотидную последовательность, которая как минимум на 90% (например, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%) идентична ей или которая скрещивается в строгих условиях с 5>Е0 ГО N0:26; или комбинации таких тяжелых и легких У-областей.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает экспрессионные векторы, содержащие изолированные нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и их антигенсвязывающие части, описание которых приводится здесь. Настоящее изобретение также обеспечивает трансгенные, не относящиеся к человеку млекопитающие, клетки-хозяева и трансгенные растения, которые экспрессируют и/или производят антитела и их антигенсвязывающие части, описание которых приведено в настоящем документе.

Более того, в изобретении представлены наборы, включающие одно или несколько изолированных моноклональных антител или их антигенсвязывающих частей, описание которых приведено здесь, и, при желании, инструкции по применению в лечении или диагностировании болезни, ассоциированной с ЕгЪВЗ-зависимой передачей сигналов, такой как раковые опухоли.

Антитела и их антигенсвязывающие части в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться в самых различных терапевтических и диагностических применениях, особенно онкологических. Соответственно, с другой стороны, изобретение предлагает способ ингибирования передачи сигнала ЕгЪВЗ у субъекта путем введения одного или нескольких антител или их антигенсвязывающих частей, описание которых приведено здесь, в количестве, достаточном для того, чтобы ингибировать передачу сигнала ЕгЪВЗ. Изобретение также предлагает способы лечения различных онкологических заболеваний субъекта, включая, но не ограничиваясь этим, меланому, рак молочной железы, рак яичников, рак почки, рак желудочно-кишечного тракта/рак толстой кишки, рак легких, светлоклеточную карциному и рак предстательной железы, путем введения одного или нескольких антител или их антигенсвязывающих частей, упомянутых в данном описании, в количестве, достаточном для лечения рака. Антитела или их антигенсвязывающие части могут вводиться отдельно или в комбинации с другими терапевтическими средствами, такими как противоопухолевые препараты или другие антитела или их антигенсвязывающие части.

В других примерах осуществления настоящего изобретения предлагаются способы диагностирования и прогнозирования болезней (например, рака), ассоциированных с ЕгЪВЗ. В одном из примеров осуществления это достигается путем контакта антител или антигенсвязывающих частей по изобретению (например, ех νίνο или ίη νίνο) с клетками, взятыми у субъекта, и путем измерения уровня связывания с ЕгЪВЗ на клетках, в котором чрезмерно высокие уровни связывания с ЕгЪВЗ указывают, что у субъекта имеется рак, ассоциированный с ЕгЪВЗ.

Другие особенности и преимущества изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и из формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1А и 1В представлены гистограммы, отображающие связывание различных анти-ЕгЪВЗ кандидатов антитела (РаЪ, именуемый здесь как АЪ) с ЕгЪВЗ, экспрессированным на МАЬМЕ-ЗМ клетках меланомы, с использованием козьего, не относящегося к человеку вторичного антитела А1еха 647.

На фиг. 2Α-2Ό показаны графики, иллюстрирующие значения К_с различных анти-ЕгЪВЗ кандидатов антитела.

На фиг. 2А и 2В показаны графики, иллюстрирующие значение К_с антитела # 6 (далее по тексту АЪ #6) и антитела # З (далее по тексту АЪ #З) соответственно, измеренные с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса (8РК).

На фиг. 2С и 2Ό даны графики, иллюстрирующие значения К_с антител АЪ #6 и АЪ #З соответственно, измеренные с помощью анализа связывания клетки с использованием МАЬМЕ-ЗМ меланомных клеток.

На фиг. З представлен график, изображающий специфичность связывания анти-ЕгЪВЗ антитела (АЪ #6) с ЕгЪВЗ с использованием ЕЫ§А. ЕОРК, В8А и ΤΟΡ-α использовались как контрольные.

На фиг. 4 дан график, изображающий способность анти-ЕгЪВЗ антитела (АЪ #6) снижать общие уровни ЕгЪВЗ в меланомных клетках МАЬМЕ-ЗМ ίη νίίτο при измерении с помощью ЕЬ!§А.

- 2 020465

На фиг. 5А и 5В показаны графики, отображающие способность аитн-ЕгЬВЗ антитела (ЛЬ #6) подавлять рецепторы ЕгЬВЗ на клетках МЛЬМЕ-ЗМ при измерении с помощью РАС8 анализа.

На фиг. 5А представлены результаты с применением Ι§Οι изотипа антитела.

На фиг. 5В представлены результаты с применением 1§С₂ изотипа антитела.

На фиг. 6Ά-6Ό представлены графики, отображающие период действия опосредованного антителом ЕгЬВЗ понижения регуляции (АЬ #6) при измерении с помощью РАС8 анализа.

На фиг. 7 показана гистограмма, отображающая способность разнообразных анти-ЕгЬВЗ антител подавлять ЕгЬВЗ в меланомных клетках ίη νίνο.

На фиг. 8 представлена гистограмма, отображающая способность анти-ЕгЬВЗ антитела (АЬ #6) подавлять ЕгЬВЗ в ксенотрансплантате АЭКг ίη νίνο.

На фиг. 9 показан график, отображающий способность анти-ЕгЬВЗ антитела (АЬ #6) ингибировать пролиферацию МАЬМЕ-ЗМ клеток в анализе Се11 Тйег С1о\у Аккау.

На фиг. 10 показан график, отображающий способность анти-ЕгЬВЗ антитела (АЬ #6) ингибировать пролиферацию клетки в яичниковой клеточной линии, АЭКг.

На фиг. 11 представлен график, отображающий способность анти-ЕгЬВЗ антитела (АЬ #6) ингибировать пролиферацию АСНЫ клеток.

На фиг. 12 показана гистограмма, отображающая способность анги-ЕгЬВЗ ангитела^Ь #6) ингибировать ЕгЬВЗ пролиферацию в АЭКг ксенотрансплантатах ίη νίνο.

На фиг. 1ЗА-1ЗС представлены графики, отображающие способность анти-ЕгЬВЗ антитела (АЬ #6) инигибировать бета-целлюлин- и херегулин-опосредованное фосфорилирование ЕгЬВЗ в АЭКг клетках.

На фиг. 14А, 14В показаны графики, отображающие способность анти-ЕгЬВЗ антитела (АЬ #6 1§С₂ изотип) ингибировать ЕгЬВЗ фосфорилирование в клеточных линиях опухоли яичника ОУСАК 5 и ОУСАК 8.

На фиг. 15А-15С даны графики, отображающие способность бета-целлюлина (ВТС) связывать ЕгЬВ1, как показано, недостатком связывания с ЕгЬВ1 отрицательных МАЬМЕ-ЗМ клеток (фиг. 17А); связывание с ЕгЬВ1 положительных АЭКг клеток при концентрациях 10 нМ (фиг. 17В) и 200 нМ (фиг. 17В) соответственно и ингибирование такого связывания с помощью ЕгЬйих.

На фиг. 16А, 16В представлены графики, отображающие способность анти-ЕгЬВЗ антитела (АЬ #6 1§С₂ изотип) ингибировать херегулин-опосредованную передачу сигналов в МАЬМЕ-ЗМ клетках.

Фиг. 16А представляет способность АЬ #6 ингибировать херегулин-опосредованное фосфорилирование ЕгЬВЗ в МАЬМЕ-ЗМ клетках, а фиг. 16В - способность АЬ #6 ингибировать фосфорилирование АКТ в МАЬМЕ-ЗМ клетках.

На фиг. 17Λ-17Ω показаны графики, отображающие способность анти-ЕгЬВЗ антитела (АЬ #6) ингибировать рост опухоли (А) яичника (АЭКг клетки), (В) предстательной железы Эи145 се11к), (С) яичника (ОуСАК8 клетки) и (Ό) поджелудочной железы (Со1о-З57 клетки) путем исследований ксенотрансплантата.

На фиг. 18А и 18В показаны графики, отображающие способность АЬ #6 (фиг. 18А) и РаЬ для АЬ #З (фиг. 18В) ингибировать херегулин, связывающийся с ЕгЬВЗ на МАЬМЕ-ЗМ клетках, при измерении с помощью РАС8 анализа.

На фиг. 19А и 19В представлены графики, отображающие способность АЬ #6 ингибировать связывание эпирегулина с ЕгЬВЗ на АЭКг клетках.

Фиг. 19А представляет связывание эпирегулина с АЭКг клетками.

Фиг. 19В представляет способность как ЕгЬйих, так и АЬ #6 ингибировать связывание эпирегулина с АЭКг клетками.

На фиг. 20А и 20В представлены графики, отображающие способность гепаринсвязывания эпидермального фактора роста (НВ-ЕСР) связывать ЕгЬВ на АЭКг клетках (фиг. 20А) и неспособность антиЕгЬВЗ антитела (АЬ #6) инигибировать такое связывание (фиг. 20В).

На фиг. 21А-21С показаны аминокислотные последовательности У-областей тяжелой и легкой цепей антител: АЬ #6, АЬ #З, АЬ #14, АЬ #17 и АЬ #19.

На фиг. 22А, 22В показаны нуклеотидные последовательности У-областей тяжелой и легкой цепей антител: АЬ #6, АЬ #З и АЬ #14.

На фиг. 2З показаны аминокислотные последовательности У-областей легкой цепи антител: АЬ #6, АЬ #17 и АЬ #19, которые возвращены к соответствующей аминокислотной последовательности зародышевой линии. Изменения аминокислотного остатка выделены.

На фиг. 24А-24С представлены графики, отображающие способность АЬ #6 ингибировать УЕСР секрецию опухолевых клеток.

На фиг. 25 показан график, отображающий влияние АЬ #6 на перемещение клетки.

На фиг. 26А-26С представлены графики, показывающие (А) ингибирование шаровидного роста в АйгК клетках, (В) ингибирование НКС-индуцированного шаровидного роста в АйгК и (С) ингибирование НКС-индуцированного шаровидного роста в Ии145 клетках.

На фиг. 27А и 27В представлены графики, показывающие влияние АЬ #6 на связывание (А) НКС и (В) ВТС с АйгК клетками.

На фиг. 28 дан график, показывающий влияние ЛЬ #6 на НОР-индуцированное фосфорилирование ЕгЬВЗ.

На фиг. 29А и 29В продемонстрировано влияние АЬ #6 на фосфорилирование (А) рЕгЬВ1 и рЕгЬВЗ и (В) НКО-индуцированное комплексообразование ЕгЬВ2/3.

На фиг. 30 представлен график, показывающий, как АЬ #6 связывает аминокислотные остатки 20-202 ЕгЬВЗ.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Для лучшего понимания настоящего изобретения в первую очередь приводятся определения некоторых терминов. Дополнительные определения излагаются по всему подробному описанию.

I. Определения.

Термины ЕгЬВЗ, НЕКЗ, ЕгЬВЗ рецептор и НЕКЗ рецептор, используемые как взаимозаменяемые в данном документе, относятся к белку человека ЕгЬВЗ в соответствии с описанием, представленном в патенте США № 5480968 и Р1о^таи е1 а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8с1. ИБА, 87:4905-4909 (1990); см. также Кап1 е1 а1., ВюсЬет181ту, 44:15842-857 (2005), СЬо и ЬеаЬу, Бшеисе, 297:1ЗЗ0-1ЗЗЗ (2002).

Термин ЕОР-подобный лиганд в соответствии с его использованием в настоящем описании касается лигандов рецептора эпидермального фактора роста (ЕОРК), включая эпидермальный фактор роста (ЕОР) и близкородственные белки, такие как трансформирующий фактор роста α (ТОР-α), бетацеллюлин (ВТС), гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста (НВ-ЕОР), бирегулин (В1К) и амфирегулин (АК), которые связываются с ЕОРК на поверхности клеток и стимулируют тирозинкиназную активность внутреннего белка рецептора. В частности, ЕОР-подобные лиганды вызывают формирование ЕОРК (также именуемые как ЕгЬВ1) и белкового комплекса ЕгЬВЗ (см., например, Шт е1 а1. (1998), ВюсЬет ί.. ЗЗ4:189-195), что приводит к фосфорилированию остатков тирозина в комплексе.

Антитела и их антигенсвязывающие части в соответствии с настоящим изобретением ингибируют опосредованное ЕОР-подобными лигандами фосфорилирование ЕгЬВЗ и в некоторых примерах демонстрируют одно или несколько следующих дополнительных свойств: (ί) ингибирование передачи сигнала, опосредованной одним или несколькими херегулином, эпирегулином, эпигеном и бирегулином (В1К), через ЕгЬВЗ; (ίί) ингибирование пролиферации клеток, экспрессирующих ЕгЬВЗ; (ίίί) способность снижать уровни ЕгЬВЗ на поверхностях клеток; (ΐν) ингибирование ΥΡΟΡ секреции клеток, экспрессирующих ЕгЬВЗ; (ν) ингибирование перемещения клеток, экспрессирующих ЕгЬВЗ; (νΐ) ингибирование шаровидного роста клеток, экспрессирующих ЕгЬВЗ; и/или (νΐΐ) связывание с эпитопом, расположенным на домене I ЕгЬВЗ, например эпитоп, который включает или перекрывает остатки 20-202 аминокислотной последовательности ЕгЬВЗ.

Термин ингибирование в соответствии с его использованием в настоящем описании относится к любому статистически значимому снижению биологической активности, включая полную блокировку активности. Например, ингибирование может относиться к снижению приблизительно на 10, 20, З0, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% биологической активности.

Соответственно, фраза ингибирование опосредованного ЕОР-подобными лигандами фосфорилирования ЕгЬВЗ в соответствии с ее использованием в настоящем описании относится к способности антитела или антигенсвязывающей части статистически значимо снижать фосфорилирование ЕгЬВЗ, вызванного ЕОР-подобным лигандом, относительно фосфорилированию в необработанной (контрольной) клетке. Клетка, которая экспрессирует ЕгЬВЗ, может быть естественной клеткой или клеточной линией или может быть рекомбинантно образована путем ввода нуклеиновой кислоты, кодирующей ЕгЬВЗ, в клетку-хозяин. В одном из примеров осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют опосредованное ЕОР-подобными лигандами фосфорилирование ЕгЬВЗ как минимум на 10%, или как минимум на 20%, или как минимум на З0%, или как минимум на 40%, или как минимум на 50%, или как минимум на 60%, или как минимум на 70%, или как минимум на 80%, или как минимум на 90%, или на 100%, как задано, например, с помощью вестерн-блоттинга, затем зондированием анта-фосфотирозин антителом, как описано в Шт е1 а1. (1998), ВюсЬет ΐ., ЗЗ4:189-195 и примерах ниже.

Фраза ингибирование херегулин, эпирегулин, эпиген или бирегулин-опосредованной передачи сигнала через ЕгЬВЗ в соответствии с ее использованием в настоящем описании относится к способности антитела или его антигенсвязывающей части статистически значимо снижать опосредованную ЕгЬВЗ лигандом передачу сигнала (например, херегулин, эпирегулин, эпиген или бирегулин) через ЕгЬВЗ, относительно передачи сигнала при отсутствии антитела (контроль). ЕгЬВЗ-лиганды также именуются здесь как херегулин-подобные лиганды. Это означает, что при наличии антитела или его антигенсвязывающей части сигнал, опосредованный в экспрессирующей ЕгЬВЗ клетке одним или несколькими херегулином, эпирегулином, эпигеном и бирегулином, относительно контроля (антитело отсутствует) статистически значимо снижается. Опосредованный ЕгЬВЗ-лигандом сигнал можно измерить путем анализа уровня или активности ЕгЬВЗ субстрата и/или белка, который присутствует в клеточном каскаде, включающем ЕгЬВЗ. В одном из примеров антитело или его антигенсвязывающая часть снижают уровень или активность ЕгЬВЗ субстрата и/или белка в клеточном каскаде, включающем ЕгЬВЗ, как минимум на 10%, или как минимум на 20%, или как минимум на З0%, или как минимум на 40%, или как минимум на 50%, или как минимум на 60%, или как минимум на 70%, или как минимум на 80%, или как минимум на 90%, или

- 4 020465 на 100% относительно уровня или активности при отсутствии такого антитела или его антигенсвязывающей части (контроль). Такую опосредованную ЕгЬВЗ-лигандом передачу сигналов можно измерить с помощью известных технологий, которые измеряют уровень или активность субстрата ЕгЬВЗ (например, §НС или ΡΙ3Κ) или белка в клеточном каскаде, включающем ЕгЬВЗ (например, АКТ), используя пробы киназы для таких белков (см., например, Ногк! е! а1. выше, §ибо е! а1. (2000), Ме1Ьобк Еп/уто1.. 322:38892 и Могдап е! а1. (1990), Еиг. ί. Вюейет., 191:761-767).

В конкретном примере антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют опосредованную ЕгЬВЗ-лигандом (например, херегулин, эпирегулин, эпиген или бирегулин) передачу сигналов через ЕгЬВЗ ингибированием связывания ЕгЬВЗ-лиганда (например, одним или несколькими из: херегулин, эпирегулин, эпиген или бирегулин) с ЕгЬВЗ. Некоторые лиганды (например, бирегулин или В1К) выполняют функцию и как ЕОР-подобных лигандов (т.е. связываются с ЕСРК/ЕгЬВ1), и как ЕгЬВЗ-подобных лигандов (т.е. связываются с ЕгЬВЗ).

Фраза ингибирование связывания херегулина, эпирегулина, эпигена или бирегулина с ЕгЬВЗ в соответствии с ее использованием в настоящем описании относится к способности антитела или его антигенсвязывающей части статистически значимо снижать связывание ЕгЬВЗ лиганда (например, одного или несколько из: херегулин, эпирегулин, эпиген или бирегулин) с ЕгЬВЗ, относительно связывания при отсутствии антитела (контроль). Это означает, что при наличии антитела или его антигенсвязывающей части количество ЕгЬВЗ-лиганда (например, херегулин, эпирегулин, эпиген или бирегулин), которое связывается с ЕгЬВЗ относительно контрольного (антитело отсутствует) статистически значимо снижается. Количество ЕгЬВЗ лиганда, которое связывается с ЕгЬВЗ, может уменьшаться при наличии антитела или его антигенсвязывающей части в соответствии с изобретением как минимум на 10%, или как минимум на 20%, или как минимум на З0%, или как минимум на 40%, или как минимум на 50%, или как минимум на 60%, или как минимум на 70%, или как минимум на 80%, или как минимум на 90%, или на 100% относительно количества при отсутствии антитела или его антигенсвязывающей части (контроль). Снижение связывания ЕгЬВЗ-лиганда можно измерить с помощью известных технологий измерения уровня связывания меченого ЕгЬВЗ-лиганда (например, меченный радиоизотопом херегулин, эпирегулин, эпиген или бирегулин) с экспрессирующими ЕгЬВЗ клетками при наличии или отсутствии (контроль) антитела или его антигенсвязывающей части.

Фраза ингибирование пролиферации клеток, экспрессирующих ЕгЬВЗ в соответствии с ее использованием в настоящем описании относится к способности антитела или его антигенсвязывающей части статистически значимо снижать пролиферации клетки, экспрессирующей ЕгЬВЗ, относительно пролиферации при отсутствии антитела. В одном из примеров пролиферация экспрессирующей ЕгЬВЗ клетки (например, раковой клетки) может быть снижена как минимум на 10%, или как минимум на 20%, или как минимум на З0%, или как минимум на 40%, или как минимум на 50%, или как минимум на 60%, или как минимум на 70%, или как минимум на 80%, или как минимум на 90%, или на 100%, когда клетки контактируют с антителом или его антигенсвязывающей частью в соответствии с настоящим изобретением относительно пролиферации, измеренной при отсутствии антитела или его антигенсвязывающей части (контроль). Клеточную пролиферацию можно проанализировать с помощью известных в этой области технологий измерения скорости цитокинеза, фракции клеток в пределах клеточной популяции, подвергающейся цитокинезу, и/или скорости потери клеток из клеточной популяции вследствие конечной дифференцировки или некроза клеток (например используя анализ се11 ТНег §1о\у аккау или тимидин инкорпорацию).

Фраза способность снижать уровни ЕгЬВЗ на поверхности клеток в соответствии с ее использованием в настоящем описании относится к способности антитела или его антигенсвязывающей части статистически значимо снижать количество ЕгЬВЗ, обнаруженное на поверхности клетки, которое подверглось воздействию антитела, относительно необработанной (контрольной) клетки. Например, снижение уровней ЕгЬВЗ на поверхности клеток может происходить в результате повышенной интернализации ЕгЬВЗ (или повышенного ЕгЬВЗ эндоцитоза). В одном из примеров антитело или его антигенсвязывающая часть снижают экспрессию ЕгЬВЗ на поверхности клетки как минимум на 10%, или как минимум на 20%, или как минимум на З0%, или как минимум на 40%, или как минимум на 50%, или как минимум на 60%, или как минимум на 70%, или как минимум на 80%, или как минимум на 90%, или на 100% и/или увеличивает интернализацию ЕгЬВЗ рецептора как минимум на 10%, или как минимум на 20%, или как минимум на З0%, или как минимум на 40%, или как минимум на 50%, или как минимум на 60%, или как минимум на 70%, или как минимум на 80%, или как минимум на 90%, или на 100% относительно экспрессии на поверхности клетки или интернализации при отсутствии антитела или его антигенсвязывающей части (контроль). Уровни ЕгЬВЗ на поверхностях клеток и/или интернализацию ЕгЬВЗ рецептора при отсутствии и наличии антитела или его антигенсвязывающей части можно легко измерить с помощью известных технологий, таких как описано в Ногк! е! а1., упомянутой выше, и в примерах, которые приводятся здесь.

Фраза ингибирование УЕСЕ секреции клеток, экспрессирующих ЕгЬВЗ, в соответствии с ее использованием в настоящем описании относится к способности антитела или его антигенсвязывающей части статистически значимо снижать УЕСЕ секрецию при отсутствии антитела. В одном из примеров

- 5 020465

УЕОР секреция клетки, экспрессирующей ЕгЬВЗ (например, раковая клетка), может быть снижена как минимум на 10%, или как минимум на 20%, или как минимум на 30%, или как минимум на 40%, или как минимум на 50%, или как минимум на 60%, или как минимум на 70%, или как минимум на 80%, или как минимум на 90%, или на 100%, когда клетки контактируют с антителом или его антигенсвязывающей частью по настоящему изобретению, относительно УЕОР секреции, измеренной при отсутствии антитела или его антигенсвязывающей части (контроль).

Фраза ингибирование перемещения клеток, экспрессирующих ЕгЬВЗ в соответствии с ее использованием в настоящем описании относится к способности антитела или его антигенсвязывающей части статистически значимо снижать перемещение экспрессирующей ЕгЬВЗ клетки относительно перемещения клетки при отсутствии антитела. В одном из примеров перемещение экспрессирующей ЕгЬВЗ клетки (например, раковая клетка) может быть снижено как минимум на 10%, или как минимум на 20%, или как минимум на 30%, или как минимум на 40%, или как минимум на 50%, или как минимум на 60%, или как минимум на 70%, или как минимум на 80%, или как минимум на 90%, или на 100%, когда клетки контактируют с антителом или его антигенсвязывающей частью по настоящему изобретению, относительно перемещения клетки, измеренного при отсутствии антитела или его антигенсвязывающей части (контроль). Перемещение клетки можно анализировать с помощью известных технологий, например, описанных здесь.

Фраза ингибирование шаровидного роста клеток, экспрессирующих ЕгЬВЗ в соответствии с ее использованием в настоящем описании относится к способности антитела или его антигенсвязывающей части статистически значимо снижать перемещение экспрессирующей ЕгЬВЗ клетки относительно перемещения клетки при отсутствии антитела. В одном из примеров перемещение экспрессирующей ЕгЬВЗ клетки (например, раковой клетки) может быть снижено как минимум на 10%, или как минимум на 20%, или как минимум на З0%, или как минимум на 40%, или как минимум на 50%, или как минимум на 60%, или как минимум на 70%, или как минимум на 80%, или как минимум на 90%, или на 100%,, когда клетки контактируют с антителом или его антигенсвязывающей частью по настоящему изобретению, относительно перемещения клетки, измеренного при отсутствии антитела или его антигенсвязывающей части (контроль). Перемещение клетки можно анализировать с помощью известных технологий, например, описанных здесь. Термин антитело или иммуноглобулин в соответствии с вариантом его использования здесь включает полные антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. антигенсвязывающая часть) или его одиночные цепи. Антитело включает как минимум две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ь) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из У-области тяжелой цепи (используемое здесь сокращение У_н) и С-области тяжелой цепи. С-область тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СНЗ. Каждая легкая цепь состоит из У-области легкой цепи (используемое здесь сокращение У_ь) и С-области легкой цепи. С-область легкой цепи состоит из одного домена, СЬ. Области У_н и У_ъ можно дополнительно подразделить на области гипервариабильности, называемые гипервариабельные участки (СОК), с вплетением участков, более консервативных, именуемых каркасные области (РК). Каждая У_н и У_ъ состоит из трех СОК и четырех РК, распределенных от аминоконцевой до карбоксиконцевой области в следующем порядке: РК1, ί'ΌΒΙ. РК2, СЭК2. РКЗ, СЭКЗ. РК4. У-области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, взаимодействующий с антигеном. С-области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с питающими тканями или факторами, включая разнообразные клетки иммунной системы (например, клетка-эффектор) и первый компонент (С1ц) классической системы комплемента. Типичные антитела по изобретению включают антитела # 1, З и 14 и их антигенсвязывающие части.

Термин антигенсвязывающая часть антитела (или просто часть антитела) в соответствии с его использованием в настоящем описании относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохранили способность специфически связываться с антигеном (например, ЕгЬВЗ). Было установлено, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами антитела полной длины. Примеры связывающих фрагментов, на которые распространяется термин антигенсвязывающая часть антитела, включают (ί) РаЬ-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов У_ъ, У_н, СЬ и СН1; (ίί) Р(аЬ')₂-фрагмент, бивалентный фрагмент, включающий два РаЬ-фрагмента, связанных дисульфидной связью в шарнирной области; (ίίί) фрагмент Рб, состоящий из доменов У_н и СН1; (ίν) фрагмент Ρν, состоящий из доменов У_ъ и У_н одного плеча антитела; (ν) бАЬ, включающий домены У_н и У_ъ; (νί) бАЬ фрагмент (\Уагб с1 а1. (1989), ЫаШге, З41, 544-546), который состоит из У_н домена; (νίί) бАЬ, который состоит из домена У_н или У_ъ; и (νίίί) изолированный гипервариабельный участок (СОК) или (ίχ) комбинацию двух или более изолированных СОК, которые могут по желанию соединяться синтетическим линкером. Кроме того, хотя два домена Ρν фрагмента, У_ъ и У_н, кодированы изолированными генами, они могут соединяться с использованием рекомбинантных методов синтетическим линкером, который позволяет выполнить их в виде одиночной белковой цепи, в которой У_ъ и У_н области объединяются в пары с образованием одновалентных молекул (известные как одиночная цепь Ρν (ксРу); см., например, Виб е1 а1. (1988), 8аеисе, 242, 42З-426 и НизЮп е1 а1. (1988), Ргос. ЫаИ. Асаб. 8с1. И8А, 85, 5879-588З). На такие антитела одиночной цепи также распространяется термин антигенсвязанная часть антитела. Эти фрагменты антитела получены с применением обычных технологий, известных специалистам в этой об- 6 020465 ласти, и фрагменты фильтруются на пригодность таким же образом, как и интактные антитела. Антигенсвязанные части можно получить с помощью технологий рекомбинантных ДНК или ферментативным, или химическим дроблением интактных иммуноглобулинов.

Термин моноклональное антитело в соответствии с его использованием в настоящем описании относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, содержащие популяцию, идентичны, за исключением естественных мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела очень специфичны, будучи направленными против одной области детерминанты. Кроме того, в отличие от обычных способов приготовления (поликлональных) антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты на антигене. Моноклональные антитела можно приготовить с помощью технологий, известных в данной области техники, и тех, описание которых приведено здесь, например метод гибридомы, как указано в КоЫег е! а1. (1975), Ыа1иге, 256:495, трансгенное животное, как описано, например, в ЬопЬегд, с( а1. (1994), Ыа1иге, 368(6474):856-859), методы рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567), или с помощью библиотек антитела фага с применением технологий, описанных, например, в С1аск§оп е! а1., №1иге, 352:624-628 (1991) и Магкз е! а1., 1. Мо1. ΒίοΙ., 222:581-597 (1991). Моноклональные антитела включают химерные антитела, антитела человека и гуманизированные антитела и могут быть естественными или их можно получать рекомбинантно.

Термин рекомбинантное антитело относится к антителам, которые приготовлены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными средствами, например: (а) антитела, выделенные из животного (например, мышь), которое является трансгенным или трансхромосомным для иммуноглобулиновых генов (например, иммуноглобулиновые гены человека), или гибридома, приготовленная из них; (Ь) антитела, выделенные из клетки-хозяина, видоизмененной для экспрессирования антитела, например из трансфектомы; (с) антитела, выделенные из библиотеки рекомбинантных, комбинаторных антител (например, содержащей последовательности антител человека) с использованием фагового дисплея; и (б) антитела, приготовленные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими средствами, которые включают сплайсинг последовательностей иммуноглобулинового гена (например, иммуноглобулиновые гены человека) к другим последовательностям ДНК. Такие рекомбинантные антитела могут иметь У-области и С-области, полученные из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевой линии человека. В некоторых примерах, однако, такие рекомбинантные антитела человека могут подвергаться ίη уйго мутагенезу, и, таким образом, аминокислотные последовательности У_н и У_ъ областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, если получены из У_н и Уь последовательностей эмбриональной линии человека и относятся к ним, не могут естественным образом существовать в спектре эмбриональной линии антитела человека ίη У1уо.

Термин химерный иммуноглобулин или антитело относится к иммуноглобулину или антителу, У-области которых получают из первых препаратов и С-области которых получают из вторых препаратов. Химерные иммуноглобулины или антитела могут быть созданы, например, с помощью генной инженерии, из сегментов иммуноглобулинового гена, принадлежащих различным препаратам.

Термин человеческое антитело в соответствии с его использованием в настоящем описании подразумевает включение антител, имеющих У-области, в которых и каркас, и СОК области получены из иммуноглобулиновых последовательностей эмбриональной линии человека, как описано, например, в КаЬа! е! а1. (см. КаЬа!, е! а1. (1991), Бесщепсех оГрго!еш8 оГ 1ттипо1одюа1 1п1еге51. ΕίΠΙι Еб|Ноп. - Последовательности белков иммунологического значения, И.8. Оерайтеп! оГ Неайй апб Нитап §егу1се8, ΝΙΗ РиЬИсайоп №. 91-3242). Кроме того, если антитело содержит С-область, то С-область также получена из последовательностей иммуноглобулина эмбриональной линии человека. Человеческие антитела могут включать аминокислотные остатки, не кодированные последовательностями иммуноглобулина эмбриональной линии человека (например, мутации, введенные неспецифическим или сайт-специфическим мутагенезом ш уйго или соматической мутацией ш У1уо). Однако человеческое антитело, по использованию здесь, не подразумевает включение антител, в которых СОК-последовательности, полученные из эмбриональной линии препаратов других млекопитающих, таких как мышь, были пересажены на каркасные последовательности человека.

Человеческое антитело может иметь как минимум одну или несколько аминокислот, замещенных аминокислотным остатком, например усиливающим активность аминокислотным остатком, который не кодируется последовательностью иммуноглобулина эмбриональной линии человека. Как правило, человеческое антитело может иметь до 20 позиций, замещенных аминокислотными остатками, которые не входят в состав последовательности иммуноглобулина эмбриональной линии человека. В конкретном примере эти замены происходят в СОК-областях, подробное описание которых приводится ниже.

Термин гуманизированный иммуноглобулин или гуманизированное антитело относится к иммуноглобулину или антителу, которые включают как минимум одну цепь гуманизированного иммуноглобулина или антитела (т.е. как минимум одну легкую или тяжелую цепь). Термин цепь гуманизированного имууноглобулина или цепь гуманизированного антитела (т.е. легкая цепь гуманизированного иммуноглобулина или тяжелая цепь гуманизированного иммуноглобулина) относится к цепи им- 7 020465 муноглобулина или антитела (т.е. легкой или тяжелой цепи соответственно), имеющей У-область, которая включает вариабельную каркасную область в основном из человеческого иммуноглобулина или антитела и гипервариабельные участки (СЭР) (например, как минимум один СЭР, предпочтительно два СЭР, еще предпочтительнее три СОК), в основном из не принадлежащего человеку иммуноглобулина или антитела, а также включает С-области (например, как минимум одну С-область или ее часть в случае легкой цепи и предпочтительно три С-области в случае тяжелой цепи). Термин гуманизированная У-область (например, гуманизированная У-область легкой цепи или гуманизированная У-область тяжелой цепи) относится к У-области, которая включает вариабельную каркасную область, в основном из человеческого иммуноглобулина или антитела и гипервариабельные участки (СОК) в основном из не принадлежащего человеку иммуноглобулина или антитела.

Биспецифическое или бифункциональное антитело - это искусственное гибридное антитело, имеющее две разные пары тяжелой/легкой цепи и два разных участка связывания. Биспецифические антитела можно получать различными способами, включая слияние гибридом или связывание РаЬ'-фрагментов. См., например, δοη^κίνίΐαί & ЬасЬтаии (1990), С1ш. Ехр. 1ттипо1. 79, 315-321; Ко81е1иу е! а1. (1992), 1. 1ттиио1. 148, 1547-1553. В конкретном примере биспецифическое антитело по настоящему изобретению включает места связывания как для ЕгЬВЗ, так и для 1СР1-К (т.е. рецептор инсулинподобного фактора роста 1). В другом примере биспецифическое антитело по настоящему изобретению включает места связывания как для ЕгЬВЗ, так и для с-МЕТ. В других примерах биспецифическое антитело включает место связывания для ЕгЬВЗ и место связывания для ЕгЬВ2, ЕКЬВЗ, ЕгЬВ4, ЕСРК, Бе\\!5 Υ., МиС-1, ЕрСАМ, СА125, простатический специфический мембранный антиген, ΡΌΟΡΗ-α, ΡΌΟΡΗ-β, с-К1Т или любой из РСР рецепторов.

Используемый в тексте описания термин гетерологическое антитело определяется в связи с трансгенным, не принадлежащим человеку организмом или растением, производящим такое антитело.

Термин изолированное антитело в соответствии с его использованием в настоящем описании подразумевает антитело, в основном не содержащее других антител, имеющих разные антигенные специфичности (например, изолированное антитело, в частности связанное с ЕгЬВЗ, в основном не содержит антител, которые, в частности, связывают другие антигены, кроме ЕгЬВЗ). Кроме того, изолированное антитело обычно в основном не содержит другой клеточный материал и/или другие химические вещества. В одном из примеров осуществления изобретения комбинации изолированных моноклональных антител с разными антигенными специфичностями объединяются во вполне определенный состав.

Используемый в описании термин изотип относится к классу антитела (например, 1дМ или [дС]), который кодируется генами С-области тяжелой цепи. В одном из примеров антитело или его антигенсвязывающая часть - это изотип, выбранный из изотипа антитела 1дС₁, 1дС₂, 1дС_З, 1дС₄, 1дМ, 1дА₁, 1дА₂, 1дА§ес, 1дЭ или 1дЕ. В некоторых примерах моноклональное антитело по изобретению - это 1дС1 изотип. В других примерах моноклональное антитело по изобретению - это 1дС₂ изотип.

Используемый в описании термин переключение изотипа относится к феномену, с помощью которого класс или изотип, антитела переходит из одного 1д класса в один из других 1д классов.

Используемый в описании термин непереключаемый изотип относится к изотипному классу тяжелой цепи, который создается, когда переключение изотипа не происходит; СН ген, кодирующий непереключаемый изотип, - это обычно первый СН ген сразу после функционально реаранжированного УЭ1 гена. Переключение изотипа классифицировано как классическое или неклассическое переключение. Классическое переключение изотипа происходит за счет явлений рекомбинации, которые включают как минимум одну область переключения последовательности в гене, кодирующем антитело. Неклассическое переключение изотипа может происходить, например, гомологичной рекомбинацией между σ_μ человека и Σ_μ человека (δ-ассоциированная делеция). Среди других могут встречаться альтернативные неклассические механизмы переключения, такие как межтрансгеннная и/или межхромосомная рекомбинация, выполняющие переключение изотипа.

Используемый в описании термин класс-свич последовательность=последовательность на этапе переключения относится к последовательностям ДНК, которые отвечают за класс-свич рекомбинацию (рекомбинацию на этапе переключения). Последовательность донор-переключатель, обычно μ область переключения, составит 5' (т.е. выше по потоку) от конструкционной области, подлежащей удалению во время рекомбинации на этапе переключения. Область акцептора-переключателя будет находиться между удаляемой конструкционной областью и С-областью замещения (например, γ, Σ, е!с.). Поскольку отсутствует активный центр, где всегда происходит рекомбинация, по конструкции обычно нельзя предсказать окончательную генную последовательность.

Антиген - это объект (например, напоминающий белок объект или пептид), с которым связываются антитело или его антигенсвязывающая часть. В различных примерах осуществления настоящего изобретения антиген - это ЕгЬВЗ или ЕгЬВЗ-подобная молекула. В конкретном примере согласно изобретению антиген - это ЕгЬВЗ человека.

Термин эпитоп или антигенная детерминанта относится к сайту на антигене, с которым реально связывается иммуноглобулин или антитело. Эпитопы могут быть сформированы из заменимых или не- 8 020465 заменимых аминокислот, размещенных рядом с помощью третичной укладки белка. Эпитопы, образованные из заменимых аминокислот, обычно сохраняются под воздействием денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные третичной укладкой, обычно погибают при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно включает как минимум З, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 1З, 14 или 15 аминокислот в одной пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают известные в этой области технологии и описанные здесь технологии, например, рентгенокристаллографию и 2-мерный ядерный магнитный резонанс. См., например, Ерйоре Марршд Рго1осо1к ίη Мебюбк ίη Мо1еси1аг Вю1о§у. - Протоколы картирования эпитопов в технологии в молекулярной биологии, νοί. 66, О.Е. Могг1к, Еб. (1996).

Настоящее изобретение также рассматривает и антитела, которые связывают такой же или перекрывающий эпитоп, что и антитела по настоящему изобретению, т.е. антитела, конкурирующие за связывание с ЕгЪВЗ, или связывают эпитопы, перекрывающиеся с эпитопами, связанными антителами, описанными здесь, т.е. эпитоп, расположенный на домене I ЕгЪВЗ. Антитела, которые распознают аналогичный эпитоп, можно идентифицировать с помощью обычных технологий, таких как иммунологический анализ, например демонстрируя способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антиген-мишенью, т.е. конкурентно-связывающий анализ. Конкурентное связывание определяется при анализе, в котором иммуноглобулин при испытании ингибирует специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном, таким как ЕгЪВЗ. Известны разные типы конкурентно-связывающего анализа, например твердофазный прямой или непрямой радиоиммунный анализ (К1А), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (Е1А), конкурентный сэндвич-анализ (см., δίαΠΙί еί а1., (198З), МеШобк ίη Еи/уто1о8у. - Методика в ферментологии 9:242); твердофазный прямой биотинавидин Е1А (см. Каббанб еί а1. (1986), ί. Iттиηο1. 1З7:З614). Твердофазный прямой анализ на основе меток, твердофазный прямой сэндвич-анализ на основе меток (см., Наг1о\у и Бане (1988), Ап1|Ъо61ск. - Антитела: А ЬаЪогаЮгу Маииа1, Со1б 8ргшд НагЪог Ргекк); твердофазный прямой К1А на основе меток с использованием 1-125 метки (см. Моге1 еί а1. (1988), Мо1. Iттиηο1. 25(1):7); твердофазный прямой биотинавидин Е1А (Сйеиид еί а1. (1990), Уио1о§у, 176:546) и прямой К1А на основе меток (МоИсЫт-шег еί а1. (1990), Зсаиб. ί. Iттиηο1. З2:77). Как правило, в таком анализе используется очищенный антиген (например, ЕгЪВЗ), связанный с твердой поверхностью или клетками, содержащими один из: немеченый испытательный иммуноглобулин и меченый эталонный иммуноглобулин. Конкурентное ингибирование измеряется путем определения количества метки, связанной с твердой поверхностью или клетками при наличии испытательного иммуноглобулина. Обычно испытательный иммуноглобулин присутствует в избытке. Обычно, когда конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном как минимум на 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% или более.

Используемые в описании термины специфическое связывание, специфически связывается, селективное связывание и селективно связывается означают, что антитело или его антигенсвязывающая часть обнаруживают заметное сродство к конкретному антигену или эпитопу и, в общем, не проявляют достоверной перекрестной реактивности с другими антигенами и эпитопами. Заметное или предпочтительное связывание включает связывание со значениями сродства как минимум 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ или

1 7 1 8 1

М^- . Более предпочтительны значения сродства свыше 10 М^-, лучше свыше 10 М^- . Также подразумевается, что средние из сформулированных здесь значений входят в объем настоящего изобретения, и предпочтительное сродство к связыванию можно обозначить как диапазон значений сродства, например от 10⁶ до 10¹⁰ М^-1, предпочтительно от 10⁷ до 10¹⁰ М^-1, лучше всего от 10⁸ до 10¹⁰ М^-1. Антитело, которое не обнаруживает достоверной перекрестной реактивности, - это антитело, которое не будет заметно связываться с нежелательным объектом (например, нежелательным напоминающим белок объектом). Например, в одном из примеров осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть, которые определенно связываются с ЕгЪВЗ, будут, в частности, связываться с молекулой этого ЕгЪВЗ, но не будут достоверно вступать в реакцию с молекулами других ЕгЪВ и не-ЕгЪВ белками или пептидами. Специфическое или селективное связывание можно определить по любой известной методике для определения такого связывания, включая, например, ЗсаЮйагб анализ и/или конкурентносвязывающие анализы.

Термин К_с, используемый в тексте описания, подразумевает константу диссоциативного равновесия особого взаимодействия антитело-антиген или сродство антитела к антигену. В одном из примеров антитело или его связывающая часть по настоящему изобретению связывают антиген (например, ЕгЪВЗ) со сродством (К_с) 50 нМ или лучше (т.е. или меньше) (например, 40, или З0, или 20, или 10 нМ, или меньше), при измерении с помощью анализа поверхностного плазмонного резонанса или анализа клеточного связывания. В конкретном примере антитело или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению связывает ЕгЪВЗ со сродством (К_с) 8 нМ или лучше (например, 7, 6, 5, 4, 2, 1.5, 1.4, 1.З, 1 нМ или меньше) при измерении с помощью анализа поверхностного плазмонного резонанса или анализа клеточного связывания. В других примерах антитело или его антигенсвязывающая часть связывают антиген (например, ЕгЪВЗ) со сродством (К_с) приблизительно менее 10^-7 М, а именно приблизительно менее 10^-8, 10^-9 или 10^-10 М или еще меньше при определении с помощью технологии поверхностного

- 9 020465 плазмонного резонанса (8РК), прибор В1ЛСОКЕ 3000, с использованием рекомбинантного ЕгЬВЗ в качестве анализируемого вещества (аналита) и антитела в качестве лиганда и связывается с заданным антигеном со сродством, которое как минимум в два раза больше его сродства к связыванию с неспецифическим антигеном (например, В8А, казеин), за исключением заданного антигена или близкородственного антигена.

Термин Κ_οίϊ, используемый в данном описании, подразумевает отношение к константе скорости диссоции для диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген.

Термин ЕС₅₀, используемый в тексте описания, относится к концентрации антитела или его антигенсвязывающей части, вызывающей ответную реакцию, либо ίη νίίτο, либо ίη νίνο анализа, что составляет 50% максимальной реакции, т.е. находится посередине между максимальной реакцией и исходным уровнем.

Используемый в документе термин структура гликозилирования определяется как структура углеводных единиц, которые ковалентно присоединены к белку, более определенно к белку иммуноглобулина.

Термин естественный, используемый в тексте применительно к объекту, относится к факту того, что объект можно найти в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы), которую можно выделить из источника в природе и которая не была специально модифицирована человеком в лаборатории, является естественной.

Термин реаранжированный, используемый в описании, относится к конфигурации локуса иммуноглобулина тяжелой или легкой цепи, в котором У-сегмент располагается непосредственно рядом с сегментом Ω-ί или ί в конформации, кодирующей в основном весь У_н или У_ъ домен соответственно.

Реаранжированный локус иммуноглобулинового гена можно идентифицировать путем сравнения с зародышевой ДНК; реаранжированный локус будет иметь как минимум один рекомбинированный семизвенный/девятизвенный гомологический элемент.

Термин нереаранжированный или зародышевая конфигурация, используемый в тексте описания в применении к V сегменту, относится к конфигурации, в которой У-сегмент не рекомбинирован настолько, чтобы он находился непосредственно рядом с Ό или ί сегментом.

Термин молекула нуклеиновой кислоты, используемый в описании, подразумевает, что он включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть однонитевой или двунитевой, но предпочтительно двунитевой ДНК.

Термин изолированная молекула нуклеиновой кислоты, используемый в тексте описания применительно к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитела или части антитела (например, У_н, Уь, СИКЗ), которые связываются с ЕгЬВЗ, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело или часть антитела, не содержат другие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела, связывающиеся с антигенами, исключая ЕгЬВЗ, другие последовательности могут свободно примыкать к нуклеиновой кислоте в человеческой геномной ДНК.

Термин модифицирование или модификация, по использованию здесь, подразумевает изменение одной или более аминокислот в антителах или их антигенсвязывающих частях. Изменение может быть достигнуто добавлением, замещением или удалением аминокислоты в одной или более позициях. Изменение может быть достигнуто путем применения известных технологий, таких как РСК мутагенез. Например, в некоторых примерах антитело или его антигенсвязывающая часть, идентифицированные с помощью методов по изобретению, могут быть модифицированы и, таким образом, модифицировать сродство к связыванию антитела или его антигенсвязывающей части с ЕгЬВЗ.

Настоящее изобретение также рассматривает консервативные замещения аминокислоты в последовательностях антител по изобретению, т.е. модификации нуклеотидной и аминокислотной последовательности, которые не отменяют связывание антитела, кодированного нуклеотидной последовательностью или содержащего аминокислотную последовательность, с антигеном, т.е. ЕгЬВЗ. Консервативные замещения аминокислоты включают замещение аминокислоты в одном классе аминокислотой того же класса, где класс определяется общими физико-химическими свойствами боковой цепи аминокислоты и высокими концентрациями замещения в гомологических белках, обнаруженных в природе, как определено, например, с помощью стандартной частотообменной диаграммой Дайхоффа или диаграммой ВЬО8ИМ. Классифицировано шесть общих классов аминокислотных цепей, которые включают: Класс I (Сук); Класс II (8ег, ТЬг, Рго, А1а, О1у); Класс III (Άδη, Λφ. Οίη, О1и); Класс IV (Ηίδ, Агд, Ьук); Класс V (Не, Ьеи, Уа1, Ме!) и Класс VI (РЬе, Туг, Тгр). Например, замещение Акр на остаток другого класса III, такого как Άδη, Ο1η или О1и, является консервативным замещением. Таким образом, предсказанный остаток заменимой аминокислоты в анти-ЕгЬВЗ антителе предпочтительно заменяется другим аминокислотным остатком из того же класса. Способы идентификации нуклеотидных и аминокислотных консервативных замещений, которые не исключают антигенсвязывания, хорошо известны (см., например, ВгиттеП е! а1., ВюсЬет. З2:1180-1187 (199З); КоЬауакЫ е! а1. Рго!еш Енд. 12(10):879-884 (1999) и Вигкк е! а1. Ргос. ИаИ. Асаб. 5ά. И8А, 94:.412-417 (1997)).

- 10 020465

Термин неконсервативные замещения аминокислоты относится к замещению аминокислоты в одном классе аминокислотой из другого класса; например, замещение А1а, остаток класса ΙΙ, остатком класса III, например Акр, Акп, С1и или С1п.

Наоборот, в другом примере мутации (консервативные или неконсервативные) можно вводить беспорядочно на всей или на части последовательности, кодирующей анти-ЕгЬВЗ антитело, такие как мутагенез насыщенности, и получаемые в результате модифицированные анти-ЕгЬВЗ антитела можно профильтровать по активности связывания.

Согласованная последовательность - это последовательность, образованная из наиболее часто встречающихся аминокислот (или нуклеотидов) в семействе связанных последовательностей (см., например, ХУйтакег, Ргот Сепек ΐο С1опек. - От генов к клонам) (Уег1адкдеке11ксйай, ХУеткепп, Сегтапу 1987). В семействе белков каждая позиция в согласованной последовательности занята аминокислотой, наиболее часто встречающейся в этой позиции в семействе. Если две аминокислоты встречаются одинаково часто, любая из них может быть включена в согласованную последовательность. Согласованный каркас иммуноглобулина относится к каркасной области в согласованной иммуноглобулиновой последовательности.

Аналогичным образом согласованную последовательность для СЭК-участков можно получить оптимальным совмещением СОК аминокислотных последовательностей ЕгЬВЗ антител по настоящему изобретению.

Для нуклеиновых кислот термин существенная гомология показывает, что две нуклеиновые кислоты или их обозначенные последовательности при оптимальном совмещении и сравнении идентичны с присущими нуклеотидными вставками нуклеотида или исключениями как минимум приблизительно в 80% нуклеотидов, обычно как минимум приблизительно в 90-95% и более предпочтительно как минимум приблизительно в 98-99,5% нуклеотидов. Альтернативно, существенная гомология встречается, когда сегменты скрещиваются в условиях селективной гибридизации с комплементом нити.

Процентное сходство двух последовательностей - это функция количества идентичных позиций, общих для последовательностей (т.е. % гомология = количество идентичных позиций/суммы количества позиций х 100), с учетом количества пропусков=гэпов и длины каждого пропуска, которые необходимо ввести для оптимального совмещения этих двух последовательностей. Сравнить последовательности и определить процентное сходство двух последовательностей можно с помощью математического алгоритма, как описано в примерах ниже, которые этим не ограничиваются.

Процентное сходство двух нуклеотидных последовательностей можно определить с помощью программы САР в программном обеспечении ССС, с применением ЖУ8дарйпа. СМР матрица и значение пропуска 40, 50, 60, 70 или 80 и значение длины 1, 2, З, 4, 5 или 6. Процентное сходство двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей можно также определить с помощью алгоритма Е. Мейерса и В. Миллера (Е. Меуегк апй У. МШег) (САВ1О8, 4:11-17 (1989)), который включен в АиСЫ программу (версия 2.0), с применением таблицы остатка значения РАМ120, штраф за длину пропуска в последовательности 12 и штраф за пропуск в последовательности 4. Кроме того, процентное сходство двух аминокислотных последовательностей можно определить с помощью алгоритма Нидлмана и Вунша (ЫееШетап и ХУппксН) (I. Мо1. Вю1. (48):444-45З (1970)), который включен в САР программу в пакете программ ССС, с применением либо В1оккит 62 матрицы, либо РАМ250 матрицы, значение пропуска 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и значение длины 1, 2, З, 4, 5 или 6.

Нуклеиново-кислотные и белковые последовательности в соответствии с настоящим изобретением можно, кроме того, использовать как запросную последовательность для поиска по общей базе данных, например, чтобы идентифицировать сходные последовательности. Такие исследования можно выполнять с помощью программ ЫВЬА8Т и ХВЬА8Т (версия 2.0), Айксйи1, е1 а1. (1990), I. Мо1. Вю1. 215:40З-10. ВЬА8Т поиски нуклеотида можно выполнять с помощью программы ЫВЬА8Т, оценка = 100, длина слова = 12 для получения нуклеотидной последовательности, гомологичной молекулам нуклеиновой кислоты по изобретению. ВЬА8Т поиски белка можно выполнять с помощью программы ХВЬА8Т, оценка = 50, длина слова = З для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белка согласно изобретению. Чтобы получить совмещения с разрывами в целях сравнения, можно использовать Саррей ВьА8Т, как описано в Айксйик е1 а1. (1997), Ыис1ею Аийк Кек. 25(17):ЗЗ89-З402. При применении программ ВЬА8Т и Саррей ВЬА8Т можно использовать значения параметров по умолчанию соответствующих программ (например, ХВЬА8Т и ЫВЬА8Т).

Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или в основном чистой форме. Нуклеиновая кислота изолированная, или считающаяся в основном чистой, если она очищена от других клеточных компонентов или других загрязнителей, например других клеточных нуклеиновых кислот или белков, с помощью стандартных технологий, включая щелочную обработку/обработку додецилсульфатом натрия (8Ό8), СкС1 связывание, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и др., известные в этой области технологии. См., Р. АикиЬе1, е1 а1., ей. Сиггеп) РгоЮсо1к ш Мо1еси1аг Вю1о§у, Сгеепе РиЬИкЫпд апй Уйеу йИегкаепсе, Ые\у Уогк (1987).

- 11 020465

Составы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, находясь часто в природной последовательности (за исключением модифицированных сайтов рестрикции и т.п.), из ДНК, геномной или их смесей могут видоизменяться, в соответствии со стандартными технологиями для создания генных последовательностей. Для кодирующих последовательностей эти мутации могут действовать на аминокислотную последовательность по мере необходимости. В частности, рассматриваются последовательности ДНК, существенно гомологичные к или полученные из нативной (природной) константы V, Ό, ΐ, переключателей и других подобных последовательностей, описание которых приведено здесь (где полученные означает, что последовательность идентична другой последовательности или модифицирована из нее).

Термин оперативно связанный относится к нуклеиново-кислотной последовательности, находящейся в функциональном отношении с другой нуклеиново-кислотной последовательностью. Например, ДНК для предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности оперативно связана с ДНК для полипептида, если она экспрессирована как предбелок, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер оперативно связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или участок связывания рибосомы оперативно связан с кодирующей последовательностью, если он размещен так, чтобы упростить трансляцию. В общем, оперативно связанный означает, что связываемые последовательности ДНК смежны и в случае секреторной лидерной последовательности смежны и находятся в фазе считывания. Однако энхансеры не должны быть смежными. Сцепление достигается сшиванием на удобных сайтах рестрикции. Если такие сайты не существуют, используются синтетические олигонуклеотидные держатели или сшивающие агенты в соответствии с обычной практикой. Нуклеиновая кислота оперативно связана, когда она находится в функциональном отношении с другой нуклеиново-кислотной последовательностью. Например, промотор или энхансер оперативно связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности. Относительно регулирующих транскрипцию последовательностей термин оперативно связанный означает, что связываемые последовательности ДНК смежны и, когда необходимо присоединить две кодирующие белок области, смежны и находятся в рамке считывания. Для последовательностей переключения оперативно связанный означает, что последовательности способны к осуществлению рекомбинации на этапе переключения.

Термин вектор, по использованию здесь, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Один тип вектора - это плазмида, относящийся к круговой двунитевой петле ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора - это вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к независимой репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный репликатор и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут объединяться с геномом клетки-хозяина после введения в клетку-хозяин и, таким образом, воспроизводятся вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы называются здесь векторы рекомбинантной экспрессии (или просто векторы экспрессии). В общем, векторы экспрессии в применении в технологиях рекомбинантных ДНК часто находятся в форме плазмид. Термины плазмида и вектор могут использоваться попеременно. Однако изобретение рассчитано на включение и других подобных форм векторов экспрессии, таких как вирусные векторы (например, дефективные ретровирусы репликации, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.

Термин рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин), по использованию здесь, относится к клетке, в которую введен вектор рекомбинантной экспрессии. Следует понимать, что такие термины относятся не только к конкретной клетке-объекту, но и потомству такой клетки. Поскольку некоторые модификации могут встречаться в последующих поколениях вследствие мутации или экологических воздействий, такое потомство не может быть, в действительности, идентично материнской клетке, но еще включено в рамки термина клетка-хозяин, используемого в тексте настоящего описания.

Термины лечить и лечение, используемые в описании, относятся к терапевтическим или профилактическим мерам, описание которых приводится здесь. В методах лечения используется введение субъекту антитела или его антигенсвязывающую часть в соответствии с настоящим изобретением, например субъекту, имеющему болезнь или нарушение, ассоциированное с ЕгЬВЗ-зависимой передачей сигнала, или предрасположенному к наличию такой болезни или нарушению, с целью предотвращения, излечения, замедления, уменьшения тяжести заболевания или улучшения одного или более симптомов болезни или нарушения или повторяющейся болезни или нарушения, или чтобы продлить выживание субъекта сверх ожидаемого при отсутствии такого лечения.

Термин ассоциированный с болезнью с ЕгЬВЗ-зависимой передачей сигнала или ассоциированный с нарушением с ЕгЬВЗ-зависимой передачей сигнала, по использованию здесь, включает болезненное состояние и/или симптомы, ассоциированные с болезненным состоянием, когда обнаружены повышенные уровни ЕгЬВЗ и/или активация клеточных каскадов, содержащих ЕгЬВЗ. Само собой разумеется,

- 12 020465 что ЕгЬВЗ гетеродимеризируется с другими ЕгЬВ белками, такими как ЕСЕК и ЕгЬВ2, когда обнаружены повышенные уровни ЕгЬВЗ. Соответственно, термин ассоциированный с болезнью с ЕгЬВЗ-зависимой передачей сигнала также включает болезненные состояния и/или симптомы, ассоциированные с болезненными состояниями, когда обнаружены повышенные уровни ЕСЕК/ЕгЬВЗ и/или ЕгЬВ2/ЕгЬВЗ гетеродимеров. В общем, термин ассоциированный с болезнью с ЕгЬВЗ-зависимой передачей сигнала относится к любому нарушению, началу, развитию или стойкости симптомов, для которых требуется участие ЕгЬВ. Типичные ЕгЬВЗ-опосредованные нарушения включают, но не ограничиваются этим, например, рак.

Термины рак и раковый относятся к физиологическому состоянию или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клетки. Примеры рака включают, но не ограничены, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких злокачественных опухолей включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, рак желудка, панкреатический рак (поджелудочной железы), опухоли глиальных клеток, такие как глиобластома и нейрофиброматоз, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатома, рак молочной железы, рак толстой кишки, меланома, колоректальный рак, эндометриальный рак, рак слюнной железы, рак почек, ренальный рак, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, рак печени и различные типы рака шеи и головы. В конкретном примере рак, лечение или диагностирование которого проводится с помощью методов по настоящему изобретению, выбирается из группы, включающей меланому, рак молочной железы, рак яичников, ренальный рак, рак желудочно-кишечного тракта/рак толстой кишки, рак легкого и рак предстательной железы.

Термин эффективное количество, используемый в описании, относится к такому количеству антитела или его антигенсвязывающей части, связывающего ЕгЬВЗ, которого достаточно для осуществления лечения, прогнозирования или диагностирования болезни, ассоциированной с ЕгЬВЗ-зависимой передачей сигналов, согласно приведенному здесь описанию, при введении субъекту. Терапевтически эффективное количество будет изменяться в зависимости от субъекта и состояния болезни, веса и возраста субъекта, степени тяжести заболевания, способа введения и т.п., что может быть легко определено любым специалистом. Дозировки для введения могут варьироваться, например, от приблизительно 1 нг до приблизительно 10000 мг, от приблизительно 5 нг до приблизительно 9500 мг, от приблизительно 10 нг до приблизительно 9000 мг, от приблизительно 20 нг до приблизительно 8500 мг, от приблизительно З0 нг до приблизительно 7500 мг, от приблизительно 40 нг до приблизительно 7000 мг, от приблизительно 50 нг до приблизительно 6500 мг, от приблизительно 100 нг до приблизительно 6000 мг, от приблизительно 200 нг до приблизительно 5500 мг, от приблизительно З00 нг до приблизительно 5000 мг, от приблизительно 400 нг до приблизительно 4500 мг, от приблизительно 500 нг до приблизительно 4000 мг, от приблизительно 1 мкг до приблизительно З500 мг, от приблизительно 5 мкг до приблизительно З000 мг, от приблизительно 10 мкг до приблизительно 2600 мг, от приблизительно 20 мкг до приблизительно 2575 мг, от приблизительно З0 мкг до приблизительно 2550 мкг, от приблизительно 40 мкг до приблизительно 2500 мг, от приблизительно 50 мкг до приблизительно 2475 мг, от приблизительно 100 мкг до приблизительно 2450 мг, от приблизительно 200 мкг до приблизительно 2425 мг, от приблизительно З00 мкг до приблизительно 2000 мг, от приблизительно 400 мкг до приблизительно 1175 мг, от приблизительно 500 мкг до приблизительно 1150 мг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 1125 мг, от приблизительно 1 до приблизительно 1100 мг, от приблизительно 1,25 до приблизительно 1075 мг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 1050 мг, от приблизительно 2 до приблизительно 1025 мг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 1000 мг, от приблизительно З до приблизительно 975 мг, от приблизительно З,5 до приблизительно 950 мг, от приблизительно 4 до приблизительно 925 мг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 900 мг, от приблизительно 5 до приблизительно 875 мг, от приблизительно 10 до приблизительно 850 мг, от приблизительно 20 до приблизительно 825 мг, от приблизительно З0 до приблизительно 800 мг, от приблизительно 40 до приблизительно 775 мг, от приблизительно 50 до приблизительно 750 мг, от приблизительно 100 до приблизительно 725 мг, от приблизительно 200 до приблизительно 700 мг, от приблизительно З00 до приблизительно 675 мг, от приблизительно 400 до приблизительно 650 мг, от приблизительно 500 или приблизительно 525 до приблизительно 625 мг антитела или его антигенсвязывающей части согласно настоящему изобретению. Регламенты дозирования можно регулировать для обеспечения оптимальной терапевтической реакции. Эффективное количество - это также количество, при котором любые токсические или вредные эффекты (т.е. побочные эффекты) антитела или его антигенсвязывающей части сводятся к минимуму и/или компенсируются полезными эффектами.

Термин пациент включает человеческие и другие млекопитающие субъекты, которым предоставляется профилактическое или терапевтическое лечение.

Используемый в настоящем описании термин субъект означает любого человека или живой организм помимо человека. Например, методы и составы в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться для лечения субъекта, болеющего раком. В конкретном примере субъект - это человек. Термин не принадлежащий человеческому роду живой организм включает всех позвоночных животных, например млекопитающих и немлекопитающих, таких как приматы, исключая человека, овцы, со- 1З 020465 баки, коровы, куры, земноводные, рептилии и т.д.

Термин образец относится к ткани, жидкости организма или клетке, взятой у пациента или субъекта. Обычно ткань или клетку берут у пациента, но диагноз ίη νίνο также рассматривается. В случае наличия солидной опухоли образец ткани можно брать из хирургически удаленной опухоли и подготовить для исследования, используя обычные технологии. В случае наличия лимфом и лейкозов можно брать лимфоциты, лейкозные клетки или ткани лимфы и соответственно их подготовить. Другие образцы пациента, включая мочу, слезы, серологическую, цереброспинальную жидкость, экскременты, мокроту, экстракты клетки и т.п., могут быть также пригодны для специфических опухолей.

Термины противоопухолевый препарат и антибластомное средство относится к препаратам, которые используются для лечения злокачественных новообразований, например раковых опухолей. Лекарственная терапия может использоваться самостоятельно или в сочетании с другими методами лечения, такими как хирургическое вмешательство или лучевая терапия. В лечении рака могут использоваться несколько классов препаратов, в зависимости от характера затронутого органа. Например, рак молочной железы обычно стимулируется эстрогенами, и его можно лечить препаратами, которые инактивируют половые гормоны. Таким же образом рак предстательной железы можно лечить препаратами, которые инактивируют андрогены, мужской половой гормон. Противоопухолевые препараты по настоящему изобретению включают, среди прочих, следующие средства.

- 14 020465

Противоопухолевый препарат

Антитела (а) антитела кроме антиЕгЬВЗ антител; и (Ь) анти-ЕгЬВЗ антитела, связывающие разные эпитопы

Комментарии

Антитела, которые связывают ΙΟΡ-1Κ (рецептор инсулиноподобного фактора роста тип 1), который экспрессирован

Примеры

А12 (полностью гуманизированный тАЬ)

19ϋ 12 (полностью гуманизированный тАЬ)

СР751-871 (полностью гуманизированный тАЬ) на поверхности клетки Н7С10 (гуманизированный тАЬ) возможных видов рака у а1рЬа1КЗ (мышь) человека зсРУ/РС (мышь/ Нитап сЫтега= человеческий химерный организм) ЕМ/164 (тоизе)

Антитела, которые связывают ЕОРК (рецептор эпидермального фактора роста); Мутации, влияющие на ЕОРК. экспрессию или активность, могли привести к раку

Ма1и/итаЬ (ЕМЭ72000)

ЕгЬЬих® / Се1их1таЬ (1тс1опе) УесИЫх® / РатШтитаЬ (Ат§еп) тАЬ 806 №то1ихитаЬ (ТЬегаСЛМ)

Направленный на малые молекулы=

Направленная доставка к малым молекулам ΙΟΡ1Κ

Антитела, которые связывают сМЕТ (фактор мезенхимальной, эпителиальной транзиции); член МЕТ семейства тирозинкиназ рецептора)

Анти-ЕгЬВЗ антитела, которые связывают разные эпитопы

ΙΟΡ-1Κ (рецептор инсулиноподобного фактора роста тип 1), который экспрессирован на поверхности клетки возможных видов рака у человека

АУЕО (АУ299) (АУЕО) АМОЮ2 (Ат§еп)

5ϋ5 (ΟΑ-5Ώ5) (Оепеп1есЬ)

Направленный на малые молекулы ЕОРК

ЕОРК (рецептор эпидермального фактора роста); Мутации, влияющие на ЕОРК экспрессию или активность, могли привести к раку

АЬ #14 (ММ 121-14) описанный здесь

НегсерЬп® (ТгакШгитаЬ; Оепеп1есЬ) 1В4СЗ; 2ОЮ12 (ИЗ РЬагта АО) ΝνΡ-ΑΕΨ541-Α

ΒΜδ-536,924 (1 Н-Ьепго1т1ба2о1-2у 1)-1 Н-рупбт-2-опе)

ΒΜδ-554,417

Сус1оН§ап

ТАЕ226

РЦ401

1гез5а® / ОеГШшЬ (АзНаХепеса) С1-1033 (Ρϋ 183805) (Рйгег)

ЬарайшЬ (О\У-572016) (О1ахо8тПЬКНпе)

ТукегЬ® / ЬарайшЬ ОЬо8у1а1е (8тЬЬК1те ВеесЬат)

Тагсеуа®/ Ег1ойтЬ НСЬ (ΟδΙ-774) (ΟδΙ РЬагта)

ΡΚΙ-166 (ΝονΒΓίίδ)

Ρϋ-158780

ЕКВ-569

ТугрЬовйп АО 1478(4-(3СЫогоаш11то)-6,7ШтеЙюхудитагоНпе)

- 15 020465

Направленный на малые молекулы сМЕТ сМЕТ (фактор мезенхимальной, эпителиальной транзиции); член МЕТ семейства тирозинкиназ рецептора)

РНА665752 ΑΚζ) 197

Антиметаболиты

Антиметаболит- это химическое вещество со структурой, подобной веществу (метаболит), необходимому для нормальных биохимических реакций, все же достаточно отличающееся, чтобы помешать нормальным функциям клеток, включая цитокинез.

Алкилирующие вещества

Алкилирующее антибластомное средство — это алкилирующее средство, которое прикрепляет алкильную группу к ДНК. Так как раковые клетки вообще распространяются неограниченно в большей степени, чем здоровые клетки, они более чувствительны к повреждению ДНК, и алкилирующие средства используются клинически для лечения целого ряда опухолей.

ИоигоигасП (5-Ри)

СаресбаЫпе / ХЕЬООА® (НЬК Косйе)

5- ТпЙиоготе1йу1-2'-беохуипб1пе Ме1йойеха1е зобшт (ТгехаП) (Ватт) Ка1бйехеб / Тотибех® (АзйаХапеса) Ретейехеб / АПт1а® (ЫИу)

Те§а1иг

СуЮзте АгаЪтоз1бе (Су1агаЫпе, Ага-С) / ТЬю§иапте® (О1ахо8тйЬК1те)

6- агасуйбше

6-тегсарЮригте (МегсарЮриппе, 6МР)

Агабпоргте / Агазап® (ΑΑΙΡΗΑΚΜΑ ЬЬС)

6-бпо£иапте (6-ТО) / Ригтебю1® (ТЕУА)

Реп1оз1абп / ΝϊρεηΙ® (Нозрпа 1пс.) ИибагаЫпе рйозрйа!е / Р1ибага® (Вауег НеаЙй Саге)

С1абпЬте (2-СбА, 2сЫогобеохуабепозте) / Ьеиз1абп® (Огбю Вю1есй)

К1Ьопис1еоббе КебисШзе 1пЫЬбог (ΚΝΚ)

Сус1орйозрйаппбе / СуЮхап (ВМЗ) Иеозаг (ТЕУА)

ИозГаппбе /Мйохапа® (А8ТА Меб1са)

ТЫоГера (ВебГогб, АЬгахзз, Теуа) ΒΟΝϋ-> 1,3-Ыз(2-сй1огоеГйу 1)-1пйозоигеа

ССИи-> 1,-(2-сй1огоеГйу1)-3сус1оЬеху1-1-пйгозоигеа (те1йу1 ссыи)

Нехатебзу1те1атте (АЙгеГатте, НММ) / Неха1еп® (ΜΟΙ Рйагта 1пс.) ВизиНап / Му1егап (О1ахоЗтййК1те) РгосагЬагте НСЬ /

Майбапе (Зщта Таи Рйагтасеибса1з, 1пс.)

ОасагЬагте (ОТ1С)

- 16 020465

СЫогатЬисП / Ьеикагап® (ЗтПЬКНпе ВеесЬат)

Ме1рЬа1ап / А1кегап® (О1ахоЗтПЬК1те)

СНзрЫт (СИзрЫтит, ΟϋϋΡ) / Р1а1то1 (Βπδίοΐ Муегз)

СагЬор1аПп / Рагар1аРп (ВМ8) ОхаНрЫт / Е1охПап® (ЗапоП-АуепПз из)

Ингибиторы топоизомеразы

Ингибиторы топоизомеразы - это средства химиотерапии, предназначенные для того, чтобы мешать действию ферментов топоизомеразы (топоизомераза I и И), которые представляют собой ферменты, контролирующие изменения в структуре ДНК путем катализирования разрыва и соединения снова фосфодиэфирного остова нитей ДНК во время нормального клеточного цикла.

ИохогцЫст НСЬ / ОохП® (А1га) ОаипогиЫст сПга1е / Оаипохоте® (ОПеаб)

Мйохапйопе НСЬ/КГоуатгопе (ΕΜϋ Зегопо)

АсНпотуст ϋ

Εΐοροδϊάε / Уерез|П® (ВМ8)/ ΕίορορΙιοδ® (НозрЬа, ВебГогб, Теуа Рагеп1ега1, Ею.)

ТороЮсап НСЬ / НусатПп® (О1ахо8тПЬКЬпе)

ТетрозЫе (УМ-26) / Уитоп® (ВМ8) 1ппо1есап НСЦСРТ-11)/

Сатрйэзаг® (РЬагтас1а & ирЦЬп)

Направленные на микротрубки препараты

Микротрубки - это один из компонентов клеточного скелета. Они имеют диаметр ~ 24 нм и длину от нескольких микрометров до возможно миллиметров в отростках (аксонах) нервных клеток.

Микротрубки служат в качестве структурных компонентов внутри клеток и вовлечены в многие клеточные процессы, включая митоз, цитокинез и везикулярное перемещение.

УтспзПпе / Οηοονϊη® (Ι^ίΠγ) УтЫазПпе зи11аЮ/Vе1Ьап®(015Соп11Пиеб) (ЬШу) Утоге1Ьте 1аг1га1е / НауеИнпе® (КеггеРаЬге)

Утбезте зи!рЬа1е / Е1сЬзте® (ЫПу) Рас1Пахе1 / Тахо1® (ВМ8)

Оосе1ахе1 / Тахо1еге® (Запой Ανεηίίδ из) №порагйс1е рас1Пахе1 (ΑΒΙ-007) / АЬгахапе® (АЬгах15 Вю8с1епсе, 1пс.) 1хаЬерПопе / ΙΧΕΜΡΚΑ™ (ВМ8)

- 17 020465

Ингибиторы киназы

Тирозинкиназы - это ферменты внутри клетки, которые функционируют, чтобы присоединить фосфатные группы к аминокислотному тирозину. Блокируя способность белковых тирозинкиназ функционировать, эти соединения обеспечивают инструмент контроля роста злокачественной клетки.

1тайшЬ тезу1а1е / Океуес (Яоуагйз) 8ишйшЪ та1а1е / Зи1еп1® (Рйгег) ЗогаГетЪ Юзу1а1е / Иехауаг® (Вауег) ΝίΙοΙίηίό ЪуйгосЫопйе топоЬуйгак / Тазщпа® (Иоуагйз)

Ингибиторы белка синтеза

Вызывают утрату клетки

Ь-а5рага§тазе / Е1зраг® (Мегск & Со.)

Иммунотерапевтические средства

Побуждают у больных раком проявление иммунологической реактивности

А1рЬа 1п1егГегоп

Ап§ю§епе515 1пЫЬйог / Ауазйп® (СепепТесЬ)

1Ь-2—> 1п1ег1еикт 2 (АШезкикт) / Ргокикт ® (СЫгоп)

1Ь-12—> 1п1ег1еикт 12

Гормоны

Г ормонотерапевтические методы, связанные с менопаузой и старением, направлены на увеличение количества определенных гормонов в вашем теле для компенсации возрастных или ассоциированных с болезнью гормональных отклонений.

Гормонотерапия как лечение рака либо снижает уровень специфических гормонов, либо изменяет способность рака использовать эти гормоны для роста и распространения.

ТогепнГепе сйгак / РагезЮп® (СТХ, 1пс.)

Рикезйап! / Разкйех® (АзйаХепеса) Какхйепе НСЬ / Еу1з1а® (Ы11у) Апазйагок / Апппйех® (Азйа/епеса) Ьейогок / Ретага® (БГоуагйз) Райгогок (СС8 16949А)

Ехетез1апе / Аготазт® (РЬагтас1а & Ир]оЬп)

ЬеиргоНйе асе!ак / ЕН§агй® (РТЬ и§А)

Ьиргоп® (ТАР РЬагт.)

ОозегеНп асеГак / 7о1айех® (Айга/епеса)

ТпркгеНп ратоак / ТгскСаг® (^Уа1зоп ЬаЬз)

ВизегеНп / 8ирге£ас1® (Запой Ауепйз) ИаГагеНп

СейогеПх / Секоййе® (ΕΜΩ Зегопо) ВкаМапййе / Сазойех® (АзНа/епеса)

- 18 020465

Глюкокортикоиды №1иДаппс1е / №1апбгоп® (Ανεηίΐδ РЬагт.)

Ме§е8Дго1 асеДаДе / Ме§асе® (ВМ8) 8отаДозДаД1п Апа1о§з (ОсДгеоДИе асеДаДе / 8апбозДаДт® (ЫоуаШз))

Противовоспалительные препараты, применяемые для уменьшения опухания, которое вызывает боль при раке

Ргебтзо1опе-преднизолон ОехатеДЬакопе / Оесабгоп® (ДУуеДЬ)

Ингибиторы ароматозы

Включает имидазолы

КеДосопагок

Ингибиторы тТОК

Химиотерапевтические вещества

Путь передачи сигнала по тТОК был первоначально обнаружен при исследовании иммуносупрессивного средства рапамицин. Этот высококонсервативный путь регулирует пролиферацию клетки и обмен веществ под влиянием факторов внешней среды, связывая передачу сигналов рецептора фактора роста клетки через фосфоинозитид-3киназу (ΡΙ-3Κ) с ростом клетки, пролиферациий и ангиогенезом.

8поНтиз (Каратуст) /

Каратипе® (\УуеДЬ)

ТетзйоНтиз (СС1-779) / Топзе!® (ДД/уеДЬ)

ОеРогоНтиз (АР23573) (Апаб РЬагт.) ЕуегоНтиз (ΚΑϋΟΟΙ) /СеШсап® (МоуагДДз)

Абпатуст, 5-Р1иогоигасП, СуДохт, В1еотуст, МЬотуст С, Оаипотуст, Сагттотуст,

АтторДепп, ОасДтотуст,

МЬотустз, Езрегапнстз

Один или несколько антираковых препаратов можно вводить либо одновременно, либо перед или после введения антитела или его антигенсвязывающей части согласно настоящему изобретению.

В последующих подразделах приводится подробное описание различных особенностей изобретения.

II. Способы получения антител в соответствии с изобретением.

(ί) Моноклональные антитела.

В соответствии с настоящим изобретением моноклональные антитела можно получить разными известными способами, такими как стандартная технология гибридизации соматических клеток, описание которой дано КоЫег и Мйз1ет (1975), ^а!иге, 256:495, вирусная или онкогенная трансформация В-лимфоцитов или технология фагового дисплея с использованием библиотеки генов антитела человека. В конкретных примерах осуществления настоящего изобретения антитела - это полностью моноклональные антитела человека.

Соответственно, в одном из примеров используется метод гибридомы для получения антитела, которое связывает ЕгЬБЗ. В данном методе мышь или другое соответствующее животное-хозяин может быть иммунизировано подходящим антигеном для выявления лимфоцитов, производящих или способных производить антитела, которые определенно свяжутся с антигеном, используемым для иммунизации. В качестве варианта лимфоциты могут быть иммунизированы ίη νίίτο. Лимфоциты могут затем сливаться с миеломными клетками с помощью пригодного, вызывающего слияние клеток фактора, такого как полиэтиленгликоль, с образованием клетки гибридомы (Ообт§, Мопос1опа1 АпбЬобдез: Ргтшр1ез апб Ргасбсе, р.59-103 (Асабетю Ргезз, 1986)). Питательная среда, в которой растут клетки гибридомы, анализируется на получение моноклональных антител, направленных против антигена. После идентификации клеток гибридомы, производящих антитела нужной специфичности, аффинности и/или активности, клоны могут быть подклонированы с помощью ограничения разведения и выращены стандартными способами (Ообтд, Мопос1опа1 АпбЬобдез: Ргтщр1ез апб Ргасбсе, р. 59-103 (Асабетю Ргезз, 1986)). Подходя- 19 020465 щие для этой цели питательные среды включают, например, питательную среду Ό-ΜΕΜ или ΚΡΜΙ-1640. Кроме того, клетки гибридомы могут быть выращены ίη νίνο как опухоли асцита у животного. Моноклональные антитела, выделенные субклонами, можно выделить из питательной среды, жидкости асцита или сыворотки обычными процедурами очистки иммуноглобулина, такими, например, как использование белка А-сефароза, гидроксиапатитовая хроматография, электрофорез в геле, диализ или аффиная хроматография.

В другом примере осуществления антитела и части антитела, которые связываются с ЕтЬВЗ, можно выделить из библиотек фагов антитела с помощью технологий, описанных, например, в МсСайет1у с! а1., Ыа1иге, 348:552-554 (1990). С1асккоп с! а1., Ыа1игс, 352:624-628 (1991), Маткк с! а1., I. Μοί. ΒίοΙ., 222:581597 (1991) и Нос! с! а1. (2005), Ыа!игс Вю!ссЬпо1о§у, 23, 344-348; патент США № 5223409; 5403484 и 5571698, Ьабпст с! а1.; патент США № 5427908 и 5580717, Эоусг с! а1.; патент США № 5969108 и 6172197, Μ^ϊιΙΊογΙυ с! а1. и патент США № 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081, ОтгГй!Й8 с! а1. Кроме того, можно использовать получение человеческих антител (пМ диапазон) высокой аффинности (подобия) путем перетасовки цепи (Μπγ1<5 с! а1., Вю/ТссЬпо1о§у, 10:779-783 (1992)), а также комбинаторную инфекцию и рекомбинацию ίη νί\Ό как стратегию создания больших фаговых библиотек (Аа!сгйои8с с! а1., Ыис. Аабз. Кск., 21:2265-2266 (1993)).

В конкретном примере осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, связывающиеся с ЕгЬВ3, получают с помощью технологии фагового дисплея, изложенной в Нос! с! а1., выше. В эту технологию входит генерация РаЬ-библиотеки человека с уникальной комбинацией иммуноглобулиновых последовательностей, выделенных у человеческих доноров и имеющих синтетическое разнообразие в СОК тяжелой цепи. Затем библиотека сортируется по РаЬ, которые связываются с ЕгЬВ3.

В еще одном из примеров осуществления моноклональные антитела человека, направленные против ЕгЬВ3, можно генерировать с помощью трансгенных или трансхромосомных мышей, носителей частей иммунной системы человека, вместо системы мыши (см., например, ЬопЬстд, с! а1. (1994), Ыа!игс, 368(6474):856-859; ЬопЬстд, N. с! а1. (1994), выше; рассмотренный в ЬопЬстд, N. (1994), НапбЬоок ок Ехрсптсп!а1 РЬаттасо1о§у. - Руководство по экспериментальной фармакологии, 113:49-101; ЬопЬстд, N. и Ник/ат Ώ. (1995), 1п!сгп. Ксу. 1ттипо1. 13:65-93 и Натбшд, Р. и ЬопЬстд, N. (1995), Апп. ΝΥ. Асаб. 8ст 764:536-546. См. также патенты США № 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429; авторы всех публикаций ЬопЬстд и Кау; патент США № 5545807, §иташ с! а1.; РСТ публикации № АО 92/03918, АО 93/12227, АО 94/25585, АО 97/13852, АО 98/24884 и АО 99/45962, авторы всех публикаций ЬопЬстд и Кау и РСТ публикация № АО 01/14424, Когтап с! а1.).

В другом примере осуществления человеческие антитела согласно изобретению можно индуцировать с помощью мыши, являющейся носителем человеческих иммоглобулиновых последовательностей на трансгенах и трансхромосомах, таких как мышь, являющаяся носителем человеческого трансгена тяжелой цепи и человеческой трансхромосомы легкой цепи (см., например, РСТ публикации АО 02/43478, Ыиба с! а1.).

Далее, альтернативные трансгенные системы животного, экспрессирующие человеческие иммуноглобулиновые гены, доступны в этой области и могут использоваться для увеличения анти-ЕгЬВ3 антител в соответствии с настоящим изобретением. Например, можно использовать альтернативную трансгенную систему, получившую название Хспотоизс (АЬдстх, 1пс); такие мыши описаны, например, в патенте США № 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963, Кисйсбараб с! а1.

Кроме того, альтернативная трансхромосомная система животного, экспрессирующая иммуноглобулиновые гены человека, доступна в этой области и может использоваться для увеличения анти-ЕгЬВ3 антител согласно изобретению. Например, могут использоваться мыши, содержащие как трансхромосому тяжелой цепи человека, так и трансхромосому легкой цепи человека; как описано в Тоии/ика с! а1. (2000), Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А. 97:722-727. Более того, имеются описания коров, являющихся носителем человеческой трансхромосомы тяжелой и легкой цепей (Кшгауа с! а1. (2002), №Дигс Вю!ссЬпо1о§у, 20:889-894), и их можно использовать для увеличения анти-ЕгЬВ3 антител в соответствии с настоящим изобретением.

В следующем примере антитела согласно настоящему изобретению можно приготовить с помощью трансгенного растения и/или клеток культивируемых растений (таких как, например, табак, кукуруза и ряска), которые вырабатывают такие антитела. Например, листья трансгенного табака, экспрессирующие антитела или их антигенсвязывающие части, можно использовать для получения таких антител, например применяя индуцибельный промотор (см., например, Сгатсг с! а1., Сигг. Тор. Μ^с^οЬ^ο1. 1ттипо1. 240:95-118 (1999)). Также можно использовать трансгенную кукурузу для экспрессии таких антител или их антигенсвязывающих частей (см., например, Нооб с! а1., Αбν. Ехр. Μсб. Вю1. 464:127-147 (1999)). Антитела можно также получать в больших количествах из семян трансгенного растения, включая части антитела, такие как антитела одиночной цепи ^Ρν’δ), например используя семена табака и клубни картофеля (см., например, Сопгаб с! а1., Р1ап! Μο1. Вю1. 38:101-109 (1998)). Способы получения антител или их антигенсвязывающих частей можно также найти, например, в Р18сйст с! а1., Вю!ссЬпо1. Арр1. Вюсйст. 30:99-108 (1999), Μа с! а1., Ттспбз Вю!ссЬпо1. 13:522-7 (1995); Μа с! а1., Р1ап! РЬувю1. 109:341-6 (1995);

- 20 020465 \У1Ше1ат е! а1., ВюсЬет. 8ос. Тгаик. 22:940-944 (1994) и патентах США № 6040498 и 6815184.

Специфичность связывания моноклональных антител или их частей, которые связывают ЕгЬВЗ, приготовленный по любой технологии, включая технологии, описание которых дано здесь, можно определить иммунопреципитацией или анализом связывания ίη νίίτο, таким как радиоиммуноанализ (К1А) или энзим-связанный иммуноадсорбентный анализ (ЕЫ8А). Сродство к связыванию моноклонального антитела или его части также можно определить с помощью анализа 8са!сЬагб, Миикои е! а1., Аиа1. ВюсЬет., 107:220 (1980).

В некоторых примерах осуществления изобретения антитело ЕгЬВЗ или его часть, полученные любым из описанных выше способов, можно дополнительно изменять или оптимизировать для достижения желаемой специфичности связывания и/или сродство к связыванию с помощью известных технологий, таких как, например, описаны здесь.

В одном из примеров осуществления частичные последовательности антитела, полученные из антитела ЕгЬВЗ, можно использовать для получения структурно и функционально родственных антител. Например, антитела взаимодействуют с антиген-мишенями преимущественно через аминокислотные остатки, которые расположены в шести гипервариабельных участках (СОК) тяжелой и легкой цепей. Поэтому аминокислотные последовательности в пределах СОК-участков в большей мере различны между отдельными антителами, чем между последовательностями вне СОК-участков. Поскольку СОК последовательности отвечают за большинство взаимодействий антитело-антиген, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, имитирующие свойства специфических естественных антител, построением векторов экспрессии, которые включают СОК-последовательности из специфического естественного антитела, пересаженного на каркасные последовательности из другого антитела с другими свойствами (см., например, ШесЬтаии, Ь. е! а1., 1998, №Циге, ЗЗ2:З2З-З27; 1оиек, Ρ. е! а1., 1986, №Циге, З21:522-525 и Оиееи, С. е! а1., 1989, Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8ст И.8.А. 86:10029-100ЗЗ). Такие каркасные последовательности можно получать из общих баз данных ДНК, содержащих последовательности гена антитела эмбрионального типа.

Таким образом, один или более структурных признаков анти-ЕгЬВЗ антитела согласно изобретению, таких как, например, СОК, можно использовать для создания структурно родственных анти-ЕгЬВЗ антител, которые сохраняют как минимум одно функциональное свойство антител в соответствии с настоящим изобретением, например ингибирование опосредованного ЕСР-подобным лигандом фосфорилирования ЕгЬВЗ; ингибирование передачи сигналов, опосредованной одним или несколькими из: херегулин, эпирегулин, эпиген или бирегулин, через ЕгЬВЗ; ингибирование пролиферации или клеток, экспрессирующих ЕгЬВЗ; и/или снижение уровней ЕгЬВЗ на поверхностях клеток.

В конкретном примере осуществления один или более СОК-участков, отобранных из последовательностей 8ЕС ГО N0:7-12, 8ЕС ГО ЫО:1З-18, 8ЕС ГО N0:19-24, 8ЕС ГО N009-44 и 8ЕС ГО N0:45-50, объединены рекомбинантно с известными человеческими каркасными областями и СОК-участками для создания дополнительных рекомбинантно-сконструированных анти-ЕгЬВЗ антител по изобретению. Вариабельные каркасные области тяжелой и легкой цепей можно получать из одних и тех же различных последовательностей антитела.

Специалистам в этой области хорошо известно, что СОКЗ-домены тяжелой и легкой цепей антитела играют особо важную роль в специфичности/сродстве к связыванию антитела относительно антигена (см., На11 е! а1., 1. 1тиио1., 149:1605-1612 (1992); Ро1утетк е! а1., 1. 1ттиио1., 152:5З18-5З29 (1994); 1аЬи е! а1., 1ттииоЬю1., 19З:400-419 (1995); КЬтка е! а1., Вп!. 1. Саисег, 8З:252-260 (2000); ВеФоет е! а1., 1. Мо1. Вю1, 296:8ЗЗ-849 (2000); Набег е! а1., Ргос. ИаИ. Асаб. 8οΐ. И8А, 95:8910-8915 (1998); ВатЬак е! а1., 1. Ат. СЬет. 8ос., 116:2161-2162 (1994); 0Пхе1 е! а1., 1. 1ттиио1., 157:7З9-749 (1996)). Соответственно, в некоторых примерах генерированы антитела, включающие СОКЗ-участки тяжелой и/или легкой цепи специфических антител, описанных здесь (например, 8Е0 ГО N0:9, 15, 21, 41, 47 и/или 8Е0 ГО N0:12, 18, 24, 44, 50). Антитела могут дополнительно включать СОК1 и/или СОК2 участки тяжелой и/или легкой цепи антител согласно настоящему изобретению (например, 8Е0 ГО N0:7, 8 и/или 8Е0 ГО N0:10, 11; 8ЕС ГО Ы0:1З, 14 и/или 8ЕС ГО N0:16, 17; 8ЕС ГО N0:20, 21 и/или 8ЕС ГО N0:22, 2З; 8ЕС ГО N009, 40 и/или 8Е0 ГО N0:42, 4З, или/или 8Е0 ГО N0:45, 46, и/или 8Е0 ГО N0:48, 49).

СОК1, 2, и/или З участки сконструированных антител, описанных выше, могут включать точную(ые) аминокислотную(ые) последовательность(и), как последовательности, рассмотренные здесь (например, СОК-участки АЬ #6, АЬ #З, АЬ #14, АЬ #17 или АЬ #19, представленные в 8Е0 ГО N0:7-12, 1З-18, 19-24, З9-44 и 45-50 соответственно). Однако рядовой специалист в этой области поймет, что некоторое отклонение от точных СОК-последовательностей возможно с сохранением способности антитела эффективно связываться с ЕгЬВЗ (например, консервативные замещения аминокислоты). Соответственно, в другом примере осуществления сконструированное антитело может состоять из одного или более СОК-участков, составляющих, например, 90, 95, 98, 99 или 99,5%, идентично одному или более СОК-участков АЬ #6, АЬ #З или АЬ #14.

В другом примере один или более остатков СОК могут быть изменены с целью модификации связывания для достижения более предпочтительной скорости ассоциации связывания. С помощью этой стратегии можно получить антитело со сверхвысоким сродством к связыванию, например 10¹⁰ М^-1 или

- 21 020465 более. Можно применять хорошо известные технологии созревания аффинности и описанные здесь технологии для изменения СИК-участка(ов) с последующей фильтрацией получаемых молекул связывания для желаемого изменения связывания. Соответственно, по мере изменения СЭК-участков изменения сродства к связыванию, а также иммуногенность можно контролировать и оценивать таким образом, чтобы получить антитело, оптимизированное для наилучшего связывания, и низкую иммуногенность.

В дополнение к или вместо модификаций в пределах СЭК-участков модификации можно также выполнять в пределах одного или более каркасных участков, РК1, РК2, РКЗ и РК4, ν-областей тяжелой и/или легкой цепи антитела, пока эти модификации не элиминируют сродство к связыванию антитела.

В другом примере осуществления антитело дополнительно модифицируется относительно эффекторной функции, чтобы повысить эффективность антитела, например, при лечении рака. Для примера, в область Рс может(ут) вводиться остаток(и) цистеина, чем обеспечивается возможность образования межцепной дисульфидной связи в этой области. Полученное таким образом гомодимерное антитело может иметь улучшенную способность интернализации и/или комплемент-зависимый клеточный лизис и антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АИСС). См. Сагоп е1 а1., ΐ. Ехр. Меб. 176:1191-1195 (1992) и §Ьоре8, В. ΐ. 1ттиио1. 148:2918-2922 (1992). Гомодимерные антитела с усиленной противоопухолевой активностью можно также приготовить с помощью гетеробифункциональных перекрестно сшивающих агентов, описанных в ^о1ГГ е1 а1. Сапсег КезеагсЬ, 5З:2560-2565 (199З). В качестве примера, можно спроектировать антитело, имеющее сдвоенные Рс-области, которые тем самым могут иметь повышенный лизис комплимента и ЛЭСС способности. См. БЮуепзоп е1 а1. Аиб-Сапсег Эгид Эе51§и, З:219-2З0 (1989).

Настоящее изобретение также рассматривает биспецифические антитела и иммуноконъюгаты, описание которых приводится ниже.

(ίί) Биспецифические антитела.

В соответствии с настоящим изобретением биспецифические антитела включают как минимум одну специфичность связывания для ЕгЬВЗ и как минимум одну специфичность связывания для другого антигена, как, например, продукт онкогена. Биспецифические антитела можно приготовить в виде антител полной длины или фрагментов антитела (например, Р(аЬ')₂ биспецифические антитела).

Способы создания биспецифических антител хорошо известны (см., например, \νϋ 05/11797З и \νϋ 06/091209). Например, получение биспецифических антител полной длины может быть основано на коэкспрессии двух иммуноглобулиновых пар тяжелой цепи-легкой цепи, где две цепи имеют разные специфичности (см., например, МПШеш е1 а1., Иа1иге, З05:5З7-5З9 (198З)). Дополнительные сведения о создании биспецифических антител можно найти, например, в БигезЬ а1., МеШобз ш Епгутокду, 121:210 (1986) и в Вгеппап а1., Баепсе, 229:81 (1985), в которых описан процесс химический связи для создания биспецифических антител. Также есть описания разных способов создания и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из рекомбинантной клеточной культуры. Например, биспецифические антитела получены с помощью лейциновых застежек (см., например, Ко51е1пу е1 а1., ΐ. 1ттипо1., 148(5):1547-155З (1992)). Существуют публикации о другой стратегии создания фрагментов биспецифических антител при помощи одноцепных Ρν (Му) димеров (см., например, ОгиЬег е1 а1., ΐ. 1ттипо1., 152:5З68 (1994)).

В конкретном примере биспецифическое антитело включает первое антитело или его связывающую часть, которая связывается с ЕгЬВЗ, и второе антитело или его связывающую часть, которая связывается с ЕгЬВ2, ЕКЬВЗ, ЕгЬВ4, ЕОРК, 1ОР1-К, с-МЕТ, ЬеМз Υ, МиС-1, ЕрСАМ, СА125, специфическим мембранным антигеном предстательной железы, РЭОРК-а, РООРК-β, с-К1Т или любым из РОР-рецепторов.

(ίίί) Иммуноконъюгаты.

В соответствии с настоящим изобретением иммуноконъюгаты можно сформировать путем соединения антител или их антигенсвязывающих частей, описанных здесь, с другим терапевтическим средством. Пригодными средствами являются, например, цитотоксическое средство (например, химиотерапевтическое средство, токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или его фрагменты) и/или радиоактивный изотоп (т.е. радиоконъюгат). Химиотерапевтические средства, используемые при создании таких иммуноконъюгатов, описаны выше. Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают дифтерийную А-цепь, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, экзотоксинную Ацепь (из синегнойной пневмонии), рициновую А-цепь, абриновую А-цепь, модесиновую А-цепь, альфасарцин, белки А1еигбе8 Гогби, диантин белки, белки РЬу1о1аса атепсапа (РАР1, РАР11 и РАР-Б), ингибитор момордики харантской, курцин, кротин, ингибитор сапаонарии целебной, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотесины. Существует целый ряд радиоизотопов для получения радиоконъюгатных анти-ЕгЬВЗ антител. Среди примеров ²¹²Вц ^1З11, ^1З11п, ⁹⁰Υ и ¹⁸⁶Ке.

В соответствии с настоящим изобретением иммуноконъюгаты можно создать с помощью разнообразных бифункциональных белок-связывающих средств, например И-сукцинимидил-З-(2пиридилдитиол)пропионат (БРИР), иминотиолан (ΙΤ), бифункциональные производные имидоэфиров (например, диметиладипинамид НСЬ), активные сложные эфиры (например, дисукцинимидил суберат), альдегиды (например, глутаральдегид), бис-азидо соединения (например, бис-(р-азидобензоил)- 22 020465 гександиамин), производные бис-диазония (например, бис-(р-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (например, толиэн 2,6-диизоцианат) и соединения бис-активного фтора (например, 1,5-дифторо2,4-динитробензол). Например, рециновый иммунотоксин можно приготовить по способу, описанному в УйеНа еί а1., 8с1Спсс. 2З8:1098 (1987). Углерод-14-меченая 1-изоцианатобензил-З-метилдиэтилен триамин эпентауксусная кислота (МХ-ЭТРА) является примером хелирующего агента для конъюгации радионуклеотида к антителу (см., например, \У0 94/11026).

III. Способы скрининга антител в соответствии с изобретением.

После создания антител или антигенсвязывающих частей, которые связываются с ЕгЪВЗ, такие антитела или их части можно определять по различным свойствам, например, описанным здесь, с помощью ряда известных в этой области анализов.

В одном из примеров осуществления изобретения антитела или их антигенсвязывающие части определяются по способности ингибировать опосредованное ЕОР-подобным лигандом фосфорилирование ЕгЪВЗ. Это можно выполнить путем обработки клеток, экспрессирующих ЕгЪВЗ, ЕОР-подобным лигандом при наличии и отсутствии антитела или его антигенсвязывающей части. После этого клетки можно лизировать, а необработанные лизаты центрифунгировать для удаления нерастворимого вещества. Фосфорилирование ЕгЪВЗ можно измерить, например, вестерн-блоттингом с последующим зондированием антифосфотирозиновым антителом, как описано в К1т еί а1. выше и в примерах ниже.

В других примерах осуществления изобретения антитела и антигенсвязывающие части дополнительно определяются по одному или нескольким из следующих свойств: (1) ингибирование опосредованной ЕгЪВЗ-лигандом (например, херегулин, эпирегулин, эпиген или бирегулин) передачи сигналов через ЕгЪВЗ; (2) ингибирование пролиферации клеток, экспрессирующих ЕгЪВЗ; (З) способность снижать уровни ЕгЪВЗ на поверхности клети (например, вызывая интернализацию ЕгЪВЗ); (4) ингибирование УЕОР секреции клеток, экспрессирующих ЕгЪВЗ; (5) ингибирование перемещения клеток, экспрессирующих ЕгЪВЗ; (6) ингибирование шаровидного роста клеток, экспрессирующих ЕгЪВЗ; и/или (7) связывание с эпитопом, расположенным на домене I ЕгЪВЗ, каждый из которых может быть легко измерен с помощью известных технологий и технологий, рассмотренных здесь.

Ингибирование опосредованной одним херегулином, эпирегулином, эпигеном или бирегулином или их совокупностью передачи сигнала через ЕгЪВЗ можно легко измерить с помощью стандартных анализов, описание которых дано в Ηοτκί еί а1. выше. Например, способность антитела или его антигенсвязывающей части ингибировать опосредованную херегулином, эпирегулином, эпигеном или бирегулином передачу сигнала через ЕгЪВЗ можно измерить с помощью анализов киназной активности для известных субстратов ЕгЪВЗ, таких, например, как §НС и РЕЗК, что описано, например, в Ηοτκί еί а1. выше, 8ибо еί а1. (2000), Мебюбк Еигуто1., З22:З88-92 и Могдаи еί а1. (1990), Еиг. ί. ВюсЪет, 191:761-767, после стимуляции одного херегулина, эпирегулина, эпигена или бирегулина или их совокупностью. Соответственно, клетки, экспрессирующие ЕгЪВЗ, могут стимулироваться одним херегулином, эпирегулином, эпигеном или бирегулином или их совокупностью и культивироваться антителом-кандидатом или его антигенсвязывающей частью. Клеточные лизаты, приготовленные впоследствии из таких клеток, могут образовывать иммунопреципитат с антителом для субстрата ЕгЪВЗ (или белок в клеточном пути метаболизма, включающем ЕгЪВЗ), например анти-ЖК-1 антитело, и подвергаться анализу на активность киназы (например, активность ШК-киназы или активность РВ-киназы) с применением известных технологий. Уменьшение или полная потеря уровня или активности (например, активности киназы) ЕгЪВЗ субстрата или белка на пути, включающем ЕгЪВЗ, при наличии антитела или его антигенсвязывающей части, относительно уровня или активности при отсутствии антитела или его антигенсвязывающей части, является индикатором антитела или его антигенсвязывающей части, которое ингибирует передачу сигналов, опосредованную одним херегулином, эпирегулином, эпигеном или бирегулином или их совокупностью.

В некоторых примерах антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют опосредованную ЕгЪВЗ-лигандом (например, херегулином, эпирегулином, эпигеном или бирегулином) передачу сигналов уменьшением связывания одного херегулина, эпирегулина, эпигена или бирегулина или их совокупности, с ЕКЪВЗ.

Для выбора тех антител или их антигенсвязывающих частей, которые ингибируют связывание одного херегулина, эпирегулина, эпигена или бирегулина или их совокупности с ЕгЪВЗ, клетки, экспрессирующие ЕгЪВЗ (например, МАЬМЕ-ЗМ клетки, как описано в примерах ниже), могут контактировать с меченым ЕгЪВЗ-лигандом (например, меченный радиоизотопом херегулин, эпирегулин, эпиген или бирегулин) при отсутствии (контроль) или наличии анти-ЕгЪВЗ антитела или его антигенсвязывающей части. Если антитело или его антигенсвязывающая часть ингибируют херегулин, эпирегулин, эпиген или бирегулин, связанный с ЕгЪВЗ, то будет наблюдаться статистически значимое уменьшение количества восстановленной метки (например, меченный радиоизотопом херегулин, эпирегулин, эпиген или бирегулин) относительно количества при отсутствии антитела или его антигенсвязывающей части.

Антитело или его антигенсвязывающая часть могут ингибировать связывание ЕгЪВЗ-лиганда (например, херегулин, эпирегулин, эпиген или бирегулин) любым механизмом. Например, антитело или его антигенсвязывающая часть могут ингибировать связывание ЕгЪВЗ лиганда (например, один херегулин,

- 2З 020465 эпирегулин, эпиген или бирегулин или их совокупность) с ЕгЬВЗ за счет связывания с тем же участком или перекрывающимся участком на ЕгЬВЗ, как ЕгЬВЗ лиганд. В качестве варианта антитело или его антигенсвязывающая часть могут ингибировать связывание ЕгЬВЗ лиганда за счет изменения или деформирования конформации ЕгЬВЗ так, что он становится неспособен связываться с ЕгЬВЗ лигандом.

Антитела и их антигенсвязывающие части, которые снижают уровни ЕгЬВЗ на поверхности клеток, можно идентифицировать их способностью осуществлять понижающую регуляцию ЕгЬВЗ на опухолевых клетках. В некоторых примерах антитела или их антигенсвязывающие части снижают ЕгЬВЗ экспрессию клеточной поверхности, вызывая интернализацию (или увеличивая эндоцитоз) ЕгЬВЗ. Чтобы проверить это, ЕгЬВЗ можно биотинилировать и легко определить количество молекул ЕгЬВЗ на поверхности клетки, например, измерением количества биотина на монослое клеток в культуре при наличии или отсутствии антитела или его антигенсвязывающей части, например, как описано, например, в ХУаЮгтаг! е! а1., I. Вю1. СЬет. (1998), 27З:1З819-27, с последующей иммунопреципитацией ЕгЬВЗ и зондированием стрептавидином. Уменьшение детекции биотинилированного ЕгЬВЗ через какое-то время, при наличии антитела или антигенсвязывающей части, является индикатором антитела, которое уменьшает уровни ЕгЬВЗ на поверхностях клетки.

В соответствии с настоящим изобретением антитела или их антигенсвязывающие части можно также проверять на их способность ингибировать пролиферацию клеток, экспрессирующих ЕгЬВЗ, например опухолевых клеток, с помощью известных технологий, таких как анализ Се11 ТЬег Ο1ο\ν Аккау, описанный в примерах ниже (см. также, например, Маса11аη е! а1., Ргос. ИаП. Асаб. 8с! (1998), 20; 95(2):7081З; Реге/ е! а1. (1995), Саисег КекеагсЬ, 55, З92-З98).

В другом примере осуществления антитела или их антигенсвязывающие части определяются по способности ингибировать ΥΈΟ? секрецию клеток, экспрессирующих ЕгЬВЗ. Это можно выполнить с помощью хорошо известных анализов, таких как набор для ΥΈΟ? ЕЫ8А фирмы Κ&Ό 8ук!етк (МитеароНк, ΜΝ, Са!. # ЭУ29ЗВ). Подобным образом антитела или части можно определять по способности ингибировать перемещение клеток, экспрессирующих ЕгЬВЗ (например, клетки МСР-7) с помощью транс-луночного анализа (МбЬроге Согр., ВЫепса, МА, Са!. # ЕСМ552), как описано здесь.

В другом примере осуществления антитела или их антигенсвязывающие части определяются по способности ингибировать шаровидный рост клеток, экспрессирующих ЕгЬВЗ. Это выполняется с помощью анализа, который почти соответствует условиям развивающегося опухолевого роста (см., например, Негтаи е! а1. (2007), 1оита1 о£ Вюто1еси1аг Бсгеешид Е1ес!готс риЬЬса!ющ - Журнал электронного издания биомолекулярного скрининга), как описано здесь.

Антитела или их антигенсвязывающие части, которые связываются с теми же или перекрывающимися эпитопами, как одно или несколько антител в соответствии с настоящим изобретением можно также идентифицировать, используя стандартные технологии, известные в этой области и описанные здесь. Например, для скрининга антител, которые связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом на ЕгЬВЗ, связанным представляющим интерес антителом, можно выполнять анализ поперечной букетировки, как, например, описанный в Ληι^Ьοб^ек. А ЬаЬога!огу Маша1, Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога!огу, Еб. Наг1о\у авб Оа\аб Ьаве (1988).

IV. Фармацевтические составы.

С другой стороны, в настоящем изобретении предлагается состав, например фармацевтический состав, содержащий одно или комбинацию моноклональных антител или его (их) антигенсвязывающую(ие) часть(и) в соответствии с настоящим изобретением, рецептура которого разработана вместе с фармацевтически приемлемым носителем. В одном из примеров составы включают комбинацию многослойных (например, два или более) изолированных антител согласно изобретению, которые связывают разные эпитопы на ЕгЬВЗ.

В соответствии с его использованием в настоящем описании фармацевтически приемлемый носитель включает все и любые растворители, диспергенты, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие всасывание средства и подобные физиологически совместимые средства. Предпочтительно, чтобы носитель был пригоден для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или вливания). В зависимости от способа введения активное соединение, т.е. антитело, биспецифическая и мультиспецифическая молекула, может быть покрыто веществом для защиты соединения от воздействия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать соединение.

Фармацевтически приемлемая соль относится к соли, которая сохраняет нужную биологическую активность исходного соединения и не оказывает какое-либо нежелательное токсикологическое воздействие (см., например, Вегде, 8.М., е! а1. (1977), I. РЬагт. 8с! 66:1-19). Примеры таких солей включают соли присоединения кислоты и соли присоединения основания. Соли присоединения кислоты включают соли, полученные из нетоксичных неорганических кислот, таких как соляная, азотная, фосфорная, серная, гидробромистая, йодисто-водородная, фосфористая кислоты и т.п., а также из нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидрооксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфокислоты и т.п. Соли присоединения основания включают соли, полученные из щелочно-земельных

- 24 020465 металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также из нетоксичных органических аминов, таких как Ν,Ν'-дибензилэтилендиамин, Ν-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, новокаин и т.п.

Фармацевтические составы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно вводить отдельно или в комбинированной терапии, т.е. в сочетании с другими средствами. Например, комбинированная терапия может включать состав в соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, такими как противораковые средства, описание которых приводится ниже. Фармацевтические составы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно также вводить совместно с лучевой терапией и/или хирургическими вмешательствами.

Состав в соответствии с настоящим изобретением можно вводить самыми разными известными способами. По выбору специалиста в этой области путь и/или способ введения будет зависеть от желаемых результатов. Активные соединения можно приготовить с носителями, которые обеспечат защиту соединения от быстрого высвобождения, такими как состав контролируемого высвобождения, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биоразлагаемые, биологически совместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы приготовления таких составов запатентованы или, как правило, известны специалистам в этой области. См., например, Зийашей апй Сойго11ей Ке1еаке Огид ОеПуегу §ук1етк. - Системы доставки лекарств с замедленным и регулируемым высвобождением, 1К. КоЬшкоп, ей., Магсе1 Эеккег, 1пс., Νον Уогк, 1978.

Чтобы ввести соединение, предлагаемое в изобретении, с помощью определенных способов введения, может потребоваться покрыть соединение веществом или ввести соединение совместно с веществом, чтобы предотвратить его инактивацию. Например, соединение можно вводить субъекту в пригодном носителе, например в липосомах или разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают солевой раствор и водные буферные растворы. Липосомы включают водно-жировые-водные ССЕ эмульсии, а также обычные липосомы (§1гс|ап е! а1. (1984), ί. №иго1ттипо1. 7:27).

Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки с целью приготовления для немедленного приема стерильных инъецируемых растворов или дисперсии. Применение таких средств и агентов для фармацевтически активных веществ известно в этой области. За исключением того, насколько любое обычное средство или агент несовместимы с активным соединением, рассматривается его применение в фармацевтических составах согласно изобретению. Эти составы могут быть также дополнены другими активными соединениями.

Терапевтические составы обычно должны быть стерильными и устойчивыми в условиях изготовления и хранения. Рецептура состава может быть приготовлена в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, пригодной для высокой концентрации лекарственного препарата. Носителем может быть растворитель или диспергент, содержащий, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их пригодные смеси. Должную текучесть можно поддерживать, например, при помощи покрытия, такого как лецитин, путем сохранения требуемого размера частиц в случае дисперсии и с помощью сурфактантов. Во многих случаях предпочтительным будет включение в состав изотонических средств, например сахаров, полиспиртов, таких как маннитол, сорбит или хлористый натрий. Пролонгированное всасывание впрыскиваемых составов может быть вызвано включением в состав средства, задерживающего всасывание, например соли моностеарата и желатин.

Стерильные впрыскиваемые растворы можно приготовить, включая активное соединение в нужном количестве в пригодный растворитель с одним компонентом или комбинацией компонентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизующей микрофильтрацией. Вообще, дисперсии готовят путем включения активного соединения в стерильный наполнитель, который содержит основной диспергент и другие необходимые компоненты из числа приведенных выше. В случае применения стерильных порошков для приготовления стерильных впрыскиваемых растворов предпочтительными методами приготовления являются вакуумная сушка и сублимационная сушка (лиофилизация), которые дают порошок активного компонента плюс любой дополнительный необходимый компонент из его раствора, предварительно стерильно отфильтрованного.

Режимы дозирования регулируются для обеспечения оптимальной желаемой реакции (например, эффективности лекарства). Например, можно вводить один болюс, можно вводить несколько разделенных доз через определенное время или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать, насколько определяет острая необходимость терапевтической ситуации. Например, человеческие антитела согласно изобретению можно вводить один или два раза в неделю подкожным впрыскиванием или один или два раза в месяц подкожным впрыскиванием.

Особенно выгодно создавать парентеральные составы в дозированной форме для упрощения введения и равномерности дозирования. Дозированная лекарственная форма=одноразовая форма в соответствии с ее использованием в настоящем описании относится к физически обособленным устройствам, пригодным для применения в виде однократных доз субъектам, проходящим лечение; каждое устройство содержит заданное количество активного соединения, рассчитанного на получение желаемого терапев- 25 020465 тического эффекта, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация на дозированные формы изобретения диктуется и непосредственно зависит от (а) индивидуальных характеристик активного соединения и конкретного достигаемого терапевтического эффекта и (Ь) ограничений, свойственных искусству составления такого активного соединения, для лечения восприимчивости у отдельных лиц.

Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеин гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфатокоферол и т.п.; и (З) металлохелирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиамин тетрауксусная кислота (ЕЭТА), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т.п.

Для терапевтических составов препараты в соответствии с настоящим изобретением включают составы, пригодные для перорального, назального, местного (включая пероральное и сублингвальное), ректального, вагинального и/или парентерального введения. Препараты можно представить в виде удобной дозированной лекарственной форме, их можно приготовить любыми способами, известными в фармацевтике. Количество активного компонента, которое можно соединять с материалом носителя для получения одной лекарственной формы, будет варьироваться в зависимости от субъекта, который проходит лечение, и конкретного способа введения. Количество активного компонента, которое можно соединять с материалом носителя для получения отдельной лекарственной формы, в большинстве случаев будет то количество состава, которое дает терапевтический эффект. Как правило, исходя из 100%, это количество составит от приблизительно 0,001 до приблизительно 90% активного компонента, предпочтительно от приблизительно 0,005 до приблизительно 70%, в наиболее предпочтительном случае от приблизительно 0,01 до приблизительно З0%.

Составы в соответствии с настоящим изобретением, пригодные для вагинального введения, также включают пессарии, тампоны, кремы, гели, пасты, пены или спреи, содержащие носители, известные в этой области как пригодные для этой цели. Лекарственные формы для местного или трансдермального введения составов в соответствии с настоящим изобретением включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и летучие препараты. Активное соединение можно смешивать в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми консервантами, буферными растворами или распыляющими веществами, которые могут потребоваться.

В соответствии с настоящим изобретением фразы парентеральное применение и применяемый парентерально означают способы введения, за исключением энтерального и местного введения, обычно инъекцией и включают, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, внутриоболочечную, внутрикапсулярную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахейную, подкожную, подкутикулярную, внутрисуставную, подкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и надчревную инъекцию и вливание.

Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно применять в фармацевтических составах в соответствии с настоящим изобретением, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их пригодные смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и впрыскиваемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Должную текучесть можно поддерживать, например, при помощи покрывающих материалов, таких как лецитин, сохранением требуемого размера частиц в случае дисперсии и при помощи сурфактантов.

Эти составы могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, увлажняющие средства, эмульгирующие вещества и диспергирующие вещества. Конкретные примеры адъювантов, хорошо известных в этой области, включают, например, неорганические адъюванты (такие как алюминиевые соли, например ортофосфат алюминия и оксид алюминия), органические адъюванты (например, сквален), адъюванты на основе масла, виросомы (например, виросомы, которые содержат мембраносвязанный гемагглютинин и нейраминидазу, полученную из вируса гриппа).

Профилактика наличия микроорганизмов может быть обеспечена как процедурами стерилизации, упомянутыми выше, так и введением различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парааминобензойной кислоты, хлорбутанола, фенол-сорбиновой кислота и т.п. Можно также по желанию включить в составы изотонические средства, такие как сахара, хлористый натрий и т.п. Кроме того, пролонгированное всасывание впрыскиваемой фармацевтической формы может быть вызвано включением средств, которые задерживают всасывание, таких как моностеарат алюминия и желатин.

Когда составы в соответствии с настоящим изобретением вводятся как фармацевтические составы людям и животным, их можно давать отдельно или в виде фармацевтического соединения, содержащего, например, 0,001-90% (более предпочтительно 0,005-70%, например 0,01-З0%) активного компонента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Независимо от выбранного способа введения соединения в соответствии с настоящим изобретением, которые можно использовать в пригодной гидратированной форме, и/или фармацевтические составы в соответствии с настоящим изобретением разработаны в виде фармацевтически приемлемых лекарственных форм обычными способами, известными специалистам в этой области.

- 26 020465

Фактические уровни дозирования активных компонентов в фармацевтических составах в соответствии с настоящим изобретением можно изменять с целью получения количества активного компонента, эффективного для достижения желаемой терапевтической реакции у конкретного пациента, состава и способа введения, не токсичного для пациента. Выбранный уровень дозирования будет зависеть от различных фармакокинетических факторов, включая активность конкретных применяемых составов в соответствии с настоящим изобретением или сложный эфир, его соль или амид, путь введения, время введения, скорость выведения конкретного используемого соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные препараты, соединения и/или вещества, используемые в комбинации с конкретными применяемыми составами, возрастом, полом, весом, режимом, общим состоянием здоровья и предшествующей историей болезни пациента, лечение которого проводится, и подобные факторы, известные в медицинской практике. Врач или ветеринар, имеющий обычный опыт в этой области, может легко определить и предписать эффективное количество необходимого фармацевтического состава. Например, врач или ветеринар может начать с уровней доз соединений в соответствии с настоящим изобретением, применяемых в фармацевтическом составе, ниже требуемых для получения желаемого терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозировку до достижения желаемого эффекта. В общем, подходящей суточной дозой состава в соответствии с настоящим изобретением будет то количество соединения, которое является самой низкой дозой, эффективной для достижения терапевтического эффекта. Такая эффективная доза, как правило, будет зависеть от факторов, описанных выше. Предпочтительно, чтобы введение было внутривенным, внутримышечным, внутрибрюшинным, или подкожным, предпочтительно как можно ближе к местонахождению мишени. По желанию, эффективная суточная доза терапевтического состава может вводиться в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или больше поддоз, вводимых отдельно через соответствующие интервалы в течение дня, по желанию, в стандартных лекарственных формах. Если есть возможность вводить соединение в соответствии с настоящим изобретением отдельно, предпочтительно вводить это соединение в виде фармацевтического препарата (состава).

Терапевтические составы можно вводить с помощью известных медицинских устройств. Например, в предпочтительном примере терапевтический состав согласно изобретению можно вводить с помощью безыгольного подкожного инъектора, такого как устройства, раскрытые в патенте США № 5399163, 5383851, 5312335, 5064413, 4941880, 4790824 или 4596556. Примеры широко известных имплантатов и модулей, пригодных для использования в настоящем изобретении, включают патент США № 4487603, который раскрывает имплантируемый микроинфузионный насос для распределения лекарства с регулируемой скоростью; патент США № 4486194, который раскрывает терапевтическое устройство для введения лекарств через кожу; патент США № 4447233, который раскрывает инфузионный насос для вливаний лекарств, обеспечивающий доставку лекарства с определенной скоростью вливания; патент США № 4447224, который раскрывает имплантируемый инфузионный прибор переменного расхода для непрерывной доставки лекарственного средства; патент США № 4439196, который раскрывает осмотическую систему доставки лекарств с многокамерными отсеками; и патент США № 4475196, который раскрывает осмотическую систему доставки лекарств. Специалистам в этой области известно много других подобных имплантатов, систем доставки и модулей.

В некоторых примерах осуществления моноклональные антитела согласно изобретению могут быть разработаны для обеспечения должного распределения ίη νίνο. Например, гематоэнцефалический барьер (ВВВ) исключает многие высокогидрофильные соединения. Для гарантии того, что терапевтические соединения согласно изобретению перекрещиваются с ВВВ (по желанию), их рецептуру можно разработать, например, в липосомах. Способы производства липосом, см., например, в патентах США № 4522811; 5374548 и 5399331. Липосомы могут включать одну или более частей, которые выборочно транспортируются в определенные клетки или органы, таким образом усиливая целенаправленную доставку лекарственного средства (см., например, У.У. Капабе (1989), 1. Οίη. РНагтасок 29:685). Примеры целенаправленности частей включают фолат или биотин (см., например, патент США № 5416016, Ьоте е! а1.); маннозиды (ите/а\уа е! а1. (1988), ВюсНет. ВюрНук. Кек. СотМип. 153:1038); антитела (Р.О. В1оетап е! а1. (1995), РЕВ§ Ье!!. 357:140; М. О\у;и5 е! а1. (1995), АпбтюгоЪ. Адеп!к СНето!йег. 39:180); сурфактант протеин А рецептор (Впксое е! а1. (1995), Ат. 1. РЬу8ю1. 1233:134), в различные образцы которых могут быть включены препараты в соответствии с настоящим изобретением, а также компоненты изобретенных молекул; р120 (§сНте1ег е! а1. (1994), 1. Вю1. СНет. 269:9090); см. также К. Кешапеп; М.Ь. Ьаиккапеп (1994), РЕВ§ Ье!!. 346:123; 1.1. КШюп; 1.1. Р1б1ег (1994), 1ттипоте!йоб8 4:273.

V. Способы применения антител согласно изобретению.

В настоящем изобретении также предлагаются способы использования антител и их антигенсвязанных частей, которые связываются с ЕгЪВ3, в различных ех νί\Ό и т νί\Ό диагностических и терапевтических применениях. Например, антитела в соответствии с настоящим изобретением можно применять для лечения болезни, ассоциированной с ЕгЪВ3-зависимой передачей сигналов, включая различные виды рака.

В одном из примеров осуществления изобретения предлагается способ лечения болезни, ассоциированной с ЕгЪВ3-зависимой передачей сигналов, путем введения субъекту антитела или его антигенсвя- 27 020465 зывающей части в соответствии с настоящим изобретением в количестве, эффективном для лечения болезни. Такие болезни включают, например, различные виды рака, включая, но не ограничиваясь этим, меланому, рак молочной железы, рак яичников, рак почки, рак желудочно-кишечного тракта, рак толстой кишки, рак легкого и рак предстательной железы.

Антитело можно вводить отдельно или с другим терапевтическим средством, которое действует в сочетании или синергично с антителом для лечения болезни, ассоциированной с ЕгЬВЗ-опосредованной передачей сигналов. Такие терапевтические средства включают, например, противоопухолевые препараты, указанные ниже (например, цитотоксины, химиотерапевтические вещества, малые молекулы и облучение).

В другом примере осуществления изобретения предлагается способ диагностирования болезни (например, рака), ассоциированной с ЕгЬВЗ повышающей регуляцией у субъекта за счет контакта антител или их антигенсвязывающих частей в соответствии с изобретением (например, ех νίνο или ίη νίνο) с клетками от субъекта и за счет измерения уровня связывания с ЕгЬВЗ на клетках. Чрезмерно высокие уровни связывания с ЕгЬВЗ указывают на то, что субъект болен болезнью, ассоциированной с ЕгЬВЗ повышающей регуляцией.

Кроме того, в объем настоящего изобретения входят наборы, включающие антитела и их антигенсвязывающие части в соответствии с настоящим изобретением, в которые, по желанию, включаются инструкции по применению во время лечения или диагностирования болезни, ассоциированной с ЕгЬВЗ повышающей регуляцией и/или с ЕгЬВЗ-зависимой передачей сигналов. В наборы может входить этикетка, показывающая назначение содержимого набора. Этикетка с указанием срока действия включает любые письменные, рекламные материалы или зарегистрированный материал, поставляемый с набором или иным образом прилагаемый к набору.

Описания других вариантов осуществления настоящего изобретения приведены в нижеследующих примерах.

Настоящее изобретение иллюстрируется примерами, которые не должны рассматриваться как ограничивающие само изобретение. Содержание перечня последовательностей, фигуры и все противопоставленные материалы, патенты и опубликованные патентные заявки, на которые даны ссылки в тексте данного описания, включены в данный документ путем ссылки.

Примеры

Материалы и способы.

Во всех примерах, если не указано иначе, использовались следующие материалы и способы.

В целом, при практическом применении настоящего изобретения используются, если не указано иначе, обычные технические приемы химии, молекулярной биологии, технологии рекомбинантной ДНК, иммунологии (особенно, например, технология антител) и стандартные технические приемы приготовления полипептидов. См., например, ЗатЬгоок, РгЬксЬ и МашаЬк, Мо1еси1аг С1отп§. - Молекулярное клонирование: Со1б Зргшд НагЬог ЬаЬогаШгу Ргекк (1989); АпЬЬобу Епдшеегшд РгоЮсо1к. - Протоколы инженерии антител (Ме!Ьобк ίη Мо1еси1аг Вю1о§у. - Технологии молекулярной биологии), 510, Раи1, 8., Нитапа Рг (1996); АпЬЬобу Епдтеегшд: А РгасЬса1 АрргоасЬ. - Практический подход (РгасЬса1 АрргоасЬ Зепек, 169), МсСаГГейу, Еб., 1г1 Рг (1996); АпИЬоб1ек: А ЬаЬогаШгу Мапиа1. - Антитела: Лабораторный справочник, Наг1о\у е1 а1., С.З.Н.Ь. Ргекк, РиЬ. (1999) и Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1о§у. Текущие протоколы молекулярной биологии, ебк. АикиЬе1 е! а1., ίο1ιπ \УПеу & Зопк (1992). Модели систем 1п νίΐΓο и 1п νίνο для анализа биологии НСУ [вирус гепатита С] описаны, например, в Се11 си11иге тобе1к апб атта1 тобе1к οί νίπι1 ЬераЬЬк. Рай II: ЬераШгк С. - Модели клеточной культуры и экспериментальные модели вирусного гепатита на животных. Часть II: гепатит С, ЬаЬ. Атт. (ΝΥ); З4(2):З9-47 (2005) и в ТЬе сЫтрап/ее тобе1 οί Ьераббк С утгик тГесЬопк. - Модель на шимпанзе вирусной инфекции гепатита С, ШАК I.; 42(2):117-26 (2001).

Клеточные линии.

Все клеточные линии, использованные в экспериментах, описание которых дано ниже, были получены из Национального института рака или подготовлены исследователями, как указано.

Клеточные линии:

МСР7 - АТСС кат. № НТВ-22,

Τ47Ό - АТСС кат. № НТВ-1ЗЗ,

Со1о-З57 - эти клетки были получены у научного исследователя и описаны в Ко1Ь е! а1. (2006), Ш!. I. Сапсег, 120:514-52З,

Όπ145 - АТСС кат. № НТВ-81,

ОУСАК 8 - источник, описание которого уже дано в предварительной заявке,

Н1975 АТСС кат. № СКЬ-5908.

Пульверизация опухолевых клеток.

Для пульверизации опухолей использовали криопульверизатор (Соуипк Шс). Опухоли хранили в специальных мешках (предварительно взвешенных перед тем, как поместить туда опухоль) и помещали в жидкий азот во время их обработки. Для небольших опухолей сначала в мешок с опухолью добавили 200 мкл лизирующего буфера, заморозили в жидком азоте и затем пульверизировали, чтобы упростить

- 28 020465 извлечение опухоли из мешка. Пульверизованные опухоли перенесли в 2-мл пробирки Эппендорфа и поместили в жидкий азот до готовности к дальнейшей обработке.

Лизис опухолевых клеток.

Опухоли были лизированы в лизирующем буфере с добавлением ингибиторов протеазы и фосфатазы. Лизирующий буфер добавили к аликвотам = определенным количествам опухоли в конечной концентрации приблизительно 62,5 мг/мл. Образцы опухоли были гомогенизированы путем интенсивного перемешивания в течение З0 с и инкубированы на льду приблизительно в течение З0 мин. Лизаты сформовали в течение приблизительно 10 мин в колонках Οί;·ι^η О|акйгеббег для последующей гомогенизации образцов. Осветленные лизаты были расфасованы в новые пробирки для последующей обработки.

ВСА анализ (количественный анализ содержания белков).

Анализ ВСА (Р1егсе) проводился по регламентированной процедуре производителя на всех образцах опухоли. Полная белковая концентрация (в мг/мл) каждого образца опухоли позже использовалась в нормализации результатов ЕЫ8А.

ЕЫ8А анализ (твердофазный иммуноферментный анализ).

Все реагенты ЕЫ8А для общих и фосфо-ЕгЪВЗ ЕЫ§А-анализов были приобретены в И&Э §ук!етк в виде Эпокс! наборов. 96-луночные планшеты №тс Мах1когЪ покрыли антителом в количестве 50 мкл и оставили на ночь на инкубацию при комнатной температуре. На следующее утро планшеты трижды промыли в 1000 мкл/лунку в устройстве для отмывки планшетов ВюТек с РВ8Т (0,05% Твин-20). Затем планшеты блокировали приблизительно в течение 1 ч при комнатной температуре 2% В8А в РВ§ (фосфатно-буферный солевой раствор). Планшеты трижды промыли с дозой раствора 1000 мкл/лунку в устройстве для отмывки планшетов ВюТек с РВ8Т (0,05% Твин-20). 50 мкл клеточных лизатов и стандартные образцы, разбавленные 50% лизирующим буфером и 1% В8А, использовали в двух экземплярах для последующей обработки. Образцы инкубировали в течение 2 ч при 4°С на планшетном шейкере и промыли трижды с дозой раствора 1000 мкл/лунку в устройстве для отмывки планшетов ВюТек с РВ8Т (0,05% Твин-20). Добавили приблизительно 50 мкл антитела детекции, разбавленного 2% В8А, добавили РВ8Т и инкубировали приблизительно в течение 1 ч при комнатной температуре. Для фосфор-ЕгЪВЗ антитело детекции непосредственно конъюгировали с пероксидазой хрена (НИР) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшет промыли трижды с дозой раствора 1000 мкл/лунку в устройстве для отмывки планшетов ВюТек с РВ8Т (0,05% Твин-20). Добавили приблизительно 50 мкл стрептавидина-НИР и инкубировали в течение З0 мин при комнатной температуре (за исключением рЕгЪВЗ). Планшеты промыли трижды РВ8Т (0,05% Твин-20) с дозой раствора 1000 мкл/лунку в устройстве для отмывки планшетов ВюТек. Добавили приблизительно 50 мкл субстрата δиρе^κ^дηа1 Рюо ЕЫ8А и считали планшет с помощью Рикюп планшет-ридера. Данные проанализировали с помощью программы ЕХСЕЬ. Двойные образцы осреднили и использовали планки погрешностей для представления стандартного отклонения между двумя репликами.

Пример 1. Получение антител с помощью фагового дисплея.

Для получения анти-ЕгЪВЗ антител человека, именуемых здесь как АЪ #6, АЪ #З, АЪ #14, АЪ #17 и АЪ #19, библиотеку человеческого РаЪ-фага, включающую уникальную комбинацию иммуноглобулиновых последовательностей, полученных от человеческих доноров (Ное! е! а1., полностью указано выше и включено в данное описание путем ссылки) сначала проверили на наличие ЕгЪВЗ связующие.

При использовании очищенного ЕгЪВЗ и клеточной линии яичника китайского хомячка, экспрессирующей поверхность клетки ЕгЪВЗ, были идентифицированы 7З уникальных РаЪ последовательностей из библиотеки. Эти 7З клона были затем перестроены как РаЪ только без фага. С помощью высокопроизводительных способов эти РаЪ были экспрессированы в маленьком масштабе и тестированы на связывание ЕЫ§А-анализом и Р1ехсЫр методом, который представляет собой высокопроизводительную технологию поверхностного плазмонного резонанса (8РИ). 7З РаЪ без фага были неравномерно нанесены на поверхность чипа, а затем были измерены кинетика связывания и блокада эпитопа по отношению к ЕгЪВЗ-Ык слитому белку-мишени или ЕгЬВЗ-Рс протеину (Ρ&Ό §ук!етк). На основании полученных данных была рассчитана константа равновесного связывания и скорости ассоциации/диссоциации для РаЪ.

Далее было проведено исследование связывания разных РаЪ с МАЬМЕ-ЗМ клетками с помощью приблизительно 500 нМ РаЪ и 1:750 раствора козьего античеловеческого А1еха 647 вторичного антитела. Как представлено на фиг. 1А и 1В, несколько РаЪ-кандидатов показали значительное окрашивание МАЬМЕ-ЗМ клеток.

Пример 2. Оптимизация анти-ЕгЪВЗ РаЪ.

После идентификации РаЪ, которые блокировали связывание ЕгЪВЗ лиганда, херегулина, с ЕгЪВЗ, У_Н и У_ъ последовательности РаЪ были кодон-оптимизированы следующим образом.

В частности, были преобразованы У_Н и У_ъ области с использованием конструкций экспрессии для экспрессии в виде ^О] или ^О: изотипа. Конструкции включали §е1ех1к остов, который имел кассету, предназначенную для замещения соответствующих последовательностей тяжелой и легкой цепей. §е1ех1к векторы включали СМУ промотор и согласующийся поли-А сигнал.

Нуклеиново-кислотные последовательности для кодон-оптимизированных У_Н и У_ъ антитела АЪ #6 изложены в последовательностях 8ЕО ГО N0:25 и 26 соответственно, а антитела АЪ #З - в последова- 29 020465 тельностях §Еф ГО N0:27 и 28 соответственно, как представлено на фиг. 22.

Пример 3. Способность к связыванию с ЕтЬВЗ.

Константы диссоциации анти-ЕгЬВЗ антител измерялись по двум независимым технологиям, т.е. анализа поверхностного плазмонного резонанса и анализа связывания клетки с помощью МАЬМЕ-ЗМ клеток.

Анализ поверхностного плазмонного резонанса.

Анализ поверхностного плазмонного резонанса (также называемый анализ Р1ехсПр) был выполнен согласно описанию в \Уа55аГ е1 а1. (2006), Апа1уИса1 ВюсЬет., 351:241-253. Значение К_с рассчитано по формуле К_с = К,|/К_а.

Значения К_с для АЬ #6 и АЬ #3 соответственно, измеренные с помощью анализа поверхностного плазмонного резонанса, представлены на фиг. 2А и 2В. Для АЬ #6 значение К_с около 4 нМ, а для АЬ #3 значение К_с около 8 нМ проиллюстировано на фиг. 2А и 2В соответственно.

Анализ связывания клетки.

Анализ связывания клетки для определения значений К_с антител АЬ #6 и АЬ #3 выполнен следующим образом.

МАЬМЕ-3М клетки были выделены 2 мл трипсина-ЕИТА + 2 мл КМР1 + 5 мМ ЕЭТА при комнатной температуре в течение 5 мин. Весь КРМ1 (10 мл) добавили сразу к трипсинизированным клеткам, осторожно ресуспендировали и обработали в настольной центрифуге Бекмана (Вестап) со скоростью 1100 об/мин в течение 5 мин. Клетки ресуспендировали в ВЭ окрашивающем буфере (РВ§ + 2% эмбриональная бычья сыворотка + 0,1% азида натрия, Бектон Дикинсон) при концентрации 2х10⁶ клеток/мл и 50 мкл (1 х 10⁵ клеток) аликвот поместили в 96-луночный титр-планшет.

Раствор 150 мкл, 200 нМ анти-ЕгЬВ3 антитела (АЬ #6 или АЬ #3) в ВЭ окрашивающем буфере приготовили в пробирке Эппендорфа и последовательно разбавили 2-кратно в 75 мкл ВЭ окрашивающего буфера. Концентрации разбавленного антитела находились в пределах от 200 до 0,4 нМ. 50 мкл аликвот разных белковых разведений добавили непосредственно к 50 мкл взвеси отмытых клеток с конечными концентрациями 100, 50, 25, 12,6, 3, 1,5, 0,8, 0,4 и 0,2 нМ антитела.

Аликвотные клетки в 96-луночном планшете инкубировали с белковыми разведениями в течение 30 мин при комнатной температуре на планшетном шейкере и промыли трижды в 300 мкл ВЭ окрашивающего буфера. Затем клетки инкубировали с 100 мкл 1:750 разведения А1еха 647 - меченого козьего античеловеческого 1дО в ВЭ окрашивающем буфере в течение 45 мин на планшетном шейкере в холодной комнате. Наконец, клетки промыли дважды, гранулировали и ресуспендировали в 250 мкл ВЭ окрашивающего буфера + 0,5 мкг/мл пропидиум йодида. Был проведен анализ 10000 клеток в РАСЗсаЬЬит проточном цитометре с использованием РЬ4 канала. Значения МР1 и соответствующие концентрации анти-ЕгЬВ3-антител нанесены на у-ось и х-ось соответственно. Значение К_с молекулы определили с помощью ОтарЬРаб РгЬт с использованием модели связывания с одним центром для нелинейной кривой регрессии.

Ки значение было рассчитано по формуле У=Втахх X/ К_с + X (Втах = флуоресценция в состоянии насыщения; Х = концентрация антитела; Υ = степень связывания). Как представлено на фиг. 2С и 2Ό, АЬ # 6 и АЬ #3 имели К_с значения примерно 4 и 1,3 нМ соответственно при анализе связывания клетки с использованием МАЬМЕ-3М клеток.

Пример 4. Специфичность связывания/Связывание эпитопа для ЕгЬВ3.

Анализ специфичности связывания эпитопа 1дО₂ антитела АЬ #6 с ЕгЬВ3 проводили с помощью ЕЬРЗА следующим образом. Идентификация эпитопа, связанного АЬ #6, также была проанализирована.

В частности, 96-луночные №.тс Мах18ОтЬ планшеты были покрыты 50 мкл белка, 5 мкг/мл (рекомбинантный человеческий ЕгЬВ3, рекомбинантный человеческий ЕОРК или несвязанный белок (В8А)) и оставили для инкубации на ночь при комнатной температуре. На следующее утро планшеты промыли трижды РВ8Т (0,05% Твин-20) с дозой раствора 1000 мкл/лунку в устройстве для отмывки планшетов ВюТек. Лунки блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре 2% В8А в РВ§. Планшеты промыли трижды РВ8Т (0,05% Твин-20) с дозой раствора 1000 мкл/лунку в устройстве для отмывки планшетов ВюТек. Примерно 50 мкл АЬ #6 добавили при нескольких разведениях (1 мкМ и последовательные 2-кратные разведения) в 2% В8А, РВ8Т. Все образцы использовались в двух экземплярах и инкубировались в течение 2 ч при 4°С на планшетном шейкере. Планшеты промыли трижды РВ8Т (0,05% Твин-20) с дозой раствора 1000 мкл/лунку в устройстве для отмывки планшетов ВюТек. Добавили 50 мкл человеческого антитела детекции 1дО (конъюгированного НКР (Ве1Ьу1 1пс; 1:75000 разведение в 2% В8А, РВ8Т)) и планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промыли трижды с дозой раствора 1000 мкл/лунку средства РВ8Т (0,05% Твин-20) в устройстве для отмывки планшетов ВюТек. Добавили 50 мкл субстрата 8ирег81§па1 Рюо ЕЬ1§А и считали планшет на Рикюп планшетридере. Данные проанализировали с помощью программы ЕХСЕЬ. Двойные образцы осреднили и планки погрешностей представили стандартное отклонение между двумя репликами.

Как представлено на фиг. 3, АЬ #6 связывался с рекомбинантным ЕгЬВ3 в ЕЬРЗА, но не проявил никакого существенного связывания с ЕОРК, В8А или ТОР-α.

- 30 020465

Фрагмент (процессинг-мутант), соответствующий аминокислотным остаткам 20-202 ЕгЬВЗ, был клонирован в векторное изображение дрожжей рУЭ2 (модифицированная версия рУЭ1 (Iην^ί^οдеη) стопкодоном, сконструированным перед Ηίδ меткой) между Ν^ и Вк1^У! сайтами рестрикции. Плазмида была преобразована в штамм дрожжей ЕВУ100 (Iην^ί^οдеη), и клоны, содержащие плазмиду, отобрали на Тгр-селективной питательной среде. Клон культивировали в глюкозе, содержащей питательную среду, в ночное время при З0°С, а экспрессию ЕгЬВЗ процессинг-мутанта индуцировали путем переноса в содержащую галактозу питательную среду в течение 2 дней при 18°С. Дрожжи, отображающие ЕгЬВЗ процессинг-мутант, окрасили в 50 нМ антитела АЬ #6, после чего козье античеловеское антитело было помечено красителем А1еха-647. Отдельный образец был окрашен козьим античеловеческим антителом только для того, чтобы показать, что нет никакого неспецифического связывания с дрожжами вторичного антитела. Анализ выполнялся цитометрией в потоке на РАС8 СаЬЬиг сортировщике клеток (ВО Вюкаепсек).

Как представлено на фиг. З0, АЬ #6 связывался с процессинг-мутантом, т.е. аминокислотными остатками 20-202 ЕгЬВЗ.

Пример 5. Понижающая регуляция общего количества ЕгЬВЗ на опухолевых клетках.

Способность АЬ #6 понижать регуляцию экспрессии ЕгЬВЗ как ίη νίίτο, так ίη νίνο в опухолевых клетках исследовали следующим образом.

МАЬМЕ-ЗМ клетки были посеяны в 96-луночные планшеты с тканевой культурой и выращены в КРМЫ640 среде, дополненной антибиотиками, 2 мМ Ь-глютамином и 10% эмбриональной бычьей сывороткой (РВ8), в течение 24 ч при З7°С и 5% диоксидом углерода. Среды затем переключили на КРМЫ640 МЕЭМ с антибиотиками, 2 мМ Ь-глютамином с и без антитела при концентрациях 1 мкМ, 250, 6З, 16, 4,0, 1,0 нМ, 240, 61 и 15 пМ. Клетки культивировали в течение 24 ч при З7°С и 5% диоксидом углерода, промыли холодным РВ8, затем собрали с помощью буфера для лизиса Легсе, 78505) белкового экстракта млекопитающего (МРЕК), содержащего 150 мМ №С1, 5 мМ пирофосфата натрия, 10 мкМ ЬρV (фен), 50 мкМ фениларсина, 1 мМ ортованадата натрия и смесь ингибиторов протеазы (8|дта, Р714). Клеточные лизаты разбавили двукратно 4% бычьим сывороточным альбумином в забуференном фосфатом физиологическом растворе 0,1% Твин-20, затем проанализировали с помощью ЕЫ8А с мышиным античеловеческим ЕгЬВЗ иммобилизованным антителом и биотинилированным мышиным античеловеческим ЕгЬВЗ вторичным антителом детекции. Сигнал был генерирован стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена, вступившей в реакцию с хемилюминесцентным субстратом (Р1егсе, З7070). Твердофазные иммуноферментные анализы (ЕЫ8А) были визуализированы с помощью люминометра.

Как представлено на фиг. 4, АЬ #6 снизил общие уровни ЕгЬВЗ примерно на 46,9% в МАЬМЕ-ЗМ клетках ш νίίτο, при измерении с помощью ЕЫ8А. В качестве контрольных использовались среды, не содержащие сыворотку и антитело.

В следующем эксперименте понижающая регуляция ЕгЬВЗ рецепторов на МАЬМЕ-ЗМ клетках при использовании !дО| и ^О₂ изотипов антитела АЬ #6 исследовалась с помощью РАС8 анализа. МАЬМЕ-ЗМ клетки обработали трипсином из 15-см чашки и промыли один раз в КРΜI + 10% эмбриональная бычья сыворотка. Дебрис ресуспендировали при плотности 1х10⁶ клеток/мл. Две аликвоты 2х10⁵ клеток добавили к 12-луночному планшету с тканевой культурой и ресуспендировали в конечном объеме 800 мкл КРΜI + 10% эмбриональная бычья сыворотка. В одну лунку добавили изотип АЬ #6 [дО] или АЬ #6 ^О₂ до конечной концентрации 100 нМ (обработанный образец), а в другую лунку добавили эквивалентный объем РВ8 (необработанный образец).

На следующий день обработанные и необработанные клетки обработали трипсином, промыли и инкубировали с 100 нМ антитела АЬ #6 в ВО окрашивающем буфере в течение З0 мин на льду. Клетки промыли дважды в 1 мл ВО окрашивающего буфера и инкубировали с 100 мкл 1:500 разведения А1еха 647-меченого козьего античеловеческого А1еха 647 в течение 45 мин на льду. Затем клетки промыли и ресуспендировали в З00 мкл ВО окрашивающего буфера + 0,5 мг/мл пропидиум йодида. Был проведен анализ 10000 клеток в РАС8саЬЬит проточном цитометре с использованием РЬ4 канала.

Как представлено на фиг. 5А и 5В, как изотипы ^О], так и изотипы ^О₂ антитела АЬ #6 понизили регуляцию ЕгЬВЗ на МАЬМЕ-ЗМ клетках примерно на 62 и примерно 66% соответственно.

Чтобы определять, было ли это уменьшение вызвано интернализацией ЕгЬВЗ рецептора на поверхности МАЬМЕ-ЗМ клеток, измерили через некоторое время экспрессию ЕгЬВЗ при наличии антитела. В частности, МАЬМЕ-ЗМ клетки обработали трипсином из 15-см чашки и промыли один раз в КРΜI + 10% эмбриональная бычья сыворотка. Дебрис ресуспендировали при плотности 1х10⁶ клеток/мл. Две аликвоты 2х10⁵ клеток добавили к 12-луночному планшету с тканевой культурой и ресуспендировали в конечном объеме 800 мкл КРΜI + 10% эмбриональная бычья сыворотка. В одну лунку добавили антиЕгЬВЗ антитело до конечной концентрации 100 нМ (обработанный образец), а в другую лунку добавили эквивалентный объем РВ8 (необработанный образец). На следующий день обработанные и необработанные клетки обработали трипсином, промыли и инкубировали с 100 нМ анти-ЕгЬВЗ антитела в ВО окрашивающем буфере в течение З0 мин на льду. Клетки промыли дважды в 1 мл ВО окрашивающего буфера и инкубировали с 100 мкл 1:500 разведения А1еха 647-меченого козьего античеловеческого А1еха 647 в течение 45 мин на льду. Затем клетки промыли и ресуспендировали в З00 мкл ВО окрашивающего бу- З1 020465 фера + 0,5 мг/мл пропидиум йодида. Был проведен анализ 10000 клеток в РАС8саИЬиг проточном цитометре с использованием РЬ4 канала.

Как представлено на фиг. 6, снижение количества ЕгЬВЗ в присутствии АЬ #6 измерялась в 0 ч (фиг. 6А), по истечении 0,5 ч (фиг. 6В), после 2 ч (фиг. 6С) и по истечении 24 ч (фиг. 6Ό). Как представлено на фиг. 6А-6Э, примерно через З0 мин количество рецепторов ЕгЬВЗ клеточной поверхности снизилось примерно на 50%, а примерно через 24 ч количество рецепторов клеточной поверхности снизилось примерно на 9З%.

Способность АЬ #6 вызывать снижение количества ЕгЬВЗ ш νίνο в клетках меланомы также была исследована следующим образом.

Вкратце, в СЬаг1ек Кйег ЬаЬк (ЛУПттдЮп, МА) были приобретены Т-дефицитные пи/пи мыши (З-4недельные женские особи из Ы1Н; аутбредные; альбинос-фенотипа). МАЬМЕ-ЗМ клетки для имплантации были выращены в культуре (КРМ1 среда, 10% РВ8, Ь-глютамин и антибиотики, З7°С, 5% СО₂) приблизительно до 80% заселенности перед сбором. Клетки держали на льду до имплантации. Мышам привили путем подкожной инъекции 100 мкл МАЬМЕ-ЗМ клеток на правом боку и обеспечили выздоровление при контроле роста начальной опухоли.

Опухоли измеряли (длина на ширину) цифровым штангенциркулем, а мышам вводили дозировано 1дС_2а (81дта, М7769-5МС) внутривенной инъекцией. Мышам вводили дозировано, внутрибрюшинно, через день либо 15 мкг, либо 100 мкг антитела номер 6, опухоли измеряли три раза в неделю и записывали в электронную таблицу Мюгокой ЕХСЕЬ.

Были проведены заключительные измерения опухоли (ЬхУ), мыши были подвергнуты эвтаназии асфиксией СО₂, опухоли были иссечены, мгновенно заморожены в жидком азоте и сохранялись при -80°С (для биохимического анализа). Заключительные измерения опухоли проанализированы и графически изображены по площади и объему опухоли, как описано, например, в Вийгит е! а1. (200З), Сапсег Кек., 6З:8912-8921. Данные были также проанализированы нормализованными и ненормализованными средствами как по объему, так и по площади опухоли. Для нормализации данных в каждый момент времени измерения каждая опухоль в каждой группе была разделена на исходный размер опухоли, определенный измерением штангенциркулем.

Как представлено на фиг. 7, среди различных антител, протестированных этим анализом, АЬ #6 вызвало снижение общего количества ЕгЬВЗ сразу после 24-часовой инъекции в опухоли, обработанные либо 1дСь либо 1дС₂ изотипом антитела АЬ #6. РВ8 использовалась как контрольная.

В следующем эксперименте исследовалась способность АЬ #6 снижать количество ЕгЬВЗ в АЭКг ксенотрансплантатах ш νίνο.

Вкратце, образцы пульверизовались в криопульверизаторе (Соуапк 1пс). Опухоли хранили в специальных мешках (предварительно взвешенных перед тем, как поместить туда опухоль) и помещали в жидкий азот во время их обработки. Для небольших опухолей сначала в мешок с опухолью добавили 200 мкл лизирующего буфера, заморозили в жидком азоте и затем пульверизировали, чтобы упростить извлечение опухоли из мешка. Пульверизованные опухоли перенесли в 2-мл пробирки Эппендорфа и поместили в жидкий азот, пока не лизируются. Опухоли подвергли лизису в лизирующем буфере с добавлением ингибиторов протеазы и фосфатазы. Лизирующий буфер добавили к аликвотам опухоли в конечной концентрации приблизительно 62,5 мг/мл. Образцы опухоли гомогенизировали путем интенсивного перемешивания в течение З0 с и выдержали на льду приблизительно в течение З0 мин. Лизаты сформовали в течение приблизительно 10 мин в колонках Ц1адеп 01акНгеййег для последующей гомогенизации образцов. Осветленные лизаты были расфасованы в новые пробирки.

Анализ ВСА выполнялся по описанию в вышеприведенном разделе о материалах и способах.

Общие уровни ЕгЬВЗ определили с помощью ЕЫ8А. Все реагенты ЕЫ8А были приобретены в К&Э 8ук1етк в виде Эпокс! наборов. 96-луночные планшеты Ыипс МахйогЬ покрыли 50 мкл соответствующего иммобилизованного антитела и оставили на ночь на инкубацию при комнатной температуре. На следующее утро планшеты трижды промыли РВ8Т (0,05% Твин-20) с дозой раствора 1000 мкл/лунку в устройстве для отмывки планшетов ВюТек, а затем блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре в 2% В8А в РВ8 (фосфатно-буферный солевой раствор). Затем планшеты трижды промыли РВ8Т (0,05% Твин-20) с дозой раствора 1000 мкл/лунку в устройстве для отмывки планшетов ВюТек. Лизаты (50 мкл) и стандартные образцы разбавили 50% лизирующим буфером и 1% В8А, все образцы использовали в двух экземплярах. Планшеты инкубировали в течение 2 ч при 4°С на планшетном шейкере и затем промыли трижды РВ8Т (0,05% Твин-20) с дозой раствора 1000 мкл/лунку в устройстве для отмывки планшетов ВюТек. Добавили 50 мкл антитела детекции, разбавленного 2% В8А, добавили РВ8Т, а планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промыли трижды РВ8Т (0,05% Твин-20) с дозой раствора 1000 мкл/лунку в устройстве для отмывки планшетов ВюТек. Добавили 50 мкл стрептавидина-НКР, а планшеты инкубировали в течение З0 мин при комнатной температуре. Планшеты снова промыли трижды РВ8Т (0,05% Твин-20) с дозой раствора 1000 мкл/лунку в устройстве для отмывки планшетов ВюТек. Добавили 50 мкл субстрата 8ирегк1дпа1 Рюо ЕЫ8А, а затем выполнили считывание на Рикюп планшет-ридере. Данные проанализировали с помощью ЕХСЕЬ. Двойные образцы

- З2 020465 осреднили и планки погрешностей показали стандартное отклонение между двумя репликами.

Результаты этого эксперимента показаны на фиг. 8. Как представлено на фиг. 8, АЬ #6 снизил количество ЕгЬВ3 в ЛОКг ксенотрансплантатах ίη νίνο.

Пример 6. Ингибирование пролиферации опухолевой клетки.

Способность АЬ #6 подавлять клеточную пролиферацию клеток, экспрессирующих ЕгЬВ3 (например, раковые клетки), исследовали следующим образом.

МАЬМЕ-3М, АСНN и NСI/Л^К^ клетки были посеяны в 96-луночные планшеты с тканевой культурой и выращены в КРМ1-1640 среде, дополненной антибиотиками, 2 мМ Ь-глютамином и 10% эмбриональной бычьей сывороткой (ЕВ8), в течение 24 ч при 37°С и 5% диоксидом углерода. Среду затем переключили на КРМ1-1640 среду с антибиотиками, 2 мМ Ь-глютамином с и без антитела при концентрациях 1 мкМ, 250, 63, 16, 4, 1 нМ, 240, 61 и 15 пМ. Клетки культивировали в течение 96 ч при 37°С и 5% диоксидом углерода, затем собрали с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток СеИТйег-СЮ® (Рготеда, С7573) и проанализировали с помощью люминометра. В качестве контрольных использовали среды, не содержащие сыворотку и антитело.

Как представлено на фиг. 9-11, антитело АЬ #6 ингибировало пролиферацию МАЬМЕ-3М клеток (фиг. 9), АЭКг клеток рака яичников (фиг. 10) и АСНN клеток (фиг. 11), которые экспрессируют ЕгЬВ3. В частности, АЬ #6 ингибировало пролиферацию МАЬМЕ-3М клеток примерно на 19,6%, при измерении с помощью анализа Се11 Тйег Ο1ο\ν. и ингибировало пролиферацию АОКг клеток рака яичников примерно на 30,5%. Кроме того, как представлено на фиг. 11, АЬ #6 ингибировало пролиферацию АСНN клеток примерно на 25,4%.

Пример 7. Ингибирование фосфорилирования ЕгЬВ3 в опухолевых клетках.

Способность АЬ #6 ингибировать пролиферацию ЕгЬВ3 ίη νίνο исследовали следующим образом.

Образцы пульверизировали с применением технологии, описанной в примере 5 выше со ссылкой на фиг. 8. Анализ ВСА был выполнен в соответствии с описанием в вышеприведенном разделе Материалы и способы, а анализ ЕЫ8А - в соответствии с описанием в примере 5 выше со ссылкой на фиг. 8.

Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 12. Как представлено на фиг. 12, антитело АЬ #6 в значительной степени ингибировало пролиферацию ЕгЬВ3 в АОКг овариальных ксенотрансплантатах ίη νίνο, при измерении количеством фосфорилированного ЕгЬВ3 (рЕгЬВ3) в нг/мг суммарного белка.

Способность АЬ #6 ингибировать индуцированное бета-целлюлином (ВТС) или херегулином (НКС) фосфорилирование ЕгЬВ3 исследовали следующим образом.

Овариальные АОКг клетки были преинкубированы с антителом АЬ #6 в течение 30 мин перед стимуляцией при помощи 50 мМ ВТС, 10 мМ НКС или 333 нМ ТСЕ-α. После преинкубации питательные среды удалили и клетки стимулировали в течение 5 мин при 37°С, 5% С0₂ с помощью 50 нМ ВТС или 333 нМ ТСЕ-α (для РЕ498). Также использовали НКС контрольные группы (5 мин, 5 нМ), 10% сывороточные и 0% сывороточные контрольные группы. Клетки промыли в 1х холодном РВ8 и лизировали в 30 мкл холодного лизирующего буфера (М-РЕК буфер плюс ванадат натрия (ЯаУ0₄, 81дта), 2-глицерофосфат, фениларсин оксид, ВрУ и ингибиторы протеазы) путем инкубации на льду в течение 30 мин. Лизаты выдерживали в течение ночи при -80°С.

В следующем эксперименте способность АЬ #6 ингибировать фосфорилирование ЕгЬВ3 в клеточных линиях овариальных опухолей 0УСАК 5 и 0УСАК 8 исследовали следующим образом.

Клеточные линии 0УСАК 5 и 0УСАК 8 получили из Национального института рака, Отдел лечения и диагностики рака (ИСТИ). Анализ ЕЫ8А был выполнен в соответствии с описанием в разделе выше Материалы и способы.

Результаты этого эксперимента изображены на фиг. 14А и 14В. Как представлено на фиг. 14А и 14В, АЬ #6 ингибировало фосфорилирование ЕгЬВ3 как в клеточных линиях рака яичников 0УСАК 5, так и в клеточных линиях рака яичников 0УСАК 8.

АЭКг клетки или МАЬМЕ-3М клетки (1х10⁵) преинкубировали с 25 мкМ анти-ЕгЬВ3 антитела АЬ #6 или 25 мкМ ЕгЬйнх (в качестве контроля) в 50 мкл ВИ окрашивающего буфера в течение 30 мин на льду. Через 30 мин к клеткам добавили 50 мкл 400-нМ биотинилированного ВТС и инкубировали еще в течение 30 мин на льду. Получили конечную концентрацию 12,5 мкМ антител и 200-нМ ВТС. Клетки затем промыли дважды в 500 мкл ВИ окрашивающего буфера и инкубировали с 100 мкл 1:200 разведения стрептавидина-РЕ (РЕ = фикоэритрин) (ίηνίίτο^η) в ВИ окрашивающем буфере в течение 45 мин. Наконец, клетки промыли дважды, ресуспендировали в 300 мкл ВИ окрашивающего буфера и проанализировали в ЕАС8са11Ьиг проточном цитометре. В качестве положительного контроля 1х10⁵ АОКг или МАЕМЕ-3М клетки инкубировали с 200-нМ ВТС в течение 30 мин на льду, промыли дважды и инкубировали с 1:200 разведением стрептавидина-РЕ в течение 45 мин. Для оценки окрашивания фона от стрептавидин-РЕ конъюгата клетки инкубировали с 100 мкл 1:200 разведения стрептавидина-РЕ только в течение 45 мин.

Результаты этого эксперимента изображены на фиг. 15А-15С. Как представлено на фиг. 15А, бетацеллюлин (ВТС) не демонстрирует никакого значительного связывания с отрицательными МАЕМЕ-3М

- 33 020465 клетками ЕгЬВ1. Однако, как представлено на фиг. 15В и 15С, ВТС действительно демонстрирует связывание с положительными АЭКг клетками ЕгЬВ 1.

Кроме того, как представлено на фиг. 15В и 15С, это связывание было блокировано ЕгЬйих, представляющее собой анти-ЕСРК антитело, которое, в частности, связывается с ЕСРК и включено как контрольное для демонстрации, что ЕОР-подобные лиганды связываются с ЕСРК, и которое описано, например, в Абатк е! а1. (2005), №!иге Вю!есЬпо1о§у, 23, 1147-1157.

Пример 8. Ингибирование херегулин-опосредованной передачи сигнала в опухолевых клетках.

Способность АЬ #6 ингибировать херегулин-опосредованную передачу сигнала в опухолевых клетках исследовали следующим образом.

МАЬМЕ-3М клетки были посеяны в 96-луночные планшеты с тканевой культурой и выращены в КРМ1-1640 питательной среде, дополненной антибиотиками, 2 мМ Ь-глютамином и 10%-ной эмбриональной бычьей сывороткой (РВЗ), в течение 24 ч при 37°С и 5% диоксидом углерода. Клетки оставили без сыворотки в КРМ1-1640 среде с антибиотиками и 2 мМ Ь-глютамином при 37°С и 5% с диоксидом углерода. Клетки предварительно обработали с и без анти-ЕгЬВ3 антитела (1дС₂ изотип антитела АЬ #6) при концентрациях 1 мкМ, 250, 63, 16, 4, 1 нМ, 240 и 61 пМ в течение 30 мин, затем стимулировали с помощью НКС1-бета 1-ЕСЬ в течение 10 мин при 37°С и 5% диоксидом углерода. Клетки промыли холодным РВЗ, затем собрали с помощью буфера для лизиса (Р1егсе, 78505) белкового экстракта млекопитающего (МРЕК), содержащего 150 мМ №С1, 5 мМ пирофосфата натрия, 10 мкМ ЬрУ (фен), 50 мкМ фениларсина, 1-мМ ортованадата натрия и смесь ингибиторов протеазы (Зщта, Р714). Клеточные лизаты разбавили двукратно 4% бычьим сывороточным альбумином в забуференном фосфатом физиологическом растворе 0,1% Твин-20, затем проанализировали с помощью ЕЫЗА на АКТ (нижележащий эффектор ЕгЬВ3) и фосфорилирование ЕгЬВ3.

Для проверки на АКТ фосфориляцию лизаты пропустили через ЕЫЗА планшет с иммобилизованным антителом, специфичным к АКТ, и антителом биотинилированной детекции, специфичным к сайту фосфорилирования на серине 473 АКТ. Сигнал был генерирован стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена, вступившей в реакцию с хемилюминесцентным субстратом (Р1егсе, 37070). Чтобы проанализировать ЕгЬВ3 фосфорилирование, лизаты прогнали на ЕЫЗА планшете с иммобилизованным антителом, специфичным к ЕгЬВ3, и антифосфотирозин антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена, с последующей реакцией с хемилюминесцентным субстратом (Р1егсе, 37070). Твердофазные иммуноферментные анализы (ЕЫЗА) были визуализированы с помощью люминометра.

Как представлено на фиг. 16А и 16В, антитело АЬ #6 - это сильный ингибитор херегулинопосредованной передачи сигналов в МАЕМЕ-3М клетках, при измерении сниженным фосфорилированием ЕгЬВ3 (фиг. 16А) и АКТ (фиг. 16В). В частности, АЬ #6 ингибировало фосфорилирование АКТ почти на 100%.

Пример 9. Ингибирование роста опухоли яичников, предстательной железы и поджелудочной железы.

Чтобы оценить эффективность АЬ #6 ш У1уо, создали несколько моделей ксенотрансплантата человеческого рака на голых мышах, оценили ингибирование роста опухоли на многократных дозах. Например, для исследований ксенотрансплантата в СЬаг1е8 Куег ЬаЬк (ЛУПпипфоп, МА) были приобретены Т-дефицитные пи/пи мыши (3-4-недельные женские особи происхождением из ΝΙΗ; аутбредные; альбинос-фенотипа). АЭКг клетки для имплантации были выращены в культуре (КРМ1 среда, 10% РВЗ, Ь-глютамин и антибиотики, 37°С, 5% СО₂) приблизительно до 85% заселенности перед сбором. Клетки держали на льду до имплантации. Мышам привили путем подкожной инъекции 100 мкл АЭКг клеток на правом боку и обеспечили выздоровление при контроле роста исходной опухоли.

Опухоли измеряли (длина на ширину) цифровым штангенциркулем, а мышам вводили дозировано 1дС_2а (Зщта, М7769-5МС) внутривенной инъекцией. Мышам вводили дозировано внутрибрюшинно через день 30 мкг или 300 мкг антитела АЬ #6, опухоли измеряли три раза в неделю и записывали в электронную таблицу МюгокоГ! ЕХСЕЬ.

Были проведены заключительные измерения опухоли (Ьх^), мыши были подвергнуты эвтаназии асфиксией СО2, опухоли были иссечены, мгновенно заморожены в жидком азоте и сохранялись при -80°С (для биохимического анализа). Заключительные измерения опухоли проанализированы и графически изображены по площади и объему опухоли, как описано, например, в ВнПгнт е! а1., упомянутой выше. Данные были также проанализированы нормализованными и ненормализованными средствами как по объему, так и по площади опухоли. Для нормализации данных в каждый момент времени измерения каждая опухоль в каждой группе была разделена на исходный размер опухоли, определенный измерением штангенциркулем.

Данные трех различных моделей, полученные из линий опухолевых клеток человека, АЭКг (овариальный), Ьн145 (простата) и ОуСАК8 (овариальный) приведены на фиг. 17А-17С, а анализ ксенотрансплантата Со1о-357 демонстрируется на фиг. 17Ό. Данные этих исследований показали, что 300-мкг доза АЬ #6, вводимая один раз в три дня (О3б), дает в результате значительное ингибирование роста опухоли (р<0,05 во многих моментах времени при исследовании). Кроме того, такое ингибирующее действие АЬ

- 34 020465 #6 далее усилилось, когда дозу увеличили до 600 мкг, Ц3й, в Эи145 модели рака предстательной железы, а также в модели ксенотрансплантата рака почки и поджелудочной железы (АСНИ и Со1о-357). Однако дальнейшее увеличение дозы до 1500 мкг О3й не привели к повышению эффективности (ОуСАК8 - фиг. 17; Со1о-357), это указывает на то, что 600 мкг является насыщающей дозой относительно ингибирования роста опухоли. Фармакокинетические (РК) анализы сыворотки от животных в результате этих исследований демонстрируют дозозависимое увеличение удержания сыворотки антитела ЛЬ #6. Аналогично, биохимический анализ внутриопухолевых уровней антитела АЬ #6 в результате этих различных исследований показал дозозависимый диапазон от 0 до ~6 пг ММ121/мкг лизата всей опухоли (данные не показаны).

Пример 10. Ингибирование связывания ЕгЬВ3 лигандов с ЕгЬВ3 на опухолевых клетках.

В следующем эксперименте специфичность антител согласно изобретению ингибировать связывание ЕгЬВ3 лигандов с ЕгЬВ3, а не ЕОР-подобных лигандов с ЕОРК исследовали следующим образом.

В одном эксперименте исследовалась специфичность АЬ #6 и РаЬ версии антитела АЬ #3 (АЬ/РаЬ #3) ингибировать связывание ЕгЬВ3 лигандов (например, херегулин и эпирегулин) с ЕгЬВ3.

Для исследования способности АЬ #6 и АЬ/РаЬ #3 ингибировать связывание херегулина с ЕгЬВ3 провели следующий эксперимент.

АЭКг клетки (1х 10⁵) были инкубированы с 10 мкМ анти-ЕгЬВ3 антитела (например, АЬ #6 или АЬ/РаЬ # 3) в 50 мкл ВИ окрашивающего буфера в течение 30 мин на льду. Через 30 мин к клеткам добавили 50 мкл из 40 нМ биотинилированного херегулина ЕОР и инкубировали еще в течение 10 мин на льду. Получили конечную концентрацию 5 мкМ антитела и 20 нМ херегулина ЕОР. Клетки промыли дважды в 500 мкл ВИ окрашивающего буфера и инкубировали с 100 мкл 1:200 разведения стрептавидина-РЕ (РЕ = фикоэритрин) (1пуйгодеп) в ВИ окрашивающем буфере в течение 45 мин. Наконец, клетки промыли дважды, ресуспендировали в 300 мкл ВИ окрашивающего буфера и проанализировали в РАСЗсаЬЬиг проточном цитометре. В качестве положительного контроля 1 х 10⁵ АЭКг клетки инкубировали с 20 нМ херегулина в течение 10 мин на льду, промыли дважды и инкубировали с 1:200 разведением стрептавидина-РЕ в течение 45 мин. Для оценки окрашивания фона от стрептавидин-РЕ конъюгата 1 х 10⁵ АЭКг клетки инкубировали с 100 мкл 1:200 разведения стрептавидина-РЕ только в течение 45 мин.

Результаты этого эксперимента показаны на фиг. 18А и 18В. Как представлено на фиг. 18А и 18В, как АЬ #6, так и АЬ/РаЬ #3 были способны ингибировать связывание херегулина с ЕгЬВ3.

Аналогично, способность АЬ #6 ингибировать связывание другого ЕгЬВ3-лиганда, эпирегулина, с ЕгЬВ3, исследовали следующим образом.

АЭКг клетки (1х10⁵) были преинкубированы с 25 мкМ АЬ #6 или 25 мкМ ЕгЬйих (в качестве контроля) в 50 мкл ВИ окрашивающего буфера в течение 30 мин на льду. Через 30 мин к клеткам добавили 50 мкл 2-мкМ биотинилированного Ер1 и инкубировали еще 30 мин на льду. Получили конечную концентрацию 12,5 мкМ антител и 1 мкМ Ерг Клетки затем промыли дважды в 500 мкл ВИ окрашивающего буфера и инкубировали с 100 мкл 1:200 разведения стрептавидина-РЕ (РЕ = фикоэритрин) (1пуйгодеп) в ВИ окрашивающем буфере в течение 45 мин. Наконец, клетки промыли дважды, ресуспендировали в 300 мкл ВИ окрашивающего буфера и проанализировали в РАСЗсаЬЬиг проточном цитометре. В качестве положительного контроля 1х10⁵ АЭКг клетки инкубировали с 1 мкМ Ер1 в течение 30 мин на льду, промыли дважды и инкубировали с 1:200 разведением стрептавидина-РЕ в течение 45 мин. Для оценки окрашивания фона от стрептавидин-РЕ конъюгата клетки инкубировали с 100 мкл 1:200 разведения стрептавидин-РЕ только в течение 45 мин.

Результаты этого эксперимента изображены на фиг. 19А и 19В. Как представлено на фиг. 19А, эпирегулин связывается с ЕгЬВ3 положительными АЭКг клетками. Кроме того, как представлено на фиг. 19В, это связывание ингибируется как ЕгЬйих, так и АЬ #6, что указывает на то, что эпирегулин может связываться как с ЕОРК, так и с ЕгЬВ3.

Еще один эксперимент был проведен для исследования, способно ли антитело АЬ #6 связывать ЕОР-подобный лиганд (например, НВ-ЕОР) с опухолевыми клетками.

АЭКг клетки (1х 10⁵) преинкубировали с 25 мкМ АЬ #6 или 25 мкМ ЕгЬйих (в качестве контроля) в 50 мкл ВИ окрашивающего буфера в течение 30 мин на льду. Через 30 мин к клеткам добавили 50 мкл из 400 нМ биотинилированного НВ-ЕОР и инкубировали еще в течение 30 мин на льду. Получили конечную концентрацию 12,5 мкМ антител и 200 нМ НВ-ЕОР. Клетки затем промыли дважды в 500 мкл ВИ окрашивающего буфера и инкубировали с 100 мкл 1:200 разведения стрептавидина-РЕ (РЕ = фикоэритрин) (1пуйгодеп) в ВИ окрашивающем буфере в течение 45 мин. Наконец, клетки промыли дважды, ресуспендировали в 300 мкл ВИ окрашивающего буфера и проанализировали в РАСЗсаПЬиг проточном цитометре. В качестве положительного контроля 1х 10⁵ АЭКг клетки инкубировали с 200 нМ НВ-ЕОР в течение 30 мин на льду, промыли дважды и инкубировали с 1:200 разведением стрептавидина-РЕ в течение 45 мин. Для оценки окрашивания фона от стрептавидин-РЕ конъюгата клетки инкубировали с 100 мкл 1:200 разведением стрептавидина-РЕ только в течение 45 мин

Как представлено на фиг. 20А и 20В, НВ-ЕОР связывается с ЕгЬВ на АЭКг клетках, а АЬ #6 не демонстрирует такое связывание, что свидетельствует о том, что антитело АЬ #6 специфично к ингибиро- 35 020465 ванию связывания ЕгЬБЗ лигандов (например, херегулин и эпирегулин) с ЕгЬБЗ.

Пример 11. Ингибирование УЕОР секреции в опухолевых клетках.

Способность АЬ #6 ингибировать УЕОР секрецию клеток, экспрессирующих ЕгЬБЗ (например, раковые клетки), исследовали с применением анализа УЕОР секреции (УЕОР ЕЬ18А набор от К&Э 8уз!етз, МДппеароЬз, ΜΝ, СаГ. # ΌΥ293Β). Сначала проанализировали способность АЬ #6 ингибировать УЕОР секрецию в необработанных и НКО-бета 1 обработанных клетках МСР-7, Τ47Ό и Со1о-357. Эти исследования показали, что Со1о-357 выделяли наибольшее количество УЕОР в питательную среду. Поскольку эти клетки также имели очень высокие уровни НКО (данные не показаны), добавление НКО в среду не смогло стимулировать дальнейшую секрецию УЕОР (фиг. 24А). И наоборот, НКО был способен стимулировать УЕОР секрецию в МСР-7 и Τ47Ό клетках.

АЬ #6 демонстрирует сильное ингибирующее действие при высоких уровнях во всех трех клеточных линиях, причем самый высокий в Со1о-357 (фиг. 24А). АЬ #6 также демонстрирует подобное действие ш νί\Ό путем ингибирования УЕОР секреции в трех разных ксенотрансплантатах, причем самое сильное в Со1о-357 ксенотрансплантате (фиг. 24В). Ингибирование УЕОР связано с ингибированием ЕгЬВ3 фосфорилирования (фиг. 24С). Ингибирование УЕОР секреции также связано с ингибированием ангиогенеза опухолевых клеток. В частности, было установлено, что факторы, секретируемые миеломной клеткой, такие как УЕОР и ЬРОР, запускают ангиогенез (см., например, Ьеипд еГ а1. (1989), ЗсДепсе, 246(4935):1306-9; Υеη е! а1. (2000), Опсодепе, 19(31):3460-9).

Пример 12. Ингибирование перемещения клетки.

Способность АЬ #6 ингибировать перемещение клеток, экспрессирующих ЕгЬВ3 (например, МСР-7 клетки), исследовали с помощью транслуночного анализа (МДШроге Согр., ВШепса, МА, СаГ # ЕСМ552). Сначала МСР-7 клетки оставили в бессывороточной среде на ночь, а затем инкубировали при наличии или отсутствии АЬ #6 (8 мкМ конечная концентрация) в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем клетки переместили в верхнюю камеру, отделенную от нижней камеры мембраной, покрытой коллагеном типа I, через которую могут перемещаться клетки. В питательную среду в нижней камере добавили 10% РВ8, чтобы он действовал как хемоатрактант при наличии или отсутствии АЬ #6. Камеры подвергли инкубации при 37 °С в течение 16 ч, а затем клетки, переместившиеся через мембрану, удалили с помощью отделяющего буфера и инкубировали с клеточно-связывающей флуоресцентной краской. Количественный анализ флуоресценции провели с помощью флуоресцентного планшет-ридера. Средняя флуоресценция ± 8ЕМ (п=2) представлена на фиг. 25.

Как представлено на фиг. 25, 10% РВ8 стимулирует перемещение клеток (канал 3) по сравнению с необработанной контрольной группой (канал 1), а 8 мкМ АЬ #6 ингибирует перемещение РВ8-индуцированных (канал 4).

Пример 13. Ингибирование шаровидного роста.

Способность АЬ #6 ингибировать шаровидный рост клеток, экспрессирующих ЕгЬВ3, исследовали с помощью анализа, который почти соответствует условиям развивающегося опухолевого роста (Негтап е! а1. (2007), 1оигпа1 о£ Вюто1еси1аг 8сгеепт§ Е1ес1готс риЬЬсаГюп). Сфероиды АбгК и ЭШ45 получили с частотой 1 сфероид на лунку в 96-луночном планшете с помощью метода висячей капли (Неггтап е! а1., 2008). Отдельные сфероиды затем обработали либо АЬ #6 (8-мкМ конечная концентрация), херегулин-β 1 ЕОР домен (К&Э 8уз1етз, МшпеароЬз, МN, СаГ # 396-НВ, 3,4 нМ конечная концентрация), либо их комбинацией, как указано. Диаметры сфероидов измерили с помощью световой микроскопии (10Х объект) в день 1-й и день 13-й.

АЬ #6 ингибирует шаровидный рост в АбгК клетках (фиг. 26А). Кроме того, 3,4 нМ НКО стимулирует шаровидный рост, а АЬ #6 ингибирует действие НКО (фиг. 26В). Сфероиды, полученные из ОШ45, не увеличились в размере в течение 13 дней эксперимента; однако рост в значительной степени стимулировался НКО1-бета 1. В этих клетках 8 мкМ АЬ #6 ингибирует шаровидный рост, вызванный НКО (фиг. 26С).

Пример 14. Ингибирование передачи сигнала.

Было проведено исследование способности АЬ #6 ингибировать передачу сигнала, вызванную разными лигандами. Например, проверили действие АЬ #6 на связывание НКО и ВТС с АбгК клетками, экспрессирующими ЕгЬВ3 рецептор. Как представлено на фиг. 27А и 27В, при применении РАС8 анализа, АЬ #6 конкурирует с НКО и не конкурирует с ВТС за связывание с АбгК клетками. Соответственно, блокировка антителом АЬ #6 связывания НКО с ЕгЬВ3 препятствовала бы передаче сигналов, вызванных НКО.

Кроме того, проверили различные лиганды на индуцирование фосфорилирования ЕгЬВ3. Три лиганда, НКО, ВТС и НОР, были способны стимулировать ЕгЬВ3-индуцированное фосфорилирование в АбгК клетках, тогда как ЕОР нет. Как представлено на фиг. 28, АЬ #6 ингибирует НОР-индуцированное фосфорилирование рЕгЬВ3 в АбгК клетках (фиг. 28). Более того, как известно в этой области (см., например, ХУаПепШз е! а1. (2000), Ат. 1. Ра1Ьо1. 156(3):821-9 10702398), усиленная передача сигналов НОР была обнаружена в различных эпителиальных и неэпителиальных опухолях.

Взаимодействие ЕгЬВ3/с-МЕТ и роль АЬ #6 в регулировании этого взаимодействия.

- 36 020465

Было продемонстрировано, что немелкоклеточные раковые опухоли легкого, содержащие активирующие мутации в рецепторе эпидермального фактора роста (ЕСЕК), развивают сопротивление тирозинкиназным ингибиторам за счет комплектования МЕТ и НЕКЗ, таким образом активируя метаболический путь Р1ЗК-АКТ клетки (Епде1тапп е! а1. (2007), §с1епсе, З16:10З9-104З; Сои (2007), ΡΝΑδ: 105(2):692-697). Связь между ЕСЕК и с-МЕТ в клеточных линиях, которые содержат активирующие ЕСЕК мутации, была хорошо установлена коиммунопреципитацией (Епде1тапп е! а1. 2007; Сои 2007). Сио е! а1. недавно продемонстрировали, что с-МЕТ и ЕгЬВЗ также существуют в комплексе в желудочной клеточной линии ΜΚΝ45, известной как зависящая от усиленной с-МЕТ, с помощью коиммунопреципитации.

Такое с-МЕТ-ЕгЬВЗ взаимодействие встречается также в АйгК клетках, содержащих ЕСЕК дикого типа, и не зависит от усиленного с-МЕТ. НСЕ (фактор роста гепатоцита) индуцирует ЕгЬВЗ фосфорилирование в АйгК клетках в дозозависимом виде, как показано на фиг. 28. Кроме того, АЬ #6 ингибирует НСЕ-индуцированное ЕгЬВЗ фосфорилирование.

Также исследовали действие НКС и ВТС и на ЕгЬВ1, и на ЕгЬВЗ фосфорилирование и обнаружили, что и НКС, и ВТС индуцируют фосфорилирование как ЕгЬВ1, так и ЕгЬВЗ. Было установлено, что НКС более сильный индуцирующий фактор ЕгЬВЗ фосфорилирования, в то время как ВТС оказался более сильным индуцирующим фактором ЕгЬВ1 фосфорилирования (фиг. 29). Такое фосфорилирование, вероятно, будет контролироваться комплексом между ЕгЬВ1 и ЕгЬВЗ. Короче говоря, НКС связывание с ЕгЬВЗ вызывает комплексообразование между ЕгЬВ1 и ЕгЬВЗ, приводящее к активации обоих рецепторов. Такой же феномен, видимо, возникает для ВТС, где ВТС связывание с ЕгЬВ1 стимулирует комплексообразование между ЕгЬВ1 и ЕгЬВЗ, приводящее к фосфорилированию как ЕгЬВ1, так и ЕгЬВЗ.

Ингибирование антителом ЕгЬВЗ фосфорилирования, стимулированного лигандом (НКС, ВТС, ЕСЕ и НСЕ).

Способность АЬ #6 ингибировать лиганд (НКС, ВТС, ЕСЕ и НСЕ)-индуцированное ЕгЬВЗ фосфорилирование исследовали следующим способом.

1. АйгК клетки поместили в 96-луночный планшет с плотностью З0000 клеток/лунку/100 мкл в КРМ1 питательной среде, содержащей 10% ЕВ§, и оставили на ночь для выращивания.

2. На следующий день клетки оставили в бессывороточной среде, заменив питательную среду на среду без ЕВ§, и оставили на ночь для выращивания.

3. Клетки предварительно обработали разными концентрациями АЬ #6 (от 0,01 до 100 нМ) или буфером (контроль) в течение 2 ч.

4. После этого клетки стимулировали 10 нМ НКС и НСЕ в течение 10 мин или 10 нМ ВТС и ЕСЕ в течение 5 мин.

5. Реакция была остановлена путем удаления культуральной среды и промыванием клеток один раз ледяным РВ§.

6. Клетки затем лизировали в 25 мМ Трис (Тпк), рН+7,5, 150 мМ №С1, 1 мМ ЕЭТА, 1,0% Тритон (ТгПоп) Х-100, 1,0% СНАР8, 10% ν/ν (об./об.) глицерине, содержащем 1Х ингибитор протеазы и 1Х ингибитор фосфатазы.

7. ЕгЬВЗ фосфорилирование измерили в клеточных лизатах, используя набор ЕЫ8А Нитап РЬокрЬо-ЕгЬВЗ (К&Э §ук!етк, М1ппеаро118, М^ Са!. # ЭУС1769) в соответствии с инструкциями производителя.

Ингибирование антителом белкового комплексообразования.

ЕгЬВ2-ЕгЬВЗ.

АйгК клетки преинкубировали с буфером (контроль) или 250 нМ АЬ #6 в течение 60 мин при комнатной температуре, затем обработали 10 нМ НКС или 10 нМ ВТС или контрольным буфером в течение 10 мин. Клетки лизировали в 25 мМ Тпк, рН 7,5, 150 мМ №С1, 1 мМ ЕЭТА, 1,0% Тгйои Х-100, 1,0% СНАР8, 10% ν/ν глицерине, содержащем 0,2 мМ РМ8Е, 50 мТЕ/мл апротинин и 100 мкМ лейпептина, и незрелый лизат кратковременно центрифугировали для удаления нерастворимого вещества. Супернатант перенесли в новую пробирку Эппендорфа и добавили анти-ЕгЬВЗ антитело (8ап!а Сги/ кс-285) при 1:500 разведении. Супернатанты инкубировали в течение ночи при легком встряхивании при 4°С. 60 мкл А/С гранул агарозы иммобилизированного белка (Р1егсе, КоскГогй, 1Ь, Са!. # 20421) сначала промыли в 1Х РВ§. Смесь клеточный лизат-антитело добавили к промытым в РВ§ гранулам и инкубировали в течение 2 ч при легком встряхивании при 4°С. Иммунопреципитаты затем промыли ледяным лизирующим буфером З раза, ресуспендировали в З0 мкл 2Х δΌδ буфера для образца, денатурировали нагреванием при 95°С в течение 7 мин и пропустили через 4-12% бис-Трис гели, δΌδ-РАСЕ, а затем выполнили электроблоттинг на РУОЕ мембрану в триглицин буфере 10% МеОН. Мембрана была блокирована в течение 1 ч в 10 мл блокирующего буфера (Ы-Сог Вюкаепсек, Ыпсо1п, ЮТ, Са!. # 927-40000) и затем инкубирована с анти-ЕгЬВ2 антителом при 1:1000 (Се11 ЗхдпаПпд ТесЬпо1оду. - Технология передачи сигнала клетки, Эапуегк, МА, Са!. # 29Ό8) в 10 мл блокирующего буфера (Ы-Сог Вюкаепсек, Са!. # 927-40000). Сигнал был обнаружен при использовании козьего антикроличьего красителя 1КЭуе800 при 1:5000 (2 мкл) в 10 мл блокирующего буфера (Ы-Сог Вюкаепсек, Са!. # 927-40000).

- З7 020465

Также было продемонстрировано, что АЬ #6 полностью ингибирует комплексообразование НКОстимулированного ЕгЬВ2/З (фиг. 29В).

Эквиваленты.

Специалисты в этой области обнаружат или смогут выявить, применяя не более чем обычную практику экспериментирования, много эквивалентов конкретных осуществлений изобретения, приведенных в данном описании. На такие эквиваленты будет распространяться приведенная ниже формула изобретения. Любая комбинация вариантов осуществлений, раскрытых в зависимых пунктах, рассматривается как входящая в объем изобретения.

Включение путем ссылки

Все публикации, патенты и ожидаемые патентные заявки, упомянутые в данном документе, тем самым полностью включены путем ссылки на них.

Claims (37)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Изолированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые связываются с ЕгЬВЗ, содержащие СИК1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий БЕЦ ГО N0:7; СГОК2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий БЕЦ ГО N0:8; СИКЗ вариабельной области тяжелой цепи, включающий БЕЦ ГО N0:9; СИК1 вариабельной области легкой цепи, включающий БЕЦ ГО N0:10; СИК2 вариабельной области легкой цепи, включающий БЕЦ ГО N0:11; и СИКЗ вариабельной области легкой цепи, включающий БЕЦ ГО N0:12.
2. 2. Изолированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые связываются с ЕгЬВЗ, содержат вариабельные области тяжелой и легкой цепей, где вариабельная область тяжелой цепи включает БЕЦ ГО N0:1.
3. 3. Изолированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые связываются с ЕгЬВЗ, содержат вариабельные области тяжелой и легкой цепей, где вариабельная область легкой цепи включает БЕЦ ГО N0:2.
4. 4. Изолированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые связываются с ЕгЬВЗ, содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую БЕЦ ГО N0:1, и вариабельную область легкой цепи, включающую БЕЦ ГО N0:2.
5. 5. Антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из предыдущих пунктов, где антитело выбирается из группы, состоящей из человеческого антитела, гуманизированного антитела, биспецифического антитела и химерного антитела.
6. 6. Антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из предыдущих пунктов, где антитело или его антигенсвязывающая часть выбираются из группы, состоящей из РаЬ, РаЬ'₂, БсРу и доменного антитела.
7. 7. Антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из предыдущих пунктов, где изотип антитела выбирается из группы, состоящей из 1дО_ь 1дО₂, 1дО_З, 1дО₄, 1дМ, 1дА_ь 1дА₂, 1дАзес, 1дИ и 1дЕ антитела.
8. 8. Антитело по п.7, где антитело является антителом изотипа 1дО₂.
9. 9. Композиция для ингибирования передачи сигнала ЕгЬВЗ, включающая антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из предыдущих пунктов в фармацевтически приемлемом носителе.
10. 10. Композиция по п.9, представляющая собой стерильный водный раствор или дисперсию, пригодные для инъекции или инфузии, или представляющая собой стерильный порошок для приготовления ех (етроге стерильного водного раствора или дисперсии, пригодных для инъекции или инфузии.
11. 11. Способ получения композиции по п.10 в форме стерильного водного раствора, включающий стерилизационную микрофильтрацию водного раствора, содержащего антитело или его антигенсвязывающую часть в фармацевтически приемлемом носителе.
12. 12. Композиция по п.9, дополнительно включающая молекулу, нацеленную на ЕОРК.
13. 13. Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела по п.1, включающая последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную БЕЦ ГО N0:25.
14. 14. Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела по п.1, включающая последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную БЕЦ ГО N0:26.
15. 15. Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела по п.1, содержащая последовательность, гибридизующуюся в условиях высокой строгости с нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность БЕЦ ГО N0:25.
16. 16. Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела по п.1, содержащая последовательность, гибридизующуюся в условиях высокой строгости с нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность БЕЦ ГО N0:26.
17. 17. Вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту по любому из пп.1З-16.
18. 18. Клетка-хозяин, включающая вектор экспрессии по п.17.
19. 19. Трансгенное млекопитающее, за исключением человека, экспрессирующее моноклональное антитело по любому из пп.1-8 или его антигенсвязывающую часть.

    - З8 020465
20. 20. Трансгенное растение, экспрессирующее моноклональное антитело по любому из пп.1-8 или его антигенсвязывающую часть.
21. 21. Клетка-хозяин, которая продуцирует антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-8.
22. 22. Набор, включающий одно или несколько изолированных моноклональных антител или их антигенсвязывающих частей по любому из пп.1-8, и, при необходимости, инструкции по применению в лечении или диагностировании болезни, ассоциированной с ЕгЬВ3-зависимой передачей сигналов.
23. 23. Набор по п.22, при котором заболевание представляет собой рак.
24. 24. Способ ингибирования передачи сигнала ЕгЬВ3 у субъекта, включающий введение субъекту изолированного моноклонального тела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8 в количестве, достаточном для ингибирования передачи сигнала ЕгЬВ3.
25. 25. Способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества изолированного моноклонального тела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8 в количестве, достаточном для лечения рака.
26. 26. Способ по п.24 или 25, в котором антитело или его антигенсвязывающая часть содержат СЭК1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ГО NО:7; СГОК2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ГО NО:8; СГОК3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ГО NО:9; СГОК1 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ГО NО:10; СГОК2 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ГО NО:11; и СГОК3 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ГО NО: 12.
27. 27. Способ по п.26, в котором антитело или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую 8Е0 ГО NО:1.
28. 28. Способ по п.26, в котором антитело или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельную область легкой цепи, включающую 8Е0 ГО NО:2.
29. 29. Способ по п.26, в котором антитело или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую 8Е0 ГО NО:1, и вариабельную область легкой цепи, включающую 8ЕО ГО Ш:2.
30. 30. Способ по п.25, в котором рак выбирается из группы, состоящей из меланомы, рака молочной железы, рака яичников, рака почки, рака желудочно-кишечного тракта/рака толстой кишки, рака легких, светлоклеточной саркомы и рака предстательной железы.
31. 31. Способ по любому из пп.24-30, где субъектом является человек.
32. 32. Способ по любому из пп.24-31, где антитело или его антигенсвязывающую часть вводят субъекту внутривенно, внутримышечно или подкожно.
33. 33. Способ по любому из пп.25-32, где антитело или его антигенсвязывающую часть вводят в комбинации со вторым терапевтическим средством, где второе терапевтическое средство представляет собой противоопухолевое средство или антитело или его антигенсвязывающую часть.
34. 34. Способ по п.33, в котором противоопухолевое средство выбирают из группы, состоящей из малой молекулы, антиметаболита, алкилирующего вещества, ингибитора топоизомеразы, направленного на микротрубочки средства, ингибитора киназы, ингибитора синтеза белка, иммунотерапевтического средства, гормона или его аналога, аналога соматостатина, глюкокортикоида, ингибитора ароматазы и ингибитора тТОК.
35. 35. Способ по п.33, в котором антитело или его антигенсвязывающая часть представляют собой анти-ЮР1-К антитело, анти-ЕОРК антитело или анти-с-МЕТ антитело.
36. 36. Способ по п.34, в котором малая молекула нацелена на 1ОР1-К, ЕОРК или с-МЕТ.
37. 37. Способ диагностирования рака, ассоциированного с ЕгЬВ3, у субъекта, включающий (а) приведение в контакт сх νί\Ό или ш νί\Ό клеток от субъекта с изолированным антителом или его антигенсвязывающей частью по любому из пп.1-8 и (Ь) измерение уровня связывания с ЕгЬВ3 на этих клетках, в котором чрезмерно высокие уровни связывания с ЕгЬВ3 указывают, что у субъекта имеется рак, ассоциированный с ЕгЬВ3.