JPH029394A - ヒトインターフエロンベーター２、その精製法及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ヒトインターフェロ／−β２（工ＩＦＮ−７
２）、モノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産
生ずるハイブリドーマセルライン及び該モノクローナル
抗体を用いたインターフェロン−β２の精哉法に関する
。丈に不発明は、ヒトインターフェロ／−β２１？ｃ含
有する薬学的組成物に関する。

発明の背景 ヒトインターフェロン−β２は、％ｆｉ昭５５−１６４
４８２によって初めて報告されたものであリ、２本鎖Ｒ
ＮＡによって誘導されたヒト線維芽細胞カラβ−型イン
ター７エロン様活性を有するものとしてクローン化され
ている。ＣＨＯ細胞によって発現されるそのｍ換え蛋白
については特願昭６１−２５８０７７に報告されている
。

サイト力インの１つでおるヒトインターフェロン−β２
μ多数の機能及び活性ｆｔ有しており、その後の文献に
記載され各Ｆ１の生物学的活性を有するものとして同定
されているいくつかの蛋白と同一であることが明らかに
されている。即ち、インターロイキン−６（工Ｌ　−６
）　（Ｔ、Ｈｌｒｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２４　、ｐＩ）、　７
３−７６　）としても命名されているＢ−細胞分化誘導
もしくは促進因子（ＢＣＤＦもしくはＢＳＦ　２　）　
；ハイプリドーマ／プラズマサイトーマ成長因子（ＨＧ
ＩＩＦもしくはＨＰＧＦ　）　（Ｊ、Ｖａｎ　Ｄａｍｎ
ｓ　ｅｔ　ａｍ、　（１９８７）Ｊ、ＥＸｐ１Ｍ＋３（
Ｌ、　１６５　、ｐＰ、　９１４−９１９　）　；肝細
胞促進因子（Ｈ８ＸＰ）　（Ｊ、Ｇａｕｌｄｉｅ　ａｔ
　ａｌ。

（１９８７）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、Ｕ、８．Ａ、　８４゜ｐｐ、７２５１−７２５５）；
ヒト線維芽細胞中で誘導される２　６ｋＰａ　ｍ白（Ｅ
（ａｅｇｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８６）　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１　
５９　　ＩＰＰ。

６２５−６６２）；及びニジスタインパールウィルス（
ＥＢＶ　）で形質転換されたと）Ｂ細胞の成長を促進す
る単球由来ヒ）Ｂ細胞成長因子（Ｇ。

Ｔｏｓａｔｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　５ｃｉｅ
ｎｃｅ　２３９　＊ｐｐ、５０２−５０４　）などの蛋
白とインターフェロ−β２とは同一であることが明らか
にされている。本明細書においてはこのインター７エロ
ンーβ２を以後ＩＦＮ−β２／工Ｉ、−２または工ＩＦ
Ｎ−／２と略記する。

例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ａｉｉｏ）な
どの咄乳動物細胸に工って屋生される天然工？Ｎ−β２
及び組換えＩＦＮ−β２には、グリコフル化及びホスホ
リル化に工９多種のタイプが存在する（　Ａ、Ｚｉｌｂ
ｅｒａｔｅｉｎ　ｏｔ　ａｍ、　（１９８６）　ＫＭＢ
ＯＪ。

５　、　ｐｐ、　２５２９−２５３７　；　Ｌ、Ｔ、Ｍ
ａｙ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８８）　Ｊ、Ｂｌｏｌ、　ｏｈｅｍ、　２６３　
＊　ＰＰ、　７７６０−７７６　Ｂ　；　ＩＪ、Ｔ、　
Ｍａｙ　ａｔ　ａｌ、　（１９８８）Ｂｉｏｐｈｙａ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　ｉ　５２　
ｈ　ｐＰ。

１１４４−１１４８）。従って、変性したゲル上でのイ
ムノプロット分析によると、約２３．２６゜４５及び６
６Ｋｄの各榴のバンドが現われる。グリコシ）ｖ−化さ
れたＩＦＮ−β２蛋白の糖鎖部分を除去すると約２　Ｑ
　Ｋｄの／トさい蛋白が得られるが、この蛋白はＩＦＮ
−β２のほとんどのあるいはすべての生物学的活性を保
持している。

発明の要旨 不発明によれば、ヒト天然ＩＦＮ−β２及びＯＨＯなど
の咄乳動物細胞あるいはＥ、　ｃｏｌｌなどのバクテリ
ア中で発現された組換え１ＦＮ−β２等の由来の異なる
ＩＦＮ−β２／工Ｌ−６と特異的に結合することの出来
るモノクローナル抗体が提供される。

また本発明は、該モノクローナル抗体を産生ずることの
出来るハイブリドーマセルラインに関する。

また本発明は、免役学的和製工８金含むヒトＩＦＮ−β
２の精製法に関する。

更に本発明は、成熟型ヒトＩＦＮ−β２のアミノｆ１に
配列を富む非グリコシル化ポリペプチド、該ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクター、該ベ
クターによって形質転換された微生物、及び該微生換金
培養してポリペプチドを回収することからなる該非グリ
コシル化ポリペプチドの製造法に関する。

史に本発明は、乳癌、白血病、感染性疾患及び骨髄前駆
細胞障害の治療用工ＩＮ−β２宮有薬学的組成物に関す
る。

発明の詳ｔａな記述 本発明の抗ＩＦＮ−β２モノクローナル抗体は、ＩＦＮ
　−、＆　２またはプロティンＡ−ＩＦＮ−β２融合蛋
白などのＩＦＮ−β２金含む；触合蛋白で免役したマウ
スの牌細胞とムリンミエローマ細胞とを小金して得られ
るハイブリドーマセルラインから得ることが出来る。

不明細書においては、プロティンＡ−工ＰＮ−β２」合
蛋白をＥ、ｃｏ１１中で発現するためのプラスばドの構
築、及びモノクローナル抗体を得るためのその使用法が
記載される。ヒトＩＦＮ−β２をコードする第１図のｃ
ＤＮＡの翻訳配列を、ブドウ球茜プロティンＡのアフィ
ニティーテイルをコードする配夕ＩＩ　（Ｕｈｌｅｎ　
ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　Ｊ、Ｂｉｏ、Ｏｈｅｍ。

２５９、ｐ、１６９５ンの６′末端に結合する。得られ
るハイプリクト遺伝子ｉｋ、ｃｏ１１中にて効果的に発
現させる丸めに、強カラムダＰＲプロモーターに連結す
る。

かくして得られる融合蛋白プロティンＡ−ＩＦＮ−β２
を梢製してマウスを免役するのに用いる。

この稍装虐合蛋白をマウスに６回注射後、示ゾテイデ血
清茫得て、固相う７オイムノアクセイ法（８Ｒ工Ａ）に
よ夕その結合力価をテストし、ウェスタンプロットに工
ｐその結合特異性をテストする。最も高い納会力価を示
すマウスから牌細胞を得（１：２５，０００希釈）、こ
れｔマクスイエローマ細淘に融合する。＃ｌ＃！の融合
は、当業名に公矧の適当な融合プロモーターの存在下で
行なう。

次いで得られる融合細胞をウェル中で培養する。

次いで各ウェルの上演を採増して、ＩＦＮ−β２と特異
的に結合するモノクローナル抗体、好ましくはマウスの
免疫化に用い几工ｙｔ＋−β２よりもむしろ異なった由
来のＩＦＮ−β２と特異的に結合するモノクローナル抗
体が存在するか否かをテストする。従って、Ｂ、　Ｑ０
１１中で発現された徹合蛋白プロティンＡ−ＩＦＮ−β
２企用いてマウスを免疫化した場合には、ＯＨＯ細胞中
で産生されたＩＦＮ　−β２ケ用いてモノクローナル抗
体のスクリーニングを行なう。このようにしてスクリー
ニングすることによって、プロティンＡとモノクローナ
ル抗体との交差反応及びマウスの免疫化に用いた抗原調
製物中に存在するＪｃＯｌｌからの混入物とモノクロー
ナル抗体との交差反応ｔさけることが出来る。ＢＲｌＡ
の際には、８Ｖ４Ｑ初期グロモーターの支配下にＩＦＮ
−β２遺伝子を含むプラスミドを保持し且つこの遺伝子
を高度に発現してプロティンＡ及びバクテリア抗原は発
現しないＣＨＯ細胞を培養してその培養液の粗上消を固
相支持体上に結合させ、次いでハイプリドーマ培養液の
上ｆＲ及び〔１２５工〕ヤギ抗マウス抗体と反応させる
。

８Ｒ工Ａによってハイブリドーマをスクリーニングし、
いくつかのポンチイブクローンを単離してその特性ｆｅ
ｖ４べる。目的とする抗体を産生ずるポンチイブクロー
ンを選択してサブクローンし、次いで、適当な生育培地
中で培養するかめるいはマウスに注入し、培養細胞の上
清からあるいは注入したマウスの腹水から目的とするモ
ノクローナル抗体七゛回収する。

かくして得られるモノクローナル抗体は、力２ム内の固
相支持体上に結合させることが出来る。

例えばアガロースポリアクリルヒドラシトなどの公仰の
ゲルマトリックスであればいずれを用いてもモノクロー
ナル抗体を固定化することが出来る。

ヒトエｌＮＮ−β２の相調製物ｔカラムに付し、その後
ＰＨめるいはイオン強度全変化させてカラム中のグルか
ら溶出させることが出来る。本発明の好ましい態様にお
いては、工ｙＮ−／２を言むフラクションｔ−（２のバ
ッファーで溶出さセ、溶出直後に−８，５のバッファー
で中和する。

上記の本発明方法によって精製される粗天然ＩＦＮ−β
２は、誘導された繊維芽細胞よりＩＦＮ　−β１ととも
に得ることが出来る。

本発明によって精鯛されるＯＨＯ細胞産生組換えＩＦＮ
−β２は、Ａ、Ｚｉｌｂｅｒａｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、
　（１９８６）ＦＸＭｓｏ：ｒ、５．ｐｐ、２５２９−
２５３７に記載された方法に二って得ることが出来る。

本発明によれば、組換えＤＮＡ法によ、β７１ＦＮ−β
２アミノ散配列を含む非グリコシル化ポリペプチドが得
られる。ヒトＤＮＡ　、特に、ＩＦＮ−β２アミノ酸配
列を富むポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、ハイブ
リッドｔｒ７ｐ−１１ＬＣプロモーターなどの強力なバ
クテリアブロモ−ターに連結し、得られる融合ＤＮＡ分
子を適当なプラスミドに挿入して、該承りペプチドがバ
クテリア細胞中で発現されるような位置に該ＤＮＡ配列
とＡ節頒域と？有する組換えベクターを構築する。この
ベクターでＥ、　ｃｏｌｉなどのバクテリア細胞を形質
転換し、得られる形質転換体を培養して目的とするポリ
ペプチドを発現せしめ、次いでポリペプチドを回収して
ａ−ｉする。

工Ｆ’Ｎ−β２分子は２１２個のアミノ酸からなるポリ
ペプチドであり、そのＮ床端には、第１図で示すように
、以下の配列を有している。

Ａｌａ”−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ｐｒｏ−−Ｐｒｏ
　　　Ｔａｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　　＃又は−ｙ、１３Ｌ
ｌ　−ｐｒｏ−Ｐｒｏ　−本発明の好ましい態様におい
ては、ＩＦＮ−β２ｃＤＮＡはＰｒｏ”コドンの位置で
Ｍθｔイニシェークーコドンとｔｒｐ−１ａｃプロモー
ターに連結している。

しかしながら、得られるポリペプチドが工Ｆ’Ｎ−β２
／工ｒ、、−６活性を有する限り、いずれの配列も本発
明に包含される。

本発明で用いるＤＮＡベクターは標準的方法によって構
築することが出来る。プラスミドＤＮＡは、０ＢＣＩ−
エチシウムプロマイドグラゾエ／ト中でバンド化するこ
とによって精製することが出来る。

アガロースデルま九はポリアクリルアミドデル上で電気
泳動により分離されたＤＮＡ制限酵素断片は、ＤＥ−５
２カラムによってｎｉすることが出来る。

制限酵Ｘ　（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒｙＮｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）　。

Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＯＷ　Ｅｎｇ：Ｌａｎｄ　Ｂ１
０１ａｂｓ　）　＃Ｅ、ｃｏ１１　ＤＮＡポリメラーゼ
のラーク断片（Ｂｏａｈ−ｒｉｎｇｅｒ　）及びＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）は、
それらの供給名の指針に従って使用することが出来る。

Ｅ、　ｃｏｌｉ形５ｉ、転換は、菌株ＨＢ　Ｉ　Ｑ　１
ＡＴＯＯ３３６９４、、ＴＭ　１０１ＡＴＣＣ３３８７
−６＊　Ｎ　４８３０−１（Ｇｏｏｔｅｓｍａｎｅｔ　
ａｘ、（１９８０）　、Ｔ、Ｍｏｌ、Ｂ１０１．１４０
　、　ｐ。

５７）及び、ＴＭ　１０５　（Ｍｅａｓｉｎｇ　ｅｔ　
ａｌ、　（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１５　Ｒｅ
ｓ、　９　ｒ　ｐｐ、　３０９−３２１　）１１いて凍
結コンピテントバクテリア法（ｌ）、Ａ。

Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　　（１９７９ン　Ｍｅｔｈｏｄｓ　
　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　７　９　　＋ｐｐ、３２６−３
３１）により実施することが出来る。

本明細書においては、乳癌細胞の成長抑制、骨髄性白血
病細胞の成長抑ｔｆｉｌＪ及び分化誘導、盗びに線維芽
細胞での補体因子Ｂの誘導及びその造血効果に用いるＩ
ＦＮ−β２の用途について記載される。

かくしてヒトＩＦＮ−β２は、乳癌、白血病、感染性疾
患及び骨髄前ｍｓ胞障害の治療用薬学的組成物の活性成
分として用いることが出来る。

以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、不発明
はこれら実施例によって何んら限定さルるものではない
。

例１ プラスミ’ｔ’ｐＢＶβ２ＨＢ　（第２図）は、強力Ｂ
Ｖ４Ｑ初期グ初期グロー−タートロール下で０）（Ｏ細
胞中にて工Ｆ’Ｎ−β２遺伝子金発現するために用いた
ベクターの１つであり、標準的クローニング法によりｃ
ＤＮＡの５′及び３′非コード飴域の全てを除去するこ
とによってシラスミドｐ　Ｆ３　ＶＯ工Ｆ／２　（Ａ。

Ｚｉｌｂｓｒｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａ：Ｌ、　（１９８６
）　ＦｉＭＢＯＪ、５　。

ｐｐ、　２５２９−２５３７　）から誘導することが出
来る。

ＩＦＮ−β２をコードする６　６　ｌ　ｂｐ　ｃＤＮＡ
挿入配列を、６６１　ｂｐ　Ｈｌｎｄ　Ｉ　／　Ｏｌａ
　Ｉ断片としてプラスミドｐ８Ｖβ２ＨＢから切９出し
、ＥｃｏＲＩで消化した。得られる５個の断片を分離用
アガロースデルで分離した。シグナルペゾチド配列と成
熟型蛋白の最初の３　ｍのアミノ酸をコードする５５．
１２及び３７　ｂｐの／トさな３個の断片を捨てて、２
６９及び３１８　ｂｐの２個の断片をデルから回収した
。

最初の部分のアミノ散配列をコードするＤＮＡ配列を復
元しプロティンＡフレームを維持するために、２本鎖合
成オリゴヌクレオチドｔ−調製しくその配列全第６図に
示した）、上記の２６９及び３１ｓｂｐＥｆＴ片ととも
に、あらかじめ７５ｃＯＲ工及びＡｃｃ工で消化したプ
ラスミドｐＧＫＭ　−１に連結した。得られるシラスミ
ドｋｐｌｚ　１３２　（第６図〕と命名した。このシラ
スミドは、シラスミドｐＧＫＭ　−１のマルチプルコー
ド部位内のアスパラインコドンとセリンコドンの後に金
ＩＦＮ　−、＆　２配列を言んでいる。アスパラギ／コ
ド／とセリンコドンは、！ラスミドｐＲＩＴ２Ｔ　（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　）のユニークセパレ）ＥＣＩ）Ｒ工
部位（プロテインＡ遺伝子の６′床端）における２つの
コドンに相当する。このズラスミドｐＲ工Ｔ２Ｔは後に
続くクローニング用に用いたものである。グラスミドｐ
β２１６２　ｋＩｌｉｃｏＲ工とＨｌｎｄ　Ｉで消化し
、エバ−β２　ｃｆ）ＮＡ児全全配列単離し、ＥｃｏＲ
ＩとＰｖｕ　Ｉ又はＥｃｏＲＩとＢｍａ工で消化しンｔ
グラスミドｐＲ工Ｔ２Ｔに導入した。ＥｃｏＲＩとＰｖ
ｕ　Ｈで消化し九グラスミドｐＲ工Ｔ２Ｔに導入してシ
ラスミドｐＲＩβ２８０２が得られ、ＢｃｏＲ工と８ｍ
ａ　Ｉで消化したプラスｆＦｐＲ工Ｔ２ＴｆｃＬＡｌで
グラスミドルＲ工β２６０４が得られた（第６図ン。

その精製 Ｊｃｏｌｉ株Ｎ　４８３０−１　（Ｇｏｏｔｅｓｍａｎ
　ａｔ　ａｌ。

（１９８０）　Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂ１０１１４０　、　ｐ、
　５７　）　ｋ組換えプラスミドｐＲＩ／ａ　８０２あ
るいはｐＲ工β２６０４で形質転換して、新たな微生物
１！ｊ、ｃｏｌｉＮ　４８３０−１　／　ｐＲ／＋　８
０２及びｌ、ｃｏｌｉＮ　４８３０−１　／　ＰＲ／２
６０２をそれぞれ得た。

これら微生物の希釈培養側ＪＩｌ！１１ｆｒ：、アンぎ
シリンを含むＭ９培地中で６０℃で１晩生育せしめて初
期定常期まで生育させ、次いで４２℃で９０分間インキ
ュベートし、冷輝して遠心により採取した。

再懸濁と遠心をくり返した後、２０％ＢＤＢを１％の終
１度となるまで、また１０Ｍ尿素を８Ｍの終濃度と表る
まで加えて、発現した融合蛋白プロティンＡ−工Ｆ’Ｎ
−β２を含む抽出物をＴＥＩ？　（５Ｑ鮨ＴｒｉＢＦＪ
Ｉ　７．６　、１５０　ｍＭ　Ｎａｐｌ及び０．０５　
％　Ｔｗｅｅｎ２０）に対して透析した。透析後の透明
な上清ｔ。

１吠セファロースｌ）　ＩＦａ、ｓｔ　Ｆｌｏｗ　（Ｆ
Ｆ）平衡化カラムに付した。カラムに付した後、ゲルを
洗浄し、結合した融合蛋白全０，５　Ｍ　ｕＨ４ｃｏｏ
Ｈ（ｐＨ３，４）で溶出し、透析することなく直接凍結
乾燥した。

例２ ３方今の雌性Ｂａ１ｂ　／　ｃに、最初は例１で得られ
る部分８段融合蛋白プロティンＡ−工ＩＦＮ−β２を注
射した（１０μ９／マウス、完全フロイントのアジュバ
ントに乳化したもの）６６週間後に、上記の戯合蛋白浴
液をマウスに皮下投与した。更に、１０日毎に４回注射
した。最も高い結合力価を示しく表１）且つウェスタン
プロット分析で最も強いシグナルを示し几マウスに、上
記融合蛋白を腹膜的投与し、６日後にマウスから・得た
肺臓リンパ球（１５０×１０’細胞）トミエローマセル
ライン（、３０Ｘ　１０’　Ｎｅｏ／Ａ！　）とを融合
した。得られる遊合細胞をマイクロカルチャープレート
に分散しく　３　ｘｌ　０’細胞／ウエル）、・・イブ
リドーマの成長に基づいてΩ合：ｉＡ胞を選択した。尻
重ＩＦＮ−β２抗体ケ分泌するハイプリドーマを選んで
これをクローン化し、更に限界希釈法によって再クロー
ン化した。

トした。次いで、洗浄溶液でグレート＠：６回洗浄し、
１２５ニー　ヤｆ抗マウス（Ｆａｂ’　）２（５０μｌ
　、　１０ｂｃｐｍ　）　を加えて４℃で１６時間イン
キエベートした。プレートを４回洗浄し、個々のシェル
を切り出シ、ガンマカウンターで計測した。ネガティブ
コントロールよりも少なくとも４倍高いカウント数を与
えるサンプルをボクテイプとした（表１）。

ハイブリドーマ培養上清について、固相ラジオイムノア
ッセイ法（ＢＲＩＡ　）により抗工ＩＦＮ−β２抗体の
存在をテストした。ＰｖＣマイクロプレート（Ｄｙｎａ
ｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＊Ａ１５ｚａｎｄ
ｒｉａ＋ＶＡ　）　ｆ、工ＰＨ−β２を分泌するＣＩＯ
細胞の血清フリー培養粗上消でコートした（８０μｇ／
ウェル）。′５７°Ｃで２時間又は４°Ｃで１６時間イ
ンキュベーション後、ＢＳＡ　（０，５％）及びＴｖｒ
ｅｅｎ　２０　（０，０５％〕を含むＰＢＥＩでプレー
トを２回洗浄し、次いで３７℃で２時間洗浄浴液でプレ
ートチブロックした。

ハイブリドーマ培養上清を加えて（５０μｙ／ウエル）
、プレートに３７℃で４時間インキュベー表１：８Ｒ工
Ａによるハイブリドーマのスクリーニング免役血清（マ
ウス） ネカティブコントロール（マウス） ハイプリドーマ１２ ネガティブハイブリドーマ 腹水 ネガティブ腹水 １　：４０００ １　：４０００ １：１２５ １：６２．０００ １：１２．０００ 表１から明らかなように、１４個の尻重ＦＮ　−β２モ
ノクロ一ナル抗体産生ノ・イブリドーマが８Ｒ工Ａによ
り選択された。ノ）イブリド−マロ４からサブクローン
化されたノ・イブリド−マロ４−１のｔ￥ｊ性を更に調
べた所、工ｇ０１クラスに属することが明らかになった
。ノ１イブリド−マロ４−１ｔＯｏ１１ｅｃｔｉＯｒ　
　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　　ｄｅａ　　Ｏｕ：Ｌｔｕｒｅ
ｓ　　ｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ−ＯＮＣＭ
、工ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｐ（１５）ｔｅｕｒ（Ｐａｒｉ
ｓ）に１９８８年１１月１４日に寄託し、受匙番号ニー
８１６が付与され九。

ハイプリドーマ６４−１はクエスタンプロツテイングに
適してお９、ｔた天然ＩＦＮ−β２及びＥ。

ｃｏｌｌあるいはＯＨＯ細胞で発現される組換え工ＩＦ
Ｎ　−β２のアフィニティー布製にも適していることが
明らかになつ九。このハイプリドーマを以下の笑験に用
いた。

例６ 抗エバーβ２モノクローナル抗体の適用天然工？Ｎ−β
２の粗ＰＡ製物サンプル、あるいはＣＨＯ細胞もしくは
Ｅ、ｃｏｌｌで発現される組換えＩＦＮ−β２粗調製物
サンプルを還元条件下で８Ｄ８−ＰＡＧＦ：で分析し、
ニトロセルロースシー）（Ｂｉ２５　＊　８ｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒとＥｌｈｕｅｌｌ　）上にエレクトロプロット
した。エレクトロプロッティング後、ブロックキングパ
ノ７アー（０，０５％Ｔｗｅｅｎ　２０及び０．０２％
ナトリウムアンドを含むＰＢ８に非脂肪ミルク５％を加
えたもの）とともにシートを１晩インキユベートした。

次いで、尻重ＦＮ−β２抗体ｍ３４−１とともに室温で
２時間インキュベートした。０．０５％’ｒｗθθｎ２
０のＰＢＳｍ液で洗浄後ニトロセルロース上１２５エー
ヤイ抗マウス血清（ブロッキングバッファー中に０．７
　ｘ　１０’　ｃｐｍ／ｊ）とともに室温で６時間イン
キュベートした。

次いでシートラ洗浄し、乾燥して、オートラジオグラフ
ィーに付し友。得られる結果を第４図に示し几。レーン
Ａ：天然ＩＦＮ−β２；レーンＢ：ＯＨＯ細胞で発現さ
れた組換え工ＩＰＮ−β２；レーン０　：　Ｊｃｏｌｉ
で発現された組換えＩＦＮ−β２；レーアＤ：ＯＨＯ細
胞で発現された組換え工ＩＦＮ　−／　１（比較用〕。

ラフイー ハイプリドーマ６４−１によって分泌されるモノクロー
ナル抗体を含むマウスの腹水を硫酸アンモニウム（５０
％飽和ｍ度）４℃で１６時間処理して沈殿させた。沈殿
物を遠心によって集め、水に再溶解し、食塩水に対して
透析した。免役グロブリン約１０〜を、Ｗｌｌｃｈｅｃ
ｋとＭｉｒＯｎの方法（（１９７４）　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　Ｅｎｚｙｍ、　３４　、Ｉ）、　７２　）によって７
ガロースーポリアクリルーヒドラゾド１ＷＪに結合させ
た。天然ＩＦＮ　−／ｙ２　（線維芽細胞由来ン又は組
換え工？Ｎ−β２（ＪｃＯｌｌ又はａｇ。

細胞にて発現）の粗ｉＳＩｍ物（０，５Ｍ　Ｎａｐｌｔ
含む）を、４℃で流速０．２５　ｘｉ／　ｍｉｎでカラ
ムに付した。

カラムを１カラムの３０倍容量の０．５　Ｍ　Ｎａ０ｌ
のＰＢＥＩ溶液で洗浄し友。５０　ｍＭクエン酸バッフ
ァー（−２）（８×１倍容量フラクション）で工Ｆ’Ｎ
−β２を溶出させ、Ｑ、ｉ　Ｍ　Ｈｏｐｅｓバッファー
（−４８，５ンで直ぐに中和した。

和組換えＩＦＮ−β２　（ＤＮＡを除いたＪｃｏｌｉ抽
出物）ヲ尻重ｒ・Ｎ−β２モノクロ一ナル仇体カラム１
１Ｌｌに付しｆｃ６　ワンステップで１０００倍に精製
され、工Ｐ′Ｎ−７ｙ２が１００％回収された（衣２）
。

８ｄアフイニテイーカラム勿用いてスケールアップした
。カラムの硝製能は、刀ラム１譚Ｉ当ρ純粋工Ｆ！Ｊ　
−ｌ１２　４００１０１が得られた６溶出フラクシヨン
ｉ　８ＩＪ８−ＰＡＧＥに付し銀染色した所、分子量２
１．０００の主要バンドとより高い分子量の混入物のバ
ンドが現われ丸（第５図２゜＠組換えＩＦＮ−β２　（
ＯＨＯ細胞）金７フイニテイーカラム１４に付した所、
ワンステップでｈａされ１００％で回収されたｔ、溶出
フラクション２５ｐａ−ｐＡＧｂ　Ｋ　Ｈし鯖染色した
所、２３ＫＤ及び２　ｆ３　ＫＤａのグリコシル化ＩＦ
Ｎ　−／　２の２つの生安バンドか現われた（第５図）
、天然ＩＦＮ−β２（包皮疎維芽軸胞由来）をイムノア
フィニティー精製に付した場合にも同様のバンドが得ら
れた。

例４ （ＨＯ細胞によって産生されるＩＦＮ−β２のモニタリ
ング ０８０細胞によって１２培養培地中に分泌されるＩＦＮ
−β２を、イムノアフィニティーｒｆ１ｇに用いたモノ
クローナル抗体３４−１に用いて定量した。

クローンＡ２−５−１０は、ＯＨＯ細胞をプラスミドｐ
８Ｖβ２２９（第６図〕でトランスフェクトし、５０　
ｎｎメトトレキセート（ＭＴＸ　）で選択することによ
り得られる０ｆ（Ｏクローンである。

グラスミドｐｆ３Ｖβ２２９は以下のようにしてイυる
ことが出来る。即ち、８ｖ４０初期プロモーター及び日
Ｖ４０ポリアデニル化部位に融合したＩＦＮ−β２コー
ド配列を含むＤＮＡ断片を、２．５　ｋｂＢａｍＨ工断
片としてシラスミドｐ＆Ｖｃ　１５から切り出し九〇プ
ラスミドｐ８Ｖａ　１５は、ＯＨＯ細胞にて強力５Ｖ４
Ｑ初期プロモーターのコントロール下にＩＦＮ−β２を
発現するのに用いたベクターの１つで６って、工ＩＦＮ
−β２ｃＤＮＡの５′末端からｘｈｏ　１部位までの全
ての配列ｔ−取り出すことによってグラスミドル８Ｖｏ
工Ｆβ２　（Ａ、Ｚｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｍ
。

（１９８６）　ＥＭＢＯＪ、　　５　、　ｐｐ、　２５
２９−２５５７）から訪導することが出来る。上記のＢ
ａｍＨ工断片全断片ｖ４０初期モーターに融合したマウ
ス１）ＨＦＲと工ｇＧガンマ−２ａのスプライシング領
域とを含むｐＤＩＨ！：ＲプラスミドのＢａｍＨ工部位
にクローン化した。

クローンＡ２−５−ＩＣｌローラーボトル中でコンフル
エントになるまで生育させた。培養培地を、低（２％）
胎児ウシ血清培地に変え、その後２４時間目に採取した
。培養液１ノを４５−に濃縮し、例６Ｂで調製しｔモノ
クローナル抗体アフィニティーカラムに付し友。カラム
を十分に洗浄し、結合１ＦＮ−β２　ｋ　５０　ｍＭク
エンｌ１ｌ（ｐＦ１２）ヲ用いてそれぞれ１１Ｌｔで４
つのフラクションにｍｔｂさせた。このようにして精製
したＩＦＮ−β２は、８Ｄ８−ＰＡＧＩ！ｔに付して銀
染色して分析した所、均質に純粋であることが示された
（第５図ン。１１培養液から回収されたＩＦＮ−／　２
蛋白の量は４６９μｇでめった。

各７ラクシヨン中の工ＩＦＮ−β２のｍを、粗調製物中
の該蛋白のハイプリドーマ成長因子（ＨＧＩＦ）活性及
びアフィニティーカラムから得られる各７ラクシヨン中
のＨＧＦ活性ヲ測定することにＬつて評価し九。カラム
に付した工ＰＮ−β２の約４０％が非、請合フラクショ
ン中に回収され（第７図）、他方、！！！ジの活性は、
ＰＪ′＋２で溶出され几クラクションであって溶出ｆｆ
２にピークを■する７ククシヨン中に回収された（第８
図）。これらの結果から、上記し九条件下ではクローン
Ａ２−５−１０により約８００μ９／ｌの工ＩＦＮ　−
ｐ２か産生されることが判る。

ＣＨＯクローンＡ２−５−１０によって産生分泌される
ＩＦＮ−β２の比活性？、イムノアフィニティーカラム
により得られる各Ｎ裂７ラクシヨ／中のＨ（）ＩＦ活性
及び蛋白−度を創建することによって求め友。ＨＧＦ　
１ユニツトを、アッセイにおいテ最大値効果の５０％を
与える蛋白１として定義した。

ＨＧＩＦ活性は、Ｎｏｒｄａｎ　ＲｏＰ、とＰｏｔｔｅ
ｒ　Ｍ、　（１９８６）８ｃｉｅｎｏｅ　２３３−　Ｐ
Ｉ）、　５６６−５６８に記載された方法と同様にして
２４時間処理し〔３Ｈ〕チミジンで１６時間パルスした
ムリンプラズマ細胞腫Ｔ１１６５ｍ胞の１ＷＪ培養液中
でアッセイした。

表３に分析結果をまとめて示した。アフィニティークロ
マトグラフィーカラムから溶出した６つの７ラクシヨン
中のＩＦＮ−β２のＨＧＦ比活性は１．１８Ｘ１０’か
ら２．１　×１０’の範囲であって１．４７−１０’の
平均値を有していた。

表６ ＩＦＮ−β２の比活性 溶出液１ 溶出液２ 溶出液６ トータル １２８．０００ ３３３．０００ １６６．０００ ６２７．０００ ｏ、１ｏｓ Ｏ，２３９ ０、０７９ ０，４２６ １，１８Ｘ１０’ １．３９×１０’ ２．１０Ｘ１０’ １．４７Ｘ１０６ アフィニティークロマトグラフィーカラムからの溶出ク
ラクションを進めて、１０ｍＭ酢酸バク７アー（ｐ）１
５）に対して透析し、Ｍｏｎｏ　８カチオン交換カラム
（ｐｈａｒｍａｃｉａ　）に付した。カラムを１０ｍＭ
酢酸バッファー（ｐＨ５）で洗浄し、次いで０−６００
ｍＭ００ｍＭ塩化ナトリウムリニアーグラジェント溶出
した。それぞれのフラクションのＨＧＦ活性ケ測定しｔ
。活性は蛋白のメインピークと一致した。

例５ 調製及び′ＰｆＩ製 プラスミドｐｏｚＭ　−１のマルチゾルコード部位内の
ＡＴＧコドンの後にＩＦＮ−β２全配列を含むシラスミ
ドル／２３２４４−１異なる合成オリがヌクレオチド（
第９図）を用−る以外は、例１人及び第３図でグラスミ
ドＩ）／ａ　１３２を調製した方法と同様にして調失し
皮、ｆラスイドｐｌｚ３２４ｋＥｃｏＲ工及びＨｌｎｄ
　Ｉで消化し、工ＩＦＮ−β２　ＣＤＮＡ完全配列を単
離し、ＥｃｏＲ工及びＨｌｎｄ　＊で消化したプラスミ
ドｐＴＬα１４３−４　（Ｙ、０ｈｅｒｎａｊｏｖｓｋ
ｙ　ｅｔａｌ、＋　（１９８３）　Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、
　Ａｃａｄ、８ｃｉ、　４１３　ｅｐｐ、　８８−９６
　）もしくは１）ＫＫ　２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ　）に導入して、シラスミドｐ’ｒＬ＃ｚ５０１及び
ｐＫｘ／２７　（第９図）をイ０た。

ペプチドの発現 Ｅ、　ｃｏ１１株、ＴＭ　ｉ　Ｑ　５　（、ＴｏＭｅｓ
ｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、＋（１９８１）　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ａｅ　Ｒｅａ、　９　、　ｐｌ）、　３０９
−３２１）を団換えシラスミドｐＫＫβ２７で形ＪＲ転
換して、新たな微生物Ｊｃｏｌｉ　ＪＩＩＩ　１０５　
／ｐＫｘ７Ｓ′ｚ７を得、これを１９８７年１２月１７
日にブタペスト条約に基づきＡＴＯＯへ寄託し、受託番
号ＡＴＣ０６７５８３が付与された。１．　ｃｏｘｉ株
、ＩＭ　１０１（ＡＴＯＣ＋　３３８７６　）を組換え
シラスミドｐＴ］、β２５０１で形質転換し、＃たな微
生物Ｅｉ、ｃｏ：ｔｉ　ＪＭｌ　０１　／　ｐＴＬ／ｚ
　５０１を得、これを１９８７年１２月１７日にブタペ
スト条約に基づきＡＴＣＯへ寄託し、受託番号ＡＴＩり
　６７５８４が付与された。

これらの微生物を培養し、次−で浴解して、ＩＦＮ−β
２倉含む抽出物を和製した。

のａ製 ポリエチレンイミンによる沈縦次いでＤＢＡＩ！ｆセル
ロースに通すことによって、核酸フリーのバクテリア抽
出物を得た。流出フラクションヲ、１０ｍＭ　Ｎａアセ
テートバッファー（−５）（バクファー、ｌ中のβ−セ
ファロースに吸着さセ、０−０．０３　Ｍ　Ｎａ０Ｊグ
ラゾエントで溶出させた。活性フラク７ヨ／を集め、バ
クファー人に対して透析し、次いでＭｏｎｏ−８ＦＰＬ
Ｌカラムに付しＯ−０，０３Ｍ　Ｎａ０Ｊグラゾエント
で溶出した。精製期間中ＨＧＩＦ活性をモニターした所
、ＩＦＮ−β２ＯＮ末端ペプチドに対するポリクａ−ナ
ル抗体上用い次イムノプロットによって検出されるＩＦ
Ｎ−β２蛋白と一致した。ｉ＆終的に得られる調製物ｉ
　８Ｄ８−ポリアクリルアミドデル電気泳動に付した所
、約２０ｋＰａの一本のバンドが現われた。

ｄ（Ａ８）に濃縮し、０．５　Ｍ　Ｎａｐ／　（Ｘ　７
．０　）（Ａ４の場合）６る−はｌ　Ｍ　Ｎａ０Ａ！　
（Ａ　８の場合）を加え九すン散緩衝化食塩水（ＰＢＥ
Ｉ　）中のモノクローナル抗体！＋４−１（腹水から得
た工ｇ）吸着カラム８−（８η工ｇ／ｄ力２ム）に付し
た。同じバクファーでカラムを洗浄後、５ＱｍＭクエン
酸バッファー（ｐｌ（２）（Ａ４の場合）あるいは同様
のクエン酸バク７アーとプロピレングリコール２５％（
Ａ８の場合〕で溶出し、得られるサンダルに直ぐＩＣＯ
，Ｉ　Ｍ　Ｈｏｐｅｓバッファー（ｔＪ１８．５１加え
て中和した。得られる結果は次の通ジである。

ロード　　　　　９０ｍ　　　５．７０ＣＭ　２９ミリ
オンＵ　　３２５．０００　　５．ｉ００溶出トータル
　４０ｙ　　　　　８．２１η　２．９ミリオンυ（チ
ューブ３）　　１０ｓｕ　　　　２．２η　　　　　　
　　１１０，０００５００．０００発酵槽培養液３−６
１から得られるＤｙｎｏｍｉｌｌ抽出物１−１．５Ｊｉ
ポリエチレンイミンで沈殿させ、得られる浴ｇ、を１０
０４（Ａ４）又は５００Ａ　８　：　ＪｃｏｌｉＩＦＮ
−Ａ２の免疫学的精製８１２　：　イムノアフィニティ
ー後の８−セファロース精製ロード ３５０ｉ　　２．５５ＣＪｎｇ　１０：リオ：’Ｕ　　
３３０．０００　４．１００溶出トータル　　　３’７
ｍｌ　　　５．２■　２０ミリオンσ　　　　　　　　
４，２ミリオン（チューブ３）９．５ｄ　　　　　　２
Ｔ！１９　　　　　　　　１３ミリオンイムノアフイニ
テイー後、Ｂ−セファロースカラム金用いて最終的に精
製し友。典型的な実験（ｓ１２）では、Ａ４クラクショ
ンを集めて更に１０ｍＭ酢酸バッファー（−５）に対し
て透析して、これをカラムに付し、０．１−０．４　Ｍ
　ＮａＣｌグラゾエントで溶出した。０．３　Ｍ　Ｍａ
ｉｌの時に活性ピークが溶出し九。得られる結果は以下
の通りである。

インプット： Ａ４プール ＰＦ′＋５透析 溶出ニ ドータルビーク チューブ５８ ０．５ミリオン １″１５＊　　　３．６ダ　　１．４ミリオンリ２２５
ｍｔ　　　２，２”７ Ｄ ４５ｗ　　　　０．６■　　０．９ミリオンＵ　　　　
　　　　　　２ミリオン［１，５ｊ　　　Ｏ，０４１号
　　　　　　　　　　　２１０．０００　　５．２ミリ
オンこの工程での収量は６４％でｂつ九。得られる生成
物を、還元条件下及び非還元条件下でＢＤＢ　−ポリア
クリルアミドデルに付し死所、２１Ｋａに１本のバンド
が現われた。

例６ 乳癌細胞の成長抑制 工？Ｎ−７２／工ｘＪ−６はプラズマ細胞腫／ハイプリ
ドーマ細胞の成長茫促進する（　ＨＧＦ活性ンが、他の
細胞の成長を抑制する。不発ＦＩＡ渚は、ヒトＢｒ５ａ
ｓｔ　Ｄｕｃｔａｌカルシノーマ細胞のＴ４７Ｄライン
（ＡＴＯＣＨＴＢ　１３３　）のコロニー形成について
調べた。コロニー形成はＩＦＮ−β１によってわずかに
抑制されるだけであるが、工ＩＰＮ−β２による抑！ｆ
ｉｌＪに対しては感受性を示した。第１１図には、純粋
なＥ、ｃｏｌｉ　ｒＩＦＮ−β２／工ｒ、、−６による
培養皿中のＴ４７Ｄコロニー形成の抑制効果が示されて
いる。１０−２０　ＨＧＰυ／厘Ｉで５０％抑制効果が
観察された。１００Ｕ／、ｊの量では、生存したコロニ
ーは極めて／ｈさく、成長が抑制された細胞がほとんど
であった。Ｊｃｏｌｉ　ｒＩＦＮ−β２／工Ｌ−６又Ｈ
０）Ｔｏ細胞ｒＩＦＮ−β２／ＸＬ−６によるセミコン
フルエントＴ４７細胞の３Ｈ−チばシン取込み抑制は、
尻重ＦＮ−β２モノクローナル抗体によって中和された
。

Ｔ４７Ｄ細胞の３Ｈ−チミジン取込み抑制が真実の成長
抑制を示しているかどりかｔ調べるために、１５日間ク
ローン原性アッセイを実施した（第１２図）　、　Ｅ、
ｃｏｌｉ工ＩＦＮ−Ａ２の２　Ｂ８Ｆ　−２σ／ｄによ
ってＴ４７Ｄ細胞のコロニー数カ５０％減少し、５０Ｕ
／−でほとんど完全に成長が抑制された。擬似調製物で
は成長抑制活性を示さなかつ九〔第１２図〕。同様の実
験糸で、工ＩＦＮ　−β１５００抗ウィルスＵ／ｍでは
Ｔ４７Ｄ細胞の成長抑制は観察されなかった。他の乳癌
カルシノーマセルラインＭＯ？　−７（ＡＴＯＯＨＴＢ
　２２　）についても同様にＩＦＮ−β２によるコロニ
ー形成抑制が観察された（第１２図ｂ）。３Ｈ−チミジ
ンの増込みについては、Ｔ４７Ｄ細胞よりもＭＯ？　−
７の方がわずかに感受性か低くかった。

クローン原理アッセイを行なうために、６−ウェル０Ｏ
ａｔａｒプレートのウェルに、Ｔ４７Ｄ＃ｌ胞はウェル
１個当カ２００個の割合いで、ＭＯ？　−７はウェル１
個当９１０００個の割合いで、細胞金接穏した。ウェル
中には、１０％胎児クシ血清（ｙｅｓ　）、インシュリ
ン０．２ＴＪ／ｄ、グルタミン２ｍＭ、ペニシリン１０
０Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μ９／ｌｌ’
！：含むＲＰＭ工１６４０培地１ｄ１に加えた。２４時
間後に、Ｂ、　ｃＯＸｉＩＦＮ−Ａ２あるいは擬似Ｅ、
ｃｏｌｉ調夷物の同じ蛋白濃度の一連の５倍希釈ｇ、を
加えたｅ、１５日後にコロニーにクリスタルバイオレッ
トを加えて染色し、倒立顕微鏡で計測した。ＤＮＡ合成
を測定するために、９６−ウェルプレートに、１ウェル
当り１５−２５Ｘ１０３個の細胞を接種し、６日後にＦ
ｏｅ　ｆ取出して２４時間放置し、Ｍ、ｃｏｌｉ　ＸＦ
Ｎ　−β２あるいは擬似調製物の一連の５倍希釈液をＷ
えた新たな培地に那えた。１６−２４時間後に、１５μ
Ｏ１／　ｄ　’Ｈ−チきシン（２５０１／　ｍ　ｍｏｌ
。

Ａｍｅｒａｈａｍ　）で１時間細胞をラベル化し、ＰＨ
１で２回洗浄し、４℃で６０分間５％）リクロロ酢酸（
ＴＯＡ　）で処理し、５％ＴＯＡで６回洗浄した。得ら
れる沈殿を６７℃で３０分間０．２　Ｍ　ＮａＯＨ３，
１ｍｅ中に苗解し、２ＭＨｃ１０．０１ｄで中和し、次
いで、トルエンシンチレータ−及びＬｕｍａｘ　（３：
　２ｖ／ｖ　）を用いてＴｒｉｃａｒｂカウンターで計
測した。

血清金与えない場合にも同様の結果が得られた。

３Ｈ−チミジンの取込みは低いが、抑制は同じであった
。

ＩＦＮ−β２を含む抽出物についてＢ８Ｆ　−２活性を
アッセイした。即ち、該抽出物処理に対して応答するｃ
Ｅｓｓ細胞による工ｇＧ分泌促進に基づいてＢ８Ｆ活性
を測定した（　Ａ、Ｍｕｒａｇｖｃｈｉ　ｅｔ　ａ’１
．。

（１９８１）Ｊ、工ｍｍｕｎｏ１．１２８　、Ｉ）Ｐ、
　１２９６−１３０１　；　Ｔ、Ｈｌｒａｎｏ　ｅｔ　
ａｌ、＋　（１９８５）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、　ＵＢＡ　８２　、　ｐｐ、　５４９０−５
４９４）。１九、プラズマ細胞独セルラインＴ１１６５
　（ＲｏＰ、ＮｏｒｃＬａｎとＭ、ＰＯｔｔｏｒ＋　（
１９８６）Ｅｉｃｉｅｎｃｅ　２３３　、ｐｐ、　５６
６−５６９　）の成長を補助する能力を測定することに
よって、ＨＧＩＩ’活性もアッセイし７’？、、Ｔ１１
６５Ｍ胞での３Ｈ−チミジンの取込み促進及びｃｚｓｓ
細胞による工ｇＧ分泌促進は、１：１２，５００希釈液
の時に最大値の手分の効果を示した。従ってこの値’１
Ｂ８Ｆ−２／ＨＧＦ活性の１ユニツトと定義した。この
単位′Ｉｋを本実験で用いた。

例７ 骨髄性白血病ｍＭ＆の成長抑制及び分化訪導ＩＦＮ　−
／　２は骨髄性白血病細胞の成長を抑制し分化誘導する
作用を有している。ムリン骨髄性Ｍ１細胞及びヒト組織
球すンパ腫Ｕ９５７ｍ胞ｔ。

１０％胎児ウシ血ｍｃＸ’ｃＥ３）’ｘＭＪえたＲＰＭ
Ｉｉ６４０培地中で生育せしめ九。１２−ウェル０ｏｓ
ｔａｒグレートに、１ク工ル当９１０５個の割合いで、
細胞？接ｌし友。純粋なに、ｃｏ１１ＩＦＮ−β２　’
ｋ　０．１−７５１１９　／　ａｌ加えて、４−６日間
培養細ａｔ−観察した。ａＢｃｌ数金計測し、！３１ｇ
ｍａ社（Ｂｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のα−す７ｆルアセ
テートエステラーゼキノト９ｌ−Ａｔ−用いて、Ｇｉｅ
ｍａａ及び非特異的エステラーゼ用に染色した。０．５
％Ｔｒｉｔｏｎ　−Ｘ　ｉ　Ｑ　Ｑ細胞抽出物中のリン
チーム活性を、ＭｉｃｒＯｃｏｃｃｕｓｌｙｓｏｄｅｉ
ｋｔｉｃｕａ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ、）の溶解１１度測
定によりアッセイすることによって測定した。卵白リン
チームを用いてキャリブレーションを行なった（　Ｗａ
ｉｓｉｎｇｅｒｅＧと５ａｃｈｓ、Ｌ、　（１９８３）
　ＦｉＭＢＯＪ、　３　、　ｐｐ、　２１０３−２１０
７）。Ｎｏｎ１ｄｅｔ　−Ｐ　４０　ｍ胞抽出物中の＜
２’−５’）オリが一人シンセターゼ活性をアッセイし
た（　Ｒｅｅｈｉｔｚｋｙ　ｅｔ　ａｌ、。

（１９８６）　０ｅｘ１＋　４６　、　ｐｐ、　３１−
４０　）。

表４ 骨髄性白血病Ｍ１細胞の成長に対する Ｂ１１　ｕｙｔｓｔ　　　０口 １日　４日　　５０　６Ｅ３ ２．３　　１？、（］　　　２５．［］　　　５５．０
２．０　　３．５　　０．９　　０．７１．４　　２．
３　　０．８　　１．２４＃：　Ｍｏｎｏ−８’ＰＰＬ
Ｃにより鞘表された組換えＥ。

ｃｏｌｉ　ＩＦＮ−β２（例５Ｃ） ＩＦＮ−β２を■え／ｌＶｈ場合には、Ｍ１細施は培養
皿に付着することなく生育し、典型的な骨髄芽球形態を
示した。これに対して、工？Ｎ−β２（ｆ−加えて培養
した場合には４日後に、Ｉａ胞は培養皿に付着し、著し
い形態の変化を示した（第１６図鬼細胞の約６０％はフ
クロファージ様の形態となり、残りの細胞は各種の成熟
度を有する形態となっ之。

細胞質は大きくな９、液胞上方し、典型的な泡状聾を示
した。核は中心から離れ、丸さがなくなり、著しい変化
を示し、隆起した核小体が少なくなった。生存細胞数を
計測した所、コントロール培養Ｉ（０胞は６日間生育し
、他方、ＩＦＮ−β２　５０Ｕ／ｄで処理したＭ１細胞
は２−３分の１になり、成長が抑制された（表４）。接
種４日後にＭ１細胞数’に５０％減少させるには、ＩＦ
Ｎ−β１ａ−Ｉ　Ｕ／　ｍｔ　（７″ラズマ細胞腫成長
ユニツトで表わした値ン以下与えれば十分であった。成
長抑！ｔｔｌＪ効果はＩＦＮ−β２約３０　Ｕ／ｄ（１
５ｎｆｌ／ｄ）で最大値を示した。化学的に精製され７
ｔｒＩＦＮ−β２の場合でも、この濃度はｂｐｓ　２．
５　ｐｇ／　ｍｌ以下に相当する。尚、ＬＰ８２．５　
ｐ＆／ＩＬｔテｈ　Ｍ　１　ａ胞ＶＣ対シーＣ何んらの
効果も示さない。ＩＦＮ−β２をポリミキシンＢ５μ、
ｊｉ’　／　ｄとともに加えて更にトレース量のＬＰ８
の作用を除いた場合でもＭ１細胞の成長抑制及び分化誘
導が観察された。分化誘導の生化学的マーカーとして、
ｘｙ’ｎ−β２　３０Ｕ／ＩＬｌテ４日間培養したＭ１
細胞５　Ｘ　１０’個の抽出物のリンチーム活性を測定
した。コントロールＭ１培養細胞ではリンチームは検出
されなかつ友。ＩＦＮ　−β２で処理した場合には、５
Ｘ１０６個の細胞当シリンチーム０．８５μｙに相当す
るレベルでリンチームが誘導された。ラテックスビーズ
上の食作用活性も、分化誘導されたＭ１細胞につ−て観
察された。

他の災験系では、Ｍ１培養細胞にＩＦＮ−／２／工Ｌ−
６を添加することによって２４時間後に細胞の成長が抑
制され（第１４図）、マクロ７アーシへの分化誘導が起
こる。２４時間後には、細胞の細胞質が大きくなって動
原体のない核となり、６−４日後に典型的なマクロ７ア
ークの形ｍｔ示した。これは、リンチーム食作用活性の
上昇及びＭａｃ　１抗原の上昇に工っで証明された。ｒ
ｌＦ’Ｎ−β２約０．５　ｎＪｉ’　／　ｍｌでＭ１細
胞の５０％成長抑制が観察され、この値は、プラズマ細
胞腫Ｔ１１６５ｍ胞の促進に必要な量よりも少ない。Ｉ
ＦＮ−β２／工Ｌ−６の効果の発現は、ｘｘＪ−１（１
０Ｕ／ｍ）とＴＮＩＦ　（１０２Ｕ／ｄ）とを組合わせ
た場合よりも早い。この組合わせの場合には４８時間後
に初めて成長の抑制効果が現われる。これらのサイト力
・インもＭ１λ１ｕ胞の分化誘導を引き起こし、工？Ｎ
−β２／工Ｉ、−６のインデューサーとして九られてい
る。ＩＰ’Ｎ−β２／工Ｌ−６による成長抑制はモノク
ローナル抗体６４によって十分に中和される。

表　　５ 朗賎球すンパ腫Ｕ９６７細胞の成長 及び分化誘導に与えるＩＦＮ−β２／ １４、Ｃ １０，０ ２６，７ ２６，５ １４，５ （１００）、０ Ｍｏｎｏ−８ＦＦＬＯで精製したｒ工Ｆ’Ｎ−β２（例
５０）で５日間処理した細胞及び未処理ｌ１４１！ｌ＠
を用いた。

ヒト組織球すンパ腫Ｕ９６７細胞は、ホルボールエステ
ル、ビタミンＤ３によって分化誘導することが出来、ま
たＩＦＮ−ガンマによっても部分的に分化誘導すること
が出来、更に他の未だ同定されていないサイトカインに
よっても分化誘導することが出来る。本発明名らは、Ｕ
９６７培養細胞にＩＦＮ−β２　１００ＨＧＦ　　Ｕ／
肩ノをＷえた時の効果を調べた。４−５日後に、約２５
％の細胞が単球／マクロ７アーゾ様形態ヲ示し、６０％
の細胞が成長抑制された（表５）。分化誘導の生化学的
マーカーとしてのα−す７チルアセテートエステラーゼ
用にＮＡ胞を染色した。工？Ｎ−ガンマによっては分化
誘導は起らない。工１？′Ｎ−β２で処理した培養細胞
の約ｌ／４が非特異的エステラーゼについて強いポジテ
ィブ特性を示し、他方、未処理培養細胞（表５）ではポ
ジティブ細胞はほとんど観察されず、また擬似調製物処
理し７を場合もほとんど観察されなかった（結果は示さ
れていない）。

純粋なｒＩＦＮ−β２の調製物の添加量が多くなれは、
それにつれて、成長抑１１ｉ１Ｊ　（表５）、及び細胞
質の拡大あるいは核のくほみなどの部分的形態変化が促
進される。しかしながら、不発８Ａ者は、ＩＦＮ−ガン
マとともにＩＦＮ−β２を加え九場合には、工ＸＦＮ−
β２の低ドーズでの効果が有意に増加すること全見出し
た（表６）。この条件下では、細胞の成長が抑制され、
はとんどの細胞が、細胞質の拡大、核の型の変化及び核
小体の減少を示し友。但し、単球の分化誘導は不完全で
あった。本発明名は、ＩＦＮ−ガンマ１００Ｕ／ｄとＩ
ＦＮ−β２（１−１０ＨＧＦｔｌ／−９とｔｉ酋わせる
ことに工って、相乗効果を発揮し、成長抑制及び分化誘
導の作用が増強されること【見出した。最適条件下では
、ＩＦＮ−ガンマ単独で１０％の成長抑制が起こり（６
日凌〕、エフＮ−β２単独で２５％の抑制が起こるが、
工１’Ｎ−ガンマとＩＦＮ−β２とを組合わセると９０
％の抑制を示す。

表　　６ との相乗効果 エフＮ−β２ ＢｓＦ　Ｕ／ｄ ＩＦＮ−ガンマ　細胞数 Ｕ／ｄ　　　Ｘ１０−’ １００　　　８．５（４２） （２’−５’　ンシンセター→ヱＹごＡどｔ”Ｐ−Ａ２
’　Ｉ）Ａ、　ｃｐｍ ４．０００ イムノアフィニティーカラムで精製したｒＩＦＮ−β２
で６日間処］し九細胞及び未処理細胞を用いた。

工ＦＩＪ−ガンマを加えることによって、ＩＦＮ−β２
による（２’−５’）オリ♂Ａシンセターゼの誘導も強
く促進され（表６）、この＄実から、Ｍ１細胞の場合の
ような完全な分化誘導を起こすには更に他の成分を加え
る必要があるかもしれないが、この２つのサイト力イン
は協力して分化誘導工程を進行させていることが判る。

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ　）の新鮮な白血病細胞に対
するＩＦＮ−β２活性についても調べた。ＡＭＬ患名の
末梢血単核細胞をｒＩＦＮ−β２／より−６と共に５日
間イン中ユベートした所、芽球の割合いが減少しくコン
トロール培養細胞で２０−３０に、ＩＦＮ−β２／工ｒ
、＋−６処理細胞で６−１２％ン多口の分化段階におけ
る骨髄球型が上昇し且つ芽球に対する骨髄単球の割合い
が上昇した。２人のＡＭＬ　、’Ｊｌ渚について調べた
結果は表７に示し九。

ＧＭ−Ｃ！ＢＦについてもテストしｆｃ（比較用）。工
ＩＦＮ−／２／工Ｌ−６は新鮮な白血病細胞に対しても
作用するため、このようなテストは、　ＡＭＬに対する
サイトカインの治療効果ｔ′：５！−想するのに有用で
ある。

表　　７ ＡＭＬ患者から得た加液細胞に 例８ ０Ｆυ−ｍ１ｘ　（コロニー形成ユニツ）−ｒｔａｇ、
単球、赤芽球、巨核球ノ、○ｙｕ−ｏｎ　（コロニー形
成ユニット−顆粒球、単球）及びＢＦＵ−Ｅ　（バース
ト形成ユニット−赤芽球）コロニーのプロゾエニター全
除去するために４−ヒドロギシンクロホス７アミド（４
−ＨＣり（１００μｐ／ｄ、５０分）で処理した単球及
びＴａ胞を含まないヒト骨髄細胞ゲ用いて、造血分化の
初期の段階に商えるｒＩＦＮ−β２／ＭＬ−６の効果を
調べた。細胞をメチルセルロース上にプレート（１０５
細胞／ｄ）した「、テ・にＩＦＮ−β２を加えた所、Ｉ
ＦＮ−β２によってはコロニーの成長は促進されなかっ
たことから、ＸＦＮ−β２は成長促進ＣＬＦ　（コロニ
ー促進因子）としては機能しないことが判った（第１５
図〕。

しかしながら、顆粒球単球（ＯＧＵ−ＧＭ　）　Ｒ現型
並びに混合型（ａｙｔｙ−ＧｚｕＭ）及び赤芽球（ＢＦ
Ｕ−に）についてのコロニー形成を工Ｌ−３が誘導する
能力を工Ｆ’Ｎ−β２／工’ｂ−６が著しく増強せしめ
た。

この作用に関しては、ＩＦＮ−７ｙ２／工Ｌ−６は工ｒ
、−１よυも強力である（第１５図）。細胞上十分なＣ
８Ｆとともにメチルセルロースにプレートする１週間前
に工？Ｎ−β２／工Ｌ−６に培養液に加える２工程アツ
セイ系では、ＩＦＮ−β２／工Ｌ−６単独によって、Ｃ
８Ｆに応答する前駆細胞の数が上昇した（第１５図右側
）。この上昇度は工Ｌ−６によるそれよりもほんのわず
かに低いだけでおり、２つの因子はこの最初のアクセイ
工程では独立に作用していると考えられる。第１５図で
は１１５日後にコロニーを計氾すし、ＯＦ’Ｕ−ｍｉｘ
　％ＣＰＵ−ＧＭ　。

ＢＦＵ−Ｅとして分類した。右側半分は、何も加えない
で培養Ｏ８目（１０％胎児ウシ血渭及びエリスロボイエ
テン）、及び１Ｑ　ＨＧＦ　Ｕ　／　ｐｇ　ｒＩＦＮ−
β２／より−６，２Ｕ　／　ｗｌ　ｒより−１、ｌ　Ｑ
　Ｕ　／　ｄ　ｒ工Ｌ−６、ＩＦＮ−β２／工Ｌ−６＋
工Ｌ−３又は工Ｌ−１＋工Ｌ−３を加えたｊ＠養０日目
？示す。

右側半分は、何も加えないであるいはｒＩＦＮ−β２／
工ＩＪ−６、ｒ工Ｌ−ｉ、ｒ工Ｌ−３、工１’Ｍ−Ｉ１
２／工Ｌ−６＋工Ｌ−３又は工Ｌ−１＋工Ｌ−５を加え
て則ｗｉ’ｊｒ：培養液中で１週間インキエベートした
場合である。久いで、　ＰＨＡ−誘導白血球ならし培地
（全てａｓｙ　２含む）とともに細胞を１５日間メチル
セルロースにプレートし、コロニーａ　’ｋ　計ＩＩし
た。正常な骨髄前駆細胞からの混合型コロニーの形成促
進効果は有意に高く、骨髄移植にｒＩＦＮ−β２／工Ｔ
Ｊ−６を使用できることを十分に保証するものでちる、 例９ 、嚢推芽細胞における補体内子Ｂの誘導ヒト二倍体皮膚
組維芽細胞ＧＭ８３９９でのＩＦＮ−β２（二よる補体
内子Ｂの誘導を調べた。イムノアフィニティーカラムに
よって稍製しｔＩＦＮ−β２ｒ単独で用いた時にも補体
因子Ｂの分泌がａ）淳されたが、この効果についてもＩ
ＦＮ−ガンマ：てよってその効果が増強された。補体因
子Ｂは、抗体なしにバクテリアあるいは寄生虫で殺すこ
とのできる補体の他の経路に必須の成分であジ、従って
ＩＦＮ−β２のこの効果は極めて」喪である。

このような感染性病原体に対する局所での抵抗性は、Ｉ
ＦＮ−β２とＩＦＮ−ガンマと？組合わせて用いること
によって増強されると考えられる。補体因子Ｂ活性のア
クセイを行なった所、細胞を溶解する補体活性が上昇し
次ことが示された。ＩＦＮ　−ガンマとＩＦＮ−β２と
の相乗効果により、この組合わせが望めてＡ要なことが
判る。

本発明によれば、ヒトＩＦＮ−β２ｔ−１乳癌、急性骨
髄性白血病などの白血病、バクテリア又は寄生虫によっ
て引き起される感染性疾患などの治療用に用いることが
出来、また骨髄移植の際に使用することも出来る。ヒト
エＩＦＮ−β２は、感染性疾患あるいはあるｌの白血病
の治療用には、他のサイトカイン、特にＩＦＮ−ガンマ
と組合わせて用いることも出来る。もちろんＩＦＮ−β
２単独で用いることも出来る。ＩＦＮ−β２は、治療が
必要とされる患者にとって適当であればいずれのルート
によって投与することが出来る。ＩＦＮ−β２は、１つ
もしくはそれ以上の楽学的に許容し得る担体とともに製
剤化することが出来、非経口、静脈又は皮下投与によっ
て、あるいは錠剤、カプセル剤の形態で経腸投与によっ
て、全身的に投与することが出来る。

投与する活性成分の食は医者によって決定され、それは
、症状、患者の体重、年令、！Ｂ名の一般的な状態、投
与ルート、ＩＦＮ−β２の比活性などに応じて変動する
。１日の投与量は、約５μｓ−約８００μＩ、好ましく
ｕｌｏ−１００μＩの範囲である。

本発明の楽学的組成吻は、単位投与形態にあるのが便宜
的でめ９、当偵壜に公昶の方法に１って単位投与形態に
成型することが出来る。

４、図面の１ｉｔ１９１）Ｌな説明 第１図は、ｘｙＮ−／ｊ２のヌクレオアト配列及びアば
ノ改配列金示す。

第２図は、プラスミドｐＥＩＶβ２ＨＢの構築を示す。

第６図は、シラスミｔ’　Ｘ）ＲＸ／’ｚ　ｂ　０２及
びｐＲＩβ２６０４の（４築を示す。

第４図は、クエスタンプロクティングによるＩｎ−β２
調劇物の分析結果を示す写真である。

２ｇ５図は、ＩＦＮ−β２の解崩７ラククヨンｔＳＤ１
３−ＰＡＧＥに付して銀染色した結果を示す与兵である
。

第６図は、シラスミ？　ｐ８’７β２２９の構築を示す
。

第７図は、モノクローナル抗体３４−ＩＬ−用い九アフ
ィニティークロマトグラフィー後の、　ＯＨＯクローン
Ａ２−５−１０によｐＭ生さ九る工？Ｎ　−β２を含む
非請合フラクションのＨＧＩＦ活性を示す。

ｍ８＋−１は、モノクローナル抗体３４−１に用いたア
フイニテイクロマトグ−）フィー後の、ＣＨＯクローン
Ａ２−５−１０によｐ１生される工ｙＮ−７２き含む鼎
出フラクションのＨＧＦ活性を示す。

第９図は、！ラスミドＰＴＬβ２５０１及びＰＫＬ”２
７の溝渠を示す。

第１０図は、イムノアフィニティーカラム及びＳ−セフ
ァロースによるＩＭ　ａ　７Ｊｉ、の、Ｎ２．　ｃｏｌ
ｉＩＦＮ−β２金ＳＤ＆−ＰＡＧＥに付して銀染色した
結果を示す写真でちる。

第１１図は、乳癌セルツインＴ４フＤコロニー形成のコ
、　ｃｏ１１ＩＦＮ−β２による抑制を示す。

第１２図は、乳癌セルラインＴ４７Ｄ及びＭＯ？−７細
施のに、ｃｏｌｉ工菖−β２ケ用いたクローン原性アク
セイの結果を示す。

ｆｆ１１３図は、生物の形態を示す写真であって、Ｅ、
ｃｏｌｉエフＮ−β２によって誘導される骨髄性白血病
Ｍ１細胞の分化誘導を示す。

Ｎ１４回は、工ＩＦＮ−β２　（ＨＧＦユニット／−１
）により処理した骨髄性白血病Ｍ１細胸の成長及びＣ７
−５′）オリゴＡシンセターゼ誘導を示す。

第１５図は、正常ヒト骨髄から得られる造血コロニーの
成長に及はすＩＦＮ　−１２の効果を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ヒト天然インターフェロン−β２（ＩＦＮ−β２
   ）及びヒト組換えＩＦＮ−β２の両者に特異的に結合す
   るヒトＩＦＮ−β２に対するモノクローナル抗体。 （２）ヒト組換えＩＦＮ−β２が、Ｅ．ｃｏｌｉにより
   発現されるヒト組換えＩＦＮ−β２及び１又はチヤイニ
   ーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により発現されるヒ
   ト組換えＩＦＮ−β２である請求項１記載のモノクロー
   ナル抗体。 （３）ＩｇＧ１クラスのモノクローナル抗体である請求
   項１又は２記載のモノクローナル抗体。 （４）請求項１−３のいずれかに記載のモノクローナル
   抗体を産生するハイブリドーマセルラインであつて、ヒ
   トＩＦＮ−β２又はヒトＩＦＮ−β２を含む融合蛋白で
   あらかじめ免疫化したマウスから得られる脾細胞とムリ
   ンミエローマ細胞とを融合することによつて得られるハ
   イブリドーマセルライン。 （５）融合蛋白がプロテインＡ−ＩＦＮ−β２である請
   求項４記載のハイブリドーマセルライン。 （６）ハイブリドーマセルラインＣＮＯＭＩ−８１３（
   Ｎｏ．３４−１）。 （７）請求項１記載のモノクローナル抗体の調製法であ
   つて、 （ａ）ヒトＩＦＮ−β２又はヒトＩＦＮ−β２を含む融
   合蛋白でマウスを免疫化し； （ｂ）該マウスから得られる脾細胞とムリンミエローマ
   細胞とを、適当な融合プロモーターの存在下で融合せし
   め； （ｃ）融合細胞を培養し、次いで、上記（ａ）で用いた
   ＩＦＮ−β２とは異なる由来のヒトＩＦＮ−β２を用い
   て、融合細胞の培養液の上清について目的とするモノク
   ローナル抗体の存在をテストし； （ｄ）目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブ
   リドーマを選択してクローニングし；次いで（ｉ）選択
   したハイブリドーマセルラインを適当な生育培地中で培
   養して、培養液の上清から目的とするモノクローナル抗
   体を回収する；又は （ｉｉ）選択したハイブリドーマセルラインをマウスに
   注入して、該マウスの腹水から目的とするモノクローナ
   ル抗体を回収する； ことからなる上記方法。 （８）上記（ａ）において、Ｅ．ｃｏｌｉで発現される
   融合蛋白プロテインＡ−ＩＦＮ−β２でマウスを免疫化
   し、上記（ｃ）において、ＣＨＯ細胞で発現されるＩＦ
   Ｎ−β２を用いて融合細胞の培養液の上清をテストする
   請求項７記載の方法。 （９）ハイブリドーマセルラインＣＮＣＮＩ−８１３を
   適当な生育培地中で培養して、その培養液の上清からモ
   ノクローナル抗体を回収する、あるいはハイブリドーマ
   セルラインＣＮＣＮＩ−８１３をマウスに注入し、その
   マウスの腹水からモノクローナル抗体を回収する、請求
   項１−３のいずれかに記載のモノクローナル抗体の調製
   法。 （１０）請求項１−３のいずれかに記載のモノクローナ
   ル抗体の調製に用いるための抗原性融合蛋白プロテイン
   Ａ−ＩＦＮ−β２。 （１１）固相支持体に結合した請求項１−３のいずれか
   に記載のモノクローナル抗体を含む免疫吸着カラムに、
   ヒトＩＦＮ−β２を含むサンプルを通すことからなるヒ
   トＩＦＮ−β２の免疫学的精製法。 （１２）精製するヒトＩＦＮ−β２が、ＣＨＯ細胞又は
   Ｅ．ｃｏｌｉによつて産生されるヒト組換えＩＦＮ−β
   ２であり、ＩＦＮ−β２を含むフラクシヨンを溶出して
   溶出直後に中和し更にＭｏｎｏＳイオン交換カラム又は
   Ｓ−セフアロースカラムで精練する請求項１１記載の方
   法。 （１３）請求項１１又は１２記載の方法によつて得られ
   る精製ヒトＩＦＮ−β２。 （１４）成熟型ヒトインターフェロン−β２のアミノ酸
   配列を含む非グリコシル化ポリペプチド。 （１５）分子量約２０，０００の一本鎖ポリペプチドで
   ある請求項１４記載の非グリコシル化ポリペプチド。 （１６）ヒト成熟型インターフェロン−β２のアミノ酸
   配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列及び調
   節領域を含む組換えベクターであって、バクテリア細胞
   中で該ポリペプチドの発現が可能なような位はにこれら
   が位置している組換えベクタ（１７）ベクターがプラス
   ミドｐＫＫβ＿２７である請求項１６記載の組換えベク
   ター。 （１８）ベクターがプラスミドｐＴＬβ＿２５０１であ
   る請求項１６記載の組換えベクター。 （１９）請求項１６−１８のいずれかに記載の組換えベ
   クターで形質転換された微生物。（２０）Ｅ．ｃｉｌｉ
   ＪＭ１０５／ｐＫＫβ＿２７（ＡＴＣＣ６７５８３）で
   ある請求項１９記載の微生物。 （２１）Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０５／ｐＴＬβ＿２５０１
   （ＡＴＣＣ６７５８４）である請求項１９記載の微生物
   。 （２２）請求項１９−２１のいずれかに記載の形質転換
   微生物を培養し、該微生物にポリペプチドの発現を行な
   わせ、次いで該ポリペプチドを回収することからなる請
   求項１４又は１５記載の非グリコシル化ポリペプチドを
   製造する方法。 （２３）ヒトＩＦＮ−β２及び薬学的に許容し得る担体
   からなる、乳癌、白血病、感染性疾患又は骨髄前駆細胞
   障害治療用薬学的組成物。 （２４）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）治療用の請求項２
   ３記載の組成物。 （２５）任意にＩＦＮ−ガンマとともに用いる、バクテ
   リア性もしくは寄生虫性疾患などの感染性疾患の治療用
   の請求項２３記載の組成物。