EA013677B1 - Человеческие моноклональные антитела против cd25 и их применение - Google Patents

Человеческие моноклональные антитела против cd25 и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA013677B1
EA013677B1 EA200500835A EA200500835A EA013677B1 EA 013677 B1 EA013677 B1 EA 013677B1 EA 200500835 A EA200500835 A EA 200500835A EA 200500835 A EA200500835 A EA 200500835A EA 013677 B1 EA013677 B1 EA 013677B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
human
cell
cells
antibodies
Prior art date
Application number
EA200500835A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200500835A1 (ru
Inventor
Янин Схюрман
Катарина Эманюэль Герарда Хавенит
Пауль Паррен
Ян Г.Й. Ван Де Винкель
Дениз Ли Уильямс
Йорген Петерсен
Оле Д. М. Ск. Бодсгорд
Original Assignee
Генмаб А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Генмаб А/С filed Critical Генмаб А/С
Publication of EA200500835A1 publication Critical patent/EA200500835A1/ru
Publication of EA013677B1 publication Critical patent/EA013677B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/06—Radiation therapy using light
    • A61N5/0613—Apparatus adapted for a specific treatment
    • A61N5/062—Photodynamic therapy, i.e. excitation of an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/04—Drugs for disorders of the respiratory system for throat disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • G01N2333/7155—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

Охватываются выделенные человеческие моноклональные антитела, которые связываются с человеческим CD25 и ингибируют его и родственные композиции, и молекулы на основе антител. Человеческие антитела можно продуцировать при использовании гибридомы, трансфектомы или в организме отличного от человека трансгенного животного, например в трансгенной мыши, способной продуцировать многие изотипы человеческих моноклональных антител при использовании V-D-J рекомбинации и переключения изотипа. Также охватываются фармацевтические композиции, содержащие человеческие антитела, отличные от человека трансгенные животные, гибридомы и трансфектомы, которые продуцируют человеческие антитела, и диагностические методы для применения человеческих антител.

Description

Высокоаффинный рецептор интерлейкина-2 (1Ь-2К) представляет собой гетеротримерный рецептор клеточной поверхности, состоящий из α, β и ус-полипептидных цепей (Кс 10-11 М). α-Цепь 55 кДа, также известная как 1Ь-2Ко., ΟΌ25. р55 и антиген Тас (активации Т клеток, Т-клеточной активации), является уникальной для 1Ь-2К. Цепи β (СИ122; Р75) и ус (СИ132) являются членами суперсемейства рецепторов цитокинов (рецепторы гемопоэтина) и функциональными компонентами других рецепторов цитокинов, таких как 1Ь-15К (^а1бтапп (1993) 1ттипо1. Тобау 14(6):264- 70; Е11егу е! а1. (2002) СуЮкте Сго\\111 Рас!ог Неу. 13(1): 27-40). Рецептор промежуточной аффинности представляет собой димер, состоящий из βи ус-цепи (Кс 10-9 М), тогда как рецептор низкой аффинности состоит из мономерной α-субъединицы, которая не способна к сигнальной трансдукции (Кс 10-8 М) (^а1бтапп (1993) 1ттипо1. Тобау 14(6): 26470).
Покоящиеся Т клетки, В клетки и моноциты экспрессируют мало молекул ΟΌ25. Однако, при активации рецептор быстро транскрибируется и экспрессируется (Е11егу е! а1. (2002) СуЮктс Сго\\И1 Рас!ог Неу. 13(1): 27-40; Мотк е! а1. (2000) Апп. Кйеит. Όίδ. 59 (8ирр1. 1) 1109-14). Клетки, экспрессирующие высокоаффинный 1Ь-2К, экспрессируют ΟΌ25 (СО25-субъединица) в избытке, который приводит к профилям связывания как высоко-, так и низкоаффинного 1Ь-2 (\Уа1бтапп е! а1. (1993) В1ооб 82(6): 1701-12; бе 1опд е! а1. (1996) 1. 1ттипо1. 156(4): 1339-48). СЭ25 экспрессируется Т клетками с высокими уровнями при некоторых аутоиммунных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, склеродермия и увеит, а также кожные заболевания, например псориаз и диффузный нейродермит, и различные лимфоидные опухоли, например Т-клеточный лейкоз и болезнь Ходжкина (\Уа1бтапп (1993) 1ттипо1. Тобау 14(6): 264-70; Кий1ег е! а1. (1999) 1. Мо1. Меб. 77(1):226-9). Помимо этого, экспрессия СЭ25 ассоциируется с отторжением аллотрансплантата и гомологичной болезнью (реакция трансплантат против хозяина) (1опе§ е! а1. (2002) 1. 1ттипо1. 168(3):1123-1130; АпакеШ е! а1. (1994) В1ооб 84(4): 1320-7).
Следовательно, СО25 является важной мишенью для опосредованной антителом терапии (антительная терапия), например, для уменьшения воспаления при аутоиммунных заболеваниях, лечения опухолей и предупреждения отторжения трансплантата. Однако, несмотря на то, что полученные результаты и современный клинический опыт чётко продемонстрировали, что СО25 является полезной мишенью для иммунотерапии, они также показывают, что современные мышиные и химерные антитела не являются идеальными терапевтическими агентами. Таким образом, существует необходимость в дополнительных терапевтических антителах против СО25, эффективно действующих для предупреждения и/или лечения ряда заболеваний, включающих клетки, экспрессирующие СО25.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение охватывает новую антительную терапию для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с клетками, экспрессирующими СО25, включая, среди прочих, отторжение трансплантата органа, тканевого и клеточного трансплантата, в том числе отторжение аллотрансплантата и ксенотрансплантата, гомологичную болезнь, аутоиммунные заболевания, воспалительные и гиперпролиферативные кожные заболевания и лимфоидные опухоли. Антитела, охватываемые изобретением, имеют преимущество в том смысле, что они являются полностью человеческими и, следовательно, потенциально менее иммуногенными для пациентов. Также антитела имеют преимущество, основанное на их улучшенных функциональных (например, терапевтических) качествах.
Как показано в данном описании, человеческие антитела по изобретению связываются с СО25, как показано методом ЕЫ8А и проточной цитометрией.
Как правило, человеческие антитела по изобретению связываются с СО25 с константой равновесной диссоциации (Кс) около 10-8 М или ниже, с такой как 10-9 М или ниже, 10-10 М или ниже, или 10-11 М или даже ниже, по определению методом плазмонного поверхностного резонанса (8РН) на приборе В1Асоге 3000 с применением рекомбинантного человеческого 1Ь-2Ка в качестве лиганда и антитела в качестве аналита. Как правило, такие антитела не реагируют перекрёстно с родственными антигенами клеточной поверхности и не ингибируют их функцию.
Помимо этого, человеческие антитела по настоящему изобретению ингибируют (например, блокируют) взаимодействие СО25 с его лигандом, 1Ь-2. Например, связывание можно ингибировать по меньшей мере примерно, на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100%. Примеры клеток, которые экспрессируют СО25 и, следовательно, клеточную функцию которых можно ингибировать с помощью человеческих антител по данному изобретению, включают, среди прочих, Т клетки, В клетки и моноциты. Например, как показано в данном описании, человеческие антитела по изобретению могут ингибировать связывание 1Ь-2 с СО25. Такое ингибирование связывания 1Ь-2 с СО25 попутно ингибирует различные клеточные механизмы, индуцированные связыванием 1Ь-2. Как также показано в данном описании, человеческие антитела по изобретению могут ингибировать индуцированную антителом против СЭ3 Тклеточную пролиферацию в зависимости от дозы. Как также показано в данном описании, человеческие антитела по изобретению могут ингибировать смешанную реакцию лимфоцитов (МЬК) в зависимости от дозы. Ингибирование пролиферации в таких экспериментах можно контролировать по уменьшению аккумуляции клеточной массы, измеряемую методом ЕЫ8А, или по уменьшению встраивания Вгби в ДНК
- 1 013677 клетки.
Человеческие антитела по изобретению включают !дС1 (например, 1§С1.к и 1§61,λ) и 1дС4 (например, 1§С4.к и 1§С4.л) антитела. Однако, другие изотипы антител также охватываются изобретением, включая 1д62, 1д63, 1дМ, 1дА1, 1дА2, секреторный 1дА, 1дЭ и 1дЕ. Антитела могут являться полными антителами или их антигенсвязывающими фрагментами, включая, например, ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ)2, Е(аЬ')2, Εν, одноцепочечные Εν фрагменты или биспецифические антитела. Кроме того, антигенсвязывающие фрагменты включают химерные (слитые) белки связывающего домена иммуноглобулинов, содержащие (ί) полипептид связывающего домена (такой как вариабельная область тяжёлой цепи или вариабельная область лёгкой цепи), слитую с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, (и) СН2 константную область тяжёлой цепи иммуноглобулина, слитую с полипептидом шарнирной области, и (ίίί) СН3 константную область тяжёлой цепи иммуноглобулина, слитую с СН2 константной областью. Такие химерные белки связывающего домена иммуноглобулина дополнительно описаны в Патентных заявках США 2003/0118592 и 2003/0133939. Конкретные человеческие антитела по настоящему изобретению включают антитела, названные АВ1, АВ7, АВ11 и АВ12, кодируемые нуклеиновыми кислотами тяжёлой цепи человеческого происхождения и лёгкой цепи каппа человеческого происхождения, содержащими нуклеотидные последовательности в их вариабельных областях, представленных в 8ЕО Ш N0:1, 5, 9 или 13 и 8ЕО Ш N0:3, 7, 11 или 15, соответственно, и их модификации консервативной последовательности. В другом варианте изобретения человеческие антитела характеризуются тем, что они имеют вариабельные области тяжёлой цепи человеческого происхождения и лёгкой цепи каппа человеческого происхождения, содержащие аминокислотные последовательности, представленные 8Е0 Ш N0:2, 6, 10 или 14 и 8Е0 Ш N0:4, 8, 12 или 16, соответственно, и модификации их консервативных последовательностей.
Другие конкретные человеческие антитела по изобретению включают антитела, которые содержат СЭК. (области, определяющие комплементарность), имеющий СОРТ область тяжёлой и лёгкой цепи человеческого происхождения, СЭК 2 область тяжёлой и лёгкой цепи человеческого происхождения и СЭК.3 область тяжёлой и лёгкой цепи человеческого происхождения, где:
(a) СЭК1, СЭК2 и СЭК3 области тяжёлой цепи человеческого происхождения содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей СОКТ, ΤΌΚ2 и СОК.3, показанных на фиг. 1-10 (8Е0 Ш N0:17-19, 23-25, 29-31 или 35-37), и модификаций их консервативных последовательностей, и (b) СОРТ, СЭК2 и СЭК3 области лёгкой цепи человеческого происхождения содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей СОКТ, ΤΌΚ2 и СОК.3, показанных на фиг. 1-10 (8Е0 Ш N0:20-22, 26-28, 32-34 или 38-40), и модификаций их консервативных последовательностей.
В другом варианте изобретения человеческие антитела против СЭ25 по настоящему изобретению можно охарактеризовать одним или более следующих свойств:
a) специфичность в отношении человеческих СЭ25:
b) аффинность связывания с ΤΌ25 (Кс) около 10-8 М или ниже, с такой как 10-9 М или ниже, 10-10 М или ниже, или 10-11 М или даже ниже, по определению методом плазмонного поверхностного резонанса (8РК.) на приборе В1Асоге 3000 с применением рекомбинантного человеческого 1Ь-2К.а в качестве лиганда и антитела в качестве аналита:
c) способность вызывать толерантность Т клеток:
6) способность блокировать взаимодействие СЭ25 с его лигандом, 1Ь-2:
е) способность элиминировать Т клетки, экспрессирующие СЭ25:
I) способность ингибировать пролиферацию Т клеток, экспрессирующих СЭ25:
д) способность ингибировать вызванную антителом против СЭ25 Т-клеточную пролиферацию мононуклеаров периферической крови (РВМС):
II) способность блокировать смешанную лимфоцитарную реакцию (МЕК.) и/или
ί) интернализация СЭ25, экспрессированных на Т-клетках.
Выражение вызывает толерантность по данному описанию означает, что Т клетки не способны реагировать с антигеном после повторной антигенной стимуляции этим антигеном.
Человеческие антитела против СЭ25 по настоящему изобретению могут быть дериватизированными, связанными с или коэкспрессирующимися с другими специфичностями связывания. В особом варианте изобретения антитела связаны с одной или более специфичностей связывания в отношении другого антигена-мишени, такого как антиген на эффекторной клетке.
Следовательно, настоящее изобретение включает также биспецифические или полиспецифические молекулы, которые связываются как с человеческим СЭ25, так с одним или более других антигеновмишеней, таких как СЭ3, СЭ4, 1Ь-15К, мембраносвязанный или связанный с рецептором ΤΚΕ-α или мембраносвязанный или связанный с рецептором 1Ь-15.
В другом варианте изобретения человеческие антитела против СЭ25 по изобретению являются дериватизированными, связанными с или коэкспрессирующимися с другой функциональной молекулой, например с другим пептидом или белком (например, фрагментом ЕаЬ). Например, антитело может быть
- 2 013677 функционально связано (например, химической связью, генетическим слиянием, нековалентной ассоциацией или другим способом) с одним или более других молекулярных объектов, таких как другое антитело (например, с образованием биспецифического или полиспецифического антитела), цитотоксин, клеточный лиганд или антиген (например, с образованием иммуноконъюгата, такого как иммунотоксин). Антитело также может быть связано с другими терапевтическими частицами, например радиоизотопом, низкомолекулярным противораковым лекарственным веществом, противовоспалительным агентом или иммуносупрессором. Следовательно, настоящее изобретение охватывает большой ряд конъюгатов антител, биспецифических или полиспецифических молекул и химерных (слитых, гибридных) белков, причём все они связываются с клетками, экспрессирующими СО25, и всех их можно использовать для нацеливания других молекул на такие клетки.
Человеческие антитела, иммуноконъюгаты, биспецифические и полиспецифические молекулы и композиции по данному изобретению можно использовать в различных методах ингибирования, киллинга и/или модулирования активности и/или роста (например, пролиферации) клеток, экспрессирующих СО25. В одном варианте изобретения метод включает ингибирование пролиферации Т клеток, экспрессирующих СО25. В другом варианте изобретения метод включает ингибирование реакций трансплантата (на) против хозяина (гомологичной болезни), например МКВ. Ещё в одном варианте изобретения метод включает киллинг клеток, экспрессирующих СО25 (например, с помощью опосредованного комплементом лизиса или путём связывания антитела с цитотоксином). Клетки предпочтительно гибнут или ингибируются, но без киллинга или ингибирования активности клеток, которые не экспрессируют СО25, но могут, например, экспрессировать структурно родственный антиген клеточной поверхности (т.е. без кросс-реактивности к родственным, но отличающимся по структуре антигенам клеточной поверхности). Клетки, экспрессирующие СО25, которые можно ингибировать или убить при использовании человеческих антител по изобретению, включают, например, активированные Т лимфоциты, В лимфоциты, моноциты, макрофаги, печёночные клетки Купфера, кожные клетки Лангерганса, экспрессирующие СО25.
Следовательно, человеческие антитела по данному изобретению можно использовать для лечения и/или предупреждения ряда заболеваний и состояний, при которых активированные клетки, экспрессирующие СО25, играют активную роль в патогенезе, вводя антитела больным, страдающим такими заболеваниями и состояниями. Примеры заболеваний, которые можно лечить (например, уменьшать интенсивность симптомов) или предупреждать, включают, но без ограничения, отторжение трансплантата, в том числе отторжение аллотрансплантата и ксенотрансплантата у пациентов, которым делают или которые перенесли трансплантацию органа или ткани, например, сердца, лёгкого, комбинированную трансплантацию сердца-лёгкого, трансплантацию трахеи, почки, печени, поджелудочной железы, пищевода, кишечника, кожи, конечности, пуповины, стволовых клеток, инсулоцитов и т.д. Антитела по данному изобретению можно, следовательно, применять в качестве профилактики отторжения аллотрансплантата и ксенотрансплантата или для обращения (полного изменения направления), лечения или иного ослабления острых эпизодов отторжения аллотрансплантата или ксенотрансплантата.
Другие заболевания, которые можно лечить, включают гомологичную болезнь (трансплантат против хозяина), например, болезнь трансплантат против хозяина в результате переливания крови или в результате пересадки мозга; воспалительные, иммунные и аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилоартрит, псориатический артрит, дерматит, диабет типа 1, инсулинзависимый диабет типа 2, рассеянный склероз, системную эритематозную волчанку, тяжёлую псевдопаралитическую миастению, воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ), болезнь Крона, язвенный колит, дерматополимиозит, синдром Сёгрена (Шегрена), артерииты, включая гигантоклеточный артериит, гипопластическую анемию, астму, склеродермию и увеит; воспалительные и гиперпролиферативные кожные заболевания, например псориаз, включая бляшечный псориаз, пустулёзный акродерматит (РРР), эрозивный плоский лишай, буллёзный пемфигоид, врождённый буллёзный эпидермолиз, контактный дерматит и диффузный нейродермит; и ряд лимфоидных опухолей, например Т-клеточный лейкоз, болезнь Ходжкина, волосатоклеточная лимфома, или кожная Т-клеточная лимфома, включая грибовидный микоз и синдром Сезари.
Другими заболеваниями, которые можно лечить, являются злокачественные опухоли, на которые благотворно действуют ингибирование инфильтрации СО25+ регуляторных Т клеток, такие как рак желудка, рак пищевода, злокачественная меланома, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, мелкоклеточный рак лёгкого, немелкоклеточный рак лёгкого, рак шеи и почечноклеточный рак;
гематологические заболевания, такие как Т-клеточный лейкоз/Т-клеточная лимфома взрослых, анапластическая гигантоклеточная лимфома, хронический лимфоцитарный лейкоз (СВЬ)/малая лимфоцитарная лимфома (8ΙΧ), периферическая Т-клеточная лимфома и вторичный амилоидоз;
кожные заболевания, такие как гангренозная пиодермия, гранулёма кольцевидная, аллергический контактный дерматит, рубцовый пемфигоид и герпес беременных;
заболевания печени и желудочно-кишечного тракта, такие как коллагеновый колит, склерозирующий холангит, хронический активный гепатит, волчаночный гепатит, аутоиммунный гепатит, алкогольный гепатит, хронический панкреатит и острый панкреатит;
- 3 013677 болезни сердца, такие как миокардит и перикардит;
заболевания сосудов, такие как артериосклероз, гигантоклеточный артериит/ревматическая полимиалгия, артериит Такаясу, узелковый артериит, синдром Кавасаки, гранулематоз Вегенера, микроскопический полиангиит, синдром Черга-Штрауса, лейкоцитокластический ангиит и вторичный лейкоцитокластический васкулит; заболевания почек, такие как острый гломерулонефрит, хронический гломерулонефрит, нефрит с минимальными изменениями и синдром Гудпасчера;
лёгочные заболевания, такие как альвеолит, облитерирующий бронхиолит, силикоз и бериллиоз;
неврологические нарушения, такие как рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, тяжёлая псевдопаралитическая миастения, хроническая демиелинизирующая полиневропатия и полирадикулит, включая синдром Гийена-Барре;
заболевания соединительных тканей, такие как рецидивирующий полихондрит, саркоидоз, системная красная волчанка, волчанка ΟΝ8 (ЦНС), дискоидная волчанка, волчаночный нефрит, синдром хронической усталости и фибромиалгия;
заболевания эндокринной системы, такие как болезнь Грейвза, тиреоидит Хашимото и подострит тиреоидит; и вирусные инфекции, такие как тропический спастический парапарез.
В особом варианте изобретения субъекта, которому вводят антитело, дополнительно лечат одним или более других терапевтических агентов, таких как иммуносупрессоры (иммунодепрессанты), противовоспалительные агенты, химиотерапевтические агенты или другие агенты, которые повышают терапевтический эффект антитела.
Ещё в одном аспекте настоящее изобретение включает метод обнаружения ίη νίίτο или ίη νίνο присутствия СЭ25 в образце или индивидуально, например, для диагностирования связанного с СЭ25 заболевания предпочтительно на ранней стадии. Это также может быть полезно для мониторинга заболевания и эффекта лечения антителом против СЭ25 и для определения и корректировки дозы вводимого антитела. В одном варианте изобретения обнаружение присутствия СЭ25 в образце проводят при контактировании тестируемого образца, необязательно наряду с контрольным образцом, с человеческим моноклональным антителом по изобретению в условиях, которые допускают образование комплекса между антителом и СЭ25. Затем детектируют образование комплекса (например, с помощью ЕЫ8А, проточной цитометрии или Вестерн-блоттинга). Если наряду с тестируемым образцом используют контрольный образец, комплекс обнаруживают в обоих образцах, и любая статистически значимая разница между образцами в образовании комплексов является показателем присутствия в тестируемом образце СЭ25. Ιη νίνο метод можно осуществлять, используя методику визуализации, такую как РЕТ (позитронно эмиссионную томографию) или БРЕСТ (единичную фотонно-эмиссионную компьютерную томографию).
В другом аспекте данное изобретение относится к антиидиотипическим антителам, которые связываются с человеческими моноклональными антителами по изобретению. Эти антиидиотипические антитела можно использовать в качестве средства для иммунодиагностики для обнаружения и количественного определения уровней человеческих моноклональных антител против СЭ25 в лаборатории или в образцах пациента. Это может применяться для изучения фармакокинетики антитела против СЭ25 или для обнаружения и корректировки дозы антитела против СЭ25 и для мониторинга заболевания и действия лечения на пациента.
Мышиные антиидиотипические антитела можно получать иммунизацией мышей Ва1Ь/С человеческими моноклональными антителами по изобретению и получением гибридом из селезёнок этих мышей путём слияния с клетками миеломы, такими как N81 клетки, стандартными методами.
Ещё в одном аспекте изобретение охватывает трансгенное, отличное от человека, животное, такое как трансгенная мышь, которое экспрессирует человеческие моноклональные антитела, связывающиеся с СЭ25. В особом варианте изобретения трансгенное, не являющееся человеком животное представляет собой трансгенную мышь, имеющую геном, содержащий трансген или трансхромосому тяжёлой цепи человеческого происхождения и трансген или трансхромосому лёгкой цепи человеческого происхождения, кодирующие всё (полное) антитело по изобретению или его фрагмент. Трансгенное отличное от человека животное можно иммунизировать очищенным или обогащённым препаратом СЭ25 антигена и/или клеток, экспрессирующих СЭ25. Предпочтительно, трансгенное отличное от человека животное, например, трансгенная мышь, способно продуцировать многие изотипы человеческих моноклональных антител к СЭ25 (например, 1дС, 1дА и/или 1дМ), если осуществлять У-Э-1 рекомбинацию и переключение изотипа. Переключение изотипа может осуществляться, например, путём классического или неклассического переключения изотипа.
Соответственно, ещё в одном аспекте изобретение охватывает выделенные В клетки трансгенного отличного от человека животного, описанного выше, например трансгенной мыши, которая экспрессирует человеческие антитела против СЭ25. Выделенные В клетки могут затем быть иммортализованы путём слияния с иммортализованной клеткой для создания источника (например, гибридомы) человеческих антител против СЭ25. Такие гибридомы (т.е. те, которые продуцируют человеческие антитела против СЭ25) также входят в объём настоящего изобретения.
Как показано в примерах по данному описанию, человеческие антитела по изобретению можно по
- 4 013677 лучать непосредственно при использовании гибридом, которые экспрессируют антитело, или можно клонировать (например, при использовании гибридом или фага, которые визуализуют антигенсвязывающие участки антител) и рекомбинантно экспрессировать в клетке-хозяине (например, в СНО клетке (клетке яичника китайского хомячка) или в N8/0 клетке). Другими примерами клеток- хозяев являются микроорганизмы, такие как Е. со11, и грибы, такие как дрожжи. Или же их можно получать методами рекомбинантной ДНК в трансгенном отличном от человека животном или растении. Соответственно, в другом аспекте настоящее изобретение охватывает методы получения моноклональных антител, которые связываются с человеческим СО25. В одном варианте изобретения метод включает иммунизацию трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, описанной ранее (например, имеющей геном, содержащий трансген тяжёлой цепи человеческого происхождения и трансген лёгкой цепи человеческого происхождения, кодирующие полное антитело против СО25 или его фрагмент), очищенным или обогащенным препаратом человеческого СО25 антигена и/или клеток, экспрессирующих человеческий СО25. Затем получают В клетки (например, В клетки селезёнки) животного и сливают с клетками миеломы для образования бессмертных гибридомных клеток, которые секретируют человеческие моноклональные антитела против СО25.
Ещё в одном аспекте изобретение включает нуклеотидные молекулы, кодирующие человеческие антитела против СО25 (например, их вариабельные области), а также рекомбинантные векторы экспрессии, которые включают нуклеиновые кислоты по изобретению, и клетки-хозяева, трансфецированные при использовании таких векторов. Методы получения антител с помощью культивирования этих клеток-хозяев также охватываются данным изобретением. Конкретные нуклеиновые кислоты по изобретению, содержат нуклеотидные последовательности, показанные 8ЕО ΙΌ N0:1, 5, 9 или 13 и 8Е0 ΙΌ N0:3, 7, 11 или 15, кодирующие тяжёлую и лёгкую цепи, соответственно, человеческих антител против СО25: АВ1, АВ7, АВ11 и АВ12.
Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеприведённого подробного описания и формулы изобретения.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показаны аминокислотные последовательности областей VI лёгкой (каппа) цепи человеческих моноклональных антител АВ1, АВ7, АВ 11 и АВ 12 (8Е0 ΙΌ N0:4, 8, 12 и 16, соответственно) с обозначенными СИВ.
На фиг. 2 - аминокислотные последовательности областей УЭ1 тяжёлой цепи человеческих моноклональных антител АВ1, АВ7, АВ11 и АВ12 (8Е0 ΙΌ N0:2, 6, 10 и 14, соответственно) с обозначенными СИВ.
На фиг. 3 - аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:2) и соответствующая нуклеотидная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:1) области УЭ1 тяжёлой цепи человеческого моноклонального антитела АВ 1 с обозначенными СИВ.
На фиг. 4 - аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:4) и соответствующая нуклеотидная последовательность (8Е0 Ш N0:3) области VI лёгкой (каппа) цепи человеческого моноклонального антитела АВ1 с обозначенными СИВ.
На фиг. 5 - аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:6) и соответствующая нуклеотидная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:5) области УЭ1 тяжёлой цепи человеческого моноклонального антитела АВ7 с обозначенными СИВ.
На фиг. 6 - аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:8) и соответствующая нуклеотидная последовательность (8Е0 Ш N0:7) области VI лёгкой (каппа) цепи человеческого моноклонального антитела АВ7 с обозначенными СИВ.
На фиг. 7 - аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:10) и соответствующая нуклеотидная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:9) области УЭ1 тяжёлой цепи человеческого моноклонального антитела АВ 11 с обозначенными СИВ.
На фиг. 8 - аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:12) и соответствующая нуклеотидная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:11) области VI лёгкой (каппа) цепи человеческого моноклонального антитела АВ 11 с обозначенными СЭВ.
На фиг. 9 - аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:14) и соответствующая нуклеотидная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:13) области УЭ1 тяжёлой цепи человеческого моноклонального антитела АВ 12 с обозначенными СОВ.
На фиг. 10 - аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:16) и соответствующая нуклеотидная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:15) области VI лёгкой (каппа) цепи человеческого моноклонального антитела АВ 12 с обозначенными СЭВ.
На фиг. 11 - график ингибирования связывания ΙΕ-2 с его рецептором, СО25, супернатантами человеческих моноклональных антител АВ1, АВ7, АВ11 и АВ12 в сравнении с ингибированием связывания ΙΕ-2 препаратом Ζοηαραχ® (даклизумаб, рекомбинантное гуманизированное антитело против СО25, Восйе).
На фиг. 12 показан график ингибирования связывания Ζеηаρаx® с СО25 человеческими монокло
- 5 013677 нальными антителами АВ1, АВ7, АВ 11 и АВ 12.
На фиг. 13 показан график ингибирования индуцированной антителом против ί.Ό3 Т-клеточной пролиферации (с применением РВМС, мононуклеаров периферической крови) человеческими моноклональными антителами АВ1, АВ7, АВ11 и АВ12 в сравнении с ингибированием контрольным антителом (Ыд61/к) и 2еиарах®.
На фиг. 14 - график ингибирования МВК. человеческими моноклональными антителами АВ1, АВ7, АВ 11 и АВ 12 в сравнении с ингибированием контрольным антителом (ЫдС1/к) и 2еиарах®.
На фиг. 15 - фотографии с применением Р1ТС фильтра, визуализующие интернализацию СЭ25 меченным Р1ТС АВ12.
На фиг. 15 А показан результат для Т-бластов, преинкубированных с меченным Р1ТС АВ 12, после инкубации при 37°С в течение 18 ч, а на фиг. 15В - результат для Т-бластов, культивированных при 37°С в течение 18 ч в присутствии меченного Р1ТС АВ12. Для сравнения на фиг. 15С показан результат для Тбластов, культивированных при 37°С в течение 18 ч в присутствии меченного Р1ТС изотипического контрольного антитела (против КНЬ).
На фиг. 16 - интернализация ί.Ό25 меченным РГГС АВ12, измеренная проточной цитометрией, где отношение средней интенсивности флуоресценции (МРГ) выше 1 указывает, что имеет место интернализация. На фиг. 16А показан результат для Т-бластов, преинкубированных с меченным РГТС АВ12 при 4 и при 37°С, соответственно, а на фиг. 16В - результат для Т-бластов, культивированных в присутствии меченного РГТС АВ 12 при 4 и при 37°С, соответственно.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение охватывает антительную терапию для лечения и диагностирования различных заболеваний (нарушений), включающих клетки, экспрессирующие ί.Ό25. Терапия по изобретению применяет выделенные человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с эпитопом антигена ί.Ό25. Такие антитела включают все известные изотипы, например антитела ГдА, Гдб-4, ГдЕ, ГдМ и 1д1).
В одном варианте изобретения антитело является ГдС1 антителом, более конкретно 1дС1.к или 1дС1./_ изотипа. В другом варианте изобретения антитело является ГдС3 антителом, более конкретно, ГдС3,к или Гд63,Х изотипа. Ещё в одном варианте изобретения антитело является ГдС4 антителом, более конкретно ГдС4,к или ГдС4,Х изотипа. Ещё в одном варианте изобретения антитело является ГдА1 или ГдА2 антителом. Ещё в одном варианте изобретения антитело является ГдМ антителом.
В одном варианте изобретения человеческие антитела продуцируются в отличном от человека трансгенном животном, например в трансгенной мыши, способной продуцировать множество изотипов человеческих моноклональных антител к ί.Ό25 при использовании У-О-1 рекомбинации и переключения изотипа. Такое трансгенное животное может также быть трансгенным кроликом для продуцирования поликлональных антител, таких как поликлональные антитела, описанные в Патентной заявке США 2003/0017534. Следовательно изобретение также охватывает человеческие поликлональные антитела, которые специфически связываются с ί.Ό25. Поэтому аспекты по изобретению включают не только антитела, фрагменты антител и их фармацевтические композиции, но также отличных от человека трансгенных животных, В клетки, трансфектомы клеток-хозяев и гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела. Также включены методы применения антител по изобретению для блокирования или ингибирования клеток, экспрессирующих СЭ25, эти методы применимы для лечения нарушений, ассоциированных с ί.Ό25. Изобретение охватывает методы применения антител по изобретению для обнаружения клеток, экспрессирующих ί.Ό25.
Для того чтобы лучше понять настоящее изобретение, сначала даётся определение некоторых терминов. Дополнительные определения вводятся в ходе подробного описания.
Термины ί.Ό25 и антиген СЭ25 применяются поочерёдно в данном описании и включают любые варианты, изоформы и гомологи вида человеческого СЭ25, которые естественно (в природе) экспрессируются клетками или экспрессируются на клетках, трансфецированных геном СЭ25. Синонимы 0025, известные в технике, включают СО25, р55 и Тас (Т-клеточной активации) антиген. Связывание антитела по изобретению с антигеном СО25 ингибирует и/или блокирует связывание СО25 с его лигандом, ГЬ-2 и, попутно, его результирующую клеточную функцию. Например, в одном варианте изобретения человеческие антитела по изобретению ингибируют вызванную антителом против СО3 Т-клеточную пролиферацию. В другом варианте изобретения человеческие моноклональные антитела ингибируют МЬВ.
Предполагается, что применяемое в данном описании выражение ингибирует рост (например, по отношению к клетке) включает любое измеряемое уменьшение роста клеток при контакте с антителом против СО25 по сравнению с ростом тех же самых клеток, не контактирующих с антителом против СО25, например ингибирование роста клеточной культуры по меньшей мере примерно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 99 или 100%.
Применяемые в данном описании термины ингибирует связывание или блокирует связывание (например, по отношению к ингибированию/блокированию связывания ГЬ-2 с СО25) используются по
- 6 013677 очерёдно и охватывают как частичное, так и полное ингибирование/блокирование. Ингибирование/блокирование связывания 1Ь-2 с СЭ25 предпочтительно снижает или изменяет нормальный уровень или тип передачи сигнала в клетке, которая происходит, когда 1Б-2 связывается с СЭ25 в отсутствие ингибирования или блокирования. Предполагается, что ингибирование или блокирование также включают любое уменьшение аффинности связывания 1Ь-2 с СЭ25 при контакте с антителом против СЭ25 по сравнению с лигандом, не контактирующим с антителом против ί.Ό25. например блокирование связывания Ш-2 с СЭ25 по меньшей мере примерно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 99 или 100%.
Термин антитело по данному описанию включает целые антитела и любой их антигенсвязывающий фрагмент (т.е. антигенсвязывающий участок) или их одиночную цепь. Антитело относится к гликопротеину, содержащему, по меньшей мере, две тяжёлых (Н) цепи и две лёгких (Ь) цепи, связанных между собой дисульфидными связями, или его антигенсвязывающему фрагменту. Каждая тяжёлая цепь состоит из вариабельной области тяжёлой цепи (сокращённо обозначенной в данном описании Ун) и константной области тяжёлой цепи. Каждая лёгкая цепь состоит из вариабельной области лёгкой цепи (сокращённо обозначенной в данном описании Уь) и константной области лёгкой цепи. Области Ун и Уъ можно далее подразделить на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (СОВ), перемежающимися (с вкраплениями) более консервативными областями, называемыми остовными (каркасными, скелетными, ТВ) областями. Каждая Ун и Уъ область состоит из трёх СОВ и четырёх ТВ, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: РВ1, СЭРЕ РВ2, СЭВ2, РВ3, СЭВ3, РВ4. Вариабельные области тяжёлой и лёгкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (С 1с|) классической системы комплемента.
Термин антигенсвязывающий участок (область, фрагмент) антитела (или просто область (участок, фрагмент) антитела) по данному описанию относится к одному или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, СЭ25). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами интактного, или полноразмерного, антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином антигенсвязывающий участок антитела включают (1) фрагмент РаЬ, одновалентный фрагмент, состоящий из Ун, Уь, Съ и СН1 доменов; (ίί) фрагмент Р(аЬ')2, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента РаЬ, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ίίί) Рб фрагмент, состоящий из Ун И Сн1 доменов; (ίν) фрагмент Εν, состоящий из Ун и Уъ доменов; (ν) фрагмент бАЬ (№атб е! а1., (1989) №т.1гс 341:544-546), который состоит из Ун домена; (νί) выделенную вариабельную область (СОВ) и (νίί) комбинацию из двух или более изолированных СОВ, которые, необязательно, могут быть соединены синтетическим линкером. Кроме того, хотя два домена фрагмента Ρν, Уь и Ун кодируются отдельными генами, они могут быть соединены, с применением методов рекомбинантной ДНК, с помощью синтетического линкера, который позволяет им находиться в виде одиночной белковой цепи, в которой Уъ И Ун области спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Ρν (δοΕν); см., например, В1гб е! а1. (1988) 8с1епсе 242:423- 426; и Нибоп е! а1. (1988) Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 85:58795883). Предполагается также, что такие одноцепочечные антитела охватываются термином антигенсвязывающий фрагмент антитела. Другим примером являются слитые белки связывающего домена иммуноглобулинов, содержащие (1) полипептид связывающего домена, который слит (гибридизован) с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, (ίί) СН2 константную область тяжёлой цепи иммуноглобулина, слитую с полипептидом шарнирной области, и (ίίί) СН3 константную область тяжёлой цепи иммуноглобулина, слитую с СН2 константной областью. Полипептид связывающего домена может быть вариабельной областью тяжёлой цепи или вариабельной областью лёгкой цепи. Слитые (химерные, гибридизованные) белки связывающего домена иммуноглобулина дополнительно описаны в Патентных заявках США 2003/0118592 и 2003/0133939. Эти фрагменты антитела получены обычными методами, известными специалистам в данной области техники, и фрагменты подвергают скринингу на полезность таким же способом, как и интактные антитела.
Термин эпитоп означает белковую детерминанту, способную специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных группирующихся на поверхности молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и, как правило, имеют специфические признаки трёхмерной структуры, а также специфический заряд. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что связывание с первым, но не с последним, утрачиваются в присутствии денатурирующих агентов.
Предполагается, что термин биспецифическая молекула включает любой агент, например белок, пептид или комплекс белка или пептида, который имеет две различных специфичности связывания. Например, молекула может связываться с, или взаимодействовать с (а) антигеном клеточной поверхности и (Ь) Рс рецептором на поверхности эффекторной клетки.
Предполагается, что термин полиспецифическая молекула или гетероспецифическая молекула включает любой агент, например белок, пептид или комплекс белка или пептида, который имеет более
- 7 013677 двух различных специфичностей связывания. Например, молекула может связываться с или взаимодействовать с (а) антигеном клеточной поверхности и (Ь) Ес рецептором на поверхности эффекторной клетки и (с) по меньшей мере одним другим компонентом. Поэтому изобретение включает, но без ограничения, биспецифические, триспецифические, тетраспецифические и другие полиспецифические молекулы, которые направлены на ί.Ό25. и на другие мишени, такие как Ес рецепторы на эффекторных клетках.
Термин биспецифические антитела также включает 61аЬо61е8 (диатела, диантитела). Диантитела (ЛаЬоЛек) представляют собой двухвалентные биспецифические антитела, в которых Ун И Уъ домены экспрессируются на одиночной полипептидной цепи, но, так как используется линкер, слишком короткий для того, чтобы было возможно спаривание двух доменов на одной и той же цепи, это вынуждает домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта (см., например, НоШпдег, Р., е1 а1. (1993) Ргос. №111. Лсаб. 8еГ И8Л 90:6444-6448; РоЦак, К.1., е1 а1. (1944) 81гисГиге 2: 1121-1123).
Термин производные человеческого антитела относится к любой модифицированной форме антитела, например, к конъюгату антитела и другому агенту или антителу.
Предполагается, что термин человеческое антитело по данному описанию включает антитела, имеющие вариабельные и константные области последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие антитела по изобретению могут также включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями человеческого иммуноглобулина зародышевой линии (например, мутации, вводимые случайным или сайт-специфическим мутагенезом ίη νίίτο или соматической мутацией ίη νίνο). Однако термин человеческое антитело по данному описанию не предполагает включать антитела, в которых последовательности СЭЕ из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, могут быть введены (трансплантированы) в человеческие остовные последовательности.
Термины моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела по данному описанию относятся к препарату молекул антитела единого молекулярного состава. Композиция моноклонального антитела демонстрирует единую (общую) специфичность и аффинность в отношении конкретного эпитопа. Следовательно, термин человеческое моноклональное антитело относится к антителам, проявляющим единую (общую) специфичность, которые имеют вариабельные и константные области из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. В одном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела продуцируются гибридомой, которая включает В клетку, полученную от трансгенного или трансхромосомного отличного от человека животного, например трансгенной мыши, имеющей геном, содержащий трансген человеческой тяжёлой цепи и трансген человеческой лёгкой цепи, слитый с иммортализованной клеткой.
Термин рекомбинантное человеческое антитело по данному описанию включает все человеческие антитела, которые получаются, экспрессируются, создаются или выделяются методами рекомбинантной ДНК, такие как (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), трангенного или трансхромосомного по генам человеческих иммуноглобулинов или полученных из них гибридом (описанных ниже, в разделе 1), (Ь) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, например, при использовании трансфектомы, (с) антитела, выделенные при использовании комбинаторной библиотеки, содержащей рекомбинантные человеческие антитела, и (6) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов человеческих иммуноглобулинов в последовательности других ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные области из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Однако в некоторых вариантах изобретения такие рекомбинантные человеческие антитела могут претерпевать ίη νίίτο мутагенез (или, если используют животное, трансгенное по последовательностям человеческого 1д, ίη νίνο соматический мутагенез), и тем самым аминокислотные последовательности Ун И Уъ областей рекомбинантных антител являются такими последовательностями, которые, будучи образованы из последовательностей Ун и Уъ зародышевой линии человека и являясь родственными им, не могут существовать в природе в составе (репертуаре) человеческого антитела зародышевой линии ίη νίνο.
Термин трансфектома по данному описанию включает рекомбинантную эукариотную клеткухозяина, экспрессирующую антитело, такую как клетки СНО, клетки N8/0, клетки НЕК293, растительные клетки или клетки грибов, включая клетки дрожжей.
Применяемый в данном описании термин гетерологическое антитело определяют в связи с трансгенным, отличным от человеческого, организмом, продуцирующим такое антитело. Этот термин относится к антителу, имеющему аминокислотную последовательность или кодирующую нуклеотидную последовательность, соответствующие последовательностям антитела, обнаруживаемого в организме, не являющемся организмом трансгенного, отличного от человека, животного, и, как правило, вида, иного, нежели вид в трансгенном, отличном от человека, животном.
Предполагается, что термин выделенное антитело по данному описанию относится к антителу, практически не содержащему других антител, имеющих отличные антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с СЭ25, практически не содержит анти
- 8 013677 тел, которые специфически связываются с антигенами, иными, нежели ΟΌ25). Выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, изоформой или вариантом человеческого ΟΌ25. может, однако, быть кросс-реактивным родственным антигенам, например, других видов (например, гомологам ΟΌ25 вида). Кроме того, выделенное антитело может практически не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ. В одном варианте изобретения комбинация выделенных моноклональных антител, имеющих различные специфичности, объединена в определённую композицию.
Применяемый в данном описании термин специфическое связывание относится к антителу, связывающемуся с заданным антигеном. Как правило, антитело связывается с аффинностью, соответствующей Кс, примерно 10-8 М или меньше, примерно такой как 10-9 М или меньше, примерно такой как 10-10 М или меньше, или примерно такой как 10-11 М или даже меньше, по определению методом поверхностного плазмонного резонанса (8РВ) на приборе В1Асоге 3000 с применением рекомбинантного 1Ь-2Ка в качестве лиганда и антитела в качестве аналита, связывается с заданным антигеном с аффинностью, соответствующей Кс, которая по меньшей мере в десять раз ниже, предпочтительно по меньшей мере в 100 раз ниже, чем его аффинность связывания с неспецифическим антигеном (например, В 8А, казеин), иным, нежели заданный антиген или близкородственный антиген. Выражения антитело, распознающее антиген и антитело, специфичное в отношении антигена применяются в данном описании взаимозаменяемо, поочерёдно с выражением антитело, которое связывается специфически с антигеном.
Предполагается, что применяемое в данном описании выражение к/ (с-1) относится к константе скорости равновесной диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Указанную величину также называют величиной кон.
Предполагается, что применяемое в данном описании выражение ка (М-1 х с-1) относится к константе скорости равновесной ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.
Предполагается, что применяемое в данном описании выражение Кс (М) относится к константе равновесной диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.
Предполагается, что применяемое в данном описании выражение КА (М-1) относится к константе равновесной ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген и эту величину получают делением ка на к4.
Предполагается, что применяемый в данном описании термин изотип относится к классу антител (например, 1дМ или !дС1), которые кодируются генами константных областей тяжёлой цепи.
Применяемое в данном описании выражение переключение изотипа относится к явлению изменения класса, или изотипа, антитела с одного 1д класса на один из других 1д классов.
Применяемое в данном описании выражение непереключённый изотип относятся к изотипическому классу тяжёлой цепи, которая продуцируется, когда не происходит переключения изотипа; СН ген, кодирующий непереключённый изотип, как правило, представляет собой первый СН ген непосредственно по ходу транскрипции от функционально реаранжированного УЭ1 гена. Переключение изотипа классифицируют как классическое или неклассическое переключение изотипа. Классическое переключение изотипа происходит с помощью событий рекомбинации, которые включают по меньшей мере одну область последовательности-переключателя в трансгене. Неклассическое переключение изотипа может происходить, например, гомологичной рекомбинацией между человеческой σμ и человеческой Σμ (δассоциированная делеция). Могут реализовываться альтернативные неклассические механизмы переключения, среди прочего такие как межтрансгенная и/или межхромосомная рекомбинация, и осуществлять переключение изотипа.
Применяемый в данном описании термин последовательность-переключатель относится к последовательностям ДНК, ответственным за рекомбинацию с переключением. Последовательность донора переключения, как правило, (μ область переключения, располагается 5' (т.е. ирйгеаш, против хода транскрипции) от области конструкции, удаляемой в ходе рекомбинации с переключением. Область акцептора переключения находится между удаляемой (делегируемой) областью конструкции и константной областью замены (например, γ, ε и т.д.).
Применяемый в данном описании термин тип гликозилирования, гликозилирующий паттерн определяется как тип (паттерн) углеводных единиц (элементов), ковалентно связанный с белком, более конкретно, с иммуноглобулиновым белком (белком антитела). Тип гликозилирования гетерологического антитела можно охарактеризовать как практически аналогичный типам гликозилирования, встречающимся в природе на антителах, продуцированных видом отличного от человека трангенного животного, если рядовой специалист в данной области техники поймёт, что тип гликозилирования гетерологического антитела более похож на тип гликозилирования вида отличного от человека животного, чем на вид, из которого образованы СН гены трансгена.
Термин природный по данному описанию, применяемый к объекту, относится к тем случаям, когда объект может встречаться в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме (включая вирусы), которую можно выделить из природного источника и которая не модифицирована преднамеренно человеком в лаборатории, является природной.
Термин реаранжированный, перегруппированный по данному описанию относится к конфигу
- 9 013677 рации тяжёлой цепи или лёгкой цепи локуса иммуноглобулина, в котором V сегмент позиционирован как непосредственно прилегающий к Ό- 1 или 1 сегменту в конформации, кодирующей в основном полный νΗ и V домен, соответственно. Перегруппированный (реаранжированный) локус гена иммуноглобулина (антитела) можно идентифицировать, сравнивая с ДНК зародышевой линии; перегруппированный локус содержит по меньшей мере один рекомбинированный гептамерный/нонамерный элемент гомологии.
Термин неаранжированный (неперегруппированный) или конфигурация зародышевой линии по данному описанию по отношению к V сегменту означает конфигурацию, в которой V сегмент не рекомбинирован таким образом, чтобы непосредственно прилегать к сегменту Ό или 1.
Предполагается, что термин нуклеотидная молекула (молекула нуклеиновой кислоты) по данному описанию включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Нуклеотидная молекула может быть однонитевой (одноцепочечной) или двухнитевой (двухцепочечной), но предпочтительно двухнитевой ДНК.
Предполагается, что термин выделенная молекула нуклеиновой кислоты (выделенная нуклеотидная молекула) по данному описанию касательно нуклеиновых кислот (нуклеотидов), кодирующих полные антитела или участки антител (например, Ун, ^, СЭК3). которые связываются с СЭ25. относится к нуклеотидной молекуле, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие интактное антитело или фрагмент антитела, не содержат других нуклеотидных последовательностей, кодирующих полное антитело или фрагменты (участки) антитела, которые связывают антигены, иные, нежели СО25, причём эти другие последовательности могут в природе фланкировать нуклеиновую кислоту в человеческой геномной ДНК. В одном варианте изобретения человеческое антитело против ί'.Ό25 включает вариабельные аминокислотные области тяжёлой цепи (Ун) и лёгкой цепи (Ул) АВ1, АВ7, АВ11 или АВ12, кодируемые нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ГО N0: 1, 5, 9 или 13 и 8Е0 ГО N0: 3, 7, 11 или 15, соответственно.
Как описывается в данном описании и заявляется в формуле данного изобретения, последовательности, представленные в 8Е0 ГО N0: 1-40, включают модификации консервативных последовательностей, т.е. модификации нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, которые не оказывают заметного влияния на или не изменяют в значительной степени характеристики связывания антитела, кодируемого нуклеотидной последовательностью или содержащего аминокислотную последовательность. Такие модификации консервативных последовательностей включают нуклеотидные и аминокислотные замены, добавления или делеции. Модификации можно вводить в 8Е0 ГО N0: 1-40 стандартными методами, известными в технике, такими как сайт-направленный мутагенез и ПНР (РСК)опосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены включают замены, в которых аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток с аналогичной боковой цепью. Семейства аминокислотных остатков, имеющие аналогичные боковые цепи, определены (охарактеризованы) в технике. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвлёнными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, предварительный остаток заменимой аминокислоты в человеческом антителе против СО-25 предпочтительно заменяют другим аминокислотным остатком из семейства с такими же боковыми цепями.
Настоящее изобретение также охватывает производные аминокислотных последовательностей, представленных 8Е0 Ш N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 и 17- 40, и модификации их консервативных последовательностей, в которых дериватизированы один или более аминокислотных остатков, например, ацилированием или гликозилированием, что не оказывает значительного влияния или не изменяет заметно характеристики связывания антитела против СО25.
Кроме того, настоящее изобретение включает антитела, в которых сделаны изменения в Ре области с целью изменения функциональных или фармакокинетических свойств антител. Такие изменения могут привести к уменьшению или увеличению С1с.| связывания и СОС или ЕсуК. связывания и антителозависимой клеточной цитотоксичности (АОСС). Можно, например, сделать замены в одном или более аминокислотных остатков в положениях 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322 константной области тяжёлой цепи, тем самым вызывая изменение эффекторной функции при одновременном сохранении способности связываться с антигеном, по сравнению с немодифицированным антителом, ср. Патенты США 5624821 и 5648260. Можно дать дополнительную ссылку на Международную заявку \У0 00/42072, описывающую антитела с изменёнными Ес областями, которые повышают АОСС, и на Международную заявку \У0 94/29351, описывающую антитела, имеющие мутации в ^концевой области СН2 домена, которые изменяют способность антител связываться с ЕсШ и тем самым понижают способность антител связываться с С1ц, что, в свою очередь, понижает способность антител к фиксации комплемента. Помимо этого, 8Ые1бз с1 а1., 1. Вю1. Сйет. (2001) 276:6591-6604 описывает варианты комбинаций, например Т256А/8298А,
- 10 013677
8298Л/Е333Л и 8298Л/Е333Л/К334Л, которые повышают связывание РсуКШ.
Ιη νίνο период полужизни антител можно также увеличить, модифицируя эпитоп рецепторамусорщика (утилизатора) 1д константного домена или 1д-подобного константного домена, так чтобы молекула не содержала интактного СН2 домена или интактной 1д Рс области, ср. Патенты США 6121022 и 6194551. Кроме того, ίη νίνο период полужизни можно увеличить, осуществляя мутации в Рс области, например, заменой лейцина на треонин в положении 252, заменой серина на треонин в положении 254 или заменой фенилаланина на треонин в положении 256, ср. Патент США 6277375.
Помимо этого, тип гликозилирования антител можно модифицировать для того, чтобы изменить эффекторную функцию антител. Например, можно экспрессировать антитела в трансфектоме, которая не добавляет элемент (единицу) фукозы, обычно соединённый с углеводом, связанным с Άδη в положении 297 области Рс, чтобы повысить аффинность области Рс к РсуКШ, что, в свою очередь приведёт к повышенной АЗКЦ (АОСС) антител в присутствии клеток ΝΚ, ср. 8Ые1й е1 а1. (2002), 1. ΒίοΙ. СНет.. 277:26733. Кроме того, для модификации СЭС можно модифицировать галактозилирование. Можно дать дополнительную ссылку на Международную заявку №0 99/54342 и на статью Итапа е1 а1., Ναι. Вю1есйηο1. (1999) 17:176, описывающую СНО клеточную линию, созданную методами рекомбинантной ДНК таким образом, чтобы экспрессировать ΟηίΙΙΙ, что вызывает экспрессию моноклональных антител с изменёнными гликоформами и улучшенной АОСС активностью.
Кроме того, фрагменты антитела, например фрагменты РаЬ по изобретению можно ПЭГировать для повышения периода полужизни. Это можно осуществить реакциями ПЭГ(пэг)ирования, известными в технике, как описано, например, в Рοси8 οη Οτο^ίΡ РасЮгз (1992) 3:4-10; европейских патентах ЕР 154316 и ЕР 401384.
Или же, в другом варианте изобретения, можно вводить мутации произвольно по всей или по участку последовательности кодирующей антитело против СО-25, например, с помощью мутагенеза насыщения, и полученные в результате модифицированные антитела против СО-25 можно подвергнуть скринингу на активность связывания.
Таким образом, антитела, кодированные (вариабельными областями тяжёлой и лёгкой цепи) нуклеотидными последовательностями по данному описанию и/или содержащие (вариабельные области тяжёлой и лёгкой цепи) аминокислотные последовательности по данному описанию (т.е. 8ЕС ГО N0:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 и 17-40), включают практически аналогичные антитела, кодированные аналогичными последовательностями или содержащие аналогичные последовательности, которые были консервативно модифицированы. Дополнительное обсуждение того, как эти практически аналогичные антитела можно получить, исходя из частичных (например, вариабельных областей тяжёлой и лёгкой цепи) последовательностей по данному описанию, таких как 8ЕС Ш N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 и 17-40, дано ниже.
В случае нуклеотидных и аминокислотных последовательностей термин гомология указывает степень идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей при оптимальном наложении и сравнении, при наличии соответствующих инсерций или делеций. Или же практическая гомология существует, когда сегменты ДНК гибридизуются в селективных условиях гибридизации с комплементом цепи. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, общих для последовательностей (например, % гомологии = # идентичных положений/общее число (#) положений х 100), принимая во внимание число гэпов и протяжённость каждого гэпа, которые требуется ввести для оптимального совмещения (наложения) двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно выполнять, используя математический алгоритм, описанный в неограничивающих примерах, приведённых ниже.
Процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей можно определить, используя САР программу в программном обеспечении ССС (доступном по адресу в Интернете 1Шρ://\ν\ν\ν.8Сβ.сο1η). используя матрицу Ν\νδβ;·ιράη;·ι.ί’ΜΡ и средневзвешенное гэпа 40, 50, 60, 70 или 80 и средневзвешенное длины (Κη§11ι хтеЩШ) последовательности 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей можно также определить с помощью алгоритма Е. Меуетз анй №. МШет (^три!. Арр1. Вюзсь, 4:11-17 (1988)), который встроен в программу ΛΕ№Ν (вариант 2.0), используя РАМ120 таблицу масс остатков, штрафную функцию длины гэпа 12 и штрафную функцию гэпа 4. Кроме того, процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определить с помощью алгоритма Nееά1етаη анй №ип8с11 (1. Μο1. Βίο1. 48:444- 453 (1970)), который встроен в программу САР в программном обеспечении ССС (доступном по адресу в Интернете 1Шр://\ν\ν\ν.8Сβ.сο1η). используя либо матрицу ВШззит 62, либо матрицу РАМ250 и средневзвешенное гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и средневзвешенное длины (Κη§11ι хтеЩШ) последовательности 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности по данному изобретению можно использовать далее в качестве последовательности по запросу для осуществления поиска в доступных базах данных, например, для идентификации родственных последовательностей. Такой поиск можно осуществлять, например, используя программы ΝΒΕΛ8Τ и ХВБА8Т (версия 2.0) А118сйи1, е! а1. (1990) 1. Μο1.
- 11 013677
ΒίοΙ. 215:403- 10. Поиск нуклеотидов ВЬЛ8Т можно осуществлять с помощью программы ΝΒΕΆ8Τ, оценка (степень) = 100, длина кода - 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот по изобретению. Поиск ВЬЛ8Т белков можно осуществлять с помощью программы ХВЬЛ8Т, оценка = 50, длина кода = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам по изобретению. При проведении совмещения последовательностей с гэпами (гэпированных) для сравнения можно использовать программу Сарреб ВЬЛ8Т, описанную Л118сйи1 е1 а1., (1997) Νιιοίοίο Лс1бк Век. 25(17):3389- 3402. При использовании программ ВЬЛ8Т и Сарреб ВЬЛ8Т можно использовать параметры соответствующих программ (например, ХВЬЛ8Т и №ЬЛ8Т) по умолчанию. См. 1ι11ρ://\ν\ν\ν.ικ1ί.η1ιη.ηί1ι.§ον.
Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в цельных клетках, в клеточном лизате или в частично очищенном или практически чистом виде. Нуклеиновая кислота является выделенной или представленной практически чистой, когда она очищена от других клеточных компонентов или других примесей, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, включая обработку щёлочью/808, СкС1 бэндинг (дифференциальное окрашивание хромосом), колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие общеизвестные в технике методы. См. Р. Лц5иЬе1, е1 а1., еб. СиггеШ Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Сгеепе РиЬйкЫпд апб Абеу Шегкшепсе, №\ν Уогк (1987).
Составы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, хотя часто имеющие нативную последовательность (за исключением модифицированных сайтов рестрикции и т.п.), любой кДНК, геномной или их смесей, можно сделать мутантными стандартными методами с целью получения последовательностей генов. Если требуется, в случае кодирующих последовательностей эти мутации могут влиять на аминокислотную последовательность. В частности, рассматриваются последовательности ДНК, практически гомологичные нативным V, Ό, 1, константным, переключателям и другим таким последовательностям по данному описанию, или последовательности ДНК, образованные из этих последовательностей (где образованный (бепуеб) указывает на то, что последовательность идентична другой последовательности или получена модификацией другой последовательности).
Нуклеиновая кислота функционально связана, если она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности. Что касается транскрипции регуляторных последовательностей, функционально связанный означает, что последовательности ДНК, будучи связанными, являются соседними и, если необходимо соединить две области кодирующие белок, соседними и в рамке считывания. В случае последовательностей-переключателей, функционально связанный указывает, что последовательности способны осуществлять рекомбинацию переключения.
Предполагается, что термин вектор по данному описанию относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить (транспортировать) другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним типом вектора является плазмида, термин, относящийся к петле кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные ДНК сегменты. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные ДНК сегменты могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и тем самым реплицированы вместе с геномом-хозяином. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном описании называются рекомбинантными векторами экспрессии (или просто векторами экспрессии, экспрессирующими векторами). В целом векторы экспрессии, применяемые в методах рекомбинантной ДНК, часто находятся в виде плазмид. В настоящем описании плазмида и вектор могут применяться взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее общеупотребительной формой вектора. Предполагается, однако, что изобретение включает другие формы векторов экспрессии (экспрессирующих векторов), такие как вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и адено-ассоциированные вирусы), которые выполняют аналогичные функции.
Предполагается, что термин рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин) по данному описанию относится к клетке, в которую вводят вектор рекомбинантной экспрессии. Следует понимать, что предполагается, что такие термины относятся не только к клетке конкретного субъекта, но и к потомству такой клетки. Так как в последующих поколениях могут встречаться некоторые модификации вследствие либо мутации, либо влияния окружающей среды, на самом деле, такое потомство может не быть идентичным родительской клетке, но, тем не менее, охватывается термином клетка-хозяин по данному изобретению. Рекомбинантные клетки-хозяева включают, например, трансфектомы, такие как клетки СНО, клетки N8/0 и лимфоциты.
Термин субъект по данному описанию включает человека или отличное от человека животное. Термин отличное от человека животное включает всех позвоночных, например млекопитающих и не млекопитающих, таких как отличные от человека приматы, овца, собака, корова, куры, земноводные,
- 12 013677 пресмыкающиеся и т.д.
Выражение трансгенное отличное от человека животное относится к отличному от человека животному, имеющему геном, содержащий один или более трансгенов или транс хромосом с тяжёлой и/или лёгкой цепью человеческого происхождения (интегрированных или неинтегрированных в природную геномную ДНК животного), и способный экспрессировать полностью человеческие антитела. Например, трансгенная мышь может иметь трансген с лёгкой цепью человеческого происхождения и либо трансген с тяжёлой цепью человеческого происхождения, либо трансхромосому с тяжёлой цепью человеческого происхождения, так что мышь, будучи иммунизирована С'Э25 антигеном и/или клетками, экспрессирующими ΟΌ25. продуцирует человеческие антитела против СЭ25. Трансген и/или трансхромосому с тяжёлой цепью человеческого происхождения можно интегрировать в хромосомную ДНК мыши или можно сохранять вне хромосомы. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши (в целом называемые в данном описании трансгенные мыши) способны продуцировать многие изотипы человеческих моноклональных антител к С’Э25 (например, 1дО, 1дА, 1дМ, 1дО и/или 1дЕ), если претерпевают У-Э-У рекомбинацию и переключение изотипа. Трансгенное отличное от человека животное можно также использовать для продуцирования специфического антитела против С'Э25 с помощью введения генов, кодирующих такое специфическое антитело против СО25, например, с помощью функционального связывания генов с геном, который экспрессируется в молоке животного. Различные аспекты изобретения более подробно описаны в подразделах, приведённых ниже.
I. Получение человеческих антител к ΟΌ25
Человеческие моноклональные антитела по изобретению можно получать многими методами, включая обычную методологию моноклональных антител, например стандартный метод гибридизации соматических клеток КоЫет апб МЙ8!еш, №1Шге 256:495 (1975). Хотя методы гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе для получения моноклонального антитела можно применять другие методы, например вирусную или онкогенную трансформацию В-лимфоцитов или методы фагового дисплея, используя библиотеки генов человеческих антител.
Предпочтительной животной системой для получения гибридом, которые секретируют человеческие моноклональные антитела, является мышиная система. Получение гибридом в мыши является общепризнанным методом. Протоколы иммунизации и методы выделения иммунизированных спленоцитов для слияния (гибридизации) известны в технике. Гибридообразующие клетки-партнёры (например, клетки мышиной миеломы) и методики гибридизации также известны.
В предпочтительном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела против ΟΌ25 можно получать, используя трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих скорее фрагменты иммунной системы человека, нежели фрагменты мышиной системы. Эти трансгенные и трансхромосомные мыши включают мышей, обозначенных в данном описании мыши НиМАЬ, например, мыши Нсо7, мыши Нсо12 и мыши КМ, соответственно, и в данном описании имеют общее название трансгенные мыши.
Мышь НиМАЬ содержит минилокусы гена человеческого иммуноглобулина, которые кодируют нереаранжированные последовательности тяжёлой (μ и γ) и лёгкой (к) цепи человеческого иммуноглобулина, вместе с нацеленными мутациями, которые инактивируют локусы эндогенных μ и к цепей (ЬопЬетд, N. е! а1 (1994) №11иге 368 (6474): 856-859). Следовательно, мыши проявляют пониженную экспрессию лёгкой цепи мышиного 1дМ или к и, в ответ на иммунизацию, введённые трансгены тяжёлой и лёгкой цепи человеческого происхождения, претерпевают переключение класса и соматическую мутацию с образованием человеческих моноклональных антител 1дО, к (ЬопЬетд, N е! а1. (1994), см. выше; обзор в ЬопЬетд, N. (1994) НапбЬоок о! Е.хрептеп1а1 Рйаттасо1оду 113:49-101; ЬопЬегд, N. апб Никхаг, Ό. (1995) 1п!егп. Ксу. 1ттипо1. Уо1. 13: 65- 93, и Нагбшд, Е. апб ЬопЬетд, N. (1995) Апп. ΚΥ. Асаб. 8с1 764: 536546). Получение мышей НиМАЬ подробно описано в Тау1ог, Ь. е! а1. (1992) ШсШс ЛОбк Кекеатсй 20:6287-6295; Сйеп, 1. е! а1. (1993) 1п!етпа!юпа1 1ттипо1оду 5: 647-656; ТиаШоп е! а1. (1994) 1. 1ттипо1. 152:2912-2920, ЬопЬегд е! а1., (1994) ^иге 368(6474): 856-859; ЬопЬегд, N. (1994) НапбЬоок о! Ехрептеп!а1 Рйагтасо1оду 113:49-101; Тау1ог, Ь. е! а1. (1994) 1п!етабопа1 1ттипо1оду 6: 579-591; ЬопЬегд, N. апб Никхаг, Ό. (1995) 1п!егп. Кеу. 1ттипо1. Уо1. 13:65-93; Натбшд, Е. апб ЬопЬетд, N. (1995) Апп. N. Υ. Асаб. 8с1 764:536-546; Е18Й№1б, Ό. е! а1. (1996) №1иге Вю!есйпо1оду 14:845-851. См. дополнительно патенты США 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299; и 5770429; все выданы ЬопЬетд апб Кау, а также Патент США 5545807, выданный 8иташ е! а1; Международные заявки АО 98/24884, 94/25585, 93/1227, 92/22645, 92/03918 и 01/09187.
Мыши НСо7 имеют ЖЭ разрыв в эндогенных генах лёгкой цепи (каппа) (как описано в Сйеп е! а1. (1993) ЕМВО 1. 12: 821- 830), С’МЭ разрыв в эндогенных генах тяжёлой цепи (как описано в примере 1 Международной заявки АО 01/14424), КСо5 трансген лёгкой цепи каппа человеческого происхождения (как описано в Е1к11\У11б е! а1. (1996) №11иге Вю!есйио1оду 14:845-851) и НСо7 трансген тяжёлой цепи каппа человеческого происхождения (как описано в патенте США 5770429).
Мыши НСо 12 имеют ЖЭ разрыв в эндогенных генах лёгкой цепи (каппа) (как описано в Сйеп е! а1. (1993) ЕМВО 1. 12: 821- 830), С’МЭ разрыв в эндогенных генах тяжёлой цепи (как описано в примере 1
- 13 013677
Международной заявки XVО 01/14424, Когтап е! а1.), КСо5 трансген лёгкой цепи каппа человеческого происхождения (как описано в Ρί51ι\νί16 е! а1. (1996) Ыа!иге Вю1ес11по1оду 14:845-851) и НСо12 трансген тяжёлой цепи каппа человеческого происхождения (как описано в примере 2 Международной заявки νθ 01/14424, Когтап е! а1.). У мышей штамма КМ эндогенный ген мышиной лёгкой цепи каппа гомозиготно разрывается, как описано в С1еп е! а1. (1993) ЕМВО 1. 12:811-820, а эндогенный мышиный ген тяжёлой цепи каппа гомозиготно разрывается, как описано в примере 1 Международной заявки νθ 01/09187. Этот штамм мышей несёт трансген лёгкой цепи каппа человеческого происхождения, КСо5, описанный в Ρί51ι\νί16 е! а1. (1996) №11иге Вю1ес11по1оду 14:845-851. Этот штамм мышей несёт также трансхромосому тяжёлой цепи человеческого происхождения, состоящую из фрагмента ЙСЕ (8С20) хромосомы 14, описанного в Международной заявке νθ 02/43478.
Иммунизация
Для получения полностью человеческих моноклональных антител к СЭ25 трансгенных или трансхромосомньгх мышей, содержащих гены человеческих иммуноглобулинов (например, мышей НСо12, НСо7 или КМ), можно иммунизировать препаратом, обогащённым СЭ25 антигеном, рекомбинантным СЭ25 и/или клетками, экспрессирующими СЭ20. описанными, например, в ЬопЬегд е! а1. (1994), см. выше; ΕίδΚΜ1ά е! а1. (1996), см. выше, и в Международной патентной заявке νθ 98/24884. Или же, мышей можно иммунизировать ДНК, кодирующими человеческий СЭ25. Предпочтительно для первой инфузии берут мышей в возрасте 6-16 недель. Например, обогащённый препарат антигена СЭ25 или рекомбинантного антигена СЭ25 можно использовать для иммунизации мышей НиМАЬ интраперитонеально. В событии, когда иммунизация с использованием очищенного и обогащённого антигена СЭ20 не приводит к антителам, для стимулирования иммунного ответа мышей можно также иммунизировать клетками, экспрессирующими СИ25, например, клеточной линией.
Кумулятивный опыт с различными антигенами показал, что трансгенные мыши НиМАЬ лучше всего отвечают (реагируют), когда их сначала иммунизируют интраперитонеально (ΙΡ) или подкожно (8С) клетками, экспрессирующими СИ25, в полном адъюванте Фрейнда или неполном адъюванте Фрейнда с последующими ΙΡ иммунизациями (всего вплоть до 10) клетками, экспрессирующими СИ25, в фосфатносолевом буферном растворе (РВ8). Мониторинг иммунного ответа можно проводить в течение курса иммунизации по протоколу с образцами сыворотки, полученными при ретроорбитальном кровотечении. Скрининг сыворотки можно проводить с помощью анализа ЕАС8 (описанного ниже), а мышей с удовлетворительными титрами человеческого иммуноглобулина против СЭ25 можно использовать для слияний (гибридизации). Мышам можно внутривенно вводить бустер-инъекцию клеток, экспрессирующих СИ25, например, за 3 или 2 дня до умерщвления и удаления селезёнки и лимфатических узлов.
Получение гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела против СИ 25
Для получения гибридом, продуцирующих человеческие моноклоналъные антитела к человеческому СИ25, спленоциты и клетки лимфатических узлов иммунизированных мышей можно выделить и гибридизовать с соответствующей иммортализованной клеточной линией, такой как клеточная линия мышиной миеломы. Полученные гибридомы можно затем подвергнуть скринингу на продуцирование антиген- специфических антител. Например, единую клеточную суспензию лимфоцитов селезёнки иммунизированных мышей можно гибридизовать с клетками миеломы 8Р2/0-Ад14 (АТСС, СКЬ 1581) с 50% РЕС (ПЭГ, вес/об.). Клетки можно засевать с примерной плотностью 1 х 105 на лунку в плоскодонный титрационный микропланшет с последующей двухнедельной инкубацией в селективной среде, содержащей помимо обычных реагентов 10% фетальной сыворотки для клонирования, 5% фактора начала клонирования гибридомы (1СЕИ) и 1Х НАТ (8фта). Примерно через две недели клетки можно культивировать в среде, в которой НАТ замещают на НТ (8щта). Затем индивидуальные клетки можно подвергнуть скринингу методом ЕЬ18А на антитела, содержащие лёгкую цепь каппа человеческого происхождения, и анализом ЕАС8 с применением клеток, экспрессирующих СИ25, на СЭ25 специфичность. Обычно, когда происходит интенсивный рост гибридом, клоны можно подвергать скринингу на продуцирование 1дС, обычно через 7-10 дней. Гибридомы, секретирующие антитело, можно снова засевать, снова подвергнуть скринингу и, если они всё ещё позитивны в отношении человеческого 1дС, моноклональные антитела против СЭ25 можно субклонировать, по меньшей мере, дважды с помощью ограниченного разведения. Стабильные субклоны можно затем культивировать ίη уйго для получения антитела в тканевой культуральной среде для характеристики.
Получение трансфектом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела к СИ25
Человеческие антитела по изобретению также можно получать в трансфектоме клетки-хозяина, используя, например, комбинацию методов рекомбинантной ДНК и методов трансфекции гена, таких как хорошо известные в технике (Моггйоп, 8. (1985) 8с1епсе 229:1202).
Например, для экспрессии антител или фрагментов антител стандартными методами молекулярной биологии (например, ПЦР (РСК) амплификацией, сайт-направленным мутагенезом) можно получать ДНК, кодирующие частичные или полноразмерные лёгкие и тяжёлые цепи, и встраивать их в экспрессирующие векторы таким образом, что гены функционально связываются с последовательностями, контролирующими транскрипцию и трансляцию. Предполагается, что в этом контексте выражение функционально связанный означает, что ген антитела таким образом, что эти последовательности контроля
- 14 013677 транскрипции и трансляции, в векторе, выполняют свою функцию регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессирующий вектор (вектор экспрессии) и последовательности регуляции экспрессии выбирают таким образом, чтобы они были совместимы с используемой клеткой-хозяином. Ген лёгкой цепи антитела и ген тяжёлой цепи антитела можно встроить в отдельные векторы или, более обычно, оба гена встраивают в один и тот же вектор экспрессии. Гены антитела вводят в вектор экспрессии стандартными методами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела или датированием по тупым концам, если отсутствуют сайты рестрикции). Вариабельные области лёгкой и тяжёлой цепи антител по данному описанию можно использовать для создания генов полноразмерного антитела любого изотипа, встраивая их в векторы экспрессии, уже кодирующие константную область тяжёлой цепи и константную область лёгкой цепи заданного изотипа, таким образом, что сегмент Ун функционально связывается с Сн сегментом(-ами) в векторе, а Уъ сегмент функционально связывается с Сь сегментом в векторе. В качестве дополнения или альтернативы вектор рекомбинантной экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела при использовании клетки- хозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в вектор таким образом, что сигнальный пептид сливается в рамке считывания с аминоконцом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом (т.е. сигнальным пептидом неиммуноглобулинового белка).
Помимо генов цепей антитела рекомбинантные векторы экспрессии по изобретению несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепей антитела в клетке-хозяине. Предполагается, что термин регуляторная последовательность включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Соеббе1; Сепе ЕхртекДоп Тес1шо1оду. Ме1йоб§ ίη Епхушо1оду 185, Асабетэс Ргс55. 8ап Όίοβο. СайТ (1990). Специалисты в данной области техники поймут, что дизайн вектора экспрессии, включая отбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор трансформируемых клеток-хозяев, нужный уровень экспрессии белка и т. д. Предпочтительные последовательности для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих включают вирусные элементы, которые определяют высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры из цитомегаловируса (СМУ), 81ш1ап У1ти8 40 (8У40, вирус зелёной мартышки 40), аденовируса, (например, главный поздний промотор аденовируса (АбМЬР)) и полиомы. Или же можно использовать невирусные регуляторные последовательности, такие как промотор убиквитина или β-глобина.
Помимо генов цепей антитела и регуляторных последовательностей, рекомбинантные векторы экспрессии по изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, ориджины репликации) и гены селективных маркёров. Ген селективного маркёра облегчает отбор клеток-хозяев, в которые был введён вектор (см., например, патенты США 4399216, 4634665 и 5179017, все Ахе1 е! а1.). Например, как правило, ген селективного маркёра придаёт резистентность к лекарственным веществам, таким как С418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую введён вектор. Предпочтительные гены селективных маркёров включают ген дигидрофолат редуктазы (ΌΗΕΒ) (для применения в бЫт-клеткаххозяевах с селекцией/амплификацией метотрексата) и нео ген (для селекции С418).
Для экспрессии лёгкой и тяжёлой цепей вектор(-ы) экспрессии, кодирующий тяжёлую и лёгкую цепи, трансфецируют в клетку-хозяина стандартными методами. Предполагается, что различные формы термина трансфекция охватывают широкий ряд методов, применяемых обычно для введения экзогенной ДНК в клетки-хозяева прокариот и эукариот, такие как электропорация, преципитация фосфатом кальция, опосредованная ΌΕΑΕ-декстраном трансфекция и т.д. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела по изобретению в клетках-хозяевах либо прокариот, либо эукариот, наиболее предпочтительной является экспрессия антител в клетках-хозяевах эукариот и самой предпочтительной в клетках-хозяевах млекопитающих, потому что такие клетки эукариот, и, в частности, клетки млекопитающих, скорее нежели клетки прокариот, собирают и секретируют соответствующим образом скрученные и иммунологически активное антитело.
Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению включают СНО клетки (в том числе клетки бЫт-СНО, описанные в иг1аиЬ апб СйаДп, (1980) Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 77:4216-4220, используемые с ΌΗΕΡ селективным маркёром, например, как описано в КН. КаиЕшап апб Р.А. 81агр (1982) Мо1. ΒίοΙ. 159:601-621), клетки миеломы N8/0, клетки СО8, клетки НЕК293 и клетки 8Р2 сеШ В частности, для применения с клетками миеломы N8/0 другой предпочтительной системой экспрессии является система экспрессии гена С8 (глутамин синтетазы), описанная в Международных заявках \¥О 87/04462, 89/01036 и в Европейском патенте ЕР 338841. Когда рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, антитела продуцируются с помощью культивирования клеток-хозяев или, более предпочтительно секрецией антитела в культуральную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Антитела можно выделить из этой культуральной среды стандартными методами очистки белков.
- 15 013677
Дополнительные рекомбинантные методы продуцирования человеческих моноклональных антител к СБ25
В качестве альтернативы гены клонированных антител можно экспрессировать в других системах экспрессии, включая клетки прокариот, такие как клетки микроорганизмов, например, Е. со11 для получения δοΕν антител, водоросли, а также клетки насекомых. Помимо этого, антитела могут продуцироваться в трансгенных животных, отличных от человека, например, в молоке овец и кроликов или в яйцах кур, или в трансгенных растениях. См., например, Усгта, В. с! а1. (1998). АпбЬобу спдтссттд: Сотрап8оп Ьас!спа1., уса§1, тксс! апб таттабап схргсУоп хуЛспъ. 1. 1ттипо1. Мс111. 216:165-181; Ро11оск, с! а1 (1999). Тгапкдсшс тбк а§ а тсбюб £ог 1Нс ртобисбоп о£ тссотЫпап! апбЬобюк. 1. 1ттипо1 Мс111. 231:147157 и Иксйсг, В. с! а1. (1999). Мо1сси1аг Гагпипд о£ тссотЫпап! апбЬобюк ш р1апК Вю1. Сйст. 380:825839.
Применение частичных последовательностей антител для экспрессии интактных антител
Антитела взаимодействуют с антигенами- мишенями, преимущественно, за счёт аминокислотных остатков, которые расположены на шести СЭР тяжёлой и лёгкой цепи. По этой причине аминокислотные последовательности в СЭР являются более разнообразными в индивидуальных антителах, нежели последовательности вне СЭР. Так как последовательности СЭР ответственны за большинство взаимодействий антиген-антитело, возможно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые подражают свойствам специфичных природных антител, путём конструкции экспрессирующих векторов, включающих последовательности СЭР специфичного природного антитела, пересаженные в остовные последовательности отличного (другого) антитела с отличными (другими) свойствами (см., например, Ктссйтапп, Ь. Е! а1. (1998) №11игс 332:323- 327; 1опс§, Р. с! а1. (1986) №11игс 321:522- 525; и Оиссп, С. Е! а1. (1989) Ргос. Νη11. Асаб. 8ск И.8.А. 86:10029- 10033). Такие остовные последовательности можно получить из доступных баз данных ДНК, которые включают последовательности генов антител зародышевой линии. Эти последовательности зародышевой линии отличаются от последовательностей зрелых генов антител, так как они не включают полностью собранных вариабельных генов, которые образуются соединением У(О)1 в процессе созревания В клетки. Последовательности гена зародышевой линии у индивидуума также будут отличаться от последовательностей вторичного антитела спектра с высокой аффинностью, которые содержат мутации по всему вариабельному гену, но, как правило, они в виде кластеров собираются в СЭР.
Например, соматические мутации являются относительно нечастыми на аминоконцевой части остовной области 1 и на карбоксиконцевой части остовной области 4. Кроме того, многие соматические мутации незначительно изменяют свойства связывания антитела. По этой причине нет необходимости получать полную последовательность ДНК, кодирующей конкретное антитело, чтобы воссоздать интактное рекомбинантное антитело, обладающее свойствами связывания, аналогичными свойствам связывания оригинального (первоначального) антитела (см. νθ 99/45962). Как правило, для этой цели достаточно частичной последовательности тяжёлой и лёгкой цепи, охватывающей СЭР области. Частичную последовательность используют для определения, какие сегменты вариабельных и соединительных генов зародышевой линии вносят вклад в вариабельные гены рекомбинированного антитела. Последовательность зародышевой линии используют затем для заполнения недостающих частей вариабельных областей. Лидерные последовательности тяжёлой и лёгкой цепей отщепляются в процессе созревания белка и не вносят вклад в свойства конечного антитела. Для добавления недостающих последовательностей клонированные последовательности кДНК можно соединять с синтетическими олигонуклеотидами лигированием или ПЦР-амплификацией. Или же полный вариабельный домен можно синтезировать в виде набора коротких перекрывающихся олигонуклеотидов и объединять с помощью ПЦР-амплификации, чтобы создать клон полностью синтетической вариабельной области. Этот процесс имеет определённые преимущества, такие как элиминирование или включение конкретных сайтов рестрикции или оптимизация конкретных кодонов.
Нуклеотидные последовательности транскриптов тяжёлой и лёгкой цепей из гибридом используют для дизайна перекрывающегося набора синтетических олигонуклеотидов с целью создания синтетических У последовательностей с идентичной природным последовательностям способностью кодировать аминокислоты. Синтетические последовательности тяжёлой и каппа цепей могут отличаться от природных последовательностей тремя путями: ряды повторяющихся нуклеотидных оснований прерываются, чтобы упростить синтез олигонуклеотидов и ПЦР-амплификацию; оптимальные сайты инициации трансляции вводятся согласно правилам Козака (Кохак. 1991, 1. Вю1. Скст. 266:19867-19870); и сайты НшбШ создают в направлении 3'-5' (иркбсат, против хода) от сайтов инициации трансляции.
Для вариабельных областей как тяжёлой, так и лёгкой цепей оптимизированные кодирующие и соответствующие некодирующие последовательности цепей разбиваются на 30-50 нуклеотидов примерно посередине (в средней точке) некодирующего олигонуклеотида. Таким образом, для каждой цепи олигонуклеотиды можно собрать в перекрывающиеся двухцепочечные наборы, которые охватывают сегменты из 150-400 олигонуклеотидов. Затем пулы используют в качестве матриц для получения продуктов ПЦРамплификации из 150-400 олигонуклеотидов. Как правило, единый набор олигонуклеотидов вариабельной области разбивают на два пула, которые амплифицируют раздельно, получая два перекрывающихся
- 16 013677
ПЦР-продукта. Затем эти перекрывающиеся продукты соединяют ПЦР-амплификацией с образованием полной вариабельной области. Также может быть желательным ввести перекрывающийся фрагмент константной области тяжёлой или лёгкой цепи (включающий сайт ΒΕδΙ лёгкой цепи каппа или сайт Аде1 тяжёлой цепи гамма) в ПЦР-амплификацию, чтобы получить фрагменты, которые можно легко клонировать в конструкции векторов экспрессии.
Реконструированные вариабельные области тяжёлой и лёгкой цепей затем соединяют с клонированными промоторной, лидерной последовательностью, последовательностями инициации трансляции, константной области, 3' нетранслируемой области, последовательностями полиаденилирования и терминации транскрипции с образованием экспрессирующих векторных конструкций. Экспрессирующие конструкции тяжёлой и лёгкой цепей можно объединить в единый вектор, котрансфецировать, последовательно трансфецировать или по отдельности трансфецировать в клетки-хозяева, а затем слить (гибридизовать) с образованием клетки-хозяина, экспрессирующей обе цепи.
Аналогичную процедуру можно применять для того, чтобы пересадить новую антигенспецифичность в имеющееся природное антитело. Предпочтительно выбирают акцепторное антитело, которое происходит из того же самого гена вариабельной области зародышевой линии, что и СЭКдонорное антитело. Затем одну или более областей СЭК переносят из донорного антитела описанными выше методами.
Примеры плазмид для применения в конструкции экспрессирующих векторов для человеческого ΙβΟκ описаны ниже. Плазмиды конструированы таким образом, чтобы ПЦР-амплифицированные последовательности кДНК V тяжёлой и V каппа лёгкой цепей можно было использовать для реконструкции минигенов полной тяжёлой и лёгкой цепей. Эти плазмиды можно использовать для экспрессии полностью человеческих !дС 1 ,к или 1дС4.к антител. Аналогичные плазмиды можно конструировать для экспрессии других изотипов лёгкой цепи или для экспрессии антител, содержащих лёгкие цепи лямбда.
Соответственно, в другом варианте изобретение включает различные способы получения человеческих антител против СЭ25. В одном варианте способ включает получение антитела, содержащего (1) остовные области тяжёлой цепи человеческого происхождения и СЭК тяжёлой цепи человеческого происхождения, в которых по меньшей мере одна из СЭК тяжёлой цепи человеческого происхождения содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей СЭК, показанных на фиг. 1-10 (или соответствующих аминокислотных остатков в 8ЕО ΙΌ N0:17-19, 23-25, 29-31 или 35-37); и (2) остовные области лёгкой цепи человеческого происхождения и СЭК лёгкой цепи человеческого происхождения, в которых по меньшей мере одна из СЭК лёгкой цепи человеческого происхождения содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей СЭК, показанных на фиг. 1-10 (или соответствующих аминокислотных остатков в 8Е0 ΙΌ N0.20-22, 26-28, 32-34 или 38-40); в которых антитело сохраняет способность связываться с СЭ25.
Способность антитела связываться с СЭ25 можно определить стандартными анализами связывания, такими, которые представлены в примерах (например, ЕАС8 анализ).
Так как в технике хорошо известно, что домены СЭК3 тяжёлой и лёгкой цепи играют особо важную роль в специфичности/аффинности связывания антитела с антигеном, рекомбинантные антитела по изобретению, полученные как представлено выше, предпочтительно содержат области СЭК3 тяжёлой и лёгкой цепи АВ1, АВ7, АВ 11 или АВ 12. Антитела дополнительно могут содержать области СЭК2 АВ1, АВ7, АВ11 или АВ12. Кроме того, антитела могут содержать области СЭК1 АВ1, АВ7, АВ11 или АВ12. Следовательно, изобретение далее содержит антитела против СЭ25, включающие: (1) остовные области тяжёлой цепи человеческого происхождения, область СЭК1 тяжёлой цепи человеческого происхождения, область СЭК2 тяжёлой цепи человеческого происхождения и область СЭК3 тяжёлой цепи человеческого происхождения, в которых область СЭК3 тяжёлой цепи человеческого происхождения представляет собой СЭК3 АВ1, АВ7, АВ11 или АВ12, показанные на фиг. 1-10 (или соответствующие аминокислотные остатки, показанные в 8Е0 ΙΌ N0:19, 25, 31 или 37); и (2) остовные области лёгкой цепи человеческого происхождения, область СЭК1 лёгкой цепи человеческого происхождения, область СЭК2 лёгкой цепи человеческого происхождения и область СЭК3 лёгкой цепи человеческого происхождения, в которых область СЭК3 лёгкой цепи человеческого происхождения представляет собой СЭК3 АВ1, АВ7, АВ11 или АВ12, показанные на фиг. 1-10 (или соответствующие аминокислотные остатки, показанные в 8Е0 ΙΌ N0: 22, 28, 34 или 40), где антитело связывается с СЭ25. Антитело может дополнительно содержать СЭК2 тяжёлой и/или лёгкой цепи АВ1, АВ7, АВ 11 или АВ 12. Кроме того, антитело может дополнительно содержать области СЭК1 тяжёлой и/или лёгкой цепи АВ1, АВ7, АВ11 или АВ12.
Предпочтительно СЭК1, 2 и/или 3 антител, полученных методом рекомбинантной ДНК, описанные выше, содержат точно такую(-ие) же аминокислоту(-ы), которая содержит АВ1, АВ7, АВ11 или АВ12 по данному описанию. Однако рядовой специалист в данной области понимает, что возможно некоторое отклонение от точных СЭК последовательностей АВ1, АВ7, АВ 11 или АВ 12 при всё ещё сохраняющейся способности антитела эффективно связывать СЭ25 (например, консервативные замены). Соответственно, в другом варианте изобретения антитело, полученное методом рекомбинантной ДНК, может со
- 17 013677 стоять из одной или более областей СОЕ, которые, например, на 90, 95, 98 или 99,5% гомологичны одной или более областей СОК АВ 1, АВ7, АВ 11 или АВ 12.
Помимо простого связывания ί.Ό25 или в дополнение к простому связыванию СЭ25 антитела, полученные методом рекомбинантной ДНК, такие как описанные выше, можно выбирать из-за сохранения ими других функциональных свойств антител по изобретению, таких как:
(1) высокая аффинность связывания с ί.Ό25;
(2) ингибирование или блокирование связывания ί.Ό25 с 1Ь-2;
(3) элиминирование Т клеток, экспрессирующих ί.Ό25;
(4) толеризация (приобретение толерантности) Т клеток;
(5) ингибирование пролиферации Т клеток, экспрессирующих ί.Ό25;
(6) ингибирование индуцированной антителом против ί.Ό3 Т-клеточной пролиферации РМВС;
(7) ингибирование МЬК и/или (8) интернализация СЭ25, экспрессированных на Т клетках.
Характеристика связывания моноклональных антител с СИ25
Человеческие антитела против ί.Ό25 по изобретению можно выделять и характеризовать различными способами. Например, выбранные гибридомы можно выращивать в соответствующих колбах для очистки моноклональных антител. Затем супернатанты можно отфильтровать и упарить перед аффинной хроматографией с протеин А-сефарозой (для антител изотипа 1дС1) (Рйаттааа, РЦса1атау, N1) или с сефарозой, покрытой антителом против человеческого 1дС или протеин С-сефарозой в случае антител изотипа 1дС3. Для гарантии чистоты элюированный 1дС можно проверять с помощью гельэлектрофореза или высокоэффективной жидкостной хроматографии. Буферный раствор можно заменить на РВ8 и концентрацию можно определять по ОЭ280, используя коэффициент экстинкции 1.43. Моноклональные антитела можно аликвотировать и хранить при -80°С.
Для того, чтобы определить, связываются ли выбранные человеческие моноклональные антитела против ί.Ό25 с уникальными эпитопами, можно использовать сайтнаправленный или полисайтнаправленный мутагенез.
Для определения изотипа очищенных антител можно осуществлять изотипический ЕЫ8А. Лунки микротитрационных планшетов можно покрывать плёнкой из 10 мкг/мл антитела против человеческого 1д в течение ночи при 4°С. После блокирования с помощью 5% В8А (альбумин бычьей сыворотки) содержимое планшетов реагирует с 10 мкг/мл моноклональных антител или контрольных очищенных изотипов при комнатной температуре в течение двух часов. Затем содержимое лунок может реагировать с зондами либо человеческих 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4, 1дЕ, 1дА1, 1дА2, либо человеческого 1дМконъюгированной специфической щелочной фосфатазы. После отмывания планшеты обрабатывают субстратом р№Р (1 мг/мл) и анализируют при 0Ό 405 нм.
Чтобы продемонстрировать присутствие антител против ί.Ό25 в сыворотках иммунизированных мышей или связывание моноклональных антител с живыми клетками, экспрессирующими СЭ25, можно применять проточную цитометрию. Коротко говоря, клеточные линии, экспрессирующие ί.Ό25 (выращенные в стандартных условиях культивирования) смешивают с моноклональными антителами в различных концентрациях в РВ8, содержащем 0,1 В8А и 0,02% азида натрия, и инкубируют при 4°С в течение 30 мин. После отмывания клетки реагируют с меченным флуоресцеином антителом против человеческого 1дС в тех же условиях, что и первичное окрашивание антитела. Образцы можно анализировать проточной цитометрией на проточном цитометре (например, на приборе ВесЮм Όχΐίηδοη ЕАС8), используя светорассеяние и боковое рассеяние на одиночных живущих клетках. Альтернативный анализ с применением флуоресцентной микроскопии можно использовать, как дополнение к или вместо, проточной цитометрии. Этот метод делает возможной визуализацию отдельных клеток, но может иметь пониженную чувствительность, зависящую от плотности антигена.
Человеческие 1дС против СЭ25 можно дополнительно тестировать на реактивность в отношении ί.Ό25 Вестерн-блоттингом. Коротко говоря, можно приготовить клеточные экстракты клеток, экспрессирующих СЭ25, и подвергнуть их электрофорезу на додецилсульфат натрия (8О8)-полиакриламидном геле. После электрофореза разделённые антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют 20% нежирным молоком и гибридизуют с зондом испытуемых моноклональных антител. Связывание человеческого 1дС можно обнаружить, применяя щелочную фосфатазу против 1дС и обрабатывая (проявляя) таблетками субстрата ВС'ЧР^ВТ (81дта Сйет. ^., 8ί. Εουίδ, МО).
Ингибирование активности клеток, экспрессирующих СИ25
Помимо специфического связывания с СЭ25, человеческие моноклональные антитела против СЭ25 можно тестировать на их способность ингибировать различные активности клеток, таких как Т клеток и других лимфоцитов, экспрессирующих СО25. Например, можно, пользуясь обычными методами, провести анализы Т-клеточной пролиферации. В одном методе человеческие РВМС разводят в подходящей среде, а затем стимулируют, например, антителом против СО3 перед тем, как добавлять различные концентрации экспериментальных антител для определения влияния, которое они оказывают на Тклеточную пролиферацию. Т-клеточную пролиферацию очищенных Т клеток можно также оценивать в присутствии моноклональных антител против СЭ3 и против СЭ28.
- 18 013677
Анализы на МЬВ можно также проводить известными методами. Например, РВМС первого донора можно подвергнуть облучению и смешать с РВМС второго донора. Затем, меняя концентрации антител, можно их добавлять к клеткам, а затем измерять МЬВ ответ.
II. Получение трансгенных отличных от человека животных, которые генерируют человеческие моноклональные антитела против СБ25
Ещё в одном аспекте изобретение включает трансгенных или трансхромосомных отличных от человека животных, таких как трансгенные или трансхромосомные мыши, которые способны экспрессировать человеческие антитела, специфично связывающиеся с СЭ25. В особом варианте изобретение включает трансгенную или трансхромосомную мышь, имеющую геном, содержащий трансген тяжёлой цепи человеческого происхождения, так что при иммунизации клетками, экспрессирующими ί.Ό25. мышь продуцирует человеческие моноклональные антитела против СЭ25. Трансген тяжёлой цепи человеческого происхождения можно интегрировать в хромосомную ДНК мыши, как в случае трансгенных, например, НиМЛЬ, мышей, как подробно описано и показано на примерах в данном описании. Или же трансген тяжёлой цепи человеческого происхождения можно сохранять вне хромосомы, как в случае трансхромосомных мышей (например, КМ), описанных в Международной заявке Х0 02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные животные способны продуцировать многие изотипы человеческих моноклональных антител против СЭ25 (например, ΙβΟ, Ι§Ά и/или Ι§Ε), претерпевая рекомбинацию и переключение изотипа. Дизайн трансгенного или трансхромосомного отличного от человека животного, которое отвечает на стимуляцию чужеродным антигеном с помощью спектра гетерологичных антител, требует, чтобы трансгены гетерологичных иммуноглобулинов в организме трансгенного животного корректно функционировали на всём пути развития В клетки. Это включает, например, переключение изотипа гетерологичного трансгена тяжёлой цепи. Поэтому трансгены строят таким образом, чтобы можно было индуцировать переключение изотипа и один или более следующих признаков генов антитела: (1) высокий уровень экспрессии и её специфичность в отношении клеточного типа, (2) функциональную реаранжировку (перегруппировку) гена, (3) активацию исключения аллеля и ответ на него, (4) экспрессию достаточного первичного спектра (спектра первичных антител), (5) сигнальную трансдукцию, (6) соматическую гипермутацию и (7) доминирование локуса трансгена антитела в процессе иммунного ответа.
Не все вышеуказанные критерии должны присутствовать обязательно. Например, в тех вариантах изобретения, в которых эндогенные локусы иммуноглобулинов трансгенного животного функционально разрушены (разорваны), трансген не нуждается в активации аллельного исключения. Кроме того, в тех вариантах изобретения, в которых трансген содержит функционально реаранжированный ген тяжёлой и/или лёгкой цепи иммуноглобулина, необязательным является второй критерий функциональной реаранжировки гена, по меньшей мере, для того трансгена, который уже является реаранжированным. Сведения общего характера о молекулярной иммунологии см. в Типбатеп1а1 Iттиηο1οду, 26 еббюп (1989), Раи1 Х1Шат Е., еб. Вауеп Ргекк, КУ.
В некоторых вариантах изобретения трансгенные или трансхромосомные отличные от человека животные, используемые для получения человеческих моноклональных антител по изобретению, в своей зародышевой линии (трансгенного животного) содержат реаранжированные, нереаранжированные трансгены или комбинацию реаранжированных и нереаранжированных гетерологичных трансгенов тяжёлой и лёгкой цепи иммуноглобулина. Каждый из трансгенов тяжёлой цепи содержит, по меньшей мере, один СН ген. Кроме того, трансген тяжёлой цепи может содержать функциональные последовательности-переключатели изотипа, которые способны поддерживать переключение изотипа гетерологичного трансгена, кодирующего многие СН гены в В клетках трансгенного животного. Такими последовательностями-переключателями могут быть такие последовательности, которые встречаются в природе в локусе зародышевой линии иммуноглобулина вида, который служит в качестве источника СН генов трансгена, или такие последовательности переключатели могут быть образованы из последовательностей, встречающихся в виде, который служит для получения трансгенной конструкции (трансгенное животное). Например, трансгенная конструкция человеческого происхождения, которая применяется для получения трансгенной мыши, может продуцировать более высокую частоту событий переключения изотипа, если она вводит последовательности-переключатели, аналогичные последовательностям-переключателям, которые встречаются в природе в локусе мышиной тяжёлой цепи, так как, предположительно, мышиные последовательности-переключатели оптимизированы таким образом, чтобы функционировать с мышиной системой переключения, контролируемой рекомбиназой, тогда как последовательностипереключатели человеческого происхождения не оптимизированы таким образом. Последовательностипереключатели можно выделить и клонировать обычными методами клонирования или их можно синтезировать бе ηονο из перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов, созданных на основе опубликованной информации о последовательностях, относящихся к последовательностям области переключения (М111к е! а1., №с1. Ас1бк Век. 15:7305- 7316 (1991); 81бегак е! а1., Ιηίί. Iттиηο1. 1:631-642 (1989)). В случае каждого из вышеприведённых трансгенных животных функционально реаранжированные гетерологичные трансгены тяжёлой и лёгкой цепи иммуноглобулина обнаружены в значительной части В клеток трансгенного животного (по меньшей мере 10%).
- 19 013677
Трансгены, используемые для получения трансгенных отличных от человека животных по изобретению, включают трансген тяжёлой цепи, содержащий ДНК, кодирующую (правильнее соответствующую) по меньшей мере один вариабельный сегмент гена, один дополнительный сегмент, один соединяющий сегмент гена и по меньшей мере один сегмент константной области гена. Трансген лёгкой цепи иммуноглобулина содержит ДНК, кодирующую (соответствующую) по меньшей мере один вариабельный сегмент гена, один соединяющий сегмент гена и по меньшей мере один сегмент константной области гена. Сегменты гена, кодирующие (вернее, соответствующие) сегменты (сегментам) генов лёгкой и тяжёлой цепи, являются гетерологичными для трансгенного животного в том отношении, что они образованы из или соотносятся с ДНК, соответствующей сегментам генов тяжёлой и лёгкой цепи, вида, не состоящего из трансгенного отличного от человека животного. В одном аспекте изобретения трансген построен таким образом, что отдельные сегменты гена являются неаранжированными, т.е. трансген не аранжирован таким образом, чтобы кодировать функциональную лёгкую или тяжёлую цепь иммуноглобулина. Такие неаранжированные трансгены содействуют рекомбинации V, Ό и I сегментов гена (функциональная реаранжировка) и предпочтительно содействуют включению всего или части Ό сегмента гена в полученную в результате реаранжированную тяжёлую цепь иммуноглобулина в трансгенном животном при экспозиции с антигеном ί'.Ό25.
В альтернативном варианте изобретения трансгены содержат неаранжированный минилокус. Такие трансгены, как правило, содержат значительную часть С, Ό и I сегментов, а также субпопуляцию сегментов V генов. В таких трансгенных конструкциях различные регуляторные последовательности, например промоторы, энхансеры, области-переключатели класса, последовательности доноров и акцепторов сплайсинга для процессирования РНК, сигналы рекомбинации и т.п., содержат соответствующие последовательности гетерологичной ДНК. Такие регуляторные последовательности могут быть включены в трансген того же самого или родственного вида отличного от человека животного, используемого в изобретении. Например, сегменты гена человеческого иммуноглобулина можно соединять в трансгене с энхансерной последовательностью иммуноглобулина грызунов для использования в трансгенной мыши. Или же синтетические регуляторные последовательности могут быть включены в трансген, в котором такие синтетические регуляторные последовательности не являются гомологичными функциональной последовательности ДНК, о которой известно, что она встречается в природе в геномах млекопитающих.
Синтетические регуляторные последовательности создают по правилам согласованности (консенсуса), таким образом, что регуляторными последовательностями являются такие, которые определяют разрешённые последовательности акцепторного сайта сплайсинга или промоторного/энхансерного мотива. Например, минилокус содержит часть геномного локуса иммуноглобулина, имеющего по меньшей мере одну внутреннюю делецию (т. е. не на конце участка) заменимого участка ДНК (например, интрон или его часть) по сравнению с природным 1д локусом зародышевой линии.
Предпочтительные трансгенные и трансхромосомные отличные от человека животные, например мыши, продуцируют значительный спектр иммуноглобулинов, практически в идеале похожий на спектр иммуноглобулинов человека после поправки на объём.
Спектр в идеале приближается к спектру человека после поправки на объём, обычно разнесении (разнообразии) по меньшей мере около 10%, предпочтительно 25-50% или более. В целом получается по меньшей мере тысяча различных иммуноглобулинов (в идеале 1§С), предпочтительно 104-106 или более, в зависимости от числа различных V, I и Ό областей, введённых в геном мыши и управляемых дополнительным разнообразием, вызванным реаранжировками V-(^)-^ сегментов гена и случайными добавлениями в соединяющих областях. Как правило, иммуноглобулины проявляют аффинность (Кс) к предварительно выбранным антигенам ниже 10-8 М, такую как аффинность, более низкая, чем 10-9 М, 10-10 М или 10-11 М или даже ниже.
Трансгенные и трансхромосомные отличные от человека животные, например мыши, описанные выше, могут быть иммунизированы, например, клетками, экспрессирующими СЭ25. Или же трансгенные животные могут быть иммунизированы ДНК, кодирующей человеческие ί'.Ό25. Животные затем продуцируют В клетки, которые претерпевают переключение класса путём рекомбинации-переключения (циспереключение) и экспрессируют иммуноглобулины, реактивные в отношении СЭ25. Иммуноглобулины могут представлять собой человеческие антитела (также называемые антитела с последовательностями человеческого происхождения), в них полипептиды тяжёлой и лёгкой цепи кодируются последовательностями трансгена человеческого происхождения, которые могут включать последовательности, образованные при использовании соматической мутации и рекомбинаторных (рекомбинированных) соединений V области, а также последовательности, кодируемые генами зародышевой линии; эти человеческие антитела можно считать практически идентичными полипептидной последовательности, кодируемой сегментами V И Ц или ^, Он и Τι генов человеческого происхождения, даже несмотря на то, что в результате соматической мутации и различия V-! и рекомбинированных соединяющих частей, могут присутствовать другие последовательности незародышевой линии.
Вариабельные области каждой цепи антитела, как правило, по меньшей мере на 80% аналогичны сегментам V, I зародышевой линии и, в случае тяжёлых цепей, V, О и I генным сегментам зародышевой цепи человеческого происхождения; часто по меньшей мере на 85% аналогичны последовательностям
- 20 013677 зародышевой линии в трансгене; часто на 90 и 95% аналогичны последовательностям зародышевой линии в трансгене. Однако, так как последовательности незародышевой линии вводятся соматической мутацией и VI, и ΥΟΙ соединением, антитела с последовательностью человеческого происхождения часто будут иметь некоторые последовательности вариабельной области, которые не кодируются сегментами V, Ό или I гена человеческого происхождения, обнаруженными в трансгене(ах) человеческого происхождения в зародышевой линии мышей. Как правило, такие последовательности нечеловеческого происхождения (или отдельные положения нуклеотидов) являются кластером (собираются в кластер) в или около СЭК или в областях, где, как известно, соматические мутации собираются в кластер.
Другой аспект изобретения включает В клетки трансгенных или трансхромосомных отличных от человека животных по данному описанию. В клетки можно использовать для получения гибридом, экспрессирующих человеческие моноклональные антитела, которые связываются с высокой аффинностью (например, константа равновесной диссоциации (Кс) ниже 10-8 М) с человеческим ΟΌ25. Так, в другом варианте изобретение включает гибридому, которая продуцирует человеческое антитело, имеющее аффинность (Кс) ниже 10-8 М, такую как аффинность, более низкая, чем 10-9 М, 10-10 М или 10-11 М или даже ниже, если её определять, анализируя клетки, экспрессирующие СЭ25, по методу Скэтчарда, используя меченное радиоактивной меткой моноклональное антитело, или определяя полумаксимальную концентрацию связывания методом ЕАС8 анализа, или анализом с применением поверхностного плазмонного резонанса на приборе В1Асоге.
Моноклональные антитела по данному описанию содержат лёгкую цепь с последовательностью человеческого происхождения, состоящую из (1) вариабельной области лёгкой цепи, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой генным сегментом V человеческого происхождения и генным сегментом ν7 человеческого происхождения, и 2) константной области лёгкой цепи, кодируемой генным сегментом Сь человеческого происхождения; и тяжёлую цепь с последовательностью человеческого происхождения, состоящую из (1) вариабельной области тяжёлой цепи, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой генным сегментом νΗ человеческого происхождения, областью Ό и генным сегментом ΙΗ человеческого происхождения, и 2) константной области тяжёлой цепи, кодируемой генным сегментом Сь человеческого происхождения. Следует отметить, что человеческие Ό гены могут быть значительно изменены событиями рекомбинации и соматической мутации, так что первоначальную последовательность человеческой зародышевой линии бывает нелегко распознать.
Создание человеческих моноклональных антител с высокой аффинностью против ΟΌ25 можно упростить с помощью метода расширения спектра сегментов вариабельной области человеческого гена в трансгенном отличном от человека животном, имеющем геном, содержащий интегрированный трансген человеческого иммуноглобулина, причём указанный метод включает введение в геном V гена трансгена, содержащего генные сегменты V области, которые отсутствуют в указанном интегрированном трансгене человеческого иммуноглобулина. Часто трансген V области представляет собой искусственную хромосому дрожжей (УАС, И.х.д.), содержащую часть набора генных сегментов V И VI, (V.) человеческого происхождения, которые могут встречаться в геноме человека или могут быть по отдельности сплайсироваться вместе методами рекомбинантной ДНК, они могут включать нестандартные или выпадающие V-генные сегменты. Часто по меньшей мере пять или более функциональных V-генных сегментов содержится на УАС (И.х.д.). В этом варианте возможно получить трансгенное животное методом расширения V спектра, при этом животное экспрессирует цепь иммуноглобулина, содержащую последовательность вариабельного домена, кодируемую сегментом V-генной области, присутствующим в трангене V области, и С области, кодируемой трансгеном человеческого 1д. С помощью метода расширения V спектра можно получать трансгенных животных, имеющих по меньшей мере 5 различных V генов; а также можно получить животных, содержащих по меньшей мере около 24 V генов или более. Некоторые Vгенные сегменты могут быть нефункциональными (например, псевдогены и т.п.); если требуется, эти сегменты можно сохранять или можно селективно делетировать (удалять) методами рекомбинантной ДНК, доступными специалистам в данной области техники.
Когда методом рекомбинантной ДНК создана такая мышиная последовательность зародышевой линии, которая содержит функциональную УАС, имеющую расширенный спектр V сегментов, практически отсутствующий в трансгене человеческого 1д, содержащем I и С генные сегменты, признак можно размножить и развести в других генетических средах, включая среды, в которых функциональные УАС, имеющие расширенный спектр V сегментов, введены в зародышевую линию отличного от человека животного, имеющую трансген другого человеческого 1д. Многие функциональные УАС, имеющие расширенный спектр V сегментов, можно ввести в зародышевую линию для работы с трансгеном человеческого 1д (или многими трансгенами человеческих 1д). Хотя такие трансгены в данном описании называются УАС трансгенами, такие трансгены, будучи интегрированы в геном, могут практически утратить последовательности дрожжей, такие как последовательности, требуемые для автономной репликации в дрожжах; такие последовательности могут необязательно быть удалены методом рекомбинантной ДНК (например, рестрикцией при гидролизе и гель-электрофорезом в пульсирующем электрическом поле или другим подходящим методом), после репликации в дрожжах они более не нужны (например, пе
- 21 013677 ред введением в мышиную клетку ЕЗ или мышиный фагоцит). Методы распространения признака экспрессии иммуноглобулина с последовательностями человеческого происхождения включают разведение трансгенного животного, имеющего трансген(-ы) человеческого(их) Гд, и, необязательно, также имеющего функциональную УАС с расширенным спектром V сегментов. Как νΗ, так и V,. генные сегменты могут присутствовать на УАС. Трансгенное животное можно разводить в любой (генной) среде, нужной практику, включая среды, содержащие (хранящие) другие трансгены человеческого происхождения, включающие трансгены человеческих Гд и/или трансгены, кодирующие другие белки человеческих лимфоцитов. Изобретение также включает высокоаффинный иммуноглобулин с последовательностью человеческого происхождения, продуцируемый трансгенной мышью, имеющей трансген с УАС, содержащей расширенный спектр V области. Хотя вышесказанное описывает предпочтительный вариант трансгенного животного по изобретению, рассматриваются другие варианты изобретения, которые делятся на три класса:
Г) трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с нереаранжированной тяжёлой и реаранжированной лёгкой цепью;
ГГ) трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с нереаранжированной тяжёлой и нереаранжированной лёгкой цепью; и
ГГГ) трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с реаранжированной тяжёлой и нереаранжированной лёгкой цепью.
Порядок предпочтительности этих классов (категорий) трансгенного животного следующий: Г > ГГ > ГГГ, где гены эндогенной лёгкой цепи (или, по меньшей мере, к ген) нокаутированы с помощью гомологичной рекомбинации (или другим методом), и Г > ГГ > ГГГ, где гены эндогенной лёгкой цепи не нокаутированы и должны быть доминирующими при использовании аллельного исключения.
III. Биспецифические/Полиспецифические молекулы, связывающиеся с СБ25
Ещё в одном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела к СЭ25 могут быть дериватизированы или связаны с другой функциональной молекулой, например другим пептидом или белком (например, с РаЬ' фрагментом) с образованием биспецифической или полиспецифической молекулы, которая связывается со многими сайтами связывания или эпитопами-мишенями. Например, антитело по изобретению может быть функционально связано (например, химической связью, генетическим слиянием (гибридизацией), нековалентной ассоциацией или иным способом) с одной или более связующих молекул, таких как другое антитело, пептид или связующий миметик.
Следовательно, настоящее изобретение включает биспецифические и полиспецифические молекулы, содержащие по меньшей мере одну специфичность связывания с СЭ25 и вторую специфичность связывания со вторым эпитопом-мишенью. В особом варианте изобретения вторым нацеленным эпитопом (эпитопом-мишенью) является СЭ3, СЭ4, ГЬ-15К, мембраносвязанный или рецепторносвязанный ΊΝΡ-а или мембраносвязанный или рецепторносвязанный ГЬ-15К. В другом варианте изобретения вторым эпитопом-мишенью является человеческий РсуК! (СЭ64) или человеческий РсаК! (СЭ89), или Т-клеточный рецептор. Следовательно, изобретение включает биспецифические и полиспецифические молекулы, способные связываться с эффекторными клетками, экспрессирующими как РсуК, РсоК, так и РсеВ (например, моноцитами, макрофагами или полиморфонуклеарами (ΡΜΝ)), и с клетками-мишенями, экспрессирующими СЭ25. Эти биспецифические и полиспецифические молекулы нацеливают клетки, экспрессирующие СЭ25, на эффекторную клетку и, подобно человеческим моноклональным антителам по изобретению, включают активности эффекторных клеток, опосредованные Рс рецептором, такие как фагоцитоз клеток, экспрессирующих СЭ25, АЭСС, высвобождение цитокинов или образование аниона супероксида.
Кроме того, биспецифические и полиспецифические молекулы по изобретению могут включать третью специфичность связывания, помимо специфичности связывания антител против Рс и специфичности связывания антител против СЭ25. В одном варианте изобретения третья специфичность связывания представляет собой участок фактора противоусиления (апП-епНапсешеШ) (ЕР), например молекула, которая связывается с поверхностным белком, включённым в цитотоксическую активность, и тем самым, повышает иммунный ответ на клетку-мишень. Участком (частью) фактора противоусиления (аийепНапсешеШ) (ЕР) может быть антитело, функциональный фрагмент антитела или лиганд, который связывается с данной молекулой, например, антигеном или рецептором, и тем самым приводит к усилению влияния детерминант связывания на Рс рецептор или антиген клетки-мишени. Участок фактора противоусиления может связываться с Рс рецептором или антигеном клетки-мишени. Или же участок фактора противоусиленияможет связываться с объектом (частицей), отличным от объекта, с которым связываются первая и вторая специфичности. Например, участок фактора противоусиления может связывать цитотоксическую Т клетку (например, через СЭ2, СЭ3, СЭ8, СЭ28, СЭ4, СЭ40, ГСАМ-1 или другую иммунную клетку, которая приводит к повышенному иммунному ответу против клетки-мишени).
В одном варианте изобретения биспецифические и полиспецифические молекулы по изобретению содержат в качестве специфичности связывания по меньшей мере одно антитело, включая РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2, Ру или ксРу. Антитело также может димером лёгкой или тяжёлой цепи или его минимальным
- 22 013677 фрагментом, таким как Εν, или одноцепочечной конструкцией, описанной Байвег е! а1. в патенте США 4946778. Антитело может также быть химерным белком связывающего домена иммуноглобулина, описанным в патентных заявках США 2003/0118592 и 2003/0133939.
В одном варианте изобретения специфичность связывания с Рс рецептором обеспечивается человеческим моноклональным антителом, связывание которого не блокируется человеческим иммуноглобулином С (1дС). Применяемый в данном описании термин 1дС рецептор относится к любому из восьми генов γ-цепи, локализованных на хромосоме 1. Эти гены кодируют всего двенадцать изоформ трансмембранных или растворимых рецепторов, которые группируются в три класса Рсу рецепторов: РсуК1 (СО64), РсуКП(СО32) и РсуКШ (СЭ16). В одном предпочтительном варианте изобретения Рсу рецептор представляет собой человеческий высокоаффинный РсуК1.
Продуцирование и характеристика этих предпочтительных моноклональных антител описаны Равдег е! а1. в Международной заявке №О 88/00052 и в Патенте США 4954617. Эти антитела связываются с эпитопом РсуК1, РсуКП и РсуКШ в сайте, который отличен от сайта связывания Рсу рецептора и, таким образом, их связывание практически не блокируется физиологическими уровнями 1дС. Специфические антитела против РсуК1, применимые по данному изобретению, представляют собой МАЬ 22, МАЬ 32, МАЬ 44, МАЬ 62 и МАЬ 197. В других вариантах изобретения антитело против РсуК1 представляет собой гуманизированную форму МаЬ 22 (Н22). Продуцирование и характеристика антитела Н22 описаны в Сн-Шагю, К.Р. е! а1. (1995) 1. Iттиηο1 155 (10): 4996-5002 и в Международной заявке №О 94/10332. Клеточная линия, продуцирующая Н22 антитело, депонирована в Американской коллекции типовых культур 4 ноября 1992 г. под названием НА022СБ1 и имеет Νο. СКБ 11177.
В других предпочтительных вариантах изобретения специфичность связывания с Рс рецептором обеспечивается антителом, которое связывается с рецептором человеческого 1дА, например с Рс-альфа рецептором (РсаК1 (СО89)), связывание которого предпочтительно не блокируется человеческим иммуноглобулином А (1дА). Предполагается, что термин 1дА рецептор включает генный продукт одного αгена (РсаК1), локализованного на хромосоме 19. Известно, что этот ген кодирует несколько альтернативно сплайсированных трансмембранных изоформ от 55 до 110 кДа. РсаК1 (СЭ89) конститутивно экспрессируется на моноцитах/макрофагах, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитах, но не на популяции неэффекторных клеток. РсаК1 имеет аффинность среды как в отношении 1дА1, так и в отношении 1дА2, которая повышается при экспозиции с цитокинами, такими как С-С8Р или СМ-С8Р (Μο^ιοη. Н.С. е! а1. (1996) СпБса1 Кеу1е\\ъ ίη Iттиηο1οду 16:423- 440). Описаны четыре РсаК1-специфических моноклональных антитела, идентифицированные как А3, А59, А62 и А77, которые связывают РсаК1 вне лигандсвязывающего домена 1дА (Μοη!е^^ο, К.С. е! а1. (1992) 1. Iттиηο1. 148:1764).
РсаК1 и РсуК1 являются предпочтительными триггерными рецепторами для применения по изобретению, так как они (1) экспрессируются первично на иммунных эффекторных клетках, например на моноцитах, РМН макрофагах и дендритных клетках; (2) экспрессируются с высокими уровнями (например, 5000-100000 на клетку); (3) являются медиаторами цитотоксических активностей (например, АОСС, фагоцитоза) и (4) опосредуют повышенную антигенную презентацию антигенов, включая аутоантигены, нацеленные на них.
Выражение специфическое антитело эффекторной клетки по данному описанию относится к антителу или функциональному фрагменту антитела, которые связываются с Рс рецептором эффекторных клеток. Предпочтительные антитела для применения в качестве предмета изобретения связываются с эффекторными клетками по сайту, который не связан эндогенным иммуноглобулином.
Применяемый в данном описании термин эффекторная клетка относится к иммунной клетке, которая участвует в эффекторной фазе иммунного ответа, в противоположность когнитивной фазе и фазе активации иммунного ответа. Примеры иммунных клеток включают клетки миелоидного или лимфоидного происхождения, например, лимфоциты (например, В клетки и Т клетки, включая цитолитические Т клетки (СТБ), киллерные клетки (клетки-киллеры), природные клетки-киллеры, макрофаги, моноциты, эозинофилы, нейтрофилы, полиморфонуклеары, гранулоциты, тучные клетки и базофилы. Некоторые эффекторные клетки экспрессируют специфические Рс рецепторы и несут специфические иммунные функции. В предпочтительных вариантах изобретения эффекторная клетка способна индуцировать АОСС, например нейтрофил, способный индуцировать АОСС. Например, моноциты, макрофаги, которые экспрессируют РсК, участвуют (включены) в специфическом киллинге клеток-мишеней и презентации антигенов другим компонентам иммунной системы, или в связывании с клетками, которые презентируют антигены. В других вариантах изобретения эффекторная клетка может фагоцитировать нацеленный антиген, клетку-мишень или микроорганизм. Экспрессия конкретного РсК на эффекторной клетке может регулироваться гуморальными факторами, такими как цитокины. Найдено, например, что экспрессия РсуК1 апрегулируется интерфероном гамма (ΙΡΝ-у). Эта повышенная экспрессия повышает цитотоксическую активность РсуК1-несущих клеток против мишеней. Эффекторная клетка может фагоцитировать или лизировать антиген-мишень или клетку-мишень.
Термин клетка-мишень должен означать любую клетку субъекта (например, человека или животного), на которую может быть нацелена композиция (например, моноклонального антитела, биспецифи
- 23 013677 ческой или полиспецифической молекулы) по изобретению. В предпочтительных вариантах изобретения клетка-мишень представляет собой клетку, экспрессирующую или сверхэкспрессирующую СЭ25. Клетки, экспрессирующие СЭ20, как правило, включают активированные Т клетки, моноциты и В клетки.
Биспецифические и полиспецифические молекулы по настоящему изобретению можно получать химическими методами (см., например, Ό.Μ. Кгапг е! а1. (1981) Ргос. Асаб. 8сг И8А 78:5807), методами полидома (см. Патент США 4474893, выданный Веабтд), или методами рекомбинантной ДНК.
В частности, биспецифические и моноспецифические молекулы по данному изобретению можно получать конъюгацией компонентов специфичностей связывания, например специфичностей связывания против ЕсВ и СЭ25, применяя методы, известные в технике и приведённые в примерах в данном описании. Например, каждую специфичность связывания биспецифической и полиспецифической молекулы можно получать отдельно, а затем конъюгировать друг с другом. Когда специфичности связывания представляют собой белки или пептиды, для ковалентной конъюгации можно использовать множество линкеров и сшивающих агентов. Примеры сшивающих агентов включают протеин А, карбодиимид, Νсукцинимидил-8-ацетилтиоацетат (8АТА), 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойную кислоту) (^ΤNΒ), офенилендималеинимид (оРЭМ), №сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионат (8РЭР) и сульфосукцинимидинил 4-(№малеинимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-8МСС) (см., например, Кагроукку е! а1. (1984) I. Ехр. Меб. 160:1686; Ьш, М.А. е! а1. (1985) Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 82:8648). Другие методы включают методы, описанные Раи1ик, ВеБппд 1пк. Мй!. (1985) №. 78, 118- 132); Вгеппап е! а1. (8аепсе (1985) 229:81-83) и С1е1Ш1е е! а1. (I. 1ттипо1. (1987) 139: 2367-2375). Предпочтительными конъюгирующими агентами являются 8АТА и сульфо-8МСС, оба выпускаются Р1егсе Сйет1са1 Со. (ВоскГогб, 1Ь).
Если специфичности связывания представляют собой антитела, их можно конъюгировать с помощью связывания сульфгидрильных групп С-концевых шарнирных областей двух тяжёлых цепей. В особенно предпочтительном варианте изобретения шарнирная область модифицирована таким образом, чтобы перед конъюгацией содержать нечётное число сульфгидрильных остатков, предпочтительно один.
Или же, обе специфичности связывания можно кодировать в одном и том же векторе, а экспрессировать и собирать в той же самой клетке- хозяине. Этот метод особенно применим в тех случаях, когда биспецифическая и полиспецифическая молекула представляет собой химерный белок МАЬ х МАЬ, МАЬ х ЕаЬ, ЕаЬ х Е(аЬ')2 или лиганд х ЕаЬ. Биспецифическая и полиспецифическая молекула по изобретению, например биспецифическая молекула, может быть одноцепочечной молекулой, такой как одноцепочечное биспецифическое антитело, одноцепочечная биспецифическая молекула, содержащая одноцепочечное антитело и детерминанту связывания, или одноцепочечная биспецифическая молекула, содержащая две детерминанты связывания. Биспецифические и полиспецифические молекулы могут также представлять собой одноцепочечные молекулы или могут содержать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Методы получения би- и полиспецифических молекул описаны, например, в патентах США 5260203; 5455030; 4881175; 5132405; 5091513; 5476786; 5013653; 5258498 и 5482858.
Связывание биспецифических и полиспецифических молекул с их специфическими мишенями можно подтвердить твердофазным иммуноферментным анализом (ЕЫ8А), радиоиммуноанализом (В1А), анализом ЕАС8, биоанализом (например, ингибированием роста), В1Асоге анализом или вестернблоттингом. Каждый из этих анализов, как правило, обнаруживает присутствие комплексов белокантитело, представляющих особый интерес, с помощью меченого реагента (например, антитела), специфического в отношении представляющего интерес комплекса. Например, комплексы ЕсВ-антитело можно обнаружить, используя, например, связанное с ферментом антитело или фрагмент антитела, который распознаёт и специфически связывается с комплексами антитело-ЕсВ. Или же, комплексы можно обнаруживать, используя любой из множества других иммуноанализов. Например, антитело можно метить радиоактивной меткой и использовать в радиоиммуноанализе (В1А) (см., например, Ает!гаиЬ, В., Рппс1р1ек оГ ВабЮттипоаккаук, 8еуеп!й Тгшшпд Соигке оп ВабюНдапб Аккау Тесйтдиек, ТНе Епбосгте 8ос1е1у, Магсй, 1986). Радиоактивный изотоп можно обнаружить такими способами, как применение счётчика γ-излучения или сцинтилляционного счётчика, или ауторадиографией.
IV. Иммуноконъюгаты
В другом аспекте настоящего изобретения человеческие моноклональные антитела против СЭ25 конъюгированы с терапевтической частицей, такой как цитотоксин, лекарственным веществом (например, иммуносупрессором) или радиоизотопом. Такие конъюгаты называются в данном описании иммуноконъюгатами. Иммуноконъюгаты, которые включают один или более цитотоксинов, называются иммунотоксинами. Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который является вредным для клеток (например, убивает клетки). Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидин Ό, этидия бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин Ό, 1дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи.
Подходящие терапевтические агенты для образования иммуноконъюгатов по изобретению включают, но без ограничения, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, ци
- 24 013677 тарабин, флюдарабин, 5-флуорурацил декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, !Ыоера, хлорамбуцил, мельфалан, кармустин (ΒδΝυ) и ломустин (ССЫИ), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиамин платина (II) (ΌΌΡ), цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (прежнее название дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (прежнее название актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)) и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин). Другие примеры терапевтических цитотоксинов, которые можно конъюгировать с антителом по изобретению, включают калихеамицины и дуокармицины.
Антитела по данному изобретению также могут быть конъюгированы с радиоизотопом, например с йодом-131, иттрием-90 или индием-111, для получения цитотоксических радиофармацевтических средств для лечения нарушения, связанного с ί.Ό25, такого как рак. Конъюгаты антител по изобретению можно использовать для модификации данного биологического ответа, а долю лекарственного вещества не следует конструировать как ограничивающуюся классическими химическими терапевтическими агентами. Например, частица, (доля) лекарственного вещества может представлять собой белок или полипептид, обладающий заданной биологической активностью. Такие белки могут включать, например, ферментативно активный токсин или его активный фрагмент, такой как абрин, рицин А, экзотоксин псевдомонад или дифтерийный токсин, или агент, активный на клеточной поверхности, такой как ферменты фосфолипазы, например фосфолипаза С.
Методы конъюгации таких терапевтических фрагментов с антителами хорошо известны, см., например, Агпоп е! а1., Мопос1опа1 АпИЬоб1ек Рог 1ттипо!агде!шд о£ Огадк 1п Сапсег ТНегару, в Мопос1опа1 Ап!1Ьоб1ек Апб Сапсег ТНегару, Ве1к£е1б е! а1. (ебк.), рр. 243-56 (А1ап В. Ыкк, 1пс. 1985), Не11к!гот е! а1., АпНЬоб1ек Рог Огид Ое1Н'егу, в Соп!го11еб Огид Ое1Нгегу (2пб Еб.), ВоЫпкоп е! а1. (ебк.), рр. 623-53 (Магсе1 Оеккег, 1пс. 1987); ТНогре, АпНЬобу Сагпегк 0£ Су!о!охю Адеп!к ш Сапсег ТНегару: А Ве\зе\\·, в Мопос1опа1 Ап!1Ьоб1ек '84: Вю1одюа1 Апб СНшса1 АррНсаНопк, РшсНега е! а1. (ебк.), рр. 475-506 (1985); Апа1ук1к, Веки1!к, апб Ри!иге Ргокрес!Ве о£ ТНе ТНегареиНс ике 0£ Вабю1аЬе1еб АпНЬобу 1п Сапсег ТНегару, в Мопос1опа1 Ап!1Ьоб1ек Рог Сапсег Ое!ес!юп Апб ТНегару, Ва1б\\гп е! а1. (ебк.), рр. 303-16 (Асабетк Ргекк 1985), и ТНогре е! а1., ТНе Ргерага!юп Апб Су!о!охю РгорегИек 0£ АпНЬобу-Тохт Соп)ида!ек, 1ттипо1. Веу., 62:119-58(1982).
Ещё в одном варианте человеческие моноклональные антитела по изобретению присоединены к линкеру-хелатору (например, тиуксетану), который способствует конъюгации антитела с радиоизотопом.
V. Фармацевтические композиции
В другом аспекте настоящее изобретение охватывает композиции, включая фармацевтические композиции, содержащие одно или комбинацию человеческих моноклинальных антител по настоящему изобретению. Композиции можно готовить с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, а также с другими известными адъювантами и эксципиентами, в соответствии с традиционными методами, такими как методы, описанные в Ветшд!оп: ТНе 8аепсе апб РгасИсе о£ РНагтасу, 19'1' Еббюп, Сеппаго, Еб., Маск РиЬЕкЫпд Со., Еак!оп, РА, 1995.
Композиции по изобретению можно также применять в комбинированной терапии, т.е. объединять с другими агентами, релевантными для заболевания или состояния, которое следует лечить. Например, комбинированная терапия может включать композицию по настоящему изобретению по меньшей мере с одним иммунодепрессантом (иммуносупрессором), по меньшей мере с одним противовоспалительным агентом, по меньшей мере одним антипсориатическим агентом или по меньшей мере одним химиотерапевтическим агентом.
В одном варианте изобретения такие агенты включают один или более иммунодепрессантов, таких как циклоспорин, азатиоприн, микофенольную кислоту, микофенолят мофетила, кортикостероиды, такие как преднизон, метотрексат, соли золота, сульфасалазин, противомалярийные средства, бреквинар, лефлюномид, мизорибин, 15-дезоксиспергуалин, 6-меркаптопурин, циклофосфамид, рапамицин, такролимус (РК-506), 0КТ3, антитимоцит глобулин и т.д.
В другом варианте изобретения композиции по изобретению применяют в комбинации с двумя или более иммунодепрессантов (иммуносупрессоров), таких как преднизон или циклоспорин; преднизон, циклоспорин и азатиоприн или преднизон, циклоспорин и микофенолят мофетила.
В другом варианте изобретения такие терапевтические агенты включают один или более противовоспалительных агентов, таких как стероидное лекарственное средство или НСПВС (нестероидное противовоспалительное средство). Предпочтительные агенты включают, например, аспирин и другие салицилаты, ингибиторы Сох-2, такие как рофекоксиб и целекоксиб, НСПВС, такие как ибупрофен, фенопрофен, напроксен, сулиндак, диклофенак, пироксикам, кетопрофен, дифлунизал, набуметон, этодолак, оксапрозин и индометацин.
В другом варианте изобретения такие терапевтические агенты включают одно или более ОМАВО, таких как метотрексат, гидроксихлорокин, сульфасалазин, ингибиторы синтеза пиримидина, например лефлуномид, блокаторы 1Ь-1 рецептора, например анакинра, и блокаторы Т№-а, например этанерсепт, инфликсимаб и адалимумаб. Другими подходящими ОМАВО являются антитела против 1Ь-6В, СТЬА41д и антитела против 1Ь-15.
- 25 013677
В другом варианте изобретения такие терапевтические агенты включают один или более агентов для лечения воспалительных или гиперпролиферативных заболеваний кожи, такие как лекарственные вещества местного действия, включая угольную смолу, витамин А, антралин, кальципотриен, таразотен, и кортикостероиды, лекарственные вещества для перорального применения или для инъекций, такие как кортикостероиды, метотрексат, ретиноиды, например ацикретин, циклоспорин, этанерсепт, алефасепт, эфалузимаб, 6-тиогуанин, микофенолят мофетила, такролимус (ЕК-506) и гидроксимочевина. Другими примерами являются СТЬА41д и инфликсимаб. Другие методы лечения включают экспозицию с солнечным светом и фототерапию, в том числе УФВ (ультрафиолет В, широкая и узкая полоса), УФА (ультрафиолет А) и РИУА (ПУФА, псорален метоксален плюс ультрафиолет А).
В другом варианте композиции по изобретению применяют в комбинации с двумя или более вышеприведённых методов терапии, таких как метотрексат + фототерапия (РИУА или УФА): метотрексат + ациретин: ациретин + фототерапия (РИУА или УФА): метотрексат + ациретин + фототерапия (РИУА или УФВ): гидроксимочевина + фототерапия (РИУА или УФВ): гидроксимочевина + ациретин: циклоспорин + метотрексат или кальципотриен + фототерапия (УФВ).
Ещё в одном варианте изобретения такие терапевтические агенты включают один или более химиотерапевтических агентов, таких как доксорубицин, цисплатин, блеомицин, кармустин, циклофосфамид, виндезин, винкристин и хлорамбуцил.
Ещё в одном варианте антитела по настоящему изобретению можно вводить в сочетании с лучевой терапией и/или с трансплантацией костного мозга.
Ещё в одном варианте антитела по настоящему изобретению можно вводить в комбинации с другими антителами, например с другими иммуносупрессорными человеческими моноклональными антителами, такими как антитела, связывающиеся с р75 1Ь-2 рецептора, или антитела, связывающиеся, например, с МНС, СЭ2, СО3, СЭ4, СЭ7, СП28, В7, (4)40, СП45, ΣΕ^γ, Т№-а, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6К, 1Ь-7, 1Ь-8, 1Ь10, СЦ11а, СЭ20 или СЭ58, или антитела, связывающиеся с их лигандами: или в комбинации с другими иммуномодуляторами, например растворимым 1Ь-15К или 1Ь-10.
Выражение фармацевтически приемлемый носитель включает все физиологически совместимые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и снижающие всасывание агенты и т.п. Предпочтительно носитель пригоден для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, с помощью инъекции или вливания (инфузии)).
Выражение фармацевтически приемлемая соль относится к соли, которая сохраняет заданную биологическую активность исходного соединения и не имеет никакого нежелательного токсикологического действия (см., например, Вегде, 8.М. е) а1. (1977) Σ. РЕагт. 8с1. 66:1- 19). Примеры таких солей включают соли присоединения кислоты и соли присоединения основания. Соли присоединения кислоты включают соли, образованные присоединением нетоксических неорганических кислот, таких как хлористо-водородная, азотная, фосфорная, серная, бромисто-водородная, йодисто-водородная, фосфорная кислоты и т. п., а также нетоксических органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещённые алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, ароматические сульфокислоты и т. п. Соли присоединения основания включают соли, образованные присоединением оснований щелочных и щелочно-земельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также нетоксических органических аминов, таких как N,N'-дибензилэтилендиамин, N метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т. п.
Композиции по данному изобретению, включая фармацевтические (терапевтические) композиции, можно вводить различными методами, известными в технике. Как понятно специалисту в данной области техники, путь и/или способ введения меняется в зависимости от желаемого результата. Активные соединения можно приготовить с носителями, которые предохраняют соединение от быстрого высвобождения, как в препарате пролонгированного действия (с регулируемым выделением), включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биодеградируемые (биоразрушающиеся), биосовместимые полимеры, такие как сополимер этилена с винилацетатом, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры и полимолочную кислоту. Методы приготовления таких препаратов хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например 8и51а1иеб апб Сои1го11еб Ке1еа§е Цгид Ое1кегу 8у§1ет8, ЕК. КоЫикои, еб., Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уогк, 1978.
Для введения композиций по изобретению определёнными методами может быть необходимо покрыть соединение оболочкой из материала, предупреждающего его инактивацию, или вводить соединение одновременно с этим материалом. Например, соединение можно вводить субъекту в подходящем носителе, например, в липосомах, или в разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают физиологический солевой раствор и водные буферные растворы. Липосомы включают эмульсии СОЕ вода-в-масле-в-воде, а также обычные липосомы (81ге)аи е) а1. (1984) Е №иго1ттиио1. 7:27).
Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии или стерильные порошки для мгновенного приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсии. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в техни
- 26 013677 ке. Рассматривается применение в фармацевтических композициях по изобретению любых обычных сред или агентов за исключением тех, которые несовместимы с активным компонентом. В композиции могут вводиться активные добавки.
Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильны и устойчивы в условиях производства и хранения. Композицию можно готовить в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, пригодной для высоких концентраций лекарственного вещества. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Соответствующую текучесть можно сохранять, например, с помощью покрытия, такого как лецитин, путём сохранения требуемого гранулометрического состава в случае дисперсии и с помощью поверхностноактивных веществ. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например сахара, полиолы, такие как маннит, сорбит, или хлористый натрий. Пролонгированное всасывание инъецированных композиций можно обеспечить, включая в композицию агент, который замедляет всасывание, например, солей-моностеаратов и желатина.
В одном варианте человеческие моноклональные антитела по изобретению вводят в кристаллической форме в виде подкожной инъекции, ср. Уапд е! а1. (2003), РЫА8, 100(12):6934- 6939.
При необходимости стерильные растворы для инъекций можно приготовить, вводя активное соединение в требуемом количестве в подходящем растворителе с одним из или с комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, с последующей стерилизационной микрофильтрацией. Как правило, дисперсии получают, вводя активное соединение в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие нужные ингредиенты, выбранные из вышеперечисленных. В случае применения стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными методами приготовления являются вакуумная сушка и сушка в замороженном состоянии (лиофилизация), которые дают порошок активного ингредиента плюс любого нужного ингредиента из их раствора, предварительно очищенного стерилизационной микрофильтрацией.
Схемы приёма доз корректируют таким образом, чтобы обеспечить оптимальную нужную реакцию (например, терапевтический ответ). Например, можно вводить единичный болюс, можно вводить несколько раздельных доз во времени или дозу можно пропорционально снизить или повысить, в соответствии с острой необходимостью, возникающей при лечении. Особенно предпочтительными являются парентеральные композиции, приготовленные в виде стандартной лекарственной формы, из-за простоты введения и однородности лекарственной формы. Выражение стандартная лекарственная форма (доза) по данному описанию относится к физически дискретным единицам лекарственной формы, применяемым как единичные дозы, для проходящих лечение субъектов; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, вычисленное исходя из того, что требуется получить заданный терапевтический эффект, в сочетании с нужным фармацевтическим носителем. Технические условия для стандартных лекарственных форм по изобретению диктуются (а) уникальными характеристиками активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который требуется достичь, и (б) ограничениями, присущими технике приготовления препарата из такого активного соединения, для лечения чувствительности у индивидуума, - и непосредственно зависят от требований, указанных в (а) и (б).
Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеин гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как алкорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфатокоферол и т.п.; и (3) агенты, хелатирующие металлы, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЕЭТА), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т.п.
Терапевтические композиции по настоящему изобретению можно готовить для конкретных способов введения, таких как пероральный, назальный, местный (включая трансбуккальное и подъязычное), ректальный, вагинальный и/или парентеральный. Обычно препараты могут находиться в виде стандартной лекарственной формы (в виде унифицированных доз) и могут быть приготовлены любыми методами, известными в технике фармации. Количество активного ингредиента, которое можно объединять с материалом носителя для получения стандартной лекарственной формы, в значительной мере зависит от субъекта, проходящего лечение, и конкретного способа применения. Количество активного ингредиента, которое можно объединять с материалом носителя для получения стандартной лекарственной формы, как правило, таково, чтобы композиция вызывала терапевтический эффект. Обычно, если исходить из ста процентов, это количество находится в интервале, примерно 0,01-99% активного ингредиента, предпочтительно около 0,1-70%, наиболее предпочтительно около 1-30%.
Препараты по настоящему изобретению, пригодные для вагинального применения, включают также пессарии, тампоны, кремы, гели, пасты, пены или препараты в виде спрея, содержащие такие носители, о которых известно в технике, что они являются подходящими. Лекарственные формы композиций по данному изобретению для местного или трансдермального (чрескожного) применения включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и летучие препараты для ингаляций. Активное соединение можно смешивать в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носите
- 27 013677 лем и с любыми нужными консервантами, буферами или диспергаторами.
Выражения парентеральное введение (применение) и применяемый парентерально по данному описанию означают способы введения (применения), иные нежели энтеральный и местный, обычно с помощью инъекции, и включает, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, подоболочечную, интракапсулярную, интраорбитальную, интракардиальную, интрадермальную, интраперитонеальную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, интраартикулярную, субкапсулярную, субарахноидную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию.
Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно применять в фармацевтических композициях по изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Должна сохраняться подходящая текучесть, например, за счёт использования материалов для покрытия, таких как лецитин, за счёт сохранения гранулометрического состава, в случае дисперсий, и за счёт использования поверхностноактивных веществ.
Эти композиции также могут содержать адъюванты, такие как консерванты, увлажняющие средства, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предупреждение присутствия микроорганизмов можно обеспечить как с помощью стерилизации, см. выше, так и включением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Также может быть желательным включение в композиции изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, пролонгированное всасывание фармацевтической формы для инъекций можно осуществить, включая агенты, которые замедляют всасывание, такие как моностеарат алюминия и желатин.
Когда соединения по настоящему изобретению вводят в виде фармацевтических препаратов людям или животным, их можно давать индивидуально или в виде фармацевтической композиции, содержащей, например, 0,01-99,5% (более предпочтительно 0,1-90%) активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
Вне зависимости от выбранного способа применения, соединения по настоящему изобретению, которые могут применяться в соответствующей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции по настоящему изобретению готовят в фармацевтически приемлемых лекарственных формах обычными методами, известными специалистам в данной области техники.
Действительные уровни доз активных ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению могут варьироваться таким образом, чтобы получать количество активного ингредиента, которое позволяет эффективно достигать нужный терапевтический ответ у конкретного пациента, для композиции и способа введения, не являясь при этом токсическим для пациента. Выбранный уровень дозы зависит от ряда фармакокинетических факторов, включая активность конкретных применяемых композиций соединений по данному изобретению, или их сложного эфира, соли или амида; способ применения, время применения, скорость экскреции конкретного применяемого соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, применяемые в комбинации с конкретными применяемыми композициями, возраст, пол, вес, состояние, общее состояние здоровья и историю болезни проходящего лечение пациента и другие подобные общеизвестные в медицинской технике факторы.
Врач или ветеринар, имеющий обычный опыт в данной области техники, может легко определить и прописать требуемое эффективное количество фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начать с доз соединений по изобретению, применяемых в фармацевтических композициях по изобретению, более низких, чем требуется, для достижения нужного терапевтического эффекта, и постепенно повышать дозу до достижения нужного эффекта. Как правило, подходящей суточной дозой соединения по изобретению является такое количество соединения, которое является самой низкой эффективной для получения терапевтического эффекта дозой. Такая эффективная доза, как правило, зависит от описанных выше факторов. Предпочтительно, чтобы введение было внутривенным, внутримышечным, интраперитонеальным или подкожным, предпочтительно проксимальное введение в нужное место. Хотя соединение по настоящему изобретению можно вводить индивидуально, предпочтительно его вводить в виде фармацевтического состава (композиции, препарата). Лекарственную дозу можно определять или корректировать, определяя количество моноклональных антител против ί.Ό25 в кровотоке в различные временные точки после введения в биологический образец, используя антиидиотипические антитела, нацеленные на антитела против ί.Ό25.
Человеческие моноклональные антитела по изобретению можно вводить для предупреждения отторжения трансплантата при индукционном лечении, т.е. в качестве профилактической кратковременной терапии для однократного или многократного применения перед трансплантацией и в самой ранней фазе после трансплантации, например незадолго до трансплантации и вплоть до 3 месяцев после трансплантации.
В одном варианте изобретения моноклональные антитела по изобретению можно, например, вво
- 28 013677 дить для предупреждения отторжения трансплантата в общей дозе около 20-100 мг, например, в виде внутривенных вливаний (инфузий) по 15 или 20 мг, причём первую дозу вводят перед операцией, а последующие дозы вводят в первые 10 дней после операции. Или же дозы можно вводить в виде болюсных инъекций. В другом варианте моноклональные антитела по изобретению для предупреждения отторжения трансплантата можно вводить в виде доз 0,5-1,5 мг/кг внутривенно, через неделю, до пяти доз, причём первую дозу вводят перед операцией. Такое применение можно соединять с терапией иммунодепрессантами, например стероидами, такими как преднизон или метилпреднизолон, и циклоспорин; стероидами, такими как преднизон или метилпреднизолон, циклоспорин и азатиоприн; или стероидами, такими как преднизон или метилпреднизолон, циклоспорин и микофенолят мофетила. Преимущество введения человеческих антител позволит обойтись без стероидов или может привести к быстрой отмене стероидов.
В другом варианте человеческие моноклональные антитела по изобретению можно вводить для лечения или предупреждения отторжения трансплантата по схеме: две внутривенных инфузий (доза около 20 мг в день трансплантации и доза около 20 мг в день 4 после транплантации). Такое введение можно объединять с терапией иммуносупрессорами, например, описанными выше. Например, 1 г микофенолята мофетила можно вводить перорально перед хирургической операцией, и 500 мг метилпреднизолона - во время введения анестетика. Циклоспорин можно вводить на второй день после трансплантации, и лечение продолжить, вводя 1 г микофенолята мофетила после трансплантации. Дозу стероидов можно постепенно уменьшать до 20 мг перорально на четвёртый день.
Ещё в одном варианте человеческие моноклональные антитела по изобретению для лечения или предупреждения отторжения трансплантата можно вводить по схеме: индукционная терапия в виде двух доз: первую дозу 1 мг/кг дают за 1 ч до операции, а вторую дозу - через 4 дня после операции. Такое введение можно соединять с терапией иммунодепрессантами, например, такой, как описанная выше.
Человеческие моноклональные антитела по изобретению можно вводить для лечения или предупреждения отторжения трансплантата в виде долговременной терапии, например, вводя дозы в интервале 10-150 мг, такие как 20-40 мг еженедельно или ежемесячно, например 3-8 раз еженедельно, необязательно с последующими одним или более ежемесячным введением. С помощью долговременной терапии можно уменьшить поддерживающую терапию циклоспорином или избежать её.
Терапевтические композиции антител можно вводить с применением медицинских устройств, известных в технике. Например, в предпочтительном варианте изобретения терапевтическую композицию по изобретению можно вводить с помощью безыгольного гиподермического инъектора, такого как устройства, описанные в патентах США 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 или 4596556. Примеры общеизвестных имплантатов и модулей, применимых в данном изобретении, включают патент США 4487603, в котором описан имплантируемый микроинфузионный насос для распределения медицинского препарата с регулируемой скоростью; патент США 4486194, в котором описано терапевтическое устройство для введения медицинских препаратов через кожу; патент США 4447233, в котором описан медицинский инфузионный насос для доставки медицинского средства с точной скоростью вливания; патент США 4447224, в котором описан имплантируемое инфузионное устройство с переменной скоростью потока для непрерывной доставки лекарственного вещества; патент США 4439196, в котором описана осмотическая система доставки лекарственного вещества с многокамерными ячейками и патент США 4475196, в котором описана осмотическая система доставки лекарственного вещества. Специалистам в данной области техники известны многие другие имплантаты, системы доставки и модули.
В некоторых вариантах человеческие моноклональные антитела по изобретению можно приготовить таким образом, чтобы гарантировать соответствующее распределение ίη νίνο. Например, гематоэнцефалический барьер (ВВВ) исключает многие высокогидрофильные соединения. Для того, чтобы гарантировать возможность проникновения лекарственных соединений по изобретению (если требуется) через ВВВ, они должны быть приготовлены, например, в липосомах. О методах получения липосом см., например, патенты США 4522811; 5374548 и 5399331. Липосомы могут содержать одну или более частиц, которые селективно переносятся (транспортируются) в конкретные клетки или органы, что повышает нацеленную доставку лекарственного вещества (см., например, V.V. Канабе (1989) ί. С1ш. Рйагтасо1. 29:685). Примеры нацеленных частиц включают фолат или биотин (см., например, патент США 5416016, принадлежащий йот е1 а1.); маннозиды Ште/ата е! а1., (1988) Вюсйет. Вюрйук. Кек. Соттип. 153:1038); антитела (Р.6. В1оетап е! а1. (1995) ЕЕВ8 Ьей. 357:140; Μ. 0\УШ8 е! а1. (1995) АпйтютоЬ АдеШк Сйето!йег. 39:180); рецептор протеина сурфактанта А (Впксое е! а1. (1995) Ат. ί. Рйукю1. 1233:134), различные виды которого могут включать рецептуры по изобретению, а также компоненты молекул по изобретению; р120 (8сйте1ег е! а1. (1994) I. Вю1. Сйет. 269:9090); см. также К. Кешапеп; М.Ь. Ьаиккапеп (1994) ЕЕВ8 Ьей. 346:123; ЕЕ К111юп; 1.6. Е1б1ег (1994) 1ттипоте!йоб5 4:273. В одном варианте изобретения лекарственные соединения по изобретению приготовлены в липосомах; в более предпочтительном варианте изобретения липосомы включают целевую частицу. В наиболее предпочтительном варианте изобретения лекарственные соединения в липосомах доставляются с помощью болюсной инъекции к месту, проксимально к нужной области, например к месту воспаления или инфекции или к опу
- 29 013677 холи. Композиция должна быть настолько жидкой, чтобы её можно было легко набирать в шприц. Она должна быть стабильной в условиях получения и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки.
Эффективные дозы и схемы приёма человеческих моноклональных антител по изобретению зависят от заболевания или состояния, которое следует лечить, и могут определяться специалистами в данной области техники.
Терапевтически эффективная доза для предупреждения отторжения трансплантата снижает число и тяжесть ранних эпизодов отторжения трансплантата.
Терапевтически эффективная доза при ревматоидном артрите предпочтительно приводит к улучшению по критериям АСК20 предварительного определения улучшения, более предпочтительно приводит к улучшению по критериям АСК50 предварительного определения улучшения и ещё более предпочтительно приводит к улучшению по критериям АСК70 предварительного определения улучшения.
Критерии АСК20 предварительного определения улучшения определяют как >20% улучшение показателей: числа болезненных суставов (ТСТ) и числа опухших суставов (8\νΐ) и >20% улучшение 3 из 5 следующих оценок: оценка болевых ощущений пациентом (УА8), общая оценка состояния пациентом (УА8), общая оценка состояния врачом (УА8), самооценка пациентом нетрудоспособности (НАф), реагент в острой фазе (СКР или Е8К).
АСК50 и АСК70 определяются таким же способом с улучшениями >50% и >70%, соответственно. Более подробно см. в Бекоп е! а1. в Атепсап Со11еде о! Кйеита!о1оду РгеНттагу Оейпйюп о! 1тргоуетеп! ίη Кйеита!о16 Аг(кг111>; АгИйк Кйеита!кт (1995) 38: 727-735.
Или же терапевтически эффективную дозу для ревматоидного артрита можно определять с помощью ЭА8 (оценка активности заболевания), в том числе ЭА828, и более предпочтительно ЭА856, по определению ЕБИАК.
Терапевтически эффективная доза для лечения псориаза предпочтительно даёт в результате РА8150, более предпочтительно РА8175 и ещё более предпочтительно РА8190 у больных или снижение общей оценки псориаза, сравнивающей впечатление после лекарственного лечения с состоянием до лечения. РА81 (индекс площади и тяжести псориаза) представляет собой оценочную систему для оценки площади и тяжести заболевания. РА8150 определяется как > 50% улучшение оценки. Аналогично РА8175 и РА8190 определяются как > 75% и > 90% улучшение оценки, соответственно.
Терапевтически эффективную дозу для терапии опухоли можно определять с помощью объективных ответов опухоли, который может быть либо полным, либо частичным. Полный ответ (СК) опухоли определяется как отсутствие клинических, радиологических или других свидетельств заболевания. Частичный ответ (РК) определяют на основании того, что общий размер опухоли уменьшился более чем на 50%). Среднее время развития (прогрессирования) есть мера, которая характеризует продолжительность объективного ответа опухоли.
Терапевтически эффективную дозу средства терапии опухолей можно также измерять его способностью стабилизировать прогрессирование заболевания. Способность соединения подавлять раковое заболевание можно оценивать на животной модельной системе, которая позволяет прогнозировать эффективность лечения человеческих опухолей. Или же это свойство композиции можно оценивать, изучая способность соединения подавлять рост клеток или индуцировать апоптоз, с помощью ίη уйго анализов, известных опытному практику. Терапевтически эффективное количество лекарственного соединения может уменьшить размер опухоли или иным способом ослабить симптомы у субъекта. Рядовой специалист в данной области техники способен определить такие количества на основе таких факторов как габариты субъекта, симптомы у субъекта и конкретная композиция или конкретный способ, выбранный для применения.
IV. Применение и способы по изобретению
Человеческие антитела по данному изобретению, а также производные/конъюгаты и их композиции имеют различное применение, в том числе лечение нарушений, опосредованных СЭ25, или нарушений, включающих клетки, экспрессирующие СЭ25.
В одном варианте человеческие антитела по данному изобретению можно вводить ίη у1уо субъекту для блокирования или ингибирования связывания СЭ25 с его лигандом (1Ь-2). Это, в свою очередь, можно использовать для предупреждения или ингибирования заболеваний, ассоциированных с клетками, несущими СЭ25.
Примеры заболеваний, которые можно лечить (например, уменьшать интенсивность симптомов) или предупреждать, включают, но без ограничения, отторжение трансплантата, в том числе отторжение аллотрансплантата и ксенотрансплантата, у пациентов, которым делают или которые перенесли трансплантацию органа или ткани, например сердца, лёгкого, комбинированную трансплантацию сердца- лёгкого, трансплантацию трахеи, почки, печени, поджелудочной железы, пищевода, кишечника, кожи, конечности, пуповины, стволовых клеток, инсулоцитов и т. д. Такие пациенты включают взрослых, но также могут быть педиатрическими пациентами.
Антитела по данному изобретению можно, следовательно, применять в качестве профилактики от
- 30 013677 торжения аллотрансплантата и ксенотрансплантата или для обращения (полного изменения направления), лечения или иного ослабления острых эпизодов отторжения аллотрансплантата или ксенотрансплантата.
Другие заболевания, которые можно лечить, включают гомологичную болезнь (трансплантат против хозяина), например, болезнь трансплантат против хозяина в результате переливания крови или в результате пересадки костного мозга; воспалительные, иммунные и аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилоартрит, псориатический артрит, диабет типа 1, инсулинзависимый диабет типа 2, рассеянный склероз, системную эритематозную волчанку, тяжёлую псевдопаралитическую миастению, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, дерматополимиозит, синдром Сёгрена (Шегрена), артерииты, включая гигантоклеточный артериит, гипопластическую анемию, астму, склеродермию и увеит; воспалительные и гиперпролиферативные кожные заболевания, например псориаз, включая бляшечный псориаз, пустулёзный акродерматит (РРР), эрозивный плоский лишай, буллёзный пемфигоид, врождённый буллёзный эпидермолиз, контактный дерматит и диффузный нейродермит; и ряд лимфоидных опухолей, например Т-клеточный лейкоз, болезнь Ходжкина, волосатоклеточная лимфома, или кожная Т-клеточная лимфома, включая грибовидный микоз и синдром Сезари.
Другими заболеваниями, которые можно лечить, являются злокачественные опухоли, на которые благотворно действуют ингибирование инфильтрации СЭ25+ регуляторных Т клеток, такие как рак желудка, рак пищевода, злокачественная меланома, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, мелкоклеточный рак лёгкого, немелкоклеточный рак лёгкого, рак шеи, рак яичника и почечноклеточный рак;
гематологические заболевания, такие как Т-клеточный лейкоз/лимфома, анапластическая гигантоклеточная лимфома, хронический лимфоцитарный лейкоз (СЬЬ)/малая лимфоцитарная лимфома (8ЬЬ), периферическая Т-клеточная лимфома и вторичный амилоидоз;
кожные заболевания, такие как гангренозная пиодермия, гранулёма кольцевидная, аллергический контактный дерматит, рубцовый пемфигоид и герпес беременных;
заболевания печени и желудочно-кишечного тракта, такие как коллагеновый колит, склерозирующий холангит, хронический активный гепатит, волчаночный гепатит, аутоиммунный гепатит, алкогольный гепатит, хронический панкреатит и острый панкреатит;
болезни сердца, такие как миокардит и перикардит;
заболевания сосудов, такие как артериосклероз, гигантоклеточный артериит/ревматическая полимиалгия, артериит Такаясу, узелковый полиартериит, синдром Кавасаки, гранулёматоз Вегенера, микроскопический полиангиит, синдром Черга-Штрауса, лейкоцитокластический ангиит и вторичный лейкоцитокластический васкулит;
заболевания почек, такие как острый гломерулонефрит, хронический гломерулонефрит, нефрит с минимальными изменениями и синдром Гудпасчера;
лёгочные заболевания, такие как альвеолит, облитерирующий бронхиолит, силикоз и бериллиоз;
неврологические нарушения, такие как рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, тяжёлая псевдопаралитическая миастения, хроническая демиелинизирующая полиневропатия и полирадикулит, включая синдром Гийена-Барре;
заболевания соединительных тканей, такие как рецидивирующий полихондрит, саркоидоз, системная красная волчанка, волчанка €N8 (ЦНС), дискоидная волчанка, волчаночный нефрит, синдром хронической усталости и фибромиалгия;
заболевания эндокринной системы, такие как болезнь Грейвза, тиреоидит Хашимото и подострый тиреоидит; и вирусные инфекции, такие как тропический спастический парапарез.
Подходящие способы введения композиций антитела (например, человеческих антител и иммуноконъюгатов) по изобретению ίη νίνο и ίη νίίτο общеизвестны в технике и могут выбираться рядовым специалистом. Например, композиции антитела можно вводить инъекцией (например, внутривенной или подкожной). Применяемые подходящие дозы молекул зависят от возраста и веса субъекта и концентрации и/или состава композиции антитела.
Антитело можно вводить самостоятельно или вместе с другим терапевтическим агентом, таким как иммуносупрессор (иммунодепрессант), противовоспалительный агент, агент для терапии воспалительных или гиперпролиферативных кожных заболеваний, химиотерапевтический агент или цитотоксин, который действует совместно или синергистически с композицией антитела для лечения или предупреждения заболеваний, ассоциированных с клетками, экспрессирующими СЭ25.
Как описано ранее, человеческие антитела против СЭ25 по изобретению можно вводить совместно с одним или более терапевтических агентов, например с иммунодепрессантом или противовоспалительным агентом, для повышения общего противовоспалительного эффекта. Антитело может связываться с агентом (в виде иммунокомплекса) или может вводиться отдельно от агента. В последнем случае (раздельное введение) антитело можно вводить до, после агента или одновременно с агентом.
Также в объём настоящего изобретения входят наборы, содержащие композиции антитела по изо
- 31 013677 бретению (например, человеческие антитела и иммуноконъюгаты) и инструкции по применению. Набор может дополнительно содержать один или более дополнительный агент, такой как иммунодепрессант, или одно или более дополнительных человеческих антител по изобретению
Следовательно, пациентам, которых лечат композициями антител по изобретению, можно дополнительно вводить (перед, одновременно с введением или после введения человеческого антитела по изобретению) другой терапевтический агент, такой иммуносупрессор (иммунодепрессант), противовоспалительный агент, агент для терапии воспалительных или гиперпролиферативных кожных заболеваний, химиотерапевтический агент, который повышает или усиливает терапевтический эффект человеческих антител.
Ещё в одном варианте иммуноконъюгаты по изобретению можно употреблять для нацеливания соединений (например, терапевтических агентов, меток, цитотоксинов, иммунодепрессантов) на клетки, которые содержат 0025, связанный с их поверхностью, путём связывания таких соединений с антителом. Таким образом, изобретение также охватывает методы локализации ех νίνο и ίη νίίτο клеток, экспрессирующих СО25 (например, детектируемая метка, такая как радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или ферментный кофактор). В другом варианте изобретение охватывает методы киллинга клеток, содержащих связанные с их поверхностью СО25, путём введения иммунотоксинов по настоящему изобретению.
Ещё в одном варианте антитела по изобретению можно использовать ίη νίνο или ίη νίίτο для диагностики заболеваний, в которых активированные клетки, экспрессирующие СО25, играют активную роль в патогенезе, с помощью обнаружения уровней СО25, или уровней клеток, содержащих СО25 на их мембранной поверхности. Это можно осуществить, например, при контактировании испытуемого, необязательно наряду с контрольным образцом, с человеческим антителом в условиях, которые допускают образование комплекса между антителом и СЭ25. Затем обнаруживают образование комплекса (например, с помощью ЕБ18А). Если наряду с тестируемым образцом используют контрольный образец, комплекс обнаруживают в обоих образцах, и любая статистически значимая разница между образцами в образовании комплексов является показателем присутствия в тестируемом образце СЭ25.
Настоящее изобретение иллюстрируется далее приведёнными ниже примерами, которые нельзя рассматривать как ограничивающие.
Примеры
Пример 1. Продуцирование человеческих моноклональных антител против СЭ25
Антиген: Клеточную линию трансфектантов, экспрессирующую антигены СЭ25 клеточной поверхности, обрабатывают, используя реагент для иммунизации мышей НиМАЬ и характеристики антител против С.О25. Эта клеточная линия является СНО клеточной линией, которая в результате применения метода рекомбинантной ДНК экспрессирует внеклеточные домены СЭ25, связанные с трансмембранным доменом рецептора фактора роста тромбоцитов. Последовательности СЭ25 амплифицируют при использовании кДНК, полученной с помощью клеток НИТ102, а последовательности фактора роста тромбоцитов получают при использовании вектора рО18РЬАУ (ЧпуЦгодеп Согрогабоп). Конструкцию экспрессии, кодирующую химерный белок, создают методом рекомбинантной ДНК в экспрессирующем векторе. СНО линию клеток-трансфектантов подвергают 2 циклам амплификации с метотрексатом в присутствии 5 и 50 нМ метотрексата для повышения уровней экспрессии СЭ25.
Культура транфектомы СНО-СЭ25: СНО-СЭ25 клетки трансфектом (Мебагех 1пс., N1, И8А) культивируют в среде СНО-8-8ЕМ II (С1Ьсо ВНЬ), без гипоксантина, без тимидина, с пенициллином (5000 Ед/мл), стрептамицином (5000 мг/мл; Вю УЫйакег, Ве1дшт) и метотрексатом (конечная концентрация 50 нМ, 81§та). Клетки заменяют на свежие каждые три дня.
Трансгенные мыши: Мыши НСо7 и НСо12 помещают в клетки с фильтром и определяют, что они находятся в хорошем физическом состоянии в дни иммунизации, взятия крови и в день слияния (гибридизации). Все мыши, которые продуцируют выбранные гибридомы, являются самцами. Мыши ГО 23185, 23196, 23197 и 23198 имеют (СМО)++; (НСо7) 11952+; (1КО) ++; (КСо5) 9272+ генотип. Мышь ГО 23175 имеет (СМО)++; (НСо12) 15087+; (1КО) ++; (КСо5) 9272+ генотип. Обозначения индивидуальных трансгенов даны в круглых скобках, за ними следуют номера строк случайно (рандомизированно) интегрированных трансгенов. Символы ++ и + указывают на гомозиготность или гемизиготность. Однако, так как скрининг мышей обычно проводят, используя анализ на основе ПЦР (РСР), невозможно сделать различие между гетерозиготностью и гомозиготностью для произвольно интегрированных человеческих 1д трансгенов. Обозначение + может быть дано мыши, которая действительно гомозиготна по этим элементам.
Методика и схема иммунизации: Мышей иммунизируют антигеном в двух формах: живые клетки (СЭ25 трансфецированные СНО клетки, описанные выше) и очищенный белок (рекомбинантный человеческий СЭ25 (ЛСО25) и №/0-экспрессированный рекомбинантный белок при использовании систем Β&Ό 8у§!ет5, (са!# 223-2А/СЕ), М1ппеароШ, МЦ). Растворимый гНСЭ25 смешивают с полным адъювантом Фрейнда (СЕА) или неполным адьювантом Фрейнда (1ЕА). Адъювант Фрейнда получают от С1ЬсоВКЕ, РоскуШе, МО. Мышам инъецируют 0,2 мл приготовленного антигена во внутрибрюшинную полость. Последние иммунизации в хвостовую вену осуществляют растворимым СО25 в стерильном РВ8
- 32 013677 или физиологическом солевом растворе (0,9% Ν;·ιί.Ί). Иммунизацию трансфецированными клетками осуществляют во внутрибрюшинную полость (1.р., интраперитонеально) в 0,2 мл стерильного физиологического раствора по 1,0-2,0 х 107 клеток на мышь. Все иммунизации осуществляют в виде инъекций во внутрибрюшинную полость. За три или два дня до слияния делают внутривенные (ί.ν., в.в.) бустерные инъекции. Схема иммунизации описана в табл. 1. Все мыши входят в состав группы из двенадцати (12) мышей генотипов НСо7 и НСо12.
Таблица 1
Дата активности Иммунизация: адъювант, Антиген Проба крови и титр*/Слияния
День 1 1.5x10' живых ΟΌ25 трансфецированных клеток, ΙΡ в физиологическом растворе
День 12 СРА, 111СО25 (20 мкг)
День 21 БбхЮ7 живых СО25 трансфецированных клеток, ΙΡ в физиологическом растворе
День 28 СРА, ЛСО25 (20 мкг)
День 35 Титр
День 42 Слияние 23175/23197
День 42 1.5х107 живых СО25 трансфецированных клеток, ΙΡ в физиологическом растворе
День 56 СРА, ι!ιίΌ25 (20 мкг)
День 63 Титр
День 68 1.5x10'’ живых СО25 трансфецированных клеток, ΙΡ в физиологическом растворе
День 71 Слияние 23196/23198
День 81 Титр
День 85 Слияние 23185
* Титры, пожалуйста, см. в табл. 2.
Титры мышей: Титры для мышей # 23175, 23185, 23196, 23197 и 23198 показаны ниже, в табл. 2. Титры, данные в табл. 2, указывают разведение в сыворотке, которое дает положительную реакцию в ί.Ό25 специфических реакциях. Ответ на антиген после повторных иммунизаций показывает высокий уровень ответа, и мышь готовят для гибридизации (слияния).
Таблица 2
Мыпть # Титр День 35 Титр День 63 Титр День 81
23175 12800
23185 6400 12800 12800
Мышь # Титр День 35 Титр День 63 Титр День 81
23196 6400 25600
23197 50000
23198 3200 25600
Методика гибридизации (слияния): Для гибридизации используют клеточную линию миеломы 8Р2/0-ад14 (АТСС СРЬ 1581, лот Т-15087). Исходные (оригинальные) АТСС в пробирке размораживают (оттаивают) и размножают в культуре. Из этих размноженных клеток в замороженных пробирках готовят исходный раствор посевного материала. Клетки выдерживают в культуре в течение 6-8 недель, меняя среду дважды в неделю.
ЭМЕМ с высоким содержанием глюкозы: Для культивирования клеток миеломы используют среду (Мсб1а!сс6 Сс11дго, # 1001233), содержащую 10% ЕВ8 (Нус1опс са!# 8Н30071), антибиотик-антимикотик (100х) (С1Ьсо, #15240062) и 0,1% Ь-глутамин. В среды для выращивания гибридомы вводят дополнительные добавки, включая 5% Огщсп-фактор клонирования гибридом (1дсп), 4,5 х 10-4 М пирувата натрия, НАТ (1,0 х 10-4 М гипоксантина, 4,0 х 10-4 М аминоптерина, 1,6 х 10-5 М тимидина; 81дта) и фетальную бычью сыворотку (Нус1опс, Ьодап, И1аЬ).
Селезёнка мыши номер #23197 имеет нормальные размеры и даёт 4,0 х 108 жизнеспособных клеток. Селезёнка мыши номер #23175 имеет нормальные размеры и даёт 2,6 х 10 жизнеспособных клеток. Селезёнки мыши номер #23196 и #23198 имеют нормальные размеры и дают 2,4 х 10 и 2,0 х 10 жизнеспособных клеток, соответственно. Последняя селезёнка мыши номер #23185 имеет нормальные размеры и даёт
- 33 013677
1,9 х 108 жизнеспособных клеток. Спленоциты гибридизуют по стандартной методике.
Среды, используемые для получения гибридом (гибридизации, слияния): Для культивирования клеток миеломы используют ЭМЕМ с высокой концентрацией глюкозы (Меб1а!есй, 1о!#10013264), содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (ЕВ8); (Нус1опе, Ьодап, И!ай, 8Н30071 1о!#А!Е10321) антибиотик-антимикотик (С1ЬсоВКЬ, 1о!#15240062) и 0,1% Ь-глутамин (С1Ьсо, 1о!#1013845). В среды для выращивания гибридомы вводят дополнительные добавки, включая 5% Опдеп-фактор клонирования гибридом (1деп, 1о!#36600 апб 36782 апб 36684), 4,5 х 10-4 М пирувата натрия, НАТ (81дта, Н 0262): 1,0 х 10-4 М гипоксантина, 4,0 х 10-7 М аминоптерина, 1,6 х 10-5 М тимидина, или НТ (81дта, Н0137): 1,0 х 10-4 М гипоксантина, 1,6 х 10-5 М тимидина.
У иммунизированных мышей удаляют селезёнку и лимфатические узлы и эти органы помещают в пробирку, содержащую ЭМЕМ + 10% ЕВ8. Пробирку переносят в помещение (комнату) для тканевых культур, из селезёнки и лимфатических узлов готовят одноклеточную суспензию и клетки считают. Соответствующий объём клеток 8Р2/0 (АТСС СКЕ 1581, лот Е - 15087; 6 клеток селезёнки или лимфатических узлов на 1 клетку 8Р2/0) переносят и клетки смешивают и ресуспендируют. Добавляют около 1,2 мл ПЭГ (РЕС) (1 мин при осторожном перемешивании пробирки в химическом стакане с водой при температуре 37°С). Пробирку оставляют на 90 с, прибавляют 15 мл ЭМЕМ и отмывают средой. Клетки осаждают центрифугированием, супернатант удаляют и клетки ресуспендируют. В пробирку прибавляют десять (10) мл НАТ-содержащей среды. Инкубируют в течение 30-60 мин в инкубаторе с СО2, клетки засевают в 96-луночные планшеты для клеточных культур, 200 мкл/лунка (около 1х10 клеток на 96луночный планшет). В день 7 клеткам дают подпитку НТ-содержащую среду, 250 мкл/лунка (НТ среда представляет собой среду НАТ, не содержащую аминоптерина).
Первоначальный скрининг ЕЫ8А на антитела к человеческому 1дС,к проводят через 7-10 дней после гибридизации. Лунки, позитивные в отношении человеческого 1дС,к, затем подвергают скринингу на планшетах ЕЬ18А с СО25 плёнкой. Затем антигенпозитивные гибридомы переносят в 24-луночные планшеты и, в конечном счёте, в колбы для тканевых культур. Антигенпозитивные гибридомы хранят на нескольких стадиях в процессе развития, замораживая клетки в среде для замораживания Опдеп ДМСО (Е1ккег Са! # 1С-50-0715).
Протокол ЕЫ8А обнаружения 1дС/к (применяемый для скрининга гибридизаций): Планшеты ЕЫ8А в течение ночи покрывают антителом против человеческой 1дСк цепи, 1 мкг/мл (1ттипо!еск, 1о!#0173) или против человеческой 1дС^, 1 мкг/мл (Засккоп, 1о!#109-006-098), 50 мкг/лунка. Планшеты опустошают и оставшиеся сайты связывания блокируют РВ8, дополненным (\\'ееп- 20 (0,05%) и 5% куриной сывороткой (РВ8ТС) в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ). Планшеты отмывают 3 раза РВ8, дополненным 0,05% (\\'ееп- 20 (РВ8Т). Супернатанты от гибридизаций и субклонов, как правило, тестируют разбавленными 1:2 в РВ8ТС. В качестве позитивного контроля используют человеческий 1дС (Са1Ьюсйет). После инкубации образцов, примерно, в течение 2 ч планшеты отмывают РВ8Т и в лунки прибавляют вторичное антитело, против конъюгированного человеческий-1дС-Ес-НКР (Засккоп, 1о!#109036-098), в разведении 1:5000 в РВ8ТС (100 мкл). После инкубации в течение 1 ч при КТ планшеты ЕЫ8А обрабатывают АВТ8 (81дта) в соответствии с рекомендациями производителя.
Определение изотипа методом ЕЬ18А: 96-луночные планшеты ЕЬ18А (Стешет, Сегтапу) в течение ночи покрывают плёнкой (100 мкл/лунка, при комнатной температуре (КТ)) мышиного антитела против человеческого 1дС1 (СЬВ, №1йег1апбк, разведение 1:5000 из исходного раствора) или мышиного антитела против человеческого 1дС3 (СЬВ, разведение 1:10000 из исходного раствора). После отмывания в планшетах 3х РВ8Т (150 мкл/лунка) планшеты инкубируют с РВ8ТС в течение 1 ч при КТ. Затем прибавляют супернатанты моноклопального антитела против человеческого СИ25 (100 мкл/лунка; 2 ч при КТ). Супернатанты антител против КЬН 1дС1 (1 мкг/мл) и против КЬН 1дС3 (1 мкг/мл) служат в качестве позитивного контроля. Культуральная среда и РВ8ТС служат в качестве негативного контроля. После отмывания в РВ8Т (3х) прибавляют антитело козы против ЫдС-НКР (специфическое в отношении Ес; 1асккоп ЬаЬк, Маше, И8А) (1 ч при КТ). Для обнаружения 1дС1 конъюгат разводят 1:500, тогда как для обнаружения 1дС3 конъюгат разводят 1:2000. После отмывания в РВ8Т (3х) готовят смесь 10 мг АВТ8 (Коске) в 10 мл буфера АВТ8 (Коске) и в каждую лунку прибавляют по 100 мкл. Через 20 мин считывают поглощение при 405 нм с помощью ридера ЕЫ8А (ЕЬ 808, Вю-Тек 1пк1гитеп!8, Уегтоп!, И8А).
Исходя из методики иммунизации отбирают 4 антигенспецифических гибридомы, которые получают при использовании мышей НСо: АВ1, АВ7, АВ11 и АВ12. Найдено, что изотипы этих четырёх клонов являются 1дС1,к.
Антитела по изобретению можно рекомбинантно экспрессировать в виде других изотипов, например 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дМ и 1дА.
Среды, применяемые для сохранения гибридом после отбора: Все клеточные линии гибридом, продуцирующие моноклональные антитела против человеческого СИ25, культивируют в модифицированной по Дульбекко среде Игла (Вю^Ыйакет, 1о!#ВЕ12-709Е), дополненной 10% ЕС8 (А1кеп! МиШсе11 орйтит С241), 2 мМ Ь-глутамина (С1и!атах-11), 50 М Ед./мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина (реп/к!гер), 2 мкМ β-МЕ (все от С1Ьсо ВКЬ, МГе Тесйио1од1е8, 8со!1апб), 24% НСЕ (Опдеп, 1деп 1п!егпа
- 34 013677
Ιίοπαΐ Ιηο., СаййегхЬигд, И8А).
Очистка антител: Перед очисткой или концентрацией антител, специфических в отношении человеческого 0025, от культурального супернатанта, супернатант клеточных культур можно отфильтровать через вакуумный фильтр на горле бутыли для удаления крупных частиц, таких как остатки клеток или другие примеси. Образец можно концентрировать, если его объём превышает 500 мл, до объёма менее 500 мл с помощью картриджа Ргер/хса1е™ ТРР, 1й2 (Мбйроге, И8А).
Очистку антител, специфических в отношении СО25, с помощью протеина А проводят аффинной хроматографией.
Колонку с протеином А на 5 мл (Рго1А 5 т1 8Р, версия 041201, Атегхйат РЬагтааа Вю1есй АВ, 8\\'ебеп) уравновешивают с РВ8, рН 7,4, заливают в насос для отбора проб А РВ8, рН 7,4; супернатант, содержащий антитела, специфические в отношении СО25, загружают на колонку, несвязанный образец вымывают, и системный насос В промывают 0,1 М лимонной кислотой, рН 5, (буфер для элюции 1). Затем бычий Ι§0 (присутствующий в культуральном супернатанте) элюируют буфером для элюции 1 с помощью системного насоса В. После промывания системного насоса А 0,1 М лимонной кислотой, рН 3, (буфер для элюции 2) антитела, специфические в отношении СО25, элюируют с помощью системного насоса А буфером для элюции 2. Затем системный насос В промывают 0,1 М лимонной кислотой, рН 2, (буфер для элюции 3) и весь остальной Ι§0, связанный с насадкой (содержимым колонки), элюируют с помощью системного насоса В буфером для элюции 3. Элюированные специфические в отношении СО25 антитела нейтрализуют 10 об.% 2 М Тпх-НС1 (81дта), рН 9, и объединяют фракции, соответствующие пикам.
Объединённые фракции пиков 2 стадии элюции подвергают диализу против РВ8 (30 мл очищенного материала против 5 л РВ8) в течение 18 ч при 4°С. Для хранения и накопления очищенного материала образцы концентрируют. Концентрацию человеческого ΙβΟ определяют нефелометрией (Оабе-Вейппд, ВМД, используя поликлональные антитела против ΙβΟ (СЬВ, Атх1егбат, ТНе №1йег1апбх, лот#М1090). Антитела аликвотируют, быстро замораживают и хранят при -80°С.
Пример 2. Секвенирование человеческих антител против СО25
Секвенирование V и νΗ областей антител
Секвенирование: νϋΐ-области секвенируют после клонирования в системе рСЕМТШесЮг 8ух1ет ΙΙ. Секвенирование проводят на приборе Вахес1еаг (Ье1беп, №1йег1апбх).
Последовательности выравнивают (совмещают) с последовательностями ν-гена зародышевой линии с помощью программы Шахе (\у\у\у.тгс-сре.сат.ас.ик/1т1-бос/риЫ1с/т1го.1ит).
Получение РНК: С применением набора Кпеаху (Р1адеп, ^ех1Ьигд, Ьеихбеп, №1йег1апбх) в соответствии с протоколом производителя получают 5 х 10 клеток четырёх (4) различных клеточных линий гибридомы человеческого СО25 (АВ1, АВ7, АВ11, АВ12).
Получение кДНК: Комплементарную кДНК (кДНК) при использовании РНК клеток гибридомы человеческого СО25 получают из 3 мкг тотальной РНК с АМV обратной транскриптазой с буфером (Косбе О1адпохбсх СтЬН, Маппйе1т, Сегтапу), олигомером б(Т)!5 (Рготеда, МаФхоп, ^Ι, И8А), бКТР (Косбе О1адпохбсх СтЬН, Маппйе1т, Сегтапу) и РНКхт (Рготеда) в соответствии с протоколом производителя (2000, версия 3).
и ν2 области амплифицируют, используя следующие праймеры ПЦР (РСК):
ν^ РК1 5' праймеры
АВ62 СЛд аТК САд СТд дТд СА§ ТС (5ЕЦ ГО N0:41)
АВ63 8Аё §Тё САд СТд КТд §Ае. ТС (8Е£) ГО N0:42)
АВ65 дАд дТд С Ад СТд дТд САд ТС (ЗЕр ГО N0:43)
Ш лидерные 5' праймеры
АВ85 АТ§ ё АС Тдд АСС Т ад А аС АТС (8Εζ> ГО N0:44)
АВ86 А Та дАА ТТд ёёё СТё АдС Та (8ЕЦ ГО N0:45)
АВ87 АТд дАд ТТТ СТд АдС Тд (8Еф ГО N0:46)
АВ88 ЛТ§ ААА САС СТд Тд§ ТТС ТТС (БЕЦ ГО N0:47)
АВ89 АТд адд ТСА АСС дСС АТС СТ (8Е0 ГО N0:48)
Ш 3' праймер
АВ90 Т§С САд §§§ дАА §АС СдА Тдд (8Εζ) ЕО N0:49)
- 35 013677
УК: ЕК1 5' праймер
ΑΒ8 НАС АТС САд АТд АУС СА§ ТС (8Е<2 ГО N0:50)
АВ9 дУС АТС УКд АТд АСС СА§ ТС (8Εζ> ГО N0:51)
АВ10 §АТ АТТ дТдАТд АСС САдАС (8ЕЦ ГО N0:52)
АВ 11 дЛЛ АТТ дТд ТТд АСК. САд ТС (КЕр ГО N0:53)
АВ12 дАА АТУ' дТК АТд АСА САд ТС (8Е(2 ГО N0:54)
АВ13 дАТ дТТ дТд АТд АСА САСт ТС (БЕО ПО N0:55)
АВ 14 дАА АТТ дТд СТд АСТ САд ТС (8Е<2 ГО N0:56)
УК лидерные 5' праймеры:
АВ 123 ССС дСТ Сад СТС СТд ддд СТС СТд (ЗЕО N0:57)
АВ124 ССС ТдС ТСА дСТ ССТ ддд дСТ дС (8Е0 ГО N0:58)
АВ125 ССС АдС дСА дСТ ТСТ СТТ ССТ ССТ дС (8Ер ГО N0:59)
АВ 126 АТд дАА ССА Тдд ААд ССС САд САС АдС (ЗЕ’О ГО N0:60)
УК 3' праймер
АВ 16 Сдд дАА дАТ дАА дАС АдА Тд (8Ер ГО N0:61)
В вьшеприведённых праймерах последовательности К, 8, К, Υ ;т6 имеют следующее значение: К= С или Т = С или С
К = А или О
У = СилиТ
XV = А или Т
ПЦР условия, применяемые для амплификации Ун и Уъ областей для клонирования: Полимеразную цепную реакцию (РСК) осуществляют с применением АтрбТац полимеразы (Регкт Е1тег) на термосайклере Т1 Тйе^тοсус1е^ 96 (Вютейа, \Уе8(Ьигд, Ьеи^ет №111ег1аг1б8).
Протокол циклов ПЦР:
94°С 2 мин циклов 94°С 30 сек
65°С 30 сек, минус 1° за цикл
72°С 30 сек циклов 94°С 30 сек
55°С 30 сек
72°С 30 сек
72°С 10 сек охлаждение до 4°С
Клонирование Ун и Уъ в системе рСЕМТ-УесЮг 8у8ίет II: После анализа ПЦР продуктов на агарозном геле продукты очищают с помощью набора для экстракции в геле Ц1АЕХ II Се1 Ех1гас1юг1 Кй (Р1адещ \Уе81Ьигд, Вешбещ Nеίйе^1аηά8). Всегда 2 независимых ПЦР продукта, использующие ЕК1 или лидерные праймеры, каждой области Ун и Уь, клонируют в векторной системе рСЕМТ-УесЮг 8у8ίет II (Рготеда) в соответствии с протоколом производителя (1999, версия 6).
После трансформации в Е. той 1М109 индивидуальные колонии подвергают скринингу методом ПЦР колоний, используя праймеры Т7 и 8Р6, 30 циклов отжига при 55°С. Плазмидную ДНК очищают, используя минипрепаративный набор Р1аргер 8ρίη тйаргер кН (Р|адег1). Для дальнейшего анализа областей Ун и Уъ №ο1/Νο11 (№ Вю1аЬ8, ХУеЧЬигд, Йеэбен Nеίйе^1аηά8) проводят расщепление и анализируют на агарозном геле.
Четыре выбранные клеточные линии гибридом экспрессируют следующие последовательности антитела:
АВ1: человеческое моноклональное антитело ЦС1,к с аминокислотными последовательностями: 8ЕР ГО N0: 2 и 4;
АВ7: человеческое моноклональное антитело ЦС1,к с аминокислотными последовательностями: 8ЕР ГО N0: 6 и 8;
- 36 013677
АВ11: человеческое моноклональное антитело ГдО1,к с аминокислотными последовательностями: ЗЕО ГО N0: 10 и 12; и
АВ 12: человеческое моноклональное антитело ГдО1,к с аминокислотными последовательностями: ЗЕО ГО N0: 14 и 16.
Полученные последовательности показаны на фиг. 1-10.
Пример 3. Характеристики связывания человеческих антител против СЬ25
Связывание супернатантов человеческих СЭ25 моноклональных антител против СЭ25, конститутивно экспрессированных СНО клеток: АВ1, АВ7, АВ11 и АВ12, все, связываются с СИ25, экспрессированным на трансфецированных СНО клетках, по определению проточной цитометрией (см. табл. 3).
Связывание супернатантов человеческих СИ 2 5 моноклональных антител к НгСЬ25 в анализе ЕЬГЗА: АВ1, АВ7, АВ11 и АВ12, все, связываются с СЭ25 при анализе ЕЬГЗА с использованием кгСИ25 в качестве антигена для покрытия. 96-луночные планшеты (Огетег) в течение ночи при ВТ покрывают гкСЬ25 (100 нг/мл; В&И), тогда как неспецифическое связывание блокируется путём покрытия планшетов плёнкой РВЗТС в течение 1 ч при комнатной температуре (ВТ). После отмывания (3х) планшетов с помощью РВЗТ прибавляют 100 мкл образца антитела. Планшеты отмывают 3х (РВЗТ) их инкубируют со стрептавидин-поли-НВР (1:10000) в РВЗ и прибавляют по 100 мкл в каждую лунку (1 ч, ВТ). Планшеты отмывают (3х в РВЗТ), готовят 10 мг АВТЗ (Воске) в 10 мл АВТЗ буфера (Воске) и прибавляют 100 мкл в каждую лунку. Через 20 мин считывают абсорбцию при 405 нм с помощью ридера ЕЬГЗА (ЕЬ 808, Вю-Тек ГпЧгитеШк).
Таблица 3. Название клонов, изотипы и связывание с СЬ25
Клон Подкласс СО25- связывание1 СНО-СО251
АВ1 1еО1 + +
АВ7 1^01 + +
АВИ 1§С1 + +
АВ12 + +
1 Связывание супернатантов культур клонов по определению с помощью ιΊιί.Ό25 ЕЬГЗА 2Связывание с СЭ25, экспрессированным на трансфецированных СНО клетках, определённое методом проточной цитометрии
Ингибирование связывания биотинилированного ГЬ-2 с его рецептором с помощью супернатантов человеческих СИ 2 5 моноклинальных антител: Чтобы изучить, избыток каких человеческих моноклональных антител блокируют или ингибируют связывание ГЬ-2 с СИ25, 96-луночные планшеты (Огетег) покрывают в течение ночи при ВТ ιΊιί.Ό25 (100 нг/мл; В&Ь куЧетк, ΜΝ, ИЗА), тогда как неспецифическое связывание блокируют, покрывая планшеты плёнкой РВЗТС в течение 1 ч при ВТ. После отмывания (3х) планшетов с помощью РВЗТ прибавляют 100 мкл образца антитела (интервал концентраций: 10, 33 и 100 нг/мл). Для сравнения прибавляют также 2еиарах®. Через 10 мин прибавляют гГЬ-2-биотин (50 нг/мл) (1,5 ч, ВТ). Планшеты отмывают 3х (в РВЗТ), инкубируют со стрептавидин-поли-НВР (разводят исходный раствор 1:10000) в РВЗ и прибавляют 100 мкл в каждую лунку (1 ч, ВТ). Планшеты отмывают (3х в РВЗТ), готовят 10 мг АВТЗ (Воске) в 10 мл АВТЗ буфера (Воске) и прибавляют по 100 мкл в каждую лунку. Через 20 мин считывают поглощение при 405 нм ридером ЕЬГЗА (ЕЬ 808, Вю-Тек ГпЧгитеп1к). Данные показывают один из двух репрезентативных экспериментов. Как показано на фиг. 11, супернатанты моноклональных антител человеческого СЬ25 АВ1, АВ7, АВ11 и АВ12 способны ингибировать связывание биотинилированного ГЬ-2 с СЬ25 более эффективно, чем 2епарах®.
Ингибирование связывания 2епарах® с СЭ25 супернатантами человеческих моноклональных антител СЬ25: Чтобы изучить, избыток каких человеческих моноклональных антител блокируют или ингибируют связывание 2епарах® с СЭ25, 96-луночные планшеты (Огетег) покрывают в течение ночи при ВТ ιΊιί.Ό25 (100 нг/мл; В&Ь куЧетк, ΜΝ, ИЗА), тогда как неспецифическое связывание блокируют, покрывая планшеты плёнкой РВЗТС в течение 1 ч при ВТ. После отмывания (3х) планшетов с помощью РВЗТ, прибавляют 100 мкл образца антитела (интервал концентраций: 10, 33 и 100 нг/мл). Для сравнения прибавляют также 2епарах®. Через 10 мин прибавляют биотинилированный 2епарах® (5 нг/мл) (1,5 ч, ВТ). Планшеты отмывают 3х (в РВЗТ), инкубируют со стрептавидин-поли-НВР (разводят исходный раствор 1:10000) в РВЗ и прибавляют 100 мкл в каждую лунку (1 ч, ВТ). Планшеты отмывают (3х в РВЗТ), готовят 10 мг АВТЗ (Воске) в 10 мл АВТЗ буфера (Воске) и прибавляют по 100 мкл в каждую лунку. Через 20 мин считывают поглощение при 405 нм ридером ЕЬГЗА (ЕЬ 808, Вю-Тек ГпЧгитеШк). Данные показывают один из двух репрезентативных экспериментов. Как показано на фиг. 12, супернатанты моноклональных антител человеческого СЭ25 АВ1, АВ7, АВ 11 и АВ 12 блокируют связывание 2епарах® с СО25.
- 37 013677
Пример 4. Человеческие моноклональные антитела против ΟΌ25 ингибируют пролиферацию Т клеток, индуцированную антителами против 0Ό3
Человеческие антитела тестируют на их способность ингибировать Т клеточную пролиферацию с помощью анализа Т-клеточной пролиферации. Для сравнения также подвергают испытанию 2епарах®, а также изотипическое контрольное антитело (ЫдС1/к).
Выделение РВМС: Клетки человеческой крови (полученные в виде светлого слоя кровяного сгустка из ЭШсй Неб Сгокк В1ооб Вапк, Ыгесй!, №!йег1апбк) центрифугируют в градиенте фиколла (Рйагташа, 2500 об./мин, 25 мин). Собирают пипеткой РВМС в НРМ1 1640 (дополненной 10% РС8 (^1кеп! МиШсе11 орбтит С241), 2 мМ Ь-глутамина, 50 М Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 25 мМ НЕРЕ8 (все от Вю \У11Шакег, Еигоре)).
Анализ Т-клеточной пролиферации: Человеческие РВМС разводят в НРМ1 1640 (дополненной 10% РС8 (\У1кеп1 Ми1йсе11 орйтит С241), 2 мМ Ь-глутамина, 50 М Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 25 мМ НЕРЕ8 (все от Вю ^Ыйакег, Еигоре)) до 1,5 х 105 клеток/лунка (в тройном повторе) в 96луночных плоскодонных планшетах (Сгетег). Клетки стимулируют антителом против СЭ3 (СЬВ-Т3/4.Е, са!#М1654, 10 нг/мл). Затем к клеткам добавляют 50 мкл экспериментальных антител в возрастающем разведении (в интервале от 500 до 7,8 нг/мл, в двухстадийных разведениях). Через 5 дней (37°С, 5% СО2) количественно определяют пролиферацию с применением Вгби (конечная концентрация: 10 мкМ, Носйе) в соответствии с описанным выше методом.
Анализ с мечением Вгби (набор Носйе сВгбИ- окрашиванием, са! по 1 647 229): Раствор Вгби для мечения (100 мкМ) прибавляют в лунки и клетки инкубируют в течение ночи (37°С, 5% СО2). клетки ресуспендируют в лунках и центрифугируют (10 минут, 300 г). Супернатанты отбрасывают и клеточный осадок сушат (1 ч, 60°С). Затем пеллеты инкубируют с Р1хЭепа! (200 мкл/лунка; 30 мин, НТ). После инкубации Р1хЭепа! отбрасывают и к осадку добавляют к осадку по 100 мкл/лунка анти-ВгбЬ-РОЭ (добавляют 100 мкл исходного раствора антитела против Вгби к 10 мл раствора для разведения Ай) (1 час, НТ). Отбрасывают супернатант, планшеты отмывают (3х) раствором для отмывания (200 мкл/лунка). Наконец, к осадку (пеллетам) добавляют 100 мл/лунка раствора субстрата (5 мин, НТ). Реакцию окрашивания прекращают, добавляя Н28О4 (25 мкл/лунка, 1 М) и считывают оптическую плотность с помощью ридера ЕЫ8А при 450 нм (Вю-Тек 1пк!гитеп!к).
Как показано на фиг. 13, человеческие моноклональные антитела АВ1, АВ7 и АВ 12 ингибируют индуцированную антителами против СЭ3 Т-клеточную пролиферацию в зависимости от дозы. Ингибирование человеческими антителами более эффективно, чем 2епарах®. Приводятся данные одного из трёх репрезентативных экспериментов.
Пример 5. Человеческие моноклональные антитела против СЭ25 ингибируют МЬН
Человеческие моноклональные антитела проверяют на способность ингибировать МЬН с помощью анализа МЬН. Для сравнения испытывают 2епарах®, а также изотипическое контрольное антитело (й1д61/к). Человеческие РВМС (получены в виде светлого слоя кровяного сгустка от ЭШсй Неб Сгокк В1ооб Вапк, Шгесй!, №1йег1апбк) от двух не совпадающих по МНС доноров разводят в НРМ1 1640 (дополненной 10% РС8 (^1кеп! МиШсе11 орйтит С241), 2 мМ Ь-глутамина, 50 М Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина (все от С|йсо ВНЬ, Ь1£е Тесйпо1од1ек, Ра1к1еу, 8со!1апб)) до 2,0 х 106 клеток/мл. РВМС от первого донора облачают (2000 рад) и смешивают (1,0 х 105 клеток/лунка) с РВМС второго донора (1.0 х 105 клеток/лунка) в 96-луночных плоскодонных планшетах (Сгетег) в тройном повторе. Затем к клеткам добавляют 50 мкл при возрастающем разведении экспериментальные антитела (в интервале от 50 до 0,8 нг/мл в двухстадийном разведении). После шести дней культивирования (37°С, 5% СО2) количественно определяют пролиферацию с помощью Вгби (конечная концентрация: 10 мкМ, Носйе) по вышеописанному методу.
Как показано на фиг. 14, человеческие моноклональные антитела АВ1, АВ7, и АВ12 ингибируют МЬН в зависимости от дозы. Ингибирование МЬН с помощью АВ1, АВ7 и АВ 12 (в дозах от 1 до 3 нг/мл) более эффективно, чем с помощью 2епарах®. Приводятся данные одного из трёх репрезентативных экспериментов.
Пример 6. Кинетический анализ АВ 12 на приборе В1асоге 3000
Аффинность анализируют с помощью мониторинга изменений на приборе В1Асоге 3000. Используют контроль с помощью В1Асоге 3000 и программного обеспечения В1Асоге 3000 (В1Асоге, Иррка1а, 8^ебеп, лот#ВН-1100-43). Человеческие СЭ25 (Н&Э 8ук!етк, лот#223-2А/СРО) иммобилизуют на См-5 сенсорный чип с низкой плотностью (В1Асоге, лот#ВН-1000-14), используя реакцию с аминами, в соответствии с рекомендациями производителя. После блокирования остаточных сайтов связывания активированного сенсорного чипа с помощью смеси этанол-амин-НС1, осуществляют кинетический анализ при 25°С (в соответствии с рекомендациями производителя) при использовании человеческого моноклонального антитела АВ 12 и, в качестве сравнения, 2епарах®. Образцы, содержащие АВ 12 и 2епарах®, соответственно, текут по поверхности покрытого оболочкой сенсорного чипа, делая возможной ассоциацию АВ12 и 2епарах® с гйСЭ25. Ассоциацию и диссоциацию АВ 12 и 2епарах®, соответственно, контролируют (мониторинг) методом плазмонного поверхностного резонанса (8РН) на сенсорном чипе. Результа
- 38 013677 ты визуализуют с помощью ВМ^ге 3000 (Вю-!ек ИМгитегИз) и анализируют с помощью программного обеспечения ΒIАеνа1иаΐ^οη 8οΠ\ν;πε 3.1 (В^^ге, Ирр5а1а, Елуейев) и в качестве предварительной берут модель связывания ΕΗη^ίΓ 1:1.
Кс для АВ 12 связывания с гЬСО25, определённая анализом ВМ^ге: 4,74 х 10-11 ± 0,43 х 10-11.
Кс для связывания Ζеηараx с гЬСО25, определённая анализом Вместе: 1,52 х 10-10 ± 0,27 х 10-10.
Пример 7. АВ 12-обработка властных Т клеток приводит к интернализации ί.'Ό25
АВ 12 испытывают на способность вызывать интернализацию ί.'Ό25. Антитело против КЬН (человеческое антитело 1дС1/к изотипу, специфичное к гемоцианину фисурелла) вводят в качестве изотипического контрольного антитела.
Индукция бластных Т клеток:
После выделения мононуклеаров периферической крови (РВМС) из образцов гепаринизированной крови в градиенте среды для разделения лимфоцитов РВМС стимулируют в течение трёх-четырёх дней с помощью 5 мкг/мл фитогемагглютинина (РНА; Όίίεο, са! # 211796) в культуральной среде (37°С, 5% С02).
Стимуляция властных Т клеток для изучения интернализации: Клетки собирают, отмывают в РВ8 и считают с помощью трипанового синего. Одну часть Т-клеточных бластов (1 х 10 клеток/мл) преинкубируют (4°С, 15 мин) с меченным Р1ТС АВ12 (2 мкг/мл АВ 12- Р1ТС) или меченным Р1ТС антителом против КЬН (2 мкг/мл) в качестве изотипического контроля, или без добавления антител. После преинкубации клетки отмывают в РВ8 и 1 х 10 клеток (в 1 мл культуральной среды) прибавляют в 24-луночные планшеты в течение 18 ч (37°С, 5% СО2). Остальные бластные Т клетки инкубируют в отсутствие или в присутствии меченного Р1ТС АВ12 (2 мкг/мл) или меченного Р1ТС антитела против КЬН (2 мкг/мл) в течение 18 дней (37°С, 5% СО2).
После инкубации клетки собирают и метят агглютинином пшеницы, меченным родамином (1 мкг/мл, мечение мембраны; Μο1еси1а^ РгоЬез, са! Νο. №-849), при 4°С в течение 15 мин. Затем клетки отмывают РВ8 и ресуспендируют в 25 мкл Уес!азЫе1й ОАР1 (УесЮг ^аЬο^а!ο^^е5, Вцг1тдате, СА, И8А). 10 мкл клеточной суспензии пипеткой отбирают на предметные стёкла с препаратами тканей, накрывают и анализируют флуоресцентной микроскопией (Саг1 2е155), и фотографии делают с фильтром ТК1ТС для окрашивания родамином (набор фильтров 15, 2е155), или с фильтром Р1ТС, в случае окрашивания Р1ТС (набор фильтров 09, 2е155). Окрашивания (клеточной) мембраны с помощью агглютинина пшеницы, меченной родамином, не наблюдается.
Как показано на фиг. 15А и 15В, через 18 ч культивирования сигнал АВ12-Р1ТС можно обнаружить внутри клеток. На фиг. 15А показан результат после культивирования клеток в течение 18 ч после преинкубации (15 мин) с АВ12-Р1ТС и отмывания, а на фиг. 15В показан результат после культивирования клеток в течение 18 ч в присутствии АВ12-Р1ТС. Контрольный эксперимент с иррелевантным конъюгированным с Р1ТС антителом против КЬН (фиг. 15С) не показывает интернализации меченного Р1ТС антитела.
Пример 8. АВ 12-обработка бластных Т клеток вызывает интернализацию ί.'Ό25 по определению методом проточной цитометрии
В другом эксперименте проточную цитометрию применяют для определения интернализации меченного Р1ТС АВ 12 в бластных Т клетках в различные временные интервалы.
После выделения мононуклеаров периферической крови (РВМС) из образцов гепаринизированной крови в градиенте среды для разделения лимфоцитов (ΕΚοΒ) РВМС стимулируют в течение трёхчетырёх дней с помощью 5 мкг/мл фитогемагглютинина (РНА; Όίίεο, са! # 211796) в культуральной среде (37°С, 5% СО2).
После культивирования в течение трёх дней бластные Т клетки собирают, отмывают РВ8 и считают, окрашивая трипановым синим. К бластным Т клеткам (2,5 х 10 клеток в 2 мл культуральной среды), прибавляют2 мкг/мл меченного Р1ТС АВ 12 или меченного Р1ТС антитела против КЬН (изотипическое контрольное антитело). Преинкубируют клетки (4°С, 1 ч) и разделяют на две части. Одну часть отмывают в культуральной среде, тогда как другую порцию не отмывают. После отмывания преинкубированные образцы ресуспендируют в культуральной среде. Обе порции инкубируют при 4 или 37°С.
Через 0, 0,5, 1 или 4,5 ч инкубации (либо при 4°С, либо при 37°С) к клеткам прибавляют 3 мл буфера РАС8 (РВ8, дополненный 0,05% В8А и 0,01 мкг/мл азида натрия) и клетки центрифугируют при 300 г (4°С). В одной порции клетки ресуспендируют в 200 мкл буфера РАС8, тогда как в другой порции клетки ресуспендируют в 200 мкл буфера РАС8 и 1 мг/мл этидия бромида (81дта, са! Νο. Е8751). Этидия бромид добавляют непосредственно перед обнаружением проточной цитометрией.
Этидия бромид применяют для тушения сигнала флуоресценции на клеточной поверхности. Как показано на фиг. 16, соотношение флуоресценции образцов, инкубированных при 4°С, измеренное с этидия бромидом или без него, примерно, единица. Это указывает, что интернализация не происходит. В клетках, культивированных при 37°С, наблюдается повышение этого соотношения флуоресценции во времени. Это указывает, что происходит интернализация АВ12-Р1ТС. Как ожидалось, инкубация клеток при длительном присутствии меченного Р1ТС АВ12 приводит к более высоким уровням интернализации
- 39 013677 (фиг. 16В) по сравнению с клетками, только преинкубированными в течение 1 ч в присутствии меченного Е1ТС АВ 12 (фиг. 16А). На фиг. 16А показано соотношение средней интенсивности флуоресценции (ΜΕΙ) для клеток, преинкубированных в течение 1 ч, после чего избыток меченных Е1ТС АВ12 отмывался. На фиг. 16В показан результат после культивирования клеток в присутствии меченных Е1ТС АВ 12. Соотношение ΜΕΙ делением ΜΕΙ тестируемых образцов на ΜΕΙ образца при 0 ч. С изотипическим контрольным антителом окрашивания не наблюдается ( антитело против КЬН-МТС, данные не показаны).
Эта особенность интернализации антител по изобретению делает их подходящими для конъюгации с токсином, например, для лечения Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых, анапластической гигантоклеточной лимфомы, кожной Т-клеточной лимфомы (включая грибовидные микозы и синдром Сезари), периферических Т-клеточных лимфом, лимфомы Ходжкина, волосатоклеточного лейкоза и хронического лимфоцитарного лейкоза (СЬЬ)/малой лимфоцитарной лимфомы (8ЬЬ).
В другом аспекте антитела по изобретению подвергают мечению радиоизотопом, например, для лечения Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых, анапластической гигантоклеточной лимфомы, кожной Т-клеточной лимфомы (включая грибовидные микозы и синдром Сезари), периферических Т-клеточных лимфом, лимфомы Ходжкина, волосатоклеточного лейкоза и хронического лимфоцитарного лейкоза (СЬЬ)/малой лимфоцитарной лимфомы (8ЬЬ).
Помимо этого, антитела можно метить ш1п для определения опухолевой нагрузки и тем самым корректировки дозы меченого радиоизотопом вводимого антитела.
Эквиваленты
Специалисты в данной области техники увидят многие эквиваленты конкретных вариантов изобретения по данному описанию или смогут в этом удостовериться, используя не более чем рутинные эксперименты. Предполагается, что эти эквиваленты охватываются нижеприведённой формулой изобретения. Любая комбинация вариантов изобретения в зависимых пунктах также рассматривается как входящая в объём изобретения.
- 40 013677
Список последовательностей <110> СептаЬ А/3 <120 Человеческие моноклональные антитела против СБ25 <130> СМ1-059РС <140> РСТ/и32003/03612б <141> 2003-11-14 <150> 60/426690 <151> 2002-11-15 <160> 74 <170> ГазНЗЕС £ог ίίίηάθ№ Чегзйоп 4.0 <210> 1 <211> 381 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400 1 саддНРсадс РддЬдсадЬс ЬддддсРдад дЬдаадаадс сЬдддРссРс ддЬдааадНс 60
РссСдсаадд сСИсРддадд сассЪГсадс сдЬРаРссНа ЬсаасНдддР дсдасаддсс 120 ссРддасаад ддсЬЬдадЪд даЬдддаадд аЬсаРсссЬа РссРЬддЬаН адсадасЬас 180 дсасададдр бссадддсад адЪсасдабР ассдсддаса ааРссасдаа сасадссРас 240 аЕддадсЪда дсадссЬдад аЬсРдаддас асддссдрдр аРРаЕРд-Ьдс даддадддас 300
НддддадасР асрддддсса дддаасссРд дРсассдРсР ссРсадссНс сассаадддс 360 ссаРсддРсН РсссссРддс а 381 <210> 2 <211> 127 <212> Белок <213> Ното заррепз <400 2
βΐη Ча1 1 31п Деи Ча1 5 С1п Зег С1у 10 Ча1 Дуз Дуз Рго С1у 15 Зег
Зег Ча1 Буз Уа1 Зег Суз Дуз А1а Зег С1у С1у ТЬг РЬе Зег Агд Туг
20 25 30
Рго Не Азп Тгр Ча1 Агд С1п А1а Рго С1у С1п С1у Деи С1и Тгр Мер
35 40 45
61у Агд Не 11е Рго Не Ьеи е1у Не А1а Азр Туг А1а 61п Агд РЬе
50 55 60
С1п С1у Агд Уа1 ТЬг 11е ТНг А1а Азр Ьуз Зег ТНг Азп ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Мер 01ц Деи. Зег Зег Деи Агд Зег (Ни Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Агд Азр Тгр С1у Азр Туг Тгр Е1у С1п С1у ТЬг Ьеи Ча1 ТЬг
100 105 НО
Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз 61у Рго Зег Ча1 РЬе Рго Ьеи А1а
115 120 125
<210> 3 <211> 420 <212> ДНК <213> Ното зараепз <40 0 3 аРддаадссс садсасадсР 6с±сНсс1:с сРдсРасРсР ддсНоссада Рассассдда 60 даааррдрдр НдасдсадРс Рссаддсасс сРдРсРРНдР сРссадддда аададссасс 120
- 41 013677 сЕсЕссЕдса ссЕддссадд дасаддЕЕса ссЕдаадаЕЕ ддадддасса дддссадЕса сЕсссаддсЕ дЕддсадЕдд ЕЕдсадЕдЕа аддЬддадаЕ дадЕдЕЕадс ссЕсаСсЕаЕ дЕсСдддаса ЕЕасЕдЕсад сааасдаасЕ адсадсЕЕсЕ ддЕдсаСсса дасЕЕсасЕс садЕаЕадЕа дЕддсЕдсас
ЕадссЕддЕа дсадддссас ЕсассаЕсад дсЕсассдсЕ саЕсЕдЕсЕЕ ссадсадааа ЕддсаСссса садасЕддад сасЕЕЕсддс саЕсЕЕсссд
180
240
300
360
420 <210> 4 <211> 120 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 4
С1и 1 11е Уа1 Ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго С1у ТЬг 10 Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 С1у
εΐυ Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
РЬе Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Е1п А1а РГО Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
Не Туг 61у А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг С1у Не Рго Азр Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Агд Ьеи С1и
65 70 75 80
Рго 61и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Сув С1п 61п Туг Зег Зег Зег Рго
85 90 95
Ьеи ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд ТЬг Уа1 А1а
100 105 но
А1а Рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго
115 120 <210> 5 <211> 381 <212> ДНК <213> Ното зар±епз <400> 5 саддЕЕсадс ЕддЕдсадЕс ЕддддсЕдад дЕдаадаадс сЕдддЕссЕс ддЕдааддЕс60
ЕссЕдсаадд сЕЕсЕддадд сассЕЕсадс адаЕаЕдсЕа ЕсаасЕдддЕ дсдасаддсс120 ссЕддасаад дасЕЕдадЕд даЕдддаадд аЕсаЕсссЕа ЕссЕЕдаЕаЕ адсадасЕас180 дсасадаадЕ Ессаддасад адЕсасдаЕЕ ассдсддаса адЕссасдаа сасадссЕас240 аЕддадсЕда дсадссЕдад аЕсЕдаддас асддссдЕдЕ аЕЕасЕдЕдс дадаааддас300
ЕддЕЕсдасс ссЕддддсса дддаасссЕд дЕсассдЕсЕ ссЕсадссЕс сассаадддс360 ссаЕсддЕсЕ ЕсссссЕддс а381 <210> 6 <211> 127 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 6
С1п 1 Уа1 С1п Ьеи Уа1 5 С1п Зег С1у А1а С1и Уа1 10 Ьуз Ьуз Рго С1у 15 Зег
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег 61у 61у ТЬг рке Зег Агд Туг
20 25 30
А1а Не Авп Тгр Уа1 Агд 61п А1а Рго С1у С1п С1у Ьеи С1и Тгр МеЕ
35 40 45
61У Агд Не Не Рго Не Ьеи Азр Не А1а Азр Туг А1а С1п Ьуз РЬе
50 55 60
С1п Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг А1а Азр Ьуз Зег ТЬг Азп ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Мес б1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Сув
85 90 95
А1а Агд Ьуз Азр Тгр Рке Азр Рго Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг
- 42 013677
51и Азп Уа1 1 Ьеи ТЬг 5 <31п Зег Рго 61у ТЬг 10 Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 51у
51и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Б1у Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у 51п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
Не Туг 51 у А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг 51у Не Рго Азр Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у Зег 61 у 5ег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Агд Ьеи С1и
65 70 75 30
Рго С1и Азр РЬе А1а 17а1 Туг Туг Суз С1п С1п Туг 51 у Зег Зег Рго
85 90 95
11е ТЬг РЬе С1у 51п С1у ТЬг Агд Ьеи СЬи Не Ьуз Агд ТЬг Уа1 А1а
100 105 110
АЬа Рго Зег Уа1 РЬе 11е РЬе Рго
115 120
- 43 013677
С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 Е1п Зег 31у А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у Зег
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у С1у ТЬг РЬе Зег Агд Туг
20 25 30
Рго Не Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у С1п 61у Ьеи С1и Тгр Мек
35 40 45
С1у Агд 11е Т1е Рго 11е Ьеи 61у Т1е А1а Азр Туг А1а С1п Агд РЬе
50 55 60
С1п С1у Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг А1а Азр Ьуз РЬе ТЬг Азп ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
МеЬ С1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ахд Агд Азр Тгр С1у Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг
100 105 110
Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а
115 120 125
<210> 11
<211> 421
<212> ДНК
<213> Ното зархепз
<400> 11
аЬддаадссс садсасадсб ЬсЬсЬЬссЬс сСдсЬасЬе!: ддсЬсссада Ьассассдда 60
даааЬЬдЬдЬ ЬдасдсадЬс Ьссаддсасс сЬдЬсЬЬЬдЬ сЬссадддда аададссасс 120
сЬсЬссЬдса дддссадкса дадЬдЬбадс адсадсбЬсЬ ЬадссЬддЬа ссадсадааа 180
ссЬддссадд сЬсссаддсЬ ссбсаЬсЬаЬ ддЬдса'Ьсса дсадддссас ЬддсаЬссса 240
дасаддЬЬса дЬддсадЬдд дЬсЬдддаса дасбЬсасЬс ЬсассаЬсад садасЬддад 300
ссЬдаадаЫ: ЬЬдсадЬдЬа ЬЬасЬдЬсад садЬакадЬа дсЬсассдсЬ сасМксддс 360
ддадддасса аддГддада-Ь сааасдаасЬ дрддсЬдсас саЬсЬдЬсЫ саЬсЬЬсссс 420
9 421
<210> 12
<211> 120
<212> Белок
<213> Ното зархепз
<400> 12
С1и 1 11е Уа1 Ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго С1у ТЬг Ьеи 10 Зег Ьеи Зег Рго 15 С1у
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
РЬе Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
11е Туг Й1у А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг С1у 11е Рго Азр Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у Зег 61у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Агд Ьеи С1и
65 70 75 80
Рго С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Туг Зег Зег Зег Рго
85 90 95
Ьеи ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз 7а1 С1и 11е Ьуз Агд ТЬг Уа1 А1а
100 105 110
А1а Рго Зег Уа1 РЬе 11е РЬе Рго
115 120
<210> <211> <212> <213> 13 381 ДНК Ното зартепз
<400> 13
- 44 013677 саддЕдсадс Есскдсаадд сскддасаад дсасадаадЕ акддадскда ЕддЕЕЕдаЕЕ ссаЕсддксЕ
ЕддЕдсадЕс сЕЕскддадд ддсЕЕдадкд Ессадддсад дсадссЕдад аскддддсса ЕсссссЕддс
ЕддддсЕдад сассЕЕсадс дакдддаадд адЕсасдаЕЕ аЕскдаддас дддаассскд а дкдаадаадс аддкаЕаЕЕа аксаЕсссЕа ассдсддаса асддссдкдк дЕсассдЕсЕ сЕдддЕссЕс ЕсаасЕдддЕ ЕссЕЕддЕдЕ ааЕссасдад аЕЕаскдЕдс ссЕсадссЕс ддЕдааддкс дсдасаддсс адаааасЕас сасадссЕас дадаааддас сассаадддс
120
180
240
300
360
381 <210> 14 <211> 127 <212> Белок <213> Ното варЬепв <400> 14
СЬи УаЬ 1 С1п Ьеи. УаЬ 5 61п Зег 61 у АЬа ЙЬи 10 УаЬ Ьуз Ьуз Рго 61у 15 Зег
Зег УаЬ Ьуз УаЬ Зег Суз Ьуз АЬа Зег СЬу СЬу ТЬг РЬе Зег Агд Туг
20 25 30
Не Не Азп Тгр УаЬ Агд С1п АЬа Рго СЬу СЬп СЬу Ьеи СЬи Тгр МеЕ
35 40 45
СЬу Агд Не Не Рго ТЬе Ьеи 61у УаЬ СЬи Азп Туг АЬа ЙЬп Ьув РНе
50 55 60
б1п йЬу Агд УаЬ ТНг ЬЬе ТНг АЬа Азр Ьуз Зег ТЬг Зег ТНг АЬа Туг
65 70 75 80
МеЕ ЙЬи Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег 51и Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг Туг Суз
85 90 95
АЬа Агд Ьуз Азр Тгр РЬе Азр Туг Тгр 61 у СЬп СЬу ТЫ Ьеи УаЬ ТНг
100 105 110
УаЬ Зег Зег АЬа Зег ТЬг Ьуз Й1у Рго Зег УаЬ РЬе Рго Ьеи АЬа
115 120 125
<210> 15 <211> 418 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400 15 аЕддаадссс даааЕЕдЕдЕ сЕсЕссЕдса ддссаддсЕс аддЕЕсадЕд даадаЕЕЕЕд дддассаадд садсасадсЕ ЕдасдсадЕс дддссадЕса ссаддсЕсср дсадЕдддЕс садЕдЕаЕЕа ЕддадаЕсаа
ЕсЕсЕСссЕс Ессаддсасс дадЕдЕЕадс саЕсЕаЕддЕ Едддасадас сЕдЕсадсад асдаасЕдЕд сЕдсЕасЕсЕ СЕдЕсЕЕЕдЕ адсЕасЕЕад дсаЕссадса ЕЕсасЕсЕса ЕаЕддЕадсЕ д с и д с а с с а и ддсЕсссада СЕссадддда ссЕддЕасса дддссаскдд ссаЕсадсад сассдсЕсас сЕдЕсЕЕсаЕ
Еассассдда аададссасс дсадааассЕ саксссадас асЕддадссЕ ЕЕЕсддсдда сЕЕссссд
120
180
240
300
360
418 <210 16 <211> 119 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400 16
СЬи 1 Не УаЬ Ьеи ТНг 5 С1п Зег Рго еьу ТНг ЬО Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 С1у
СЬи Агд АЬа ТНг Ьеи Зег Суз Агд АЬа Зег С1п Зег УаЬ Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи АЬа Тгр Туг 61п 61П Ьуз Рго СЬу СЬп АЬа Рго Агд Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг СЬу АЬа Зег Зег Агд АЬа ТНг 61 у 11е Рго Азр Агд РНе Зег СЬу
50 55 60
Зег СЬу Зег ЙЬу ТЫ Авр РНе ТНг Ьеи ТНг Не Зег Агд Ьеи СЬи Рго
65 70 75 80
СЬи АЗр РЬе АЬа УаЬ Туг Туг Суз ЙЬп СЬп Туг Й1у Зег Зег Рго Ьеи
85 90 95
- 45 013677
<210> 22
<211> 9
<212> Белок
<213> Ното зархепз
<400> 22
- 46 013677
С1п 51п Туг Зег Зег Зег Рго Ьеи ТЬг
1 5
<210> 23
<211> 5
<212> Белок
<213> Ното варЬепз
<4 00> 23
Агд Туг А1а 11е Азп
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> Белок
<213> Ното зарЬепз
<400> 24
Агд 11е 11е Рго 11е Ьеи Азр 11е А1а Азр Туг А1а С1п Ьуз РЬе С1п
1 5 10 15
Азр
<210> 25
<211> δ
<212> Белок
<213> Ното зардепз
<400> 25
Ьуз Авр Тгр РЬе Азр Рго
1 5
<210> 26
<211> 12
<212> Белок
<213> Ното зарЬепз
<400> 26
Агд А1а Зег С1п Зег <31 у Зег Зег Зег Туг Ьеи А1а
1 5 10
<210> 27 <211> 7 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <400> 27
С1у А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг
5 <210> 28 <211> 9 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 28
51п С1п Туг СЬу Зег Зег Рго Не ТЬг
5
- 47 013677 <210> 29 <211> 5 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 29
Агд Туг Рго Не Азп
5 <210> 30 <211> 17 <212> Белок <213> Ното зар±епз <400> 30
Агд 11е Не Его Не Ьеи С1у 11е А1а Азр Туг А1а С1п Агд РЬе С1п 15 10 15 у
<210> 31 <211> 6 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 31
Агд Азр Тгр 61у Азр Туг
5 <210> 32 <211> 12 <212> Белок <213> Ното зар!епз <400> 32
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Зег РЬе Ьеи А1а
10 <210> 33 <211> 7 <212> Белок <213> Ното зарТепз <400> 33
С1у А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг
5 <210> 34 <211> 9 <212> Белок <213> Ното зар!епз <400> 34
С1п Е1п Туг Зег Зег Зег Рго Ьеи ТЬг
5
- 48 013677
- 49 013677
<211> 20
<212> Белок
<213> Ното зар1епз
<400> 41
Суз А1а <31у (31у ТЬг Ьуз Суз А1а
1 5
А1а <31 у ТЬг Суз
20
<210> 42
<211> 20
<212> Белок
<213> Ното зархепз
<400> 42
Зег А1а С1у С1у ТЬг 01 у Суз А1а
1 5
А1а <31 у Ткг Суз
20
<210> 43
<211> 20
<212> Белок
<213> Ното заръепз
<400> 43
С1у А1а С1у С1у ТЬг С1у Суз А1а
1 5
А1а 01 у Ткг Суз
20
<210> 44
<211> 21
<212> Белок
<213> Ното зархепз
<400> 44
А1а ТЬг С1у <31у А1а Суз ТЬг <31у
1 5
С1у Суз А1а ТЬг Суз
20
<210> 45
<211> 20
<212> Белок
<213> Ното зараепз
<400> 45
А1а Ткг С1у С1у А1а А1а ТЬг ТЬг
1 5
С1у Суз ТЬг С1у
20
С1у Суз Ткг С1у б1у Ткг С1у Суз
15
С1у Суз Ткг С1у Ъуз Ткг 61у С1у
15
С1у Суз Ткг <31у С1у Ткг С1у Суз
15
С1у А1а Суз Суз Ткг С1у С1у А1а
15
С1у С1у С1у С1у Суз Ткг С1у А1а
15 <210> 46 <211> 20 <212> Велок <213> Ното зараепз
- 50 013677 <400> 46
А1а Ткг Б1у С1у А1а 61у Ткг Ткг ТЬг Б1у Б1у Агд Суз Ткг 61у А1а 15 10 15
Б1у Суз ТЬг Б1у <210> 47 <211> 21 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 47
А1а ТЬг Б1у А1а А1а А1а Суз А1а Суз Суз ТЬг С1у ТЬг 61у 61у Ткг 15 10 15
Ткг Суз Ткг ТЬг Суз <210> 48 <211> 20 <212> Белок <213> Ното зархепз
<400> 48
А1а ТЬг С1у 61у С1у Б1у ТЬг Суз А1а А1а Суз Суз Б1у Суз Суз А1а
1 5 10 15
ТЬг Суз Суз ТЬг
20
<210> 49 <211> 21 <212> Белок <213> Ното зархепз <400 49
ТЬг С1у Суз Суз А1а Б1у С1у Б1у С1у Б1у А1а А1а Б1у А1а Суз Суз 15 10 15
С1у А1а ТЬг С1у С1у <210> 50 <211> 20 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 50
Агд А1а Суз А1а ТЬг Суз Суз А1а Б1у А1а ТЬг Б1у А1а Туг Суз Суз 15 10 15
А1а О1у ТЬг Суз <210> 51 <211> 20 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 51
С1у Туг Суз А1а ТЬг Суз Туг Агд Б1у А1а ТЬг С1у А1а Суз Суз Суз 15 10 15
А1а Б1у ТЬг Суз
- 51 013677
20
<210> 52
<211> 20
<212> Белок
<213> Ното зартепз
<400> 52
С1у А1а ТЬг А1а ТЬг ТЬг 61у ТЬг
1 5
А1а С1у А1а Суз
20
<210> 53
<211> 20
<212> Белок
<213> Ното заргепз
<400> 53
С1у А1а А1а А1а ТЬг ТЬг <51у ТЬг
1 5
А1а С1у ТЬг Суз
20
<210> 54
<211> 20
<212> Белок
<213> Ното зар!епз
<400> 54
С1у А1а А1а А1а ТЬг Тгр <31у ТЬг
1 5
А1а С1у ТЬг Суз
20
<210> 55
<211> 20
<212> Белок
<213> Ното заргепз
<400> 55
С1у А1а ТНг С1у ТЬг ТЬг С1у ТЬг
1 5
А1а С1у ТЬг Суз
20
<210> 56
<211> 20
<212> Белок
<213> Ното зар1епз
<400> 56
С1у А1а А1а А1а ТЬг ТЬг С1у ТЬг
1 5
А1а С1у ТЬг Суз
20
<210> 57
С1у А1а ТЬг 01у А1а Суя Суз Суз
15
С1у ТЬг ТЬг С1у А1а Суз Агд Суз
15
Агд А1а ТЬг С1у А1а Суз А1а Суз
15 б1у А1а ТЬг 61у А1а Суз А1а Суз
15 е1у Суз ТЬг С1у А1а Суз ТЬг Суз
15
- 52 013677 <211> 24 <212> Белок <213> Ното зархепз
<400> 57
Суз Суз Суз С1у Суз ТЬг Суз А1а С1у Суз ТЬг Суз Суз ТЬг б1у С1у
1 5 10 15
С1у С1у Суз ТЬг Суз Суз ТЬг 61 у
20
<210 58 <211> 23 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 58
Суз Суз Суз ТЬг 51у Суз ТЬг Суз А1а 61у Суз ТЬг Суз Суз 15 10
51у С1у С1у Суз ТЬг С1у Суз
ТЬг 51у <210 59 <211> 26 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 59
Суз Суз Суз А1а 61у Суз 61у Суз А1а 51у Суз ТЬг ТЬг Суз ТЬг Суз
1 5 10 15
ТЬг ТЬг Суз Суз ТЬг Суз Суз ТЬг С1у Суз
20 25
<210> 60 <211> 27 <212> Белок <213> Ното зарлепз <400 60
А1а ТЬг С1у 61у А1а А1а Суз Суз А1а ТЬг С1у 61у А1а А1а 61у Суз
1 5 10 15
Суз Суз Суз А1а С1у Суз А1а Суз А1а 51 у Суз
20 25
<210> 61 <211> 20 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <400> 61
Суз С1у С1у С1у А1а А1а С1у А1а ТЬг 61у А1а А1а 61у А1а Суз А1а
10 15
С1у А1а ТЬг С1у <210> 62 <211> 6 <212> Белок <213> Ното зархепз <220
- 53 013677 <221> ВАРИАНТ <222> 1 <223> Хаа=Агд, Н1з, или Ь1в <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 4 <223> Хаа=С1у, А1а, Иа1, Ъеи, Не, Туг, Тгр, или РЬе <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 6 <223> Хаа=Рго, Туг, РЬе, или Тгр <400> 62
Хаа Азр Тгр Хаа Азр Хаа
1 5
<210> 63
<211> 6
<212> Белок
<213> Ното заръепз
<220>
<2215 ВАРИАНТ
<222> 1
<223> Хаа=Агд или Ъуз
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 4
<223> Хаа=С1у или РЬе
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 6
<223> Хаа=Рго или Туг
<400> 63
Хаа Азр Тгр Хаа Азр Хаа
5 <210> 64 <211> 5 <212> Белок <213> Ното заръепз <220>
<2215 ВАРИАНТ <222> 1
<223> Хаа—АЗ. а, Ъеи, МеЕ Туг Суз, г Азп, Азр, Рго, С1и, Θΐη, РЬе, С1у,Н±з, Не, Ъуз, , Тгр, ИЛИ
Агд, ТЬг , 7а1
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 3
<223> Хаа=Суз, Азр, С1и, РЬе, С1у,Н1з, Не, Ъуз, Ъеи,
МеЕ, Азп, - Рго, 61п, Агд, Зег, ТЬг , Уа1 , Тгр, Туг
<220>
<221> ВАРИАНТ
- 54 013677 <222> 5 <223> Хаа=А1а, Суз, Азр, С1и, РЬе, С1у,Н1з, 11е, Ьуз, Ьеи, Мер, Азп, Рго, 61п, Агд, ТЬг, νΑΙ, Тгр, Туг <40О> 64
Хаа Туг Хаа 11е Хаа
5 <210> 65 <211> 5 <212> Белок <213> Ното зархепз <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 1 <223> Хаа=Агд, Ьуз, или Н1з <220>
<221> νΑΗΙΑΝΤ <222> 3 <223> Хаа=А1а, 61у, Уа1, Ьеи, 11е, или Рго <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 5 <223> Хаа=Азп или С1п <400> 65
Хаа Туг Хаа 11е Хаа
5 <210> 66 <211> 5 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 3 <223> Хаа=А1а, 11е, или Рго <400> 66
Агд Туг Хаа 11е Азп
5 <210> 67 <211> 17 <212> Белок <213> Ното зарпепе <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 8 <223> Хаа=А1а, Суз, Азр, С1и, РЬе, С1у, Н1з, Ьуз, Ьеи, Мер, Азп, Рго, С1п, Агд, Зег, ТЬг, Уа1, Тгр, или Туг <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 9
- 55 013677
<223> Хаа—Суа, Азр, С1и, РЬе, С1у, НЬз, 11е, Ьуз, Ьеи,
МеЬ, Азп Туг , Рго , С1п, , Агд, Зег , ТЬг , Уа1, Тгр, или
<220 <221> ВАРИАНТ
<222> 10
<223> Хаа=А1а, Суа, Азр, СЬи, РЬе, С1у, Ηχε, 11е, Ьув,
Ьеи, МеЬ, , Рго, С1п, Агд, Зег, ТЬг, Уа1, Тгр, ИЛ1
Туг
<220> <221> ВАРИАНТ
<222> 14
<223> Хаа=А1а, Суз, Азр, СЬи, РЬе, 61у, НЬз, 11е, Ьеи,
МеЬ, Азп, Туг Рго, , СЬп, Агд, Зег , ТЬг , УаЬ, Тгр, или
<220 <221> ВАРИАНТ
<222> 17
<223> Хаа=А1а, Суз, Азр, С1и, РЬе, НЬз, Ие, Ьуз, Ьеи,
Мер, Азп, Рго, . С1п, Агд, Зег , ТЬг , Уа1, Тгр, Туг
<400 67
Агд 11е 11е Рго 11е Ьеи С1у Хаа Хаа Хаа Туг АЬа С1п Хаа РЬе СЬп
10 15
Хаа <210> 68 <211> 17 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <220 <221> ВАРИАНТ <222> 8 <223> Хаа»11е, Уа1, С1у, АЬа, или Ьеи <220 <221> ВАРИАНТ <222> 9 <223> Хаа=А1а, Ые, Уа1, СЬу, Ьеи, 61и, или Азр <220 <221> ВАРИАНТ <222> 10 <223> Хаа=Азр, С1и, Азп, или С1п <220 <221> ВАРИАНТ <222> 14 <223> Хаа=Ьуз, Агд, или НЬз <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 17 <223> Хаа=С1у, Не, Уа1, АЬа, Ьеи, Азр, или СЬи <400 63
Агд 11е 11е Рго 11е Ьеи СЬу Хаа Хаа Хаа Туг А1а С1п Хаа РЬе СЬп
10 15
- 56 013677
Хаа <210> 69 <211> 17 <212> Белок <213> Ното зархепз <220>
<221> ВАРИАНТ <222> е <223> Хаа=11е или Уа1 <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 9 <22 3> Хаа=А1а или С1и <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 10 <223> Хаа=Азр или Азп <220 <221> ВАРИАНТ <222> 17 <223> Хаа=б1у или Авр <400> 6-9
Агд 11е Не Рго Не Ьеи С1у Хаа Хаа Хаа Туг А1а С1п Хаа РЬе С1п
10 15
Хаа <210 70 <211> 11 <212> Белок <213> Ното заргепз <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 6
<223> Хаа=А1а, Суз, Азр, С1и, РЬе, 61у, Н1з, 11е, Ьуз,
Ьеи, МеЬ Туг , Азп, , Рго, С1п, Агд, . Зег, , ТЬг, Тгр, ИЛИ
<220 <221> ВАРИАНТ
<222> 9
<223> Хаа=А1а, Суз, Азр, С1и, РЬе, С1у, НЬз, Не, Ьуз,
Ьеи, МеЬ , Азп, Рго, С1п, Агд, 5ег, ТЬг, Уа1, или
Тгр <400> 70
Агд А1а Зег С1п Зег Хаа Зег Зег Хаа Ьеи А1а
10 <210 71 <211> 11 <212> Белок <213> Ното зараепз
- 57 013677 <220 <221> ВАРИАНТ <222> 6 <223> Хаа=Уа1, А1а, Ьеи, Не, или С1у <220 <221> ВАРИАНТ <222> 9 <22 3> Хаа=?Ъе, Тгр, или Туг <400> 71
Агд А1а Зег 61п Зег Хаа Зег Зег Хаа Ьеи А1а
10 <210 72 <211> 11 <212> Белок <213> Ното заргепз <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 6 <223> Хаа='7а1 или С1у <220 <221> ВАРИАНТ <222> 9 <223> Хаа=РЬе или Туг <400 72
Агд А1а Зег С1п Зег Хаа Зег Зег Хаа Ьеи А1а
10 <210 73 <211> 9 <212> Белок <213> Ното еарЬелз <220 <221> ВАРИАНТ <222> 4 <223> Хаа=С1у, А1а, \Га1, Ьеи, 11е, Зег, или ТНг <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 8 <223> Хаа=Ьеи, С1у, А1а, Уа1, или 11е <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 9 <223> Хаа=ТЬг или Зег <400> 73
61л 61л Туг Хаа Зег Зег Рго Хаа Хаа
5 <210 74
- 58 013677 <211> 9 <212> Белок <213> Ното зариепз <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 4 <223> Хаа=С1у или Зег <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 8 <223> Хаа=Ьеи или Не <400> 74
С1п С1п Туг Хаа Зег Зег Рго Хаа ТЬг
5

Claims (45)

1. Выделенное человеческое моноклональное антитело, которое связывается с человеческим ί.'Ό25 и ингибирует связывание ΙΌ-2 с СЭ25, содержащее по меньшей мере одну вариабельную область человеческого происхождения, выбранную из группы, состоящей из:
(1) 8 ЕС) ΙΌ N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16; или (ίί) последовательности, которая по меньшей мере на 90% гомологична, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологична любой из аминокислотных последовательностей, представленных в (1).
2. Антитело по п.1, содержащее тяжёлую цепь человеческого происхождения и лёгкую каппа-цепь человеческого происхождения, включающие аминокислотные последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 6 и 8, 8ЕЦ ΙΌ N0: 14 и 16, 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 и 4 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 10 и 12 соответственно или последовательности, которые по меньшей мере на 90% гомологичны, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичны и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологичны аминокислотным последовательностям 8ЕЦ ΙΌ N0: 6 и 8, 8ЕЦ ΙΌ N0: 14 и 16, 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 и 4 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 10 и 12 соответственно.
3. Антитело по п.2, в котором вариабельные области тяжелой цепи человеческого происхождения и лёгкой каппа-цепи человеческого происхождения кодируются нуклеотидными последовательностями 8ЕЦ ΙΌ N0: 5 и 7, 8ЕЦ ΙΌ N0: 13 и 15, 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 и 3 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 9 и 11 соответственно или указанными последовательностями, имеющими модификации в консервативных областях.
4. Антитело по п.2, в котором вариабельные области тяжёлой цепи человеческого происхождения и лёгкой каппа-цепи человеческого происхождения содержат аминокислотные последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 6 и 8, 8ЕЦ ΙΌ N0: 14 и 16, 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 и 4 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 10 и 12 соответственно.
5. Антитело по любому из пп.1-4, содержащее по меньшей мере одну или по меньшей мере четыре последовательности СОВ, выбранные из:
(1) 8 ЕС) ΙΌ N0: 23, 24, 25, 26, 27 или 28; или (ίί) 8ЕС) ΙΌ N0: 29, 30, 31, 32, 33 или 34; или (ίίί) 8ЕС) ΙΌ N0: 35, 36, 37, 38, 39 или 40; или (ίν) 8ЕС) ΙΌ N0: 17, 18, 19, 20, 21 или 22; или (ν) любой из указанных последовательностей (ί), (ίί), (ίίί) или (ίν), с консервативными модификациями.
6. Антитело по любому из пп.1-5, содержащее область Ун СОВ3, имеющую аминокислотную последовательность
Х1 -Акр-Тгр-Х2-Акр-Х3 где Х1 обозначает Агд, Н1к или Ьук, предпочтительно Агд или Ьук; Х2 обозначает С1у, А1а, Уа1, Ьеи, Не, Туг, Тгр или РНе, предпочтительно С1у или РНе; и Х3 обозначает Рго, Туг, РНе или Тгр, предпочтительно Рго или Туг.
7. Антитело по п.6, содержащее СОВ3 области УН с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0: 25, 8ЕЦ ΙΌ N0: 31, 8ЕЦ ΙΌ N0: 37 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 19 или с любой из указанных последовательностей с консервативными модификациям, в том числе с заменами, делециями или добавлениями 1-3 аминокислот.
8. Антитело по любому из пп.1-7, содержащее УН СОВ1, СОВ2 и СОВ3 и Уь СОВ1, ί.’ΌΡ2 и СОВ3 с последовательностями:
(ί) 8ЕЦ ΙΌ N0: 23, 24, 25, 26, 27 и 28; или с любой из указанных последовательностей с консервативными модификациями;
(ίί) 8ЕЦ ΙΌ N0: 29, 30, 31, 32, 33 или 34; или с любой из указанных последовательностей с консервативными модификациями;
(ш) 8ЕЦ ΙΌ N0: 35, 36, 37, 38, 39 или 40; или с любой из указанных последовательностей с консер
- 59 013677 вативными модификациями;
(ίν) 8ЕЦ ΙΌ N0: 17, 18, 19, 20, 21 или 22; или с любой из указанных последовательностей с консервативными модификациями.
9. Антитело по любому из пп.1-8, содержащее V СБИ1 домен, имеющий аминокислотную последовательность
Х!-Туг-Х2-11е-Х3 где Х1, Х2 и Х3 обозначают природные аминокислоты; и где Х1 отличен от 8ег; или Х2 отличен от А1а; или Х3 отличен от 8ег.
10. Антитело по п.9, где Х1 обозначает Агд, Бук или Шк, предпочтительно Агд; Х2 обозначает А1а, 61у, Vа1, Ьеи, 11е или Рго, предпочтительно А1а, 11е или Рго; и Х3 обозначает Акп или 61п, предпочтительно Акп.
11. Антитело по любому из пп.1-10, содержащее VII СБИ2 домен, имеющий аминокислотную последовательность
Агд-11е-11е-Рго-11е-Ьеи-61у-Х1-Х2-Х3-Туг-А1а-61п-Х4-Рйе-61п-Х5 где Х1, Х2, Х3, Х4 и Х5 обозначают природные аминокислоты; и где Х1 отличен от 11е; или Х2 отличен от А1а; или Х3 отличен от Акп; или Х4 отличен от Бук; или Х5 отличен от С1у.
12. Антитело по п.11, где Х1 обозначает 11е, Vа1, С1у, А1а или Ьеи, предпочтительно 11е или Vа1; Х2 обозначает А1а, 11е, Vа1, 61у, Ьеи, 61и или Акр, предпочтительно А1а или 61и; Х3 обозначает Акр, 61и, Акп или С1п, предпочтительно Акр или Акп; Х4 обозначает Бук, Агд или Шк, предпочтительно Бук или Агд; и Х5 обозначает 61у, 11е, Vа1, А1а, Беи, Акр или 61и, предпочтительно 61у или Акр.
13. Антитело по любому из пп.1-12, содержащее V СБИ1 домен, имеющий аминокислотную последовательность
Агд-А1а-8ег-61п-8ег-Х1-8ег-8ег-Х2-Беи-А1а где Х1 и Х2 обозначают природные аминокислоты; и где Х1 отличен от Vа1; или Х2 отличен от Туг.
14. Антитело по п.13, где Х1 обозначает Vа1, А1а, Беи, 11е или С1у, предпочтительно Vа1 или С1у; и Х2 обозначает РНе, Тгр или Туг, предпочтительно РНе или Туг.
15. Антитело по любому из пп.1-14, содержащее V СБИ3 домен, имеющий аминокислотную последовательность
61п-61п-Туг-Х1-8ег-8ег-Рго-Х2-Х3 где Х1 обозначает 61у, А1а, Vа1, Беи, 11е, 8ег или ТНг, предпочтительно 61у или 8ег; Х2 обозначает Беи, С1у, А1а, Vа1 или 11е, предпочтительно Беи или 11е; и Х3 обозначает ТНг или 8ег, предпочтительно ТНг.
16. Антитело по любому из пп.1-15, содержащее:
(ί) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжёлой цепи, образованную из последовательности ^1-69/Ш4Ь или ^1-69/Ш5Ь человеческой зародышевой линии, и аминокислотную последовательность вариабельной области лёгкой цепи, образованную из последовательности А27/1К4 или А27/1К5 человеческой зародышевой линии, или (ίί) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжёлой цепи, образованную из последовательности ^1-69/Б7-27/1Н4Ь или ^1-69/П7-27/Ш5Ь человеческой зародышевой линии, и аминокислотную последовательность вариабельной области лёгкой цепи, образованную из последовательности А27/1К4 или А27/1К5 человеческой зародышевой линии.
17. Антитело по любому из пп.1-16, выбранное из группы, состоящей из 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дМ, 1дА1, 1дА2, секреторного 1дА, 1дБ и 1дЕ антитела.
18. Антитело по любому из пп.1-17, которое диссоциирует от человеческого СБ25 с константой равновесной диссоциации (Кс) около 10-8 М или ниже, предпочтительно около 10-9 М или ниже, или более предпочтительно около 10-10 М или ниже, или 10-11 М или даже ниже, по определению методом плазмонного поверхностного резонанса (8РР) на приборе В1Асоге 3000 с применением рекомбинантного человеческого СБ25 в качестве лиганда и антитела в качестве аналита.
19. Антитело по любому из пп.1-18, которое имеет одно или более следующих свойств:
(a) элиминирует Т клетки, экспрессирующие СБ25;
(b) ингибирует пролиферацию Т клеток, экспрессирующих СБ25;
(c) ингибирует вызванную антителом против СБ25 Т-клеточную пролиферацию мононуклеаров периферической крови (РВМС);
(6) ингибирует смешанную лимфоцитарную реакцию (МБР);
(е) обеспечивает интернализацию СБ25, экспрессированных на Т-клетках.
20. Антитело по п.17, которое представляет собой интактное антитело, выбранное из группы, состоящей из интактного 1дС1,к антитела, предпочтительно интактного 1дС4,к антитела и интактного 1дС4,Б антитела, причем это антитело гликозилируется в клетке эукариот.
21. Антитело по любому из пп.1-15, которое представляет собой фрагмент антитела или одноцепочечное антитело.
22. Антитело по любому из пп.1-21, которое представляет собой белок, слитый по связывающему
- 60 013677 домену иммуноглобулина, содержащий (ί) вариабельную область тяжёлой цепи или вариабельную область лёгкой цепи, как определено в п.2, слитую с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, (ίί) константную область СН2 тяжёлой цепи иммуноглобулина, слитую с шарнирной областью, и (ίίί) константную область СН3 тяжёлой цепи иммуноглобулина, слитую с константной областью СН2.
23. Гибридома, продуцирующая человеческое моноклинальное антитело по любому из пп.1-20.
24. Гибридома по п.23, которая содержит В-клетку трансгенного отличного от человека животного, в которой реаранжировки генных сегментов ν-(Ό)-1 привели к образованию функционального трансгена тяжёлой цепи человеческого происхождения и функционального трансгена лёгкой цепи человеческого происхождения, слитую с иммортализованной клеткой.
25. Трансфектома, содержащая последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжёлую цепь антитела человеческого происхождения и лёгкую цепь человеческого происхождения, продуцирующая детектируемое количество антитела по любому из пп.1-21.
26. Эукариотическая или прокариотическая клетка-хозяин, содержащая последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжёлую цепь антитела человеческого происхождения и лёгкую цепь антитела человеческого происхождения, продуцирующая детектируемое количество антитела по любому из пп.1-21.
27. Трансгенное отличное от человека животное, содержащее последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжёлую цепь антитела человеческого происхождения и лёгкую цепь антитела человеческого происхождения, продуцирующее детектируемое количество антитела по любому из пп.1-21.
28. Трансгенное растение, содержащее последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжёлую цепь антитела человеческого происхождения и лёгкую цепь антитела человеческого происхождения, продуцирующее детектируемое количество антитела по любому из пп.1-21.
29. Экспрессирующий вектор, содержащий последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие человеческое моноклональное антитело по любому из пп.1-21.
30. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из пп.1-21 или вектор по п.30 и фармацевтически приемлемый носитель, и, при необходимости, другой терапевтический агент.
31. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из пп.1-21 или вектор по п.30, и второй терапевтический агент для их отдельного применения при лечении человека или животного.
32. Композиция по п.30, отличающаяся тем, что другой терапевтический агент представляет собой:
(ί) иммуносупрессор, выбранный из группы, включающей циклоспорин, азатиоприн, микофенольную кислоту, микофенолят мофетила, кортикостероиды, такие как преднизон, метотрексат, соли золота, сульфасалазин, противомалярийные средства, бреквинар, лефлюномид, мизорибин, 15дезоксиспергуалин, 6-меркаптопурин, циклофосфамид, рапамицин, такролимус (РК-506), 0КТ3 и антитимоцит глобулин;
(ίί) противовоспалительный агент, выбранный из группы, включающей стероидные препараты, НСПВС (нестероидные противовоспалительные средства) и ОМАВЭ (противоревматические средства), такие как метотрексат, гидроксихлорокин, сульфасалазин, лефлуномид, блокаторы ЕЬ-1 рецептора, например, анакинра, блокаторы ΙΝΕ-α, например этанерсепт, инфликсимаб и адалимумаб, антитела против ГЬ-6В, СТЬА4Гд и антитела против ГЬ-15;
(ίίί) агент для лечения воспалительных или гиперпролиферативных кожных заболеваний, выбранный из группы, включающей угольную смолу, витамин А, антралин, кальципотриен, таразотен, кортикостероиды, метотрексат, ретиноиды, например ацикретин, циклоспорин, этанерсепт, алефасепт, эфалузимаб, 6-тиогуанин, микофенолят мофетила, такролимус (РК-506) и гидроксимочевину; или (ίν) агент, выбранный из доксорубицина, цисплатина, блеомицина, кармустина, хлорамбуцила и циклофосфамида.
33. Антитело по любому из пп.1-21, дополнительно содержащее линкер-хелатор для связывания радиоактивного изотопа.
34. Иммуноконъюгат, предназначенный для применения в лечении или предупреждении заболевания, связанного с клетками, экспрессирующими СЭ25, содержащий антитело по любому из пп.1-21 или 33, связанное с цитотоксическим агентом, радиоизотопом или лекарственным веществом.
35. Биспецифическая или полиспецифическая молекула, предназначенная для применения в лечении или предупреждении заболевания, связанного с клетками, экспрессирующими СЭ25, содержащая антитело по любому из пп.1-21 и которая дополнительно связывает один и более антигенов, таких как СЭ3, СЭ4, ГЬ-15В, мембраносвязанный или рецепторносвязанный ΙΝΈ-α или мембраносвязанный или рецепторносвязанный ГЬ-15.
36. Способ ш \з1го ингибирования роста и/или пролиферации клетки, экспрессирующей СЭ25, или элиминации клетки, экспрессирующей СЭ25, заключающийся во введении антитела по любому из пп.122 или композиции по п.30 или иммуноконъюгата по п.34 или биспецифической или полиспецифической молекулы по п.35 таким образом, что рост и/или пролиферация клетки подавляется, или происходит киллинг клетки, экспрессирующей СЭ25, причем клетка, экспрессирующая СЭ25, представляет собой активированную Т-клетку.
- 61 013677
37. Способ лечения или предупреждения отторжения трансплантата, гомологичной болезни (трансплантат против хозяина), иммунного, аутоиммунного и воспалительного заболевания, воспалительного или гиперпролиферативного кожного заболевания и лимфоидной опухоли, заключающийся во введении субъекту антитела по любому из пп.1-22 или композиции по п.30 или иммуноконъюгата по п.34 или биспецифической или полиспецифической молекулы по п.35.
38. Способ по п.37, отличающийся тем, что:
(ί) отторжение трансплантата представляет собой отторжение аллотрансплантата и ксенотрансплантата у пациентов, оперируемых по поводу трансплантации органа или ткани, например сердца, лёгкого, комбинированной трансплантации сердца, лёгкого, трансплантации трахеи, почки, печени, поджелудочной железы, пищевода, кишечника, кожи, конечности, пуповины, стволовых клеток или инсулоцитов;
(ίί) гомологичная болезнь (трансплантат против хозяина) представляет собой болезнь, выбранную из группы, состоящей из гомологичной болезни в результате переливания крови и гомологичной болезни в результате пересадки костного мозга;
(ΐϊϊ) иммунное, аутоиммунное или воспалительное заболевание представляет собой болезнь, выбранную из группы, состоящей из ревматоидного артрита, анкилозирующего спондилоартрита, псориатического артрита, диабета типа 1, инсулинзависимого диабета типа 2, рассеянного склероза, системной эритематозной волчанки, тяжёлой псевдопаралитической миастении, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, дерматополимиозита, синдрома Сёгрена, артериитов, включая гигантоклеточный артериит, гипопластической анемии, астмы, склеродермии и увеита, (ίν) воспалительное или гиперпролиферативное кожное заболевание представляет собой болезнь, выбранную из группы, состоящей из псориаза, включая бляшечный псориаз, пустулёзного акродерматита (РРР), эрозивного плоского лишая, буллёзного пемфигоида, врождённого буллёзного эпидермолиза, контактного дерматита и атопического дерматита; или (ίν) лимфоидная опухоль представляет собой опухоль, выбранную из группы, состоящей из Тклеточного лейкоза, болезни Ходжкина, волосатоклеточного лейкоза или кожной Т-клеточной лимфомы, включая грибовидный микоз и синдром Сезари.
39. Способ лечения или предупреждения злокачественной опухоли, при котором обеспечивается ингибирование инфильтрующих ί.Ό25+ регуляторных Т-клеток, причем опухоль выбрана из группы, состоящей из рака желудка, рака пищевода, злокачественной меланомы, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, мелкоклеточного рака лёгкого, немелкоклеточного рака лёгкого, рака шеи, рака яичника и почечноклеточного рака, заключающийся во введении субъекту антитела по любому из пп.1-22 или композиции по п.30 или иммуноконъюгата по п.34 или биспецифической или полиспецифической молекулы по п.35.
40. Способ лечения или предупреждения гематологического заболевания, выбранного из группы, состоящей из Т-клеточного лейкоза/Т-клеточной лимфомы, анапластической гигантоклеточной лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза (СЬЬ)/малой лимфоцитарной лимфомы (8ЬЬ), периферической Т-клеточной лимфомы и вторичного амилоидоза, заключающийся во введении субъекту антитела по любому из пп.1-22 или композиции по п.30 или иммуноконъюгата по п.34 или биспецифической или полиспецифической молекулы по п.35.
41. Способ детектирования присутствия в образце антигена ί.Ό25 или клетки, экспрессирующей 0025, заключающийся в обеспечении контактирования образца с антителом по любому из пп.1-21 в условиях, допускающих образование комплекса между антителом и СО25; и детектировании образовавшегося комплекса.
42. Диагностический набор для обнаружения присутствия в образце антигена СО25 или клетки, экспрессирующей СО25, содержащий антитело по любому из пп.1-22, при необходимости, связанное с детектируемой меткой.
43. Антиидиотипическое антитело, связывающееся с антителом по любому из пп.1-22.
44. Антиидиотипическое антитело по п.43, связывающееся с антителом, содержащим тяжёлую цепь человеческого происхождения и лёгкую каппа-цепь человеческого происхождения, которые содержат в своих вариабельных областях аминокислотные последовательности 8Еф Ш N0: 6 и 8, 8Еф ΙΌ N0: 14 и 16, 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 и 4 или 8Еф ΙΌ N0: 10 и 12 соответственно
45. Применение антиидиотипического антитела по п.43 или 44 для детектирования уровня человеческого моноклонального антитела против СО25 в образце.
EA200500835A 2002-11-15 2003-11-14 Человеческие моноклональные антитела против cd25 и их применение EA013677B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42669002P 2002-11-15 2002-11-15
PCT/US2003/036126 WO2004045512A2 (en) 2002-11-15 2003-11-14 Human monoclonal antibodies against cd25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200500835A1 EA200500835A1 (ru) 2006-02-24
EA013677B1 true EA013677B1 (ru) 2010-06-30

Family

ID=32326400

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200500835A EA013677B1 (ru) 2002-11-15 2003-11-14 Человеческие моноклональные антитела против cd25 и их применение

Country Status (19)

Country Link
US (6) US7438907B2 (ru)
EP (1) EP1578397B1 (ru)
JP (1) JP4966497B2 (ru)
KR (2) KR20050086628A (ru)
CN (1) CN101124244B (ru)
AU (1) AU2003295471B2 (ru)
BR (1) BRPI0316282B8 (ru)
CA (1) CA2505991C (ru)
DK (1) DK1578397T3 (ru)
EA (1) EA013677B1 (ru)
ES (1) ES2401136T3 (ru)
HK (1) HK1077226A1 (ru)
IL (1) IL168304A (ru)
MX (1) MXPA05005160A (ru)
NO (1) NO20052889L (ru)
NZ (1) NZ540555A (ru)
PL (1) PL217296B1 (ru)
UA (1) UA90082C2 (ru)
WO (1) WO2004045512A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2745451C1 (ru) * 2017-05-25 2021-03-25 Инститьют Фор Бейсик Сайенс Антитела к человеческому интерлейкину-2 и их применение

Families Citing this family (146)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2441228A1 (en) 2001-03-23 2002-10-03 Aphton Corporation Combination treatment of pancreatic cancer
US20090191232A1 (en) 2001-05-04 2009-07-30 Gevas Philip C Combination therapy for the treatment of tumors
US20040009172A1 (en) * 2002-04-26 2004-01-15 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
US20090280065A1 (en) * 2006-04-10 2009-11-12 Willian Mary K Uses and Compositions for Treatment of Psoriasis
PL218992B1 (pl) * 2002-07-19 2015-02-27 Abbott Biotech Ltd Neutralizujące o wysokim powinowactwie izolowane ludzkie przeciwciało anty-TNFα, zastosowanie tego przeciwciała, kryształ zawierający ludzkie przeciwciało anty-TNFα i preparat zawierający ten kryształ
KR20050086628A (ko) * 2002-11-15 2005-08-30 젠맵 에이/에스 Ｃｄ25에 대한 인간 모노클로날 항체
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
BRPI0414688A (pt) * 2003-09-23 2006-11-28 Pdl Biopharma Inc tratamento de doença respiratória com anti-receptor de il-2
JP2008513536A (ja) 2004-09-22 2008-05-01 レセプター バイオロジックス インコーポレイテッド プロガストリンに対するモノクローナル抗体
BRPI0516470A (pt) * 2004-10-07 2008-09-09 Universitot Zuerich uso de um agente de bloqueio do interferon tipo i, e, método de prevenção e tratamento da psorìase
US20060165687A1 (en) * 2004-10-19 2006-07-27 Duke University Vaccine adjuvant
EP1819731A4 (en) * 2004-12-08 2013-02-13 Immunomedics Inc METHOD AND COMPOSITION FOR IMMUNOTHERAPY AND FOR THE DETECTION OF INFLAMMATORY AND DYSEGRATIVE IMMUNE DISEASES, INFECTION DISEASES, PATHOLOGICAL ANGIOGENESIS AND CANCER
KR20070102538A (ko) * 2005-02-08 2007-10-18 노파르티스 아게 Ｓ1ｐ 수용체 효능제/조절제와 면역억제성 약물의 조합에의한 항림프구 항체 유도
JP5837730B2 (ja) * 2005-02-10 2015-12-24 ベイラー リサーチ インスティテュートＢａｙｌｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 抗インターフェロンアルファモノクローナル抗体及び使用方法
SI2567976T1 (sl) * 2005-03-23 2017-11-30 Genmab A/S Protitelesa usmerjena proti cd38 za zdravljenje multiplega mieloma
GB0507696D0 (en) * 2005-04-15 2005-05-25 Novartis Ag Organic compounds
JP5129122B2 (ja) 2005-04-26 2013-01-23 トリオン ファーマ ゲーエムベーハー 癌治療のための抗体およびグルココルチコイドの組み合わせ
BRPI0610058A2 (pt) 2005-05-16 2010-05-25 Abbott Biotech Ltd uso de inibidor de tnf para tratamento da poliartrite erosiva
CA2609234C (en) * 2005-06-01 2014-04-22 Micromet Ag Anti-il2 antibodies
AU2006300234B2 (en) * 2005-10-14 2013-01-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agents for suppressing damage to transplanted islets after islet transplantation
KR101239051B1 (ko) 2005-10-21 2013-03-04 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 심장질환 치료제
AR057582A1 (es) * 2005-11-15 2007-12-05 Nat Hospital Organization Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos
TW200803894A (en) * 2005-11-25 2008-01-16 Univ Keio Prostate cancer therapeutic agents
BRPI0619056A2 (pt) 2005-11-28 2011-09-20 Genmab As anticorpo monovalente, método para preparar e produzir um antcorpo monovalente, construção de ácido nucleico, célula hospedeira, imunoconjugado, uso de um anticorpo monovalente, e, composição farmacêutica
CN104189907A (zh) 2006-01-27 2014-12-10 学校法人庆应义塾 伴有脉络膜血管生成的疾病的治疗药
EP2025346B1 (en) 2006-04-07 2016-08-10 Osaka University Muscle regeneration promoter
EP2666472A3 (en) 2006-04-10 2014-04-02 Abbott Biotechnology Ltd Uses and compositions for treatment of psoriatic arthritis
EP2010214A4 (en) 2006-04-10 2010-06-16 Abbott Biotech Ltd USES AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF RHEUMATOID ARTHRITIS
US9605064B2 (en) * 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
US20080131374A1 (en) * 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
EP2046383B1 (en) 2006-07-04 2014-11-19 Genmab A/S Cd20 binding molecules for the treatment of copd
JP5476122B2 (ja) 2006-09-26 2014-04-23 ゲンマブ エー／エス Ｃｄ３８発現腫瘍の併用処置法
US7939075B2 (en) 2007-01-11 2011-05-10 Philipps-Universitaet Marburg Human monoclonal anti-amyloid-beta antibodies
WO2008088902A2 (en) * 2007-01-17 2008-07-24 Yale University Attenuation of the adaptive immune response
MX2009007830A (es) * 2007-01-23 2009-10-07 Univ Shinshu Inhibidor de rechazo cronico.
NZ577858A (en) * 2007-01-29 2012-02-24 Valtion Teknillinen Method for producing novel ige based reagents
US9322035B2 (en) 2007-05-31 2016-04-26 Genmab A/S Recombinant IgG4 monovalent antibodies
EP2234633A1 (en) * 2007-12-21 2010-10-06 Ben Gurion University Of The Negev Research And Development Authority A method of treating neurodegenerative diseases
EP2300022A2 (en) 2008-04-25 2011-03-30 Duke University Regulatory b cells and their uses
KR101687032B1 (ko) 2008-05-07 2016-12-15 아고스 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 인간 인터페론-알파에 대한 인간화 항체
US10717781B2 (en) * 2008-06-05 2020-07-21 National Cancer Center Neuroinvasion inhibitor
UA109633C2 (uk) 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
EP2494062B1 (en) * 2009-10-28 2016-12-28 Janssen Biotech, Inc. Anti-glp-1r antibodies and their uses
WO2011133636A1 (en) 2010-04-20 2011-10-27 Cedars-Sinai Medical Center COMBINATION THERAPY WITH CD4 LYMPHOCYTE DEPLETION AND mTOR INHIBITORS
ES2932398T3 (es) 2010-05-28 2023-01-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Potenciador de la respuesta de las células T antitumorales
JP6093696B2 (ja) 2010-06-09 2017-03-08 ゲンマブ エー／エス ヒトｃｄ３８に対する抗体
JP6055404B2 (ja) 2010-06-15 2016-12-27 ゲンマブ エー／エス 組織因子に対するヒト抗体薬物結合体
US8637641B2 (en) 2010-07-29 2014-01-28 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
EP2600878A4 (en) 2010-08-04 2014-06-11 Univ Duke REGULATORY B-CELLS AND ITS USES
US9814740B2 (en) * 2010-12-21 2017-11-14 Duke University Methods and compositions combining immunotherapy with monocyte activation
CN106432506A (zh) 2011-05-24 2017-02-22 泽恩格尼亚股份有限公司 多价和单价多特异性复合物及其用途
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
CN103374074A (zh) * 2012-04-28 2013-10-30 中国科学院上海生命科学研究院 一种抗cd25单链抗体
BR112015000167B1 (pt) 2012-07-06 2021-11-23 Genmab B.V. Proteína dimérica, proteína, composição, kit de partes e seus usos, bem como método para aumentar a oligomerização em solução de uma proteína dimérica compreendendo um primeiro e segundo polipeptídeo, cada um compreendendo pelo menos as regiões ch2 e ch3 de uma cadeia pesada de igg1 humana e proteína dimérica variante
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
CA2880271C (en) 2012-08-13 2021-10-19 Genentech, Inc. Anti-jagged anitbodies and methods of use
US10017739B2 (en) 2012-09-06 2018-07-10 Duke University Methods of expanding and assessing B cells and using expanded B cells to treat disease
PT2906296T (pt) 2012-10-12 2018-06-01 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina-anticorpo
KR20200134340A (ko) 2013-01-10 2020-12-01 젠맵 비. 브이 인간 IgG1 Fc 영역 변이체 및 그의 용도
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
AU2014205086B2 (en) 2013-01-14 2019-04-18 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
AU2014207549B2 (en) 2013-01-15 2018-12-06 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
US20140302037A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
EP2968541A4 (en) 2013-03-15 2017-02-08 Zyngenia, Inc. Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
US10544187B2 (en) * 2013-03-15 2020-01-28 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10519242B2 (en) * 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP3097420A4 (en) * 2014-01-24 2018-01-17 Ntercept, LLC Methods and compositions for immune dis-inhibition
US11213583B2 (en) 2014-02-05 2022-01-04 Cedars-Sinai Medical Center Methods and compositions for treating cancer and infectious diseases
AP2016009475A0 (en) 2014-03-28 2016-09-30 Xencor Inc Bispecific antibodies that bind to cd38 and cd3
WO2015199534A1 (en) * 2014-06-26 2015-12-30 Erasmus University Medical Center Rotterdam Determining encapsulating peritoneal sclerosis
WO2016054522A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Ntercept, Llc Compositions and methods for inhibiting the biological activity of soluble biomolecules
CA2968447A1 (en) 2014-11-25 2016-06-02 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates and their use to treat neoplasms
PE20171324A1 (es) 2014-11-26 2017-09-11 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a cd3 y a antigenos tumorales
MX2017006918A (es) 2014-11-26 2018-01-25 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a cd3 y cd38.
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
CN104483493B (zh) * 2014-12-30 2016-09-28 青岛市市立医院 一种筛选咪唑立宾于免疫t细胞中药物作用靶位的方法
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
GB201507827D0 (en) * 2015-05-07 2015-06-17 Adc Therapeutics Sarl Diagnostic test
US11371066B2 (en) 2015-07-13 2022-06-28 Modular Genetics, Inc. Generation of acyl alcohols
WO2017019949A1 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Ntercept, Llc Modular compositions for scavenging soluble biomolecules and methods related thereto
US20170157215A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Jomoco, Corp. Compositions and methods to mitigate or prevent an immune response to an immunogenic therapeutic molecule in non-human primates
EP3387013B1 (en) 2015-12-07 2022-06-08 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and psma
EP3407916B1 (en) 2016-01-29 2023-12-20 Merck Sharp & Dohme LLC Phosphonate linkers and their use to facilitate cellular retention of compounds
CA3020204A1 (en) * 2016-04-07 2017-10-12 Cancer Research Technology Limited Anti cd25 fc gamma receptor bispecific antibodies for tumor specific cell depletion
RU2767357C2 (ru) 2016-06-14 2022-03-17 Ксенкор, Инк. Биспецифические антитела-ингибиторы контрольных точек
CA3029328A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
WO2018071919A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 Xencor, Inc. IL15/IL15Rα HETERODIMERIC FC-FUSION PROTEINS
US20180206726A1 (en) 2016-12-07 2018-07-26 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
CN110248668B (zh) 2016-12-15 2023-05-30 杜克大学 用于消耗调节性b10细胞的抗体和方法以及与免疫检查点抑制剂的联用
JP2020504177A (ja) 2017-01-04 2020-02-06 ナノティックス，エルエルシー 捕捉粒子をアセンブルするための方法
US11879014B2 (en) 2017-03-17 2024-01-23 Tusk Therapeutics Ltd. Method of treating cancer or depleting regulatory T cells in a subject by administering a human IGG1 anti-CD25 antibody
EP3600416B1 (en) 2017-03-30 2023-06-07 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
BR112019021680A2 (pt) 2017-04-20 2020-05-12 Adc Therapeutics Sa Terapia de combinação com conjugado anticorpo-fármaco anti-cd25??
CN108795858A (zh) * 2017-04-28 2018-11-13 深圳宾德生物技术有限公司 高抗癌活性t细胞的筛选方法和应用
WO2018203545A1 (ja) 2017-05-02 2018-11-08 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｉｌ－６及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法
CA3064681A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-cd25 adc
CA3066756A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 Cancer Advances Inc. Compositions and methods for inducing humoral and cellular immunities against tumors and cancer
CN111132733A (zh) 2017-06-30 2020-05-08 Xencor股份有限公司 含有IL-15/IL-15Rα和抗原结合结构域的靶向异源二聚体Fc融合蛋白
CN111094346A (zh) * 2017-07-06 2020-05-01 塔斯克疗法有限公司 用于肿瘤特异性细胞消耗的化合物和方法
EP3698808A4 (en) 2017-10-20 2021-07-14 Hyogo College Of Medicine MEDICAL COMPOSITION CONTAINING ANTI-IL-6 RECEPTOR ANTIBODIES FOR THE PREVENTION OF POSTOPERATIVE ADHESION
CN112272563A (zh) 2017-11-08 2021-01-26 Xencor股份有限公司 使用新颖抗pd-1序列的双特异性和单特异性抗体
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
KR20200100098A (ko) 2017-12-19 2020-08-25 젠코어 인코포레이티드 조작된 il-2 fc 융합 단백질
KR102083884B1 (ko) * 2018-02-19 2020-03-03 가톨릭대학교 산학협력단 이식 거부 질환 치료용 미니서클 벡터
CN112020515A (zh) 2018-03-13 2020-12-01 塔斯克疗法有限公司 用于肿瘤特异性细胞清除的抗-cd25
WO2019195623A2 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
KR20210003814A (ko) 2018-04-18 2021-01-12 젠코어 인코포레이티드 IL-15/IL-15Rα Fc-융합 단백질 및 TIM-3 항원 결합 도메인을 함유하는 TIM-3 표적화 이종이량체 융합 단백질
JP2021521784A (ja) 2018-04-18 2021-08-30 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＦｃ融合タンパク質とＰＤ−１抗原結合ドメインを含むＰＤ−１標的化ヘテロダイマー融合タンパク質およびそれらの使用
MX2020012418A (es) 2018-05-23 2021-04-28 Adc Therapeutics Sa Adyuvante molecular.
US20230009902A1 (en) 2018-06-20 2023-01-12 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue orginating from the endoderm
US20230041197A1 (en) 2018-06-20 2023-02-09 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
GB201811364D0 (en) 2018-07-11 2018-08-29 Adc Therapeutics Sa Combination therapy
WO2020072821A2 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
CA3120096A1 (en) * 2018-11-14 2020-05-22 Rubryc Therapeutics, Inc. Cd25 antibodies
WO2020106754A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
MX2021010390A (es) 2019-03-01 2021-11-17 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a enpp3 y cd3.
BR112021022682A2 (pt) 2019-05-14 2022-02-22 Provention Bio Inc Métodos e composições para prevenir diabetes do tipo 1
CA3142664A1 (en) 2019-06-10 2020-12-17 Adc Therapeutics Sa Combination therapy comprising an anti-cd25 antibody drug conjugate and a further agent
JP7245358B2 (ja) * 2019-06-10 2023-03-23 山東博安生物技術股▲ふん▼有限公司 抗ｃｄ２５抗体及びその適用
GB201917254D0 (en) 2019-11-27 2020-01-08 Adc Therapeutics Sa Combination therapy
WO2021119482A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
EP4151655A1 (en) 2020-05-14 2023-03-22 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Anti-cd25 antibodies, antigen-binding fragments thereof, and medical uses thereof
US11124568B1 (en) * 2020-08-19 2021-09-21 Vitruviae LLC CD3/CD25 antibodies for neuro-immune diseases
GB202015916D0 (en) 2020-10-07 2020-11-18 Adc Therapeutics Sa Combination therapy
WO2022173714A2 (en) * 2021-02-12 2022-08-18 Merck Sharp & Dohme Llc Antibodies that bind metapneumovirus, antigenic metapneumovirus proteins, and uses thereof
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
IL305736A (en) 2021-03-09 2023-11-01 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CLDN6
EP4305065A1 (en) 2021-03-10 2024-01-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
KR102604849B1 (ko) * 2021-05-11 2023-11-22 가톨릭대학교 산학협력단 항-cd25 항체, il-10 및 cxcr3를 발현하는 미니서클 벡터
AU2022302769A1 (en) 2021-06-29 2024-02-08 Adc Therapeutics Sa Combination therapy using antibody-drug conjugates
CA3228178A1 (en) 2021-08-05 2023-02-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses
CA3230934A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cmet antibodies and their uses
CA3230933A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-lamp1 antibodies and their uses
CN115197321B (zh) * 2022-06-02 2023-08-18 四川大学 靶向cd25的抗体及其用途
WO2024006961A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Neoleukin Therapeutics, Inc. Neo-2/15 variants and uses thereof for preferentially stimulating t-regulatory cells
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6383487B1 (en) * 1990-03-16 2002-05-07 Novartis Ag Methods of treatment using CD25 binding molecules

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE272471C (ru)
US4845198A (en) * 1984-05-21 1989-07-04 Immunex Corporation Hybridoma antibody which binds IL-2 receptor
US4578335A (en) * 1984-05-21 1986-03-25 Immunex Corporation Interleukin 2 receptor
US5356795A (en) * 1984-07-25 1994-10-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Cloning cDNAs for the human interleukin-2 receptor (55 RD protein)
US5317087A (en) * 1984-11-13 1994-05-31 Immunex Corporation Purification of the IL-2 receptor
US4816565A (en) * 1985-08-13 1989-03-28 Tasuku Honjo Interleukin 2 receptor and a method for production thereof
US5336489A (en) * 1985-09-05 1994-08-09 The Beth Israel Hospital Association Treatment of allograft rejection with IL-2 receptor-specific cytotoxins
US5011684A (en) * 1985-09-05 1991-04-30 Beth Israel Hospital Association Lysing or blocking unwanted cells with IL-2 receptor-specific binding substance
FR2616330B1 (fr) 1987-06-12 1990-12-21 Immunotech Sa Agent actif et medicament en contenant destines a prevenir ou a combattre le rejet de greffe d'organe chez l'homme
ATE137119T1 (de) 1987-08-17 1996-05-15 Us Commerce Verfahren zur behandlung der bösartigen und autoimmunen krankheiten beim menschen
DE68917138T2 (de) 1988-05-19 1995-02-23 Beth Israel Hospital Toleranzinduktion gegenüber einem fremdantigen.
US5152980A (en) * 1988-05-19 1992-10-06 The Beth Israel Hospital Association Induction of tolerance to a foreign antigen IL-2 receptor-binding substances
DD272471A1 (de) 1988-06-13 1989-10-11 Univ Leipzig Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen den il-2-rezeptor humaner t-lymphozyten
IL162181A (en) * 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
FR2649488A1 (fr) 1989-07-07 1991-01-11 Inst Nat Sante Rech Med Fragments d'anticorps monoclonaux specifiques de la presence de leucocytes actives - leur procede d'obtention et leur application dans le cas de rejet de greffe
FR2652746A1 (fr) 1989-10-06 1991-04-12 Merieux Inst Application d'agents actifs pour la preparation d'un medicament destine au traitement de lymphomes ou assimiles.
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
DE4028955A1 (de) 1990-09-12 1992-03-19 Boehringer Mannheim Gmbh Monoklonale antikoerper gegen den interleukin 2-rezeptor
FR2672291A1 (fr) 1991-01-31 1992-08-07 Inst Nat Sante Rech Med Composition d'anticorps diriges contre le recepteur de l'interleukine-2 humaine ou animale.
CA2104958A1 (en) 1991-03-07 1992-09-08 Jean C. Nichols Use of cell surface receptor targeted molecules for the treatment of viral diseases
JP3105629B2 (ja) 1991-04-23 2000-11-06 サングスタット メディカル コーポレイション 特異的結合ペアのメンバーの細胞活性調節接合体
US5326559A (en) 1991-05-16 1994-07-05 Miller D Douglas Treatment of accelerated atheosclerosis with interleukin-2 receptor targeted molecules
WO1992020364A1 (en) 1991-05-17 1992-11-26 Seragen, Inc. Cytokine receptor targeted molecules for treatment of meoplastic cell growth
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JPH08140528A (ja) * 1993-12-03 1996-06-04 Genpharm Internatl Inc 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
ES2322975T3 (es) 1998-01-15 2009-07-02 Center For Molecular Medicine And Immunology Componente direccionador biespecifico que comprende un anticuerpo contra el antigeno carcinoembrionario (cea) y la region de union a ligando de la subunidad alfa del receptor de il-13.
AU2793099A (en) 1998-02-27 1999-09-15 Cli Oncology, Inc. Methods and compositions using tumor specific soluble interleukin-2 receptor alpha molecules
JP2000022337A (ja) * 1998-06-30 2000-01-21 Matsushita Electric Works Ltd 多層配線板及びその製造方法
US6620189B1 (en) 2000-02-28 2003-09-16 Radiant Medical, Inc. Method and system for control of a patient's body temperature by way of a transluminally insertable heat exchange catheter
US6472179B2 (en) * 1998-09-25 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
WO2000025816A1 (en) 1998-10-30 2000-05-11 The University Of Miami Treatment of hepatitis c by administration of anti-il-2 receptor monoclonal antibody and an antiviral compound
GB9825632D0 (en) * 1998-11-23 1999-01-13 Novartis Ag Organic compounds
FR2793691B1 (fr) 1999-05-21 2003-10-03 Hippocampe Utilisation d'anticorps reconnaissant le recepteur de l'interleukine-2 dans la prevention et/ou le traitement des infections par les virus du sida
WO2002007783A2 (en) 2000-07-20 2002-01-31 Regents Of The University Of Minnesota Radiolabeled immunotoxins
ES2309167T3 (es) * 2001-02-19 2008-12-16 Merck Patent Gmbh Metodo para identificar epitotes de celulas t y metodo para preparar moleculas con inmunogenicidad reducida.
CA2445168A1 (en) * 2001-04-24 2002-10-31 Bayer Corporation Human timp-1 antibodies
EP1517921B1 (en) * 2002-06-28 2006-06-07 Domantis Limited Dual specific ligands with increased serum half-life
KR20050086628A (ko) 2002-11-15 2005-08-30 젠맵 에이/에스 Ｃｄ25에 대한 인간 모노클로날 항체
WO2007000169A2 (en) * 2005-06-29 2007-01-04 Genmab A/S Non-human mammalian arthritis model featuring human antibodies against citrullinated proteins
JP2009501913A (ja) * 2005-07-21 2009-01-22 ゲンマブ エー／エス Ｆｃ受容体と結合する抗体原薬に関する効力アッセイ
JP4316600B2 (ja) 2006-11-06 2009-08-19 本田技研工業株式会社 吸気装置のレゾネータ
US8168185B2 (en) * 2007-01-17 2012-05-01 Merck Serono Sa Process for the purification of anti CD-25 antibodies
US8802089B2 (en) * 2008-01-03 2014-08-12 Genmab A/S Monoclonal antibodies against CD32B
UA109633C2 (uk) * 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
JP6055404B2 (ja) * 2010-06-15 2016-12-27 ゲンマブ エー／エス 組織因子に対するヒト抗体薬物結合体
US9334331B2 (en) * 2010-11-17 2016-05-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Bispecific antibodies
JP6261341B2 (ja) * 2011-02-01 2018-01-17 ゲンマブ エー／エス Ｃｄ７４に対するヒト抗体および抗体−薬物コンジュゲート
US8790651B2 (en) * 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
WO2013059885A2 (en) * 2011-10-28 2013-05-02 Cephalon Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
WO2014028502A1 (en) * 2012-08-13 2014-02-20 ImmunGene Inc. Engineered antibody-interferon fusion molecules for treatment of autoimmune diseases
PT2906296T (pt) * 2012-10-12 2018-06-01 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina-anticorpo
CA2968447A1 (en) * 2014-11-25 2016-06-02 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates and their use to treat neoplasms
GB201507827D0 (en) * 2015-05-07 2015-06-17 Adc Therapeutics Sarl Diagnostic test
GB201513607D0 (en) * 2015-07-31 2015-09-16 Feingold Jay M Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6383487B1 (en) * 1990-03-16 2002-05-07 Novartis Ag Methods of treatment using CD25 binding molecules

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JAKOBOVITS A.. The Long-Awaited Magic Bullets: Therapeutic Human Monoclonal Antibodies from Transgenic Mice. Expert Opinion on Investigational Drugs. April 1998, Vol. 7, No. 4, pages 607-614, see entire document *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2745451C1 (ru) * 2017-05-25 2021-03-25 Инститьют Фор Бейсик Сайенс Антитела к человеческому интерлейкину-2 и их применение

Also Published As

Publication number Publication date
NO20052889D0 (no) 2005-06-14
CA2505991C (en) 2018-02-27
US10703818B2 (en) 2020-07-07
AU2003295471B2 (en) 2011-08-25
CN101124244A (zh) 2008-02-13
BRPI0316282B8 (pt) 2021-05-25
EA200500835A1 (ru) 2006-02-24
US8961968B2 (en) 2015-02-24
CN101124244B (zh) 2012-10-10
JP2006523433A (ja) 2006-10-19
US20040170626A1 (en) 2004-09-02
DK1578397T3 (da) 2013-03-11
PL217296B1 (pl) 2014-07-31
US7438907B2 (en) 2008-10-21
EP1578397A2 (en) 2005-09-28
CA2505991A1 (en) 2004-06-03
WO2004045512A3 (en) 2005-11-24
JP4966497B2 (ja) 2012-07-04
BRPI0316282B1 (pt) 2019-04-30
EP1578397A4 (en) 2007-05-09
US9598493B2 (en) 2017-03-21
KR20120056863A (ko) 2012-06-04
UA90082C2 (ru) 2010-04-12
WO2004045512A2 (en) 2004-06-03
US8182812B2 (en) 2012-05-22
NZ540555A (en) 2008-04-30
PL377794A1 (pl) 2006-02-20
AU2003295471A1 (en) 2004-06-15
MXPA05005160A (es) 2005-07-22
BR0316282A (pt) 2005-10-11
ES2401136T3 (es) 2013-04-17
US20120244069A1 (en) 2012-09-27
IL168304A (en) 2010-11-30
EP1578397B1 (en) 2012-12-26
HK1077226A1 (en) 2006-02-10
KR20050086628A (ko) 2005-08-30
US20150259424A1 (en) 2015-09-17
US20210107985A1 (en) 2021-04-15
KR101329843B1 (ko) 2013-11-14
US20090081219A1 (en) 2009-03-26
US20170240640A1 (en) 2017-08-24
NO20052889L (no) 2005-07-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA013677B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против cd25 и их применение
US20240132603A1 (en) Ccr8 antibody and application thereof
US10501555B2 (en) Humanized anti-trop-2 monoclonal antibodies and uses thereof
KR101348472B1 (ko) Ｃｄ20에 대한 인간 모노클로날 항체
CN101679523B (zh) 全人源抗vap-1单克隆抗体
US20150191543A1 (en) Engineered antibody fragments for targeting and imaging cd8 expression in vivo
EA016609B1 (ru) Рекомбинантные моновалентные антитела и способы их получения
KR20210142638A (ko) Cd3 항원 결합 단편 및 이의 응용
EP3821006A2 (en) Antibodies specific to folate receptor alpha
CN111093692A (zh) 治疗淀粉样沉积疾病的嵌合抗体
EA015897B1 (ru) Применение человеческого моноклонального антитела к ил-15 в составе композиции и лекарственного препарата (варианты), композиция и лекарственный препарат, его включающие
CN115925918A (zh) 特异性识别c5a的抗体及其应用
CN114874330A (zh) 靶向单链抗体的中和性单克隆抗体
AU2019204903A1 (en) Human monoclonal antibodies against CD20

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM