DE69626829T2

DE69626829T2 - Monoklonale antikörper gegen lösliche tnf-alpha rezeptoren p55 und p75 als auch gegen tnf-alpha und dessen analogen

Info

Publication number: DE69626829T2
Application number: DE69626829T
Authority: DE
Inventors: Vladka Curin Serbec; Annette Schuurbiers; Viktor Menart; Vladimira Gaderc Porekar; Anton Stalc; Petra Zunec; Janja Ocvirk; Borut Stabuc
Original assignee: ZAVOD REPUBLIKE SLOVENIJE ZA TRANSFUZIJO KRVI; ZD REPUBLIKE SLOVENIJE ZA TRAN; Lek Pharmaceuticals dd
Current assignee: Zavod Republike Slovenije Za Transfuzijo Krvi Lju; Lek Pharmaceuticals dd
Priority date: 1995-08-04
Filing date: 1996-07-31
Publication date: 2004-03-18
Anticipated expiration: 2016-08-01
Also published as: AU6634596A; AU703091B2; DE69626829D1; ATE234918T1; EP0846169A1; WO1997006251A1; EP0846169B1

Description

Monoklonale Antikörper gegen lösliche TNF-α-Rezeptoren p55 und p75 als auch gegen TNF-α und dessen Analoga
Die vorliegende Erfindung gehört in den Bereich der pharmazeutischen Industrie und betrifft eine Reihe von neuen monoklonalen Antikörpern und deren Fragmenten, die an die verfügbare Oberfläche entweder des humanen rekombinanten TNF-α oder der TNF-α-Analoga oder löslicher TNF-α-Rezeptoren p55 oder p75 sowie deren Komplexe gebunden sind. Die Erfindung betrifft weiter stabile Hybridoma-Zelllinien, die fähig sind, solche monoklonale Antikörper zu produzieren, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zubereitungen.
Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur quantitativen Bestimmung von humanem TNF-α, frei oder mit löslichen Rezeptoren komplexiert, and von dessen Analoga oder löslichen TNF-α-Rezeptoren p55 oder p75, frei und mit TNF-α komplexiert, in biologischen Proben sowie einen zu diesem Zweck zu verwendenden Kit. Ein anderer Erfindungsgegenstand ist auch ein TNF-α-Analogon, d. h. TNF-α Cys95His107His108Cys 148, das in einem Komplex mit TNF-α löslichen Rezeptoren p55 und/oder p75 als Antigen zur Immunisierung von Mäusen verwendet wird.
Technisches Problem
Mittels bis jetzt beschriebener monoklonater Antikörper und daraus entwickelter Reagenzien war es nicht möglich, freie Makromoleküle von TNF-α oder dessen löslichen Rezeptoren und Komplexen davon gleichzeitig zu bestimmen. Diese Bestimmung ist sehr wichtig für die Einschätzung einer Krankheit oder für den Behandlungserfolg, denn durch die Entwicklung der Krankheit wird in vielen Fällen auch der Spiegel von löslichen, TNF-α-bindenden und so den tatsächlichen Gehalt an sowohl Rezeptoren als auch TNF-α senkenden TNF-α-Rezeptoren erhöht.
Stand der Technik
Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) ist ein Cytokin, das primär von Monocyten und Makrophagen als Reaktion auf Stimulation mit Endotoxin oder anderen Stimuli produziert wird. Löslicher TNF-α kann auch von anderen Zellen, so Granulozyten, T- und B-Lymphozyten und NK-Zellen, produziert werden. Löslicher TNF-α ist in Trimerform; das Molekulargewicht der Untereinheiten beträgt 17 kDa und das Molekulargewicht des in Membranen eingebauten beträgt 26 kDa. Eine Übersicht von TNF-α wurde in vielen Zeitschriften offenbart, z. B. B. Beutler er al., Nature 320, 584, 1986, und G. Serša, Zdrav. vestn. 63, Suppl. II, 35, 1994.
Ursprünglich wurde beabsichtigt, TNF-α wegen seiner Antitumorwirkung in Behandlung von Krebserkrankungen zu verwenden. Spätere Untersuchungen zeigten jedoch, dass TNF-α ein pluripotenter und pleiotroper Cytokin ist: Seine Wirkung wird z. B. auch in vemngerter Lipase-Wirkung, Verhinderung der vitalen Propagierung, Aktivation und Chemotaxis von Neutrophilen, Zellwachstum – Proliferation und Differenzierung – von verschiedenen Zellen, erhöhter Produktion von Prostaglandin E2 und Collagenase, vemngerter Collagensynthese, prokoagulanter Wirkung, Verhinderung der Kontraktilität und erhöhter Expression des Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC) der Klassen I und II ausgedrückt. Zahlreiche negative Wirkungen von TNF-α sind mit der Entwicklung von verschiedenen schweren pathologischen Zuständen, wie z. B. Meningitis, septischem Schock und anderen bakteriellen, vitalen oder fungalen Infektionen, verschiedenen akuten und kronischen Entzündungen, Gewebenekrose, Neoplasma, Kachexia, Autoimmunerkrankungen usw. verbunden (e.g. LE Junming et al., WO 92/16553; G. Serša, Zdrav. vestn. 63, suppl. II, 35, 1994).
Vom therapeutischen Gesichtspunkt her ist neben Herstellung von TNF-α oder dessen weniger schädlichen Analoga auch die Entwicklung von die Wirkung des TNF-α neutralisierenden Produkten interessant. Eine solche Möglichkeit bieten z. B. spezifische monoklonale Antikörper. Bei verschiedenen Krankheiten ermöglichen spezifische monoklonale Antikörper auch die Bestimmung von TNF-α in einigen Körperflüssigkeiten und tragen so signifikant zur Diagnostizierung zahlreicher schwerer Krankheiten bei.
Die Wirkung von TNF-α wird durch Rezeptoren an verschiedenen Zellen erreicht. Es gibt zwei Arten von Rezeptoren mit Molekulargewichten von 55 kDa und 75 kDa (M. Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3127, 1990). Die extrazellulären Rezeptordomänen sind ähnlich (J. Vilcek und TH Lee, J. Biol. Chem. 166, 7313, 1991), während die intrazellulären Teile verschieden sind. Das ermöglicht wahrscheinlich eine Mediation von verschiedener Stimulation in der Zelle (Z. Dembic et al., Cytokine 2, 231, 1990).
Abgespaltete extrazelluläre, in Serum und Plasma befindliche Rezeptordomänen werden lösliche TNF-α-Rezeptoren (P. Seckinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, 5188, 1990) genannt. Manchmal wurden diese Proteine inhibitorische Peptide für TNF genannt ( US 5,359,037 ). Bei einigen Krankheiten hängt z. B. die Menge der löslichen Rezeptoren von Intensität der Krankheit und von deren Behandlung (I. Olson et al., Eur. Cytokine Netw. 4, 169, 1993) ab, während die Kinetik des TNF-α und somit dessen Wirksamheit wahrscheinlich von dessen Menge in Serum (Kus et al., Int. J. Cancer 55, 110, 1993) abhängt. So ist die Bestimmung von löslichen Rezeptoren für TNF-α wichtig vom Gesichtspunkt sowohl der Diagnostizierung der Schwere der Krankheit als auch der Bestimmung der Wirksamkeit und der Zweckmäßigkeit der Behandlung. Lösliche Rezeptoren für TNF-α können mit spezifischen monoklonalen Antikörpern bestimmt werden.
Antikörper gegen einen ausgewählten Antigen können durch Immunisierung der Tiere mit Antigen und Isolierung der aus dem Tierserum gewonnenen Antikörper gewonnen werden. Die so erhaltenen Antikörper sind heterogen – polyklonal; sie haben nämlich verschiedene Affinitäten zum Antigen und sind auch an verschiedene Antigendeterminanten – Epitope gebunden.
Koehler und Millsstein (Nature 256, 495, 1975) entwickelten eine Methode zur Hybridisierung von Zellen, die die Produktion von monoklonalen Antikörpern, d. h. Antikörpern mit gleicher Struktur, die alle an derselben Stelle gebunden sind und nur mit einer Antigendeterminante reagiren, ermöglicht. Solche Zellen – Hybridome – werden durch Fusion von Lymphoblasten und Myelomzellen gebildet. Diese Methode ermöglicht eine unbegrenzte Synthese von gleichen monoklonalen Antikörpern; wegen dieser Eigenschaft sind monoklonale Antikörper unentbehrlich in vielen Bereichen, in Therapie und in Diagnostik.
In EP 212489 offenbarten Cerami et al. ein aus Makrophagen isoliertes Modulatormaterial. Es wurden zahlreiche diagnostische und therapeutische Verwendungen vorgeschlagen sowie Testvorgänge, Materialien in Kitform und pharmazeutische Zubereitungen angegeben. Rubin et al, entwickelten Hybridome zur Produktion von monoklonalen Antikörpern und Antikörper zur Bestimmung von TNF-α und dessen Reinigung ( EP 218868 ).
A. Moeller und F. Emlig entwickelten monoklonale Antikörper mit zwei verschieden schweren Ketten, was den Antikörpern verschiedene Neutralisationsfähigkeit und somit auch eine spezifischere Verwendung ( EP 260610 ) verleiht.
In EP 288088 offenbarten Yone et al, eine Methode zur Bestimmung von TNF-α in Körperflüssigkeiten von Patienten mit Kawasaki-Krankheit, mit Erkennbarkeit von Epitopen auf TNF-α-Stellen von G1y68 bis Ile97. Diese monoklonalen Antikörper können cytotoxische Wirkungen des TNF-α auf L9929-Zellen, Wirkungen, die den Metabolismus von Fetten und das Binden an den TNF-α-Rezeptor regulieren, neutralisieren. Sie offenbarten auch Antikörper erkennende Stellen an TNF-α von Thr7 bis Leu37 sowie Stellen von Pro113 bis Glu127.
In EP 492448 offenbarte E. Barbanti monoklonale Antikörper oder deren Fragmente zur Neutralisierung von TNF-α in Molverhältniss von 2 : 1 sowie zur Detektion von humanem TNF-α in Körperflüssigkeiten.
In WO 92/16553 offenbarten Junming et al, neben üblichen monoklonalen Antikörpern gegen TNF-α auch Chimären-Antikörper, d. h. humanisierte Antikörper verschiedener Struktur mit hoher Affinität zu TNF-α und hoher Neutralisationsfähigkeit für TNF-α; in diesen Fällen können monoklonale Antikörper an Aminosäurereste des rekombinanten TNF-α 59–80 und 87–108 gebunden werden, während sie an die für Bindung zum Rezeptor wichtigen TNF-α-Teile: 11–13, 37–42, 49–57 oder 155–157 nicht gebunden werden. Die Stoffe sind in der Diagnostik von TNF-α und zur Behandlung von mit erhöhter TNF-α-Synthese verbundenen Krankheiten verwendbar.
Auch in WO 92/11383 offenbarten Adair et al, teilweise humanisierte Antikörper gegen TNF-α zur Therapie und Diagnostik. Für diese Antikörper ist es charakteristisch, dass jeder davon drei spezifische Verbindungsstellen an einem variablen Teil von sowohl der schweren als auch der leichten Kette aufweist, was eine wiederholte und sicherere parenterale Applikation ermöglicht.
In US 5 223 395 ist ein immunometrischer Test für den biologisch aktiven Tumornekrosefaktor in biologischen Proben beschrieben, der die Gewinnung eines Komplexes aus einem ersten markierten monoklonalen Antikörper, biologisch aktivem TNF, und einem zweiten monoklonalen Antikörper, der an ein unlösliches Substrat gebunden werden kann, und eine Detektierung der mit dem Komplex verbundenen Markermenge umfasst.
In US 5 360 716 beschrieben Y. Ohomoto et al, die Herstellung von monoklonalen Antikörpern von hoher Spezifität, die zur Reinigung von TNF-α oder zu dessen quantitativer Bestimmung in biologischen Proben verwendet werden können. Darunter sind mehrere mit dem SDS-denaturierten TNF-α reagierende Antikörper.
Neben Antikörpern gegen TNF-α wurden auch Fab-Fragmente entwickelt, die wegen der Bindung zu TNF-α einen septischen Schock verhindern können (KJ Tracy et al., Nature 330, 662, 1987).
Zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von humanem TNF-α in biologischen Flüssigkeiten und bakteriellen Lysaten werden auch für TNF-α und Meerrettichperoxidase bispezifische monoklonale Antikörper verwendet (N. Berkova et al., DE 4104787 ).
In WO 91/02756 offenbarte M. Kriegler Antikörper verschiedener Herkunft, die die Abspaltung von pro-TNF-α zu grösseren oder kleineren Fragmenten verhindern. Durch eine Kombination beider Arten von Antikörpern kann der TNF-α-Gehalt in verschiedenen Körperflüssigkeiten bestimmt werden. Sie können auch für verschiedene prophylaktische und therapeutische Zwecke bei mit pathologischem TNF-α-Gehalt verbundenen Krankheiten verwendet werden.
P. Boyle et al, entwickelten monoklonale, in Diagnostik verwendbare Antikörper. Sie werden auch an Zelloberflächen-TNF-α gebunden und verhindern die von LPS induzierte TNF-α-Sekretion durch humane Monocyt-Zelllinie ( EP 614984 ).
Polyklonale un monoklonale Antikörper gegen TNF-α sind auch ein Grundbestandteil eines Reagens, das eine selektive Bestimmung des oligomeren TNF-α, nicht aber der angeblich biologisch unwirksamen Monomere oder des an TNF-Rezeptoren gebundenen TNF-α ermöglicht (A. Corti, WO 93/06489).
Antikörper gegen TNF-α und dessen Fragmente, die verschiedener Herkunft und an sich neutralisierend sind, findet man auch in einer Kombination mit verschiedenen, zur Behandlung von mit einer erhöhten TNF-α-Menge verbundenen Krankheiten beabsichtigten Xanthinderivaten (H. Anagnostopulos, WO 92/07585).
Eine Kombination von Antikörpern für TNF-α und Interferon-γ wurde zur Behandlung von mit immunologischem System verbundenen Krankheiten wie Autoimmunerkrankungen und Transplantatabweisung vorgeschlagen (Jonker und PH Van der Meide, WO 90/10707).
Kombinationen von Antikörpern gegen TNF-α mit verschiedenen Antibiotika wurden zur Behandlung bakterieller Meningitis vorgeschlagen (RF Hector und MS Collins, EP 585705 ).
Zahlreiche für rekombinanten TNF-α spezifische monoklonale Antikörper wurden in verschiedener Literatur offenbart, z. B.: CH Liang, Biochem. Biophys. Res. Comm. 137, 847, 1986; A. Meger et al., Hybridoma 6, 305, 1987; Fendly et al., Hybridoma 6, 359, 1987; TS Bringman et al., Hybridoma 6, 489, 1987; M. Hirai et al., J. Immunol. Meth. 96, 57, 1987; A Mooler et al., Cytokine 2, 162, 1990. Sie werden entweder zur Bestimmung von Epitopen an TNF-α oder zur Entwicklung von Immunomethoden zur Bestimmung von TNF-α oder zur Isolierung von TNF-α verwendet. Keine der obigen Referenzen betrifft jedoch unmittelbar den Therapiebereich oder die in vivo Diagnostik (LE Junming et al., WO 92/16553).
Betreffend die Entwicklung von Antikörpern gegen TNF-α mit verschiedener Bindungs- oder Neutralisierungsfähigkeit sollen PR Temest et al., Hybridoma 13, 183, 1994, erwähnt werden. In diesem Artikel wurden solche Antikörper offenbart, die partielle kompetitive Antagonisten des nicht-modifizierten TNF-α-Antikörpers, der vor Strukturänderungen des TNF-α entstand, sind.
Monoklonale Antikörper und biologisch aktive Fragmente gegen Rezeptoren für humanen TNF-α, aus HL-60-Zellen isoliert, wurden von Brockhaus und Loetscher ( EP 334165 ) entwickelt. Diese aktiven Bestandteile dienen entweder zur Reinigung der Membranenrezeptoren für TNF-α oder für therapeutische oder diagnostische Zwecke.
Eine ausführlichere Definition der Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen lösliche TNF-Rezeptoren geht aus WO 94/09137 (Fendley et al,) hervor. Sie werden zur Behandlung von Patienten mit malignen Tumoren, HIV und durch T-Zellen mediierten Autoimmunerkrankungen verwendet.
In US 5 359 037 offenbarten Wallash et al, polyklonale und monoklonale Antikörper gegen einen TNF-α-Rezeptor und deren biologisch aktive Fragmente; einige Wirkungen von TNF-α auf Zellrezeptoren können durch diese Proteine stimuliert oder inhibiert werden. Sie sind auch in Diagnostik zur Detektierung von endogen gebildeten Antikörpern gegen TNF-α-Rezeptoren und für die Bestimmung des TNFα-Rezeptorspiegels in Körperflüssigkeiten verwendbar.
In WO 92/22666 offenbarte G. Adolf monoklonale Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne eines TNF-α-Rezeptors. Diese Antikörper sind zur Bestimmung von löslichen TNF-α-Rezeptoren p55 in Körperflüssigkeiten mittels ELISA-Methode verwendbar.
Erfi ndungsgemäße Lösung
Die Zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich von bisher bekannten monoklonalen Antikörpern und daraus entwickelten Reagenzien zur Bestimmung von TNF-α oder löslichen Rezeptoren, indem sie eine Bestimmung der freien Rezeptoren p55 oder p75 oder TNF-α sowie eine Bestimmung von Komplexen beider TNF-α-Rezeptoren mit TNF-α oder dessen Analoga ermöglichen. Die Bestimmung von freien und gebundenen löslichen TNF-α-Rezeptoren ist sehr wichtig zur Bewertung des Krankenheitszustands oder des Behandlungserfolgs. Während der Entwicklung von einigen Krankheiten erhöht sich der Spiegel von löslichen TNF-α-Rezeptoren mit gebundenem TNF-α. So sind die den Spiegel sowohl der freien TNFα-Rezeptoren als auch der TNF-α-Rezeptoren in einem Komplex mit TNF-α darstellenden Werte ein sicherer Maßstab der Krankheit oder der Therapie als die Bestimmung von freien löslichen TNF-α-Rezeptoren allein.
Solche monoklonale Antikörper werden durch Kultivierung von unter ECACC 95101016, 95071217 und 95071218 deponierten stabilen Hybridoma-Zelllinien erhalten. Die stabilen Hybridoma-Zelllinien wurden mittels Immunisierung von Mäusen mit Komplexen des TNF-α-Analogons Cys95His107His108Cys 148 mit löslichen TNF-α-Rezeptoren p55 und/oder p75 hergestellt.
Die monoklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können in Diagnostik sowie in Prophylaxe und/oder Therapie von Krankheiten, worin die TNF-α-Menge erhöht wird, verwendet werden. Solche typischen Krankheiten sind z. B. septischer Schock, AIDS, zerebrale Malaria, Graft-versus-host-Krankheit, rheumatoide Arthritis. Die monoklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können zu diesen Zwecken allein oder als pharmazeutische Zubereitungen verwendet werden. Die monoklonalen Antikörper in entsprechenden Zubereitungen können parenteral: subkutan, intravenös, intraarteriell oder intramuskulär verabreicht werden.
Die monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung sind auch für Immunteste in flüssiger Phase sowie auf fester Phase geeignet.
Die monoklonalen Antikörper und deren Fragmente werden mittels Immortalisierung von Lymphozyten B eines mit einem ausgewählten Antigen immunisierten Mauses hergestellt. Das kann entweder mittels Transformation mit einem onkogenen Virus, mittels Elektrofusion oder mittels Fusion mit bereits immortalisierter Zelllinie von Myeloma- oder Lymphoblastoid-Zellen getan werden. In meisten Fällen werden Plasmacytoma-(Myeloma-)Zellen von Säugetierherkunft verwendet, die kein Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (HGPRT) aufweisen.
Zelllinien werden dann mittels einer der möglichen Methoden kloniert und anschließend für die Fähigkeit, gewünschte Antikörper zu produzieren, getestet. Bekannt sind verschiedene Teste zur Bestimmung von spezifischen Antikörpern und deren Auswähl hängt üblicherweise von der Natur des Antigens selbst sowie von den gewünschten Eigenschaften der Antikörper ab. Dieser Schritt ist der wichtigste im ganzen Verfahren, da im diesen Schritt Antikörper mit hohen Affinitätskonstanten und gewünschter Spezifität ausgewählt werden.
Nachdem eine stabile, monoklonale Antikörper der gewünschten Spezifität und Affinität produzierende Hybridoma-Zelllinie erhalten wurde, stellt diese Linie eine Quelle des den monoklonalen Antikörper kodierenden genetischen Materials dar.
Gene, die die ausgewählten monoklonalen Antikörper gegen TNF-α oder dessen Analogon TNF-α Cys95His107His108Cys148 kodieren, werden so isoliert, dass cDNA-Bibliothek aus mRNA hergestellt wird. Dann wird die Immunoglobulin kodierende cDNA isoliert und weiter manipuliert. Bestimmte Teile der nukleotiden Sequenz können ausgewechselt werden, um sogenannte humanisierte, zur therapeutischen Verwendung geeignete Antikörper (dadurch wird deren Immunogenizität vermindert) herzustellen. Der cDNA-Klon kann in einen Prokaryonten- oder Eukaryonten-Expressionsvektor eingesetzt werden und wird zu einer möglichen Massenproduktion verwendet.
Der Ausdruck "stabile Zelllinie" bedeutet, dass die Linie eine lange Zeit lebensfähig ist, theoretisch über eine uneingeschränkte Zeitperiode, und dass während dieser Zeit sie auch den gewünschten monoklonalen Antikörper produziert.
Der Ausdruck "monoklonaler Antikörper" betrifft einen aus einem Gemisch von verschiedenen Antikörpern ausgewählten Antikörper. Alle monoklonale Antikörper mit derselben Spezifität und Affinität sind identisch mit Ausnahme von deren natürlichen Mutanten.
Unter dem Ausdruck "Antikörper" sind intakte Moleküle der Immunoglobuline sowie deren Fragmente (Fab, F(ab')₂, Fv, scFv) gegen ein TNF-α-Analogon zu verstehen.
Der Ausdruck "neutralisierend" bedeutet die Fähigkeit der Antikörper, cytotoxische Wirkung von TNF-α oder dessen Analogon TNF-α Cys95His107His108Cys148 in vitro und/oder in vivo zu blockieren.
Zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Fusionsmethode verwendet, die zuerst von Koehler und Millstein (Koehler, G. und Millstein, C., Nature 256: 496, (1975)) offenbart wurde. Verwendet wird eine in BALB/c Mäusen gewonnene NS1-Plasmacytoma-Linie, die HGPRT- ist und Immunoglobuline weder produziert noch sekretiert. Eine solche immortalisierte Zelllinie wird mit Zellen, von denen einige Antikörper, die an das TNF-α-Analogon Cys95His 107His 108Cys 148 und auch an TNF-α gebunden werden, produzieren, fusioniert. Die Antikörper gegen das TNF-α-Analogon produzierende Zellen werden aus der Milz von BALB/c Mäusen, die mit einem Komplex von TNF-α-Analogon Cys95His 107His 108Cys 148 immunisiert sind, isoliert. Das TNF-α-Analogon Cys95His 107His 108Cys 148 wird mittels rekombinanter DNA-Technologie hergestellt. Nach der Fusion beider Zellarten wird die Anwesenheit von spezifischen Antikörpern in Überstanden von gebildeten Hybridomen getestet. Augewählt werden solche Antikörper, die mit dem TNF-α-Analogon oder auch mit TNF-α allein reagieren. Zum Testen wird die ELISA-Methode (enzyme linked immunosorbent assay) verwendet, worin beide rekombinante Proteine (TNF-α-Analogon Cys95His107His108Cys148 und TNF-α) zur Bekleidung von Mikrotiterplättchen verwendet werden. Die ausgewählten stabilen Zelllinien werden in kleinen plastischen Flaschen oder in Spinnerflaschen kultiviert. Eine Konzentration der monoklonalen Antikörper von bis zu 1,0 mg/ml kann in den Überständen in einem geeigneten Medium und unter geeigneter Kultivierung von Zelllinien erreicht werden. Solche monoklonalen Antikörper können aus Überständen mittels Ausfällung mit Ammoniumsulfat oder mittels Ionenaustauschchromatographie oder Affinitätschromatographie auf Protein A- oder Protein G-Sepharose isoliert werden.
Zur Immunisierung wurden Komplexe mit der Zusammensetzung AB_n1, AB_n2 oder ein AB_n1AB_n2-Gemisch ausgewählt und hergestellt.
Die Bedeutungen der obigen Symbole sind wie folgt:
A bedeutet das TNF-α-Analogon TNF-α Cys95His107His108Cys148,
AB_n1 bedeutet ein Gemisch von Komplexen löslicher nativer oder rekombinanter TNF-α-Rezeptoren p55 mit dem Analogon TNF-α Cys95His107His108Cys148,
AB_n2 bedeutet ein Gemisch von Komplexen löslicher nativer oder rekombinanter TNF-α-Rezeptoren p75 mit dem Analogon TNF-α Cys95His107His108Cys148, wodurch
AB_n1AB_n2 ein Gemisch von Komplexen des Analogons TNF-α Cys95His107His108Cys148 und verschiedener abgestumpfter Formen von beiden nativen löslichen TNF-α-Rezeptoren p55 und p75 bedeutet.
Man kann von einem Gemisch gesprochen, weil es bekannt ist, dass beim Nterminalen Teil eines löslichen Rezeptors eine proteolytische Abspaltung von mehreren Aminosäuren erfolgt, und weil an dasselbe TNF-α-Trimer der eine oder der andere der löslichen TNF-α-Rezeptoren p55 oder p75 gebunden werden kann.
Die rekombinanten löslichen TNF-α-Rezeptoren p55 oder p75 können anstelle nativer löslicher TNF-α-Rezeptoren verwendet werden.
Das rekombinante Analogon TNF-α Cys95His107His108Cys148 wurde zur Immunisierung aus folgenden Gründen ausgewählt:

1. Die zweifachige Mutation His107His108 ermöglicht eine genügend feste Bindung des Analogons an die chromatographische Säule Cu2+--IDA und dient so als Affinitätsligand bei der einstufigen Isolation von löslichen TNF-Rezeptoren sowohl natürlicher Herkunft (Harn, Plasma, pleurale Flüssigkeit usw.) als auch aus Kulturen von rekombinanten Organismen, z. B. E. coli, Hefe und Insekten- oder Säugetierzellkulturen. Der Komplex wird aus der Säule durch eine erhöhte Imidazolkonzentration eluiert, d. h. bei milden Bedingungen, die weder die biologischen Eigenschaften des Komplexes oder dessen Komponenten verschlechtern noch eine Dissoziation oder Denaturierung von Proteinen verursachen.
2. Die zusätzliche zweifache Mutation Cys95Cys148 ermöglicht eine spontane Verbindung der Untereinheiten im TNF-Trimer mit Disulfidbindungen. Einzelne Mutationen Cys95 und Cys148 liegen an Berührungsflächen, die bereits auf eine natürliche Weise Monomere zu einem ziemlich kompakten Trimer verbinden, das jedoch nach bis jetzt bekannen Daten bei niedrigen Konzentrationen (z. B. physiologische Konzentrationen) trotzdem zu Monomeren dissoziiert und gleichzeitig denaturiert wird und seine biologische Wirkung verliert (US Patent 5 223 395). Mittels zweifacher Mutation von Cys95Cys148 wurde die unerwünschte Dissoziation verhindert und gleichzeitig die Thermostabilität des Trimers sehr erhöht.
3. Die Einführung der angegebenen Mutationen beeinflusste in keiner Weise die zur Bindung der Rezeptoren wichtigen Stellen, was daraus geschlossen wird, dass die Cytotoxizität im Vergleich mit TNF-α nicht geändert wurde. Die Cytotoxizität wurde auf L929-Zelllinie bestimmt.
4. Das Analogon TNF-α Cys95His107His108Cys148 dient nicht nur einer einfachen Isolation der Rezeptoren, sondern stellt auch einen kompakten, thermodynamisch stabilen Trägerkern für lösliche Rezeptoren dar. Ein solcher Komplex ist stabiler, lebensfähiger und auch immunogener im Vergleich zu einer gesonderten Verwendung einzelner Komponenten.
5. Da die Bindungsstellen zwischen TNF-α und dem Rezeptor gedeckt sind, können mit grösserer Wahrscheinlichkeit nur monoklonale, auf aufgedeckte Oberflächen gerichtete Antikörper gebildet werden, was bei der Verwendung dieser Antikörper zu analytischen Zwecken (ELISA) wichtig und für eine richtige Bestimmung der TNF-α-Konzentration in Gegenwart eines Überschusses an löslichen Rezeptoren sehr wichtig ist.
6. Zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern ist keine Isolation der einzelnen reinen Rezeptoren nötig. Durch Verwendung des Gemisches werden äquivalente oder sogar bessere Ergebnisse erreicht.

Einige monoklonale Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung haben auch eine hohe Neutralisationswirkung. Sie werden zu therapeutischen Zwecken eingesetzt. Die übrtgen monoklonalen Antikörper ermöglichen die Bestimmung sowohl von freien Makromolekülen der TNF-α-Rezeptoren p55, p75 und des TNF-α als auch von deren gegenseitigen Komplexen.
Die Messungen des löslichen TNF-α-Rezeptors p55 im Serum durch monoklonale Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung zeigen, dass z. B. mittels dieser Antikörper gesunde Freiwillige, radikal behandelte Melanom-Patienten und Patienten mit metastatischem Melanom unterschieden werden können. Auch der Erfolg der Chemoimmuntherapie kann damit vorhergesagt und der Erfolg der Behandlung verfolgt werden.
BEISPIELE
Die Erfindung wird durch folgende Beispiele illustriert und keineswegs darauf eingeschränkt.
Beispiel 1
Herstellung des Analogons TNF-α Cys95His107His108Cys148
Gen und Expressionssystem
Es wurde ein handelsübliches synthetisches, ins Trägerplasmid BBG4 (British Biotechnology, Großbritannien) eingebautes TNF-α-Gen eingesetzt. Das Gen wies der Expression im Bakterium E. coli angepasste Codone auf.
Basisches Expresssionsplasmid pCYTEXPl (Belev T. N. et al., A fully modular vector system for optimization of gene expression in Escherichia coli. Plasmid 1991: 26: 147–150) wurde von der Firma Medac (Hamburg, Deutschland) geliefert. Bei unserer Arbeit verwendete Enzyme wurden von Sigma, Amershen und Boehringer geliefert. Wenn die Herkunft von Reagenzien nicht spezifisch angegeben wird, sind sie von einer den Anforderungen der Arbeit in Molekulärbiologie entsprechenden Qualität.
Das Gen wurde aus dem Plasmid BBG4 mit dem Restriktasenpaar Ndel/BamHI ausgeschnitten und in das vorher mit demselben Restriktasenpaar behandelte Expressionsplasmid pCYTEXP 1 subkloniert.
In diesem Expressionsplasmid wird das TNF-α-Gen von einem thermoinduzierbaren Promotor kontrolliert und daher muss die Fermentation bei 40–42°C durchgeführt werden. Bei optimierten Fermentationsbedingungen war die Expression von TNF-α in diesem System etwa 1–2% der ganzen Zellproteine. Wegen der relativ niedrigen Expression wurde das Expressionsplasmid derart modifiziert, dass
a) das Plasmid pCYTEXP 1 mit dem Enzym HindIII geschnitten wurde, die kohesiven Enden auf beiden Seiten mit Klenow-Enzym eingefüllt und wieder in ein Zirkularplasmid mit T4 DNA-Ligase ligiert wurden oder
b) aus dem Plasmid pCYTEXP 1 ein Teil des Repressor cI⁸⁵⁷-Gens mit einem Paar der Enzyme HindIII/NotI asugeschnitten wurde, die Enden mit Klenow-Enzym eingefüllt und wieder in ein Zirkularplasmid mit T4 DNa-Ligase ligiert wurden.
In beiden Fällen wurde die Plasmid-DNA aus zehn Klonen analysiert. Der ausgewählte Klon musste eine richtige Plasmidgröße und eine hohe Expresion bereits bei 30°C aufweisen. So wurde ein Expressionsplasmid mit Promotor, der nicht mehr vom Repressor cI⁸⁵⁷ kontrolliert wurde, erhalten und bei optimaler Fermentationsführung in Laborfermentator wurde die Expression von TNF-α bis zu 15–25% der ganzen Zellproteine in Abhängigkeit von der Art des Analogons erhöht. Alle hier angegebenen TNF-α-Analoga wurden durch so modifiziertes Expressionsplasmid erhalten. Somit zeigte sich, dass die konstitutive Expression von TNF-α oder dessen Analoga das Wachstum von E. coli nicht wesentlich beeinflusst, und gleichzeitig wurde im Cytoplasma eine genügend große Menge an gewünschtem Protein akkumuliert, um eine wirtschaftliche Isolation zu ermöglichen. Da die Expression nicht mehr an Temperaturinduktion gebunden war, konnten die Zellen auch bei niedrigerer Temperatur (z. B. bei 30°C) kultiviert werden, was sich gerade bei Cysteinmutanten, wo bei üblicher Induktionstemperatur fast keine Protein akkumulation erfolgte, als sehr günstig zeigte. Der Zusatz von verschiedenen teuren Stoffen (Induktoren, z. B. IPTG) entfiel. In den meisten kommerziellen Expressionssystemen werden nämlich kontrollierte Promotoren verwendet.
Beispiel 2
Die Herstellung von mutierten TNF-α-Genen
Die entsprechenden Mutationen wurden mit oligonukleotid-gerichteten Mutagenese auf Einzelstrand-Plasmid-DNA nach einer bekannten Methode (Kunkel, T. A. Rapid and efficient site specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488–492) in zwei Schritten eingeführt. Oligonukleotide wurden auf einem DNA-Synthetisator (Modell 381A) der Firma Applied Biosystems mit von derselben Firma gelieferten Chemikalien synthetisiert.
Zuerst wurde das Ausgangsanalogon TNF-α His107His108 hergestellt und zur Einführung der Mutationen G1u107G1y108 → His107His108 wurde oligo-M28z31 mit der Sequenz
5'-CGC TTC TGC ATG GTG GGG AGT TTC ACG C-3'
verwendet.
In der nächsten Stufe wurden noch beide Cysteinmutationen eingeführt und zur Mutation Ser95 → Cys95 wurde oligo-M20z38 mit der Sequenz
5'-CTT GAT AGC GCA CAG CAG GT-3'
und zur Mutation G1y148 → Cys148 wurde oligo-M23z41 mit der Sequenz
5'-GTY CAC CT6 GCA AGA TTC AGC GA-3'
verwendet.
Beispiel 3
Isolation und Reinigung des Analogons TNF-α Cys95His 107His 108Cys 148
Aus frischen Kolonien von E. coli NM 522 wurden 10 bis 30 ml einer Übernachtkultur in einem einfachen Kultursubstrat LB mit Zusatz von 100 μg Ampicillin/ml des Mediums in Erlenmeyerkolben auf einer Laborschüttelvonichtung bei 30°C und bei 120–130 U/min hergestellt. Diese Kultur wurde als eine Impfkultur zur Herstellung von Biomasse aus einem grösseren Volumen (1 – 3 1 von LB mit Ampicillinzusatz) verwendet. Die bakterielle Kultur wuchs bei diesen Bedingungen bis zur Sättigungsphase (optische Dichte bei 550 nm betrug von 1 bis 1,2). Das Zellpellet wurde durch Schleudern (5000 U/min; 5 Minuten) vom Kultursubstrat getrennt und gewaschen. Die gewaschenen Zellen des bakteriellen Pellets wurden mechanisch in Browns MKS-Homogenisator gebrochen. Im Zentrifugat wurde ein Großteil der Nukleinsäuren mit 0,1%-gem Polyethylenimin ausgefällt. Proteine wurden mit Ammoniumsulfat (65% der Sättigung) gefällt, der Niederschlag wurde in einem Puffer 0,02 M K-Phosphat, 0,2 M NaCl, pH 7,1, gelöst und auf eine Säule von Zn⁺⁺-IDA Chelating Superose (Pharmacia) aufgetragen. Auch andere Ionen wie z. B. Cu⁺⁺, Ni⁺⁺, Co⁺⁺, können verwendet werden. Eine Gradientenelution erfolgte mit einem Puffer derselben Zusammensetzung und mit Imidazolzusatz (50 mM). Da unser Analogon Histidinmutationen hatte, blieb es am längsten an der Säule, während andere Proteine und die meisten anderen Unreinugungen früher eluiert werden. Gleichzeitig mit dem biologisch wirksamen Analogon wurde auch ein kleinerer Teil des teilweise proteolytisch abgebauten Proteins eluiert, das jedoch in der Phase der Polierung an HIC-Säule der Phenyl Superose (Pharmacia) entfernt werden konnte. Die ganze Ausbeute bei Reinigung war 40–50%.
Die Reinheit und Qualität des gereinigten Analogons wurden mit Standard-SDS-PAGE-Analyse bewertet (bei Silberfärbung wurde nur ein Hauptfleck der Größe von 17 kDa sichtbar, während ein Fleck des kovalent-gebundenen, mit Merkaptoethanol nicht-reduzierbaren TNF-α-Dimers kaum sichtbar wurde). Bei SDS-PAGE-Ausführung ohne Reduktionsmittel – d. h. ohne Merkaptoethanol – wurde nur ein Fleck in der Höhe von 40–42 KDa, der einem TNF-α-Trimer mit allen drei, mit Disulfidbindungen kompakt verbundenen Untereinheiten entspricht, erhalten. Der isoelektriche Punkt (pI) wurde zu einem Wert von etwa 7,85 erhöht. Eine der zusätzlichen Eigenschaften eines solchen Trimers war auch eine wesentlich erhöhte Thermostabilität.
Der Cytotoxizitätstest auf einer Standard-L929-Zeltlinie von Mäusefibroblasten zeigte, dass die biologische Wirksamkeit etwas vermindert, jedoch vergleichbar zu jener des nativen TNF-α war.
Beispiel 4
Isolation löslicher Rezeptoren p55 und p77 aus Harn und Herstellung von. Komplexen des Analogons TNF-α Cys95His 107His 108Cys 148 und löslicher TNF-α. Rezeptoren p55, p75
a) Herstellung einer Proteinfraktion aus Harn
Aus Harn (50 1) von Patienten mit verschiedenen Krebserkrankungen wurde mittels Ultrafiltration (Membrane 10000 NMWL polysulfone cat. no. PTGCOMIP04, Apparat Minitan, Firma Millipore) ein Konzentrat (600 ml) erhalten. Die Proteine; wurden mit Zusatz von Ammoniumsulfat (bis zu 60% der Sättigung) ausgefällt und bei –70 °C zur weiteren Behandlung gelagert.
b) Isolation der Rezeptoren auf einer Affinitätssäule mit immobilisiertem. Analogon
TNF-α Cys95His 107His 108Cys 148 Das Analogon TNF-α Cys95His 107His 108Cys 148 (1 mg), gelöst in 1 ml von 0,02 M K-Phosphatpuffer mit 0,2 M NaCl, pH 7,1 (Puffer A), wurde auf eine gemäß Herstellersanweisungen hergestellte Affinitätssäule von Chelating Superose (Pharmacia) mit immobilisiertem Cu⁺⁺ gebunden. Auf die so hergestellte Säule wurde in Puffer A gelöster Ammoniumsulfatniederschlag der Proteine aus Harn langsam während 30 Minuten appliziert. Nicht-gebundene Proteine wurden mit Puffer A gewaschen. Dann wurden die Komplexe zwischen dem Analogon TNF-α Cys95His 107His 108Cys 148 und löslichen Rezeptoren sowie der überschüssige Analog TNF-α Cys95His107His108Cys148, die alle gleichzeitig in demselben Proteinpeak vorkamen, durch den linearen Gradienten des Imidazols (von 0 zu 50 mM) im Puffer A eluiert. Auf die gleiche Weise wurde die Eluierung des angegebenen Proteinkomplexes und des überschüssigen Analogons TNF-α Cys95His 107His 108Cys 148 durch den Gradienten von Histidin und Glycin oder nur durch Senken des pH des Ausgangspuffers erreicht. Im Falle der Eluierung durch Senken des pH mußten die Eluate sofort nach Eluierung neutralisiert werden. Die Proteinkomplexe zwischen dem Analogon TNF-α Cys95His 107His 108Cys 148 und löslichen Rezeptoren sowie das überschüssige Analogor TNF-α Cys95His 107His 108Cys 148 enthaltenden Fraktionen wurden auf Amicon-Membrane YM10 konzentriert.
c) Gelfiltration
Das überschüssige Analogon wurde von den Komplexen zwischen dem Analogon TNF-α Cys95His 107His 108Cys 148 und löslichen Rezeptoren mittels Gelfiltration auf Superose 12 (Pharmacia) und Sephacryl 200 (Pharmacia) im obigen Puffer A, der auch zur Äquilibrierung der Säule verwendet wurde, getrennt.
Beispiel 5
Immunisierung der Mäuse
Gruppen von je drei BALB/c Mäusen wurden subkutan mit einem Gemisch von einem Komplex des Analogons TNF-α Cys95His107His108Cys148 und löslichen humanen TNF-α-Rezeptoren p55 oder p75 immunisiert. Beide Proteine wurden 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit komplettem Freund-Adjuvans (Sigma, St. Louis, MO, USA) gemischt. Nach einem Monat wurden die Mäuse intraperitoneal mit denselben Dosen beider Proteine im inkompletten Freund-Adjuvans (Sigma, St. Louis, MO, USA) immunisiert. Zehn Tage nach der zweiten Inokulierung wurde den Mäusen Blut aus der Schwanzvene entnommen und die Anwesenheit von polyklonalen Antikörpern gegen beide Antigene wurde in allen Sera mit ELISA-Test bestimmt. Einen Monat nach der zweiten Immunisierung wurden die den besten Titer der spezifischen Antikörper aufweisenden Mäuse intravenös mit denselben Dosen beider Komplexe wie in der ersten und in der zweiten Inokulation, diesmal in einer physiologischen Lösung, inokuliert. Nach drei Tagen wurden die Mäuse geopfert und deren Lymphoblasen wurden für Fusion verwendet.
Beispiel 6
Herstellung von stabilen Hybridoma-Zelllinien
Lymphozyten wurden aus der Milz der geopferten Mäuse mittels Perfusion isoliert und gleichzeitig wurden auch NS 1 Myelomen-Zellen (> 99% lebende Zeilen) in der log-Wachstumsphase hergestellt. Beide Zellarten wurden in einem 10 : 1-Verhältnis vermischt und geschleudert. Zum Niederschlag wurde eine 50%-ige (Vol/Vol.) Lösung von Polyethylenglykol 1500 (PEG 1500; Sigma, St. Louis, MO, USA) in einem gemäß Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) langsam zugesetzt und dann wurde die Zellsuspension langsam mit dem DMEM-Medium (1 ml während 1 Minute und 20 ml während 5 Minuten) verdünnt. Die Zusammensetzung des DMEM-Mediums war wie folgt: DMEM (Flow, Scotland, Großbritannien), 10 mM HEPES (Flow, Scotland, Großbritannien) und 45 mM NaHCO₃ (Sigma, St. Louis, MO, USA). Nach dem Schleudern wurde der Zellniederschlag in einem kompletten DMEM-Medium, das neben DMEM der obigen Zusammensetzung auch. 13% des fötalen Kalbserums (Hy Clone, Utah, USA), 100 μg/ml Penicillin, 200 μg/ml Streptomycin und einen Zusatz von 2 mM L-Glutamin (Gibco, Scotland, Großbritannien) enthielt, resuspendiert. Als Nährsubstrat wurde auch eine Suspension von aus den Thymi von 2-monatigen BALB/c-Mäusen hergestellten Thymozyten zugesetzt. Die Zellsuspension wurde auf acht Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA, USA), 70 μl je Vertiefung, aufgetropft. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C in einem mit Dampf und 5% CO₂ gesättigten Inkubator aufbewahrt. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit HAT DMEM (Sigma, St. Louis, MO, USA), 140 μl je Vertiefung, aufgefüttert. Neben dem kompletten DMEM-Medium enthielt HAT DMEM auch Hypoxanthin (H), Aminopterin (A) und Thymidin (T). Nur Hybridome wuchsen in diesem Medium, während sich NS1-Zellen in Anwesenheit von Aminopterin zersetzten und nicht-fusionierte Milzellen in in vitro Bedingungen eine begrenzte Lebensdauer aufwiesen. Die Platten wurden dann die ganze Zeit bei 37°C in einem mit Dampf und 5% CO₂ gesättigten Inkubator aufbewahrt. HAT DMEM wurde jeden dritten Tag zugefüttert. Am vierten Tag konnten die ersten Klone beobachtet werden. Die Überstände wurden nach sieben Tagen getestet. Darin wurde erst die Anwesenheit von Mäuseimmunglobulinen bestimmt und anschließend wurden jene Überstände, die in ELISA-Test sehr starke Reaktionen ergaben, auch auf die Anwesenheit der Antikörper gegen das Analogon TNF-α Cys95His107His108Cys148 und gegen das rekombinante humane TNF-α getestet. Die Hybridome in jenen Vertiefungen, wo in den Überständen spezifische Antikörper mit den größten relativen Bindungsaffinitäten bestimmt wurden, wurden zu grösseren Volumina (zuerst auf Platten mit 24 Vertiefungen und dann in Fläschchen mit immer grösseren Volumina) gezüchtet. Dabei wurde das komplette HAT DMEM-Medium zuerst durch ein komplettes HT DMEM-Medium und dann durch ein komplettes DMEM-Medium ersetzt.
Um die Stabilität und Homogenität der ausgewählten Zelllinien zu gewährleisten und dadurch sicherzustellen, dass die von diesen Linien produzierten Antikörper tatsächlich monoklonal waren, wurde ein Teil der Hybridome durch die Methode der Endpunkt-Verdünnung kloniert und ein Teil gefroren. Die Überstände der klonierten Hybridome wurden wieder mit dem ELISA-Test getestet. Ausgewählte Hybridome wurden zu grösseren Volumina gezüchtet. Ein Teil davon wurde gefroren und der andere Teil zur maximalen Dichte gezüchtet. Solche Überstände wurden zur Bestimmung der Klasse und Unterklasse der Immunglobuline, zur Bestimmung der relativen Bindungsaffinität von monoklonalen Antikörpern und zur Bestimmung der Konzentration von Immunglobulinen in erschöpften Überständen der Hybridome verwendet.
Beispiel 7
ELISA zur Bestimmung von monoklonalen Mäuse-Antikörpern gegen das Analogon
TNF-α Cys95His107His108Cys148, TNF-α sowie gegen p55- und p75-Rezeptoren Mikrotiterplatten mit einem flachen Boden (Maxisorp, Nunc, Dänemark) wurden mit Anti-Maus-Immunglobulinen (100 μl) (Dakopatts, Dänemark) bzw. dern Analogon TNF-α Cys95His107His108Cys148, TNF-α, p55- oder p75-Rezeptoren. in 50 mM Na-Carbonat-/-Bicarbonatpuffer, pH 9,6, in der Konzentration von 1 μg/ml bedeckt. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Dann wurden sie dreimal mit isotonischem Phosphatpuffer (PBS) mit 0,05%-igem Tween 20 (PBS/Tween₂₀, Sigma, St. Louis, MO, USA) gewaschen. Die freien Stellen wurden mit 100 μl von 1%-igem Rinderserumalbumin (BSA) in PBS/Tween₂₀ 1 Stunde bei 37°C blockiert. Nach einem dreifachen Waschen mit PBS/Tween₂₀ wurden je 100 μl der Überstände von Hybridomen in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aufgetragen und 1 Stunde und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dann wieder mit PBS/Tween₂₀ gewaschen und auf jede davon wurden 100 μl des Konjugats (Ziege-anti-Maus-Immunglobuline, mit Peroxidase konjugiert; Jackson Immuno Research Laboratories, Dianova), Verdünnung 1 : 5000 in 1%-igem BSA-PBS/Tween₂₀, aufgetragen. Nach einer 1,5-ständigen Inkubation bei 37°C wurde die Platte dreimal mit automatischem Plattenwascher gewaschen und in jede Vertiefung wurden 100 μl des Substrats [0,1%ige 2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure) (ABTS) und 0,012%H₂O₂ in einem Substratpuffer, bestehend aus 0,1 M Zitronsäure und 0,1 M Phosphatpuffer, mit pH 4,5] aufgetragen. Nach 30 Minuten wurde die Absorbanz bei 410 nn mit einem automatischen Plattenleser gemessen. In diesen Test wurden auch positive und negative Kontrollen eingeschlossen.
Beispiel 8
ELISA zur quantitativen Bestimmung der Maus-IgG-Antikörper
Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (Maxisorp, Nunc, Dänemark) wurden mit Ziege-Anti-Maus-Immunglobulinen (100 μl) (Dakopatts, Dänemark) in 50 mM Na-Carbonat-/-Bicarbonatpuffer, pH 9,6, der Endkonzentration von 1 μg/ml bedeckt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach dem Waschen, Blockieren der Platte mit 1% BSA in PBS/Tween₂₀ und nach dreifachem erneutem Waschen mit PBS/Tween₂₀ wurden 100 μl Maus-Immunglobulin G oder M bekannter Konzentrationen (Sigma, St. Louis, MO, USA) sowie 100 μl entsprechend verdünnte Überstände von Hybridomen, worin die Konzentration von monoklonalen Antikörpern bestimmt wurde, in jede Vertiefung aufgetragen. Auf die Platte wurden nach 1,5-ständiger Inkubierung bei 37°C und Waschen noch 100 μl der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugierten und in 1%igem BSA-PBS/Tween₂₀ 1 : 5000-verdünnten Ziege-Anti-Maus-Immunglobuline (Jackson Immuno Research Laboratores, Dianova) aufgetragen. Nach 1,5-ständiger Inkubation bei 37°C und Waschen wurden 100 μl des Substrats in jede Vertiefung aufgetragen. Seine Zusammensetzung wurde bereits im Beispiel 7 beschrieben. Nach halbstündiger Inkubierung bei 37°C wurde die Absorbanz bei 410 nm mit einem automatischen Plattenleser gelesen.
Aus der mit bekannten Konzentrationen von Maus-Immunglobulinen gewonnenen Kalibrierungskurve wurden die Konzentrationen monoklonaler Antikörper in Überständen der Hybridome berechnet.
Beispiel 9
Bestimmung der Klasse und Unterklasse monoklonaler Antikörper
Die Klassen und Unterklassen der Maus-Immunglobuline wurden auf zwei Weisen bestimmt. Eine davon war ELISA wie im Beispiel 7 beschrieben mit der Ausnahme, dass anstatt mit Peroxidase konjugierter Test-Ziege-anti-Maus-Antikörper optimale Verdünnungen spezifischer Immunglobuline gegen Maus-Immunglobuline M sowie gegen alle vier Klassen der Maus-Immunglobuline G (IgG₁, IgG_2a, IgG_2b, IgG₃) (Nordic, die Niederlande) in 1% BSA-PBS/Tween₂₀ verwendet wurden. In den Test wurden auch positive und negative Kontrollen eingeschlossen. Alle Proben wurden doppelt gemessen.
Die Klassen und Unterklassen von Maus-Immunglobulinen wurden auch mit Sigma Immuno Type^TM ISO-1 Kit (Sigma, St. Louis, MO, USA) gemäß den Herstelleranweisungen bestimmt.
Beispiel 10
Bestimmung der relativen Bindungsaffinität monoklonaler Antikörper
Wenn die Antikörperkonzentration in Überständen der Hybridome bekannt war oder wenn bereits reine monoklonale Antikörper vorlagen, konnte die relative Bindungsaffinität aus der im indirekten, im Beispiel 7 beschriebenen ELISA-Test gewonnenen Titrationskurve bestimmt werden mit der Ausnahme, dass anstatt der Überstände von Hybridomen deren Verdünnungen in 1%BSA-PBS/TNeen₂₀ oder Verdünnungen reiner monoklonaler Antikörper auf eine Mikrotiterplatte aufgetragen wurden. Die Antikörperkonzentration, bei der die im ELISA-Test gemessene Absorbanz einem halben Wert der Absorbanz bei Sättigung gleich war, gab – berechnet in Molen – die relative Bindungsaffinität der Antikörper, die ein Maßstab für deren Affinitätskonstante ist.
In den Test wurden auch positive und negative Kontrollen eingeschlossen. Alle Proben wurden doppelt gemessen.
Beispiel 11
Reinigung monoklonaler Antikörper
Monoklonale Antikörper wurden auf Protein G-Sepharose (Sigma, St. Louis, MO, USA) gereinigt. Fünfundzwanzigmal konzentrierte Überstände der Hybridome, dialysiert in Centriprep 30 (Amicon, USA) gegen 0,02 M Phosphatpuffer, pH 8,0, der 0,5 M NaCl enthielt, wurden auf eine Säule von Protein G-Sepharose aufgetragen. Die Probe wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur befestigt. Dann wurden nicht-befestigte Proteine mit 0,02 M Phosphatpuffer, pH 8,0, der 0,5 M NaCl enthielt, gewaschen und die befestigten Immunglobulinfraktionen, d. h. monoklonale Antikörper, wurden mit 0,1 M Glycin/HCl, pH 2,7, eluiert. Diese Fraktionen wurden sofort mit 1 M Tris-Puffer, pH 9,0, neutralisiert. Die Anwesenheit von Antikörpern in einzelnen Fraktionen wurde durch Messen der Absorbanz bei 280 nm und deren Wirksamkeit wurde mit einem indirekten ELISA-Test bestimmt. Die positiven Fraktionen wurden auf Centriprep 30 konzentriert un dialysiert, dann in Aliquoten aufgeteilt und auf –20°C eingefroren.
Beispiel 12
Konjugierung monoklonaler Antikörper mit Meenettich-Peroxidase
Monoklonale Antikörper wurden mit HRP (Typ VI, Sigma, St. Louis, MO, USA) mittels der Glutaraldehydmethode (Antibodies, A laboratory manual, Harlow, E., Lane, D., editors, 1988) konjugiert.
HRP (2,9 mg) wurde in 1,25%-igem Glutaraldehyd/PBS (0,1 ml), pH 7,1, gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde das überschüssige Glutaraldehyd mittels Filtration auf einer mit 0,15 M NaCl equilibrierten Sephadex G-25 Superfine-Säule entfernt. Braungefärbte Fraktionen wurden vereinigt: und gegen 0,1 M Na-Carbonat-/-Bicarbonatpuffer, pH 9,2, dialysiert und in Centriprep 30 bis zu 0,65 ml konzentriert.
Die ausgewählten reinen monoklonalen Antikörper (1,5 mg) wurden in Centricone (Amicon, USA) gegen 0,1 M Na-Karbonat-/-Bikarbonatpuffer, pH 9,2, dialysiert und bis zu 0,25 ml konzentriert, dann wurde die hergestellte HRP zugesetzt und es wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Am nächsten Tag wurde 0,2 M Lysin (0,1 ml) zugesetzt und es wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Probe wurde in Centricone gegen PBS, pH 7,1, dialysiert und bis zu 1 ml konzentriert. Konjugierte Antikörper wurden in Aliquoten bei –20°C gelagert.
Beispiel 13
Optimierung des Sandwich-ELISA-Tests zur quantitativen Bestimmung von TNF-α und dessen Analoga (Schachbrett)
Um den ELISA-Test zur quantitativen Bestimmung von TNF-α und dessen Analoga zu optimieren, wurden die Vertiefungen auf einer Mikrotiterplatte mit flachem Boden (Maxisorp, Nunc, Dänemark) mit 100 μl der ausgewählten monoklonalen Antikörper verschiedener Verdünnungen (von 10 μg/ml bis 80 ng/ml; Verdünnungen 1 : 2ⁿ) in 50 mM Na-Carbonat-/-Bicarbonatpuffer, pH 9,6, bedeckt. In jede der acht Reihen wurden dieselben Verdünnungen der monoklonalen Antikörper aufgetragen. Die Platten wurden über Nacht bei +4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden sie dreimal mit PBS/Tween₂₀ gewaschen. Die freien Stellen wurden 30 Minuten mit 100 μl von 1%-igem BSA in PBS/Tween₂₀ bei 37°C blockiert. Dann wurden in jede Vertiefung 100 μl von TNF-α oder vom Analogon TNF-α Cys95His107His108Cysl48 in 1%igem BSA-PBS/Tween₂₀ in der Konzentration von 0,5 μg/ml aufgetragen. Nach 1,5-stündiger Inkubierung bei 37°C und wiederholtem Waschen mit PBS/Tween₂₀ wurden 100 μl verschiedener Verdünnungen des Konjugats in 1%-igem BSA-PBS/Tween₂₀ (von 1 : 50 bis 1 : 6400; Verdünnungen 1 : 2ⁿ) in jede der acht Säulen der Mikrotiterplatte aufgetragen. Nach 1,5-stündiger Inkubierung bei 37°C und Waschen mit PBS/Tween₂₀ wurden 100 μl des ABTS-Substrats (seine Zusammensetzung wurde im Beispiel 7 beschrieben) in jede Vertiefung aufgetragen. Nach hallbstündiger Inkubierung bei 37°C wurde die Absorbanz bei 410 nm von einem automatischen Plattenleser abgelesen. In den Test wurden auch positive und negative Kontrollen eingeschlossen.
Beispiel 14
Kalibrierungskurve zur Bestimmung von TNF-α und dessen Analoga
Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit flachem Boden (Maxisorp, Nunc, Dänemark) wurden mit einer optimalen Konzentration (1 μg/ml) der ausgewählten monoklonalen Antikörper in 50 mM Na-Karbonat-/-Bikarbonatpuffer, pH 9,6, bedeckt. Nach Inkubierung über Nacht bei +4°C wurden die Platten dreimal mit PBS/Tween₂₀ gewaschen und 30 Minuten bei 37°C mit 1%-igem BSA-PBS/Tween₂₀ blockiert. Nach einem wiederholten Waschen mit PBS/Tween₂₀ wurden je 100 μl verschiedener Konzentrationen (von 10 μg/ml bis 0,2 pg/ml) von TNF-α oder dessen Analoga in 1%-igem BSA-PBS/Tween₂₀ in die Vertiefungen aufgetragen. Die Platten wurden 1,5 Stunden bei 37°C inkubiert, dreimal mit PBS/Tween₂₀ gewaschen und 100 μl einer optimalen Verdünnung des Konjugats (1 : 1000), hergestellt wie im Beispiel 12 beschrieben, in 1%-igem BSA-PBS/Tween₂₀ wurden in jede Vertiefung aufgetragen. Nach 1,5-ständiger Inkubierung bei 37°C und Waschen der Platte mit PBS/Tween₂₀ wurden 100 μl des ABTS-Substrats (die Zusammensetzung wurde im Beispiel 7 angegeben) in jede Vertiefung zugesetzt. Nach halbstündiger Inkubierung bei 37°C wurde die Absorbanz bei 410 nm von einem automatischen Plattenleser abgelesen.
Beispiel 15
Optimierung des Sandwich-ELISA-Tests zur quantitativen Bestimmung von beiden löslichen TNF-α-Rezeptoren p55 und p75 (Schachbrett)
Das Schachbrett wurde in derselben Weise, wie für TNF-α oder für dessen Analogon TNF-α Cys95His 107His 108Cys 148 offenbart, ausgeführt. Für jedes Antigen wurden zwei Konjugate mit Meenettich-Peroxidase nach der im Beispiel 12 beschriebenen Methode hergestellt. Jedes Konjugat wurde dann in Kombination mit vier monoklonalen, zur Bedeckung einer Mikrotiterplatte verwendeten Antikörpern getestet, um herauszufinden, welche Kombination von monoklonalen Antikörpern den empfindlichsten ELISA-Test gewährleistete.
Beispiel 16
Kalibrierungskurven zur Bestimmung von löslichen TNF-α-Rezeptoren p55 und p75
Die Prozedur und Reagenzien waren dieselben wie bei der Kalibrierungskurve für TNF-α und dessen Analogon mit der Ausnahme, dass die optimale Konzentration der monoklonalen Antikörper zur Bedeckung der Mikrotiterplatte 2 μg/ml betrug und die optimale Verdünnung des Konjugats 1 : 1000 war. 1 stellt die Kalibrierungskurve für den Rezeptor p55 dar.
Beispiel 17
Die Bestimmung des löslichen TNF-α-Rezeptors p55 in Serum
Der lösliche TNF-α-Rezeptor p55 wurde im Serum von 69 gesunden Freiwilligen, bei 35 Patienten mit malignem Melanom ohne Krankheitssymptome mindestens 30 Monate nach primärer chirurgischer Behandlung und bei 47 Patienten mit metastatischem Melanom bestimmt.
Gesunde Blutspender wurden in die Kontrollgruppe eingeschlossen. Sie waren mindestens 14 Tage vor Blutentnahme gesund. So wiesen sie keine respiratorische oder andere Infektion auf. Bei keinem von ihnen wurde eine infektiöse Leberkrankheit oder HIV-Virusinfektion gefunden. Deren Durchschnittsalter betrug 21 Jahre (19 bis 25).
Die Gruppe mit malignem Melanom ohne Krankheitssymptome bestand aus 31 Patienten, 15 Männern und 16 Frauen, mit einem Durchschnittsalter von 46 Jahren (17 bis 73). Nach mindestens 3 Jahren nach der primären Melanomoperation wies keiner von ihnen Krankheitssymptome auf. Während der letzten 6 Monate wurde keiner wegen kronischer degenerativer Gelenkerkrankungen oder Leberkrankheiten, Hypertension, Diabetes oder Herzerkrankungen behandelt. Vierzehn Tage vor Blutentnahme zeigte keiner Zeichen einer Harninfektion oder respiratorischer Infektion.
Die Gruppe mit metastatischem Melanom bestand aus 47 Patienten, 19 Männern und 28 Frauen, mit einem Durchschnittsalter von 47 Jahren (18 bis 66). Gemäß WHO waren 21 Patienten im Leistungszustand 0, 15 Patienten in Zustand 1 und 9 Patienten in Zustand 2. 21 Patienten hatten eine metastatische Lokation, 17 Patienten hatten 2 metastatische Lokationen und 9 Patienten hatten 3 oder mehrere metastatische Lokationen. 22 Patienten hatten Hautmetastasen, 21 Patienten hatten Metastasen in Lymphknoten, 12 in der Lunge, 4 in Knochen und 4 in der Leber. Keiner dieser Patienten wurde wegen chronischer Krankheiten behandelt. Mindestens 2 Monate vor Blutentnahme zur Bestimmung des löslichem TNF-α-Rezeptors p55 waren sie nicht mittels Chemotherapie und Modifikatoren der biologischen Antwort behandelt worden. Ihr Blut wurde einen Tag vor dem Beginn der Behandlung mit Chemoimmunotherapie, am Tag 57 und am Tag 100 bis 120 ab Behandlungsbeginn entnommen.
Die Patienten erhielten Chemoimmunotherapie gemäß dem folgenden Schema: Vinblastin 2 mg/m² der Körperoberfläche in einer 12-ständigen Infusion, Lomustin 60 mg/m² p. o. am ersten Tag, Cisplatin 20 mg/m² in einer 2-ständigen Infusion am 2., 3., 4., 5. Tag und Interferon alpha 2b 6 MIE subkutan am 3. bis 7. Tag. Der Zyklus wurde jede 28 Tage wiederholt.
Die zweite Blutentnahme zur Bestimmung des löslichen TNF-α-Rezeptors p55 fand am Tag 57 ab dem Behandlungsbeginn, d. h. vor dem dritten Zyklus statt. Die dritte Blutentnahme fand drei Wochen nach dem fünften Zyklus der Behandlung, d. h. am Tag 100 bis 120 nach dem Behandlungsbeginn statt.
In jeder Gruppe wurden der durchschnittliche Wert des Rezeptors p55 im Serum und das 95%-ige Vertrauensintervall CI bestimmt.
Die Werte des löslichen TNF-α-Rezeptors p55 bei gesunden Freiwilligen, bei radikal behandelten Melanompatienten und bei Patienten mit metastatischem Melanom sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
In Tabelle 2 werden die Werte des löslichen TNF-α-Rezeptors p55 nach zwei Chemotherapiezyklen für Patienten mit metastatischem Melanom aus der Tabelle 1 gegeben. Sie sind in zwei Untergruppen in Bezug auf die Behandlungsreaktion aufgeteilt. Die Patienten mit einem niedrigen Wert des löslichen TNF-α-Rezeptors p55 reagierten gut auf die Therapie, die Patienten mit einem hohen Wert jedoch nicht. Ähnliche Werte wurden auch vor dem Beginn des dritten Chemoimmunotherapiezyklus oder nach dem fünften (letzten) Zyklus bestimmt.
Tabelle 2
Beispiel 18
Pharmazeutische Zubereitungen mit monoklonalen Antikörpern
Pharmazeutische Zubereitungen enthalten einen neutralisierenden monokllonalen anti-TNF-α-Antikörper. Die Zubereitungen können in einer zur parenteralen Verabreichung geeigneten Form, d. h. in der Form der Injektionen oder eines lyophilisierten Pulvers, das mit dem Zusatz einer geeigneten Lösung, z. B. Wasser für Injektionen, eine Injektionslösung ergibt, vorliegen. Die Menge der Antikörper in den Zubereitungen hängt vom Verwendungszweck, Verabreichungsweg, Alter und Zustand des Patienten ab. Im allgemeinen enthalten die Zubereitungen so viele anti-TNF-α-Antikörper, dass mit einer einzigen Applikation 0,1 bis 5 mg anti-TNF-α je kg des Körpergewichtes verabreicht werden können. Die Zubereitungen enthalten entweder anti-TNF-α-Antikörper allein oder mit Zusatz von verschiedenen Antihistaminika und/oder Glucocorticoiden. Den Zubereitungen werden noch verschiedene Stoffe zur Isotonisierung, Solubilisierung, Stabilisierung und pH-Regulierung zugesetzt.
Als ein Beispiel soll die folgende Zusammensetzung einer Zubereitung gegeben werden:

anti-TNF-α 50,00 mg

Natriumchlorid 112,00 mg

primäres Natriumphosphat 11,25 mg

sekundäres Natriumphosphat 45,00 mg

Polysorbate 80 5,00 mg

Wasser für Injektionen bis 5 ml
Information über die Deponierung von Hybridoma-Zelllinien
Hybridoma-Zelllinien, bezeichnet als C9/8, C7/12 und B12/1, sind bei der "European Collection of Cell Cultures" unter den Nummern 95101016, 95071217 und 95071218 deponiert.

Claims

Monoklonale Antikörper und deren Fragmente, die fähig sind, sich an die verfügbare Oberfläche entweder des humanen TNF-α oder der TNF-α-Analoga oder freier löslicher TNF-a-Rezeptoren p55 oder p75 sowie deren Komplexe zu binden, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Kultivierung einer stabilen Hybridoma-Zell-Linie ECACC 95101016 erhalten werden.
Monoklonale Antikörper und deren Fragmente, die fähig sind, sich an die verfügbare Oberfläche entweder des humanen TNF-α oder der TNF-α-Analoge oder freier löslicher TNF-α-Rezeptoren p55 oder p75 sowie deren Komplexe zu binden, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Kultivierung einer stabilen Hybridoma-Zell-Linie ECACC 95071217 erhalten werden.
Monoklonale Antikörper und deren Fragmente, die fähig sind, sich an die verfügbare Oberfläche entweder des humanen TNF-α oder der TNF-α-Analoge oder freier löslicher TNF-α-Rezeptoren p55 oder p75 sowie deren Komplexe; zu binden, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Kultivierung einer stabilen Hybridoma-Zell-Linie ECACC 95071218 erhalten werden.
Stabile Hybridoma-Zell-Linie ECACC 95101016.
Stabile Hybridoma-Zell-Linie ECACC 95071217.
Stabile Hybridoma-Zell-Linie ECACC 95071218.
Verfahren zur Herstellung der stabilen Hybridoma-Zell-Linie nach Ansprüchen 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es – Immunisierung der Mäuse mit einem Gemisch aus einem Komplex des TNF-α-Analogs Cys95His 107His 108Cys 148 und löslicher nativer oder rekombinanter TNFα-Rezeptoren p55 und/oder p75, – eine Fusion der isolierten Mausemilzzellen mit einer Zell-Linie der Myelomazellen, und – Klonierung von monoklonale Antikörper produzierenden Hybridomen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass zur Immunisation ein Komplex des TNF-α-Analogs Cys95His107His108Cys148 und des löslichen nativen oder rekombinanten TNF-α-Rezeptors p55 verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass zur Immunisation ein Komplex des TNF-α-Analogs Cys95His107His108Cys148 und des löslichen nativen oder rekombinanten TNF-α-Rezeptors p75 verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass zur Immunisation ein Komplex des TNF-α-Analogs Cys95His107His108Cys148 und der beiden löslichen nativen oder rekombinanten TNF-a-Rezeptoren p55 und p75 verwendet wird.
Verwendung von monoklonalen Antikörpern und deren Fragmenten nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Testkits zur Bestimmung von humanem TNF-α, frei und mit löslichen TNF-α-Rezeptorem p55 und p75 komplexiert, in hiologischen Proben.
Verwendung von monoklonalen Antikörpern und deren Fragmenten nach Anspruch 2 zur Herstellung eines Testkits zur Bestimmung von humanem löslichem TNF-α-Rezeptor p55, frei und mit TNF-α komplexiert, in biologischen Proben.
Verwendung von monoklonalen Antikörpern und deren Fragmenten nach Anspruch 3 zur Herstellung eines Testkits zur Bestimmung von humanem löslichem TNF-α-Rezeptor p75, frei und komplexiert, in biologischen Proben.
Methode zur quantitativen Bestimmung von humanem TNF-α, frei und mit löslichen TNF-α-Rezeptorem p55 oder p75 komplexiert, in biologischen Proben unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern oder deren Fragmenten nach Anspruch 1.
Methode zur quantitativen Bestimmung von TNF-α-Rezeptoren p55, frei und mit TNF-α komplexiert, in biologischen Proben unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern oder deren Fragmenten nach Anspruch 2.
Methode zur quantitativen Bestimmung von TNF-α-Rezeptoren p75, frei und mit TNF-α komplexiert, in biologischen Proben unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern oder deren Fragmenten nach Anspruch 3.
Kit zur Bestimmung von humanem TNF-α, frei und mit löslichen TNF-α-Rezeptoren p55 und/oder p75 komplexiert, in biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass es monoklonale Antikörper und deren Fragmente nach Anspruch 1 enthält.
Kit zur Bestimmung von löslichem TNF-α-Rezeptor p55, frei und mit TNF-α komplexiert, in biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass es monoklonale Antikörper oder deren Fragmente nach Anspruch 2 enthält.
Kit zur Bestimmung von löslichem TNF-α-Rezeptor p75, frei und mit TNF-α komplexiert, in biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass es monoklonale Antikörper oder deren Fragmente nach Anspruch 3 enthält.
TNF-α-Analogon Cys95His107His108Cys148.
Verfahren zur Herstellung vom TNF-α-Analogon nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es - eine Expression in rekombinantem E. coli-Stamm und - eine einstufige Reinigung mittels Chelatenchromatographie umfasst.
Verwendung vom TNF-α-Analogon nach Anspruch 20 zur Isolierung von TNF-α löslichen Rezeptoren p55 und p75 aus humanem Harn.