JPS61115024A - Ｂ細胞分化因子の製造法 - Google Patents
Ｂ細胞分化因子の製造法Info
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- JPS61115024A JPS61115024A JP59235199A JP23519984A JPS61115024A JP S61115024 A JPS61115024 A JP S61115024A JP 59235199 A JP59235199 A JP 59235199A JP 23519984 A JP23519984 A JP 23519984A JP S61115024 A JPS61115024 A JP S61115024A
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- cells
- human
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明は、人について活性を有するＢ細胞分化因子（
以下ｒＢ ＣＤ Ｆ Ｊと記す）に関する。
以下ｒＢ ＣＤ Ｆ Ｊと記す）に関する。
従来の技術
抗原刺激を受は活性化された成熟Ｂ細胞は、Ｔ細胞の助
けにより分裂増殖するが、さらにＢ細胞が抗体産生細胞
にまで最終的に分化するには、１種またはそれ以上のＴ
細胞由来の分化誘導性の物質が必須であることが知られ
ている。
けにより分裂増殖するが、さらにＢ細胞が抗体産生細胞
にまで最終的に分化するには、１種またはそれ以上のＴ
細胞由来の分化誘導性の物質が必須であることが知られ
ている。
この物質の存在はＲ，Ｗ、 Ｄｕｔｔｏｎら、丁ｒａｎ
ｓｐｌａｎｔ。
ｓｐｌａｎｔ。
Ｒｅｖ、 ２３ ０Ｂ（１９７５）、 Ａ、 Ｓｃｈｉ
ｍｐｌとＥ、Ｗｅｃｋｅｒ−ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｎ、
Ｂｌｏｌ、 ２３７．１５（１９７２）、により明らか
にされた。彼らはマウスのリンパ球混合物培養後の培養
上滑中または抗原やマイトゲンにより刺激を受けたマウ
スのリンパ−球・培養上清中に存在する物質が、マウス
のＴ細胞を除去されたリンパ球細胞集団やヌードマウス
由来のリンパ球のヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）に対する１
次免。
ｍｐｌとＥ、Ｗｅｃｋｅｒ−ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｎ、
Ｂｌｏｌ、 ２３７．１５（１９７２）、により明らか
にされた。彼らはマウスのリンパ球混合物培養後の培養
上滑中または抗原やマイトゲンにより刺激を受けたマウ
スのリンパ−球・培養上清中に存在する物質が、マウス
のＴ細胞を除去されたリンパ球細胞集団やヌードマウス
由来のリンパ球のヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）に対する１
次免。
疫応答を増幅させることを見出し、そのような作用を有
する活性物質にＴす／バ球代替因子、すなわちＴＲＦと
いう呼称を与えた。それ以来ＴＲＦは、抗原非特異的に
主要組織適合遺伝子複合体（以下、ＭＨＣと略称する。
する活性物質にＴす／バ球代替因子、すなわちＴＲＦと
いう呼称を与えた。それ以来ＴＲＦは、抗原非特異的に
主要組織適合遺伝子複合体（以下、ＭＨＣと略称する。
）の一致を必要としない様式でＢ細胞に作用し、Ｂ細胞
の分裂増殖を誘導せ゛ず、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分
化を誘導する液性因子であると定義されている。
の分裂増殖を誘導せ゛ず、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分
化を誘導する液性因子であると定義されている。
その後、この上うなり細胞分化因子の存在を示す証拠が
蓄積されており、人においてもマウス同様の分化因子の
存在が示唆されている。現在では上述のように定義され
たＢ細胞を抗体産生細胞へ分化させる因子をＢＣＤＦと
総称するようになった。
蓄積されており、人においてもマウス同様の分化因子の
存在が示唆されている。現在では上述のように定義され
たＢ細胞を抗体産生細胞へ分化させる因子をＢＣＤＦと
総称するようになった。
このようにＢＣＤＦは人の体内でＢ細胞の抗体産生機能
に重要な働きをしている。ＢＣＤＦの臨床への応用は大
別して３つ考えられ る。
に重要な働きをしている。ＢＣＤＦの臨床への応用は大
別して３つ考えられ る。
第１はＢＣＤＦによりＢＣＤＦ抗体を作り、ＢＣＤＦと
抗ＢＣＤＦ抗体によるＢＣＤＦのイムノアッセイ系を用
いて免疫学的な病態の解析に用いることが出来る。第２
の応用は各種疾患の治療への応用である。例えば、Ｔ細
胞のヘルパー機能低下にともなうＢ細胞抗体産生能低下
による免疫不全症患者にＢＣＤＦ単独または他のリンホ
カインと共に投与することにより抗体産生機能を正常に
戻すことが考えられる。
抗ＢＣＤＦ抗体によるＢＣＤＦのイムノアッセイ系を用
いて免疫学的な病態の解析に用いることが出来る。第２
の応用は各種疾患の治療への応用である。例えば、Ｔ細
胞のヘルパー機能低下にともなうＢ細胞抗体産生能低下
による免疫不全症患者にＢＣＤＦ単独または他のリンホ
カインと共に投与することにより抗体産生機能を正常に
戻すことが考えられる。
さらにＢＣＤＦの応用として次のことが考えられる。
Ｂ細胞増殖因子 （ＢＣＧＦ ’）（Ｋ、 Ｖｏｓ
ｈｉｚａｋｉ ら 、 Ｊ、 ｏｆ １ｍｍａｎｏ
１． １３０゜＋２４１（１９８３））、その他のリン
ホカインを含むＴ細胞因子を培地に加えることにより正
ｆＢ細を長期培養できることが報告されている（Ｉ３゜
５ｒｅｄｎｉら、 Ｊ、 ＥＸＩ）、 Ｍｅｄ、、
１５４． １５００（１９８１）参照）。これらの培養
正常Ｂ細胞に対し、適当な時期にＢＣＤＦを作用させる
ことにより生体外で抗体を産生させることが出来る。特
定の抗体、例えば、病原細菌、病原ウィルス、病原原虫
、癌細胞などの表面にある特定抗原を認識する抗体を産
生するＢＩＯ１１１２Ｊをモノクロ−７化し、クローン
化正常Ｂ細胞をＢＣＤＦとその他のリンホカインを組合
せて培養し、宵月なモノクローナル抗体を産生させるこ
とが出来る。これら抗体は感染症や癌の治療右よび診断
に利用できる。
Ｂ細胞増殖因子 （ＢＣＧＦ ’）（Ｋ、 Ｖｏｓ
ｈｉｚａｋｉ ら 、 Ｊ、 ｏｆ １ｍｍａｎｏ
１． １３０゜＋２４１（１９８３））、その他のリン
ホカインを含むＴ細胞因子を培地に加えることにより正
ｆＢ細を長期培養できることが報告されている（Ｉ３゜
５ｒｅｄｎｉら、 Ｊ、 ＥＸＩ）、 Ｍｅｄ、、
１５４． １５００（１９８１）参照）。これらの培養
正常Ｂ細胞に対し、適当な時期にＢＣＤＦを作用させる
ことにより生体外で抗体を産生させることが出来る。特
定の抗体、例えば、病原細菌、病原ウィルス、病原原虫
、癌細胞などの表面にある特定抗原を認識する抗体を産
生するＢＩＯ１１１２Ｊをモノクロ−７化し、クローン
化正常Ｂ細胞をＢＣＤＦとその他のリンホカインを組合
せて培養し、宵月なモノクローナル抗体を産生させるこ
とが出来る。これら抗体は感染症や癌の治療右よび診断
に利用できる。
従来ＢＣＤＦを得るには、人末梢血などより分離した正
常人Ｔ細胞蕃マイトーゲン刺激することによりＢＣＤＦ
を産生させる方法が採られてきた。この方法では、Ｔ細
胞を十分得ることが困難である点、マイトーゲ／を用い
たため、ＢＣＤＦに存寄なマイトーゲンが混入し、これ
を除去するのが困難である点、またＴ細胞培養にはウシ
胎児血清など血清成分を培地に添加する必要があり、こ
れら添加タンパク質とＢＣＤＦを十分分離することが出
来ず、ＢＣＤＦを医療に用いるには、純化ＢＣＤＦが得
られぬことが障害となっている点など問題が多く、工業
的にＢＣＤＦを産生することは出来なかった。また人Ｔ
細胞を人癌細胞と細胞融合して人Ｔ融合細胞を得、これ
によりＢＣＤＦを産生せしめる方法も報告されている（
０ｋａｄａら、ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｏｄ、。
常人Ｔ細胞蕃マイトーゲン刺激することによりＢＣＤＦ
を産生させる方法が採られてきた。この方法では、Ｔ細
胞を十分得ることが困難である点、マイトーゲ／を用い
たため、ＢＣＤＦに存寄なマイトーゲンが混入し、これ
を除去するのが困難である点、またＴ細胞培養にはウシ
胎児血清など血清成分を培地に添加する必要があり、こ
れら添加タンパク質とＢＣＤＦを十分分離することが出
来ず、ＢＣＤＦを医療に用いるには、純化ＢＣＤＦが得
られぬことが障害となっている点など問題が多く、工業
的にＢＣＤＦを産生することは出来なかった。また人Ｔ
細胞を人癌細胞と細胞融合して人Ｔ融合細胞を得、これ
によりＢＣＤＦを産生せしめる方法も報告されている（
０ｋａｄａら、ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｏｄ、。
１５７、５８３（１９８３））。しかし、人融合細胞は
継代中、す／ホカイン産生能が低下してゆくことが多く
、実用的ＢＣＤＦ産生人融合細胞は未だない。
継代中、す／ホカイン産生能が低下してゆくことが多く
、実用的ＢＣＤＦ産生人融合細胞は未だない。
発明が解決しようとする問題点
従ってこの発明の目的は、ＢＣＤＦのより効率のよい製
造法を見い出すことにある。
造法を見い出すことにある。
問題点を解決するための手段
本発明者らは、人Ｔ細胞白血病ウィルス（以下ｒＨＴＬ
ＶＪと記す）により形質転換された人Ｔ細胞が高い効率
でＢＣＤＦを生産することを見い出した。即ち、この発
明は、ＨＴＬＶにより形質転換された人Ｔ細胞を培養し
、生成したＢ細胞分化因子を採取することを特徴とする
Ｂ細胞分化因子の製造法である。
ＶＪと記す）により形質転換された人Ｔ細胞が高い効率
でＢＣＤＦを生産することを見い出した。即ち、この発
明は、ＨＴＬＶにより形質転換された人Ｔ細胞を培養し
、生成したＢ細胞分化因子を採取することを特徴とする
Ｂ細胞分化因子の製造法である。
人ＢＣＤＦ産生人Ｔ細胞株の作製は以下のように行なう
ことが出来る。人の末梢血・扁桃命腑帯血などよりフィ
コールバックなどを用いた密度勾配遠心法等でリンパ球
を分離し、Ｎ、 Ｙａ−ｍａｍｏｔｏ、５ｃｉｅｎｃｅ
２１７．７３７（１９８２）の方法に準じてＨＴ Ｌ
Ｖを用いて人Ｔ細胞を形質転換（トランスフォーメー
シヨン）する。たとえば下記の方法を用いることができ
る。ウィルス産生細胞株ＭＴ−２ヲＸｌ１ａｌ？（射（
１２０００〜１４０００ラド）で不活化した細胞Ｉ Ｘ
１０７ ／紅と、上述のようにして得た入り／パ球１
ｘ １０ ？ ／ｘｉヲ２０ ！／ｉ Ｆ ＣＳ ％
１００ μｇ／ｕカナマイシン、２ｕ ｇ／ｕ
ＮａＨＣＯ３，２５ｍＭ Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅ
ｔｈｙｉｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’ −２−ｅｔｈ
ａｎｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）を含むＲ
ＰＭＩ １８４０培地を入れたプラスチックシャーレ
（７フルコ／＃３００８）に接種し５％ＣＯ２存在下３
７゛Ｃで培養するａ１週間に２回、半分の培地を新鮮な
培地と交換しつつ２〜３力月培養した後、リミティング
ダイリューシ３７法により株化する。
ことが出来る。人の末梢血・扁桃命腑帯血などよりフィ
コールバックなどを用いた密度勾配遠心法等でリンパ球
を分離し、Ｎ、 Ｙａ−ｍａｍｏｔｏ、５ｃｉｅｎｃｅ
２１７．７３７（１９８２）の方法に準じてＨＴ Ｌ
Ｖを用いて人Ｔ細胞を形質転換（トランスフォーメー
シヨン）する。たとえば下記の方法を用いることができ
る。ウィルス産生細胞株ＭＴ−２ヲＸｌ１ａｌ？（射（
１２０００〜１４０００ラド）で不活化した細胞Ｉ Ｘ
１０７ ／紅と、上述のようにして得た入り／パ球１
ｘ １０ ？ ／ｘｉヲ２０ ！／ｉ Ｆ ＣＳ ％
１００ μｇ／ｕカナマイシン、２ｕ ｇ／ｕ
ＮａＨＣＯ３，２５ｍＭ Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅ
ｔｈｙｉｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’ −２−ｅｔｈ
ａｎｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）を含むＲ
ＰＭＩ １８４０培地を入れたプラスチックシャーレ
（７フルコ／＃３００８）に接種し５％ＣＯ２存在下３
７゛Ｃで培養するａ１週間に２回、半分の培地を新鮮な
培地と交換しつつ２〜３力月培養した後、リミティング
ダイリューシ３７法により株化する。
株化した細胞の培養上清のＢＣＤＦ活性を測定し、ＢＣ
ＤＦ活性を存する株を得る。
ＤＦ活性を存する株を得る。
この方法により株化した細胞としてたとえばＶＴ−１と
標識された人Ｔ細胞株を用いることが出来る。ＶＴ−１
を増殖させるための特別な条件はなく、一般に用いられ
ている培養条件を適宜採用して行なえばよい。また、Ｂ
ＣＤＦの産生も一般的な方法で行なえばよいが、好まし
くはタンパク質を含まない培地を用いて行なうべきであ
る。
標識された人Ｔ細胞株を用いることが出来る。ＶＴ−１
を増殖させるための特別な条件はなく、一般に用いられ
ている培養条件を適宜採用して行なえばよい。また、Ｂ
ＣＤＦの産生も一般的な方法で行なえばよいが、好まし
くはタンパク質を含まない培地を用いて行なうべきであ
る。
以下に、ＶＴ−１を用いてＢＣＤＦを製造する方法の１
例を示す。
例を示す。
ＶＴ−１を増殖させるのに好適な条件、たとえばウシ胎
児血清（Ｆｅ２）を含む培地にてＶＴ−１を培養し、Ｖ
Ｔ−１の細胞数を増やした後、細胞を分離洗浄してＢＣ
ＤＦ産生に最適な条件、たとえばＦｅ２などのタンパク
質を含まぬ完全合成培地に細胞を移し、さらに培養する
ことにより夾糟タンパク質の少ないＢＣＤＦを得ること
ができる。
児血清（Ｆｅ２）を含む培地にてＶＴ−１を培養し、Ｖ
Ｔ−１の細胞数を増やした後、細胞を分離洗浄してＢＣ
ＤＦ産生に最適な条件、たとえばＦｅ２などのタンパク
質を含まぬ完全合成培地に細胞を移し、さらに培養する
ことにより夾糟タンパク質の少ないＢＣＤＦを得ること
ができる。
ＶＴ−１を培養するのに用いる培地の主成分は市販の培
地でよい。例えばＲＰＭ１１６４０培地、改良イーグル
培地（ＭＥＭ）、ダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）またはクリック・培地でよい。これらの培地に対す
る添加物として；）１ｕ当り約２０〜２５０単位、理想
的には１ｕ当り約１００単位のペニシリン、１１）ＩＭ
当り１μｇ〜１００μｇ１理想的には１紅当り１０μｇ
のゲンタマイシン、ｉｉｉ）１Ｍ１当り２０〜２５０μ
ｃ１理想的には１００μｇのストレプトマイシン、ｉｖ
）ＩＭ当り約１００〜１０００μｇ１理想的には１′＠
を当り約３００μｇの新鮮Ｌ−グルタミノ、Ｖ）１０〜
８０ ｍＭ、理想的には２５ｍＭのヘペス緩街液、ｖｉ
）８〜２０ｍＭ、理想的には１８ＭｍのＮａＨＣＯ３、
Ｖｊ） ５ Ｘ １０− ’ 〜５ｘｌＯ−６Ｍ、理想
的には５Ｘ１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールなど
を必要に応じて用いることが出来る。
地でよい。例えばＲＰＭ１１６４０培地、改良イーグル
培地（ＭＥＭ）、ダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）またはクリック・培地でよい。これらの培地に対す
る添加物として；）１ｕ当り約２０〜２５０単位、理想
的には１ｕ当り約１００単位のペニシリン、１１）ＩＭ
当り１μｇ〜１００μｇ１理想的には１紅当り１０μｇ
のゲンタマイシン、ｉｉｉ）１Ｍ１当り２０〜２５０μ
ｃ１理想的には１００μｇのストレプトマイシン、ｉｖ
）ＩＭ当り約１００〜１０００μｇ１理想的には１′＠
を当り約３００μｇの新鮮Ｌ−グルタミノ、Ｖ）１０〜
８０ ｍＭ、理想的には２５ｍＭのヘペス緩街液、ｖｉ
）８〜２０ｍＭ、理想的には１８ＭｍのＮａＨＣＯ３、
Ｖｊ） ５ Ｘ １０− ’ 〜５ｘｌＯ−６Ｍ、理想
的には５Ｘ１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールなど
を必要に応じて用いることが出来る。
ＶＴ−１の細胞数を増やすのに最適な培地として、たと
えば上述の培地にさらに１〜３０％、好ましくは２０％
のＦｅ２を添加した培地を用いる。ＢＣＤＦ産生のため
の最適な培地としては、Ｆｅ２を添加しない上述の培地
でよい。
えば上述の培地にさらに１〜３０％、好ましくは２０％
のＦｅ２を添加した培地を用いる。ＢＣＤＦ産生のため
の最適な培地としては、Ｆｅ２を添加しない上述の培地
でよい。
Ｆｅ２を添加しない完全合成培地中で４８時間培養後も
ＶＴ−１の生存率は７０％以上が保持されている。
ＶＴ−１の生存率は７０％以上が保持されている。
Ｔ細胞よりＢＣＤＦを生産する場合、従来は培地にＦｅ
２のようなタンパク質を添加したり、マイトゲンを添加
したりすることが必須であった（Ｔ、 Ｔｅｒａｎｉｓ
ｈｉら、Ｊ、 ｏｆ ｌｍ５ｕｎｏ１．１２８゜１９０
３（１９８２）、Ａ、 Ｍｕｒａｇｕｃｈｉら、Ｊ、
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ。
２のようなタンパク質を添加したり、マイトゲンを添加
したりすることが必須であった（Ｔ、 Ｔｅｒａｎｉｓ
ｈｉら、Ｊ、 ｏｆ ｌｍ５ｕｎｏ１．１２８゜１９０
３（１９８２）、Ａ、 Ｍｕｒａｇｕｃｈｉら、Ｊ、
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ。
１２７、４１２（１９８１）参照）。コれに対ｔ、テＶ
Ｔ−１を使用してＢＣＤＦを生産する場合、培地にＦｅ
２のような血清、血液中のタンパク質成分、その他タン
パク質成分を加える必要がな（、また通常用いられてい
るＴ細胞またはＢ細胞に対するマイトゲンも加える必要
がないことは特筆に値する。そのため高価なＦｅ２を用
いないで安価にＢＣＤＦを生産することが出来るばかり
でな（、人体に有害な異種タンパク質やマイトゲンを含
まない安全なりＣＤＦを容易に得ることが出来る。
Ｔ−１を使用してＢＣＤＦを生産する場合、培地にＦｅ
２のような血清、血液中のタンパク質成分、その他タン
パク質成分を加える必要がな（、また通常用いられてい
るＴ細胞またはＢ細胞に対するマイトゲンも加える必要
がないことは特筆に値する。そのため高価なＦｅ２を用
いないで安価にＢＣＤＦを生産することが出来るばかり
でな（、人体に有害な異種タンパク質やマイトゲンを含
まない安全なりＣＤＦを容易に得ることが出来る。
ＶＴ−１を用いてＢＣＤＦを生産する上記方法は種々の
環境的条件で行なわれる。しかし、好ましくはＶＴ−１
培養物は約３５〜３８℃の温度範囲において約５〜ｌＯ
％の炭酸ガスを含む湿度調節空気中に保持すべきである
。また、理想的には培地のｐＨは約７．０〜７．４と僅
かにアルカリ性の条件下に保持すべきである。ＶＴ−１
は平底ミクロプレートなど種々のタイプの培養器上１０
０μを単位などの種々の容量で接種される。ファルコン
ーラブウェア・ディヴイジョン、ベクトン・ディッキン
ソン・エンド・コーボレーシ：Ｉ ７ （Ｆａｌｃｏｎ
Ｌａｂｗａｒｅ、 Ｄｉｖ。
環境的条件で行なわれる。しかし、好ましくはＶＴ−１
培養物は約３５〜３８℃の温度範囲において約５〜ｌＯ
％の炭酸ガスを含む湿度調節空気中に保持すべきである
。また、理想的には培地のｐＨは約７．０〜７．４と僅
かにアルカリ性の条件下に保持すべきである。ＶＴ−１
は平底ミクロプレートなど種々のタイプの培養器上１０
０μを単位などの種々の容量で接種される。ファルコン
ーラブウェア・ディヴイジョン、ベクトン・ディッキン
ソン・エンド・コーボレーシ：Ｉ ７ （Ｆａｌｃｏｎ
Ｌａｂｗａｒｅ、 Ｄｉｖ。
Ｂｅｃｔｏｎ、 Ｄｉｅｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ、
）から市販されているフラスコＮａ３０１３または３０
２５のような組織培養フラスコも使用できる。別法とし
て上記７アルコ／ａラブウェアから市販されているボト
ル＆３０２７のような回転びんも培養容器として使用で
きる。
）から市販されているフラスコＮａ３０１３または３０
２５のような組織培養フラスコも使用できる。別法とし
て上記７アルコ／ａラブウェアから市販されているボト
ル＆３０２７のような回転びんも培養容器として使用で
きる。
ＶＴ−１を培養して細胞数を増やすための最適条件とし
て、細胞の当初密□度は培地１ｕあたりｌＸｌ０’細胞
ないし５Ｘ１０５細胞、好ましくは２Ｘ１０’細胞であ
る。上述の条件でＶＴ−１を培養すると、通常２〜７日
で培地１ｕ当り５Ｘ１０’細胞から２Ｘ １０’細胞程
度まで細胞密度が増加するので、再び新しい培地を加え
て培地１ｓｔ当りｌＸ１０４〜５Ｘ１０Ｍ０１ｍにまで
細胞密度を下げ、再び培養を続ける。このようにして目
的とする細胞数になるまでＶＴ−１の培養を続けた後、
細胞を遠心分離等で分離し、細胞をタンパク質を含まぬ
完全合成培地で洗ってから新しい完全合成培地に接種す
る。
て、細胞の当初密□度は培地１ｕあたりｌＸｌ０’細胞
ないし５Ｘ１０５細胞、好ましくは２Ｘ１０’細胞であ
る。上述の条件でＶＴ−１を培養すると、通常２〜７日
で培地１ｕ当り５Ｘ１０’細胞から２Ｘ １０’細胞程
度まで細胞密度が増加するので、再び新しい培地を加え
て培地１ｓｔ当りｌＸ１０４〜５Ｘ１０Ｍ０１ｍにまで
細胞密度を下げ、再び培養を続ける。このようにして目
的とする細胞数になるまでＶＴ−１の培養を続けた後、
細胞を遠心分離等で分離し、細胞をタンパク質を含まぬ
完全合成培地で洗ってから新しい完全合成培地に接種す
る。
この時の細胞の当初密度は培地１ｕあたり約Ｉ×１０４
細胞ないしｌＸ１０７細胞であることが好ましく、理想
的には培地１ｕあたりｌＸ１０６細胞である。
細胞ないしｌＸ１０７細胞であることが好ましく、理想
的には培地１ｕあたりｌＸ１０６細胞である。
ＶＴ−１を培養することによって生産されるＢＣＤＦ量
は経時的に変化する。例えば１′＠を当りＩＸ １０
’初発細胞密度でＶＴ−１をＲＰＭ１１６４０培堆（Ｌ
Ｍ当りペニシリン１００単位、ストレプトマイシン１０
０μｇ１ ゲツクマイシ７１０μｇおよびＮａＨＣＯ
３１ｅμＭを含む）で培養すると、ＢＣＤＦ活性は４８
時間後にピークレベルに達する。さらに、次の２４時間
に存在するＢＣＤＦ活性は僅かに減少する。このように
ＲＰＭ１１８４０培地中のＶＴ−１でＢＣＤＦを生産す
る至崖培養時間は約２４〜７８時間である。
は経時的に変化する。例えば１′＠を当りＩＸ １０
’初発細胞密度でＶＴ−１をＲＰＭ１１６４０培堆（Ｌ
Ｍ当りペニシリン１００単位、ストレプトマイシン１０
０μｇ１ ゲツクマイシ７１０μｇおよびＮａＨＣＯ
３１ｅμＭを含む）で培養すると、ＢＣＤＦ活性は４８
時間後にピークレベルに達する。さらに、次の２４時間
に存在するＢＣＤＦ活性は僅かに減少する。このように
ＲＰＭ１１８４０培地中のＶＴ−１でＢＣＤＦを生産す
る至崖培養時間は約２４〜７８時間である。
ＢＣＤＦの精製
ＢＣＤＦは塩析、真空透析、限外濾過、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アブイ
エティークロマトグラフィー、クロマトフオーカシング
、逆相クロマトグラフィー、焦点電気泳動およびゲル電
気泳動等の種々の方法によって上述の培養物上清から濃
縮して精製できる（実施例１参照）。
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アブイ
エティークロマトグラフィー、クロマトフオーカシング
、逆相クロマトグラフィー、焦点電気泳動およびゲル電
気泳動等の種々の方法によって上述の培養物上清から濃
縮して精製できる（実施例１参照）。
ＢＣＤＦの物理化学的性質
上述の方法でＶＴ−１より生産されるＢＣＤＦは以下の
性質を任する。
性質を任する。
（１）分子量
前もってＰＢＳで平衡化したＡｃＡ３４カラム（ムＫｎ
、 Ｂｒｏ＋＋ｍａ、 Ｓｗｅｄ、）にＢＣＤＦを含む
、濃縮されたＶＴ−１培養土清を流し、Ｐｕｓで溶出す
ると、分子量３．５±０．５Ｘ１０’ダルトンに対応す
る位置にＢＣＤＦが溶出する。上述の方法で精製したＢ
ＣＤＦを主述の方法でＨＩ’ＬＣＪＴＩＴＳＫ−２００
０ＳＷＧ （東洋ソーダー）を用いてゲル濾過すると、
分子量３．５± ０．５Ｘ１０４ダルトンに対応する位
置にＢＣＤＦが溶出する。又ＳＤＳ −ＰＡＧＥ（Ｓ
ＤＳ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）にて泳動する
と２．２±０．２Ｘ１０’ダルト／に対応する位置にＢ
ＣＤＦが溶出される。
、 Ｂｒｏ＋＋ｍａ、 Ｓｗｅｄ、）にＢＣＤＦを含む
、濃縮されたＶＴ−１培養土清を流し、Ｐｕｓで溶出す
ると、分子量３．５±０．５Ｘ１０’ダルトンに対応す
る位置にＢＣＤＦが溶出する。上述の方法で精製したＢ
ＣＤＦを主述の方法でＨＩ’ＬＣＪＴＩＴＳＫ−２００
０ＳＷＧ （東洋ソーダー）を用いてゲル濾過すると、
分子量３．５± ０．５Ｘ１０４ダルトンに対応する位
置にＢＣＤＦが溶出する。又ＳＤＳ −ＰＡＧＥ（Ｓ
ＤＳ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）にて泳動する
と２．２±０．２Ｘ１０’ダルト／に対応する位置にＢ
ＣＤＦが溶出される。
■等電点
前述の方法でＶＴ−１より得たＢＣＤＦを含む培養液を
限外濾過により濃縮し、ＡｃＡ３４カラムにより分離精
製したＢＣＤＦをｐＨ７〜４の範囲でファルマシアＭｏ
ｎｏＰカラムを用いてクロマトフオーカシングを行なう
と、Ｐ）１４．０〜５．１の位置にＢＣＤＦが溶出する
。 これよりＢＣＤＦの等電点はｐｌ＋４．９〜５．１
と推定される。
限外濾過により濃縮し、ＡｃＡ３４カラムにより分離精
製したＢＣＤＦをｐＨ７〜４の範囲でファルマシアＭｏ
ｎｏＰカラムを用いてクロマトフオーカシングを行なう
と、Ｐ）１４．０〜５．１の位置にＢＣＤＦが溶出する
。 これよりＢＣＤＦの等電点はｐｌ＋４．９〜５．１
と推定される。
ＢＣＤＦＣＤ側定法
人ＢＣＤＦに反応してＩｇＧを産生ずる人Ｂ細胞株ＣＥ
Ｓ Ｓ （Ｋ、 Ｙｏｓｈｉｚａｋｉら、Ｊ、 ｏｒ
Ｉｍｍｕｎｏ−１ｏｇｙ、 １３２．２９４８（１９
８４））を用いてｎｃＤＦ活性を測定した。ＢＣＤＦ活
性を測定する検液と６Ｘ １０３個のＣＥＳＳを２００
μｔの１０％ＦＣ３を含むＲＰ Ｍ １１６４０培地（
ＩＭ当りプニシリ７１００単位、ストレプトマイシン１
００μｇ、ゲンタマイシ／１０μｇおよびＮ龜ＨＣＯ３
１６ｍｆｌｌを含む）に入れる。この混合物を９６穴マ
イクロプレート中で３日間、５％ＣＯ２存在下、３７℃
で培養し、培養上清のＩｇＧ量を酵素免疫測定法により
、測定する。この条件において最大のＩｇＧ生産量（最
高のＣＥＳＳの反応）の５０％を示すＢＣＤＦの活性を
ＩＵ／紅とした。
Ｓ Ｓ （Ｋ、 Ｙｏｓｈｉｚａｋｉら、Ｊ、 ｏｒ
Ｉｍｍｕｎｏ−１ｏｇｙ、 １３２．２９４８（１９
８４））を用いてｎｃＤＦ活性を測定した。ＢＣＤＦ活
性を測定する検液と６Ｘ １０３個のＣＥＳＳを２００
μｔの１０％ＦＣ３を含むＲＰ Ｍ １１６４０培地（
ＩＭ当りプニシリ７１００単位、ストレプトマイシン１
００μｇ、ゲンタマイシ／１０μｇおよびＮ龜ＨＣＯ３
１６ｍｆｌｌを含む）に入れる。この混合物を９６穴マ
イクロプレート中で３日間、５％ＣＯ２存在下、３７℃
で培養し、培養上清のＩｇＧ量を酵素免疫測定法により
、測定する。この条件において最大のＩｇＧ生産量（最
高のＣＥＳＳの反応）の５０％を示すＢＣＤＦの活性を
ＩＵ／紅とした。
作 用
一方、本発明におけるＨＴＬＶをＴ細胞に感染させるこ
とにより得た形質転換された人Ｔ細胞株は、前述のＢＣ
ＤＦ産生方法に比べ、大量のＢＣＤＦを培地中に産生ず
る点、この細胞株は継代培養が出来、継代中にＢＣＤＦ
産生能力が低下することがない点、又、この細胞株は、
蛋白質をまったく含まない完全合成培地中で、マイトー
ゲ／のような刺激剤をまったく加えることなく 、Ｂ
ＣＤ Ｆと産生し、混入蛋白質の少ないＢＣＤＦを得、
比較的容易な精製方法で、純化したＢＣＤＦを得られる
点などの特徴をもち、本発明によりはじめて人ＢＣＤＦ
の工業的生産が可能となった。
とにより得た形質転換された人Ｔ細胞株は、前述のＢＣ
ＤＦ産生方法に比べ、大量のＢＣＤＦを培地中に産生ず
る点、この細胞株は継代培養が出来、継代中にＢＣＤＦ
産生能力が低下することがない点、又、この細胞株は、
蛋白質をまったく含まない完全合成培地中で、マイトー
ゲ／のような刺激剤をまったく加えることなく 、Ｂ
ＣＤ Ｆと産生し、混入蛋白質の少ないＢＣＤＦを得、
比較的容易な精製方法で、純化したＢＣＤＦを得られる
点などの特徴をもち、本発明によりはじめて人ＢＣＤＦ
の工業的生産が可能となった。
実施例１ ＶＴ−１によるＢＣＤＦの製造２を容プ
ラスチックローラー培養器（フフルコ７＃３０２７）（
以下ローラーと称する）中の１ｔの２０％ ＦＣ３含有
ＲＰＭ１１８４０培地（２＋ｍＭグルタミ７，５Ｘ１０
″″’Ｍ２ＭＥ、１００単位ｌ紅ベニシリア、１００μ
ｃｌｕ ストレプトマイシ／。
ラスチックローラー培養器（フフルコ７＃３０２７）（
以下ローラーと称する）中の１ｔの２０％ ＦＣ３含有
ＲＰＭ１１８４０培地（２＋ｍＭグルタミ７，５Ｘ１０
″″’Ｍ２ＭＥ、１００単位ｌ紅ベニシリア、１００μ
ｃｌｕ ストレプトマイシ／。
２０μｇ１Ｍ ゲンタマイシン、 １６ ｍＭ Ｎａ１
ｌＣＯｅを含「）に２ Ｘ １０５／ｕ細胞数に：ＶＴ
−１’ｉ：ｔｊｉ８ｉＬ。
ｌＣＯｅを含「）に２ Ｘ １０５／ｕ細胞数に：ＶＴ
−１’ｉ：ｔｊｉ８ｉＬ。
８ｒｐ■で回転させつつ３日間、３７℃で培養した。
培養後、培養物を遠心分離して細胞を集めＲＰＭ１１８
４０培地で２回細胞を洗った後、細胞を２２容ローラー
中１ｔのＲＰＭ１１８４０培地に１ｘ、１０’／ｕ細胞
濃度に懸濁した。ローラーを８ｒｐｍで回転させつつ２
日間、３７℃で培養する。
４０培地で２回細胞を洗った後、細胞を２２容ローラー
中１ｔのＲＰＭ１１８４０培地に１ｘ、１０’／ｕ細胞
濃度に懸濁した。ローラーを８ｒｐｍで回転させつつ２
日間、３７℃で培養する。
培養後培養物を遠心分離して、培養上清を得た。
上述のように、ＶＴ−１を培養して得たＢＣＤＦを含む
培養上清よりＢＣＤＦを以下の方法で精製した。無細胞
上清１０ｔを限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０、アミコ
／・コーポレーシヨン、マサチューセッツ、ＵＳＡ）を
装着した限外濾過装置（アミコン大量処理用セル２００
０型、アミコン・コーポレーション、マサチューセッツ
、ＵＳＡ）を用いて窒素ガスにより４ｋｇ／ｃＪ の圧
力をかけ濾過した。濾過膜上部に残った１００ｕの濃縮
液をさらに限外濾過膜（アミコ／ＹＭ−１０’）を装着
した限外濾過装置（アミコ／、スタンダードセル５２型
）を用い窒素ガスにより４ｋｇ／ｃ（の圧力をかけて濾
過した。濾過股上部に残った５゛紅の濃縮液を採取した
。
培養上清よりＢＣＤＦを以下の方法で精製した。無細胞
上清１０ｔを限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０、アミコ
／・コーポレーシヨン、マサチューセッツ、ＵＳＡ）を
装着した限外濾過装置（アミコン大量処理用セル２００
０型、アミコン・コーポレーション、マサチューセッツ
、ＵＳＡ）を用いて窒素ガスにより４ｋｇ／ｃＪ の圧
力をかけ濾過した。濾過膜上部に残った１００ｕの濃縮
液をさらに限外濾過膜（アミコ／ＹＭ−１０’）を装着
した限外濾過装置（アミコ／、スタンダードセル５２型
）を用い窒素ガスにより４ｋｇ／ｃ（の圧力をかけて濾
過した。濾過股上部に残った５゛紅の濃縮液を採取した
。
上述の濃縮した上清をＡｃＡ−３４ゲル濾過カラム（Ｌ
ＫＩＩ Ｐｒｏｄｕｋｅｒ、 Ｓｗｅｄｅｎ、 ２．６
Ｘ ９０ ｏｎ ）で処理した。なお、ゲル濾過カラ
ムはあらかじめＰＢＳ （ホスフェート昏バッフ７−セ
イライン、０．１５Ｍ食塩を含む０．０１Ｍホスフェー
ト・バフファー、ｐｌ＋７．０）で平衡化した。ａｔｒ
Ｊ上清をＰＢＳで溶出し、溶出液を５ｕずつ分取し、分
取液のＢＣＤＦ活性を測定した。ＢＣＤＦ活性を有する
分画は分子量（３，５±０．５Ｘ１０４ダルトンに相当
するフラクシヨンにＢＣＤＦが含まれていることがわか
った。ゲル濾過カラムは次の分子量マー カ −で検定
した。ブルーデキストラン２０００ （ファルマシアー
ファインケミカルス、スウェーデン＞２Ｘ１０Ｇ、
フェリチン４．５Ｘ１０５、アルドラーゼ１．５８Ｘ１
０’１ オブアルブミン４．５Ｘ１０’％ キモドリ
ブンノー）ｆ７２．５ｘｌＯ’、チトクロームＣ１，１
７Ｘ１０’また、ＢＣＤＦを含むフラクシヨンを集め、
限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０）を装置した限外−過
装置を用いて２５ｍＭピペラジ／−塩酸緩衝液（ｐＨ６
，３）に置換した。
ＫＩＩ Ｐｒｏｄｕｋｅｒ、 Ｓｗｅｄｅｎ、 ２．６
Ｘ ９０ ｏｎ ）で処理した。なお、ゲル濾過カラ
ムはあらかじめＰＢＳ （ホスフェート昏バッフ７−セ
イライン、０．１５Ｍ食塩を含む０．０１Ｍホスフェー
ト・バフファー、ｐｌ＋７．０）で平衡化した。ａｔｒ
Ｊ上清をＰＢＳで溶出し、溶出液を５ｕずつ分取し、分
取液のＢＣＤＦ活性を測定した。ＢＣＤＦ活性を有する
分画は分子量（３，５±０．５Ｘ１０４ダルトンに相当
するフラクシヨンにＢＣＤＦが含まれていることがわか
った。ゲル濾過カラムは次の分子量マー カ −で検定
した。ブルーデキストラン２０００ （ファルマシアー
ファインケミカルス、スウェーデン＞２Ｘ１０Ｇ、
フェリチン４．５Ｘ１０５、アルドラーゼ１．５８Ｘ１
０’１ オブアルブミン４．５Ｘ１０’％ キモドリ
ブンノー）ｆ７２．５ｘｌＯ’、チトクロームＣ１，１
７Ｘ１０’また、ＢＣＤＦを含むフラクシヨンを集め、
限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０）を装置した限外−過
装置を用いて２５ｍＭピペラジ／−塩酸緩衝液（ｐＨ６
，３）に置換した。
クロマトフオーカシング
ＡｃＡ−３４カラムクロマトグラフイー、で分画された
ＢＣＤＦ画分をあらかじめ２５ｍＭピペラジン−塩ｉ！
！緩衝液（ｐＨＥ３．３）で平衡化したＭ ｏｎ。
ＢＣＤＦ画分をあらかじめ２５ｍＭピペラジン−塩ｉ！
！緩衝液（ｐＨＥ３．３）で平衡化したＭ ｏｎ。
Ｐカラム（ファルマシア・ファインケミカルス、スウェ
ーデン）に通した。このカラムを２５ｍＭピペラジン−
塩酸緩液で洗った後、塩酸でｐＨ４，５に調製した４０
Ｍの１１１ｏ希釈ポリバッフ７−７４（ファルマシア・
ファインケミカルス、スウェーデン）で溶出した。カラ
ム操作はファースト・プロティン・リキッド・クロマト
グラフィー、Ｆ Ｐ Ｌ Ｃ（フフルマシアーフ？イン
ケミカルス、スウェーデン）を用い、流速は毎分０．５
ｕで行なった。
ーデン）に通した。このカラムを２５ｍＭピペラジン−
塩酸緩液で洗った後、塩酸でｐＨ４，５に調製した４０
Ｍの１１１ｏ希釈ポリバッフ７−７４（ファルマシア・
ファインケミカルス、スウェーデン）で溶出した。カラ
ム操作はファースト・プロティン・リキッド・クロマト
グラフィー、Ｆ Ｐ Ｌ Ｃ（フフルマシアーフ？イン
ケミカルス、スウェーデン）を用い、流速は毎分０．５
ｕで行なった。
溶出液を１′＠ｔずつ分取し、ＢＣＤＦ活性とｐＨを測
定した。ＢＣＤＦ活性はｐＨ４，９〜５．１の位置に溶
出された。
定した。ＢＣＤＦ活性はｐＨ４，９〜５．１の位置に溶
出された。
ＭｏｎｏＰカラムより得たＢＣＤＦ活性画分を０．１９
／ｉ ＴＦＡ （）リフルオロ酢酸水溶液）で緩衝化
した逆相クロマドグ ラ フィー用 カ ラ ムＰ ｒ
ｏＲＰ ＣＨＲ５／１０ （ファルマシアＱファインー
ケミカルズ）にかけ、溶出液、０．１％ ＴＦＡ中のア
セトニトリル濃度を０から６０％まで直線的に増加させ
ＢＣＤＦを溶出した。アセトニトリル５０〜５５％で溶
出される。Ｏ、Ｄ 、ｚｓｏのピーりは他の０．Ｄ、２
８０のピークとは完全に分離しており、このピークに対
応してＢＣＤＦ活性が検出された。このピークを凍結乾
燥して精製ＢＣＤＦを得た。
／ｉ ＴＦＡ （）リフルオロ酢酸水溶液）で緩衝化
した逆相クロマドグ ラ フィー用 カ ラ ムＰ ｒ
ｏＲＰ ＣＨＲ５／１０ （ファルマシアＱファインー
ケミカルズ）にかけ、溶出液、０．１％ ＴＦＡ中のア
セトニトリル濃度を０から６０％まで直線的に増加させ
ＢＣＤＦを溶出した。アセトニトリル５０〜５５％で溶
出される。Ｏ、Ｄ 、ｚｓｏのピーりは他の０．Ｄ、２
８０のピークとは完全に分離しており、このピークに対
応してＢＣＤＦ活性が検出された。このピークを凍結乾
燥して精製ＢＣＤＦを得た。
ＶＴ−１のＦＣ３無添加培養上清１．８ｔから精製した
ＢＣＦは、第１表に示すごとく活性の回収率１８％で蛋
白量当りの活性は約１．０００倍に上がった。
ＢＣＦは、第１表に示すごとく活性の回収率１８％で蛋
白量当りの活性は約１．０００倍に上がった。
第 １ 表
実施例２
人末梢血よりＢ細胞を調製し、これよりブラスト化Ｂ
Ｉｍ胞を分離した（ Ｋ、 Ｙｏｓｈｉｚａｋｉら、Ｊ
、 ｏｆｌ＋ａｍｕｎｏｌｏｇｙ １３２．２９４８（
１９Ｂ４＞参照）。すなわち、人Ｂ細胞をパーコールの
ダラージェント（５０％〜７０％） 中テ遠心分ｌ１１
（４℃、４００Ｇ、１５分）シ、プラスト化した低比重
Ｂ細胞（パーコールＰＢＳ溶液５０％〜５５％）又、高
比重休止期Ｂ細胞（パーコールＰＢＳ溶液６０％〜７０
％）を各々集めた。
Ｉｍ胞を分離した（ Ｋ、 Ｙｏｓｈｉｚａｋｉら、Ｊ
、 ｏｆｌ＋ａｍｕｎｏｌｏｇｙ １３２．２９４８（
１９Ｂ４＞参照）。すなわち、人Ｂ細胞をパーコールの
ダラージェント（５０％〜７０％） 中テ遠心分ｌ１１
（４℃、４００Ｇ、１５分）シ、プラスト化した低比重
Ｂ細胞（パーコールＰＢＳ溶液５０％〜５５％）又、高
比重休止期Ｂ細胞（パーコールＰＢＳ溶液６０％〜７０
％）を各々集めた。
Ｂ細胞を１ｕあたり２Ｘ１０’細胞に９６穴プラスチツ
クマイクロプレート中の２００μｔのＲＰＭＩＩＥ３４
０培地に懸濁した。培地には１単位／４ｇのＢＣＤＦを
含むＶＴ−１培養上清、１０％ＦＣ５，ＩＭあたり１０
０単位のペニシリン、１ｕあたり１００μｇのストレプ
トマイシン、１紅あたり１０Ｍｇのゲンタマイシン、１
６ＩＩＩＭのＮａ１ｌＣＯ３を含有させた。
クマイクロプレート中の２００μｔのＲＰＭＩＩＥ３４
０培地に懸濁した。培地には１単位／４ｇのＢＣＤＦを
含むＶＴ−１培養上清、１０％ＦＣ５，ＩＭあたり１０
０単位のペニシリン、１ｕあたり１００μｇのストレプ
トマイシン、１紅あたり１０Ｍｇのゲンタマイシン、１
６ＩＩＩＭのＮａ１ｌＣＯ３を含有させた。
培養物を空気中５％炭酸ガス含有の湿度調節環境下３７
℃に保ち、２日後培養土清を集めた。この培養上清中の
ＩｇＧ 濃度をＢＣＤＦ活性検定の項に記述した通り検
定した。第２表に示すよ うに、ＢＣＤＦの添加によっ
て低比重Ｂ細胞にのみＩｇＧ産生が誘導された。
℃に保ち、２日後培養土清を集めた。この培養上清中の
ＩｇＧ 濃度をＢＣＤＦ活性検定の項に記述した通り検
定した。第２表に示すよ うに、ＢＣＤＦの添加によっ
て低比重Ｂ細胞にのみＩｇＧ産生が誘導された。
第 ２ 表
実施例３
前述の活性測定方法に従い、ＣＥＳＳの抗体産生に対す
る精製ＢＣＤＦの作用を調べた結果を下表に示す。
る精製ＢＣＤＦの作用を調べた結果を下表に示す。
手続補正書動式）
昭和６０年６月２７日
Claims (1)
- 人Ｔ細胞白血病ウィルスにより形質転換された人Ｔ細胞
を培養し、生成したＢ細胞分化因子を採取することを特
徴とするＢ細胞分化因子の製造法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59235199A JPH0657157B2 (ja) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | Ｂ細胞分化因子の製造法 |
| JP2325865A JPH03184997A (ja) | 1984-11-09 | 1990-11-29 | Ｂ細胞分化因子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59235199A JPH0657157B2 (ja) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | Ｂ細胞分化因子の製造法 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60025301A Division JPH0657720B2 (ja) | 1985-02-14 | 1985-02-14 | Ｂ細胞分化因子 |
| JP2325865A Division JPH03184997A (ja) | 1984-11-09 | 1990-11-29 | Ｂ細胞分化因子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61115024A true JPS61115024A (ja) | 1986-06-02 |
| JPH0657157B2 JPH0657157B2 (ja) | 1994-08-03 |
Family
ID=16982539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59235199A Expired - Lifetime JPH0657157B2 (ja) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | Ｂ細胞分化因子の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0657157B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62263200A (ja) * | 1986-05-08 | 1987-11-16 | イエダ リサ−チ アンド デベロツプメント コンパニ− リミテツド | ヒトインタ−フエロン−β２Ａ及びヒトインタ−フエロン−β２Ｂ、該インタ−フエロンをコ−ドする遺伝子を含むベクタ−、該インタ−フエロンを産生するセルライン及び該インタ−フエロンの医薬品としての用途 |
| JPH029394A (ja) * | 1988-01-26 | 1990-01-12 | Yeda Res & Dev Co Ltd | ヒトインターフエロンベーター２、その精製法及びその用途 |
| JP2010501668A (ja) * | 2006-08-24 | 2010-01-21 | コーネル・ユニバーシティー | プロピレンオキシドおよび二酸化炭素の共重合ならびにプロピレンオキシドの単独重合 |
-
1984
- 1984-11-09 JP JP59235199A patent/JPH0657157B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62263200A (ja) * | 1986-05-08 | 1987-11-16 | イエダ リサ−チ アンド デベロツプメント コンパニ− リミテツド | ヒトインタ−フエロン−β２Ａ及びヒトインタ−フエロン−β２Ｂ、該インタ−フエロンをコ−ドする遺伝子を含むベクタ−、該インタ−フエロンを産生するセルライン及び該インタ−フエロンの医薬品としての用途 |
| JPH029394A (ja) * | 1988-01-26 | 1990-01-12 | Yeda Res & Dev Co Ltd | ヒトインターフエロンベーター２、その精製法及びその用途 |
| JP2010501668A (ja) * | 2006-08-24 | 2010-01-21 | コーネル・ユニバーシティー | プロピレンオキシドおよび二酸化炭素の共重合ならびにプロピレンオキシドの単独重合 |
| US9683077B2 (en) | 2006-08-24 | 2017-06-20 | Cornell Research Foundation, Inc. | Copolymerization of propylene oxide and carbon dioxide without production of propylene carbonate |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0657157B2 (ja) | 1994-08-03 |
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