JPH02295482A - Ｉ血清型緑膿菌に反応性を有するヒトモノクローナル抗体、その産生細胞、製造方法及び製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産　土の利 本発明は、■血清型の緑膿菌（シュードモナス・エルギ
ノーサ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓ
ａ）に対するヒトモノクローナル抗体を大量、かつ安定
に供給することを可能とするヒ１一一ヒト・ハイブリド
ーマ細胞株と、その産生ずるヒトモノクローナル抗体お
よびそれを有効成分とする緑膿菌感染症の予防、治療用
の製剤に関するものである。

史胆Δ失権 緑膿菌感染症は、各種基礎疾患を有する患者や免疫抑制
作用を有する薬剤の投与を受けている患者に多く発生す
る日和見感染症である。現在，緑ＩｌｌｉＩ菌感染症は
最も治療の困難な感染症と考えられている。すなわち、
緑膿菌はこれまで常用されてきた抗生物質のほとんどす
べてに対して耐性を示すばかりでなく、近年開発された
抗生物質に対しても容易に耐性が誘導される傾向が強い
。そのため、宿主側の緑膿菌処理能力の増強をめざした
予防、治療法の研究がなされている。

近年、緑膿菌感染症の治療に健常人の血清あるいは血漿
から精製したヒト免疫グロブリンあるいはその化学的修
飾物を有効成分とするグロプリン製剤を用いることが多
い。しかし、これらの製剤に含まれる抗体のうち緑膿菌
に対し親和性を有し，かつ、治療に有効な抗体の量は一
定せず，また，その含量が少ないため、これらの製剤の
予防、治療効果を疑問視する向きも多い。そのため、低
用量で有効なヒトモノクローナル抗体の開発が急がれて
いる。

緑膿菌は外膜上に存在するリポ多糖体 （ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、以下ＬＰＳ
と略す）分子上の〇一多糖側鎖を認識する免疫抗体、す
なわち緑膿菌の血清型特異○抗原に対する抗体を用いて
血清型別分類がなされている。緑膿菌の血清型別分類に
関しては現在でも多くの議論があるが、日本ではＡ型か
らＭ型までの１３種の血清型に分類する緑膿菌研究会分
類（Ｈｏｍｍａ，　Ｊａｐａｎ　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅ
ｄ．，３２９−３３６（１９７６））が広く用いられて
いる。臨床現場で緑膿菌感染患者より分離される緑膿菌
の血清型の割合はほぼ一定しており，１３種の血清型の
うちＡ．Ｂ．Ｅ．Ｇ．Ｉ型の５踵の血清型の菌が占める
率が高いことが知られている。

一方、緑膿菌に対するマウスモノクローナル抗体は、ケ
ーラーとミルスタインにより開発されたマウスーマウス
・ハイブリドーマ技術（Ｋｉ５ｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅ
ｉｎ，　Ｎａｔｕｒｅ，　２５６，　４９５−４９７（
１９７５））を用いて作農されて以来〔例えば、Ｈａｎ
ｃｏｃｋら、Ｉｎｆｅｃｔ　，Ｉ＋＋＋ｍｕｎ．，　３
７，　１６６−１７１（１９８２））、型別診断への応
用［例えば、明冶製菓、ＥＰ　１０１０３９］や、感染
防御に有用なモノクローナル抗体の検索のための基礎研
究などに用いられてきた。

サドッフらは、緑膿菌の血清型特異ＬＰＳ分子上の〇一
多糖側鎖に対するマウスモノクローナル抗体が，マウス
の感染実験において、対応する血清型の菌による致死感
染に対して高い防御活性を有することを報告したＣＳａ
ｄｏｆｆら、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆｔｈｅ　１９ｇ
２　１ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ
　ｏｎＡｎｔｉｎ＋ｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　
ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，　Ｎ［ｌ２５３（
１９８２）　）。その後の報告にも，緑膿菌の血清型特
異Ｏ抗原に対するマウスあるいはヒ１−モノクローナル
抗体のインビボおよびインビトロの試験系での有効性が
示されている〔例えば．　Ｓａｖａｄａら、Ｊ．■ｎｆ
ｅｃｔ．　Ｄｉｓ．，　１５０，　５７０−５７６（［
８４）、中村善明ら，口本細菌学雑誌、３９，　３３７
　（１９８４）、ＰｅｎｎｉｎＨｔｏｎ　，Ｉｎｆｅｃ
ｔ．　Ｉｍｍｕｎ．，　５４，　２３９−２４４（１９
８６）、Ｓｕｚｕｋｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．３１，９５９−９６６（１９８７）、Ｚｗｅ
ｒｒｎｉｋ　　ら、　Ｉｎｆｅｃｔ．　　Ｉｍｍｕｎｉ
ｔｙ，　　５６．　　１８７３−１８７９（１９８８）
　）。また、血清型特異的ヒトモノクローナル抗体の緑
膿菌感染症の予防、治療への利用については、本発明者
らによる血清型特異ＬＰＳ分子上の〇一多糖側鎖を単独
に認識する抗体が特許出願明細書〔特開昭６０　−　２
４８６２６号〕に、および複数の〇一多糖側鎖を共通に
認識する抗体が特許出願明細書［国際公開番号υ０８８
／０４６６９］に、その他、幾つかの特許出願明細書〔
ジェネティック　システムズ　コーポレーション、ＥＰ
　１６３４９３とＢＥ　９０５８９０．帝人株式会社、
Ｗ０８６／０３７５４、湧永製薬株式会社，特開昭６１
　−　０９１１３４号、メルク　エンド　カムパニイン
コーボレーテッド、ＨＰ　２５６７１３）に記載されて
いる。

発明が解決しようとする　　占 ヒトモノクローナル抗体の作製は、一般的にはヒトのＢ
細胞にエブスタイン・バー・ウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ
−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ、以下ＥＢウィルスと略す）を
感染させてＥＢウィルス形質転換細胞とするか、Ｂ細胞
などのヒト抗体産生細胞と無限増殖能を有する親細胞株
を細胞融合してヒトーマウス・ヘテロハイブリドーマあ
るいはヒト−ヒト・ハイブリドーマとすることにより行
われる． ＥＢウィルス形質転換法により作製したＥＢウィルス形
質転換細胞は一般に抗体産生量が低く、継代安定性に劣
り、また、比較的栄養要求性が高いため、無血清培地を
用いた大量培養生産には適さない。マウスミエローマを
親細胞株に用いてヒト抗体産生細胞と融合した場合、作
製されたヒトーマウス・ヘテロハイブリドーマはヒト抗
体と共にマウスの蛋白質を合成，分泌するため、ヒトへ
投与するヒトモノクローナル抗体の生産株として用いる
には必ずしも適当でない．また，ヒト染色体のみを有し
、かつ無限増殖能を有する細胞を親細胞株に用いて、ヒ
ト抗体産生細胞と融合してヒト−ヒト・ハイブリドーマ
を作裏する場合も幾つかの間麗点がある．例えば、ヒト
ミエローマに由来する親細胞株とヒト抗体産生細胞の融
合効率は低い．また、ＥＢウイル形質転換細胞に由来す
る親細胞株とヒト抗体産生細胞の融合効率は比較的高い
が、作製されたヒト−ヒト・ハイブリドーマは抗原特異
性が不明な抗体を同時に産生したり，その抗体産生量が
低いものが多い。ヒトミエローマとＥＢウィルス形質転
換細胞のハイブリドーマに由来する親細胞株とヒト抗体
産生細胞の融合により作製されたヒト−ヒト・ハイブリ
ドーマは比較的高い抗体産生量を示すが、抗原特異性が
不明な抗体を同時に産生ずる性質は解消されていない。

間　を　決するための手 本発明者らは，■血清型緑膿菌に反応性のヒトモノクロ
ーナル抗体を産生ずるヒト−ヒト・ハイブリドーマが作
製出来ること、また，該ヒト−ヒト・ハイブリドーマが
各種培地中で安定に増殖し，比較的大量の抗体産生を長
期継続すること、更には、該ヒトーヒト・パイプリドー
マを培養し，その培養物より工血清型緑膿菌に反応性の
ヒトモノクローナル抗体が調製出来ることを見いだした
。

本発明者らは、これらの結果に基づき、該ヒト−ヒト・
ハイブリドーマの産生ずる抗体の緑膿菌感染に対する防
御活性を試験し、本発明を完成するに至った． 本発明でいうヒト−ヒト・ハイブリドーマとは、ヒト染
色体のみを有し、かつ無限増殖能を有する親細胞株とヒ
ト抗体産生細胞との融合により作製されるヒト染色体の
みを有するハイブリドーマをいう． 本発明でいう選択特性とは，作製したハイブリドーマを
未融合の細胞より選別することを可能とする親細胞株の
化学的あるいは物理的な特性をいう．例えば、選択特性
として８−アザグアニンあるいは６−チオグアニン、お
よびウアバイン耐性の親細胞株を使用した場合、ヒト抗
体産生ＥＢウィルス形質転換細胞とのハイブリドーマの
みがヒポキサンチン、アザセリン、およびウアバインを
含む培養液中で生き残る． 上記選択特性を有する親細胞株は適宜選択される。また
、緑膿菌に反応性のヒト抗体産生細胞はヒドＢ細胞およ
びその由来細胞より適宜選択される。

以下、ヒト染色体のみを有し、かつ無限増殖能と８−ア
ザグアニンおよびウアバイン耐性を有する細胞株を親細
胞株として、■血清型緑膿菌に反応性を有するヒト抗体
産生ＥＢウィルス形質転換細胞をヒト抗体産生細胞とし
て用いてヒト−ヒト・ハイブリドーマを作製する場合を
例にあげ、本発明を説明する。

（具体的説明） ■．使用緑膿菌 本発明では便宜上，使用緑膿菌の分類を緑膿菌研究会主
催の血清型別検討委員会の決定による血清型別分類に従
うものとし、Ａ型からＭ型に属する菌株を使用している
。

Ａ型からＭ型に属する菌株は，アメリカン・タイプ力ル
チャーコレクション（ＡＴＣＣ）、財団法人発醪研究所
（ＩＦＯ）および東京大学医科学研究所から入手できる
。

２．　ヒト−ヒト・ハイブリドーマの作製本発明による
、工血清型緑膿菌に反応性を有するヒＩ〜モノクローナ
ル抗体を産生ずるヒト−ヒト・ハイブリドーマは、ハイ
ブリドーマ作製用のｌＡａ胞株ＭＰ　４１０９あるいは
その継代株とヒト抗体産生細胞＆公知の方法〔成書ｒＭ
ＯＮＯｃＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＪｐ３６３
，　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒａｓｓ刊（１９８０）他〕に準
じて細胞融合して作製出来る。ヒト抗体産生細胞には、
緑膿菌に対する抗体産生がみられる健常人あるいは緑膿
菌感染症既往歴のある患者の末梢血、リンパ節、扁桃腺
，牌臓や分娩時の請帯血などから公知の方法により得ら
れるＢ綱胞を用いることが出来るが、Ｂ細胞にＥＢウィ
ルスを感染させて形質転換を行い一定期間培養後、培養
上清中に緑膿菌に反応性を有する抗体の分泌が検出され
たＥＢウィルス形質転換細胞コロニー、あるいはこれら
ＥＢウィルス形質転換細胞コロニーより単一に選別され
た細胞株を用いることが好適である。

次に各工程につき詳細な説明を加える。

血液や上記組織などからのＢＩ［胞の分離および濃縮は
，フイコール・コンレイ液等の細胞分画液を用いた比重
遠心法、Ｅロゼット形成法、バニング法などを組み合わ
せて効率的に行うことが出来る。さらには、Ｂ細胞をポ
ークウィードマイトージェン（ＰＷＭ）を添加した培養
液中で数日間培養し，ＢＪＩＩＩ胞を増殖させた後に細
胞融合に供することも出来る． ＥＢウィルスによるＢ細胞の形質転換法は公知の方法〔
例えば、Ｓｔｅｉｎｉｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ，　２６９
，　４２０−４２２（１９７７））に準じて実施するこ
とが出来る。Ｂ９５−８細胞（感染性のＥＢウィルスを
産生ずるマーモセット白血球由来細胞）を２０％ウシ胎
児血清（以下ＦＣＳと略す）を含むＲＰＭＩ　１６４０
培地（以下培養液と略すことがある）で培養し、遠心分
離にて得られた静止期に近い７日目の培養上清をウィル
ス液とする〔小野ら、第４回日本免疫学会総会記録、３
９９−４０１（１９７４）　）．　Ｂ細胞を遠心分離し
．吸引にて上清を除去して得られるペレットにウィルス
液を加えて分散後、３７℃、５％炭酸ガス存在下で３０
分から１時間インキユベーションする。培養後、遠心分
離し，吸引にて上清を除去した後，ペレットに細胞密度
がｌ　Ｘ　１０’個／ｍｌから５　Ｘ　１０５個／ｍｌ
となる様に培養液を加え、細胞を分散させる．細胞分散
液を２４ウエル培養プレートまたは９６ウエル培養プレ
ートの各ウエルに分注し、３７℃、５％炭酸ガス存在下
で２週間から４週間培養する．この間、３日から４日ご
とに培養液の半量を新しい培養液に交換することが望ま
しい． 緑膿菌に反応性を有する抗体の検出は、一般のラジオイ
ムノアッセイ法や，酵素抗体法（以下ＥＬＩＳＡ法と略
す）などの方法〔成書「単クローン抗体Ｊ　ｐｌ４４、
講談社刊（１９８３）等〕により行うことが出来る。本
発明ではＥＬＩＳＡ法を用いている．すなわち、あらか
じめ緑膿菌の０．３％ホルマリン処理菌体をメンプラン
フィルターに固定し，容器中で細胞の培養上清と一定時
間反応させた後、酵素標識したウサギ抗ヒト抗体を反応
させ、酵素反応による基質の呈色割合により目的抗体の
産生の有無および産生量を測定するドット・イムノバイ
ンディングアッセイ法（以下ＤＩＢＡ法と略す）（Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１１９，　１４２−１４７
（１９８２））を簡易アッセイ法として用いている． ＥＢウィルス形質転換細胞の増殖コロニーが認められた
各ウエルの培養上清について上記ＥＬＩＳＡ法により、
目的抗体が存在するウエルを選別した後、このウエル中
の細胞を軟寒天法〔成書「組織培養応用研究法Ｊ　ｐＺ
８９、ソフトサイエンス社刊（１９８５）等〕あるいは
限界希釈法〔成書『単クローン抗体』ｐ７３．講談社刊
（１９８３）等〕によりクローニングを行う。さらに、
クローニングにより細胞の増殖が認められた後、再度Ｅ
ＬＩＳＡ法によるアッセイを行う。１回から数回のクロ
ーニングにより、目的の抗体のみを分泌する単一細胞株
を得ることが出来る。

ＨＰ　４１０９とヒト抗体産生細胞との融合は，ポリエ
チレングリコール（以下、ＰＥＧと略す）などの一般的
な融合試薬や、センダイウィルス （Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ　ｖｉｒｕｓ　ｏ
ｆ　Ｊａｐａｎ　；　ＨＶＪ）などのウィルス粒子を使
用して行える．例えば、平均分子ｊｉｉｌｏｏｏから６
０００程度のＰＥＧを．　ＲＰＭＩ　１６４０培地やダ
ルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に３０％か
ら５０％（Ｗ／Ｖ）の濃度に添加したものが融合液とし
て推奨される。また、融合効率を高めるため，ジメチル
スルホオキサイド（ＤＭＳＯ）を添加することも望まし
い．また、電気融合装置などを用いた物理的手法によっ
ても行える。

例えば、ＭＰ　４１０９とＥＢウィルスによる形質転換
後目的抗体の産生が認められたウエルの細胞や、末梢血
等から分離される抗体産生細胞を１：ｌから１：１０程
度の比率で混合し、細胞融合用培地（５０％ＰＥＧと１
０％ＤＮＳＯを含むＲＰ［　１６４０培地等）を加えて
、細胞を融合させる。つぎに，融合したハイブリドーマ
のみの増殖に適した培養液（以下、選択培地と略す）に
、細胞密度がＩ　Ｘ　１０’個ｌ耐から５Ｘ１０″個／
ｍｌとなる様に細胞を分散させる．細胞分散液を２４ウ
エルまたは９６ウエルの培養プレートに分注し，３７℃
，５％炭酸ガス存在下で２週間から４週間培養する．こ
の間、３日から５日ごとに選択培地の半量を新しい選択
培地と交換することが望ましい。この際、フィーダー細
胞としてマウスの腹腔浸出細胞等を共存させるとハイブ
リドーマの増殖を早めることが出来る．ヒト抗体産生細
胞が無限増殖能を有さない細胞（Ｂ細胞）の場合、選択
培地としてヒポキサンチン，アミノプテリン、チミジン
を含む培地（以下．　ＨＡＴ培地と略す）あるいはヒボ
キサンチン，アザセリンを含む培地（以下，＋１Ａ培地
と略す）が使用できる．また、ヒト抗体産生，細胞がＥ
Ｂウィルス形質転換細胞などの無限増殖能を有する細胞
の場合、選択培地としてＨＡＴ培地にウアバインを添加
した培地（ＨＡＴ−０培地）または＋１Ａ培地にウアバ
インを添加した培地（ＨＡ−０培地）が使用できる。ハ
イブリドーマの増殖コロニーが認められた各ウエルの培
養上清について上記ＥＬＩＳＡ法により、目的抗体が存
在するウエルを選別した後，限界希釈法によりクローニ
ングを行う．さらに、クローニングにより細胞の増殖が
認められた後、再度ＥＬＩＳＡ法によるアッセイを行う
。１回から数回のクローニングにより，目的の抗体のみ
を分泌する単一細胞株を得ることが出来る。

本発明のヒト−ヒト・ハイブリドーマの培養は，通常の
培地を用いて行える．例えば＋　　５Ｘ１０’個／耐か
ら２Ｘ１０’個／ｍｌの細胞密度となるように培養液に
分散し，適当な細胞培養容器に播種した後、３７℃．５
％炭酸ガス存在下で培養できる．培養液の例としては、
ＲＰＭＩ　１６４０やＤＭＥＭ等の基礎培地に、ＦＣＳ
の適量を添加したものが好適である．また，各種の低血
清あるいは無血清培地も適宜使用できる．例えば、ＮＹ
ＳＦ　４０４無血清培地単独、あるいはＮＹＳＦ　４０
４無血清培地にウシ血清アルブミンの適量を添加したも
のが推奨される．継代培養は、３日から７日間隔で細胞
の回収と播種の操作を繰り返すとよい． 本発明のとトーヒト・ハイブリドーマの凍結保存はー・
般的手法により行える。例えば、細胞を適当な細胞凍結
保存液にＩ　Ｘ　１０’個／ｍｌから５　ｘ　１０’個
／ｍｌの細胞密度となるように分散し、液体窒素あるい
は液体窒素ガス中、または、−２０℃から−８０℃の冷
凍庫中で凍結保存出来る．細胞凍結保存液には、上記基
礎培地や中性緩衝液等に動物血清、アルブミン，メチル
セルロース．ぶどう糖やジメチルスルホオキサイドなど
を適宜添加して用いることが推奨される． 凍結細胞の復元は一般的手法により行える．例えば、凍
結された細胞を含む保存液を温水中で急速に融解し、細
胞を培養液等で洗浄して保存液に含まれるＤＭＳＯを洗
い出した後に培養液に分散して培養を行うと良い。

培養上清中の免疫グロブリン量の測定は、一般のＥＬＩ
ＳＡ法により行うことができる．例えば，ＥＬＩＳＡ法
による場合は、固相に抗ヒト免疫グロブリン抗体を固定
し（この時使用される抗体を以下、固相化抗体と略す）
，培養上清の一部を反応させる。次に、酵素標識抗ヒト
免疫グロブリン抗体を反応させ、基質を加え，酵素反応
により生じる呈色割合より培養上清中の免疫グロブリン
量の測定が行える．　ヒトＩｇＭ量の潤定は，同相化抗
体として抗ヒトＩｇＭ　（ミュー鎖特異）抗体を、酵素
標識抗体としてバーオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ　（
ミュー鎖特異）抗体を使用することにより行える．３．
　ヒトモノクローナル抗体の製造 本発明のヒト−ヒト・ハイブリドーマは、重鎮としては
抗体産生細胞株由来のもののみを合成，分泌し、通常の
動物細胞培養用の培地中で長期間安定に継代、増殖が可
能である．また、培養物より抗体を精製する際に培地由
来の未知の不純物の混入の恐れのない無血清培地中でも
抗体を産生ずる能力を有しており、緑膿菌感染症の予防
、治療用製剤の組成物調裏の為の原料となるヒトモノク
ローナル抗体を得るのに最適である． 本発明のヒト−ヒト・ハイブリドーマを無血清培地中で
培養し、培養液より任意の一般的な方法，例えば、ゲル
ろ過法，イオン交換クロマトグラフィー法、ハイドロキ
シアパタイトなどを用いる吸着クロマトグラフィー法な
どの物理化学的精製法や、抗原あるいはヒトモノクロー
ナル抗体に親和性を有する物質（例えばプロテインＡや
抗ヒト免疫グロブリン抗体等）を固定化した担体を用い
るアフィニテイクロマトグラフイー法や、電気泳動法、
硫酸アンモニウム塩析などの沈澱法等を組み合わせるこ
とにより、■血清型緑膿菌に反応性を有する単一なヒト
モノクローナル抗体を比較的容易に高度に精製出来る。

４．　ヒトモノクローナル抗体製剤の製造本発明の工血
清型緑膿菌に反応性を有するヒトモノクローナル抗体は
，対応する血清型緑膿菌感染に対して高い防御活性を有
している．本発明のヒトモノクローナル抗体は、単独、
あるいは通常用いられる添加剤，賦形剤等を加えて液剤
あるいは凍結乾燥製剤として緑膿菌感染症の予防、治療
に供することが出来る。添加剤，賦形剤には一般に生物
製剤に用いられる天然物、化合物より適宜選択されるが
，抗体の安定性の保持にはアルブミン等の動物性蛋白質
や、デキストラン等の多糖類、アミノ酸，糖類の使用が
良好な結果を与える。また，本発明のヒトモノクローナ
ル抗体は緑膿菌や緑膿菌以外の微生物に反応性を有する
他のモノクローナル抗体やポリクローナル抗体と混合し
た製剤の作製に用いることも出来る。

５．　ヒトモノクローナル抗体による感染症の予防、治
療 実際の緑膿菌感染症の予防、治療にあたっては本発明の
ヒトモノクローナル抗体あるいはそれを含む製剤を単独
または２種以上混合するか、あるいは緑膿菌に反応性を
有する他のモノクローナル抗体あるいはそれを含む製剤
やグロプリン製剤と混合して用いてもよい。

本発明のＩ血清型緑膿菌に反応性を有するヒトモノクロ
ーナル抗体あるいはそれを含む襲剤は、緑膿菌感染症の
予防，治療のために直接ヒトに投与可能である。用量，
投与経路は適宜選択されるが、用量は体重（ｋｇ）あた
り０．０１ないしｌＯｍｇが好ましく，投与経路は皮内
，皮下，筋肉内、靜脈内投与等を適宜選択出来る。

従って、本発明により、緑膿菌感染症の予防、治療、診
断などの広い分野に使用出来るヒトモノクローナル抗体
の工業的生産用の細胞株を提供することが可能となる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではなｔ）。

尚，ハイブリドーマ作製用の親細胞株ＭＰ　４１０９は
微工研に昭和６３年ｌＯ月２７日から寄託番号微工研条
寄第２１２９号として寄託されている。■およびＤ血清
型緑膿菌に交差反応性のヒトモノクローナルＩｇκ産生
ＩＥＢウィルス形質転換細胞株ＭＰ　５０３５は微工研
に昭和６３年１２月９日から寄託番号微工研条寄第１５
９８号として寄託されている。緑膿菌研究会分類標；９
血清型緑膿菌として，■血清型緑膿菌にはＡＴＣＣ　２
７５８６（ＩＩＤ　１０１０）、Ｄ血清型緑膿菌にはＡ
ＴＣＣ２７５８０（ＩＩＤ　１００４）を用いた。

実施例ｌ．抗緑膿菌抗体産生ハイブリドーマの作製 （１）細胞融合 ＭＰ　４１０６とＭＰ　５０３５をｌＯ％ＦＣＳを含む
ＲＰＭＩ　１６４０培地（以下，ＩＯ％ＦＣＳ培養液と
略すことがある）中で増殖させ，各々集めてＲＰＭＩ　
１６４０培地で洗浄した．各々４．５　Ｘ　１０７個の
細胞を５０ｍｌ容量のプラスチック製遠心管中で混合し
た。遠心分離（１７５Ｘｇ．　１０分間）後、上清を吸
引除去し、細胞ペレットに直接、０．５ＩＩｌの５０％
ＰＥＧ　（Ｍ．リ，　１　５００、和光純薬）および１
０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ　１６４０培地を静かに加
えゆっくり回転させ，細胞を融合させた。２分後．　１
０ｍｌのＲＰＭＩ　１６４０培地を加え静かに攪拌後、
遠心分離（１７５　Ｘ　ｇ．　１０分間）した。上清を
吸引除去し，細胞ペレットに２０％ＦＣＳ．　２Ｘ１０
−″４Ｍヒポキサンチン（シグマ）、１μｇ／ｍｌアザ
セリン（シグマ）．　５Ｘ１０−’１４ウアバイン（シ
グマ）を含むＲＰＭＩ　１６４０培地（以下、ＨＡ−０
培地と略すことがある）を加えて、ｌ　Ｘ　１０’個／
ｍｌの密度となるように懸濁後、９６ウエル平底培養プ
レートのウエル当たり０．１ｍｌずつを播種（合計８６
４ウエル）した。細胞は５％炭酸ガス存在下、３７℃で
静置培養した。４日後に０．１ｍｌのＨ　Ａ　−　０培
地を加え、その後、３日から５日毎に半量のＨＡ−０培
地を新しいＨＡ−０培地と交換した。４週間から５週間
後に、合計２６ウエルに細胞増殖が認められた。

（２）抗緑膿菌抗体の検出 培養上清中の抗Ｉ血清型緑膿菌ヒト抗体の有無はＤＩＢ
Ａ法で調べた。各ウエルの培養上清０，ｌｍｌを１ドッ
ト当たり０．４μｇの■血清型緑膿菌ＡＴＣＣ２７５８
６のホルマリン処理乾燥菌体を固定したグリッド入りニ
トロセルロース・メンブレンフィルター（３．１ｍ＋ｍ
角）と，９６ウエルＵ底マイクロプレート中で反応させ
た。室温で２時間反応させ、ついでパーオキシダーゼ標
識ウサギ抗ヒト・イムノグ口プリン抗体（ダコ社）と２
時ＩＩＳ反応後、４−クロロ−■−ナフトールを基質と
して発色させ、抗原を固定したニトロセルロース・メン
ブレンフィルター上に肉眼１！ｆｔ察で発色が認められ
たものを抗体産生が陽性と判定した。

（３）クローニング ■胞増殖が認められた２６ウエルの培養上清のうちＩ４
ウエルの培養上清中に抗Ｉ血清型緑膿菌抗体産生が認め
られた。ｌ４ウエルの細胞をそれぞれ個別に集め、血球
計算盤を用いて正確に細胞数を計測した。細胞をＨ　Ａ
　−　０培地に分散し、　２０個／ｍｌの廁胞密度の細
胞浮遊液とした。あらかじめ、ウェル当たりＩＸＩＯ’
個のマウスＢ′４．臓細胞を播種した９６ウエル平底培
養プレー１−　（以下、フィーダープレー１・と称する
）の各ウエルの上清を除去後、細胞浮遊液を各ウエル当
たり０．ｌｍｌずつ播種し，５％炭酸ガス存在下，３７
℃で静置培養した。各細胞当たり１枚のフィーダープレ
ートを使用した。４日後に０．　１ｍｌのＨＡ−０培地
を加え、その後、３日から５日毎に半量のｌ｛Ａ−０培
地を新しいＨＡ−０培地と交換した６２週間から４週間
後，増殖の認められたウエルについて培養上清中の抗丁
血清型緑膿菌ヒト抗体の有無をＤＩＢＡ法で調べた。■
血清型緑膿菌と反応する抗体産生が陽性と判定されたウ
ェルの細胞を上記のごとく再度クローニングした。２回
のクローニングにより緑膿菌研究会分類の血清型の工お
よびＤ血清型緑膿菌に交差反応するヒトモノクローナル
抗体を産生ずるハイブリドーマＭＰ　５１５６、ＭＰ　
５１６３の２株が得られた。

９６ウエル平底培養プレート中で十分に増殖したハイブ
リドーマを徐々に拡大培養した。細胞は７５％ＦＣＳ．
　１０％ＤＭＳＯ、１５％ＲＰＭＩ　１６４０培地より
なる細胞保存液にｌ　Ｘ　１０’個／ｍｌ密度となるよ
うに忽濁後、２ｍｌの凍結チューブに分注した。−２０
℃まで１分間当たり１℃の速度で冷却後，液体窒素中で
凍結保存した。

（４）抗体産生量の測定 ハイブリドーマが細胞外へ分泌する１ｇＭＢの測定は以
下の様に行った。対数増殖期の細胞を集め、１０％ＦＣ
Ｓ培養液にＩ　Ｘ　１０’個／ｍｌ密度となるように懸
濁し，６ウエル培養プレートの各ウエルに１耐ずつ播種
し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で静置培養した．２４
時間後、遠心分Ｍ（２５０Ｘｇ．　１０分間）により培
養上清を分離し、上清中のヒトＩｇＭ量をＩＥＬＩＳＡ
法にて定量した。ハイブリドーマＭＰ　５１５６、朴５
１６３は、ｉｏ’個の細胞が２４時間に，それぞれ１５
μｇ、ＩＯμｇのヒトＩｇＭを培養上浦中に分泌した．
（５）細胞株の継代安定性の測定 細胞株の継代安定性を細胞増殖性能と抗体産生能より調
べた。

増殖の安定性は培養開始時と継代培養開始３カ月後の細
胞について増殖曲線を測定することにより調べた。抗体
産生の安定性は培養開始時、培養開始１カ月、２カ月、
３カ月の細胞のＩｇＭ抗体産生量を（４）と同様にして
ＥＬＩＳＡ法にて謂定す゜ることにより調べた． 継代培養は、以下のように行った。細胞を２系列独立し
て、１０％ＦＣＳ培養液にｓｘｔｏ’個／Ｉ１１密度と
なるように懸濁後、底面積２５ａｊのフラスコに４ｍｌ
ずつ播種し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で静置培養し
た。３日から４日毎に細胞を集め、新鮮なＩＯ％ＦＣＳ
培養液に同密度となるように再度懸濁後、静置培養する
操作を３カ月間連続的に行った．増殖曲線の測定は、以
下のように行った．２系列独立して培養した対数増殖期
の細胞を集め、１０％ＦＣＳ培養液に５ＸＩＯ’個／ｍ
ｌ密度となるように懸濁後、６ウエル培養プレートの各
ウエルにｌｍｌずつ計６ウエルに播種し、５％炭酸ガス
存在下、３７℃で静置培養した。１日毎に、１ウエル中
の培養物を集め，生細胞および死細胞密度を計測し、更
に、培養上清についてはＩｇＭ量をＥＬＩＳＡ法にて測
定した．ＭＰ　５１５６は培養開始時および培養開始３
カ月の細胞ともほぼ同様な増殖曲線を示した．増殖曲線
より計算される倍加時間は２３．６時間であった．また
，１０１個の細胞が２４時間に分泌するＩｇＭは、培養
開始時には１５μｇ、培養開始１カ月後には１１μｇ，
２カ月後には１２μｇ、３カ月後には１０μｇで、３カ
月間の継代培養中に抗体産生には大きな変化はなかった
。

ＭＰ　５１５６は微工研に条寄第２３３９号として寄託
した。

実施例２．細胞の培養および抗体の精製ＭＰ　５１５６
の凍結保存細胞を復元し、１０％ＦＣＳ培養液を用いて
拡大培養し、ＮＹＳＦ　４０４無血清培地〔矢部則次、
組織培養、１１．　４５８（１９８５））で更に拡大培
養の後，Ｍｉ胞を集め、５ＸｌＯ’個／Ｉ１１の密度と
なるように５００ｍｌのＮＹＳＦ　４０４無血清培地に
｝）濁し、ｌＯ枚のフラスコ（底面積１７５ｃｊ）に播
種した。５日間、５％炭准ガス存在下，３７゜Ｃで静１
ｎ培養した。培養物より遠心分は（４００　ｘ　ｇ、２
０分間）により４８０ｍｌの上清を得、ボアサイズ０．
２２ミクロンのメンプランフィルターで濾過した。

濾液に４８０ｍｌの飽和硫酸アンモニウム溶液を加え，
４℃に放置した。翌日，これを遠心分濯し（１０，００
０ｘｇ、３０分間）、沈澱を朶めた。５ｍｌのｐｎｓ（
−）で沈澱を溶解し．　ＰＢＳ（−）に対して十分に透
析を行い、粗■１両分を得た。

精嬰には、高速液体クロマトグラフィー用のハイドロキ
シアパタイト充填力ラムを用い、　１　ｍｌ／分の流速
で分画した。ＨＣＡ一カラム（ガード力ラム：４　Ｉｌ
ｍ　Ｘ　１０＋ａｍ，本体力ラム；　７．６ｍ＋ｍ　Ｘ
　１００ｍｍ、三井東圧化学株式会社）を、あらかじめ
Ｏ．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０，ＯＩＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ＰＨ７．０）（以下、Ａ液と略す）で十
分に洗浄し、２ｍｌの粗ＩｇＭ画分を添加した。Ａ液で
１０分間，更に７５容のＡ液に対して２５容の割合（２
５％）で０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）（以下、Ｂ液と略す）を加えた溶液でカラムを１５
分間洗浄した。その後，Ｂ液の割合が２５％からｌＯＯ
％までの直線濃度勾配溶出を２０分間で行った。単一ピ
ークとして溶出したＩｇＭ画分をＰＢＳ　（−　）に対
して十分に透析した。４ｇＯｎ＋１の培養上清より１　
１　．　６ＢのＩｇＭ　（Ｎ５−１　）溶液が得られた
。

実施例３．　ヒトモノクローナル抗体の緑膿菌感染に対
する防御活性試験 実施例２で得られたヒトモノクローナル抗体、Ｎ５−　
１の緑膿菌感染に対する感染防御活性について検討した
。生後、８週から１２週令のマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ、雌
）一群５匹から１０匹に、マウス１匹当たりヒトモノク
ローナル抗体を５０Ｂ、５００ｎｇ、５μ．．　５０μ
ｇ含む溶液０．２ｍｌを腹腔内へ投与し、２時間後に工
血清型緑膿菌（ＦＩ．８５６）の菌液を腹腔内へチャレ
ンジした。対照群にはヒトモノクローナル抗体の代わり
に生理食塩液のみを投与した。■血清型緑膿菌は、ハー
トインフユージョン寒天平板培地に播種して、３７℃で
一夜培養した。増殖した菌体コロニーをかきとり、生理
食塩液にて希釈後、５％ムチンを加え，マウス１匹あた
り５０％致死量（ＬＤ，。値）の１１．０倍のチャレン
ジ菌量となるように調製し、菌液とした。緑膿菌をチャ
レンジ後，７日目の各投与群のマウスの生存率から５０
％有効投学量（ＥＤｓ　ｏ値）を求めた。Ｎ５−１のＥ
Ｄ，。値は、３．５μｇであった。本ヒ１−モノクロー
ナル抗体は工血清型の緑膿菌の感染に対し高い防御活性
を有していた。

実施例４．　液剤のｙＡＩＡ 実施例２で得られたＮ５−１をｌｍｇ／ｍｌ．ヒト血清
アルブミン（カルビオ社）を０．２％（＋＋／ｖ）とな
るように１’［ｌｓ（−）により調製し、ボアサイズ０
．２２ミクロンのメンプランフィルターを用いて除菌濾
過した．抗体をバイアル当たりｌｍｌずつ無菌分注し、
液剤を調製した．１カ月間、４℃または３７℃の温度に
放置した。製剤の保存安定性はＩ血清型緑膿菌ＬＰＳに
対する抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定することによっ
て判定した。

抗体価は、次のようにして測定した． ■血清型緑膿菌（ＡＴＣＣ　２７５８６）　ＬＰＳを０
．ＩＭクエン酸緩衝液（ｐ｝１４．０）に溶解（２　μ
ｇ／＋ｍｌ）　　Ｌ，、ＥＩＡ用９６ウエルプレート（
グライナー社）の各ウエルあたり０．０５ｍｌずつ分注
した．３７℃に１６時間放置し、ＬＰＳをプレートに吸
着させた。液剤希釈系列をウエル中、室温で２時間反応
させた．次に、パーオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＭ
抗体（タゴ社）と２時間反応後、２，２′−アジノビス
（３−エチルベンズチアゾリンスルフォニツクアシド）
（シグマ社）を基質として発色させ、波長４１４ｎｍの
吸光度を測定した．吸光度が０．１となる希釈倍率を最
小自乗法を用いて計算し，これを抗体価とした． １カ月間４℃または３７℃に放置したＮ５−１の抗体価
は、対照の−８０℃に保存の液剤の抗体価と差はなく、
抗体活性が保持されていた． 実施例５．凍結乾燥製剤の調製 実施例２で得られたＮ５−１をＩＩｌｇ／ｍｌ．ヒト血
清アルブミン（カルビオ社）を０．２％（ｗ／ｖ）とな
るようにＰＢＳ（−）により調製し，ボアサイズ０．２
２ミクロンのメンプランフィルターを用いて除菌濾過し
た。

抗体をバイアル当たりｌｍｌずつ無菌分注し，凍結乾燥
して凍結乾燥製剤を調製した．蒸留水で再溶解し，実施
例４と同様にしてＩ血清型緑膿菌（ＡＴＣＣ　２７５８
６）　ＬＰＳに対する抗体価を測定したところ，Ｎ５−
　１の凍結乾燥製剤の再溶解液の抗体価は、対照の凍結
乾燥未処理液の抗体価と差はなく，抗体活性が保持され
ていた。

発明の効果 本発明によるヒト−ヒト・ハイブリドーマを適当な生産
用培地を用いて培養し、培養物より精製したヒトモノク
ローナル抗体の単品，又は２種以上の組み合わせ，ある
いは他のヒト抗体と組み合わせることにより、緑膿菌感
染症に対し優れた予防、治療効果が達成される。

本発明の■血清型緑膿菌に反応性のヒトモノクローナル
抗体を産生ずるヒト−ヒト・ハイブリドーマは，動物細
胞培養用のウシ胎児血清添加培地中で長期間安定に継代
，増殖が可能である。さらには，培養物よりヒトモノク
ローナル抗体を精製する際に培地由来の未知の不純物の
混入の恐れのない無血清培地中でも抗体を大量に産生ず
る能力を有しており，緑膿菌感染症の予防．治療用製剤
の組成物調製の為の原料となるヒトモノクローナル抗体
を得るのに最適である。即ち，本発明の新規ヒト−ヒト
・ハイブリドーマは高い抗体分泌能を有し、大量に培養
してヒトモノクローナル抗体を製造する場合に、培養期
間の短縮化と製造コストの低減をもたらすことが出来る
。

また、本発明のヒト−ヒト・ハイブリドーマはヒトモノ
クローナル抗体の生産用の細胞株として使用できるだけ
でなく、他の宿主細胞あるいは微生物にグロプリン遺伝
子を導入，発現させる場合のヒト抗体遺伝子！ｌ！ｌｉ
ｌＯ用の材料細胞に使用することも出来る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくともＩ血清型緑膿菌に反応性を有するヒトモ
   ノクローナル抗体を産生するヒト−ヒト・ハイブリドー
   マとそれに由来する細胞株。 ２、ヒト染色体のみを有し、かつ無限増殖能を有する細
   胞株とヒト抗体産生細胞とのハイブリドーマである第１
   項記載のヒト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由来する
   細胞株。 ３、ヒト染色体のみを有し、かつ無限増殖能を有する細
   胞株がハイブリドーマの選択特性を有する細胞株である
   第２項記載のヒト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由来
   する細胞株。 ４、ハイブリドーマの選択特性を有する細胞株が微工研
   条寄第２１２９号あるいはそれに由来する細胞株である
   第３項記載のヒト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由来
   する細胞株。 ５、ヒト抗体産生細胞がＥＢウィルス形質転換細胞であ
   る第２項記載のヒト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由
   来する細胞株。 ６、ＥＢウィルス形質転換細胞が微工研条寄第１５９８
   号あるいはそれに由来する細胞株である第５項記載のヒ
   ト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由来する細胞株。 ７、産生するヒトモノクローナル抗体が対応する血清型
   緑膿菌の感染に対して防御的である第１項から第６項記
   載のヒト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由来する細胞
   株。 ８、微工研条寄第２３３９号のヒト−ヒト・ハイブリド
   ーマとそれに由来する細胞株。 ９、第１項から第８項記載のヒト−ヒト・ハイブリドー
   マの作製方法。 １０、第１項から第８項記載のヒト−ヒト・ハイブリド
   ーマとそれに由来する細胞株の少なくとも１つを培養し
   、その培養物より精製することよりなるＩ血清型緑膿菌
   に反応性を有するヒトモノクローナル抗体の調製方法。 １１、第１項から第８項記載のヒト−ヒト・ハイブリド
   ーマとそれに由来する細胞株が産生するヒトモノクロー
   ナル抗体。 １２、第１０項記載の調製方法により調製したヒトモノ
   クローナル抗体。 １３、第１０項から第１２項記載のヒトモノクローナル
   抗体を少なくとも１種含有する緑膿菌感染症の予防、治
   療用の製剤。 １４、第１３項記載の製剤が液剤である緑膿菌感染症の
   予防、治療用の製剤。 １５、第１３項記載の製剤が凍結乾燥製剤である緑膿菌
   感染症の予防、治療用の製剤。 １６、第１３項から第１５項記載の予防、治療用の製剤
   を投与することを特徴とする緑膿菌感染症の予防、治療
   方法。