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Die vorliegende Erfindung betrifft die Prävention von ungewollten Immunreaktionen auf
Fremdantigene.
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Fremdantigene (z.B. rekombinante Proteine), die für therapeutische Zwecke
Säugetieren, z.B. Menschen, verabreicht werden, können zu ungewollten
Immunreaktionen führen, d.h. zur Bildung von Antikörpern gegen das Fremdantigen.
Solche Immunreaktionen können selbst dann auftreten, wenn das Antigen die
rekombinante Form eines in der Natur vorkommenden menschlichen Proteins, z.B. des
Gewebe-Plasminogenaktivators, ist, da ein solches Protein, selbst wenn es die gleiche
Aminosäuresequenz wie das natürliche Protein aufweist, in einer solchen Weise
glykosyliert sein kann, daß das Protein dem Immunsystem als fremd erscheint. Der
hierin verwendete Ausdruck "Fremdantigen" bezieht sich daher auf jede beliebige
Substanz, die mit einer im in Behandlung befindlichen Säugetier natürlich vorhandenen
Substanz nicht identisch ist. Ein Ziel der Medizin besteht darin, therapeutische
Fremdagenzien wie z.B. rekombinante Proteine verabreichen zu können, ohne eine
ungewollte Immunreaktion hervorzurufen, d.h. eine Toleranz gegenüber dem
therapeutischen Agens zu induzieren. (Der hierin verwendete Ausdruck Toleranz
bezieht sich auf die Unterdrückung der Fähigkeit, eine humorale Immunreaktion auf ein
Fremdantigen bei einer erneuten Herausforderung durch dieses Antigen zu zeigen,
selbst nachdem die Substanz, welche die Unterdrückung induziert, aus dem Blutstrom
ausgeschieden wurde).
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In einem ersten Aspekt der Erfindung stellen die Autoren der Erfindung ein
Hybridprotein bereit, umfassend einen ersten und zweiten kovalent miteinander
verbundenen Proteinanteil, wobei der genannte erste Anteil den enzymatisch aktiven
Anteil eines Toxinmoleküls und der genannte zweite Anteil einenAnteil von interleukin
2 (nachstehend "IL-2") oder ein IL-2 rezeptorbindendes Fragment oder ein Analog
irgendeines dieser beiden umfaßt, sowie ein Fremdantigen zur begleitenden
Anwendung (d.h. zur gleichzeitigen Verabreichung an einen tierischen oder
menschlichen Patienten oder zur Verabreichung des genannten Hybridproteins nach
dem genannten Fremdantigen an einen menschlichen oder tierischen Patienten,
vorzugsweise innerhalb von 7 Tagen ab Verabreichung des Fremdantigens) zur Therapie
oder Prophylaxe.
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In einem zweiten Aspekt der Erfindung stellen die Autoren ein Hybridprotein bereit,
umfassend einen ersten und zweiten kovalent miteinander verbundenen Proteinanteil,
wobei der genannte erste Anteil den enzymatisch aktiven Anteil eines Toxinmoleküls
und der genannte zweite Anteil einen Anteil von Interleukin-2 (nachstehand "IL-2") oder
ein IL-2 rezeptorbindendes Fragment oder ein Analog irgendeines dieser beiden umfaßt,
sowie ein Fremdantigen zur begleitenden Anwendung (d.h. zur gleichzeitigen
Verabreichung an einen tierischen oder menschlichen Patienten oder zur Verabreichung
des genannten Hybridproteins nach dem genannten Fremdantigen an einen
menschlichen oder tierischen Patienten, vorzugsweise innerhalb von 7 Tagen ab
Verabreichung des genannten Fremdantigens), wodurch die humorale Immunreaktion
des genannten tierischen oder menschlichen Patienten auf eine nachfolgende
Herausforderung durch dieses Antigen durch Zerstörung eines ausreichenden Ausmaßes
von IL-2-rezeptorpositiven Zellen, vorzugsweise Helfer T-Zellen, unterdrückt wird. Das
Toxinmolekül ist vorzugsweise ein bakterielles Toxin, am bevorzugtesten Diphterietoxin
oder alternativ dazu Pseudomonas Exotoxin.
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Die Toleranz ist vorzugsweise permanent; die erneute Herausforderung durch das
Fremdantigen zu einem beliebigen Zeitpunkt, selbst nach dem Ausscheiden der
Substanz aus dem Blutstrom des Säugetiers, führt zu einer Unterdrückung der Fähigkeit
des Säugetiers, eine humorale Immunreaktion auf das Antigen zu zeigen. Der
antigenspezifische induzierte Toleranzzustand, der gemäß der vorliegenden Erfindung
erreicht wird, kann die krankheitsbezogene Therapie deutlich verbessern, z.B. die
Kurzzeit- oder Langzeittherapie, welche die Verabreichung eines monoklonalen
Antikörpers, eines rekombinanten Proteins oder anderer medizinisch nützlicher
Fremdantigene umfaßt.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Die Toleranz gegen über der Fremdantigen-Trinitrobenzol sulfonsäure (TNBS) wurde als
die Unfähigkeit eines Säugetiers definiert, nachdem es durch eine normalerweise
Immunreaktion-hervorrufende (d.h. Antikörper-stimulierende) TN BS-Dosis 30 Tage nach
der Verabreichung sowohl von TNBS als auch der toleranzinduzierenden Substanz
erneut herausgefordert wurde, eine humorale Reaktion auf die erneute Herausforderung
zu zeigen, wie sich dies in der Abwesenheit von zirkulierenden anti-TNBS Antikörpern
im Blutstrom des Säugetiers nach der erneuten Herausforderung äußert.
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Die Toleranz wurde im allgemeinen gemäß der folgenden Schritte erreicht und
aufgezeigt: i) Gewinnung der toleranzinduzierenden Substanz; 2) Immunisierung der
Versuchssäugetiere (Mäuse) mit TNBS; 3) Verabreichung der toleranzinduzierenden
Substanz an die Versuchssäugetiere; 4) erneute Herausforderung der Versuchssäugetiere
durch TNBS; 5) Bestimmung der normalen Reaktion der mit der toleranzinduzierenden
Substanz behandelten Versuchssäugetiere auf eine Vielzahl an Antigenen, die den
Tieren asynchron mit der toleranzinduzierenden Substanz verabreicht werden; und 6)
Charakterisierung der Immunreaktion oder ihres Mangels nach der erneuten
Herausforderung durch Quantifizierung der anti-TNBS Antikörper und Charakterisierung
der T-Lymphozyten-Oberflächenmarker.
Herstellung eines chimären IL-2 Toxin Fusionsproteins
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Eine erfindungsgemäße Ausführungsform verwendet als IL-2-rezeptorpositive
zellzerstörende Substanz ein chimäres IL-2-rezeptorspezifisches Toxin. Die Expression
des IL-2 Rezeptors ist ein erforderlicher - wenn auch vorübergehender - Schritt auf dem
herömmlichen Weg der T-Zellaktivierung; somit findet man den IL-2 Rezeptor auf neu
aktivierten Helfer T-Zellen, doch nicht auf älteren aktivierten T-Zellen und ruhenden T-
Zellen.
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Das Fusionsprotein von 68.086 Dalton, IL-2-Toxin, wurde von einem genetisch
konstruierten Hybridgen exprimiert, das sowohl für einen Teil des Diphterietoxins als
auch für IL-2 kodiert, worin die DNA, die für die allgemeine eukaryotische
rezeptorbindende Domäne des Diphterietoxins kodiert, mit für IL-2 kodierender DNA
ersetzt wurde, wobei man rekombinante DNA-Verfahren anwendete, wie sie bei
Murphy US PS Nr. 4.675.382 beschrieben sind. Die genetische Konstruktion erfolgte
unter der Leitung von John R. Murphy von University Hospital, Boston, MA wie folgt.
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Der Diphterie toxin-bezogene Anteil des Fusionsgens befand sich auf dem Plasmid
pABC508 (Bishai et al, 1987, J.Bacteriol. 169: 1554). Dieses Plasmid trägt die
genetische Information, die für den Diphterie tox-Promotor und das tox-Strukturgen
kodiert, durch Aminosäure Ala&sub4;&sub8;&sub5;. Der Bereich des toxGens, das für Val&sub4;&sub8;&sub3; - His&sub4;&sub8;&sub4;
- Ala&sub4;&sub8;&sub5; kodiert, ist auch durch eine einzelne Sphl Restriktionsendonukleasestelle
definiert. Der IL-2 Anteil des Fusionsgens wurde in vitro synthetisiert und in dem
pUC18 Vektor kloniert (pUC18 ist bei den Bethesda Research Labs, Bethesda, MD
erhältlich). Die Sequenz des IL-2 Gens ist wohl bekannt und beiTaniguchi et al, US PS
Nr. 4.738.927, angeführt, die hierin durch Verweis aufgenommen ist. Durch das
Konstruieren wurde das 5'-Ende des synthetischen IL-2 Gens durch eine Sphl
Restriktionsstelle auf Plasmid pDW15 definiert, um die Konstruktion des
Toxin/Wachstumsfaktor-Fusionsgens zu erleichtern. Das chimäre Diphterie
toxinbezogene IL-2 Fusionsgen wurde durch Digerieren von pDW15 mit Sphl und Sall,
Reinigen des synthetischen IL-2 Gens mit 428 bp durch Agarosegelelektrophorese und
erneutes Klonieren des Fragments in Sphl- und Sall-digeriertes pABC508 konstruiert. Die
Sphl Restriktionsstelle auf dem 5'-Ende des synthetischen IL-2 Gens wurde solcherart
positioniert, daß der translationale Leserahmen durch die Diphterietoxin/IL-2
Fusionsverbindung bewahrt bleibt, sodaß Pro&sub2; der reifen Form von IL-2 mit Ala&sub4;&sub8;&sub5; von
Diphterietoxin durch eine Peptidbindung verbunden wird.
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Nach der Ligierung und Transformation wurden mehrere Klone von E.coli isoliert, die
Plasmide enthielten, welche die für die Toxin-Wachstumsfaktorgenfusion erwarteten
Restriktionsendonuklease-Digerierungsmuster aufwiesen. Einer dieser Stämme wurde
ausgewählt und das rekombinante Plasmid als pABI508 bezeichnet. Um sicherzustellen,
daß der korrekte translationale Leserahmen für den IL-2 Anteil der Genfusion nach dem
Zusammenbau des intakten chimären Toxingens beibehalten wird, wurde die
Nukleotidsequenz des IL-2 Abschnitts der Chimäre durch die Fusionsverbindung in den
Toxinanteil des rekombinanten Gens bestimmt. Die DNA-Sequenz und die abgeleitete
Aminosäuresequenz im Bereich der Toxin/T-Zellenwachstumsfaktor-Fusionsverbindung
zeigten auf, daß der IL-2 Leserahmen beibehalten wurde.
Expression und partielle Reinigung von IL-2 Toxin
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Klonierte Diphterie tox-Genprodukte, die eine funktionale Signalsequenz aufweisen,
werden exprimiert und zum periplasmischen Anteil von E.coli K-12 exportiert. E.coli
(pABI508) wurde in 10-l Volumina gezüchtet, und periplasmische Extrakte wurden
hergestellt und durch Polyacrylamidgelelektrophorese und Immunblotting analysiert.
Man stellte fest, daß ein einziges Protein von Mr 68.000 mit monoklonalen Antikörpern
zu rekombinantem IL-2 (rIL-2) immunreaktiv war.
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Anti-IL-2 wurde als Immunaffinitätsmatrix zur Reinigung von IL-2 Toxin verwendet.
Konzentrierte periplasmische Extrakte aus E.coli (pABI508) wurden äuf eine anti-IL-2
Säule aufgebracht, die Säule wurde gründlich gewaschen und IL-2-Toxin mit 4 M
Guanidinhydrochlorid eluiert. Typischerweise führt die Immunaffinitätschromatographie
zu Präparaten von IL-2-Toxin, die zu 50-70% rein sind; dies wird durch
Laserdensitometrie von SDS-Polyacrylamidgels gemessen, die Coomassi Blue-gefärbt
waren.
Toleranzinduktion unter Verwendung von IL-2-Toxin
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Tiere BALB/c Mäuse wurden aus dem Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME
gewonnen und dann in Tiereinrichtungen im Brigham and Women's Hospital, Boston,
MA gehalten. Alle untersuchten Mäuse waren 5 bis 10 Wochen alte Männchen.
Immunisierung von Mäusen mit Hapten
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Die Mäuse wurden mit einer 10 mm TNBS Lösung in 0,5 M phosphatgepufferter
Salzlösung (PBS) bei einem pH-Wert von 7,2 bis 7,4 immunisiert, die durch eine
subkutane Injektion von 0,1 ml bilateral in den Rücken verabreicht wurde. 7 Tage nach
der Immunisierung wurden diese Mäuse durch 25 ul der gleichen Lösung in die rechte
Pfote herausgefordert. 30 Tage nach der Immunisierung wurden diese Tiere mit 0,1 ml
der gleichen, durch subkutane Injektion bilateral in den Rücken verabreichten Lösung
erneut herausgefordert.
Verabreichung von IL-2-Toxin
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IL-2-Toxin ist sowohl für Mäuse- als auch für menschliche T-Zellen, die Oberflächen-IL-
2 Rezeptoren hoher Affinität tragen, selektiv cytotoxisch, während Zellen, die solche
Rezeptoren nicht exprimieren, gegenüber dem Wirken von IL-2-Toxin resistent sind. Die
Mäuse bekamen in täglichen Abständen vom Zeitpunkt der Immunisierung bis Tag 7
intraperitoneale (IP) Injektionen mit einer einzigen Dosis IL-2-Toxin (5 pg pro Tier) oder
CRM45, einer Kontrollsubstanz (5 pg pro Tier), die aus einer nichttoxischen
Mutantenform von Diphterietoxin mit einem Molekulargewicht von 45.000 Dalton
bestand, das die normale rezeptorbindende Domäne des Toxins nicht aufweist.
Charakterisierung von IL-2-toxininduzierter Toleranz
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Um die Wirkung von IL-2-toxininduzierter Toleranz zu charakterisieren, wurden zwei
Assays durchgeführt: erstens wurden die monodispergierten Lymphknotenzellen der zur
Antigen-herausgeforderten Pfote ipsilateralen Gliedmaße mit T-Zellen-Untergruppe und
p55 IL-2R-Markern unter Verwendung von M7/20 monoklonalem Antikörper
phänotypisiert, um den p55 IL-2- Rezeptorzellenoberflächenmarker nachzuweisen;
zweitens wurden die zirkulierenden anti-TNBS-Antikörper mittels eines ELISA-Assays
gemessen.
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Zwei monoklonale Antikörper wurden zum Nachweisen von T-Zellen-
Oberflächenmarkern verwendet, der M7/20 monoklonale Antikörper, der für die p55-
Untereinheit des IL-2 Rezeptors spezifisch ist und ein monoklonaler Kontrollantikörper,
RA3-2C2, der für prä-B Zellen und einige ruhende B-Zellen spezifisch ist und daher die
neu aktivierten IL-2 rezeptorpositiven Zellen nicht nachweist. Diese monoklonalen
Antikörper wurden gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt.
Herstellung und Verabreichung monoklonaler Antikörper
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Die Herstellung und das anfängliche Screenen monoklonaler Antikörper, um jene zu
ergeben, die für den IL-2 Rezeptor spezifisch sind, kann nach dem Verfahren von
Uchiyama et al., 1981, J.Immunol. 126: 1393 erfolgen. Dieses Verfahren läßt sich wie
folgt zusammenfassen.
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Menschliche kultivierte T-Lymphozyten werden in Säugetiere, z.B. Mäuse, injiziert, die
Milz der immunisierten Tiere wird entfernt und die Milzzellen getrennt und mit
unsterblichen Zellen verschmolzen, z.B. Mäuse- oder menschliche Myelomazellen, um
Hybridoma zu bilden. Die Hybridomakultur-Überstände werden dann hinsichtlich jener
gescrennt, die Antikörper enthalten, die für den IL-2 Rezeptor spezifisch sind, wobei ein
komplementabhängiger Cytotoxizitätstest zur Anwendung kommt. Menschliche T-
Lymphozyten und EBV-transformierte B-Lymphozyten werden mit &sup5;¹Cr Natriumchromat
markiert und als Zielzellen verwendet. Wenn die Zielzellen in Gegenwart eines
Komplements mit Antikörperenthaltenden Kulturüberständen inkubiert werden, sieht
man, daß nur jene Zellen, die durch Antikörper gebunden sind, lysieren und &sup5;¹Cr
freisetzen. Die Überstände werden gesammelt und die Menge an vorhandenem &sup5;¹Cr
mittels eines Gammazählers bestimmt. Jene Überstände, die gegenüber den neu
aktivierten (d.h. IL-2 Rezeptor tragenden) T-Lymphozyten, aber nicht älteren aktivierten
T- oder B-Lymphozyten Toxizität zeigen, werden ausgewählt und dann einem weiteren
Screenschritt unterworfen, um jene Überstände auszuwählen, die Antikörper enthalten,
der mit dem IL-2 Rezeptor spezifisch reaktiv ist; ein solcher Antikörper sorgt für eine
Immunausfällung des Glykoprotein IL-2 Rezeptors von 50 kd (ausführlich beschrieben
in Leonard et al., 1983, P.N.A.S. USA 80: 6957). Der gewünschte anti-IL-2
Rezeptorantikörper wird mittels herkömmlicher Verfahren von den Überständen
gereinigt.
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Der verwendete monoklonale Antikörper war Antikörper M7/20, der in Gaulton et al.
(1985) Clin. Immunol. and Immunopath 36: 18 beschrieben ist. M7/20 ist ein
monoklonaler Ratten-Antimaus K, mu, Ig-Antikörper, der für den IL-2 Rezeptor
spezifisch ist. M7/20 wurde aus den Kulturüberständen der in serenfreien Medien
gezüchteten Zellen gereinigt (Hanna Labs, Berkeley, CA). Die Überstände wurden mit
40-50% gesättigtem Ammoniumsulfat ausgefällt, dialysiert, über DEAE Affi-Gel Blue
(BioRad, Richmond, VA) in 20 mM NaCl geschickt und das Eluat auf Sephadex G-200
fraktioniert (Pharmacia, Piscataway, NJ) und in 20 mM Tris (pH-Wert 7,2), 250 mM
NaCl, 0,5% n-Butanol laufen gelassen. Die Antikörperreinheit wurde durch SDS-Page
Gelelektrophorese beurteilt. Der monoklonale Kontrollantikörper, RA3-2C2, wurde
durch die oben beschriebene Verfahrensweise von Zellen gereinigt, die von der
American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten wurden.
Phänotypisieren von Lymphknotenzellen
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Einzelzell- (10&sup6; Zellen/Probe) Suspensionen von ableitenden paraortischen
Lymphknoten der 7 Tage TNBS-herausgeforderten Lymph- oder Milzzellen aus IL-2-
Toxin-behandelten und Kontrollmäusen wurden mit einer sättigenden Menge entweder
von anti-L3T4 (hergestellt aus dem Hybridoma GK1.5, American Type Culture
Collection Zugriffsnummer T1B207, Rockville, MD.), einem Ratten IgG2b Mab, oder
anti-Lyt-2 (aus dem Hybridoma 53-6.72, A.T.C.C. Zugriffsnummer T1B195), einem
Ratten IgG2a, in 50 ul PBS bei einem pH-Wert von 7,4 gefärbt, die 20%
wärmeinaktiviertes Mäuseserum (Cappel Laboratories, West Chester, PA) gemeinsam
mit 0,1 % Natriumazid (PBS-S) enthielt. Die Zellen wurden mit einem
Fluoresceinmarkierten Kaninchen-Antiratten-IgG (Cappel Laboratories) in 50ul PBS-S gegengefärbt.
Biotinylierter gereinigter M7/20 wurde dann zum Zellpräparat (50 ul) in PBS-S
hinzugefügt und mit Phycoerythrin-Avidin in PBS-S (Becton-Dickinson, Mountain View,
CA) gegengefärbt. Alle Inkubationen erfolgten auf Eis über einen Zeitraum von 30
Minuten, und die Zellen wurden dreimal in kalter PBS gewaschen und bis zur Analyse
im Dunkeln bei 4ºC gehalten. Die Zellen wurden auf einem FACS-1 Zellanalysator
(Bedon-Dickinson FACS Systems, Mountain View, CA) unter Verwendung eines
Consort 30 Computerprogramms, das von Bedon-Dickinson bereitgestellt wurde,
analysiert. Das Hintergrundfärben wurde durch Inkubieren der Zellen mit FITC-Hasen-
Antiratten-Ig und anschließend mit Biotin-markiertem Schaf-Antiratten-Ig und
Phycoerythrin-Avidin bestimmt.
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IL-2-Toxin richtete sich selektiv gegen IL-2 Rezeptor-tragende T-Zellen in ableitenden
Lymphknoten und eliminierte diese. Wie durch die Zweistrahlfluß-cytometrische
Analyse bestimmt, verringerte sich bis zum Tag 7 der Prozentsatz von CD4&spplus; p55&spplus; IL-
2R&spplus; Zellen von 14% in immunisierten, nicht behandelten Mäusen auf 5% in TNBS-
immunisierten IL-2-Toxin-behandelten Tieren. In ähnlicher Weise wurden die Cb8&spplus;
p55&spplus; IL-2R&spplus; Zellen bis zum Tag 7 von 18% auf 5% abgereichert. IL-2 Toxin war so
wirkungsvoll, daß es die Zahl von p55&spplus; IL-2R&spplus; T-Zellen auf Werte verringerte, die den
in den nicht immunisierten Mäusen nachgewiesenen Werten ähnelten (3% für CD4&spplus;
und 2% für CD8&spplus; Zeilen). Hingegen konnte man fast keine Verringerung in der IL-2
Rezeptorexpression in Milzzellen nach der TNB-Immunisierung in
IL-2-Toxinbehandelten Mäusen feststellen, und der niedrige Prozentsatz von IL-2R&spplus; Zellen wies
gegenüber den nicht immunisierten Tieren keinen bedeutsamen Unterschied auf.
Quantifizierung zirkulierender Antikörper
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Um das Ausmaß zu messen, in dem die IL-2-Toxinbehandlung einen Toleranzzustand
hinsichtlich der humoralen Immunität induziert, wurden die zirkulierenden
antigenspezifischen Antikörper anhand des Serums quantifiziert, das aus den Mäusen an
den Tagen 0, 7 und 30 gewonnen wurde. Der Titer von anti-TNBS-Immunoglobulinen,
die im Serum von IL-2-Toxin-behandelten, TNBS-immunisierten Mäusen vorhanden
waren, wurde durch einen Festphasen-Enzym-verbundenen Immunassay (ELISA)
gemessen. Polystyrol-Mikrotiterplatten mit 96 Näpfen (COSTAR, Cambridge, MA)
wurden mit 40 ng gereinigter TNBS (50 ul/Napf) in einem Boratpuffer (0,05 M, pH-Wert
8,6) über Nacht bei 4ºC beschichtet. Die Platten wurden dann mit 3% Rinder-
Serumalbumin (BSA) in PBS über einen Zeitraum von 1 Stunde bei 25ºC inkubiert.
Vierfache Verdünnungen von Mäuseserum im Bereich von 1:50 bis 1:12.800,
suspendiert in 1 % BSA, 0,05% Tween-80, PBS (Verdünnungspuffer) (50 ul), wurden
über einen Zeitraum von 4 Stunden bei 25ºC jedem Napf zugegeben. Die Näpfe
wurden dann mit (100 ul) PBS 1 % Tween-80xl und PBSx2 gewaschen. Gebundenes
Serum IgG wurde durch Inkubieren der Näpfe mit einem Protein A-alkalische
Phosphatase-Konjugat (ZYMED) (1:3.000 verd.) in einem Verdünnungspuffer über Nacht
bei 4ºC nachgewiesen. Nach dem Waschen der Platten wurde gebundenes alkalische
Phosphatase-Konjugat durch die Zugabe von 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat (Sigma)
nachgewiesen. Die optische Dichte (OD) wurde bei einer Wellenlänge von 405 nm in
einem DYNASCAN-Multikanal-ELISA-Ableser abgelesen. Alle Tests wurden dreifach
durchgeführt. Der Endtiter wurde als höchste Verdünnung des Testmausserums
quantifiziert, das ein signifikantes, über das Präimmunserum hinausgehendes Binden an
TNBS aufwies.
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Die IL-2-Toxinbehandlung induzierte Toleranz gegenüber dem TNBS-Antigen in TNBS-
immunisierten Tieren. 30 Tage nach der Immunisierung stimulierte das Ausgesetztsein
gegenüber TNBS keine Immunreaktion auf dieses Antigen; man konnte keine
nachweisbaren Werte zirkulierender anti-TNBS-Antikörper in der
IL-2-Toxinbehandelten Gruppe feststellen.
Toleranzmechanismus
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Der Mechanismus, der dem Verlust der Fähigkeit zugrundeliegt, auf ein Fremdantigen
zu reagieren, d.h. die Induktion von Toleranz, ist unbekannt, könnte jedoch eine
Löschung des antigenspezifischen Klons von Helfer T-Zellen sein. Die Permanenz dieser
klonalen Löschung kann das Ergebnis eines Versuches des Immunsystems sein, dieses
antigenspezifische T-Zellenklon aus der Stammzellen population des Knochenmarks
wiederaufzufüllen, was zu einem neuen antigenspezifischen Klon von Unterdrücker T-
Zellen und nicht von Helfer T-Zellen führt.
Menschliche Dosierung und Verabreichung
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Die Dosierungen von toleranzinduzierenden Substanzen variieren und hängen von
Faktoren wie z.B. der Halbwertszeit der Substanz, der Wirksamkeit, der
Verabreichungsart und dem Zustand des Patienten ab. Im allgemeinen sollte IL-2-Toxin
dem Patienten solcherart verabreicht werden, daß es während der ersten 45
Behandlungsminuten mit dem Fremdantigen in der Nähe des Fremdantigens in einer
Konzentration von etwa 10&supmin;&sup9; M IL-2-Toxin vorhanden ist. Wenn das Fremdantigen z.B.
in den Blutstrom eines erwachsenen Patienten eingeführt werden soll, würde die
gleichzeitige intravenöse Infusion einer Lösung von etwa 15 mg IL-2-Toxin in einem
geeigneten Volumen Salzlösung, die über einen Zeitraum von 1 Stunde zugeführt wird,
im allgemeinen für eine ausreichende Konzentration von IL-2-Toxin im Blut über einen
ausreichend langen Zeitraum sorgen. Diese Vorschrift kann angepaßt werden, eine
niedrigere Konzentration von IL-2-Toxin über einen längeren Zeitraum oder eine höhere
Konzentration über einen kürzeren Behandlungszeitraum vorzusehen. Wenn die
Gegenwart des Fremdantigens lokalisiert und nicht systemisch ist, kann die IL-2-
Toxinbehandlungsvorschrift in geeigneter Weise eingestellt werden, 10&supmin;&sup9; M IL-2-Toxin
in unmittelbarer Nähe des Fremdantigens über einen Zeitraum von 45 Minuten
vorzusehen.
Andere Ausführungsformen
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Andere erfindungsgemäße Ausführungsformen sind in den folgenden Ansprüchen
enthalten. Es kann z.B. Pseudomonas aeruginosa Exotoxin mit dem IL-2
rezeptorspezifischen Fragment anstelle des Diphterie-Toxinanteils des Hybridproteins
verschmolzen sein. Das Pseudomonas-Exotoxin ist ein wohlbekanntes Toxin, das in der
US PS Nr. 4.545.985 (Pastan et al.) beschrieben ist. Das für dieses Toxin kodierende
Gen ist bei Hwang et al., (1987) Cell 48: 129 beschrieben.