JPS60169424A - 新規ヒトｂ細胞分化因子，その製造法およびその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は従来Ｂ細胞分化因子（以下、ＢＯＤＦと略称
する。）または’ｌ’　リンパ球（以下、Ｔ細胞と略称
する。）代替因子（以下、ＴＲＦと略称する。）として
知られているヒトのＢＯＤＦの性質を有する新規ヒ）　
ＢＯＤＦ　、その製造法およびその使用法に関するもの
である。より詳細には、ヒトＢ細胞由来細胞から産生さ
れ、ヒトのＢ細胞を抗体産生細胞へ分化させる新規ヒ）
ＢＯＤＩＦ（以下、Ｂ　−Ｂ　ＯＤＦと略称する。）、
ヒ）Ｂ細胞由来細胞を用いてこの新規１ｌ−ＢＯＤＦを
製造する方法およびこの新ＭＢ−ＢＯＤＦを用いてヒ）
Ｂ細胞由来細胞を抗体産生細胞へ分化させ、ヒ）Ｂ細胞
由来細胞より抗体を産生させる方法に関する。ここで言
うヒトＢ細胞由来細胞は、ヒト正常Ｂ細胞〜およびヒ）
Ｂ細胞を用いた融合細胞、ヒト形質転換細胞、ヒ）Ｂ白
血病細胞、ヒ）ＢＩＪンパ腫細胞等の悪性化ヒ）Ｂ細胞
を含むものである。

Ｂ　ＯＤＦは抗原刺激を受け活性化された成熟Ｂ細胞を
抗体産生細胞へ分化させるリンホカインであって、過去
においてはマイトゲンで刺激されたマウス、ラットまた
はヒトのＴ細胞あるいはマウスまたはヒトのＴ細胞融合
細胞より生成されるという報告がある。

活性化され分裂増殖したＢ細胞が抗体産生細胞にまで最
終的に分化するには、１種またはそれ以上のＴ細胞由来
の分化誘導性の物質が必須であることが知られている。

この物質の存在はＲ，Ｗ。

ＤｕｔｔＯｎら、　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、　Ｒｅｖ、
　２３６６　（１９７５）。

Ａ、　ＳｃｈｉｍｐｌとＦｊ、　Ｗｅａｋｅｒら、　Ｎ
ａｔｕｒｅ　Ｎ、　Ｂｌｏｌ。

２３７　、　１５　（１９７２）、Ｆｒｏｇ、　Ｉｍｍ
ｕｎｏ！、　２　、　１３５（１９７４）、Ｔｒａｎｓ
ｐｌａｎｔ、　Ｒｅｖ、＊　２３　＊　１７６　（１９
７５）により明らかにされた。彼らはマウスのリンパ球
混合物培養後の培養上清中または抗原やマイ）ゲンによ
り刺激を受けたマウスのリンパ球培養°上清中に存在す
る物質がマウスのＴ細胞を除去された！リンパ球細胞集
団やヌードマウス由来のリンパ球のヒツジ赤血球（５Ｒ
ＢＯ）に対する１次免疫応答を増幅させることを見出し
、そのような作用を有する活性物質にＴリッツ球代替因
子すなわちＴＲＦという呼称を与えた。それ以来’［’
ＲＦは抗原非特異的に主要組織適合遺伝子複合体（以下
、ＢｆＨＯと略称する。）の一致を必要としない様式で
Ｂ細胞に作用し、Ｂ細胞の分裂増殖を誘導せず、Ｂ細胞
の抗体産生細胞への分化を誘導する液性因子であると定
義されている。

その後、このようなり細胞分化因子の存在を示す証拠が
蓄積されており、ヒトにおいてもマウス同様の分化因子
の存在が示唆されている。現在では上述のように定義さ
れたＢ細胞を抗体産生細胞へ分化させる因子を１３０Ｄ
Ｆと総称するようになった。

このようにＢＯＤＦはヒトの体内でＢ細胞の抗体産生機
能に重要な働きをしている。ＢＯＤＦの臨床への応用は
大別して３つ考えられる。第１はＢＯＩ）ＦによりＢＯ
ＤＦ抗体を作り、ＥＯＤＦと抗ＢＯＤＦ抗体によるＢＣ
ＤＦのイムノアッセイ系を用いて免疫学的な病態の解析
に用いることが出来る。第２の応用は各種疾患の治療へ
の応用である。例えばＴ細胞のヘルパー機能低下にとも
な５Ｂ細細胞体産生能低下による免疫不全症患者にＥＯ
ＤＦ単独または他のリンホカインと共に投与することに
より抗体産生機能を正常に戻すことが考えられる。

さらに、Ｂ（！ＤＦの応用として次のことが考えられる
。Ｂ細胞増殖因子（ＥＯＧＦ　）　（Ｋ、　Ｙｏｓｈｉ
ｚａｋｉら、Ｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏ！、１３０　、　
１２４１　（１９８３）　）、その他のリンホカインを
含むＴ細胞因子を培地に加えることにより正常Ｂ細胞を
長期培養できることが報告されている（　Ｂ、　５ｒｅ
ｄｎｉら、Ｊ、　ｌｘｐ。

Ｍｅｄ、、　１５４　、１５００　（１９８１）参照）
。これらの培養正常Ｂ細胞に対し適当な時期にＢＯＤＦ
を作用させることによりｉｎ　ｖｉｔｒｏ　抗体を産生
させることが出来る。特定の抗体、例えば病原細菌、病
原ウィルス、病原原虫、癌細胞などの表面にある特定抗
原を認識する抗体を産生ずるＢ細胞をモノクローン化し
、クローン化正常Ｂ細胞を′ＢＣＤＦとその他のリンホ
カインを組合せて培養し、有用なモノクローナル抗体を
産生させることが出来る。これら抗体は感染症や癌の治
療および診断に利用できる。

本発明において重要な点が３つある。１つは従来Ｔ細胞
により産生されるとされてきたＢＯＤＦがＢ細胞由来細
胞からも産生されることをはじめて見出したことである
。さらに、ヒトＢＯＤＦを工業的に生産することを可能
とするヒ）　ＢＯＤＦ産生Ｂ産生株細胞株し、ヒ）　Ｂ
ＯＤＦ産生条件、精製法を見出し、ヒトＢＯＤＦ製造法
を確立したことである。

第２を本従来ＢＯＤＦが存在する証拠は集積しているに
もかかわらず、その物理化学的性質や機能が不明確であ
ったが、本発明によりＢＯＤＦを単離でき、その物理化
学的性質や機能を明確にできたことである。その結果、
このＢ細胞由来細胞からの１３ＱＤＦは、従来Ｂ細胞に
作用する可能性が報告されている種々の因子と明らかに
異なる新規物質であることが解明された。第３は、この
新規ＢＯＤＦによって実際にヒト正常Ｂ細胞を抗体産生
細胞へ分化させる方法を見出し、この新規ＢＯＤＦの実
用性を示した点である。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。本発明者らはＢ
ＯＤＦの工業的生産に有利であるヒ）ＢＣ！ＤＦ産生ヒ
）Ｂ細胞株を樹立し、この株化細胞を用いたヒ）　ＢＯ
ＤＦ製造法を確立した。

ヒ）　ＢＯＤＦ産生ヒト細胞株の作製は以下のように行
なうことが出来る。ヒトの末梢血、扁桃、ａ帯面などよ
りフィコールパックなどを用いた密度勾配遠心法等でリ
ンパ球を分離し、Ｔ、　Ｋａｔｓｕｋｉら（Ｉｎｔ、　
Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　１８．　７　（１９７６））の方
法に準じてＥｐｓｔｅｉｎ−Ｅａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ　（
以下、ＦｉＢＶと略称する。）を用いてヒ）Ｅ細胞を形
質転換（トランスフォーメーション）する。たとえば下
記の方法を用いることが出来る。ウィルス産生細胞株Ｂ
９５−８の培養上清（約１０’　ＴＤ　５Ｑ／ｄのウィ
ルスを含む）を１〜２×１０６／Ｉ！Ｌｌのリンパ球と
共に３７℃で９０分間ゆるやかに振動させた後、細胞を
一度洗浄してから２０％ＦＯ８を含むＩ’ＬＰＭＩ　１
６４０　（培地１　ｍｌにペニシリン０１００単位、ス
トレプトマイシン１００μｓを含む）培養液に浮遊させ
、１×１０６細胞／ウエルずつ９６穴マイクロプレート
に分注し、炭酸ガス培養器で培養する。５日毎に培養液
を半量交換する。２〜３週間後に形質転換Ｂ細胞が増殖
したウェルの培養上清のＢＯＤＦ活性（活性測定法は後
述する）を測定し、ＢＯＤＦ活性を有するウェルの形質
転換Ｂ細胞をリミテイングダイリューション法により株
化する。

この方法により株化した細胞としてたとえば０ＥＳＳと
標識されたヒ）Ｂ細胞株を用いることが出来る。０ＥＢ
Ｓを増殖させるための特別な条件は　１なく、一般に用
いられている培養条件を適宜採用して行なえばよい。ま
た、ＥＯＤＦの産生も一般的な方法で行なえばよいが、
好ましくはタンパク質を含まない培地を用いて行なうべ
きである。

以下に、０ＩＥ８Ｂを用いてＢＯＤＦを製造する方法の
１例を示す。

０’Ｅ８Ｓを増殖させるのに好適な条件、たとえばウシ
胎児血清・（Ｆｅ２）を含む培地にて０ＥＳ８を培養し
、ｏＦｉｓｓの細胞数を増やした後、細胞を分離洗浄し
てＢＯＤＦ産生に最適な条件、たとえばＦｅ２などのタ
ンパク質を含まぬ完全合成培地に細胞を移し、さらに培
養することにより共線タンパク質の少ないＢＯＤＦを得
ることができる。

０３８８を培養するのに用いる培地の主成分は市販の培
地でよい。例えばＲＰＭＩ　１６４０培地、改良イーグ
ル培地（ＭＥＮ　）　、ダルベツコ改良イーグル培地（
ＤＭＥＭ　）またはクリック培地でよい。これらの培地
に対する添加物として１）１ｄ当り約２０〜２５０単位
、理想的には１ｄ当り約１００単位の１ｄ当り約１００
〜１０００μ１１理想的には１ゴ当り約３００μｇの新
鮮Ｌ−グルタミン　ｖ）１０〜６０　ｍＭ　、理想的に
は２５ｍＭのヘベス緩衝液Ｖｉ）　８〜２０　ｍＭ　、
理想的には１６　ｍＭのＮａＨＣＯｓｖｌｉ）　５　Ｘ
　１０−’　〜５　Ｘ　１０”−’　Ｍ、理想的には５
×１０−’　Ｍの２−メルカプトエタノール　などを必
要に応じて用いることが出来る。

０：ＥＳＳの細胞数を増やすのに最適な培地として、た
とえば上述の培地にさらに１〜３０％、好ましくは１０
％のＦｅ２を添加した培地を用いる。ＢＯＤＦ産生のた
めの最適な培地としては、Ｆｅ２を添加しない上述の培
地でよい。Ｆｅ２を添加しない完全合成培地中で４８時
間培養後もａｐｓｓの生存率は９０％以上が保持されて
いる。また、Ｆｅ２やマイトゲンを添加した培地とこれ
らを添加しない完全合成培地においてのＢＯＤＦ生産量
はほぼ等しい。

Ｔ細胞よりＢＯＤＦを生産する場合、従来は培地にＦｅ
８のようなタンパク質を添加したり、マイトゲンを添加
したりすることが必須であった（　Ｔ。

Ｔｅｒａｎｉｓｈｉら、Ｊ、　ｏｆ　ＩｍｍｕｎｏＬ、
　１２８　、　１９０３（１９８２）　、　Ａ、　Ｍｕ
ｒａｇｕｃｈｉら、Ｊ−ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１２７．４１２（１９８１）参照）。これに対してｃＥ
ｓ　ｓを使用してＢＯＤＦを生産する場合、培地ＫＦＯ
８のような血清、血液中のタンパク質成分、その他タン
パク質成分を加える必要がなく、また通常用いられてい
るＴ細胞またはＢ細胞に対するマイトゲンも加える必要
がないことは特筆に値する。そのため高価なＦｏｇを用
いないで安価にＥ（７ＤＦを生産することが出来るばか
りでなく、人体に有害な異種タンパク質やマイトゲンを
含まない安全なりＯＤＦを容易に得ることが出来る。

０ＥＳＳ　１７を用いてＢ−ＢＯＤＦを生産する上記方
法は種々の環境的条件で行なわれる。しかし、好ましく
は０１８８　Ｎ培養物は約３５〜３８℃の温度範囲にお
いて約５〜１０％の炭酸ガスを含む湿度調節空気中に保
持すべきである。また、理想的には培地のｐｎは約７，
０〜７．４と僅かにアルカリ性の条件下に保持すべきで
ある。ａｐｓｓｙは平底ミクロプレートなど種々のタイ
プの培養器上１００μ！単位などの種々の容量で接種さ
れる。ファｉコン・ラブウェア・ディゲイジョン、ペク
トン・デイッキンソン・エンド・コーポレーション（Ｆ
ａ／ｃｏｎＬａｂＷａｒｅ、　Ｄｉｖ、　Ｂｅｃｔｏｎ
、　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、　）から市販
されているフラスコＡ　３０１３または３０２５のよう
な組織培養フラスコも使用できる。別法として上記ファ
ｉコン・ラブウェアから市販されているボトル７１１３
０２７のような回転びんも培養容器として使用できる。

ＯＥＳ　Ｓを培養して細胞数を増やすための最適条件と
して、細胞の当初密度は培地１　ｍｌあたり１×１０４
細胞ないし５　Ｘ　１０’細胞、好ましくは１×１０’
ａ胞である。上述の条件で０Ｅ８Ｓを培養すると、通常
２〜７日で培地１ｄ当り５　Ｘ　１０’細胞から２Ｘ１
０’細胞程度まで細胞密度が増加するので、再び新しい
培地を加えて培地１ｄ当りｌＸｌ０’〜５ＸＩＱ’細胞
にまで細胞密度を下げ、再び培養を続ける。このように
して目的とする細胞数になるまで０ＥＳ８の培養を続け
た後、細胞を遠心分離等で分離し、細胞をタンパク質を
含まぬ完全合成培地で洗ってから新しい完全合成培地に
接種する。

この時の細胞の当初密度は培地ＩＦ！Ｌｌあたり約１×
１０’細胞ないしＩ　Ｘ　１０’細胞であることが好ま
しく、理想的には培地１ａあたり５×１い細胞である。

ｃｉｓｓｌｌ’を培養することによって生産されるＢＯ
ＤＦ量は経時的に変化する。例えばＩＦｒＬｔ当り５×
１０５初発細胞密度でａｐｓｓ　ｐｉをＲＰＭＩ　１６
４０培地（１４当りペニシリン１００単位、ストレプト
マイシン１００μ！、ケンタマイシン１０βｇおよびＮ
ａＨ（！０６１６μＭを含む）で培養すると、ＢＣＤＦ
活性は４８時間後にピークレベルに達する。さらに、次
の２４時間に存在するＢＯＤＦ活性は僅かに減少する。

このようにＲＰＭＩ　１６４０培地中１７）ＯＥＳＳ−
２＝棟でＢ−ＥＯＤＦを生産する至適培・養時間は約２
４〜７８時間である。

正常Ｂ細胞によるＢＧ！ＤＦの製造 本発明者らは、さらに０Ｅ８Ｓの場合と同様のＢ　ＯＤ
Ｆを正常Ｂ細胞が産生ずることを見出した。

ヒト正常Ｂ細胞を使用する場合、ヒト正常Ｂ細胞は健康
人の末梢血または手術によりヒトより切除された扁桃腺
、牌臓、リンパ節などより分離することかできる。この
場合の分離方法は公知の方法でよく、たとえばＥ、ロゼ
ツト法（Ｍ、　Ｊｏｎｄａｌら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅ
ｄ、　１３６．２０７　（１９７２）　、Ｒ，Ｍ。

Ｆａｌｋｏｆｆら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ７．　Ｍｅｔｂ
、　５０．３９　（１９８２）　）で行なうことができ
る。その１例を示すと、たとえばフィコールバックなど
を用いた密度勾配遠心法により単核球を集め、さらにノ
イラミニダーゼ処理８ＲＢＱまたはＡＦｔＴ　（８−２
−ａｍｉｎｏｅｔｈｙ）ｉｓｏｔｈｉ−ｏｕｒ８−２−
ａ　ｂｒｏｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ　）処
理５ＲＢＯとヒトＴ細胞との特異的結合を利用してヒ）
Ｔｐｌ胞を除去し、さらに抗ヒトマクロファージ抗体と
補体処理あ゛るいは表面処理プラスチックシャーレや表
面処理プラスチックフラスコ中でヒ）Ｔ細胞除去単核球
を数時間から１夜培養することにより付着性細胞を除き
、ヒトＢＭ胞を得ることが出来る。

上述の方法によってＴ細胞および付着性細胞が除去され
たヒ）Ｂ細胞群を得ることが出来る。

上述の正常ヒ）Ｂ細胞を用いてＢ−ＥＯＤＦを生産する
場合、細胞の初濃度は培地ＩＦｒＬｌあたり約１×１０
５細胞ないしｌＸｌ０’細胞であることが好ましく、理
想的な濃度は培地１ｄ当り５Ｘ１０’細胞である。使用
できる培地としてはＲＰＭＩ　１６４０培地、クリック
培地、　ＤＭＥＭ、　ＨＥＭなどがある。これらの培地
に対する添加物としては１１！Ｌｌ当り約２０〜２５０
単位、好ましくは１ｄ当り約１００単位のペニシリンが
ある。さらに、ストレプトマイシンも好ましくはＩＩＩ
Ｌｌ当り２０〜２５０μｇ、理想的には１ｄ当り約１０
０μｇの濃度で添加剤として使用できる。ゲンタマイシ
ンも１ｄ当？ｌ）１μＩ〜１００μｇ１理想的には１ａ
当り１０１１９の濃度で添加剤として使用できる。他の
添加物としては（１）好ましくは１ｄ当り約１００〜１
０００μｇ、理想的には１ｄ当り約３００μｇの新鮮Ｌ
−グルタミン（Ｉｔ）好ましくは１０〜６−ＯｍＭ　、
理想的には２５ｍＭのヘベス緩衝液および（ｔｉｉ）好
ましくは８〜２０ｍＭ、理想的には１６ｍＭのＮａＨＯ
Ｏｓ　Ｇｙ）好ましくは５×１６５Ｍの２−メルカプト
エタノールなどがある。

また、０．５〜１０％濃度のＦｅ２の添加はｌｌ−ＢＯ
ＤＦの生産に好ましく、特に１％濃度が理想的である。

さらに、マイトゲンの添加はＢ−ＢＯＤＦ生産に太きな
影響を与える。有効なマイトゲンはＢ細胞マイトゲンと
して知られているもので、（１）グラム陽性菌、たとえ
ばスタフィロコッカス・アウレウス・コーワン（５ｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　Ｏｏｗａｎ　
）　ｌをホルマリン処理または加熱処理等で殺菌した菌
体あるいは細胞壁など　グラム陽性菌菌体由来のマイト
ゲン　（１）グラム陰性菌、たとえばサルモネラ死菌体
、細胞壁およびこれらより分離した細胞壁成分やりボポ
リサツカライド（ＬＰ８）などグラム陰性菌菌体由来の
マイトゲン　（１１０酵母、たとえばキャンデイダ・ア
ルビカンス（０ａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　）の
死菌体、細胞壁およびこれらより分離した細胞壁成分な
ど酵母菌体由来のマイトゲン　動デキストランサルフェ
ートなどを用いることが出来る。

これらマイトゲンの添加量はＥ−ＢＯＤＦの産生に至適
量を選ぶとよいことは勿論であり、たとえばスタフィロ
コッカス・アウレウス・コーワンＩのホルマリン処理菌
体（カルビオケム、「パンソルビン・セル」）を０．０
０２５％添加するとよい。

正常ヒ）Ｂ細胞からＢ−ＢＯＤＦを生産する環境条件は
一般的条件でよく、たとえば前記ＣＥＳ８と同様でよい
。しかし、好ましくは正常ヒ）１３細胞培養物は約３５
〜３８℃の温度範囲において約５〜１０％の炭酸ガスを
含む湿度調節空気中に保持すべきである。また、理想的
には培地のｐＨは約７．０〜７．４と僅かにアルカリ性
の条件に保持すべきである。正常ヒトＢ細胞は培養フラ
スコなどの種々のタイプの培養器上１００μｌ〜ｉ　ｏ
　ｏ　Ｏａｕの種々の容量で接種される。たとえばフア
シヨン・ラブウェア・ディビジョン・ベクトン・デイツ
キンソン・エンド・コーポレーションかう市販サレテイ
るフアシヨン４３０１３または３０２５　のような組織
培養フラスコも使用できる。別法としてフアシヨン・ラ
ブウェアから市販されているボトル屋３０２７のような
回転ビンも培養容器として使用できる。

正常ヒトＢ細胞を培養することによって生産されるＢ−
ＢＯＤＦ量は経時的に変化する。一般的に、正常ヒ）Ｅ
細胞でＢ−ＢＯＤＦを生産する至適培養時間は０ＥＳＳ
の場合と同様に約２４〜７２時間であり、好ましくは約
４８時間である。

ＢＣＤＦ活性の測定法 種々のヒ）Ｂ細胞由来細胞を培養して生産されたＢＯＤ
Ｆの活性はＡ、　ＭｕｒａｇｕｃｈｉらＪ、　ｉｍｍｕ
、Ｈｏｊ１２７　、４１２　（１９８１）に論じられた
検定法に準じて測定できる。この検定法はＥＥＶによる
形質転換ヒトＢ細胞株のイムノグロブリン産生誘導によ
り活性検定するものである。ＢＣ！ＤＦのシグナルによ
りイムノグロブリン産生細胞に分化するヒ）Ｂ細胞株と
して０．８ａｅｋｉら（１ｉｉｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ　１３　＊３１　（１９８３））で報告されてい
る５ＫＷ６　ＣＬ−４を用いる。

Ｂ（ＩＩ）Ｆ含有試料をｌｏｇ　２希釈した一連の希釈
溶液２００μｌずつに約１０４の５ＫＷ６　ＣＬ−４を
接種する。

希釈は１０％ＦＯ８を含むＲＰＭＩ　１６４０培地（１
ｙ当すぺ斤シリン１００単位、ストレプトマイシン１０
０μｇ、ゲンタマイシン１０μｇ、およびＮａｐｏ□、
　１６　ｍＭを含む）で行なう。通常、１つの試料につ
いて２連で行なう。この混合物を９６穴マイクロプレー
ト中で９６時間、３７℃にて５％炭酸ガスを含む湿度調
節された空気中で培養する。途中４８時間後、各ウェル
に１００μｌの新鮮な上述の培地を添加する。４８℃に
保温した試験管の中ヘハンクス緩衝液に溶解した０、５
％アガロース溶液３００μｌ、ハンクス緩衝液に懸濁し
たプロティンＡ結合５ＲＢＯ４０％ｖ／ｖ懸濁液２０μ
ｌ（プロティンＡ結合８ＲＢＯ；　８ＲＢＯパツク１ｄ
に対し、プロティンＡ０．７５■を含む生理食塩水Ｑ、
７５ｙおよびＯｒＣ７ｇ　・６ＮｇＯ６６０Ｌｇを含む
生理食塩水１０Ｍを混合し、３７℃で３０分保温後、５
ＲＢＯを生理食塩水で４回洗浄する）、ハンクス緩衝液
で希釈した上述の５ＫＷ６　ＣＬ−４細胞浮遊液１００
μ！（２連の試料を含む培養物を合せ、遠心分離して細
胞を集める。これを１Ｎのハンクス緩衝液に懸濁する。

）２モルモット補体溶液（８ＲＢＯで吸収したモルモッ
ト血清をハンクス緩衝液で３〜４倍希釈して用いる）２
０μ！および抗ヒ）　ＩｇＭ抗体溶液（ウサギ抗ヒ）Ｉ
ｇＭ抗体全血清、マイルスをハンクス緩衝液で２０〜５
０倍希釈して用いる）２０μｌを上記の順に攪拌しつつ
手早く加え、次いでプラスチックシャーレにツスイＰシ
ャーレ、　深！。

日水製薬株式会社）上に直径約５ｃＲの円板を画くよう
に上述の混合物を手早くまく。寒天が固まってから３７
℃で５％の炭酸ガスを含む温度調節された空気中で約１
６時開瞼１する。

この方法によりＢＯＤＦの存在下に培養された５ＫＷ６
　ＣＬ−４細胞はＥＣＤＦの添加量に依存して溶血斑（
ブラック）の増加を示す。これらＢＯＤＦにより８ＫＷ
６０Ｌ−４が抗体産生細胞へ分化し、ＩｇＭを分泌する
ようになり、寒天中のＳＫ％Ｖ６　ＣＬ−４細胞が分泌
したＩｇＭと８ＫＷ６　ＣＬ−４細胞周囲の抗ヒ）　Ｉ
ｇＭ抗体結合５ＲＢＯが結合し、補体の働きで溶血する
ものである。

ＢＯＤＦ活性の標準として、Ｔ細胞因子（ＴＦ）を用い
る。

ＰＨＡを含む培地で４８時間培養した培養上清をＴＦ令
≠弁膝号とする。このＴＦ−ム暴子を１単位／　ｍｌと
し、このＴ　Ｆ：＃により作成した標準曲線より測定試
料の単位を決定した。

Ｂ−ＢＯＤＦの精製 Ｅ−ＢＯＤＦは塩析、真空透析、限外ｐ過、ゲルｐ過ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、クロマトフオーカシ
ング、逆相クロマトグラフィー。

焦点電気泳動およびゲル電気泳動等の種々の方法によっ
て上述の培養物上清から濃縮して精製できる（実施例１
参照）。

本発明により見出された物質Ｂ−ＢＯＤＦは表１に示さ
れる性質を持つ物質として規定される。Ｂ−ＢＯＤＰの
性質をより詳細に以下に述べる。

表　１ Ｂ−ＢＯＤＦの物理化学的性質 上述の方法で正常Ｂ細胞または０ＥＳ８より生産される
Ｅ−ＢＯＤＦは以下の性質を有する。

（１）分子景。

前もってＰＢ８で平衡化したＡｃＡ　３４カラム（ＬＫ
Ｂ　。

Ｂｒｏｍｍａ、　Ｓｗｅｄ、　）にＢ−ＢＣＤＦを含む
、濃縮された正常Ｂ細胞またはｃｘｓｓ培養上清を流し
、ＰＢ８で溶出すると、分子量１５，０００から３０，
０００に対応する位置にＢ−ＢＯＤＦが溶出する。上述
の方法で精製したＢ−ＥＯＤＦを上述の方法でＨＰＬＯ
用ｌ−１２５カラム（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔ
ｅ　Ｉｎｃ、ｍ　Ｍｉ／ｆｏｒｄ、　Ｍａｓｓ、）を用
いてゲルｐ遇すると、分子量２０，０００に対応する位
置にＢ−ＢＯＤＦが溶出する。また、精製Ｂ−ＢＯＤＦ
を８ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ標準タンパク質の移動距離と
対応させると、分子量２０，０００に対応する位置に１
本のタンパク質のバンドが検出される。

これよりＢ　−Ｂ　ＯＤＦの分子量は１５，０００〜３
０，０００であると推定される。

（２）等電点 前述の方法で正常Ｂ細胞またはＣ！Ｂ８　Ｓ　時より得
たＢ　−ＢＯＤＦを含む培養液を限外濾過により濃縮し
、ＡｃＡ　３４カラムにより分離精製したＢ−ＢＯＤＦ
をｐＨ７〜４の範囲でファルマシアＭＯｎｏ　Ｐカラム
を用いてクロマトフオーカシングを行なうと、ｐＨ５〜
５．５の位置にＢ−ＢＯＤＦが溶出する。これよりＢ−
ＢＯＤＦの等電点はｐＨ５〜５．５と推定される。

（３）安定性 Ｂ−ＢＣ！ＤＦを含む培養上清を５６℃、３０分処理し
た場合、９０％以上のＢＯＤＦ活性が残存する。

また、Ｂ−ＢＯＤＦを含む培養上清を８０℃、１５分処
理した場合、９０％以上のＢＣＤＦ活性が消失した。

Ｂ−ＢＯＤＦを含む培養上清を０．１Ｍグリシン塩酸で
ｐＨ２とし、３０分処理した場合、９０％以上のＢＯＤ
Ｆ活性が残存する。Ｂ−ＢＣＤＦを含む培養上清０．５
　ｍに２５単位の不溶化トリプシン（シグマ・ケミカル
・コーポレーション、セントルイス）ヲ加え、ｐＨ７，
３で３７℃、６０分保温すると、９０秀以上のＢＯＤＦ
活性が消失する。

Ｂ−ＢＯＤＦを含む培養上清をＺｏｏ、０ＯＯＧで６０
分遠心しても上清のＢＯＤＦ活性は変化しない。また、
Ｂ−ＥＯＤＦを含む培養上清を紫外線照射しても、ＢＯ
ＤＦ活性は消失しない。

以上のように、Ｅ−ＥＯＤＦはα−インターフェロンや
ＩＬ−２と同様に比較的酸性域で安定なタンパク質を主
体とする物質の挙動を示す。また、超遠心や紫外線照射
の結果よりウィルス粒子やマイコプラズマのような細胞
感染性の生物ではない。

Ｂ−ＥＯＤＦの新規性 直接にＢ細胞に作用し、または他の細胞に働いて間接的
にＢ細胞に作用し、Ｂ細胞の分化誘導に影響を与える物
質としてＩＬ−２（Ｐ、Ｍａｒｒａｃｋら、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、　Ｒｅｖ、　６３．３３　（１９８２））　、　
ＢＯＧＦ　（Ｋ。

Ｙｏｓｈｉｚａｋｉら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２
８．１２９６　（１９８２）　。

Ｍ、　Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ、　１ｉｘｐ、　Ｍｅｄ、　
１５５　、９４　（１９８２）　）およびインターフェ
ロン（Ｗ、　Ｂｒａｕｎら、Ｐｒｏｃ。

Ｓｏｃ、　Ｆｉｘｐ、　Ｂｉｏｉ　Ｍｅｄ、　１４１　
、７６９　（１９７２）　）が報告されている。そこで
Ｃ′ＥＳＳ培養液のＩＬ−２活性。

ＢＯＧＦ活性およびインターフェロン活性を測定したが
、これらの活性は検出されなかった。すなわち、０Ｋ８
Ｂ培養上清５〜２０％濃度で活性を測定した。ＩＬ−２
依存ヒトまたはマウスの細胞性障害Ｔ細胞株を用い、Ｔ
、　Ｋａｉｅｄａらの方法（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１２９　、４６　（１９８２））Ｋ示される方法テＩＬ
−２活性を測定した。ＢＯＧＦ活性は抗イデイオタイプ
抗体により刺激したＥ−ＯＬＬ細胞またはＳＡＣで刺激
した末梢の正常ヒ）Ｂ細胞の増殖により測定した。

測定方法はに、　Ｙｏｓｈｉｚａｋｉらの方法（Ｊ、　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１２８　、１２９６　（１９８２）　）およびＡ−Ｍｕ
ｒａｇｕｃＪらの方法（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ１１１２９
．１１０４　（１９８２））に従った。インターフェロ
ン活性はＨ，Ｄａｂ４の示す方法（Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ
ｏｉ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　５ｃａｎｄ、　（Ｂ）＋　
８１ａ　３５９（１９７３）　）に従い抗ウィルス活性
を測定した。

上述の結果より、Ｂ−ＢＯＤＦのＢ細胞分化活性はＩＬ
−２，ＢＯＧＦ、インターフェロンの混入によるもので
はない。

これまでにＢ細胞がＢＯＤＦを産生するという報告はな
く、本発明により初めて明らかにされたものである。一
方、前述のようにヒ）Ｔ細胞の産生ずるＢ　ＯＤＦが報
告されている。Ｔ、　Ｈｉｒａｎｏら（平野俊夫、細胞
工学ｖｏＣ３，２１（１９８４）　）の報告するＢＯＤ
Ｉ”　−ＩはＳＡＧまたはＰＷＭで活性化されたヒト※ 正常Ｂ細胞抗体産生細胞まで分化させる分子量２０．０
００の物質であり、Ｂ−ＢＯＤＦと類似した性質を示す
が、ＢＯＤＦ−Ｉ　（７）等電点はｐＩ　６．５　、　
ｐＩ　７．０゜ｐＩ　８．０の３種とされており、いず
れもＢ−Ｂ（！ＤＦと異なる。また、Ｔ、　Ｔｅｒａｎ
ｉｓｈｉら（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ１１１２８　、１９０
３．　（１９８２）　）の示すＢＯＤＦ−Ｉ［ハヒ）　
Ｔ　細胞の産物で、ＥＢＶにより形質転換したＢ細胞、
すなわちＥ　Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ　Ｃｅ１ｌ
　Ｌｉｎｅ　（ＬＯＬ）を抗体産生細胞へ分化させる働
きをする物質で分子量は４０，０００と２０，０００、
等電点は５〜６であり、Ｂ−ＢＯＤＦと類似する。また
、Ｂ−ＥＣＤＦはＳＡＣで活性化されたヒト正常Ｂ細胞
を抗体産生細胞へ分化させる働きがあるが、ＥＯＤＦ−
ＩＩはＥＯＤＦ　−■との共同作業により同様作用を有
するが、ＥＯＤＦ４単独ではヒト正常Ｂ細胞を抗体産生
細胞へ分化させ得ない。

以上よりＢ−ＢＯＤＦは新規物質であることが明らかで
ある。

Ｂ−ＢＯＤＦによるヒ）Ｂ細胞由来細胞の抗体産生細胞
への分化誘導 本発明者らはＥ−ＢＯＤＦを用いてヒ）Ｂ細胞由来細胞
を抗体産生細胞へ分化させ、ヒ）Ｅ細胞由来細胞より抗
体を産生させる方法を見出した。

この抗体製造法は、種々の添加物を含有する血清含有ま
たは不含培地中で正常ヒ）Ｂ細胞、ヒト形質転換Ｂ細胞
、ヒト悪性化Ｂ腫瘍細胞等をＰ−ＢＣ！ＤＦと共にｉｎ
　ｖｉｔｒｏ培養することにより抗体を生産する。ここ
で使用するＢ−ＢＣＤＦは培養上清をそのまま用いても
よいが、本発明のＢ−ＥＯＤＦは分離精製が容易なので
、精製品を用いてもよい。精製品を用いる場合は、Ｂ−
ＢＯＤＦ産生時の不純物が産生抗体に混入することが避
けられるので有利である。一定時間培養した後、培養上
清を集め抗体を分離する。抗体の製造にはヒトの末梢血
、扁桃腺、牌臓、リンパ節などより得た正常ヒ）Ｂ細胞
を用いる。また、Ｅ−ＢＯＤＦの存在下で抗体産生細胞
へ分化するあるいは分化が促進される特定なヒト形質転
換Ｂ細胞、ヒ）Ｂ白血病細胞、ヒトＢリンパ腫細胞、ヒ
）Ｂ細胞融合細胞などのヒ）Ｂ細胞由来悪性化細胞を用
いることもできる。培養液の主成分は市販の培地、例え
ばＲＰＭＩ　１６４０培地。

改良イーグル培地（ＭＩＭ　）　、ダルベツコ改良イー
グル培地（ＤＭＥＭ　）またはクリック培地でよい。

培地に個々あるいは組合せて添加できる添加物はペニシ
リン、ストレプトマイシン、ケンタマイシン、新鮮Ｌ−
グルタミン、ヘベス緩衝液、　ＮａＨ（！Ｏ＠およびＦ
Ｏ８である。また、必要に応じてスタフィロコッカス・
アウレウス・コーワンＩ菌体（ｓＡａ）のようなマイト
ゲンを添加することが出来る。Ｂ細胞由来細胞を１１１
Ｌｅあたり１×１０４〜ｌＸ１０７の細胞密度に接種し
、００ｓなどの存在下において中性付近のｐＨに保ちつ
つ、３７℃付近で１〜４日程度培養して抗体を含む培養
上清を得ることが出来る。培養は培養フラスコ、培養ロ
ーラーボトル。

ジャーファーメンタ−などを用いることが出来る。

なお、ヒト正常Ｂ細胞を用いる場合については後記実施
例３、ヒト形質転換Ｂ細胞を用いる場合については前記
ＢＯＤＦ活性の測定法を参照されたい。

次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例１　０ＥＳ８によるＢ−ＢＯＤＦの製造１０％Ｆ
ＯＲ含有ＲＰＭＩ　１６４０培地で培養して得たｃＢｓ
ｓをＩＩＩＬｌあたり５　Ｘ　１０’細胞数、５００ゴ
ゆ平底フラスコ（ファルコン３０２８　、ベクトンデイ
ツキンソン、カルフォルニア、ＵＳＡ）中５０ｄのＲＰ
ＭＩ　１６４０培地で培養した。培地には１ｒＩＬｔあ
たり１００単位のペニシリン、ＩＷＬｌあたり１００μ
ｓのストレプトマイシン、１ゴあたり１０μＩのゲンタ
マイシン、１６ｍＭのＮａＥｏｏ、を含有させた。細胞
株、培地、添加物を含む各培養物の全量は５Ｑｍとした
。培養物を空気中５％炭酸ガス含有の湿度調節環境下３
７℃に保った。４８時間後、培養上清を取り、前述の検
定法を用いてＥ　ＯＤＦ活性を調べた。この結果、ＩＩ
Ｌｌ中約１０単位のＢ−ＥＯＤＦが得られた。

上述のように、Ｃ！ＥＳＢを培養して得たＥ　−ＢＯＤ
Ｆを含む培養上清よりＢ−ＢＯＤＦを以下の方法で精製
した。無細胞上清１０１を限外ｐ過膜（アミコンＹＭ−
１０，アミコン・コーポレーション、マサチューセッツ
、　ＵＳＡ　）を装着した限外ｐ過装置（アミコン大量
処理用セル２０００型、アミコン・コーポレーション、
マサチューセッツ、ｕｓＡ）ヲ用いて窒素ガスにより４
　ｋｇ／ｃｌＩＬ”の圧力をかけ濾過した。

−過膜上部に残った１ｏｏｙの濃縮液をさらに限外ｐ過
膜（アミコンＹＭ−１０）を装着した限外ｐ過装置（ア
ミコン、スタンダードセル５２型）を用い窒素ガスによ
り４ｋｇ／ｃＩｒＬ２の圧力をかけて一過した。漣過膜
上部に残った５Ｍの濃縮液を採取した。

上述の濃縮した上溝をＡｃＡ　−３４ゲルｐ過カラム（
ＬＫＢ　Ｐｒｏｄｕｋｅｒ、　Ｓｗｅｄｅｎ　、１−６
　Ｘ　９０　ｃｍ　）で処理した。なお、ゲル一過カラ
ムはあらかじめＰＢＳ（ホスフェート・バッファーセイ
ライン、　０．１５Ｍ食塩ヲ含む０．０１　Ｍホスフェ
ート・バッファー。

ｐＨ７，０）で平衡化した。濃縮上清をＰＢＳで溶出し
、溶出液を５ｄずつ分取し、分取液のＢ　ＯＤＦ活性を
測定した。ＢＯＤＦ活性を有する分画は分子量１５．０
００から３０，０００に相当するフラクションにＢＯＤ
Ｆが含まれていることがわかった。ゲル一過カラムは次
の分子量マーカーで検定した。ブルーデキストラン２０
００（ファルマシア・ファインケミカルス、スウェーデ
ン）２ＸＩＱ’、フェリチン４．５　Ｘ　１０６．アル
ドラーゼ１．５８Ｘ１０″、オフアルブミン４．５Ｘ１
０’、キモトリプシノーゲン２．５　Ｘ　１０’　、チ
トクローム０１．１７　Ｘ　１０’また、Ｅ−ＢＯＤＦ
を含むフラクションを集め、１００倍容の２５　ｍＭ　
ピペラジン−塩酸緩衝液（ｐＨ６，３）に対し４℃で１
夜透析した。

クロマトフオーカシング ＡｃＡ−３４カラムクロマトグラフイーで分画され、集
められ、透析されたＢ−Ｂ（！ＤＦ画分をあらかじめ２
５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝液（ｐＨ６−３）で平衡化
したＭｏｎｏ　Ｐカラム（ファルマシア・ファインケミ
カルス、スウェーデン）に通した。このカラムを１０ｄ
の２５　ｍＭピペラジン−塩酸緩衝液で洗った後、塩酸
でｐＨ４，５に調製した４９ｍの１希釈ボ０ リバツファ−７４（ファルマシア・ファインケミカルス
、スウェーデン）で溶出した。カラム操作はファースト
・プ四ティン°リキッド・クロマトグラフィー、　ＦＰ
ＬＯ（ファルマシア・ファインケミカルス、スウェーデ
ン）を用い、流速は毎分１ｄで行なった。溶出液を１ｄ
ずつ分取し、ＢＣ！ＤＦ　’活性とｐＨを測定した。Ｂ
ＯＤＦ活性はｐＨ５〜５．５の位置に溶出された。

ＢＣｊＤＦ活性を持つフラクションを集め、２０ｍＭビ
ス・トリス−プロパン塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）に透析
した。

ＭｏｎｏＱ陰イオン交換力ジムクロマトグラフイー上述
の透析した活性フラクションを２０　ｍＭビス・トリス
−プロパン塩酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＭ
ｏｎｏ　Ｑカラム（ファルマシア・ファインケミカルス
、スウェーデン）Ｋ通した。このカラムを１０！ＩＬｌ
の２０　ｍＭ　ビス・トリス−プロパン塩酸塩緩衝液（
ｐＨ７，０）で洗った後、２０１１Ｌｔの２０　ｍＭ　
ビス・トリス−プロパン塩酸ａ　衝Ｗ　（ｐＨ７，０）
　Ｋ対し２０ｒｎ！！の１．０Ｍ食塩を含む２０　ｍＭ
ビス・トリスーグロパン塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）を直
線的濃度勾配により加えて溶出した。Ｍｏｎｏ　Ｑカラ
ムの操作はファルマシアＦＰＬＯ装置を用い、流速は毎
分１ｄで行なった。溶出液を１ｍずつ分取し、Ｂ　ＯＤ
Ｆ活性を測定した。ＢＯＤＦ活性は約７５　ｍＭ食塩を
含む７ラクシヨンに検出された。

ｌ−１２５ゲル濾過力ラムクロマドグ２フイーＭｏｎｏ
Ｑカラムより溶出されたＥ　ＯＤＦ活性を持つフラクシ
ョン０．５ｍｌをｌ−１２５カラム（ウォーターズ・ア
ソシエイテッド・インコーポレーション。

マサチューセッツ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　）に通した。ｌ−
１２５カラムは２本連結し、ＰＥ８で緩衝化した後、上
述のＢＯＤＦ活性フラクションを通した。カラム操作は
ハイ・・パフォーマンス・リキッド・クロマトグラフィ
ーＨＰＬＯ（ウォーターズ・アソシエイテッド・インコ
ーポレーション、マサチューセッツ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、）を用い、流速は毎分０．６１ｎｌで行な
った。

溶出液を１ａずつ分取し、ＢＯＤＦ活性を測定した。

分子量約２００００に対応する位置にＢ　ＯＤＦ活性が
認められた。

ＭｏｎｏＱカラムからのＢＯＤＦ活性を持つ溶出液フラ
クション２ゴを４回に分けて上述の操作でｌ−１２５カ
ラムによりゲル濾過し、得られたＢＯＤＦ活性を持つフ
ラクションを合わせてｌＱｍＪのＢ−ＢＯＤＦ溶液を得
た。この溶液を限外ｐ過膜、゛アミコンＹＭＩＯ（７ミ
ｊ　ン−コーホｖ　−シ：Ｉ７　、　Ｕ、８．Ａ、）を
装置した限外ｐ過装置、アミコンマイクロダイアフロー
システム８ＭＯ型でｌ　ｍｅまで濃縮し、凍結して精製
Ｂ−ＥＯＤＦとして保存した。

上述の精製操作におけるＢ−ＢＯＤＦ精製過程を表２に
示す。０１８８の培養上清に対し、精製Ｂ−ＢＯＤＦは
タンパク質当りのＢＯＤＦ活性よりみて約１５００倍に
精製された。活性の回収率は約５．７％であった。最終
的に得られたＢ−ＢＯＤＦ溶液１ｄの２８０ｎｍの吸光
度は帆２５１であった。

精製Ｂ　−ＢＯＤＦの純度検定 ｉ）　ｌ−１２５ゲルｐ過クロマトグラフイ−ｍ製Ｂ　
−ＢＯＤＦ　溶１０．５ｄ’ｋ　ｌ−１２５ゲルｉｓ過
カラムに通した。クロマトグラフの条件は上述の精製操
作と同じに行なった。タンパク質の吸収を示す２８０　
ｎｍの吸収は分子量２００００に対応する場所にただ１
つのピークが検出された。溶出液のＢＯＤＦ活性を測定
した結果、ただ１つのＢ−ＢＯＤＦ活性ピークが検出さ
れ、このＢＯＤＦ　活性のピーク位置と２８０　ｎｍに
おける吸着のピークは完全に一致した。

ｉｉ）ソデイウム・ドデシル・サルフエイト・ポリアク
リルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＲ−ｐＡＧＦｉ　）精
製Ｂ−ＥＯＤＦ溶液のＳＤＲ−ＰＡＧＥを行なった。

Ｕ、に、Ｌａｅｍｍｔｉ　（Ｎａｔｕｒｅ　ｅ　２２ヱ
、６８０　（１９７０））に示された方法でＳＤＲ−Ｐ
ＡＧＦｔを行なった。１％ＢＤＢ中１２％中ソ２クリル
アミドゲルを用いた。

Ｂｗｉｔｚｅｒらの方法（Ａｎａｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　９８　、２３１（１９７９））にしたがいシルバー
づテイユング法を用いてタンパク質を検出した。その結
果、分子量２０００００位置にただ１本のタンパク質の
バンドが検出された０以上の結果より、上述の精製Ｂ　
−ＢＯＤＦ標品は単一物と判断される。

実施例２正常ヒ）Ｂ細胞によるＢ−ＥＯＤＦの製造ｉ）
ヒトＢ細胞の調製 ヒトより血液を採取し、これよりリンパ球を分離した。

２００−の血液に生理食塩水を加えて２倍に希釈した。

希釈血液を３０ｄずつ透明なプラスチックチューブに入
った１５ｍ１のフィコールパック溶液（ファルマシア・
ファインケミカルス。

スウェーデン）上に静かに重層し、２０℃で２５０Ｇ、
１５分遠心した。各チューブの血清とフィコールパック
溶液の境界面に存在する不透明に見えるリンパ球画分を
分取し、３倍容のＰＢＳを加えて１００Ｇ、１０分遠心
した。得られたリンパ球ペレットを５０ゴのＰＢＳに懸
濁し、１００Ｇ、１０分遠心した。得られたリンパ球ペ
レットを再び５０ｄのＰＢＳに懸濁し、１００Ｇ、１９
分遠心してリンパ球を得た。次に、リンパ球より１．ロ
ゼツト法によりＴ細胞を除いた。すなわち、リンパ球な
１ｄ当りｌＸｌ０”の細胞数にＦＣ８中に懸濁し、これ
に１−のＦＯ８あたりＩ　Ｘ　１０”の細胞数としたノ
イラミニデース処理ヒツジ赤血球（５ＲＢＯ）懸濁液を
加え、リンパ球の総細胞数とノイラミニデース処理５Ｒ
ＢＣの総細胞数を１：５０とした。リンパ球とノイラミ
ニデース処理５ＲＥＯ混合液を１０ｍＡ！容のプラスチ
ックテープ中２ｄずつ分注し、３７℃で１５分保温後、
５０Ｇ、２分遠心した。遠心したチューブを水中で２時
間放置し、ノイラミニデース処理８ＲＢＯとＴ細胞のロ
ゼツト形成を行なった。氷中放置後、ペレットを極めて
静かにほぐし、この懸濁液６Ｍを１０威容プラスチツク
チユーブ（ファルコン２０５１チューブ）中の４ｄフイ
コールパツク溶液上に静かに重層した。この重層液を２
０℃で３５０Ｇ、２０分遠心した。ＦＯ８とフィコール
バック溶液の境界面に存在する不透明に見える細胞層を
分取し、３倍量のＰＢＳｆｇ：加え、１００Ｇ、１０分
遠心した。このようにして得た細胞ペレットをＦＯ８に
懸濁し、上述と同じ操作を行ない、ノイラミニデース処
理８ＲＢＯと残存するＴ細胞とロゼツトを形成させてＴ
細胞を除いた。

得られたＢ細胞濃縮分画より付着性細胞を除いた。

上述のようにして得たＢ細胞濃縮分画を１４あた６ｘｘ
ｔｏ細胞数として２００Ｔ！Ｌｌの平底７ラスコ（ファ
ルコン３０２４フラスコ、ヘクトンディツギンソン、カ
ルフォルニア、　ＵＳＡ、　）　中Ｉ　Ｏ％ＦｏＳを含
むＲＰＭ工１工種６４０培地養した。培養物を空気中５
％炭酸ガス含有の湿度調節環境下３７℃に保った。１２
時間後、フラスコを軽く５０回振った後、培養液を分取
して１００Ｇ、ｉｏ分遠心してＢ細胞分画を得た。この
Ｂ細胞分画にわすかに残存するＴ細胞および付着性細胞
を除くために、抗Ｔ細胞抗体（抗Ｌｅｕ　−１抗体、ペ
クトンデイツキンソン、カルフォルニア、　ＵＳＡ　）
および抗マクロファージ抗体（和光純薬工業（株）、大
阪）と補体でＢ細胞分画を処理した。すなわち、上述の
Ｂ細胞分画細胞を１１Ｒ１あたり１×１０細胞数で１０
０倍希釈抗Ｌｅｕ　−１抗体、１００倍希釈抗マ　１ク
ロフア一ジ抗体および１％Ｆｏｇ　ｉ含むＰＢＳに懸濁
した。細胞懸濁液を室温で３０分放置後、１００Ｇ、３
０分遠心して細胞を集め一％１−当りｌＸｌ０’細胞を
１０％ＦＯ８および１０倍希釈ウサギ血清を含むＲＰＭ
Ｉ　１６４０培地に懸濁した。この懸濁液を３７℃で３
０分保温し）１０分間毎に静かに攪拌した。

なお、ウサギ血清は生れてから１週間以内のウサギより
得た。ウサギ血清で処理した細胞を１０％ＦＢＢを含む
几ＰＭＩ　１６４０培地で３回洗ってＢ細胞を得た０ １１）ヒトＢ細胞によるＢ　−ＢＯＤＦの生産上述のヒ
）Ｂ細胞な１１ｒＬｌあたり５×１０細胞数に２００ゴ
容平底フラスコ中２０ｍのＲＰＭ１１６４０培地で培養
した。培地には１ｍｌあたり１００単位のペニシリン、
１ｍＡ！あたり１００μｓのストレプトマイシン、１ｄ
あたりｌＯμｇのゲンタマイシン。

ルビオケム、「パンフルビンセル」〕を含有させた。

培養物を空気中５％炭酸ガス含有の湿度調節環境下３７
℃に保った。４８時間後、上清をとり前述の検定法を用
いてＢＯＤＦ活性を調べた。この結果１ｒｎｌ！中約１
単位／１１ＬｌのＢ　−ＢＯＤＩＦが得られた０ｉｉｉ
）正常Ｂ細胞より得たＢ　−ＢＯＤＦの物理学的性質上
述のＢ細胞培養上清２０ｍ／を限外−過膜アミコンＹＭ
−１０を装着した限外ｐ過装置（アミコンダイアフロー
セル、アミコンコーポレーション。

ＵＳＡ　）を用いて窒素ガスにより４　ｋｇ／ｃｍ　の
圧力をかけ濾過した。ｐ過膜上部に残った２−の濃縮液
を採取した。

Ｂ細胞培養上清濃縮液１ｄをＡＯＡ−３４カラム（ＬＫ
Ｂ　Ｐｒｏｄｕｋｅｒ　＋スウェーデン）によりゲル洲
過した。なお、ＡＯＡ−３４カラムはあらかじめＰＢＳ
で平ｉ吃、溶出はＰＢＳで行なった・溶出液を１ｄずつ
分取し、ＢＣＤＦ活性を測定した。分子量１５．０００
から３０，０００に対応するフラクションにＢＯＤＦ活
性が検出された。

次に、上述のＢ細胞培養上清濃縮液１ｄを２５ｍＭヒペ
ラジンー塩酸緩衝液（田７．０）に透析した。

この透析内液をあらかじめ２０ｍＭビス・トリス−プロ
パン−塩酸緩衝液（Ｆ４４７．０　’）で平衝化したＭ
ｏｎｏＰカラム（ファルマクアファインケミカルス。

スウェーデン）に通した。このカラムを１０ｄの２０ｍ
Ｍビス・トリス−プロパン−塩酸緩衝液（Ｆ！（７，０
）　テ洗ツタ後、塩酸ｆＦｔ１４．５［調節しり４゜ｍ
ｌのｉ希釈ポリバッファー７４（ファルマシアファイン
ケミカルス、スウェーデン）で溶出した♂カラム操作は
ファースト・プロティン・リキッ叶゛・クロマトグラフ
ィー、　ＦＰＬＯ（ファルマシアファインケミカルス、
スウェーデン）を用い１流速は毎分０．５ｄで行なった
。溶出液を１−ずつ分取し、ＥＯＤＦ活性とＰＨを測定
した。ＥＯＤＦ活性は田５〜５．５の位置に溶出された
。

以上の結果より、正常ヒトＢ細胞の生産するＢ−ＢＯＤ
Ｆは０１８８　Ｌ８の生産するＢ　−ＢＯＤＦと分子量
および等電点いずれも一致している。

実施例３　Ｂ−ＢＯＤＦによるヒ）Ｂ細胞の抗体産生細
胞への分化誘導 ヒトより血液を採取し、これより実施例２に示した方法
でＢ細胞を分離した。このＢ細胞を４０％パーコール（
ファルマクア）ヲ含むＰＢ８に懸濁した。２０ＴｒＬｌ
容ガラスチユーブ中にパーコール７０％ＰＥＳ溶液２−
、パーコール６０％ＰＥＳ溶液２ｍｌ。

パーコール５５％ＰＥＳ溶液２ｍ、パーコール５０％Ｐ
ＢＳ溶液２Ｎおよびパーコール４５％ＰＥＳ溶液２ＴＬ
ｌを順次重層したものの上に、前述のＢ細胞懸濁液な静
かに電層し、４℃、４００Ｇ、１５分遠心した。パーコ
ールＰＢＳ溶液５０％−５５％に存在する細胞層を分取
し、ブラスト化した低比ＩＢ細胞を集めた。

低比重Ｂ細胞を１−あたり２×ｌＯ５細胞に９６穴プラ
スチツクマイクロプレート中の２００μｌ（１’）ＲＰ
Ｍ１１６４０培地に懸濁した。培地には１単位／ｄのＢ
　−ＢＯＤＦを含むｏｍｓｓ培養上清、１０％ＦＯ８゜
０．００２５％Ｓ　Ａ　Ｃｔ　Ｉ　Ｊあたり１００単位
のペニシリン。

１ｒｎｌあたり１００μ？のストレプトマイシン、ｘｍ
ｉｈた９１０μｍのゲンタマイ７ｙ、１６ｍＭのＮａＨ
ＣＯ３ｆ−延秀牛≠を含有させた。

培養物を空気中５％炭酸ガス含有の湿度調節環境下３７
℃に保ち、５日後Ｂ細胞を集めた。この細胞の抗体産生
能力をＢＯＤＦ活性検定の項に記述した通り検定した。

表３に示すように、Ｅ−ＢＯＤＦの添加量に対応した抗
体産生Ｂ細胞によるプラークを検出した０ 表　３ 応答Ｂ細胞　ＳＡＣ０Ｅ８８＝＝＝８培養上清ＩｇＧ　
ＰＦＣＩ／１０細胞またはτ：Ｆ −〇ＥＳＳ幡培養上滝１０％）　５７．４±　４．５−
〃（５％）４０゜■±１４．５ −　／ｐ、ＨＦ　（ＩＵ昨ｌ）　３３１．６±５５．２
−　ｊ’Ｌ”＋Ｆ　（０，２５Ｕ／ｌｄ）　２８９．３
　±４５．４−　培　地　１９．４±　１．３ 低比取り細胞□ −ｉ−ａＥｓｓｙ４培養土清旬％）　４３９．４±７０
．２十　〃　（５％）　１６４．６±１１゜５＋　：Ｔ
：Ｆ　（１１）；Ｊリ　５１８．６±１９．２＋　、！
ｒｌＦ　（０，２５Ｕ〜）３０８．０±７４．４＋　培
　地　６７．０±　４．７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトＢ細胞の産生ずるリンホカインであって、３０
   分処理で９０％以上のヒ）Ｂ細胞分化因子活性が残存し
   、トリプシン処理でヒ）ＢＩＩＩｌ胞分化因子分化因子
   活性る諸性質を有する新規ヒ）Ｂ細胞分化因子。 ２、ヒ）Ｂ細胞由来細胞を培地に培養し、ヒ）Ｂ細胞の
   産生ずるリンホカインであって、分子量分処理で９０％
   以上のヒ）１３細胞分化因子活性が残存し、トリプシン
   処理でヒ）１３細胞分化因子活性が低下する諸性質を有
   する新規ヒ）Ｂ細胞分化因子を産生せしめ、これを回収
   することを特徴とするヒ）１３細胞分化因子の製造法。 ３、ヒ）Ｅ細胞の産生ずるリンホカインであって、３０
   分処理で９０％以上のヒ）Ｅ細胞分、化因子活性が残存
   し、トリプシン処理でヒ）Ｂ細胞分化因子活性が低下す
   る諸性質を有する新規ヒ）Ｅ細胞分化因子を用いてヒ）
   Ｂ細胞由来細胞を抗体産生細胞へ分化させ、ヒ）Ｂ細胞
   由来細胞より抗体を産生させる方法。